Biblioteca Digital | FCEN-UBA

Biblioteca Digital ¿Por qué?
Objetivos
Impactos
Estadísticas
Documentos
Presentaciones
Notas
Autores y derechos
¿Por qué depositar?
¿Cómo depositar?
Autorización
Depositar y publicar
Editoriales
Publicar mi tesis Formulario Tesis Posgrado
Formulario Tesis Grado
Normativa
Res. CD 2053/05
Res. CD 2533/09
Res. CD 0272/13
Res. CD 2793/15

Colecciones Tesis Doctorales
Fotografías
Publicaciones
Archivo
Libros
Reportes Técnicos

Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Biología Molecular y Celular [ 309 tesis ]

Strusberg, Sylvia Teresa. "Mecanismos de replicación del ácido deoxiribonucleico : ADN polimerasas en linfocitos humanos" (1977) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Grinblat, Lea. "Diabetes y funciones mitocondriales en miocardio de rata" (1980) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Beconi, Martha Teresa. "Actividad de oxidasa alternativa y respiración mitocondrial en plantas superiores" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Se estudió la actividad de oxidasa alternativa y la respiración mitocondrial en mitocondrias aisladas de diferentes tejidos de plantas superiores. Incubando tejido de tubérculos de papa en una cámara húmeda (envejecimiento) durante 24 y 48 horas se observó un incremento de la proteína mitocondrial con un concomitante aumento en la actividad de oxidasa alternativa. Además en dichas mitocondrias se observó un incremento en el consumo de oxígeno y una disminución en el control respiratorio con el tiempo de incubación. Al determinar la producción de anión superóxido en mitocondrias aisladas de tubérculos de papa se encontró que representa una pequeña fracción del consumo de oxígeno total y que no se incrementa con el envejecimiento. El envejecimiento del tejido produce un considerable incremento en la actividad de superóxido dismutasa citosólica (enzima Cu-Zn) lo cual es consistente con un incremento en la producción citosólica de Ō¯2̄ en condiciones fisiológicas. En la determinación de la actividad de oxidasa alternativa en mitocondrias aisladas de ejes embrionarios de semillas de soja no se observó una actividad apreciable de oxidasa alternativa durante los primeros estadíos de incubación como habían propuesto Yentur y Leopold (1976) y su nivel se mantuvo bajo entre las 2 y las 14 horas de imbibición. En embriones de soja se observó un incremento en el consumo de oxígeno que es paralelo al observado en el peso fresco entre las 2 y las 14 horas de imbibición. En mitocondrias aisladas de ejes embrionarios de soja se observó un incremento en la respiración por el agregado de citocromo c exógeno, y una disminución del efecto del citocromo c con el tiempo de imbibición. Al medir la respiración de embriones de soja se observó que el 46-50% del consumo de oxígeno total es de origen mitocondrial siendo el resto del consumo de oxígeno extramitocondrial y debido a la actividad de otras enzimas como oxidasas, oxigenasas (por ej. tirosinasa, lipoxigenasa, etc.). Esto coincide con trabajos realizados con quimioluminiscencia (Boveris y col., 1980) donde se obtiene una gran actividad de lipoxigenasa en homogenados de semillas de soja. Esta actividad de lipoxigenasa es insensible al cianuro y a la antimicina, pero es sensible al SHAM, similarmente a la oxidasa alternativa que es sensible al SHAM e insensible a los otros dos inhibidores. En mitocondrias de raíces de maiz que crecen en una solución nutritiva, se encontró una actividad de oxidasa alternativa que da cuenta del 41% del consumo de oxígeno total. En dichas mitocondrias la actividad de la oxidasa alternativa parece asociarse a la denominada "respiración salina" donde se produce exceso de ácidos orgánicos cuya función es mantener la electroneutralidad frente a la absorción de iones. Se observó con el uso de inhibidores de la respiración, que en mitocondrias de raíces de maíz, el SHAM y la antimicina actúan en sitios separados, pero que muestran una ligazón cooperativa entre ambos sitios. Los estudios realizados sobre la actividad de oxidasa alternativa y su papel fisiológico se han hecho sobre tejidos y mitocondrias aisladas de los mismos. En los trabajos realizados con tejidos enteros, no se puede afirmar que la actividad medida sea la que corresponde a la oxidasa alternativa, porque hay que considerar otros factores que pueden influir en su determinación. En el trabajo realizado para esta tesis utilizando tejidos y mitocondrias aisladas de los mismos permite concluir que para determinar la actividad de la oxidasa alternativa de un tejido hay que aislar las mitocondrias del mismo.

Galvagno, Miguel Angel. "Caracterización de la fosfodiesterasa de AMP cíclico del hongo dimórfico Mucor rouxii : Regulación de la actividad enzimática por fosforilación-desfosforilación" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Ritta, Mónica Nora. "Prostaglandinas y función pineal : Su participación en la síntesis y mecanismo de acción de la hormona pineal melatonina" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Torruella, Mónica. "Anticuerpos monoclonales contra adenilato ciclasa de eucariotes inferiores" (1984) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Kerner, Néstor Alberto. "Mecanismo de regulación de la fosfodiesterasa de AMP cíclico del hongo dimórfico Mucor rouxii por fosforilación y proteólisis : Variaciones de las formas enzimáticas durante el crecimiento filamentoso" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Cozza, Eduardo Néstor. "Metabolismo y transformaciones espontáneas de la 18-hidroxicorticosterona con énfasis en sus condiciones precursoras para la aldosterona" (1986) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Guerra, Liliana Noemí. "Estudios biológicos, bioquímicos y genéticos de la línea IIB-MEL-J como modelo para el melanoma humano" (1991) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Fastame, Inés Gabriela. "Regulación de síntesis proteica en bacterias y parásitos" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Estévez, Alvaro Germán. "Papel del óxido nítrico y de las especies reactivas derivadas del oxígeno en la muerte neuronal apoptótica" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Elola, María Teresa. "Detección, cuantificación y caracterización de Lectinas ß-Galactosídicas de Bufo arenarum" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Costas, Mónica Alejandra. "Mecanismos moleculares de regulación de la sensibilidad a glucocorticoides por las citoquinas" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las citoquinas inducen la producción de glucocorticoides (GC), los cuales inhiben la producción de citoquinas y sus acciones biológicas, protegiendo al organismo de una respuesta inmune exacerbada. Se observó que el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) aumentó la actividad transcripcional inducida por GC vía elementos respondedores a GC (GRE) en fibroblastos de ratón L-929 transfectadas con un plásmido reporter inducible por GC. Además, TNF-a aumentó el número de receptores para GC (GR) y la actividad transcripcional en el promotor de GR (HGRP) en células L-929 transfectadas con un plásmido reporter HGRP. TNF-a no tuvo efecto en células que no expresan GR pero que sí expresan receptores para TNF-a, aunque, el efecto fue evidente cuando estas células fueron cotransfectadas con un vector de expresión para GR. Estas acciones ponen de manifiesto, que TNF-a puede aumentar la actividad transcripcional de GR en respuesta a GC independientemente del aumento en el número de GR. Más aún, TNF-a aumentó la unión de GR a GRE. Como correlato biológico de estos efectos, un priming (preincubación) de TNF-a (dosis baja, no citotóxica) aumentó significativamente la sensibilidad a la acción inhibitoria de los GC sobre la citotoxicidad/apoptosis inducida por TNF-a en las células L-929. TNF-a e IL-1b tuvieron el mismo efecto estimulatorio sobre la actividad transcripcional de GR en distintos tipos celulares (glioma, epiteliales, hipofisiarias). Concluimos que, las citoquinas, pueden modular la acción de los GC a nivel molecular aumentando la sensibilidad a sus efectos reguladores en la célula blanco.

Abstract:
Cytokine-induced glucocorticoid secretion and glucocorticoid inhibition of cytokine synthesis and pleiotropic actions act as important safeguards in preventing cytokine over-reaction. We found that tumor necrosis factor-a (TNF-a) increased glucocorticoid-induced transcriptional activity of the glucocorticoid receptor (GR) via the glucocorticoid response elements (GRE) in L-929 mouse fibroblasts transfected with a glucocorticoid-inducible reporter plasmid. In addition, TNF-a also enhanced GR number and transcriptional activity on GR promoter (HGRP) in L-929 cells transfected with a HGRP reporter plasmid. The TNF-a effect on transcriptional activity was absent in other cell lines that express TNF-a receptors but not GRs, and became manifest when a GR expression vector was cotransfected, indicating that TNF-a, independent of any effect it may have on GR number, has a stimulatory effect on the glucocorticoid-induced transcriptional activity of the GR. Moreover, TNF-a increased GR binding to GRE. As a functional biological correlate of this mechanism, priming of L-929 cells with a low (non-cytotoxic) dose of TNF-a significantly increased the sensitivity to glucocorticoid inhibition of TNF-a-induced cytotoxicity/apoptosis. TNF-a and IL-1b had the same stimulatory action on glucocorticoid-induced transcriptional activity of the GR via the GRE, in different types of cytokine/glucocorticoid target cells (glioma, pituitary, epithelioid). The phenomenon may therefore reflect a general molecular mechanism whereby cytokines modulate the transcriptional activity of the GR, thus potentiating the counter-regulation by glucocorticoids at the level of their target cells.

Rossi, María Magdalena. "Clonado y caracterización de un gen de tomate modulable por ácido abscísico" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Bocanera, Laura Viviana. "Rol de la Guanilil Ciclasa y el GMPc en el metabolismo de la tiroides" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El presente trabajo de tesis tienen como objetivo estudiar el rol en la glándula tiroides de la enzima guanilato ciclasa (GC) y el producto de la reacción catalizada por esta: el GMPc. En la primera sección se detalla la caracterización parcial de la enzima en tiroides bovinas. Los resultados obtenidos, demuestran la presencia de dos tipos de GC: una soluble y una particulada, predominando la actividad soluble (79%) sobre la actividad asociada a membrana (8%). El tratamiento con Tritón X-100 incrementa la actividad de ambas enzimas (350% GC particulada, 70% GC soluble). Con el objeto de descartar cualquier posible contaminación de la fracción soluble con la fracción particulada y viceversa, se determinó las actividades de las enzimas en ambos preparados, previamente tratados con activadores específicos para cada una de ellas: Pépitido natriurético atrial (ANP) para la GC particulada y nitroprusiato de sodio (NP) para la GC soluble. El ANP incrementó la actividad en la fracción de membrana y el NP activó la GC de la fracción soluble, sin observarse ningún efecto del ANP y NP sobre la enzima soluble y particulada respectivamente, descartando una contaminación de las fracciones entre si. Para estudiar el grado de interacción entre la enzima particulada y la membrana, se sometió al precipitado de la centrifugación de 105.000 x g a tratamientos con NaCl 0.5 mM, deoxicolato 1%, o Lubrol PX 1%, obteniéndose mayor actividad en las muestras tratadas con Lubrol PX indicando que la proteína se encuentra fuertemente asociada a la membrana. Cuando se estudió el comportamiento cinético considerando el complejo MnGTP como sustrato, la cinética fue michaelina para la GC soluble con un Km de 0.036 mM, mientras que la enzima particulada mostró un comportamiento alostérico positivo con un S0.5 de 0.230 mM y un coeficiente de Hill de 1.9, indicando que existen en la enzima, por lo menos dos sitios de unión para el sustrato. Con el objeto de estudiar el efecto de diferentes concentraciones de manganeso, se determinó la actividad enzimática trabajando en condiciones de exceso de Mn2+ respecto de la concentración de GTP. Los resultados obtenidos en esta serie de experimentos, muestra un comportamiento alostérico positivo para la enzima soluble con un S0.5 de 1.2 mM y un coeficiente de Hill de 2.9. La cinética para la enzima particulada ensayada en las misma condiciones, resultó michaeliana con un Km de 0.280 mM. Si bien la actividad enzimática es altamente dependiente de manganeso, resultó de interés investigar el efecto sobre la enzima de otros cationes divalentes: Mg2+ y Ca2+. Reemplazando el Mn2+ por Mg2+ en el medio de reacción, no se observó actividad de la enzima asociada a la fracción particulada, obteniéndose con la enzima particulada, sólo un 15% de la actividad determinada en presencia de manganeso. El calcio en ausencia o presencia de concentraciones óptimas de manganeso, no tuvo efecto sobre la actividad de ninguno de los dos tipos de GC. Con concentraciones subóptimas de Mn2+, se observó un aumento de la actividad en la GC soluble a altas concentraciones de calcio. Este este estímulo sólo representa aproximadamente el 20% de los valores obtenidos con concentraciones de manganeso óptimas. Con la GC particulada en las mismas condiciones experimentales se observó una ligera pero significativa inhibición a concentraciones altas de Ca2+. La segunda parte de este trabajo está dedicada a determinar el posible rol biológico asociado a la GC soluble en la glándula tiroides. Para este fin se utilizó como modelo experimental cultivos primarios de tiroides bovinas. La primera serie de experimentos tuvo como objetivo verificar que en el modelo experimental utilizado, la GC soluble es activable por el nitroprusiato de sodio (NP). Los resultados obtenidos indican que el NP produce un incremento en la actividad enzimática que es dependiente de la y del tiempo de tratamiento, incrementando correlativamente los niveles de GMPc. Dado que el transporte de ioduro, constituye el paso inicial y limitante en la síntesis de las hormonas tiroideas, se estudió el efecto del NP sobre la incorporación del halógeno. Se observó una inhibición significativa de la capitación de yoduro a las 2 hs de tratamiento con 5 mM de NP en células previamente tratadas con TSH por 72 hs, sin variaciones sobre los basales (células sin TSH). Este efecto fue reproducido por un análogo del GMPc (8Br-GMPc), y bloqueado por hemoglobina reducida, sugiriendo que este se encuentre mediado por la vía GC-GMPc. La inhibición producida por el NP fue también observada cuando las células son tratadas con activadores del sistema adenilil ciclasa-AMPc tales como forskolina y análogos del AMPc, indicando que el compuesto nitrogenado podría estar inhibiendo un efecto de la TSH desencadenado a través de este sistema de transducción de señales. Sin embargo, el punto de acción sería distal a la formación de AMPc, dado que los niveles del nucleótido no se encuentra disminuidos. Dado que la incorporación de iodo a la célula tiroidea se encuentra determinada por un equilibrio entre la entrada y la salida o eflujo, se consideró de ínterés evaluar que mecanismo se encontraba afectado por el NP. En una primera instancia se estudió el efecto del compuesto nitrogenado sobre la salida o eflujo de iodo, no observándose diferencias significativas en las células tratadas con NP respecto al control. Teniendo en cuenta que la incorporación de yoduro en la célula tiroidea se encuentra inequivocamente ligada a la actividad de la ATPasa Na+/K+ estimulable, se investigó la acción del NP sobre esta enzima. Los resultados obtenidos indicaron una marcada inhibición en la actividad de la enzima en células previamente tratadas con TSH por 72 hs sin efectos significativos sobre los cultivos en condiciones basales. Este efecto es reproducido por 8Br-GMPc confirmando que la inhibición se encuentra mediada por el sistema GC-GMPc.

Abstract:
The present Doctoral Thesis work had as an aim to study the role of guanylil cyclase (GC) and its product, cyclic GMP (cGMP), in the regulation of thyroid function. In the first section the partial characterization of the enzyme in calf thyroid is presented. The results obtained showed the presence of two types of GC: one is soluble and comprises around 79% of total activity, while the remaining is particulate. Treatment with Triton X-100 increases both activities (350% increase for the particulate, 70% for the soluble enzyme). In order to rule out the possibility of a contamination of the soluble fraction with the particulate, and vice-versa, the activity of each of the enzymes was determined after stimulation with specific activators for each one. The atrial natriuretic peptide (ANP) for the particulate GC and sodium nitroprusside (NP) for the soluble enzyme. Both compounds increased their respective effectors and no cross stimulation was observed. In order to analyze the interaction between the particulate enzyme and the membranes the pellet obtained after centrifugation at 105,000 x g was treatedwith either 0.5 mM NaCl, 1% sodium deoxycholate or 1% Lubrol PX 1%. The highest activity was obtained after treatment with Lubrol, suggesting that the enzyme is strongly associated to the membrane. When the kinetics of the enzyme was analyzed, taking the complex MnGTP as a substrate, the results showed a Michaelis type kinetics for the soluble GC, with a Km of 0.036 mM, whereas the particulate GC showed a positive allosteric behaviour with a S0.5 of 0.230 mM and a Hill coefficient of 1.9, indicating that the enzyme has at least two binding sites for the substrate. When the influence of different Mn2+ concentrations was studied, under excess with respect to GTP, apositive allosteric behaviour for the soluble GC was found, with an S0.5 of 1.2 mM and a Hill coefficient of 2.9 The kinetic of the particulate enzyme under similar conditions was of Michaelis type, with a Km of 0.280 mM. Although the enzyme is highly dependent of Mn2+, it was of interest to investigate the possible effects of other divalent cations, such as Ca2+ and Mg2+. The replacement of Mn2+ for Mg2+ caused a complete disappearance of the particulate enzyme, while the soluble activity decreased by 85%. Addition of Ca2+ had no effect on either GC. However, with suboptimum concentrations of Mn2+, high Ca2+ concentrations caused an increase in soluble activity, but it comprised only 20% of maximum activity with optimal Mn concentrations. With the particulate enzyme a slight but significant inhibition was observed. The second part of this study examines the role of GC and cGMP in thyroid regulation. Primary cultures of calf thyroid cells were used as a model. In the first studies the stimulation of soluble GC by NP was confirmed. This increase is time and concentration- dependent, with a correlative increase in cGMP concentrations. Iodide uptake is the limiting step in thyroid hormone biosynthesis and a typical functional parameter. Therefore it was determined as an index of thyroid function. In cells treated with TSH for 72 h, addition of 5 mM NP for the last 2 h caused a significant inhibition of iodide uptake, without change in cells not treated with TSH. This action was mimicked by an analogue of cGMP, 8Br-cGMP, and blocked by reduced haemoglobin, thus suggesting that it is mediated by GC-cGMP pathway. NP also inhibited the stimulation caused by forskolin or analogues of cAMP, indicating that the effect takes place at this pathway, which would be distal to cAMP generation, since cAMP are not decreased by NP. The accumulation of radioiodine by thyroid cells is the consequence of the balance between uptake and efflux. In order to rule out an effect on this last parameter a series of studies were conducted. The results failed to demonstrate that NP affects iodide efflux, therefore concluding that it inhibits uptake. Since iodide transport across the membrane depends of the energy supplied by the Na+/K+ ATPase the possible effect of NP on the enzyme was analyzed. The results showed a significant inhibition of the ATPase by NP in cells treated for 72 h with TSH. This action was reproduced by 8Br-cGMP, thus confirming the role of GC and cGMP in this process.

Panebra Alvarado, Alfredo. "Respuesta humoral en Leishmaniasis del Perú : Proteínas HSP70 y ribosomales P" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En la presente tesis, se abordó el clonado de la hsp70 de L.(V.) peruviana y la caracterización de la respuesta humoral en pacientes con Leishmaniasis Tegumentaria Americana, la Enfermedad de Chagas y la enfermedad mixta Chagas/Leishmaniasis. Se determinó el tamaño del inserto de U4 en 1,6 Kpb. Se mostró que U4 presentaba un marco de lectura abierto de 525 pb. que codifican para los 174 aminoácidos C-terminales de la hsp70 de L.(V.) peruviana. U4 presenta una homología de 98% con Lbb1 (97% de identidad y 1% de cambios conservativos) y con RA1 un 87% (74% de identidad y 13% de cambios conservativos). Se determinó la organización genómica de los genes hsp70 por Southern-blot de ADN genómico de clones de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis. Se encontró 2 locus genómicos, uno de los cuales contenía un tandem de genes hsp70 para ambas especies de Leishmania sp. Los ADNc de U4 y Lbb1 se subclonaron pGEX1l T para caracterizar la respuesta humoral en Leishmaniasis Tegumentaria Americana, Enf. de Chagas y la Inf. mixta Chagas/Espundia por Ensayo de Placa de Lisis, Western-blot y ELISA. Los resultados obtenidos por las 3 técnicas indican que U4/Lbb1 se pueden usar en el diagnóstico de L. Mucocutánea (Espundia) y junto a JL7, permitiría un diagnóstico diferencial de la enfermedad mixta Chagas/Espundia. El clonado y la caracterización de la respuesta humoral de las proteínas ribosomales P2 de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis. El clonado de las proteínas ribosomales ácidas de tipo P2 de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis se realizó mediante rastreo de bibliotecas de expresión en l gt11 con sondas de las proteínas ribosomales P2a y P2b de L.(L.) infantum. En la biblioteca de expresión de L.(V.) peruviana se aisló un recombinante con cada sonda. El recombinante LbpP2a tenía un inserto de aprox. 900 pb., presentando un marco de lectura abierto de 327 pb. que codifican 108 aminoácidos, faltándole sólo los 3 primeros residuos N-terminales para estar completa. El recombinante LbpP2a presenta una homología de aminoácidos de 95% (89% de identidad y 6% de cambios conservativos) con la proteína homóloga de L.(L.) infantum, un 87% (74% de identidad y 13% de cambios conservativos) con la de T. cruzi y un 65% (44% de identidad y 21% de cambios conservativos) con la proteína P2 humana. El otro recombinante (LbpP2b ) aislado de la misma biblioteca continua un inserto de 271 pb., presentando un marco de lectura abierto de 144 pb. que codifican los 44 últimos aminoácidos C-terminales. Cuando se compara el recombinante LbpP2b con sus homólogas de otras especies de Trypanosomátidos, la más alta homología la presenta con la proteína ribosomal P2b de L.(L.) infantum con un 90% (81% de identidad y 9% de cambios conservativos), con la P2b de T. cruzi alcanza un 86% (78% de identidad y 8% de cambios conservativos), con la P2b de T. brucei un 78% (66% de identidad y 12% de cambios conservativos) y con la P2 humana un 73% (59% de identidad y 14% de cambios conservativos). En la biblioteca de expresión de L.(V.) braziliensis se aisló un recombinante (LbbP2b -like) con la sonda la P2a de L.(L.) infantum. Este recombinante contiene un inserto de aprox. 750 pb., presentando un marco de lectura abierto de 264 pb. que codifican los 87 aminoácidos C-terminales de una proteína ribosomal P2b atípica de L.(V.) braziliensis. La comparación de aminoácidos es mayor con el recombinante LbpP2b con un 72% (52% de identidad y 20% de cambios conservativos), un 69% con la de L.(L.) infantum (49% de identidad y 20% de cambios conservativos), con la P2 humana un 64% (35% de identidad y 29% de cambios conservativos), con la T. brucei 58% (38% de identidad y 20% de cambios conservativos) y finalmente con la de T. cruzi un 53% (31% de identidad y 22% de cambios conservativos). Al analizar la respuesta humoral de pacientes con L. Mucocutánea contra los recombinantes LbpP2a y LbbP2b -like, se vió que el epítope inmunodominante no se localiza en el extremo C-terminal, mientras que en las proteínas ribosomales P de T. cruzi, se había determinado el extremo C-terminal como el epítope inmunodominante (péptido R-13). De otro lado, pacientes con la Enfermedad de Chagas no reaccionaban con las proteínas ribosomales de tipo P2 de Leishmania sp., indicando que inducen anticuerpos Leishmania-específicos y que no cros-reaccionan con las de T. Cruzi.

Abstract:
I have performed the cloning of the hsp70 of Leishmania (Viannia) peruviana (recombinant U4) and characterization of the humoral inmune response in patients with American Tegumentary Leishmaniasis (ATL), Chagas’ disease (CH) and the mixed infection Chagas/Leishmaniasis (CH/L) against this protein. The recombinant U4 has an insert of 1,6 Kbp., presenting an open reading frame (ORF) of 525 bp, coding for the last 174 aminoacids. The recombinant U4 presents a high degree of homology with the recombinant Lbb1 (C-terminal domain of the hsp70 of L.(V.) braziliensis) of 98% (97% identity and 1% non conservative substitutions) and with the recombinant RA1 (C-terminal domain of the hsp70 of T. cruzi) of 87% (74% identity and 13% non conservative substitutions). I found two hsp70 genomic loci in the genome of the related species L.(V.) peruviana and L.(V.) braziliensis as determined by Southern blot. One locus comprised the tandem repeat of the hsp70 genes, which present a repetitive unit of 3,7 Kbp. I have cloned the U4, Lbb1 and RA1 cDNAs in the expression vector pGEX1l T to characterize the humoral inmune response in ATL, CH and CH/L as measured by ELISA, Phage dot array immunoassay and Western blot. I found a high reactivity of Mococutaneous Leishmaniasis sera with the U4/Lbb1 recombinant proteins, whereas most of the Cutaneous Leishmaniasis, Chagasic and non-related sera did not. I have also cloned the ribosomal P2-type proteins of L.(V.) peruviana (LbpP2a and LbpP2b ) and L.(V.) braziliensis (LbbP2b -like) by screening of the expression libraries with P2-type ribosomal proteins from L.(L.) infantum as probes. The recombinant LbpP2a has an insert of 900 bp. An ORF of 327 bp, codifying 108 aminoacids, lacking the three N-terminal residues to be a full length protein. This recombinant presents an homology of 95% (89% identity and 6% conservative substitution) with the homologous of L.(L.) infantum, 87% of homology (74% identity and 13% conservative substitutions) with the corresponding of T. cruzi and 65% of homology (44% identity and 25% conservative substitutions) with the human P2 protein. The recombinant LbpP2b has an insert of 271 bp, presenting on ORF of 144 bp, coding for the last 44 C-terminal aminoacids. It has an homology of 90% (81% identity and 9% conservative substitutions) with the corresponding of L.(L.) infantum, 86% of homology (78% identity and 8% conservative substitutions) with that of T. cruzi, 78% of homology (66% identity and 12% conservative substitutions) with the P2b protein of T. brucei and 73% of homology (59% identity and 14% conservative substitutions) with the human P2 protein. The LbbP2b -like protein has an insert of 750 bp, presenting an ORF of 264 bp. coding for the 87 C-terminal aminoacids. It has 72% of homology (52% identity and 20% conservative substitutions) with that of L.(V.) braziliensis, 69% (49% identity and 20% conservative substitutions) with that of L.(L.) infantum, 64% (35% identity and 29% conservative substitutions) with the human P2 protein, 58% (38% identity and 20% conservative substitutions) with the P2b of T. brucei and a 53% (31% identity and 22% conservative substitutions) with that of T. cruzi. In both Leishmania P2 proteins (LbpP2a and LbbP2b -like) evaluated, the most antigenic epitope was not located at the C-terminus, whereas in the T. cruzi P2 proteins the inmunodominant epitope was the last 13 C-terminal residues (R-13 peptide). Chagasic sera did not react with the ribosomal P2 proteins from Leishmania sp.

Casas, Adriana Gabriela. "Metabolismo del hemo y neoplasias" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Terapia Fotodinámica del cáncer (TFD) es un tratamiento que se basa en la acumulación selectiva de un fotosensibilizante en las células tumorales. Este, luego de ser excitado por acción de la luz roja, desencadena una serie de reacciones mediadas por radicales libres, que finalmente destruyen el tejido. El empleo del ácido 5-aminolevúlico (ALA) como precursor de la síntesis de porfirinas, ha cobrado especial interés en los últimos años tanto en la TFD usando las porfirinas como fotosensibilizantes, como en la fotodetección de tumores, empleando la propiedad de estos pigmentos de fluorescer con la luz UV. Por otra parte, se ha observado que algunos tejidos neoplásicos acumulan porfirinas, por lo cual se ha postulado que el camino biosintético de los tetrapirroles se encuentra alterado en los pacientes con neoplasias. En el presente trabajo se caracterizaron las actividades de algunas de las enzimas del camino biosintético del hemo en un adenocarcinoma mamario de ratón y en el hígado de los animales portadores de dicha neoplasia. Se estudió la biosíntesis de porfirinas in vitro a partir de ALA en tumor y otros tejidos, empleando para ello la técnica de explantes tisulares, y se encontró que la acumulación de porfirinas se hace más selectiva para el tumor cuando el precursor se administra encapsulado en liposomas o cuando se agrega cinc en el medio de incubación. Se desarrolló un modelo in vitro-in vivo para estudiar la efectividad de la acción fotodinámica de las porfirinas sintetizadas endógenamente a partir de ALA, en el cual se monitorea el crecimiento de los tumores irradiados, luego de su reimplantación en animales receptores. Se encontró que los explantes incubados 2 hs con ALA, y que por lo tanto sintetizaron 4,6 (g de porfirinas/g tej., al ser irradiados sufrieron una reducción desde un 60% de la masa tumoral, hasta la falta completa de crecimiento del tumor en el ratón receptor. Además se observó una correlación entre el nivel de porfirinas acumuladas y el daño celular. El mismo modelo fue utilizado para investigar la efectividad del daño fotodinámico inducido por ALA en combinación con los antineoplásicos 5-Fluorouracilo, Ciclofosfamida y Doxorubicina.. Se encontró un aumento en la eficacia de la TFD, cuando se emplearon Ciclofosfamida y Doxorubicina; no así cuando se usó 5-Fluorouracilo. Con nuestro modelo in vitro-in vivo se ha demostrado que ocurre una importante y hasta una completa destrucción de las células tumorales mediante la combinación de la síntesis endógena de porfirinas a partir de ALA y un tratamiento lumínico de baja potencia. Los resultados presentados en este trabajo indican que el empleo del ALA en la detección temprana de las células alignas y en la TFD es sumamente prometedor. Nuestros hallazgos plantean también la posibilidad del uso combinado de antineoplásicos con la TFD inducida por ALA.

Abstract:
Photodynamic Therapy (PDT) shows considerable promise as a treatment modality for malignant tumors. This type of therapy is based on the accumulation of a photosensitiser after its administration. Subsequent illumination with light of an appropriate wavelength provokes a photochemical reaction that results in tissue destruction. 5-aminolevulinic acid (ALA) induced photosensitisation may be a promising approach. So does the use the fluorescence under UV light of ALA induced porphyrins on the early detection of malignancies. The overproduction of porphyrins in tumors, in the absence of known porphyria, has also been observed by several authors. It has been suggested that porphyrin metabolism may be altered in cancer patients. In this work we have reported some properties of ALA-D and PBG-ase, two enzymes of the porphyrin biosynthesis pathway, in a mouse mammary adenocarcinoma and liver of tumor bearing mice. Using the tissue explant cultures technique we have studied the endogenous porphyrin biosynthesis in tumor and other organs using the ALA precursor either free or encapsulated in liposomes. It was found that the latter improved tumor selective accumulation. Porphyrin retention was further enhanced when cinc was added to the incubation media. To assess the potential antineoplasic efficacy of ALA-based Photodynamic Therapy, we have designed a new in vitro - in vivo model. Tumor explants were incubated with ALA and, after irradiation, viability was tested by monitoring the growth of implanted tumors in receptor animals. It was found that tumor explants incubated 2 hours with ALA, reaching a concentration of 4.6 (g porphyrin/g tissue, lead from 60% reduction of the tumoral mass to complete lack of tumor growth. These results showed a correlation between cellular destruction and the level of porphyrin content. The same model was used to investigate the effectiveness of ALA as photosensitizer in combination with antineoplasic drugs such as 5-Fluorouracil, Cyclophosphamide and Doxorubicin. An increase in the efficacy of the photodynamic therapy was observed when Cyclophosphamide and Doxorubicin were used, but there was no improvement when 5-Fluorouracil was used. These findings, showing an important to complete tumor cell destruction by combination of porphyrins endogenously formed from ALA and low irradiance, support our proposal on the use of ALA for early diagnosis and photodynamic treatment of malignant cells. Furthermore, ALA-based PDT in combination with chemotherapy is a promising therapy.

Fernández, Sandra Viviana. "Estudio de la estructura y regulación de la expresión de los genes Cab en plantas superiores" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Se aislaron seis genes Lhc a partir de una biblioteca genómica de papa(Solanum tuberosum). Estos genes codifican polipéptidos que formarían parte de los complejos que captan la luz que luego es utilizada en la fotosíntesis. Estos genes se hallan en tandem y están separados por regiones de 1.3-1.4 kb. Todos poseen la misma orientación 5'( 3' y cada uno de ellos tiene su propio promotor localizado 5' río arriba de la región de código. Las proteínas deducidas a partir de las secuencias de bases, poseen todos los aminoácidos característicos de las proteínas CAB del PSII, Tipo I, las cuales están codificadas por los genes Lhcb1. Por lo tanto los genes aislados fueron denominados: Lhcb1*1, Lhcb1*2, Lhcb1*3, Lhcb1*4, Lhcb1*5 y Lhcb1*6. La región codificante de estos genes posee 798 pb excepto el Lhcb1*6 el cual fue aislado en forma incompleta (411 pb). Estos genes codifican proteínas de 265 aminoácidos, incluyendo el péptido señal. Los genes estudiados poseen un 94-98 por ciento de homología en sus secuencias de bases y codifican proteínas que poseen entre un 97.5 por ciento a 99.75 por ciento de identidad. Las regiones 5' flanqueantes de los seis genes poseen secuencias conservadas y que están presentes en otros genes cuya expresión es regulada por la luz (el fragmento de 62 pb localizado entre las cajas CAAT y TATA contiene tres secuencias GATA). La expresión de los genes Lhcb1 en las plantas de papa mostró ser específica de órgano. Diferentes transcriptos fueron detectados en las hojas de las plantas mientras que solo uno se detectó en los tallos y no hubo expresión en las raíces. Se determinó el sitio de iniciación de la transcripción para el gen Lhcb1*2. El mismo esta localizado a 69 nucleótidos río arriba del codón de iniciación de la traducción (codón ATG). Los resultados indicaron que la C en la secuencia CTTCAT constituye el primer nucleótido en el ARNm correspondiente al gen Lhcb1*2. La región localizada río arriba del gen Lhcb1*2 que se extiende hasta -1300pb fue secuenciada. Esta región contiene un motivo "G" (5'TGGTTGTGTC3') localizado entre las bases -162 a -171 con respecto al sitio de iniciación de la transcripción. Recientemente fue demostrado que el factor citosólico GBF, el cual se une al motivo "G", se transloca al núcleo en presencia de luz, mientras que en la oscuridad permanece en el citoplasma (Harter et al, 1994). Las funciones regularais de la región 5' flanqueaste del gen Lhcb1*2 fueron analizadas en plantas transgénicas de tabaco. En la construcción realizada, la región promotora del gen Lhcb1*2 dirige la expresión del gen reportero uidA, el cual codifica la enzima (-glucuronidasa (GUS). El análisis de las plantas transgénicas reveló que la región 5' flanqueante (-1300 a +10) del gen Lhcb1*2 es suficiente para conferir una respuesta a la luz a través del fotoreceptor fitocromo así como también una respuesta específica de órgano. Por otra parte, la expresión del gen uidA fue detectada en las plántulas transgénicas de tabaco a partir de las 72 hs luego de la germinación de las semillas. Este resultado se correlaciona con el tiempo de maduración de los cloroplastos (Oemüller et al,1986). Además, no se detectó expresión del gen uidA cuando las plántulas de tabaco transgénicas fueron cultivadas en presencia de un herbicida que impide el desarrollo de los cloroplastos. Por lo tanto, estos resultados indican que la presencia de cloroplastos maduros es necesaria para la expresión del GUS dirigida por el promotor del gen Lhcb1*2 aislado de plantas de papa. Se realizaron deleciones de la región promotora las cuales fueron fusionadas al gen uidA. De estos experimentos se pudo concluir que la región del promotor comprendida entre las bases -690 a +10 es suficiente para conferir una respuesta específica de órgano así como también una respuesta a la luz a través del fotoreceptor fitocromo.

Abstract:
A potato (Solanum tuberosum) genomic library was used to isolate five full-length genes and part of a sixth one, encoding the apoproteins of a light-harvesting complex (LHC). These genes are arrange in tandem with a spacing of 1.3-1.4 kb between neighboring genes. They present the same orientation and they have their own promoters 5'-upstream of the coding regions. All the Lhcb1 genes have 798 bp open reading frame coding for a protein of two hundred and sixty-five amino acids, including a transit peptide. The nucleotide homology among the five genes is between 94-98 per centum. The nucleotide sequences showed that they encoded very similar proteins (99.75 per centum o 97.50 per centum identities). The deduced amino acid sequences were homologous to the PSII Type I CAB proteins encoded by the Lhcb1 genes, so these genes were named Lhcb1*1, Lhcb1*2, Lhcb1*3, Lhcb1*4, Lhcb1*5 and Lhcb1*6, respectively. The 5'-flanking regions of the six potato genes shared conserved sequences already detected in other light-responsive genes (62 bp fragment located between the CAAT and TATA boxes containing three GATA motifs). The expression of Lhcb1 genes in potato was organ-specific. At least nine different transcripts can be recognized in leaves by the primer extension method. A unique transcript could be detected in stems and not in roots. The transcription start site for the Lhcb1*2 gene was determinated. It is located 69 nucleotides upstream from the ATG codon. Our results indicated that the C in the sequence CTTCAT would be the first nucleotide in the Lhcb1*2 mRNA. The 5' upstream region of Lhcb1*2 extending from -1300 bp to the cap site was sequenced. This region contained a G-box motif (TGGTTGTGTC) located between -162 and -171 from the transcription start site. It has been recently demonstrated that the translocation of the cytosolic GBFs (G-box binding factor) to the nucleus is light-regulated (Harter et al, 1994). The regulatory function of the 5'-flanking region of the potato Lhcb1*2 was analyzed in transgenic tobacco plants. The construct used contained the uidA gene which was under the control of the potato Lhcb1*2 promoter. Analysis of transgenic plants revealed that the 5'-flanking region (-1300 to +10, relative to the transcription start site) of the Lhcb1*2 gene is sufficient to confer a phytochrome response as well as organ-specific expression. In ours experiments, the expression of the uidA gene was detected in the transgenic tobacco seedlings around 72 h after germination. This result correlates well with the time of maturation of the chloroplasts (Oemüller et al, 1986). Furthermore, the expression of uidA was not detected when transgenic seedlings were grown in presence of Norflurazon. These results correlates the presence of mature chloroplasts with the GUS expression directs by the Lhcb1*2 promoter. We have obtained constructs in which the uidA gene was under the control of deletions of the 5'-flanking region of potato Lhcb1*2. The -690 to +10 flanking region of the Lhcb1*2 is enough to confer organ-specific and phytochrome-regulated expression on the uidA coding sequence.

Trevani, Analía S.. "Factores capaces de condicionar la actividad biológica de los anticuerpos IgG : Acción de las enzimas proteolíticas e impacto de la carga eléctrica" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En la presente Tesis, se estudió la capacidad de factores propios a los entornos inflamatorios e inherentes a los complejos inmunes (CI), de condicionar distintas respuestas biológicas inducidas a consecuencia de la interacción del fragmento Fc de los anticuerpos IgG con sus receptores celulares específicos (RFcg). Respecto a los primeros se evaluó el efecto de dos enzimas proteolíticas de distinta especificidad, pronasa y quimotripsina. Los resultados obtenidos indicaron que estas proteasas incrementan marcadamente la avidez y la funcionalidad del RFcgII expresado por neutrófilos, condicionando la magnitud de las respuestas biológicas que involucran la participación de este receptor. Este efecto, sin embargo, parece ser dependiente de las características del CI empleado como estímulo, puesto que las proteasas aumentaron notablemente las respuestas inducidas por eritrocitos sensibilizados con anticuerpos IgG y por CI solubles, pero no modificaron aquellas inducidas por CI precipitantes. La acción potenciadora de las proteasas parece ser selectiva del RFcgII, pues este efecto no fue observado en otros receptores operativos en neutrófilos. Considerando la existencia de altos niveles de proteasas en reas inflamatorias, es posible que este mecanismo sea relevante in vivo en la regulación de la actividad del RFcgII del neutrófilo humano. En cuanto a los factores inherentes a los CI, se analizó el impacto de la carga eléctrica de los antígenos y anticuerpos que los conforman, sobre su capacidad de inducir respuestas proinflamatorias y trombóticas mediadas por células fagocíticas y plaquetas, respectivamente. La cationización de la fracción IgG de los CI, procedimiento que incrementó sus pI desde 5,8-8,2 hasta 8,0-9,5, aumentó, al menos en un orden de magnitud, su capacidad de inducir funciones dependientes de los RFcg expresados por células fagocíticas tales como la citotoxicidad, la emisión de quimioluminiscencia y la liberación extracelular de elastasa. El efecto potenciador de la cationización fue a£n m s notable empleando plaquetas. Los CI que incluían anticuerpos IgG cationizados fueron capaces de inducir fuertes respuestas de activación de plaquetas lavadas, filtradas o plaquetas suspendidas en plasma, mientras que aquellos formados con componentes nativos fueron incapaces de inducir la activación plaquetaria bajo condiciones experimentales similares. La cationización del componente antigénico de los CI, también incrementó marcadamente su potencia biológica. En conjunto, estos hallazgos indican que la carga eléctrica de los CI constituye una propiedad critica que condiciona su capacidad de inducir la activación celular y sugieren que los anticuerpos y antígenos catiónicos podrían ser relevantes en eventos inflamatorios asociados a enfermedades que cursan con altos niveles de CI circulantes. Durante el transcurso de estos estudios se realizaron observaciones adicionales relacionadas con el desarrollo de procesos inflamatorios agudos. El paradigma corriente asume que las capacidad quimiot ctica de la IgG reside en su habilidad para formar CI e inducir la activación del sistema complemento y la subsecuente producción de péptidos quimiot cticos como el C5a. En la presente Tesis, se observó que los CI son capaces, per se, de estimular la quimiotaxis de neutrófilos a través de su interacción con el RFcgII. Esta actividad quimiot ctica intrínseca de los CI podría ser responsable, al menos en parte, delreclutamiento de neutrófilos observado en sitios inflamatorios de huéspedes deficientes de complemento.

Abstract:
In the current Thesis it was studied the ability of different factors to condition biological functions induced by the interaction of the Fc fragment of IgG antibodies with their cellular specific receptors (FcgR). Both factors belonging to inflammatory focus and IC-intrinsecal factors were evaluated. Among the formers, the effect of two proteolytic enzymes with distinct specificity, pronase and chymotrypsin, was analyzed. The results obtained showed that proteases markedly increase the avidity and functionallity of FcgRII, conditioning the magnitude of the biological responses that involve this receptor. However, this effect appears to be dependent on the characteristics of the IC employed as stimulus judging by the capacity of proteases to increase functions induced by erythrocytes coated with IgG antibodies and soluble IC but not those induced by precipitating IC. The enhancing action of proteases seems to be restricted to FcgRII-dependent functions since proteases did not up-regulate the activity of other receptors expressed by neutrophils. Taking into account the high levels of proteases in inflammatory areas, these findings suggest that a mechanism involving the action of proteolytic enzymes could be relevant for the in vivo regulation of human neutrophil FcgRII activity. Among IC-intrinsecal factors, the impact of electric charge of their antibodies and antigens on their ability to induce proinflammatory and thrombotic responses mediated by phagocytes and platelets was analyzed. Cationization of the IgG fraction of IC, procedure that increased its pI from 5.8-8.2 to 8.0-9.5, enhanced at least by tenfold their ability to induce RFcg-dependent functions by phagocytic cells such as cytotoxicity, chemiluminescence emission and the elastase extracellular release. Noteworthy, it was observed that IC prepared with cationized antibodies were able to trigger platelet activation either in washed platelets, gel-filtered platelets or plasma suspended platelets. By contrast, IC formed with native components did not induce platelet activation under similar experimental conditions. Additional experiments showed that antigen cationization also markedly increses IC biological activity. These findings suggest that the electric charge of IC constitutes a critical property that conditions their ability to induce cellular activation and support a role of cationic antibodies and antigens in the development of inflammatory events associated to certain IC-induced diseases. During the course of these studies, additional observations related to the development of acute inflammatory processes were made. The current paradigm for the mechanism by which IgG induce neutrophil chemotaxis assert that this ability lies on its capacity to form IC and induce complement activation with the subsequent generation of chemotactic peptides such as C5a. In the current Thesis, it was observed that IC are able, per se, to induce neutrophil chemotaxis through their interaction with FcgRII. This intrinsic chemotactic activity of IC may account, at least in part, for the neutrophil recruitment that is observed at inflammatory sites in complement-deficient hosts.

Bassi, Daniel Ernesto. "Biosíntesis de succinoglicano y de compuestos relacionados en Agrobacterium radiobacter" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Agrobacterium radiobacter produce un polisacárido extracelular (EPS), el succinoglicano, cuya unidad repetitiva (U.R.) es un octasacárido constituído por Glc, Gal, piruvato y succinato en relación 7:1:1:1 (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal—4-6-4Pyr (ver en versión PDF). Este polisacárido tiene gran importancia en la industria del petróleo, y el producto comercial, se extrae de la bacteria en estudio debido a que lo produce en cantidades elevadas. En otros sistemas, se ha demostrado que la biosíntesis de EPS se realiza fundamentalmente en cuatro etapas (Ielpi et al, 1993, J. Bacteriol, 175: 2490-2500). En la primera, se sintetizan los nucleótido-azúcares precursores. En una segunda etapa, se forma la U.R. por transferencia secuencial de los distintos monosacáridos que la componen a partir de los respectivos nucleótido-azúcares a un prenil-fosfato aceptor ubicado en la membrana plasmática. Estas reacciones están catalizadas por enzimas específicas, las glicosiltransferasas. Una vez completada la U.R., ésta actúa como monómero en una reacción de polimerización, siendo el producto final el EPS. Es probable que la polimerización y el transporte al exterior celular (cuarta etapa) del polímero sean simultáneos. En este estudio, se describe la biosíntesis "in vitro" del succinoglicano en A. radiobacter. Se obtuvieron y caracterizaron algunos prenil difosfato azúcares intermediarios y el producto final, es decir el succinoglicano sintetizado "in vitro". Para estudiar la posible formación de compuestos relacionados con la síntesis de EPS, se realizaron incubaciones con células permeabilizadas con EDTA (García et al, 1974, Eur. J.Biochem. 43:93-105) en presencia de UDP-Glc y/o UDP-Gal uno de los dos marcado con -Glc. La mezcla de incubación se centrifugó y el precipitado de células se lavó con buffer acuoso y luego se trató con solventes orgánicos, que extraen los lípido-azúcares formados. Los lavados se unieron al sobrenadante y en esta fracción se investigó la presencia de EPS. Al realizar incubaciones con células provenientes de la cepa silvestre en presencia de UDP--Glc, si bien se observó la síntesis de numerosos compuestos, algunos de ellos de propiedades novedosas, ninguno presentó las propiedades esperables para los compuestos intermediarios, es decir, los prenil fosfo-azúcares. Sin embargo, fue posible observar polímero en los lavados acuosos aunque en muy baja cantidad. En caso de incubar en presencia de UDP--Gal se pudieron obtener algunos compuestos de interés, uno de ellos liberaba Gal, pero en cantidades no adecuadas como para ser analizadas. Cuando se incubó en presencia de ambos dadores, uno de ellos radioactivo, se obtuvo menor cantidad de radioactividad en los extractos orgánicos que en el caso de incubar en presencia de un solo nucleótido. Este hecho se atribuyó a la dilución de la marca radioactiva, debido a que la cepa silvestre contiene la UDP-Gal-4-epimerasa, enzima que cataliza la interconversión de UDP-Glc en UDP-Gal. Se buscó, entonces resolver el problema utilizando una mutante, defectiva en la síntesis de esta enzima, de forma tal de poder realizar incubaciones con ambos nucleótidos sin observar el efecto de dilución mencionado anteriormente. En efecto, al utilizar la cepa SGN-1, defectiva en la síntesis de la epimerasa, se pudo lograr la síntesis de los siguientes compuestos: Gal-P-P-prenol, celobiosil- galactosa-P-P-prenol y los prenil difosfato derivados de un octasacárido y de su derivado piruvilado, estrechamente relacionados con la U.R. del succinoglicano. La cantidad de polímero obtenida fue sensiblemente mayor que en el caso de la cepa silvestre. Mediante incubaciones en dos etapas, se demostró también que los prenilfosfo-azúcares analizados eran los precursores del polisacárido. Por otro lado, se estudió el efecto de los dadores de grupos no glicosídicos sobre la síntesis del polímero. El PEP estimula discretamente la formación de polímero, probablemente por un aumento en la piruvilación de la U.R., que es, aparentemente un sustrato mas adecuado para la polimerasa, es decir la enzima o grupo de enzimas que catalizan la polimerización de la U.R. El SuccCo-A ejerce un efecto dual. A una concentración de 0,1 mM estimula en forma notoria la polimerización, mientras que a una concentración diez veces mayor se observó una reducción gradual en dicha estimulación. Finalmente, estos estudios se extendieron a una bacteria estrechamente relacionada, patógena de plantas, Agrobacterium tumefaciens que también produce succinoglicano. En esta cepa, se habían aislado y caracterizado parcialmente varios prenil-fosfo-azúcares, pero no se había logrado su polimerización (Staneloni et al, 1984, J. Gen. Microbiol., 130: 869-879). Con la experiencia lograda en A. radiobacter, se logró obtener succinoglicano "in vitro"también en A. tumefaciens.

Abstract:
Agrobacterium radiobacterium produces an extracellular polysaccharide (EPS), succinoglycan, containig an octasaccaharide repeating unit (R.U.) constituted with Glc, Gal, piruvate and succinate in a 7:1:1:1 molar ratio (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal--4-6-4Pyr. This polysaccharide is widely used in the oil industry, and Agrobacterium radiobacter is regularly employed to produce it because of the good yields reached. As it was demonstrated for other systems, the biosynthesis of the EPS takes place mainly in four stages (Ielpi et al, 1993, J.Bacteriol. 175:2490-2500). In the first one, the donor sugar nucleotides are synthesized. In a second stage, the R.U. is made by the secuential transfer of the different monosaccharides that constitute it, from the proper sugar nucleotides, to a plasmatic membrane bound prenyl phosphate. Once the R.U. is completed, it acts as a monomer in a polymerization reaction, the EPS being the final product. It is likely that polimerization and the transport to the extracellular compartment (fourth stage) are simultaneous. In this study, the "in vitro" biosynthesis of succinoglycan in A. radiobacter is described. Some intermediate prenyl phospho sugars and the final product, the "in vitro" synthesised succinoglycan were obtained. In order to search for the posible formation of compounds related to the synthesis of polysaccharide, incubations with EDTA permeated cells (García et al., 1974, Eur. J. Biochem.43:93-105) in the presence of UDP-Glc and/or UDP-Gal, one of them radioactively labelled, were performed. The reactions were ended by dilution and centrifugation and the cell pellet was washed several times with buffer and then extracted with organic solvents, that dissolve the lipid-sugars. The presence of EPS was investigated in the combined supernatants and washings. When the incubations were done using wild type cells, in the presence of UDP--Glc several lipidic compounds were obtained, some with unusual properties, but none of them behaved as expected for prenyl-phospho-sugars. However, polymer was observed in the aqueous supernatant though in very low amounts. When incubating in the presence of UDP--Gal, it could be found some compounds of our interest, one of them liberating Gal, but in quantities not suitable to be analized. Incubations done in the presence of both nucleotides, one of them radioactively labelled, yielded smaller amounts of radioactivity soluble in organic solvents, probably because of the dilution of the labell, due to the activity of UDP-Gal-4-epimerase, the enzime which catalizes the interconversion of UDP-Glc into UDP-Gal. The idea was then to look for a mutant defective in this enzyme activity to be able to perform incubations in the presence of both sugar nucleotides, one of them labelled, in order to avoid this dilution effect. As expected, the synthesis of compounds with the properties of prenylphosphosugars was achieved when the SGN-1 strain, a mutant not able to synthesise the UDP-Gal-4-epimerase, was used as enzime source. The following compounds were characterized: Gal-P-P-prenol; (cellobiosyl)-galactose-P-P- prenol , and the prenyl diphosphate derivatives of an octasaccharide and of its pyruvilated octasaccharide closely related to the structure of the R.U. of succinoglycan. The amount of radioactive labelled polymer was significatively higher and could be identified as succinoglycan. Performing two steps incubations, it was demonstrated that the prenyl-phospho-sugars were the precursors of the EPS. On the other hand, the effects of the non glycosidic donors on the polymer synthesis was studied. Phosphoenolpyruvate stimulates moderately polymer formation, probably due to the rise in the amounts of the pyruvulated R.U., which is apparently a more adequate sustrate for the polimerase. Succinyl coenzyme A excerts a dual effect. At concentrations of 0,1 mM greatly enhances the polimerization, but with a tenfold increase (1 mM) a reduction in the activation was observed. Finally these studies were extended to the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens, a closely related bacteria that also produces succinoglycan. Enzymatic preparations from this strain allowed the synthesis of several prenyl-phospho sugars, but no polymerization was observed (Staneloni et al, 1984 J. Gen. Microbiol, 130: 869- 879). With the experience acquired with A. radiobacter system, "in vitro" succinoglycan synthesis was also obtained.

Biondi, Ricardo M.. "Aislamiento, purificación y caracterización de la nucleósido difosfato quinasa del hongo patógeno Candida albicans : Comparación con otras especies" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La enzima nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa) es ubicua y cataliza la síntesis de NTPs a partir de sus correspondientes NDPs y un NTP dador (fisiológicamente el ATP). La reacción sigue una cinética de ping-pong con la formación del intermediario de alta energía (P)NDP quinasa. Aparte de su rol fundamental en la síntesis de NTPs, se ha relacionado a esta enzima con a) la activación de proteínas G en la transducción de señales, b) la diferenciación de Drosophila y distintas líneas celulares, c) inhibición de metástasis (nm23), y recientemente ha sido identificada como d) un factor de transcripción. En el presente trabajo se presentan resultados de la purificación y caracterización de la NDP quinasa de Candida albicans, un hongo patógeno oportunista de vertebrados. Se caracterizó la enzima bioquímicamente, en cuanto a su tamaño, al número de subunidades, su punto isoeléctrico, su estabilidad térmica, y la posibilidad de usar distintos NTPs y NDPs como dadores y aceptores de la reacción. A través de dos enfoques experimentales diferentes se demostró que los nucleótidos de guanina y adenina son los mejores aceptores de la reacción (Arch). Biochem. Biophys. (1995), 187-194). Se evaluó a su vez, la capacidad de NDP quinasas de distinto origen de fosforilar a análogos de nucleótidos utilizados en terapias antivirales; para ello, se desarrolló la metodología para medir la actividad NDP quinasa con estos sustratos (J. Biol. Chem. (1996), 271, en prensa). Se estudió la actividad y la presencia de la enzima durante el crecimiento y la morfogénesis del hongo; la actividad específica máxima se encontró durante el crecimiento logarítmico (An. Asoc. Quím. Argent. (1993), 81, 4-5, 359-366). Se realizó un estudio detallado del proceso de autofosforilación de la NDP quinasa, y se encontró que sólo se encuentra autofosforilada en residuos de histidina. La autofosforilación de la enzima también se realizó en extractos crudos de C. albicans y de Escherichia coli. Dado que la NDP quinasa se autofosforila en residuos de histidina como parte de su mecanismo de acción, los ensayos para estudiar la posible regulación de la enzima por fosforilación a través de alguna quinasa necesitan de una metodología que pueda distinguir la fosforilación en histidina de aquella en serina o treonina. Se desarrolló entonces una metodología sobre membranas de Immobilon con el uso de buffers de pH 1 y 14 con el agregado de 5 por ciento metano. Esta metodología se utilizó para estudiar la fosforilación in vivo en C. albicans y en células HeLa en cultivo. Se discuten las posibles implicancias de la fosforilación en serina in vivo.

Abstract:
Nucleoside diphosphate kinase (NDP kinase) is a ubiquitous enzyme catalysing the synthesis of NTPs from its corresponding NDPs using a NTP donor (physiologically ATP). The reaction follows a ping-pong mechanism of catalysis with a (P)NDP kinase high energy intermediate. Apart of its essential role in the synthesis of NTPs, this enzyme has been related to a) G-protein interaction in signal transduction, b) differentiation in Drosophila and different cell lines, c) inhibition of metastasis (nm23), and has recently been identified to d) a transcription factor. In the present work, data are presented on the purification of Candida albicans NDP kianse as well as a biochemical characterization of the enzyme, number and type of subunits, pI, thermal stability and the possibility to use as substrates different NTPs and NDPs. By two different approaches, guanine and adenine di and triphosphates were found to be the better acceptors and donors of the reaction (Arch. Biochem. Biophys. (1995), 187-194). The ability of NDP kinase to phosphorylate different anti-HIV nucleotide analogs was addressed, and a methodology was developed to measure the enzyme activity with these substrates (J. Biol. Chem. (1996), 271, in press). The specific activity of the enzyme during the growth and morphogenesis of C. albicans was studied; the specific activity was found to be maximal during logarithmic growth (An. Asoc. Quím. Argent. (1993), 81, 4-5, 359-366). Using purified enzyme, a detailed study of the pure enzyme autophosphorylation was carried out; the results indicated that only histidine autophosphorylation was found. Autophosphorylation in C. albicans and Escherichia coli crude extracts was also performed. As NDP kinase autophosphorylates in a histidine residue as part of its kinetic mechanism of action, the studies of phosphorylation by other kinases need to discriminate between phosphorylation on serine/threonine and histidine residues. A method on Immobilon membranes using 5 per centum methanol in buffers of pH 1 and 14 is described. This method was used to study the in vivo phosphorylation of the enzyme in C. albicans and in HeLa cells in culture. Possible implications of in vivo NDP kinase serine phosphorylation are discussed.

Herrero, María Belén. "Evidencias sobre la existencia de la enzima óxido nítrico sintasa en el espermatozoide murino y su participación en el proceso de fertilización" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Virtualmente todas las células de mamíferos están bajo la influencia del radical libre denominado óxido nítrico (NO). Las enzimas responsables de la síntesis del NO se conocen como óxido nítrico sintasas (NOS 6 NO-sintasas). En mamíferos, se han clonado tres isoenzimas de la NO-sintasa. Las isoformas neuronal y endotelial son dependientes de Ca++ y se expresan constitutivamente, mientras que la isoforma inducible es Ca++ independiente y se induce en presencia de lipopolisacáridos y citocinas. Todas las isoformas pertenecen a la farnilia de los citocromos P-450, utilizan L-arginina como sustrato, con oxígeno molecular y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato forma reducida (NADPH) como co-sustratos. Las funciones del NO fueron descriptas primeramente en tres sistemas fisiológicos (vascular, nervioso e inmune) y a partir de dicho estudio se fueron descubriendo funciones del NO en otros sistemas como el reproductor, respiratorio y excretor. En reproducción, se vio que el NO induce la erección peniana, estimula al factor liberador de la hormona luteinizante (LH-RH) y modula la síntesis de prostaglandinas uterinas y ováricas durante la luteólisis en la rata. Sin embargo, hasta el momento no se había descripto la participación del NO en el proceso de fertilización. En el presente trabajo se presentan evidencias de la existencia de la enzima NO-sintasa en la gameta masculina murina y su participación en la fertilización in vitro. Mediante ensayos farmacológicos determinamos que la adición de inhibidores específicos de la NO-sintasa (NG-nitro-L-arginina (NO2-arg) ó NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME)) durante el proceso de capacitación in vitro disminuye el porcentaje de ovocitos fertilizados. Esta inhibición es estereoespecífica y depende de la concentración. Dado que el proceso de fertilización se encuentra afectado en presencia de L-NAME y NO2-arg, medimos la motilidad espermática y el patrón de hiperactivación. A los 120 min de incubación, el L-NAME disminuye el porcentaje de espermatozoides mótiles e hiperactivados, mientras que un generador de NO como el nitroprusiato de sodio (NP) acelera estos parámetros de manera concentración dependiente. Considerando que el NO también podía participar en la reacción acrosomal, medimos el efecto del L-NAME sobre espermatozoides reaccionados espontáneamente ó en presencia de un inductor fisiológico como la progesterona. En estos casos, la exocitosis acrosomal también se halla inhibida; la inhibición es estereoespecífica y depende de la concentración. Contrariamente, 0.1 mM de spermine-NONOate (generador de NO) estimula la reacción acrosomal en espermatozoides previamente capacitados a niveles semejantes a los obtenidos con 15 microM de progesterona. Luego de los ensayos farmacológicos, evidenciamos la presencia de la NO-sintasa espermática mediante ensayos inmunológicos. Por inmunofluorescencia indirecta localizamos la NO-sintasa en el acrosoma y en la cola de espermatozoides no capacitados. Durante la capacitación, la fluorescencia desaparece del acrosoma y se mantiene en el flagelo, otorgando a esta enzima un potencial significado fisiológico en el proceso de capacitación y/o de reacción acrosomal. Seguidamente, realizamos ensayos de Western Blot, los cuales nos permitieron demostrar que anticuerpos anti-NOS neuronal, endotelial e inducible reconocen una única fracción proteica de 140 kD bajo condiciones desnaturalizantes y no reductoras en espermatozoides frescos de ratón. Cuando realizamos los experimentos cinéticos, detectamos la presencia de formación de NO, medida como conversión de L-arginina a L-citrulina en espermatozoides intactos y vivos (condiciones in vivo). Los espermatozoides sintetizan NO durante el proceso de capacitación alcanzando un plateau a los 120- 180 min de incubación. Además, la producción de NO depende de la concentración de L-arginina presente en el medio de incubación y es inhibida por L-NAME pero no por aminoguanidina (inhibidor específico para la NO-sintasa de caracter inducible), sugiriendo la existencia de una NO-sintasa espermática de caracter constitutivo. Considerando que en los ensayos farmacológicos evidenciamos la participación de la NO-sintasa del espermatozoide en la exocitosis acrosomal inducida por progesterona, se estudió también la modulación de este esteroide sobre la formación de NO en espermatozoides capacitados. Así, observamos que 15 microM de progesterona estimula directamente la síntesis de NO durante el período ensayado (90-120 min). Basándonos en trabajos realizados en nuestro laboratorio intentamos relacionar al NO con la síntesis de prostaglandinas e hidroxiácidos. Para ello, en primer término, demostramos que los espermatozoides de ratón son capaces de sintetizar PGE2 e hidroxiácido 5-HETE y luego observamos que el NP estimula la síntesis de estos metabolitos en la gameta masculina. Sin embargo, la síntesis basal de prostaglandinas no se ve modificada en presencia de L-NAME. Los resultados de este trabajo evidencian por primera vez la presencia de la NO-sintasa en el espermatozoide de ratón y demuestran su participación en el proceso de fertilización, modulando la motilidad espermática y la exocitosis acrosomal. Podemos afirmar entonces, que el NO sintetizado por la NO-sintasa espermática, es necesario para que el espermatozoide pueda expresar su plena capacidad fertilizante in vitro.

Abstract:
Mammalian cells are all virtually exposed to the action of nitric oxide (NO). Nitric oxide synthases (NOS or NO-synthases) are the enzymes that catalyze the production of NO. Three distinct isoforms of NO-synthase have been cloned in mammals. The neuronal and the endothelial isoforms are Ca++-dependenat nd are constitutively expressed while the inducible isoform does not depend on Ca"' and is induced with bacterial products and cytokines. NO actions have been previously described in the vascular, the nervous and the immune systems. However, many other fbnctions are being shown in the reproductive, the respiratory and the urinary systems. In the reproductive field, it was found that NO induces penis erection, stimulates LH-RH factor and modulates prostaglandins synthesis in the rat uterus. Nevertheless, till now it was not described the role of NO in the fertilization process. Our results show that NO-synthase inhibitors (NO-nitro-L-arginina (NO,-arg) 6 No-nitro- L--arginina meti1 kster (L-NAME)) added at the onset of capacitation reduce the percentage of f e e d oocytes. This inhibition is stereospecific and depends on the concentration. Moreover, we demonstrate that L-NAME reduces the percentage of motile and hyperactivated spermatozoa at 120 min of incubation, while a nitric oxide donor named sodium nitroprusside (NP) accelerates hyperactivation in a concentration manner. We were then interested in searching the effect of NO-syntahse inhibitors on the spontaneous and progesterone-induced acrosome reaction. In these cases, the acrosomal exocytosis is inhibited, the inhibition is stereospecific and depends on the concentration. In contrast, 0.1 mM spermine-NONOate (NO donor) stimulates the progesterone-induced acrosome reaction. Then, we evidence the presence of sperm NO-synthase by immunological assays. Thus, we localized NO-synthase in the acrosome and tail of non capacitated mouse spermatozoa by the immunofluorescence technique. During capacitation the fluorescence disappears in the acrosome and it persists in the tail. Besides, under denaturing and non reducing conditions, Western Blot analysis of solubilized sperm proteins reveal a unique band of Mr=140 kD with the three NO-synthase antisera tested (neuronal, endothelial and inducible isoforms). By means of kinetics assays, we detect the production of NO by intact spermatozoa (in vivo conditions). During the capacitation period (120 min), lo7 spermatozoa are capable to synthesize 7*2 picomoles of NO. Besides, NO formation depends on the incubation periodand on the concentration of L-arginine present in the incubation medium. Different concentrations of L-NAME but not aminoguanidine, inhibit L-citrulline formation, suggesting that sperm NO-synthase is a constitutive isoform. In the pharmacological assays, we demonstrated that NO-synthase may be involved in the progesterone-induced acrosome reaction; so we studied the effect of this steroid on the production of NO by capacitated sperm. In this set of experiments we show that 15 pM progesterone stimulates NO formation in spermatozoa. Based on studies done in our laboratory, we finally intend to relate NO to prostaglandins and hydroxyacids synthesis. We first demonstrate that mouse spermatozoa synthesize PGE, and 5-HETE and that these synthesis are stimulated by NP. However, L-NAME does not inhibit these basal synthesis. The results presented here evidence for the first time the presence of NO-synthase in the murine male gamete and the role of this enzyme in the fertilization process: sperm NO-synthase modulates sperm motility and the acrosomal exocytosis. So, we can say that NO, synthesized by sperm NO-synthase is necessary for spermatozoa to express its full fertilizing ability.

Mladovan, Alejandro G.. "Modulación de oncogenes en cancer mamario humano" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El cáncer de mama es el tumor más frecuente en el sexo femenino afectando en la actualidad a una de cada diez mujeres. La complejidad de esta patología y el escaso conocimiento acerca de su etiología y desarrollo dificultan el entendimiento fisiopatológico de dicho desorden y, por consiguiente, la prevención y el tratamiento. Los estudios diferenciales sobre la proliferación y los mecanismos moleculares involucrados en los procesos de duplicación celular en células normales y neoplásicas aportan nuevas ideas para la comprensión del desarrollo de esta enfermedad. En tal sentido, los trabajos realizados en la presente Tesis tuvieron como principal objetivo estudiar diversos par metros involucrados en la proliferación de células mamarias humanas bajo la acción de hormonas peptídicas y de agentes que actúan como promotores tumorales. De la amplia gama de señales moleculares se analizaron especialmente aquellas relacionadas con la expresión de proto-oncogenes nucleares y la activación de ciertas kinasas que participan en la vía de señales que regulan la expresión de dichos genes. Estos estudios se realizaron utilizando como modelo de trabajo diversas líneas celulares, principalmente la línea no tumorigénica establecida a partir de tejido mamario humano normal, MCF-10A, su contraparte transformada con el oncogén H-ras, MCF-10T y líneas neoplásicas de mama humana ampliamente descriptas en la literatura como MCF-7, MDA-453 y SKBR3. La caracterización celular y molecular de MCF-10T evidenció la presencia de un gen H-ras mutado en el codón 12 y la sobre-expresión de dicho gen. Si bien se comprobó que MCF-10T es capaz de proliferar en forma independiente del anclaje, su duplicación es inhibida por la alta densidad celular siendo incapaz de proliferar en forma estratificada. Las células provenientes de tejido normal evidenciaron una tasa proliferativa mayor que las de origen neoplásico en condiciones de cultivo favorable, mientras que células no transformadas como las MCF-10A no sobreviven en ausencia de nutrientes. De los agentes que promueven la proliferación en células MCF-10, el EGF ejerció un potente efecto mitogénico seguido por el IGF-I y la insulina a altas dosis. Los estudios determinaron que en estas células el EGF y el PMA, pero no la insulina o el IGF-I, son capaces de aumentar los niveles de ARNm del gen c-fos. Los estudios demostraron que el EGF y el PMA inducen la expresión de los proto-oncogenes c-fos, c-jun, fosB y junB con cinéticas particulares para cada gen no mostrando diferencias significativas entre las células MCF-10A y MCF-10T, siendo válida esta observación para los dos agentes analizados. Otros genes como c-myc, junD o fra1, evidenciaron escasa variación en sus niveles de transcriptos ante dichos estímulos. Si bien ambas líneas exhibieron una dosis dependencia del EGF en cuanto a su proliferación, inducción de la síntesis de ADN y expresión de proto-oncogenes nucleares, la línea transformada MCF-10T manifestó un menor requerimiento de nutrientes y una mayor sensibilidad a otros mitógenos comparado con MCF-10A, posiblemente debido a una mayor proliferación autócrina. La combinación del EGF con otros agentes estudiados promueve un mayor efecto proliferativo que el ejercido por cada uno de ellos individualmente sin afectar los niveles de transcriptos de proto-oncogenes nucleares inducidos por el EGF. Se comprobó que el EGF ejerce su acción inductora sobre los proto-oncogenes nucleares a través de la autofosforilación de su receptor específico con la subsecuente activación de MAP kinasas involucradas en la cascada de señales mitogénicas. Se observó además, que las diversas líneas celulares analizadas difieren cuantitativamente en los tipos de MAP kinasas que expresan según su origen normal o neoplásico. Esto establece un hecho relevante por cuanto podría inferirse que tales especies constituyen marcadores específicos de desórdenes asociados al tipo de neoplasia analizado. Si bien la acción de agentes que inducen la formación del segundo mensajero AMPc resultan inhibitorios de la proliferación en ciertas líneas celulares de mama, en ningún caso estos agentes, o drogas que mimetizan la acción del AMPc, bloquearon la activación de MAP kinasas mediada por el EGF como se ha descripto en otros sistemas celulares. Por último, el gen c-myc, cuyos transcriptos se encuentran elevados en las células MCF-10A y MCF-10T durante su crecimiento exponencial o en estadio de aquiescencia, no solo es regulado por agentes mitogénicos como el EGF, sino también por las condiciones extracelulares (densidad celular y factores de crecimiento autócrinos) y por agentes inhibitorios de la proliferación como el TGFb1. Por lo tanto se ha demostrado que la transformación in vitro de células de mama normales por el oncogén H-ras, a diferencia de lo que ocurre en otros modelos celulares, altera en forma pleiotrópica diversas funciones celulares relacionadas con el proceso neoplásico, como el crecimiento en ausencia de sustrato de anclaje, requerimiento de nutrientes y diversos cambios morfológicos, sin afectar ciertos mecanismos involucrados en la respuesta primaria que conducen a la duplicación celular como la inducción de proto-oncogenes nucleares o la activación de la vía de MAP kinasas. Asimismo, se deduce que el proceso neoplásico difícilmente pueda ser atribuido a la alteración de un solo gen; resulta más adecuado sugerir que tales desórdenes son consecuencia de un número mayor de fenómenos que actúan en forma coordinada para desarrollar todo su potencial neoplásico. Es mi más firme deseo que los estudios detallados en esta Tesis puedan contribuir de alguna forma al entendimiento de la patogenia y el desarrollo de las enfermedades neoplásicas que afectan al ser humano.

Abstract:
Breast cancer is the most frequent female tumor affecting at present one out of ten women. The complexity of this pathology and our limited knowledge of its etiology and biology hinder the understanding, prevention and treatment of the disease. Studies on the proliferation and molecular mechanisms involved in cell division from both normal and neoplastic cell lines would contribute with new insights in the the development of this affliction. In this sense, the aim of this Thesis was to study several parameters involved in the proliferation of human mammary cells exposed in culture to peptide hormones and tumor promoters. Among the broad range of molecular signals, those involved with the expression of proto-oncogenes and related kinases that regulates this process, were analyzed. These studies were carried out on several cell lines, namely MCF-10A, established from normal human breast tissue; MCF-10T, the same line transformed with an H-ras oncogene and several well-known neoplastic human breast cell lines: MCF-7, MDA-453 and SKBR3. The cellular and molecular characterization of MCF-10T showed the presence of the H-ras gene mutated in codon 12 and its overexpression. Although MCF-10T is capable of anchorage-independent growth, its duplication is inhibited by high cell density and cannot proliferate in a stratified fashion. Cells from normal tissue displayed a higher growth rate than those from neoplastic sources in a suitable culture condition, but non-tumorigenic cells, as MCF-10A cannot survive in the absence of appropriate growth factors. From the proliferating agents studied on MCF-10A and MCF-10T cells, EGF exerted the most potent mitogenic effect, followed by IGF-I and insulin at high dose. Both EGF and PMA, but neither IGF-I nor insulin, were able to modify c-fos mRNA levels. Studies demonstrated that EGF and PMA induced the expression of c-fos, c-jun, fosB and junB with a particular kinetic for each gene without any significant differences between MCF-10A and MCF-10T nor among EGF and PMA. Other genes, such as c-myc, junD or fra-1 showed only a poor variation in its transcript levels with those stimuli. Although growth rate, DNA synthesis and proto-oncogene induction were dependent on the EGF concentration in both lines, the transformed MCF-10T cell line exhibited a lower requirement for nutrients and an increased sensitivity to other mitogens, probably due to an autocrine proliferation. The association of EGF with other agents increased the proliferative effect exerted by each agent alone, without affecting the proto-oncogene mRNA levels induced by EGF. EGF exerts its action on nuclear proto-oncogenes through autophosphorylation of its specific receptor with the subsequent activation of MAP kinases. Each cell line expressed different classes of MAP kinases, according to their normal or neoplastic origin. This constitutes a significant finding, as it could be inferred that such species make up specific markers associated to the type of neoplasia analyzed. Though cAMP inducing agents inhibit proliferation of certain mammary cell lines, this action is not mediated through the control of MAP kinase activity as it was widely described in other systems. c-myc gene, whose transcripts are elevated in both proliferating and quiescent MCF-10 cells, is regulated by mitogens such as EGF and also by extracellular conditions (cellular density and autocrine factors) and TGF(1, an inhibitor of cell growth. Thus, in vitro transformation of breast cells with an activated H-ras gene alters in a pleiotropic mode several cellular functions associated to the neoplastic process, such as independent-anchorage growth, nutrient requirement and morphological changes. However, it does not affect those mechanisms involved in the early responses which trigger cell duplication, such as the induction of nuclear proto-oncogenes or activation of MAP kinases. Therefore, these results suggest that the neoplastic process cannot be attributed to the alteration of only one gene; instead, it would be more adequate to consider this disease as a consequence several events acting in coordination to fulfill their neoplastic potential. I hope the studies analyzed in this Thesis could contribute in part to the understanding of the pathogenesis and development of the neoplastic disease affecting the human being.

Dada, Laura Andrea. "Mecanismos de transducción de receptores de hormonas proteicas : Relación entre sistemas adenilato ciclasa dependientes e independientes" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Srebrow, Anabella. "Modulación de la expresión de genes homeóticos en el desarrollo de la glándula mamaria murina" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los genes homeóticos codifican para reguladores transcripcionales involucrados en la formación de patrones y las decisiones de destino celular durante la embriogénesis. Recientemente, ha despertado gran interés la función de dichos genes en tejidos adultos en continuo desarrollo así como también en procesos tumorigénicos. La mayor parte del crecimiento y morfogénesis de la glándula mamaria ocurre durante la vida subadulta y adulta del animal y ciertos estadios de la glándula postnatal presentan características de tipo embrionarias. Regulación de fomación de patrones, diferenciación celular e interacciones epitelio-estroma tienen lugar una vez finalizada la embriogénesis y reocurren durante cada ciclo de preñez, lactancia e involución. Debido a que la matriz extracelular influencia el desarrollo funcional y morfogenético de la glándula mamaria, investigamos si las señales provenientes de dicha matriz podrían estar involucradas en la expresión y regulación de genes homeóticos. Mediante una estrategia basada en reacciones en cadena de polimerasa, identificamos la expresión de 5 genes homeóticos pertenecientes a dos "clusters" del complejo Hox, en células mamarias murinas en cultivo. Un gen de cada uno de estos "clusters", Hoxa-1 y Hoxb-7, fue elegido para una caracterización más profunda. Encontramos que Hoxb-7 se expresa tanto en cultivo como in situ, donde su expresión es regulada a lo largo del desarrollo glandular y se localiza en el epitelio mamario. Hoxa-1 no se expresa en ningún estadio del desarrollo de la glándula murina normal pero sí se expresa en algunos tumores mamarios y en células mamarias funcionales, no malignas, cultivadas sobre plástico de cultivo. La expresión de ambos genes es reprimida cuando las células son cultivadas sobre una membrana basal reconstituída. Mientras que la regulación negativa de Hoxb-7 requiere estrictamente la presencia de membrana basal y cierta conformación celular, la de Hoxa-1 se logra mediante el cultivo de las células sobre un sustrato inerte antiadhesivo que permite una reorganización del citoesqueleto y concomitantemente cambios de morfología celular. En celulas tumorales, la expresión de Hoxb-7 es prácticamente indetectable y la expresión de Hoxa-1 no es regulada por ninguno de estos factores microambientales.

Abstract:
Homeobox-containing genes encode transcriptional regulators involved in cell fate and pattern formation during embryogenesis. Recently, their role in continuously developing adult tissues as well as in tumorigenesis has also become a subject of interest. The mammary gland undergoes most of its growth and morphogenesis in the subadult and adult animal and certain stages of the postnatal gland exhibit embryonic-like features. Regulation of pattern formation, cell differentiation and epithelial-stromal interactions take place after completion of embryogenesis and reoccur during each cycle of pregnancy, lactation and involution. Because the extracellular matrix is known to influence both functional and morphological development of the mammary gland, we asked whether the extracellular matrix signaling could be involved in the expression of homeobox genes. Using a polymerase chain reaction based-strategy, five members of two Hox gene clusters were shown to be expressed in cultured mouse mammary cells. One gene from each cluster, Hoxa-1 and Hoxb-7, was chosen for further analysis. We found that Hoxb-7 is expressed both in culture and in sihr, where it is developmentally regulated and localized to the mammary epithelium. Hoxa-1 is not expressed at any stage of the normal mammary gland but was shown to be expressed in some mammary tumors as well as in non-malignant and functional mammary cells on tissue culture plastic. The expression of both genes was suppressed when cells were cultured on a reconstituted basement membrane. Whereas Hoxb-7 strictly required the basement membrane and a certain cellular conformation for suppression, Hoxa-1 down-regulation could be mimicked by culturing the cells on an inert substratum (polyHEMA) that allows reorganization of actin cytoskeleton and thus changes in cell shape. In malignant cells the expression of Hoxb-7 was practically undetectable and Hoxa-1 expression was not responsive to any of these microenvironmental regulators.

Mazzadi, Alejandro Noel. "Evolución mecánico-energética del músculo cardíaco durante la isquemia y la reperfusión" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Se estudió la producción de calor (Ht) y evolución mecánica en ventrículos de rata estimulados eléctricamente a 1.5 Hz, perfundidos según la Técnica de Langendorff y sometidos a 45 min de isquemia (Isq) y 45 min de reperfusión (Rep). La influencia de la temperatura se evaluó a 25, 30 y 35 ºC. Los 4 componentes diferenciables del calor activo (H1, H2, H3 y H4)(Ponce-Hornos y col, Pflugers Arch-Eur J Physiol 429; 1995) se analizaron en contracciones aisladas en los 10 primeros min de Isch. Los músculos se montaron en un calorímetro (Ponce-Hornos y col, Am. J. of Physiol. 243; 1982) que permitió medir Ht y simultáneamente la presión desarrollada en condiciones isovolúmicas (P) y la presión de reposo (PR). A partir de los estudios realizados fue posible descartar procesos que fueron postulados como responsables de la falla cardíaca isquémica e involucrar en medida apropiada a otros. Entre los primeros, fue posible descartar la caída del pH y los cambios en la energía libre del ATP como responsables en etapas muy tempranas. También pudo disociarse la caída de la P respecto de la desaparición de un componente mitocondrial Ca++ dependiente (H4). Entre los segundos, se identificó un evento energético durante la Isch de alto valor predictivo de la disfunción mecánica y/o daño durante la Rep. También, los experimentos dan apoyo a los cambios en la PR como responsables de la abrupta caída en la P al inicio de la Isch. Además, fue posible vincular a la interacción actomiosínica con la mayor fracción de liberación de energía en el período inicial de la Rep. También se asoció la baja recuperación mecánica durante la Rep con altos valores relativos de calor independiente de tensión.

Abstract:
Total heat production and mechanical evolution were studied in electrically stimulated (1.5 Hz) rat’s ventricles perfused by Langendorff technique and subjected to ischemia (isch) and reperfusion (Rep) (45 min both). Temperature effect was evaluated at 25, 30 and 35 °C. For identified active heat components from a single contraction (H1 to H4)(Ponce-Hornos et al, Pflugers Arch-Eur J Physiol 429; 1995) were analyzed during the first 10 min of ischemia. Resting (RP) and developed pressure (P) and total heat production (Ht) were simultaneously measure on isovolumetric hearts placed in a calorimeter (Ponce-Hornos et al, Am J of Physiol 243; 1982). From these results a fall in pH, as well a changes in ATP free energy, were discarded as possible causes of cardiac failure after early ischemia. Also, the fall in developed tension was dissociated from the Ca-dependent mitochondrial component (H4). An energetic event was identified during the ischemic phase which was highly related with the mechanical failure during reperfusion. And the other hand, these experiments suggest that changes in resting tension are responsible for the brisky fall in the developed pressure at the begining of the ischemia. Even more, the main fraction of released energy during the begining of reperfusion was associated to acto-myosin interaction. Finally, the small mechanical recovery during reperfusion was related with high relative values of tension independent heat.

Ceriani, María Carolina. "Metabolismo de poliaminas en Crithidia fasciculata : Caracterización, clonado y secuenciación de la enzima ODC" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En este trabajo, se han caracterizado distintos aspectos del metabolismo de poliaminas en el parásito tripanosomátido Crithidia fasciculata, poniendo especial énfasis en la enzima ornitina decarboxilasa (ODC), que cataliza el primer paso en la síntesis de estas sustancias. El transporte de poliaminas al interior del parásito es muy bajo, y solo se ve aumentado cuando se expone a los cultivos a un inhibidor de la ODC, como es el difluorometilornitina (DFMO). Este dato indicaría que en condiciones normales, la maquinaria biosintética del parásito es suficiente para satisfacer sus requerimientos, pero que al someter a C.fasciculata a un ayuno de poliaminas por bloqueo de su biosíntesis se produce una marcada inducción de la entrada de estas sustancias desde el medio externo. La enzima fue ampliamente caracterizada dsde el punto de vista bioquímico y molecular. Se clonó y secuenció en su totalidad, determinandose a partir de estos datos su PM y las zonas que podrían ser importantes desde el punto de vista de su regulación "in vivo". Por último se estudió la resistencia a DFMO del parásito, y se determinó que este fenómeno no produce diferencias sustanciales en la expresión del gen de ODC. Todas estas observaciones nos llevan a pensar que la enzima ODC de este parásito tiene propiedades que la hacen distintiva entre las estudiadas hasta el momento en otras células, y abren un nuevo capítulo en el estudio general de la estabilidad enzimática.

Abstract:
In this work, different aspects of polyamine metabolism in the trypanosomatid parasite Crithidia fasciculata have been characterized, with special emphasis in ornithine decarboxilase (ODC), which catalyses the first step in the biosynthesis of these substances. Polyamine transport inside the parasite is very low, but it is strongly increased when the cultures are exposed to an ODC inhibitors, like difluoromethilornithine (DFMO). This data could indicate that in normal conditions, the biosynthetic machinery of the parasite is enough to satisfy their requirements, but when C. fasciculata suffers polyamine starvation, by blocking their biosynthesis, there is a great induction of the transport of these substances from the external medium. The enzyme was characterized from the biochemical and molecular point of view. It was cloned and sequenced, and the molecular weight , and some regions that could be considered important for its " in vivo" regulation were determined from the sequence. Last, we studied the resistance to DFMO, and we determined that this fenomena does not produce substancial differences in the expression of the ODC gene. Taken all together, these observations allow us to state that the ODC enzyme from this parasite has propertiers that make it different from the other studied up to this moment, opening a new chaper in the general study of enzyme stability.

Zelada, Alicia M.. "Rol del AMPc en el dimorfismo del hongo C. Albicans : Efecto del glucagon: Caracterización de la quinasa de proteínas dependiente de AMPc y purificación de sus subunidades" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Mallo, Gustavo V.. "Estudio de genes expresados diferencialmente en el cáncer de colon humano" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Kornisiuk, Edgar E.. "Toxinas proteicas del veneno de serpientes del género Dendroaspis que reconocen receptores colinérgicos muscarínicos" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Hace diez años se reportó la existencia de dos proteínas, MTx1 y MTx2, del veneno de la mamba verde oriental (Dendroaspis angusticeps) que inhibieron la unión de ligandos muscarínicos en cerebro de rata. Actualmente se han aislado más de diez toxinas muscarínicas (MTxs) de la mamba verde oriental, la mamba negra (D. polylepis) y la mamba verde occidental (D. viridis). Estas toxinas poseen 65-66 aminoácidos, con cuatro puentes disulfirro que les confieren una estructura de "tres dedos", tal como las α-neurotoxinas (bloqueantes de receptores nicotínicos), las dendrotoxinas (bloqueantes de canales de K+) y las fasciculinas (inhibidoras de la acetilcolinesterasa). Existen cinco subtipos de receptores colinérgicos muscarínicos (m1-m5), aunque sólo pueden discriminarse dificilmente cuatro subtipos farmacológicos (M1-M4) por agentes poco selectivos, que no pemiiten una clasificación confiable y, en consecuencia, una identificación clara. Nuestros experimentos de unión especifica en tejidos nativos pemiitieron sugerir que ambas toxinas, MTxl y MTx2, se unen selectivamente al subtipo farmacológico M1 de receptor muscarínico. Luego demostramos que ambas toxinas presentan alta afinidad y selectividad por los receptores muscarínicos humanos clonados m1 y m4, con muy bajas afinidades relativas por los otros. Estos resultados se confirmaron por experimentos de unión específica en diferentes tejidos centrales y periféricos de rata y conejo; se demostró una unión de alta afinidad en el hipocampo, rico en receptores m1 y m4, y en el estriado, rico en m4, pero no se observó interacción en páncreas, rico en m3, ni en auricula, rica en m2. El patrón de selectividad de MTxl fue m1 ≈ m4 >> m5 > m3, m2, siendo MTxl más potente que MTx2, pero con menor capacidad discriminativa entre m1 y m4. Tanto MTxl como MTx2 se comportaron como agonistas muscarínicos, facilitando la consolidación de la memoria cuando se inyectaron en el hipocampo de ratas entrenadas en una tarea de evitación inhibitoria. En el conducto deferente de conejo las toxinas actuaron como McN-A 343 y CPCP, agonistas relativamente selectivos por el receptor M1, reduciendo las contracciones fásicas del músculo liso, aunque los efectos de las toxinas no resultaron reversibles. En la misma preparación, las MTxs parecieron tener un efecto sobre los receptores adrenérgicos, que fue reversible. Además, MTxl y MTx2 resultaron capaces de desplazar la unión de ³H-prazosin, un antagonista α-adrenérgico, a membranas de corteza cerebral y conducto deferente de rata y conejo. La unión de MTxl y MTx2 a los receptores muscarínicos resultó irreversible, mientras que a los adrenérgicos resultó reversible. Recientemente hemos aislado dos fracciones proteicas (7000-8000 Da) del veneno de D. viridis que parecen ser ligandos potentes y específicos para subtipos de receptores muscarínicos. Una de ellas, DvMT4, mostró selectividad por el subtipo m4, mientras que otra, DvMT3-4, exhibió selectividad por los subtipos m3 y m4. Dada la carencia de agentes muscarínicos selectivos, estas MTxs resultan muy útiles para localizar y mapear subtipos muscarínicos en el sistema nervioso central, para caracterizados y estudiar sus funciones en órgano aislado o in vivo. La familia de las Msz ha ido creciendo rápidamente y parecen ser ligandos selectivos extremadamente promisorios para el estudio del rol y la distribución de los subtipos de receptores muscarínicos. La comparación de las secuencias permitió definir importantes residuos y regiones de las toxinas, probablemente responsables de su selectividad y acción agonista/antagonista. Esto podría llevar al desarrollo de nuevos ligandos muscarínicos aún más selectivos, tal vez más apropiados como agentes terapéuticos.

Abstract:
Ten years ago, two proteins from the venom of the Eastern green mamba snake (Dendroaspis angusticeps), MTxl and MTx2, which inhibited the binding of muscarinic ligands to rat brain, were reported. Actually, more than ten muscarinic toxins (Msz) have been isolated from Eastern green mamba, black mamba (D. polylepis) and Western green mamba (D. viridis). All these toxins have 65-66 aminoacids, with four disulphide bonds that confer a “three fingered” structure, shared by α-neurotoxins (nicotinic receptor blockers), dendrotoxins (K+ channel blockers) and fasciculins (acetylcholinesterase inhibitors). There are five muscarinic acetylcholine receptor subtypes (m1-m5), although only four pharmacological subtypes (M1-M4) are hardly discriminated by poorly selective agents, not enough to enable a reliable classification and a defined identification. From radioligand binding experiments in native tissues we have suggested that both toxins, MTxl and MTx2, bound selectively to M1 pharmacological subtype of muscarinic receptor. Then, we demonstrated that both toxins have high affinity and selectivity for m1 and m4 cloned human muscarinic receptors, with rather low relative affinity for the others. These results were confirmed by binding experiments in different central and peripheral tissues from rat and rabbit. High affinity binding was found in the hippocampus, rich in m1 and m4 receptors, and striatum, rich in m4, but no interaction was found in pancreas, rich in m3, nor in atria, rich in m2.The pattern of selectivity of MTxl was m1 ≈ m4 >> m5 > m3, m2, being MTxl more potent than MTx2, but less discriminative between m1 and m4. Both MTxl and MTx2 behaved as muscarinic agonists when infused into the hippocampus of rats trained in an inhibitory avoidance task, facilitating memory consolidation. On rabbit vas deferens the toxins acted as the relatively M1 selective agonists McN-A 343 and CPCP in reducing the twitch response of the smooth muscle, but the effects of toxins were not reversible. In the same preparation, MTxs seemed to have an effect on adrenergic receptors. Then it was shown that MTxl and MTx2 were able to displace ³H-prazosin binding, an α-adrenergic antagonist, to rat and rabbit cerebral cortex and vas deferens membranes. However, MTxl and MTx2 binding to muscarinic receptors appear irreversible, while it was reversible to adrenergic receptors. Recently, we have isolated two protein fractions (7000-8000 Da) from D. viridis venom that appear to be potent and specific ligands for subtypes of muscarinic receptors. One of them, DvMT4, showed selectivity for m4 subtype, while the other, DvMT3-4, exhibited selectivities for both m3 and m4 subtypes. Due to the lack of selective muscarinic agents, MTxs are useful to localise and to map muscarinic receptor subtypes in the central nervous system, to characterise them and to study their functions either in isolated organs or in vivo. The MTx family has been rapidly growing up and they appear as extremely promising selective ligands to study the role and distribution of muscarinic receptor subtypes. The comparison of sequences allowed to define important residues or regions in the toxins, putatively responsible of their selectivity and agonist/antagonist action. This would lead to the development of new more selective muscarinic ligands, that would likely be more appropriate as therapeutic agents.

Loaiza Pérez, Andrea Irene. "Estudios del mecanismo molecular de acción del hexaclorobenceno sobre la expresión del gen de la enzima málica citosólica hepatica" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El hexaclorobenceno (HCB) es un tóxico ambiental ampliamente distribuido en la biosfera. la exposición crónica de animales de laboratorio al HCB produce importantes efectos biológicos tales como desencadenamiento de porfiria, inducción de enzimas microsomales hepáticas, disfunciones tiroideas, inmunosupresión y carcinogénesis. Trabajos realizados en nuestro laboratorio habían demostrado que el HCB incrementa la actividad de enzimas lipogénicas hepáticas reguladas por hormonas tiroideas (HT) tales como la enzima málica (EM). En este trabajo hemos demostrado que el HCB provoca un incremento en los niveles de RNAm de EM hepática, siendo este efecto a nivel transcripcional. Estudios de los elementos en cis y en trans que median la respuesta descripta revelaron que el pesticida provoca la inducción de un complejo proteico sobre el elemento de respuesta a HT (TRE) presente en el promotor de EM, el cual presenta un 64% de homología con el elemento de respuesta a xenobióticos (XRE). RT3 no está involucrado en forma directa en dicha inducción aunque su presencia seria necesaria para dicha estimulación. Otros factores de trancripción tales como Ahr o factores de la familia "fork head" formarían parte del complejo inducido.

Abstract:
Hexachlorobenzene (HCB) is a widespread environmental pollutant. Chronical exposure of laboratory animals to HCB causcs a number of biological effects such as triggering porphyria, microsomal enzyme induction, thyroid dysfunction, inmunosupression and carcinogenesis. Previous data of our laboratory have demonstrated that HCB increases the activity of thyroid-responsive lipogenic enzymes such as malic enzyme(ME).In this work we have demonstrated that HCB increases ME mRNA levels as a consequence of stimulation of the transcription process. We have studied cis and trans elements that mediate that phenomena. Our data reveal that HCB induces protein/DNA complexes formed on TRE of ME promoter, that has a 64% of homology with consensus xenobiotic response element (XRE). RT3 would not be involved directly in that regulation but its presence would be necessary. Other transcription factors such as Ahr or fork head family members could participate in the HCB-induced complex formed on TRE.

Chianelli, Mónica Silvia. "Sistemas de transporte de aminoácidos neutros en Saccharomyces cerevisiae, cepas silvestres y mutantes transporte-defectivas" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Evidencias cinéticas y genéticas muestran que en Saccharomyces cerevisiae, la incorporación de los aminoácidos de cadena ramificada L-leucina, L-isoleucina y L-valina es mediada por al menos tres sistemas funcionalmente distintos: la permeasa general de aminoácidos GAP1 (inactiva en presencia de iones amonio) y dos sistemas de transporte más específicos S1 y S2, previamente descriptos para el transporte de L-Leucina. En celulas silvestres cultivadas en medio conteniendo L-prolina, cada uno de los aminoácidos de cadena ramificada exhibe un solo sistema de transporte de alta afinidad y muy alta capacidad. Una mutante gap1 muestra dos sistemas de transporte para Leucina con valores de KT y Jmáx similares a aquellos descriptos previamente como S1 y S2, y un solo sistema de transporte de baja afinidad- alta capacidad para isoleucina o valina. Una cepa mutante defectiva en los sistemas S1 y S2 que transportan Leucina fue aislada a partir de la parental ya deficiente en la permeasa general de amingácidos, GAP1. La mutante fue seleccionada como una cepa espontánea resistente a triflúorleucina (TFL). Esta mutante fue cruzada con una cepa testigo gap1, y el análisis de tetradas indicó que la resistencia completa a TFL dependió de la presencia de al menos dos genes mutantes no ligados, denominados let (leucine transport). La mutación let1 inactiva completamente el sistema de transporte de Leucina de alta afinidad-baja capacidad definido cinéticamente como S1. Aunque la mutación let2 causó una marcada disminución en la Jmax del sistema S2 de baja afinidad, el transporte residual de Leucina en la mutante gap1let1let2 tuvo el mismo KT que el de la cepa parental gap1LET1LET2. Resultados similares se obtuvieron para los únicos sistemas de transporte de isoleucina o valina. La mutante gap1let1let2 exhibió una marcada disminución en el crecimiento sobre medio minimo conteniendo Leucina, isoleucina o valina como únicas fuentes de nitrógeno. Además, la asimilación de metionina, fenilalanina, serina, treonina y norleucina estuvo impedida severamente, mientras los aminoácidos básicos y ácidos sostuvieron un crecimiento normal. Esto indica que al menos una de las permeasas de Leucina tiene una considerablemente amplia pero aún limitada especificidad. La reversión del gen gap1 restauró el transporte de los aminoácidos de cadena ramificada. La cepa revertante fue sensible a TFL cuando creció en prolina, pero resistente cuando amonio fue la fuente de nitrógeno. La segregante (sensible a TFL) gap1let2 exhibió para cada uno de los aminoácidos de cadena ramificada, solamente un sistema de transporte de alta afinidad-baja capacidad. Esta cepa mostró parámetros cinéticos para el transporte de Leucina muy similares a aquellos caracterizados para el sistema S1 en la cepa gap1. Cada uno de los sistemas de transporte de alta afinidad de los aminoácidos de cadena ramificada es inhibido competitivamente por los otros dos aminoácidos de cadena ramificada. Además, metionina, norleucina y TFL actúan como inhibidores competitivos del transporte de Leucina por el sistema de alta afinidad. En la mutante gap1let2 la deficiencia en la actividad de S2 resulta en la perdida de la capacidad de crecer significativamente en medios de cultivo conteniendo treonina, serina y norleucina como únicas fuentes de nitrógeno y un crecimiento reducido sobre los aminoácidos de cadena ramificada individuales, metionina y fenilalanina. Por lo tanto, el gen LET1 codifica la permeasa de L-aminoácidos de cadena ramificada de alta afinidad-baja capacidad S1, y posiblemente transporte también metionina y -fenilalanina. La permeasa LET1 (St) es primariamente responsable de la acumulación intracelular de TFL a niveles tóxicos, porque este sistema no es detectable en la mutante resistente a TFL gap1let1let2. En contraste, la segregante gap1/eN exhibió para cada uno de los aminoácidos de cadena ramificada solamente un sistema de transporte de baja afinidad- alta capacidad. Esta cepa mostró para el transporte de Leucina un valor de KT muy similar a aquel caracterizado para el sistema S2 en la cepa gap1 aunque con un valor de Jmax mas alto. Un único sistema de transporte de baja afinidad -alta capacidad para isoleucina o valina mostró similares características. Esta cepa crece normalmente como la cepa gap1 sobre todas las fuentes de nitrógeno ensayadas. Isoleucina, valina, metionina, alanina y norleucina son inhibidores competitivos del transporte de Leucina por el sistema S2. Los valores de Ki están en el orden de los valores de KT determinados para el transporte de Leucina, isoleucina y valina. DL-TFL es un inhibidor competitivo del sistema S2 pero el valor Kies más grande que el valor de KTpara el transporte de Leucina. Por Io tanto. el sistema S2 de baja afinidad- alta capacidad tiene una relativamente amplia especificidad. transportando no sólo los aminoácidos de cadena ramificada sino también metionina, alanina, serina. treonina y norleucina. Estos resultados sugieren que el gen LET2 codifica un componente asociado a la óptima actividad del sistema S2. La regulación de la actividad de transporte por la fuente de nitrógeno presente en el medio de cultivo indica que la permeasa LET1 (S1) no está sujeta a la represión catabólica por nitrógeno ni a la inactivación catabólica por nitrógeno (NCI). En contraste, en la cepa gap1 la actividad de transporte de L-leucina por S2 es regulada negativamente por los iones amonio. Más aún, en esta condición, el transporte de L-leucina por el sistema S2 en las cepas gap1 y gap1let1let2 exhibió parámetros Cineticos similares. En la segregante gap1/en el comportamiento regulatorio fue diferente. Las activdades de transporte de los aminoácidos de cadena ramificada por S2 fueron más altas que aquellas obtenidas en las células mutantes gap1 o gap1let1let2 crecidas en los medios de cultivo conteniendo L-prolina o iones amonio como únicas fuentes de nitrógeno. Estos resultados sugieren una tercera mutación además de let1 y let2 que podría interferir con la incorporación de los aminoácidos de cadena ramificada o de una interacción entre los productos de los genes LET1 y LET2.

Abstract:
Kinetic and genetic evidence show that the uptake of L-branched-chain amino acids into Saccharomyces cerevisiae is mediated by at least three functionally distinct systems: the general amino acid permease GAP1 (inactive in the presence of ammonium ions), and two transport systems more specific S1 and 82, previously described for L-leucine transport. Wild type cells grown in medium containing L-proline as nitrogen source, exhibit a single transport system for each of the L-branched-chain amino acids of high-affinity and very high-capacity A gap1 mutant shows two transport systems for leucine wrth KTand Jma, values Similar to those previously described as S1 and 82, and a single low affinity-high capacity transport system for isoleucine or valine. A strain mutant defective in Systems S1 and S2 transporting L-leucine was isolated from the parental strain already deficient in the general amigo acid permease, GAP1. The mutant was selected as a spontaneous, trifluoroleucine-resistant (TFL) strain. This mutant was crossed with gap1 tester strain. and tetrad analysis indicated that full resistance to TFL was dependent upon the presence of at least two unlinked mutant genes, denominated let (leucine transport). The let1 mutation completely inactivates the high affinity-low capacity leucine transport system kinetically defined as S1. Although the let2 mutation caused a marked decrease in the Jmax of the low affinity system S2, residual transport in the gap1let1let2 mutant had the same KT as in the gap1LET1LET2 parental strain. Similar results were obtained for the single transport system of L-isoleucine or L-valine. The gap1let1let2 mutant exhibited a marked decrease in growth on minimal medium containing leucine, isoleucine or valine as a sole nitrogen source. Moreover, assimilation of methionine, phenylalanine, serine, threonine and norleucine, was severely impaired, whereas basic and acidic amino acids supported normal growth. This indicates that at least one of leucine permeases has a fairly broad, but yet limited specificity. Reversion of the gap1 gene restored branched-chain amino acids transport. The revertant strain was sensitive to TFL when grown on proline but resistant to TFL when ammonia was the nitrogen source. The gap1let2 (TFL-sensitive) segregant exhibited for each of the L-branched-chain amino acids only one transport system of high affinity-low capacity. This strain showed transport kinetic parameters for L-Leucine very similar to those characterized for system S1 in a gap1 strain. Each of the high-affinity transport systems for the L-branched-chain amino acids is inhibited competitively by the other two branched chain amino acids. ln addition, methionine, norleucine and trifluoroleucine act as competitive inhibitors of the high affinity transport system of leucine. In mutant gap1let2 the deficiency in L-leucine S2 activity results, in the loss of its ability to grow significantly in culture media containing threonine, serine or norleucine as the sole nitrogen source and in a decreased growth on individual branched chain amino acids, methionine and phenylalanine. Therefore, the gene LET1 encodes for the high affinity-low capacity L-branched-chain amino acids permease S1 and very likely for methionine and phenylalanine as well. The LET1 permease (S1) is primarily responsible for the intracellular accumulation of TFL up to toxic levels, because this system is not detectable in the TFL-resistant mutant gap1let1let2. In contrast, the gap1let1 segregant exhibited only one system transport of low affinity-high capacity for each of the Lbranched-chain amino acids. This strain, showed a transport KT value for leucine very similar to that characterized for system S2 in a gap1 strain although with the higher Jmax value. A single low affinity-high capacity transport system for isoleucine or valine shown similar characteristics. This strain, alike gap1 strain grows normally on all nitrogen sources assayed. lsoleucine, valine, methionine, alanine and norleucine are competitive inhibitors of the Ieucrne transport system S2. The Ki values are of the same order as the KT values determined for leucine, isoleucine and valine transport. TFL is a competitive inhibitor of the S2 system but its Ki value is larger than the KT value for -Leucine transport. Therefore, the low affinity-high capacity system S2 has a relatively broad specificity, transporting not only branched chain aminoacids but also methionine, alanine, serine, threonine and norleucine. These results suggest that LET2 encodes for a component which is associated to optimum activity of transport system S2. Regulation of transport activity by the nitrogen source indicates that S1 permease is not subject to nitrogen catabolite repression (NCR) nor to nitrogen catabolite inactivation (NCI). In gap1 strain the leucine transport S2 activity is negatively regulated by ammonium ions. Moreover, under this condition leucine transport by S2 system in gap1 and gap1/et1/e12 strains, exhibited similar kinetic parameters. In the segregant gap1let1 the regulatory behaviour was different. The branched-chain amino acids transport activities by S2 were higher that those obtained in gap1 or gap1let1/et2 mutant cells grown in culture media containing L-proline or ammonium ions as sole nitrogen source. These results suggest the existance of a third mutation, besides let1 and let2 which could interfere with the L-branched chain amino acids uptake or of an interaction between the products of the genes LET1 and LET2.

Walz, Katherina. "Estudio bioquímico y estructural de la quinasa de proteínas CK2 del hongo Candida Albicans y su participación en la fosforilación del proteasoma 20S homólogo : Clonado de la subunidad regulatoria (beta) de la enzima" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Varone, Cecilia Laura. "Regulación de la expresión génica de la delta-aminolevulinato sintetasa por cAMP y glucosa : participación de las quinasas de proteínas A y C" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El primer paso en la biosíntesis del hemo en las células animales es catalizado por la enzima mitocondrial δ-aminolevulinato sintetasa (ALA-S), que condensa glicina y succinil CoA para formar ácido 6-aminolevulínico y que, al menos en hígado, es la limitante de la velocidad. En hígado esta enzima constitutiva regula la producción de hemo necesario para sintetizar las proteínas citocromos P-450. Aunque en los tejidos animales el nivel de enzima es muy bajo, la transcripción del gen de ALA-S en hígado de animales de experimentación aumenta cuando se les administran compuestos porfirinogénicos como el fenobarbital. Diferentes mecanismos fueron propuestos por los que el hemo puede regular la expresión de ALA-S a nivel transcripcional reprimiendo la sintesis del RNA, a nivel postranscipcional disminuyendo la estabilidad del mensajero y a nivel postraduccional inhibiendo la entrada de la enzima a la mitocondria. En el presente trabajo examinamos el mecanismo ejercido por cAMP y glucosa sobre la expresión génica de ALA-S en hepatocitos de ratas normales y con diabetes experimental, y en cultivos de células HepG2. Se ha demostrado que el cAMP potencia la inducción mediada por fenobarbital, aumentando la cantidad del mRNA de ALA-S a través de la activación de la quinasa de proteínas dependiente de cAMP. El efecto inductor ejercido por el fenobarbital es mayor en hepatocitos diabéticos que en normales debido probablemente al nivel de cAMP elevado que presentan. Por otro lado, se ha demostrado que la glucosa inhibe la inducción de la expresión de ALA-S mediada por fenobarbital en hepatocitos normales pero no en diabéticos. Este efecto glucosa es revertido por la presencia de dibutiril CAMP,de activadores de la adenilil ciclasa o de un inhibidor de fosfodiesterasa. Se presentan evidencias que los efectos del cAMP y la glucosa son ejercidos a nivel transcripcional. La vida media del mRNA de ALA-S no se modifica en presencia de ellos. Mas aún, los efectos de cAMP y la glucosa se manifiestan en el análisis de tranfecciones transientes de células HepG2 con un vector que contenie la región promotora del gen ALA-S clonada en 5’ del gen de la cloramfenicol acetiltransferasa. En este tipo de experimentos hemos confirmado además que el efecto de cAMP requiere la activación de la proteina quinasa dependiente de cAMP ya que hemos obtenido resultados similares cotransfectando con la subunidad C de la PKA. Finalmente se demuestra que la activación de la PKC actúa negativamente sobre el mRNA de ALA-S, probablemente a nivel transcripcional, de acuerdo a las determinaciones por Northern, slot blot y análisis de transfecciones transientes de células HepG2. Asimismo se observa que el efecto del éster de forbol TPA anula el efecto inductor del cAMP. Es posible que ambos caminos de transducción de señales, que involucran la activación de PKA y PKC, estén interconectados en la regulación de la expresión génica de ALA-S.

Abstract:
The first step of heme biosynthesis pathway in animal cells is catalyzed by the mitochrondrial enzyme δ-aminolevulinate synthase (ALA-S), wich condensates glycine and succinyl-CoA to form δ-aminolevulinic acid, and -at least in liver- is rate controlling. ln liver, this housekeeping enzyme regulates the supply of heme necessary to form respiratory cytochrome P-450 proteins. Although the enzyme level in animal tissues is usually very low, the transcriptional rate of ALA-S gene is greatly increased in experimental animal livers after the administration of a variety of porphyrinogenic effectors such as phenobarbital. Different mechanisms have been proposed to show that heme can regulate ALA-S gene expression at the transcriptional level by repressing mRNA biosynthesis, at the posttranscriptional level by diminishing ALA-S mRNA stability, and at the post-traductional level by inhibiting the enzyme entrance to the mitochondria. In the present work we examined the mechanisms underlying the effect of cAMP and glucose on ALA-S synthase gene expression both in isolated hepatocytes from normal and experimental diabetic rats, and in HepG2 cells. It was demonstrated that cAMP potentiates phenobarbital-mediated induction, increasing the amount of ALA-S mRNA by means of the activation of cAMP dependent protein kinase. The inducing effect exerted by the phenobarbital is greater in diabetic hepatocytes than in normal cells, due probably to the high level of endogenous cAMP in diabetic cells. One the other hand, it was shown that glucose inhibits phenobarbitalinduced ALA-S expression in normal hepatocytes, but not in diabetic ones. This glucose effect can be prevented adding dibutyril cAMP, adenylate cyclase activators, or a phosphodiesterase inhibitor. There are evidences that both cAMP and glucose effects would operate at the transcriptional level. ALA-S mRNA half life was not modified in their presence. Moreover cAMP and glucose effects were manifested in transfection analysis of HepG2 cells using ALA-S promoter region cloned 5’ upstream chloramphenicol acetyltransferase reporter gene. With this kind of experiments we were also able to confirm that the effect of cAMP requires the activation of cAMP dependent protein kinase, since it was possible to bypass this activation cotransfecting with PKA subunit C. Finally there are evidences that protein kinase C activation influences negatively ALA-S mRNA -probably at the transcriptional level-, according to Northern, slot blot and transient transfection analysis of HepG2 cells. We could also observe that the effect of phorbol ester TPA overcomes dibutyril cAMP induction. Thus, it is feasible that both signal transduction pathways involving PKA and PKC activation are interconnected in the regulation of ALA-S gene expression.

Finkielstein, Carla V.. "Caracterización molecular de una fosfoproteína novel intermediaria en el mecanismo de acción de hormonas proteicas" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Trabajos previos de nuestro laboratorio han permitido caracterizar una fosfoproteína novel (p43), intermediaria en la síntesis de esteroides en la zona fasciculata de la corteza adrenal de rata (Paz C. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 224:709-716). En la presente Tesis, se describe la caracterización molecular de p43 asi como también la regulación hormonal del transcripto. Los resultados obtenidos mostraron que p43 es homóloga a una acil-CoA tioesterasa mitocondrial. La secuencia aminoacídica deducida de la proteína presentó sitios consenso de fosforilación para diferentes proteínas quinasas y un motíf para serina Lipasa. Anticuerpos dirigidos contra un péptido sintético que incluye dicho motif y otro contra la región N-terminal de p43, bloquearon la actividad biológica de la proteína. El transcripto de p43 fue detectado en ovario de ratas pseudopreñadas, en zona fasciculata y glomerulosa de adrenal de rata, en una línea tumoral de células de Leydig, en cerebro de ratón y en placenta humana. El tratamiento de ratas con dexametasona (Dx) provoca una disminución en los niveles del ARNm de p43 de manera dosisdependiente en adrenales de rata. El tratamiento posterior con ACTH no sólo revierte el efecto de la Dx, sino que produce un aumento rápido (5 min) en los niveles del mensajero alcanzando un máximo a los 15 min (62%) y retornando a los valores basales a los 30 min posteriores al estímulo. El tratamiento con actinomicina D o cicloheximida antes del estímulo con ACTH provoca una disminución o un aumento en los niveles del ARNm de p43 respectivamente. Estos resultados relacionan por primera vez que una actividad de acil-CoA tioesterasa está involucrada en los procesos esteroidogénicos.

Abstract:
We have previously reported the purification of a phosphoprotein (p43) intermediary in steroid synthesis from adrenal zona fasciculata (Paz C. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 224:709-716). Here we describe the cloning and sequencing of a cDNA encoding p43 as well as the hormonal regulation of p43 transcript. The protein resulted homologous to a very recently described mitochondrial peroxisome proliferator-induced very-long-chain acyl-CoA thioesterase. The deduced amino acid sequence of the protein shows consensus sites for phosphorylation by different protein kinases, and a Lipase serine motif. Antibodies raised against a synthetic peptide that includes the Lipase serine motif and against the N-terminal region of p43 block the action of the protein. The transcript of p43 was detected in ovary of pseudopregnant rats, rat adrenal zona fasciculata and glomerulosa, mouse Leydig tumor cell line, rat brain and human placenta. Inhibition of adrenocorticotropin hormone (ACTH)release and steroid synthesis by dexamethasone produced a dosedependent decrease in the abundance of the adrenal transcript. The transcript was induced by in vivo stimulation of the adrenals with ACTH. The effect had a rapid onset (5 min), reached maximal stimulation (62%) at 15 min and returned to basal levels at 30 min. ACTH effect on p43 transcript was inhibited by actinomycin D and enhanced by cycloheximide. Our results provide the first evidence linking acyl-CoA thioesterases, with very-long-chain specificities, and a protein intermediary in steroid synthesis, thereby supporting a regulatory role for acyI-CoA thioesterases in steroidogenic tissues.

Urtreger, Alejandro Jorge. "La fibronectina como moduladora del fenotipo metastásico en líneas tumorales murinas" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los procesos de invasión tumoral y diseminación metastásica involucran tanto moléculas de adhesión como proteasas tumorales. Entre las moléculas de adhesión la fibronectina (FN), una glicoproteína de alto peso molecular presente en la matriz extracelular (ME) y en varios fluidos corporales, juega un importante rol en muchos aspectos de la interacción célula-célula y célula-sustrato incluyendo adhesión, spreading y migración, cicatrización y transformación maligna. El activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPA) es una enzima proteolítica capaz de activar el sistema fibrinolítico por conversión del plasminógeno en plasmina e interviene en numerosos fenómenos de remodelación de matrices tisulares. Los tejidos cancerosos suelen contener un exceso de uPA, hecho que genera una intensa actividad degradativa en torno de la masa tumoral primaria. De esta manera, las células tumorales son capaces de degradar diferentes componentes de la matriz extracelular y migrar a través de estos defectos, constituyendo un paso crucial en el proceso de invasión y metástasis. En el presente trabajo se muestra el desarrollo de modelos de cáncer experimental útiles para estudiar el rol de las proteasas y los componentes de la ME en la biología de la progresión tumoral. En una primera instancia se establecieron y caracterizaron las líneas celulares LM3 y LMM3. obtenidas por subcultivos sucesivos in vitro a partir de cultivos primarios de los adenocarcinomas mamarios murinos M3 y MM3 respectivamente. Durante la evolución de la línea LM3 se observó un incremento en la capacidad de crecer en forma independiente del anclaje, un desplazamiento hacia un nivel triploide en la distribución del número cromosómico y la perdida gradual de la expresión de FN. La capacidad invasiva local y la capacidad metastásica espontánea de la línea LM3 se incrementaron con el aumento del número de repique, en asociación con la progresiva pérdida de expresión de FN y el incremento en los niveles de uPA unido a la membrana celular. Por otra parte, las células LMM3 mantuvieron la incapacidad para expresar FN y la alta capacidad metastásica espontánea ya observada en su tumor parental MMS, adquiriendo además una mayor invasividad local. Con el fin de analizar el rol de la FN en el proceso metastásico, células de la línea LMM3 se transfectaron en forma estable con distintas construcciones conteniendo variantes wt (salvaje) y RGD (-) del cDNA de FN humana y se obtuvieron, de esta manera, clones celulares capaces de re-expresar esta FN humana recombinante. Si bien ninguno de estos clones fue capaz de ensamblar una matriz extracelular in vitro, los mismos mostraron una reducción en su capacidad migratoria y un incremento en sus propiedades adhesivas. Todos los clones celulares analizados mostraron una reducción significativa en su potencial metastásico experimental cuando se los comparó con clones control y con la linea celular parental. Una tendencia similar se observó en la capacidad metastásica espontánea. Estos resultados indican que la re-expresión de FN, carente del sitio de unión a células RGD e incapaz de formar matriz extracelular. es suficiente para disminuir el potencial metastásico de las células tumorales. Además de tener un efecto directo en la adhesión y migración celular, la expresión de FN podría estar modulando otros eventos celulares asociados a la cascada metastásica. Con el fin de analizar esta hipótesis, se estudió el potencial angiogénico y la capacidad de producir uPA, una proteasa altamente correlacionada con el fenotipo invasivo, de los diferentes clones celulares. Independientemente de la integridad de la secuencia RGD, todos los clones transfectados con el gen de FN mostraron una reducción significativa en la capacidad angiogénica respecto del clon control, indicando que la FN podría prevenir el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos, ya sea capturando o impidiendo la liberación de factores angiogénicos. Por otra parte, la re-expresión de FN produjo un incremento en los niveles de uPA secretados al medio condicionado en todos los clones analizados, si bien aquellos que expresan la variante RGD (-) secretaron un 50% menos de uPA que aquellos que expresan la variante wt. Por otro lado, los clones FNwt fueron incapaces de unir uPA a la superficie celular, mientras que los clones RGD (-), al igual que el clon control, conservan esta capacidad. El tratamiento de células LMM3 o del clon control con FN exógena indujo un aumento en la secreción de uPA y una caída en la capacidad de unir uPA a la membrana plasmática, en forma similar a los efectos inducidos por la re-expresión de FN en los clones. La modulación por FN de la actividad uPA secretada y asociada a la membrana celular mostró ser dependiente de la secuencia RGD y de la integrina β1. Estos resultados sugieren que la capacidad de la FN de bloquear el desarrollo de las metástasis en los clones celulares analizados puede también estar parcialmente generada por la disminución en la capacidad de unir uPA a la superficie celular mediada por la FN, generando la reducción de la capacidad migratoria e invasiva de las células. En la presente tesis se describe por primera vez un mecanismo por el cual la FN interviene en la prevención de la diseminación metastásica de manera independiente de la formación de ME y del principal sitio de unión a células, la secuencia RGD. Además, demostramos que la FN es capaz de modular la expresión de uPA y de su receptor uPAR. Por otra parte se sugiere la existencia de otros mecanismos que influyen en el potencial metastásico. En la presente tesis se proveen además nuevas evidencias acerca de cómo moléculas de la ME pueden modular el fenotipo metastásico.

Abstract:
Tumor invasion and metastasis is a multistep process involving adhesion molecules as well as tumor proteases. In order to study the role of fibronectin (FN) in the metastatic process, we transfected a new cell line (LMM3), obtained in our laboratory by sequential subcultures in vitro, with two variants of a full length human FN cDNA. Besides affecting the adhesion and migration, we also analyzed if the reexpresion of FN may be somehow modulating the production of urokinase-type plasminogen activator (uPA), a protease highly correlated with the invasive phenotype. Our results showed that FN may prevent the metastatic dissemination independently of matrix formation and RGD sequence, the main cellular binding site. The results presented here strongly support a novel activity for the multifunctional glycoprotein FN regarding the regulation of uPA production as well as the capacity of tumor cells to bind uPA. We believe that the present report also provides a new insight on how ECM molecules like FN, may reduce the metastatic phenotype.

Gómez, Eliana Beatriz. "Clonado y caracterización de quinasas relacionadas con la CDC2 en el parásito Trypanosoma cruzi" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Pereira, Claudio Alejandro. "Metabolismo de L-arginina en Trypanosoma cruzi" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Apartir de los resultados obtenidos en nuestro laboratorio sobre la modulación de la motilidad de los epimastigotes de Trypanosoma cruzi a través de los distintos efectores de la ruta metabólica del óxido nítrico, se planteó la necesidad de estudiar en forma más amplia el metabolismo del sustrato de la óxido nítrico sintasa, la L-arginina. Inicialmente se describió el transporte de este aminoácido en epimastigotes de T. cruzi en fase logaritmica de crecimiento. Se determinaron los parámetros cinéticos y sus características bioquímicas, siendo algunas de las más relevantes, las que se detallan a continuación: - El transportador presenta una alta afinidad por el sustrato (Km = 4.16 μM) en comparación con otros sistemas similares. - Es sumamente específico ya que no se inhibe competitivamente en presencia de aminoácidos naturales como así tampoco por análogos estructurales de la arginina. Sólo se observó una disminución significativa en la incorporación de L-arginina en presencia de homoarginina, canavanina y D-arginina. - Es saturable por sustrato, independiente de Na+,pero dependiente de ATP. - Es afectado en forma específica por el tiempo de "ayuno"de L-arginina. Cuando se estudió el destino de la arginina incorporada a las células en 30 minutos, se observó que el 4.3% se incorpora a proteínas, el 68.6% queda formando parte del conjunto de aminoácidos libres y un 27.1% se identificó como fosfoarginina. La presencia de fosfoarginina como fosfágeno involucrado en la regeneración del ATP,hidrolizado principalmente en el flagelo del parásito, explica probablemente la necesidad de un transportador específico de las caracteristicas descriptas. La relevancia de esta actividad biológica como posible blanco terapéutico tripanosomicida está dada por ser éste un sistema diferencial entre el parásito y el hospedador humano, quien carece de esta enzima pues utiliza la creatina como fosfágeno. Estas evidencias nos llevaron a centrar el interés del trabajo en el sistema transportador de arginina y la enzima arginina kinasa. En la segunda parte del trabajo se caracterizó bioquímicamente la enzima arginina kinasa. Se midió la actividad enzimática tanto in vivo como In vitro, se determinó su localización subcelular y sus parámetros cinéticos (Km para arginina, 0.33 mM y para ATP 0.31 mM). Se purificó parcialmente la actividad arginina kinasa en dos pasos cromatográficos, uno de intercambio iónico y el segundo de filtración molecular. También se estudiaron sus requerimientos de ATP y cationes bivalentes. Se ensayaron in vitro inhibidores potenciales de la enzima, siendo los más relevantes,el análogo natural canavanina, la homoarginina y la histidina. Se analizó también la presencia de la arginina kinasa en otros organismos, encontrándose dicha actividaden otras cepas y especies del género Trypanosoma y también en los denominados “trypanosomátidos inferiores" como Herpetomonas y Leptomonas. Finalmente se clonó el gen que codifica para la arginina kinasa de T. cruzi utilizando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)y rastreo en bibliotecas genómicas. El gen de 1074 pb codifica para una proteína de 357 aminoácidos y un peso molecular de 40 kDa (GenBank # AF070451),el cual probablemente se encuentre como copia única dentro del genoma. El análisis de la secuencia obtenida demuestra un alto grado de conservación evolutiva. El gen completo de la enzima se expresó en un sistema heterólogo (Escherichia coll) demostrándose actividad arginina kinasa de la proteína recombinante.

Díaz Añel, Alberto Marcelo. "Caracterización de una ARN Helicasa de Trypanosoma cruzi clonada por el método de Differential Display" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Una de las últimas técnicas aplicadas en biología molecular para detectar diferentes niveles de transcripción en distintos estadios de un mismo tipo celular es el Differential Display. Este ensayo se basa en la técnica de RT-PCR, utilizando un oligo dT “anclado” que se une al nacimiento del pon A+ de los ARN mensajeros, y un oligonucleótido corto de secuencia al azar que, en diferentes combinaciones, van a amplificar un set de bandas característico para cada par de oligos elegidos. Estas reacciones se corren en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y se observan por autorradiografía. De esta forma se comparan ambos estadios celulares y se recuperan del gel aquellas bandas que muestren una amplificación diferencial como producto de distintos niveles de ARN mensajeros. Utilizando el Differential Display en los estadios no infectivo (epimastigotes) e infectivo (trypomastigotes metacíclicos) del parásito Trypanosomacruzi, causante de la enfermedad de Chagas, se purificaron varias bandas de expresión diferencial. Una de ellas aplicada como sonda en un Northern-blot demostró tener una transcripción entre 8 y 9 veces mayor en trypomastigotes metacíclicos. A partir de una biblioteca genómica realizada en el bacteriófago A Fix, se aisló un clon positivo para esta banda que, una vez secuenciado y comparado en bancos de datos, dió una homología de hasta el 46 % a nivel de aminoácidos con diferentes ARN helicasas. Estas proteínas pertenecen a la familia de las proteinas DEAD Box y participan en el relajamiento de estructuras de ARN doble cadena. Por lo tanto son importantes en procesos como transcripción, traducción, ensamblado de ribosomas, splicing y editing.Además se ha descripto su participación en diferenciación y desarrollo celular, por lo cual se abre un campo muy importante con en el estudio de la participación de estas proteinas en los procesos de metaciclogénesis e infectividad del Trypanosoma cruzi. Por otro lado se demostró por Southern-blot que, a diferencia de la mayoría de los genes conocidos de Trypanosoma cruzi, el gen de esta ARN helicasa es de única copia en el genoma. Ensayos de Cromo-blot con ia región que codifica al carboxilo terminal de la proteína mostraron que este gen se encuentra representado en por lo menos nueve cepas del parásito. Por último, se demostró que esta ARN helicasa posee una especificidad enzimática con dirección 3’-5’ sobre transcriptos realizados in-vitro, con una aparente independencia de ATP o GTP, como ocurre con algunos miembros de esta familia El descubrimiento de este gen de transcripción diferencial entre ambos estadios de la metaciclogénesis de T. cruzi y la caracterización parcial de su función enzimática, son el principio para estudiar su participación en la diferenciación y/o infectividad de este parásito y nos permitirá conocer un poco más de este proceso del cual se sabe tan poco y que es parte del comienzo de la enfermedad de Chagas en los huéspedes vertebrados, entre ellos el hombre.

Abstract:
One of the last techniques applied in molecular biology to detect different transcription levels in different stages of one cellular type is the Differential Display. This assay is based on the technique of RT-PCR, using an oligo dT “anchored” that anneals to the birth of the messenger RNAs poly A, and a short oligonucleotide of at random sequence that, in different combinations, they will amplify a characteristic set of bands for each couple of selected oligos. These reactions are run on a dennaturing polyacrylamide gel and they are observed by autoradiography. This way both cellular stages are compared and we can recover of the gel those bands that show a differential amplification as product of different levels of messenger RNAs. Using the Differential Display in the stages non infective (epimastigotes) and infective (metaciclic trypomastigotes) of the parasite Trypanosoma cruzi, causing of the Chagas’ illness, we purified several bands of differential expression. One of them applied as probe in a Northern-blot demonstrated to have a transcription level between 8 and 9 times higher in metaciclic trypomastigotes. Starting from a genomic library carried out in A Fix bacteriophage, a positive clone was isolated for this band that, once sequenced and compared in databases, showed an homology of until 46% at level of aminoacids with different RNA helicases. These proteins belong to the family of the DEAD Box proteins and they participate in the relaxing of RNA double chain structures. Therefore they are important in processes like transcription, translation, ribosome assembling, splicing and editing. Also it has been described their participation in diferentiation and cellular development, reason why a very important field opens up with in the study of the participation of these proteins in the metaciclogénesis processes and infectivity of Trypanosoma cruzi. On the other hand it was demonstrated by Southern-blot that, contrary to most of the well-known genes of Trypanosoma cruzi, the gene of this RNA helicase is single copy in the genome. Assays of Chromo-blot with the region that codes to the carboxy terminal of the protein, showed that this gene is represented in at least nine strains of the parasite. Lastly, it was demonstrated that this RNA helicase possesses an enzymatic specificity with 3’-5' direction with transcripts carried out in-vitro, with an apparent independence of ATP or GTP, like it happens with some members of this family. The discovery of this gene of differential transcription between both stages of the T. cruzi metacyclogenesis, and the partial characterization of their enzymatic function, is the principle to study their participation in the diferentiation and/or infectivity of this parasite, and it will allow to us to know a little more about this process of which is known so little and that it is part of the beginning of the Chagas’ illness in the vertebrate guests, among them the man.

Gorostiaga, María A.. "Caracterización de la línea celular VERO como sustrato para la producción de vacunas virales" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las líneas celulares establecidas a partir de células de riñón del mono verde africano, se han usado durante años en Virología. La investigación y el desarrollo que involucra el uso de líneas celulares requiere el conocimiento preciso de las especies de origen y su pureza. Esto se lleva a cabo mediante un monitoreo periódico de los cultivos celulares que comprende varios marcadores genéticos, incluyendo isoenzimas y cromosomas. La estabilidad del cariotipo de la línea celular VERO se estudió con métodos de coloración diferencial de los cromosomas, en cultivos continuos estáticos (10 pasajes). Bajo estas condiciones el número modal (de 58 a 54) y la estructura del cariotipo variaron, tanto en el número de copias de cromosomas normales como en el de marcadores. Los cambios cuantitativos (el aumento del porcentaje de las células diploides, así como la variación en la fracción de células que tienen el número modal, ocurren a pesar de la estabilidad de la composición cromosómica, que limita el uso de las células Vero como sustrato para la preparación de vacunas. Para estandarizar las vacunas patrón en el proceso de producción, se estudió la influencia potencial que los diferentes pasajes podrían tener en la capacidad inmunogénica del virus, con el objetivo de establecer el número máximo y minimo de pasajes que cada tipo de virus admite, sin alterar las características biológicase inmunológicas de las vacunas virales que se usan en la actualidad. El método desarrollado y evaluado en diez pasajes es apto para la producción de vacunas antirrábicas de referencia en células VERO.

Abstract:
Non-tumorigenic cell lines established from African green monkey kidney cells have been used over years in virology. Research and development involving the use of cell lines requires precise knowledge of the species of origin and purity of the cell lines involved. This can only be assured by periodical monitoring of cultured cell lines that involves testing for a combination of genetic markers, including isoenzymes and chromosomes. The Vero cell line karyotypic stability was carried out by methods of differential chromosome staining in continuous static cultures (10 passages). Under these conditions, both the modal number of chromosomes (from 58 to 54) and the karyotype structure, namer the copy number of normal chromosomes and the market composition were shown to change. The quantitative changes (the rising percentage of diploid cells, as well as the change of cell fraction involving the modal number of chromosomes) were shown to occurr in spite of the chromosome composition stability, which limits the time of using Vero cells as a substrate for preparation of vaccines. To the standardization of pattern vaccines in the production process we studied the potential influence of different passages on the virus inmunogenic capability, to establish the minimum and maximum number of passages that each type of virus admit, without change in the biological and inmunological characteristics of viral vaccines that are currently being used. The method developed and evaluated is appropiate for the production of referencial antirrabic vaccines on Vero cells.

Ledda, María Fernanda. "Estudio del rol de la proteína en el desarrollo y progresión del melanoma humano" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
SPARC (Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine) es una proteína extracelular asociada a tejidos que presentan altas tasas de proliferación celular y remodelación de la matriz. En este trabajo se muestra que las lineas celulares de melanoma humano IIB-MEL-LES, IIB-MEL-IAN e IIB-MEL-J así como varios melanomas humanos metastásicos expresan altos niveles de la proteína y del ARNm de SPARC. Mediante análisis por Western Blot, detectamos una única banda de 42 kDa secretada in vitro por fibroblastos diploides humanos y un doblete de 40 a 45 kDa secretado por las tres líneas celulares de melanoma y en todos los melanomas metastásicos testeados. Algunas de las muestras de melanomas y de las líneas celulares mostraron un doblete adicional de 34-36 kDa. El ARNm de SPARC fue detectado por ensayos de northern blot en las tres líneas de melanoma estudiadas, en las l4 muestras de melanomas metastásicos y en los tumores inducidos en ratones atímicos. El patrón heterogéneo de SPARC secretado por las células de melanoma humano es resultado de la glicosilación post-traduccional y de un clivaje extracelular específico. A diferencia de lo que sucede con los fibroblastos humanos, las células de melanoma no sobreexpresaron SPARC luego del agregado de TGF-β. El análisis inmunohistoquímico demostró que SPARC se expresó fuertemente en el 100% de los melanomas primarios (7/7) y metastásicos (29/29), con moderación en la mayoría de los nevos displásicos positivos (13/14) y débilmente en los nevos benignos (4/25). No se detectó expresión de SPARC en melanocitos normales. Los datos sugieren que la expresión de de esta proteína está asociada a la progresión neoplásica del melanoma humano. En el presente trabajo también se describe la supresión parcial de la expresion de SPARC en 2 líneas de melanoma humano utilizando un vector de expresión con la secuencia antisentido para SPARC. La reducción de los niveles de expresión de esta proteína dio como resultado una reducción en la capacidad adhesiva e invasiva in vitro de las células tumorales sobre membranas basales reconstituídas, eliminando completamente su capacidad tumorigénica in vivo. Esta es la primera evidencia de que SPARC desempeña un papel clave la progresión del melanoma humano.

Abstract:
SPARC (Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine) is an extracellular protein associated with tissues exhibiting high rates of cell proliferation and matrix remodelling. The present work shows that the human melanoma cell lines IIB-MEL-LES, IIB-MEL-IAN and IIB-MEL-J and different human metastatic melanomas expressed high levels of SPARC mRNA and protein. By western blot analysis we detected a unique secreted 42 kDa band in human diploid fibroblast-conditioned medium and a 40 to 45 kDa doublet in the three melanoma cell lines and all the metastatic melanomas tested. Part of the melanoma samples and cell lines showed an additional doublet of 34-36 kDa. SPARC mRNA was expressed by the three established cell lines, 14 metastatic melanoma samples, and tumors raised in nude mice, and no spliced variants were found. The heterogeneous pattern of SPARC secreted by human melanoma cells is the result of post-translational glycosilation and specific extracellular cleavage. Unlike human fibroblasts, melanoma cells did not over express SPARC upon addition of TGF-β. Immunohistochemical analysis showed that SPARC was strongly expressed in 100 % of primary melanomas (7 of 7) and metastatic melanomas (29 of 29), moderately expressed in most of the positive dysplastic nevi (13 of 14), and only weakly expressed in nevocellular nevi (4 of 25). Normal melanocytes did not express SPARC. The data suggest that the expression of SPARC is associated with the neoplastic progression of human melanoma. The present study also reports that the suppression of SPARC expression by 2 human melanoma cell lines using a SPARC antisense expression vector, results in significant decrease in the in vitro adhesive and invasive capacity of tumor cells, completely abolishing their in vivo tumorigenicity. This is the first evidence that SPARC plays a key role in human melanoma development and progression.

Cerdán, Marcelo Guido. "Especificidad tisular de la expresión de genes Eucariotas en ratones transgénicos : 1) 3,8 kilobases del promotor de beta-caseína bovino dirigen la expresión de proteínas recombinantes a la glándula mamaria y 2) expresión específica del gen de proopiomelanocortina en el sistema nervioso central" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Durante este trabajo se estudio la regulación tejido especifica de dos genes mediante la utilización de ratones transgénicos. l) Se estudio con que eficacia un fragmento de 3,8 kb del promotor bovino de β-caseina puede dirigir una expresión tejido especifica a la glándula mamaria. El patrón de expresión espacial, temporal y hormonal del gen de fusión, resultó altamente regulado y confinado estrictamente a celulas epiteliales de la glándula mamaria lactante. En estudios previos realizados sobre una línea celualar de glándula mamaria de ratón, se había demostrado que con 1,7 kb del promotor bovino de β-caseína era posible obtener expresión celular específica, a su vez regulada hormonalmente. Esta misma construcción no funcionó al intentar dirigir la expresión específica a glándula mamaria de ratones transgénicos. En este trabajo utilizamos un promotor de mayor tamaño del mismo gen, 3.8 kb, para direccionar la expresión del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) a glándula mamaria de ratones transgénicos. Por medio de un ensayo de Northern blot se determinó la presencia de ARNm de hGH únicamente en glándula mamaria de hembras en período de lactancia. Este ARNm no se detectó en glándula mamaria de hembras vírgenes. Un análisis durante el desarrollo de la glándula mamaria demostró que el transgén sigue un patrón de expresión que se asemeja mucho más al bovino que al murino. En estudios de hibridización in situ, realizados sobre secciones de glándula mamaria, se observó que el patrón de expresión del transgén resultó homogeneo en todos los lóbulos, tanto en animales heterocigotas como homocigotas. La cantidad de granos de plata contados sobre tejido mamario se correlacionó áltamente con el contenido de hGH en leche, previamente determinado por radioinmunoensayo (r=0 996). Por lo tanto, las 3,8 kb del promotor bovino de β-caseína pueden direccionar altos niveles de expresión de proteínas terapéuticas a la glándula mamaria de ratones transgénicos con especificidad celular y regulación correcta durante el desarrollo. 2) Se evaluó la expresión celular especifica del gen de Pro-Opiomelanocortin (POMC) en neuronas. El gen de POMC se expresa en una serie de neuronas del hipotálamo y tracto solitario, y en corticotrofos y melanotrofos hipofisarios. En estudios previos se determinó que una porción proximal del promotor de POMC de rata o ratón era suficiente para dirigir expresión celula-específica, regulada hormonalmente y en forma correcta durante el desarrollo, a melenotrofos y corticotrofos, pero no a neuronas. Más recientemente se identificó la presencia de posibles activadores de la transcripción dentro de una zona de 11 kb en la región 5’flanqueante del gen de POMC (entre —13kb y —2kb). En el presente trabajo, por medio de un análisis delecional se ubicó el elemento neuronal específico a una resolución de 4 kb. Se generaron 3 construcciones conteniendo secuencias genómicas de POMC (6 kb de la unidad transcripcional y 2 kb de la región 3’flanqueante) con diferentes longitudes de la región 5’flanqueante, 13 kb (-13/+8POMC-EGFP), 9 kb (—9/+8POMC-EGFP) y 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). A estas secuencias se les introdujo en el exón 2, previo al sitio ATG, una versión mamiferizada de la proteína verde fluorescente de medusa (EGFP). Esta innovación permitió visualizar la expresión transgénica en el cerebro e hipófisis en forma inmediata luego de realizar los cortes de los tejidos. En tres de un total de cuatro lineas de animales transgénicos generados para las construcciones -5/+8POMC-EGFP y -9/+8POMC-EGFP se observó fluorescencia en corticotropos y melanotropos. Estos transgenes se expresaron en neuronas. Contrariamente, la construccion -13/+8POMC-EGFP se expresó correctamente en hipófisis y neuronas de POMC Este resultado nos sugiere que la presencia del elemento neuronal específico buscado se encuentra entre —9 y —l3kb del inicio de la transcripción. En experimentos futuros, nuestro objetivo será clonar e identificar el factor de transcripción neuronal que interactúa con los elementos en cis. Nosotros proponemos inmortalizar un linea celular neuronal que exprese POMC mediante oncogénesis dirigida en ratones transgénicos. Hemos generado 4 lienas de ratones transgénicos con una construcción similar a —l3/+8POMC-EGFP, pero conteniendo una versión termo-sensible del antígeno T largo (AgT-tsA58) insertada en el segundo exón del gen de POMC de ratón. En estas 4 líneas se desarrollaron tumores prematuramente en la región hipofisaria-lúpotalámica, a pesar de que la temperatura corporal del ratón es no permisiva. Tres de estos ratones murieron antes de reporoducirse. Sólo una líena pudo ser mantenida con un programa de aparcamientos utilizando machos jóvenes. En estudio realizado con un Northern blot se observó una expresión considerable de POMC en esos tumores. En próximos experimentos evaluaremos la prsencia de marcadores neuronales e hipofisafios para determinar la naturaleza de dichos tumores.

Abstract:
During this study the tissue specific regulation of two different promoter genes were studied using transgenic mice. 1) The ability of a 3.8-kilobase promoter of the bovine β-casein gene to drive cell specific expression to the mammary gland was evaluated in transgenic mice. The spatial, temporal, and hormonal pattern of expression of the fusion gene is highly regulated and confined to the epithelial cells of the lactating mammary gland. Previous studies have shown that l.7 kb of the bovine β-casein promoter were able to drive cell-specific and hormone-dependent expression in a mouse mammary cell line but failed to induce accurate expression to the mammary gland of transgenic mice. We investigated here the ability of a larger sequence consisting of 3.8 kb of the bovine β-casein gene promoter to drive the expression of the human growth hormone (hGH) gene in transgenic mice. A Northern blot analysis using total RNA obtained from different tissues of lactating and non lactating females revealed the presence of hGH mRNA only in the mammary gland of lactating females. hGH mRNA was not detectable in the mammary gland of Virgin females. A developmental analysis showed that hGH mRNA only peaked on parturition, resembling more closely the bovine β-casein temporal expression pattern rather than the murine. In situ hybridization studies performed on mammary gland sections showed that the cellular pattern of hGH expression was homogeneous in all lobules from heterozygous and homozygous transgenic mice. Silver grain counts on the tissue sections highly correlated with the hGH contents in the milk determined by radio immunoassay (r = 0.996). Thus 3.8 kb of the bovine β-casein promoter direct a high-level expression of therapeutic genes to the lactating mammary gland of transgenic mice in a tissue-specific and developmentally regulated manner. 2) The cell-specific expression of the Pro-Opiomelanocortin (POMC) gene in hypothalamic neurons was evaluated in transgenic mice. The POMC gene is expressed in a subset of hypothalamic and hindbrain neurons and in pituitary melanotrophs and conicotrophs. Previous studies demonstrated that the presence of a proximal promoter of the rat or mouse POMC gene was sufficient to drive cell-specific, developmentally and hormonally regulated expression in melanotrophs and conicotrophs of transgenic mice, but not in neurons. More recently we identified the presence of a putative neuron-specific enhancer/s within 11 kb of 5‘flanking sequences of the mouse POMC gene (-l3 kb to —2 kb). In the present work, by using a deletional analysis in transgenic mice we localised this site/s within a 4 kb resolution. Three different constructs were generated containing genomic sequences of the POMC gene (6 kb of the transcription unit and 2 kb of the 3’flanking region) with different lengths of the 5’flanking region, 13 kb (-13/+ 8POMC-EGFP), 9 kb (-9/+8POMC-EGFP) and 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). We also introduced in the exon 2 of the POMC gene, previous to the ATG site, a “mammalianized” version of the green fluorescent protein (EGFP). This innovation allowed us to visualise transgenic expression in the brain and the pituitary immediately after tissue sectioning. Three out of four lines of transgenic mice generated with each of the constructs, -9/+8POMC-EGFP and -5/+8POMC-EGFP showed green fluorescence in pituitary melanotrophs and conicotrophs. These transgenes failed to direct expression of EGFP to POMC neurons. However, the construct —l3/+8POMC-EGFP showed correct expression in pituitary and hypothalamic neurons, suggesting that a specific neurone element is located between -9 kb and —l3 kb from the transcription initiation point. In future experiments our goal is to clone and identify the neuronal transcription factor that interacts with the cis-acting elements. We propose to immortalise neuronal cell lines expressing POMC by targeted oncogenesis in transgenic mice. We have generated 4 transgenic mouse lines with a construct similar to the —l3/+8POMC-EGFP, but containing the temperature sensitive version of the oncogenic large T antigen (tsA58-Tag) inserted into the second exon of the mouse POMC gene. These four lines showed premature tumors in the pituitary-hypothalamic region despite the non-permissive temperature of the mouse body. Three of these mice died before breeding. Only one line could be maintained by mating young males. Interestingly, Northern blots experiments showed high POMC expression in these tumors. In further experiments we are going to evaluate the presence of neuronal and pituitary markers to establish the nature of these tumors.

Wilkowsky, Silvina Elizabeth. "Trypanosoma cruzi : transducción de señales y transporte endocitico en la interacción parásito-célula huésped" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Durante la invasión del Trypanosoma cruzi se producen alteraciones tanto en la célula huésped como en el parásito para facilitar el éxito de dicha invasión y el establecimiento del mismo en esa célula. En el análisis de estos temas se ha arribado a las siguientes conclusiones: El aumento citosólico del Ca²+ en la célula huésped es necesario para la invasión. La señal disparadora se encuentra en membranas parasitarias sólo del estadío infectivo. Se determinó la participación de una proteína G heterotrimérica del tipo Gαᵢ de la célula huésped que estimula la invasión. El contacto de la célula huésped con membranas del estadío infectivo produce un aumento de la actividad de la fosfatidilinositol 3 kinasa (PI3K) necesaria para la invasión. Existe también una activación temprana de la proteína blanco de la PI3K, la proteína kinasa B (PKB),que se confirma por el aumento de la invasión en células PKB+ y la disminución en PKB-. La participación de las proteínas Rab 5 y Rab 7 (marcadoras de endosomas tempranos y tardíos respectivamente) en la invasión se confirmó por microscopía confocal y experimentos en células transfectadas. Además, la PI3K y las proteínas Gαᵢ y Gαs, ,también presentes en el parásito, tienen influencia definitoria sobre su capacidad invasiva.

Abstract:
Several modifications are induced in the host cell and the parasite during Trypanosoma cruzi invasion that facilitate this process and further parasite establishment. The analysis of these issues led to the following conclusions : A cytosolic Ca²+ increase in the host cell is necessary for parasite invasion. The triggering signal is present in the parasite membrane of the infective stage only. The participation of a host heterotrimeric G protein, Gαᵢ, that is involved in parasite invasion was determined. The contact between host cells and membranes of the infective stage induce a host phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) activation that was necessary for succesful invasion. There is also an early activation of protein kinase B (PKB) which is a target of PI3K. This fact is confirmed by increased infection percentages in transfected PKB+ cells and decreased values in PKB-cells. The host proteins Rab 5 y 7 (early and late endosome markers respectively), are involved in parasite invasion. This fact was confirmed by confocal microscopy and infection experiments with Rab 5 and Rab 7-transfected cells. Besides. T. cruzi's PI3K, Gαᵢ and Gαs have a definitive role on its infective capacity.

Yanovsky, Marcelo Javier. "Control del crecimiento y desarrollo de las plantas por la luz: Funciones fotoperceptivas y mecanismos de acción del fitocromo A" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La luz es un factor ambiental crítico para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Provee no solo la energía lumínica necesaria para el proceso fotosíntético, sino también señales informativas que las plantas utilizan para coordinar su crecimiento y desarrollo con el ambiente circundante. La percepción de las señales lumínicas esta mediada por fotorreceptores específicos como los fitocromos. Estos son una pequeña familia de proteínas codificada por cinco genes en Arabidopsis thaliana, FITOCROMO A-E (PHY A-E). El objetivo de esta tesis es dilucidar las funciones sensoriales y los mecanismos de acción de uno de los fitocromos más abundantes, el fitocromo A (phy A). Las funciones fotosensorias del phy A en condiciones naturales de radiación fueron investigadas comparando el comportamiento de plantas con niveles normales de phy A y de plantas mutantes y/o transgénicas con niveles incrementados o reducidos de este fotorreceptor. De los experimentos se puede concluir que el phy A actúa como un sensor de cambios en la irradiancia. En plantas etioladas el phy A es el único fotorreceptor que permite a las plantas distinguir la transición entre la oscuridad reinante bajo la superficie del suelo y la escasa luz presente bajo canopeos muy densos. Los cambios morfológicos y fisiológicos desencadenados por el phy A en respuesta a la percepción de dicho cambio en el ambiente lumínico incrementan notablemente la supervivencia de las plantas emergidas en tales condiciones. El phy A, además, está involucrado en la percepción de los cambios en el ambiente lumínico producidos por la presencia de plantas vecinas: percibe directamente la disminución de la cantidad de luz roja (R) y rojo lejana (RL) que se produce por el sombreado y modula, indirectamente, la sensibilidad a reducciones de la relación R/RL que se producen por la relexión selectiva de RL en las hojas de plantas vecinas. Estas acciones del phy A conducen finalmente a un incremento en la tasa de alargamiento del tallo que disminuyen el riesgo de sombreado. En plantas verdes el phy A también está involucrado en la percepción de las transiciones cotidianas oscuridad/luz que se producen al amanacer. En respuesta a la percepción de dicha señal el phyA sincroniza al reloj endógeno que controla el movimiento de las hojas y probablemente la actividad de numerosos procesos vitales en las plantas. El phy A actúa a través de dos modos de acción, el VLFR (por Very Low Fluence Responses) que se satura con muy bajos flujos de luz, y el HIR (por High Irradiance Responses) que se satura con altas irradiancias de RL. Aquí presento evidencias genéticas que indican que 1aacción del phy A en el VLFR y el HIR involucra dos mecanismos moleculares diferentes. Por un lado se identificaron dos loci, vlf1 (en el cromosoma 2) y vlf2 (en el cromosoma 5), polimórficos entre los ecotipos Landsberg erecta y Columbia de Arabidopsis thaliana, que afectan las respuestas VLFR pero no las HIR. También se caracterizaron las respuestas VLFR y HIR en dos mutantes de transducción de señales del phy A previamente identificados y se observó que uno de ellos, el fhy1, afectaba de manera similar las respuestas VLFR y HIR mientras que el otro, el fhy3, afectaba mucho más las respuestas HIR que las VLFR. En conjunto, estos resultados sugieren que el phy A desencadena las respuestas VLFR y HIR a través de dos vías de transducción de señales diferentes que poseen algunos elementos en común. Por otro lado, utilizando una estrategia novedosa de búsqueda, se identificaron dos mutantes débiles de phy A, denominadas phy A-301 y phy A-302, que afectaban mucho más las respuestas HIR que las VLFR. Tanto la mutante phy A-301 como la mutante phy A-302 presentaron niveles reducidos de phy A en ensayos de inmunodetección. La secuenciación del gen PH YAen el mutante phy A-301, reveló una mutación que da lugar a una proteína truncada que carece de 142 aa del extremo C-terminal. La secuenciación del gen PHYA en el mutante phyA-302 reveló una mutación puntual que convierte el glutamato 778 en lisina. Esta mutación se encuentra en una región previamente descripta como importante para la actividad regulatoria de los fitocromos. Estos resultados indican que las respuestas a muy bajos flujos, es decir las VLFR, y las respuestas a altas irradiancias, es decir las HIR, se diferenciarían en los niveles de phyA y/o en los dominios de ésta molécula necesarios para inducir cada una de las respuestas. En resúmen, hemos demostrado que el phyA está involucrado en la percepción de diferentes cambios en el ambiente lumínico durante distintas etapas del ciclo de vida de las plantas y hemos encontrado evidencias genéticas que indican que el phyA actuaría a través de dos vías de transduccíón de señales distintas, una inducida en respuesta a muy bajos flujos de luz y otra inducida en respuesta a altas irradiancias.

Abstract:
Light is a critical enviromental factor for plants. It provides not only the radiant energy for photosynthesis, but also the informational signals that plants use to adapt and optimize their growth and development in response to the ambient conditions. Perception of light signals is mediated by specific photoreceptors such as phytochromes. Phytochromes are a small family of proteins encoded by five genes in Arabidopsis thaliana (PHYA-PHYE). The aim of this thesis is to investigate the photosensory functions of phytochrome A (phyA) and to improve our understanding of the mechanisms by which this photoreceptor transduces different light signals. The photoperceptive functions of phyA were analyzed by comparing the behavior of mutant and transgenic plants with either reduced or increased phyA levels to that of wild type (WT) plants that have normal levels of this photoreceptor. It can be concluded, from the experimental results, that phyA acts as a sensor of irradiance. In etiolated plants phyA is the only photoreceptor capable of perceiving the transition from the dark envirnonment present below the earth surface to the low light levels present beneath very dense canopies. In response to the perception of that signal phyA induces several changes in the developmental pattern that are crucial for seedling survival. In light-grown plants phyA is directly involved in the perception of changes in the amount of red light (R) and far-red light (FR) produced as a consequence of vegetation shading, and modulates the sensitivity to changes in the R/FR ratio produced by the selective reflection of FR in the leaves of nearby plants. These actions of phyA lead to an increment in stem elongation that helps preventing future shading. In light-grown plants phyA is also involved in the perception of the dark/light transitions that occure daily at dawn. In response to such signal phyA sinchronizes the endogenous clock that controls the rhythm of leaf movement, and probably the activity of other vital processes. PhyA acts through two different action modes. The first, VLFR (for Very Low Fluence Responses) is saturated with very low fluences of either R or FR light. The second, HIR (for High Irradiance Reactions) is only saturated with high irradiances of FR. Here I present genetic evidence indicating that the action of phyA in the VLFR and HIR involve two different molecular mechanisms. First, I have identified two loci polyrnorphic between ecotypes Landsberg erecta and Columbia of Arabídopsis thalíana, vlf1 (on chromosome 2) and vlf2 (on chromosome 5), that affect VLFR but not HIR. Second, I have characterized two previously identified phyA signal transduction mutants, fhy1 and fhy3, and found that fhy3 is more affected in the HIR than in the VLFR, while fhy1 is similarly affected in both phyA action modes. These results suggest that phyA elicits VLFR and HIR through two different signal transduction pathways that have some common component(s). Finally, using a novel screening strategy, I have identified two mutants lacking HIR but retaining VLFR. The genetic complementation analysis indicated that they were weak alleles of phyA and therefore they were named phyA-301 and phyA-302. Western blott analysis revealed that both mutants had reduced phyA levels. The sequence analysis of the phyA-301 mutant indicated that the PHYA gene beared a mutation leading to a truncated phyA protein, lacking 142 aa from the C-terminal domain. The sequence analysis of the phyA-302 mutant revealed a mutation that converted glutamic acid 778 into lysine. These results indicate that the responses to very low fluences of light and the responses to high irradiances of FR are different either in the levels of phyA or in the domains of this molecule that are necessary to induce each type of response. In summary, we have shown that phyA is involved in the perception of different changes in the light environment during the whole life cycle of plants and we have found genetic evidence supporting the hypothesis that phyA activates two different signal transduction pathways, one in response to very low fluences of light and the other in response to high irradiances.

Cramer, Paula. "Estudio de la relación entre transcripción y Splicing alternativo de mRNAs eucarióticos" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En el presente trabajo de tesis nos hemos propuesto buscar evidencias sobre la coordinación entre los procesos de transcripción y splicing alternativo. Nuestro modelo de estudio consistió en construir una batería de minigenes α-globina/ fibronectina que incluyen al exón EDI de la fibronectina capaz de sufrir splicing alternativo, clonados río abajo de diferentes promotores. Con estos minigenes se transfectaron líneas celulares en cultivo, analizándose luego el patrón de splicing alternativo por medio de las técnicas de Northern blot y/o RTPCR. Encontramos así que el tipo de promotor determina el patrón de splicing alternativo. Este efecto del promotor sobre el splicing alternativo no depende de la fuerza del promotor ni de la secuencia de la región 5' no codificante de los mRNAs, sino de la calidad de factores de transcripción reclutados en el promotor. Posteriormente intentamos dilucidar el mecanismo subyacente a este fenómeno. Para ello sobreexpresamos proteínas que participan del splicing general y/o alternativo en otros modelos. Encontramos que sólo las proteínas SF2/ASF, SRp40, SRp55 y SC-35 son capaces de modificar el patrón de inclusión de EDI, mientras que las proteínas SRp20, SRp30c y Tra2βno tienen efecto alguno. El efecto de SF2/ASF, la proteína con mayor actividad estimulatoria, es específico de promotor y opera a través de las secuencias regulatorias en cis presentes en EDI, tal como lo demuestran los experimentos con minigenes mutantes en estas regiones. Los resultados mencionados constituyen la primera evidencia de coordinación entre transcripción y splicing alternativo. A partir de los mismos proponemos un modelo de interacción entre el dominio carboxiterminal (CTD ) de la RNA polimerasa II y los factores de splicing, compatible con los resultados observados en nuestro laboratorio y en otros grupos de investigación.

Abstract:
In this work we searched for evidence of coupling between transcription and alternative splicing. Our model consisted in the construction of a series of alphaglobin/ fibronectin minigenes including the fibronectin alternative ED1 exon, cloned downstream of different promoters. Cell lines were transfected with the minigenes and the alternative splicing pattern was analyzed either by Northern blot and/or RT-PCR. We found that the type of promoter controls the pattern of alternative splicing. This effect is neither dependent on promoter strength nor on the 5' non-coding region of the mRNAs, but on the quality of the transcription factors recruited by the promoter. We then tried to elucidate the mechanism underlying this phenomenon. For this purpose, we overexpressed splicing factors involved in general and/or alternative splicing in other models. We found that SF2/ASF, SRp40, SRp55 y SC-35 were the only the splicing factors with ability to stimulate ED1 inclusion, whereas SRp20, SRp30c y Tra2β had no effect. The effect yielded by SF2/ASF, the protein with the highest stimulation activity, is promoter specific and is mediated by exon regulatory sequences, as revealed by experiments performed with mutants in these regions. The mentioned results comprise the first evidence of coupling between transcription and alternative splicing. Based on our results and evidences presented by other laboratories, we propose a model in which the carboxyterminal domain (CTD) of the RNA polymerase II interacts with the splicing factors.

Bais, Carlos E.. "El receptor acoplado a proteína G del herpes virus asociado al sarcoma de Kaposi (Kaposi’s Sarcoma associated herpevirus o KSHV) es una oncoproteína viral y un activador angiogénico" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Abstract:
The Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV-HHV-8)is a γ-2 herpesvirus that is implicated in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma and of primary effusion B-cell lymphomas (PELs), it encode putative oncogenes, and genes that may cause Kaposi's sarcoma lesions by stimulating angiogenesis. The G-protein-coupled receptor encoded by an open reading frame (ORF 74) of KSHV is expressed in Kaposi's Sarcoma lesions and in PELs, and stimulates signaling pathways linked to cell proliferation in a constitutive (agonist-independent) way. Here we show that signaling by this G-Protein Coupled Receptor leads to cell transformation an tumorigenicity, and induces a switch to an angiogenic phenotype mediated by vascular endothelial growth factor (VEGF), an angiogenesis and Kaposi's-spindle cell growth factor. We find that this receptor can activate ( in HEK293T) two protein kinases, JNK/SAPK and p38MAPK, by triggering signaling cascades like the ones induced by inflammatory cytokines that are angiogenic activators and mitogens for Kaposi's sarcoma-cells and B cells. Although this is a suggestive result, when we express KSHV-GPCR in different cell types it activate different signaling cascades, and induces different phenotypes. Using pathway specific dominant negatives and pharmacological inhibitors we show that, in the cell line NIH3T3, the activation of JNK and p38 play a major rol in the molecular mechanism of KSHV-GPCR induced cell transformation. Endothelial cells play a central rol in kaposi's sarcoma pathogenesis. KSHV infects endothelial cells and spindle-like cells, of suspected endothelial origin, wich are present in the kaposi's sarcoma lesions. Therefore, in the context of viral infection, KSHV-GPCR is expressed in endothelial cells. As the expression of KSHV-GPCR has different biological and biochemical effects in different cell types we decide to study the consecuences of KSHV-GPCR expression in human primary endothelial cells. KSHV-GPCR expression in endothelial cells induce strong morphologic changes, modifications in the citoskeleton structure, secretion of metaloproteases and resistence to serum starvation mediated by activation of the PI3K/AKT pathway's. All those changes are reminiscent of the transformed phenotype. Usually, the expression of transforming oncogenes in primary cells induces shortage of telomeres, premature senescence, and cell death. In sharp contrast the expression of KSHV-GPCR in primary endothelial human cells stabilize telomere length, by an alternative mechanism independent of telomerase activity (Alternative Lengthening of Telomeres or ALT ), and inmortalize endothelial cells. To our knowledge this is the first demostration that a protein encoded by KSHV is able to inmortailize primary human cells. Thus using a KSHV oncogenic protein we created a new inmortilized endothelial cell line that we call Ecs-KSGPCR. As predicted by the multistep carcinogenesis hypotesis, our preliminary experiments suggest that the mechanisms of Terminal Proliferation Arrest (TPA) are not completelly supressed by KSHV-GPCR and that additional oncogenic events are necessary in order to fully transform human primary endothelial cells. Further research will determine wether other KSHV's oncogenes can cooperate oncogenicaly with KSHV-GPCR. KDR/VEGFR-2 and Tie-2 are endothelial specific tyrosine kinase receptors that play key roles in vascular biology. These two receptors regulate cell survival and proliferation of endothelial cells during angiogenesis, as a consequence of this they appear to be minimally expressed in quiescent endothelium in vivo, and they are down regulated after a few passages, in vitro, of primary endothelial cells. Surprisingly KDR and Tie-2 are overexpressed in long term cultures of Ecs-KSGPCR. Altough in this work we show that the sustained expression of those receptors is functional, further experiments are required to determine if they play any rol in the inmortalization process. We conclude that KSHV-GPCR is a viral oncogene that can exploit cell signaling pathways to induce oncogenesis and angiogenesis in KSHV-mediated oncogenesis.

Cadenas, María Belén. "Mecanismos de señalización inducidos por el factor de crecimiento y transformación Beta 1 (TGF beta sub 1), en fibroblastos de ratón Swiss 3T3" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La superfamilia del TGFβ está formada por polipéptidos que regulan diferencialmente la división celular, en mamíferos. Dependiendo del tipo celular, el TGFβ1 puede inhibir, promover o potenciar la división celular. En monocapas confluentes y aquietadas de la línea celular Swiss 3T3, el TGFβ1 (O,5—2 ng/ml) no induce, ni inhibe la proliferación celular. Sin embargo, este factor es capaz de potenciar la proliferación inducida por la PGF2α (300 ng/ml) . De las señales activadas por la PGF2α, se buscó cúales eran las más importantes en la sinergia con el TGFβ1. Se comenzó estudiando la quinasa C (PKC), a través de la retromodulación con 12-tetradecanoilforbol l3-acetato (TPA, 800 nM, 96 hs.), o Briostatina l (lOO nM, 96 hs.). En la condición de retro-modulación de la PKC, se observó que el TGFβ1 (1,0 ng/ml) era capaz de inducir la proliferación celular (50 % de células en fase S, después de 28 hs. de estimulación, y 50 % de aumento en el número de células, después de 48 hs. de estimulación), siendo ésta dependiente, tanto de la concentración del factor, como de la concentración de los compuestos que retro-modulan la PKC. En las células pretratadas con TPA, la fase G1 tiene unas 6 a 7 horas más, que en las células sin pretratar. En la primer condición, el TGFβ1 induce la expresión de la ciclina D1, y en correlación a la mayor duración de la fase G1, ocurre horas más tarde después de la estimulación (lO-12 hs.), comparado con las células sin pretratar, estimuladas con PGF2α (6-9 hs.) . Fue interesante observar, que la PGF2α, induce la expresión de la ciclina Dl, en células pretratadas con TPA, aún cuando en esta condición no es mitogénica, y a pesar que la CDK4 se halle presente. Este resultado lleva a plantear que la expresión de la ciclina Dl, no necesariamente indica que la célula se dividirá, y además que es independiente de la PKC. Con el uso del anticuerpo monoclonal anti PKCα , se observó que esta enzima está ausente en el momento de agregado el TGFβ1, en células pretratadas con TPA. La inhibición directa de la PKC con el inhibidor específico GF 109203X (1O μM), agregado una hora antes a células sin pretratar, no fue suficiente para permitir que el TGFβ1 indujera la mitogénesis. El GF es capaz de inhibir parcialmente la sinergia entre el TGFβ1 y la PGF2α, mientras que inhibe totalmente la sinergia entre el TGFβ1 y el OAG, en células sin pretratar. Es decir que la PKC no es suficiente, pero sí necesaria en la primer sinergia, y sí muy importante en la última. El agregado de GF por períodos prolongados, no logra retro-modular la PKC. Los receptores del TGFβ1, detectados con el uso de anticuerpos, están presentes en ambas condiciones, y la medición del transporte de glucosa, inducido por este factor, pone en evidencia que la actividad de los mismos, no se ve alterada por el pretratamiento con TPA. El agregado de ácido okadaico (5 nM), junto al TGFβ1, en células sin pretratar, induce la síntesis de ADN (lO % de células en fase S), indicando la presencia de fosfatasas de ser/thr, pero no sería el único impedimento, por el cual el TGFβ1 no es mitogénico en las células Swiss 3T3. En el estudio de las sinergias del TGFβ1 con insulina y PGE1, se observó que, en células pretratadas con TPA, PGE1 no induce la proliferación, ni potencia la inducción de esta última por el TGFβ1 solo o agregado con insulina. De estos resultados se concluye, que la PKC es necesaria para que la PGE1 potencie la sinergia entre el TGFβ1 más insulina. La falta de potenciación entre el TGFβ1 y la PGE1, podría indicar un camino de señalización en común. Inhibiendo la PKA con PKI, péptido inhibidor (l nM), y también con el uso del inhibidor H-89 (l nM), se encontró que la inhibición de esta enzima no altera la inducción de la proliferación por el TGFβ1, en células pretratadas con TPA. Con el uso del inhibidor genisteina (10 μM), se observó que las quinasas de tirosina están involucradas en la sinergia del TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones, y en la inducción de la proliferación por el TGFβ1, en células pretratadas con TPA. El uso de lovastatina (80 μM) y mevalonato (800 μM), puso en evidencia la importancia relativa de la isoprenilación de proteínas, en la sinergia entre el TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones. El TGFβ1 no activa la MAPK (ERK 1/2) en ninguna condición, ni potencia la actividad, ni la presencia de la misma, en la sinergia con la PGF2α. La actividad de esta enzima se midió, a través de la inmunoprecipitación y fosforilación de la mielina básica, y con el anticuerpo anti ERK 1/2, bifosforilado (forma activa). El TGFβ1 induce la translocación de la Smad4 (medida por inmunoflourescencia, con anticuerpo anti Smad4), en ambas condiciones, y ésta no se ve alterada en las sinergias de este factor y la PGF2α. En conclusión, el TGFβ1 induce la proliferación celular en células Swiss 3T3, que han sido pretratadas con compuestos capaces de retro-modular la PKC, es decir, primero activada y luego degradada. La inducción de la ciclina Dl, debe ocurrir por una vía alternativa a ERK l y 2. El pretratamiento con TPA lleva a las células a una fase G0 diferente de la misma fase en la que se encuentran las células confluentes y aquietadas, sin pretratar. El TGFβ1 activa las moléculas señalizantes específicas de su camino de señalización, y éstas deben interaccionar con factores de transcripción u otros compuestos, que surgen por el pretratamiento con TPA, haciendo que la fase G1 sea más larga, tiempo en el cual se sintetizan y/o modifican compuestos necesarios para inducir la proliferación celular.

Abstract:
TGFβ is a superfamily of polypeptides that can differencially regulate mammalian cell division. Depending upon TGFβ1 interaction with various cell types, its action can cause inhibition, promotion, as well as potentiation of cell division. In confluent resting Swiss 3T3 cells, TGFβ1 (0,5-2 ng/ml) neither not induce, nor inhibits cellular proliferation. However, this factor enhances PGF2α (300 ng/ml) proliferative response, in this cell type . Of PGF2α-induced signalling activities, our endeavour was focused in to those involved in the synergy with TGFβ1. The first activity studied was protein kinase C (PKC), through it's “down-modulation” either with the phorbol ester, 12-tetradecanoylphorbol l3-acetate (TPA, 800 nM, 96 hs), or Bryostatin 1 (100 nM, 96 hs). In PKC “down-modulated” cells, TGFβ1 can induce entry in S phase (50 % of cells in S phase, after 28 hs of stimulation, and 50 % more cells, upon 48 hs of stimulation), being dependent upon factor concentration, as well as on PKC-“down-modulating” compounds concentration. In TPA-treated cells, the G1 phase is of 6 to 7 hs more, than cells without treatment. In the first condition, TGFβ1 induced cyclin D1 expression, and in correlation with the G1 phase extension time, this expression occurs hours latter after stimulation (10-12 hs), compared with cells without treatment, stimulated with PGF2α (6-9 hs) . It was interesting to observe that PGF2α induced cyclin D1 expression in TPA-treated cells, eventhough in this condition failed to induce mitogenesis, and even with CDK4 presence. This results implie that cyclin D1 expression, does not necessarily indicate that cells are going to divide, and that such event is independent of PKC activity. Using monoclonal antibody anti PKCα , we reveal that this enzyme is absent upon TGFβ1 addition, in TPA-treated cells. PKC direct inhibition with GF 109203X (10 μM), PKC-specific inhibitor, added 1 hour prior to cells without treatment, was not enough to allow TGFβ1 induce mitogenesis. GF inhibited parcially the synergy between TGFβ1 and PGF2α, and prevent totally the action between TGFβ1 and OAG, in cells without treatment. Thus, PKC is not sufficient, but yet necessary in the first synergy, and important in the last one. GF added for long periods of time, is not capable of down-modulates PKC. TGFβ1 receptors, detected by antibodies, are present in both conditions, and glucose transport measurements, induced by this factor, puts in evidence, that receptor activities are not altered by TPA treatment. Okadaic acid (5 nM) added with TGFβ1, in cells without treatment, induce DNA synthesis (10 % of cells in S phase), indicating the existence of ser/thr phosphatases. However, this would not be the only retrain for TGFβ1 to induce mitogenesis in Swiss 3T3 cells. In the synergies study between TGFβ1, insulin and PGE1, it was observed that in TPA-treated cells, PGE1 neither induce proliferation, nor enhances TGFβ1 action, added without or with insulin. From this findings we conclude that PKC is necessary for PGE1 to enhance the synergy between TGFβ1 and insulin. The lack of synergy between PGE1 and TGFβ1, may indicate that they share common signalling pathways. PKA inhibited using PKI (1 nM), peptide inhibitor, and H-89 (1 nM) inhibitor, reveal that this activity is not involved in TGFβ1-induced proliferation, in TPA-treated cells. The use of inhibitor Genistein (10 μM), enable to show that tirosine kinases activities might be involved in the synergy between TGFβ1 and PGF2α, in both conditions, as well as for the TGFβ1-induced proliferation in TPA-treated cells. Using lovastatin (80 μM) and mevalonate (800 μM), indicated the relative importance of protein isoprenylation in the synergy between TGFβ1 and PGF2α, under both conditions. TGFβ1 did not activate MAPK (ERKl/2) in any condition, nor enhanced it's activity or presence in the synergy between PGF2α. MAPK activity measured by immunoprecipitation and phosphorylation of myelin basic protein, as well as by immunodetection with antibody anti ERK 1/2 biphosphorylated (active form). Thus, this results indicated that MAPK activity was induced only by PGF2α, and was not altered by TGFβ1 addition. Smad4 translocation induced specifically by TGFβ1 (measured by immunofluorescence with antibody anti Smad4), in both conditions, is not altered in the synergy with PGF2α. We conclude that TGFβ1 induces proliferation in Swiss 3T3 cells, whose PKC had been “down-modulated” by specific compounds, thus, first activated and then degraded. Cyclin D1 induction by TGFβ1 may occurs via an alternative mechanisms to ERK 1/2 action. TPA treatment leave the cells in a different G0 state, compared with the same state in which confluent and resting Swiss 3T3 cells are. TGFβ1 activated its specific signalling molecules, and this ones may interact with transncription factors or other compounds, which appeared by TPA treatment, thus lengthening G1 phase duration, required for the synthetisis and/or modification of compounds necessaries to induce cellular multiplication.

Di Noia, Javier Marcelo. "Familias de genes que codifican proteínas de tipo mucina en Trypanosoma cruzi" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las mucinas son glicoproteínas cuyo esqueleto proteico está densamente cubierto por oligosacáiidos unidos a Thr y Ser. Los azúcares representan hasta un 80% de la molécula, confiriéndole una estructura extendida y un fuerte carácter hidrofílico. Participan en procesos de protección, lubricación y adhesión. Trypanosoma cruzi posee proteínas de tipo mucina en la superficie en todos sus estadios. En por lo menos dos de ellos las mucinas son las principales glicoproteínas de membrana y funcionan como aceptores de ácido siálico, azúcar que el parásito obtiene de glicoconjugados del medio mediante la trans-sialidasa, una enzima solo presente en Tripanosomátidos. Dado que el ácido siálico es importante en diversos procesos relacionados con la infección del parásito a vertebrados, el objetivode esta tesis fue caracterizar los genes de las mucinas de T. cruzi. Se describieron dos familias de genes tipo mucina en el parásito. La primera, denominada TcMUC, es muy compleja y polimórfica con unos 500 genes por genoma haploide. Esta familia puede dividirse en tres grupos de genes que comparten las regiones correspondientes al amino y carboxilo terminal del producto deducido, y que codifican para un péptido señal y para una señal de anclaje por glicosilfosfatidil inositol (GPI), pero difieren en su región central. El grupo I posee un número variable de repeticiones con la secuencia T8KP2 como región central. El grupo II posee regiones centrales no repetitivas pero diferentes para cada miembro, seguidas por repeticiones degeneradas ricas en Thr. El grupo III es homogéneo y no posee repeticiones de ningún tipo. Los productos derivados de los genes del grupo I y II presentan una región hipervariable en su amino terminal debida a la acumulación localizada de mutaciones. El análisis de la expresión de los genes mostró que los ARNm del grupo I se expresan en mayor abundancia en el estadío de tripomastigote mientras que los del grupo II pueden variar según cada miembro. Los productos de los genes del grupo I se identificaron como mucinas ancladas en la membrana por GPI. Sueros de ratones infectados reconocieron proteínas recombinantes del grupo I, indicando que las mucinas codificadas están efectivamente presentes en los estadios relacionados con la infección. De la misma forma, sueros de infección de ratones, humanos y conejos reconocieron algunas regiones hipervariables de mucinas del grupo I indicando que están presentes en la proteína madura y que más de una puede expresarse durante el curso de la infección. Dado que las repeticiones están muy O-glicosiladas deben adoptar una estructura extendida, con el N-terminal hipervariable como extremo externo y su C-terminal anclado a la membrana por GPI. La segunda familia, denominada TcSMUG, es mucho menos compleja, con alrededor de 70 genes por genoma haploide. Está compuesta por dos grupos de genes, denominados S y L, dispuestos en tándems independientes en el genoma. Los productos S y L están estructuralmente muy relacionados pero poseen una regulación diferencial específica de estadío de la abundancia del ARNm, ejercida al nivel de la estabilidad del mensajero. El ARNm del grupo S esta presente en los estadios relacionados con el insecto vector. El ARNm del grupo L está presente en todos los estadios pero es mucho más abundante en los estadios capaces de replicarse. Las proteínas deducidas de esta familia poseen regiones centrales compuestas por repeticiones (grupo L) o no repetidas (grupo S), pero ambas con un contenido alrededor del 50% en Thr y con una estructura muy similar a una apomucina. Sus productos poseen un peso molecular alrededor de 7.000 descontando las señales de importación al reticulo endoplasmático y de anclaje por GPI. La secuencia deducida de las proteinas del grupo S coincide con secuencias de péptidos obtenidos en otro laboratorio a partir de mucinas purificadas del estadio epimastigote. Se identificaron entonces genes que codifican mucinas de los estadios trlpomastigote sanguíneo (TcMUC grupo I) y epimastigote (TcSMUG grupo S). Si bien ambos grupos están estructuralmente muy relacionados, el parásito regula la expresión de ambos de acuerdo al hospedador y, mientras que las mucinas expresadas en el insecto son homogéneas en secuencia aquellas expresadas en el vertebrado poseen en la región más expuesta epitopes que varían entre los diferentes miembros de la familia.

Abstract:
Mucins are glycoproteins whose protein core is densely O-glycosylated in Thr and Ser residues. Sugars account for up to the 80% of the molecular mass, conferring it an extended structure and a strong hydrophilic character. They can be a protective barrier. serve for lubrication and act as adhesion molecules. Trypanosoma cruzi has mucin-type molecules on the surface of all its stages. In at least two of them, mucins are the main surface glycoproteins and sialic acid acceptors. This sugar is transferred to the parasite mucins from glycoconjugates at the medium by a unique Trypanosomatids-specific enzyme called trans-sialidase. Given that sialic acid is important in infection related processes the main objective of this Thesis was to characterize mucin genes in T. cruzi. Two mucin-type gene families were described. The first one, named TcMUC, is very complex and polymorphic with about 500 genes per haploid genome. There are three groups of genes within this family that share the regions corresponding to N and C termini of the deduced product, encoding a signal peptide and a GPI anchor signal respectively, but that differ in their central region. Group I central region is composed of a variable number of tandem repeats with the consensus sequence T8KP2. Each member of Group II has unique non-repetitive central regions followed by degenerated Thr-rich repeats. Group III is homogeneous and has no Thr runs. The products derived from Groups I and II have a hypervariable mature N-terminus due to the localized accumulation of mutations. Gene expression analyses showed that Group I is highly expressed in the cell-derived trypomastigote stage while Group II can vary in abundance among stages depending on the studied member. Group I gene products were identified as mucins GPI anchored to the parasite membrane. Infected mice sera recognized recombinant Group I proteins, indicating that mucins encoded by them are present in the stages of the parasite present during the infection. In the same way, mice, human and rabbit infection sera recognized some hipervariable regions from Group I mucins suggesting that they are present in the mature protein and that more than one can be expressed during the infection. Given that the Thr-rich repeats are highly O-glycosylated they must adopt an extended structure. with the hypervariable N-terminus as external end and GPI anchored to the membrane by its C-terminal end. The second family, named TcSMUG, is much less complex with about 70 genes per haploid genome. It is composed of two groups of genes, named S and L, arranged in independent tandems in the genome. The S and L products are structurally related but have differential stage-specific regulation of their mRNA abundance determined by mechanisms affecting their mRNA stability. Group S mRNA is present in the insect related stages. Group L mRNA is present in all the stages but is much more abundant in the replicative ones. Deduced proteins have central regions composed of tandem repeats (group L) or non-repeated sequences (group S) but both with about 50% Thr content. and with an apomucin-like structure. Their products have a molecular mass around 7 kDa without the signal and GPI anchor peptides. The sequence deduced from proteins of the group S matched peptide sequences obtained elsewhere from epimastigote purified mucins so having a positive identification. Then, genes encoding mucins from tripomastigote (TcMUC group I) and epimastigote (TcSMUG group S) stages were identified. Yet both groups are structurally related, their expression is regulated in a stage-specific manner in the parasite, according to the host. While those expressed in the insect are homogeneous in sequence, those expressed in the vertebrate that are targets of the immune response have variant epitopes in their exposed N-temini.

Cremona, María Laura. "TRANS-SIALIDASA en Trypanosoma cruzi: estudio de la estructura y función de esta familia de antígenos de superficie" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La enfermedad de Chagas es una de las parasitosis endémicas más importantes de América. Dieciocho millones de personas infectadas releva un informe reciente de la Organización Mundial de la Salud (WHO, 1998). Tryparzosoma cruzzi es el parásito responsable de esta enfermedad. Presenta en su superficie la trans-sialidasa, una enzima unida a la membrana por un enlace glicofosfatidilinositol. Esta enzima le otorga la capacidad de adquirir ácido siálico a partir de sialiglicoconjugados del organismo que infecta, ya que T cruzles incapaz de sintetizar este monosacárido. La trans-sialidasa fue involucrada en aspectos clave de la infección y la supervivencia del parásito en sangre. La familia de proteínas de la trans-sialidasa está codificada por al menos 140 genes que pueden clasificarse en tres sub-familias de acuerdo a la estructura y la función de sus productos proteicos. Dos de estos grupos son expresados en tripomastigotes, la forma infectiva del parásito, y se distinguen en su capacidad de trans-glicosidar: las trans-sialidasas activas y las trans-sialidasas inactivas. La comparación de la secuencia de la región N-terminal de proteínas de ambos grupos permitió deducir que la sustitución Tyr-His en la posición 342 de la proteína madura determina su capacidad de actuar como trans-sialidasa. Esta tirosina es imprescindible para que la molécula pueda actuar como enzima y su reemplazo por histidina, residuo presente en los integrantes de la familia sin actividad enzimática, determina la pérdida total de la capacidad trans-glicolítica. Además de la Tyr342,otro aminoácido, Pro231, también es necesario para la actividad enzimática: el cambio Pro231Ala resulta en una trans-sialidasa parcialmente activa con respecto a la enzima natural. Se examinó la capacidad de las proteínas inactivas para unir ácido siálico y galactosa en un ensayo de aglutinación y se comprobó que las trans-sialidasas enzimáticamente inactivas aglutinan glóbulos rojos desialidados que presentan betagalactosas terminales, la misma especificidad que requiere la enzima. La trans-sialidasa podría definirse como una sialidasa particular. En lugar de hidrolizar ácido siálico lo transfiere preferencialmente a beta-galactosas terminales presentes en glicoproteínas y glicolípidos y difiere de las sialil y glicosil-transferasas conocidas en que no requiere un nucleótido-azúcar como dador. De los 16 aminoácidos que constituyen el sitio activo de la sialidasa de Salmonella typhimurium, 14 aminoácidos, incluyendo la Tyr342, están presentes en las mismas o en similares posiciones en la estructura primaria de la trans-sialidasa. Tryparzosoma rangeli, parásito de origen americano no patógeno para el hospedador humano, libera al medio una sialidasa cuya secuencia primaria es 70 % homóloga a la trans-sialidasa de T. cruzi La estructura cristalográfica de la sialidasa obtenida en nuestro laboratorio permitió obtener el modelo de la trans-sialidasa. La comparación de ambas estructuras permitió la identificación de unos pocos aminoácidos que modularían la actividad de transferencia. Los experimentos de mutagénesis dirigida sugirieron la presencia de un sitio distinto de unión para el carbohidrato aceptor del grupo sialilo, y una probable diferencia en la arquitectura de ambos sitios activos.

Abstract:
Trypanosoma cruzzi is the protozoan haemoflagelate responsible for Chagas’ disease, which affects almost 18 million people in America, as reported recently by the World Health Organization (WHO, 1998). T. cruzzi trypomastigotes acquire sialic acid from host glycoconjugates by means of a plasma membrane associated trans-sialidase, as it is unable to synthesize this sugar. This enzyme differs from all other known sialyl- and glycosyl- transferases in that it does not require a nucleotide sugar as donor. It has been involved in key aspects of parasite’s infection and survival. This enzyme belongs to a large family of proteins encoded by at least 140 genes. These proteins contain the enzymatic region at the N-terminus, the only one required for trans-sialidase activity and an antigenic domain on the C-terminus. Some members of the family lack the enzymatic activity. Gene encoding inactive members are not a few, but rather are present in the same copy number, 60-80 per haploid genome, as those encoding active trans-sialidase. The complete sequences of the enzymatic region of active an inactive members were compared and it showed a limited divergence among them: 20 out of the 642 amino acids in the region were found to differ. From these 20 amino acids, only one was found to be essential for enzymatic activity. A Tyr residue at position 342 of the mature protein is deduced in active proteins while an His at the same position is present in inactive ones. This naturally occurring Tyr324His substitution completely abolished trans-sialidase activity. In addition to Tyr, a second amino acid, Pro231, was found to be necessary for full enzymatic activity. A Pro231Ala change rendered the trans-sialidase protein partially active. Recombinant inactive proteins were purified and assayed for sialic acid and galactose binding activity in agglutination tests. The enzymatically inactive trans-sialidases were found to agglutinated de-sialilated erythrocytes but not untreated red blood cells. Assays made with mouse and rabbit red blood cells suggest that inactive trans-sialidases bind to beta, rather than alpha terminal galactoses, the same specificity required by active trans-sialidases. At least some molecules in the trans-sialidase family that have lost their enzymatic function still retain their Gal-binding properties and might have a function as lectins in the parasite-host interaction. The trans-sialidase could be defined as a particular sialidase that, instead of hydrolyzing sialic acid, it preferentially transfers the monosaccharide to a terminal beta-galactose in glycolipids and glycoproteins. Fourteen amino acids residues, including Tyr342, out of the 16 amino acids that build the active site of the sialidase from Salmonella typhymurium, are present at the same or similar positions in the primary structure of trans-sialidase. The crystal structure of the sialidase from the closely related American trypanosome T. rangeli allowed the modeling of T. cruzi trans-sialidase. Comparison of these structures allowed the identification of few amino acids that may modulate transferase activity. Mutagenesis experiments suggest the presence of a distinct binding site for the acceptor carbohydrate and different arquitectural arrangements of both active sites.

Pignataro, Leonardo Antonio. "Neuroesteroides en el sistema nervioso central en desarrollo : biosíntesis y modulación del complejo receptor GABA sub A" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El ácido γ-aminobutírico (GABA) se une principamente al receptor GABAa y aumenta la conductancia de la membrana plasmática al ion Cl-, lo que suele estar acompañado de un hiperpolarización de la misma. Estas funciones del GABA son moduladas por diversas drogas como ser benzodiazepinas, barbitúricos y neuroesteroides. Los resultados aquí presentados demuestran que al igual que en los mamíferos los neuroesteroides son capaces de modular positivamente al receptor GABAa presente en el SNC de las aves, siendo este efecto mayor en los estadios embrionarios. Además, se comprobó que en el SNC de las aves existe un sitio esteroideo en la molécula receptora con requerimientos estrecuturales para la neuroactividad diferente a los hallados en mamíferos. La biosíntesis de derivados de la progesterona en el lóbulo óptico en desarrollo reveló que la misma es mayormente metabolizada a esteroides 5β-reducidos, que luego son 3β-hidroxilados resultando en el derivado epipregnanolona, el cual modula la unión del flunitrazepam en forma inversamente relacionada con la edad. Por último, el tratamiento crónico in ovo con este esteroide demostró que el mismo es capaz de reducir el acoplamiento alostérico entre los sitios benzodiazepínicos y GABA érgicos con el de los neuroesteroides y por otro lado facilitar la interacción enre los sitios de GABA con los de benzodiazepinas y barbitúricos. Estos datos sugieren que la epipregnanolona podría endógenamente modular las interacciones alostéricas del receptor GABAa de la aves afectando su funcionamiento.

Abstract:
γ-aminobutyric acid (GABA) binds mainly to GABAa receptor increasing membrane chloride conductance, that usually results in membrane hyperpolarization. GABA actions are modulated by several drugs such as benzodiazepine, barbiturates and neurosteroids. We demonstrated that neurosteroids positively modulate GABAa receptor present in avian CNS, in a manner inversely related to age. Results also disclosed that structural requirements for neuroactivity in birds are not identical to those of mammals. Pogesterone derived steroids produced in the optic lobe are mainly 5β-reduced metabolites, which are in turn 3-βhydroxilated to form epipregnanolone. Epipregnanolone biosynthesis is higher at early stages of development as well as its ability to modulate flunitrazepam binding. Lastly, in ovo chronic treatment with this steroid produced a reduction in the allosteric coupling between GABA and benzodiazepine sites and the steroid modulatory sites. On the other hand, this treatment increased the coupling between GABA receptor sites and benzodiazepine and barbiturate modulatory sites. These data suggest that epipregnanolone may endogenously modulate GABAa receptor interactions and consequently affects its function.

Silber, Ariel M.. "Identificación de dos moléculas de Trypanosoma cruzi involucradas en la invasión de las células del huésped" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Rabossi, Alejandro. "Caracterización del proceso de degradación de tejidos larvales durante la metamorfosis en la Mosca del Mediterráneo, Ceratitis Capitata (Wiedemann)" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Se han estudiado en detalle, por primera vez, los eventos moleculares más importantes responsables de la histolisis de tejidos larvales durante la transición larva-adulto de dípteros. Se han descrípto, por primera vez en los insectos, proteinasas lisosomales específicas de la histolisis y se ha correlacionado su actividad con la de otras enzimas degradativas y con las imágenes de cambios anatómicos degenerativos en músculos y cuerpo graso. Los principales resultados obtenidos son: l. Se aisló una nueva aspartil-proteínasa de 43.000 daltons, específica de la histolisis, denominada EMAP (Early metamorphosis aspartyl proteinase), con características bioquímicas similares al grupo de las Catepsinas tipo D y cuya secuencia amino terminal no presentó homología con este grupo. Usando la secuencia correspondiente al N- terminal se obtuvo un transcripto que fue clonado y secuenciado. La secuencia obtenida mostró homología del 59% con catepsina D de porcino, 51% con una proteinasa aspártica de mosquito y 60% con una proteinasa aspártica de arroz. 2. Se aislaron dos nuevas cisteín proteínasas lisosomales denominadas MCP I y MCPII (metamorphosis cystein proteinase), de 32.000 y 67.000 daltons respectivamente. Ambas enzimas fueron caracterizadas bioquímicamente y sus extremos amino terminales secuenciados. MCP I mostró características bioquímicas similares y alta homología N-terminal con las Catepsinas B de mamíferos (55.5%) y con una cisteín proteinasa de la mosca Sarcophaga (44%). MCP II es una endoproteinasa de nuevo tipo, cuyo N-terminal no presentó homología con ninguna cisteín proteinasa conocida en invenebrados, ni tampoco en vertebrados. 3. El perfil de actividad de las nuevas endopeptidasas coincidió con el de fosfatasa ácida, β-glucosidasa y β-galactosidasa lisosomales y correlacionó estrechamente con un marcado descenso en el contenido de proteínas registrado durante las etapas tempranas de la metamorfosis. El incremento en la actividad de enzimas lisosomales coincidió temporalmente (entre 20³º y 48 h desde la inmovilización definitiva de la larva) con la aparición de los primeros signos de muerte celular en los músculos y el cuerpo graso. 4. Es la primera vez que se describe en insectos el progreso temporal de la histolisis del cuerpo graso larval. Se determinó que la degradación de éste es un proceso gradual, que se inicia a las 20³ºh cuando las células que forman una red se separan unas de otras y finaliza alrededor de las 120 h cuando gran parte de las mismas se han fragmentado. Se determinó que los músculos esqueléticos correspondientes a los segmentos anteriores (l a 5) se fragmentan a partir de las 22 h, mientras que los correspondientes a la región abdominal, lo hacen recién a partir de las 72 h. 5. Se encontró una estrecha correlación entre la degradación del cuerpo graso larval y la depleción en el contenido de las principales moléculas de reserva. Cortes histológicos de cuerpo graso teñidos por PAS demostraron la completa desaparición del glucógeno en horarios posteriores a las 20³º h. El glucógeno fue consumido principalmente durante la etapa de salto y dispersión de la larva, mientras que el remanente (14% del contenido original, de acuerdo a dosaje directo) se consumió durante las primeras 20³ºh después de iniciada la metamorfosis. Los lípidos se consumieron principalmente a partir del estadio pupal (40 h), confirmando las imagenes histológicas obtenidas, donde se registró la disminución en el número y tamaño de las vesículas de grasa a partir de este horario Los resultados alcanzados han permitido obtener un panorama integral de la progresión de eventos degradativos durante la transición larva-adulto y mostraron por primera vez, que con muy pequeñas variantes, los eventos de la metamorfosis tienen idéntica duración relativa y representan etapas equivalentes del ciclo de vida en todos los insectos dípteros.

Abstract:
We have studied in detail for the first time the most important molecular events involved in larval tissue degradation during dipteran larva to pupa transition. We have described for the first time in insect, specific lysosomal proteinases of the hystolitic process. We have also correlated these activities with other degradative enzymes and with the anatomic changes in muscles and fat body registered during metamorphosis. The most important results obtained are: l. We isolated a novel aspartic proteinase with a relative molecular weight of 43,000, called Early Metamorphosis Aspartic Proteinase, that is specific of hystolisis. EMAP presented similar biochemical characteristics to the Cathepsin D group, but the amino terminal sequence did not present homology with this group. Using the sequence corresponding to the N-terminal, we obtained a transcript which was cloned and sequenced. The sequence obtained showed a 59% homology to pork Cathepsin D, 51% to a mosquito aspartic proteinase and 60% to a rice aspartic proteinase. 2. We isolated two novel lysosomal cysteine proteinases denominated MCP I and MCP II (Metamorphosis Cysteine Proteinases), with 32,000 and 67,000 daltons respectively. The biochemical characterization of the enzymes and the amino terminal sequences were obtained. MCP I showed similar biochemical characteristics and high homology in the N-terminal sequence with mammalian Cathepsin B group (55.5%) and with the fly Sarcophaga cystein proteinase (44%). MCP II is a novel endopeptidase with an N-terminal sequence which neither presented homology with any cysteine proteinase of invertebrate nor with vertebrate. 3. The novel endopeptidase activity profile during metamorphosis was coincident and correlated well with the acid phosphatase, β-glucosidase and β-galactosidase activities profiles. Endopeptidase profile activity also correlated with the decrease in the amount of proteins registered during pre-pupal and pupal stages. The increment in lysosomal enzymes activities observed (from 20³º h to 48 h), were coincident with the appearance of the first symptoms of cell death in muscles and fat body. 4. As far as we know, this is the first time that larval fat body histolytic process was described in insect. It was determined that this is a gradual process, that begins at 20³º h when larval fat body cells dissociate from the typical mesh structure and ends 120 h after when most of the cells are fragmented. Larval muscles from 1ˢͭ to 5ͭʱ segment were fragmented 22 h from the beginning of metamorphosis. Muscles from the abdominal region fragmented since 72 h. 5. Temporal larval fat body degradation agreed well with the depletion of storage molecules. PAS histologic stain demonstrated the complete disappearance of glycogen in samples later than 20³º h. While the glycogen content decreased during larva III jumping and dispersal stage, the remaining 14 % remanent glycogen disappeared during the first 20³º h since the beginning of metamorphosis. Lipids were degradated since the beginning of the pupal stage (40 h), confirming the histologic images obtained, where a decrease in the number and size of lipids vesicles were registered since 40 h. The results reached in this Thesis have allowed us to obtain a complete view of the degradation events during larva-adult transition and showed for the first time, that with very little variations, the metamorphosis events have an identical relative duration and represent equivalent stages of the life cycle in all the dipteran insects.

De Lorenzo, Mariana S.. "Acción del antiestrógeno Nafoxidina y del inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1) en la angiogénesis tumoral" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La terapia antiangiogénica se basa en estrategias moleculares que intentan bloquear la neovascularización tumoral y así detener la progresión de la masa neoplásica. Las células endoteliales suelen responder al estímulo estrogénico. La angiogénesis implica la proliferación del endotelio junto a la remodelación de la matriz extracelular, donde participan, las metaloproteinasas (MMPs) y sus inhibidores (TIMPs). En el presente trabajo se investigaron los posibles mecanismos antiangiogénicos del potente antiestrógeno nafoxidina y el intrincado papel del TIMP-1 en la vascularización y progrésión tumoral. Se encontró que el tratamiento in vitro de células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) con dosis no citotóxicas de nafoxidina disminuye de manera dosis-dependiente la proliferación. Nafoxidina redujo también la adhesión, la capacidad de extensión sobre el sustrato y la migración de las células endoteliales, e indujo un aumento en la activación de la MMP-2 y en la secreción de TIMP-1. Además, inhibió significativamente la invasión y la formación de cordones endoteliales sobre Matrigel. La acción antiangiogénica de nafoxidina podría asociarse a acciones indirectas, mediadas a través del aumento del TIMP-1, como también a efectos directos del antiestrógeno sobre las células HUVEC. Los cotratamientos in vitro con nafoxidina y el éster de forbol PMA indicaron que la acción antiangiogénica podría estar relacionada con la inhibición de vías de señalización intracelular dependientes de la proteína quinasa C. El cotratamiento con el inhibidor de fosfodiesterasas IBMX y el derivado de CAMP dbcAMP sugirieron la participación de múltiples vías de señales en la acción antiangiogénica de nafoxidina. Otros ensayos in vitro con el inhibidor de fosfolipasa D n-butanol, el ionósforo A23187 y el bloqueante de canales de calcio verapamilo indicaron la importancia de estas vías de señales en la formación de capilares endoteliales. Finalmente, se exploraron in vivo los efectos de nafoxidina y TIMP-1, empleando un modelo singénico de carcinoma mamario en ratones BALB/c y un melanoma murino inoculado en hídridos C57BL/6j-CBA transgénicos que sobrexpresan TIMP-1 humano en hígado y lo vuelcan a la circulación. Los datos obtenidos en animales ratifican La complejidad de los mecanismos regulatorios que operan in vivo durante la vascularización tumoral y diseminación metastásica. Este trabajo aporta elementos útiles para el futuro diseño de ensayos clínicos con nuevos agentes antiangiogénicos para el tratamiento del cáncer.

Abstract:
Antiangiogenic therapies use molecular strategies to block tumor neovascularization and arrest neoplasic progression. Endothelial cells respond to estrogenic stimulation. Angiogenesis involves endothelial cell proliferatíon and extracellular matrix remodeling, in which take part metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMPs). In this present study it was investigated the potential antiangiogenic mechanisms of the antiestrogen nafoxidine and the intrincate role of TIMP-1 in vascularization and tumor progression. It was found that teatment in vitro with non citotoxic doses on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) decreased endothelial growth in a dose manner dependent. Nafoxidine reduced adhesion, spreading and migration of endothelial cells and induced an increment in MMP-2 activation and TIMP-1 secretion. Invasion and endothelial tube formation on Matrigel were inhibited. Antiangiogenic effect of nafoxidine could be associate with indirect actions, mediated by TIMP-1 increment, or also with direct effects of the antiestrogen on HUVEC. In vitro cotreatments with nafoxidine and phorbol ester PMA indicated that antiangiogenic action could be related with inhibition of PKC intracellular signalling pathways. Cotratments with phosphodiesterases inhibitor IBMX and cAMP derivative dbcAMP suggested the involvement of multiple signalling pathways. Other in vitro assays with phospholipase D inhibitor n-butanol, ionosphore A23l87 and L-type Ca2+ channels blocker veraparnil indicated that their pathways are important in endothelial tube formation. Finally, it was investigated the in vivo effects of nafoxidine and TIMP-1, using a murine mammary carcinoma in BALB/c mice and a murine melanoma inoculated in hybrid C57BL/6j-CBA transgenic mice that overexpress human TIMP-1 in liver and overturn it at circulation. The results in animals ratify the complexity of regulating mechanisms that act in vivo during tumor vascularization and metastatic dissemination. The present study supplies useful elements to future clinic trials designs with new antiangiogenic agents for cancer treatment.

Agüero, Fernán Gonzalo. "Purificación, caracterización, clonado y expresión de malato dehidrogenasas del helminto parásito Echinococcus granulosus" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las isoformas de malato dehidrogenasa presentes en protoescólices de E. granalosus fueron purificadas a homogeneidad, mediante un protocolo que incluye un fraccionamiento con sulfato de amonio y la separación de las isoformas citosólica y mitocondrial mediante cromatografía de afinidad en 5'-AMP-Sefarosa. La mMDH es llevada a homogeneidad mediante la adición de una cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. La cMDH en cambio es purificada siguiendo un protocolo ya descripto que incluye cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa, filtración molecular en columna de Superosa 12 y cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. la identidad de las isoformas fue confirmada mediante i) el estudio del comportamiento cinético de ambas en presencia de exceso del sustrato oxaloacetato, ii) el comportamiento diferencial que muestran las dos isoformas frente al detergente catiónico CTAB y iii) la secuenciación de péptidos a partir de ambas. En el caso de la mMDH, cuyo gen no se encontraba clonado, la información peptídica obtenida permitió comenzar el clonado del mismo, por amplificación de dos fragmentos del ADNc codificante de la enzima. Con ellos, se rastreó una biblioteca de ADNc de protoescólices que permitió extender la secuencia del ADNc hacia el extremo 3'. Finalmente, la secuencia del ADNc se completó utilizando la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (5' RACE), que permitió amplificar y secuencia: el extremo 5’ faltante. El ADNc completo fue utilizado para expresar, en forma recombinante, a la mMDH, en forma de fusión con la glutation-S-transferasa de S. japonicum. La proteína recombinante resultó activa y los parámetros cinéticos de la misma fueron comparados con los obtenidos para la enzima obtenida de la fuente natural. La cMDH recombinante, clonada y expresada por el grupo del Dr. Arnaldo Zaha también fue comparada cinéticamente con la enzima natural purificada en esta Tesis.

Abstract:
The isoforms of malate dehydrogenase present in protoscolices of E. granulosus were purified to homogeneity using a protocol that includes an ammonium sulfate precipitation step and an afinity chromatogmphy step on 5’-AMP Sepharose to separate cMDH from mMDH. The mMDH is obtained in apparently homogeneous form by an additional affinity chromatography step on Blue Sepharose. The cMDH is purified following a previously described protocol that includes ion exchange chromatography on DEAE-cellulose, gel filtration on Superose 12 columns and affinity chromatography on Blue Sepharose. The identity of the purified isoforms was confirmed based on i) the kinetic behaviour of the enzymes in the presence of an excess of oxaloacetate, ii) the differential behaviour shown in the presence of the cationic detergent CTAB, and iii) by sequencing of internal peptides from both isoforms. Peptide information from mMDH was used to start the cloning of its gene. This information allowed us to amplify two fragments from the cDNA that were then used to screen a protoscolex cDNA library and obtain a positive phage which contained sequence information corresponding to the 3’ end of the cDNA. The remaining 5' end was amplified using the 5' RACE technique. The full-length CDNA was then used to produce recombinant mMDH as a fusion protein with the S. japonicum glutathione-S-transferase. The recombinant protein was active and its kinetic parameters were compared with those of the natural enzyme. The recombinant cMDH, cloned and expressed by Dr. Zaha’s group was also compared kinetically with the natural enzyme purified in this Thesis.

D’Alessio, Cecilia. "Rol de los oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en Schizosacchatomyces pombe" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El retículo endoplasmático (RE) es el compartimiento de varias modificación post-traduccionales y plegamiento de proteínas destinadas a secreción, a membrana plasmática o a organelas del sistema endocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales mas frecuentes, la N-glicosilación, está relacionada con el plegamiento de las proteínas ya que sin la adición de N-glicanos, numerosas especies proteicas son incapaces de alcanzar su conformación nativa. Los intermediarios de plegamiento, las proteínas oligoméricas no totalmente ensambladas, las proteínas mal plegadas y los agregados son selectivamente retenidos en el RE. El transporte hacia el aparato de Golgi ocurre solamente cuando las proteínas se han plegado y ensamblado correctamente. El mecanismo que asegura la funcional de las proteínas que salen del RE, ha sido denominado “control de calidad del plegamiento de glicoproteínas". En la mayoría de los eucariotas la N-glicosilación comienza con la transferencia de un oligosacárido de composición Glc3Man9GlcNAc2 desde un intermediario lipídico (dolicol difosfato) a la secuencia Asn-X-Ser/Thr de proteínas nacientes en el RE. Las tres glucosas terminales del oligosacárido transferido son inmediatamente removidas pordos glucosidasas del RE, I y II (GI y GII). Parodi y colaboradores demostraron la existencia de una reglucosilación transitoria de los N-oligosacáridos libres de glucosa dentro del RE por la acción de la enzima luminal UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima glucosila glicoproteínas, en ensayos libres de células, sólo si éstas han sido previamente desnaturalizadas. Por esta característica especial se ha propuesto a la GT como posible sensor del estado conformacional de las glicoproteínas en el RE. Los oligosacáridos monoglucosilados, que se generan por la deglucosilación parcial por la GI (encargada de remover la glucosa más externa) y GII (encargada de remover las dos glucosas más internas) y por la actividad de la GT, permiten la interacción de las glicoproteínas con dos lectinas del RE, la calreticulina (CRT) y/o calnexina (CNX). Esta interacción facilita el plegamiento de las glicoproteínas, evita la formación de agregados, permite la interacción de las glicoproteínas unidas a CNX con otras chaperonas del RE y constituye un mecanismo para retener en el RE las estructuras proteicas mal plegadas. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe existen todos los componentes del modelo de control de calidad de glicoproteínas en el RE, ya que esta levadura expresa actividad GT y posee un homólogo de CNX. Además, el oligosacárido transferido a polipéptidos nacientes es Glc3Man9GlcNAc2 y este compuesto es procesado en el RE a Man9GlcNAc2, indicando la presencia de actividades GI y GII. La disrupción del gen que codifica la CNX en S. pombe ha resultado ser letal para estas células. Sin embargo una mutante deficiente en actividad GT (mutante gpt1) obtenida en nuestro laboratorio no posee ningún fenotipo distintivo. Esto planteó el interrogante de cuál es la importancia y el rol de la formación de oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en estas levaduras. En este trabajo se realizaron además experimentos destinados a analizar si una conformación mal plegada es condición suficiente para para la glucosilación de todos los olgosacáridos N-unidos a proteínas por la GT in vivo, tal como ocurre in vitro. En este trabajo de Tesis se presentan evidencias genéticas de la estructura heterodimérica propuesta para la GII. La GII de S. pombe está compuesta de dos subunidades GIIα y GIIβ. La actividad catalítica está presente en la subunidad GIIα, que carece de señal conocida para permanecer en el RE. La subunidad GIIβ posee en el extremo C-temiinal el tetrapéptido VDEL, homólogo a conocidas señales de retención/recuperación en el lumen del RE. En S. pombe la CNX es esencial para la viabilidad celular. Sin embargo, la disrupción del gen que codifica para GIIα abolió totalmente la formación de oligosacáridos monoglucosilados, tanto por deglucosilación del compuesto transferido a las proteinas como por reglucosilación mediada por la GT. Estas mutantes de S. pombe resultaron viables a todas las temperaturas ensayadas. Esto significa que la CNX y no los oligosacáridos monoglucosilados son esenciales para esta levadura en condiciones normales de crecimiento. Si bien la formación de oligosacáridos monoglucosilados no es esencial para la viabilidad celular, células defectivas total (mutantes GIIα-) o parcialmente (mutantes GIIβ- o GT-) en la formación de oligosacáridos monoglucosilados presentaron una acumulación de proteínas mal plegadas en el RE en ausencia de estrés adicional. Esto se evidenció por la inducción de mensajeros que codifican para chaperonas del RE (respuesta a proteínas mal plegadas o UPR). La acumulación de proteínas mal plegadas en estas mutantes se evidenció además por la presencia en sus glicoproteínas de una mayor proporción de oligosacáridos con estructuras específicas del RE y no del aparato de Golgi. Los glicanos sintetizados por estas mutantes son similares a los obtenidos cuando se agregó a células salvajes un agente reductor que provoca un mal plegamiento en las glicoproteínas que se están sintetizando en el RE. Tal como fue descripto para células de mamifero, en células intactas de S. pombe la formación de oligosacáridos monoglucosilados reduce la velocidad de plegamiento, pero incrementa su eficiencia. Esto fue evidenciado por una comparación de la cantidad de carboxipeptidasa y la velocidad de llegada a la vacuola de esta proteína en células salvajes y GIIα-. Este resultado indicó que los oligosacáridos monoglucosilados están involucrados en la facilitación del plegamiento de las glicoproteínas de S. pombe. La formación de proteínas mal plegadas causada tanto por el agregado de una agente que impide la formación de puentes disulfuro (ditiotreitol) a células intactas, como por un shock de calor, no fueron condiciones suficientes para la glucosilación in vivo mediada por la GT. dichos tratamientos no resultaron en un aumento generalizado de la glucosilación. La explicación para este resultado podría estar en las restricciones de la GT para reconocer sus sustratos: aparentemente la GT sólo glucosilaría glicoproteínas que presentan una estructura parcial o un intermediario del plegamiento con flexibilidad limitada, ausente en las formas completamente desplegadas. Estos resultados sugieren que las glicoproteínas que se pliegan en el RE son sometidas al sistema de control de calidad del plegamiento en las etapas finales del proceso de plegamiento.

Abstract:
The endoplasmic reticulum (ER) is the intracellular location of some post-translational modifications and folding of proteins destined to secretion, to the plasma membrane or to organelles of the endocytic system. N-glycosylation is one of the most frequent modifications. This modification is related to protein folding, as many species are unable of properly fold without N-glycan addition. Folding intermediates, incomplete assembled oligomers, misfolded proteins and aggregates are selectively retained in the ER. Transport to Golgi compartments takes place only if proteins are in their native conformation and properly assembled. The mechanism that ensures the functionality of proteins that exit the ER, is the so called “quality control of glycoprotein folding”. In most eucariotic cells, N-glycosylation is initiated on transfer of an oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2)from a lipid-carrier (dolichyl diphosphate), to the sequence Asn-X-Ser/Thr in nascent proteins in the ER. The three terminal glucose residues of the transferred oligosaccharide are irnmediately trimmed by two ER glucosidases, I and II (GI and GII). Parodi and coworkers demonstrated the occurrence of transient reglucosylation of glucose-free N-linked oligosaccharides in the ER by a lumenal enzyme, the UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (GT). This enzyme glucosylates glycoproteins in a cell-free assay, only if they have been previously denatured. For this especial feature, GT has been proposed as a possible sensor of glycoprotein conformation in the ER. Monoglucosylated oligosaccharides can be generated by partial deglucosylation by of GI (that removes the most terminal glucose) and GII (that trims both inner glucose residues), or by GT. Monoglucosylated oligosaccharides allow interaction of glycoproteins with two ER lectins, calnexin (CNX) and/or calreticulin (CRT). This interaction facilitates glycoprotein folding, avoids aggregation of glycoproteins, allows interaction of bound glycoproteins with the ER chaperone system and constitutes a retaining mechanism of misfolded glycoproteins in the ER. The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has the three elements of the quality control of glycoprotein folding in the ER as this yeast expresses a GT activity and a CNX homologue. In addition, the oligosaccharide transferred to nascent polypeptides is Glc3Man9GlcNAc2 and this compound is processed in the ER to Man9GlcNac2 indicating the presence of both GI and GII activities. The disruption of the gene encoding CNX in S. pombe has been shown to be lethal. However, a mutant lacking GT activity (gpt1) obtained in our laboratory had no discernible phenotype. This raised the question of the actual importance of monoglucosylated oligosaccharide formation in glycoprotein folding in this yeast and its role in glycoprotein folding. Further work reported here was performed in order to test whether a misfolded conformation is a sufficient condition for in vivo glucosylation of all N-linked oligosaccharides by GT as was observed in vitro. Results presented herein provide genetic support for a proposed heterodimeric structure of GII. S. pombe GII appears to be composed by two subunits GIIα and GIIβ. Catalytic activity is contained in GIIα subunit, which in turn lacks any known ER retrieval signal. GIIβ has in its C-terminal sequence the tetrapeptide VDEL, homologous to known lumenal ER retrieval signal. A model is proposed in which GII β-subunit functions as the retrieval element of GII α-subunit to the ER. CNX resulted essential for S. pombe viability. However, GIIα subunit disruption completely abolished the formation of monoglucosylated oligosaccharides, both by deglucosylation of the transferred compound as by GT-mediated reglucosylation. This mutant was viable at all temperatures tested. It was concluded that CNX but not monoglucosylated oligosaccharides is essential for this yeast. Although monoglucosylated oligosaccharide formation is not essential for cell viability, cells totally (GIIα minus) or partially (GIIβ or GT minus) defective in monoglucosylated oligosaccharide formation showed accumulation of misfolded proteins in the ER in the absence of any exogenous stress. This was evidenced by the induction of mRNAs encoding ER chaperones (unfolded protein response). Besides, misfolding of glycoproteins in those mutants was reveled by the much higher proportion of protein-linked oligosaccharides having ER-specific structures and lacking Golgi-specific modifications. Glycans synthesized by the mutants displayed sizes similar to those found when a reducing agent that prevents proper protein folding in the ER was added to wild type cells. As was described for mammalian cells, also in intact S. pombe cells formation of monoglucosylated oligosaccharide decreased the folding rate but increased the folding efficiency as judged by comparison of amounts and rates of arrival of carboxypeptidase Y to the vacuole in wild type and GIIα minus cells. This result indicated that monoglucosylated glycans are indeed involved in glycoprotein folding facilitation in the fission yeast. Protein misfolding caused both by addition of a reagent that prevents disulfide bond formation (dithiothreitol) to intact cells as well as by a heat shock treatment were not conditions sufficient for in vivo GT-mediated glucosylation. Those treatments did not result in a generalized glycoprotein glucosylation. The explanation for this result may lie in GT restrictions to recognize its substrates. Apparently GT only glucosylates partially structured conformers or folding interrnediates bearing a limited flexibility that is absent in less structured species. These results suggest that glycoproteins are mainly subjected to ER quality control in the last folding stages.

Calviño, María Ana. "Estudio de moduladores endógenos de la Na+, K+ -ATPasa cerebral durante el desarrollo postnatal en ratas" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Na+, K+-ATPasa es una enzima especialmente abundante en las membranas neuronales de la región sináptica, que parecería ser crucial en el ciclo celular normal y durante la diferenciación del Sistema Nervioso. Los resultados aquí presentados demuestran la presencia de dos fracciones solubles de corteza cerebral de rata, picos I y II, con distinta capacidad modulatoria sobre la Na+, K+-ATPasa de membranas sinaptosomales en un estadio temprano del desarrollo postnatal de la rata (4 días de edad). Además, una subfracción más pura del pico II se aisló de la corteza cerebral de ratas neonatas semejante a la de ratas adultas (denominada endobaína E por las propiedades símil-ouabaína), pero con mayor actividad sobre la enzima. Sin embargo, debido al comportamiento del modulador sobre la actividad de la Na+, K+-ATPasa de membranas sinaptosomales de corteza cerebral de ratas neonatas se sugirió que dicha sustancia podría fijarse además a sitios no relacionados con la inhibición de la enzima. Trabajando con prismas de corteza cerebral de rata, se comprobó que la endobaína E estimula la hidrólisis de fosfoinosítidos en forma transitoria a lo largo del desarrollo postnatal, un mecanismo de señalización intracelular implicado en la regulación de la plasticidad sináptica de los períodos críticos en el desarrollo del Sistema Nervioso. Se demostró que el mecanismo de acción de esta sustancia endógena sería diferente del de la ouabaína, aún cuando el efecto de ambas involucra la activación del subtipo 5 del receptor metabotrópico del glutamato y la liberación de glutamato por reversión del transportador de dicho neurotransmisor. Los datos sugieren que la liberación del neurotransmisor no sería suficiente para explicar el efecto de dichas sustancias y en el caso de la ouabaína los resultados estarían de acuerdo con la existencia de un sitio de unión en el receptor glutamatérgico.

Abstract:
Na+, K+-ATPasa is a synaptic membrane enzyme which seems to be crucial in the normal cell cycle and differentiation of the Nervous System. The presence of two brain soluble fractions -peaks I and II- which differently modulate Na+, K+-ATPase activity is described at an early postnatal stage of rat development (4-day-old rats). A more purified II-E fraction, termed endobain E (endogenous ouabain-like factor), was isolated from neonatal rat brain cortex which exerted a higher inhibitory activity than the homologous fraction prepared from adult brain. Such endogenous Na+, K+-ATPase modulator behavior on neonatal versus adult synaptosomal membrane suggested its binding to membrane sites unrelated of enzyme inhibition. Employing rat brain prisms, we found that, similar to ouabain, endobain E transiently stimulates phosphoinositide hydrolysis during postnatal brain development, a mechanism most likely responsible for neuronal neocortical plasticity during critical periods. Although the effect of both endobain E and ouabain involve subtype 5 metabotropic glutamate receptor activation and glutamate release through reversal of the plasma membrane glutamate transporter, a dissimilar mechanism was proved. Data suggested that glutamate release is not enough to explain the effect of both substances and are in favour of the existence of a glutamate receptor binding site for ouabain.

Ellerman, Diego A.. "Relación estructura-función de la proteína epididimaria de rata "DE", y su potencial uso para el desarrollo de un método de regulación de la fertilidad" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La glicoproteína epididimaria de rata "DE" se asocia al espermatozoide durante la maduración, y participa en el proceso de fusión de gametas a través de sitios complementarios presentes en la superficie del ovocito. Con el fin de comprender los mecanismos involucrados en la participación de DE en dicho proceso, se estudió la importancia de la estructura de DE para la actividad de la proteína. El clonado del ADNc de DE permitió obtener la secuencia de los 227 aminoácidos (aa) de la proteína. El análisis de dicha secuencia indicó que DE pertenece a la familia CRISP (cystein rich secretory proteins), y la presencia de 16 cisteínas en la molécula. El ADNc fue utilizado luego para expresar la proteína recombinante en bacterias (recDE). El estudio de recDE y de la proteína nativa deglicosilada, indicó que la actividad biológica residiría en la porción peptídica de la molécula. Por otro lado, el análisis del estado de oxidación de las cisteínas indicó que la mayoría de ellas formaría puentes disulfuro, y que la ruptura de los mismos afectaría la actividad de la proteína. La expresión de distintos fragmentos recombinantes de DE y su empleo en ensayos biológicos, reveló que la actividad de la proteína residiria en la región comprendida entre los aa 62-158. Resultados previos de nuestro laboratorio indican que la inmunización de ratas con proteína DE produce una respuesta inmune y una inhibición significativa de la fertilidad. El presente trabajo indica que los mecanismos responsables de dicha inhibición involucrarían la entrada de anticuerpos anti-DE al tracto reproductivo, su interacción con los espermatozoides, y la disminución de la capacidad fertilizante de los mismos, abriendo la posibilidad del potencial uso de DE para el desarrollo de un método inmunológico de regulación de la fertilidad. Dado que para ello es necesario poder disponer del antígeno en grandes cantidades, la proteína recombinante fue utilizada en ensayos de inmunización, que indicaron que recDE, al igual que la proteína nativa, es capaz de producir una respuesta inmune y una reducción de la fertilidad. Con el fin de investigar la posible aplicación de este método inmunológico en el hombre, la capacidad inmunogénica de la proteína humana homóloga a DE, proteína ARP, fue estudiada en un modelo de primates no humanos, observándose la inducción de una elevada respuesta inmune en los animales inmunizados. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo contribuyen al esclarecimiento de los mecanismos involucrados en la participación de DE en el proceso de fusión de gametas, y apoyan el potencial uso de esta proteína y sus homólogos para el desarrollo de un método inmunológicode regulación de la fertilidad tanto en animales como en el hombre.

Abstract:
Rat epididymal glycoprotein “DE” associates with sperm during maturation and participates in gamete fusion through complementary sites localized on the egg surface. To get a better understanding of the molecular mechanisms underlying the participation of DE in this process, the relevance of protein DE structure for its biological activity was studied. Cloning of DE cDNA allowed obtaining the sequence of the 227 aminoacids (aa) of the protein. The analysis of the sequence, indicated that DE belongs to the CRISP (cystein rich secretory proteins) family, and the presence of 16 cysteines in the molecule. DE cDNA was then used for the bacterial expression of the recombinant protein (recDE). The study of recDE as well as of the deglycosilated native DE (nDE) indicated that the activity of the protein resides on the peptidic portion of the molecule. The evaluation of the oxidative state of cysteines indicated that most of them would be involved in disulfide bridges, and that the rupture of these bridges would affect the protein activity. The expression of different recombinant fragments of DE, and their use in biological assays indicated that the biological activity of DE would be located within the region encompassed by aa 62-158. Previous results from our laboratory indicate that immunization of rats with protein DE induces an immune response and a significant inhibition of fertility. The present study indicated that the mechanisms responsible for this inhibition would involve the entry of antibodies into the reproductive tract, their association to sperm, and the reduction of sperm fertilizing ability. These results suggested the potential use of DE for developing and immunological method of fertility regulation. Since an important requirement for this purpose, is the possibility of obtaining the antigen in large quantities, recombinant DE was used in immunization studies, which revealed that, like native DE, recDE is able to produce an immune response as well as an inhibition of fertility. In order to explore the potential application of this immunological approach to humans, the immunogenic ability of the human protein homologue of DE, protein ARP, was evaluated in a non human primate model. The induction of a high immune response was observed in all the immunized animals. Together, the results obtained in this work contribute to a better understanding of the molecular mechanisms underlying the participation of DE in sperm-egg fusion, and support the potential use of DE for the development of an immunological method of both animal and human fertility regulation.

González Guerrico, Anatilde María. "Expresión de genes asociados a fibrosis quística" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Fibrosis Quística es la más frecuente de las enfermedades humanas severas, de origen genético, en la población caucásica (Welsh MJ, 1995). Se produce por mutaciones en un único gen, que codifica para el canal de Cl- CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). Aún no ha sido establecida una relación clara entre el defecto genético y los mecanismos que gobiernan esta enfermedad. Todas las citoquinas proinflamatorias que han sido estudiadas en el ambiente inflamatorio de los pulmones FQ están elevadas y la concentración de la citoquina antinflamatoria interleuquina-10 (IL-10) está considerablemente reducida (Khan et al., 1995). A su vez, la IL-1β regula la expresión del CFTR (Cafferata E G A, 2001; Cafferata et al., 2000). Por otro lado, las proteínas proinflamatorias TNF-α, IL-1β y IL-6 regulan positivamente los genes de las mucinas muc2 y muc5 (Dohrman et al., 1998) e incrementan la quimioatracción de neutrófilos (Ohishi, 2000) que liberan gran cantidad de proteínas, especies reactivas de oxígeno y NO, que pueden causar daño celular. Entonces, es posible que genes diferencialmente regulados por IL-1β tengan una participación en los mecanismos que llevan a la muerte celular, la exacerbación de los procesos inflamatorios o la acumulación de mucinas en el tracto respiratorio FQ. Con el fin de identificar nuevos intermediarios en la vía de señalización de IL-1β, o de identificar genes que tuviesen una regulación similar al CFTR, se realizó un "Differential Display" sobre las células T84 tratadas con distintas concentraciones de IL-1β. Se aisló un gen regulado por dicha citoquina, que poseía el mismo patrón de modulación que el CFTR. La banda aislada fue clonada y secuenciada. La misma mostró una homología del 99% con otras del banco de datos que codificaban para proteínas cuya actividad es desconocida. A este gen diferencial se lo denominó hsccl (Homo sapiens T84 colon carcinoma cell line IL-1beta regulated mRNA 1). Por el análisis de la secuencia completa del ARNm se determinó que hscc1 contiene dominios que se hallan conservados en la familia de las proteínas transportadoras. Mediante "Northern blots" se observó una doble banda correspondiente a 3,5 kb, que mostraba un máximo de activación cuando las células fueron tratadas con 0,5 ng/ ml de IL-1β. Por otro lado, la expresión de hscc1 se inhibió a concentraciones de IL-1β mayores a 1 ng/ml. La IL-1β induce al factor de transcripción NF-κB cuando se encuentra presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,5 ng/ml (Cafferata E G A, 2001), mientras que con 2,5 ng/ml de IL-1β se inducen los factores c-jun y c-fos, pero no NF-κB. Usando un virus que sobre-expresa a un dominante negativo de NF-κB, se determinó que la inducción de este factor es necesaria para que se produzca el aumento en la expresión de hscc1 por IL-1β, en forma similar a lo que ocurre con CFTR. Por otro lado, el inhibidor de proteína quinasa C, GF109203X (Battle et al., 1998) y los inhibidores de proteína quinasas de tirosina Genisteína (Rao et al., 1997) y Herbimicina A (Taylor et al., 1997), bloquearon la inducción mediada por IL-1β, sugiriendo que estas proteína quinasas estan también involucradas en el camino de transducción de la señal de IL-1β. Otro objetivo de este trabajo fue identificar genes cuya expresión fuese dependiente de la actividad del CFTR, con el fin de determinar cuales eran las funciones celulares dependientes del canal CFTR y de identificar factores que contribuyesen a la deficiencia pulmonar en fibrosis quística. Realizamos un "Differencial Display" usando células de epitelio de traquea fibroquística (CFDE) y las mismas células transfectadas con el CFTR normal (CFDE/6RepCFTR). Aislamos e identificamos un ARNm de expresión diferencial que codifica para la quinasa de tirosina c-Src. Este mensajero se encontró sobre-expresado en las células CFDE. Cuando las células CFDE/6RepCFTR fueron tratadas con el inhibidor del canal CFTR NPPB, los niveles del ARNm c-Src se elevaron. Es decir, la actividad del canal CFTR sería necesaria para la regulación de c-src. Asimismo, los análisis de la proteína c-Src por inmunohistoquímica mostraron que ésta se encuentra elevada en los pulmones FQ. La fibrosis quística se caracteriza por la acumulación de mucus que obstruye los conductos de distintos órganos (Hutchison and Govan, 1999). A su vez, este aumento en la producción de mucinas puede hacer a los enfermos más susceptibles de sufrir infecciones pulmonares por Pseudomonas aeruginosa (Parmley and Gendler, 1998). Se sabe que MUC1 se encuentra elevada en el colon de los ratones FQ, pero los ratones FQ que no producen MUC1 (ratones "knock out" para MUC1) tienen una obstrucción intestinal mucho menor. Además, a c-Src se la ha involucrado en la producción de mucinas en respuesta a diversas injurias (Bausbaum et al., 1999). Era posible entonces que el aumento de c-Src inducido por la falla en CFTR fuese responsable de la acumulación de mucus. Para corroborar esta hipótesis, se midió la expresión de la MUC1. Esta fue encontrada elevada en células CFDE respecto de las células CFDE/6RepCFTR. Además, cuando las células CFDE fueron tratadas con un dominante negativo o con un inhibidor de c-Src (PP2) los niveles de MUC1 disminuyeron. Estos resultados indican que c-Src estaría involucrada en el camino de señalización que lleva el aumento de MUC1. Estos datos sugieren, además, que la falla en el CFTR produciría un incremento en la expresión de MUC1 en el sistema respiratorio y que esto ocurre previamente a la infección pulmonar. En consecuencia, la quinasa c-Src podría ser el nexo entre la falla del CFTR y la acumulación de mucinas en fibrosis quística.

Abstract:
Cystic Fibrosis (CF) is the most important severe genetic in Caucasian population (Welsh MJ, 1995). It is caused by mutations in a single gene that codifies for the chloride channel named cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). A clear relationship between the genetic defect and the mechanisms governing the disease has not been fully established. In the inflammatory medium of CF lung every pro-inflammatory cytokines tested were elevated and the concentration of anti-inflammatory cytokine interleukin-10 (IL-10) was considerably decreased. In addition, IL-1β regulates CFTR expression. In this work, a differential display from T84 cells treated with different concentrations of IL-1β was performed, in order to identify new second messengers of IL-1β signaling pathway or other genes that have a regulation similar to cftr. The proinflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 up-regulate muc2 and muc5 gene expression (Dohrman et al., 1998) and increase neutrophils chemioattraction (Ohishi, 2000), which produce proteins, NO, and oxygen reactive molecules that can cause cellular injure; then, IL-1β differential expressed genes may be involved in processes that produce cell died, inflammation exacerbation or mucus accumulation in the CF airway. One of the differential display isolated fragments was cloned and sequenced. The sequence showed 99% homology with other sequences present in the data bank. They codify for proteins with unknown activity. This differential expressed gene was called hscc1 (Homo sapiens T84 colon carcinoma cell line IL-1beta regulated mRNA 1). The complete hscc1 mRNA sequence analysis predicted that HSCC1 sheared some conserved domains with transport proteins. Northern blots assays, using 32P labeled hscc1 as a probe, a double band of 3,7 kbp was observed. Maximum mRNA levels were obtained after treating the cells with 0.5 ng/ml of IL-1β. Hscc1 expression was inhibited with 1 ng/ml or higher concentrations of IL-1β. On the other hand, IL-1β at 0.5 ng/ml induced the transcription factor NF-ĸB (Cafferata E G A, 2001) but 2.5 ng/ml of this cytokine induced c-jun and c-fos but not NF-ĸB. In this work it was determinated that NF-ĸB is essential for the IL-1β induction of hscc1 by using a NF-ĸB dominant negative expressing virus. The pre-treatment with PKC inhibitor GF109203X (Batlle et al., 1997) blocked the IL-1β induction of hscc1, suggesting that these protein-kinases are involved in the IL-1 signal transduction pathway. In order to better understand which cellular functions depend on CFTR channel activity and which factors contribute to the pulmonary defects in cystic fibrosis, we search for possible genes having a CFTR-dependent expression. We performed a differential display assay using human CF tracheal epithelial cells (CFDE) and the same cells transfected with normal CFTR (CFDE/6RepCFTR). We have isolated and identified the tyrosine kinase c-Src as a differential gene, which was up-regulated in CFDE cells. When CFDE/6RepCFTR cells were treated with the CFTR channel inhibitor, NPPB, the levels of the c-Src mRNA raised, suggesting that the chloride channel activity should be involved in CFTR-dependent regulation of c-Src expression. In addition, immuno-histochemical analysis showed and increased c-Src in the CF lung. The most important problem in cystic fibrosis results from obstruction of ducts in several organs due to excessive mucus secretion (Hutchison and Govan, 1999). The overexpression of mucins in turn might lead to susceptibility to Pseudomonas aeruginosa infection in cases of CF (Basbaum et al., 1999). The expression of the mucin MUC1 is elevated in the colon of CF mouse, and CF mouse lacking MUC1 exhibits greatly diminished intestinal mucus obstruction (Parmley and Gendler, 1998). In addition, c-Src has been involved in mucin production in response to diverse insults (Basbaum et al., 1999). Therefore, we studied the possible role of c-Src in mucus accumulation due to the CFTR failure. We found taht MUC1 was elevated in the tracheal CFDE cells compared with CFDE/6RepCFTR cells. When CFDE cells were treated with a c-Src dominant negative plasmid or the c-Src inhibitor PP2, the MUC1 levels diminished, suggesting that c-Src might be involved in the signalling pathway that drives the elevation of MUC1 in CF. These data suggest that the CFTR failure produce an elevated MUC1 expression in the airway and this occurs previously to lung infection. Therefore, the tyrosine kinase c-Src seems to constitute a bridge between MUC1 over-expression and the CFTR channel failure.

Lorenzi, Hernán Alejandro. "Estructura genómica y diseño de nuevos vectores de transfección para Trypanosoma cruzi" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Trypanosoma cruzi es un parásito protozoario causante de la enfermedad de Chagas. Dentro del marco del proyecto genoma de T. cruzi y como un activo aporte a su concreción, se ha caracterizado un nuevo tipo de marcador genético asociado a la secuencia repetida SIRE denominado SAS, que condujo a la identificación de cuatro nuevos genes y de las secuencias repetidas TCREL y VIPER. Para contribuir a la construcción del mapa fisico, se construyó y caracterizó una biblioteca de ADN genómico de T. cruzi en vectores YAC con un tamaño promedio de inserto de 365 kpb, que fue utilizada para construir el mapa fisico de una región de ~900 kpb del cromosoma XVI y comenzar la construcción del mapa fisico del cromosoma XX. También se construyeron cromosomas circulares en levaduras por el método de clonado RAT utilizando las secuencias repetidas como base del clonado, y se probó la utilidad de un vector de fragmentación que sirvió para ubicar el gen TcP2β cerca de una región telomérica de un cromosoma de ~1 Mpb. Para contribuir con los estudios genómicos funcionales se diseñó y construyó el vector necesario para obtener cromosomas artificiales de T. cruzi. Finalmente, estos estudios llevaron a utilizar comparaciones de secuencia para definir las características de sintenía de extensas regiones genómicas de T. cruzi, Trypanosoma brucei y Leishmania major.

Abstract:
Trypanosoma cruzi is a parasitic protozoan that causes Chagas disease. As part of the T. cruzi genome project and to contribute to its concretion we have characterized a new type of chromosomal marker associated to the repetitive element SIRE named SAS, that allowed the identification of four novel genes and two repetitive sequences, TcREL and VIPER. To accomplish the construction of the physical map of the T. cruzi genome, we constructed and characterized a genomic YAC library of T. cruzi with an average insert-size of 365 kbp that was used to get the physical map of a ~900 kbp region from chromosome XVI and to start the assembly of contigs from chromosome XX. In addition, we also constructed circular artificial chromosomes in yeast, based on a T. cruzi repetitive sequence by RAT cloning, and verified the utility of a fragmentation vector in the position of the TcP2β gene near a telomeric region of a chromosome of ~1 Mbp. To perform functional genomic studies we designed and constructed a vector that can be used as an artificial chromosome in T. cruzi. Finally, comparison and sequence analysis allowed us the identification of large genomic sintenic regions among T. cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania major.

Gallo, Mariana. "Desarrollo de oligonucleótidos modificados químicamente con potencial aplicación en terapia génica" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Dentro del campo de la Terapia Génica, el concepto de oligonucleótidos como potenciales agentes terapéuticos ha ganado credibilidad y atención. El fundamento de la estrategia antisentido consiste en inhibir selectivamente la expresión de un determinado gen, impidiendo asi la producción de una dada proteína mediante la acción de un oligonucleótido de secuencia complementaria al ARN mensajero que codifica para esa proteina. Dentro de este enfoque, las ribozimas, moléculas de ARN con una secuencia de bases y una estructura tridimensional definidas y que presentan actividad enzimática, aparecen como una alternativa interesante, ya que permiten incorporar a la acción antisentido de los oligonucleótidos su actividad catalitica. Debido a que los oligonucleótidos son degradados rápidamente por nucleasas presentes tanto en suero como intracelularmente, surge la necesidad de modificados químicamente, lo cual permite obtener drogas con tiempos de vida medio adecuados. En el caso particular de las ribozimas y otros análogos de ARN, es importante que las modificaciones introducidas no afecten los requerimientos estructurales para la actividad o función particular de estas moléculas. Entre las diversas modificaciones desarrolladas, las modificaciones en la posición 2’ demostraron ser de utilidad. La presencia del hidroxilo-2’ probó ser de suma importancia en determinadas posiciones para el correcto plegamiento de las moléculas de ARN. Debido a que ninguna de las modificaciones desarrolladas en la posición 2' mantiene esta función, la utilización de una nueva generación de oligonucleótidos modificados en la posición 2' del azúcar que conserven esta función resulta atractiva y prometedora para el diseño de ribozimas estables en medios biológicos. Aquí se propone, por lo tanto, una nueva clase de nucleótidos modificados, los 2'—C-metilnucleótidos, potencialmente útiles para ser incorporados en determinadas posiciones de análogos de ARN resistentes a la degradación por nucleasas. Se espera que cuando un 2'—C-metilnucleótido sustituya un ribonucleótido particular proveerá un hidroxilo-2' disponible para reproducir las interacciones terciarias del ARN; mientras que la presencia del metilo, brindará resistencia a la degradación mediada por nucleasas. En este trabajo, se sintetizó la 2'—C-metiluridina siguiendo una ruta estereoselectiva, así como también, la fosforamidita adecuada para la sintesis automatizada de oligonucleótidos, incluyendo la protección regioselectiva del grupo hidroxilo-2'. Asimismo, se realizó un estudio confonnacional de la 2'-C-metiluridina en solución por RMN y se comparó con resultados obtenidos por cálculos computacionales. Los resultados mostrarón que la conformación preferida de este nucleósido es la misma que la de la uridina natural, con lo cual ambas moléculas posicionarían el hidroxilo-2' con la misma orientación. Con el fin de ensayar la hipótesis de la aplicabilidad de la nueva modificación, se eligió como modelo biológico la ribozima cabeza de martillo. Un estudio preliminar usando modelado molecular sugirió que la introducción de estos monómeros en las posiciones de esta ribozima para las cuales se había detectado que sus hidroxilos-2' tenían interacciones de orden terciario no parecía afectar la conformación global de la ribozima, excepto en una posición particular. La 2'-C—metiluridina fue, entonces, introducida en ribozimas cabeza de martillo dirigidas contra la región 5'-lider/gag del virus HIV-1 en las posiciones de la uridina del core catalítico cuyos hidroxilos-2' demostraron ser importantes. Las ribozimas resultaron ser activas y tener una incrementada estabilidad frente a nucleasas. Tambien se midió la afinidad por hebras complementarias de DNA y de RNA de oligodesoxinucleótidos conteniendo uridina, la nueva modificación o la (2’S)-2'-desoxi-2’-C-metiluridina.

Abstract:
Oligonucleotides have gained credibility and attention as potential therapeutic agents based on the gene therapy principle. The fundament of the antisense strategy consists in the selective inhibition of the gene expression by means of an oligonucleotide carrying a complementary sequence to that of the mRNA that codifies for the target protein. In particular, ribozymes, RNA molecules with a defined sequence and three-dimensional structure that show enzymatic activity; appear as an interesting alternative, due to the fact that they combine the antisense action with a catalytic activity. Since oligonucleotides are rapidly degraded by nucleases present both, in serum and intracellularly, it is mandatory to chemically modify them in order to obtain drugs with proper half life times. In the case of ribozymes and other RNA analogues, additional structural requirements must be taken into account in order to preserve activity or a particular function. Among the modifications developed so far, those involving the 2'-position proved to be useful, but they lack the 2'-hydroxyl group. The presence of this function showed to be of great importance for the correct folding of RNA molecules. Therefore, the development of a new generation of 2'-modified oligonucleotides carrying the 2'-hydroxyl is a promising alternative for the design of resistant ribozymes. Having in mind this goal, a new kind of analogues is proposed in this work, the 2'-C-methylnucleotides. They are expected to be potentially useful for generating RNA mimics resistant to the degradation by nucleases. This assumption is based on the hypothesis that when a 2'-C-methylnucleotide substitutes a particular ribonucleotide, it will provide a 2'-hydroxyl group available for reproducing RNA tertiary interactions; and additionally, the presence of the 2’methyl group will bring resistance to degradation mediated by nucleases. The 2'-C-methyluridine was syntehsized by a stereoselective strategy, the 2'-hydroxyl group was regioselectively protected and the corresponding phosphoramidite for solid phase synthesis of oligonucleotides was prepared. In addition, a conformational study of the 2'-C-methyluridine in solution was carried out by RMN techniques and these data were compared with those obtained by computational calculations. The results showed that the preferred sugar conformation of this nucleoside is the same than the one adopted by the natural uridine, and therefore, it is expected that both molecules will position the 2'-hydroyl group with the same orientation. With the aim of testing our hypothesis, the new monomer was introduced in the catalytic core of a hammerhead ribozyme in those positions where the 2'-hydroxyl group showed to be important for the activity. The ribozymes were targeted against the 5'-lider/gag region of the HIV-1. The modified ribozymes were active in vitro and displayed an increased resistance to nucleases. The affinity for RNA and DNA complementary sequences of oligonucleotides containing the new modification and the (2'S)-2'deoxy-2'-C-methyluridine is also reported.

Falzone, Tomás Luis. "Estudio de la función del receptor dopaminérgico D4 en el sistema nervioso central a través del análisis de ratones modificados genéticamente" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Alonso, Guillermo Daniel. "La arginina quinasa de Trypanosoma cruzi : Estudio de su regulación y utilización de modelos transgénicos" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La arginina quinasa cataliza la transferencia reversible de un grupo fosfato entre el ATP y la L-arginina. En este trabajo se reporta modelos de sobre-expresión exitosos para una enzima endógena, como es el caso de la arginina quinasa. Se obtuvieron 60 veces de sobre-expresión, utilizando el vector de expresión de alta eficiencia pTREX-A. La población transfectada con la arginina quinasa presentó un aumento en la densidad celular y en la tasa de replicación, sugiriendo que los fosfágenos podrían estar involucrados en la división celular. Además, la actividad arginina quinasa aumento continuamente durante la fase exponencial de crecimiento. Se observó una correlación entre la tasa de crecimiento, la actividad arginina quinasa y los niveles de enzima. En el rango de tiempo de cultivo estudiado, los niveles de ARNm mostraron solo cambios menores. La sobreexpresión de la arginina quinasa presentó una cinética de degradación a lo largo de la curva de crecimiento coincidente con el aumento de la enzima endógena y de la actividad, indicando una posible regulación por proteólisis. La incorporación de arginina fue estudiada en epimastigotes de Trypanosoma cruzi durante las fases del cultivo in vitro. La incorporación de arginina disminuyó continuamente desde el 3ro al 14to día. Estas variaciones pueden ser reproducidas utilizando medio condicionado o medio fresco. El ayuno de arginina, la densidad celular y la disponibilidad de Fuentes de carbono, también afectaron la incorporación. En tripomastigotes, el estadio infectivo no replicativo, la actividad y expresión arginina quinasa fueron 2.2 veces superior a la correspondiente a epimastigotes del 7mo día, y la incorporación de arginina fue al menos 30 veces menor en tripomastigotes que en epimastigotes del 7mo dia. Además una disminución reversible del 40 % de la arginina incorporada fue observado cuando células del día 3 fueron tratadas con el agente antimitótico, hidroxi urea. Estos resultados sugieren una relación entre la incorporación de arginina, la tasa de duplicación celular, y el aumento en la actividad arginina quinasa.

Abstract:
Arginine kinase catalyzes the reversible transphosphorylation between ATP and L-arginine. This work reports one of the first successful over-expression models of an endogenous enzyme, such as arginine kinase. Thus, it was obtained a 60-fold over-expression using the high-efficiency expression vector pTREX-A. The cells transfected with arginine kinase showed an increase in cell density and replication rate, suggesting that phosphagens could be involved in cell division. Furthermore, the arginine kinase activity was increased continuously during the exponential phase of growth. A correlation between growth rate, enzyme-specific activity and enzyme protein was observed. In the whole range of the culture time mRNA levels showed minor changes. Overexpressed arginine kinase has a degradation kinetics along the parasite growth curve coincident with the increment of the endogenous enzyme protein and activity, indicating that arginine kinase activity might be regulated by proteolysis. Arginine uptake was measured in Trypanosoma cruzi epimastigote cells along the in vitro culture growth phases. Arginine uptake decreased continuously from the 3rd to the 14th day. These fluctuations could be resembled using conditioned or fresh medium. Arginine starvation, cell density and carbon source availability also affect the arginine uptake. In trypomastigote cells, the infective and nonreplicative stage, arginine kinase activity and expression were 2.2-fold higher than 7th-day epimastigote activity, and arginine uptake was at least 30-fold lower in trypomastigote than 7th-day epimastigote forms. Moreover, a reversible 40% decrease of the arginine uptake was observed when 3rd-day cells were treated with the antimitotic hidroxyurea. These results suggest a correlation between arginine uptake, the cell replication rate, and the increase in the arginine kinase specific activity.

Portal, Daniel. "Control de la expresión génica en Trypanosoma Cruzi : proteínas que participan en la regulación del procesamiento de pre-RNA mensajeros" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El Trypanosoma cruzi. es el parásito protozoario flagelado responsable de la enfermedad de Chagas en Latinoamérica. Esta enfermedad produce miles de muertes y un costo elevado para los países de la región. El mecanismo de control de la expresion génica en el parásito es objeto de fuertes estudios, ya que éste procesa sus pre-RNA mensajeros de manera diferente a la forma en que lo hacen sus hospedadores, mediante un mecanismo conocido como trans-splicing. Por lo tanto, entender las bases moleculares de dicho control es importante para encontrar puntos potenciales para el desarrollo de drogas terapéuticas que puedan interrumpir el ciclo vital del parásito. Presentamos aquí el clonado y la caracterización de dos proteínas importantes para la catálisis y el control del procesamiento de los pre-RNAm jamás descriptas anteriormente en ningún protozoario poseedor del sistema de trans-splicing. Estas proteínas, llamadas TcSR, perteneciente a la familia de factores de splicing ricas en serina y arginina y su quinasa asociada, TcSRPK mostraron un altísimo grado de conservación a todo nivel con sus contrapartes de eucariotas superiores tanto en ensayos in vivo como in vitro. Si bien esto las descarta, en principio, como base para el desarrollo de drogas terapéuticas, ilustra sobre el grado de conservación que pueden tener dos vias aparentemente discímiles como el cis- y el trans-splicing. Además, los resultados sugieren que los mecanismos de control de la expresión génica a nivel del procesamiento del RNA están altamente conservados a pesar de la distancia evolutiva, demostrando la enorme presión de selección a la que está expuesto dicho mecanismo.

Abstract:
The Trypanosome cruzi, is a flagellate protozoan parasite responsible for the Chagas' disease in Latin America. The mechanisms of control of gene expression are not well understood, since the parasite processes nearly all of its pre-mRNAs by trans-splicing which is different from cis-splicing, in their insect and mammalian hosts. Understanding the molecular basis of such mechanism is important in order to develop drugs that could interrupt the parasite's vital cycle. Here we present for the first time in a trans-splicing performing organism, the cloning and characterization of two important proteins involved in the catalysis and control of pre-mRNA processing. These proteins, called TcSR, a member of the serine-arginine (SR) protein family of splicing factors and its associated kinase. TcSRPK, showed a highly conserved activity both in vitro and in vivo, in a variety of functional assays. Although this discards the proteins as potential targets for therapeutic drug development, it illustrates on the striking conservation that two apparent different pathways like cis- and trans-splicing can show. Moreover, the results suggest that the mechanisms of control of gene expression at the pre-mRNA processing level are highly conserved despite the evolutionary distance that separates the organisms. This demonstrates the huge selection pressure to which pre-mRNA processing is exposed.

Bellani, Marina. "Replicación de plásmidos en Escherichia coli recBC sbcBC" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Este trabajo estudia la replicación de plásmidos en Escherichia coli recBC sbcB sbcCD, un contexto Rec+, en el cual se amplifican procesos de recombinación que involucran intermediarios conteniendo extremos doble cadena (en función de la deficiencia en RecBCD). En este contexto genético, plásmidos con diversos origenes de replicación acumulan multimeros lineales de muy alto peso molecular denominados HMW Se re-evaluó el proceso de generación de multimeros HMW en el contexto recBC sbcBC, a la luz de los nuevos conceptos vigentes acerca de la interrelación replicación / recombinación. Durante la primer etapa del trabajo, se utilizó el sistema de recombinación especifico-de-sitio del transposón γδ para poner a punto un sistema de complementación regulable, que permitiera generar células conteniendo un mínimo porcentaje de multimeros, para analizar luego la síntesis de HMW a lo largo de la curva de crecimiento. Utilizando este sistema, se demostró que las células recBC sbcBCD pueden sintetizar multimeros del plásmido descontroladamente, durante las primeras horas de la fase estacionaria. La capacidad de replicar descontroladamente el plásmido durante la fase estacionaria está determinada por las condiciones de cultivo y depende en parte de la respuesta de fase estacionaria, gobernada por el regulador de la respuesta general al estrés σˢ. Una vez establecida la cinética de acumulación de HMW, se realizó un análisis genético para individualizar las funciones celulares involucradas en la síntesis de estos multímeros. Se analizó la incidencia de anular funciones de recombinación (RecA, RecF, RecR, LexA) y funciones involucradas en el re-inicio de la replicación sobre una horquilla restaurada (PriA, PriC, Rep), sobre la capacidad de las células de sintetizar HMW. La comprobación de que PriA resulta indispensable para la generación de HMW en un contexto RecBC- SbcBC-, constituye una evidencia de que la generación de HMW involucra el colapso de intermediarios normales de replicación del plásmido y el reinicio de la replicación por un mecanismo alternativo. En base a los resultados reportados, se proponen dos modelos para explicar el mecanismo de generación de HMW, que involucran el colapso de un intermediario de replicación y el restablecimiento de la replicación por un mecanismo de invasión/replicación entre multimeros lineales (similar al que utiliza T4 en su etapa tardía de replicación) o por un mecanismo de tipo círculo rodante (equivalente al utilizado por el fago ʎ para generar concatémeros).

Abstract:
This work studies plasmid replication in Escherichia coli recBC sbcBC, a Rec+ background, in which recombination processes involving linear DNA (or DNA molecules containing a double strand end) are amplified, given the deficiency in RecBCD characteristic of this genetic context. In recBC sbcBC cells, plasmids with diverse replication origins, were reported to accumulate high molecular weight linear multimers (HMW). During the course of this work we have re-evaluated the phenomenon of HMW synthesis, in terms of the current understanding of the link between replication, recombination and repair. Acomplementation system was designed, based on the site-specific recombination system from transposon γδ, which permitted the reduction of the percentage of HMW in the culture to a minimum, in order to analyze the kinetics of HMW accumulation along the growth curve. This system allowed us to demonstrate that recBC sbcBC cells can synthesize plasmid multimers in an unregulated manner, during the first hours of stationary phase. The ability of non-growing cells to replicate the plasmid in an uncontrolled manner during stationary phase is determined by growth conditions and depends in part on the stationary phase response, which is regulated by σˢ (the regulator of the general stress response). A genetic analysis was performed in order to characterize the cellular functions involved in HMW synthesis. We analyzed the effect of inactivating recombination functions (RecA, RecF, RecR, LexA) or genes involved in re-initiating replication upon replication fork repair (PriA, PriC, Rep), on the ability of the cells to synthesize HMW. PriA proved to be essential for HMW synthesis in a RecBC- SbcBC- strain, providing strong evidence for a model for HMW synthesis involving replication fork collapse and re-initiation of plasmid replication through an alternative mechanism. We postulate two models to explain the alternative mechanisms to initiate the synthesis of HMW in a recBC sbcBC context.

Guberman, Alejandra Sonia. "Represión de la expresión génica mediante el secuestro de un coactivador : Transducción de la señal y elementos involucrados en la regulación ejercida por ésteres de forbol sobre el promotor del gen 5-aminolevulinato sintetasa" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los factores de transcripción AP-1 (Activation protein-1) son genes tempranos involucrados en gran diversidad de procesos regulatorios. El éster de forbol 12-O-tetradecanoilforbol- l3-acetato (TPA) es utilizado habitualmente para inducir la actividad de AP-1 y proteinquinasa C (PKC). El propósito de este trabajo es explorar los mecanismos moleculares involucrados en la regulación por TPA de la expresión del gen de 5-aminolevulinato sintetasa (ALAS), la primer enzima y determinante de velocidad de la biosíntesis de hemo. Análisis previos de la secuencia 5’ flanqueante revelaron la existencia de dos elementos de respuesta a cAMP (CRE) requeridos para la expresión basal y estimulada por CAMP. El fragmento —833a +42 en la región 5’flanqueante del gen de ALAS de rata, fue subclonado en un vector con el gen reporter cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El vector de expresión, pALAS/CAT, produjo una significativa actividad CAT en células de hepatoma humano HepG2 transfectadas transientemente, que fue reprimida por TPA. Mediante análisis de secuencias y deleciones dctectamos un elemento de respuesta a TPA (TRE), localizado entre —261 y -255 que según establecimos por mutagénesis, es crítico para la regulación por TPA. Demostramos que c-Fos, c-Jun y JunD están involucrados en el efecto inhibitorio por su habilidad de interactuar con TRE-ALAS, como evidenciamos por análisis de supershift y su capacidad para reprimir la actividad del promotor en ensayos de transfección. Demostramos la participación de componentes de diferentes vías de señalización. Se encuentran involucradas la isoforma α de la PKC, la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK 1/2) y la quinasa N-terminal de c-Jun (JNK). Asimismo, presentarnos a la quinasa p90RSK2 como un posible punto de convergencia de las vías de PI3K y ERK. Mediante sobreexpresión de CBP (CRE protein binding protein) o p300, se bloqueó significativamente la represión por TPA o sobreexpresión de Fos/Jun, de la actividad del promotor de ALAS. Por otra parte, cuando el sitio TRE se ubicó en diferente contexto con respecto a los sitios CRE, éste se comportó como un enhancer de la transcripción. Proponemos que la disminución en la actividad basal del promotor de ALAS en presencia del TPA puede reflejar una disminución en la capacidad del promotor de ensamblar un complejo de pre-iniciación eficiente, debido al secuestro de CBP, por parte de AP-1. Asimismo, sugerimos que las propiedades transcripcionales del sitio TRE serian dependientes de la disposición espacial, con respecto a los sitios CRE.

Abstract:
Activation protein -1 (AP-1) transcription factors are early response genes involved in a diverse set of transcriptional regulatory processes. The phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol- l3-acetate (TPA) is often used to induce AP-1 and PKC activity. The purpose of this work is to explore the molecular mechanisms involved in the TPA regulation of 5-aminolevulinate synthase (ALAS) gene expression, the first and rate-controlling step of the heme biosynthesis. Previous analyses of the 5’-flanking sequence of ALAS revealed the existence of two camp response elements (CRE) required for basal and cAMP-stimulated expression. The fragment —833 to +42 in the 5’-flanking region of rat ALAS gene, was subcloned into a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter vector. The expression vector, pALAS/CAT, produced a significant CAT activity in transiently transfected HepG2 human hepatoma cells, which was repressed by TPA. Sequence and deletion analyses detected a TPA response element (TRE), located between —261 and —255 (TRE-ALAS), critical for TPA regulation, as we established by mutagenesis. We demonstrated that c-Fos, c-Jun, and JunD are involved in TPA inhibitory effect due to their ability to bind TRE-ALAS evidenced by supershift analyses and their capacity to repress promoter activity in transfection assays. We demonstrated the participation of components of different signaling pathways. The α isoform of proteinkinase C (α PKC), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), extracellular signal regulated kinase (ERK 1/2) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) are involved. The p90RSK2 is presented as a putative convergence point of the P13K and ERK pathways. Repression of ALAS promoter activity by TPA-treatment or Fos/Jun overexpression was largely relieved when CRE protein binding protein (CBP) or p300 was ectopically expressed. When the TRE site was placed in a different context with respect to CRE sites, it appeared to act as a transcriptional enhancer. We propose that the decrease in ALAS basal activity observed in the presence of TPA may reflect a lower ability of this promoter to assemble the productive pre-initiation complex due to CBP sequestration. We also suggest that the transcriptional properties of this AP-1 site would depend of a spatial-disposition-dependent manner with respect to the CRE sites.

Ben-Dov, Claudia Paola. "Regulación post-transcripcional en Trypanosoma cruzi : regiones intergénicas y elementos repetidos" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Trypanosoma cruzí es un parásito protozoario causante de Ia enfermedad de Chagas, cuya regulación de la expresión génica se da casi exclusivamente a nivel post-transcripcional. Los objetivos de la presente tesis fueron estudiar las regiones intergénicas y la influencia del elemento repetido SIRE en las mismas. Se determinó la presencia del elemento SIRE en regiones no codificantes del genoma del parásito . Se estableció que SIRE se asocia a una amplia variedad de genes implicados en distintos procesos metabólicos. Másaún, se determinó la relevancia que esta asociación tiene en la regulación de la expresión génica del parásito, dado que SIRE pude disminuir la estabilidad y la traductibilidad del ARNm al estar en regiones 3’ UTR, o bien aumentar la traductibilidad del ARNm al incluirse los últimos nucleótidos de SIRE en regiones 5' UTR. A su vez se estudió en profundidad las secuencias requeridas en el transsplicing y se definió la existencia de elementos reguladores del mencionado proceso y al mismo tiempo de la traductibilidad del ARNm correspondiente. Por último los resultados determinan la falta de consensos estrictos para las señales reconocidas en los primeros pasos del trans-splicing.

Abstract:
Trypanosoma cruzi is a parasitic protozoan that causes Chagas disease. The regulation of gene expression occurs mainly at a post-transcriptional level. The aims of this thesis were to study the role of intergenic regions and the influence of the repetitive element SIRE. The results demonstrate that SIRE is present in non-coding regions of the genome. Moreover, the results reveal that SIRE is associated to a wide variety of genes involved in different metabolic processes. Also, the results determine the relevance of this association to the regulation of gene expression given that SIRE, when present in 3’ UTR regions, down regulates the stability of the mRNA as well as its translation. In addition, the last nucleotides of SIRE can stimulate translation when present in the 5' UTR region. Furthermore, we study which are the most important sequences for the trans-splicing reaction. We defined new elements that are able to up regulate not only trans-splicing but also the translation of the corresponding mRNA. Finally, the results determine that there is no need of consensus sequences to achieve the early steps of the trans-splicing process.

Lutzky, Viviana Paula. "PECAM-1/CD31 en células tumorales : Un nuevo blanco para la terapia antiotumoral?" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las moléculas de adhesión han sido implicadas en la metástasis y la progresión tumoral. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la expresión y el rol de las moléculas de adhesión, en particular PECAM-l/CD31 en las células tumorales humanas. PECAM-l/CD31 es una glicoproteína de 130kDa perteneciente a la superfamilia de Inmunoglobulinas. Se encuentra presente en células endoteliales, plaquetas y en la mayoría de los leucocitos. Sin embargo, en este trabajo se demostró, por inmunofluorescencia y Western blot, la presencia de la molécula en líneas de células de melanoma y de adenocarcinoma. La expresión cuantitativa y cualitativa de PECAM-l/CD31 sobre las células tumorales es diferente a la de los leucocitos y células endoteliales, ya que en las células tumorales la expresión es menor, y además, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los dominios-2 y —6 no reaccionan con la molécula. La expresión de PECAM-l/CD31 sobre la superficie de las células tumorales fue modulada por interacciones célula-célula, siendo mayor en las células provenientes de cultivos sub-confluentes y en las células desprendidas espontáneamente de monocapas de células tumorales confluentes. La fijación y la permeabilización de las células tumorales reveló la presencia de reservorios intracelulares de PECAM-l/CD31. Por otro lado, la expresión de PECAM-l/CD31 aumentó y disminuyó en presencia de citocalasina B y brefeldina A, respectivamente. Las células de melanoma se adhirieron a células endoteliales y a proteínas de matriz extracelular. En el primer caso, la adhesión fue parcialmente mediada por PECAM-l/CD31, ya que la transfección de las células de melanoma con un oligonucleótido antisentido para PECAM-l/CD31, disminuyó la expresión de esta molécula y su adhesión. Lo mismo sucedió al tratar las células tumorales con anticuerpos dirigidos contra los dominios-1, —3 y —4/—5. En cambio la adhesión a las distintas proteínas de matriz extracelular fue mediada por las integrinas α1 (para colágeno IV); α3 (para matrigel, laminina, colágeno IV y colágeno I); α4 y α5 (para fibronectina); α6 (para matrigel) y β1 (para matrigel, colágeno IV, colágeno I y fibronectina). Finalmente, la coligación de PECAM-l/CD31 con anticuerpos dirigidos contra el dominio 3 en las células de melanoma y adenocarcinoma, tiene un efecto inhibitorio sobre la proliferación celular. Los resultados obtenidos en el presente trabajo, indican que existe un reservorio intracelular de PECAM-l/CD31 en células tumorales que probablemente module la expresión de CD31 en la superficie celular. Además sugieren un rol de esta molécula en el crecimiento tumoral y en la metástasis.

Abstract:
Tumor progression and metastasis have been related to the adhesion molecules expression. The aim of the present study was to examine the expression and the role of adhesion molecules on tumor cells, in particular PECAM-l/CD31. PECAM-l/CD31 is a 130-kDa member of the Immunoglobulin gene superfamily that is highly expressed on endothelial cells, platelets and most leukocytes. However, herein it is demonstrated by Western Blot and immunofluorescence that some melanoma cells and adenocarcinoma cells express PECAM-l/CD31 on the cell surface. The expression of PECAM-l/CD31 on tumor cells seems to be different from normal cells, since the expression was low compared to endothelial cells and leukocytes, and based on the absence of reactivity of monoclonal antibodies directed to domains 2 and 6. Furthermore, the tumor cells surface expression of PECAM-l/CD31 can be regulated by cell-cell contact, being higher on sparse and spontaneously detached cells. Fixing and permeabilizing tumor cells revealed a cytoplasmic pool of the molecule. Indeed, cell surface CD31 was internalized following mAb binding and the expression was enhanced and decreased by cytochalasin B and brefeldin A, respectively. Melanoma cells were able to adhere to endothelial cells and to extracellular matrix proteins, using different adhesion molecules. The interaction of melanoma cells with endothelial cells was partially mediated by PECAM-l, since decreasing the expression of CD31 on tumor cells by CD31-specific antisense oligonucleotide or by treatment with mAbs to domains -1, -3, -4/—5 decreased the adhesion to endothelium. Melanoma cells adhesion to ECM proteins was mediated by α1 (for collagen type IV); α3 (for matrigel, laminin, collagen type IV and collagen type I); α4 and α5 (for fibronectin); α6 (for matrigel) and β1 (for matrigel, collagen type IV, collagen type I and fibronectin). Furthermore, ligation of CD31 via domain —3 but not β1 integrin inhibited proliferation of melanoma and adenocarcinoma cells. Overall, these results indicate that there is an intracellular pool of CD31 on tumor cells which might modulate CD31 surface expression and its role in cancer cell growth and metastasis.

O’Rourke, Eyleen J.. "Identificación, caracterización e importancia biológica de las ADN glicosilasas del sistema de reparación del ADN por escisión de bases de Helicobacter pylori" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Tejera, Agueda Mercedes. "Efectos del tratamiento prolongado con AZT sobre células tumorales : acortamiento telomérico, inducción de senescencia y apoptosis, y reducción de tumorigenicidad" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Santori, María Isabel. "Clonado y caracterización de proteínas relacionadas al control del ciclo celular del parásito Trypanosoma cruzi" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En nuestro laboratorio se clonaron dos CRKs (CDK1 Related Kinases) de T. cruzi, TzCRK1 y TzCRK3 (Gómez y col., 1998) y se identificaron, por doble híbrido, proteínas que se asocian a TzCRK1 con similitud a una familia de ciclinas (Gómez y col., 2001). En el presente trabajo de tesis se caracterizaron y clonaron proteínas candidatas a participar en el control del ciclo celular de T. cruzi. Se secuenciaron en su totalidad los fragmentos de los genes obtenidos por doble híbrido y se los denominó TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Además se clonaron los genes completos y se secuenciaron. La secuencia predicha para las tres proteinas mostró similtud con ciclinas denominadas PHO, presentes en S. cerevisiae. TzCYC5 posee una región rica en histidinas próxima al amino terminal. Se determinó que los tres genes son de copia única mediante Southern blot y por rastreo de una biblioteca genómica. La expresión de los tres genes mostró variaciones particulares en distintos estadios de T. cruzi. TzCYC6 complementó una cepa mutante de S. cerevisiae, deficiente en las ciclinas de G1, demostrando que es una ciclina funcional. Se determinó el patrón de expresión de TzCRK3 en estadíos de T. cruzi. El ARNm de TzCRK3 es más abundante en el estadío amastigotes que en epimastigotes o tripomastigotes. Se obtuvo un suero específico contra TzCRK3, inmunizando conejos con la proteína recombinante expresada en bacterias. Ensayos de Western blot mostraron, en epimastigotes la presencia de una proteína del peso molecular esperado, 35 kDa. En amastigotes y tripomastigotes, se observaron bandas específicas de menor movilidad. Se estableció que la proteina identificada en epimastigotes se asocia a p13ˢͧͨ¹-agarosa, proteína con alta afinidad por CDK1. TzCRK3 endógena mostró actividad quinasa de histona H1 y fue inhibida por inhibidores de CDKs: flavopiridol, roscovitina y olomoucina. Flavopiridol inhibió el crecimiento de epimastigotes en cultivo, aunque no en forma total. La actividad quinasa de la TzCRK3 de dichos epimastigotes se inhibió en forma dosis dependiente. La actividad de quinasa de histona H1 asociada a p13ˢͧͨ¹ mostró las mismas variaciones estadío especificas y similar sensibilidad a los CK1s que TzCRK3. En los cultivos con flavopiridol el IC50 no mostró diferencias significativas con el de TzCRK3. La actividad de TzCRK3 en epimastigotes sincronizados mostró un pico en G2/M mientras que la actividad asociada a p13ˢͧͨ¹ aumentó al mismo tiempo pero no disminuyó hasta M. La expresión de TzCRK3 fue constante. Los patrones de actividad y expresión de TzCRK3 son tipicos de una CDK. Esta evidencia indica que TzCRK3 está involucrada en el control del ciclo celular de T. cruzi, controlando el pasaje de G2/M, aunque no se puede excluir la presencia de otra CDK. Se identificó un EST con alta similitud de secuencia con Lmmp12ͨᴷˢ¹, el gen homólogo a p13ˢͧͨ¹ en Leishmania mexicana. Se clonó el gen completo y se determinó que es copia única. La secuencia esperada de la proteína muestra una alta identidad de secuencia con la familia de proteinas CKS. Su expresión mostró variaciones estadío especificas. La proteina recombinante se expresó en bacterias, en fusión a histidinas, se la purificó y se inmunizaron conejos para obtener un anti suero.

Abstract:
In our laboratry two CRK genes: TzCRK1 and TzCRK3 from T. cruzi were previously isolated (Gómez et al., 1998), and using the yeast two-hybrid system open reading frames coding for proteins able to associate with TzCRK1 were identified (Gómez et al, 2001). Positive clones obtained in the two hybrid screen were sequenced and compared in data banks. Clones sharing identity with S. cerevisiae PHO cyclins were named TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Full lenght genes were cloned and sequenced. Identity with proteins from the PHO family was still observed when the predicted aminoacidic sequences were compared. An histidine-rich domain was observed in the TzCYC5 amino terminal region. All three genes were shown to be single copy. Cyclins mRNA levels varied in a stage specific manner. TzCYC6 was able to functionally complement a S. cerevisiae deficient for G1 cyclins. To establish if TzCRK3 has a role in the regulation of the parasite cell cycle, its expression and activity were studied. Northern and Western blot analyses detected the enzyme in three forms of the parasite; mRNA levels, subcellular localization and apparent molecular weight of the protein varied throughout the stages. TzCRK3 from epimastigote soluble extracts interacted with p13ˢͧͨ¹-beads. Endogenous TzCRK3 phosphorylated histone H1 and this activity was inhibited by specific CDK inhibitors (CKIs): olomoucine, flavopiridol and roscovitine. In addition, p13ˢͧͨ¹ beads coprecipitated with a kinase activity that was inhibited by the CDK inhitors mentioned above. Flavopiridol partially inhibited the growth of T. cruzi epimastigotes at 50 nM, the lowest concentration used, but even with the highest (5 mM), cell growth was not completely arrested. TzCRK3 from flavopiridol inhibited epimastigotes extracts exhibited a dose dependent inhibition of histone H1 phosphorylation. T. cruziˢͧͨ¹- binding CRK displayed the same inhibition profile. TzCRK3 IC50 did not significatively differed from the shown by the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹. This indicates that TzCRK3 is the enzyme responsible for the majority of the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹. TzCRK3 activity of hydroxyurea (HU) synchronized epimastigotes peaked in G2/M boundary while the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹ beads increased at the same time point but remained high until late G2/M. In addition, TzCRK3 expression was constant along the cell cycle. This is a common pattern of CDK activity regulation. Taken together, these results contribute to support the idea that TzCRK3 is involved in control of the cell cycle in T. cruzi. A T. cruzi EST sharing high identity values with the Leishmania mexicana p13ˢͧͨ¹ homologous, Lmmp12ͨᴷˢ¹ was identified. The full lenght gene was cloned. The predicted aminoacidic sequence showed high identity scores with proteins belonging to the CKS family. This protein was named Tzp12ͨᴷˢ¹. mARN levels in different stages of the parasite varied. The recombinant protein, fused to a histidine tag, was expressed in bacteria. It was purified and used to immunize rabbits, in order to obtain a specif antibody.

Furlong, Laura Inés. "Caracterización bioquímica y molecular de los sitios de unión a zona pellucida presentes en proacrosina humana" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el rol de la proteina espermática humana proacrosina/acrosina como molécula de adhesión a las glicoproteínas de la zona pellucída (ZP). En una primera etapa, se llevó a cabo un análisis bioinformático sobre la secuencia aminoacídica de proacrosina con el propósito de identificar sitios potenciales de unión a glicoproteínas de la ZP. El resultado de este análisis reveló que los residuos Lys74. Lys169, Arg172, Arg199, Arg249, Lys251, Arg252 y la secuencia KRLQQKLIE, localizada entre los residuos 367-374, conformarían sitios potenciales de unión a la ZP. A continuación se realizaron experimentos para evaluar la interacción entre proacrosina/acrosina con glicoproteínas de la ZP. Para ello se desarrolló una estrategia de subclonado del ADNc de proacrosina humana en vectores de expresión procariotas (pET-22b, pGEX-3X) para la expresión de proacrosina recombinante. Utilizando el sistema de expresión en forma directa (pET-22b) se obtuvo un producto de expresión recombinante correspondiente a la proenzima (Rec-40), y productos truncados del extremo N-terminal de la proteína (Rec-30, Rec-20, Rec-10). Estas proteinas fueron caracterizadas mediante la utilización de anticuerpos especificos y análisis de secuenciación de aminoácidos, determinándose que Rec-30 correspondería a los residuos 1-300, Rec-20 a 1-190 y Rec-10 a 1-160 de proacrosina humana. Utilizando el mismo sistema de expresión se sintetizó un producto de expresión correspondiente a los residuos 1-59 de proacrosina (Rec-6). Los productos de expresión, obtenidos como cuerpos de inclusión, fueron solubilizados y aislados mediante electroforesis preparativa. El estudio de la interacción entre proacrosina/acrosina recombinante y las glicoproteínas de la ZP se llevó a cabo utilizando ensayos de unión en fase sólida ("Ligand blot", "Dot blot", ensayo en placa de poliestireno). Se utilizaron glicoproteínas obtenidas de ovocitos humanos de descarte de programas de fecundación in vitro, así como glicoproteínas obtenidas por expresión en células CHO a partir del ADNc (rec-hZPA, rec-hZPB, rec-hZPC). El resultado de estos estudios indicó que proacrosina recombinante (Rec-40) y fragmentos del extremo N-terminal de la proteína (Rec-30, 20 y 10) tienen capacidad de unión a glicoproteínas de la ZP y a azúcares. Las glicoproteínas de la ZP mostraron diferente capacidad de unión a proacrosina/acrosina, siendo hZPA el ligando principal. El mecanismo de unión involucraría interacciones electrostáticas entre aminoácidos cargados positivamente en proacrosina/acrosina, y oligosacáridos sulfatados en la ZP, así como el reconocimiento de residuos de fucosa y manosa presentes en los oligosacáridos de la ZP. El resultado del mapeo de los sitios de unión en la molécula de proacrosina permite proponer que éstos estarían localizados en dos regiones de la proteína. Una región estaría comprendida entre los residuos 59-160 (Dominio II), y otra entre los residuos 300-402 (Dominio III). Los sitios de unión localizados en el Dominio II de la proteina estarían estabilizados por uniones no covalentes y puentes disulfuro, mientras que los sitios localizados en el Domino II estarían estabilizados por interacciones no covalentes, y tendrían una contribución principal a la afinidad de la interacción. En dichas regiones, los residuos Lys74, Lys108, Lys114 y el motivo KRLQQKLIE (residuos 367-374), identificados mediante el análisis de secuencias, participarían en la interacción con glicoproteinas de la ZP y azúcares. En resumen, este trabajo muestra que proacrosina/acrosina humana presenta La capacidad de reconocer glicoproteinas de la ZP. de manera independiente de la actividad de proteasa. Esto permite proponer que proacrosina/acrosina participaría como molécula de adhesión en la unión secundaria del espermatozoide a la ZP en el humano.

Perez Castro, Carolina Inés. "Rol de la familia de citoquinas gp130 en la regulación de la función hipofisaria" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las cítoquinas mas conocidas en la regulación de la función de células de la pituitaria anterior son LIF e IL-6. Estas cítoquinas, junto con IL-11, oncostatina M, CNTF y cardiotrofma-1, son referidas como cítoquinas gp 130, debido a que comparten el mismo transductor de señales. En la presente tesis, se estudió el papel de las cítoquinas de la familia gp130 en células de la pitutaria anterior. Se encontró que, tanto células TtT (foliculoestrlladas-FS) como GH3 (lactosomatotrofas) expresan el mRNA para la cadena específica α del receptor de IL-11 (IL-11-R) y de CNTF-R. Ambas cítoquinas estimulan la proliferación de células FS y células GH3. También, CNTF estimula la producción hormonal (GH y PRL) en células GH3 e IL-11 la secreción de VEGF en células FS. Ambos tipos celulares expresan el mRNA para CNTF. Células normales de pituitaria anterior y adenomas humanos también expresan CNTF-R(α).IL-11 y CNTF estimulan en forma similar los niveles del mRNA GH en cultivos celulares acromegálicos en monocapa, sin modificar los niveles de secreción hormonal. CNTF estimula la secreción de PRL en monocapa de prolactinomas. En cultivos en monocapa de células normales, IL-11 y CNTF no modifican la secreción de GH y PRL, ni los niveles del mRNA GH. Sin embargo, cuando las células son cultivadas en forma de agregados celulares, ambas cítoquinas estimulan la secreción de dichas hormonas. Se estudió además la acción de esta familia de cítoquinas sobre los procesos tumorigénicos. En clones estables de células GH3 que sobreexpresan gp130 (gp130 sentido), y clones de expresión reducida (gp130 antisentido), se examinó la secreción hormonal, la proliferación celular y la capacidad tumorigénica de los clones en ratones nude. La sobreexpresión de gp130 no modificó el comportamiento celular. Sin embargo, los clones gp130 antisentido, que no responden al estímulo específico de la citoquina gp130, mostraron una marcada inhibición in vitro y en el desarrollo de tumores in vivo. Mediante la técnica de Differential Display se aisló e identificó un cDNA (X2CR1) el cual se expresa diferencialmente en células que sobreexpresan gp130. Este cDNA codifica para una proteina de 195-aa; no posee motivos funcionales conocidos y posee una localización citoplasmática/nuclear. Su perfil de expresión (mRNA) correlaciona con el de gp130. Presenta una secuencia altamente conservada (entre rata y humano), y dos isoformas (mRNA) en los distintos tejidos analizados. La sobreexpresión de X2CR1, regula negativamente tanto la expresión basal del promotor de GH, así como la estimulación con cAMP. De estos resultados se puede concluir: - las cítoquinas gp130 y sus receptores, se expresan y son funcionales en células normales como tumorales de la pituitaria anterior. IL-11 y CNTF son capaces de regular, a través del transductor común gp130, la secreción de hormonas y factores angiogénicos, así como la proliferación celular. La estructura de la glándula es de crítica importancia para la acción de estas cítoquinas; - la sobreexpresión de gp130 en células GH3 no modifica rotundamente el comportamiento celular. Sin embargo, la disminución en los niveles de expresión, refleja la importancia de la acción de las cítoquinas de esta familia no sólo en situaciones fisiológicas sino patofisiológicas como en la formación y/o el mantenimiento de adenomas hipofisarios; - células lactosomatotrofas sobreexpresoras de gp130, expresan diferencialmente X2CR1. Esta nueva proteína podría tener un papel como regulador negativo de las acciones de gp130 así como de otras rutas de señalización intracelular (como en la de CAMP).

Abstract:
Two of the most potent cytokines regulating anterior pituitary cell function are LIF and IL-6. These and others like IL-11, oncostatín M, CNTF and cardiotropin- 1 are referred to as the gp130 cytokines, because they share the gp130 protein as an initial signal transducer. In the present thesis of work, we studied the role of the gpl30 cytokine family in anterior pituitary cells. Receptors (mRNA α-chain specific) for IL-11 and CNTF are expressed on both lactosomatotropic (GH3 cells) and folliculostellate-FS cells (TtT cells). Both cytokines stimulate the proliferation of FS and GH3 cells. In addition, CNTF stimulates the hormonal production (GH and PRL) by GH3 cells and IL-11 stimulates the secretion of VEGF, by FS cells. Both GH3 and FS cells express the CNTF mRNA. The mRNA for the CNTF-R is expressed in all of the human adenoma types analyzed and normal pituitary cells. CNTF and IL-11 exerted a similar stimulatory effect on GH mRNA expression in acromegalic monolayers cell cultures, but these cytokines had no significant influence on GH secretion. CNTF stimulates prolactine secretion in prolactinoma monolayers cell cultures. In monolayers cell cultures from normal rat anterior pituitary, IL-11 and CNTF had no significant effect on the release of either GH or PRL, or on the level of GH mRNA. However, when these cells were cultured in aggregate cultures, both cytokines stimulated hormonal secretion. We generated GH3 gp130 stable clones (gp130 sense and gp130 antisense), in order to study the role of gp130 cytokine family in the tumorigenic process. We examined hormonal secretion, cell growth and tumorigenesis properties in athymic nude mice. The overexpressed gp130 clones did not shown any changes in the cellular behavior. The gp130 antisense clones did not respond to the specific gp130. Likewise, GH3 gp130 antisense cells had severely impaired the in vivo tumor development. By Differential Display technique, we isolated and identified a new cDNA (X2CR1), which differentially expressed in overexpressed gp130 cells. This cDNA encodes a protein of 195-aa, which contains no well-characterized functional motifs and shows a citoplasmic/nuclear localization. Its expression profile (mRNA) is linked with the gp130 expression. The rat X2CRl shares striking sequence homology with its human counterpart, and in the human tissues that we analyzed it presents two different isoforms. GH promoter baseline activity and also under CAMP stimulation were reduced by overexpression of X2CR1. From these results the following conclusions can be drawn: - the gp130 cytokines and their receptors are expressed and are functional in normal anterior pituitary cells and pituitary tumor cells. CNTF and IL-11 regulate, through gp130 transducer, the secretion of hormone, VEGF and the cell proliferation. The three-dimensional structure of the gland is critical for these actions; - the overexpressed gp130 protein did not produce any changes in the GH3 cellular behavior. In contrast, the reduction gp130 level, revealed the importance of the gp130 cytokines actions not only in physiological but also in patophysiological situations, like the beginning and/or the maintenance of pituitary adenoma development; - X2CR1, a novel protein isolated from overexpressed gp130 GH3 cells, may function as a negative regulator of the gp130 cytokines actions, and also may play a similar role in another intracellular pathways (like cAMP signaling).

Kadener, Sebastián. "Regulación transcripcional del Splicing alternativo" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En el presente trabajo de tesis investigamos aspectos relacionados con el acoplamiento entre la transcripción y el splicing alternativo. Utilizando como modelo al exón alternativo EDI de la fibronectina humana, encontramos que la elongación transcripcional es un importante modulador del splicing alternativo. El Ag T de SV40 activa la replicación del DNA 2 veces, la transcripción entre 12 y 20 veces, y es capaz de provocar un incremento de 25 veces en la inclusión del exón EDI. El efecto del Ag T es específico de exón, ocurre en cis y depende de la replicación del DNA y no de la transformación celular. VP16, un activador de la iniciación y elongación transcripcionales tiene un efecto similar en la transcripción pero opuesto sobre el splicing: inhibe la inclusión de EDI 35 veces. Es más, esta proteína viral es capaz de revertir el efecto del Ag T sobre el splicing de EDI. Consistentemente se determinó que la replicación es capaz de modificar la estructura cromatínica del molde y de ese modo alterar la capacidad elongadora de la RNA pol II. Por otro lado, el enhancer transcripcional del SV4O (una secuencia capaz de aumentar la capacidad elongadora de la RNA pol II) favorece la exclusión del exón EDI en forma independiente de los niveles de RNA. De este modo, la modulación de la capacidad elongadora de la RNA pol II aparece como una nueva forma de regular el splicing alternativo. Independientemente se determinaron dos hechos de importancia: ni el sitio intranuclear de transcripción, ni el reclutamiento de proteínas de splicing por la maquinaria transcripcional parecen tener una influencia importante sobre la decisión de inclusión del exón EDI en el transcripto maduro.

Abstract:
In this work we investigated aspects related to the coupling between transcription and alternative splicing. Using the fibronectin alternative EDI exon as a model, we found that th pol II elongation rate has an important influence on alternative splicing. SV40 large T-antigen (T-Ag) activates template replication by only 2-fold, transcription by 12-20 fold and provokes a 25-fold increase in the inclusion of the EDI exon into mature mRNA. VP16, an activator of transcriptional initiation and elongation, has a similar effect on trasncription but the opposite effect on splicing: EDI inclusion is inhibited by 35-fold. Moreover, this Viral protein can revert the T-Ag effect. T-Ag- mediated replication can modify the chromatin structure of the plasmid DNA and, as a consecuence of this, can inhibit the processivity of RNA pol II. The SV40 enhancer (a sequence capable of changing the elongation rate of RNA pol II) stimulates EDI exon exclusion. Then, modulation of the elongation rate apperars as a key mechanism to regulate alternative splicing. In addition, we found that the intranuclear transcription site and the recruitment of splicing proteins by the transcription machinery are not important for the fate of EDI inclusion in mature mRNA.

Vilá Ortiz, Guillermo. "Caracterización de la expresión y actividad de las fosfatasas de Serina y treonina durante el desarrollo del sistema nervioso central : función de la Calcineurina" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El objetivo en esta tesis fue caracterizar el comportamiento de las fosfatasas de serina y treonina (STPasas) durante el desarrollo del sistema nervioso. Como modelo experimental se empleó en primera instancia el desarrollo postnatal del cerebelo de ratón, ya que durante este período se dan numerosos procesos, como el crecimiento axonal, la formación de sinapsis y la apoptosis, en los cuales las distintas STPasas podrían llegar a estar involucradas. Para caracterizar la expresión de los ARNm de las fosfatasas, se diseño una nueva estrategia, SSDD (Single-Strand Differential Display), la cual nos permitió determinar como era la expresión de los distintos mensajeros a distintas edades. Esta técnica no solo nos permitió observar que cada una de las STPasas detectadas presenta una expresión diferencial, sino que también identificar una nueva variante de splicing de la isoforma gamma de la PP1. Esta técnica también fue empleada con éxito para el estudio de STPsas en tumores del sistema nervioso, pudiéndose observar que tanto la expresión de la isoforma alfa de la PP1 como de las isoformas alfa y beta de la PP2A era mayor en tumores de índole maligna que en benignos. Además, se detectó por primera vez la isoforma gamma de la calcineurina (CaN Aγ) en tumores del sistema nervioso. Durante el desarrollo del cerebelo, se observó que PP2A no muestra variaciones significativas ni en la expresión de proteínas ni en la actividad fosfatasa que posee. Por otro lado, PP1 sí muestra diferencias no solo en la expresión de proteínas, donde se observa un aumento a P13 y una disminución posterior a P20, sino también en lo que respecta a su actividad, cuyo incremento coincide con el período en el cual se empiezan a formar las sinapsis entre los axones de las células grano y las espinas dendríticas de las células de Purkinje. En el mutante cerebeloso staggerer, en el cual se encuentran afectadas las células de Purkinje y no se produce la estabilización sináptica, se encontró que los niveles proteicos de PP1 no disminuyen a P20 como ocurre en el cerebelo normal, y que la actividad no se incrementaba. Por otro lado, la fosfatasa que mostró mayores variaciones durante el desarrollo fue la calcineurina. Específicamente, los niveles de proteínas de la isoforma CaN Aα se incrementan gradualmente con el tiempo, lo cual coincide con el período de formación de sinapsis. En este período además, se produce un incremento en la actividad de la calcineurina. En el mutante staggerer, los niveles de esta isoforma son similares hasta P11, pero después no se incrementan como sucede en el ratón normal. La actividad fosfatasa en el mutante decae también a partir de esta edad. Con el fin de estudiar con mayor detalle la función de la calcineurina, se estudió lo que ocurría en distintos cultivos del sistema nervioso (células PC12, células NT2 y cultivos primarios de células grano). Para esto se incubaron los distintos cultivos con inhibidores de la calcineurina y con oligonucleótidos antisentido contra las dos isoformas. En todos los casos se observó que, tanto la inhibición de la actividad como de la expresión, particularmente de la isoforma CaN Aβ, provocaba que las células murieran por apoptosis, independientemente del estadío de diferenciación en el que ellas se encontraran. Este proceso estaba relacionado con un aumento en los niveles de Bax y una disminución de Bad. Particularmente en el caso de las células NT2, se pudo observar que el aumento de la expresión de Bax coincidía con un incremento en la translocación de la proteína al núcleo, mientras que la disminución de Bad lo hacía con la aparición de “parches” en el citoplasma, lo que es indicativo de una translocación a mitocondria. Posteriormente se estudió lo que ocurría con estas proteínas pro-apoptóticas en el mutante staggerer, el cual presentaba una muy baja actividad de calcineurina. Bad no mostró variaciones pero los niveles de Bax a P20 aumentaron considerablemente. Todos estos resultados sugieren que la inhibición de la expresión o de la actividad de la calcineurina ocasiona que las células entren en apoptosis por un mecanismo que involucra, por lo menos, un aumento en los niveles de Bax.

Abstract:
The objective of this work was to characterize the behavior of serine/threonine phosphatases (STPases) during development in the nervous system. As first approach, mouse cerebellum postnatal development was employed as experimental model, because several processes during this period, such as axonal growth, synapses formation and apoptosis, might involved several STPases. A new method was developed, SSDD (Single-Strand Differential Display), to characterize mRNA expression of STPases, which allowed us to analyze the expression of these messengers at different ages. Using this method, not only a different pattern of mRNA expression was obtained but the identification of a new splicing form of PP1 gamma isoform was achieved. This technique was successfully applied to the study of the mRNA of STPases in tumors of the nervous system too, showing that the PP1 alpha, PP2A alpha and beta isoforms have a increased expression in malign tumors than in benign. In addition, for the first time, calcineurin gamma isoform (CaN Aγ) was detected in tumor of the nervous system. During cerebellum development, PP2A showed no significant changes in protein expression or in the phosphatase activity. On the other hand, PP1 shows differences, not only in protein expression, with an increase in expression at P13 and a posterior decrease at P20. The activity of PP1 was also modified, showing an increase that correlates with the period when synapses begin to form between granule cell axons and dendritic spines of Purkinje cells. When the cerebellar mutant mouse staggerer was analyzed, in which Purkinje cells are affected and synaptic stabilization are impaired, it was found that the protein PP1 levels do not decreased at P20, as in normal cerebellum, and that the activity no increased. On the other hand, the phosphatase that shows the most important changes was calcineurin. Specifically, protein levels of the CaN Aα isoform increased gradually with time, in correlation with the period of synapses formation. In addition, calcineurin showed a raise in its activity. In the staggerer mutant, similarily levels of this protein at P11 were observed, but after this time no increase in expression or activity were observed. With the objective to obtain a more detailed knowledge of calcineurin function, studies using several cultures of nervous system (PC12, NT2 and primary cultures of cerebellar granule cells) were conduced. Incubations with calcineurin inhibitors and oligonucleotide antisenses against both isoforms were performed. In all the cases, inhibition of either the activity or the expression, in particular of the CaN Aβ isoform, produced cell apoptosis, independently of the differentiated state in which the cells are found. In this process, increased Bax and decreased Bad levels were involved. In particular, in NT2 cells, the increased Bax expression was associated with an increased protein translocation to nucleus, while decreased Bad levels with a punctate staining pattern in the cytoplasm, indicating a translocation to mitochondria. Later, we study what happened with these pro-apoptotic proteins in the staggerer mutant mice, that presents a very low calcineurin phosphatase activity. In this case, Bad showed no modifications, but Bax levels increased condisederably. All these results sugget that expression or activity inhibition of calcineurin induce cells to enter in apoptosis, through a mechanism that involved, at least in part, increased in Bax levels.

Kovalovsky, Damián. "Inducción y activación de Nurr77 y Nurr1 por CRH e IL-1 en corticotrofos : rol sobre la regulación del gen de POMC y vías de transducción de señales involucradas" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En este trabajo de tesis abordamos el estudio de la función corticotrofa normal y tumoral focalizándonos en tres temas fundamentales: a) los eventos moleculares involucrados en la regulación de los factores de transcripción Nur y sus consecuencias en la activación del gen de proopiomelanocortina (POMC) por la hormona liberadora de corticotrofina (CRH) y AMP cíclico (cAMP), b) la implicancia de los factores Nur en la regulación corticotrofa por interleuquina-1 (IL-1) y c) la de interacción entre IL-1,CRH y glucocorticoides. Demostramos en células corticotrofas AtT20 que la entrada por canales de calcio tipo L es esencial para la inducción de los mRNAs de Nur77 y Nurr1 y la estimulación de la actividad Nur por CRH a través de la actividad de CAMKII. La entrada de calcio es suficiente para producir la estimulación. El tratamiento con cAMP estimula Nur77 también independientemente del calcio entrante. Existe una vía de MAPK (Rap1/B-Raf/MEK1,2/ERK1,2) funcional en corticotrofos que estimula la fosforilación y actividad transcripcional de Nur77 y que es activada por CRH y cAMP en forma calcio-dependiente y calcio-independiente. La regulación por estas vías de señalización sobre la actividad Nur correlaciona con la regulación sobre el promotor de POMC. Demostramos también que Nur77 media la acción estimulatoria de IL-1 sobre el promotor de POMC: IL-1 estimula la actividad Nur sobre el sitio NurRE; produce la inducción del mRNA de Nur77 y no de Nurr1, un efecto transcripcional a nivel del promotor de Nur77; estos efectos dependen de la actividad de la protein quinasa p38; una línea que sobreexpresa una mutante dominante negativa de Nur77 es insensible a la estimulación por lL-1 de la secreción de ACTH, la actividad Nur y la inducción de POMC. La activación del factor de transcripción NFkB ejerce un efecto negativo en la estimulación de la actividad Nur y la inducción de POMC por IL-1. Demostramos que la potenciación entre IL-1 y CRH sobre la secreción de ACTH se observa también sobre la actividad Nur. El tratamiento con IL-1 aumenta la sensibilidad a la inhibición de la secreción de ACTH por glucocorticoides, tanto en la línea celular AtT20 como en cultivos primarios de adenomas corticotrofos humanos. Este efecto no es consecuencia de la inhibición del mRNA de POMC sino un efecto a nivel de la secreción y no es consecuencia de una diferencia en la afinidad de GR por los glucocorticoides ni una diferencia en el número de GR. En conclusión, en este trabajo de tesis caracterizamos por primera vez las vías de señalización involucradas en la regulación de la actividad Nur y la función corticotrofa por IL-1, CRH, glucocorticoides y sus interacciones, demostrando que la regulación de la expresión de POMC y ACTH en corticotrofos involucra: la existencia de una vía de MAPK funcional, la actividad fundamental de Nur tanto para CRH como para IL-1 y la interacción funcional de IL-1 con CRH (sinergismo) y con glucocorticoides (aumento de la sensibilidad a la inhibición).

Abstract:
In this thesis work we studied the normal and tumoral corticotrophic function focusing on three fundamental points: a) the molecular events involved in Nur regulation and its consequences on proopiomelanocortin (POMC) gene regulation by corticotrophic releasing hormone (CRH), cyclic AMP (cAMP), b) the implicance of Nur factors in corticotrophic regulation by interleukin-1 (IL-1) and c) the interaction among IL-1, CRH and glucocorticoids. We demonstrate that calcium entry through L type channels is crucial for Nur77 and Nurr1 mRNA induction and increased activity by CRH treatment involving CAMKII function. Calcium entry is sufficient to produce this stimulation. Treatment with cAMP stimulates Nur77 also independently of calcium. There is a functional MAPK (Rap1/B-Raf/MEK1,2/ERK1,2) pathway in corticotrophs that stimulates Nur77 phosphorylation and transcriptional activity and it is activated by CRH and cAMP treatments involving calcium-dependent and —independent signals. POMC regulation by this pathways correlates with Nur activity. We also demonstrate that Nur77 is involved in the stimulation of POMC by IL-1: IL-1 stimulates Nur activity on the NurRE site; induces Nur77 and not Nurr1 mRNAs, a transcriptional effect on the Nur77 promoter; these effects depend on p38 protein kinase activity; a cell line that overexpresses a dominant negative mutant of Nur77 is insensitive to IL-1 stimulation of ACTH secretion, Nur activity and POMC induction. NFkB activity exerts a negative effect on Nur activity and POMC mRNA induction by IL-1. We demonstrate that the synergism between CRH and IL-1 on ACTH secretion is also observed on Nur activity. IL-1 treatment increases the inhibitory effect of glucocorticoids on ACTH secretion, in the corticotrophic AtT20 cell line and in corticotroph human adenomas primary cultures. This effect is not a consequence of inhibition of POMC mRNA but an effect at the level of secretion and it is not due to different affinity of glucocorticoid receptor (GR) for glucocorticoids nor to different GR number. In conclusion, in this thesis work we characterized for the first time the signaling pathways involved in the regulation of Nur activity and the corticotrophic function by IL-1,CRH, glucocorticoids and its interactions, demostrating that the regulation of POMC mRNA expression and ACTH in corticotrophs involves: the existence of a functional MAPK pathway, the instrumental activity of Nur for CRH and IL-1 actions and the functional interaction of IL-1 with CRH (synergism) and with glucocorticoids (increased sensitivity to inhibition).

Rivarola, Valeria. "Caracterización funcional y molecular de la regulación del transporte de agua y del pH intracelular en células del túbulo colector cortical" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los túbulos colectores corticales (CCD) del riñón de mamífero juegan un papel central en la regulación del transporte de agua-solutos y en el equilibrio ácido-base del organismo. Si bien muchos estudios han sido realizados para tratar de entender los mecanismos implicados en estos procesos, los mismos no han sido completamente aclarados. En la presente tesis hemos utilizado a la línea celular RCCD1 (modelo de CCD) para intentar clarificar los mecanismos por los cuales se produce el movimiento de agua y la regulación del pHi en este segmento del nefrón. En lo referente al movimiento de agua observamos que la línea celular desarrolla importantes flujos en ausencia de fuerzas impulsoras osmóticas e hidrostáticas. Demostramos, además, que los mismos ocurrirían por un mecanismo de cotransporte agua-soluto ya que la línea no expresa acuaporinas. Basalmente predominaría un flujo secretor asociado al movimiento de Cl-, HCO3- y K+. La hormona AVP estimularía, a “corto plazo”, una absorción de fluido acoplada a la de Na+ y, a “largo plazo”, un flujo secretor acoplado al Cl- probablemente mediado por el canal CFTR. En cuanto a la regulación del pHi demostramos funcional y molecularmente que la linea expresa, basolateralmente, las isoformas NHE-1 y NHE-2 del intercambiadores Na+/H+. La NHE-1 sería la encargada de la regulación del pHi ante una carga ácida y la NHE-2 mantendría el pHi basal. En lo que respecta a los intercambiadores Cl-/HCO3- demostramos que la línea celular RCCD1 expresa las isoforrnas AE2, AE3 y AE4. Las dos primeras se localizarían en la membrana basolateral y la AE4 estaría en la membrana apical. Funcionalmente AE3 y AE4 se encargarían de mantener el pHi basal mientras que la AE2 se activaría ante cargas alcalinas. Además proponemos que las células RCCD1 tendrían plasticidad en la expresión de sus intercambiadores Cl-/HCO3-. Finalmente mostramos que la AVP es capaz de modular tanto a los intercambiadores Na+/H+ como a los Cl-/HCO3-. Interesantemente hallamos que esta hormona, tradicionalmente asociada a las células principales, podría también regular a los transportadores Cl-/HCO3- presentes en las células intercalares.

Abstract:
The mammalian cortical collecting duct (CCD) plays an important role in the regulation of water-ion coupling and acid-base balance. Although several studies have been performed in order to study the bases of these processes, these have not been completely clarified. During this thesis we used the RCCD1 cell line (as a CCD model) to elucidate the mechanisms of water movement and pHi regulation in this part of the nefron. Conceming water movement this cell line developed important water fluxes in the absence of osmotic or hydrostatic driving forces. As this cell line does not express aquaporins, the mechanism involved in these movements is associated to a water-solute cotransport. In basal conditions RCCD1 cells developed a secretory flux associated to Cl-, HCO3- and K+ movements. A “short term” effect of AVP resulted in an absortive flux associated to Na+ and, a “long term” effect in a secretory flux associated to Cl- probably driven by CFTR channel. Conceming pHi regulation our functional and molecular studies showed that RCCD1 cells express, in the basolateral membrane, the NHE-l and NHE-2 isoforms of the Na+/H+ exchanger. NHE-1 would be responsible of pHi recovery after an acid load and NHE-2 would mainly be involved in steady-state pHi. On the other hand RCCD1 cells express AE2, AE3 and AE4 isoforms of the Cl-/HCO3- exchanger. AE2 and AE3 would be localized in the basolateral membrane and AE4 in the apical one. AE3 and AE4 would be involved in Steady-state pHi while AE2 would be activated after an alkaline load. Moreover we demonstrated that RCCD1 cells would have plasticity in Cl- /HCO3- exchanger expression. Finally our studies showed that AVP can activated both NHE and AE exchangers. Interestingly, we propose that the hormone action, traditionally associated to the principal cells, would be also able to regulate Cl-/HCO3- exchanger in the intercalated cells.

Carrillo, Carolina. "Metabolismo de las poliaminas y su regulación en parásitos tripanosomatidos : expresión del gen de la Ornitina decarboxilasa (ODC) de C. fasciculata en T. cruzi" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Trypanosoma cruzi es el agente causal del “Mal de Chagas”, enfermedad endémica en América Latina. Este parásito unicelular, al igual que otros parásitos tripanosomátidos, presenta un complejo ciclo de vida a través de diferentes hospedadores (insecto vector - hospedador vertebrado). A lo largo de su ciclo el parásito pasa por distintos estadios celulares, sufriendo profundos cambios morfológicos, fisiológicos y bioquímicos que le permiten adaptarse a los distintos ambientes. Uno de los estadios, el epimastigote, no es infectivo para el hospedador vertebrado y presenta una capacidad proliferativa que permite su cultivo en el laboratorio sin mayores dificultades. Trypanosoma cruzi presenta numerosas características metabólicas que lo diferencian de otros organismos incluso del mismo orden. Describir estas diferencias permitiría conocer más detalladamente al parásito aportando datos de utilidad taxonómica y evolutiva y contribuiría al posible desarrollo de tratamientos quimioterapéuticos más específicos y eficientes que los disponibles hasta el presente. Un punto clave en el metabolismo de los tripanosomátidos está asociado a las poliaminas. Estos policationes alifáticos (putrescina, esperrnidina y espermina) están presentes en la mayoría de los organismos, tanto procariotas como eucariotas, cumpliendo funciones celulares esenciales tales como asistir la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas, estabilizar macromoléculas y estructuras celulares y participar en la proliferación y diferenciación celular. La biosíntesis de poliaminas comienza por la conversión de ornitina en putrescina por acción de la ornitina decarboxilasa (ODC). Esta enzima es fundamental en la regulación de la síntesis de poliaminas y su actividad esta rigurosamente controlada a distintos niveles. Además, se ha descripto un inhibidor específico e irreversible, difluorometilornitina (DFMO), que ha facilitado el estudio de dicha enzima. Una vía alternativa de síntesis de putrescina actúa a través de la arginina decarboxilasa (ADC) cuyo sustrato es el aminoácido arginina. Esta enzima fue inicialmente descripta en plantas y bacterias y recientemente ha sido encontrada en ciertos tejidos de mamíferos. En parásitos protozoarios existen controversias con respecto a la existencia de las enzimas que catalizan el primer paso de la síntesis de poliaminas, especialmente la ADC. La discutida carencia de dichas actividades es suplida por un transporte activo constitutivo de poliaminas desde el medio extracelular. A lo largo de este trabajo confirmamos que los epimastigotes de distintas cepas de T. cruzi son auxótrofas para poliaminas. Esta auxotrofia esta ocasionada por la falta de la actividad enzimática de ODC y de ADC que, a su vez, se da por la ausencia de los genes correspondientes. Además, se transfectaron epimastigotes de T. cruzi con un vector de expresión recombinado con el gen de ODC de Crithidia fasciculata (clonado en este laboratorio). De este modo, caracterizamos al cultivo transfectado con el gen heterólogo de ODC a nivel fisiológico (capacidad proliferativa), bioquímico (síntesis y concentración intracelular de poliaminas y caracterización de la actividad enzimática heteróloga) y molecular (ubicación del gen heterólogo, determinación del número de copias, etc.). El cultivo transfectado se volvió autótrofo para poliaminas y sensible al inhibidor de la ODC, el DFMO. Sin embargo, luego de un cierto tiempo de cultivo en presencia del inhibidor se seleccionó una subpoblación resistente a DFMO. Este cultivo también fue caracterizado comparándolo con los cultivos sensibles. Finalmente, el parásito transfectado con el gen heterólogo de ODC contribuyó con los estudios sobre el metabolismo de las poliaminas en T. cruzí y podría ser útil en futuras investigaciones acerca de la relación poliaminas - diferenciación a tripomastigote (metaciclogénesis) y poliaminas - infectividad en células de mamíferos.

Abstract:
Trypanosoma cruzi is the etiological agent of “Mal de Chagas”, an endemic illness in Latin America. This unicellular parasite, as other trypanosomatid protozoa, has a complex life cycle involving different hosts (insect vectors - vertebrate hosts). During its life cycle the parasite pass through several differentiation stages undergoing mayor morphological, physiological and biochemical changes in order to adapt to variable environments. Epimastigote is the noninfective form, which proliferates inside the insect and can be easily cultivated in axenic media. Trypanosoma cruzi differs from other trypanosomatid parasites in many physiological and metabolic characteristics. The study of these properties would increase the knowledge of the parasite, providing useful taxonomic and evolutive information. It would also contribute to the development of more specific and efficient chemoterapies against this protozoo. A key point of trypanosome metabolism is related to polyamines. These aliphatic cationes (putrescina, espermidina y espermina) are present in almost all living organisms (prokaryotes as well as eukaryotes). It is well known that polyamines participate in nucleic acids and protein syntheses and can stabilize macromolecules and cellular structures, therefore playing essential roles in cellular proliferation and differentiation. The biosynthesis of polyamines begins with the conversion of ornithine to putrescine by ornithine decarboxylase (ODC). This enzyme is essential in the regulation of the pathway and its activity is tightly controlled at different levels. Difluoromethil-ornitine (DFMO), an specific and irreversible inhibitor of ODC, has been described ago. Arginine decarboxylase (ADC), which catalyses an alternative route to synthesize putrescine from arginine has been first described in plants and bacteria, but recently has also been found in some mammal tissues. The presence of both polyamine biosynthetic pathways (from ornithine and arginine) in some protozoa has been a matter of controversy for many years. In this work, we confirmed that epimastigotes from different wild type strains of T. cruzi are auxotrophic for polyamines. This auxotrophy is due to the absence of ODC and ADC genes in the protozoa genome. These parasites which contain neither ODC nor ADC enzymatic activities are able to obtain polyamines from the environment through an active transport mechanism. We have been able to transform wild type T. cruzi epimastigotes with a recombinant plasmid bearing the ODC gene from Crithidia fasciculata (cloned in a previous work of our laboratory). The resulting transgenic parasites have been studied at the physiological, biochemical and molecular levels in order to determine the relationship among proliferation capacity, intracellular polyamine levels and exogenous gene location and expression. The transfected cultures became autotrophic for polyamine and sensitive to the presence of DFMO. However, after some time of exposure to high levels of the inhibitor, a DFMO resistant subpopulation was naturally selected. This resistant culture has been characterized together with the sensitive counterpart. The transfected parasites containing the heterologous ODC gene is a valuable tool to improve our knowledge about polyamine metabolism in T. cruzi; it could be very useful to study the relationship among differentiation to trypomastigote form (metacyclogenesis), infectivity towards mammalian cells and polyamine endogenous concentrations.

Labriola, Leticia. "Interacción entre las vías de transducción de señales activadas por el receptor de progesterona y las activadas por receptores con actividad de tirosina quinasa tipo I y II en cáncer de mama" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Existe numerosa evidencia que indica que los progestágenos están involucrados en el control de la tumorigénesis mamaria. A pesar de ello, los mecanismos por los cuales las hormonas esteroideas estimulan el crecimiento de células de cáncer de mama no han sido todavía descifrados completamente. Uno de los mecanismos propuestos ha sido la regulación de la expresión de factores de crecimiento que actuarían como mitógenos de las células tumorales. En particular, se ha demostrado previamente en el laboratorio que Heregulina (HRG), ligando de receptores con actividad de tirosina quinasa (RTK) tipo I, estimula el crecimiento de células epiteliales provenientes de cultivos primarios del tumor mamario progestágeno-dependiente C4HD y potencia los efectos mitogénicos del acetato de medroxiprogesterona (MPA) (Balañá et al., 1999; 2001). La primera parte del presente trabajo se centró en el estudio de interacciones entre los caminos de señalización activados por progestágenos y por RTKS tipo I y II en el modelo de carcinogénesis mamaria inducida por acetato de medroxiprogesterona en ratones Balb/c (Molinolo et al., 1987; Lanari et al., 1989). El tratamiento de las células C4HD con MPA indujo tanto el aumento de los niveles proteicos de ErbB-2 como el aumento de su fosforilación. Habíamos demostrado anteriormente que el receptor tipo I del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR) y el ErbB-2 están involucrados en la proliferación de estas células mediada por MPA. Al estudiar el bloqueo simultáneo de ErbB-2 y IGF-IR sobre la proliferación inducida por MPA, no se observaron efectos aditivos ni sinérgicos. Efectos aditivos hubieran sido esperados si IGF-IR y ErbB-2 activaran vías de señalización independientes. Una interacción sinérgica hubiera existido si el camino de transducción de señales activado por uno de los receptores potenciara el del otro receptor. Por lo tanto tan sólo un mecanismo que involucrara una interacción jerárquica entre IGF-IR y ErbB-2, en el cual uno de ellos es esencial para la activación de del otro, podía explicar nuestros resultados. En efecto, al suprimir la expresión del IGF-IR, la fosforilación del ErbB-2 inducida por MPA se vio totalmente inhibida. Sin embargo, el bloqueo de la síntesis de ErbB-2 no afectó la fosforilación del IGF-IR. Estos resultados muestran la existencia de una interacción jerárquica entre IGF-IR y ErbB-2; por medio de la cual IGF—IR dirige la activación de ErbB-2. Se demostró, por primera vez, que esta interacción involucra la asociación física de ambos receptores en un complejo heteromérico. Es más, experimentos de microscopía confocal laser mostraron que el MPA fue capaz de inducir la co-localización de ErbB-2 y IGF-IR. El propósito de la segunda parte del trabajo fue el de investigar la capacidad de HRG de activar al receptor de progesterona (RP) utilizando el mismo modelo experimental que en la primera parte. Es así que pudimos observar que HRG fue capaz de regular las características bioquímicas del RP en forma similar a la efectuada por la activación del receptor luego de la unión a un progestágeno. Se encontró que HRG fue capaz de inducir una disminución de los niveles proteicos de ambas isoformas, A y B, del RP y de disminuir la cantidad de sitios específicos de unión a progestágenos. Además, el tratamiento con HRG produjo un aumento de la proporción de RP con localización nuclear. Estudios posteriores nos permitieron saber que el tratamiento con HRG podía también inducir la unión del RP a su elemento respondedor en el ADN(PRE) y aumentar la transcripción de un gen reportero que contenía dos PRE en su promotor. Un antiprogestágeno como el RU486 provocó la inhibición de la activación transcripcional del RP mediada por HRG. Al profundizar en los mecanismos moleculares que estaban involucrados en los efectos de la HRG sobre el RP, pudimos observar que era necesaria la presencia de ErbB-2 funcional así como de proteínas quinasas activadas por mítógenos (MAPK) en su estado activo. Es más, MAPKs activadas por HRG tuvieron la capacidad de fosforilar al RP en ensayos de fosforilación in vitro. Los mismos estudios se realizaron en la línea de carcinoma mamario humano T47D obteniéndose resultados similares. Nuestros resultados mostraron que, en ausencia de progestágenos, HRG activa al RP tanto murino como humano mediante un mecanismo que requiere la presencia de ErbB-2 funcional así como la activación de MAPKs.

Abstract:
Accumulated evidence has indicated that progestins are involved in controlling mammary tumorigenesis. Although the mechanisms by which steroid hormones stimulate growth of breast cancer cells have not been completely deciphered, regulation of the expression of growth factors which in turn act as mitogens for tumor cells, has already been proposed. Particularly, we have previously demonstrated that Heregulin (HRG) stimulates gowth of primary cultures of the progestin-dependent C4HD mammary tumor epithelial cells and potentiates medroxyprogesterone acetate (MPA) mitogenic effects (Balañá et al., 1999; 2001). The first part of the present study focused on interactions between signaling pathways activated by progestins and by type I and II receptor tyrosine kinases (RTKs) in mammary tumors. An experimental model in which the synthetic progestin medroxyprogesterone acetate (MPA) induced mammary adenocarcinomas in Balb/c mice was used (Molinolo et a|., 1987; Lanari et al., 1989). MPA-stimulated proliferation of epithelial cells from primary cultures of progestin-dependent tumors induced up-regulation of ErbB-2 protein levels and tyrosine phosphorylation of this receptor. Recent findings in our laboratory indicate that type I insulin-like growth factor receptor (IGF-IR) and ErbB-2 are involved in proliferative signaling pathways in C4HD cells. Thus, we investigated the potential antiproliferative effect of the simultaneous downregulation of ErbB-2 and IGF-IR. The simultaneous blockage of ErbB-2 and IGF-IR showed neither synergistic nor additive effects on the inhibition of MPA induced proliferation of C4HD cells. Additive effects could have been expected if IGF-IR and ErbB-2 targeted different independent signaling pathways. Synergistic interaction could have been existed if one receptor pathway potentiated the other receptor biochemical pathway. Thus, only a mechamism involving a hierarchical interaction between IGF-IR and ErbB-2, wherein one of the receptors is essential for the activation of signal transduction pathways elicited by the other, could fit our results. In fact, suppression of IGF-IR by antisense oligodeoxinucleotides (ASODN) resulted in complete abrogation of MPA-induced phosphorylation of ErbB-2 in C4HD cells, whereas blockage of ErbB-2 did not affect IGF-IR phosphorylation. These results show the existence of hierarchical interactions between IGF-IR and ErbB-2, by means of which IGF-IR directs ErbB-2 phosphorylation. We demonstrated, for the first time, that this hierarchical interaction involves physical association of both receptors, resulting in the formation of a heteromeric complex. Furthermore, confocal laser microscopy experiments demonstrated that MPA was able to induce colocalization of ErbB-2 and IGF-IR. The aim of the second part of this study was to investigate the capacity of HRG to activate progesterone receptor (PR) by using the same model of hormonal mammary carcinogenesis. We first found that HRG was able to induce a decrease on PR A and B isoforms at protein level and to promote a significant increase in the nuclear localization of PR. Further studies allowed us to know that HRG was also able to induce PR binding to a progesterone response element (PRE) and significantly increased the transcription of a reporter gene with two PREs in its promoter. When we investigated molecular mechanisms involved in HRG action, we found that both the presence of functional ErbB-2 and activation of mitogen-activated protein kinases (MAPK)were needed. Additionally, HRG activated-MAPKs were able to phosphorylate PR in vitro. This PR activation by HRG was also seen in T47D human breast cancer cells. Our findings demonstrated that in the absence of progestins, HRG activates PR in both human and mouse breast cancer cells by a mechanism that requires both a functional ErbB-2 and MAPK activation. In addition, herein we provide the first evidence that MAPK activated by HRG are able to phosphorylate human and mouse PR in vitro.

Guerin, Marcelo Eduardo. "Estudios moleculares sobre la UDP-GLC : Glicoproteína glucosiltransferasa : relación estructura-función" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El retículo endoplasmático (RE)es el compartimiento subcelular involucrado en la síntesis, modificación post-traduccional y plegamiento de proteínas y glicoproteínas que serán destinadas a secreción, membrana plasmática o distintas organelas de los sistemas endocítico y exocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales más frecuentes, la N-glicosilación, está relacionada con el plegamiento de las proteínas. Numerosas proteínas son incapaces de alcanzar su conformación nativa sin la adición de N-oligosacáridos. Los intermediarios de plegamiento, las proteínas no totalmente ensambladas, las proteínas mal plegadas y los agregados proteicos son selectivamente retenidos en el RE. El transporte hacia los complejos de Golgi se lleva a cabo exclusivamente cuando las proteínas se han plegado correctamente y se han ensamblado los multímeros. Este importante fenómeno, que asegura la integridad funcional de las proteínas que salen del RE,ha sido denominado "control de calidad". En el caso de las glicoproteínas, la estructura y el grado de procesamiento de sus N-oligosacáridos resulta ser una señal para la retención en el RE o el transporte hacia los complejos de Golgi. La N-glicosilación de proteínas comienza en la mayoría de las células eucariotas, con la transferencia de un oligosacárido de estructura Glc3Man9GlcNAc2 desde un intermediario lipídico (dolicol-P-P-oligosacárido), a cadenas polipeptídicas nacientes en el lumen del RE.Sin embargo la Glc no es un componente normal de las N-glicoproteínas maduras. Inmediatamente luego de la transferencia, los residuos de Glc son removidos por las glucosidasas I (GI) y II (GII). Los N-oligosacáridos libres de Glc son reglucosilados transitoriamente por la UDPG-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT)y deglucosilados posteriormente por la GII. De acuerdo al modelo actualmente aceptado, la calnexina (CNX), la calreticulina (CRT), la GII y la GT intervienen en el control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en el RE. A medida que las glicoproteínas van adquiriendo sus conformaciones nativas, alternan entre formas no glucosiladas y monoglucosiladas por efecto de las actividades catalíticas opuestas de la GII y de la GT. Las dos chaperonas moleculares no convencionales con propiedades de lectinas, CNX y CRT, que reconocen exclusivamente N-oligosacáridos monoglucosilados, unirían glicoproteínas en proceso de plegamiento o incorrectamente plegadas, reteniéndolas en el RE. Los ciclos de deglucosilación y reglucosilación continuarían hasta que el plegado correcto de las glicoproteínas se haya completado. Cuando las mismas adoptan su conformación nativa, se convertirían en sustrato de la GII, pero no de la GT, y se liberarían de las lectinas. Las glicoproteínas bien plegadas continuarían su camino por la vía secretoria hacia su destino mientras que las que se encuentran en proceso de plegamiento, serían retenidas en el RE y eventualmente translocadas al citoplasma para ser degradadas en el proteasoma. ' En este ciclo la GT funcionaría como un sensor del estado conformacional de las glicoproteínas, marcándolas o no con el residuo de Glc que determinará su unión a CNX o CRT. La GT fue purificada a homogeneidad a partir de Drosophila melanogaster,Rattus norvegicus y Schizosaccharomyces pombe,y demostró ser una proteína soluble del RE que depende de Ca2+ para su actividad y que utiliza UDP-Glc como dador de Glc. En cuanto a la glicoproteína aceptora, en un ensayo libre de células, ésta debe estar desnaturalizada para funcionar eficientemente como aceptor. La enzima reconoce el residuo más interno de GlcNAc de los N-oligosacáridos, y amino ácidos hidrofóbicos expuestos en las conformaciones no nativas de las glicoproteínas sustrato. Experimentos presentados en este trabajo de tesis demuestran que: (a) la GT de S. pombe es una enzima conformada por dos dominios: el dominio C-terminal (400 amino ácidos, altamente conservados entre GTS, 20% de la molécula), responsable de la interacción con UDP-Glc; y el dominio N-terminal (1100 amino ácidos, pobremente conservados entre GTs, 80% de la molécula) posiblemente responsable de la interacción de la GT con amino ácidos hidrofóbicos, confiriéndole a la enzima especificidad por glicoproteínas no totalmente plegadas. La unión entre ambos dominios se puede clivar proteolíticamente, pero ellos interaccionan a través de uniones no covalentes y no pueden separarse sin pérdida de la actividad enzimática. Esto explicaría el porqué la GT solo glucosila N-oligosacáridos muy cercanos al sitio mal plegado de la parte proteica (ver Discusión). Esta estructura de dos dominios está conservada desde levaduras a eucariotes superiores. (b) Los dominios N-terminal y C-terminal correspondientes a la GT de S. pombe, expresados separadamente en una misma célula S. pombe GT pueden formar una enzima activa y ser capaces de transferir Glc a glicoproteínas mal plegadas. (c) Los dominios N-terminal y C-terminal correspondientes a GTS de distintas especies, resultan ser intercambiables. (d) El dominio C-terminal correspondiente a la GT de S. pombe requiere la presencia del dominio N-terminal para plegarse correctamente y formar un complejo biológicamente activo, y/o para ser estable en el lumen del RE.

Abstract:
The endoplasmic reticulum (ER)is the intracellular location responsible for post-translational modifications and proper folding of proteins bound for secretion, the plasma membrane or organelles of the endocytic system. N-glycosylation is one of the most frequent post-translational modifications and is related to protein folding, as many species are unable of properly fold without N-glycan addition. Folding intermediates, incompletely assembled oligomers, misfolded proteins and aggregates are selectively retained in the ER. Transport to Golgi compartments takes place only if proteins are in their native conformations and properly assembled. The mecanism that ensures the functionality of proteins that exit the ER, is the so called "quality control" (QC) of glycoprotein folding. For glycoproteins, the structure and processing degree of the N-oligosaccharides appeared to be a signal for the retention or transport to the Golgi complex. In most eukariotic cells, N-glycosylation is initiated upon oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2)transfer from a lipid-carrier (dolichol diphosphate) to nascent proteins in the ER lumen. However, the Glc unit is not usually found in folded glycoproteins. The three Glc residues of the transferred oligosaccharide are immediately trimmed by two ER resident enzymes, glucosidases I and II (GII). The Glc-free N-linked oligosaccharides are then transiently reglucosylated by the UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (GT)and further deglucosylated by GII. According to a currently accepted model, calnexin (CNX), calreticulin (CRT), GII and GT are involved in the ER glycoprotein-specific folding and QC. As glycoproteins acquiere their native conformations, they switch between nonglucosylated and monoglucosylated forms by the opposing activities of GII and GT. CNX and CRT are lectins that specifically bind monoglucosylated high mannose-type oligosaccharides in newly synthesized glycoproteins. The lectin-monoglucosylated glycoprotein interaction retains not properly folded or assembled species in the ER. The deglucosylation and reglucosylation cycle continues until proper folding is achieved. Once glycoproteins have adopted their mature, fully folded conformations, they are no longer recognized by GT. Subsequent GII-mediated deglucosylation liberates them from their lectin anchors, thus allowing properly folded species to continue their maturation along the secretory pathway. In addition, the lectin-glycoprotein interaction enhances folding efficiency by preventing aggregation, premature' oligomerization and incorrect disulfide bond formation. GT is the key element of the QC mechanism as it is the only element discriminating between glycoprotein conformations. GT was purified to homogeneity from Drosophila melanogaster, Rattus norvegicus and Schizosaccharomyces pombe. The enzyme is a soluble ER protein that has an absolute requirement of millimolar Ca2+ concentrations for activity and uses UDPGlc as sugar donor. In cell-free assays GT glucosylates glycoproteins only if the Noligosaccharides are linked to a polypeptide backbone displaying a non-native conformation. It has been proposed that GT senses the exposure of hydrophobic regions normally buried in native conformations. GT sequence analysis suggests that it is composed of two domains, the N-terminal that comprises 80% of the molecule, has no homology to other known proteins and is presumably involved in recognition of non-native conformers and the C-terminal or catalytic domain that binds UDP-Glc homologs and displays a similar size and significant homology to members of glycosyltransferase family 8. Here we show that N- and C-terminal domains from either R. norvegicusor S. pombe GTS remained tightly but not covalently bound upon mild proteolytic treatment and could not be separated by a variety of different procedures without loss of enzymatic activity. Further, the notion of a two domain protein was reinforced by the synthesis of an active enzyme on transfection of S.pombe GT null mutants with two expression vectors, each of them encoding one of both domains. The tight association between N- and C-terminal domains may explain why N-glycans in the close proximity to protein structural perturbations are preferentially glucosylated by the enzyme. In spite of displaying practically no homology with S. pombe N-terminal domain (15.5-16.3%),the same portions from R. norvegicus and D. melanogaster enzymes linked to the C-terminal domain of yeast GT were functionally active when expressed in S. pombe thus indicating that all N-terminal domains share a common role. No functional enzyme was obtained on expression of the C-terminal domain, thus reinforcing the idea that the N-terminal domain is responsible for recognition of non-native conformers.

Binda, María Mercedes. "Factores reguladores de la angiogénesis en el fenómeno de resistencia antitumoral concomitante" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La resistencia antitumoral concomitante (RC) describe el fenómeno mediante el cual individuos portadores de un tumor son capaces de inhibir implantes tumorales secundarios o metástasis. En esta tesis se analizaron cinco modelos tumorales, tres derivados a partir de tumores mamarios murinos en ratones singenéicos y dos líneas de carcinoma de pulmon humano en ratones nude, el objeto de saber que factores angiogénicos/angiostáticos regulaban el fenómeno. Una de las líneas humanas generó una fuerte RC frente a un inóculo tumoral secundario subcutáneo (s.c.) en ratones nude, así como lo hicieron dos de los modelos tumorales murinos frente a inóculos s.c. y endovenosos (i.v.) de sus respectivas celulas. Se analizaron dos inhibidores (angiostatina y endostatina) y dos inductores (factor de crecimiento fibroblástico basico o bFGP y factor de crecimiento endotelial vascular o VEGF) de la angiogenesis, en sueros de animales portadores y en los medios condicionados (MCs) provenientes de los distintos tumores cultivados in vitro. Aunque no se pudo detectar angiostatina in vivo en los sueros de ratones portadores, si se detecto la conversion de plasminogeno a angiostatina in vitro por MCs en aquellos casos que mostraban capacidad de generan RC. El estudio con diferentes tipos de inhibidores de proteasas demostro que la enzima involucrada en esta conversión era una serinoproteasa. El uso de inhibidores del activador del plasminogeno de tipo uroquinasa (uPA) inhibio la generacion de angiostatina, a excepcion de una de las líneas murinas (M3MC) que posiblemente utilice una serinoproteasa distinta de uPA. Ademas, en general, se observo una baja concentración de VEGF y una alta concentración de endostatina en los sueros de animales portadores inductores de RC, respecto de sus controles y de los restantes grupos experimentales incapaces de desarrollar RC. Los resultados hallados permiten comprender mas profundamente el mecanismo de RC, a la vez aportan información que podría ser de utilidad para un eventual futuro tratamiento del cáncer basado en el uso de reguladores de la angiogenesis tumoral.

Abstract:
The term "concomitant antitumoral resistance” (CR) describes the phenomenon by which tumor-bearing hosts are capable of inhibiting secondary tumor implants or metastases. In order to elucidate whether the phenomenon under study is dependent on the capacity of tumor cells to generate different angiogenic and/or antiangiogenic factors, we used in this thesis three murine mammary adenocarcinomas and two human lung cancer cell lines. One of the human lung cancer cell lines revealed a strong CR against secondary subcutaneous (s.c.) tumor implants in nude mice, as well as two of the murine mammary tumors against secondary s.c. and intravenous (i.v.) tumor inoculations in syngeneic hosts did. Two angiogenesis inhibitors. (angiostatin and endostatin) and two angiogenic inducers (basic fibroblast growth factor or bFGF and vascular endothelial growth factor or VEGF)were analyzed in tumor-bearing mice sera and in conditioned media (CM)derived from the different tumor cells grown in vitro. Angiostatin could not be detected in either of the tumor-bearing mice sera analyzed. However, the CMs derived from those tumor cells that were capable to induce CR, showed in vitro conversion of plasminogen into angiostatin. The use of different types of protease inhibitors revealed that the conversion could be due to a serine protease. The use of urokinase type plasminogen activator (uPA) inhibitors could abrogate the generation of angiostatin, except for one of the murine mammary cancer cells lines, namer M3MC, that might utilize a serine protease other than uPA for the cleavage of plasminogen into angiostatin. Furthermore, a low VEGF concentration and a high endostatin concentration were usually found in sera from tumor-bearing mice, with respect to their controls and other experimental groups that did not induce CR. The results found herein lead to a more profound understanding of the CR mechanism, providing new information that could be useful for a future treatment of cancer based on the use of angiogenesis regulators.

Goldberg Cavalleri, Alina Viviana. "Estudio biológico y molecular del proceso de infección de un virus de la granulosis de Epinotia aporema y evaluación de su potencial como agente de control biológico" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El “barrenador de los brotes", Epinotia aporema, es una de las principales plagas de leguminosas en América del Sur. Las larvas de esta plaga, son infectadas por un granulovirus (EpapGV) el cual representa una de las principales causas de epizootias esporádicas en poblaciones de E. aporema. En el trabajo de tesis, se realizaron estudios biológicos y patológicos sobre EpapGV en larvas del insecto huésped, los cuales establecieron una base de conocimientos importante para determinar distintos aspectos de la interacción virus-huésped. Ensayos en laboratorio demostraron que el virus es altamente virulento y especie específico, lo que indica que es un buen candidato para ser utilizado en el control biológico de la plaga. Larvas infectadas con EpapGV sufrieron un retraso en el desarrollo, siendo inhibido el proceso de muda. Además, exhibieron un incremento en el peso mayor al observado en larvas sin infectar. Esto pudo deberse a la expresión del gen viral egt cuyo producto altera la fisiología de los insectos. Mediante exámenes de tejidos al microscopio óptico y electrónico, por medio de las técnicas de inmunohistoquimica e hibridación in situ (ARN-ARN), se observó que EpapGV causa infecciones de tipo poliorganotrópicas. Los principales tejidos afectados fueron el adiposo, la epidermis y la matriz traqueal. Luego de infectar el intestino medio, la diseminación del virus hacia otros tejidos se produce aparentemente vía hemolinfa. Los viriones producidos en células infectadas se acumulan entre la membrana plasmática y la lámina basal, lo que indica que dicha lámina constituye una barrera efectiva para diseminación de la infección. Mediante la técnica de inmuno-oro se detectó expresión de granulina dentro del núcleo, lo cual indica que la expresión de genes tardíos ocurre luego de la ruptura de la membrana nuclear. Análisis computacional de las secuencias de los extremos de clones de la biblioteca genómica de EpapGV generada en el laboratorio, permitieron identificar una posible proteína de fusión (Epap-F). El gen completo fue subclonado, secuenciado y analizado mostrando motivos característicos de las proteinas F de Nucleopolyhedrovirus (involucradas en la entrada del virus a una nueva célula). Sin embargo, no se había demostrado la funcionalidad de proteínas F de Granulovirus. Mediante la técnica de Northern blot se confirmó la expresión de dicho gen y se estudió su expresión temporal. Posteriormente, a través de la técnica de RACE, se mapeó el extremo 5' no codificante demostrándose que la transcripción del gen se realiza a partir de un motivo típico de transcripción tardío (CAGT) y también a partir de un motivo no convencional ATGC. Para demostrar la actividad fusogénica de dicha proteína se realizó un ensayo de actividad transiente in vitro. Para ello, se transfectó un cultivo de células (Spodoptera frugiperda. Sf21) con un plásmido conteniendo el ORF completo de Epap-F bajo el promotor ie-1 de Anticarsia gemmatalis MNPV, se modificó el pH del medio a 5 y se registró formación de sincicios. Con el fin de producir anticuerpos que reconozcan a Epap-F, se expresó dicha proteína utilizando un sistema de expresión de baculovirus. Los anticuerpos serán utilizados para la determinación de la ubicación subcelular de dicha proteína.

Abstract:
The bean shoot borer, Epinotia aporema, is a major pest of legume crops in South America. Larvae of this pest are infected by a granulovirus (EpapGV) that is the most important cause of sporadic epizooties in E. aporema populations. This PhD dissertation deals with the biological and pathogenesis studies on EpapGV on the host larvae that provide the basic information of the virus-host interaction. The high specificity and pathogenicity indicate that EpapGV is a good candidate for the biological control of this pest. Larvae infected by EpapGV, suffered a retardation of development and typically failed to pupate, but exhibited a weight increase greater than that of healthy larvae. It is possible that the effect observed was due to the expression of the egt viral gene whose product alters the insect physiology. Using immunohistochemistry and in situ hybridization (by both, light and electron microscope) we observed that EpapGV caused a polyorganotropic infection. We found that the fat body, epidermis and tracheal matrix were the main tissues infected. Virions liberated from the midgut may gain entry to other tissues via circulation through hemolymph. Virions produced by infected cells accumulated between the plasma membrane and basal lamina, this indicated that the basal lamina is an effective barrier for the spread of the infection. Granulin was detected in the nucleus by immuno-gold staining. indicating that late gene expression occurred prior to nuclear membrane disruption. Computer-assisted analysis of the sequence of the end sequences EpapGV clone library produced in our lab, revealed a putative fusion protein (Epap F). The complete gene was subcloned, sequenced and analyzed revealing aminoacids motif of characteristic for Nucleopolyhedrovirus F proteins (involved in virus entry to a new cell). However no functional F protein had been demostrated in any Granulovirus. Northern blots were used to confirm the transcription of this gene and to study its temporal expression. Employing the RACE technique we mapped the 5' untranslated region and we found that the transcription starts at a typical late gene (CAGT) motif and also at an unconventional (ATGC) motif. In order to demonstrate the fusion activity of Epap-F, we carried out a transient expression assay. To this end, a Spodoptera frugiperda (Sf 21) cell line was transfected with an expression plasmid containing the Epap-F ORF under the control of the Anticarsia gemmatalis MNPV ie-1 promoter and, alter lowering the pH to 5 many extensive syncytia were observed. With the aim of producing antibodies against Epap-F, the protein was expressed using a baculovirus expression system. The antibodies will be used to determine the subcelular localization of this protein.

Lev, Paola Roxana. "Estudios moleculares de citoquinas relacionadas con fibrosis medular en la trombocitemia esencial" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis con metaplasia mieloide son enfermedades mieloproliferativas crónicas que se caracterizan por aumento de megacariocitos en médula ósea. Los pacientes con TE presentan además, aumento del recuento plaquetario en sangre periférica. Se estudió un grupo de pacientes con TE sin tratamiento y durante la normalización del recuento plaquetario por el tratamiento con anagrelide. En ellos se evaluó el nivel proteico en el plasma y en las plaquetas y el nivel de ARN mensajero intraplaquetario de tres citoquinas relacionadas con el desarrollo de fibrosis medular, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante β (TGFβ) y el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). Se observó un incremento significativo en el nivel plasmático del PDGF que se normalizó con la reducción del recuento plaquetario por el tratamiento. Los pacientes que tenían fibrosis reticulínica leve en la biopsia de médula ósea mostraron mayores niveles de PDGF plasmático con respecto a los pacientes que no tenían fibrosis. Esta citoquina se encontró disminuida en las plaquetas y nuevamente los valores se normalizaron con el tratamiento. A diferencia de los niveles plasmáticos, los intraplaquetarios no se relacionaron con la presencia o ausencia de fibrosis en la médula ósea. El ARN mensajero se encontró disminuido antes y durante el tratamiento. La normalización del nivel plasmático de PDGF durante el tratamiento puede indicar que su incremento en el plasma se debe a liberación plaquetaria. La disminución del contenido intraplaquetario también podría atribuirse a una disminución de su síntesis en el megacariocito dado que se encontró disminuido el ARN mensajero. Los niveles plasmáticos del TGFβ se encontraron aumentados y los intraplaquetarios normales antes y durante el tratamiento y no se encontró relación con la presencia o ausencia de fibrosis reticulínica leve. El ARN mensajero intraplaquetario se encontró aumentado y se normalizó durante el tratamiento. Dado que el nivel plasmático de esta citoquina permaneció elevado aún con recuento plaquetario normal, se buscó la participación de otra fuente celular en este incremento. Se vió por inmunofluorescencia, la presencia de la citoquina en linfocitos y megacariocitos, la intensidad de marcación fue similar a la de los controles normales. Por lo tanto, los megacariocitos y no los linfocitos podrían ser una posible fuente celular causante del incremento plasmático, dado que su número se encuentra elevado en los pacientes con esta enfermedad. Los niveles plasmáticos e intraplaquetarios del bFGF se encontraron aumentados en los pacientes sin tratamiento y si bien disminuyeron significativamente con la normalización del recuento plaquetario, permanecieron aumentados con respecto al control. No se encontró relación con la presencia o ausencia de fibrosis reticulínica leve en la médula ósea. El ARN mensajero de la citoquina se encontró normal. Dado que el nivel plasmático se reduce cuando se normaliza el recuento plaquetario la liberación de esta citoquina podría ser atribuida en parte a las plaquetas. Pero por otro lado, se buscó la participación de otra fuente celular. Se vió por inmunofluorescencia, la presencia de la citoquina en linfocitos y megacariocitos con intensidad de marcación similar a la de los controles normales. Por lo tanto, también en este caso, los megacariocitos y no los linfocitos podrían ser una posible fuente celular causante del incremento plasmático. El aumento de estas citoquinas en el plasma de los pacientes con TE puede sugerir que éstas juegan un rol en la patogenia de la enfermedad. Los niveles del TGFβ intraplaquetarios normales con el aumento de su ARN mensajero y el aumento intraplaquetario del bFGF con el nivel de su ARN mensajero normal puede indicar una desregulación en su síntesis. Por otro lado se estudió el efecto del TGFβ sobre plaquetas normales. Se encontró la presencia de un número bajo de receptores en la membrana plaquetaria y se estudió el efecto de la citoquina sobre la agregación plaquetaria. El efecto del TGFβ sobre la función plaquetaria fue variable dependiendo tanto del tiempo de incubación como de la concentración de ADP utilizada como agonista. Se observó que el TGFβ potencia la agregación plaquetaria tanto en incubaciones de las plaquetas con la citoquina por períodos cortos como por períodos largos utilizando ADP en bajas concentraciones y tiene el mismo efecto cuando se incuban las plaquetas por periodos largos pero se utilizan concentraciones altas de ADP para inducir la agregación. En cambio, produce un efecto inhibitorio cuando las plaquetas se incuban con la citoquina por períodos cortos y se las estimula con concentraciones de ADP altas. En todos los casos el efecto fue leve y se corresponde con el bajo número de receptores encontrado por plaqueta. Las incubaciones de plaquetas con TGFβ in vitro durante tiempos largos podrían semejar situaciones patológicas en donde hay niveles altos de la citoquina durante tiempos prolongados. De esta manera, las plaquetas circulantes están continuamente expuestas a esta citoquina y ante un estímulo plaquetario las mismas responderían en forma incrementada Este sería el caso de la TE. La respuesta inhibitoria observada en tiempos cortos podría indicar un posible mecanismo de regulación negativa de la activación plaquetaria ante un estímulo intenso, en el sitio de injuria. Al estudiar el mecanismo por el cual la citoquina modula la función plaquetaria, se vió que cuando la activación plaquetaria está inhibida, la presencia de la citoquina no induce en forma directa la fosforilación de proteínas en residuos tirosinas. Al evaluar la fosforilación de proteínas durante la agregación plaquetaria inducida por ADP, en presencia de la citoquina, se vió una disminución en la intensidad de dos bandas correspondientes a 100 y 105 kd que estan relacionadas con la agregación. Este efecto se observó sólo al incubar las plaquetas durante 5 minutos en precencia de la citoquina y concuerda con el efecto inhibitorio causado por el TGFβ en la agregación plaquetaria.

Ferreiro, Diego U.. "Mecanismo de unión a ADN del dominio C-terminal de la proteína E2 del papilomavirus humano, principal regulador de la expresión génica viral" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La interacción proteína-ADN juega un papel central en la fisiología celular. Dentro de éstas, se identifica al reconocimiento secuencia especifico con un rol regulatorio clave, pues de éstas interacciones depende la orquestación de los patrones de expresión génica de un organismo. Utilizando el dominio de unión a ADN del factor de transcripción E2 del papilomavirus humano, nos propusimos analizar la interacción en condiciones en las cuales fuera posible extraer datos fisicoquímicos precisos del proceso de unión. Confiamos en que la interpretación de éstos en términos termodinámicos provee un marco para relacionar las estructuras proteicas con su funcionalidad biológica Caracterizamos un mecanismo de unión E2c-ADN al equilibrio en el cual E2c presenta dos modos diferentes de unión de ADN diferentes. Estos modos resultan estar estrechamente relacionados con la ocurrencia de poblaciones conformacionales del estado plegado de E2c. Mostramos ademas que ésto no sucede en un homólogo cercano con el que comparte una alta identidad de secuencia y una topología de plegamiento idéntica, sugiriendo que ésto puede estar relacionado con los distintos roles funcionales que E2c presenta. El camino cinétíco de interacción E2c-ADN se inicia con una colisión rápida, limitada por la difusión de las macromoléculas en solución. Esto da lugar a un "complejo de encuentro" estabilizado por interacciones electrostáticas, en el cual E2c tiene la posibilidad de deslizarse sobre la doble hélice. Si el ADN contiene un sitio E2, el complejo sufre fuertes rearreglos conformacionales que, luego de una fase de expulsión de solvente. resultan en la formación de un complejo estable proteina:ADN. Este último paso involucra un ocultamiento de superficie accesible al solvente y es allí donde se consolidan las interacciones cercanas aminoácido-base. Experimentos de doble-mezcla por flujo detenido nos permitieron asignar el orden secuencial de los rearreglos y demostrar que la unión puede también proceder por una ruta macroscópica paralela. caracterizada como de dos estados. Utilizando una estrategia de mutagénesis sitio-dirigida realizamos un mapeo energético de la interfase de unión. Pudimos asignar las contribuciones que cada residuo realiza, en forma aditiva, a la energía libre de asociación. Las asignaciones energéticas resultaron estar en excelente concordancia con las estructuras de alta resolución, y correlacionan con el carácter altamente dinámico de la interfase de asociación. Lon conjuntos de estados de transición del camino cinético fueron analizados con 23 mutantes sitio-dirigidas. Esto nos permitió disectar las contribuciones energéticas de los residuos independientes a nivel atómico e inferir los cambios conformacionales que ocurren durante las etapas de unión y reconocimiento de secuencia. Mostramos que la plasticidad estructural que E2c presenta está íntimamente ligada a su capacidad de reconocimiento sitio-específico. Por último, presentamos un modelo funcional plausible de regular la actividad biológica de E2c y su capacidad de reconocimiento de secuencias de ADN.

Abstract:
Protein-DNA interactions play a central role in cellular physiology. Within these, site specific recognition is a primary topic that underprints the expression profile of whole genomes. Although many biological aspects of these non-covalent interactions are becoming clearer, detailed biophysical understanding of site specific recognition is lacking. Using the human papilomavirus (HPV) E2c transcription factor as a model system we aim a physicochemical dissection of its DNA binding properties. We set-up an spectroscopic binding essay, readily done in solution, which allowed us to quantify DNA binding parameters in energetic terms, detect conformational changes exerted on both macromolecules upon binding and relate them to the high resolution structures available. We characterized an equilibrium DNA binding mechanism where the HPV-16 E2c domain is capable of two distinct binding modes, which correspond to different conformational ensembles of the E2c molecule. Despite having a strong sequence identity and an identical folding topology, a close homolog does not show this behaviour under the same experimental conditions. The differences observed may be related to the distinctive transcriptional roles in which these proteins are involved. The kinetic DNA-binding mechanism is initiated by the diffusion controlled formation of an encounter complex stabilized by electrostatic interactions, in which E2c has the possibility to slide along the DNA duplex. If the target DNA contains an E2-binding site, substantial conformational rearrangements take place, and a solvent exclusion step leads to the formation of a highly stable protein-DNA complex. This last step involves the largest burial of surface area from the interface and the direct readout of the DNA bases is proposed to occur. Double-Jump stopped flow experiments allowed us to characterize the sequence of intermediate events and demonstrate that a last-formed final complex can be formed through a parallel two-state macroscopic route. An extensive site-directed mutagenesis analysis over the entire DNA binding reglon led us assign the energetic contributions of individual sidechains to the overall binding free energy. We show that each sidechain contribute in a small amount to the total free energy in an additive way. These contributions are in excelent agreement with the high resolution structures and correlate with the highly dynamic character of the interface. The transition state ensembles of the kinetic binding pathway were probed with 23 site-directed mutants. This led us to dissect the sidechain energetic contributions at almost atomic resolution, and infer the conformational changes that take place in each kinetic event. We show that the conformational plasticity this protein presents is intimately linked to its DNA recognition capacity. Finally, a plausible biological model for functional E2c regulation and specific DNA recognition is presented.

Franco, Diana Lorena. "Mecanismos moleculares de sensibilización y protección de la apoptosis inducida por TNF-alfa" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La mayoría de las células son resistentes a la apoptosis inducida por TNF-ᵅ y se sensibilizan cuando se inhibe la activad transcripcional de NF-kB o bien en presencia de inhibidores de la síntesis proteica capaces de inhibir la expresión de genes antiapoptóticos. En esta tesis analizamos el rol del estrés osmótico en la apoptosis inducida por TNF-ᵅ. Nosotros encontramos que éste es capaz de sensibilizar a células HeLa resitentes a la apoptosis inducida por TNF-ᵅ y que esta sensibilización involucra, un aumento de la actividad de varias MAPKs, la inhibición de la expresión de Bcl-2 y el aumento en una etapa tardía de la actividad de NF-kB. La muerte ocurre a pesar del aumento de la actividad de NF-kB, cuya inhibición por otro lado causa un aumento mayor de la apoptosis. La proteína quinasa p38 parecería estar involucrada en la activación de NF-kB ya que su inhibición provoca un aumento significativo del efecto del estrés osmótico en la apoptosis inducida por TNF-ᵅ. Se ha demostrado previamente que dosis bajas de TNF-ᵅ tienen un rol sensibilizador a la acción de los glucocorticoides en su protección de la apoptosis inducida por esta citoquina. En este trabajo estudiamos las señales inducidas por TNF-ᵅ que podrían estar involucradas en la regulación de la actividad del receptor de glucocorticoides. Analizamos el rol de las MAPKs en la regulación de las actividades biológicas del receptor de glucocorticoides, en un modelo de células sensibles a la apoptosis inducida por TNF-ᵅ, donde los glucocorticoides son capaces de proteger a las células de dicha muerte. Nosotros observamos que las cinco MAPKs mejor caracterizadas hasta el momento son capaces de fosforilar al GR in vitro y que cuatro miembros de esta familia, JNK, p38, Erk6 y Erk1/2 son capaces de interactuar in vivo. Asimismo vimos que p38 induce la activación transcripcional del GR, incrementa su localización nuclear y su unión a sus secuencias blanco presentes en el ADN. De acuerdo con nuestros resultados, existen mecanismos moleculares que involucran la participación de MAPKs inducidas por TNF-ᵅ, por los cuales la citoquina puede regular la actividad del GR y la sensibilidad a su acción protectora de la apoptosis en el modelo de apoptosis inducida por TNF-ᵅ.

Abstract:
Most cells are naturally resistant to TNF-ᵅ-induced cell death and become sensitized when NF-kB transactivation is blocked or in the presence of protein synthesis inhibitors that prevent the expression of anti-apoptotic genes. We analyzed the role of osmotic stress on TNF-ᵅ-induced cell death. We found that it sensitizes the naturally resistant HeLa cells to TNF-ᵅ-induced apoptosis with the involvement of an increase in the activity of several kinases, the inhibition of Bcl-2 expression and a late increase on NF-kB activation. Cell death occurs regardless of the enhanced NF-kB activity whose inhibition produces an increase in apoptosis. The inhibition of p38 kinase, also involved in NF-kB activation, significantly increases the effect of osmotic stress on TNF-ᵅ-induced cell death. It was previously shown that a low dose of TNF-ᵅ has a priming effect on the glucocorticoid-mediated inhibition to TNF-ᵅ-induced apoptosis. We analyzed TNF-ᵅ induced signals that could be involved in the regulation of GR activities. We also investigated the role of MAPKs in the regulation of GR biological activities in L-929 cells. These cells are sensitive to TNF-ᵅ-induced apoptosis which is prevented by ligand activated GR. We observed that five MAPK family members can phosphorylate GR in vitro and four members of this family: JNK, p38, Erk6 and Erkl/2 can physically interact with GR in vivo. We also found that p38 increases the transcriptional activity of GR, its nuclear localization and its binding to DNA specific sequences. According to our results, there are molecular mechanism that involves MAPKs induced by TNF-ᵅ by which the cytokine may modulate the activity of GR and the sensitivity to their protective role on TNF-a-induced apoptosis.

Díaz, Emilce Silvina. "Influencia de las proteínas de la matriz extracelular sobre la morfología y funcionalidad de las células de Leydig de rata adulta" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Está ampliamente aceptado que las proteínas de la matriz extracelular (MEC) intervienen en la regulación de la diferenciación, morfogénesis, proliferación y migración celular. La mayor parte de las interacciones célula-MEC están mediadas por las integrinas, las cuales regulan a su vez, la reorganización del citoesqueleto, el transporte intracelular de iones, el metabolismo de los lípidos, la activación de quinasas y la expresión génica. Asimismo, en la última década se ha demostrado que las integrinas ejercen un papel importante en los procesos reproductivos, incluyendo la fertilización, implantación y embriogénesís. En el testículo, la regulación de distintos procesos como el desarrollo, la diferenciación y la esteroidogénesis de las células de Leydig, depende de la acción concertada de las hormonas gonadotróficas y de una gran variedad de factores locales producidos de manera autocrina o paracrina. A pesar de lo mencionado en el párrafo anterior, son pocos los estudios realizados que intentan dilucidar el papel que ejercen las proteínas de la MEC sobre la funcionalidad de las células de Leydig. Estas células están rodeadas por proteínas de la MEC organizadas como una membrana basal continua o discontinua. El objetivo de esta tesis fue estudiar la influencia de las proteínas de la MEC sobre la morfología, la adhesión celular, la expresión de integrinas y la esteroidogénesis de las células de Leydig . Como modelo experimental, se utilizó el cultivo de células de Leydig de rata adulta, utilizando como sustrato, la laminina-l, el colágeno tipo IV y la fibronectina. Nosotros observamos que las células de Leydig cultivadas sobre laminina-l, colágeno tipo IV y fibronectina, presentan un mayor número de prolongaciones cítoplasmáticas que las cultivadas sobre vidrio. Asimismo, demostramos que la adhesión de las células al sustrato es un fenómeno que ocurre rápidamente y que el grado de adhesión a las mismas varía según el sustrato al cual se adhieren. Además, observamos que si bien las integrinas se expresan de manera constitutiva en las células de Leydig, su expresión aumenta en respuesta a la adhesión de las células a las proteínas de la MEC. Con respecto al efecto de las proteínas de la MEC sobre la capacidad esteroidogénica de las células de Leydig, demostramos que el colágeno tipo IV y la fibronectina inhiben la producción de testosterona de las células de Leydig de rata adulta, tanto en condiciones basales como estimuladas con hCG y que este fenómeno no se debe a un efecto citotóxíco. En cambio, la laminina-l utilizada como sustrato, no ejerció un efecto modulador sobre la producción de testosterona. En relación al mecanismo de la esteroidogénesis, demostramos que el efecto inhibitorio del colágeno tipo IV y la fibronectina ocurre en un paso posterior a la producción de AMPc y anterior a la entrada del colesterol a la membrana mitocondrial interna. Por otra parte, demostramos que el colágeno tipo IV es capaz de modular la expresión de la proteína StAR, involucrada en el transporte del colesterol a la membrana mitocondrial interna. Teniendo en cuenta estos resultados, se decidió analizar alguna de las vías de señalización intracelular activadas por el colágeno IV, capaces de regular negativamente la esteroidogénesis de las células de Leydig. Demostramos que la modulación negativa del colágeno tipo IV sobre la esteroidogénesis de las células de Leydig de rata está mediada por la activación de tirosina quinasas. En particular, detectamos que la interacción del colágeno tipo IV con las integrinas de la subfamilia β1, activa la cascada de Ras/MEK/ERK, siendo estas las responsables de la modulación negativa del colágeno tipo IV sobre la esteroidogénesis. Asimismo demostramos que las proteínas ERK 1-2 están involucradas en las adhesiones focales inducidas por la interacción de las integrinas de las células de Leydig con las proteínas de la MEC. Las integrinas tienen la capacidad de activar la vía de señalización de las MAPK a través de distintos mecanismos. Uno de ellos, ocurre a través de la activación de las proteínas Ras, pudiendo ser dependiente o no de la proteína FAK. Nosotros demostramos que en las células de Leydig de rata, la activación de la cascada de las MEK, inducida por el colágeno tipo IV, se desencadena fundamentalmente, a través de un mecanismo FAK independiente. La activación de las proteínas ERK l-2 independiente de FAK, podría estar mediada por una proteína denominada caveolina-1. Nosotros identificamos la proteína caveolina-1 en las células de Leydig y detectamos que su fosforilación es modulada por la interacción del colágeno tipo IV con las integrinas de la subfamilia β1. Por otro lado, observamos que la expresión de la proteína StAR (“steroidogenic acute regulatory”) no solo es modulada por la vía de señalización del receptor de LH/hCG, sino que en su regulación participan las MAPK, en particular las MEK 1-2. Asimismo, demostramos que si bien el colágeno tipo IV, a través de las integrinas, es el principal responsable de la activación de las proteínas ERK 1-2, PKA también interviene en la fosforilación de las mismas, siendo capaz de modular la cascada de señalización de las MAPK en las células de Leydig de rata estimuladas con hCG. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo, nos demuestran que las proteínas de la MEC, son capaces de modular la adhesión, la diferenciación celular y la expresión de integrinas. El colágeno tipo IV, a través de la interacción con las integrinas de la subfamilia β1 y mediante un mecanismo FAK independiente, activa a las proteínas ERK 1-2, las cuales regulan negativamente la expresión de la proteína StAR, inhibiendo la producción de testosterona. Además, observamos que el estímulo de LH/hCG al aumentar la producción de AMPc, activa a la PKA, la cual interacciona con la cascada de señalización de las MAPK, ejerciendo una regulación dual sobre la esteroidogénesis en las células de Leydig de rata adulta Los resultados presentados en esta tesis contribuyen a ampliar los conocimientos sobre la influencia que las proteínas de la matriz extracelular ejercen sobre la morfología y diferenciación de las células de Leydig. Demuestran además, que el colágeno tipo IV, es capaz de modular, in vitro, la esteroidogénesis de las células de Leydig de la rata adulta.

Abstract:
It is well known that extracellular matrix (ECM) proteins are involved in the regulation of the differentiation, morphogenesis, proliferation and migration of cells. Most cell-ECM interactions are mediated by integrins, which in turn regulate the reorganization of the cytoskeleton, intracellular transport of ions, lipid metabolism, activation of kinases and genic expression. In the last decade, integrins have also been shown to have an important role in reproductive processes including fertilization, implantation and embryogenesis. In the testis, the regulation of different processes as the development, differentiation and steroidogenesis of Leydig cells depends on the concerted action of gonadotrophic hormones and a large variety of local factors produced in an autocrine or paracrine way. In spite of the information in the paragraph above, few studies have attempted to elucidate the role of ECM proteins in the functioning of Leydig cells. These cells are surrounded by ECM proteins organized as a continuous or discontinuous basement membrane. The objective of this thesis was to study the influence of ECM proteins on the morphology, cell adhesion, integrin expression and steroidogenesis of Leydig cells. The experimental model used was the culture of adult rat Leydig cells, using laminin-1 , type IV collagen and fibronectin as substrates. We observed that the Leydig cells cultured on laminin-1, type IV collagen and fibronectin present a larger number of cytoplasmic processes than those cultured on glass. We also demonstrated that the cells adhesion to the substrate occurs rapidly and that their degree of adhesion varies depending on the substrate to which they adhere. We also observed that, although integrins are constitutively expressed in Leydig cells, their expression increases in response to the adhesion of the cells to ECM proteins. In relation to the effect of ECM proteins on steroidogenesis, we demonstrated that type IV collagen and fibronectin inhibit the production of testosterone of the Leydig cells of adult rat, both in basal conditions and when stimulated with hCG, and that this phenomenon does not result from a cytotoxic effect. On the other hand, laminin-1 used as substrate had no modulatory effect on testosterone production. With respect to the mechanism of steroidogenesis, we demonstrated that the inhibitory effect of type IV collagen and fibronectin occurs after AMPc production step and before the entry of cholesterol into the internal mitochondrial membrane. We also demonstrated that type IV collagen is able to modulate the expression of the StAR (steroidogenic acute regulatory) protein, involved in the transport of cholesterol to the internal mitochondrial membrane. In view of these results, we decided to analyze some of the intracellular signal pathways, activated by collagen IV and able to negatively regulate the steroidogenesis of Leydig cells. We demonstrated that the negative modulation of type IV collagen on the steroidogenesis of rat Leydig cells is mediated by the activation of tirosine kinases. In particular, we found that the interaction of type IV collagen with β1 subfamily integrins activates the Ras/MEK/ERK cascade, these being responsible for the negative modulation of type IV collagen in steroidogenesis. We also demonstrated that ERK 1-2 proteins are involved in the focal adhesions induced by interaction between Leydig cell integrins and ECM proteins. Integrins have the capacity to activate the MAPK signal pathway through different mechanisms. One of these occurs through the activation of Ras proteins, and may or may not depend on the FAK protein. We demonstrated that in rat Leydig cells, the activation of the MEK cascade induced by type IV collagen is triggered basically through an independent FAK mechanism. The activation of the ERK 1-2 proteins independent of FAK could be mediated by a protein: caveolin-l. We identified the caveolin-l protein in the Leydig cells and found that its phosphorilation is modulated by the interaction of type IV collagen with β1 subfamily integrins. We also observed that the expression of the StAR protein is not only modulated by the signal pathway of the LH/hCG receptor, but that the MAPK participate in its regulation, particularly MEK 1-2. We also demonstrated that although type IV collagen, through the integrins, is the main factor in the activation of ERK 1-2 proteins, PKA also intervenes in their fosforilation and is able to modulate the MAPK signal cascade in rat Leydig cells stimulated with hCG. In conclusion, the results of this work demonstrate that ECM proteins are able to modulate adhesion, cell differentiation and integrin expression. Type IV collagen, through interaction with β1 subfamily integrins and by an independent FAK mechanism, activates the ERK 1-2 proteins that negatively regulate expression of the StAR protein, inhibiting testerosterone production. We also observed that LH/hCG stimulation, by increasing AMPc production, activates PKA; interacting with the MPAK signal cascade, exerting dual regulation on the steroidogenesis of adult rat Leydig cells. The results presented in this thesis contribute knowledge of the influence of extracellular matrix proteins on the morphology and differentiation of Leydig cells. They also show that type IV collagen is capable of modulating, in vitro, the steroidogenesis of adult rat Leydig cells.

Raiger-Iustman, Laura J.. "Estudio de la fosforilación de péptidos asociados a membranas fotosintéticas en Rhodovulum sulfidophilum" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Durante más de 10 años, nuestro grupo ha estudiado la relación que existe entre la fosforilación de péptidos asociados a las membranas fotosintéticas de bacterias fototróficas pertenecientes a distintos géneros y la síntesis del aparato fotosíntético. Estudios similares han sido llevados a cabo por diferentes grupos de investigación tanto en organismos fotosintéticos como en cloroplastos de plantas superiores. En Rhodobacter capsulatus se demostró la existencia de péptidos del complejo antena, sobre todo de los péptidos α2 y β1 de, que sufrían una modificación postraduccional por fosforilación y que dicha modificación estaba regulada por las condiciones ambientales en que el cultivo bacteriano se desarrollaba. Esta modificación estaba también relacionada con la regulación genética de la síntesis de los componentes del aparato fotosíntético y el mecanismo de inserción del mismo en las membranas. En el transcurso de este trabajo de tesis se ha observado que en Rhodovulum sulfidophilum existe un péptido de un peso molecular aparente de 6 kDa, al que se lo denominó péptido P, que se fosforila in vivo exclusivamente en tirosina. A pesar de que este péptido resultó no corresponder a ninguna de las proteínas que unen bacterioclorofila descriptas hasta el momento, su fosforilación parece depender de condiciones que regulan, en genreal, la sintesis del aparato fotosíntético, o sea que responde a los cambios en las condiciones de crecimiento: luz-oscuridad, aerobiosis-anaerobiosis. Es probable que este péptido fosforilable esté relacionado con los sitios de iniciación del crecimiento de las membranas intracitoplasmáticas. Durante este trabajo de tesis se también se construyó y caracterizó una mutante LH1- , no polar, denominada rsLRI. Dicha mutante se obtuvo por deleción de los genes pufBA, que codifican para las apoproteínas LH1β y LHIα.

Abstract:
During the last ten years, our group has studied the relationship existing between phosphorylation of peptides of photosynthetic membranes in phototrophic bacteria belonging to different genera, and the synthesis of the photosynthetic apparatus. Similar studies have been performed in chloroplast of higher plants. In Rhodobacter capsulatus the LH2α and LH1β polypeptides were phosphorylated in vivo and the process was regulated by ambient growth conditions. This postranslational modification was related to the gene expression of the antenna polypeptides and their insertion in the membrane The present thesis work has revealed that in Rhodovulum sulfidophilum a small polypeptide of apparent MW of 6 kDa (P peptide) was phosphorylated exclusively in tyrosine This peptide could not be identified as a belonging to the photosynthetic apparatus although its phosphorylation depends on those conditions that regulates the synthesis of the photosynthetic apparatus. Thus it was govemed by changes in light-dark or aerobiosisanaerobiosis conditions. It is possible that peptide P was related with the initiation sites present in the intracitoplasmic membranes. In this work we have obtained and characterised a mutant resulting in a non-polar LH1- mutant was obtained by deleting pufBA genes codifying for LHl and βLH1α polypeptides

Maskin, Laura. "Estudio de la familia génica Asr de tomate (Lycopersicon esculentum)" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En este trabajo se estudiaron los miembros de la familia génica Asr de tomate (Asr1, Asr2 y Asr3). Por métodos computacionales se compararon las secuencias aminoacídicas de las proteinas codificadas y se realizó una búsqueda de proteinas homólogas que reveló la existencia de moléculas proteicas conservadas que se acumulan en situaciones de variados tipos de estrés y/o en fruto. La comparación de todas estas proteínas "tipo ASR", provenientes de muy distintas especies, mostró que la homología se encuentra concentrada en dos dominios particulares. Además, todas comparten caracteristicas estructurales como la alta hidrofilicidad,alta carga, sitios conservados de miristoilación y dos regiones hidrofóbicas. Por otro lado, se evaluó la expresión de cada uno de los miembros conocidos de esta familia génica en tomate (L. esculentum), determinándose que poseen un nivel de expresión variable en condiciones basales en los órganos analizados y que se inducen diferencialmente en respuesta al estrés hídrico, al daño, al frio y durante la maduración del fruto. Se observó que la expresión basal de Asr1 y Asr2 en hoja se limita especificamente a células acompañantes del floema. En condiciones de falta de agua, la expresión en hoja y en raíz se visualiza también en las células parenquimáticas adyacentes. Se muestran evidencias de que ASR forma agregados in vitro (dímeros y trímeros). Finalmente, ensayos preliminares de expresión en sistemas heterólogos demuestran que ASR1 provoca un aumento de la viabilidad de levaduras sometidas a estrés salino.

Abstract:
This work reports the study of the members of the tomato Asr gene family (Asr1, Asr2 and Asr3). Using computational methods, the amino acidic sequences were compared. A search of homologous proteins reveled the presence of conserved molecules that accumulate in responses to various types of stress and/or in fruit. Comparison of all these ASR-like proteins from different plant species showed that homology is concentrated at two particular domains. Besides, all of them share structural features like high hydrophilicity, high charge, a conserved myristoylation signal and two hydrophobic zones. In addition, the expression of each known member of the Asr family in tomato (L. esculentum) were evaluated. The results showed variable basal expression level in all the analyzed organs and differential induction in response to water stress, wounding, cold and during fruit ripening. In leaves, Asr1 and Asr2 basal expression was restricted to the companion phloem cells. Under water deficit conditions, this expression was also visualized in leaf and root parenchyma adjacent cells. Evidences that ASR form aggregates in vitro (dimers and trimers) are shown. Finally, preliminar assays in heterologous expression systems showed that ASR1 causes an increment in viability of yeast subjeted to salt stressed.

Raíces, Marcela. "Identificación y caracterización de quinasas y fosfatasas de proteínas inducidas durante la tuberización de Solanum tuberosum" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En este trabajo se estudiaron genes posiblemente involucrados en los procesos de señalización relacionados con la tuberización. Se identificaron los genes StCDPK1, StCDPK2 y StCDPK3, que son los primeros miembros de la familia CDPK de Solanum tuberosum. En particular se caracterizó el gen StCDPK1 que codifica para una quinasa activa con todas las propiedades de las CDPKs. Se demostró que StCDPK1 se miristoíla in vitro y que su localización subcelular depende de miristoilación y palmitoilación. Por otra parte se determinó que existe una fuerte correlación entre la expresión de StCDPK1 y el engrosamiento del estolón. Mediante ensayos de hibridación in situ se observó que StCDPK1 se expresa en el ápice de estolones inducidos a tuberizar. También se determinó que StCDPK3 se expresa diferencialmente en estolones tempranos. En ensayos de Western blot se identificaron dos CDPKs, de 55 y 60 kDa, cuya expresión correlaciona con la expresión de los genes StCDPK3 y StCDPK1 respectivamente. Se determinó que la actividad CDPK asociada a estolones tempranos y la actividad CDPK asociada a estolones inducidos poseen diferente especificidad de sustrato y distinta localización subcelular. Por otra parte se estudió el efecto de la sacarosa sobre la tuberización y sobre la expresión de StCDPK1. Se determinó la importancia de las actividades quinasa durante la inducción de la tuberización inducida por sacarosa y se demostró que este azúcar induce la expresión de StCDPK1 mediante un mecanismo que involucra la actividad de fosfatasas de la familia PP1/PP2A. Además, se identificó el gen StPP2A1c que codifica para la primer fosfatasa de la familia PP2A de Solanum tuberosum. Se determinó que el gen StPP2A1c se expresa diferencialmente durante la tuberización y, mediante ensayos de complementación en levaduras, se demostró que este gen codifica para una fosfatasa funcional.

Abstract:
In this work we studied genes which are possiby involved in the signalling events leading to tuber development. The first members of Solanum tuberosum CDPK family, StCDPK1, StCDPK2 y StCDPK3, were identified. The gene StCDPK1, which encodes an active kinase with all the features of CDPKs, was characterized. It was demonstrated that StCDPK1 suffers myristoylation in vitro and that its subcellular localization depends on myristoylation and palmitoylation. On the other hand, a strong correlation between StCDPK1 expression and stolon swelling was established. Using in situ hybridization we observed that StCDPK1 is expressed in the apical dome of tuberizing stolons. Moreover, StCDPK3 is differentially expressed in early stolons. By Western blot assays, two CDPKs of 55 y 60 kDa which correlated with the expression of StCDPK3 y StCDPK1 respectively, were detected. The CDPK activity associated to early and induced stolons showed different substrate specificity and subcellular localization. The effect of sucrose on tuberization and StCDPK1 expression was also analyzed. The importance of protein kinase activities during sucrose-induced tuber development was established and the induction of StCDPK1 by sucrose, through a mechanism that involves PP1/PP2A phosphatase activities,was demonstrated. Besides, we identified StPP2A1c, a gene that encodes the first phosphatase of the PP2A family in Solanum tuberosum. StPP2A1c was differentially expressed during tuberization and encoded a functional phosphatase, as was observed in yeast complementation assays.

Ghio, Sergio Claudio. "Clonado y caracterización de un antígeno rico en aminoacidos ácidos de Trypanosoma cruzi y su posible rol en la inmunopatogenia de la cardiopatía chagásica crónica" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Se ha postulado la hipótesis de un origen autoinmune para explicar la etiología de la enfermedad de Chagas. Este proceso autoinmune podría ser el resultado de una respuesta inmune cruzada contra componentes específicos de células cardíacas que comparten epítopes con antígenos de Trypanosoma cruzí (mimetismo molecular). En trabajos anteriores demostramos que los anticuerpos de pacientes crónicos, inmunopurificados con el péptido correspondiente a los 13 aa C-terminales de la proteína ribosomal P28 de T. cruzi (TcP2β),alteraron la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ya que también podían reconocer el segundo bucle de los receptores cardiacos (M2 muscarínicos y β-adrenérgícos). Lo mismo ocurrió con los inmunopurificados contra un péptido correspondiente a la proteína ribosomal P0 (TcP0). Tanto los epítopes parasitarios como los del hospedador reconocidos por estos anticuerpos estaban formados por secuencias aminoacídicas ácidas. En la búsqueda de nuevos antígenos que pudieran producir este tipo de reacción cruzada, se propuso el rastreo de ESTs (Expressed Sequence Tags) producidos en el Proyecto Genoma T. cruzi que codificaran para proteínas ricas en secuencias ácidas. De este modo se aisló un EST de 718 pb. Se obtuvo la secuencia completa del gen que denominamos garp (glutamic acid rich protein) de 3500 pb, que es de copia única y origina un único ARNm de aproximadamente 4 kb. Según la comparación de secuencias se encontró una identidad de hasta 72% con secuencias de T. brucei. La proteína es de 130 KDa, y según ensayos de Western blot e inmunofluorescencia se localiza en el citoplasma del parásito. Aproximadamente el 20% de los sueros de pacientes con la enfermedad de Chagas crónica fueron capaces de reconocer la proteína recombinante GARP, y todos ellos lo hicieron con la región más C-terminal de la proteína, que contiene los aminoácidos ácidos. La inmunización con la proteína recombínante GARP provocó la aparición de anticuerpos dirigidos contra toda la proteína. Estos anticuerpos no modificaron la frecuencia de latidos de los cardiocítos en cultivo, y consecuentemente los ratones no sufrieron alteraciones electrocardiográficas. Como un método alternativo de inmunización, ensayamos la metodologia de inmunización con ADN. Con esta técnica de inmunización se pretendía reflejar mejor la situación de la infección crónica, ya que la presentación constantes de los antígenos parasitarios por las células musculares del hospedador podría ser mas adecuada para estudiar la patogenicidad de la enfermedad. Para poner a punto esta metodología, realizamos inmunizaciones con las proteínas ribosomales TcP2β y TcP0. Las inmunizaciones de ADN con TcP2β ,TcP0 y GARP generaron anticuerpos capaces de reconocer epítopes diferentes a los reconocidos en la infección natural. Los anticuerpos no provocaron alteraciones en la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ni se observaron alteraciones electrocardiográficas tales como las ocurridas cuando ratones fueron inmunizados con proteínas recombinantes TcP2β y TcP0. Por tanto concluimos que la inmunización con ADN es capaz de generar anticuerpos que reconocen epítopes diferentes a los inducidos por inmunizaciones con proteínas recombinantes o por la infección natural, lo cual es de utilidad al momento de generar una vacuna contra T. cruzi.

Abstract:
The hypothesis of an autoimmune origin has been postulated to explain the etiology of the Chagas' heart disease. This autoimmune process could be the result of an immune response capable of cross-reacting to specific components of heart (issues that share epitopes with antigens of Trypanosoma cruzi (molecular mimicry). As we have previously reported, antibodies of chronic patients, recognizing a peptide corresponding to the 13 aminoacid C-terminus (peptide R13) of the T. cruzi ribosomal P2 β protein (TcP2β) altered the frequency of cardiomyocyte beating culture. This antibodies were also able to recognize the second extracellular loop of the G-protein coupled receptors (M2 muscarinic and β-adrenergic receptors). Antibodies immunopurified against the C-terminus of the T. cruzi ribosomal P0 protein (TcP0) present a similar functional and physicochemical features. Both the parasitic and the host epitopes recognized by these antibodies are composed of acidic sequences. In the search of new antigens that could produce this type of cross-reaction, we looked for ESTs (Expressed Sequence Tags) in the Genome Project of T. cruzi coding for acidic residues rich proteins. So we identified a EST of 718 bp. The complete sequence of the gene (3500 bp) was obtained and we named it garp (glutamic acid rich protein). This gene exists in a single copy and gives origin to only transcript of approximately 4 kb. Its sequence was compared with database, finding a identity up to 72% with T. brucei sequences. The protein has 130 KDa, and both Western blot and immunofluorescence assays located it into cytoplasm. Approximately 20% of the sera of chronic chagasic patients were capable to recognize the recombinant protein GARP, and all of them recognized only the C-terminus of GARP, which contains the acidic sequences. When we immunized mice with the recombinant protein GARP, we achieved antibodies against the whole protein GARP. With anti-GARP serum we carried out assays on beating rat cardiomyocytes. With neither of the antisera beating frequency was altered and immunized mice with high anti-GARP titers showed no electrocardiografic alterations. As alternative method of immunization, we assayed immunizations with DNA plasmids. With this immunization technique we attempted to reflect better the situation of the chronic infection, since the constant presentation of the parasitic antigens from the host’s muscular cells could be more appropriate to study the pathogenicity of the disease. To set up this methodology we achieved immunizations with DNA coding genes of ribosomal TcP2β and TcP0 proteins. The DNA immunizations with TcP2β, TcP0 and GARP generated antibodies capable to recognize different epitopes to those obtained in the natural infection. No alterations in cardyocytes culture nor electrocardiografics recording in mice were observed. In contrast, immunization with TcP2β and TcP0 recombinant proteins generated functionally active antibodies. So we conclude that DNA immunization is useful to generate antibodies against epitopes that are different than the antibodies obtained in immunization with recombinant protein o in the natural infection. This could be useful to generate a vaccine against T. cruzi.

Goutman, Juan D.. "Caracterización farmacológica y biofísica de los receptores ionotrópicos de Gaba" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El ácido γ-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central de vertebrados y hasta el momento se han caracterizado tres tipos de receptores de GABA, según sus propiedades farmacológicas: GABAa, GABAb y GABAc. Los receptores de GABAa (GABAaR) y GABAc (GABAcR) comparten además su mecanismo de señalización, ambos son receptores ionotrópicos con una alta permeabilidad a iones cloruro. Los receptores de GABAb son metabotrópicos, generalmente acopladas a proteínas G. En esta tesis se presenta una extensa caracterización de las propiedades farmacológicas y biofísicas de los receptores de GABA, con especial énfasis en los GABAcR Este subtipo de receptores de GABA fue el último en ser identificado y se caracteriza por su insensibilidad al antagonista clásico GABAérgico, bicuculina y por el lento curso temporal de sus respuestas. Este trabajo se realizó expresando los receptores en ovocitos de Xenopus laevis y estudiando sus propiedades con dos diferentes técnicas electrofisiológicas: fijación de voltaje con dos electrodos (FVDE) y patchclamp en la configuración outside out. Los receptores ionotrópicos de GABA (GABA-R) son modulables por una diversidad de compuestos de diferente naturaleza química. Entre ellos se encuentran los flavonoides (F), una familia de compuestos aislados de plantas vasculares que presentan una gran variedad de acciones neurofarmacológicas. Algunos son ansiolíticos y sedantes, y se ha propuesto que su mecanismo de acción sería a través de los GABAaR. En este trabajo, evaluamos la acción de un grupo de F sobre las respuestas mediadas por GABA-R. Los F utilizados en este trabajo fueron: quercetina, crísina, apígenina, morina, flavona y α-naftoflavona. Contra lo esperado, los F evaludados tuvieron un efecto inhibitorio general tanto sobre los GABAaR como los GABAcR. Quercetina fue el más potente para ambos receptores con un IC50 de aproximadamente 4 µM en cada caso. También se evaluó la acción de quercetina en otros receptores ionotrópicos de neurotransmisores, como los colinérgicos nicotínicos, serotonina y kainato. En todos ellos se observaron efectos inhibitorios con distinta potencia. Tanto los GABAaR como los GABAcR son sensibles al alcaloide picrotoxina. Se han propuesto distintos mecanismos para su acción sobre los GABAaR incluyendo efectos no-competitivos y mixtos. Sin embargo, aún no se ha esclarecido suficientemente el mecanismo de acción en los GABAcR. Picrotoxina produjo una inhibición reversible con un IC50 = 0.6 ǂ 0.1 µM. La curva dosis-respuesta (D-R) para GABA en presencia del antagonista (1, 10 y 100 µM) sufrió un desplazamiento hacia la derecha y para las concentraciones más altas de esta toxina, una reducción en la respuesta máxima. Este resultado sugeriría un mecanismo de acción de tipo no-competitivo. No obstante, al igual que los antagonistas competitivos, las respuestas a concentraciones bajas de GABA fueron más sensibles a picrotoxina que las más altas. La inhibición por esta toxina fue también dependiente del uso, es decir, requirió la activación de los receptores para ejercer su efecto. La recuperación de la inhibición también fue facilitada por la acción de GABA. Además, picrotoxina produjo un aumento en la velocidad de de-activación de las respuestas al GABA, sugiriendo un mecanismo de tipo no-competitivo. En resumen, la inhibición de los GABAcR por picrotoxina tendría un mecanismo de acción no-competitivo o mixto, y dependiente del uso aunque menos que los GABAaR. Los GABAcR son sensibles a la modulación por iones trivalentes de la serie de los lantánidos (L) que producen un incremento en las respuestas a GABA. En un estudio previo se caracterizó la acción de uno de los elementos pertenecientes a los L, lantano (La³+); mientras que en este trabajo se analizaron los efectos de otro, lutecio (Lu³+). Ya en experimentos preliminares, se observó que la acción de Lu³+ sería más compleja ya que produjo un aumento rápido de la corriente, seguido de una atenuación durante la aplicación del ión sobre la respuesta a GABA. Lu³+ provocó una aumento en la afinidad aparente por GABA (0.4 ǂ 0.1 µM) y un incremento en la respuesta máxima a concentraciones saturantes de agonista. También se evaluó cómo afectaba la presencia de Lu³+ a la acción de ciertos antagonistas, como parámetro de la función de los GABAcR. El antagonista competitivo, TPMPA, inhibió las respuestas evocadas por GABA en presencia de Lu³+ con una potencia semejante a lo observado en ausencia de este ión. No obstante, no tuvo un efecto protector de la atenuación de la respuesta mediada por Lu³+, sugiriendo que este proceso sería operado por este ión independientemente de GABA. Las respuestas evocadas en presencia de Lu³+ también fueron sensibles a picrotoxina pero con caracteristicas diferentes a lo ya descripto. Se elaboró, además, un modelo de gating de los GABAcR y de la acción de Lu³+, donde se propone la existencia de dos estados abiertos, revelado por la presencia de este ión, que además mediaría un proceso de desensibilización independiente de GABA. Los estudios existentes sobre la cinética de los GABAcR fueron hechos con técnicas de pobre resolución temporal, y por esto decidimos realizar esta serie de experimentos en parches de membrana con la técnica de patch-clamp en la configuración outside out. Las respuestas al GABA obtenidas con esta metodología presentaron un curso temporal característico de los GABAcR: activación y de-activación lentas, de varios segundos de duración, con escasa desensibilización. La afinidad aparente por GABA calculada fue 4.0 ǂ 0.8 µM con un n de Hill = l.7 ǂ 0.5. La relación corriente-voltaje fue lineal, y el canal mostró una permeabilidad alta a cloruro. Se evaluó la sensiblidad de los GABAcR en parches de membrana a una serie de agonistas (TACA, β-alanina, glicina), antagonistas (TPMPA, picrotoxina, quercetina, zinc) y moduladores (La³+ y Lu³+) conocidos. Todos estos produjeron efectos similares al descripto previamente. Un estudio más profundo de la cinética de de-activación de las respuestas mostró que a concentraciones altas de agonista, la relajación era mejor descripta por ecuación de decaimiento exponencial de segundo orden; mientras a dosis cercanas al EC50,de primer orden. Esto sugeriría un modelo de gating con dos estados abiertos con distinta cantidad de moléculas de agonista unido, que fue evaluado realizando simulaciones numéricas de la actividad del receptor.

Abstract:
γ-arninobutyric acid (GABA) is the main inhibitory neurotransmitter in vertebrate central nervous system. Three GABA receptors subtypes have been described according to their pharmacological properties: GABAa, GABAb, and GABAc. GABAa (GABAaR) and GABAc (GABAcR) receptors also share their signaling mechanism, they are both ionotropic receptors with high chloride permeability. GABAb receptors are metabotropic and commonly coupled to G protein. In this thesis, we show an extent pharmacological and biophysical description of GABA receptors with special interest in GABAcR. This is the more recently identified GABA receptor and characterizes by its resistance to the classic GABAergic antagonist, bicuculine, and its slow time-course responses. Receptors were studied in this work by means of the expression in Xenopus laevis oocytes and two different electrophysiological techniques: two electrode voltage clamp (TEVC) and patch-clamp in outside out configuration. Ionotropic GABA receptors (GABA-R) can be modulated by a variety of compounds with different chemical structure. Flavonoids (F) are a group of compounds isolated from vascular plant that show distinct neuropharmacological effects. Some of them are anxiolytic and sedative, and a mechanism mediated by GABA receptors has been suggested. In this study, we have evaluated the effects of a group of F on GABA receptors function. The F tested were: quercetin, chrisin, apigenin, morin, flavone and α-naphtoflavone. Unexpectedly, these F showed an overall inhibitory effects on GABAaR and GABAcR. Quercetin was the most potent antagonist on both types of receptors with an IC50 value of approximately 4 µM. The actions of quercetin on other ionotropic neurotransmitter receptors, like cholinergic nicotinic, serotonin and kainate, were also tested. Different degrees of inhibition were observed in all of them. Both GABAaR and GABAcR can be blocked by the alkaloid picrotoxin. Different mechanisms of action have been proposed for the inhibition of this antagonist on GABAaR, including non-competitive and mix effects. However, the exact mechanism of action for GABAcR has not been clarified yet. Picrotoxin produced a reversible inhibition on GABAcR with an IC50 = 0.6 ǂ 0.1 µM. Dose-responses (D-R) curves in the presence of this antagonist (1, 10 and 100 µM) were right-shifted and an insumountable blockage was seen for high concentrations of toxin. All these suggest a non-competitive mechanism of action. However, as described for competitive antagonists, inhibition was more profound with low agonist concentrations than higher. Picrotoxin action was also use-dependent, i.e., receptor activation was required to exert its effect. Antagonist wash out was also facilitated by GABA action. In addition, picrotoxin produced an increase in de-activation rate of GABA-evoked responses, suggesting a non competitive effect. In summary, GABAcR inhibition by picrotoxin would present a non-competitive or mix mechanism of action, and also use-dependent effect, but in a lower degree than GABAaR. GABAcR can be modulated by trivalent cations from lanthanides (L) series that produce an increase in GABA evoked responses. The actions of lanthanum (La³+), one of the L, on GABAcR have been characterized in a previous study, and here we have analyzed the effects of other L, lutetium (Lu³+). In preliminary experiments, Lu³+ showed more complex actions, with a fast increase in GABA-evoked current, followed by attenuation during ion application. An increase in apparent affinity for GABA (0.4 ǂ 0.1 µM) and also in maximal efficacy was observed in the presence of Lu³+. The inhibition of some antagonists was evaluated in the presence of Lu³+ as a parameter for GABAcR function. TPMPA, a competitive antagonist, inhibited the action of GABA and Lu³+ with a potency similar to that was observed in the absence of this ion. However, Lu³+ mediated current attenuation was not protected by this antagonist, suggesting that this process would be operated by this modulator independently of GABA. GABA-evoked responses in the presence of Lu³+ could also be inhibited by picrotoxin but with a different profile than was previously described. In addition, a model for GABAcR gating and Lu³+ actions has been elaborated, in which two open states were proposed based on this ion effect, that would also mediate a desensitization process independent of GABA. Currently available studies on GABAcR kinetics have been carried out with techniques devoid of a proper time resolution. This is why we decided to perform experiments on membrane patches with the patch-clamp technique in outside out configuration. GABA-evoked responses showed typical GABAcR characteristics when obtained with this methodology: slow activation and de-activation kinetics, and poor desensitization even at high agonist concentrations. An apparent affinity for GABA of 4.0 ǂ 0.8 µM was calculated with a Hill coefficient = 1.7 ǂ 0.5. Current-voltage relation was lineal, and the channel was highly permeable to chloride. GABAcR present in membranes patches were tested with distinct already-known agonists (TACA, β-alanine, glycine), antagonists (TPMPA, picrotoxin, quercetin, zinc) and modulators (La³+ and Lu³+). They all showed similar effects to what was already described. An extensive study on de-activation kinetics of GABA-evoked currents showed that relaxation at high concentrations was better fit by a second order exponential decay equation, while at EC50 doses a first order was used. This would suggest a gating model with two open states with distinct number of agonist bound molecules, that was evaluated by numerical simulations of receptors function.

Estrella, María Julia. "Metabolismos de alfa y beta-glucanos en bacterias que interaccionan con plantas" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las bacterias sintetizan y acumulan diferentes polisacáridos de tipo α y β, los cuales cumplen funciones relevantes en la adaptación a los distintos entornos ambientales y en la interacción de las mismas con otros organismos. Los estudios que realizamos se refirieron especificamente al metabolismo de los glucanos cíclicos y del glucógeno en bacterias del suelo que interaccionan con plantas. Una parte del trabajo estuvo orientada a conocer el tipo de glucano que producen los rizobios que establecen simbiosis con el género Lotus. En dichos estudios se estableció que los glucanos cíclicos producidos por la cepa B. loti NZP 2309 tienen el mismo tipo de unión y estructuras estrechamente relacionadas con los descritos previamente en B. japonicum USDA 110, aunque la estructura de la especie mayoritaria de cada cepa es diferente. La cepa B. loti NZP 2309 produce una mezcla de glucanos cíclicos con uniones β(1-3), β(1-6), que están formados por especies neutras, no sustituidas, con DP= 10, 11 y 12, y la especie cíclica mayoritaria esta ramificada, tiene un DP=11 y está formada por un anillo de 10 residuos de glucosa con un único residuo terminal que forma la rama. La proporción de enlaces glucosidicos que tiene este glucano cíclico es 3:7:1 para las uniones β(1-3), β(1-6)y β(1-3, 6) respectivamente. La comparación de los glucanos cíclicos producidos por las cepas de B. loti NZP 2309 y B. japonicum USDA 110, sugiere que dichas moléculas tienen propiedades hidrofóbicas diferenciales y distinta capacidad de unión con flavonoides de leguminosas. Por otra parte, se observó que ambas cepas de Bradyrhizobium sintetizan in vitro, glucanos cíclicos β(l-3), β(1-6) por mecanismos similares y que dichos glucanos están estructuralmente relacionados. En B. loti NZP 2309 se identificó una proteína de membrana interna de 85 kDa que podría estar involucrada en la sintesis de glucanos solubles β(1-3) y β(1-6); insolubles β(1-3) tipo laminarina, o en la sintesis de ambos compuestos. Las moléculas sintetizadas in vitro están formadas principalmente por enlaces β(1-3), mientras que las moléculas producidas in vivo tienen mayor proporción de enlaces β(1-6). Nuestros resultados sugieren que la síntesis de glucanos cíclicos β(1-3), β(1-6)en Bradyrhizobium sp podria involucrar la formación de un glucano cíclico con uniones β(1-3), al que posteriormente se introducen uniones β(1-6)por transglicosilación, a través de la proteína NdvC Además, determinamos y comparamos el tipo de glucano que sintetizan y acumulan dos cepas de colección de M. loti, y evaluamos si la estrucutra de los mismos está relacionada con la capacidad que tienen dichas cepas para nodular distintas espcecies de Lotus. Se determinó que las cepas M. loti NZP 2213 y NZP 2037 producen glucanos cíclicos neutros y sustituidos con residuos aniónicos y uniones β(1-2), los que son similares a los reportados en otros rizobios de crecimiento rápido. La sintesis de los glucanos de M. loti se realiza a través de una proteína intermediaria que tiene una masa molecular similar a la proteína de 319 kDa reportada en otros rizobios que sintetizan glucanos cíclicos β(1-2).Se estableció que el tipo de glucano producido por las cepas M. loti NZP 2213, NZP 2037 y B. loti NZP 2309 no está relacionado con el rango de hospedante, ya que se determinó que las dos especies de M. loti producen glucanos similares con el mismo tipo de unión y presentan distinto rango de nodulación. Además, se observó que dos cepas con distinto tipo de glucano forman nódulos efectivos en una misma especies de Lotus. Otra parte de la tesis se centró en el metabolismo del glucógeno en bacterias que interaccionan con plantas. Se clonó y caracterizó un fragmento de ADN genómico de B. loti que tiene homologia con el genes de la síntesis de glucógeno y que contiene gran parte del gen glgC y el gen glgA completo, que codifican para las enzimas ADPGlc PPasa y GS, respectivamente. El fragmento clonado es similar a una región presente en el genoma de B. japonicum, indicando que la organización de los genes estructurales del metabolismo del glucógeno en el género Bradyrhizobium está conservada y es diferente a la reportada en otras bacterias. Las secuencias aminoacidicas de la ADPGlc PPasa y GS de B. loti presentan un grado de homologia mayor con las enzimas de B. japonicum que con otras enzimas homólogas de rizobios. La ADPGlc PPasa de B. loti pertenece al grupo V de ADPGlc PPasas que están altamente reguladas ya que se activan por Fru 6P, Fru 1,6 bisP y piruvato. La actividad de esta enzima en nódulos reveló que la ADPGlc PPasa de bacteroides de B.japonicum aumenta con la maduración del nódulo, cuando los mismos todavía tienen actividad reductora de acetileno. Por otra parte, se realizaron experimentos de mutagénesis sitio-dirigida con la ADPGlc PPasa de A. tumefaciens, que se tomó como modelo experimental, para determinar el rol que tienen los residuos de arginina que están conservados y ubicados en la región N-terminal de las ADPGlc PPasas reguladas positivamente por Fru 6P y piruvato. Se determinó que una carga positiva en la posición 32 sería necesaria para mantener la afinidad aparente de las ADPGlc PPasas activadas por hexosas-fosfato y/o piruvato y cualquier modificación de arginina por otro aminoácido que altere el tamaño o la hidrofobicidad, reduce la afinidad aparente por Fru 6P. El comportamiento de las mutantes en la posición 33 respecto a los activadores fue diferente, afectándose de manera más drástica la activación por Fru 6P que la activación por piruvato. La presencia de arginina en la posición 33 es muy importante para la activación de la ADPGlc PPasa de A. tumefaciens y no podría ser reemplazada por otro aminoácido. La presencia de arginina en la posición 45 es importante para la activación de la enzima por Fru 6P pero es poco probable que desempeñe un rol directo en la unión de un efector particular, ya que está completamente conservada entre todas las ADPGlcPPasas bacterianas analizadas.

Espelt, María Victoria. "Mecanismos que determinan la tolerancia a la anoxia celular" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En la presente tesis se estudió la relación entre el volumen celular y los flujos transmembranales de K+ en hepatocitos de goldfish (Carassius auratus) expuestos a condiciones anisosmóticas o a limitación energética. La respuesta de volumen fue luego comparada con aquella presentada por hepatocitos de trucha (Oncorhynchus mykiss) y de rata (Rattus rattus). El volumen celular fue estudiado utilizando video microscopía y microscopía de epifluorescencia, mientras que la medición de los flujos de K+ se estimó a partir de los flujos unidireccionales de 86Rb+. En hepatocitos de trucha y rata, la exposición a medio hiposmótico (180 mosM) a pH 7.45 produjo el aumento de volumen celular seguido por disminución regulatoria de volumen (RVD), respuesta que es mediada por el eflujo neto de KCl seguido de agua. Por el contrario, los hepatocitos de goldfish aumentaron su volumen pero no presentaron RVD en esas condiciones. En hepatocitos de goldfish, si bien la N-etilmaleimida pudo activar la salida de K+, esto no ocurriió cuando las celulas fueron expuestas a medio hiposmótico (120-180 mosM). Se desarrolló un modelo matemático con el fin de analizar las interacciones existentes entre el volumen celular, el potencial de membrana, y la masa de los principales solutos difusibles bajo condiciones anisosmóticas. Este modelo pudo ser utilizado para simular las respuestas volumétricas de los hepatocitos de las tres especies. Los resultados del modelo apoyan la idea de que la ausencia de RVD observada en hepatocitos de goldfish se debe a la ausencia de un elemento sensor de volumen. La comparación entre los resultados obtenidos con el modelo matemático y los resultados experimentales sugiere que los hepatocitos de goldfish poseen una capacidad restringida para desarrollar RVD. El bloqueo de metabolismo energético puede generar gradientes osmoticos por aumento de la osmolaridad intracelular. En el presente estudio, la inhibición de la glucólisis por ácido iodoacético (IAA)no alteró el volumen celular en hepatocitos de goldfish, mientras que en presencia de cianuro (CN), inhibidor de la fosforilación oxidativa, o de CN y IAA (IAA+CN), el volumen celular disminuyó un 3—7%.A pesar de que en los hepatocitos de goldfish la limitación energética no tuvo efecto sobre el eflujo de K+, el influjo disminuyó un 57-66% en presencia de CN y CN+IAA pero no se vio alterada por el IAA sólo. La pérdida de K+ intracelular luego de 20 min de exposición a CN o IAA+CN fue solo de un 4% del K+ intracelular total. En general, los resultados de este estudio sugieren que los hepatocitos de goldfish, a diferencia de las células de especies sensibles a la anoxia, evitan el desacople de los flujos transmembranales de K+ en respuesta a un gradiente osmótico o limitación energética. Esto podría explicar por un lado la incapacidad de estas células para presentar RVD, pero al mismo tiempo la extraordinaria capacidad para mantener las concentraciones intracelulares de K+, prolongando de esta manera la viabilidad celular.

Abstract:
The relationship between cell volume and K+ transmembrane fluxes of goldfish (Carassius auratus) hepatocytes exposed to anisosmotic conditions or energetic limitation was studied, and compared with the volumetric response of hepatocytes from trout (Oncorhynchus mykiss) and rat (Rattus rattus). Cell volume was studied by video- and epifluorescence microscopy, while K+ fluxes were assessed by measuring unidirectional 86Rb+ fluxes. In trout and rat hepatocytes, hyposmotic (180 mosM) exposure at pH 7.45 caused cell swelling followed by a regulatory volume decrease (RVD), a response reported to be mediated by net efflux of KCI and osmotically obliged water. In contrast, goldfish hepatocytes swelled but showed no RVD under these conditions. Although in goldfish hepatocytes a net K+ efflux could be activated by N-ethylmaleimide. this flux was not, or only partially, activated by hyposmotic swelling (120-180 mosM). A mathematical model was developed in order to gain insight into the multiple interactions between cell volume, membrane potential and the masses of diffusible solutes under anisosmotic conditions. This model was successfully used to simulate the volumetric responses of hepatocytes from the three species. Results from the model gave support to the idea that the lack of RVD observed in goldfish hepatocytes is due to the absence of a volume sensor element. A comparison between data predicted by this model and that obtained experimentally suggests that goldfish hepatocytes have a limited capacity to enable RVD. Blockage of the metabolism can be viewed as an osmotic challenge where intracellular osmolarity may increase. In the present work, the inhibition of glycolysis by iodoacetic acid (IAA)did not alter cell volume in goldfish hepatocytes, whereas in the presence of cyanide (CN), an inhibitor of oxidative phosphorylation, or CN plus IAA (IAA+CN), cell volume decreased by 3—7%. While in goldfish hepatocytes, energetic limitation had no effect on K+ efflux, K+ influx decreased by 57-66% in the presence of CN and CN+IAA but was not significantly altered by IAA alone. Intracellular K+ loss after 20 min of exposure to CN and IAA+CN amounted to only 4% of total intracellular K+. Collectively, these observations suggest that goldfish hepatocytes, unlike hepatocytes of anoxia-intolerant species, avoid a decoupling of transmembrane K+ fluxes in response to an osmotic challenge. This may underlie both the inability of swollen cells to undergo RVD but also the capability of anoxic cells to maintain intracellular K+ concentrations almost unaltered, thereby prolonging cell survival.

Distéfano, Ana Julia. "Caracterización molecular del Mal de Río Cuarto virus (MRCV) del maíz : estudio de los segmentos genómicos S1-S6, S8 y S10 y de las proteínas codificadas por los mismos" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El Mal de Rio Cuarto es la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Es causado por el Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y transmitido por una chicharrita de la especie Delphacodes kuscheli. El MRCV pertenece a la familia Reoviridae, género Fijivirus, y tiene la propiedad de multiplicar tanto en plantas de maíz como en el insecto vector. Las particulas virales consisten en una cápside icosahédrica formada por una doble capa de proteínas y contiene en su interior lO segmentos genómicos de RNA de doble cadena (dsRNA) llamados Sl a SlO, siendo el tamaño del genoma de aproximadamente 29 kbp. En los últimos años, y en muchos casos en paralelo con el desarrollo de éste trabajo, se han reportado las secuencias de algunos segmentos de virus relacionados: el MRDV (Maize rough dwarf virus), el FDV (Fiji disease virus), el ODSV (Oat sterile dwarf virus), el genoma completo del RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) y del NLRV (Nilaparvata lugens reovirus). En este trabajo se clonaron, secuenciaron y analizaron los segmentos genómicos Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 y SlO completos del MRCV. Se determinó que todos los segmentos genómicos analizados poseen secuencias 5’ y 3’ terminales conservadas y características del serogrupo al cual pertenece el MRCV: 5’AAGUUUUU3’ (extremo 5’) y 5’CAGCUnnnGUC3’ (extremo 3’). Adyacente a los extremos conservados se encuentran repeticiones de 7 a 12 nucleótidos invertidas e imperfectas que son segmento específicas. La predicción de la estructura secundaria de las cadenas codificantes de todos los segmentos estudiados, muestra que las regiones terminales son capaces de formar estructuras secundarias determinadas y estables que fueron propuestas como señales de replicación y empaquetamiento en virus del género Rotavirus. Se compararon las secuencias de nucleótidos obtenidas y las secuencias de aminoácidos deducidas con las secuencias de otros reovirus depositadas en las bases de datos, y se identificó la presencia de motivos característicos, a menudo indicativos de función. Se determinó que el MRCV Sl codifica para una proteína básica de 168,4 kDa que contiene motivos conservados en las RNA polimerasas dependientes de RNA y es homóloga a las RNA polimerasas codificadas por los virus RBSDV, FDV y NLRV, asi como a las codificadas por miembros de otros géneros de la familia Reoviridae. El MRCV S2 codifica para una proteína de 134,4 kDa y posee homología con las proteínas codificadas por el RBSDV S4, el FDV S2 y NLRV S2. En este trabajo presentamos evidencias de que la proteína codificada en éste segmento es no estructural. El MRCV S3 codifica para una proteína de 141,7 kDa, y hemos demostrado que es la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral y posee una alta homología con las proteínas correspondientes codificadas por el RBSDV S2 y FDV S3. El MRCV S4 codifica para una proteina de 131,7 kDa y su función se desconoce. Presenta una relativamente alta homología con miembros del género Fijivirus como así también con otros miembros de la familia Reoviridae. El MRCV S5 codifica para una proteína de 106,9 kDa cuya función se desconoce. Esta proteína presenta homología con las proteínas codificadas por los segmentos S5 del RBSDV y del FDV. El MRCV S6 codifica para una proteína de 90 kDa cuya función se desconoce. Esta proteína presenta una llamativa baja homología con las proteínas codificadas por los segmentos S6 del RBSDV y del FDV. El MRCV S8 codifica para una proteína de 68,3 kDa que contiene un motivo de unión de ATP/GTP que es característico de helicasa. Además la proteína es homóloga con las proteínas codificadas por el RBSDV S8, el MRDV S7, el OSDV S9 y el NLRV S7, todas con probable función de helicasa. El MRCV SlO codifica para una proteína de 63,5 kDa y su probable función sería la de proteína de cápside externa. Esta proteína presenta una alta homología con las proteínas correspondientes codificadas por los segmentos SlO de los virus RBSDV, MRDV y FDV. El análisis de los valores de homología encontrados entre los distintos segmentos del MRCV y los segmentos de virus relacionados, apoyaría la idea de evolución independiente de cada segmento viral. El análisis filogenético realizado con las secuencias obtenidas del MRCV permitió proponer que a pesar de que el MRCV está relacionado con el MRDV y el RBSDV, debe ser considerado una especie diferente del género Fijivirus (Distéfano y col., 2002) y no una raza geográfica del MRDV, como había sido inicialmente propuesto. El análisis filogenético realizado con las secuencias de aminoácidos de polimerasas representativas de todos los géneros de la familia Reoviridae mostró la existencia de dos grupos evolutivos separados: uno agrupa a los Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus y Rotavirus, y otro agrupa a los Fijivirus, Cypovirus, Olyzavirus y Coltivirus. Se expresaron algunos de los segmentos virales en estudio en bacterias obteniéndose proteínas de fusión con un péptido rico en histidinas que facilita su posterior purificación. Se obtuvieron antisueros policlonales contra las proteínas codificadas por los segmentos S2, S3, S4 y S6. El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 fue capaz de reconocer específicamente una de las proteína estructurales presentes en partículas virales purificadas del MRCV en un ensayo de “Western blot”. Esta proteina correspondería a la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral. En un experimento complementario, un antisuero obtenido contra las proteínas de la partícula viral fue capaz de reconocer a la proteína del MRCV S3 expresada en bacterias. Asimismo el antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 reconoce una proteína de tamaño similar al esperado en extractos de plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificada por el S3 del MRCV es una proteína estructural del virus y se demostró que forma parte del “core” viral El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV 82, reconoció específicamente a una proteína de menor tamaño al esperado en extractos proteicos totales de plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificada por el S2 del MRCV seria una proteína no estructural presente en los viroplasmas. En experimentos de “Far-Western blot” se observó que la proteína codificada por el MRCV S3 era capaz de interactuar consigo misma, con una proteína de 130 kDa que correspondería a la espícula viral de tipo B y con la RNA polimerasa dependiente de RNA codificada por el MRCV Sl. En Rotavirus se demostró que las proteínas equivalentes interaccionan entre sí. Los resultados presentados en este trabajo contribuyeron al avance en el estudio del virus que causa la enfermedad del Mal de Río Cuarto, a la clasificación taxonómica del mismo y al estudio de su origen evolutivo. Además los datos obtenidos permitieron el diseño de una estrategia de resistencia al MRCV en plantas transgénicas de maíz basada en el desencadenamiento del silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS).

Abstract:
Mal de Río Cuarto is the most important maize disease in Argentina. lt is caused by the Mal de Río Cuarto virus (MRCV) and transmitted by the planthopper Delphacodes kuschell. MRCV belongs to the Reoviridae family, Fijivirus genus, and has the interesting feature of being able to multiply both phloem cells of maize plants and in vector insects. The viral icosahedral double-shelled particles contain lO double-stranded RNA segments (dsRNA) called Sl -SlO, with a total genome size of nearly 29 kbp. In the last years, and in many cases simultaneously with this work, the nucleotide sequences of some Fijivirus genome segments have been reported: MRDV (Maize rough dwarf virus), FDV (Fiji disease virus) and ODSV (0at sterile dwarf virus). In addition the entire RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) and NLRV (Nilaparvata lugens reovirus) has been published. This work reports the cloning, sequence and analysis of the genomic nucleotide sequences of MRCV Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 and SlO. All the analyzed segments have the conserved 5’ and 3’ ends that were reported for viruses of the same serogroup to which MRCV belongs: 5’AAGUUUUU3’ and 5’CAGCUnnnGUC3’, respectively. In addition segment-specific imperfect inverted repeats of 7-12 nucleotides were identified immediately adjacent to the conserved sequences. Prediction of the secondary structure of all segments coding strands showed that terminal regions were able to form defined and stable secondary structures that are proposed to be replication and packaging signals in Rotavirus. We compared their nucleotide and amino acidic sequences with the ones deposited in Genebank for other reoviruses. MRCV Sl potentially encodes a 168.4 kDa basic protein that contains RdRp distinctive motifs and has identity with the RdRps encoded by RBSDV, FDV and NLRV as well as with RNA polimerases coded by virus belonging to other genera of the Reovirdae family. MRCV S2 encodes a single 134.4 kDa protein which has and intermediate identity to RBSDV S4, FDV S2 and NLRV S2-encoded proteins. In this work we showed that the protein coded by this segment is a non-structural protein. MRCV S3 codes for a l4l .7 kDa protein and we demonstrated that is the major core protein and has an extremely high homology with the proteins coded by RBSDV S2 and FDV S3. MRCV S4 codes for a 131.7 kDa protein and its function is unknown. It shows identity to members of Fijivirus as well as to two other genera of the Reoviridae family. MRCV S5 codes for a 106.9 kDa protein and its function is unknown. It shows identity with RBSDV SS and FDV S5-encoded protein. MRCV S6 codes for a 90 kDa protein and its function is unknown. It has a very low homology with the proteins coded by RBSDV S6 and FDV S6. MRCV SBcodes for a 68.3 kDa protein Significantly, MRCV S8 encoded protein contains an ATP/GTP-binding site motif that is a common feature of dsRNA helicases. In addition, MRCV S8 revealed identity with the proteins coded by RBSDV S8, MRDV S7, OSDV S9 and NLRV S7, all of them with proposed helicase function. MRCV SlO codes for a 63.5 kDa protein that probably corresponds to the outer capsid protein. This protein shows a high identity with the proteins coded by RBSDV SlO, MRDV SlO and FDV SlO. The comparative level of homology between different MRCV encoded proteins varied noticeably, supporting an independent evolution of the different genome segments. We discussed the evolutionary relationships of MRCV to other Reoviridae, and based on phylogenetic analysis we proposed that although MRCV is related to MRDV and RBSDV, it could be regarded as a new species of the Fijivirus genus and not a geographic race of MRDV as it was previously proposed. Phylogenetic analysis based on RdRps amimo acidic sequences of viruses belonging to all the genus of the Reoviridae family, showed the existence of two major evolutionary divisions of polymerase proteins among them: one grouped Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus and Rotavirus, and the second one grouped Fijivirus, Cypovirus , Oryzavirus and Coltivirus. Some of the studied segments were expressed in bacteria as fusion proteins with an histidine-rich peptide. Polyclonal antibodies were raised against S2, S3, S4 and S6 coded proteins. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S3 was able to specifically recognize a single structural protein present in the purified virus particles in a Western blot assay and a 140 kDa protein present in infected plants. This protein corresponds to the major core protein. On the other side, a polyclonal antiserum against the purified virus particle was able to recognize a MRCV S3 fusion protein expressed in bacteria. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the protein coded by MRCV S3 reacted with viral cores. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S2 was able to specifically detect a single protein of a smaller size as predicted in total proteins extracts from infected maize plants. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the protein coded by MRCV S2 reacted with viroplasms present in the phloem cells of infected maize plants. “Far-Westem blot” experiments showed that MRCV S3 coded protein interacts with itself with a protein of l30 kDa that probably correspond to the B-spike and with the RNA dependent RNA polimerase encoded by MRCV Sl. In Rotavirus the correspondent proteins also interact. The results showed in this work contribute to the understanding of the virus that cause Mal de Rio Cuarto disease, helped redefine the virus taxonomic classification within the genera, and collaborated with the determination of the evolutionary origin of the fijivirus genus. Also these results allowed to the design of a MRCV resistance strategy in trasgenic maize plants based on the triggering of post-transcriptional gene silencing (PTGS).

Lavista Llanos, Sofía. "Control de la respuesta transcripcional a hipoxia en Drosophila melanogaster, por las proteínas de la familia bHLH-PAS: Similar y Tango" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En mamíferos, se ha demostrado que el factor de transcripción hetero-dimérico bHLH-PAS - Hypoxia Inducible Factor (HIF) - es un regulador clave de la respuesta a hipoxia induciendo la expresión de genes regulada por oxígeno. En esta tesis demostramos la existencia de un sistema homólogo en Drosophila, y caracterizams su actividad in vivo durante el desarrollo. Usando reporteros transcripcionales en moscas transgénicas mostramos que la actividad trancripcional inducible por hipoxia aumenta a lo largo del desarrollo resultando máxima hacia el final de la embriogénesis. Mostramos que los diferentes tipos celulares tienen distintos niveles de sensibilidad a hipoxia y que las células traqueales son más sensibles respondiendo a hipoxia suaves. Mostramos que las proteínas bHLH-PAS Similiar (Sima) y Tango funcionan como los homólogos de HIF-α y β respectivamente, y demostramos un modo conservado de regulación por oxígeno para Sima. La proteína Sima se indujo en hipoxia, mientras el nivel de su ARN mensajero no varió con la concentración de oxígeno. En experimentos de un pulso de expresión ectópica de Sima seguidos de una curva de tiempo vimos que Sima se estabiliza en hipoxia y que su degradación depende de oxígeno. La expresión ectópica continua de Sima superó su tasa de degradación permitiéndonos estudiar el control de su localización subcelular. Sima es mayormente citoplasmática en normoxia y la proteína transloca al núcleo únicamente en hipoxia, revelando una segunda etapa de activación regulada por oxígeno. Describimos que la localización subcelular de Sima se encuentra modulada por parámetros del desarrollo. Caracterizamos el mecanismo que gobierna la localización subcelular dependiente de oxígeno de Sima. Mostramos que Sima entra y sale continuamente del núcleo al citoplasma y caracterizamos la exportación nuclear de Sima, cuyo mecanismo involucra al receptor de exportación nuclear CRM-1/Embargoed y es dependiente de oxígeno. Mostramos que el factor supresor de tumores deVon Hippel Lindau (VHL) modula la exportación nuclear de Sima, la cual requiere la hidroxilación de un residuo de prolina específico (Pro850). Proponemos que la localización núcleo-citoplasmática de HIFα/Sima resulta de un quilibrio dinámico entre la importación y la exportación nuclear, siendo este último un proceso modulado por oxígeno.

Abstract:
In mammalian systems, the heterodimeric bHLH-PAS transcription factor - Hypoxia Inducible Factor (HIF) - has emerged as the key regulator of responses to hipoxia. In this thesis we defined a homologous system in Drosophila, and characterise its activity in vivo during development flies we show that hypoxia inducible activity rises to peak levels in late embryogenesis, and is most pronounced in tracheal cells. We show that the bHLH-PAS protein Similar (Sima) and Tango function as HIF-α and β homologues respectively, and demonstrate a conserved mode of regulation for Sima by oxygen. Sima protein, but not its mRNA, was upregulated in hypoxia. Time course experiments following pulsed ectopic expression demonstrated that Sima is degraded in normoxia. Continuous ectopic expression over-rode Sima degradation which remained cytoplasmic in normoxia, and translocated to the nucleus only in hypoxia, revealing a second oxygen regulated activation step. We also show that Sima shuttles continuously between the nucleus and the cytoplasm. We characterized nuclear export of Sima which occurs through a mechanism that involves the nuclear export receptor CRM1/Embargoed and is oxygen-dependent. The Von Hippel Lindau (VHL) tumor suppressor factor modulates nuclear export of Sima, which requires hydroxylation of a specific prolyl residue (Pro850). We propose that HIFα/Sima nucleo-cytoplasmic localization is the result of a dynamic equilibrium between nuclear import and nuclear export, being the latter process modulated by oxygen tension.

Ferrari, María Rosa. "Estudio de la composición genómica de forrajeras mediante técnicas electroforéticas y de citogenética clásica y molecular" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Tricepiro es un cereal sintético de alto valor forrajero, que fue obtenido por el Ing. Covas en 1972. Lo logró cruzando triticale Don Santiago INTA(2n=42) por trigopiro Don Noé INTA(2n=56). Luego de varios años de mejoramiento logró la linea 3-40 que fue inscripta en 1994 como cultivar con el nombre de tricepiro Don René INTA.Esta línea, que presenta resistencia a enfermedades y es tolerante al frío y a la salinidad del suelo, constituye un material apto para ser usado en programas de mejoramiento. Dentro de los objetivos de la presente tesis estuvieron. Establecer y comparar los patrones electroforéticos de gluteninas de alto peso molecular (HMW)de tricepiro Don René INTA y de sus progenitores, así como determinar la existencia de variabilidad para dichas proteínas en lineas hermanas del cultivaren estudio. Determinar la estabilidad meiótica de tricepiro Don René INTA mediante el estudio de la meiosis masculina. Establecer la relación entre la rugosidad de las semillas y el contenido de heterocromatina telomérica de los cromosomas de centeno, en lineas de tricepiro Determinar la composición genómica de tricepiro Don René INTA e individualizar sus cromosomas mediante técnicas de citogenética clásica y molecular. La electroforesis de proteinas seminales (SDS-PAGE) mostró que tricepiro Don René INTA tiene cinco bandas correspondientes a gluteninas (HMW), ninguna de las cuales le es propia. De las cinco bandas, cuatro las comparte con ambos progenitores y la quinta la comparte sólo con trigopiro Don Noé INTA. Esta banda podría provenir de Thinopyrum. Las 9 lineas hermanas de tricepiro Don René INTA que se estudiaron tienen las cinco bandas que presenta el cultivar. Dos de estas líneas, tienen una banda adicional, FA-L2 la comparte con trigopiro Don Noé INTA y FA-L66 tiene una banda propia. Los estudios meióticos de tricepiro Don René INTA mostraron la formación de 21 II en diacinesis. Sin embargo, en Metafase I se observaron asincronías en el comportamiento cromosómico tales como bivalentes que segregaban tempranamente y presencia de univalentes fuera de la placa ecuatorial. El comportamiento meiótico no reveló la presencia de heterocigosis para alteraciones numéricas ni estructurales. El número de micronúcleos presentes en las tetradas osciló entre 0 y 9 y se calculó un Índice Meiótico de 66,47. Se hizo bandeo C y DAPI en cromosomas mitóticos de tricepiro Don René INTA. Se observaron 14 cromosomas con importantes bandas teloméricas atribuibles a cromosomas de centeno y 14 cromosomas con numerosas bandas intersticiales, supuestamente pertenecientes al genoma B de trigo, de acuerdo con patrones usados internacionalmente. Tricepiro Don René INTA posee semillas rugosas, mientras que la línea FA-L2 tiene semillas lisas. Se determinó que el tamaño de las bandas teloméricas del genoma R es similar en ambas lineas. Por lo tanto, las caracteristicas rugosidad de las semillas y tamaño de las bandas teloméricas de los cromosomas de centeno no muestran asociación . Los estudios de hibridación in situ con ADN genómico total de Secale cereale y Thinopyrum bessarabicum como sondas y Triticum aestivun var Chinese Spring como bloqueante (GISH) mostraron que Tricepiro Don René INTA tiene 14 cromosomas de centeno y 28 de trigo. En un par de estos últimos se detectó introgresión de Thinopyrum. La identificación de todos los cromosomas del hibrido se logró haciendo hibridación con las sondas pSc 119.2 y pAs1 (FISH). La composición genómica y la constitución cromosómica de tricepiro Don René INTA es la siguiente: 7 pares de cromosomas de centeno (1R, 2R, 3R, 4R, 5R, 6R, 7R); 7 pares de cromosomas del genoma A de trigo (1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A); 7 pares de cromosomas del genoma B de trigo (1B, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B). Introgresión del genoma J de Thinopyrum (posiblemente Th. ponticum 2n=70) en un par cromosómico del genoma A, que por su morfología y su tamaño podría ser el 6A.

Abstract:
Tricepiro is a synthetic cereal of high forage value obtained by G. Covas in 1972 in Argentina by crossing hexaploid triticale (2n=6x=42) and octoploid trigopiro (2n=8x=56). Several years of self pollination resulted in a line, 3-40, that was registered as a cultivar under the name tricepiro Don René INTA. This line possesses high potential as a parent in breeding programmes due to its marked disease resistance and freezing and drought tolerance. Inside the objectives of the present thesis they were: to find homologies between tricepiro Don René INTA and its ancestors through high molecular weight glutenines (HMW) analysis and to compare the variability between advanced lines; to study the meiotic behavior in order to determine the meiotic stability of tricepiro Don René INTA; to correlate kernel shrivelling in tricepiro with the size of terminal heterochromatin blocks on the rye chromosomes; to characterize the genome constitution of tricepiro Don René lNTA and identify its chromosomes using clasical and molecular cytogenetical techniques. Glutenines were fractionated by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis ( SDS- PAGE) and bands of Triticum aestivum var. Chinese Spring were used for comparison. Tricepiro has five bands, four of them shared with both progenitors and one only with trigopiro Don Noé INTA. With the exception of two lines (FA L2 and FA L66) the advanced lines of tricepiro show very low variability among them. Meiotic studies showed the presence of 21 II in diacinesis but in metaphase I an asincronic chromosome behavior was observed: some bivalents segregated early and univalents were detected. Tetrades have between 0 and 9 micronuclei and the Meiotic Index was 66.47. No heterocigosis for structural rearrayement or numerical alterations were detected. C-bands and DAPI showed 14 chromosomes with large terminal heterochromatic band that are putative rye chromosomes and 14 chromosomes with intersticial bands that are putative 14 wheat chromosomes (genome B). Tricepiro Don René INTA (shrivelling kernel) and FA-L2 (smooth kernel) didn't show statistical differences between the size of their rye telomeric heterocromatin bands. So no relation were detected between shrivelling kernel and rye telomeric heterocromatin bands in these tricepiro lines. The in situ hybridization using total DNA of Seca/e, Triticumand Thinopyrum as a probe (GISH) labelled with biotin and/or digoxigenin showed that tricepiro Don René INTA consists of 14 rye chromosomes and 28 wheat chromosomes. Small introgression zones of Thinopyrum in wheat chromosomes were detected. FISH using the repetitive DNA probes pSc 119.2 and pAs1 labelled with biotin, leads us to state that the genomic composition and the chromosomes identification of tricepiro Don René INTA are the folowing: 7 rye chromosomes pairs (1R, 2R, 3R, 4R, 5R, 6R, 7R). 7 wheat chromosomes pairs belonging to the B genome (1B, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B). 7 wheat chromosomes pairs belonging to the A genome (1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A). Introgression of a region from Thinopyrum in a wheat chromosome pair belonging to the A genome (putative chromosome 6A).

Pazos, Adriana Alejandra. "Caracterización de un sustituto de piel humana a base de dermis porcina" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las lesiones cutáneas que abarcan una gran superficie de la piel, requieren el recubrimiento inmediato de la zona afectada para reducir riesgos se sepsis y facilitar la regenración tisular. Entre los múltiples procedimientos terapéuticos aplicados en el tratamiento de estas lesiones, los injertos de piel proveen un medio adecuado y seguro para la regeneración tisular. En esta tesis se estudió un sustituto de piel humana a base de dermis porcina utilizado para ese fin terapéutico, el cual essometidopara su comercialización a un tratamiento industrial que incluye liofilizacipon. El objetivo de la tesis, consistió en la caracterización de este producto comercial, su comparación con la dermis fresca original, y la descripción de ciertos aspectos de su actividad biológica. El análisis consistió en desarrollar la metodología adecuada para el aislamiento y cuantificación de los componentes de importancia biológica. Estos fueron los colágenos del tipo I y III, las proteínas fibronectina y laminina, y los proteoglicanos de ácido hialurónico, keratán sulfato, dermatán sulfato y condroitín sulfatos A y C. Los resultados se esta etapa sugieren que el tratamiento industrial aplicado para su comercialización, no los modificó de manera importante, ya que no hubo alteraciones cuali-cuantitativas relevantes. Además, el análisis de su actividad biológica en un " modelo de cultivo in vitro" de fibroblastos humanos, mostró que la dermis induce un aumento de la proliferación celular. Por lo tanto, este sustituto dérmico puede considerarse una excelente herramienta para el tratamiento de pacientes con heridas cutáneas extensas.

Abstract:
Extended skin damage requires immediate covering of the wounded area in order to avoid sepsis and to facilitate tissue regeneration. There are multiple approaches to treat these injuries, however skin graft is one of the most suitable and safe measures to accomplish this issue. In the present thesis, it was examined a human skin substitute based on porcine dermis used for this kind of treatments, which was previously submitted to an industrial treatment that includes dried-freeze. The objective of this was, characterization of the product, later comparison to the original fresh tissue, and description of certain aspects of this biological activity. The analysis was focused on the development of an appropriate methodology to isolate and quantify those components considered of biological interest. These compounds were collagen types I and III, fibronectin, laminin, and hyaluronic acid, keratan sulphate, dermatan sulphate, and chondroitin sulphates A and C-containing proteoglycans. The results of this step suggest that the industrial treatment applied to the dermis for marketing purposes did not modify greatly the product, since there were no relevant qualitative and quantitative alterations. Besides, the biological activity analysis performed in an "in vitro culture model" of human fibroblasts showed that the dermis induces an increment of cellular proliferation and DNA synthesis, and a consequent shorten of cell cycle. Therefore, the studied dermal substitute could be considered as an excellent tool for the treatment of patients with extended skin injuries.

Daroqui, María Cecilia. "Caracterización del sistema TGF-ß/TßRs en carcinomas de mama y pulmón murinos. Rol en la progresión tumoral" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En este trabajo analizamos el rol de TGF-β en la progresión tumoral, empleando dos modelos de adenocarcinoma murino, de mama y de pulmón. Nuestro modelo de tumor de mama está constituido por los tumores parentales M3 y MM3, poco y altamente metastásicos, respectivamente, y por las lineas celulares derivadas LM3 y LMM3, altamente invasivas y metastásicas. Todas las células de nuestro modelo expresan el sistema completo TGF-β y sus receptores específicos TβRs, y éste es funcional. Además, mediante estudios in vitro determinamos que TGF-β activa la vía de transducción de señales Smads y otras vias, como p38Mapk y MEK/ERK, en las células de carcinoma de mama de nuestro modelo. En cuanto a su acción biológica, TGF-β tiene un efecto antiproliferativo sobre los cultivos primarios de M3 y MM3, mientras que las líneas son resistentes a dicho efecto. Por otra parte, TGF-β induce la actividad de MMP-9 en todas las células de nuestro modelo. Determinamos por primera vez que las vías de señalización p38Mapk y MEK/ERK bloquean la inducción de MMP-9 por TGF-β y que los receptores de señalización TβRI y TβRII son esenciales en esta respuesta. Además, estudiamos el rol de TGF-β sobre la expresión y/o actividad de distintos componentes del sistema de activación del plasminógeno, incluyendo activadores como el uPA y el uPA unido a membrana, e inhibidores como PAI-1. Detectamos que TGF-β inhibe el balance neto de este sistema en las células poco metastásicas, mientras que lo estimula en las células de fenotipo más agresivo. Por otro lado, analizamos la función de TGF-β en la reorganización del citoesqueleto de acfina y determinamos que TGF-β no modula las tropomiosinas ni la proteina HSP27, moléculas relacionadas con actina. Sin embargo, demostramos por primera vez que la actividad del complejo Arp2/3, fundamental en la polimerización de actina, aumenta en respuesta a TGF-β,si bien su consecuencia biológica debe aún esclarecerse mediante otros estudios. Además, TGF-β induce una leve remodelación de la actina cortical en nuestro modelo, sin producir cambios fenotípicos como la formación de fibras de stress y la transición epitelio-mesenquimática como ocurre en sistemas epiteliales no-tumorigénicos. Asimismo, determinamos que la via de señaligación MEK/ERK bloquea la formación de fibras de stress en las células tumorales en estudio y que además está involucrada en la inducción de la migración celular por TGF-β, junto con la vía p38Mapk. Por otra parte, TGF-β estimula la capacidad invasiva in vitro de todas las células de nuestro modelo de tumor de mama. Observamos que la presencia de TβRI y TβRII funcionales, así como las vías de señalización p38Mapk y MEK/ERK, son esenciales en este proceso. Estos datos son muy novedosos, ya que no ha sido descripto previamente un mecanismo de acción de TGF-β en la invasión celular. Mediante estudios in vivo determinamos que TGF-β no modula la capacidad angiogénica en nuestro modelo. Por otro lado, empleando células LM3 transfectadas con formas dominantes negativas de los receptores de señalización de TGF-β, encontramos que la tasa de crecimiento tumoral y la capacidad metastásica de las células de adenocarcinoma mamario en estudio dependen de un sistema funcional TGF-β/TβRs. Por otro lado, estudiamos el sistema TGF-β/TβRs en la línea de adenocarcinoma de pulmón LP07, altamente metastásica. Encontramos que estas células han perdido la capacidad de expresar la proteina TGF-β, respecto del tumor P07 que le dio origen. Además, determinamos que las células LP07 expresan los receptores de señalización TβRI y TβRII. Por medio de estudios in vitro detectamos que si bien las células LP07 no producen TGF-β, la via de Smads y otras vías de transducción de señales pueden ser activadas por TGF-β, por lo que son capaces de responder a la citoquina. Así, TGF-β es un potente inhibidor del crecimiento de LP07. Además, TGF-β inhibe marcadamente la actividad de las proteasas uPA y MMP-2 en las células LPO7 y controla su motilidad in vitro. Y también es capaz de inhibir la angiogénesis in vivo de LP07. De este modo, nuestros resultados indican que TGF-β podría funcionar como un supresor tumoral en nuestro modelo de adenocarcinoma de pulmón, y que la pérdida de funcionalidad del sistema TGF-β/TβRs podria contribuir a la progresión tumoral en estas células.

Abstract:
In the present work we have studied the role of TGF-β in tumor progression, by using a mammary and a lung murine adenocarcinoma experimental models. The mammary tumor model is composed by two closer related tumors, the poorly metastatic M3 and the highly metastatic MM3 ones, as well as the derived highly invasive and metastatic cell lines, LM3 and LMM3. We determined that all these cell types express both TGF-β and its receptors (TβRs), so they present the complete TGF-β/TβRs system. By in vitro studies we found that TGF-β induces the activation of different signaling pathways in our model, including Smads, p38Mapk and MEK/ERK. Besides, TGF-β exerts an antiproliferative action on M3 and MM3 primary cultures while the derived cell lines are resistant to this effect. On the other hand, TGF-β estimulates MMP-9 activity in all the cell types of our tumor model. We show here for the first time that p38Mapk y MEK/ERK pathways block MMP-9 by TGF-β, as well as that the TGF-β signaling receptors, TβRI and TβRII, are key components of this response. We also studied the role of TGF-β on the expression and/or activity of distinct components of the plasminogen activation system, including activators like uPA and membrane-bound uPA and inhibitors like PAI-1. We found that TGF-β inhibits the net balance between activators and inhibitors in the poorly metastatic cells, enhancing it in those cells with the more aggressive phenotype. On the other hand, we studied TGF-β action on actin cytoskeleton reorganization and we determined that TGF-β is not able to modulate the actin-related molecules tropomyosins and HSP27. However, we show here for the first time that TGF-β enhances Arp2/3 complex activity, although its biological significance remains to be fully determined. Besides, we found that TGF-β induces only a slight remodelling on the cortical actin in our tumor model, without affecting the cellular phenotype like the formation of stress fibers and the epithelial-to-mesenchymal transition showed by some normal epithelial cells. We also demonstrate that the MEK/ERK pathway blocks stress fiber formation in the tumor cells studied here, and that this pathway is also implicated in TGF-β-mediated cell migration, together with the p38Mapk pathway. Besides, we found that TGF-β induces the in vitro invasive ability of all the cell types studied here, and that this effect requires TβRI and TβRII activity as well as p38Mapk and MEK/ERK pathways. This is the first time that a signaling pathway is implicated in TGF-β-induced cellular invasion. By in vivo studies we showed that TGF-β is not able to modulate the angiogenic ability of the mammary tumor cells studied here. Finally, by using LM3 cells stably transfected with dominant negative forms of TGF-β signaling receptors, we determined that the tumor growth rate as well as the ability to form metastases depend on a functional TGF-β/TβRs system. On the other hand, we studied the role of the TGF-β/TβRs system in the highly metastatic lung tumor LP07 cell line. We found that LP07 cells do express TβRs but they have lost the ability to express TGF-β at the protein level showed by P07 parental cells. Using in vitro studies we detected that despite LP07 cells do not produce TGF-β, Smads and other signaling pathways can be activated by TGF-β, so these cells are able to respond to the cytokine. Besides, TGF-β markedly inhibits the activity of proteases like uPA and MMP-2 in LP07 cells as well as it reduces the in vivo angiogenic ability of these cells. So, our data suggest that TGF-β could function as a tumor suppressor in our lung tumor model, and that a disruption in the TGF-β/TβRs system regulation may thus contribute to tumor progression.

D’Agostino, Agata Magdalena. "Estudio de los mecanismos moleculares de patogénesis del sarcoma de Kaposi mediados por el Herpesvirus Humano-8/KSHV y su oncogén, el receptor acoplado a proteína G (vGPCR), en modelos animales" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
KSHV es un oncovirus implicado en Sarcoma de Kaposi (KS) y otros cánceres asociados a SIDA. KS es un neoplasma caracterizado por la proliferación de células ahusadas y la intensa angiogénesis. Los mecanismos a través de los cuales KSHV causa la respuesta angioproliferativa de KS se desconocen y la reproducción de todos los aspectos de KS mediante infección experimental por KSHV aún no ha podido ser demostrada. El receptor acoplado a proteína-G (vGPCR) de KSHV puede estimular cascadas de señalización que inducen angiogénesis y transformación celular. Identificar estas cascadas puede tener significancia terapéutica. Ciclooxigenasa-2 (COX-2) es un medidor involucrado en angiogénesis tumoral que puede ser regulada por antinflamatorios (AINEs). En la primera parte de este trabajo demostramos que vGPCR regula la actividad y la expresión de COX-2 vía ERK-1/2. Encontramos que la inhibición de COX-2 impide la angiogénesis inducida por vGPCR y que la administración del AINE Celecoxib retarda el crecimiento tumoral con disminución en la vascularata y producción de VEGF. Así, COX-2 sería uno de los componentes moleculares del cambio angiogénico de vGPCR y un posible blanco terapéutico. En la segunda parte mostramos que la transfección con KSHV clonado en un Cromosoma Artificial Bacteriano (KSHVBac36) en preparaciones de médula ósea murinas enriquecida en precursores de células endoteliales (mEC) es suficiente para inducir tumorigénesis y llevar al cambio fenotípico angiogénico. Las células mEC transfectadas con KSHVBac36 (mECK36) estaban infectadas con KSHV, secretaban VEGF, eran angiogénicas in vivo e indujeron en ratones inmunodeficientes la formación de sarcomas de células ahusadas vascularizados que expresaban LANA y marcadores característicos de KS. La inhibición de la expresión de vGPCR en las mECK36 utilizando siRNA condujo a la inhibición de su angiogenicidad y tumorigenicidad. Estos resultados definen un modelo animal para estudiar la patogénesis de KS mediada por KSHV y señalan a vGPCR como uno de sus principales oncogenes angiogénicos.

Abstract:
KSHV ia a human oncovirus associated with Kaposi´s sarcoma (KS) an AIDS associated cancer. KS is a neoplasm characterized by proliferation of spindle-shaped cells and intense angiogenesis. The mechanisms whereby KSHV causes KS angioproliferative response are not well defined and the reproduction of KS by experimental KSHV infection has not yet been shown. vGPCR is a G protein-coupled receptor encoded by KSHV that subverts host´s signaling pathways to induced cell transformation and angiogenesis. Cyclooxygenase-2 (COX-2) is a mediator involved in tumor angiogenesis that can be inhibited by NSAIDS. We demonstrated that vGPCR upregulates COX-2 activity and expression, and we found that inhibition of COX-2 by the NSAID Celecoxib impairs vGPCR-driven angiogenesis and tumorigenesis. Taken together these results show that COX-2 is a molecular mediator of vGPCR angiogenicity and potential target for KS therapy. On the second part we show that transfection of KSHV cloned in a Bacterial artificial chromosome (Bac36) into mouse Bone marrow preparations enriched in endothelial cells and its progenitors (mEC) is sufficient to induce tumorigenesis and angiogenesis. mEC transfected with KSHVBac36 (mECK36) were infected with KSHV, displayed high levels of VEGF secretion, were angiogenic in vivo and induced spindle-cell sarcomas expressing KSHV LANA and KS phenotypic markers. The inhibition of vGPCR expression mediated by siRNA led to inhibition of mECK36 angiogenesis and of tumor growth. These results define an animal model of KSHV-mediated KS pathogenesis in vivo and point to vGPCR as one of its major angiogenic oncogenes.

König, Guido Alberto. "Desarrollo de un sistema de vigilancia epidemiológica molecular para el virus de la fiebre aftosa" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La fiebre aftosa es una enfermedad que provoca importantes trabas en el comercio internacional y en el desplazamiento de animales en las zonas afectadas. El agente etiológico de la enfermedad es el virus de la fiebre aftosa (VFA). El avance de la Epidemiología Molecular en los últimos años ha facilitado la caracterización de las cepas que circulan en un brote y permite la determinación del probable origen y evolución del mismo. Con el objeto de estudiar los brotes surgidos en Sudamérica y especialmente en la Argentina en los últimos 15 años, se amplificó por trascripción reversa asociada a la reacción en cadena de 1a polimerasa (RT-PCR) y se secuenció la región nucleotidica que codifica para la proteína VP1 de 94 muestras del VFA. En el período 2000-2002 se identificaron y caracterizaron las dos cepas virales responsables de los brotes de serotipo A (A Argentina 2000 y A Argentina 2001) y las dos variantes del virus responsable de los brotes de serotipo O (O Argentina 2000). Asimismo se determinó la cocirculación viral de distintas cepas del VFA para los serotipos A, O y C en el período 1990-1994. Además se establecieron las relaciones filogenéticas dentro del topotipo Europeo-Sudamericano de cada uno de los serotipos y se elaboró una clasificación interna de los topotipos. Finalmente se creó un banco de secuencias nucleotïdicas de la proteína VP1 de los aislamientos sudamericanos y se optimizó la metodología molecular a utilizar en la caracterización del VFA, en casos de emergencias sanitarias en el país.

Abstract:
Foot and Mouth disease causes significant loses in international trade and animal movements in affected areas. The etiologic agent of the disease is the Foot and Mouth Disease Virus (FMDV). The progress of Molecular Epidemiology on past years allowed the characterization of an outbreak and the discrimination of his origin and evolution. The nucleotide VP1 coding region of 94 samples of FMDV were amplified by reverse transcription and polimerase chain reaction (RT-PCR)and sequenced. These isolates belong to South America, but most of them were obtained from Argentina in the last 15 years. In 2000-2002 period, two strains responsible for serotype A outbreaks, have been identified (A Argentina 2001 and A Argentina 2000). Also, two variants of the virus liable to serotype O outbreaks were recognized (O Argentina 2000). Viral co circulation of different serotypes A, Oand C stains has been detected on 1990-1994 years. Moreover, phylogenetic relationships have been established inside the Europe-South American topotype of each serotype and an internal classification has been established. Finally, in case of a new outbreak of the disease, a VP1 nucleotide sequence database of South-American isolates has been built up. Also, the molecular methodology has been optimised in order to characterize the FMDV strain.

Perotti, Christian Pablo. "Terapia fotodinámica a partir de ALA: acerca de estrategias para aumentar su eficacia y selectividad" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Nogués, Guadalupe. "Influencia de la elongación transcripcional sobre el splicing alternativo" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El splicing alternativo de los pre-mRNAs es un mecanismo fundamental de las células eucariotas, que permite generar una gran diversidad proteica a partir de un número relativamente pequeño de genes. Desde hace unos años se sabe que las reacciones de procesamiento de los pre-mRNAs tales como la adición de una caperuza o cap en el extremo 5', el splicing de intrones, y el corte y poliadenilación en el extremo 3', no sólo ocurren cotranscripcionalmente, sino que todos estos procesos estin acoplados funcionalmente entre si. Esto llevó a proponer una posible influencia de la transcripción sobre todos ellos. En particular, nuestro grupo demostró en 1997 que si se cambian los promotores que dirigen la transcripción de un minigén de fibronectina humana, se modifica el patrón de splicing del exón alternativo EDI. En esta tesis continuamos con esta línea de investigación, y nos preguntamos si la modulación de la capacidad de la RNA polimerasa II (Pol II) de elongar a través de pausas del molde, también llamada procesividad, puede modificar el splicing alternativo de EDI. Para responder esto, estudiamos el efecto, sobre el splicing alternativo, de distintos activadores transcripcionales capaces de estimular la iniciación y/o la elongación transcriptional. Además, investigamos indirectamente la influencia del factor de elongación P-TEFb, que posee una actividad kinasa capaz de convertir la Pol II a su isoforma procesiva. Por último, examinamos la influencia de la procesividad de la Pol II en el control del splicing alternativo en relación a la fuerza de los sitios de splicing. Las evidencias obtenidas apoyan un modelo cinético de control del splicing alternativo, según el cual la transcripción mediada por una Pol II altamente procesiva favorecería la exclusión de un exón alternativo, debido probablemente a un menor reconocimiento del sitio subóptimo de splicing.

Abstract:
In eukaryotic cells, pre-mRNA alternative splicing is an essential mechanism that generates a large protein diversity fiom a small number of genes. For the last few years, it has been known that pre-mRNAs processing reactions such as capping, splicing, and 3'-end processing not only occur cotranscriptionally, but they are functionally coupled to each other. This suggested the possibility of transcription affecting all these processes. In particular, our group demonstrated in 1997 that swapping of the promoters that drive transcription of a human fibronectin minigene alters splicing of the ED1 alternative exon. In this thesis we continued with this subject, and we asked ourselves if changes in RNA polymerase I1 (Pol 11) ability to elongate trough pauses in the template, quality also known as processivity, can modify ED1 alternative splicing. To answer this, we studied the effect on alternative splicing of different transcriptional activators that stimulate transcriptional initiation andlor elongation. Besides, we examined indirectly the influence of the elongation factor P-TEFb, that exhibits a kinase activity that makes Pol I1 to become more processive. We also investigated the importance of Pol I1 processivity on the control of alternative splicing in relation to splice sites strength. The evidences obtained support an alternative splicing kinetic model in which transcription driven by a processive Pol I1 would favor alternative exon skipping, probably because of a poor recognition of the suboptimal splice site.

Hochbaum, Daniel. "Una nueva función para un factor intercambiador de GDP/GTP" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Factores intercambiadores de GDP/GTP (GEFs), y sus proteinas G asociadas son piezas fundamentales en la maquinaria que transduce información desde el medio extracelular hacia respuestas específicas intracelulares. Entre ellas, la cascada de MAPKs, representa una via efectora ampliamente representada. De forma análoga a la activación de la vía ERK-1/2 dependiente de Ras, miembros de la familia Rho de proteínas G son capaces de activar la cascada de JNK, al ser cargado GTP, por sus correspondientes GEFs. En la búsqueda de nuevos reguladores de la actividad de JNK, hemos identificado a EPAC como un fuerte activador de JNK-1, EPAC (Exchange Protein Activated by CAMP) es un miembro de la creciente familia de GEFs que intercambian nucleótidos sobre la subfamilia Rap de proteinas G de Ia familia Ras. En la presente tesis, reportamos que mientras EPAC activa a JNK varias veces, una mutante constitutivamente activa de Rap1b (G12V), no es capaz, sugiriendo que Rap-GTP no es suficiente para transducir señales dependientes de EPAC hacia la activación de JNK. Es más, la señalización de EPAC a JNK no es bloqueada por la inactivación de Rap endógena, sugiriendo que la activación de Rap no es necesaria para esta respuesta. Consistentemente con estas observaciones, la utilización de mutantes que tienen delecionados dominios proteicos, muestran que el dominio catalitico GEF no es necesario para la activación de JNK mediada por EPAC. Estos estudios identificaron una región que se superpone con el dominio REM de EPAC, como crítico para la activación de JNK. De hecho, el dominio REM aislado es suficiente para activar JNK. Mediante a utilización de mutantes dominantes negativas de la cascada de JNK, hemos identificado a la familia Rho de pequeñas proteínas G como blanco de EPAC, en la activación de JNK. Incluso, una actividad intercambiadora de nucleótido para Rac y Cdc42, se encuentra presente en inmunoprecipitados de EPAC, sugiriendo la formación de un complejo entre EPAC y un putativo GEF para estas proteinas G. Concluimos que EPAC señaliza a la cascada de JNK a través de un nuevo mecanismo que no involucra su canónica acción catalitica, ej: intercambio de GDP/GTP sobre proteínas Rap. Esto representa no solo una nueva vía de activación de JNK, sino un mecanismo aún no descripto de señalización río abajo de EPAC.

Abstract:
Guanine Nucleotide Exchange Factors (GEFs) and their associated GTP binding proteins (G-proteins) are key regulatory elements in the signal transduction machinery that relays information from the extracellular environment into specific intracellular responses. Among them, the MAPK cascades represent ubiquitous downstream effector pathways. We have previously described that, analogous to the Ras-dependent activation of the Erk-1/2 pathway, members of the Rho family of small G-proteins activate the JNK cascade when GTP is loaded by their corresponding GEFs. Searching for novel regulators of JNK activity we have identified EPAC as a strong activator of JNK-1. EPAC (Exchange Protein Activated by CAMP)is a member of a growing family of GEFs that specifically display exchange activity on the Rap subfamily, of Ras small G-proteins. We report here that while EPAC activates the JNK several fold, a constitutively active (G12V) mutant of Rap1b does not, suggesting that Rap-GTP is not sufficient to transduce EPAC-dependent JNK activation. Moreover, EPAC signaling to the JNKs was not blocked by inactivation of endogenous Rap suggesting that Rap activation is not necessary for this response. Consistent with these observations, domain deletion mutant analysis shows that the catalytic GEF domain is dispensable for EPAC-mediated activation of JNK. These studies identified a region overlapping the REM domain as critical for JNK activation. Consistent with this, an isolated REM domain from EPAC is sufficient to activate JNK. Using dominant negative mutants of the JNK cascade, we identified the Rho family of small G proteins as a target for Epac mediated JNK activation. Indeed, an exchange activity towards Rac and Cdc42, is present in Epac immunoprecipitates, suggesting the formation of a complex between Epac and a putative GEF for these G proteins. We conclude that EPAC signals to the JNK cascade through a new mechanism that does not involve its canonical catalytic action, i.e. Rapspecific GDP/GTP exchange. This represents not only a novel way to activate the JNKs but also a yet undescribed mechanism of downstream signaling by EPAC.

Ferrario, Juan Esteban. "Estudio de la expresión diferencial de genes inducidos por el tratamiento crónico con levodopa en el estriado de ratas con lesiones del sistema nigroestriatal" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La levodopa constituye la terapia principal para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. En modelos animales de la enfermedad se reportó que el tratamiento crónico con levodopa induce una serie de efectos compensatorios, entre los que se destaca el aumento de terminales axonales de las neuronas dopaminérgicas en el núcleo estriado. Con el objetivo de conocer mejor los mecanismos celulares y moleculares que median los principales cambios compensatorios construimos una biblioteca de expresión diferencial enriquecida en transcriptos del estriado de ratas con lesión del haz nigroestriatal, tratadas con levodopa durante 6 meses. Para identificar los transcriptos presentes en la biblioteca utilizamos un atlas de expresión de genes que representa las principales funciones celulares. Identificamos varios genes que habían sido previamente relacionados con los mecanismos de plasticidad y trofismo. Posteriormente confirmamos la expresión diferencial de tres transcriptos por medio de hibridación in situ y encontramos que el factor trófrco pleiotrofma, la proteína básica de la mielina y la calmodulina están sobreexpresados en el estriado desnervado de las ratas tratadas con levodopa. Además, analizamos el grado de inervación dopaminérgica estriatal mediante la detección inmunoautorradiográfica del transportador de dopamina. En conjunto nuestros resultados obtenidos a partir de aproximaciones moleculares e histológicas, sugieren la participación de determinados genes en la reinervación dopaminérgica estriatal inducida por el tratamiento crónico con levodopa.

Abstract:
Levodopa, the major treatment for patients with Parkinson’s disease, has been shown to induce a variety of compensatory effects, including facilitation of sprouting by dopaminergic neurons in experimental animals with lesions leading to denervation of the striatum. To better understand the cellular and molecular environment where most of these compensatory changes take place, in particular elements that might contribute to the recovery of dopaminergic innervation, we constructed a differential expression library enriched in transcripts from the striata of rats with lesions of the nigrostriatal dopaminergic pathway, orally-treated with levodopa for 6 months. We used this library to screen an expression array of rat genes representing the major cell functions, and have identified several that are involved in neurotrophic mechanisms and plasticity. We confirmed the differential expression of selected transcripts by non-radioactive in situ hybridization, and report that the growth factor pleiotrophin, myelin basic protein and calmodulin are overexpressed in the denervated striatum of levodopa-treated rats. In addition, we analyzed the levodopa-induced dopaminergic reinnervation in the denervated striatum of lesioned rats by immunoautoradiographic detection of the dopamine transporter (DAT). Together, from a combination of molecular and histochemical approaches, our results suggest a possible functional role of several genes in dopaminergic neurons sprouting during levodopa treatment.

Cordo, Sandra M.. "Interacción del virus Junín con el citoesqueleto y la membrana de la célula huésped" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
EI virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, es un miembro de la familia Arenaviridae. Es un virus envuelto de genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación ha sido caracterizado en varios aspectos. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de PH. Una vez que la nucleocápside se encuentra dentro del citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales, mediante una estrategia de codificación ambisense. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside es denominada NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), sintetizado en el retículo y exportado a la membrana plasmática de la célula, se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2. Ambas conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. Se desconocen hasta el momento los mecanismos detallados y las estructuras celulares involucradas en el transporte de las distintas proteínas virales hacia el sitio de brotación. El ensamblado de las partículas virales se lleva a cabo en la membrana plasmática de las células infectadas. En este trabajo se estudiaron algunos aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando la asociación de NP, GPC y GP1 a distintas estructuras celulares. En primer lugar se estudió la interacción del virus con la red de filamentos intermedios (FI) del citoesqueleto. Se utilizó el compuesto acrilamida capaz de desorganizar específicamente los FI. La producción de virus infeccioso disminuyó de manera dosis-dependiente en presencia del mismo. Los resultados, observados en celulas Vero, cultivos de fibroblastos humanos y astrocitos murinos, fueron comparables. Se analizó luego el efecto del compuesto sobre diferentes pasos del ciclo de multiplicación. De esta manera se determinó que la integridad de los FI es crucial al menos durante los pasos previos a la síntesis de proteínas virales y posteriores a la internalización. Mediante extracciones específicas realizadas con detergentes no iónicos se encontró que NP se asocia a la fracción celular correspondiente al citoesqueleto, aunque no se determinó a que componente correspondería esta interacción. Las glicoproteínas no mostraron asociación específica a estas fracciones celulares en iguales condiciones. Por otro lado, modificaciones en el contenido de colesterol de las células infectadas y tratadas con inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa, disminuyeron la infectividad y localización de las glicoproteinas en la membrana de las mismas. Estos resultados llevaron al análisis de la asociación de GPC y GP1 a estructuras de membrana ricas en colesterol denominadas rafts. Los ensayos de fraccionamiento celular específicos para estos microdominios de membrana mostraron la localización de las glicoproteínas en rafts. Esta interacción fue dependiente de la temperatura y de la presencia de colesterol en los cultivos infectados. Además, la asociación de las glicoproteínas a las fracciones rafts fue estabilizada a 37°C por la adición de anticuerpos específicos. Estos resultados sugieren la utilización de esta vía como mecanismo de transporte para GPC y GP1 a la membrana celular de las células infectadas. Asimismo la localización de las glicoproteínas en los microdominios rafts podría representar una estrategia para el reclutamiento de los componentes virales previo al paso de liberación de la progenie en las células infectadas.

Abstract:
Junin virus (JUNV), the etiological agent of argentine hemorrhagic fever, is a member of the Arenaviridae family. The viral cycle multiplication of this RNA virus has been characterized in different aspects. The entrance in the target cells is performed by receptor-mediated endocytosis following pH dependant fusion step. Once the nucleocapsids are within the cytoplasm the ambisense strategy allows expression of five structural proteins. The major nucleocapsid associated protein is named NP. As a result of the glycoprotein precursor synthesis and after its maturation and exocytic transport to plasma membrane of infected cells, two glycoproteins are obtained. Both proteins, named GP1 and GP2, form the claviform structures found in the viral envelope. At this moment, the detailed mechanisms and cellular structures involved in the transport of different viral proteins towards the budding site are not known although the fact that viral assembly is carried out in plasma membrane of infected cells is currently accepted. In this work we have studied some aspects of virus-cell interaction characterizing the association of NP, GPC y GP1 to cellular structures. First, we have studied the interaction between virus and cytoskeletal intermediate filaments (IF). In the presence of acrylamide, compound that selectively disrupt IF, viral yield was diminished. The results were similar in Vero cells, human fibroblast cultures and murine astrocytes. Then, we analyzed the effect of acrylamide on different steps of the multiplication cycle. It was determined that IF integrity is essential at least between the step of internalization and viral protein synthesis. Detergent extractions of infected cultures demonstrated that NP associates to cellular cytoskeletal fraction although it was not possible to identify the specific cytoskeletal framework involved in that association. Glycoproteins did not show specific association to these cytoskeletal fractions under similar conditions assayed. On the other hand, modifications in the cholesterol contents of infected cells induced by HMG-CoA reductase inhibitors, diminished infectivity and glycoproteins membrane localization. This result leded us to analyse the association of GPC and GP1 to membrane cholesterol enriched structures named rafts. Specific cellular fractionation assays showed glycoproteins associated to raft microdomains. This interaction was temperature and cholesterol dependant. Moreover, glycoprotein association to membrane rafts was stabilized at 37°C by specific antibody addition. These results suggest that GPC and GP1 may utilize the exocytic raft pathway to reach the plasma membrane of infected cells. Finally, glycoproteins raft association may represent the strategy to recruit viral proteins before releasing progeny from the cells.

Estévez, Alejandra. "Participación de la interleuquina-1ß en el mecanismo de regresión luteal en la rata" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En los mamíferos, la regresión luteal o luteólisis es un evento determinante para el proceso reproductivo ya que garantiza la finalización de un ciclo no concepcional, permitiendo el inicio de otro ciclo potencialmente fértil. Estudios recientes demostraron la acumulación de leucocitos durante la luteólisis, asociada a la producción de citoquinas pro-inflamatorias y radicales libres. Es por esto que el objetivo del presente trabajo de tesis fue estudiar la participación de la Interleuquina-1 beta (IL-1β) en la luteólisis funcional. Además, dado que inhibidores de la NOS prolongan la vida del CL, se analizó si el óxido nítrico (NO) estaba involucrado en el mecanismo de acción de la IL-lβ. Para ello, se utilizó el modelo de la rata pseudopreñada, en el cual la administración de PMSG induce la formación de CLs con una vida media de aproximadamente lO días. Al comparar el CL en regresión (día 9 de psp) respecto del CL funcional (día 5 de psp) se observó que durante la luteólisis espontánea aumentó la producción endógena de IL-lβ y de PGF2α, mientras que disminuyeron la biosíntesis de P, los niveles del mRNA y de la proteína StAR y el contenido de glutation reducido (molécula antioxidante). La IL-Iβ fue capaz de reducir la biosíntesis de P y de aumentar la producción de PGF2α, incrementando los niveles proteicos de la COX-II pero no los de COX-I, enzimas responsables de la síntesis de PGs. Además, la IL-lβ moduló el estado oxidativo del CL funcional ya que aumentó el índice de lipoperoxidación (TBARs) y redujo el contenido de glutation reducido. Por lo tanto, la incubación de los explantes ováricos (día 5 de psp) en presencia de la IL-lβ reprodujo, en los CLs funcionales, las características observadas en los CLs en regresión sugiriendo que la IL-lβ promueve la luteólisis funcional. Mientras que los niveles del mRNA de la iNOS aumentaron en el CL en regresión, el contenido del mRNA de la eNOS disminuyó en un 50% en el día 9 de psp. A su vez, la producción de NO fue mayor en el CL en regresión, evidenciando la presencia de un sistema generador de NO en los explantes ováricos en las distintas etapas del desarrollo luteal. La IL-lβ estimuló la síntesis de NO y la incubación con el sustrato de la NOS, la L-Arginina, disminuyó la síntesis de P y aumentó la de PGF2α. Por otro lado, la presencia del L-NAME revirtió los efectos inducidos por la IL-lβ, indicando que el NO estaría involucrado en el mecanismo de acción de la citoquina. La activación de la iNOS sería un evento necesario en la acción biológica de la IL-lβ, ya que la citoquina aumentó la expresión del mRNA y de la proteína iNOS, mientras que el 1400W, inhibidor selectivo la iNOS, revirtió completamente su acción sobre la P. La acumulación de GMPc se incrementó por el tratamiento con IL-lβ y, mientras que el 8-Bromo-GMPc, un análogo del GMPc, disminuyó la biosíntesis de P, la presencia del inhibidor de la guanilato ciclasa soluble, el ODQ, anuló la reducción en la esteroidogénesis inducida por la IL-lβ .Estos resultados sugieren que el GMPc participa en el mecanismo de acción de la IL-lβ. Más aún, dado que el ODQ anuló el efecto antiesteroidogénico inducido por la L-Arginina, el GMPc sería un intermediario necesario en el efecto inhibitorio del NO sobre la biosíntesis de P. Los resultados del presente trabajo de tesis sugieren que la IL-Iβ participa en la luteólisis funcional a través de un mecanismo que involucra al NO, la isoforma iNOS y el GMPc.

Abstract:
In mammals, luteal regression or luteolysis is a determinant event for the reproductive process as it guarantees the end of a non-conceptional cycle, enabling the onset of a new potentially fertile cycle. Recent studies demonstrated the accumulation of leukocytes in the regressing CL, associated to pro-inflammatory cytokine production and free radical generation. Thus, the aim of the present work was to study the participation of Interleukin-lbeta (IL-1β) in functional luteolysis. Also, as nitric oxide synthase inhibitors prolong CL lifespan, we evaluated if nitric oxide (NO) was involved in IL-lβ signaling pathway. We used the rat pseudopregnant model, in which the administration of PMSG induces the formation of CLs of approximately lO days of life. Comparative analysis between the regressive (day 9 psp) and functional (day 5 psp) CLs revealed that during spontaneous luteolysis the endogenous IL-1β and PGF2α production increased, whereas progesterone biosynthesis, StAR mRNA and protein expression as well as reduced glutathione diminished. IL-1β was able to reduce P biosynthesis yet augment PGF2α production, enhancing COX-II protein expression but not COX-I expression, rate-limiting enzymes of PGs synthesis. In addition, IL-1β affected the overall mid-luteal redox state, as reactive oxygen species generation (TBARs) was increased in the presence of IL-lβ while intracellular glutathione content was reduced. Therefore, the incubation of ovarian explants with IL-lβ mimicked, in the functional CLS, the features seen in the regressive CLs suggesting that IL-1β promotes functional luteolysis. While iNOS mRNA levels augmented in the regressive CL, eNOS mRNA levels diminished to a 50% on day 9 psp. This was accompanied by a higher production of NO in the regressing CL, unveiling the presence of a NO-generator system in ovarian explants at different stages of CL development. IL-lβ was able to stimulate NO synthesis and the incubation with L-Arginine exerted both a reduction in P production and an increase in PGF2α synthesis. On the other hand, the presence of L-NAME reverted IL-lβ-induced anti-steroidogenic effect, suggesting that NO is involved in lL-lβ signaling pathway. INOS activation might be a necessary event in lL-lβ biological actions, as IL-1β increased iNOS mRNA and protein expression and furthermore, the selective iNOS inhibitor 1400W completely reverted the anti-steroidogenic effect elicited by lL-lβ. IL-1β promoted GMPc accumulation and, whereas the permeable GMPc analogue, 8-Bromo- GMPc mimicked IL-lβ action, reducing P levels, the soluble guanylyl cyclase inhibitor ODQ blocked the IL-lβ-induced anti-steroidogenic effect. These results stroneg suggest that GMPc is involved in IL-Iβ transduction pathway. Moreover, as ODQ prevented L-Arginine-elicited anti-steroidogenic effect, GMPc could be regarded as a necessary intermediary molecule in the NO-induced inhibitory action on P biosynthesis. The results from the present study suggest that IL-lβ participates in functional luteal regression through a mechanism involving NO, the inducible NOS isoform and GMPc.

Rodríguez Gil, Diego Javier. "Alteraciones producto de una hipoxia aguda en el complejo receptor Gabaa : caracterizaciones bioquímicas, farmacológicas y moleculares" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Se ha demostrado que la hipoxia produce diversas alteraciones en la neurotransmisión GABAérgica, principalmente en el período perinatal. El complejo receptor GABAa está asociado a un canal de cloruro, el cual en presencia de GABA aumenta la conductancia al ion Cl- hacia el interior de la neurona produciendo su hiperpolarización. Los objetivos de la presente Tesis fueron diseñar una cámara hipóxica para embriones de aves, y caracterizar las alteraciones que se producen en el complejo receptor GABAa luego del trauma hipóxico. Los resultados obtenidos demuestran que los estadios embrionarios más tempranos son más sensibles a la injuria, exhibiendo una reducción del máximo número de sitios de unión de baja afinidad, y un aumento de la estimulación máxima producida por un barbitúrico (pentobarbital sódico) y un neuroesteroide (alopregnanolona). Asimismo, se observó un aumento de la captación de Cl̄ inducida por GABA de los receptores remanentes luego del tratamiento hipóxico. Dado que los embriones detectan en todos los estadios embrionarios la injuria producida, evidenciándose como un aumento en los niveles de lactato, es probable que existan cambios durante el desarrollo en la composición de las subunidades del receptor que lo hagan más resistente a la hipoxia, la cual además, ocurre fisiológicamente en los últimos días de desarrollo. La expresión de algunas subunidades del receptor GABAa durante la embriogénesis, mostró cambios en los niveles de expresión de α1, β2 y ɣ2 en embriones control luego del tratamiento hipóxico, los cuales correlacionaron con lo observado luego de producida la hípoxia fisiológica. Estos datos sugieren que, podrían existir conformaciones del receptor más resistentes a la hipoxia, y que los niveles de oxígeno podrían regular la expresión de algunas subunidades de alguna manera aún desconocida.

Abstract:
It has been demonstrated that hypoxic treatment produces functional disorders and changes in the GABAergic neurotransmission, specially during perinatal period. GABAa receptor complex is associated to a chloride channel, and GABA binding increases Clˉ influx, resulting in neuron hyperpolarization. The aims of this Thesis were (a) to design a hypoxic chamber for avian embryos and (b) to characterize alterations on the GABAa receptor complex after hypoxic injury. The results obtained demonstrated that the earlier embryonic stages are more sensitive to injury, exhibiting a reduction in maximal number of low affinity binding sites, and an increase in the maximal stimulation produced by a barbiturate (sodium pentobarbital) and a neurosteroid (alopregnanolone). Moreover, an increase in chloride influx of the remaining receptors was observed after hypoxia. Taking into account that the embryos sense hypoxic treatment at all embryonic days studied, which was proved by the increase in lactate levels, it is probable that during development receptor subunit composition is altered making this receptor subtype more resistant to hypoxia. This occurs physiologically at latest embryonic days. The expression pattern of some GABAa receptor subunits during ontogeny showed changes in α1, β2 and ɣ2 levels in control embryos, and also after hypoxic treatment. A correlation could be observed between hypoxic treatment and physiological hypoxia. These data suggest the existence of some receptor isotypes which are more resistant to hypoxia, and that oxygen levels may regulate subunit expression in some unknown way.

Coluccio Leskow, Federico. "Estudio funcional y estructural de las quimerinas, una familia de receptores de DAG y esteres de Forbol con actividad de Rac-GAP" (2005) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las quimerinas son una familia de GAPs (GTPase Activating Proteins) especificas para la familia de proteínas de Rac, reguladas por el segundo mensajero diacilglicerol (DAG) y los esteres de forbol. En mamíferos los genes CHN1 (o α) y CHN2 (o β) codifican para las cuatro isoformas conocidas, α1 y β1 presentan un dominio C1 y un dominio de GAP, mientras que α2 y β2 poseen un dominio adicional SH2. En el primer capitulo de este trabajo se muestra que el gen beta codifica para al menos 3 nuevas isoformas. La resolución de la estructura cristalográfica de β2-chimaerin. Se demuestra que es necesaria la unión del ligando al dominio C1 y la interacción con fosfolípidos de membrana para la activación del GAP. En el tercer capitulo se muestra que el dominio SH2 de β2-chimaerin es capaz de unir proteínas fosforiladas en tirosina y se identifican tres de estas proteínas. En el capitulo cuarto se reporta el clonado y caracterización de z-chimaerin, el producto del único gen de quimerinas presente en el pez cebra. Esta proteína posee características similares a las de mamíferos y se expresa de forma materna y zigotica a lo largo del desarrollo embrionario. En el ultimo capitulo se estudia la función de z-chimaerin en el desarrollo embrionario. Se determino que su actividad de GAP es necesaria en la capa sincitial del saco vitelino para regular el movimiento de epíboli.

Abstract:
Chimaerins are a family of GAPs (GTPase Activating Proteins) specific for the Rac small GTPases regulated by the second messenger diacylglycerol (DAG) and the phorbol esters. In mammalians the genes CHN1 (or α) and CHN2 (or β) encode the four known isoforms, α1 and β1 that posses a C1 and a GAP domain, and α2 and β2 that have an additional SH2 domain. The first chapter describes the existence of at least three novel β isoforms. The 3-D structure of β2-chimaerin reveals that it is autoinhibited with the C1 and GAP domains sterically blocked. In the second chapter a mechanism for lipid activation of β2-chimaerin is proposed. In the third part of this thesis it is shown that the SH2 domain of β2-chimaerin binds phosphotyrosine proteins. Three proteins that interact with β2-chimaerin were isolated. The fourth chapter reports the cloning and characterization of z-chimaerin, the product of the only chimaerin gene in the zebrafish. This protein is similar to the mammalian isoforms and it is maternally and zygotically expressed during embryogenesis. In the last chapter we analyzed the function of z-chimaerin during early development and found that its GAP activity is necessary in the yolk syncytial layer for the regulation of epiboly

Freudenthal, Ramiro A.M.. "Participación de factores de transcripción de la familia Rel/NF-kappa B en procesos de plasticidad y memoria" (2006) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La memoria de largo término y la plasticidad neuronal comparten varias características,incluyendo las fases temporales de mecanismos celulares y moleculares: la inducción requiere de un aumento de calcio intracelular, la persistencia temprana depende de la activación de quinasas y las etapas tardías necesitan de transcripción génica y de la síntesis de proteínas. Desde los primeros experimentos en los cuales se logro amnesia inhibiendo la síntesis proteica, se especula acerca de la función de factores de transcripción (FT) específicos, en la regulación de la expresión génica necesaria para la perdurabilidad tanto de fenómenos mnésicos como de la plasticidad neuronal. Este trabajo se concentro en dos aspectos de la función del FT NF-kappa B en la consolidación de la memoria de largo término y la plasticidad neuronal. El primer aspecto se refiere a la activación del FT luego de inducidos estos fenómenos, y el segundo a la conservación evolutiva de la función de esta vía de transducción desde crustáceos a mamíferos. Para los propósitos de este trabajo se evaluó la activación de este FT en tres modelos: la consolidación de la memoria de largo termina (MLT) en el cangrejo Chasmagnathus granulatus, un paradigma evitación inhibitoria en ratón y la inducción de potenciación de largo término in vivo de la vía perforante del hipocampo de ratón. La presencia de la vía de regulación transcripcional Rel/NF-kappa B, se determinó en el cangrejo por retardo electroforético (EMSA), Western Blot, inmunoprecipitación, unión covalente con irradiación ultravioleta e inmunohistoquímica. En el cangrejo, un protocolo que induce una MLT es seguido por una activación bifásica de unión al ADN por parte del NF-kappa B, mientras que un protocolo que induce una memoria de corto término no activa al FT. NF-kappa B se encuentra presente en las terminales sinápticas, en donde es activado por protocolos de entrenamiento que inducen MLT. El curso temporal de la activación de NF-kappa B nuclear en hipocampo, se estudió por EMSA, después del entrenamiento de un ensayo, en el paradigma de evitación inhibitoria en ratón. Mostrando, cuando se lo comparo con los animales naive, una inhibición del FT luego de 15 min. del entrenamiento seguida por una activación a los 45 min. tanto en los animales que sufrieron un shock eléctrico, como en los que fueron expuestos al contexto sin shock. En esta misma línea argumental, encontramos que la inyección intra cerebro ventricular (icv) de sulfasalazina inmediatamente post-entrenamiento impide la formación de la memoria de largo término. Más aún, una segunda estrategia independiente para inhibir el NF-kappa B en el cerebro, la administración icv de un oligonucleótido doble cadena de ADN conteniendo la secuencia consenso de NF-kappa B (kB Decoy) también resulta amnésica. Cuando se estudian los EMSAs de extractos nucleares de hipocampo de ratón, se observa que animales tetanizados (protocolo inductor de potenciación de largo término) muestran, luego de 15 min. un aumento en la actividad de unión al ADN, cuando son comparados con, animales estimulados a baja frecuencia (EBF) y animales naive. Los hipocampos al ser analizados por inmunohistoquímica con un anticuerpo contra la forma activa del factor, muestran la misma tendencia general pero con patrones celulares de activación más complejos. Estos resultados indican, primero que la actividad de unión al ADN del NF-kappa B es necesaria para la consolidación de memorias de largo término. Y el tratamiento con inhibidores específicos de NF-kappa B, suficiente para generar amnesia en los animales inyectados. A la vez que muestra un patrón temporal claramente delimitado en el cual el factor es necesario para la consolidación. Igualmente significativa es la activación del FT luego de inducida la plasticidad neuronal, mostrando un papel en el proceso de potenciación. El segundo aspecto de este trabajo sugiere que la vía de transducción señales de NF-kappa B se encuentra conservada, en su función fisiológica en el sistema nervioso, entre invertebrados y vertebrados.

Abstract:
Long term memory and neural plasticity share several characteristics, including the temporal phases of molecular and cellular mechanisms: the induction requires an increment on intracellular calcium, early persistence depends on the activation of kinases and the late steps need gene expression and protein synthesis. Since the first experiments in which amnesia was produced by protein synthesis inhibition, it has been speculation about the role of specific transcription factors (TF) in the regulation of the gene expression needed for the lasting of mnesic processes such as neural plasticity. This thesis concentrates on two aspects of the function of TF NF-kappa B during long term memory consolidation and neuronal plasticity. The first, concerns it’s activation after the induction of these phenomena, and the second concerns the evolutionary conservation of this signaling pathway from crustaceans to mammals. For the purpose of this thesis, the activation of NF-kappa B was evaluated in three models: long term memory (LTM) consolidation in the crab Chasmagnathus granulatus, inhibitory avoidance in mice and the induction of in vivo long term potentiation, of the hipocampal perforant pathway in mice. The presence of the Rel/NF-kappa B transcriptional regulatory pathway in Chasmagnathus was studied by Electro Mobility Shift Assay (EMSA), Western Blot, Immunoprecipitation, Ultraviolet Crosslinking and Immunohistochemistry. In the crab, a protocol that induced LTM, is followed by a a bifasic activation of the DNA binding activity of the TF, while a protocol that induces short term memory does not activate NF-kappa B. This TF is present at the synaptic terminals, where it is activated by the LTM inducing training protocols. The temporal course of nuclear NF-kappa B activation in mice hippocampus, was studied by EMSA, after the one trial inhibitory avoidance training. Showing, when compared with naive animals, an inhibition 15 min. after training, followed by activation after 45 min., both in the animals that received shock and the ones only exposed to the context. In the same line of evidence, animals injected intra cerebro ventricular (icv) with sulfasalazine (an inhibitor of NF-kappa B activation) immediately after training impede the formation of LTM. What is more, an independent and more specific form of NF-kappa B inhibition, the icv injection of a double stranded DNA containing the TF consensus sequence (kB decoy), results amnesic. When we studied EMSAs of hippocampal nuclear extracts, tetanized mice (a protocol that induces potentiation) shows, 15 min after, an augment in DNA binding activity, in contrast with low frequency stimulated and naive mice. Immunohistochemical analysis with an antibody against the active form of the transcription factor, showed the same tendency but with a more complicated cellular pattern of activation within the hipocampal structure. These results indicate, first that the DNA binding activity of the TF is necessary for LTM and that the treatment with NF-kappa B specific inhibitors is sufficient to generate amnesia in the injected animals. At the same time it shows that a clear temporal pattern of activation is needed for consolidation. Equally significant is the activation of TF after the induction of neural plasticity, showing a role in this process. The second aspect suggested by this work, is that the Rel/NF-kappa B pathway is conserved in its physiological function between invertebrates and vertebrates.

Fernández, Paula del Carmen. "Análisis genómico de girasol: desarrollo de colecciones de ESTs y de una plataforma bioinformática para estudios de expresión de genes candidato en respuestas a estreses abióticos" (2006) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El girasol es uno de los principales cultivos oleaginosos del mundo por su volumen de producción y composición en ácidos grasos insaturados. En promedio, durante los últimos cinco años, la producción mundial se ha mantenido estable concentrándose el 72% de la misma entre Argentina y la Unión Europea. A pesar de esto y debido a las condiciones de los precios internacionales y la productividad comparativa con otros cultivos, el área de producción se está desplazando a regiones más áridas a nivel mundial cobrando relevancia la incidencia de estreses abióticos como sequía, salinidad y bajas temperaturas. Pese a la importancia económica del girasol a escala mundial, el grado de avance de los conocimientos públicos sobre el genoma de girasol es limitado cuando se lo compara con cultivos como el arroz, el maíz, la soja, el tomate, el trigo, la papa, la cebada. Sin embargo, en los últimos cinco años, en paralelo al avance de este trabajo, se han iniciado distintos proyectos a nivel nacional e internacional orientados al análisis genómico de girasol con lo cual ha aumentado significativamente la disponibilidad de secuencias genómicas y de ADNc, con el consecuente impacto en el avance de las investigaciones y el conocimiento sobre esta especie. El objetivo de este trabajo es contribuir al conocimiento de las regiones codificantes del genoma de girasol a partir de una estrategia de genómica funcional que sirva como base para la caracterización transcripcional simultanea de los perfiles de expresión inducidos bajo condiciones de estrés y el desarrollo de marcadores funcionales. Para lo cual se abordo el desarrollo de un banco local de secuencias que se expresan o ESTs ("expressed sequence tags") diferenciales para distintos órganos y/o estadios de desarrollo de girasol y el desarrollo de una plataforma bioinformática para la caracterización de los perfiles transcripcionales de las mismas en respuesta a estrés abióticos. En una primera etapa se evaluaron distintas estrategias de secuenciación a pequeña y mediana escala para la identificación de genes diferencialmente expresados en girasol a partir de la generación colecciones de ADNc diferencial. La técnica utilizada se basó en la hibridación substractiva como herramienta para la identificación de genes diferencialmente expresados en un tejido definido, disminuyendo significativamente la redundancia en la secuenciación de clones que representan a genes abundantes y maximizando la detección de los transcriptos “raros” o poco abundantes. Esta estrategia posibilitó un incremento de la eficiencia de secuenciación dentro del marco de un proyecto genómico de pequeña escala que apunta a la identificación de genes de utilidad para propósitos de mejoramiento y la búsqueda de marcadores funcionales. Como resultado, se obtuvieron clonotecas diferenciales a partir de hoja, tallo, raíz y flor en dos estadios de desarrollo (R1 y R4). El uso de diferentes fuentes de ARN como objeto o “tester” y referencia o “driver” fue de utilidad para la selección y detección de transcriptos poco abundantes. La especificidad órgano- específica varió dentro de un rango de 75 a 100% de las secuencias no- redundantes (unigenes) dentro de cada clonoteca de ADNc. La clonoteca correspondiente al estadio R4 de flor fue la menos redundante con un 62% de secuencias únicas y la que aportó el número más elevado de secuencias nuevas de girasol. El análisis bioinformático se llevó a cabo mediante la instalación de un servidor local (INTA 01) conteniendo las herramientas de distribución pública para la edición, análisis y ensamblado de secuencias como Phred/Phrap, CAP3 y algoritmos de comparación de secuencias como BLAST y el desarrollo de BioPipeline® una plataforma desarrollada en entorno Windows para el análisis automatizado de secuencias utilizando los mismos programas y algoritmos mencionados anteriormente. La información de secuencias generadas fue depositada en la base dbESTs de NCBI para su distribución pública. Para el manejo local de esta información se desarrolló una base relacional de tipo ACeDB para la integración de la información generada y su anotación funcional. Sobre un total de 919 secuencias que fueron editadas y anotadas, 318 representan secuencias únicas. Las comparaciones contra bases de datos públicos arrojaron un valor del 60% de secuencias no-redundantes con similitud a secuencias conocidas. El número de genes novedosos predichos varió según la clonoteca analizadas, en un rango que va de 56% en las clonotecas de flor estadio R4 al 16% en las de flor R1. Las comparaciones con los ESTs de girasol depositados y reportados en bases de datos mostraron que 197 secuencias (59,9%) del total) representaban secuencias nuevas, sin similitud significativa con secuencias conocidas. Este enfoque fue exitoso respecto del aislamiento de un número significativo de secuencias reportadas asociadas en su función inferida (probable) a caracteres de importancia agronómica, procesos regulatorios y fisiológicos clave. En una segunda etapa se abordó la evaluación de la expresión relativa simultánea de los transcriptos correspondientes a las secuencias de la base de ESTs desarrollada bajo diferentes condiciones de estrés abiótico utilizando la tecnología de micromatrices de ADN. Se imprimieron los fragmentos representativos de los 318 unigenes anotados en las clonotecas previamente descriptas en micromatrices sobre soporte de vidrio. Se evaluaron tres muestras biológicas tanto para tratamiento de frío (estrés térmico), tratamiento de salinidad (estrés salino) y controles representados por plantas crecidas en condiciones regulares. Estos estreses fueron seleccionados considerando al girasol como una planta con grado intermedio-alto de sensibilidad a bajas temperaturas en la zona radicular, así como también particularmente susceptible al desarrollo en condiciones de alta salinidad. El análisis transcripcional permitió detectar 3 grupos de genes bien diferenciados en sus patrones de expresión. Por una parte el Grupo 2, integrado por 126 genes, no mostró variación en sus niveles medios a través de los tratamientos. En cambio, el Grupo 1 (integrado por 112 genes) evidenció sobre- expresión respecto del control cuando las plantas fueron sometidas a estrés (por frío o por salinidad). De manera análoga, 49 genes conformaron el Grupo 3, pero en este caso se observó una sub-expresión respecto del control en ambos tratamientos. Dentro del grupos 1 y 3, se detectaron perfiles de expresión diferenciales para ambos tipos de estrés, siendo la sobre expresión y/o sub expresión de los genes evaluados más pronunciada en respuesta al estrés por frío respecto al estrés por salinidad. Finalmente, surgieron 80 genes candidato en la separación de tratamientos de acuerdo a su p-valor en la prueba de comparación de medias por análisis de la varianza y su ubicación en la región periférica del plano de ordenación generado por los dos primeros ejes principales de un Análisis de Componentes Principales (ACP) de la matriz de expresión génica escalada gen a gen por la desviación estándar residual del análisis de la varianza. De estos genes, 7 fueron validados por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Real Time PCR), habiéndose obtenido patrones transcripcionales similares con ambas estrategias de análisis La diferencia en expresión génica fue analizada en relación al origen de las secuencias en evaluación. Las secuencias provenientes de la colección de hoja mostraron en general patrones de subexpresión génica en respuesta a ambos estreses (la mayoría corresponden a genes asociados al proceso de fotosíntesis) mientras que las secuencias aisladas de colecciones de tallo o flor en estadio R4 mostraron patrones de inducción génica frente a los mismos estreses. Si se considera que los cambios transcripcionales en respuesta a frío y salinidad fueron evaluados en hoja, estos resultados confirman la eficiencia de la técnica de SSH utilizada para la generación de las colecciones de ADNc órgano específicas y explica la alta relación de transcriptos que muestra cambios en su perfil en respuesta a estreses en relación a los que no varían su nivel transcripcional en las condiciones evaluadas. Durante la segunda etapa de este trabajo se realizó un análisis de los 80 genes candidatos, detectándose 48 como sobre o sub expresados frente a uno u otro estrés, indicando la implicancia de mecanismos regulatorios comunes a ambos estreses. Asimismo 17 y 12 genes se detectaron inducidos o sub expresados específicamente frente a un estrés y no frente al otro. De acuerdo al análisis funcional comparativo estos genes estarían involucrados en mecanismos de regulación incluyendo procesos de transcripción, traducción, degradación/plegado o interacción de proteínas o asociados a mecanismos de generación y procesamiento de especies reactivas de oxigeno. De estas secuencias, 12 corresponden a secuencias con funcionalidad desconocida. Sólo 3 de las secuencias analizadas en este trabajo mostraron patrones transcripcionales opuestos incluyendo una con similitud a un transportador de lípidos. La información generada a partir de la caracterización del banco de ESTs constituye por una parte una fuente de información sobre genes candidatos involucrados en mecanismos de respuesta a estreses abióticos que pueden ser incluidos en ensayos de complementación en plantas transgénicas modelo y asimismo permite identificar secuencias nuevas no descriptas anteriormente para el desarrollo de marcadores funcionales a ser utilizados en programas de mejoramiento asistido de este cultivo

Abstract:
Sunflower is one of the most important oil crops worldwide regarding its production volume and composition in unsaturated fatty acids. However due to international price conditions and productivity respect to other crops, sunflower production is progressively expanding to arid regions worldwide. Consequently, abiotic stresses as drought, low temperatures and salinity arise as main constrains nowadays. Sunflower is considered a medium-high tolerant plant crop to low temperatures in the radial zone and sensitive to saline environment. Compared to other crops such as rice, maize, soybean, tomato, wheat, potato and barley genetic and genomic sunflower knowledge was limited until the onset of the present decade. However, in parallel to the advance of this thesis (last five years), different projects aimed to the genome analysis of cultivated sunflower and its related wild species, resulted in a significant increase of the number of available expressed and genome sequences in public databases. The objective of this work was to develop tools for structural and functional analysis of cultivated sunflower through the development of a model organ-specific ESTs ("expressed sequence tags") database, the creation and actualization of a bioinformatics platform to characterize transcriptional profiles of the represented genes in response to abiotic stress conditions with the aim to identify novel genes as a source of functional molecular markers associated to important traits, under the scope of an alternative, cost-effective strategy to high-throughput sequencing projects. In the first stage of this work a low scale sequencing strategy based on suppressed subtracted hybridization method was evaluated for the construction of organ- specific cDNA libraries in order to identify differentially expressed genes in sunflower Differential organ-specific ESTs were generated from leaf, stem, root and flower bud at two developmental stages (R1 and R4). Organ-specificity ranged from 75 to 100% of non-redundant sequences in the different cDNA libraries. Sequence redundancy varied according to the target and driver cDNA used for each library. The R4 flower cDNA library was the less redundant library with 62% of unique sequences. Bioinformatics analysis was achieved through the development of BioPipeline®, a bioinformatic tool for sequence quality analysis, contaminant sequence removal and sequence assembly and automatic annotation based on the utilization of free available software as Phred/Phrap, CAP3 and BLAST algorithms using a local server installed at the Institute of Biotechnology, INTA01. Processed sequences were deposited for public distribution in the dbEST database at NCBI. Biological information related to these sequences was locally stored using an ACeDB-based relational database as a laboratory information management system. Out of a total of 919 sequences that were edited and annotated, 318 were non redundant sequences. Comparison against sequences in public databases showed that 60% of non redundant sequences showed significant similarity to known sequences. The number of predicted novel genes varied among the different cDNA libraries, ranging from 56% in the R4 flower to 16 % in the R1 flower bud library. Comparison with sunflower ESTs on public databases showed that 197 of non- redundant sequences (60%) did not exhibit significant similarity to previously reported sunflower ESTs. This approach helped to successfully isolate 33 newly reported unique sequences for sunflower putatively related to responses to biotic and/or abiotic stresses. Application of suppressed subtracted hybridization technology not only enabled the cost effective isolation of differentially expressed sequences but it also allowed the identification of novel sequences in sunflower from a relative small number of analyzed sequences when compared to major sequencing projects. In a second stage, functional genomic studies were performed using microarray technology. A cDNA glass slide chip containing the 318 organ-specific unigenes was constructed in order to evaluate the expression profile under cold and salinity stress conditions. Three biological leaf samples from treated plants, exposed either to low temperatures or watered with NaCl solution, as well as control plants grew under standard condition, were evaluated by hybridization of fluorescence labeled treated and control RNA to target genes. Transcriptional analysis allowed the detection of three groups of genes well differentiated in their expression profiles during the exploratory analysis. One group composed by 126 genes did not show variation along treatments; a second group composed by 112 genes showed evidence of up-regulation under abiotic stress (cold or salinity), whereas a SUB- regulation in both treatments was observed in the 49 genes belonging to a third group. During the second phase of this analysis, 80 candidate genes were identified according to the p-value obtained by classical ANOVA and their peripheral location in the PCA analysis of the gene matrix. Seven genes were experimentally validated by quantitative real time PCR (qRT-PCR) being the transcriptional patterns derived from the two methods highly similar in all cases. Differences in genes expression were analyzed according to the differential organ-specific cDNA library from which they were isolated. While differential leaf library sequences showed the majority of genes sub-regulated (most of them corresponding to photosynthesis or general metabolism related genes), R4 flower developmental stage and stem libraries showed a larger number of up-regulated genes. Considering that transcriptional changes in response to salt and cold stresses were evaluated in leaf tissue, these results confirmed the efficiency of SSH technique in the generation of the differential organ specific libraries and explained the large transcription change / transcription unchanged ratio detected in these assays. Within the 80 candidate a large number of evaluated sequences (48) were either up-regulated or sub-regulated under both abiotic stresses, thus supporting common regulatory mechanisms and general responses to low temperature and salinity. Interestingly 17 sequences were specifically up regulated and 12 were specifically sub-regulated in one stress but not in the other. These genes are potentially involved in different regulatory mechanisms including transcription / translation / protein degradation / protein folding or correspond to genes involved in ROS production or ROS-scavenging and some of them (12) did not show similarity to reported gene products. Only three of the evaluated sequences in this work showed an inverted transcriptional pattern under cold and salinity stress, including one with similarity to a LTP transcript. The information obtained from this EST library characterization not only contributed as a major source of knowledge about candidate genes involved in the mechanisms of abiotic stress responses in sunflower that can be incorporated in future complementary gene studies in model or sunflower transgenic plants but also allows the detection of new putative functional markers as a key tool for marker assisted selection in sunflower.

Frankel, Nicolás. "Aproximación a la evolución y función de la familia génica Asr" (2006) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los genes Asr están presentes en plantas con semilla formando, en general, familias génicas de pocos miembros. Su función precisa es desconocida hasta el momento, pero estudios recientes llevan a pensar que estos genes son factores de transcripción involucrados en la regulación del transporte de azúcares en la planta. En esta tesis hemos analizado la evolución de la familia génica Asr en plantas con semilla con un especial énfasis en el género Lycopersicon (tomates). Encontramos que las relaciones de ortología de las proteínas ASR pueden definirse sólo entre especies cercanas evolutivamente. En un árbol filogenético, las proteínas ASR de tomate y papa forman un cluster consistente, separado de las ASR de otras dicotiledóneas, monocotiledóneas y gimnospermas. Las dos observaciones anteriores pueden explicarse por eventos de evolución concertada y “nacimiento y muerte” de genes. Asimismo, investigamos la evolución de los cuatro Asr en especies silvestres de tomate y pudimos comprobar que Asr1 tiene una evolución más lenta que los otros tres genes, tanto a nivel sinónimo como de reemplazo. Creemos que este patrón se debe a sus altos niveles de expresión y a sus diversas funciones en distintos tejidos de la planta. Además, hemos generado plantas transgénicas de papa (Solanum tuberosum) y tabaco (Nicotiana tabacum) que sobreexpresan o tienen silenciado el gen Asr1. Del análisis de estas plantas podemos concluir que este gen regula los niveles de hexosas en la célula, pero no de otros azúcares. En este sentido, tenemos evidencias que indican que Asr1 estaría directa o indirectamente controlando los niveles de algunos transportadores de hexosas en tejidos “destino”, por lo tanto actuando como regulador de la importación de estos azúcares. Por último, por medio de microscopia de fuerza atómica, observamos el pegado de la proteína ASR1 al ADN. Confirmando evidencia previa, vimos dímeros de ASR1 interaccionando con un ADN doble cadena.

Abstract:
Asr genes are present in the genomes of seed plants, in general forming small gene families. Their precise function is currently unknown, but recent reports have suggested that Asr genes encode transcription factors involved in the regulation of sugar mobilization in planta. In this thesis we have analyzed the evolution of the Asr gene family in seed plants and particularly focused in the genus Lycopersicon (tomatoes). We have found that the orthology relations among the members can only be inferred between closely related species. In a phylogenetic tree, ASR proteins from tomato and potato form a consistent cluster, separated from ASRs from other dicots, monocots and gymnosperms. These observations can be explained by events of concerted evolution and “birth and death of genes”. At the same time, we investigated the evolution of the four Asrs in tomato wild species. We could see that Asr1 has a slower evolutionary rate both at synonymous and replacement sites when compared to the other three genes. We think that this pattern is caused by its high expression level and multiple functions in different tissues of the plant. In addition, we generated potato (Solanum tuberosum) and tobacco (Nicotiana tabacum) transgenic plants that overexpress or silence Asr1 gene. From the analysis of these plants we can conclude that this gene is regulating the quantities of hexoses (but not other sugars) in the cells. In this direction, we have evidence supporting that Asr1 would be directly or indirectly involved in controlling the levels of hexose transporters in “sink” tissues, thereby acting as a regulator of hexose uptake. Finally, by means of atomic force microscopy, we observed ASR1 protein bound to DNA. Corroborating previous evidence, we saw ASR1 dimers interacting with double-stranded DNA.

Guazzone, Vanesa Anabella. "Estudio de las moléculas de adhesión celular y quemoquinas involucradas en el tráfico leucocitario en un cuadro de orquitis autoinmune experimental" (2006) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los cuadros de inflamación e infección del aparato reproductor masculino constituyen una de las principales causas de infertilidad. La orquitis autoinmune experimental (OAE) fue inducida por inmunización activa, en la rata, con antígenos espermáticos y adyuvantes y constituye un modelo útil para estudiar inflamación testicular y autoinmunidad específica de órgano. La OAE se caracteriza por la presencia de un infiltrado linfomonocitario intersticial y lesión de los túbulos seminíferos con células germinales que sufren apoptosis y descamación. Nos propusimos estudiar, en la OAE, las principales quemoquinas y moléculas de adhesión involucradas en la migración y extravasación de linfomonocitos. Mediante técnicas de ELISA se detectó, en las ratas con orquitis, respecto de controles, un aumento en la concentración testicular de MIP-1? durante el período de inmunización mientras que MCP-1 aumentó durante el desarrollo completo del cuadro incluyendo el período de lesión severa. Se observó un aumento en el número de linfomonocitos testiculares que expresan los receptores específicos de dichas quemoquinas, CCR2 y CCR5. Por citometría de flujo, se detectó una disminución en el número linfomonocitos CD44+ en sangre periférica, simultánea a un aumento de dichas células en el intersticio testicular. A nivel del endotelio testicular, aumentó el número de células PECAM-1+ que expresan VCAM-1. Los resultados sugieren que las quemoquinas y moléculas de adhesión estudiadas constituyen un componente del circuito de amplificación de la respuesta inmune, esencial para el reclutamiento linfomonocitario y la inducción de una orquitis autoinmune severa, en el contexto de una inflamación crónica.

Abstract:
Inflammation and infection of the genital tract is one of the leading causes of male infertility. We have developed an experimental model of autoimmune orchitis (EAO) in rats by active immunization with spermatic antigens and adjuvants, a useful model to study organ specific autoimmunity and to analyze testis inflammation. This disease is characterized by interstitial lymphomononuclear cell infiltrates and severe damage of seminiferous tubules with apoptosis and sloughing of germ cells. The aim of this work was to detect the main chemokines and cell adhesion molecules involved in leukocyte extravasation in this model. By ELISA we detected in rats with EAO an increase in the testicular content of MIP-1? during the immunization period and of MCP- 1 during the development of the disease including the period of severe testicular damage. We also observed an increase in the number of testicular cells CCR2+ o CCR5+, specific chemokine receptors. By flow cytometry we detected a decrease in the number of CD44+ lymphomonocytes from peripheral blood concomitant with an increase of these cells in the testicular interstitium. Rats with EAO showed a significant increase in the number of PECAM-1+ testicular endothelial cells that express VCAM-1. Results suggest that the chemokines and cell adhesion molecules analyzed constitute part of an amplification circuit of the immune cell response essential, for leukocyte recruitment and induction of severe autoimmune orchitis, in the context of a chronic testicular inflammation.

Blaustein Kappelmacher, Matías. "Regulación post-transcripcional de la expresión génica por señales extracelulares" (2007) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El splicing alternativo del precursor del RNA mensajero es una fuente extraordinaria de diversidad proteica y la regulación de este proceso es crucial para diversas funciones celulares tanto en situaciones fisiológicas como patológicas. Sin embargo, poco se sabe acerca de las señales y vías que regulan el splicing alternativo. Un modelo relevante de este proceso es provisto por la fibronectina, que contiene tres regiones de splicing alternativo conocidas como EDI, EDII y IIICS. Encontramos que diferentes factores de crecimiento estimulan la inclusión de EDI y de IIICS pero no la de EDII en el RNA maduro de la fibronectina en diferentes líneas celulares, favoreciendo isoformas de fibronectina asociadas con la proliferación, migración y remodelado de tejidos. Caracterizamos a la vía de supervivencia Ras-fosfatidilinositol 3-quinasa-AKT/Proteína quinasa B como la principal responsable de esta regulación. Mostramos que los factores de crecimiento gatillan la fosforilación de proteínas ricas en serina/arginina tales como SF2/ASF y 9G8, las cuales son importantes reguladores del splicing y probamos que AKT/Proteína quinasa B funciona como una proteína quinasa de proteínas ricas en serina/arginina. Asimismo, mostramos que los factores de crecimiento no sólo modifican el patrón de splicing alternativo de la fibronectina sino que también alteran la traducción de RNAs reporteros conteniendo una secuencia de EDI responsable de la unión de proteínas ricas en serina/arginina, sugiriendo dos niveles co-regulados de amplificación específica de isoforma. Tanto la regulación del splicing como la de la traducción en respuesta a factores de crecimiento son inhibidas por RNAs pequeños de interferencia contra SF2/ASF y 9G8. Finalmente, mostramos que SF2/ASF es capaz de regular la diversidad proteómica alterando el balance entre diferentes mecanismos de iniciación de la traducción, expandiendo aún más su ya descripto potencial para aumentar el repertorio proteico.

Abstract:
Alternative splicing of messenger RNA precursors is an extraordinary source of protein diversity and the regulation of this process is crucial for diverse cellular functions in both, physiological and pathological situations. However, little is known about signals and pathways regulating alternative splicing. A relevant model of this process is provided by fibronectin, which contains three alternatively spliced regions known as EDI, EDII and IIICS. We found that different growth factors stimulate EDI and IIICS but not EDII inclusion into fibronectin mature RNA in different cell lines, favoring fibronectin isoforms associated with proliferation, migration and tissue remodeling. We characterized the Ras-phosphatidylinositol 3-kinase-AKT/Protein kinase B survival pathway as the main contributor to this regulation. We show that growth factors trigger phosphorylation of serine/arginine-rich proteins such as SF2/ASF and 9G8, which are important regulators of splicing and prove that AKT/Protein kinase B functions as a serine/arginine-rich protein kinase. We also show that growth factors not only modify fibronectin alternative splicing pattern but also alter translation of reporter RNAs containing an EDI sequence responsible for serine/arginine-rich binding, suggesting two co-regulated levels of isoform-specific amplification. Both, regulation of splicing and translation by growth factors are inhibited by small interfering RNAs against SF2/ASF and 9G8. Finally, we show that SF2/ASF regulates proteomic diversity by altering the balance between different translation initiation mechanisms, expanding its already described potential to increase protein repertoire even further.

Feld, Mariana. "Rol de la vía de MAPKs en distintas fases de la memoria. Implicancias en la señalización intracelular de ß-amiloide" (2007) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El objetivo de esta tesis fue en primer lugar, estudiar el rol de las proteína- quinasas activadas por mitógenos (MAPK) en distintas fases de la formación de la memoria en el paradigma de Memoria Contexto–Señal (MCS) del cangrejo Chasmagnathus. En segundo lugar, una vez establecida la participación de estas quinasas en dicho modelo, evaluar su rol en la interferencia sobre la memoria ejercida por péptidos β-amiloide de origen humano en este paradigma de memoria en invertebrados. Se observó activación de ERK 1 h luego de un entrenamiento espaciado (que induce formación de una memoria de largo término ) en fracciones citosólicas pero no nucleares. Dos entrenamientos control (que no inducen MLT) evidenciaron activación de ERK y JNK citosólicas inmediatamente luego del entrenamiento, decayendo 1 h después. En concordancia, un inhibidor de la vía de ERK1/2 (PD098059) indujo amnesia durante la evaluación de la MLT, solo cuando fue administrado 45 min después del entrenamiento, y no inmediatamente pre- o post-entrenamiento, o cuando se evaluó la memoria de corto término (MCT). Dosis muy bajas de fibrillas de Aβ naturalmente secretadas (FN) impidieron la retención de la memoria solo cuando fueron administradas peri-entrenamiento, e indujeron activación generalizada de ERK/MAPK 1 h luego de su administración. La inyección de péptidos sintéticos de βA1-42 y βA3-42 fibrilados (pero no oligomerizados) resultó amnésica. Sin embargo, no se observó este efecto por administración de βA1-40 o βA11-42 fibrilados. En conclusión, la consolidación de la MLT, a diferencia de su reconsolidación o de la MCT, requiere la fosforilación diferencial de sustratos extra-nucleares de ERK en este modelo. Aβ parece inducir alteraciones fisiológicas y transitorias en el cerebro, más que permanentes y neuropatológicas, dada la especificidad temporal y de vías de señalización implicadas a partir de la administración de bajas dosis de fibrillas. Este efecto específico sobre la memoria está mediado, al menos en parte, por la activación generalizada de ERK que interferiría con la consolidación de la memoria.

Abstract:
This thesis was aimed firstly at studying the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK) in different phases of memory formation in the Context–Signal Memory (CSM) paradigm of the crab Chasmagnathus. Secondly, having established the kinase ́s participation in this model, another objective was to evaluate their role in human β-amyloid-induced memory interference in this invertebrate memory paradigm. ERK activation was disclosed 1 h after spaced training (which induces long-term memory formation) in cytosolic but not nuclear fractions. Two control trainings (which do not induce long-term memory formation) showed cytosolic activation ERK and JNK immediately after training, decaying 1 h later. Accordingly, an ERK1/2 pathway inhibitor (PD098059) induced amnesia during LTM testing, only when administered 45 min after training, but not immediately pre- or post-training, or when short-term memory (STM) was assessed. Very low doses of naturally secreted Aβ fibrils (NF) impaired memory retention in the crab only when administered peri-training, and induced generalized ERK/MAPK specific activation 1 h after administration. Synthetic fibrillated but not oligomerized Aβ1-42 and Aβ3-42 administration induced amnesia. However, no amnestic effect was found after fibrillated Aβ1-40 and Aβ11-42 peptides administration. In conclusion, extra-nuclear ERK substrates must be differentially phosphorylated during memory formation, and this function is necessary for LTM consolidation, but not for reconsolidation or STM, in this model. Transient physiological, rather than permanent neuropathological, alterations of the brain seem to be induced by Aβ, given the temporally- and signaling-specific effects of low doses of fibrils administered. This specific effect on memory involves, at least in part, generalized ERK activation, which would impair memory consolidation.

Ceruti, Julieta María. "Proteínas INK4 en el mantenimiento de la integridad del genoma : participación de p19INK4d en los mecanismos de reparación del DNA en células neuronales" (2007) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En neuronas, así como en otras células somáticas la progresión a través de la fase G1 del ciclo celular depende de la actividad de las enzimas CDK4 y CDK6, y luego, de CDK2. La familia INK4 incluye a cuatro polipéptidos, p16, p15, p18 y p19, los cuales se unen e inhiben específicamente CDK4/CDK6. A pesar de ser estructuralmente redundantes e igualmente potentes como inhibidores, cada uno se expresa diferencialmente durante el desarrollo en ratón. Además, distintos inhibidores han sido implicados en la inducción de la diferenciación terminal, la senescencia y la apoptosis. La gran diversidad en el patrón de expresión, sugirió que estos inhibidores podrían tener funciones específicas de tipo celular o de tejido. En el sistema nervioso central p19 es una de las INK4 mayoritaria. Es expresada tempranamente durante el desarrollo en el cerebro y allí su expresión es mantenida en la adultez. Aparte de sus roles fisiológicos, las proteínas INK4 se encuentran comúnmente perdidas o inactivadas por mutaciones en diversos tipos de cáncer. En este estudio, investigamos el rol de p19 en la respuesta celular frente al daño del DNA con distintos agentes genotóxicos en células de neuroblastoma humano SHSY5Y y otros tipos celulares. Al contrario de las otras INK4, solamente la expresión de p19 es periódica a lo largo del ciclo. En este trabajo demostramos que p19 es la única INK4 cuya expresión es inducida por UV en células de neuroblastoma, que esta inducción se da a nivel transcripcional y que requiere parcialmente la síntesis de proteínas. Además, observamos la translocación de p19 desde el citoplasma al núcleo luego de la irradiación con UV. La sobrexpresión de p19 claramente reduce la apoptosis inducida por el daño y mejora la eficiencia de la reparación del DNA. Experimentos llevados a cabo con mutantes de CDK4, con mimosina o en células Saos-2, sugieren que estos efectos de p19 serían independientes de su rol como controlador del ciclo. Además, con ensayos clonogénicos y de supervivencia celular, observamos que p19 influencia la sensibilidad celular a largo plazo y confiere resistencia al estrés genotóxico. Estos resultados descubren una nueva función de p19 como regulador del nivel de apoptosis inducida por daño en el DNA, sugiriendo que p19 protegería a las células de morir por apoptosis mediante el aumento en la eficiencia de reparación del DNA. Postulamos que p19 pertenecería a una red proteica integrando la reparación del DNA, la apoptosis y los checkpoints del ciclo celular para mantener la integridad genómica.

Abstract:
In neurons, as in other somatic cells, progression through the G1 phase of the cell cycle depends upon the activities of CDK4/6, and later, upon the activity of CDK2. The INK4 family includes four polypeptides, p15, p16, p18 and p19 that specifically bind to and inhibit CDK4/6. Although they are structurally redundant and equally potent as inhibitors, members of the INK4 family are differentially expressed during mouse development. Moreover, different inhibitors have been implicated in regulating terminal differentiation, senescence or apoptosis. The striking diversity in the pattern of expression, suggests that this family of cell cycle inhibitors might have cell-lineage or tissue- specific functions. In the central nervous system, p19 is one of the major INK4 proteins. It is expressed early during brain development and its expression is mantained into adulthood. Apart from their physiological roles, the INK4 proteins are commonly lost or inactivated by mutations in diverse types of cancer. In the present study, we investigated the role of p19 in the response driven by human neuroblastoma cells, against DNA injury caused by different genotoxic agents. In contrast to the other INK4, p19 expression is periodic through the cell cycle. In this work, we demonstrated that p19 is the only INK4 protein whose expression is induced by UV in neuroblastoma cells, that this induction acts at the transcriptional level and partially requires protein synthesis. Furthermore, we observed p19 translocation from cytoplasm to nucleus after UV irradiation. Ectopic expression of p19 clearly reduces DNA damage induced apoptosis and improves the cellular ability to repair DNA lesions. Experiments performed with a CDK4 mutant, or with mimosine, or Saos-2 cells, suggest that p19 exerts its effects independently of its role as a cell cycle checkpoint gene. Moreover, performing clonogenic and viability assays we observed that p19 influences the long term cellular sensibility and confers resistence to genotoxic stress. These results uncover a new role for p19 as regulator of DNA damage induced apoptosis and suggest that p19 might protect cells by allowing a more efficient DNA repair. We postulate that p19 would belong to a protein network that integrates DNA repair, apoptosis, and cell cycle checkpoints to surveil and maintain genome integrity.

Bottino, María Cecilia. "Efectos genómicos y no genómicos de progestágenos en carcinomas mamarios murinos en estadíos diferentes de hormono-dependencia" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los estrógenos y la progesterona se unen a sus respectivos receptores para ejercer su acción. Los receptores para hormonas esteroides fueron históricamente considerados nucleares, sin embargo existen evidencias en la actualidad de un rol no-genómico de los mismos, ejercido a través de su localización en membrana. Si bien ya se ha descripto la presencia de receptores clásicos en membrana para estrógenos y glucocorticoides, aún no se han encontrado para la progesterona. El estudio del mecanismo de acción de los hormonas esteroideas sexulaes así como también de sus receptores específicos, receptores de estrógenos (RE) y de progesterona (RP), es sumamente importante en el campo de la oncología mamaria ya que en la clínica, la expresión de estos receptores es un parámetro esencial para determinar el tratamiento a seguir. En nuestro laboratorio se ha desarrollado el modelo experimental de obtención de adenocarcinomas mamarios murinos de origen ductal inducidos por administración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembra BALB/c. Se establecieron líneas tumorales hormono-dependientes (HD) y hormono-independientes (HI) que expresan altos niveles de RE y RP. En estudios previos describimos dos sitios de unión a progesterona, el sitio clásico de alta capacidad, y otro nóvel de mayor afinidad y baja capacidad. El objetivo de este trabajo fue estudiar la presencia de los RP en la membrana celular de tumores HD y HI, y su participación en efectos genómicos y no- genómicos. Observamos la localización en membrana de ambas isoformas del RP y demostramos que, tanto agonistas como el antagonista RU-486, regulan por igual la distribución de los RP en la membrana y en el núcleo celular a tiempos cortos. Además, demostramos la expresión de los receptores nóveles para progesterona, recientemente descriptos, que también tienen localización en la membrana: mPRα, mPRβ y mPRγ. Se ha demostrado que la activación de los mismos induce una disminución de AMPc. Estudiamos dos vías paradigmáticas de señalización, como la activación de ERK 1/2 y la regulación de AMPc, que resultaron ser activadas tanto por MPA como por RU-486. Teniendo en cuenta que los receptores nóveles no se activan con estos ligandos, se sugiere la participación del RP clásico localizado en la membrana celular. Además detectamos que la progesterona, el agonista natural del RP, es capaz de desencadenar los mismos efectos que el MPA. Por último, analizamos el efecto biológico desencadenado por el antagonista y observamos que el tratamiento de un cultivo primario con RU-486 a concentraciones menores al Kd del receptor generó un efecto proliferativo, mientras que a concentraciones iguales o mayores que el Kd clásico, su efecto fue inhibitorio. Resumiendo, los efectos finales de la activación de RP localizado en la membrana celular difieren según la concentración de la hormona utilizada. En el caso del MPA, su efecto biológico es siempre proliferativo, sin importar la concentración utilizada. Cuando el tratamiento se realiza con RU-486, el resultado de la activación de estas vías depende de la concentración de hormona utilizada. Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren el uso de dosis de antiprogestágenos en el tratamiento del cáncer que garanticen la obtención de efectos genómicos.

Abstract:
Estrogen and progesterone bind to their respective receptors to initiate their action. The steroid receptors were historically considered as nuclear, however, nowadays, many evidences suggest they may play a non-genomic role through their membrane localization. The understanding of the mechanisms related to hormone action has become a very important issue in the breast cancer field since the level of estrogen (ER) and progesterone receptors (PR) determine the therapy selection. In our laboratory, we have developed an experimental model of murine ductal mammary adenocarcinomas induced by the administration of medroxyprogesterone acetate (MPA), in BALB/c mice. We have established hormone-dependent (HD), and hormone-independent (HI) lines, both expressing high levels of ER and PR. In previous studies, we have described two binding sites to progesterone, the classical one, with a high capacity, and a novel site with higher affinity and lower capacity. The aim of this work was to study the presence of PR at the cell membrane of HD and HI tumors, and to study their role mediating genomic and non-genomic effects. We have detected both PR isoforms located at the cell membrane. We also demonstrated a similar distribution of membrane and nuclear PR after priming with MPA or with the antagonist RU-486. We have also detected the presence of the novel progesterone receptors mPR α, mPR β and mPR γ. The activation of these receptors has been reported to be associated with a decrease in cAMP levels. We have studied two paradigmatic signaling pathways, ERK 1/2 activation and cAMP regulation, that were similarly activated by MPA and RU-486, suggesting that the classical PR located at the cell membrane might be responsible for this effect. Progesterone was as efficient as MPA inducing ERK activation. These data, showing similar rapid effects mediated by agonist and antagonist prompted us to investigate the role of low concentrations of antagonist in cell proliferation. As expected, concentrations of RU-486 lower than those able to bind the classical PR to elicit the genomic effects, were able to stimulate cell proliferation, while higher concentrations were inhibitory. To sum up, our results suggest the presence of classical PR at the cell membrane of murine mammary carcinomas. The activation of these receptors with agonists or antagonists regulates non genomic pathways and PR distribution. In the case of MPA and progesterone, their biological effect is always proliferative, no matter the concentration used to treat the cells. RU-486, on the other hand, at low concentrations, not high enough to activate the classical binding site, will elicit only the proliferative signals, at higher concentrations, in spite of activating MAPK it will induce an inhibition of cell proliferation. These results suggest that in the clinic, concentrations high enough to activate the classic nuclear PR should be use to inhibit tumor growth.

Wengier, Diego Leonardo. "Aislamiento y caracterización del ligando del pistilo que interactúa con el sistema de receptores quinasa LePRK1 y LePRK2 de polen de Solanum lycopersicon (tomate)" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los LePRKs son receptores quinasa que se localizan en la membrana plasmática de polen, posiblemente mediando interacciones polen-pistilo. Previamente, hemos demostrado que LePRK2 se encuentra fosforilada en polen maduro y germinado, y se desfosforila cuando microsomas de polen son incubados con extractos de estigma-estilo. Esto sugiere que por lo menos LePRK2 podría estar transduciendo una señal del pistilo a través de la actividad de LePRK2. En esta tesis, mostramos que la desfosforilación de LePRK2 está mediada por una molécula proveniente del pistilo resistente al tratamiento térmico, alcalino y proteasas. Basándonos en la desfosforilación de LePRK2, desarrollamos un protocolo de purificación con el cual obtuvimos un pico aislado de ~3550 Da (determinado por UV-MALDI-TOF MS) correspondiente a esta molécula peptídica que nombramos MrX. Con el fin de evaluar los efectos de MrX en tubos polínicos en crecimiento, realizamos ensayos de germinación in vitro en presencia de MrX parcialmente purificado y determinamos la longitud del tubo polínico como marcador del estado fisiológico. La adición de MrX al medio de germinación resultó en un aumento del largo del largo del tubo polínico en una forma dependiente de la dosis, mientras que las fracciones control no tuvieron efecto alguno. Nuestra hipótesis plantea que las interacciones polen-pistilo a través del complejo de LePRKs involucran la percepción de MrX por LePRK2, seguido de una desfosforilación de ésta y un incremento de la tasa de crecimiento del tubo polínico.

Abstract:
LePRK1 and LePRK2 are pollen specific receptor kinases that belong to a plasma membrane high molecular weight complex possibly involved in pollen-pistil interactions. Previously, we have shown that LePRK2 is phosphorylated in mature and germinated pollen grains, but is dephosphorylated when pollen microsomes are incubated with stigma-style extracts. This suggests that LePRK complex might be transducing a signal from pistils through LePRK2 activity. In this thesis, we show that LePRK2 dephosphorylation is mediated by a heat-, base- and protease-resistant molecule from pistils. Based on LePRK2 phosphorylation, we developed a purification protocol and obtained an isolated peak of ~3550 Da peptidic compound (as determined by UV-MALDI-TOF MS) that we named MrX. In order to assess the effects of MrX on growing pollen tubes, we did in vitro germination assays in the presence of partially purified fraction of MrX and determined pollen tube length as a marker of the physiological state. MrX addition to germination medium resulted in pollen tube length increase in a dose-dependent manner, but not when pollen grains were incubated with control fractions. We hypothesize that pollen-pistil interactions through LePRK complex involve MrX perception by LePRK2, followed by LePRK2 dephosphorylation and an increase in pollen tube growth rate.

Valdivieso, Angel Gabriel. "Modulación de la expresión del gen MTND4 mitocondrial mediada por la actividad del CFTR" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva producida por mutaciones en el gen que codifica el canal de cloruro CFTR. Mediante la metodología de “Differential Display” (DD) detectamos que la expresión del gen mitocondrial MTND4 está regulada negativamente en FQ. MTND4 es un gen que codifica para la subunidad ND4 del Complejo I mitocondrial (CIm). Esta subunidad es fundamental para la correcta actividad del CIm. Nuestro objetivo principal fue determinar si la reducción de la expresión de MTND4 en FQ induciría una falla en la actividad del CIm. Primero, validamos los resultados del DD mediante RT-PCR semi-cuantitativa en células FQ (CFDE) así como también en células donde la expresión del CFTR había sido corregida (CFDE/6RepCFTR) y en células CFDE/6RepCFTR tratadas con inhibidores de la actividad del CFTR (glibenclamida y CFTR(inh)- 172). A su vez, medimos la actividad del CIm mediante la técnica “Blue Native- PAGE”, en mitocondrias extraídas desde diferentes modelos de células FQ. Así, observamos una disminución significativa de la actividad del CIm en los distintos modelos FQ. También detectamos un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células FQ, mediante la sonda diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). Finalmente, medimos el número de copias de ADN mitocondrial (ADNmt) mediante “Real-Time”-PCR para determinar si existía una disminución en el número de copias que pudiese explicar la reducción de la expresión de MTND4. Sin embargo, no encontramos diferencias significativas entre las células FQ y sus controles. Nuestros resultados sugieren que existe una relación causal entre la falla del CFTR y la disminución de la expresión de MTND4. Esta disminución en la expresión de MTND4 está acompañada de una reducción en la actividad del CIm y por un aumento en la producción de ROS, lo que podría tener un rol trascendental en los procesos inflamatorios y apoptóticos observados en FQ, para los cuales no se conocen los mecanismos ni las implicancias fisiopatológicas.

Abstract:
Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene encoding CFTR chloride channel. By using the "Differential Display” (DD) methodology, we detected that MTND4 gene expression is downregulated in CF. MTND4 is a mitochondrial gene encoding for the ND4 subunit of mitochondrial Complex I (mCI). This subunit is essential for correct activity of mCI. Our main objective was to determine whether reduced expression of MTND4 in CF induces a failure in the activity of the mCI. First, we validate the DD results by semi-quantitative RT-PCR in CF cells (CFDE) as well as in CFDE cells where CFTR expression has been corrected (CFDE/6RepCFTR) and in CFDE/6RepCFTR cells treated with inhibitors of the CFTR activity (glibenclamide and CFTR(inh)-172). In addition, we measured the mCI activity by using the Blue Native-PAGE technique, on mitochondria extracts from different CF models cells. Thus, we observed a significant decrease in the mCI activity in the different CF models. We also detected, through diacetate 2',7'- dichlororofluorescein probe (DCFH-DA), an increase in the production of reactive oxygen species (ROS) in the different CF cells. Finally, we measured the copy number of mitochondrial DNA (mtDNA) by Real-Time-PCR to determine if there was a decrease in the number of copies that could explain the reduction in the MTND4 expression. However, we found no significant differences between the CF cells and their controls. Our results suggest a causal relationship between CFTR failure and MTND4 decreased expression. This decrease in the MTND4 expression is accompanied by a reduction in the mCI activity and an increased ROS production, which could have an important role in inflammatory and apoptotic processes observed in CF, for which there are no known mechanisms and pathophysiological implications.

Quaglino, Ana. "Estudio de la regulación de la expresión y activación de factores relevantes en la involución mamaria y el desarrollo tumoral. El rol del estrés mecánico en estos procesos" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En la mama normal, LIF es el principal activador del factor de transcripción STAT3,responsable de inducir la apoptosis del epitelio secretorio durante la involución. En el cáncer de mama STAT3 se encuentra frecuentemente activo aunque su rol biológico es aún controversial. En este trabajo nos propusimos evaluar si el LIF producido localmente es responsable de la activación de STAT3 en tumores mamarios murinos. Por estudios in vivo e in vitro determinamos que LIF se sobre-expresa en estos tumores, donde actúa como principal activador de STAT3. Encontramos además que LIF ejerce un efecto opuesto en células normales y tumorales, inhibiendo e induciendo, respectivamente, la supervivencia celular. A continuación, decidimos evaluar si el estrés mecánico inducido por la acumulación de leche al final del amamantamiento dispara la expresión de factores relevantes en la involución y tumorigénesis mamaria. Para ello, diseñamos un dispositivo que permite “estirar” radialmente células creciendo en cultivo sobre membranas elásticas. Encontramos que el estímulo mecánico es capaz de disparar en células mamarias la activación de cascadas de señales y la expresión de genes fundamentales en la involución y el desarrollo tumoral. En conjunto, nuestros resultados brindan nuevas evidencias de la importancia de los factores locales en la regulación de procesos normales y patológicos de la glándula mamaria.

Abstract:
It has been demonstrated that LIF induces epithelium apoptosis through STAT3 activation during mouse mammary gland involution. Although STAT3 is frequently activated in breast cancer, its biological role is controversial. In this work, we evaluated if locally produced LIF can be responsible for STAT3 activation in mouse mammary tumors. In in vivo and in vitro studies we observed that LIF is over- expressed in mouse mammary tumors, where it acts as the main STAT3 activator. Furthermore, we found that LIF has opposite effects on normal and tumor epithelial cells by inhibiting or inducing cell survival, respectively. Then, we decided to evaluate if cell stretching caused by milk accumulation after weaning, triggers the expression of relevant factors in mammary gland involution and tumorigenesis. To address this issue, we designed a practical device that radially stretches mammary epithelial cells growing on elastic membranes in culture. We found that mechanical strain is able to trigger signaling cascades activation and gene expression relevant in involution and tumor development. Together, these findings provide new evidence about the critical role of local factors in regulating normal and pathological processes in the mammary gland.

Valacco, María Pía. "Avances en el estudio de las funciones de p8 a través del análisis de su localización subcelular y de la identificación de sus proteínas interactoras" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
p8 es una proteína de 8 kDa que fue identificada en rata debido a su inducción durante la fase aguda de la pancreatitis. Los niveles de expresión de p8 aumentan en líneas celulares en respuesta al estrés y a factores mitogénicos. Se postula un rol importante para p8 en la progresión tumoral, ya que, al anular su expresión en fibroblastos transformados, se inhibe el desarrollo tumoral. El objetivo de este estudio es comprender más profundamente las funciones de p8 así como las vías celulares en las que está involucrada. Un análisis de homología de secuencias nos permitió identificar a p8 en diferentes especies de eucariotas superiores, y no en eucariotas inferiores. Se encontró una NLS (señal de localización nuclear) altamente conservada en su secuencia. Ensayos de inmunocitoquímica nos permitieron estudiar su localización subcelular. Observamos que se encuentra nuclear en cultivos de células subconfluentes y uniformemente distribuida en toda la célula en cultivos superconfluentes. Su importación al núcleo es dependiente de energía, y su localización depende del estadio del ciclo celular, y del estado de acetilación. Demostramos que la NLS de p8 es funcional. p8 es lo suficientemente pequeña como para difundir libremente entre el núcleo y el citoplasma. Su NLS y el estricto control de su localización, indican que formaría parte de complejos multiproteicos. Para profundizar en esta hipótesis, identificamos por abordaje proteómico las proteínas que copurifican con p8. A partir de las proteínas identificadas construimos el interactoma de p8. El análisis de este interactoma indica que p8 es una proteína multifuncional que puede interactuar con distintas proteínas con diversas funciones en diferentes compartimentos celulares.

Abstract:
p8 is an 8 kDa protein that was first identified in rat due to its induction during the acute phase of pancreatitis. Various functions related to cell growth control and stress have been attributed to p8. An important role in tumor progression was also assigned to p8 since it was observed that transformed p8-/- fibroblasts do not induce tumors when injected in nude mice. In this study we aim to understand further, the functions of p8 and to find the pathways in which it is involved. Through sequence homology analysis we identified p8 in different species of higher eukaryotes, but not in lower eukaryotes. We saw that there is a highly conserved NLS (Nuclear Localization Signal). Through immunocytochemistry, we found that p8 presents nuclear localization in sub-confluent cells, but it localizes in the cytoplasm of confluent cells. We also observed that nuclear import of p8 is energy dependent, and that its sub- cellular localization changes with the cell cycle stage and the acetylation state of the cells. We proved the functionality of its NLS. p8 is small enough to diffuse between nucleus and cytoplasm passively. The fact that it presents a NLS and a strictly controlled sub-cellular localization suggests that it is forming part of multiprotein complexes. To study this, and to identify the proteins associated to p8 we performed co purification experiments and mass spectrometry analysis. With the identified proteins we built the p8 interactome, and conclude that p8 is a multifunctional protein that is capable of interacting with different proteins associated to different pathways in different cellular compartments.

Schor, Ignacio Esteban. "Regulación del splicing alternativo en células neuronales y su relación con la estructura de la cromatina" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Cambios en la tasa de elongación de la ARN polimerasa II (pol II) modulan los patrones de splicing alternativo, debido a que afectan el tiempo en el cual los sitios de splicing del pre- ARNm naciente son presentados a la maquinaria de splicing (un efecto conocido como acoplamiento cinético). Mostramos aquí un nuevo exón alternativo que responde a la elongación de la pol II: el exón 18 de la molécula de adhesión celular neural (NCAM), cuya inclusión es regulada durante la diferenciación y la plasticidad sináptica. Buscando estímulos que afecten al splicing alternativo a través de su acoplamiento cinético con la transcripción, encontramos que la despolarización del potencial de membrana de células neuronales provoca la exclusión del exón 18 del ARNm maduro. El efecto se observa tanto en cultivos primarios de neuronas hipocampales como en una línea de neuroblastoma murino, y es independiente de la vía de las kinasas dependientes de calcio/calmodulina (CaMKs). Un análisis de los niveles de modificaciones de histonas a lo largo del locus endógeno de Ncam revela una disminución local de marcas asociadas a transcripción activa y elongación de la pol I I, como tri-metilación de H3K36 y acetilación de histonas, en la vecindad del exón 18. El tratamiento de despolarización afecta la cromatina de este gen en forma específica, causando un incremento en acetilación de H3K9 en una región interna que incluye a este exón alternativo. Esta acetilación intragénica está asociada a mayor apertura de la cromatina, mayor procesividad de la pol II y tri-metilación de H3K36 en esta región, pero no es acompañada por cambios en el promotor del gen. En base a los resultados de la tesis presentamos un modelo donde la excitación neuronal dispara cambios en la estructura de la cromatina intragénica del gen de NCAM, que facilita la elongación de la pol II en esta región y subsecuentemente causa la exclusión del exón 18 del ARNm. Este modelo señala un rol fisiológico de la modulación de la cromatina intragénica en la biogénesis de los ARNm en las células eucariotas.

Abstract:
Changes in RNA polymerase II (pol II) elongation rates modulate alternative splicing choices, affecting the timing at which nascent pre-mRNA splice sites and regulatory sequences are presented to the spliceosome (an effect known as kinetic coupling). We show here a new case of an alternative exon that responds to pol II elongation: the exon 18 from the neural cell adhesion molecule (NCAM), whose inclusion is modulated during differentiation and synaptic plasticity. In search for physiological pathways affecting alternative splicing through its kinetic coupling with transcription, we found that membrane depolarization of neuronal cells triggers the skipping of exon 18 from mature mRNA. The effect is seen in both primary cultured neurons and N2a murine neuroblastoma cells, and is independent of the calcium/calmodulin protein kinase (CaMK) pathway. Analysis of histone modifications across the endogenous Ncam locus revealed a local decrease in marks of transcriptional elongation and active transcription, such as H3K36 tri-methylation and histone acetylation, in the neighbourhood of exon 18. Depolarization affects the chromatin template in a specific way, by causing an increase in H3K9 acetylation on an internal region of the NCAM gene surrounding the alternative exon. This intragenic histone hyperacetylation is associated with chromatin relaxation, increased pol II processivity and is linked to H3K36 tri-methylation, but is not paralleled by changes at the promoter,. The effects on acetylation and splicing are reverted when the depolarizing conditions are withdrawn and can be both duplicated and potentiated by the histone deacetylase inhibitor trichostatin A. Based on these evidences, we present a model where neuronal excitation acts by promoting changes in the intragenic chromatin structure of the NCAM gene, which allows higher pol II elongation rates and the subsequent skipping of exon 18. This model points at a physiological role of intragenic chromatin modulation in eukaryotic mRNA biogenesis.

Ilarregui, Juan Martín. "Papel crítico de galectina-1 en la diferenciación de células dendríticas tolerogénicas: relevancia fisiopatológica in vivo en la interfase de inflamación crónica y cáncer" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células dendríticas son células altamente especializadas en captar, procesar y presentar antígenos a linfocitos T vírgenes a los fines de inducir una respuesta inmune específica. A pesar de su papel crítico en iniciar la inmunidad adaptativa, estas células pueden redireccionarse hacia un perfil tolerogénico. En el presente trabajo de tesis, determinamos el papel de galectina-1, una lectina endógena con propiedades antiinflamatorias, sobre la fisiología de células dendríticas humanas y de ratón. Células dendríticas diferenciadas en presencia de galectina-1 exhibieron un perfil regulatorio dependiente de la producción de IL-27 y de la activación del factor de transcripción STAT3, favorecieron la inducción de tolerancia en el microambiente tumoral y suprimieron las respuestas patogénicas Th1 y Th17 en un modelo de inflamación autoinmune desmielinizante. De acuerdo con su función regulatoria, la expresión endógena de galectina-1 fue elevada en células dendríticas expuestas a estímulos tolerogénicos y durante el pico y la resolución de la patología autoinmune, instancia en la cual contribuyó a la resolución de la enfermedad. Asimismo, células dendríticas deficientes en el gen de galectina-1 presentaron un mayor potencial inmunogénico y capacidad disminuida de suprimir fenómenos inflamatorios. Los resultados expuestos demuestran el papel crítico de galectina-1, tanto exógena como endógena, en la inducción de DC tolerogénicas productoras de IL-27 con profundas implicancias en el control de procesos inflamatorios y neoplásicos.

Abstract:
Dendritic cells are highly specialized antigen-presenting cells that recognize, process and present antigens to naïve T cells. In spite of their pivotal role in orchestrating immunity, dendritic cells may be licensed by inhibitory signals to become tolerogenic. Here we show that galectin-1, an endogenous glycan-binding protein, can endow dendritic cells with tolerogenic potential in vivo. Galectin-1-differentiated dendritic cells acquired an IL-27-dependent 'regulatory signature', promoted T cell tolerance in neoplastic settings and suppressed TH-17-mediated autoimmune neuroinflammation in wild-type, but not IL-27 receptor a-deficient mice. Consistent with its regulatory function, expression of galectin-1 was elevated on dendritic cells exposed to tolerogenic stimuli and during the peak and resolution of autoimmune pathology, where it contributed to disease recovery. Accordingly, dendritic cells lacking galectin-1 had greater immunogenic potential and impaired capacity to halt inflammatory disease. Our findings identify an essential role for galectin-1 in driving the differentiation of IL-27-producing tolerogenic dendritic cells with broad therapeutic implications in immunopathology.

Sellaro, Romina. "Integración dinámica de señales ambientales en Arabidopsis thaliana" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las plantas han desarrollado complejos sistemas que les permiten percibir el ambiente lumínico. Los resultados expuestos en este trabajo proponen mecanismos por los cuales la compleja red de señalización regula el crecimiento de las plántulas integrando señales lumínicas. El primero se refiere a la acción sinérgica de la luz azul y la luz roja. En plántulas de Arabidopsis cultivadas en luz roja (condición que activa a phyB), un corto suplemento de luz azul activa a cry1 generado así una respuesta sinérgica. En esta tesis encontré que el mecanismo de integración implica la activación de reguladores positivos como HY5, HYH, SPA1 y SPA4 por medio de los criptocromos al percibir una señal transitoria de luz azul. Luego de esta señal, los genes HY5, HYH, SPA1 y SPA refuerzan la señalización mediada por phyB. Como phyB se mantiene activo en oscuridad, el sinergismo permite la persistencia de los procesos que llevan a la autotrofía durante la noche. En la segunda parte, investigué la integración de señales fluctuantes de sombreado vegetal. Cuando una plántula crece en sombra, distintos genes de respuesta a hormonas y genes involucrados en la señalización de la luz como PIF4, PIF5 (que promueven el alargamiento del hipocotilo) aumentan su expresión. Cuando una plántula que estaba creciendo en sombra percibe luz no filtrada por plantas vecinas, aumentan los niveles de expresión de HY5. HY5 podría regular negativamente la señalización de auxinas e inhibir la expresión de reguladores positivos del crecimiento como son PIF4, PIF5, HAT2, PKS4, LHY y CCA1 evitando que se genere la respuesta máxima a la sombra. En ambos casos se observa como las plantas integran señales ambientales mediante la conexión de distintas vías de señalización.

Abstract:
Plants have developed complex systems that allow them to perceive the light environment. The results presented in this work proposes mechanisms by which the complex signaling network regulates the seedlings growth integrating light signals. The first relates to the synergistic action of blue light and red light. In Arabidopsis seedlings grown under red light (condition that activate phyB), a short supplement of blue light activate cry1 and generated a synergistic response. In this thesis I found that the mechanism of integration involves the activation of positive regulators such as HY5, HYH, SPA1 and SPA4 through the perception of transient signal of blue light by cryptochrome. After this signal, genes HY5, HYH, SPA1 and SPA reinforce the phyB-mediated signaling. Because phyB is active in darkness, synergism allows the persistence of the processes that lead to autotrophy during night. In the second part, I researched the integration of shade fluctuating signals. When a seedling grows in shade, several hormone-response genes and genes involved in signaling of light as PIF4, PIF5 (that promote hypocotyl elongation) increase their expression. When a seedling that was growing in shade perceived unfiltered light by neighboring plants, increase the expression levels of HY5. HY5 could negatively regulate auxin signaling and inhibit the expression of positive regulators of growth such as PIF4, PIF5, HAT2, PKS4, LHY and CCA1 preventing shade maximal response. Both cases shows how plants integrate environmental signals by connecting different signaling pathways.

Giulianelli, Sebastián Jesús. "Papel de los receptores de estrógenos alfa en el crecimiento de carcinomas mamarios murinos con respuesta diferencial a progestágenos" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los mecanismos por los cuales los estrógenos y los progestágenos, a través de sus respectivos receptores (RE y RP), participan en el desarrollo y crecimiento del cáncer de mama es un tema controversial y de gran interés. La detección de estos receptores se utiliza como factor pronóstico y direcciona la terapéutica hacia una de tipo hormonal, dirigida principalmente a bloquear la fuente de estrógenos o inhibir la acción del RE. Sin embargo, han aparecido en los últimos años numerosas evidencias que implican a los RP en el desarrollo y progresión de carcinomas mamarios. En nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo experimental de adenocarcinomas mamarios murinos inducidos por la administración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Se establecieron líneas tumorales hormono-dependientes (HD) y hormono-independientes (HI) que expresan RE, α y beta, y las dos isoformas del RP (RPA y RPB). Se ha demostrado que el RP es fundamental en el crecimiento de estos tumores, tanto en los HD como en los HI. El tratamiento con antiprogestágenos u oligonucleótidos antisentido para el RP, inducen regresión de ambas variantes tumorales. Paradójicamente los estrógenos inducen regresión tumoral, mientras que el tamoxifeno inhibe el crecimiento tumoral. En estudios preliminares observamos que el antiestrógeno puro ICI 182.780, inhibe in vitro, la estimulación inducida por el MPA sobre células epiteliales tumorales HD. Todas estas observaciones nos llevaron a investigar qué papel cumple el REα, además del RP, en el crecimiento de estos tumores. Utilizamos la línea C4-HD como prototipo de tumor HD, y su variante C4-HI, capaz de crecer en ausencia de la administración de hormonas. Asimismo, teniendo en cuenta las líneas de trabajo llevadas a cabo en el laboratorio que sugerían que el estroma tumoral participaba en el crecimiento tumoral HI, quisimos investigar la participación de fibroblastos asociados a tumor (CAFs) en la activación de los RP, e investigar si los REα podrían estar también involucrados en la proliferación epitelial inducida por CAFs. Si bien en un principio pretendimos abarcar a los REß en este estudio, dada la complejidad de las interacciones observadas con el REalfa, decidimos abocarnos sólo a éste último. En cultivos primarios de células epiteliales o en tumores creciendo in vivo, observamos que el MPA induce la expresión, fosforilación y activación del REα en tumores HD, mientras que en los HI, éstos se encontrarían basalmente fosforilados y activos. La inhibición farmacológica o génica del REα indujo una inhibición de la proliferación celular de la misma manera que anteriormente se había observado al inhibir el RP. Esta inhibición fue lograda aún en presencia del RP. In vivo el antiestrógeno puro inhibió completamente el crecimiento tumoral inducido por MPA, mientras que indujo efectos inhibitorios en el tumor HI. Los resultados sugieren la necesidad de un REα presente y activado en forma ligando independiente en el crecimiento de ambas variantes tumorales. Demostramos además que la expresión del RP, si bien es modulable por estrógenos, no seria totalmente dependiente del REα. Por otra parte, detectamos interacción nuclear entre el REα y el RP en tumores creciendo in vivo, y en células epiteliales C4-HD in vitro, en un mecanismo regulado por el MPA. Estos resultados fueron corroborados usando anticuerpos que reconocen a los receptores fosforilados sugiriendo que los receptores estarían activos transcripcionalmente. Si bien ya estaba reportada la interacción citoplasmática entre el RPB y el REα, no hay datos aún que demuestren la interacción nuclear entre el RPA y el ERα. Teniendo en cuenta que el 17ß-estradiol (E2) y el ICI indujeron una disminución de la colocalización de ambos receptores sugerimos que dicha interacción es imprescindible para inducir el crecimiento tumoral. Quisimos evaluar si se trataba de una particularidad de nuestro modelo experimental y estudiamos la interacción de los mismos receptores en la línea de cáncer de mama humano T47D, en la cual pudimos observar que ambos receptores también interaccionan en el núcleo. La diferencia importante entre ambos modelos radica en el hecho que la línea T47D es estimulada por E2, además de progesterona, mientras que nuestros tumores son inhibidos por E2. En estudios previos hemos demostrado la participación de los CAFs, en el crecimiento tumoral HI. Vimos que el FGF-2 está más expresado en CAFs de tumores HI en cultivo, que en los CAFs HD y que es capaz de activar al RP. En este trabajo mostramos que los CAFs HI son más eficientes que los CAFs HD en estimular la activación del RP, y demostramos además que los antagonistas estrogénicos también inhiben la estimulación inducida por el FGF-2, mostrando nuevamente un paralelismo entre la estimulación inducida por MPA y la estimulación inducida por CAFs. Interesados por las diferencias observadas entre los CAFs HD y los CAFs HI en regular el crecimiento celular y activar los receptores hormonales, el siguiente objetivo planteado fue caracterizar de forma molecular, a través de microarrays de ADN, la participación del MPA en el crecimiento tumoral HD, como así también, obtener información sobre las diferencias entre el crecimiento tumoral HD y HI, y la participación del estroma y del epitelio en la adquisición del fenotipo HI. Los resultados mostraron que en ausencia del MPA, un mayor número de genes resultaron sobreexpresados en tumores C4-HD en comparación a la condición proliferativa con el progestágeno. Genes asociados con arresto del ciclo celular se vieron incrementados en el tumor sin MPA, mientras que curiosamente en el tumor creciendo en presencia del MPA, uno de los genes sobreexpresados fue el FGF-2. Pudimos establecer diferencias en los patrones de expresión génica entre tumores C4-HD y C4-HI; mientras que por estudios de Laser capture microdissection (LCM) acoplados a microarrays de ADN, confirmamos que tanto el parénquima como el estroma de tumores HI, son diferentes a los del tumor HD. Observamos alta expresión de metaloproteasas y genes relacionados a mecanismos de reparación de heridas y quimiotaxis, en el estroma C4-HI. Las evidencias sustentan la hipótesis de la participación del estroma en la adquisición del fenotipo HI, dado que cambios en el compartimiento estromal podrían causar cambios en las señales parácrinas que modifiquen el comportamiento del tumor, a través de mecanismos que involucren tanto la activacion del RP como del REα.

Abstract:
The mechanisms by which estrogens and progestins activate estrogen (ER) and progesterone receptors (PR) respectively, is still a main and controversial area in breast cancer research. The detection of these receptors is used as a prognostic factor and patients with high levels of ER and PR will be treated with a hormone therapy aimed to block estrogen synthesis or to inhibit ER activation. There is however compelling evidence that points out that PR is also involved in the development and progression of breast carcinomas. In our Laboratory we have developed an experimental model of mammary carcinomas induced by the continuous administration of medroxyprogesterone acetate (MPA) into BALB/c female mice. This procedure gave rise to MPA-dependent tumors (HD) that are maintained by syngeneic transplantations in MPA-treated mice. Spontaneously, tumors which are able to grow without exogenous hormone supply may arise, and these are referred to as hormone independent tumors (HI). Both tumor types express ER alpha (ERα) and beta (ERß), and both isoforms of PR (PRA and PRB). We have already demonstrated that PR play a key role mediating tumor growth in both tumor types since antisense oligonucleotides of PR and different antiprogestins inhibit their growth. Interestingly, estrogens (E2) also induce tumor regression, while tamoxifen inhibits tumor growth. In previous studies we observed that the pure antiestrogen ICI 182780 was able to inhibit MPA-induced cell proliferation in vitro. All these observations prompted us to study the role of ERa in tumor growth in the MPA-induced breast cancer model. In this study we used the C4-HD, as a representative of HD tumors, and its HI variant, C4-HI. In addition, and considering previous works from our Lab which suggested that the tumor stroma participates in the acquisition of hormone independence, we have evaluated if carcinoma associated fibroblasts (CAFs) form HI tumors had a different ability than CAFs from HD tumors to activate PR and cell proliferation. We also evaluated if ERa is involved in CAF-induced proliferative effects. We demonstrated that MPA induced the expression, phosphorylation and activation of ERα in HD tumors growing in vivo or in primary cultures derived from the tumors. Interestingly, the ERα was already activated in HI tumors in the absence of MPA, but this constitutive activation was not enough to induce cell proliferation. The mitogenic signal that activates PR and induces cell proliferation is still needed in vitro. Furthermore, the pharmacological or genetic inhibition of ERα in both tumor types inhibited tumor growth, even when PR was not completely abolished, suggesting that ligand independent activation of ERa is needed for tumor growth. Similar results were previously obtained when we inhibit PR. Finally, all these results suggested that PR expression is not completely ERa dependent in this model. Nuclear interaction between ERa and PR was observed in both tumors types growing in vivo and in C4-HD cells growing in vitro in the presence of MPA. These results were corroborated using different antibodies that recognize the phosphorylated forms of the receptors suggesting that they may be transcriptionally active. The cytosolic interaction between PRB and ERα was already reported in the literature; however we described here a nuclear interaction of PRA and ERα which seems to be necessary to mediate MPA-induced cell proliferation since it can be blocked by E2 and ICI 182780. The nuclear interaction of steroid receptors was not a particularity of our experimental model, since we found similar results in T47D cell. The most important difference between this model and ours lies in the fact that E2 stimulates T47D cells whereas it is inhibitory in the C4 cells. In previous studies we have analyzed the role of CAFs in HI tumor growth. We have demonstrated that FGF-2 expression was higher in CAFs derived from HI tumors than in CAFs derived from HD ones and that FGF-2 was able to activate PR. In this study we demonstrated that CAFs from HI tumors had a higher stimulatory effect on cell proliferation and PR activation than CAFs from HD tumors. Estrogen antagonists could inhibit this CAFs-induced epithelial cell proliferation, suggesting a parallelism between the mechanisms underlying MPA-induced effects and CAFs-induced effects. As we were interested in the differences found between CAFs HD and CAFs HI, activating PR, our next aim was to characterize by DNA microarrays the molecular portraits of C4-HD and C4-HI tumors. We searched for differences in C4-HD tumors in the presence or absence of MPA, and also differences between the tumor parenchyma and the stroma from C4-HI tumors and C4-HD tumors growing with MPA. For this purpose tumor parenchyma and stroma was dissected using Laser Capture Microdisscetion (LCM) and samples processed for microarray studies. Interestingly, most of the genes were down regulated by MPA. Only 8 genes were up regulated in MPA-treated C4-HD tumors as compared with tumors in which MPA was removed. One of them was FGF-2. In tumors where MPA was removed, we registered increases in genes related with cell cycle arrest. We could establish patterns of gene expression from samples obtained by LCM confirming that the stroma from C4-HD and C4-HI tumors were different. The stroma of C4-HI tumors showed higher expression of metalloproteases, wound healing proteins and chemotactic factors than the stroma of C4- HD tumors. All these evidences support the idea of an "activated" stroma participating in the acquisition of the HI phenotype, suggesting that paracrine signaling may be inducing tumor growth through the activation of both ERα and PR in the parenchyma compartment of the tumor.

Domaica, Carolina Inés. "Eventos tempranos en la interfase tumor linfocito T y consecuencias sobre la actividad de las células NK" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células NK secretan IFN-g y ejercen citotoxicidad contra tumores que expresan ligandos del receptor NKG2D (NKG2DLs, tales como MICA, MICB y las moléculas ancladas a residuos GPI ULBP-1 a -3) y de los receptores de citotoxicidad natural tales como NKp46 (NKp46Ls, de identidad desconocida). No obstante, desconocemos si las células T son capaces de regular la respuesta anti-tumoral mediada por células NK. En este trabajo, investigamos los eventos tempranos que ocurren la interfase tumor-linfocito T, y su impacto sobre la funcionalidad de células NK. En esta Tesis demostramos que luego del co-cultivo con una línea de melanoma que expresa MICA en superficie, linfocitos T CD4+ o CD8+ activados o en reposo capturaron este NKG2DL de las células tumorales mediante un fenómeno que se denomina trogocitosis. Esta transferencia de membrana entre células fue confirmada mediante la utilización de células marcadas con los fluorocromos CFSE, DiOC18 y PKH26 y fue dependiente del contacto celular. Sin embargo, no fuimos capaces de detectar la transferencia de proteínas ancladas a residuos GPI. Los linfocitos T que estuvieron en contacto con las células tumorales fueron resistentes a la lisis mediada por células NK, pero fueron capaces de promover su degranulación y la secreción de IFN-g en forma dependiente de NKG2D y NKp46, lo que sugiere que además de MICA, otros NKG2DLs y NKp46Ls son capturados por los linfocitos T activados desde la superficie de las células tumorales. Por lo tanto, células de la inmunidad adaptativa (linfocitos T) son capaces de estimular funciones efectoras en células de la inmunidad innata (células NK) a través de la captura de ligandos específicos y en forma independiente del TCR.

Abstract:
NK cells trigger IFN-g secretion and cytotoxicity upon engagement of NKG2D or members of the NCR family such as NKp46 by ligands expressed on tumor cells (such as MICA, MICB, and the GPI-anchored molecules ULBP-1 to -3 for NKG2D, or ligands of unknown identity for NKp46). However, it remains uncertain whether T cells can regulate NK cell-mediated anti-tumor responses. Here, we investigated early events occurring during T lymphocyte-tumor cell interactions, and the impact on NK cell functions. Upon co-culture with MICA+ melanomas, activated CD4+, CD8+, or resting T cells displayed substantial amounts of cell surface MICA due to direct capture (trogocytosis) from the tumor cells. Such transfer was confirmed using CFSE-, PKH26- or DiOC18-labeled cells and required cell-to-cell contact. However, GPI-anchored NKG2DLs were not transferred. Tumor-experienced T lymphocytes remained resistant to NK cell-mediated cytotoxicity, but promoted degranulation and IFN-g secretion by NK cells in a NKG2D- and NKp46-dependent manner, suggesting that additional NKG2DLs and NKp46 ligands were captured by activated T lymphocytes from tumor cells. We conclude that cells from the adaptive immune response (T lymphocytes) support effector functions of innate immune cells (NK cells) through capture of specific ligands in a TCR-independent manner.

Salem, Tamara Marcela. "Estudio de los residuos fosforilados del receptor quinasa LePRK2 en polen de Solanum lycopersicum VF36 (tomate cultivado) y su función en las interacciones polen-pistilo" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El crecimiento apical del tubo polínico es un modelo muy utilizado para el estudio de células polarizadas en plantas. Previamente caracterizamos a LePRK2, un receptor quinasa específico de polen de tomate (Solanum lycopersicum). Cuando se expresa de manera transitoria LePRK2-eGFP en polen de tabaco, se observa una disminución significativa del largo del tubo polínico y un aumento del ancho del ápice del tubo, comparado con tubos eGFP. Tubos que expresan la mutación en una lisina esencial para la actividad quinasa de LePRK2, muestran la misma longitud del tubo polínico y del ancho del ápice que los tubos eGFP control. Hemos demostrado que LePRK2 estaría presente como múltiples isoformas fosforiladas tanto en membranas de polen maduro como germinado. Utilizando un análisis comparativo de secuencias y la predicción de sitios de fosforilación, identificamos dos motivos posibles de fosforilación en el dominio citoplasmático yuxtamembrana. Mutagénesis dirigida sobre estos motivos y su sobreexpresión en polen de tabaco, muestra que ambos motivos tienen efectos opuestos en la regulación del crecimiento del tubo polínico. Sustituciones a alanina en residuos del motivo I de LePRK2, S277/S279/S282, resultó en tubos polínicos más largos, mientras que la sustitución a alanina de residuos del motivo II, S304/S307/T308, resultó en tubos más cortos. En contraste, sustituciones fosfomiméticas con ácido aspártico en estos residuos, mostró resultados recíprocos: tubos más cortos con mutaciones en el motivo I y tubos más largos con mutaciones en el motivo II. Concluimos que la longitud del tubo polínico puede estar controlada a través de una regulación negativa y positiva debida a la fosforilación de los residuos del motivo I y II respectivamente. Estos resultados sugieren que LePRK2 podría tener un papel central en el crecimiento del tubo polínico a través de la regulación de su propio estado de fosforilación. Hemos realizado distintos abordajes con polen maduro de tomate con el fin de determinar por espectrometría de masa los sitios de fosforilación de LePRK2, pero hasta el momento no hemos logrado identificarlos. Por otro lado, STIL, un ligando de LePRK2 proveniente del pistilo, desfosforila LePRK2 en membranas de polen maduro en 32 PγATP. Nuestra hipótesis plantea que LePRK2 está involucrada en el control del crecimiento del tubo polínico de tomate y el mismo es regulado in vivo por el equilibrio de distintos residuos de fosforilación, a veces organizados en motivos en su dominio yuxtamembrana. Por otro lado, alguno de los residuos de LePRK2 son desfosforilados por STIL.

Abstract:
The tip-growing pollen tube is a useful model for studying polarized cell growth in plants. We previously characterized LePRK2, a pollen-specific receptor-like kinase from tomato (Solanum lycopersicum). When transiently overexpressed in tobacco pollen tubes, LePRK2-eGFP significantly decreased pollen tube length and increased pollen tube tip width, relative to eGFP tubes. Tubes that expressed a mutation in a lysine essential for kinase activity showed the same length and width as the eGFP control. LePRK2 might be present as multiple phosphorylated isoforms in mature and germinated pollen membranes. Using comparative sequence analysis and phosphorylation site prediction programs we identified two putative phosphorylation motifs in the cytoplasmic juxtamembrane domain. Site-directed mutagenesis in these motifs, and overexpression in tobacco pollen, showed that both motifs have opposite effects in regulating pollen tube length. Relative to LePRK2-eGFP pollen tubes, alanine substitutions in residues of motif I, S277/S279/S282, resulted in longer pollen tubes, but alanine substitutions in motif II, S304/S307/T308, resulted in shorter tubes. In contrast, phosphomimicking aspartic substitutions at these residues gave reciprocal results: shorter tubes with mutations in motif I and longer tubes with mutations in motif II. We conclude that length of pollen tubes can be negatively and positively regulated by phosphorylation of residues in motif I and II respectively. These results suggest that LePRK2 may have a central role in pollen tube growth through regulation of its own phosphorylation status. In order to discover LePRK2 phosphorylation sites in vivo, some approaches were tested with tomato mature pollen. Morover, STIL, a ligand of LePRK2 from pisitil, dephosphorylates LePRK2 in mature pollen membranes in the 32PγATP. We hypothesize that LePRK2 is involved in the control of tomato presence pollen tube growth, and this is regulated in vivo by the equilibrium of different phosphorylated residues, sometimes organized in motifs in the juxtamembrane domain. On the other hand, some residues of LePRK2 are dephosphorylated by STIL.

Soto, Gabriela Cynthia. "Caracterización funcional de proteínas del tipo acuaporinas en polen maduro de Arabidopsis thaliana" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La reproducción sexual en plantas incluye procesos en donde el movimiento de agua y solutos se encuentra finamente regulado, lo cual sugiere la participación de acuaporinas. La existencia de acuaporinas, facilitando estos flujos, provee una base molecular sólida para la regulación del transporte de agua y solutos a través de las membranas y de esta forma establecen conexiones entre dicho transporte, el desarrollo de las plantas y sus respuestas adaptativas a las condiciones a las que se encuentran expuestas tanto a nivel organismo, como tejido e incluso a nivel intracelular. Este trabajo de tesis se centró principalmente en la identificación y caracterización de las acuaporinas potencialmente involucradas en la reproducción desde los órganos reproductivos masculinos en Arabidopsis thaliana. Primeramente identificamos las tres acuaporinas específicas de granos de polen de Arabidopsis, AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1. En base a experimentos funcionales, utilizando ovocitos de Xenopus laevis como sistema heterólogo, pudimos determinar que AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1 son transportadores de agua. AtTIP5;1 y AtTIP1;3 son también transportadores de urea y solamente AtTIP5;1 se encuentra regulado por pH externo. Estudios de localización subcelular evidenciaron que AtTIP5;1 se expresa en mitocondrias de polen. Por otro lado, AtTIP1;3 se encuentra en estructuras intracelulares no vacuolares del tipo vesículares, pero que no participan de mecanismos de endocitosis ni exocitosis. Finalmente, los experimentos fisiológicos in vitro sugirieron un papel de AtTIP5;1 en germinación del grano de polen actuando como regulador negativo. AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1 se vincularon de forma directa o indirecta con el proceso de elongación del tubo polínico, destacándose los efectos más drásticos para AtTIP1;3. En cuanto a los experimentos fisiológicos in planta, encontramos que solamente AtNIP4;1 tiene afectados los parámetros de fertilidad con una reducción significativa en el número de semillas. En el marco de esta tesis doctoral hemos realizado una revisión de la información disponible de acuaporinas de plantas, evaluando los perfiles de expresión de las mismas en los diversos tejidos. Hemos discutido la nomenclatura utilizada para clasificar esta familia proteica y analizado la posibilidad de establecer relaciones filogenéticas y funcionales entre los distintos subgrupos: PIPs, TIPs, NIPs y SIPs. El conjunto de resultados desarrollados en esta tesis, en concordancia con los trabajos publicados en estos últimos años, nos ha permitido aventurar posibles roles en relación con la actividad de transporte de agua y/o solutos de las acuaporinas de polen; que van desde la migración celular hasta el control del daño y prevención de apoptosis. También nos ha permitido generar un modelo sobre el mecanismo de acción de las acuaporinas en el polen relativo a la actividad como transportadores de urea. Este modelo vincula la actividad de AtTIP5;1 y AtTIP1;3 con el reciclado del nitrógeno descripto en polen.

Abstract:
Sexual reproduction involves processes where water and solute movement is finely regulated, suggesting the involvement of aquaporins. The existence of aquaporins facilitating these flows, provides a solid molecular basis for the regulation of water and solute transport through membranes and thus make connections between the transport, plant development and adaptive responses to conditions to which the plant is exposed at both the organism such as tissue or even intracellular level. This thesis is focused mainly on the identification and characterization of aquaporin potentially involved in reproduction from the male reproductive organs in Arabidopsis thaliana. We first identified the three Arabidopsis pollen grains specific aquaporins, AtTIP5;1 AtTIP1,3 and AtNIP4;1. Based on functional experiments using Xenopus laevis oocytes as a heterologous system, we could determine that AtTIP5;1 AtTIP1;3 and AtNIP4;1 are water carriers. AtTIP5;1 and AtTIP1;3 are also carriers of urea and only AtTIP5;1 is regulated by external pH. Subcellular localization studies showed that AtTIP5;1 is expressed in pollen ́s mitochondria. Furthermore, AtTIP1;3 is located in intracellular structures not vesicular vacuolar-type, but not participating in endocytosis and exocytosis mechanisms. Finally, in vitro physiological experiments suggested a role AtTIP5;1 in pollen grain germination by acting as negative regulator. AtTIP5;1, AtTIP1,3 and AtNIP4;1 is linked directly or indirectly with the process of pollen tube elongation, especially the more drastic effects for AtTIP1;3. For physiological experiments in planta, we found that only AtNIP4;1 has affected fertility parameters with a significant reduction in the number of seeds. As part of this thesis, we have conducted a review of available information of plant aquaporins, evaluating the expression profiles of the same in various tissues. We discussed the nomenclature used to classify this protein family and discussed the possibility of phylogenetic and functional relationships between different subgroups: PIPs, TIPs, NIPs and SIPs. Together, the results obtained in this thesis, along different reports published in recent years has allowed us to venture possible roles in relation to water and urea transport activity of pollen's aquaporins ranging from cell migration, to damage control the and prevent apoptosis. It also allowed us to generate a model on the mechanism of action of aquaporins on the activity of urea transporters in pollen. This model links specially AtTIP5;1 activity, and AtTIP1;3 with nitrogen recycling in pollen.

Giusti, Sebastián. "Mecanismos celulares y moleculares involucrados en la muerte neuronal inducida por una injuria hipóxica prenatal" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En la presente Tesis hemos utilizado un modelo experimental de hipoxia aguda normobárica en embriones de aves, con el objetivo de elucidar las vías moleculares y eventos de señalización celular que forman parte de los mecanismos de injuria y neuroprotección ante un daño hipóxico en el SNC en desarrollo. Los resultados obtenidos han demostrado que la hipoxia induce un incremento en los marcadores de stress oxidativo y activa la vía apoptótica intrínseca. La muerte apoptótica se encuentra precedida por una inducción de óxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS), daños ultraestructurales e inhibición del complejo I mitocondriales ambos cambios dependientes de óxido nítrico. En segundo lugar, se ha establecido que el precondicionamiento con un estímulo hipóxico de baja intensidad, confiere tolerancia parcial a una injuria hipóxica más severa 24 h después. Mediante la administración de moduladores de las HIF-prolil hidroxilasas, demostramos que la acumulación de HIF-1 durante el precondicionamiento es necesaria para que se manifieste la tolerancia a una injuria hipóxica posterior. Por último, observamos que la administración de inhibidores selectivos de nNOS/mtNOS y el precondicionamiento hipóxico, aplicados en forma conjunta, tuvieron un efecto aditivo, logrando una neuroprotección completa. Los resultados obtenidos sugieren que los efectos neuroprotectores de los inhibidores selectivos de nNOS/mtNOS en nuestro modelo se deben a efectos independientes de la acción de NO sobre la vía de HIF-1.

Abstract:
In the present Thesis, a chick embryo model of normobaric acute hypoxia has been used to elucidate the molecular pathways underlying injury and neuroprotection events after a hypoxic insult in developing CNS. Our results demonstrate that in our model hypoxia increases oxidative stress markers and activates the intrinsic apoptotic pathway. Apoptotic cell death is preceded by the up-regulation of mitochondrial nitric oxide synthase (mtNOS), and NO-dependent ultrastructural damage and complex I inhibition. Besides, we have determined that a mild hypoxic event confers partial tolerance to a subsequent strong hypoxic injury 24 h later (hypoxic preconditioning). Using modulators of HIF-prolyl hydroxylases, we have demonstrated that HIF-1 up-regulation during preconditioning is essential to afford neuroprotection. To conclude, we have observed that administration of nNOS/mtNOS specific inhibitors and hypoxic preconditioning had additive effects on neuroprotection. Our results suggest that neuro-protective effects of nNOS/mtNOS inhibitors do not rely on interactions of NO with HIF-1 pathway.

Muñoz, Manuel Javier. "Respuesta al daño al ADN: un ejemplo de acoplamiento entre transcripción y splicing alternativo" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El splicing alternativo (AS) explica cómo se obtiene una gran cantidad de proteínas a partir de una cantidad limitada de genes. Este proceso es afectado no sólo por la interacción de proteínas reguladoras del AS con sus secuencias blanco en los pre‐mRNAs sino que, dado que ocurre en íntimo contacto con la maquinaria transcripcional, es también afectado por ésta (acoplamiento transcripción/AS). Interesantemente, un gran número de genes involucrados en apoptosis son regulados por splicing alternativo produciendo mRNAs que codifican para proteínas con funciones antagónicas. Sin embargo poco se sabe sobre la regulación del AS en condiciones de estrés. En esta tesis se ha investigado cómo la respuesta al daño al DNA inducido por la luz UV provoca cambios en los patrones de AS de minigenes transfectados transitoriamente o de genes endógenos como Bcl‐x y caspasa 9. El UV induce la hiperfosforilación del dominio carboxilo terminal (CTD) de la RNA polimerasa II (pol II) y consecuentemente con esto afecta preferencialmente el AS co‐transcripcional. El efecto de UV es sistémico ya que el daño del DNA molde no es necesario y no involucra al factor de transcripción p53 como demostramos al utilizar células que carecen de éste clásico factor de respuesta a estrés. Utilizando la técnica de FRAP, en combinación con polimerasas mutantes en su CTD que imitan no sólo el estado hiperfosforilado sino también los efectos de la luz UV sobre el AS, demostramos que la hiperfosforilación del CTD inhibe la tasa de elongación de la pol II afectando así el acoplamiento entre la transcripción y el AS. Confirmando la relevancia de este mecanismo, la apoptosis inducida por luz UV en células p53‐/‐ es prevenida al revertir el cambio en el AS de Bcl‐x. Para evaluar la generalidad de nuestros resultados utilizamos microarrays de AS y encontramos que la irradiación con UV promueve una mayor proporción de cambios en AS en el grupo de genes donde también ha afectado su transcripción. Estos resultados sugieren que el acoplamiento entre la transcripción y el AS es clave en la respuesta al daño en el DNA.

Abstract:
Alternative splicing (AS) explains how a vast protein diversity is achieved with a limited number of genes and its regulation not only depends on the interaction of splicing factors with their target sequences in the pre‐mRNA but is coupled to RNA polymerase II (pol II) transcription. AS seems to play a key role in DNA damage response as suggested by the large number of apoptotic genes that are alternatively spliced, with often antagonistic roles of the isoforms generated. However, little is known about AS regulation in a DNA damage derived stress situation. In this thesis we show that ultraviolet (UV) radiation affects alternative splicing of transfected and endogenous genes like Bcl‐x and caspase 9 (C9). UV light induces the hyperphosphorylation of the carboxy terminal domain of the pol II and by doing so it affects co‐transcriptional AS preferentially. The UV effect is systemic as demonstrated by the fact that the actual damage of the DNA template in cis is not necessary and also p53 independent because it is observed in cells lacking this classic stress response factor. By using the FRAP technique and in combination with mutant polymerases that not only mimic the hyperphosphorylated state of its CTD but also the UV effect on AS, we demonstrated that the UV induced CTD hyperphosphorylation inhibits pol II transcriptional elongation rates which in turn affects AS decisions through its coupling with transcription. Confirming the relevance of this mechanism, apoptosis promoted by UV light in cells lacking p53 is prevented when the change in AS of the apoptotic gene Bcl‐x is reverted. To evaluate the generality of these results and using splicingsensitive microarrays, we found a significant overlap of the subsets of genes changing AS with UV light and those that also downregulate their expression, suggesting that transcription/AS coupling is a key feature of the DNA damage response.

Edreira, Martín Miguel. "Influencia de la fosforilación dependiente de PKA sobre la conformación y función de la GTPasa Rap 1b" (2009-10-09) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La activación de Rap1b por la proteína de intercambio activada por AMPc (Epac) y su fosforilación mediada por la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA), son requeridas para la mitogénesis dependiente de AMPc. Sin embargo, el rol de la fosforilación permanece incierto. Evaluamos potenciales cambios conformacionales inducidos por la fosforilación de Rap1b, utilizando el intercambio hidrogeno/deuterio acoplado a espectroscopia de masa (DXMS) y cristalografía. Velocidades de intercambio hidrogeno/deuterio para Rap1b fosforilada (Rap1-P) y fosfomimética (Rap1-D) mostraron un perfil de intercambio idéntico, con velocidades incrementadas en regiones discretas a lo largo de la proteína, incluyendo un dominio alrededor del sitio de fosforilación y la región efectora. La estructura cristalina de Rap1b-G12V-S179D mostró que la presencia del S179D induce cambios en la interfase con los switch I y II. Nuestro segundo objetivo fue la búsqueda de efectores de Rap1b modulados por fosforilación. Entre los clones aislados por doble hibrido, se encontró la proteína asociada a la adenilil ciclasa 1 (CAP1). Rap y CAP presentaron una asociación independiente del nucleótido, pero dependiente de la isoprenilación de Rap1b. Aunque la fosforilación demostró modular negativamente esta interacción, su efecto sobre la señal mitogénica mediada por Rap1 fue positivo. CAP1, actuando como proteína andamio de Rap, resultó necesaria para la acción de Rap1, siendo requerida además para su activación y fosforilación, efecto que estaría mediado por la estimulación del aumento de los niveles de AMPc.

Abstract:
Activation of Rap1b by the exchange protein activated by cAMP (Epac) and its cAMPdependent protein kinase (PKA)-mediated phosphorylation are required for cAMP dependent mitogenesis. However, the role of phosphorylation remains unknown. We assessed potential conformational changes induced by phosphorylation of Rap1b using the amide hydrogen/deuterium exchange mass spectroscopy (DXMS) and Crystallography. Exchange rates PKA-phosphorylated (Rap1-P) and phosphomimetic (Rap1-D) Rap1b proteins showed the same pattern of exchange, revealing an increased exchange rate in discrete regions along the protein, including a domain around the phosphorylation site and the effector domain. Crystal structure for the full length Rap1b-G12V-S179D showed that the presence of the S179D induce changes at the interface with switch I and II. Our second objective was finding Rap1b effectors modulated in a phospho-dependent fashion.. Within the clones isolated by Two Hybrid, we found the adenylate cyclase-associated protein 1 (CAP1). Rap/CAP association showed to be nucleotide independent, but dependent on Raps’ isoprenylation. Although, phosphorylation showed to negatively modulate this interaction, it had positive effect on the mitogenic signal mediated by Rap1. CAP, acting as a scaffolding protein for Rap1b, was necessary for Rap1 mediated action, and required for Rap1b activation and phosphorylation, effect mediated by stimulating the increase of the levels of cAMP.

Ricart, Karina Claudia. "Mecanismos moleculares de la degeneración de las motoneuronas en el contexto de la esclerosis lateral amiotrófica" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por la degeneración gradual y muerte de las neuronas motoras de la médula espinal. Aunque en estos últimos años se han producido muchos adelantos sobre las posibles causas de la ELA, todavía no se conoce la fisiopatología de la enfermedad. El objetivo de este trabajo fue profundizar el conocimiento sobre los mecanismos celulares y moleculares que contribuyen a la muerte celular de las motoneuronas, para así entender su muerte selectiva en la ELA. Para el estudio de las características específicas a nivel de células individuales, utilizamos cultivos puros de motoneuronas espinales de rata. En esta tesis doctoral demostramos que, a pesar de que las motoneuronas exhiben una alta dependencia de los factores tróficos para su sobrevida, ciertas combinaciones de factores tróficos desencadenan una muerte apoptótica similar a la descrita para las motoneuronas crecidas en ausencia total de factores tróficos. Dicha muerte celular apoptótica es mediada por el receptor de neurotrofinas p75NTR y depende de la inhibición de la vía de PI3K/Akt y de la activación de la vía JNK, seguidas de la producción de especies reactivas del nitrógeno y la posterior formación de nitrotirosina. Asimismo, demostramos que la formación de nitritirosina en proteínas de las motoneuronas desencadena la muerte celular apoptótica observada en ausencia total de factores tróficos, ya que la presencia de péptidos que contienen tirosina en su secuencia disminuye la nitración endógena y previene la apoptosis, siendo los derivados radicales de la descomposición del peroxinitrito los agentes causantes de esta nitración. Nuestros estudios también demuestran que una de las proteínas nitradas en estas condiciones es la proteína de choque térmico 90 (HSP90), siendo las motoneuronas particularmente sensibles a la inhibición de la actividad ATPasa de la HSP90. La HSP90 también esta nitrada en médulas espinales de pacientes de ELA y en ratones transgénicos usados como modelo experimental de la enfermedad. De estos resultados podemos concluir que la decisión de la motoneuronas en vivir o morir está altamente regulada y que un mismo factor trófico puede producir efectos tan opuestos como activar la apoptosis o inhibirla, dependiendo de su entorno celular.

Abstract:
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder characterized by the gradual degeneration and death of motor neurons of the spinal cord. Despite many recent advances regarding the potential causes of ALS, the pathophysiology of the disease is not yet known. The aim of this Doctoral Thesis work was to extend our basic knowledge of the cellular and molecular mechanisms that contribute to motor neuron cell death and to better understand their selective degeneration and loss in ALS. The use of pure spinal motor neurons culture allows for the study of specific characteristics at the single cell level. In this Doctoral Thesis dissertation, we demonstrate that despite the strong dependency of motor neuron survival on trophic factors, certain combinations of those same trophic factors trigger apoptotic cell death, which is similar to that observed in motor neurons grown in the absence of trophic factors. This apoptotic motor neuron death is mediated by the neurotrophin p75NTR receptor, being dependent on the inhibition of the PI3K/Akt signaling cascade and on the activation of the JNK signaling cascade, followed by the production of reactive nitrogen species and the subsequent formation of nitrotyrosine in motor neuron proteins. In addition, we demonstrated that nitrotyrosine formation in motor neuron proteins triggers the apoptotic cell death observed in motor neurons grown in the total absence of trophic factors, since introducing peptides rich in tyrosine prevents apoptotic cell death. We also showed that the derivatives of peroxynitrite decomposition are responsible for nitration of tyrosine residues in motor neuron proteins during apoptotic cell death induced by the absence of trophic factors. Furthermore, our studies indicate that HSP90 is one of the nitrated proteins in motor neurons cultured under these conditions, an intriguing observation considering that motor neurons are particularly sensitive to the inhibition of the ATPase activity of HSP90. Consistently, HSP90 is also nitrated in the spinal cord of ALS patients and in transgenic mice used as experimental models of this disorder. From our results, we conclude that motor neuron survival and apoptotic cell death is a highly regulated process, during which the same trophic factor could have opposite effects depending on the cellular context of intracellular signaling.

López, María Gabriela. "Complementación de baculovirus que no forman cuerpos de oclusión mediante líneas celulares establemente transformadas con el gen poliedrina" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los baculovirus son un grupo diverso de virus que infectan artrópodos. AcMNPV presenta un ciclo de vida bifásico, con dos fenotipos virales: los virus brotantes y los virus derivados de los cuerpos de oclusión (ODV). Los ODV, responsables de la infección primaria, se embeben en una matriz de poliedrina, proteína que no es esencial para la propagación de los virus en cultivos celulares. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo desarrollar una línea transformada de insecto empaquetadora de baculovirus defectivos en poliedrina, bajo la hipótesis de que es posible complementar esta deficiencia en trans desde el genoma celular. Para ello, en primer lugar, se evaluaron diferentes secuencias regulatorias del promotor del gen poliedrina controlando el gen reportero CAT, en ensayos de transfección transitoria. Luego de la infección con un baculovirus occ-, los mayores niveles de actividad reportera se obtuvieron con una región regulatoria de 2.735 pb que incluye el promotor mínimo de poliedrina y secuencias con funciones de enhancer de la transcripción en baculovirus (hr1, AcSp). Esta región fue seleccionada para regular la transcripción de poliedrina en las líneas establemente transformadas. La infección de una de estas líneas, Sf9POL, demostró que la morfogénesis de poliedros ocurre de manera similar a la de la infección natural y los baculovirus resultantes mostraron además una infectividad similar a los salvajes, en larvas de Rachiplusia nu. Las larvas infectadas oralmente mostraron sólo una progenie viral de genotipo pol- y fenotipo occ-, incapaz de propagar la infección por vías naturales. Colateralmente, se describe una mutación en la posición 130 del gen poliedrina, responsable de alteraciones en tamaño, morfología y capacidad de oclusión de poliedros. En conjunto, los resultados y conclusiones de este trabajo contribuyen al conocimiento de los mecanismos de morfogénesis de los cuerpos de oclusión en el baculovirus AcMNPV, con importantes implicancias en el diseño de baculovirus recombinantes para el control de plagas y la producción de proteínas recombinantes en larvas de lepidópteros.

Abstract:
Baculovirus is a diverse family of virus infecting arthropoda. AcMNPV has a bifasic life cycle, with two viral phenotypes: budded virus and occlusion-derived virus (ODV). ODVs are responsible of primary infection and occlude into a polyhedrin matrix to form polyhedra. Polyhedrin is a non- essential protein for multiplication in cell cultures. The main goal of this work was to develop a transformed insect cell line for packaging polyhedrin defective virus, hypothesizing that it is possible to complement this deletion in trans from the cellular genome. In this way, different polh gene regulatory sequences driving CAT were evaluated by reporter gene assays. After infection of transiently transformed insect cells with pol- baculovirus, the highest CAT levels were obteined when a 2,735 bp regulatory region containing the minimum polyhedrin promoter preceded by hr1 and AcSp sequences with known enhancer activities, was positioned upstream CAT gene. This region was selected to regulate the transcription of polyhedrin in stably transformed cell lines. The infection of one line named Sf9POL demonstrated that morphogenesis of polyhedra occurred in a similar way to the natural infection and that rendered baculovirus also showed similar infectivity for Rachiplusia nu larvae. Oral infection of larvae with polyhedra from infection of Sf9POL line, generated a viral progeny genotypically pol- and phenotypically occ-, unable to propagate the infection by natural means. Colaterally, a mutation in the polyhedrin gene mapped in the position 130 and responsible for alterations in size, shape and capacity for virion occlusion, is described. Together, results and conclusions presented here contribute to the knowledge of the morphogenesis of occlusion bodies in AcMNPV, with important implicances in the design of recombinant baculovirus for plague control and production of heterologous proteins in lepidoptera larvae.

Petrigh, Romina Sandra. "Identificación y caracterización de antígenos de Babesia bigemina" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los protozoarios intraeritrocitarios Babesia bovis y Babesia bigemina son los agentes causales de la babesiosis bovina, una enfermedad transmitida por la garrapata Rhipicephalus microplus que provoca importantes pérdidas económicas a la ganadería en áreas enzoóticas. En tal sentido resulta de gran relevancia la identificación de genes y la caracterización de proteínas para el desarrollo de pruebas diagnósticas de elevada sensibilidad y especificidad y el diseño racional de vacunas. En este trabajo, hemos desarrollado un método de detección molecular de B. bigemina, basado en la amplificación del gen rap-1a, útil para el estudio epidemiológico de la babesiosis bovina en áreas enzoóticas. La PCR en un solo paso, resultó altamente específica detectando 0,00002% de parasitemia. Por otra parte, para la identificación de nuevos antígenos de B. bigemina, se aplicaron dos estrategias: proteómica y herramientas de genómica comparativa. A través de la aproximación proteómica logramos extraer y separar en geles de dos dimensiones las proteínas solubles del estadio de merozoíto de B. bigemina que fueron reconocidas por sueros de bovinos infectados. A partir de las secuencias disponibles del proyecto genoma de B. bigemina y en base a la información proveniente de los genomas anotados de otros apicomplejos, pudimos identificar, anotar y caracterizar una familia de ocho genes que codifican para proteínas del tipo perforina (PLP) con el dominio de ataque a membrana MACPF en B. bigemina. Además se demostró que si bien todos los genes plp se transcriben en el estadio intraeritrocitario, particularmente los genes plpb y plpe presentan una tasa transcripcional significativamente mas alta indicando su importancia en este estadio. Asimismo, el reconocimiento de la proteína PLPA por los sueros bovinos infectados puede ser considerado como un indicio de la participación de esta proteína en la salida del parásito del eritrocito. Este trabajo de tesis contribuye al estudio de la babesiosis bovina a través del desarrollo de herramientas de diagnóstico y de la identificación de genes implicados en los mecanismos moleculares que median la interacción parásito-hospedador.

Abstract:
The intraerythrocytic Protozoan, Babesia bovis and Babesia bigemina, are causal agents of bovine babesiosis, a tick-borne disease trasmitted by Rhipicephalus microplus that cause important economic losses to livestock in areas where the disease is enzootic. In this regard is important the gene identification and protein characterization in order to develop highly sensitive and specific diagnostic methods and rational vaccines. In this work, we developed a molecular test, based on rap-1a gene amplification, for B. bigemina detection, a useful tool for epidemiological studies of babesiosis in enzootic areas. The one-step PCR assay was highly especific and sensitive detecting up to 0.00002% of parasitemia. Moreover, to identify relevant B. bigemina proteins to the development of methods of diagnosis and control of babesiosis, we applied two strategies: proteomic and comparative genomic tools. In the proteomic aproach we could purify and separate B. bigemina merozoites proteins using two dimensional gels and detecting immunodominant proteis using bovine sera. The bioinformatic tools applied to the available sequences of the B. bigemina genome project based on data from the annotated genomes of other apicomplexans, allowed us to identify, annotate and characterize a perforin-like proteins family (PLP) in B. bigemina containing a membrane-attack complex domain (MACPF). Transcriptional studies showed that while all plp genes are transcribed in the intraerythrocytic stage, particularly plpe and plpb genes have a significantly higher transcriptional rate, which may suggest its possible role in intraerythrocytic stage. Furthermore, PLPA recognition of bovine sera from animals infected can also be considered as an indication of the involvement of this protein in the exit of the parasite erythrocyte. This thesis work, contributes to the study of bovine babesiosis through the development of diagnostic tools and the identification of genes involved in the molecular mechanisms that mediate the parasite-host cell interaction.

Presman, Diego Martín. "Mecanismos moleculares involucrados en la modulación de la actividad del receptor de glucocorticoides" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
A lo largo de esta tesis se investigaron algunos de los mecanismos moleculares que modulan la actividad del receptor de glucocorticoides (GR), un factor de transcripción regulado por ligando. En primer lugar, utilizando cuatro esteroides con diferentes actividades se estudió cómo la estructura del ligando afecta la actividad transcripcional del GR. Además, mediante la técnica de Número y Brillo se demostró por primera vez, en forma directa, que el receptor es capaz de homodimerizar in vivo. Los resultados sugieren que este proceso sería independiente de la unión al ADN y a coactivadores como TIF2. En segundo lugar, se investigaron los mecanismos responsables de la inducción dependiente de glucocorticoides del gen pro‐apoptótico Bax, en células derivadas de timoma de ratón S49. Los resultados indican que el aumento transcripcional de bax no es causado por la estabilización de su ARNm, y que las primeras 6.5 kb del promotor del gen no estarían involucradas en el efecto inductor mediado por el GR. A través del uso de un glucocorticoide disociado, sugerimos que el GR induce la expresión de Bax mediante un mecanismo de transactivación. Más aún, no se descarta la posibilidad que el efecto del GR sea indirecto, es decir, induciendo la expresión de otro gen, necesario para aumentar los niveles totales de Bax. Por último, se investigaron los mecanismos involucrados en el efecto antagónico entre la melatonina (MEL) y los glucocorticoides. Nuestros hallazgos muestran que MEL no inhibe al GR en forma generalizada, sino que sólo lo hace en ciertos tipos celulares, y mediante mecanismos diferentes. Mientras que en timocitos de ratón MEL inhibe la disociación del complejo GR‐Hsp90, en células BHK inhibe la interacción del GR con el coactivador TIF2. Finalmente, presentamos evidencias que sugieren que el inhibidor farmacológico de los receptores de melatonina, el Luzindole, sería también un antagonista del receptor de glucocorticoides.

Abstract:
The glucocorticoid receptor (GR) is a transcription factor that regulates gene expression in a ligand‐dependent fashion. This thesis explores some of the molecular mechanisms involved on GR’s activity modulation. By using four different steroid ligands with distinct glucocorticoid and antiglucocorticoid properties, we analyzed ligand structure effects on GR transcriptional modulation. In this sense, by performing Number and Brightness assays we presented for the first time direct evidence of GR homodimerization process in vivo. Results also show that this event can occur without TIF2 coactivator interaction and most likely in a ligand structure and DNA independent manner. On the other hand, we investigated the mechanisms underlying glucocorticoid‐dependent bax induction in S49 cells. Results show that glucocorticoids do not have any effect on bax mRNA stability, suggesting that GR enhances bax’s transcription rate. Moreover, at least 6.5 kb upstream of bax’s start translation site would not be involved on the glucocorticoid‐dependent induction. Results derived from the use of a selective glucocorticoid suggest that GR induces bax expression through a transactivation mechanism. Moreover, we can’t rule out that GR could regulate bax levels through an indirect mechanism involving the expression of another factor. Finally, we studied the molecular mechanisms underlying melatonin (MEL) modulation on the glucocorticoid pathway. Our results show that MEL is not a generalized‐cell type glucocorticoid antagonist. We found that MEL modulates GR response only in a subset of cells, in a cell‐type specific molecular mode of action. In thymocytes, it inhibits GR action by blocking the dissociation of the 90‐kDa heat shock protein; while in BHK cells MEL reduces GR‐TIF2 interaction. Lastly, we also present evidences suggesting that melatonin receptor inhibitor Luzindole is also an antagonist of the glucocorticoid receptor pathway.

Salvatierra Colussi, Edgardo Enrique. "Rol de la proteína SPARC en los mecanismos de angiogénesis" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Proteína Secretada Acídica y Rica en Cisteínas (SPARC en Ingles) ha sido asociada con efectos pro- y anti-angiogénicos. En esta tesis inicialmente se ensayó la actividad de la proteína SPARC de diferentes fuentes y todas fueron capaces de inhibir la proliferación, adhesión y migración de células endoteliales. SPARC obtenida de melanoma produjo un efecto bifásico en la proliferación de fibroblastos, aunque sobre las células tumorales no demostró efectos detectables. Por otro lado, SPARC fue capaz de modular la migración de células endoteliales inducida por factores angiogénicos como VEGF y PDGF. A bajas concentraciones SPARC estimulo la migración de las células endoteliales y a altas la inhibió. En esta última condición dicho efecto estuvo acompañado por el incremento en la capacidad de inducir la diferenciación de las células endoteliales, independientemente de los factores presentes en el medio. Además, encontramos que los niveles de SPARC disminuyen en hipoxia sugiriendo que la modulación de los niveles de SPARC por la tensión de oxigeno sería responsable de los efectos moduladores de la angiogénesis tumoral. Nuestros datos demuestran que SPARC puede actuar como un factor proangiogénico o anti-angiogénico en función de su concentración y los factores con los que interactúa. Hemos demostrado que tiene un rol único en la modulación de la angiogénesis tumoral actuando sobre la diferenciación, migración y proliferación de las células endoteliales.

Abstract:
The Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC in English) has been associated with pro- and anti-angiogenic effects. Here we evaluated the activity of SPARC obtained from different sources and established that each one of them was able to inhibit the proliferation, adhesion and migration of endothelial cells. SPARC obtained from melanoma cells exhibited a biphasic effect on fibroblasts proliferation but has no detectable effects on tumor cells. However, it was able to modulate endothelial cell migration induced by different angiogenic factors such as VEGF and PDGF. At low concentrations SPARC stimulates the migration of endothelial cells but while at higher concentrations SPARC inhibited endothelial cell migration induced by the proangiogenic factors. High SPARC concentrations induced endothelial cell differentiation, regardless of the factors in the environment. Interestingly, SPARC production is down regulated under hypoxia which in turns promotes endothelial migration. Thus, it appears that the modulation of SPARC levels by oxygen tension could be responsible for the pro or anti-angiogenic effects of SPARC. Our data show that SPARC may act as a pro-angiogenic factor or anti-angiogenic depending on the tumor oxygen levels and factors encountered in tumor environment. We have shown that it has a unique role in the modulation of tumor angiogenesis by acting on the differentiation, migration and proliferation of endothelial cells.

Radic, Claudia Pamela. "Genética molecular de hemofilia: caracterización de mutaciones en hemofilia B, expresión de hemofilia en mujeres y desarrollo de nuevos métodos de análisis de inversiones" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las hemofilias A (HA) y B (HB) son coagulopatías hereditarias, ligadas al cromosoma X (X), sufridas por varones (1:5000) y raramente por mujeres, causada por defectos génicos del factor VIII (F8) y IX (F9), respectivamente. Para caracterizar el espectro de mutaciones causales de HB en Argentina se aplicó un esquema original de 12 amplímeros para el F9, incluyendo un screening por CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis), en 49 familias, y se identificaron 29 cambios missense (60%), 7 nonsense (14%), 4 defectos de splicing (8%), 2 pequeñas inserciones‐deleciones (4%), 6 grandes deleciones (12%) y un cambio en región promotora del F9. Dos cambios missense no reportados mostraron, uno la disrupción de un puente disulfuro y otro la destrucción de un sitio de γ‐carboxilación condicionando el fenotipo de HB severa. Para mejorar la estrategia de detección de grandes rearreglos que involucran int22h e int1h en el F8, causales del 50% de las HA severas, se desarrolló un abordaje nuevo, inverse‐shifting‐PCR (IS‐PCR). Mediante el uso de un test diagnóstico para la inversión del intron 22 (Inv22), los resultados de IS‐PCR fueron validados por perfecta concordancia en 32 y 43 casos previamente estudiados por Southern blot y PCR inversa, y en 34 casos nuevos. El uso conjunto del test diagnóstico y complementario sobre las series de nuestra población, no mostró las variantes estructurales, i.e., deleciones y duplicaciones hipotetizadas en la literatura. El test para la inversión del intrón 1 fue validado por perfecta concordancia en 21 casos estudiados por doble PCR y en 13 casos nuevos. Para investigar la utilidad de IS‐PCR en diagnóstico prenatal, muestras de vellosidades coriónicas de una madre portadora de la Inv22 y su feto nonato fueron diagnosticadas. Para estudiar la causa de la expresión de HA severa en mujeres portadoras heterocigotas se ajustó y validó el sistema del gen HUMARA para estimar el patrón de inactivación del X (XIP). Se estudiaron 6 mujeres con HA severa: una mostró la mutación c.3633delA en hemi‐homocigosis, 4, mostraron la mutación en heterocigosis y sesgo extremo en el XIP, y un caso, heterocigota para c.4388_4391delCTTT, mostró XIP no sesgado en leucocitos de sangre periférica (hipotetizando una inactivación hepática distinta). En una serie de 37 portadoras heterocigotas, y un grupo control de 20 no portadoras, se estudió la correlación XIP‐FVIII:C mediante análisis de contingencia y de errores respecto a un modelo teórico original (Obs.‐Esp.), obteniéndose modestas diferencias significativas (p menor a 0,05) asociadas a una gran dispersión de FVIII:C. Este trabajo presentó la primera serie molecular de mutaciones causales de HB en Argentina, el desarrollo de una nueva estrategia para el estudio de las grandes invers.

Abstract:
Hemophilia A (HA) and B (HB) are X‐chromosome (X) linked inherited coagulation disorders suffered by men (1:5000) and rarely by women, which are caused by gene defects of factor VIII (F8) and IX (F9), respectively. To characterize the spectrum of HB causative mutations in Argentina, an original scheme of 12 amplicons for F9 including a screening by CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis) was applied in 49 families identifying 29 missense mutations (60%), 7 nonsense (14%), 4 splicing defects (8%), 2 small insertions‐deletions (4%), 6 large deletions (12%) and one change in the F9 promoter region. Two previously unreported missense changes showed a disruption of a disulfide bridge, and the destruction of a site for γ‐ carboxylation by analysis in silico, both conditioning the severe HB phenotype. To improve the genotyping strategy for large rearrangements involving int22h and int1h in the F8 that cause 50% of severe HAs worldwide, we design and developed a new approach, inverse‐shifting‐PCR (IS‐PCR). Using a diagnostic test for analysis of the intron 22 inversion (Inv22), IS‐PCR results were validated by obtaining perfect agreement, in 32 and 43 cases previously studied by Southern blot and a former inverse PCR approach; and in 34 new cases. The combined use of a complementary and a diagnostic test over our population series showed no structural variants, i.e., deletions and duplications hypothesized in the literature. The test for genotyping F8 intron 1 inversion was validated by perfect result agreement in 21 cases previously studied by double PCR, and 13 new cases. To investigate the usefulness of IS‐PCR in prenatal diagnosis, chorionic villus samples from an Inv22 carrier mother and her fetus were diagnosed. To study the cause of severe HA expression in heterozygous female carriers a system of the gene HUMARA for estimating X‐inactivation patterns (XIP) was adjusted and validated. We studied 6 women with severe HA: one showed an hemi‐homozygous mutation, c.3633delA, 4 showed heterozygous mutations with extremely skewed XIP; and one case, heterozygous for c.4388_4391delCTTT, showed a non skewed XIP in peripheral blood leukocytes (hypothesizing a different hepatic inactivation). A series of 37 heterozygous carriers and a control group of 20 non‐carriers were studied for XIP‐FVIII: C correlation. We analyzed contingency tables and relative errors (Obs.‐ Esp.) applying an original theoretical model and found modest significant differences (p minor than 0.05) associated with a wide variation of FVIII:C. This work presented the first molecular series of HB causative mutations in Argentina, the development of a new strategy for characterization of large DNA inversions causing severe HA and investigate the causes of a full expression of severe HA phenotype in women.

Pérez Millán, María Inés. "Estudio de la participación del receptor de dopamina D2 en la regulación de lactotropodos hipofisarios y su influencia en el desarrollo de prolactinomas mediante la generación de un ratón transgénico tejido específico" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Con el objetivo de estudiar la participación del receptor dopaminérgico D2 (RD2) en células hipofisarias productoras de prolactina hemos desarrollado ratones mutantes incapaces de expresar el gen de RD2 (Drd2) selectivamente en lactotropos. Para producir estos ratones con mutaciones nulas de Drd2 restringidas a lactrotropos generamos ratones transgénicos que expresan la recombinasa Cre bajo el control transcripcional del promotor de prolactina de ratón (Prl-Cre) y luego los cruzamos con ratones mutantes condicionales para el gen del RD2 (Drd2^flox/flox) para producir ratones mutantes y transgénicos compuestos (Drd2^flox/flox.Tg Prl-Cre). La caracterización molecular y bioquímica mostró que los ratones Drd2^flox/flox.Tg Prl-Cre no expresan Drd2 en el lóbulo anterior de la hipófisis pero sí en el lóbulo intermedio y en todas las áreas del cerebro donde Drd2 se expresa normalmente. En consecuencia, esta nueva cepa de ratones con mutaciones nulas de Drd2 restringidas a lactotropos fue denominada pitD2RKO. Los ratones pitD2RKO presentan niveles elevados de prolactina que resultan extremadamente altos en hembras adultas que desarrollan prolactinomas hipofisarios. Como consecuencia de la falta de receptores RD2 lactotrópicos, los niveles de prolactina de los ratones pitD2RKO no aumentan luego de la administración aguda del antagonista de RD2s, haloperidol. Las curvas de crecimiento corporal de los ratones pitD2RKO resultaron normales así como los distintos parámetros asociados al eje de la hormona de crecimiento (GH), en marcado contraste con lo estudiado en ratones mutantes totales del RD2 (Drd2^+) que son enanos. Esta observación indica que la ausencia de RD2s de los lactotropos hipofisarios no es responsable del déficit severo presente en el eje de GH de los ratones Drd2^+. Sorprendentemente, las hembras pitD2RKO presentan un aumento considerable de la ingesta de alimento y del peso corporal a partir de los 90 días de edad, probablemente como consecuencia de los elevados niveles crónicos de prolactina. Finalmente, analizamos los prolactinomas experimentales resultantes en nuestro nuevo modelo y ampliamos el estudio a adenomas hipofisarios humanos; en ambos casos, de manera interesante, observamos un aumento en la proliferación celular y en la angiogénesis de los adenomas respecto a las hipófisis controles, contrariamente a lo publicado.

Abstract:
To study the participation of the dopamine D2 receptor (D2R) on pituitary lactotropes we have generated mutant mice that are unable to express the D2R gene (Drd2) selectively in lactotropes. We first generated transgenic mice expressing Cre recombinase under the transcriptional control of the mouse prolactin promoter (Prl-Cre). Prl-Cre transgenic mice were mated with mutant mice carrying conditional null mutations of Drd2 (Drd2^flox/flox) to produce compound mutant/transgenic mice (Drd2^flox/flox.Tg Prl-Cre). Molecular and biochemical characterization of these mice showed they lack Drd2 expression in the anterior lobe of the pituitary while normally expressing Drd2 in the pituitary intermediate lobe and in all brain areas. Thus, we designated this novel lactotrope-specific Drd2 mutant mouse strain pitDrd2^+ o pitD2RKO. PitD2RKO mice had elevated serum prolactin levels that were extremely high in adult females which eventually developed pituitary prolactinomas. As a result of lactototrope D2R disruption, the acute administration of the D2R antagonist haloperidol failed to raise prolactin levels in pitD2RKO mice. Body growth curves in pitD2RKO mice were normal as well as several parameters related to the growth hormone (GH) axis, in clear contrast to what had been shown in null Drd2 mutant mice (Drd2^+ or D2RKO). This observation indicates that the absence of D2Rs in pituitary lactotropes is not responsible for the severe GH axis deficit found in D2RKO mice. Strikingly, pitD2RKO female mice developed a considerable increase in food intake and body weight starting at 90 days old, probably as a consequence of their chronically elevated prolactin levels. Finally, we analyzed the resulting experimental prolactinomas in our new model and extended the study to human pituitary adenomas. In both cases we observed a rise in cell proliferation and angiogenesis in the pituitary adenomas respect to the normal pituitary.

Duffy, Tomás. "Desarrollo y aplicación de estrategias de PCR para la genotipificación y cuantificación de Trypanosoma cruzi" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La infección por el parásito Trypanosoma cruzi (T. cruzi), causante de la enfermedad de Chagas, sigue siendo un importante problema de salud pública en los 21 países endémicos de América, con una prevalencia estimada de 8 millones de personas infectadas. Esta enfermedad muestra un curso clínico variable, desde asintomática hasta fases crónicas con parasitemias bajas, cuya forma más severa es la cardiopatía. En diferentes regiones endémicas los pacientes se encuentran infectados con distintas poblaciones parasitarias que a su vez podrían desempeñar un papel en la patogenia, las formas clínicas y la gravedad de la enfermedad. Para el tratamiento de la enfermedad actualmente se dispone de quimioterapias que son más eficaces en las infecciones recientes que en la población adulta crónica. A su vez, la evaluación de la eficacia de nuevas drogas se encuentra seriamente comprometida dado que el criterio de cura actualmente se basa en la conversión serológica a negativa, lo que puede ocurrir sólo años después del tratamiento, lo que requiere un largo plazo de seguimiento. En este contexto, nos propusimos desarrollar ensayos de PCR cuantitativa (QPCR) sensibles y precisos para la cuantificación de la carga parasitaria que permitan evaluar tempranamente la eficacia o el fracaso de nuevas drogas tripanocidas, así como monitorear la respuesta al tratamiento con las drogas actuales en casos clínicos. El otro objetivo de la tesis ha sido el desarrollo de estrategias de PCR sensibles y con distintos grados de resolución para la genotipificación de T. cruzi. Estas técnicas permiten tipificar las poblaciones parasitarias directamente a partir de muestras biológicas y por lo tanto establecer asociaciones entre el genotipo del parásito y las formas clínicas de la enfermedad, así como evaluar el rol eco-epidemiológico de las distintas poblaciones parasitarias.

Abstract:
Infection with the parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi), which causes Chagas disease, remains a major public health concern in 21 endemic countries of America, with an estimated prevalence of 8 million infected people. Chagas disease shows a variable clinical course, ranging from asymptomatic to chronic stages with low parasitaemias, whose severest form is heart disease. Individuals from different endemic regions are infected with distinct parasite populations that may play a role in pathogenesis, clinical forms and severity of the disease. Current chemotherapies are unsatisfactory since they are more effective in recent infections than in the chronic adult population, and the criterion of cure relies on serological conversion to negative, which may occur only years after treatment, requiring long-term follow-up, hampering novel drug trails. In this context, we aimed to develop sensitive and accurate quantitative PCR strategies (QPCR) for T. cruzi quantification that may allow an early assessment of efficacy or failure of novel drugs in future trials, as well as to follow-up patients under etiological treatment with the currently available chemotherapies. The second aim of this thesis has been the development of sensitive PCR strategies for genotyping T. cruzi populations. These assays allow us to establish relationships between parasite genotypes and clinical forms of the disease, as well as to evaluate the eco-epidemiological role of distinct parasite populations.

Calero, Cecilia Inés. "Modulación redox de los receptores GABAc p1" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
MODULACIÓN REDOX DE LOS RECEPTORES GABACρ1: En condiciones fisiológicas en el SNC la producción de especies reactivas de oxígeno es una consecuencia natural del metabolismo celular y el posible daño oxidativo se encuentra balanceado por antioxidantes intrínsecos. La actividad de un gran número de receptores sinápticos y canales iónicos puede ser modulada por agentes redox endógenos y/o farmacológicos. Estos incluyen a los NMDAR y AChR, así como también a los GABAAR, entre otros. Aunque, los GABAAR son susceptibles a diversos agentes redox, estudios previos sugerían una falta de sensibilidad de los GABACR a este tipo de modulación. Con el fin de estudiar si compuestos con propiedades redox son capaces de modular la actividad de los GABACR se expresaron heterólogamente en ovocitos de Xenopus laevis GABACR ρ1 homoméricos (GABAρ1R), y sus respuestas -corrientes de Cl- evocadas por GABA- se registraron electrofisiológicamente. Nuestros resultados muestran que los GABAρ1R, al igual que otros miembros de la familia cys-loop, son sensibles a los agentes redox. En presencia de compuestos reductores las curvas D-R se desplazaron hacia la izquierda, mientras que los oxidantes produjeron el efecto opuesto, esto indica un aumento o una disminución, respectivamente, en la afinidad aparente por el agonista de los GABAρ1R. Asimismo, encontramos que la modulación inducida por ácido ascórbico, un antioxidante celular, presenta tanto componentes redox como alostèricos. La modulación de los GABAρ1R fue suceptible a la modificación química de los grupos sulfhidrilos y a la mutación H141D, indicando que estos sitios, localizados en el dominio extracelular, tienen un importante rol en el proceso.

Abstract:
REDOX MODULATION OF GABAC ρ1 RECEPTORS: Free radical production is a natural consequence of metabolism and the possible oxidative damage is limited by cellular antioxidant mechanisms. Activity of many receptors and channels in the CNS can be regulated by redox mechanisms. Whereas the action of redox agents has been demonstrated on GABAA receptors, the sensitivity of GABAC receptors has not been studied. Here we report the effects of ascorbic acid, together with several reducing and oxidizing agents on homomeric GABAρ1 receptors (GABAρ1R) expressed in X. laevis oocytes. Our results showed that, similarly to others members of the cys-loop family, GABAρ1R were highly sensitive to redox modulation. Dose–response curves for GABA were shifted to the left in the presence of reducing agents, whereas oxidizing agents produced the opposite effect. Susceptibility was strongly dependent on GABA concentration. We also found that ascorbic acid modulation had both redox and non-redox components. GABAρ1R modulation was affected by chemical modification of SH- and site-directed mutagenesis of H141, indicating that these sites, located in the extracellular domain, play a key role in this process.

Dellarole, Mariano. "E2, regulador de transcripción y replicación del papilomavirus humano: interacción con ADN, dinámica conformacional y divergencia evolutiva" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Más de 50 tipos de papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelio mucoso causando una variedad de lesiones benignas y malignas. El dominio C-terminal de la proteína E2 de HPV (E2C) discrimina entre cuatro sitios de ADN altamente similares regulando el ciclo de vida del virus vía la activación de la replicación y la activación y/o represión de la transcripción. Con el fin de tratar de entender la naturaleza de la interacción entre E2C y ADN, realizamos un análisis detallado del complejo utilizando herramientas bioinformáticas y el contenido de información en las secuencias proteicas y nucleotídicas y usando técnicas biofísicas, proteínas E2C recombinantes y sitios sintéticos de ADN específicos y no-específicos. Antes de estudiar el rol de la interacción E2C-ADN, nos focalizamos en el proceso de polimerización no-funcional de E2C dado que su desarrollo es reprimido por la presencia de ADN específico. Inducida por temperatura, la polimerización de E2C se desencadena mediante la formación de un núcleo estructurado y finaliza en un paisaje morfológico de oligómeros solubles con propiedades amiloideas. El estudio computacional de la interacción E2-ADN de todos los tipos de HPV mucosos indica que las proteínas E2 de distintos tipos poseen propiedades de discriminación de ADN similares. Las diferencias en la interacción E2-ADN se encuentran principalmente en la secuencia de ADN específico, en acuerdo con el análisis de la unión de E2C a diferentes sitios mediante titulaciones isotérmicas de calorimetría. Basado solamente en la secuencia de ADN, logramos predecir diferencias en la energía de unión las cuales se ordenaron en seis grupos de afinidades discretas. Ciertas jerarquías de afinidades como también distancias entre sitios y presencia de sitios de metilación se encontraron estadísticamente asociados con tipos de HPV propensos a ser malignos. Estudiamos la estabilidad y la propiedad de discriminación de secuencia de cinco proteínas E2C homólogas de identidad de secuencia proteica en el rango 44% al 77%. La desnaturalización al equilibrio y la cinética de desplegado en cloruro de guanidinio mostró que todos los dominios son homodímeros estables que se desnaturalizan vía un mecanismo de dos estados. Medimos la unión a distintos sitios de ADN y confirmamos que el mecanismo de unión para todos los complejos es el mismo en base a una genuina compensación entropico-entálpica. Nuestros resultados muestran que la inusual estructura de barril-beta de E2C puede acomodarse a numerosas mutaciones manteniendo las propiedades cruciales de conformación y función. Pero la unión cooperativa a sitios adyacentes de ADN mostró que los componentes entálpicos-entrópicos de la reacción como la deformación del ADN puede divergir entre distintas homólogas en acuerdo con un fuerte acoplamiento entre la dinámica global de la proteína y el reconocimiento del ADN.

Abstract:
More than 50 Human papillomavirus (HPV) types infect mucosal epithelia causing a variety of benign and malign lesions. The C-terminal domain of HPV E2 protein (E2C) discriminates between four highly similar cognate DNA sites in order to regulate the virus life cycle by activating replication and repressing and/or activating transcription. In order to try to understand the nature of the interaction between E2C and DNA, we performed a detailed analysis of the complex using bioinformatics tools and the information content on DNA sequences and using biophysical techniques and recombinant engineered and homologous E2C proteins and synthesized specific and nonspecific DNA sites. Before studying the role of the E2C-DNA interaction, we focused on the nonfunctional polymerization process of E2C as its development is repressed by the presence of DNA binding sites. Triggered by heat, the polymerization of E2C starts by formation of a stable and structured nucleus and ends in an organized morphology landscape of soluble amyloid-like oligomers. The computational study of the E2-DNA interaction of all mucosal HPV types, indicates that E2 proteins have similar DNA discrimination properties. Differences in E2-DNA interaction among HPV types lie mostly in the target DNA sequence, in agreement with the analysis of binding of E2C to different sites using isothermal titration calorimetry. Based on DNA sequences only, we could predict differences in binding energies which clustered into six discrete affinity hierarchies. Finally, certain distances between sites, affinity hierarchies and their eventual changes upon methylation, are statistically associated with high-risk types. We studied the stability and DNA discrimination properties of five homologous E2C proteins with sequence identities ranging from 45% to 77%. Equilibrium denaturation and unfolding kinetics in guanidinium chloride showed that all five domains are very stable homodimers that unfold via a two-state mechanism. We used isothermal titration calorimetry to follow binding of the five proteins to three different DNA sites. Genuine enthalpy-entropy compensation confirms that the binding mechanism is the same for all complexes. The five domains have nearly identical capacities for DNA sequence discrimination despite the high degree of sequence divergence. Our results show that the unusual E2C beta-barrel can accommodate many mutations while retaining its crucial conformational and functional properties. But cooperative binding to tandem DNA E2 site showed that the enthalpic-entropic components of the reaction and DNA deformation can diverge in agreement with a strong coupling between global dynamics and DNA recognition.

Bey, Paula. "Optimización de la expresión de un amplicón viral basado en PVX en plantas de tabaco. Caracterización funcional de la proteína de 15 kDa del Garlic mite-borne filamentous virus" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Con el objetivo de optimizar la producción de proteínas heterólogas en plantas se desarrolló un sistema de expresión basado en un amplicón derivado del genoma del PVX. Se diseñaron distintos amplicones virales que permiten la expresión, tanto constitutiva como inducible, de proteínas recombinantes. La utilización del amplicón constitutivo permitió obtener, por primera vez, plantas transgénicas que sobrexpresan altos niveles de proteínas virales. Además, se logró expresar exitosamente GFP a partir de un amplicón inducible, tanto en ensayos de expresión transitoria como en plantas transgénicas. Uno de los problemas que dificultan la producción de proteínas de interés en plantas utilizando vectores virales es el establecimiento de respuestas de silenciamiento génico postraduccional (PTGS) en respuesta a la replicación viral. Para intentar superar esta dificultad, se propuso co-expresar un amplicón viral junto con una proteína supresora del PTGS. Se caracterizó la actividad de una nueva proteína supresora del PTGS, la proteína 15K codificada en el genoma del Garlic mite-borne filamentous virus (GmbFV). Si bien esta proteína muestra una actividad supresora débil en plantas silenciadas por agroinfiltración con transgenes u horquillas de silenciamiento, presenta la ventaja de no producir fenotipos aberrantes en plantas transgénicas. Mediante la co-agroinfiltración con construcciones que expresan la proteína 15K y el amplicón PVX-2aA (amplicón que expresa el epítope 2aA del virus de aftosa) se lograron obtener altos niveles de una fusión del epítope de interés a la cápside viral en plantas de Nicotiana benthamiana en un corto período de tiempo. Este resultado sugiere que es posible generar sistemas estables que permitan obtener altos niveles de expresión mediante el cruzamiento entre plantas transgénicas que expresen la proteína supresora 15K y amplicones de interés.

Abstract:
In order to optimize the production of heterologous proteins in plants, an expression system based on the PVX genome has been developed. Several viral amplicons have been designed with the purpose of expressing recombinant proteins, either constitutively or in an inducible manner. The use of constitutive amplicons led, for the first time, to the generation of transgenic plants which over-express high levels of viral proteins. Moreover, GFP protein was successfully expressed from an inducible amplicon, both in transient expression assays and in transgenic plants. One of the problems that hinder the production of heterologous proteins using plant viral vectors is the establishment of post-transcriptional gene silencing (PTGS) in response to viral replication. In an attempt to overcome this restriction, the co-expression of PTGS- suppressor proteins and viral amplicons was explored. The 15K protein of Garlic mite-borne filamentous virus (GmbFV) has been characterized as a new PTGS-suppressor. Although this protein shows suppressor activity in agroinfiltration assays triggered by both transgenes or silencing hairpins, it has the advantage of avoiding the development of aberrant phenotypes in transformed plants. Co-agroinfiltration of the 15K protein and the PVX-2aA amplicon (harbouring the 2aA epitope of Foot and mouth disease virus) yielded high levels of a fusion comprising the epitope of interest and the PVX coat protein in N. benthamiana. This result suggest that stable expression systems could be developed by crossing of transgenic plants carrying the 15K suppressor protein and plant viral amplicons.

García Samartino, Clara. "Interacciones de Brucella abortus con la inmunidad innata del sistema nervioso central como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La invasión al sistema nervioso central (SNC) por bacterias del genero Brucella resulta en un desorden inflamatorio llamado neurobrucelosis. En este trabajo nosotros presentamos evidencia in vivo e in vitro mostrando que B. abortus y sus lipoproteínas activan la inmunidad innata del SNC, originando una respuesta inflamatoria que lleva a la astrogliosis, una característica típica de neurobrucelosis. Inyecciones intracraneales de B. abortus muerta por calor (HKBA) o de la proteína de la membrana externa 19 (Omp19), una lipoproteína de B. abortus utilizada como modelo, indujeron astrogliosis concomitantemente con un infiltrado neutrofilico en el cuerpo estriado de los ratones. La infección de astrocitos y microglia con B. abortus incitó la secreción de IL-6, IL-1beta, TNF-alfa, MCP-1 y KC (CXCL1). HKBA también estimuló la liberación de estos mediadores inflamatorios, sugiriendo la independencia de la viabilidad bacteriana en este fenómeno e implicando a un componente estructural de la bacteria. De acuerdo con esto, Omp19 indujo el mismo patrón de secreción de citoquinas y quimiocinas. La respuesta inflamatoria desencadenada por Omp19 estuvo mediada por TLR2, ya que cultivos de células gliales provenientes de ratones TLR2 KO no promovieron la secreción de mediadores proinflamatorios. Sin embargo este receptor no media la infección ni la replicación de la bacteria en astrocitos o en microglía. La infección con B. abortus promovio apoptosis de astrocitos pero no de microglia. HKBA y Omp19 indujeron, no solo la apoptosis de los astrocitos sino también su proliferación, dos de las caracteristicas que se observan durante la astrogliosis. La proliferación inducida por HKBA y Omp19 disminuyó en presencia de Ac anti-IL-6. Por otro lado, la apoptosis promovida por los 2 estímulos fue completamente suprimida en células provenientes de ratones deficientes del receptor p55 de TNF-alfa o cuando se agregó a los cultivos el inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK. Por lo tanto, IL-6 contribuye a la proliferación de astrocitos, y la senalización de TNF-alfa vía TNFR1 a través de caspasas determina la apoptosis, cuando son estimulados con B. abortus y sus lipopoproteínas. Los resultados de esta tesis son prueba de principio de que las lipoproteínas de Brucella podrían ser determinantes de patogenia claves en neurobrucelosis, y que la astrogliosis podria contribuir a la patogénesis de la misma.

Abstract:
Central nervous system (CNS) invasion by bacteria of the genus Brucella results in an inflammatory disorder called neurobrucellosis. In this study we present in vivo and in vitro evidence showing that B. abortus and its lipoproteins activate the innate immunity of the CNS, eliciting an inflammatory response that leads to astrogliosis, a characteristic feature of neurobrucellosis. Intracranial injection of heat killed B. abortus (HKBA) or outer membrane protein 19 (Omp19), a B. abortus lipoprotein used as a model, induced astrogliosis with concomitant neutrophil's infiltrate in mouse striatum. Infection of astrocyte and microglia with B. abortus induced the secretion of IL-6, IL-1beta, TNF-alpha, MCP-1 and KC (CXCL1). HKBA also induced these inflammatory mediators, suggesting independency of bacterial viability and involvement of a structural component of the bacterium. Accordingly, Omp19 induced the same cytokine and chemokine secretion pattern. TLR2 mediated the inflammatory response induced by Omp19 since cultures from TLR2 KO mice did not induced the secretion of proinflammatory mediators. However, this receptor is not envolved in the infection or replication of the bacteria inside astrocytes or microglia. B. abortus infection induced astrocyte, but not microglia, apoptosis. HKBA and Omp19 elicited not only astrocyte apoptosis but also proliferation, two features observed during astrogliosis. Proliferation induced by HKBA and Omp19 was diminished in the presence of anti-IL-6 antibody, and apoptosis induced by both stimuli was completely suppressed in cells of TNF-alpha receptor p55-/- mice or when the general caspase inhibitor Z-VAD-FMK was added to cultures. Hence, IL-6 contributes to astrocyte proliferation, and TNF-alpha signaling via TNFR1 through the coupling of caspases determines apoptosis, as elicited by B. abortus and its lipoproteins. Our results provide proof of the principle that Brucella lipoproteins could be key virulence factors in neurobrucellosis, and that astrogliosis might contribute to neurobrucellosis pathogenesis.

Larzábal, Mariano. "Identificación de péptidos bloqueantes del sistema de secreción de tipo III y de la adherencia a epitelios de Escherichia coli enterohemorrágico (EHEC) y Escherichia coli enteropatógeno (EPEC)" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Escherichia coli Enteropatógeno (EPEC) y Escherichia coli Enterohemorrágico (EHEC) se encuentran asociadas con diarrea en seres humanos. EPEC es una de las principales causas de diarrea infantil en países desarrollados, mientras que EHEC es responsable de enfermedades cuyo espectro clínico incluye diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH), que es la principal causa de insuficiencia renal aguda de niños menores de 5 años en la Argentina. La expresión de la toxina Shiga (Stx) codificada por bacteriófagos integrados al cromosoma de cepas EHEC, es considerada la responsable de la colitis hemorrágica y el SUH. El principal reservorio de EHEC es ganado bovino sano a pesar de que un número limitado de serotipos se han asociado con diarrea en terneros jóvenes, mientras que el reservorio de EPEC son los niños sintomáticos y asintomáticos. Ambos patotipos de E. coli, al igual que Citrobacter rodentium, poseen un isla de patogenicidad conocida como Locus of enterocyte effacement (LEE). El LEE codifica para el sistema de secreción de tipo III (SSTT), cuya función es traslocar proteínas efectoras a los enterocitos, provocando la subversión celular. Este resulta en la formación de lesiones características de attaching and effacement (A/E) en el epitelio intestinal, que consisten en la destrucción de las microvellosidades y la formación de pedestales de actina polimerizada por debajo del sitio de contacto entre la bacteria y la célula. El SSTT es una estructura compleja con más de 20 proteínas que forman un sistema de 'aguja y jeringa' que permite inyectar proteínas efectoras directamente en la célula hospedadora. El LEE contiene cinco grandes operones que han sido completamente secuenciados: LEE1, LEE2, LEE3, LEE4 y LEE5. EspA, EspB y EspD son algunas de las proteínas codificadas por el LEE4 que componen la parte del traslocon del SSTT. EspA, es la proteína mayoritaria, y sus polímeros forman filamentos huecos (estructura aguja), que están presentes de manera transitoria. EspB y EspD, se asocian al extremo del filamento y están involucrados en la formación de poros en las membranas de las células infectadas. El extremo proximal del filamento de EspA se apoya sobre el cuerpo basal formado por polímeros de la proteína EscF, que también se encuentra codificado en el LEE4. La proteína de membrana externa intimina, se encuentra codificada en el LEE5, y es responsable de la adherencia íntima de la bacteria al enterocito, así como también su propio receptor Tir, que es traslocado a través de la SSTT al citoplasma para luego anclarse en la membrana celular. Con el fin de utilizar a los factores de virulencia responsables de la lesión A/E como blancos de terapias de intervención, se determinó la inmunogenicidad y la antigenicidad de las proteínas del sistema de secreción de tipo III y la adhesina intimina empleando calostro de bovinos naturalmente infectados o colonizados. Los resultados demostraron que el calostro de bovinos no vacunados, proveniente de ganado lechero y cárnico de la región Pampeana de la Argentina, contiene una alta frecuencia de anticuerpos contra las proteínas intimina-γ C280, EspA y EspB. Por otro lado, también se obtuvieron sueros policlonales a partir de conejos inmunizados con proteína EspA, EspB y N-EspD recombinantes, demostrando la capacidad por parte de estas proteínas de inducir elevados títulos de respuesta inmune humoral en anticuerpos IgG. En este trabajo, se observó que tanto el calostro bovino como anticuerpos policlonales específicos contra proteínas del SSTT, inhibieron la acción mediada por SSTT de EPEC 2348/69 sobre los GRs de manera dependiente de la dosis, demostrando que compuestos dirigidos contra el SSTT pueden inhibir su funcionalidad. Estos efectos protectores han sido parcialmente atribuidos a la presencia de anticuerpos contra componentes del SSTT, ya que una reducción significativa en la actividad inhibitoria fue obtenida cuando el calostro o los sueros policlonales fueron depletados de IgG total. La inmunogenicidad, antigenicidad y exposición en superficie de varios de los componentes responsables de la lesión A/E, los convierte en potenciales candidatos para vacunas, y moléculas blanco para péptidos y otros compuestos. Por lo tanto, resulta atractiva la estrategia de utilizar a los factores de virulencia como blanco de terapias de intervención. Con el objetivo de impedir el desencadenamiento de la acción del SSTT por parte de EHEC y EPEC, se utilizó la técnica de phage display para disponer de péptidos de 12 aminoácidos seleccionados específicamente contra proteínas estructurales y efectoras del SSTT, como EspA y EspB, susceptibles de ser bloqueadas. Si bien, los péptidos obtenidos por phage display tuvieron una alta afinidad hacia las proteínas blanco, no consiguieron neutralizar la patogénesis de EPEC in vitro, indicando que no necesariamente la interacción entre péptidos y proteínas blanco afecta la funcionalidad del SSTT. Teniendo en cuenta estos resultados, se trató de reducir el rango de especificidad de péptidos hacia regiones altamente conservadas y funcionalmente importantes de proteínas estructurales del inyectosoma, como son las regiones coiled-coil que consisten en α-hélices hidrofóbicas con repeticiones de siete aminoácidos, que participan de las interacciones proteína-proteína especialmente en la formación de complejos de multímeros. En este estudio, se examinaron los péptidos sintéticos, diseñados para bloquear la formación del SSTT. Los péptidos CoilA y CoilB, representan la región coiled-coil del C-terminal de la proteína traslocadora EspA y el péptido CoilD, correspondiente a la región coiled–coil del extremo N-terminal de la proteína EscF, fueron efectivos en la inhibición de la hemólisis de glóbulos rojos dependiente del SSTT de EPEC E2348/69 y EHEC O157:H7. Los péptidos de CoilA y CoilB también redujeron la formación de pedestales de actina cuando fueron pre-incubados con las bacterias EPEC E2348/69 y afectaron la traslocación por medio del SSTT a las células epiteliales de la proteína efectora Tir. A su vez, CoilA y CoilB fueron capaces de bloquear el ensamble del filamento de EspA, evitando la polimerización in vitro de la proteína EspA recombinante y por microscopía electrónica se observó una reducción en la longitud de los filamentos de EspA. Esto sugiere que los péptidos coiled-coil pueden prevenir el montaje y por lo tanto la funcionalidad del TTSS. A su vez, ensayos de western blot demostraron que los péptidos también inhibieron la correcta secreción de las proteínas EspB y EspD en EPEC E2348/69 y EspD en C. rodentium. Estos resultados motivaron a desarrollar un ensayo de protección contra C. rodentium in vivo, como modelo de infección para bacterias que contienen LEE. El tratamiento vía oral de ratones con una combinación de péptidos CoilA y CoilB, previa y durante la infección con C. rodentium, previno de la lesión A/E colónica. Estos resultados demostraron que el tratamiento preventivo y post inoculación con los péptidos coiled-coil inhibe la formación del SSTT de C. rodentium in vivo, actuando con un efecto protector contra la formación de la lesión A/E en ratones. En conclusión, el diseño de moléculas que perjudiquen la asociación íntima de los patógenos a la mucosa intestinal probablemente tendrán un efecto importante en las estrategias disponibles contra microorganismos patógenos, y existe la posibilidad de que los inhibidores específicos contra un mecanismos de virulencia sean efectivos por un largo tiempo antes que la resistencia se convierte en un problema, ya que habría poca o ninguna presión selectiva al no afectar la viabilidad, reduciéndose así el desarrollo de resistencia a estos agentes antimicrobianos. La investigación orientada a la búsqueda de inhibidores contra distintos mecanismos de virulencia puede tener un alto potencial terapéutico y preventivo como en este caso, a la vez que puede servir como herramienta para dilucidar los sistemas regulatorios intrínsecos que modulan la virulencia EPEC y EHEC o de cualquier otra bacteria que posea un SSTT. Los péptidos coiled-coil son moléculas pequeñas, más fáciles de sintetizar que moléculas orgánicas complejas, y podrían ser parte de formulaciones nutracéuticas contra patógenos diarreagénicos. Por lo tanto, la interferencia en la formación y/o funcionalidad del SSTT podría evitar la manifestación de lesiones A/E, impedir la colonización del epitelio intestinal y en última instancia podrían prevenir la enfermedad. Incluso, reducir la carga bacteriana de animales próximos a ingresar a frigorífico o mantenidos en feed-lot, disminuyendo la posibilidad de contaminación de la carne.

Abstract:
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are associated with diarrhea in humans. EPEC is one of the leading causes of childhood diarrhea in developed countries, while EHEC is responsible for the clinical spectrum disease include diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS), which is the main cause of acute renal failure in children under 5 years in the Argentina. The expression of Shiga toxin (Stx) encoded by bacteriophages integrated in the chromosome strains EHEC is considered responsible for hemorrhagic colitis and HUS. The main reservoir of EHEC is healthy cattle while a limited number of serotypes have been associated with diarrhea in young calves while EPEC reservoir is symptomatic and asymptomatic children. Both diarrheagenic E. coli, as well as Citrobacter rodentium, possess a pathogenicity island known as the locus of enterocyte effacement (LEE). The LEE encodes type III secretion system (TTSS) whose function is to translocate effector proteins to the enterocytes, causing cellular subversion. This results in the formation of characteristic attaching and effacement lesions (A/E) in the intestinal epithelium, which consist of the microvilli destruction and formation of actin polymerized than contact between bacteria and the cell site pedestals. The TTSS is a complex structure with more than 20 proteins that forms a system of 'needle and syringe' which allows injecting effector proteins directly into the host cell. The LEE contains five major operons which have been fully sequenced: LEE1 LEE2, LEE3 LEE4 and LEE5. EspA, EspB and EspD are some of the proteins encoded by the LEE4 comprising part of the TTSS translocon. EspA, is the major protein and its polymers are hollow filaments (needle structure), which are present on a transitional basis. EspB and EspD, are associated with the end of the filament and are involved in the formation of pores in the membranes of the infected cells.The proximal end of the EspA filament relies on basal body formed by the EscF polymers, protein that is also encoded in the LEE4. The outer membrane protein, Intimin, is encoded in the LEE5 and is responsible for intimate adhesion to the enterocytes as well as its own receptor Tir, which is translocated through TTSS into the cytoplasm to then anchor into the cell membrane. In order to use the virulence factors responsible for the A/E lesion as targets of intervention therapies, the immunogenicity and antigenicity of TTSS proteins and intimin using naturally infected or colonized bovine colostrum. The results showed that bovine colostrum from unvaccinated dairy and meat cattle from Argentina contains a high frequency of antibodies against intimin-γ C280, EspA and EspB proteins. On the other hand polyclonal IgG antibodie from in rabbits immunized with EspA, EspB and N-EspD recombinant proteins, demonstrating the ability of these proteins to induce a strong humoral immune response. In this work, it was observed that both bovine colostrum and specific polyclonal antibodies against proteins of the TTSS inhibited the lysis on the red blood cells (RBCs) mediated by TTSS of EPEC 2348/69, demonstrating that directing substances against the TTSS can inhibit its functionality. These protective effects have been partially attributed to the presence of antibodies against the TTSS components because a significant reduction in inhibitory activity was obtained when colostrum or polyclonal sera were IgG totally depleted. Immunogenicity, antigenicity and exhibition surface of various proteins responsible for the A/E lesion, demonstrated that they can be potential candidates for vaccines, and target molecules for peptides and other molecules. The strategy used to intervention therapies target virulence factors is therefore attractive. In order to prevent the triggering action from EHEC and EPEC TTSS, the technique of phage display was used to obtain peptides of 12 aminoacids selected specifically against structural and effector TTSS protein such as EspA and EspB, likely to be blocked. Although peptides obtained by phage display had a high affinity towards target proteins, did not neutralize the pathogenesis of EPEC in vitro, indicating that not necessarily interaction between peptides and target proteins affects the functionality of the TTSS. Given these results, the range of specificity of peptides was reduce to functionally important and highly conserved regions of the inyectosome-structural proteins such as coiled-coil regions, consisting of hydrophobic α- helices with repetitions of seven amino acids involved in protein-protein interactions especially in the formation of multimers complexes. This study examined the synthetic peptides, designed to block the formation of the TTSS. Peptides CoilA and CoilB, represent the coiled-coil region at the C-terminus of the protein EspA and the peptide CoilD, corresponding to the coiled-coil region of N-terminal EscF protein, were effective in RBCs hemolysis mediated by TTSS of EPEC E2348/69 and EHEC O157:H7. Peptides CoilA and CoilB also reduced formation of actin pedestals when they were pre-incubated with EPEC E2348/69 bacteria and affected translocation by the TTSS epithelial cells of the Tir effector. In turn, CoilA and CoilB were able to block the ensemble the filament of EspA, avoiding the polymerization in vitro of EspA recombinant protein. By electron microscopy a reduction in the length of the filaments of EspA was observed. This suggests the coiled-coil peptides can prevent the ensemble and thus the TTSS functionality. In turn, western blot assays showed that peptides also inhibited the correct secretion of EspB and EspD proteins from EPEC E2348/69 and EspD protein from C. rodentium. These results led to develop a test for protection against C. rodentium in vivo, as model of infection by bacteria containing LEE. Treatment by oral route of mice with a combination of peptides CoilA and CoilB prior and during the infection with C. rodentium, prevented colonic A/E lesion. These results showed that preventive treatment and post inoculation with the coiled-coil peptides inhibits the formation in vivo of TTSS from C. rodentium, acting with a protective effect against the formation of A/E lesion in mice. In conclusion, design molecules which harm the intimate association of pathogens to the intestinal mucosa probably will be an important effect on strategies available against pathogenic microorganisms. The specific inhibitors against virulence mechanism are effective for a long time before resistance becomes a problem, since there would be little or no selective pressure to affect the viability, thus reducing the development of resistance to antimicrobial agents. Research aimed at finding inhibitors against different mechanisms of virulence can have a high therapeutic and preventive potential as in this case. Also, it can used as a tool for elucidating the regulatory mechanisms that modulate the EPEC and EHEC virulence, and also for any other bacteria possessing a TTSS. Coiled-coil peptides are small molecules, easierad to synthesize than complex organic molecules, and could be part of nutraceutic formulations against diarrheagenic E. coli. Therefore, training and/or functionality of the TTSS interference could avoid A/E lesion manifestation, the colonization of the gut epithelium and ultimately could prevent the disease. Even could reduce the bacterial load of animals going to slaugtherhouse or at the feed-lot, decreasing the possibility of contamination of meat.

Wargon, Victoria. "Resistencia constitutiva y adquirida al tratamiento hormonal de carcinomas mamarios murinos" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Alló, Mariano. "Regulación epigenética del splicing alternativo mediante RNAs pequeños y argonauta 1" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los RNAs pequeños interferentes (siRNAs) son conocidos por mediar el silenciamiento post-transcripcional de genes (PTGS) promoviendo la degradación de mRNAs targets. Cuando son dirigidos contra regiones promotoras, los siRNAs participan en una vía alternativa conocida como silenciamiento transcripcional de genes (TGS) que promueve la metilación de histonas, formación de heterocromatina e inhibición de la transcripción. Mostramos aquí que los siRNAs dirigidos contra secuencias ubicadas en cercanías al exón alternativo EDI del gen de la fibronectina son capaces de regular su splicing alternativo en celulas de mamíferos. El efecto necesita de dos proteínas claves de la vía de interferencia por RNA, AGO1 y AG02. Sin embargo, como sólo AGO1 es necesario para el TGS concluimos que ésta es la principal vía involucrada. Por otra parte, la importancia del estado de la cromatina ha sido resaltada al mostrar que los efectos son eliminados o reducidos por factores que favorecen una estructura cromatínica mas relajada o que aumentan la elongación de la transcripción. Más aun, el mecanismo involucra la presencia de marcas epigenéticas de heterocromatina facultativa (H3K9me2 y H3K27me3) intragénicas en la región target y la función de la proteína asociada a heterocromatina HP1alfa. Utilizando tecnología genome-wide encontramos que aproximadamente el 40% de los eventos de splicing alternativo contenidos en un panel de RT-PCR relacionado a cáncer fueron afectados tras la depleción de AGO1 o Dicer. Mediante experimentos de ChIP-seq hemos encontrado un enriquecimiento de clusters de AGO1 en promotores de genes con alta expresión y en exones ubicados en genes con baja tasa transcripcional. Adicionalmente, descubrimos un aumento del solapamiento de marcas de histonas sobre sitios target de AGO1. Finalmente, hemos detectado un evento de splicing alternativo endogeno del gen SYNE2 (exón 107) que podría estar siendo afectado fisiológicamente por AGO1.

Marazita, Mariela C.. "P19INK4D y su fosforilación secuencial son críticas para el mantenimiento de la integridad del genoma" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las proteínas INK4 (p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c, y p19INK4d) componen una familia de inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CDKs) que funcionan en la fase G1 bloqueando la actividad de las quinasas CDK4 y CDK6. Mientras que comparten similitudes en sus estructuras formadas por repeticiones de motivos ankirina, estas proteínas difieren en sus patrones de expresión durante el desarrollo y en el adulto. Más allá de la aparente redundancia de su función en el control del ciclo celular, algunos de sus miembros han sido involucrados en distintos procesos tales como diferenciación, senescencia y supresión tumoral. En este trabajo demostramos que p19INK4d es inducido por radiación UV en diferentes tipos celulares (células de Leydig MA-10, cultivos primarios de células de Leydig, BHK-21 y WI-38) y que la inducción es específica de este miembro de la familia. Planteamos que la inducción podría implicar una posible participación de p19INK4d en la reparación del ADN. Mediante diversas estrategias, establecimos que p19INK4d efectivamente tiene una función en este proceso. Además, frente a daño genotóxico la disminución en los niveles de p19INK4d aumentó el número de aberraciones cromosómicas, concluyendo que la actividad de p19INK4d afecta el mantenimiento de la integridad del genoma. Sumado a esto, las células con niveles reducidos de p19INK4d resultaron con menor capacidad de sobrevivir al tratamiento con radiación UV. En respuesta al daño al ADN se encienden una serie de cascadas de señales que involucran diversas proteínas quinasas. Estas quinasas activan a su vez diferentes sustratos efectores de la respuesta conduciendo a la reparación, o no, del daño. Habiendo descripto una función de p19 en este proceso el siguiente objetivo consistió en estudiar si p19 formaba parte de este grupo de proteínas efectoras fosforiladas frente al daño. Encontramos que p19 es fosforilada por agentes que inducen diferentes tipos de daño (radiación UV, péptido β-amiloide y cisplatino). Identificamos dos sitios de fosforilación, serina 76 y treonina 141, los cuales son fosforilados en forma secuencial. Los resultados señalan a CDK2 y CDK5 como responsables de la fosforilación en serina 76 y a PKA en treonina 141. La fosforilación de ambos sitios ocurre en el citoplasma y la serina 76 es necesaria para la translocación de p19 al núcleo en esta respuesta. Evaluamos luego la relevancia fisiológica de la fosforilación en estos sitios. Encontramos que tanto la serina 76 como la treonina 141 son estrictamente necesarias para la función de p19 en la reparación del ADN. Sin embargo, mutantes en estos sitios incapaces de ser fosforiladas, mantienen la misma capacidad de inhibir la proliferación del ciclo celular cuando son sobreexpresadas. Esto señala que existe una independencia en la función de reparación respecto de la función inhibitoria de CDK4/CDK6. Por último, iniciamos el estudio referido a las posibles proteínas que interactúan con p19INK4d relacionadas a la función de reparación del ADN. Describimos seis interactores encontrados por análisis de doble híbrido en levaduras que resultan de particular interés porque presentan funciones en procesos comunes a p19INK4d. Estos posibles interactores participan en la reparación del ADN, en la remodelación de la cromatina y en la regulación de factores de transcripción del ciclo celular y la apoptosis. En vista de la participación de p19INK4d en respuesta a diversos agentes genotóxicos, que activan distintos mecanismos de reparación, postulamos que p19INK4d actuaría en la reparación del ADN específicamente en una etapa temprana de la respuesta celular al daño al ADN. El análisis de los potenciales interactores de p19INK4d, luego de la injuria genotóxica, permite sugerir la participación de esta proteína en los complejos remodeladores de la cromatina necesarios para permitir el acceso de las maquinarias de reparación en los sitios de daño.

Abstract:
INK4 proteins are members of a family of cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors that function in G1 to block the activity of CDK4 and CDK6. While they share clear structural similarities, numerous studies have shown that INK4 proteins differ in their expression patterns during development and in the adult, and have differing roles in differentiation, senescence and tumor suppression. We demonstrated that p19INK4d is induced in response to UV radiation in different cell types (Leydig MA-10 cell line, primary Leydig cell culture, BHK-21 y WI-38) and that this induction is specific of this family member. We hypothesized that this fact could be related to a role of p19INK4d in DNA repair. Taking advantage of diverse strategies, we found that p19INK4d effectively participates in this process. Adding to this, diminished p19INK4d levels when cells are exposed to genotoxics leads to an increase in the number of chromosomal aberrations. From these facts we concluded that p19INK4d influences the maintenance of genome integrity. Furthermore, cells with reduced p19 expression resulted in a significant decrease of the survival rate upon UV damage. In DNA damage response different pathways are triggered involving the activity of protein kinases. These kinases in turn activate diverse substrates that act as effectors of the response leading or not to DNA repair. Having described a function of p19INK4d in this process, the next aim leaded the study to analize whether p19INK4d is part of the effector proteins phosphorylated after DNA damage. We found out that p19 is phosphorylated by treatment with agents which induce different types of DNA damage (UV light, β-amyloid peptide and cisplatin). We identified two phosphorylation sites, serine 76 and threonine 141, which are sequentially phosphorylated. Our results pointed out CDK2 and CDK5 as responsible kinases to act on serine 76 and PKA as the one acting on threonine 141. Both sites are phosphorylated in the cytoplasmic space but only serine 76 is required for p19INK4d translocation to the nucleus in this response. We investigate the physiological relevance of the phosphorylation process in these sites. We showed that serine 76 and threonine 141 are strictly necessary for p19 function in DNA repair. However, those mutants of p19 not able to be phosphorylated have full capacity for inhibiting cell proliferation when they are overexpressed. This fact indicates the independence of p19INK4d functions. Lastly, we began the study related to potential proteins interacting with p19INK4d linked to DNA repair. We described six interactors found by a yeast two hybrid screening which appear particularly interesting because they have functions in common processes to p19INK4d. These interactors participate in processes such as: DNA repair, chromatin remodelling and regulation of transcription factors of the cell cycle and apoptosis. Taking into account p19INK4d participation in response to diverse genotoxic agents which activate different DNA repair mechanisms, we finally raised the hypothesis that p19 would be taking part in an early step in DNA damage response, specifically in DNA repair. The analysis of potential p19INK4d interactors, after genotoxic injury, suggests that this protein could play a role as a member of chromatin - remodeling complexes necessary for the accessibility of DNA repair machineries to DNA damaged sites.

Radonic, Laura Mabel. "Nuevas estrategias para la transformación y expresión de genes de interés en girasol" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El girasol es una especie de la familia Asteraceae (Compositae) de gran importancia económica, considerada hasta hace una década recalcitrante al cultivo in vitro y la transformación genética. En un trabajo previo (Radonic, 2005) se logró establecer el protocolo de selección por enraizamiento en kanamicina con una eficiencia del 0,7 %. En esta tesis se mejoró este protocolo utilizando una construcción portadora de los genes antifúngicos glucanasa y quitinasa, ambos bajo el control del promotor CaMV35S y el enhancer Ω del TMV, obteniéndose una eficiencia de 1,26 %, al aumentar gradualmente la concentración del antibiótico kanamicina en los sucesivos medios de regeneración. También se evaluó la especificidad y estabilidad de dos vectores conteniendo la construcción CaMV35S-secuencia codificante para la β-glucuronidasa (GUS)-interrumpida por un intrón. Las plantas T1 derivadas de los eventos de transformación presentaron un patrón de expresión de tipo no constitutivo, con expresión de GUS localizada exclusivamente en los tricomas de las nervaduras de la cara abaxial de las hojas, siendo necesario la utilización de lupa para su visualización. En las plantas T2 no se pudo detectar la presencia de los transgenes. El nivel bajo de expresión es similar al descripto en crisantemo y la inestabilidad génica obtenida con este mismo promotor fue también descripta en lechuga, ambas de la familia Asteraceae. Estos datos llevaron a la búsqueda de nuevos promotores para la transformación de girasol. Los promotores ensayados fueron CaMV35S-Ω TMV, PPC, nos, 2X35S y rbcS1. Estos promotores fueron incorporados en el vector Gateway pKGWFS7,0, diseñado para el análisis de promotores regulando, en todos los casos, la expresión del gen reportero GUS. Este vector, además posee el gen nptII de resistencia a kanamicina bajo la regulación del promotor nos. Para analizar la funcionalidad de las construcciones obtenidas se realizaron ensayos de agroinfiltración de Nicotiana benthamiana. La actividad de los promotores en girasol fue evaluada mediante ensayos de agroinfiltración en hojas de plantas en invernáculo y la evaluación temprana de los explantos blanco de transformación, por determinación histoquímica de GUS y cuantificación fluorométrica de MUG. Para los ensayos de agroinfiltración de girasol se logró establecer un protocolo, considerado hasta este momento como no factible, determinando el estadio de desarrollo de la planta, la cepa bacteriana a utilizar y el tiempo de análisis. Estos análisis permitieron seleccionar al promotor rbcS1 como el más adecuado, ya que presentó buenos niveles de actividad enzimática y, a diferencia del promotor CaMV35S-Ω TMV, se expresó mayoritariamente en la zona meristemática de los explantos blanco de transformación, región a partir de la cual se regeneran los brotes. Los resultados obtenidos en los ensayos de transformación estable mostraron que el uso del promotor rbcS1, en comparación al CaMV35S-Ω TMV, no solo aumentó los niveles de expresión de GUS (donde grandes regiones del mesófilo mostraron expresión) sino que modificó la expresión del gen nptII, mejorando notoriamente la eficiencia de transformación (aumentando de 1,26 % a 7,06 %). Además, mejoró la respuesta y el aspecto de las plantas obtenidas (T0) al ser transferidas al invernáculo (tanto por pasaje a tierra directo como por injerto), siendo éstas de gran porte y con capítulos florales más grandes, que resultaron en un aumento del número y tamaño de los aquenios obtenidos. Resultados similares fueron publicados en Arabidopsis donde el promotor CaMV35S afectaba y alteraba en trans el patrón de expresión de transgenes y cambiaba el fenotipo de las plantas transgénicas. El análisis de las plantas T1 permitió observar altos niveles de expresión del gen reportero, comparable al de otras especies vegetales. Los resultados expuestos muestran que es posible transformar girasol con buenos niveles de eficiencia y expresión.

Abstract:
The sunflower is a species from the Asteraceae family of great economic importance, considered recalcitrant to in vitro culture and genetic transformation until a decade ago. In a previous work (Radonic, 2005) it was possible to establish a selection protocol by rooting in kanamycin with an efficiency of 0,7 %. In this thesis this protocol was improved using a construct carrying glucanase and chitinase antifungal genes, both under the CaMV35S promoter and TMV enhancer Ω, obtaining an efficiency of 1,26 % by gradually increasing kanamycin concentration in the successive regeneration media. The specificity and stability of two vectors containing the construct CaMV35S- β- glucuronidase codifying sequence (GUS)-interrumpted by an intron was also evaluated. The T1 plants derived from the transformation events showed a non-constitutive expression pattern, with GUS expression located only in the trichomes of the leaf veins on the abaxial surface of leaves, for its visualization it was necessary to use a magnifying glass. Detection of transgenes was not possible in T2 plants. This low expression level is similar to that described in chrysanthemum and the genetic instability achieved with the same promoter was also described in lettuce, both of the Asteraceae family. These data led to the search for new promoters for sunflower transformation. CaMV35S-Ω TMV, PPC, nos, rbcS1 and 2X35S promoters were assayed. These promoters were incorporated in pKGWFS7,0 Gateway vector, which is designed for promoter analysis regulating, in all cases, GUS reporter gene expression. This vector, also has the nptII kanamycin resistance gene under the regulation of nos promoter. Agroinfiltration assays in Nicotiana benthamiana in order to analyze de functionality of the obtained constructs were performed. Promoter activity in sunflower was evaluated in leaf agroinfiltration assays in greenhouse plants and early evaluation of the transformation target explants, by GUS histochemical determination and MUG fluorometric cuantification. A sunflower agroinfiltration protocol was established, until this moment considered not feasible, by determining the developmental plant stage, the bacterial strain used and the time of analysis. These analysis allowed to select rbcS1 promoter as the most suitable, as it showed good enzymatic activity levels and, unlike the CaMV35S-Ω TMV promoter, it is mostly expressed in the meristematic zone from the transformation target explants, region from which shoots regenerate. Results obtained in stable transformation assays showed that the use of rbcS1 promoter, compared with CaMV35S-Ω TMV promoter, not only increased GUS expression levels (where large regions of the mesophyll showed expression) but modified nptII gene expression, greatly improving transformation efficiency (which increased from 1,26 % to 7,06 %). Moreover, response and aspect of the obtained plants (T0) was improved when they were transferred to the greenhouse (both by direct passage to earth or grafting), they were large- sized and with larger floral chapters, resulting in an increase in the number and size of the obtained achenes. Similar results were published in Arabidopsis where the CaMV35S promoter affected and altered in trans transgene pattern expression and changed transgenic plants phenotype. T1 plants analysis allowed to observe high levels of reporter gene expression, comparable to that of other plant species. The above results show that it is possible to transform sunflower with good levels of efficiency and expression.

Bouvier, León Alberto. "Estudio de adenilato quinasas de tripanosomas. Desarrollo de herramientas de manipulación genética" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las adenilato quinasas son fosfotransferasas que participan en la homeostasis intracelular de nucleótidos de adenosina. Se postula que constituyen los componentes clave de las redes enzimáticas de fosfotransferencia. Las mismas comunicarían, de forma espacial, los sitios de generación con los de consumo de ATP. Los kinetoplástidos, entre los que se incluye el parásito causante del mal de Chagas, el Trypanosoma cruzi, representan a los organismos con mayor número de isoformas de adenilato quinasas del que se tenga conocimiento. En este trabajo se desarrolló una herramienta de rastreo de bases de datos con la que se pudo identificar a seis isoenzimas codificadas en el genoma de Trypanosoma cruzi. Se estudiaron diferentes aspectos de cada una de las mismas. Algunas variantes fueron localizadas en la estructura flagelar, en el lumen glicosomal, solubles en el citosol y posiblemente asociadas a reservosomas. Adicionalmente se estudiaron los dominios y motivos responsables de su respectiva localización. Por otro lado se investigaron tres de las isoformas presentes en Trypanosoma brucei. Se determinó la esencialidad de la isoforma candidata mitocondrial, los patrones de expresión estadío específicos para la isoenzima glicosomal y además la potencial presencia de una señal críptica de localización a esta organela, en otra de las variantes. Finalmente se evaluaron metodologías de reemplazo génico dirigido en Trypanosoma cruzi y se desarrollaron numerosas herramientas que permiten la manipulación genética de este tripanosoma. Entre estas se encuentran vectores de expresión con diferentes marcadores de selección, plásmidos mínimos con marcadores de selección de sencilla transferencia y secuencias codificantes para múltiples epítopes, proteínas fluorescentes y sitios de proteasas. Se espera que estas herramientas sean de utilidad para futuras investigaciones de tripanosomas y otros organismos.

Abstract:
Adenylate kinases are phosphotransferases involved in intracellular homeostasis of adenosine nucleotides. They are thought to be key components of enzymatic phosphotransfer networks. These would spatially communicate sites of ATP synthesis with those involved in the consumption of this molecule. To the present knowledge kinetoplastids, which include the causative agent of Chagas' disease, Trypanosoma cruzi, are among the organisms with the highest number of adenylate kinase isoenzymes. In this work, a database screening tool was developed, which allowed us to identify six different isoenzymes present in the genome of Trypanosoma cruzi. For every one identified, various aspects where analyzed. Some variants where localized to the flagellum, inside the glycosomal lumen, soluble in the citosol and possibly associated to reservosomes. Additionally the domains and motifs responsible for their respective localization where studied. On the other hand three variants present in Trypanosoma brucei where investigated. The mitochondrial candidate was determined to be an essential enzyme, stage specific expression patterns for the variant localized inside glycosomes where established and the presence of a putative cryptic glycosomal targeting signal where found in another isoform. Finally methodologies for targeted gene replacement in Trypanosoma cruzi where evaluated and numerous tools for the genetic manipulation of this trypanosome where developed. Among them, expression vectors with different selectable markers, minimal plasmids with easy to transfer selectable markers and sequences which code for multiple epitopes, fluorescent proteins and protease cleavage sites. Hopefully these tools will be useful in future investigations regarding trypanosomes and other organisms.

Rivas, Martín Alfredo. "Participación del factor de necrosis tumoral alfa en la proliferación de carcinomas mamarios" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) es una citoquina pro-inflamatoria implicada en promover el crecimiento de ciertos tipos de cánceres. En el presente trabajo de Tesis se exploraron los caminos de señalización intracelulares que llevan al crecimiento de las células de cáncer de mama inducido por TNFα y su interacción con el receptor tirosina quinasa tipo I, ErbB-2. Nuestros resultados indicaron que el TNFα, actuando a través del receptor de TNFα tipo 1 (TNFR1), indujo la activación de las quinasas activadas por mitógenos p42 y p44 (p42/p44 MAPK), la quinasa del amino terminal de c-jun (JNK) y la fosfatidilinositol 3-fosfato quinasa / Akt (PI3-K/Akt), la activación del factor de transcripción Factor Nuclear κB (NF-κB) y la proliferación celular. También comprobamos que la administración de TNFα in vivo indujo el crecimiento del tumor C4HD en ratones Balb/c y que el tratamiento con un inhibidor selectivo de NF-κB, Bay 11-7082, resultó en la regresión parcial de dicho tumor de mama. Asimismo, el Bay 11-7082 bloqueó la capacidad del TNFα de inducir el aumento de la proteína promotora del ciclo celular ciclina D1 y de la proteína antiapoptótica Bcl-XL. Un importante hallazgo fue demostrar que el TNFα indujo la transactivación de ErbB-2 en células de cáncer de mama que sobreexpresan ErbB-2. En estas células, el TNFα activa a la tirosina quinasa c-Src, promueve la fosforilación de ErbB-2 en el residuo Tyr877, y favorece la formación del heterodímero ErbB-2/ErbB-3. Este último proceso lleva a la fosforilación de Akt, a la activación del factor de transcripción NF-κB, y al aumento en la expresión de ciclina D1. La presencia del inhibidor de ErbB-2, AG825, o de ARN cortos de interferencia (siRNA) contra ErbB-2, pero no la del anticuerpo monoclonal humanizado trastuzumab (HerceptinMR) abolió la fosforilación de ErbB-2, la activación de NF-κB y la proliferación inducidas por TNFα. Nuestro trabajo revela que el TNFα es capaz de transactivar a ErbB-2 y utilizarlo como un intermediario en la generación de señales mitogénicas. Dado que el TNFα se encuentra presente en un alto porcentaje de cánceres de mama, nuestros hallazgos tendrían una gran importancia en la comprensión de la biología de tumores de mama que sobreexpresan ErbB-2 como así también en la elección del tratamiento al cual los pacientes son sometidos.

Abstract:
Tumor necrosis factor alpha (TNFα) is a pro-inflammatory cytokine that promotes the growth of certain cancer types. In the present Thesis we explored signaling pathways involved in TNFα-induced breast cancer growth and its interaction with the tyrosine kinase receptor I, ErbB-2. Our results indicate that TNFα, acting through TNFR1, induces activation of p42/p44 MAPK, JNK and PI3-K/Akt, NF-κB activation and cell proliferation. TNFα, when administered in vivo, induced C4HD tumor growth on Balb/c mice and treatment with a specific inhibitor of NF-κB, Bay 11-7082, induced a partial regression of said breast tumor. Bay 11-7082 blocked TNFα ability of inducing the cell cycle promoter protein cyclin D1 and the antiapoptotic protein Bcl-XL. In addition we showed that TNFα induces ErbB-2 transactivation on breast cancer cells with ErbB-2 overexpression. We found that TNFα activates the tyrosine kinase c-Src, promotes ErbB-2 phosphorylation on Tyr877, and favors heterodimer formation between ErbB-2 and ErbB-3. This last event leads to Akt phosphorylation, NF-kB activation and to the increase in cyclin D1 protein expression. The presence of AG825, an ErbB-2 inhibitor, or small interference RNA (siRNA) to ErbB-2, but not the humanized monoclonal antibody trastuzumab (HerceptinTM) abolished ErbB-2 phosphorylation, NF-κB activation and TNFα-induced proliferation. Our findings reveal that TNFα is able to transactivate ErbB-2 and using it as an obligatory downstream signaling molecule in the generation of mitogenic signals. Given the fact that TNFα is present in a high percentage of invasive breast cancers, our work would be of importance for the understanding of breast cancer which overexpresses ErbB-2 and also for choosing the most appropriate treatment for patients.

Peluffo, Guillermo D.. "Rol de la ciclooxigenasa-2 en la progresión de tumores de pulmón y mama" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Diversos tipos de tumores poseen elevados niveles de expresión de la ciclooxigenasa-2 y de producción de prostaglandinas. El uso de los antiinflamatorios no esteroides resultó beneficioso en el tratamiento de distintos modelos tumorales, a veces independientemente de la expresión de las ciclooxigenasas, sus blancos primarios. Nuestro objetivo en este trabajo de tesis fue estudiar el papel de la COX-2 en la progresión de distintos modelos tumorales. Utilizamos el adenocarcinoma de pulmón murino LP07 y hallamos que la COX-2 es un componente importante del comportamiento maligno de estas células. En este modelo, la inhibición de la COX-2 redujo el crecimiento del tumor primario y el desarrollo metastásico así como también los síndromes paraneoplásicos provocados por el tumor. La COX-2 y la PGE2 tienen un papel clave en la modulación de la supervivencia de las células LP07, que ejerce modulando las actividades de las quinasas Akt y p38, así como también la actividad del factor de transcripción NF-κB. En los adenocarcinomas de mama murinos LM3 y LMM3 la importancia de la COX-2 es menos relevante, ya que si bien el uso de un inhibidor selectivo de esta enzima, el celecoxib, produjo esencialmente los mismos resultados que en las células LP07, un análogo carente de actividad inhibitoria se comportó de manera similar. La PGE2 exógena no revirtió ninguno de los efectos del celecoxib. En estas células, la modulación de la biología tumoral involucró también un aumento de la apoptosis y el arresto del ciclo celular posiblemente mediado por p21 y p27. Finalmente, utilizamos un modelo más complejo, con el cocultivo de células de un carcinoma ductal in situ de mama humano y fibroblastos inflamatorios de artritis reumática. Las células del CDIS MCF10DCIS.com no expresan COX-2, la cual es inducida cuando son cocultivadas con los fibroblastos de AR. Encontramos que los fibroblastos inducen la progresión hacia el carcinoma invasivo, en parte modulada por la COX-2, cuya inhibición disminuyó los niveles de la MMP-14 y la actividad de la MMP-9. La inhibición de la COX-2, el NF-κB y la MMP-9 redujo la capacidad invasiva de las células MCF10DCIS.com inducida por las interacciones con los fibroblastos inflamatorios. En conjunto, este trabajo sugiere la utilidad de los inhibidores de la COX-2 para el tratamiento de la progresión tumoral y la participación de esta enzima en la modulación del comportamiento de algunos tumores ya sea mediante su expresión constitutiva o inducida por un microambiente inflamatorio.

Abstract:
COX-2 expression is increased in a number of tumors along with elevated PG production. NSAID treatment was found to have antitumor properties in different types of cancers, although the dependency of COX-2 inhibition remains controversial, in spite of being their primary target. We aimed to study the role of COX-2 in tumor progression using different cancer models. We found that COX-2 is a key player for the malignant behavior of the LP07 murine lung adenocarcinoma. COX-2 inhibition delayed not only tumor growth but also the metastatic outcome and the development of paraneoplastic syndromes. COX-2 and PGE2 were found to have an important role for LP07 cell survival by modulating the Akt and p38 kinase activities and the transcription factor NF-κB. The relevance of COX-2 activity in the murine mammary adenocarcinomas LM3 and LMM3 was somewhat less important. The COX-2 specific inhibitor celecoxib renders nearly the same outcome in these cells than in LP07 cells. However the closely related analogue dimethyl-celecoxib, devoid of COX-2 inhibitory activity, was found to be equally effective. Moreover, exogenously added PGE2 did not revert the effect of celecoxib. The antitumor properties also involved an increased apoptosis and the cell cycle arrest possibly modulated by p21 and p27. Finally, we studied the role of COX-2 in mediating the interaction between breast cancer epithelial cells and inflammatory fibroblasts leading to the transition between DCIS and invasive carcinoma. The MCF10DCIS.com cells express COX-2 upon coculture with rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. We found that RASF-induced progression to invasive carcinoma involved in part the induction of COX-2 expression, and that MMP-14 levels and MMP-9 activity were reduced by COX-2 inhibition. The increased invasiveness of MCF10DCIS.com cells acquired though the interaction with the inflammatory fibroblasts were lowered by COX-2, MMP-9 or NF-κB inhibition. Taken together, these results suggest COX-2 inhibitors are useful antitumor drugs and the key role for COX-2 in modulating the behavior of some tumors by being either constitutively expressed or induced by an inflammatory stroma.

Lodillinsky, Catalina. "Rol de los receptores activadores de la proliferación de peroxisomas del subtipo gamma el el cáncer de vejiga" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
PPARg es miembro de la superfamilia de receptores nucleares que son factores de transcripción activados por su ligando. BCG es el tratamiento de elección para el cáncer devejiga (CaV) que no invade músculo. Nos propusimos estudiar el rol de éste receptor bajo el tratamiento de BCG en ésta patología. Encontramos que BCG es capaz de inducir la expresión de PPARg en células de CaV murinas, MB49 y los ligandos de PPARg potencian este efecto. La actividad transcripcional de PPARg también es aumentada por BCG y potenciada por 15-d-PGJ2, ligando de PPARg. Al mismo tiempo BCG induce en las líneas de CaV la expresión de iNOS y la consecuente producción de óxido nítrico (NO). Los ligandos de PPARg inhibirían la producción de NO inducida por BCG, por un mecanismo PPARg independiente pero dependiente de la vía de NF-kB. In vivo, BCG inhibe el crecimiento de tumores, efecto bloqueado por BADGE, antagonista de PPARg indicando que parte del mecanismo de acción de BCG es a través de PPARg. BCG induce la expresión de colágeno, SMA-alfa y FGF-2, al mismo tiempo induce la proliferación de los fibroblastos in vitro. RO revierte el efecto inhibitorio ejercido por BCG, inhibiendo diferentes funciones de macrófagos y fibroblastos. BCG media su mecanismo de acción antitumoral, en parte, a través de PPARg pero su activación in vivo con agonistas exógenos puede ser contraproducente dado su funcionalidad en el sistema inmune. Obtuvimos una nueva línea celular, MB49-I y desarrollamos un modelo murino ortotópico con distinto grado de invasión. Al evaluar la expresión de PPARg en éste modelo, observamos que PPARg está aumentado en tumores superficiales comparado con la vejiga normal, mientras que se pierde en vejigas portadoras de tumor invasor. En tumores vesicales de pacientes observamos que un mayor número de pacientes con tumores invasores expresa bajos niveles de PPARg comparado con aquellos pacientes con tumores no invasores, sugiriendo que PPARg podría estar involucrado en la progresión de tumores de vejiga.

Abstract:
Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma (PPARg) is a member of the nuclear receptor superfamily of ligand-activated transcription factors that is involved in cell growth and differentiation as well as inflammatory processes. We found that BCG is able to induce PPARg expresión in bladder murine cell line MB49. Transcriptional activity of PPARg is also increased by BCG and it is enhanced by 15-d-PGJ2, a PPARg ligand. At the same time, PPARg ligands enhance BCG-induced cell death. BCG also induces iNOS expression and NO production. PPARg ligands inhibits NO production induced by BCG. In vivo, BCG inhibits tumor growth, but RO reverses that effect. RO inhibits different functions associated to activated macrophages induced by BCG. In vitro, BCG induces fibroblast proliferation and in vivo, induces collagen, FGF-2 and alpha-SMA expresión. RO decreases that induction. We have generated a new cell line, MB49-I and we developped a new murine ortothopic model with different levels of invasion. PPARg is increased in superficial tumors compared to normal bladder, meanwhile, this expression is reduced in invasive tumors. In patients, we observed that invasive tumors express low level of PPARg compared to those with non-invasive tumors. PPARg is involved in the mechanism of action of BCG, but his activation could be not recommended in vivo, since it has a relevant role in the inmune system. PPARg expression is decreased in invasive tumors, which suggests that this transcription factor plays a key role during progresion in bladder tumors.

Galizia, Luciano. "Estudio del rol de la AQP2 en la regulación del volumen celular" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La capacidad de las células para regular su volumen es esencial para el mantenimiento de la homeostasis celular en condiciones de anisotonia. Nosotros previamente informamos, en una línea celular que deriva de túbulo colector cortical de rata (RCCD_1), que la presencia de la acuaporina 2 (AQP2) en la membrana celular es crítica para la activación rápida de mecanismos de regulación de volumen luego de un shock hipotónico (RVD). El objetivo de este trabajo de tesis fue investigar la vía de señalización que relaciona la AQP2 con esta activación rápida de RVD. Probamos la hipótesis de que AQP2 podría tener un papel en la activación de la entrada de calcio por hipotonía e investigamos su importancia en la regulación del volumen celular. Para ello estudiamos la i y el volumen celular en respuesta a un shock hipotónico en células WT- RCCD1 (no expresan acuaporinas) y en células AQP2-RCCD_1 (transfectadas con AQP2). Encontramos, que luego de la exposición a un gradiente hipotónico, sólo en las células que expresan AQP2 se observa un sustancial aumento i. Este aumento de la i es fuertemente dependiente del calcio extracelular y de depósitos intracelulares. La exposición de las células AQP2-RCCD_11 a HgCl_2 (inhibidor de las acuaporinas), gadolinio y rojo de rutenio (inhibidores del TRPV4) redujeron el aumento i . Además, la exposición de las células a estos inhibidores disminuyó el rápido RVD. Estudios de inmunofluorescencia mostraron que, en condiciones de isotonía el TRPV4 se distribuye principalmente en el compartimento intracelular en ambas líneas celulares. Sin embargo en condiciones de hipotonía el TRPV4 es translocado a la membrana celular sólo en las células que expresan AQP2. En esta tesis proponemos la existencia de una asociación funcional entre la AQP2 y el TRPV4, esencial para la generación de señales de calcio inducidas por swelling y necesarias para la activación rápida de los mecanismos de regulación de volumen celular.

Abstract:
The ability of cells to regulate their volume is essential for maintenance of cellular homeostasis under anisotonic environmental conditions. We previously reported in a rat cortical collecting duct cell line (RCCD_1) that the presence of aquaporin 2 (AQP2) in the cell membrane is critical for the rapid activation of regulatory volume decrease mechanisms (RVD). The aim of our present work was to investigate the signalling pathway that links AQP2 to this rapid RVD activation. We tested the hypothesis that AQP2 could have a role in activation of calcium entry by hypotonicity and its implication in cell volume regulation. We studied i and cell volume changes in response to a hypotonic shock in WT-RCCD1 (not expressing aquaporins) and in AQP2-RCCD_1 (transfected with AQP2) cells. We found that after a hypotonic shock only AQP2-RCCD_1 cells exhibit a substantial increase in i. This i increase is strongly dependent on extracellular Ca^2+ and on intracellular stores. Exposure of AQP2- RCCD1 cells to HgCl_2 (aquaporin inhibitor), gadolinium and ruthenium red (TRPV4 inhibitors) reduced the increase in i. Furthermore, exposure of cells to all of the above described conditions impaired rapid RVD. Immunofluorescence studies show that under isotonic conditions TRPV4 is distributed mainly in intracellular compartment in both cell lines. However under hypotonic conditions TRPV4 is translocated to the cell membrane only in AQP2-RCCD1 cells. In this thesis we suggest the existence of a functional interaction between AQP2 and TRPV4, which is essential for the calcium signal generation induced by swelling and necessary for a rapid activation of the mechanisms of cell volume regulation.

De Pino, Verónica. "Estudio de la función de los polipéptidos reversiblemente glicosilados (Reversibly Glycosylated Polypeptide) en plantas de interés agro-económico" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las plantas explotan una variedad de mecanismos para regular la producción y el acceso a los azúcares en respuesta al desarrollo, al ambiente, y al estado metabólico. La síntesis de polisacáridos a partir de fotosintatos, como la sacarosa, es un proceso muy regulado en el que están involucradas invertasas y glicosiltransferasas. La estructura y destino de los polisacáridos es bien conocida, pero el mecanismo de biosíntesis particularmente la síntesis de novo y las enzimas que transfieren los azúcares siguen siendo un enigma a resolver. En este trabajo de tesis nos focalizaremos en unas proteínas muy particulares que fueron descubiertas intentando identificar componentes de la pared celular. Estas proteínas se denominan RGP, por “reversibly glycosylated polypeptide”, y tienen capacidad de autoglicosilarse, a partir de UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-Xyl y UDP-Ara dando como producto la proteína glicosilada y regenerando el nucleótido azúcar. Las RGPs están presentes en plantas superiores tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas, pero están ausentes en otras especies, lo que indicaría que su función está muy conservada en las plantas, aunque se sabe poco de su rol fisiológico (Moreno & Tandecarz 1982; Moreno et al. 1986; Delgado et al. 1998; Bocca et al. 1999). Un análisis filogenético (Wald et al. 2003) muestra que hay dos clases, clase 1, la mayoría de las RGps pertenece a esta clase, que es muy activa, y la clase 2, a la cual no se le asoció actividad, pero sí capacidad de interactuar con la clase 1. Se encontró una multiplicidad de isoformas en todas las especies donde está presente, aspecto asociado con su capacidad de formar homo y heterodímeros. Anteriormente se demostró que la expresión de la RGP se produce en los tejidos donde hay activa síntesis de pared celular, durante este trabajo mostramos que la expresión esta modulada por el desarrollo, la inducción hormonal y el estrés, clarificando el rol fisiológico de la RGP en la remodelación/reconstrucción de novo de la pared celular vegetal, en donde uno de los caminos metabólicos claves en dicho proceso de la célula vegetal es la síntesis de polisacáridos.

Abstract:
Plants exploit diversity of mechanisms to regulate the production and the access to sugars in response to developmental cues, the environment and to the metabolic sate. Polysaccharide synthesis upon photosynthates as sucrose is a highly regulated process, in which invertases and glycosyltransferases are implicated. Although the structure and destination of polysaccharides is well established, mechanisms of de novo synthesis as well as the identification of glycosyltransferases are yet an enigma to be resolved. This work is focused on a group of proteins called reversibly glycosylated polypeptide, RGP which have the unique capability to perform self-glycosylation upon incubation with UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-Xyl and UDP-Ara given as product the glycosylated protein and the regeneration of the nucleotide diphosphate. RGPs are present in higher plants; in monocotyledons as well as in dicotyledons, indicating that their functions is highly conserved, although little is known about their physiological role (Moreno & Tandecarz 1982; Moreno et al. 1986; Delgado et al. 1998; Bocca et al. 1999). A phylogenetic analysis of RGP (Wald et al. 2003) showed that there are two classes, class 1, the majority of RGP belongs to this class, which is highly active, and class 2, which is inactive but it has the capability to interact with the class 1 forming heteromultimers. It was found a multiplicity of forms of RGP in all species; this fact is associated with its ability to form homo and heterodimers. Previously, it was found that the expression of the RGP is particularly relevant in tissues where an active synthesis of cell wall take place. Here we demonstrate that the expression of the RGP is modulated by development, elongating involved hormones, germination as well by stress, clarifying the physiological role of the RGP in the remodeling/de novo synthesis of the plant cell wall, where the synthesis of polysaccharide is a key metabolic pathway.

Desbats, María Andrea. "Estudio de la dinámica y función de la ¨Proteína Heterocromática 1 gama¨ durante el proceso de diferenciación celular" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La diferenciación celular es un proceso complejo en el cuál un grupo específico de genes se activa y el resto permanece silenciado. HP1γ se asocia a genes activos, pero se desconoce su rol durante la diferenciación celular. En los preadipocitos HP1γ localiza tanto en heterocomo eucromatina, pero cuando se induce la diferenciación HP1γ rápidamente se concentra en un polo del núcleo excluyéndose de regiones heterocromáticas. La polarización de HP1γ no se observa en células que no se diferencian. La fosforilación de HP1γ en Ser93 se induce durante la adipogénesis y también se localiza polarizadamente. La polarización de HP1γ depende de la transcripción, de la integridad del RNA y DNA, y de la señalización por PKA. Interesantemente, marcas epigenéticas que marcan activa transcripción y la RNA pol II colocalizan con HP1γ en dicho polo nuclear. Este dominio muestra altos niveles de incorporación de BrUTP y de acumulación de mRNAs. La inhibición de HP1γ con siRNAs disminuye la incorporación de BrUTP y la expresión de marcadores de diferenciación adipocítica. Este dinámico patrón nuclear polarizado no se ha descripto antes, y proponemos que podría constituir un nuevo mecanismo para regular la expresión de genes requeridos durante el inicio de la diferenciación celular.

Abstract:
Cell differentiation is a complex process in which a specific subset of genes is activated while the rest of genes are silenced. HP1γ is associated to actively transcribed genes, however little is known about its role during cell differentiation. In preadipocytes HP1γ localizes in heterochromatic and euchromatic domains, but when preadipocytes are induced to differentiate HP1γ rapidly concentrates in one pole of the nucleus being transiently excluded from heterochromatin. HP1γ polarization is not observed in cells that do not differentiate. HP1γ PSer93 is induced upon adipogenesis and also concentrates in a polarized manner. HP1γ polarization depends on transcription, RNA and DNA integrity, and on PKA signalling. Noteworthy, epigenetic marks that correlate with active transcription and RNA polymerase II co-localizes with HP1γ in the nuclear pole. This domain shows high level of BrUTP incorporation and mRNAs accumulation. Knock down of HP1γ by siRNAs causes a decrease in BrUTP incorporation and a decrease in the expression of markers of adipocyte differentiation. Importantly, to our knowledge this dynamic nuclear polarization has not been described before, and we propose that it may constitute a novel mechanism for regulating the expression of a determined subset of genes required during the initial steps of cell differentiation.

Pelisch, Federico. "La proteína rica en serinas y argininas SF2/ASF regula la conjugación de sumo" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La modificación post‐traduccional de proteínas por la conjugación de SUMO (del inglés, Small Ubiquitinrelated Modifier) está involucrada en diversas funciones biológicas tales como regulación de la transcripción, localización sub‐celular, respuesta a estrés, reparación del daño al DNA y remodelado de la cromatina. En el presente trabajo, mostramos que la proteína rica en serinas y argininas (SR), SF2/ASF, un factor involucrado en la regulación del splicing y otros procesos relacionados con el metabolismo del ARN, es un regulador de la vía de SUMOilación. Su sobre‐expresión estimula, mientras que la disminución de su expresión inhibe la conjugación de SUMO. SF2/ASF actúa en dos niveles en la cascada de SUMOilación. Primero, interacciona con Ubc9 y aumenta la SUMOilación de sustratos específicos, funcionando como una E3 ligasa de la vía de SUMO. Por otro lado, SF2/ASF interacciona con la conocida E3 ligasa de SUMO, PIAS1, regulando su función en los patrones globales de SUMOilación. Todos estos efectos dependen de la presencia del motivo de reconocimiento al ARN 2 (RRM2) de SF2/ASF. Más aún, SF2/ASF juega un papel importante en la SUMOilación estimulada por el estrés térmico. Estos resultados agregan un nuevo componente a la vía de SUMOilación y también un nuevo rol a la proteína SR multifuncional SF2/ASF.

Abstract:
Post‐translational protein modification by conjugation of small ubiquitin‐related modifier (SUMO) is involved in diverse biological functions such as transcription regulation, sub‐cellular partitioning, stress response, DNA damage repair and chromatin remodeling. In the present work, we show that the serine/arginine‐rich (SR) protein SF2/ASF, a factor involved in splicing regulation and other RNA metabolism‐related processes, is a regulator of the SUMOylation pathway. Its over‐ expression stimulates while its knockdown inhibits SUMO conjugation. SF2/ASF acts at two different levels in the SUMO pathway. First, it interacts with Ubc9 and enhances SUMOylation of specific substrates, functioning as a SUMO E3 ligase. Second, SF2/ASF interacts with the SUMO E3 ligase PIAS1, regulating PIAS1‐ induced overall protein SUMOylation. All these effects are dependent on SF2/ASF RNA recognition motif 2 (RRM2). Moreover, SF2/ASF has an important role in heat shock‐induced SUMOylation. These results add a new component to the SUMOylation pathway and also a new role for the multifunctional SR protein SF2/ASF.

Béguelin, Wendy. "Definición de una nueva clase de complejo transcripcional: ErbB2 actúa de coactivador de Stat3 promoviendo la proliferación en tumores mamarios" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El receptor con actividad de tirosina quinasa ErbB2 y la proteína transductora de señales y activadora de la transcripción 3 (Stat3) juegan un rol importante en el desarrollo del cáncer de mama. Distintas evidencias sugieren la existencia de interacciones cruzadas entre ErbB2 y Stat3. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a esta interacción en tumores mamarios permanecen poco estudiados. En este trabajo identificamos un nuevo mecanismo de interacción entre ErbB2 y Stat3 que involucra la translocación nuclear de ErbB2 y la formación de un complejo en el que ErbB2 actúa como coactivador transcripcional de Stat3. Mostramos que la formación de este complejo es inducida tanto por el ligando de los receptores ErbBs, heregulina, como por los progestágenos a través del receptor de progesterona (PR). Demostramos también que la función de ErbB2 como coactivador de Stat3 promueve la activación del promotor de ciclina D1. Cuando la formación del complejo Stat3/ErbB2 es inducida por progestágenos, encontramos al PR co-reclutado en el promotor de ciclina D1, revelando un nuevo mecanismo de acción genómico no clásico del PR. Demostramos que la presencia de ErbB2 en el núcleo celular ejerce un rol fundamental en la proliferación in vitro e in vivo en tumores mamarios. Estos hallazgos revelan una posible intervención terapéutica nueva en tumores de mama que sobreexpresan ErbB2, mediante la inhibición de la translocación nuclear de ErbB2, dado que esta estrategia es efectiva en células tumorales resistentes a las terapias anti ErbB2 convencionales.

Abstract:
ErbB2 tyrosine kinase receptor and Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (Stat3) have been unraveled as two major players in breast cancer growth. In spite of all the accumulating evidence suggesting a crosstalk between ErbB2 and Stat3, the molecular mechanisms underlying ErbB2 and Stat3 interaction in breast tumor remain poorly explored. In this work, we identified a new mechanism of ErbB2 and Stat3 interaction, which involves ErbB2 nuclear translocation and the assembly of a complex in which ErbB2 acts as a transcriptional coactivator of Stat3. We showed that the assembly of this complex is induced by heregulin, a ligand of the ErbBs receptors, as well as by ligand bound progesterone receptor (PR). We also highlighted that ErbB2 function as Stat3 coactivator drives cyclin D1 promoter activation. When the assembly of Stat3/ErbB2 complex is induced by progestins, we found PR recruitment together with Stat3 and ErbB2 to the cyclin D1 promoter, unraveling a new nonclassical PR genomic mechanism. We found that the nuclear Stat3/ErbB-2 transcriptional complex plays a key role in in vitro and in vivo proliferation of breast tumors. Our findings reveal a novel therapeutic intervention in ErbB2-overexpressing breast tumors, by inhibition of ErbB2 nuclear translocation, since this strategy has proven effective in tumor cells which are resistant to conventional anti ErbB2 therapies.

Martínez, María Guadalupe. "Estudio de las etapas tempranas del ciclo de replicación del Virus Junín" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, es un miembro de la familia Arenaviridae. Es un virus envuelto de genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación ha sido caracterizado en varios aspectos. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de pH. Una vez que la nucleocápside se encuentra dentro del citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales, mediante una estrategia de codificación ambisentido. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside es denominada NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP). Estos conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. Se desconocen hasta el momento los mecanismos detallados y las estructuras celulares involucradas en los eventos tempranos del ciclo de replicación viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos del ciclo de multiplicación del JUNV. En primer lugar se analizó la vía de entrada utilizada por el JUNV para ser endocitado en las células, así como también se estudiaron las proteínas celulares esenciales para este proceso. Con este fin se utilizaron plásmidos que expresan proteínas dominantes negativas, encontrándose que es esencial la Eps-15 y dinamina en el proceso de endocitosis, mientras que las proteínas Rab5 y Rab7 juegan un rol esencial en el paso posterior a la internalización y previo a la fusión. Luego se estudio la interacción del virus con las principales redes del citoesqueleto: los microfilamentos y los microtúbulos. Se utilizaron compuestos capaces de despolimerizar o estabilizar específicamente cada una de estas redes. La internalización del virus disminuyó de manera dosisdependiente en presencia de compuestos que alteraban la integridad de los microfilamentos o estabilizaban los microtúbulos. El tropismo de los virus está regulado por la interacción entre factores celulares y virales durante la transmisión, diseminación y replicación en el huésped. La unión del virus a receptores de superficie específicos determina la susceptibilidad de las células a ser infectadas. La entrada y diseminación de diferentes familias virales puede ser mediada por lectinas de tipo C, como DC-sign o L-sign. Por este motivo se estudió si estas actúan en la infección con el JUNV. Para esto se utilizaron células relativamente no permisivas a la infección por JUNV como las células CHO, las cuales al expresar transientemente las lectinas DC-sign o L-sign fueron infectadas por el JUNV de forma altamente eficiente. Fue demostrado que las células 3T3, que en su forma salvaje no permiten la infección del JUNV, se vuelven permisivas al mismo al expresar de forma estable estas lectinas, y esta interacción es específica lo cual fue demostrado al bloquear la infección con anticuerpos específicos contra las lectinas o el compuesto mannan. Actualmente no hay tratamiento para las fiebres hemorrágicas, por lo que existe una necesidad crítica de desarrollar terapias efectivas para tratar los brotes anuales y contrarrestar su potencial uso como armas biológicas. Todos los virus causantes de fiebres hemorrágicas infectan preferencialmente monocitos, macrófagos y células dendríticas durante las etapas tempranas de la enfermedad. Es por este motivo que estas células representan un blanco potencial en el tratamiento de las fiebres hemorrágicas.

Abstract:
Junín virus (JUNV), the etiological agent of argentine hemorrhagic fever, is a member of the Arenaviridae family. The viral cycle multiplication of this RNA virus has been characterized in different aspects. The entrance in the target cells is performed by receptor-mediated endocytosis following pH dependant fusion step. Once the nucleocapsids are within the cytoplasm the ambisense strategy allows expression of five structural proteins. The major nucleocapsid associated protein is named NP. As a result of the glycoprotein precursor synthesis and after its maturation, two glycoproteins and a signal peptide are obtained. These components, named GP1, GP2 and SP, form the claviform structures found in the viral envelope. At this moment, the detailed mechanisms and cellular structures involved in the early steps of the virus replication cycle are not known although. In this work the interaction between virus and host cells was studied, characterizing the role of cellular proteins in early events of virus replication cycle. It was first evaluated the way of entry used by JUNV to entry host cells and the proteins involved in this process. With this end, plasmids that express dominant negative mutants were used, demonstrating that EPS-15 and dynamin were key proteins in this step, while Rab5 and Rab7 were essential in a step after entry prior to fusion. Then the interaction between JUNV and the main components of the cytoskeleton was evaluated. Compounds that specifically disrupt or stabilized microfilaments or microtubules were used. Virus entry was extremely reduced in a dose dependent way in the presence of compounds that depolimerized microfilaments or stabilized microtubules. Target cell tropism of enveloped viruses is regulated by interactions between viral and cellular factors during transmission, dissemination, and replication within the host. Binding of viral envelope glycoproteins to specific cellsurface receptors determines susceptibility to viral entry. The entry and dissemination of viruses in several families can be mediated by C-type lectins such as DC-sign and L-sign. Results from transduction with JUNV pseudovirus show that infection of relatively non-permissive CHO cells was markedly enhanced when we over expressed DC-sign or L-sign. Experiments using non-permissive mouse 3T3 cells showed that they become permissive to JUNV pseudovirus transduction when they stable express DC-sign, or its homologue L-sign, and that transduction of 3T3 stable expressing DC-sign or L-sign is blocked by anti–DC-sign and/or L-sign antibodies and mannan. Therefore hDC- and hL-sign can act as a novel attachment factors that mediate entry of JUNV. To the date there is no treatment for hemorrhagic fevers, so there is an important requirement to develop specific therapies against annual outbreaks and reduce its potential use as a bioterrorism agent. All hemorrhagic fever viruses infect preferentially monocytes, macrophages and dendritic cells during early stages of the disease. For this reason these cells represent a potential target in the treatment of hemorrhagic fevers.

Pais, Silvia Marina. "Caracterización de fosfatasas de proteínas 2 A en Solanum tuberosum L. y su participación en vías de señalización asociadas a tuberización y estrés" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La fosforilación reversible de proteínas tiene un rol importante en la señalización asociada al desarrollo y al estrés en plantas. Algunos estudios sugieren que las fosfatasas de proteínas 2A (PP2A) están involucradas en estos procesos. El objetivo de este trabajo fue caracterizar las subunidades catalíticas de PP2A (PP2Ac) en Solanum tuberosum L. y estudiar su participación en la señalización asociada a la tuberización y el estrés. Búsquedas bioinformáticas en bases de datos de ESTs revelaron la presencia de seis isoformas de PP2Ac en S. tuberosum. Estas isoformas muestran patrones de expresión diferentes en distintos órganos de la planta y sus niveles cambian durante la formación del tubérculo. Se ha propuesto que las señales hormonales y ambientales que modulan la tuberización son integradas en las hojas. Para estudiar el rol de las PP2As en respuesta a condiciones que afectan la tuberización, se analizó la expresión en hojas de los genes “específicos de tubérculo” Patatina y Pin2, en presencia o ausencia de inhibidores de estas fosfatasas. Se encontró que una alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio (condición promotora de la tuberización) estimula la expresión de Patatina y Pin2 posiblemente mediante el aumento de la actividad de PP2A, sin afectar los niveles de ARNm y proteínas de PP2Ac. Por otro lado, el ácido giberélico (GA, regulador negativo de la tuberización), disminuye el nivel de ARNm de algunas de las subunidades catalíticas, lo que se correlaciona con una menor cantidad de proteínas PP2Ac. Esta disminución causada por el GA inhibiría las señales de tuberización río abajo de los efectos inductores de una alta relación sacarosa/nitrógeno. Por otro lado, para estudiar la participación de las PP2As en la señalización asociada al estrés, se estudió la expresión de genes de respuesta a estrés en presencia o ausencia de un inhibidor de estas fosfatasas y se determinaron los patrones de expresión de las subunidades catalíticas en dichas condiciones. Se observó que las isoformas de PP2Ac son diferencialmente reguladas en respuesta a estrés y que estas fosfatasas tendrían un rol positivo en la señalización asociada a salinidad, mientras que regularían negativamente la transducción del estrés biótico.

Abstract:
Protein phosphorylation/dephosphorylation plays critical roles in development and stress signaling in plants, and some studies have suggested that protein phosphatases 2A (PP2A) are involved in these processes. The aim of this work was to characterize PP2A catalytic subunits (PP2Ac) in Solanum tuberosum L. and to study their involvement in tuberization and stress signaling. Bioinformatic searches of EST databases revealed the presence of six PP2Ac isoforms in S. tuberosum. PP2Ac isoforms show distinct expression patterns in different organs and are developmentally regulated during tuber formation. The hormonal and environmental signals that modulate potato tuberization are thought to be integrated in the leaves. To study the roles of PP2A in the leaf responses to conditions that affect tuberization, the expression of the “tuber-specific” genes Patatin and Pin2 was analyzed in the presence or absence of PP2A inhibitors. It was found that a high sucrose/nitrogen ratio, which promotes tuber formation, increases the transcript levels of Patatin and Pin2 possibly by increasing the activity of PP2As, without affecting PP2Ac mRNA or protein levels. In addition, gibberellic acid (GA), a negative regulator of tuberization, down-regulates the transcription of some of the PP2Ac isoforms, decreasing their protein levels. PP2Ac downregulation by GA may inhibit tuberization signaling downstream of the inductive effects of a high sucrose/nitrogen ratio. These results suggest that PP2As may act as molecular switches that can be regulated by signals that affect tuberization to activate or inhibit the response. In addition, to determine if PP2As are involved in stress signaling in potato plants, the expression of stress-responsive genes was analyzed in the presence or absence of a PP2A inhibitor. PP2Ac expression profiles in response to different environmental stresses were also determined. The results obtained show that the expression of different PP2Ac isoforms is modified in response to stress, and that these phosphatases may positively regulate salt stress signaling while having a negative role in biotic stress signal transduction.

Landoni, Verónica Inés. "Relevancia de mecanismos inflamatorios en el daño celular inducido por toxina Shiga, agente causal del sindrome urémico hemolítico (SUH)" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El síndrome urémico hemolítico (SUH) se caracteriza por anemia hemolítica, trombocitopenia y disfunción renal. La forma típica de SUH se asocia a infecciones por bacterias Gram negativas enterohemorrágicas del género Shigella y Escherichia productoras de toxina shiga (Stx). La disfunción endotelial inducida por la Stx es central, pero lipopolisacáridos bacterianos (LPS) y neutrófilos (PMN) contribuyen con la patofisiología. La falla renal es característica del SUH, aunque en casos severos, ocurren complicaciones neurológicas usualmente asociadas a casos fatales. Es clara la alteración de la barrera hemato-encefálica (BHE) asociado al daño de las células endoteliales (CEs) que la componen. Los astrocitos (ASTs) son células inflamatorias del cerebro y determinan el funcionamiento de la BHE. Los ASTs están en contacto con CEs, por lo que el estudio de los efectos de Stx y LPS sobre los ASTs, así como la influencia de esta respuesta sobre las ECs es fundamental. Stx1 y LPS indujeron la activación de ASTs y la liberación de TNF-α, óxido nítrico y quimioquinas atractantes de PMN. Factores liberados por ASTs estimulados con LPS y Stx1 disminuyeron la permeabilidad endotelial e indujeron la activación de CEs favoreciendo la adhesión de plaquetas y PMN. Los efectos evaluados fueron dependientes del TNF-α astrocitario. La respuesta de ASTs frente a Stx1 y LPS podría contribuir con la disfunción de la BHE y el desarrollo de la neuropatología observada en SUH.

Abstract:
The hemolytic uremic syndrome (HUS) is characterized by hemolytic anemia, thrombocytopenia and renal dysfunction. The typical form of HUS is generally associated with infections by Gram-negative Shiga toxin (Stx)- producing Escherichia coli organisms. Endothelial dysfunction induced by Stx is central, but bacterial lipopolysaccharide (LPS) and neutrophils (PMN) contribute to the pathophysiology. The renal failure is characteristic, although in severe cases, neurological complications occur and is usually associated with death. Impaired blood-brain barrier (BBB) is associated with damage to cerebral endothelial cells (ECs) that comprise the BBB. Astrocytes (ASTs) are inflammatory cells in the brain and determine BBB function. ASTs are in contact with ECs, hence the study of the effects of Stx1 and LPS on ASTs, and the influence of this response on ECs is essential. Stx1 and LPS induced activation of ASTs and the release of TNF-a, nitric oxide and PMN attractant chemokines. Factors released by Stx1 and LPS stimulated-ASTs decreased endothelial permeability. Furthermore, these factors induced ECs activation promoting platelet and PMN adhesion. Evaluated effects were dependent on ASTs secreted-TNF-α. Stx1 and LPS induced ASTs response could contribute to BBB dysfunction and to the development of the neuropathology observed in HUS.

Maymó, Julieta L.. "Regulación de la expresión de leptina y su acción en células placentarias" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Conocida inicialmente como la “hormona de la gordura” por su asociación con la saciedad y el balance energético del organismo, la leptina, una proteína de 16 kDa, también es reconocida actualmente por el papel fundamental que posee en la biología reproductiva. La expresión de la leptina y de sus receptores, descubierta originalmente en tejido adiposo, se ha evidenciado en otros tejidos tales como placenta, en donde la síntesis de leptina es altamente regulada. Los niveles de leptina aumentan tempranamente durante la gestación, aún antes de que se incremente el tejido adiposo, sugiriendo que existen otros factores que modulan su producción. Sin embargo, los mecanismos de acción de la leptina sobre la implantación y el crecimiento embrionario son aún desconocidos. El presente trabajo ha sido desarrollado con el objeto de estudiar las vías de transducción de señales activadas por leptina en placenta y para elucidar los mecanismos que median el efecto antiapoptótico de leptina. Más aún, dado que la leptina sería importante en la supervivencia celular y en el mantenimiento de la placenta, analizamos la regulación de la expresión de leptina en placenta por la hormona gonadotrofina coriónica y por AMPc. Se utilizaron como modelo las líneas celulares trofoblásticas JEG-3 y BeWo, y explantos de placenta humana a término. Demostramos que la unión de la leptina a su receptor causa la estimulación de las vías de señalización de JAK/STAT, MAPK, p38MAPK y PI3K. Asimismo, hallamos que la leptina cumple una función antiapoptótica en células trofoblásticas y que ejerce dicha función principalmente a través de la vía de MAPK. Cuando estudiamos la regulación de la expresión de leptina, los resultados mostraron que la hCG, una hormona esencial del embarazo, estimula la transcripción y la síntesis de leptina en placenta. Contrario a lo esperado, el AMPc inhibió la inducción de leptina por hCG. El efecto de hCG sobre leptina parece estar mediado por la vía de MAPK. Observamos que el AMPc estimula la expresión de leptina en placenta y que el nucleótido es capaz de activar no sólo la vía de señalización de PKA sino también la de MAPK. En este sentido, demostramos que la acción inductora del AMPc sobre leptina estaría mediada por un entrecruzamiento entre dichas vías. En síntesis, los resultados obtenidos contribuyen a esclarecer el modo de acción de la leptina en placenta así como los mecanismos de regulación de la expresión de la proteína, y sustentan la importancia de la leptina en la biología de la reproducción.

Abstract:
Leptin is a 16000 MW protein product of the obese gene, originally considered as an adipocyte-derived signaling molecule for the central control of metabolism. However, leptin has been suggested to be involved in other functions during pregnancy, particularly in placenta, where it was found to be expressed. Leptin levels rise early in pregnancy, even before the augmentation of adipose tissue, suggesting that others factors modulate its production. The mechanism of leptin action in implantation and fetal development remains unknown. In the present work we aimed to study the signal transduction pathways activated by leptin in placenta and to elucidate the mechanisms that mediate the antiapoptotic effect of leptin. Moreover, since leptin could be important in trophoblastic cell survival, and therefore in maintenance of the placenta, we attempted to study the regulation of leptin expression in placenta. BeWo and JEG-3 choriocarcinoma cell lines, as well as trophoblastic cells from human placenta explants were used. We determined that both models of work express leptin and leptin receptor. We have found that leptin stimulates JAK-STAT, MAPK and PI3K signaling pathways. We demonstrated that leptin has an antiapoptotic effect in placental cells and this effect is mediated mainly by the MAPK pathway. We have also found that hCG added to BeWo cells showed a stimulatory effect on leptin expression and transcription. Similar results were obtained with placental explants thus evidencing physiological relevance. We found that dbcAMP counteracted hCG effect on leptin expression. Moreover, hCG effect on leptin is mediated by the MAPK pathway. We showed that cAMP stimulates leptin expression in placental cells. More interestingly, we demonstrated that the cAMP effect on leptin expression probably involves both the PKA classic signaling pathway and the MAPK signal transduction pathway. A cross talk between these pathways would be responsible for the observed effects. In summary, our results will lead to a better understanding of the regulatory mechanisms of leptin expression by human placental trophoblasts and further support the importance of leptin in the biology of reproduction

Pardo, Romina Paola. "Estudio del rol de la proteína VMP1 en los procesos de autofagia, muerte y sobrevida celular en la fisiopatología pancreática" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La autofagia es un proceso de degradación de componentes citoplasmáticos que en algunos casos puede jugar un rol citoprotectivo, mientras que en otros puede llevar a la muerte celular. En trabajos previos hemos descripto a la proteína transmembrana VMP1, la cual se encuentra inducida en la pancreatitis experimental. Con el objetivo de determinar su función, se estudió su participación en el proceso de autofagia. Los resultados obtenidos en esta tesis demostraron que la sobreexpresión de VMP1 induce autofagia en células cultivadas en un medio rico en nutrientes. Además, VMP1 está involucrada en la autofagia inducida por ayuno y rapamicina. Más aún, el silenciamiento de VMP1 inhibe la formación de autofagosomas por el tratamiento con ayuno o rapamicina sugiriendo que VMP1 es necesaria para la autofagia. Aún no ha sido esclarecido el rol de la autofagia en el cáncer de páncreas. Los estudios desarrollados en este trabajo sobre la autofagia y VMP1 en el cáncer de páncreas, indican que el tratamiento con gemcitabina induce autofagia en las líneas celulares de cáncer de páncreas PANC-1 y MIAPaCa-2, y que este proceso promueve la muerte celular por apoptosis. La inhibición de la autofagia con 3-metiladenina redujo significativamente el porcentaje de células apoptóticas en respuesta a la gemcitabina. También se observó que la gemcitabina induce la expresión temprana de VMP1, que el silenciamiento de VMP1 disminuye la apoptosis inducida por este agente quimioterapéutico y que la sobreexpresión de VMP1 aumenta significativamente el porcentaje de células apoptóticas. Estos resultados demuestran que la vía de autofagia mediada por VMP1 participa en la muerte celular por apoptosis inducida por gemcitabina. Con el objetivo de profundizar el estudio de los mecanismos moleculares mediante los cuales VMP1 interviene en la sobrevida o muerte celular, se buscaron interactores de esta proteína utilizando la estrategia de doble híbrido. Se demostró que VMP1 interacciona con S100A10, un miembro de la familia de proteinas S100 que se encontró sobreexpresado en adenocarcinomas pancreáticos. También se observó que la expresión basal del mRNA de S100A10 en las células MIAPaCa-2 es mayor que en las células HeLa. S100A10 se induce bajo estímulos autofágicos, como el tratamiento de ayuno y la gemcitabina, en células HeLa, pero no en las células tumorales MIAPaCa-2, sugiriendo que en estas su expresión se encuentra desregulada. El análisis del rol de la interacción VMP1-S100A10 en las células tumorales mostró que la sobreexpresión de VMP1 induce la expresión del mRNA de S100A10, sugiriendo que S100A10 forma parte de la respuesta celular mediada por VMP1. Cuando la proteína sobreexpresada es S100A10, se modifica la distribución intracelular de VMP1, disminuyendo su patrón punteado característico y aumentando la distribución en una estructura reticulada semejante al retículo endoplásmico. Finalmente se investigó la participación de S100A10 en el proceso de autofagia mediado por VMP1. Se observó que la sobreexpresión de S100A10 disminuye la formación de autofagosomas tanto en respuesta al tratamiento con gemcitabina como ante la inducción directa por la sobreexpresión de VMP1. Se determinó también que S100A10 reduce la apoptosis inducida por gemcitabina, ya que su silenciamiento aumentó la apoptosis causada por este agente quimioterapéutico. Por lo tanto, la expresión de S100A10 disminuye la autofagia y la apoptosis mediadas por VMP1, favoreciendo la resistencia a la muerte de las células de cáncer de páncreas. Los resultados de este trabajo contribuyen a elucidar el rol de la autofagia en el cáncer de páncreas, señalando a la autofagia mediada por VMP1 como un mecanismo molecular que conduce a la muerte por apoptosis de las células neoplásicas de origen pancreático, y a la proteína S100A10 como un mecanismo posible de supervivencia de las células de cáncer de páncreas, que actúa disminuyendo la capacidad de desarrollar autofagia y apoptosis. En base a los resultados obtenidos, proponemos a la vía de autofagia mediada por VMP1 como posible blanco para el estudio de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de páncreas.

Abstract:
Autophagy is a process of degradation of cytoplasmic components, in some cases can play a cytoprotective role, while in other cases can lead to cell death. In previous works we have described the transmembrane protein VMP1, which is induced in experimental pancreatitis. In order to determine its function, its participation in the process of autophagy was studied. The results obtained in this thesis showed that overexpression of VMP1 triggers autophagy in cells grown in a culture media rich in nutrients. VMP1 is also involved in starvation or rapamycin-induced autophagy. Moreover, the silencing of VMP1 gene inhibits the formation of autophagosomes by starvation or rapamycin treatments, suggesting that VMP1 is necessary for autophagy. The role of autophagy in pancreatic cancer has not been clarified yet. Studies developed in this work on autophagy and VMP1 in pancreatic cancer indicate that treatment with gemcitabine induces autophagy in PANC-1 and MIAPaCa-2 pancreatic cancer cell lines, and this process promotes cell death by apoptosis. Inhibition of autophagy with 3-methyladenine significantly reduced the percentage of apoptotic cells in response to gemcitabine. It was also observed that gemcitabine induces early expression of VMP1. Furthermore, the silencing of VMP1 reduces this chemotherapeutic agent-induced apoptosis and VMP1 overexpression significantly increases the percentage of apoptotic cells. These results demonstrate that the pathway of VMP1-mediated autophagy participates in apoptotic cell death induced by gemcitabine. With the aim of study the molecular mechanisms by which VMP1 participates in cell death or survival, interactors of this protein were searched using the two-hybrid strategy. It was shown that VMP1 interacts with S100A10, a member of the family of proteins S100 found to be overeexpressed in pancreatic adenocarcinoma. It was also noted that the basal expression of the S100A10 mRNA in MIAPaCa-2 cells is higher than in HeLa cells. S100A10 is induced under autophagic stimuli such as starvation or treatment with gemcitabine in HeLa cells, but not in MIAPaCa-2 tumor cells, suggesting that in these cells its expression is unregulated. The analysis of the role of VMP1-S100A10 interaction in tumor cells showed that the overexpression of VMP1 induces S100A10 mRNA expression, suggesting that S100A10 is part of the VMP1-mediated cell response. When S100A10 protein is overexpressed, VMP1 intracellular distribution is modified, lowering its characteristic dotted pattern and increasing distribution in a reticulated structure similar to the endoplasmic reticulum. Finally the involvement of S100A10 in the process of autophagy mediated by VMP1 was investigated. It was found that S100A10 overexpression reduces the formation of autophagosomes induced by gemcitabine treatment or by VMP1 overexpression. It was also determined that S100A10 reduces gemcitabine –induced apoptosis, since its silencing increased apoptosis caused by this chemotherapeutic agent. Therefore, the expression of S100A10 reduces the autophagy and apoptosis mediated by VMP1, increasing death resistance of pancreatic cancer cells. The results of this work contribute to elucidate the role of autophagy in pancreatic cancer, pointing out VMP1- mediated autophagy as a molecular mechanism leading to death by apoptosis of neoplastic pancreatic cells, and protein S100A10 as a possible survival mechanism of pancreatic cancer cells, which acts decreasing the ability to develop autophagy and apoptosis. Based on these results, we postulate the pathway of VMP1-mediated autophagy as a possible target for the study of new therapeutic strategies for pancreatic cancer.

Ocampo, Josefina. "Estudio bioquímico de las isoformas de las subunidades R y C de la proteína quinasa A de Mucor circinelloides y sus efectos en el desarrollo y la diferenciación" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La vía de señalización por cAMP-proteína quinasa A (PKA) juega un rol importante en la regulación del desarrollo, crecimiento y virulencia en un variado número de hongos. La PKA está compuesta por un dímero de subunidades regulatorias (R) y dos subunidades catalíticas (C). La subunidad R posee una estructura modular con un dominio de dimerización y anclaje (D/D) en el extremo Nterminal y dos dominios de unión de cAMP en el extremo C-terminal, entre ambos se encuentra una zona bisagra que incluye el sitio inhibitorio (IS). A ambos lados del IS se definen el linker I y linker II. Nuestro modelo de estudio es el hongo Mucor circinelloides cuya holoenzima PKA se diferencia de las de otras especies por su mayor fuerza de interacción R-C. En esta tesis demostramos la participación del linker I en la interacción R-C y la importancia de su naturaleza química, dada por la presencia de un grupo residuos ácidos, para establecer la alta fuerza de interacción entre las subunidades. Definimos por primera vez en hongos la existencia de cuatro isoformas de subunidad R, PKAR1, PKAR2, PKAR3 Y PKAR4, las cuales se expresan en forma diferencial a lo largo del desarrollo de M. circinelloides. Mediante la construcción de dos cepas que poseen anulados los genes de pkaR1 y pkaR2 demostramos que cada una de las isoformas posee roles diferentes en la diferenciación y morfología del hongo. M. circinelloides también presenta múltiples isoformas de subunidad C, de las cuales hemos ahondado en el estudio de una en particular denominada PKAC. Caracterizamos la isoforma como una posible pseudoquinasa por las características de su secuencia aminoácidica y por la falta de actividad catalítica. Finalmente demostramos la existencia de variantes de R modificadas posttraduccionalmente por ubiquitinación, en particular se definieron isoformas multiubiquitinadas de alto PM y la monoubiquitinación de PKAR2.

Abstract:
The PKA signal transduction pathway plays an important role in growth, development, morphology and virulence of many fungi. PKA is composed of a dimer of regulatory subunits (R) and two catalytic subunits (C). The R subunits has a modular structure: a dimerization docking domain (D/D) at the N-terminus; two tandem cAMP binding domains at the C-terminal region (CNB) and a hinge variable region that includes an inhibitory sequence (IS). At both sides of the IS the regions linker I and linker II are defined. Our experimental model is the fungus Mucor circinelloides with a PKA holoenzyme that differs from other species for its high affinity interaction between R and C subunits. In this work we show the importance of linker I region in the R-C interaction and also the importance of its chemical nature in determining the high affinity interaction between its subunits. The existence of four R subunits isoforms, PKAR1, PKAR2, PKAR3 and PKAR4 is reported. These isoforms show a differential expression through M. circinelloides development. The construction of two strains with deletions in pkaR1 and pkaR2 genes, allowed to demonstrate the role of PKA in the regulation of morphological and cellular development.in M. circinelloides. This fungus also has multiple genes coding for C subunits; we have particularly studied the characteristics and the role of PKAC. This isoform has been characterized as a putative pseudokinase since it is catalytically inactive and has unusual aminoacidic sequence. Finally, we show that some R isoforms are modified post-translationally by ubiquitination, particularly the multiubiquitinated high molecular weight isoforms and the monoubiquitinated PKAR2.

Góngora, Adrián Daniel. "Supresión de la angiogénesis tumoral a través de anticuerpos monoclonales" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La angiogénesis es el mecanismo por el cual se generan nuevos vasos sanguíneos a partir de los pre-existentes. En adultos, la angiogénesis es un evento raro excepto durante la reparación de heridas o en procesos asociados con el ciclo menstrual. Sin embargo, existen desórdenes patológicos dependientes de angiogénesis, como el desarrollo de tumores, la retinopatía diabética, la artritis reumatoidea, entre otras. Este proceso, es modulado en condiciones normales y patológicas por el balance entre factores positivos (pro-angiogénicos) y negativos (anti-angiogénicos), y ha sido propuesto como un factor limitante en el desarrollo tumoral, jugando también un papel importante en la metástasis. Los melanomas son tumores muy agresivos y resistentes a las terapias antineoplásicas que se caracterizan por expresar diversos factores de crecimiento. Estos pueden actuar en forma autocrina e intracrina sobre la proliferación y sobrevida, y en forma paracrina en la angiogénesis. Entre estos factores se destacan el VEGF y el FGF-2. Este trabajo tiene como objetivo principal el desarrollo de anticuerpos monoclonales (AMs), capaces de neutralizar los efectos biológicos del VEGF y del FGF-2 sobre las células endoteliales y evaluarlos terapéuticamente sobre el crecimiento tumoral en ratones atímicos, inducidos por distintas líneas de melanoma humanos. También, se caracterizó la expresión de estos factores en las líneas de melanoma para evaluar si existe una relación entre el efecto terapéutico de dichos AMs y el patrón de expresión de dichos factores en las líneas de melanoma. Concluimos que sólo el bloqueo del VEGF con AMs conduce a una reducción del crecimiento tumoral, mientras que el bloqueo del FGF-2 con AMs no mostró efectos terapéuticos en los modelos ensayados, incluso en las líneas que sobre-expresaban FGF-2, ni la combinación de ambos AMs sinergizó el efecto terapéutico del AM anti-VEGF. Por otro lado, si bien el efecto del bloqueo del VEGF con AMs se observó en todas las líneas neoplásicas ensayadas, evidenciaron una gran diferencia en la respuesta, dependiendo de los niveles de expresión de FGF-2. Las líneas de melanoma que sobreexpresan FGF-2 (A375 y 1205Lu) mostraron una mayor resistencia a esta terapia antiangiogénica, con una reducción del tamaño tumoral del orden del 50% respecto a los controles. Sin embargo, en la línea de melanoma que expresa bajos niveles de FGF-2 (IIB-Mel-J) esta reducción fue cercana al 90%. En conclusión, demostramos que solo el bloqueo del VEGF con AMs es efectivo en el tratamiento de melanomas experimentales y encontramos que este efecto terapéutico es en parte dependiente de los niveles de expresión de FGF-2, que actuaría en forma intracrina, generando una resistencia al tratamiento mencionado. De esta manera, contribuimos a definir al FGF-2 como un posible marcador de resistencia a esta terapia en melanoma. Finalmente, a partir del AM anti-VEGF, desarrollamos un anticuerpo recombinante de cadena simple (scFv-Fc) neutralizante de la actividad biológica del VEGF. Resultados preliminares indican que con solo un bajo porcentaje de células transfectadas con un plásmido que expresa el scFv-Fc anti-VEGF, xenotransplantadas en ratones atímicos, alcanza para disminuir significativamente la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

Abstract:
Angiogenesis is the process by which new blood vessels sprout from pre-existing vasculature. In adults, angiogenesis is a rare event except during the wound healing or menstrual cycle. However there are pathological disorders like tumors, diabetic retinopathy, and rheumatoid arthritis, among others, that depends on angiogenesis. This process is controlled in normal and pathological conditions by a balance between positive (pro-angiogenic), and negative (anti-angiogenic) factors, and it has been proposed as a limiting process in tumor development, and metastasis. Melanoma is an aggressive tumor resistant to antineoplastic therapies and are known to express several growth factors that can act as an autocrine and intracrine way in proliferation and survival and as a paracrine way in angiogenesis. Among other factors, VEGF and FGF- 2, are the more important pro-angiogenic factors. The aim of this work was to develop two monoclonal antibodies (MAs) able to block the biological effects of VEGF and FGF-2 on endothelial cells growth, and to evaluate their therapeutic effect on human melanoma cells growing in athymic mice. Moreover, we have characterized the expression of these factors in three melanoma cell lines, to evaluate the possible relationship between the therapeutic effect of these MAs and the expression of these factors in those cells. We have concluded, that only the MA anti- VEGF induces a reduction on tumor growth, while MAs against FGF-2 showed no antitumor activity on the assayed models, even in cell lines that overexpress this factor, and the combination of both MAs did not show improvements in the MA anti-VEGF therapeutic effect. On the other hand, although the therapeutic effects of VEGF inhibition was observed in all cell lines studied, we have found a great response differences depending on FGF-2 expression levels. Cells that overexpressed FGF-2 (A375 y 1205Lu), showed a greater resistance to this anti-angiogenic therapy with only a 50% on tumor size reduction as compared with the untreated mice. Nevertheless, when the xenotransplanted mice carrying melanoma cell line (IIB-Mel-J), that express lower values of FGF-2, were treated with MA anti-VEGF, the tumor mass reduction was near 90%. In conclusion, we have demonstrated that only the use of MA anti-VEGF is responsible for the decrease of experimental melanoma progression and we found that this therapeutic effect is in part dependent on FGF-2 expression levels, acting as an intracrine factor given rise to anti- VEGF therapy resistance. In this way, we have defined FGF-2 as a possible melanoma resistance molecular marker to this therapy. Finally, from the MA anti-VEGF, we have developed a recombinant single chain version (scFv) that neutralizes VEGF activity. Preliminar results indicated that only few percentage of melanoma cells transfected with a plasmid codifing scFv-Fc anti-VEGF, and xenotransplanted in athymic mice, are enough to reduce both angiogenesis and tumor progression.

Taverna Porro, Marisa Lía. "Síntesis quimio-enzimática de nucleósidos naturales y modificados" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Este trabajo de tesis presenta una estrategia versátil y económica para la síntesis de nucleósidos tanto naturales como modificados partiendo de azúcares naturales. La aproximación quimio-enzimática de la síntesis de nucleósidos que se exploró, se encuentra resumida en la Figura 1. En primer lugar, se desarrolló una estrategia general de obtención de furanosas-5- fosfato utilizando un esquema de protección química y desprotección selectiva con lipasas, cornbinado con una fosforilación quimica. De esta forrna se sintetizaron D-ribosa 5-fosfato, 2- desoxi-D-ribosa 5-fosfato y D-arabinosa 5-fosfato. Luego se exploró la reacción de glicosidación enzimática de nucleósidos mediante el acoplamiento de nucleósido fosforilasas (NPs) con la fosfopentomutasa (PPM). Esta última, al no ser una enzima comercial, debió ser sobreexpresada y purificada, y su actividad debió ser optimizada para ser utilizada en las reacciones de síntesis de nucleósidos. De esta forrna se han obtenido con altos rendimientos (70-100%) los nucleósidos: adenosina, inosina, 6- metcaptopurín ribonucleósido, 1,2,4-triazol-3-carboxamida ribonucleósido (Rivabirina), timidina, 2'-desoxiuridina, 5-fluoro-2'-desoxiuridina y 5-bromo-2'-desoxiuridina. Asimismo se han obtenido diversos nucleósidos con moderados rendimientos (30-50%), tales como la guanosina, 2-amino-6-cloro-purin ribonucleósido, 2-fluoroadenosina e hipoxantín arabinonucleósido. Finalrnente se han obtenido con escaso rendimiento (10-30%) los siguientes nucleósidos: adenín arabinonucleósido, 6-mercaptopurin arabinonucleósido, 1,2,4-triazol-3-carboxamida arabinonucleósido, 2'-desoxiinosina y 2-amino-6-cloro-purín 2'-desoxirribonucleósido. Luego se llevó a cabo la inrnovilización de la enzima sobreexpresada PPM, y la coinmovilización del sistema enzimático acoplado (PPM-NP). Por último, se realizó un estudio computacional para desarrollar una propuesta estructural de la PPM de E. coli y deterrninar aproximadarnente el sitio activo de la misma y el modo de unión de los ligandos.

Abstract:
This thesis presents a versatile and economic strategy for the synthesis of natural and modified nucleosides, using natural sugars as starting materials. The used chemoenzymatic approach is summarized in Figure 1. In first place, a general strategy for the preparation of furanoses 5-phosphate was developed by means of a selective protection-deprotection scheme using lipases, combined with chemical phosphorylation. Thus, D-ribose 5-phosphate, 2-deoxy-D-ribose 5-phosphate and D-arabinose 5-phosphate were synthesized. Then, the enzymatic synthesis of nucleosides was explored by coupling nucleoside phosphorylases (NPs) and phosphopentomutase (PPM). The latter, not being commercially available, had to be overexpressed and purified, and its activity optimized, in order to be used in nucleoside synthesis reactions. In this way, the following nucleosides were obtained in high yields (70-100 %): adenosine, inosine, 6-mercaptopurine ribonucleoside, 1,2,4-triazol-3-carboxamide ribonucleoside, thymidine, 2'-deoxyuridine, 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 5-bromo-2'- deoxyuridine. Also, several nucleosides were obtained with moderate yields (30-SO%), such as: guanosine, 2-amino-6-chloropurine ribonucleoside, 2-fluoroadenosine and hypoxanthine arabinonucleoside. Finally, adenine arabinonucleoside, dmercaptopurine arabinonucleoside, 1- 1,2,4-triazol-3-carboxamide arabinonucleoside, 2'deoxyinosine and 2-amino-6-chloropurine 2'- deoxyribonucleoside, were obtained with low yields (10-30%). Then, the immobilization of the overexpressed PPM, and the co-immobilization of the coupled enzyme system (PPM-NP) was achieved. Finally, a computational study directed to explore PPM's structure, the approximate determination of its active site and binding mode of the ligands was accomplished.

Brion, Laura. "Regulación hormonal y papel funcional de la map quinasa fosfatasa-1 (MKP-1) en células esteroidogénicas" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las MAP quinasas fosfatasas (MKPs) son componentes regulatorios importantes en aquellos procesos fisiológicos en los cuales participan las MAPKs debido a su capacidad de inactivar específicamente a estas enzimas. En este trabajo se analizó el rol funcional y la regulación transcripcional y post-traduccional de MKP-1 en células esteroidogénicas. Demostramos que hCG y AMPc incrementan los niveles de MKP-1 por mecanismos transcripcionales y post-traduccionales. Los resultados obtenidos indican que hCG/AMPc promueven la fosforilación de MKP-1 por acción de PKA y ERK1/2 y que esta modificación promueve su estabilización. También demostramos que esta fosfatasa se localiza tanto en núcleo como en mitocondrias. En lo que respecta al papel funcional de MKP-1, se comprobó que la expresión de MKP-1 inhibe la producción de esteroides por su capacidad de interferir con la inducción de StAR, una proteína clave para la esteroidogénesis. En conclusión, en este trabajo demostramos que LH/ACTH, además de promover la activación de enzimas necesarias para la síntesis de esteroides como ERK1/2, también dispara la activación de mecanismos que contribuyen a la inactivacion de esta enzima. Se concluye que el aumento en la expresión de MKP-1 y la estabilización de la proteína por acción de hCG/AMPc es un mecanismo clave para el cierre de la acción hormonal sobre la esteoidogénesis.

Abstract:
MAP kinase phosphatases (MKPs) are important regulatory components in the physiological processes in which the MAPKs are involved, due to its ability to inactivate specifically these enzymes. In this study we have analyzed the functional role and transcriptional and post-translational regulation of MKP-1 in steroidogenic cells. We show that hCG and cAMP increase MKP-1 levels by transcriptional and posttranslational mechanisms. The results indicate that hCG/cAMP promotes MKP-1 phosphorylation by PKA and ERK1/2 action and that this modification promotes its stabilization. We also show that this phosphatase is localized in nucleus and mitochondria. Regarding the functional role of MKP-1, it was found that the expression of MKP-1 inhibits the production of steroids by its ability to interfere with the induction of StAR, a key protein for steroidogenesis. In conclusion, in this work we demonstrate that LH/ACTH, in addition of promoting the activation of ERK1/2, which is necessary for steroid synthesis, also triggers the activation of mechanisms that contribute to the inactivation of this enzyme. We show the increased expression of MKP-1 and stabilization of the protein by hCG/cAMP action, as a key mechanism for the closure of hormone action on steroidogenesis.

Rojas, Federico. "El complejo de ubiquitinación SCF en Trypanosoma brucei y su función en la regulación del ciclo celular" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El sistema ubiquitina-proteasoma es una vía reguladora fundamental para controlar la estabilidad de las proteínas dentro de varios procesos celulares, como la señalización y el ciclo celular. En respuesta a señales particulares, proteínas reguladoras específicas son marcadas con una cadena de moléculas de ubiquitina a través de la acción de una cascada enzimática compuesta por una enzima activadora de la ubi- quitina (E1), una enzima conjugadora de la ubiquitina (E2), y una ubiquitina ligasa (E3). Las E3 son responsables de unir los sustratos y acercarlos a la E2 cargada con ubiquitina, la cual luego transfiere la ubiquitina al sustrato y a la siguiente ubiqui- tina de la cadena en una reacción secuencial. Una de las ubiquitina ligasa E3 res- ponsables en el control directo de proteínas involucradas en el ciclo celular es el complejo SCF (SKP1-CUL1-F-box). En esta tesis se estudió cuál es la función de las proteínas que forman parte del complejo SCF en la regulación del ciclo celular de Trypanosoma brucei. El análisis de los genomas de Tripanosomátidos mostró que las cuatro proteínas que forman parte del complejo se encuentran conservadas, a excepción de las proteínas F-box. Utilizando la técnica de ARN de interferencia en los dos estadios del ciclo de vida de Trypanosoma brucei, se determinó en que fase del ciclo celular estas proteínas tienen una función preponderante. Los resultados obtenidos muestran que las subunidades del complejo actúan en diferentes momen- tos del ciclo celular. No solo se demostró que la actividad del complejo SCF es im- portante para el crecimiento de los parásitos in vitro, sino que la enzima conjugadora de ubiquitina es necesaria para que los parásitos establezcan una infección en un hospedador mamífero. A su vez, se utilizó la técnica de Electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE) con el objetivo de identificar posibles sustratos del complejo de ubiquitinación. Este trabajo describe por primera vez la actividad de las subunidades homólogas del complejo SCF en el parásito Trypanosoma brucei.

Abstract:
The ubiquitin–proteasome system (UPS) is a fundamental regulatory pathway for controlling protein stability that underlies many cellular processes, such as signaling and cell cycle progression. In response to particular signals, specific regulatory pro- teins are tagged with a chain of ubiquitin molecules through the action of an enzyma- tic cascade composed of an E1 ubiquitin activating enzyme, an E2 ubiquitin conjuga- ting enzyme (Ubc), and an E3 ubiquitin ligase. E3s are responsible for binding subs- trates and for bringing substrates into the proximity of a ubiquitin-charged E2, which then transfers ubiquitin to the substrate and to the ensuing ubiquitin chain in a pro- cessive reaction. One of the E3 responsible for the ubiquitination of cell cycle regula- tors is the SCF complex (SKP1-CUL1-F-box). In this thesis, we have studied the function of the proteins that form the core of the SCF complex in the Trypanosoma brucei cell cycle. The analysis of the Trypanosome genomes showed us that the four core subunit homologs are conserved, with the exception of the F-box proteins. Using RNA interference in both life cycle stages of Trypanosoma brucei, we were able to determine the cell cycle stages in which these proteins have important roles. The obtained results show that the subunits of the complex act at diferent points in the cell cycle. Not only we demonstrated that the activity of the complex is important for the parasites growth in vitro, but we showed that the ubiquitin conjugating enzyme is indispensable for establishing an infection in a mammalian host. At the same time, we utilized the Two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) technique for the purpose of identifiying possible substrates of the ubiquitination complex. This work analizes for the first time the activity of the subunits of the SCF complex in a lower eukaryote organism.

Haurigot, Lorena Cristina. "Identificación y caracterización de un sistema de secreción de proteínas tipo I en Agrobacterium tumefaciens" (2010-12-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los Sistemas de Secreción de Proteínas tipo I (T1SS) permiten a una amplia variedad de bacterias Gram-negativas secretar proteínas al medio extracelular; estos sistemas participan en varias respuestas fisiológicas como la adaptación al medio ambiente y contribuyen a la virulencia en diversos patógenos. Los T1SS están formados por un componente de membrana interna (ABC) un componente de fusión de membrana (MFP) y un componente de membrana externa (OMF). Los genes de los dos primeros (e inclusive el OMP) suelen estar formando un operón y pueden estar adyacentes a los genes que codifican sus proteínas sustrato. En la bacteria simbionte Rhizobium leguminosarum, el T1SS, PrsDE, es responsable de la secreción de diversas proteínas que participan en la supervivencia del rizobio en el suelo, favoreciendo la formación de estructuras comunitarias denominadas biofilms. A. tumefaciens es un fitopatógeno de alto interés agronómico y biotecnológico. A pesar de la relevancia que los TISS muestran tener en diversas bacterias Gram negativas, hasta la fecha no se ha avanzado en el estudio y la relevancia fisiológica de estos sistemas de secreción en este fitopatógeno. En este trabajo, se aisló a partir de una biblioteca genómica proveniente de A. tumefaciens el cósmido pIJ7760 que fue capaz complementar el fenotipo de secreción de cepas mutantes en el sistema PrsDE de R. leguminosarum. Se determinó que dicho cósmido alberga los genes de un sistema homólogo al que se denominó AspD-AspE, Agrobacterium secretion protein D and E) formado por un componente ABC (dominio de unión a ATP) y otro MFP (proteína de fusión de membranas), respectivamente. Este sistema fue responsable de la secreción de una proteína, a la que se denominó Hla, de función desconocida codificada rio arriba de aspDE. El análisis de las secuencias del cósmido permitió identificar, río arriba de hla, genes cuyo productos presentan alta similitud de secuencia aminoacídica con receptores de hemo (denominado hlaR) y a factores sigma y anti sigma (denominados hlaS y hlaI). Las zonas promotoras de ambos loci presentaron secuencias consenso de reconocimiento del regulador RirA que responde a la concentración de hierro extracelular. Rio arriba de estos genes se identificó un probable sistema ABC de captación de hemo (denominado ahuUVTB) que presenta en su región promotora secuencias de reconocimiento de RirA y del regulador del metabolismo del hemo IrrA. El análisis de las proteínas presentes en el medio extracelular en diversas condiciones de cultivo y nutricionales permitió reflejar un complejo control y una regulación diferencial de la secreción de la proteína Hla en el hospedador sustituto R. leguminosarum A34 y A. tumefaciens C58. Se observó una muy elevada secreción de Hla en el hospedador sustituto R. leguminosarum A34 en medios ricos de cultivo. Se determinó que esta desregulación se debe a que la cepa de A34 contiene una mutación ancestral en algún regulador desconocido hasta la fecha que provoca un fenotipo pleiotrópico. Este regulador es codificado en el plásmido simbiótico pRL1JI y regula, la secreción de Hla. El estudio de la regulación en el pariente heterólogo R. leguminosarum mostró que la secreción de Hla también se ve reprimida por los reguladores globales de respuesta a hierro descriptos en Rhizobiaceae, RirA e IrrA. Por otro lado, el agregado de hemoglobina como fuente de hemo extracelular, indujo la secreción de Hla como proteína mayoritaria en el contexto heterólogo de Rhizobium. El análisis del contexto genético de hla mostró que este gen está incluido en un locus sinténico a otros clusters de genes involucrados en la captación de hemo a través de hemóforos, aunque Hla no presenta similitud de secuencia aminoacídica con hemóforos caracterizados. Sin embargo, la purificación por columna de afinidad de hemina mostró que Hla presenta capacidad de unir hemina y sería el primer hemóforo descripto en la familia Rhizobiaceae. Mediante mutagénesis dirigida se generó una mutante de secreción en aspD de A. tumefaciens C58. Los fenotipos asociados a esta mutante mostraron un carácter pleiotrópico, tanto la autoagregación bacteriana, la adhesión a soporte abiótico y la motilidad en agar se vieron afectadas. En A. tumefaciens la secreción de Hla respondió principalmente a condiciones microóxicas/anóxicas, además de a la ausencia de hierro y presencia de hemo. Interesantemente, la mutante deficiente en la secreción de Hla fue incapaz de inducir la formación de tumores en Kalanchoe sp. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo sugieren que el T1SS AspDE, participaría en la captación de hemo extracelular a través de la secreción de un nuevo hemóforo (Hla) probablemente en condiciones microaerófilas y de bajo hierro presentes en el contexto del tumor.

Abstract:
Type I secretion systems (TISSs) enable a wide spectrum of Gram-negative bacteria to deliver proteins to the extracellular medium. This secretion machinery has been shown to be involved in several physiological responses such as adaptation to the environment and virulence. T1SS are composed by an inner membrane component (ABC), a membrane fusion component (MFP) and an outer membrane component (OMP). ABC and MFP are ussually encoded as an operon and they can even be located in adjacency to some of their substrate proteins. The PrsDE System of the related symbiont R. leguminosarum is responsible for the secretion of several proteins that participate in the survival behaviour of rhizobia in the soil by the establishment of structured communities known as biofilms. A. tumefaciens is an important agroeconomical and biotechnological phytopathogen. Despite the physiological relevance of the subject, previous observations suggested the presence of T1SS in A.tumefaciens since C58 strain genome sequences are available (2001), however there have been no advances in the characterization or functional studies of the secretion system in this phytopathogen. In this work, heterologous functional complementation assay has been carried out using an A. tumefaciens genomic library to revert PrsDE mutant strains of R. leguminosarum A34. This strategy allowed us to isolate an A. tumefaciens cosmid, pIJ7760 encoding a T1SS, namely AspDE (Agrobacterium secretion protein D and E). aspD and aspE genes encoded the ABC (ATP binding domain) and MFP (membrane fusion protein) components of the secretion system respectively. Hla, a conserved unknown protein located upstream in the cosmid, was identified as a substrate of AspDE system. The genetic analysis of the surrounding region revealed a putative heme receptor (HlaR) and an ECF sigma and antisigma factor (HlaSI) encoded upstream of Hla. These genes have a RirA (global iron regulation) consensus sequence in their promoter region. Another putative ABC uptake system (AhuUVTB) was identified in pIJ7760 with recognition sequence for RirA and IrrA (heme response regulator). Extracellular protein analysis from different cultured conditions shown that complex and differential control of the secretion of Hla occurs between R. leguminosarum A34 and A. tumefaciens C58 strains. An elevated Hla secretion was observed in rich medium in the R. leguminosarum A34 heterologous host. This miss regulation was found to be in response to a so far unknown mutation which triggers pleiotropic phenotypes. This regulator is encoded in the pRL1JI symbiotic plasmid and appears to regulate Hla secretion. The modulation of Hla secretion was studied using the related strain R. leguminosarum, and revealed that the secretion of the protein is also controlled by the two global regulators previously described in Rhizobiaceae, RirA and IrrA. Additionally, adding hemoglobin as an extracellular heme source induces the secretion of Hla as the major protein in the R. leguminosarum heterologous context. Despite the fact that Hla shows no homology with previously characterized hemophores, the gene is included in a region with remarkable homology to a locus involved in heme uptake through hemophores. Hla was purified from extracellular medium cultures using hemin affinity column suggesting novel hemophore in Rhizobiaceae family. Using directed mutagenesis, an aspD secretion mutant was generated in A. tumefaciens C58 strain. Phenotypic characterization revealed that the mutation has a pleiotropic phenotype affecting the bacterial aggregation, adhesion to an abiotic surface and agar-motility. Studies on A. tumefaciens showed that apart from responding to iron starvation and addition of heme to the medium, Hla secretion mainly responds to microoxic/anoxic conditions. Interestingly, aspD mutant, unable of Hla secretion was avirulet, as shown by incapability of tumor induction in Kalanchoe sp. plants. Taking together, these results suggest that the AspDE Type I Secretion System characterized in this work could be involved in heme uptake through the secretion of a novel hemophore (Hla) probably in the low iron and microaerobiosis present in the tumor.

Petrillo, Ezequiel. "Regulación del splicing alternativo en plantas. Efectos de la luz por señales retrógradas y de la metil-transferasa de proteínas PRMT5" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Como organismos sésiles, las plantas superiores se caracterizan por un alto grado de plasticidad en el desarrollo en respuesta a las señales ambientales, optimizando así sus funciones de una manera que maximiza sus posibilidades de supervivencia y reproducción. Son capaces de detectar la calidad, cantidad y dirección de la luz, y utilizarla como una señal externa para optimizar su crecimiento. Por otra parte, el splicing alternativo es un mecanismo esencial para aumentar la plasticidad del transcriptoma que juega importantes roles en varios aspectos del desarrollo de los metazoos. Sin embargo, poco se conoce del proceso en plantas y de las consecuencias del mismo. Aquí demostramos que el splicing alternativo de varios genes de Arabidopsis thaliana está regulado por transiciones de luz/oscuridad. Para el caso particular de RSp31 (un gen que codifica para una proteína reguladora de splicing o SR) es la intensidad de la luz incidente la que tiene un efecto directo sobre su transcripción y procesamiento. El cloroplasto percibe la luz y genera una señal (retrógrada) capaz de viajar por la planta que provoca los cambios observados en la abundancia relativa de isoformas de RSp31. Las plastoquinonas, componentes de la cadena de transporte electrónico fotosintético, serían un lugar de integración de diferentes señales y una pieza clave en la respuesta de RSp31 a la luz. Por otra parte, demostramos que la metil‐transferasa de proteínas PRMT5 es un importante regulador del proceso de splicing alternativo en Arabidopsis thaliana y está involucrada en la generación de respuestas circadianas en esta planta. Reunimos evidencia que apunta a un efecto sobre el reconocimiento de los sitios dadores (5’ss) de splicing en el mecanismo por el cual PRMT5 ejerce su modulación sobre el proceso de splicing alternativo. Tal mecanismo estaría conservado en Drosophila melanogaster. En este organismo, al igual que en Arabidopsis, PRMT5 regula la expresión y los patrones de splicing alternativo de numerosos genes. Sin embargo, si bien controla la actividad locomotora (una respuesta mediada por el reloj), su vínculo con el oscilador central es más difuso.

Abstract:
As sessile organisms, higher plants are characterized by a high degree of developmental plasticity in response to environmental signals, thereby optimizing their developmental patterns in a manner that maximizes their chances of survival and reproduction. Plants are able to detect the quality, quantity and direction of light and to use it as an external cue to optimize their growth. On the other hand, alternative splicing is an essential mechanism to increase transcriptome’s plasticity that plays important roles in various aspects of metazoan development. However, little is known of this process and its consequences in plants. Here we show that alternative splicing of several genes of Arabidopsis thaliana is regulated by light/dark transitions. For the particular case of RSp31 (a gene encoding a splicing regulator or SR protein) it is the intensity of light what leads to the effect on transcription and processing. The chloroplast senses light and creates a retrograde signal that travels through the plant that causes the observed changes in the relative abundance of RSp31’s isoforms. The plastoquinone pool, from the photosynthetic electron transport chain, would be a place for integration of different signals and a key factor responsible for RSp31 responses to light. We also identified the protein‐arginine methyltransferase PRMT5 as an important splicing regulator in Arabidopsis thaliana which is involved in circadian responses. We raised evidence pointing at an effect on the recognition of the splicing donor sites (5'ss) underlying the mechanism by which PRMT5 regulates the alternative splicing process. Such a mechanism would be conserved in Drosophila melanogaster. However, while controlling locomotor activity in this organism (a response mediated by the clock), the link to the central oscillator appears more diffuse.

Cassino, Lucila. "Coinfección HIV-HBV en regiones genómicas reguladoras" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La coinfección con HIV y HBV es común en virtud de que ambos virus comparten similares vías de transmisión. La coexistencia de HIV puede modificar la historia natural de la infección por HBV favoreciendo la progresión a cronicidad y aumentando la tasa de replicación de éste. Estos eventos encuentran sustento en la potencial capacidad de modificar el accionar de elementos que regulan la expresión génica. Desde allí surge como objetivo principal de la presente tesis estudiar el impacto de HIV sobre la variabilidad y la evolución molecular de HBV desde las regiones genómicas S, pol, preC/C y X a partir de pacientes crónicamente monoinfectados con HBV y HIV-coinfectados, estudiados longitudinalmente. El genotipo A2 de HBV resultó el más prevalerte ante la coinfección. Sin embargo, comparativamente los aislamientos de tal genotipo caracterizados en pacientes monoinfectados mostraron mayor propensión a cambios en regiones regulatorias. En línea con ello, la evolución molecular de HBV exhibió diferentes tasas de evolución así como menor heterogeneidad y diversidad de cuasiespecies cuando HIV está presente. Este estudio muestra por vez primera el impacto que le imprime la concomitante infección por HIV sobre diferentes parámetros relacionados a la evolución molecular del HBV.

Abstract:
Coinfection with HIV and HBV is a common event since both viruses share blood-borne transmission routes. The natural history of HBV infection is modified by HIV infection leading to an increased risk of hepatitis B evolution to chronicity and a higher replication rate. These events are related with a potential capacity of HIV to modify the activity of regulatory elements of genomic expression. Taking this into account, this thesis is aimed to study HIV impact on HBV variability and molecular evolution in S, pol, preC/C and X HBV genomic regions from HBV monoinfected and HIV coinfected patients, longitudinally studied. Hepatitis B genotype A2 was the most prevalent in coinfected individuals. However, genotype A2 isolates from monoinfected patients showed more changes in regulatory regions. In line with these results, HBV molecular evolution exhibited different evolutionary rates and less heterogeneity and quasispecies diversity when HIV coexists. This study demonstrates HIV influence in different parameters related with HBV molecular evolution.

De Maio, Federico Andrés. "Relevancia de la variabilidad genética del HIV-1 y del hospedador en el SIDA pediátrico: sistema Vif-APOBEC3" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las proteínas APOBEC3 son citidina deaminasas que pueden determinar cambios G→A en la secuencia codificante de HIV-1, propiedad que les confiere una capacidad antiviral. Esta actividad puede ser contrarrestada por el virus al expresar la proteína Vif, la cual recluta un complejo ubiquitina ligasa basado en Culina5 que desestabiliza a las moléculas APOBEC3. La variabilidad genética tanto del virus como del hospedador puede afectar la eficiencia con la que se desarrollan estos procesos. Una elevada edición G→A puede resultar en la restricción de HIV-1 (fenómeno de mutagénesis letal denominado hipermutación), aunque cambios en niveles subletales podrían favorecer a la diversificación viral. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la variabilidad del sistema Vif-APOBEC3 en niños perinatalmente infectados por HIV-1, determinando su relevancia para el desarrollo de SIDA infantil. Los polimorfismos APOBEC3G H186R, APOBEC3G C40693T y CUL5 SNP6 no parecieron modificar el curso clínicos de la infección. En cambio, mutaciones en Vif (inserción de un aminoácido en posición 61 y las sustituciones V13I, V55T, A62D/N/S, L81M y Q136P) sí se relacionaron con diferencias en los tiempos de progresión a SIDA. Se hallaron además evidencias de que ciertos alelos de APOBEC3G/CUL5 seleccionarían variantes particulares de Vif. Se determinó una baja frecuencia de casos con una población proviral constituida mayoritariamente por formas de HIV-1 hipermutadas. El grado de edición en niveles subletales exhibió diferencias entre variantes de CUL5 y Vif. En conclusión, la variabilidad del sistema Vif-APOBEC3 afectaría los tiempos de desarrollo de SIDA pediátrico y también los niveles de edición sufridos por HIV-1.

Abstract:
The APOBEC3 proteins are cytidine deaminases able to determine G→A changes in the HIV-1 coding sequence, a property that confers them antiviral capacity. This activity can be counteracted by the virus through the expression of the Vif protein, which recruits a Cullin5- based ubiquitin ligase complex that destabilizes APOBEC3 molecules. The genetic variability of both virus and host may affect the efficiency of these processes. A high G→A editing can result in the restriction of HIV-1 (phenomenon of lethal mutagenesis called hypermutation), although changes at sublethal levels could favor viral diversification. The aim of the present work was to study the variability of the Vif-APOBEC3 system in perinatally HIV-1 infected children and to asses its relevance to the pediatric AIDS development. The APOBEC3G H186R, APOBEC3G C40693T and CUL5 SNP6 polymorphisms did not seem to modify the clinical course of infection. In contrast, Vif mutations (a one-amino-acid insertion at position 61 and substitutions V13I, V55T, A62D/N/S, L81M and Q136P) were related to different times of progression to AIDS. Evidences suggesting that certain APOBEC3G/CUL5 alleles could select for particular Vif variants were also found. Cases showing a proviral population mainly composed by hypermutants were observed in a low frequency. The grade of editing at sublethal levels exhibited differences linked to CUL5 and Vif variants. In conclusion, the variability of the Vif-APOBEC3 system could affect the time of progression to pediatric AIDS and also the level of editing carried by HIV-1.

La Rosa, Isabel. "Rol del factor morfogenético del hueso 4 (BMP4) en la maduración ovocitaria y el desarrollo embrionario de bovinos" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El factor morfogenético del hueso 4 (BMP4, por sus siglas en inglés Bone Morphogenic Protein) cumple funciones en distintos aspectos del desarrollo como diferenciación, morfogénesis, apoptosis y crecimiento celular en diversos tipos celulares. Nogina es un potente inhibidor de BMP4 que actúa evitando la unión de BMP4 con sus receptores. El objetivo de este trabajo fue investigar el rol de BMP4 en la maduración ovocitaria y en el desarrollo embrionario in vitro de bovinos. Se maduraron in vitro ovocitos bovinos en presencia de BMP4 o de Nogina. A partir de estos ovocitos, se produjeron embriones por activación partenogénica (AP) y por fecundación in vitro (FIV). Por otro lado, se produjeron embriones por AP y por FIV y fueron cultivados en presencia de BMP4 o de Nogina. BMP4 está implicado en la maduración ovocitaria en bovinos con efectos en las tasas de clivaje y el estado pluripotente de los blastocistos; Y Nogina modifica la expresión de ciertos genes en ovocitos. Más aún se demuestra por primera vez que un balance equilibrado del sistema de señalización de BMP es necesario para el correcto desarrollo embrionario preimplantatorio en bovinos.

Abstract:
BMP4 acts on many aspects of development such as differentiation, morphogenesis, apoptosis and cell growth in different cell types. Noggin is a potent BMP inhibitor that exerts its function by binding to BMPs preventing interactions with its receptors. The aim of this work was to investigate the role of BMP4 on oocytes in vitro maturation and embryos in vitro development of bovine. For this, oocytes were in Vitro matured in the presence of BMP4 or Noggin and these oocytes were used to produce embryos by parthenogenic activation (PA) or in Vitro fertilization (IVF). On the other hand, embryos were produced by PA or IVF and cultured in the presence of BMP4 or Noggin. We found that BMP4 is implicated in oocyte maturation with effects on cleavage rates and pluripotency state of the cells. Noggin supplementation up-regulated the expression of certain genes in matured oocytes. Our results show that BMP4 is implicated in bovine oocytes maturation and embryo development. Moreover, our findings demonstrate, for the first time, that a correct balance of BMP signaling is needed for proper preimplantation development of bovine embryos.

Rodríguez, Lorena Gabriela. "Selectividad de la terapia fotodinámica empleando ALA y otros fotosensibilizantes. Rol de la vasculatura en el daño fotodinámico" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Terapia Fotodinámica (TFD), es un tratamiento para el cáncer y otras patologías, basado en la activación de un fotosensibilizante (FS) ante la exposición a la luz. Uno de los mayores desafíos de la TFD es aumentar su selectividad por las células neoplásicas. En este trabajo hemos estudiado la selectividad de FSs (Foscan, Merocianina 540, naranja de Acridina, Clorina, Verteporfin y Photofrin) y pro-FSs (ALA) por las células tumorales en un modelo de línea celular normal/tumoral, HB4a y HB4a-Ras transfectada establemente con el oncogén Ras. Para ello hemos comparado la acumulación y localización subcelular de diversos FSs y la respuesta a la TFD y encontramos que las células transfectadas con Ras son resistentes respecto a su parental. Por lo que nuestro objetivo de trabajo se focalizó en estudiar las causas de dicha resistencia en las células HB4a-Ras. Hemos hipotetizado que dicha resistencia se puede deber a una menor adhesión al sustrato y adhesión célula- célula debido a una desorganización de la E-cadherina y a alteraciones en el citoesqueleto en F-actina y vinculina. Otro aspecto importante de la fotosensibilización es el rol de la vasculatura. En esta Tesis estudiamos cual es el blanco preferencial (vascular o tumoral) de la TFD. Los estudios in vivo indican que tanto el daño tumoral directo como el vascular son fundamentales, mientras que in vitro, las células endoteliales HMEC-1 son más resistentes a la TFD con FSs tetrapirrólicos que algunas líneas mamarias tumorales y que los queratinocitos humanos, aunque no ocurre lo mismo con FSs de otras estructuras tales como la Merocianina 540 y naranja de Acridina. Las diferencias de selectividad por las células endoteliales para los distintos FSs podrían ser explotadas para su uso en el tratamiento de patologías específicas. Hemos concluido que la selectividad de la TFD varía fuertemente con la estirpe celular, y que la estructura del FS es esencial en dicho proceso. Asimismo, la expresión de oncogenes en los tumores, sería un factor determinante en la efectividad del tratamiento.

Abstract:
Photodynamic Therapy (PDT) involves the administration of a photosensitiser (FS) which is activated by light of an appropriate wavelength to treat cancer and other diseases. Tumour selectivity is one of the major challenges in the PDT field. In the present work we have studied FSs (Foscan, Merocyanin 540, Acridine orange, Clorine,Vertephorfin and Photofrin) and pro-FS (ALA) selectivity for tumour cells employing the normal/tumour cell line pair model HB4a and HB4a-Ras. We have compared accumulation and intracellular distribution of a panel of FSs, and we have found that HB4a-Ras cells are resistant to PDT treatment. Taking into account this finding, we then focused on the study of the mechanism of PDT resistance. We hypothesised that a decreased cell-substratum and cell-cell adhesion due to E- cadherin, F-actin and vinculin disorganization, were involved in the development of resistance. The role vasculature in PDT photodamage has largely been discussed. We decided to study vascular and tumour targets in the in vivo and in vitro photodynamic processes. Our results suggest that whereas in vivo both targets are equally damaged by PDT, in vitro, human endothelial HMEC-1 cells are more resistant to PDT employing tetrapyrrolic PSs than some mammary tumour lines and human keratinocytes, but not employing FSs dyes such as Merocyanin 540 and Acridine orange. These differences in selectivity between different FSs could be exploited for the treatment of specific pathologies. The main conclusion of this work was that PDT selectivity strongly depends on cell type, and that FS structure is crucial on the process. Moreover, oncogene expression may be a key point in the prediction of the tumours that can profit from PDT.

Filevich, Oscar. "Compuestos enjaulados para la regulación de la expresión de genes" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En este trabajo se extiende la tecnología de fotoliberadores de moléculas biológicamente interesantes activables con luz visible basados en bipiridinas de rutenio, inicialmente desarrollada en nuestro laboratorio. Se caracterizan algunas propiedades de fotoliberadores de moléculas de importancia biológica, coordinados a rutenio a través de grupos poco básicos como nitrilos o tioéteres. Se describen algunas propiedades de dos de ellos: Un fotoliberador de un fluoróforo derivado de rodamina cuya fluorescencia disminuye en su estado coordinado y es recuperada al ser fotoliberado; y un fotoliberador de una molécula pequeña capaz de controlar la síntesis de proteínas por el operón lactosa, como demuestran los bioensayos en E. coli. La capacidad para proteger y fotoliberar estos grupos funcionales junto con la posibilidad de funcionalizar superficies con fotoliberadores y microirradiarlas a escala subcelular con un microscopio adaptado a tal fin, extienden la utilidad de estas herramientas para responder preguntas actuales y relevantes.

Abstract:
In this work we further extend the technology of visible-light phototriggers for biologically relevant biomolecules, which was originally developed in our lab. We characterize some properties of molecules with biological importance which, through low-basicity groups like nitriles or thioethers, coordinate ruthenium-bipyridine complexes yielding caged-compounds which can be released with low-energy visible light. The properties of two of them are studied to some detail: a phototrigger of a modified rhodamine that is a fluorescence quencher: rhodamine's full fluorescence is recovered upon photorelease. The second one is a phototrigger for a small-molecule which can control genetic systems under lac operon regulatory elements, as shown by E. coli bioassays. As a proof-of-concept, the chemical modification of surfaces with a ruthenium caged-compound is shown, toghether with the optical instrument constructed for controlling photouncageing at a sub-cellular scale. These ruthenium- bipyridine based tools extend the functions available through biomolecule and small-molecule visible-light phototriggers.

Battista, Ariadna Gabriela. "Las señales purinérgicas como reguladores de la proliferación y muerte celular durante la regeneración de la retina de pez cebra" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La retina de los peces óseos, a diferencia de la retina de los mamíferos, posee células progenitoras multipotentes que proliferan a lo largo de toda la vida del animal, originando todos los tipos celulares retinianos, que se agregan al tejido diferenciado a medida que éste crece. Este crecimiento ocurre en una región histológicamente distinguible, ubicada entre la retina neural y el epitelio ciliar, denominada zona ciliar marginal (CMZ), cuyas células poseen capacidad proliferativa. Esta zona representa un anillo de tejido, alrededor de la retina madura, donde existe un gradiente de diferenciación celular, que comprende tanto stem cells (más periféricas) como células progenitoras ya comprometidas con determinados fenotipos retinianos (más centrales). Una característica sorprendente de la retina adulta de pez es que posee la capacidad de regenerarse completamente en respuesta al daño. Por consiguiente, la retina de este vertebrado ofrece características únicas para el estudio de los factores extracelulares e intracelulares que dirigen la proliferación celular y que llevan a la regeneración del tejido adulto. Tanto algunas neuronas como células gliales de la retina, así como también las células del epitelio pigmentario, liberan ATP hacia el espacio extracelular, donde éste, o sus productos de hidrólisis, actúan como neurotransmisores, o neuromoduladores, a través de su unión a receptores purinérgicos específicos. La liberación de ATP puede producirse en respuesta a diversos estímulos fisiológicos, ya sea mecánicos, químicos, osmóticos o eléctricos, o en respuesta a condiciones patológicas como la hipoxia, deshidratación, neurodegeneración o frente a una lesión. Los nucleótidos extracelulares, además de interactuar de manera autócrina o parácrina con receptores purinérgicos de membrana, son hidrolizados por ectonucleotidasas presentes en la membrana plasmática. Entre estas enzimas, una familia importante se denomina ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa (E-NTPDasa). La actividad de estas enzimas no sólo garantiza la finalización del estímulo inducido por los nucleótidos extracelulares, sino que además posibilita la conversión de unos nucleótidos en otros, por ejemplo, ATP a ADP, éste a AMP y luego a adenosina, o UTP a UDP. Estos productos de hidrólisis, a su vez, presentan diferente afinidad por distintos receptores, provocando diversas respuestas intracelulares. El conjunto de nucleótidos y nucleósidos extracelulares, receptores y NTPDasas se conoce como sistema de señalización purinérgica. En esta tesis doctoral, se realizó una caracterización detallada del posible rol regulatorio de las señales purinérgicas sobre la capacidad proliferativa y regenerativa de la retina adulta de pez cebra en respuesta al daño. Se utilizaron dos modelos de daño de tipo citotóxico, uno que provoca una lesión parcial del tejido, generando muerte celular solamente en las capas internas de la retina (interneuronas y células ganglionares), y otro que causa una lesión global, que involucra a todos los tipos celulares retinianos, incluyendo a los fotorreceptores. En primer lugar, se describió que una lesión citotóxica con ouabaína, ya sea parcial o global, indujo la activación mitótica de las células proliferativas presentes tanto en el tejido maduro diferenciado como en la CMZ, alcanzándose un pico de máxima proliferación a los 7 días luego de la lesión. Además, se evidenció un importante rol de los nucleótidos extracelulares en la regulación de esta activación mitótica luego de la inducción de ambos tipos de lesión, ya que el tratamiento con un exceso de enzimas que hidrolizan nucleótidos extracelulares disminuyó significativamente el máximo aumento de proliferación celular. Asimismo, el tratamiento con MRS2179 (un antagonista de los receptores purinérgicos metabotrópicos P2Y1 con alta afinidad por el ADP) disminuyó significativamente el pico de proliferación celular inducido por la lesión (tanto parcial como global) de la retina. Es interesante destacar que retinas no lesionadas y tratadas con un análogo poco hidrolizable del ADP presentaron un aumento significativo de la actividad proliferativa tanto en las capas de tejido maduro como en la CMZ. Estos resultados indicaron que el ADP es una señal suficiente para inducir activación mitótica de los precursores retinianos aún en ausencia de daño. El efecto del ADP en el tejido intacto fue también inhibido completamente por un antagonista del receptor P2Y1. Se observó también que los nucleótidos extracelulares son fundamentales para la reparación del tejido, ya que retinas lesionadas y posteriormente tratadas con apirasa o MRS2179 mostraron un mayor grado de desorganización tisular y desaparición nuclear en todas las capas retinianas, en comparación con retinas lesionadas. El grado de regeneración de las retinas dañadas y sometidas posteriormente a los tratamientos mencionados exhibió un retardo con respecto al tejido lesionado y en regeneración en presencia de señalización purinérgica endógena. Asimismo, se observó que el tratamiento de retinas lesionadas con ARL67156, un inhibidor selectivo de las ecto-ATPasas, disminuyó significativamente el incremento de proliferación celular, evidenciando la importancia de la actividad de las NTPDasas en la regulación de la proliferación celular inducida por la lesión del tejido. Por otra parte, se evidenció un importante rol de los nucleótidos extracelulares en la regulación de la muerte celular inducida por la lesión, ya que la remoción enzimática de estos nucleótidos incrementó significativamente este proceso. Este efecto fue reproducido al bloquear los receptores P2Y1, sugiriendo un rol neuroprotector del ADP, particularmente sobre los fotorreceptores retinianos. Estos resultados sugirieron que las señales purinérgicas son capaces de atenuar significativamente los efectos de la lesión citotóxica sobre la muerte neuronal y glial. Posteriormente, se observó que el nivel de expresión del ARNm de las NTPDasas 1, 2mq, 2mv, y 3 aumentó significativamente luego de inducida la lesión. En concordancia, el patrón espacial de expresión de la proteína NTPDasa2 sufrió importantes cambios luego de la inducción de la lesión. Finalmente, se describió la expresión del receptor P2Y1 en la retina de pez cebra. El nivel de su ARNm, así como su expresión proteica, aumentaron de manera significativa luego de inducida la lesión citotóxica con ouabaína. Se observó además, mediante la técnica de western blot, un cambio en el patrón de expresión en las etapas de degeneración y proliferación, luego de lesionar el tejido retiniano. En conjunto, estos resultados demuestran un rol fundamental, necesario y suficiente del sistema de señalización purinérgica en el control de los mecanismos de proliferación y muerte celular que ocurren durante el proceso de regeneración de la retina adulta de pez cebra.

Abstract:
Teleost fish retina, in contrast with mammal retina, has multipotent progenitor cells that proliferate throughout the animal life, giving rise to all cell types of mature retina, which are added to the differentiated tissue whereas it grows. Moreover, teleost fish retina has a ciliary marginal zone (CMZ) with proliferative capacity, localized around the mature retina, where there is a gradient of cell differentiation, including stem cells, progenitor cells committed to specific retinal phenotypes, and fully differentiated neurons. Remarkably, in teleost fish mechanical, chemical, laser or light damage of the mature retina activates regenerative mechanisms. Regeneration and growth that occur in the adult teleost retina by neurogenesis have been helpful in identifying molecular and cellular mechanisms underlying cell proliferation and differentiation. In the retina, ATP is released from neurons and glia (and also from the retinal pigmented epithelium) to the extracellular milieu where this nucleotide, or its hydrolysis products, acts as a neurotransmitter or neuromodulator by binding to purinergic receptors. ATP release can occur in response to physiological stimuli or to pathological conditions, including retinal damage. Extracellular nucleotides such as ATP, ADP, and UTP are extracellularly dephosphorylated by ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) localized in the cell membrane. The activity of these enzymes not only guarantees the completion of a specific stimulus, but allows the conversion of some agonists to other, with different specificity for different receptors. Extracellular nucleotides and nucleosides, receptors and NTPDases are known as purinergic signaling system. In the present work, we performed a characterization of the possible regulatory role of purinergic signals on the capacity of the zebrafish retina to regenerate in response to damage. We use two different models of cytotoxic lesion: a partial lesion, which produces damage only in the inner layers of the retina, and a global injury, which involves all retinal layers, including photoreceptors. We described that cytotoxic lesion with ouabain, either partial or global, increases cell proliferation both in the mature retina and in the CMZ, with a maximum at 7 days post injury (dpi). Moreover, we demonstrated an important role for extracellular nucleotides in regulating injury-induced cell proliferation, regardless the magnitude of the injury, because treatment with enzymes that hydrolyze extracellular nucleotides significantly decreased the peak of cell proliferation. In addition, treatment with MRS2179 (an ADP-activated P2Y1 receptor selective antagonist) provoked a significant decrease in the injury-induced cell proliferative peak normally observed 7 dpi both in the CMZ and the mature retina. Interestingly, ADPβS significantly increased cell proliferation in intact retinas both at the CMZ and mature retina. Moreover, the selective antagonist MRS2179 of the metabotropic ADP- activated receptor P2Y1 significantly inhibited the increment in cell proliferation induced by ADPβS. We also demonstrated that extracellular nucleotides play a crucial role in retinal repair, since retinas treated with apirase or MRS2179 after lesioning were damaged at a higher level than control ouabain-treated retinas. Additionally, we observed that treatment with ARL67156, which has been shown to inhibit NTPDase activity, significantly reduced injury-induced cell proliferation, showing a role for the enzymes that catalyze the extracellular hydrolysis of ATP as well as other nucleotides in controlling cell proliferative activity in lesioned retinas. On the other hand, we described an important role for purinergic signals in regulating cell death induced by injury, since scavenging of extracellular nucleotides significantly increased cell death. This effect is partially reproduced by blocking P2Y1 receptors suggesting a neuroprotective function for ADP. Furthermore, lesioned retinas showed a significant increase of NTPDase1, 2mq, 2mv and 3 following injury. In accordance with this result, expression pattern of NTPDas2 changed after injury. Lesioned retinas also showed a significant increase of P2Y1 receptor mRNA expression relative to undamaged retinas in the proliferative phase. P2Y1 receptor protein, when assessed by western blot and immunocytochemistry, showed a lesion-induced change in its expression pattern as well as an increase and modified distribution on damaged retinal layers. In summary, this study demonstrated a crucial role for endogenous purinergic signals regulating cell proliferation, as well as cell death, induced by a cytotoxic injury of the adult zebrafish retina, which underlays retinal repair.

Robaldo, Laura. "Síntesis, caracterización y aplicaciones de dnazimas modificadas con 2´-desoxi-2´-c-metilnucleósidos" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las enzimas de ADN (DNAzimas) son moléculas catalíticas formadas por una cadena simple de desoxirribonucleótidos. Estas moléculas no se encontraron en la naturaleza sino que fueron obtenidas a través de procesos de selección molecular in vitro. En particular, la DNAzima 10-23 es una enzima de ADN que fue descripta por Santoro y Joyce en 1997. Es la más utilizada en estudios de silenciamiento génico en sistemas biológicos debido a su capacidad de reconocer, unirse e hidrolizar una molécula de ARNm. Su secuencia se compone de un núcleo catalítico conservado de 15 desoxirribonucleótidos y dos brazos de reconocimiento a ambos lados del núcleo. Luego de unirse por complementariedad de bases, la DNAzima 10-23 puede hidrolizar al ARNm blanco entre una purina desapareada (A, G) y una pirimidina apareada (U, C) en presencia de Mg2+. La estabilidad de una DNAzima se puede mejorar mediante la incorporación de nucleósidos modificados tanto en el núcleo catalítico como en los brazos de reconocimiento. Estas modificaciones pueden aumentar la estabilidad y prolongar la vida media de la DNAzima en sistemas biológicos. Por otro lado, el uso de modificaciones químicas permite estudiar y resolver interrogantes respecto a la relación entre la estructura y la función de estas moléculas. Esta tesis consiste en la síntesis y caracterización de DNAzimas modificadas en el núcleo catalítico con (2'R) y (2'S)-2'-desoxi-2'-C-metilnucleósidos. Estos nucleósidos presentan una restricción de la conformación del anillo furanósico dependiendo de la configuración del carbono 2 ́. Por otra parte, al incluir estas modificaciones en secuencias de oligonucleótidos, se ve aumentada la estabilidad ante la degradación por nucleasas. El objetivo principal fue obtener DNAzimas resistentes a la degradación nucleolítica que pudieran ser útiles en la inhibición de la expresión de ARNms terapéuticos. Por otra parte, se analizaron las consecuencias funcionales y estructurales generadas por la incorporación de estas modificaciones a la estructura de la DNAzima 10-23. Los resultados obtenidos muestran que las modificaciones (2'R) y (2'S)-2'-desoxi-2'-C- metilnucleósidos pueden ser estratégicamente introducidas en diferentes posiciones del núcleo catalítico de la DNAzima 10-23 sin observarse una pérdida significativa de la actividad. También se observó que estas modificaciones aumentan la vida media de las DNAzimas en diferentes sistemas biológicos. En base a estos resultados, podemos concluir que las DNAzimas sintetizadas en este trabajo podrían ser útiles como molécula antisentido en la inhibición de la expresión de ARNms terapéuticos.

Abstract:
DNA enzymes (DNAzymes) are catalytic molecules composed of a single strand of deoxyribonucleotides. They are unnatural sequences that were discovered through molecular in vitro selection processes. The 10 23 DNAzyme is a specific DNA enzyme that was described by Santoro and Joyce in 1997. It is the most commonly used in biological studies of gene silencing because it shows the ability to recognize, bind and then cleave RNA. The 10 23 DNAzyme sequence is composed of a conserved catalytic domain of 15 deoxyribonucleotides and two substrate recognition arms on both sides. It can cleave any RNA substrate between an unpaired purine (A, G) and a paired pyrimidine (U, C) in presence of Mg2+. DNAzyme stability may be improved by employing chemically modified nucleotides at either the core or the flanking regions. The modifications can increase the stability of the macromolecule and extend DNAzyme half life in biological systems. On the other hand, the inclusion of modifications could also solve questions related to structure function relationships of these molecules. This thesis involves the synthesis and characterization of modified 10-23 DNAzymes in the catalytic core with (2 R) and (2 S)-2 -deoxy-2 -C-methylnucleosides. These nucleosides show differential preferred sugar conformation depending on the configuration of the 2 ́-carbon. The inclusion of these modifications into oligonucleotides sequences increases the stability to nuclease degradation. The main objective was to obtain active modified DNAzymes with increased resistance to nucleolitic degradation and could therefore be useful for targeting interesting mRNA. On the other hand, the functional and structural implications of the introduction of these restricted modifications in the catalytic core of the 10-23 DNAzyme were also studied. The results presented herein show that (2 R) and (2 S)-2 -deoxy-2 -C- methylnucleosides can be strategically introduced in different positions of the catalytic core without significant loss of activity. They also show that these modifications enhance the half life of modified DNAzymes in different biological systems. For these reasons we concluded that the modified DNAzymes synthesized in this work could potentially be used as resistant antisense molecules against therapeutics mRNA targets.

Cardillo, Sabrina Beatriz. "Regulación de la expresión del gen UGA4 de Saccharomyces cerevisiae: mecanismos moleculares involucrados en la respuesta a los aminoácidos extracelulares" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La levadura Saccharomyces cerevisiae es capaz de incorporar y metabolizar el ácido γ-aminobutírico (GABA) gracias a los productos de tres genes: UGA4, UGA1 y UGA2. El primero de ellos, UGA4, codifica para una permeasa específica de GABA que es capaz de incorporar este aminoácido a las células. Luego, el GABA puede ser degradado por las enzimas GABA transaminasa y succinato semialdehído deshidrogenasa, codificadas por los genes UGA1 y UGA2, respectivamente. Estos genes son inducibles por GABA y esta inducción depende de los factores de transcripción Uga3 y Uga35/Dal81. Estudios previos reportaron que la inducción del gen UGA4 se ve afectada por la presencia de aminoácidos en una forma dependiente del sensor SPS. En este trabajo demostramos no sólo que el sensor SPS interviene en la regulación por leucina del gen UGA4, sino que también los factores Stp1 y Stp2 intervienen en esta regulación. En presencia de leucina, se observó un menor reclutamiento de los factores Uga3 y Uga35/Dal81 al promotor UGA4, lo que sería la causa de la menor inducción observada en esas condiciones. Por otra parte, se demostró que esta alteración en la interacción de dichos factores con el promotor UGA4 es causada por una señal disparada por el sensor SPS. Ambos factores, Uga3 y Uga35/Dal81, actúan a través del elemento UASGABA presente en el promotor UGA4 y dependen uno del otro para poder interactuar con dicho elemento. Más aún, nuestros resultados sugieren que el factor de transcripción Uga35/Dal81 interactúa con el promotor UGA4 a través del factor Uga3. Por otra parte, se demostró que la inducción de la expresión de los otros genes miembros del regulón UGA, UGA1 y UGA2, es también inhibida por aminoácidos en una forma dependiente del sensor SPS y que esta regulación ocurre muy probablemente a través del mecanismo establecido para UGA4. Por último, demostramos que el factor de transcripción Leu3 regula negativamente la expresión de los genes UGA4 y UGA1 pero no interviene en la regulación de UGA2.

Abstract:
Saccharomyces cerevisiae yeast cells are able to transport and metabolize γ-aminobutyric acid (GABA) using the product of three genes: UGA4, UGA1 and UGA2. The first one, UGA4, encodes a GABA specific permease, while the other two genes, UGA1 and UGA2, encode the GABA transaminase and semialdehyde dehydrogenase enzymes, both responsiblefor GABA degradation. These genes are inducible by GABA and this induction depends on Uga3 and Uga35/Dal81 transcription factors. Previuos reports demonstrated that UGA4 induction is inhibited by the presence of extracellular amino acids being this effect mediated by the SPS amino acid sensor. In this work we demonstrated that the effect of leucine on UGA4 induction is not only mediated by the SPS sensor, but also by the Stp1 and Stp2 transcription factors. Uga3 and Uga35/Dal81 recruitment to UGA4 promoter was affected by the presence of leucine, wich would be the reason of the low induction levels observed in these conditions. We also demonstrated that the low recruitment of these transcription factors to the UGA4 promoter was mediated by a signal triggered by the SPS amino acid sensor. Both transcription factors, Uga3 and Uga35/Dal81, act trough the UASGABA element present in the UGA4 promoter and they depend on each other to interact with that element. In adittion, our results suggest that the Uga35/Dal81 transcription factor interacts with the UGA4 promoter through Uga3. Moreover, we demonstrated that the induction of the other two members of the UGA regulon, UGA1 and UGA2, is also inhibited by extracellular amino acids by the same mechanism we established for UGA4. Finally, we demonstrated that the Leu3 transcription factor negatively regulates UGA4 and UGA1 expression, but does not participate in UGA2 regulation.

Galello, Fiorella Ariadna. "Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependiente de cAMP: proteínas sustrato y de anclaje de PKA de Saccharomyces cerevisiae" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La especificidad en la vía de transducción de señales de cAMP-PKA está determinada por el reconocimiento de la secuencia blanco en el sustrato y por la localización de la quinasa en compartimentos subcelulares. En Saccharomyces cerevisiae los determinantes de la especificidad de la proteína quinasa A (PKA) están menos caracterizados que en mamíferos. Analizamos el comportamiento de los sustratos y los determinantes de secuencia alrededor del sitio de fosforilación de tres proteínas sustrato: Piruvato quinasa 1 (Pyk1), Piruvato quinasa 2 (Pyk2) y Trehalasa neutra (Nth1). La proteína Nth1 es mejor sustrato que la proteína Pyk1 y ambas son fosforiladas tanto por Tpk1 como por Tpk2, dos de las isoformas de la subunidad catalítica de la PKA de levaduras. Las tres proteínas contienen uno o más motivos consenso de PKA, Arg-Arg-X-Ser, pero no todos ellos son fosforilados. Análisis de esos sitios permitieron determinar que los residuos ácidos en la posición P+1 o en el extremo N-terminal son deletéreos para la reacción catalítica, mientras que los residuos positivos presentes más allá de las posiciones P-2 y P-3 la favorecen. Un residuo hidrofóbico voluminoso en posición P+1 no resulta crítico, a diferencia de lo que ocurre con los sustratos de la PKA de mamíferos. El mejor sustrato tiene en la posición P+4 un residuo ácido, equivalente al que se encuentra en la secuencia inhibitoria de Bcy1, la subunidad regulatoria de la PKA de levaduras. Se analizó también el efecto del sustrato sobre la activación de la holoenzima y demostramos que tanto los sustratos peptídicos como las proteínas enteras sensibilizan en diferentes grados, dependiendo de sus secuencias, a la holoenzima para la activación por cAMP. Los resultados también sugieren que las proteínas enteras son mejores co-activadores que los péptidos. Se determinaron los catalitic turnover numbers de las isoformas Tpk1 y Tpk2, y ambas enzimas mostraron el mismo valor, 3 seg-1, diez veces menor que el valor determinado para las subunidades C de mamíferos. La compartimentalización de la señal del cAMP, otro punto de regulación de la especificidad, es mantenida por el agrupamiento de las enzimas de la vía de señalización en unidades discretas a través de las proteínas de anclaje de la proteína quinasa A (AKAPs), las cuales interactúan con la subunidad regulatoria de la holoenzima. Hasta el momento no habían sido identificadas proteínas de anclaje en levaduras. Definimos, utilizando abordajes in silico y bioquímicos de copurificación e identificación por espectrometría de masa, proteínas que hacen interacción con Bcy1, entre ellas: GTPase activating protein 2 (Ira2), Myosin2 (Myo2), Heat shock protein 60 (Hsp60) and Protein Tyrosine Phosphatase 1 (Ptp1). Utilizando arrays de péptidos se identificaron los residuos críticos para la interacción en las proteínas de anclaje. Los dominios definidos como claves de la interacción presentan una estructura posible de α-hélice con residuos cargados positivamente que son importantes para la interacción. Usando mutantes de deleción se definió que las proteínas estudiadas hacen interacción con la región N-terminal de Bcy1. Se verificó la interacción in vitro por ensayos de pull-down, e in vivo por inmunoprecipitación. También se demostró que Bcy1 e Ira2 localizan en la misma fracción subcelular y que péptidos derivados de Ira2 son fosforilados por las Tpks in vitro. Se analizó la relevancia fisiológica de la interacción entre Bcy1 y Hsp60 y se observó que la actividad quinasa de PKA disminuye en ausencia de la chaperona, indicando que la Hsp60 tendría una función estabilizadora sobre las Tpks y además que frente a un estrés térmico Bcy1, Tpk1 y Hsp60 aumentan su localización en la fracción mitocondrial, lo que permitiría modular el transporte de proteínas mitocondriales por fosforilación

Módena, Natalia A.. "Estudios sobre la fosforilación de la proteína de movimiento TGBp1 del Potato Virus X" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas, miembro tipo del género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para el movimiento viral de célula a célula en la planta hospedera. Diferentes líneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puede regular la replicación y el movimiento viral. En este estudio, se demostró que la proteína TGBp1 es fosforilada por al menos una proteína quinasa, presente en extractos de plantas de Nicotiana tabacum infectadas con PVX y no infectadas, que posee características distintivas de la caseína quinasa 2 (CK2). El análisis en geles bidimensionales de extractos de plantas infectadas permitió determinar que la proteína TGBp1 producida durante la infección viral presenta múltiples isoformas de diferentes puntos isoeléctricos; el tratamiento con fosfatasas de los extractos de plantas infectadas indicó la presencia de isoformas fosforiladas. A través de la combinación de estudios de determinación de aminoácidos fosforilados por espectrometría de masa, comparación de secuencias aminoacídicas de TGBp1 de distintos virus y evaluación de la fosforilación in vitro de mutantes puntuales y de deleción de la proteína TGBp1, se identificaron tres probables sitios de fosforilación por la quinasa CK2 de N. tabacum: S-165, T-193, T-214. Se observó que la simulación de la fosforilación en los residuos T-193 y T-214 regula negativamente la dispersión viral y la capacidad de la proteína TGBp1 de hidrolizar ATP. Los resultados sugieren firmemente que una proteína quinasa de la familia de CK2 estaría involucrada en la fosforilación de TGBp1 durante el curso de la infección viral de N. tabacum. Además, se discute el modo en que la fosforilación podría regular las actividades de la proteína TGBp1 durante la infección viral.

Abstract:
Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome is based on a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movement proteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capside protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside the host plant. Recent work on other plant viruses has indicated that viral proteins phosphorylation by host kinases can regulate processes such us viral replication and mobilization. The results obtained during this Thesis work show that TGBp1 is phosphorylated by at least one kinase protein with properties characteristic of Caseinkinase 2 (CK2). This kinase activity is present in crude extracts prepared from both non-infected and PVX infected Nicotiana tabacum plants. Bi-dimensional gel experiments with crude extracts from PVX infected plants showed that TGBp1 expressed during infection presented several isoforms with different Isoelectrical points. Some of these isoforms were sensitive to phosphatase treatment, suggesting that TGBp1 is phosphorylated in multiple residues. Several experimental approaches (mass spectrometer identification of phosphorylated aminoacids, sequence comparison among TGBp1 homologues from several viruses, and in vitro phosphorylation experiments with mutated versions of TGBp1), allowed the identification of three potential phosphorylation sites by recombinant alpha subunit N. tabacum CK2: S-165, T-193 and T-214. Mimicking phosphorylation on residues T-193 and T-214 had a negative impact on viral spreading and TGBp1 ATP hydrolysis activity. The results presented in this Thesis strongly suggest that a N. tabacum kinase protein belonging to CK2 family is involved in the phosphorylation of TGBp1 during PVX infection. How the phosphorylation regulates TGBp1 activities is discussed.

Veiga, María Florencia. "Estudios sobre la presencia y expresión de cadherina epitelial en gametas humanas y murinas. Evidencias sobre su participación en el proceso de la fecundación" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La fecundación involucra eventos de adhesión celular ovocitoespermatozoide dependientes de Ca2+. Cadherina epitelial (cadE) es una glicoproteína de membrana de 120 KDa, con 5 dominios extracelulares, 1 transmembrana y 1 citoplasmático. CadE se asocia al citoesqueleto de actina a través de moléculas adaptadoras como β-catenina y está involucrada en la adhesión celular dependiente de Ca2+. CadE participa en el desarrollo embrionario, la organogénesis y mantenimiento de tejidos y la tumorigénesis. El objetivo de este proyecto fue evaluar la expresión de cadE en tejidos reproductivos, su presencia y localización en ovocitos y espermatozoides y su participación en la fecundación. Se emplearon 2 modelos: humano y murino. Los estudios describen 1) la expresión del ARNm de cadE en testículo y epidídimo y 2) la presencia de la proteína en extractos de epidídimo y su localización en las células epiteliales 3) la presencia de cadE en estructuras membranosas del plasma seminal humano y del fluido epididimario murino 4) la presencia, formas proteicas y localización de cadE, β-catenina y actina en espermatozoides murinos epididimarios y humanos eyaculados 5) la localización de cadE en espermatozoides capacitados y reaccionados 6) la localización de cadE en ovocitos y formas proteicas en ovocitos murinos 7) la capacidad de anticuerpos bloqueantes de la función adhesiva de cadE de inhibir la interacción espermatozoide-ovocito 8) la evaluación de la presencia de cadE en pacientes en tratamiento por infertilidad e identificación de alteraciones en algunos casos. Este es el primer estudio que aborda de manera exhaustiva la detección de cadE en las gametas humanas y murinas y muestra evidencias de su rol en la fecundación.

Abstract:
Fertilization involves Ca2+ dependent adhesion events between the oocyte and the spermatozoon. Epithelial cadherin (Ecad) is a 120 KDa glycoprotein organized in five extracellular domains, one transmembrane and one cytoplasmic domain. Ecad is linked to the actin cytoskeleton by adaptor molecules, such as β- catenin, and is involved in Ca2+-dependent cell-cell adhesion. Among several functions, Ecad has been shown to participate in embryonic development, organogenesis and maintenance of tissues as well as in tumor progression and metastasis. The aims of this project were to evaluate Ecad expression in reproductive tissues, its presence and localization in oocytes and spermatozoa and its participation in fertilization. Human and murine tissues and gametes were used throughout the study. The studies have shown: 1) expression of Ecad mRNA in the testis and the epididymis 2) presence of the 120 KDa Ecad form in the epididymis mainly localized in the epithelial cells borders 3) immunodetection of Ecad in membranous vesicles isolated from human seminal plasma and murine epididymal fluid 4) presence and localization of Ecad, β-catenin and actin in murine epididymal spermatozoa and in ejaculated human sperm cells 5) a distinctive localization of Ecad in capacitated and acrosome-reacted spermatozoa 6) immunoreactivity towards Ecad in human oocytes and its protein forms in murine oocytes 7) the ability of specific antibodies towards Ecad to inhibit spermoocyte interaction 8) the assessment of Ecad in patients under infertility treatment and the identification of changes in some of them. This is the first report that thoroughly characterizes the expression of Ecad in tissues of the male reproductive tract, as well as in gametes from mice and humans, and shows evidence of its participation in fertilization.

Grandellis, Carolina. "Identificación de la proteína quinasa dependiente de calcio isoforma 3 de Solanum tuberosum (StCDPK3): estudio genómico, transcripcional y bioquímico" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las CDPKs acoplan un sensor de calcio a un dominio quinasa y coordinan respuestas fisiológicas frente a estímulos. StCDPK3 codifica una CDPK funcional homóloga a isoformas de tomate y tabaco. Se amplificó el gen StCDPK3 (11366 pb), se generó y purificó la proteína recombinante y se determinaron sus parámetros cinéticos. Antagonistas de calmodulina disminuyen la actividad de 6xHisStCDPK3. La proteína recombinante se autofosforila y fosforila histonas. Se generó un anticuerpo policlonal que detecta a StCDPK3 en extractos particulados de hojas. StCDPK3 se expresa en respuesta a PGA y ABA, pero disminuye en respuesta a GA. Líneas transgénicas de fusión del promotor a GUS indican que es activo en hojas, raíces, ojos y brotes de minitubérculos y en estolones elongantes. La actividad GUS disminuye tras la elongación del estolón previo al inicio del crecimiento radial y aumenta en tubérculos tempranos. El factor de transcripción NtRSG es fosforilado por NtCDPK1. Se subclonó su homólogo en papa que es fosforilado in vitro por 6xHisStCDPK3. Además, StCDPK3 fosforila a StABF1. StCDPK3 podría participar en la transducción de señales asociada a procesos de crecimiento y elongación durante el desarrollo del tubérculo (modelo I), el desarrollo de raíces y brotes (modelo II) y como quinasa específica del FT StRSG (modelo III).

Abstract:
CDPKs couple calcium sensors to a kinase domain, and coordinate physiological responses to stimuli. StCDPK3 encodes an active CDPK homologous to tobacco and tomato isoforms. The gene was amplified (11366 bp), the recombinant protein was produced and kinetic parameters were evaluated. Calmodulin antagonists, CPZ and 48/80 reduce 6xHisStCDPK3 activity. The recombinant protein autophosphorylates and is able to phosphorylate histones. A policlonal antibody was produced that detected StCDPK3 in particulate extracts from leaves. StCDPK3 is induced in response to PGA and ABA, but is reduced after GA treatment. Transgenic lines carrying the StCDPK3promotor fused to GUS displayed GUS activity in leaves, roots, minitubers eyes, sprouts and in elongating stolons. When stolon elongation ceases before the onset of radial growth, GUS activity was downregulated to be later detected in early tubers. NtRSG is a transcription factor (TF) phosphorylated by NtCDPK1. The potato homologue, StRSG, was subcloned. In vitro, 6xHisStCDPK3 could phosphorylate NtRSG and StRSG, and an ABA transcription factor, StABF1, suggesting that these TFs could be endogenous targets of the kinase. StCDPK3 could play a role in elongation and proliferation events associated to tuber development (model I), root and sprout growth (model II) and as a specific kinase for StRSG (model III).

Malamud, Florencia. "Bases moleculares del desarrollo de biofilms en Xanthomonas axonopodis pv citri y su rol en el proceso infectivo" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis de los cítricos, una enfermedad endémica en nuestro país. Xac es capaz de desarrollar biofilms in vitro y sobre hojas, propiedad importante para el desarrollo de esta enfermedad. En esta tesis se buscaron nuevos genes involucrados tanto en la adhesión como en el desarrollo del biofilm. Para esto, se realizaron mutantes en genes candidatos y se utilizó una biblioteca de mutantes generadas al azar. Mediante mutagénesis dirigida se estudiaron los roles del flagelo, de la adhesina FhaB y de los dos sistemas de secreción de tipo II presentes en la bacteria. Todas las mutantes deficientes en estos sistemas tuvieron problemas en la adhesión in vitro. Se observó que las bacterias mutantes en el gen que codifica para las proteínas que conforman el gancho flagelar además presentaron dificultades en el desarrollo del biofilm in vivo y deficiencias en la patogenicidad. A través de la realización de un screening donde se utilizó una colección de mutantes generadas al azar, mediante la inserción del transposón Tn5, se encontraron genes cuya participación en el desarrollo del biofilm de Xac ya se conocía: gumB (codifica para una proteína involucrada en la exportación del xantano), xcsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xcs), xpsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xps). También se encontraron nuevos genes implicados en la adhesión de esta bacteria, algunas de estas mutantes presentaron además una importante disminución en su patogenicidad. Se siguió caracterizando en mayor profundidad a una de ellas. La mutante posee una inserción en el gen hrpM, que codifica una glucosiltransferasa implicada en la síntesis de glucanos lineales, de acuerdo a lo que se conoce en otras bacterias. Se observó que esta mutante tiene disminuida su patogenicidad y además es incapaz de sintetizar glucanos cíclicos.

Abstract:
Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) is the causative agent of citrus canker. This disease is endemic in our country and it attacks different types of cultivars. Xac is able to develop biofilms in vitro and on leaves, a very important property for the development of the disease. In this thesis we look for new genes that were involved in adhesion and biofilm formation. For this, both a generation of mutants in candidate genes and and a library of of randomly generated mutants were used. By directed mutagenesis of candidate genes the roles of flagellar proteins, FhaB adhesin, and two proteins of the two type II secretion systems present in Xac were studied. All these defective mutants had problems with adhesion in vitro. Bacteria lacking the gene coding for the flagellar hook also had problems in the development of biofilm in vivo and was also deficient in pathogenicity. With the aim of finding new genes implicated in the biofilm formation a library of mutants was generated using a Tn5 transposon and tested. Some of the mutants found here were previously known as deficient in adhesion: gumB (polysaccharide export outer membrane protein), xcsD (type II secretion system protein D), xpsD (general secretion pathway protein D). New genes implicated in adhesion were also found, some of these mutants were also severely impaired in the development of canker disease. We continue with the characterization of one mutants. The mutant has an insertion in the hrpM gene, implicated in the elaboration of lineal glucans. We observe that this mutant was impaired in canker development. The synthesis of cyclic glucan was also affected.

Rubinstein Guichon, Mara Roxana. "Influencia del condicionamiento genético y del estrés en la desregulación de la respuesta inmune en el estado diabético. Participación del estrés oxidativo" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Aunque está clínicamente aceptado que la diabetes predispone a sufrir infecciones severas y los estudios sugieren una asociación entre esta patología y las infecciones, no se conocen los mecanismos que median entre la diabetes y la inmunosupresión. A su vez, el estrés tiene un significativo reconocimiento en el desarrollo y la evolución de la diabetes. Es así que el objetivo del presente trabajo fue estudiar la respuesta inmune en la diabetes mellitus tipo 1, ampliando el conocimiento acerca de los factores genéticos y no genéticos que participan en la evolución del estado diabético y en la alteración de la respuesta inmune. Para esto, se utilizó un modelo experimental murino de diabetes mellitus tipo 1 en dos cepas de ratones: BALB/cByJ y C57Bl/6J y se analizó la respuesta inmune encontrándose que, en los ratones diabéticos de la cepa BALB/cByJ, la repuesta inmune determinada in vivo e in vitro se encontraba afectada, mientras que en los ratones de la cepa C57Bl/6J no lo estaba. A continuación se investigó el efecto del estrés sobre la respuesta inmune en la diabetes. Para esto se utilizó el modelo de estrés crónico moderado (CMS) aplicado luego de la instauración de la diabetes. Los resultados mostraron que en los ratones diabéticos de la cepa BALB/cByJ el CMS provocó alteraciones más tempranas sobre la proliferación linfocitaria probablemente mediadas por el aumento en la glucemia. En estos ratones se observó una correlación positiva entre la glucemia y catecolaminas. En cuanto al efecto sobre la cepa C57Bl/6J, sólo se encontró un aumento en las glucemias sin estar presente la alteración inmune. Dado que la hiperglucemia es el principal factor involucrado en el desarrollo de las complicaciones de la diabetes, se evaluó su participación en los efectos observados. Para esto, se analizó el efecto de la alta glucosa sobre la actividad linfocitaria normal. Las altas concentraciones de glucosa sobre linfocitos provenientes de la cepa BALB/cByJ afectaron directamente la proliferación y condujeron a la muerte de las células, alteración que no se observó en los linfocitos provenientes de la cepa C57Bl/6J. Entre los mecanismos que estarían implicados en los efectos deletéreos de la alta glucosa se destacó el aumento en el estrés oxidativo. Estos resultados señalan la influencia del condicionamiento genético y del estrés en el deterioro de la respuesta inmune en el estado diabético. Si bien la extrapolación de estos resultados a pacientes con diabetes debe ser tomada con precaución, puntualizan la importancia de un temprano y adecuado control de la glucemia como así también de los factores ambientales que puedan alterarla.

Abstract:
Diabetes is widely believed to predispose to serious infections. Experimental clinical literature supports an association between diabetes and infection. However, the mechanisms linking diabetes and immunosuppression are not well defined. In particular, stress has a significant recognition in the development and progression of diabetes. Therefore, the aim of the present project was to study the immune response in type 1 diabetes and genetic and nongenetic factors involved in the evolution of the diabetic state and in immune response alteration. For this purpose, an experimental animal model of diabetes was used in two mice strains: BALB/cByJ and C57Bl/6J and the immune response was analyzed. The immune response in BALB/cByJ diabetic mice was affected while in C57Bl/6J it was not. Then, the effect of stress on immune response in the diabetic state was investigated. The animals were exposed to a chronic mild stress model after diabetes induction. Stress exposure in BALB/cByJ mice caused earlier alterations on immune response mediated by the glycaemia increase. Also, a positive correlation between glycaemia and catecholamines was found. In C57Bl/6J mice, stress exposure only caused glycaemia increase without the immune alteration. Hyperglyacemia is the main factor involved in the development of diabetes complication, thus its participation in the observed effects was evaluated. The effect of high glucose incubation on lymphocyte reactivity was studied. In BALB/cByJ lymphocytes, high glucose decreased the proliferation and increased the apoptosis whereas in C57Bl/6J lymphocytes these alterations were not observed. Among the mechanisms involved in the deleterious effects of high glucose, the increase in oxidative stress was the most important. These results show the influence of genetic background and stress in the immune alteration in the diabetic state. Although extrapolation of these results to patients with diabetes should be taken with caution, it is important to emphasize the early and adequate glycaemia control as well as environmental factors too.

Bertoli, Carlos Ignacio. "Exploración de la arquitectura genética para la respuesta al frío y al etanol en el modelo Drosophila: líneas de selección y mapeo de QTL" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las respuestas de los organismos a los distintos factores de estrés han sido objeto de estudio desde hace varias décadas. El interés que despertó esta área de conocimiento ha llevado a tomar diferentes enfoques para abordar un tema sumamente complejo como es la respuesta de un organismo a un factor de estrés. Tanto aspectos fisiológicos, como moleculares y genéticos entre otros aspectos, han sido considerados en estudios recientes para develar como es que los organismos responden a la presencia de un estresor. En esta tesis colaboramos, desde la genética cuantitativa, en la búsqueda de la base genética que permita entender más acabadamente que factores intervienen en la recuperación de un individuo cuando se lo expone al frío, así como cuales son los factores que permiten la recuperación y la tolerancia cuando son expuestos a altas concentraciones de etanol. También se buscan posibles correlaciones genéticas entre la recuperación al frío y otros caracteres de historia de vida así como de resistencia a distintas formas de estrés. Hemos hecho uso de un organismo experimental ampliamente utilizado en el área de la genética, Drosophila melanogaster. Asimismo, algunos experimentos también fueron desarrollados en otra especie del mismo género Drosophila, Drosophila buzzatii, que es una especie cactófila. En primer lugar, desarrollamos, mediante selección artificial, líneas para alta y baja velocidad de recuperación al coma por enfriamiento, ambas en Drosophila buzzatii. Una vez constatada la heredabilidad del caracter y la diferenciación significativa entre los fenotipos de ambas líneas evaluamos la posible correlación de este régimen selectivo con distintos caracteres adaptativos, como ser el tiempo de desarrollo, resistencia al golpe de calor, tamaño corporal, resistencia a la inanición, resistencia a los vapores de etanol. También desarrollamos un programa que permite mejorar la eficiencia y precisión de la medición. En segundo lugar, realizamos, mediante la utilización de líneas RIL (líneas recombinantes endocriadas) de Drosophila melanogaster pertenecientes al laboratorio GERES, un mapeo genético para localizar la posible existencia de QTL (loci de caracter cuantitativo) vinculados con las diferencias fenotípicas para la recuperación al frío presentes en las líneas RIL antes mencionadas. En tercer lugar, utilizando estas mismas líneas de Drosophila melanogaster se 4 mapearon tres caracteres vinculados a la respuesta a la exposición al etanol (recuperación y tolerancia en adultos y supervivencia en larvas). Por último, se comparan los resultados obtenidos en los mapeos para la recuperación al frío con los obtenidos en la respuesta al etanol. Si bien se pudo constatar que en Drosophila buzzatii la heredabilidad de la recuperación al coma por enfriamiento es significativa en un régimen selectivo de múltiples generaciones, no se pudo establecer correlaciones genéticas entre este régimen y otros caracteres medidos (tamaño corporal, tiempo de desarrollo, resistencia al calor o resistencia a la inanición). El único caracter que mostró una correlación con el régimen selectivo fue la tolerancia a la exposición al etanol. El mapeo de QTL para la recuperación al frío permitió identificar 3 QTL para los cuales fue posible detectar algunos genes candidatos. Algunos de estos QTL solapan con QTL identificados por otros autores para el mismo caracter de resistencia al frío así como también para otros caracteres de resistencia al calor. Para el caso del mapeo de QTL para la exposición al etanol se encontraron 13 QTL, muchos de estos específicos según el caracter analizado. La superposición de los QTL correspondientes a la respuesta al etanol con los QTL encontrados para la recuperación al frío fue casi nula, así como la superposición entre los mismos caracteres vinculados a la respuesta al etanol. En conjunto, los resultados indican que la arquitectura genética es diferente entre la resistencia al frío y los caracteres mapeados de tolerancia al etanol en el modelo Drosophila. Debido a esto es que podemos decir que la correlación detectada en Drosophila buzzatii parece ser dependiente de la población, lo que nos lleva a plantear que los vínculos entre la respuesta al frío y la respuesta al etanol son débiles y dependientes de la población en estudio.

Abstract:
The responses of organisms to diferent stress factors have been studied for several decades. The interest in this topic has been illustrated from different approaches to address a very complex issue, which is the response of an organism to a stressor. Both physiological and molecular mechanisms, as well as the genetic variation among other issues, have been considered in recent studies to reveal how the organisms respond to the presence of a stressor. In this thesis a quantitative genetic approach is followed to search for the genetic basis of stress resistance to test for factors that are potentially involved in the recovery of an individual when it is exposed to cold stress, and what is the genetic basis for recovery and stress tolerance when exposed to high concentrations of ethanol. This work also test for possible correlations between chill- coma recovery and other adaptive characters, including some life history traits as well as other traits of stress resistance. We made use of an experimental organism widely used in the area of genetics, Drosophila melanogaster. Likewise, another species of the same genus Drosophila is used in other experiments, the cactophilic species Drosophila buzzatii. Firstly, artificial selection was applied to select for both increased and reduced times of chill-coma recovery in Drosophila buzzatii. After constructing divergent lines for chill-coma recovery by artificial selection in D. buzzatii, the possible genetic correlations were tested between this trait and other adaptive traits such as development time, resistance to heat stroke, body size, starvation resistance, resistance to ethanol vapors. I also developed a program that improves the efficiency and precision of measurement. Second, recombinant inbred lines (RIL) of Drosophila melanogaster were used to identify QTL (quantitative trait loci) for chill-coma recovery. Third, the same RIL were used to also map traits of tolerance to ethanol in adults and larvae. Finally, the results are compared between traits of cold and ethanol tolerance. After applying artificial selection for chill-coma recovery in Drosophila buzzatii, replicated lines obtained were divergent for this trait indicating the the trait is heritable. These divergent lines were used to test for any possible genetic correlations between chill-coma recovery and other adaptive traits such as body size, development 6 time, heat-stress resistance and starvation resistance. In these experiments with D. buzzatii, the only character that showed a correlation with selective regime for chill- coma recovery was tolerance to ethanol. QTL mapping for the chill-coma recovery allowed to reveal the presence of 3 QTL where some candidate genes are allocated. Some QTL for chill-coma recover overlapped with QTL with QTL regions detected in previous studies with other mapping populations for both chill-coma recovery and heat-stress resistance. In the case of the QTL mapping for ethanol resistance traits, a total of 13 QTL were identified. There was no consistent overlapping between QTL for chill-coma recovery and QTL for ethanol tolerace. Overall, the results indicate that the genetic architecture of the mapped traits is different between chill-coma recovery and ethanol resistance in the Drosophila model. Because of this we can say is that the correlation detected in Drosophila buzzatii seems to be dependent on the population, which leads us to propose that the ties between the response to cold and response to ethanol are weak and dependent on the study population.

González Polo, Virginia. "Estudio del papel de las palmitoil-proteínas en la regeneración del sistema nervioso, la importancia de la palmitoilación y la ubicación en dominios lipídicos de la membrana en su función" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La S-palmitoilación ha sido propuesta de tener un papel fundamental en la asociación de proteínas citoplasmáticas con la membrana. Nuestro objetivo fue evaluar el papel de la S-palmitoilación en la transducción de señales en neuronas, en tres modelos de investigación: (i) el aislamiento de dominios membranales resistentes a la solubilización con detergentes (DRMs) de sinaptosomas de cerebro de la rata adulta, (ii) la asociación a membranas artificiales de una proteína neuronal palmitoilada y (iii) una visión funcional de la expresión de proteínas palmitoiladas ante un estímulo fisiológico. En el primer modelo de DRMs pudimos ver con el tratamiento con la proteasa trombina y dibutiril AMPc la translocación de ciertas palmitoil-proteínas a DRMs. Complementariamente en el modelo de liposomas estudiamos la asociación de la proteína neuronal GAP-43 palmitoilada ó no a las membranas artificiales de distinta composición. Nuestros resultados nos llevaron a proponer que en la interacción de la proteína GAP-43 con la membrana es influenciada por efectos electrostáticos. Para analizar la influencia del extremo amino terminal en la asociación de GAP-43 sin palmitoilar a la membrana abordamos la técnica de resonancia paramagnética electrónica (EPR). No pudimos observar diferencias estructurales en la proteína asociada a los liposomas en comparación con la proteína libre mediante esta técnica. Finalmente para poner la Spalmitoilación en un contexto funcional, analizamos la expresión y compartimentalización subcelular de varias palmitoil-proteínas durante la injuria y regeneración neuronal, trabajando con un modelo de axotomía unilateral del nervio ciático en ratas adultas. Entre las proteínas analizadas la expresión de la proteína quinasa lyn mostró un aumento significativo en la rama periférica pero no central ante el estímulo de la lesión del nervio ciático. Como conclusión general de nuestros resultados podemos decir que las proteínas palmitoiladas están involucradas activamente en procesos tan importantes como la regeneración neuronal y plasticidad sináptica. En un futuro trabajo y gracias a los avances logrados en la técnica de detección de proteínas palmitoiladas estaremos en condiciones de analizar el estado de palmitoilación de las proteínas involucradas en la regeneración neuronal y durante la remodelación sináptica fisiológica y patológica.

Abstract:
S-palmytolation has been proposed to have a major role in protein-membrane association. Our major objective was to evaluate the role of the S-palmytoilation in the neural intracellular signal transduction. We used three biological systems, (i) the isolation and evaluation of detergent resistant membrane (DRM) domains from adult rat brain synaptosomes, (ii) the association with artificial membranes of a palmytoil protein (iii) and a functional vision of the palmytoil protein because of physiological stimuli. The first approach consisted in the isolation and evaluation of detergent resistant membrane domains from adult rat brain synaptosomes. We saw that the treatment with thrombin and dibutiril cAMP translocated some palmytoil-proteins to DRMs. Complementary we measured the association of the neural GAP-43 S-palmytoilated protein to artificial membranes and to different lipid compositions in vitro. Our results led us to propose that the interaction of the protein GAP-43 with the lipid membrane is influenced by electrostatics forces. We wanted to analyze the influence of the amino terminal end in the association of GAP-43 with the membrane .We used the novel technique Electron Paramagnetic Resonance (EPR). No structural difference was observed when the protein was associated with membrane lipids or free. Additionally, using a unilateral sciatic nerve injury rat model, we analyzed the S-palmytolation of proteins ex vivo during axonal injury and regeneration. The protein lyn showed an increment in the peripherals stream but not in the central by the injury stimuli. Our general conclusion was that the palmytoilated proteins was involved actively in as important processes as neuronal regeneration and synaptic plasticity. In the future work and thanks to the advances obtained in the technique of palmytoil-protein detection we will be able to analyze the state of palmytoilation of the proteins involved in neuronal regeneration and during the physiological and pathological synaptic remodeling.

Arizio, Carla Marcela. "Marcadores funcionales relacionados con la síntesis de pigmentos y su localización en un mapa de ligamiento en Ipomoea batatas L. Lam" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Ipomoea batatas L. Lam, es una especie de importancia agrícola, que se cultiva en más de 100 países con una producción anual de 120 millones de toneladas. Esta especie presenta una raíz engrosada denominada batata que constituye un alimento básico en muchos países subdesarrollados. En la piel y en la pulpa de la raíz engrosada puede observarse una amplia variedad de colores. Estos colores se deben a la presencia de dos clases de pigmentos: las antocianinas (flavonoides) y los carotenoides. Estos pigmentos además de jugar un rol central en la elección por parte del consumidor, presentan importantes beneficios para la salud, principalmente por actuar como antioxidantes. Muchos de ellos han sido caracterizados por sus propiedades antimutagénicos y anticancerígenos El desarrollo de marcadores moleculares asociados a estos genes de interés puede aportar una herramienta eficaz a los programas de mejoramiento, en particular hacia aquellos que están focalizados en la obtención de clones con propiedades funcionales, como el alto contenido de pigmentos. El objetivo principal de este trabajo de tesis fue desarrollar marcadores de Genes Candidatos relacionados con las síntesis de pigmentos para su localización en un mapa de ligamiento estructurado con marcadores neutros: SSR y AFLP Este trabajo contribuye al conocimiento de la estructura y secuencia de los genes de interés, la herencia del genoma y la búsqueda de regiones genómicas relacionadas con la síntesis de pigmentos. El mismo implicó el desarrollo de una población de mapeo a partir de padres segregantes para el carácter de interés, la determinación de la herencia, la localización de los marcadores neutros, el diseño de marcadores de genes candidatos de las rutas de síntesis de los principales pigmentos, el desarrollo de un mapa de ligamiento, la caracterización fenotípica de la población y la búsqueda de regiones genómicas asociadas a dicha variación.

Abstract:
Ipomoea batatas L. Lam, an specie of agricultural importance, is grown in more than 100 countries, with an annual yield of 120 millon tons. This specie presents a thickened root, which constitute a staple food in several underdevelopment countries. In its flesh and skin an assorted range of colors can be observed. These colours are due to the presence of two kinds of pigments: anthocyanins (flavonoids) and carotenoids. They play an important role in consumers’ choice and they present several benefits for health, principally acting as antioxidant as well. Many of them were reported because of their anti mutagenic and anti carcinogenic properties. The development of molecular markers associated with genes of the biosynthetic pathways of these compounds can contributed as an efficient tool to breeding programs, particularly to that which are focus in the obtaining of clones with functional properties like high content of pigments. The main object of this work was the development of markers for Candidate Genes related with pigment synthesis and their localization in a linkage map structured with neutral markers: SSR and AFLP. This work contributes to the knowledge of structure and sequence of genes of interest, genome heredity and the localization of genomic regions related to pigments. This implies a mapping population development from segregant parents for the character in study, marker design for candidate genes, heredity determination, marker localization, linkage map development, phenotypic characterization and the search of genomic regions associated with the variation observed.

Giudice, Jimena. "Estudio de la endocitosis y señalización mitogénica y metabólica de las dos variantes de splicing del receptor de insulina" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La señalización por insulina comprende una compleja cascada de eventos que llevan a la regulación del metabolismo de la glucosa y al crecimiento celular. Fallas en la respuesta a insulina conducen a diabetes mientras que en ciertos tipos de cáncer se encontraron aumentos en la actividad de esta vía se señalización. En mamíferos el gen del receptor de insulina (IR) adquirió un exón adicional junto con la capacidad de procesarlo alternativamente originando dos isoformas, IR-A e IR-B. En esta tesis se presenta el desarrollo de herramientas que permitieron visualizar procesos celulares in vivo por técnicas de microscopía. Esto permitió estudiar la endocitosis de las dos isoformas del IR en células individuales en respuesta a insulina y al factor de crecimiento similar a la insulina II (IGF-II). Una mayor internalización para el IR-A que para el IR-B en respuesta a ambos ligandos fue demostrada. Esto condujo a estudiar la señalización río abajo del receptor observando que la insulina desencadena una cascada mitogénica a través del IR-A y una predominantemente metabólica a través del IR-B. Cuando el estudio se extendió al IGF-II, pudo mostrarse que un mismo receptor sea mitogénico (IR-A) o metabólico (IR-B) se comporta diferente en respuesta a un ligando mitogénico (IGF-II) o metabólico (insulina). La existencia de los híbridos IR-A/IR-B en la membrana fue estudiada generando una quimera del IR capaz de ser modificada extracelularmente y que actúa como dominante negativo selectivo del efecto mitogénico. Esto permitió detectar los dímeros en membrana, analizar su formación y estudiar la señalización diferencial de cada isoforma. Por microscopía de fuerza atómica se midió la interacción molecular entre la insulina y cada IR mostrando que la misma es mayor para el IR-A. Se propone a la dinámica de internalización como el mecanismo responsable de la señalización diferencial de las dos isoformas del IR en respuesta a un mismo ligando. Se plantea un modelo de activación diferencial donde el IR-A se activa más y de forma más sostenida internalizándose más rápido, activando así la vía mitogénica desde los endosomas. Por otro lado, la isoforma B se internaliza de forma más lenta, permitiendo mayor señalización desde la membrana, reclutando moléculas efectoras de esta vía, gatillando la fosforilación de Akt, regulando la actividad de enzimas metabólicas.

Abstract:
Insulin signalling comprises a complex cascade of events playing a key role in the regulation of glucose metabolism and cellular growth. Failures in its function lead to diabetes and disregulations of these pathways were described in many cancer types. In mammals, the insulin receptor (IR) gene acquired an additional exon together with the ability to alternatively skip it in a developmental and tissue-specific manner leading to two isoforms, IR-A and IR-B. This thesis presents the design and development of different tools which allow the visualization of cellular processes in vivo by microscopy. This strategy allowed the study of endocytosis in individual cells after insulin and insulin like growth factor II (IGF-II) binding. The quantitative study revealed a higher rate of endocytosis of IR-A than IR-B induced by both ligands. These differences leaded to study the downstream signaling. It was possible to demonstrate that insulin triggers a mitogenic cascade via IR-A and a more metabolic signaling through IR-B. The study of IGF-II showed that each receptor behaves differently upon activation by a mitogenic ligand (IGF-II) or a metabolic one (insulin). The existence of IR-A/IR-B hybrids in the plasma membrane was studied in this thesis by the generation of an IR chimera that could be modified at the cell surface. This chimera showed behaviour of a selective dominant negative of the mitogenic effect. It was possible to detect the dimers in the plasma membrane, analyze their formation and study the isoform differential signaling. Atomic force microscopy was used to measure the molecular interaction between each IR and insulin. Single molecule force spectroscopy showed that interaction of insulin with IR-A is stronger than with IR-B. This thesis proposes the internalization dynamics as a responsible mechanism for the differential signaling of IR isoforms. By this model, IR-A gets activated and internalized faster triggering mitogenic cascade from the endosomes. On the other hand, IR-B is internalized in a slower manner allowing a higher signaling from the membrane, recruiting effector molecules, triggering Akt phosphorylation, regulating metabolic enzymes and GLUT4 translocation to the plasma membrane.

Tudisca, Vanesa Romina. "Especificidad de la proteína quinasa A en Saccharomyces cerevisiae vía fosforilación y localización de las isoformas catalíticas" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Proteína Quinasa dependiente de cAMP (PKA) participa en una amplia variedad de procesos fisiológicos. En Saccharomyces cerevisiae un único gen codifica para la subunidad regulatoria (BCY1) y tres genes para las subunidades catalíticas (TPK1, TPK2 y TPK3). El desarrollo de esta tesis permitió comprender parte del mecanismo por el cual la vía de transducción de señales cAMP-PKA logra especificidad espacio-temporal en respuesta a variaciones en el medio ambiente. Particularmente, nos propusimos establecer si las tres isoformas de PKA son reguladas diferencialmente por fosforilación y localización subcelular en respuesta a diferentes condiciones nutricionales y de estrés. Hemos determinado que Tpk2 y Tpk3, pero no Tpk1, se localizan en gránulos de procesamiento de mRNA en respuesta al arresto traduccional evocado por estrés nutricional y fase estacionaria. Estos resultados sugieren que la vía de PKA conecta el estado nutricional de la célula con la regulación de la traducción de proteínas. Además hemos identificado a Pkh1 como una quinasa común a Tpk1, Tpk2 y Tpk3 cuya fosforilación diferencial regula la interacción con la subunidad regulatoria y la localización subcelular. Los resultados obtenidos en esta tesis contribuyen a ampliar el conocimiento sobre la especificidad temporal y espacial de la vía de transducción de señales.

Abstract:
cAMP dependent Protein Kinase (PKA) is involved in a wide variety of physiological processes. In Saccharomyces cerevisiae one gene encodes for the regulatory subunit (BCY1) and three genes encode for the catalityc subunits (TPK1, TPK2 and TPK3). This thesis has allowed us to understand some aspects of the mechanism involved in the spatio-temporal regulation of PKA in response to specific stimuli. Our main aim was to determine if specificity of action of PKA catalytic isoforms is achieved through differential phosphorylation and subcelular localization in response to different nutritional and stress conditions. We found that Tpk2 and Tpk3, but not Tpk1, localize in mRNA processing granules in response to translational inhibition induce by nutritional stress and stationary phase. These results indicate that PKA pathway connects the nutritional state of the cell with protein translation regulation. Even more, we have identified Pkh1 as a common kinase of the three Tpks, which differential phosphorylation regulates the interaction with the regulatory subunits and the subcelular localization. The results obtained in this thesis improve our knowledge of the spatio-temporal specificity of signal transduction pathways.

Ainciart, Natalia. "Estudio de Lumazina Sintasa de Brucella como proteína transportadora de antígenos: relación entre estructura, estabilidad e inmunogenicidad" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La proteína lumazina sintasa de Brucella abortus (BLS) tiene características estructurales, de estabilidad y de inmunogenicidad que la convierten en un candidato interesante para su utilización como carrier o proteína transportadora de distinto tipo de moléculas (péptidos, dominios proteicos, azúcares, etc) BLS tiene una estructura de dímero de pentámero en solución y los estudios realizados en el laboratorio establecieron que tiene una temperatura de melting aparente de 89 °C y un ΔG de desnaturalización de 320 ± 22 kJ/mol. Además, genera una alta respuesta tanto celular como humoral cuando la proteína recombinante es administrada en ratones o conejos (inclusive sin adyuvante) o como vacuna a DNA en un vector de expresión eucariota. La fusión de distintos péptidos y dominios proteicos en su extremo amino terminal da lugar a quimeras de BLS y permite utilizarla como proteína transportadora y aumentar la inmunogenicidad contra las moléculas transportadas en distintos modelos animales. BLS se disocia en dos pentámeros plegados cuando es incubada con cloruro de guanidinio 2M o en buffer fosfato a pH 5. Si la concentración de desnaturalizante aumenta por encima de 2,3 M, se produce una disociación y desnaturalización concertadas que dan lugar a monómeros desplegados. Conocer en detalle estos equilibrios nos permitió diseñar dos estrategias para obtener proteínas mixtas de BLS que contuvieran una mezcla de péptidos provenientes de dos quimeras diferentes. Obtuvimos proteínas mixtas con diferente cantidad de péptido OMP31 y pudimos establecer una relación lineal entre la inmunogenicidad y la densidad de epitopes en la presentación antigénica. Al mismo tiempo, obtuvimos mutantes de estabilidad de BLS y estudiamos el efecto que tiene la estabilidad de la proteína transportadora en la inmunogenicidad contra el péptido transportado. Mediante el estudio de este modelo pudimos establecer que la densidad local de epitopes que se consigue con las quimeras de BLS y las elevadas estabilidad e inmunogenicidad intrínseca de BLS son las principales características que hacen que esta proteína funcione tan eficientemente como carrier de moléculas.

Abstract:
The enzyme lumazine synthase from Brucella spp. is highly immunogenic. This decameric protein is remarkably stable to thermal or chemical denaturation, suggesting a correlation between thermodynamic stability, polymeric arrangement and immunogenicity. The three-dimensional structure of this protein shows that is possible to insert foreign peptides or full-length proteins at the amino terminus without disrupting its general folding. These peptides are presented to the immune system in a polymeric way and in the context of a high specific immune response. BLS is a dimer of pentamers in solution, has a melting temperature of 89 °C and a ΔG of denaturation of 320 ± 22 kJ/mol. BLS induces a high humoral and cellular response when the recombinant protein is inoculated in mice and rabbits (even in the absence of adjuvants) or when is used as a DNA vaccine in an eukaryotic expression vectors. The decoration with peptides or protein domains (chimeras) show that of BLS acts as an efficient carrier and enhances the immunogenicity against the transported molecules. BLS dissociates into two folded pentamers when is incubated in 2 M guanidinium chloride in phosphate buffer at pH 5. Guanidinium chloride concentrations above 2.3 M produce a concerted dissociation and denaturation process resulting in unfolded monomers. The knowledge of these equilibria allowed us to design two different strategies to obtain mixed proteins of BLS with peptides from different chimeras. We obtained mixed chimeras decorated with different number of OMP31 peptides and established a linear relationship between the immunogenicity against the peptide and the epitope density. At the same time, we obtained mutants of BLS with decreased stability and studied the effect of the stability of the carrier protein in the immunogenicity of the peptide. This experimental model allowed us to demonstrate that the local density of epitopes and the high stability and intrinsic immunogenicity of BLS are the main features that make BLS an efficient carrier for vaccine design.

De Luca, Paola. "Rol de BRCA1 en la regulación de la transcripción en cáncer de próstata" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El gen de susceptibilidad al cáncer de mama (BRCA1) es un supresor tumoral. Las mutaciones germinales en este gen confieren predisposición al cáncer de mama, ovario y están asociadas con una mayor agresividad del cáncer de próstata (PCa). Varias evidencias demuestran que BRCA1 tiene numerosas funciones, sin embargo, no se conoce aún cuál es el rol de este supresor tumoral en el PCa. En esta tesis determinamos por primera vez que BRCA1 regula directamente su propia transcripción y la de otros genes que intervienen en la respuesta al daño en el ADN, el ciclo celular y la apoptosis en el PCa. Establecimos un mecanismo por el cual la regulación de la transcripción de BRCA1 es una característica fundamental en la modulación de la sensibilidad a los agentes genotóxicos. Comprobamos que BRCA1 forma un complejo multriproteico integrado por E2F1 y Rb, que se asocia a su promotor autorreprimiéndolo. Luego del estrés genotóxico generado por doxorrubicina, BRCA1 se libera activando su transcripción y asociándose a los promotores de otros genes, entre ellos GADD153. Así, BRCA1 induce la transcripción de GADD153 aumentando la apoptosis y el arresto del ciclo celular. Además, generamos un modelo in vivo de xenotransplantes de PCa que poseen disminuída la expresión de BRCA1. Con este modelo demostramos que la disminución de la expresión de BRCA1 aumenta el desarrollo tumoral de próstata. Considerando que los agentes quimioterapéuticos utilizados comúnmente en el tratamiento del cáncer causan daño en el ADN, en este trabajo proponemos que el PCa asociado a mutaciones en BRCA1 presentaría una respuesta alterada a la quimioterapia, representando un nuevo subgrupo de pacientes que podrían requerir terapias alternativas. Los tumores de próstata avanzados se tornan rápidamente resistentes a todos los agentes quimioterapéuticos actualmente utilizados. Así, el entendimiento de los mecanismos de resistencia en tumores con mutaciones en BRCA1 ayudará a desarrollar mejores opciones de tratamiento, como por ejemplo, terapias personalizadas para el PCa.

Abstract:
Breast Cancer susceptibility gene (BRCA1) is a tumor suppressor. Germline mutations in BRCA1 gene increase breast and ovarian cancer risks, and are associated to high grade prostate tumors. Evidence demonstrates that BRCA1 has several functions mainly through interaction with key proteins in several cellular processes; however, BRCA1 role in prostate cancer (PCa) is poorly understood. In this doctoral thesis we determined for the first time that BRCA1 directly regulates its own and other genes transcription in PCa. These genes are involved in DNA damage response, cell cycle and apoptosis. We established one mechanism in which the co- regulator BRCA1 function is a key feature in the modulation of genotoxic sensitivity. We showed that BRCA1 form a multiprotein complex with E2F1 and Rb that associates to its own promoter auto-repressing its expression. After genotoxic stress induced by doxorubicin, BRCA1 is released activating its transcription and associating to other promoters, as GADD153. Thus, BRCA1 induces GADD153 transcription increasing apoptosis and arresting cell cycle. Furthermore, we developed a BRCA1 depleted in vivo xenograft model of PCa. Using this model we could demonstrate for the first time that BRCA1 depletion increases prostate tumor growth in mice. Due to chemotherapeutic agents frequently used in cancer therapy cause DNA damage, in this work we propose that BRCA1 mutations associated to PCa will show different chemotherapy response. This will create a new subset of patients that requires alternative therapies. Advanced PCa rapidly acquire resistance to chemotherapy. Based on this, our model gains high significance. Knowing the mechanisms for BRCA1 associated tumor resistance will help to develop better therapy options, as personalized therapies for PCa.

Sanchez, Sabrina Elena. "PRMT5, un nexo entre el reloj circadiano y el splicing alternativo" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los cambios producidos diariamente en el ambiente donde se desarrollan los seres vivos proveen señales que modulan su desarrollo y crecimiento. En particular, los relojes circadianos les permiten a los organismos adaptarse y anticiparse a esas fluctuaciones, optimizando su éxito reproductivo. En las plantas, las principales fuentes de sincronización están constituidas por los ciclos de luz-oscuridad y las oscilaciones diarias de la temperatura. El objetivo de este trabajo es identificar nuevos componentes regulatorios del reloj circadiano. Para ello, se realizó una búsqueda a gran escala de mutantes de Arabidopsis thaliana. Como resultado de la misma se aisló una mutante para el gen PRMT5. Este locus codifica para una enzima capaz de transferir grupos metilos al aminoácido arginina de otras proteínas. Aquí, se demostró que PRMT5 participa en la regulación de la transcripción, modula el splicing alternativo, y forma parte del oscilador central, mediando parte del control que éste ejerce sobre el procesamiento del ARNm prematuro en esa especie vegetal. Luego, se comprobó que el homólogo de PRMT5 presente en Drosophila melanogaster participa en el control de la actividad locomotora, una respuesta modulada por el reloj circadiano. Sin embargo, su vínculo con el oscilador central mostró ser más difuso que el observado en plantas. Por otro lado, la actividad de esta proteína en la regulación del splicing alternativo parece ser similar en ambos organismos estudiados, y estaría relacionada con el reconocimiento de las secuencias dadoras del splicing. En conjunto, este trabajo constituye una herramienta potencial para el mejoramiento de especies cultivables, ya que incrementar el conocimiento sobre el funcionamiento del reloj circadiano y los mecanismos celulares con los que éste interactúa nos permitirá manipular el tiempo que tardan las plantas en florecer y aumentar su rendimiento. Por otro lado, muchas enfermedades humanas se han asociado a defectos en el splicing, y se ha vinculado a PRMT5 con procesos cancerígenos, por lo cual, mejorar nuestro entendimiento sobre el rol de esta proteína a nivel celular en modelos de estudio simples como lo son Arabidopsis thaliana y Drosophila melanogaster, podría facilitar la labor que se realiza en organismos más complejos.

Abstract:
Circadian clocks allow organisms to adjust multiple physiological and developmental processes in anticipation of daily and seasonal changes in the environment. In plants, the most important signals synchronizing the clock are the day- night cycles and associated temperature changes. To identify new regulatory components of the circadian clock, a high throughput screening of mutants in Arabidopsis thaliana was performed. As a result, we isolated a mutant allele for PRMT5 gene, which codifies for an enzime that transfers methyl groups to arginine residues present in other proteins. Here, we show that PRMT5 is part of a feedback loop strongly associated with the central oscillator, which couples the clock to the control of transcription and alternative splicing. Afterwards, we assayed a mutant affected in the Drosophila melanogaster PRMT5 homolog, and we found that circadian rhythms in locomotor activity are disrupted in this mutant, although the clock connection is more elusive than in plants. We also found evidence indicating that PRMT5 has a role in the regulation of alternative splicing in flies, which seems to be quite similar to that observed in Arabidopsis thaliana, being related to the donor splice sequence recognition. Together, these data could be a useful tool in crop improvement, since a better understanding of the circadian clock and cellular and molecular mechanisms under its control, could allow us to develop novel varieties that flower at the most appropriate time of the year, maximizing crop yield. On the other hand, splicing defects have been linked to human diseases, and PRMT5 has been associated with cancer development. Therefore, understanding the cellular and molecular roles of this protein in simple organisms, could facilitate similar work in more complex ones.

Bellusci, Carolina Paula. "Implicancias de la farmacogenética en la infección pediátrica por HIV-1" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El gen de resistencia a múltiples drogas (MDR1) codifica para la Glicoproteína P (P-gp), que bombea diversos sustratos hacia el exterior de la célula, entre ellos los antirretrovirales: inhibidores de proteasa (PI). Además, el nivel de expresión de MDR1 está regulado por el receptor nuclear PXR. En el presente trabajo de Tesis Doctoral evaluamos la influencia de los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) de MDR1 (T-129C, C1236T y C3435T) y PXR (C63396T) en la infección pediátrica por HIV-1, la respuesta al tratamiento antirretroviral y la expresión de P-gp. Los SNPs C1236T y C3435T cumplirían un rol protector retrasando la progresión a SIDA pediátrico, pero no afectarían la transmisión vertical por HIV-1. Además, evaluamos el efecto de los SNPs en la respuesta antirretroviral al PI lopinavir, demostrando que el SNP C1236T se asocia con una menor concentración plasmática de la droga y una mayor carga viral. Por otra parte, analizamos si los niveles de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ se asocian con los SNPs de MDR1 o PXR, sin hallar diferencias entre los distintos genotipos. Sin embargo, observamos que el nivel de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ aumenta con la edad y la infección pediátrica por HIV-1. En conjunto, nuestros resultados sugieren que P-gp es un factor clave tanto en la modulación de la infección por HIV-1, independientemente de su función en el transporte de drogas, como en la respuesta a la terapia antirretroviral.

Abstract:
The multidrug resistant gene (MDR1) encodes for P-glycoprotein (P-gp), which pumps several substrates out of the cell, such as the antiretroviral protease inhibitors (PI). In addition, the MDR1 expression level is regulated by the nuclear receptor PXR. In the present PhD Thesis we evaluated the influence of the single nucleotide polymorphisms (SNP) T-129C, C1236T y C3435T of MDR1 and C63396T of PXR in HIV-1 pediatric infection, response to antiretroviral therapy and P-gp expression. The SNPs C1236T and C3435T may play a protective role delaying progression to pediatric AIDS, but we did not observe an effect HIV-1 vertical transmission. In addition, we evaluated the effect of SNPs on antiretroviral response to the PI lopinavir, demonstrating that the SNP C1236T is associated with a lower drug plasma concentration and a higher viral load. We analyzed whether P-gp expression levels in CD4+ lymphocytes are associated with the SNPs of MDR1 or PXR, but no differences between the genotypes were found. However, we observed that P-gp expression levels in CD4+ lymphocytes increase with the age and the HIV-1 pediatric infection. Our results suggest that P-gp is a key factor either in the modulation of the HIV-1 infection, independently of its function in drug transport, or in the response to antiretroviral therapy.

Pérez Piñero, Cecilia. "Efecto de compuestos alfa2 y beta-adrenérgicos en modelos experimentales de cáncer de mama humano" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La expresión de receptores β-adrenérgicos (RA-β) es conocida tanto en células tumorales mamarias humanas como en modelos experimentales. Sin embargo, el efecto descripto para agonistas y antagonistas sobre la proliferación celular y crecimiento tumoral es paradójico, impidiendo su utilización como terapia adyuvante, especialmente en tumores refractarios. La expresión de RA-β2 fue confirmada en las células humanas por inmunofluorescencia y RT-PCR. La incorporación de -timidina se encontró aumentada por epinefrina (por acción RA-α2) y disminuida por los agonistas β, isoproterenol o β2 salbutamol. Estos agonistas redujeron el crecimiento de los tumores estudiados (IBH-4 e IBH-6). Este efecto fue revertido por el antagonista β-adrenérgico propanolol. El antagonista α2- adrenérgico rauwolscina y los agonistas β-adrenérgicos isoproterenol y salbutamol fueron igualmente eficaces disminuyendo el crecimiento tumoral y la activación de Erk1/2 (fosforilación analizada por western blot). La señalización de estos RA en cuanto a la disminución de la fosforilación de Erk1/2 demostró ser dependiente de AMPc y de la activacion de la PKA. Cuando se realizaron experimentos de migración, se reveló un efecto modulador de este fenómeno por parte de los compuestos adrenérgicos, tanto por parte de las catecolaminas endógenas epinefrina y norepinefrina como de los agonistas β- adrenérgicos. En los modelos experimentales de cáncer de mama estudiados, los agonistas β- adrenérgicos inhiben la proliferación celular y el crecimiento tumoral. Este efecto está probablemente mediado por la inhibición de la fosforilación de Erk1/2. Estos compuestos fueron tan eficaces como el antagonista α2-adrenérgico rauwolscina, brindando la posibilidad de evaluar nuevas terapias adyuvantes para el tratamiento del cáncer de mama.

Abstract:
β-adrenoceptor (β-AR) expression is known in both human breast cancer cells and experimental animal models. However, the reported effect of the agonists and antagonists on cell proliferation and tumour growth is paradoxical, precluding their utilization as possible adjuvant therapy, mainly in the cases of refractory tumours. β2-AR expression was confirmed in the human cells tested by immunofluorescence and RT-PCR. -thymidine incorporation was increased by epinephrine (by α2-AR action) and decreased in every tested cell line by the β-agonist isoproterenol and/or the β2- agonist salbutamol. Isoproterenol and/or salbutamol reduced tumour growth in both tumours tested (IBH-4, IBH-6). This effect was reversed by the β-adrenergic antagonist propranolol. The α2-adrenergic antagonist rauwolscine and the β-adrenergic agonists isoproterenol or salbutamol performed equally well in lowering tumour growth. Erk1/2 phosphorylation inhibition was mainly mediated by the PKA pathway. When the migration potential was assessed, the endogenous catecholamines and also β- adrenergic compounds were able to modulate the migration of the cells. In the experimental models studied, the β-adrenergic agonists inhibit breast cancer cell proliferation and tumour growth. This effect is probably mediated by Erk1/2 phosphorylation inhibition. The β-adrenergic agonists perform equally well as the α2-adrenergic antagonist rauwolscine, providing possible novel therapeutic adjuvant treatments for breast cancer.

Westergaard, Gastón Germán. "Búsqueda de potenciales blancos para el diseño de drogas anti-parasitarias en dominios de interacción proteína-proteína y proteína-ARN en Trypanosoma cruzi" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En el presente trabajo encaramos la construcción de vectores destino Gateway®, pTREX-GW y pTREX-HGX-GW. Mediante el sistema de detecciones rápidas con fusiones a GFP exploramos una serie de mutantes Tcp14 para definir con exactitud las señales involucradas en su localización nuclear. De esta forma, pudimos determinar que Tcp14 no depende de su unión al factorSF3b155 para ingresar al núcleo, sino que posee una señal propia no descripta hasta ahora, que podría ser explotada como posible blanco de drogas. Otro modelo ambicioso de blanco de drogas son los dominios WW, módulos proteicos que median interacciones proteína-proteína reconociendo motivos peptídicos ricos en prolina. Un ejemplo promisorio entre las proteínas con WW son las TcZFPs. Se utilizó un vector inducible por tetraciclina para sobreexpresar TcZFP1b en las formas epimastigotes. Tras la inducción, los parásitos dejaron de dividirse después de 60 hs de la adición de tetraciclina y una extensa muerte celular se produjo después de 5 días. Las células se observaron como “monstruos” con múltiples flagelos y el contenido de ADN bloqueado en la citocinesis, provocando la muerte celular. Para analizar los cambios globales en la expresión génica, se llevo a cabo una pirosecuenciación de los ARNm en un Genome Sequencer FLX 454-Roche. Un grupo de 70 genes mostraron una regulación positiva mayor a 3 veces respecto al control, mientras que 35 genes mostraron una regulación negativa menor a 3 veces respecto el control. En general, se observó que varios ARNm de funciones relacionadas cambiaron de manera concertada como un patrón en respuesta post-transcripcional a la sobreexpresión de TcZFP1b, que parecería activar parte de un programa para diferenciar a los epimastigotes en tripomastigotes.

Abstract:
In this work we approach the construction of Gateway® destination vectors: pTREX-GW y pTREX-HGX-GW. Through the rapid detection system with GFP fusions we explored a series of Tcp14 mutants to define the precise signals involved in nuclear localization. Thus, we could determine that Tcp14 not depend on its binding factor SF3b155 to enter the nucleus, but has a non-descript, nuclear localization signal (NLS), which could be exploited as a potential target for drugs. Another ambitious model drug target are the WW domains, protein modules that mediate protein-protein interactions by recognizing proline-rich peptide motifs. A promising example between proteins with WW are TcZFPs. We used a tetracycline-inducible vector to overexpress TcZFP1b in epimastigotes. After induction, the parasites stopped dividing after 60 h of the addition of tetracycline and extensive cell death occurred after 5 days. The cells were seen as "monsters" with multiple flagella and DNA content in cytokinesis blocked, causing cell death. To analyze global changes in gene expression pyrosequencing of the mRNA was carried out in a Genome Sequencer FLX 454-Roche. A group of 70 genes showed an upregulation of more than 3 times compared to the control, while 35 genes showed a downregulation of less than 3 times compared to control. In general, we observed that several mRNA-related functions moved in concert as a pattern in post-transcriptional response to overexpression of TcZFP1b, which seems to activate part of a program to differentiate epimastigotes into trypomastigotes.

Benedetti, Lorena Gabriela. "Rol de la proteína de matriz extracelular SPARC en el crecimiento y diseminación metastásica del cáncer de mama" (2011-12-21) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El crecimiento tumoral resulta de la interacción de la célula neoplásica y su entorno. SPARC “Secreted Protein Acid and Rich in Cystein” es una proteína de matriz extracelular cuya expresión normal se asocia al desarrollo y a tejidos en remodelación. En la mayoría de las neoplasias el aumento de la expresión de SPARC se asocia con un mal pronóstico. Sin embargo, en cáncer de mama la función que cumple la expresión de esta proteína en relación al crecimiento del tumor primario y la diseminación metastásica es controvertida. En este trabajo nos propusimos profundizar las funciones de SPARC, proveniente tanto del estroma como de las células epiteliales en la biología del cáncer de mama. A partir de los estudios realizados con animales transgénicos (SP-/-) que no expresan SPARC en ninguna de sus células, diferentesmodelos de cáncer de mama humanos con distintos niveles de expresión de SPARC, y la cuantificación de la expresión de la proteína en muestras de pacientes con cáncer de mama, determinamos que la expresión de SPARC en ambos componentes tumorales, epitelio y estroma, favorece el fenotipo maligno. Mientras que la elevada expresión en el epitelio tumoral resultó ser más relevante, encontramos que la expresión de SPARC en el estroma tumoral favorece el crecimiento del tumor sólo si el epitelio es negativo. Por otro lado, mediante la utilización del modelo murino 4T1, representativo de un tumor humano estadio IV, pudimos establecer una relación positiva entre la expresión de SPARC y la etapa metastásica de la enfermedad. A partir de la tecnología de microarreglos de ADN, encontramos que SPARC es un importante modulador transcripcional del espacio extracelular y de la proliferación celular, así como también de la respuesta inmune. Finalmente identificamosalgunos genes como posibles efectores de SPARC, favorecedores del crecimiento tumoral y la diseminación metastásica.

Abstract:
Tumor growth is the result of the crosstalkbetween neoplastic cells and theirmicroenvironment.SPARC “Secreted Protein Acid and Rich in Cystein” is a matricellular protein whose normal expression is associated with remodeling tissues. Despite some authors describe this protein as a marker of bad prognosis, its role during development and breast cancer progression remains controversial.Our goal was to understand the role of SPARC expressed either by the epithelial cells or by the surrounding stroma in tumor growth and metastatic dissemination of breast cancer. Using SPARC KO mice (SP-/-), human breast cancer lines with different SPARC expression levels, and the quantification of SPARC expression in human breast cancer samples, we were able to determine that both, epithelial and stromal SPARC contributes to tumor progression. While high epithelial SPARC expressionis more relevant, stromal SPARC only facilitates tumor growth in the presence of a SPARC negative epithelium. Moreover, using 4T1 murine model that very closely models a stage IV human breast carcinoma, we established a positive relation between SPARC expression and the metastatic stage of the disease. DNA microarray data revealed SPARC as an important transcriptional regulator of the extracellular region part, cellular proliferation and an immune response modulator. We identified some new genes as possible effectors of SPARC that regulate tumor growth and metastatic dissemination.

Rossi, Lucas Ezequiel. "Impacto de los inhibidores de Deacetilasas de Histonas (iHDAC) sobre la funcionalidad de células NK" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Desde el descubrimiento de que la expresión y funcionalidad de las deacetilasas de histonas (HDAC) se encuentra alterada en muchos tumores y que las mismas contribuyen a la carcinogénesis, se han desarrollado inhibidores de HDAC (iHDAC) para el tratamiento del cáncer. Los iHDAC inducen apoptosis, arresto del ciclo celular e inhibición de la angiogénesis en células tumorales. Sin embargo, no se ha estudiado adecuadamente el impacto de los iHDAC sobre células del sistema inmune involucradas en la respuesta anti‐tumoral. Por eso y debido a la relevancia de las células NK en la respuesta contra tumores, el objetivo de esta tesis fue estudiar el impacto de los iHDAC sobre estas células. Hemos demostrado que los iHDAC Tricostatina A (TSA), valproato de sodio (VPA) y butirato de sodio (NaB) inhibieron la producción de IFN-γ y la actividad citotóxica de células NK humanas. Aunque las drogas indujeron apoptosis en una fracción de las células NK, la marcada inhibición de sus funciones efectoras también se debió a la inhibición de la translocación nuclear de NF-κB y a una modulación negativa en la expresión de receptores activadores (NKG2D, NKp44 y NKp46), receptores de citoquinas (IL-12Rβ1, IL-15Rβ, IL-2Rγ e IL-18R) y de la subunidad α del receptor de IL-2 de alta afinidad (CD25). Además, demostramos que esta modulación negativa de NKG2D, NKp46 y CD25 fue funcionalmente relevante. Estos resultados fueron validados in vivo con células NK de ratones tratados con TSA, las que mostraron una menor expresión de los receptores NK1.1, NKG2D y NKp46, y una menor producción de IFN‐γ en respuesta a la estimulación ex vivo con citoquinas. Asimismo, comenzamos un estudio con muestras de sangre de pacientes epilépticos tratados con VPA ya que las células NK de estos pacientes se encuentran expuestas sólo a los efectos de la droga. Observamos un menor porcentaje de células NK en células mononucleares de los pacientes, las que exhibieron una menor expresión de receptores activadores, una menor producción de IFN-γ y una menor capacidad de degranulación. Estos resultados indican que estas drogas poseen efectos supresores sobre células NK (comprometidas en la inmunovigilancia contra tumores) y contribuyen al diseño de nuevos enfoques para el desarrollo de drogas terapéuticas que no comprometan la respuesta inmune anti-tumoral.

Abstract:
Since the discovery that many tumors exhibit altered expression and activity of different histone deacetylases (HDAC) and that they contribute to carcinogenesis, many HDAC inhibitors (HDACi) have been developed for the treatment of cancer. HDACi can induce apoptosis, cell cycle arrest and inhibit angiogenesis on tumor cells. However, their impact on cells of the immune system involved in immune surveillance against tumors has not been studied. Thus, the aim of this work was to investigate the effect HDACi on NK cells as they constitute critical actors of the anti‐tumor immune response. We have demonstrated that the HDACi Tricostatin A (TSA), sodium valproate (VPA) and sodium butyrate (NaB) inhibited in vitro IFN-γ production and cytolytic activity by human NK cells. Although the drugs induced apoptosis of a minor fraction of NK cells, the strong inhibition of their effector functions involves additional mechanisms such as inhibition NF-κB p50 nuclear translocation and down‐regulation of activating receptors (NKG2D, NKp44 and NKp46), cytokine receptors (IL-12Rβ1, IL-15Rβ, IL-2Rγ, IL-18R) and CD25 (the α chain of the high affinity IL-2R). Downregulation of NKG2D, NKp46 and CD25 were functionally relevant. Our results were validated in vivo, in HDACi treated mice, which exhibited NK cells with lower expression of the activating receptors NK1.1, NKp46 and NKG2D, and produced less IFN-γ upon ex vivo stimulation with cytokines. Preliminary data obtained with peripheral blood mononuclear cells from epileptic patients treated with VPA, showed that these patients exhibited lower percentages of NK cells than normal controls, and these NK cells presented lower expression of NKG2D and NKp46, lower IFN-γ production upon stimulation with citokynes and lower degranulation after stimulation with K562 cell line. Thus, our results suggest that HDACi have immunosuppressive effects on NK cells that may dampen their immune surveillance capacity. Our results may contribute to the development of drugs with a higher therapeutic eficacy which do not compromise immune response.

de la Fuente, Verónica. "Mecanismos celulares y moleculares involucrados en las distintas fases de la memoria de condicionamiento de miedo en ratones" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En el aprendizaje asociativo, la reactivación de la memoria por la presentación de un recordatorio puede inducir dos procesos mnésicos aparentemente opuestos, la reconsolidación o la extinción. En esta Tesis describimos un switch molecular entre mecanismos de transcripción que se inducen diferencialmente en el hipocampo en la determinación de dichos procesos. Encontramos que NF-kB es necesario para la reconsolidación, mientras que para la extinción su activación se ve restringida por la fosfatasa calcineurina. El factor de transcripción NFAT es activado a su vez por calcineurina durante la extinción, y es necesario para que este proceso tenga lugar. Por el contrario, NFAT parecería no tener ningún rol en la reconsolidación. La actividad de calcineurina también es necesaria para que se lleve a cabo el proceso de extinción. Esta fosfatasa jugaría entonces un doble papel: 1) induciendo la activación y translocación de NFAT desde el citoplasma hacia el núcleo, 2) bloqueando a la vez la activación de NF- kB. Asimismo, nuestros resultados en el estudio de la consolidación sugieren fuertemente que calcineurina actúa como limitante negativo en la formación de memorias, y su mecanismo de acción involucra la regulación del estado de activación de NF-kB. Profundizamos entonces el modelo en el que quinasas y fosfatasas dependientes de calcio controlan activamente el procesamiento neuronal, mediante un equilibrio finamente regulado en el que se oponen entre sí. Por último, estudiamos el rol de NF-kB en plasticidad estructural relacionada a procesos de memoria, y resultados preliminares nos indican que el mismo tendría un rol clave en el aumento de densidad de espinas asociado al aprendizaje.

Abstract:
In associative learning, memory reactivation by the presentation of a reminder can induce two behaviorally opposing memory processes, reconsolidation or extinction. In this PhD Thesis, using the fear conditioning paradigm in mice, we describe a molecular switch between transcriptional mechanisms that are induced differentially in the hippocampus by these two processes. We found that NF-kB is necessary for reconsolidation, whereas in extinction, its activation is constrained by the phosphatase calcineurin. The transcription factor NFAT is, in turn, necessary for the extinction process to take place, and it seems to have no role in reconsolidation. Calcineurin activity is also necessary for extinction. This phosphatase plays then a dual role: inducing the activation and translocation of NFAT from the cytoplasm to the nucleus, while blocking activation of NF-kB. Furthermore, our results in the study of the consolidation phase strongly suggest that calcineurin acts as a negative constraint in memory formation, and its mechanism of action involves the regulation of NF-ĸB activation. Thus, we support the model in which kinases and phosphatases actively control calcium-dependent neuronal processing through a finely regulated balance in which they oppose each other. Finally, preliminary results from our study on the role of NF-ĸB in structural plasticity related to memory processes indicate that it has a key role in the increase in spine density associated with learning.

Bello Gay, Estefanía Pilar. "Estudio funcional del receptor dopaminérgico D2 en el sistema nervioso central mediante el uso de ratones mutantes inducibles" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Liberaciones subóptimas o excesivas de dopamina son rasgos característicos de varias patologías muy frecuentes que incluyen a la enfermedad de Parkinson, esquizofrenia, desorden de déficit atencional e hiperactividad (ADHD) y autoadministración compulsiva de drogas de abuso. En este trabajo se estudió el rol del D2R mediante la generación de ratones mutantes condicionales. En primer lugar, generamos ratones deficientes de D2R en las neuronas dopaminérgicas (autorreceptores). Estos ratones tienen la síntesis y liberación de dopamina aumentada, son hiperactivos e hipersensibles a los efectos psicomotores de la cocaína, y tienen mayor motivación para trabajar por la comida. En segundo lugar, estudiamos los efectos de la pérdida de D2Rs en animales adultos que se habían desarrollado normalmente en comparación con ratones deficientes en D2Rs constitutivos que desarrollan programas compensatorios tempranos. La abrupta remoción de los D2R en la adultez provocó una marcada disminución de la locomoción, problemas severos en el aprendizaje y la coordinación de rutinas motoras. En algunos casos, se observó rigidez y temblor en los animales en reposo con características de parkinsonismo. Los resultados obtenidos, demostraron la importancia de la estricta regulación mediada por los D2R (pre y postsinápticos) en el control de la actividad locomotora, la sensibilidad a drogas de abuso y el estado motivacional de los animales.

Abstract:
Suboptimal or excessive dopamine (DA) release are characteristic of a number of very common diseases, including Parkinson's disease, schizophrenia, attention deficit disorder with hyperactivity (ADHD) and compulsive self-administration of drugs of abuse. In this paper, we study the role of D2R by generating mutant mice. First, we generated mice lacking D2R in dopaminergic neurons (autoreceptors). These mice have increased dopamine synthesis and release, are hyperactive and hypersensitive to the psychomotor effects of cocaine, and show enhanced motivation to work for food. Second, we generated a model that allows us to eliminate D2R of adult animals normally developed. The abrupt removal of the D2R in adulthood causes a marked decrease in locomotion, severe learning problems and motor coordination routines. In some cases, it can induce rigidity and tremor at rest. These results demonstrate the importance of the strict regulation mediated by the D2R (pre and postsynaptic) in the control of locomotor activity, sensitivity to drugs of abuse and particularly in the motivational state of animals.

Bachmann, Sandra D.. "Caracterización bioquímica y molecular de nucleósido difosfato quinasas de Solanum tuberosum (StNDPKs): análisis de su expresión en la planta de papa en respuesta a estreses" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La capacidad de respuesta de una planta ante los cambios ambientales circundantes asegura su supervivencia. Los mecanismos de respuesta a estres biótico y abiótico están regulados por vías que dependen de la activación de genes en la cual una red de transducción de señales abarca desde la percepción de las señales hasta la expresión de genes de respuesta permitiendo la adaptación de la planta a su entorno, debiendo para ello integrar las señales externas e internas. Las nucleosido di fosfato quinasas (NDPKs) son enzimas que transfieren el fosfato γ de nucleósidos tri fosfatos (NTPs) a nucleósidos di fosfatos (NDPs) a través de un intermediario fosforilado en una histidina conservada, participando de la red de comunicación energética intracelular y pudiendo alterar el pool de NTPs. En plantas se han visto recientemente involucradas en varias cascadas de señalización. El objetivo general del trabajo es caracterizar las isoformas de NDPK en plantas de papa (S. tuberosum, var. Spunta) y estudiar su participación en la percepción de señales ambientales, analizando su expresión en respuesta a señales de estrés biótico y abiótico. La hipótesis planteada es que, dado que en toda situación de estrés subyace un compromiso energético y considerando que las NDPKs poseen actividad de fosfo-transferasa, éstas podrían estar involucradas en las respuestas a estímulos ambientales. A partir de los EST correspondientes a isoformas de NDPKs (STMED71, STMHY37) detectados en los microarreglos TIGR 10K de ARNm de brotes de papa cultivados en luz/oscuridad, se clonó de la secuencia codificante completa de StNDPK1 (GB FJ743686) a partir de brotes de papa y se sub-clonó un fragmento de la secuencia codificante de StNDPK2 (GB JF832386) a partir de una biblioteca de estolones. Se comparó la expresión de ambas en los distintos tejidos vegetativos y reproductivos de la planta y en tres estadios de tuberización por RT-PCR semi cuantitativa. StNDPK1 se expresa con distintos niveles de ARNm tanto en los tejidos como en los estadios de tuberización, mientras que StNDPK2 se expresaría en algún estadio de estolón tuberizante que no se pudo determinar. El análisis in silico de la secuencia aminoacidica de StNDPK1 muestra que tiene 238 amino ácidos de longitud, un peso molecular aproximado de 26 kDa y un punto isoeléctrico de 9.24. Codificaría para una proteína mitocondrial, el péptido señal comprendería los primeros 56 aa y el PM de la proteína madura sería de aprox. 20 kDa. La proteína recombinante StNDPK1 marcada con seis histidinas (6xHis) en su N-terminal producida se analizó por Western blot. Un anticuerpo anti-His detectó una banda de 26 kDa, mientras que un anticuerpo anti-NDPK1 dirigido contra el extremo Cterminal de la proteína reveló la banda de 26 kDa y una banda de 18kDa que podría corresponder a la proteína madura. Se detectó actividad de NDPK en extractos crudos y fracciones mitocondriales de brotación tubérculos, pero no en fracciones de cloroplastos. Además, los ensayos de Western blot realizados con el anticuerpo específico antiNDPK1 detectó la enzima en la fracción mitocondrial. El análisis filogenético de la proteína muestra que StNDPK1 está directamente emparentada con NDPK de Spinacia olaracea (que localiza en cloroplastos) y que posee un ancestro común con las otras isoformas de NDPKs de localización mitocondrial (AtNDPK3, BrNDPKIII y PsNDPK3). Además se pudo clonar la secuencia genómica completa de Stndpk1 (GB GU144806) de 3358 nts, posee 7 exones y 6 intrones. El Southern Blot usando como sonda la secuencia codificante de StNDPK1 sugiere que este gen pertenece a una familia multigénica. Por otro lado, se obtuvo el promotor de éste gen de 2385 pb cuyo análisis in silico revela la presencia de elementos regulados por luz, frío, daño mecánico, respuesta a defensa y dos sitios reguladores de los niveles transcripcionales (CAATbox y 5UTR Py-rich stretch). Dado que se disponía de mayor información respecto de la estructura del gen y de los elementos regulatorios que contiene la isoforma 1 de StNDPK y considerando que ésta tenía un perfil de expresión menos complejo que la isoforma 2, se realizaron los estudios de expresión en condiciones de estrés abiótico y biótico sólo para la isoforma 1. Los resultados de las RT-PCR semi-cuantitativas muestran que el nivel de ARNm de StNDPK1 aumenta en la exposición de plantas a oscuridad por tiempos cortos, mientras que en la exposición a bajas temperaturas se produce una disminución inicial de la expresión para luego recuperar los niveles normales. Se observó que tanto en el tratamiento con daño mecánico como el agregado de AJ (10μM) producen un aumento del mensajero de StNDPK1. Por otro lado, se midió actividad de NDPK en extractos de proteínas nativas de fracciones mitocondriales y de cloroplastos; tanto el extracto crudo, como la fracción mitocondrial presentan actividad de NDPK, sin embargo en la fracción de cloroplastos no se detectó actividad alguna. El análisis bio-informático sugiere que las dos isoformas, son de localización sub-celular. Pero en particular, StNDPK1 fue detectada por Western blot en la fracción mitocondrial donde también se midió la actividad enzimática; por lo que StNDPK1 sería una isoforma que localiza en la mitocondria. Al menos dos isoformas de NDPK en plantas de papa muestran un patrón muy diferente de expresión, StNDPK1 tiene diferentes niveles de expresión en tejidos, pero su expresión es ubicua, mientras StNDPK2 muestra un patrón más restringido y sólo se expresa en ciertas etapas de estolones, lo que sugiere que posiblemente su expresión esté asociada a ciertas etapas del desarrollo del tubérculo. Nuestros resultados sugieren fuertemente que StNDPK1 está dirigida a la mitocondria. El análisis de los datos de Stndpk1 promotor es consistente con los resultados de la expresión, lo que sugiere que StNDPK1 podrían estar involucrados en las respuestas ambientales a la disponibilidad de luz, temperaturas bajas o ataque herbívoro.

Abstract:
The responsiveness of a plant to environmental changes ensures its survival. Response mechanisms to biotic and abiotic stresses are regulated by signal transduction networks that extend from signal perception to gene activation allowing the plant´s adaptation to the environment through a process that integrates external and internal signals. Nucleoside diphosphate kinases (NDPKs) participate in the intracellular energy communication network by altering the nucleoside triphosphates (NTPs) pool; they catalyze the transfer of γ phosphates from NTPs to nucleoside diphosphate (NDPs) through a phosphorylated protein intermediary at a conserved histidine. NDPKs have been involved in several signaling cascades in plants. The overall aim of this study is to characterize NDPK isoforms in potato (S. tuberosum, var. Spunta) plants and to study their involvement in the perception of environmental signals by analyzing their expression in response to biotic and abiotic stress signals. Our hypothesis is that, as in all stress situations there is an underlying commitment to energy; NDPKs could be involved in responses to environmental stimuli. ESTs from NDPKs isoforms (STMED71, STMHY37) were detected in a TIGR 10K microarray probed with total RNA from potato sprouts grown under different conditions (light/dark). StNDPK1 complete coding sequence (GB FJ743686) was cloned using total RNA from potato sprouts while a fragment of StNDPK2 coding sequence (GB JF832386) was amplified from a cDNA library from tuberizing stolons. Bioinformatic analysis suggested that both isoforms have a sub-cellular localization because they don´t have the characteristic YE motif present in cytosolic NDPKs. Phylogenetic analysis shows that StNDPK1 protein is directly akin of Spinacia olaracea NDPK (which is located in chloroplasts) and shares a common ancestor with other NDPK isoforms with mitochondrial localization (AtNDPK3, BrNDPKIII and PsNDPK3). In silico analysis of StNDPK1 sequence shows that it encodes a protein of 238 aminoacids (aa) with a molecular weight of 26 kDa and an isoelectric point of 9.24. A mitochondrial signal peptide of 56 aa was predicted, thus the mature protein would be of approx. 20 kDa. The recombinant StNDPK1protein tagged with six histidines (6xHis) in its N-terminus was produced and analyzed by Western blot. An anti-His antibody detected a 26 kDa band while an anti-NDPK1 antibody directed against the C-terminus of the protein revealed the 26 kDa band and an 18kDa band that could correspond to the mature protein. NDPK activity was detected in crude extracts and mitochondrial fractions from sprouting tubers, but not in chloroplast fractions. In addition, Western blot assays performed with the specific antiNDPK1 antibody detected the enzyme in the mitochondrial fraction. A Southern blot probed with StNDPK1 complete coding sequence suggests that this gene belongs to a multigene family. The complete genomic sequence of Stndpk1 (GB GU144806) and its promoter region (2385 bp) were cloned. Stndpk1 is 3358 bp long and has seven exons and six introns. In silico analysis of the promoter region reveals the presence of elements regulated by light, cold, wounding, defense and two regulatory sites of transcriptional levels (CAATbox and Py-rich 5UTR stretch). We compared the expression of both isoforms in various vegetative and reproductive tissues of the plant and in three stages of tuberization by semiquantitative RT-PCR. StNDPK1 is expressed in all tissues and tuberization stages being most abundant in shoot apex, flowers and leaves, while StNDPK2 expression was undetectable in the tissues analyzed. Expression studies under abiotic and biotic stress conditions were performed only for StNDPK1. Semiquantitative RT-PCR results show that StNDPK1 transcripts increased in plants exposed to short periods of darkness, while exposure to low temperatures produced an initial decrease in the expression recovering after 6hs. Both, mechanical wounding or the addition of 10μM jasmonic acid (JA) produced an increase in StNDPK1´s mRNA. According to our results we propose that at least two NDPK isoforms are present in potato plants that show different expression patterns, StNDPK1 is ubiquitous being most abundant in aerial tissues, while StNDPK2 is restricted to tuberizing stolons. Our results strongly suggest that StNDPK1 is targeted to mitochondria. The data analysis of Stndpk1 promoter is consistent with the expression results, suggesting that StNDPK1 could be involved in environmental responses to light availability, low temperatures or herbivore attack.

Heer, Angeles. "Análisis estructural y conformacional de E6*I, un producto de procesamiento alternativo derivado de la oncoproteína E6 de HPV16" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las proteínas E6 de papilomavirus humano de alto riesgo participan en la progresión tumoral, mayoritariamente por su habilidad de promover la degradación de p53. Los transcriptos de HPV muestran un patrón de procesamiento complejo, donde E6*I es el transcripto más abundante en HPV de alto riesgo, correspondiendo en secuencia de aminoácidos a los primeros 50 aminoácidos de E6. Actualmente, no hay información estructural o bioquímica de este polipéptido que contiene la mitad del primer motivo de unión a Zn de E6, debido a la dificultad de obtener una estructura compacta y monomérica en tan pequeño polipéptido. En este trabajo se muestra que E6*I de HPV16 puede plegarse en oligómeros con alto contenido de hélice-α o láminas-β a pH 7.5 y 5.0 respectivamente, en ausencia de Zn. Los oligómeros-β son altamente estables y no se ven afectados por la presencia de Zn, mientras que los oligómeros-α tienden rápidamente a agregar, evitando esto la presencia de Zn. Dos moléculas de E6*I unen una molécula de Zn, sugiriendo una coordinación tetraédrica de alta afinidad (KD < 10⁻¹² M), que resulta en un dímero de E6*I mediado por Zn con significativa estructura secundaria. Previamente se encontraron en el citosol de líneas celulares transformadas por HPV oligómeros endógenos de E6, y nosotros proponemos que las características determinantes de esta agregación se encuentran dentro de E6*I. Los efectos reportados de E6*I están asociados a la regulación negativa de la proteína E6, y la relación entre ambas especies modula la degradación de p53 y otras cascadas de señalización de apoptosis. En este trabajo, demostramos la interacción directa y específica entre las proteínas E6 y E6*I de HPV16. La abundancia en la célula de E6*I con una naturaleza “camaleón” correlaciona con la plasticidad para unir blancos celulares, y su destino está asociado a un balance entre los niveles de proteína, la disponibilidad de Zn, el potencial redox y la oligomerización. Este pequeño pero complejo polipéptido está asociado a un efecto más que a una función de un producto viral que, cuando se encuentra en altas concentraciones, puede directa o indirectamente afectar varios procesos celulares.

Abstract:
High-risk human papillomavirus E6 participates in tumorigenic progression, mainly by its ability to promote p53 degradation. HPV transcripts show a complex splicing pattern, where E6*I is the most abundant transcript in high-risk HPV types, comprising the first 50 amino acids of E6. No structural or biochemical information of this polypeptide, which contains half of the first zinc binding motif of E6, is available, due to the difficulty to acquire a compact monomeric fold in such a small polypeptide. We show that HPV16-E6*I can fold into either a-helix or ß-sheet large oligomers at pH 7.5 and 5.0, respectively, in the absence of zinc. The ß-sheet oligomers are highly stable and unaffected by the presence of zinc, while the a-helix oligomers tend to rapidly form aggregates, prevented by the presence of the metal. Two E6*I molecules bind per atom of zinc, suggesting a tetrahedral, high affinity arrangement (KD< 10⁻¹² M), which results in a zinc mediated E6* dimer with significant secondary structure. Endogenous E6 oligomers were previously found in the cytosol of high-risk HPV transformed cell lines, and we propose that the oligomerization determinant resides within E6*I. E6*I effects were reported to counteract those of E6 in cells, and the ratio between these two species modulates p53 degradation and other apoptosis dependent signaling cascades. In the present work, we show a direct and specific interaction between HPV16 E6 and E6*I. A residue of an evolved splicing event related to regulation of oncogene expression in HPV or a splicing event resulting from the selection of a small deleterious viral polypeptide, the abundant existence of E6*I with a “chameleon” nature correlates with target plasticity, and its fate is linked to a balance between protein levels, zinc availability, redox potential, and oligomerization. In addition, the results presented here have strong implications for zinc binding sites in nascent polypeptides. This evolved promiscuous folder speaks of effect rather than function of a viral product that, when highly increased, can directly or indirectly affect various cellular processes leading to cell deregulation and tumorigenesis.

Travella, Ana Carolina. "Análisis de nuevos marcadores moleculares en Leucemia Linfocítica Crónica" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La leucemia linfocítica crónica (LLC) constituye la leucemia más frecuente en occidente, caracterizada por presentar un curso clínico variable, siendo de interés la búsqueda de nuevos marcadores. En este trabajo se estudiaron 223 pacientes con LLC mediante análisis citogenético, citomolecular y molecular. Los estudios citogenéticos y citomoleculares permitieron identificar 35 alteraciones estructurales no descriptas previamente en la literatura, siendo el cromosoma 8 el más frecuentemente implicado. El análisis del estado mutacional y los rearreglos del gen IGVH (immunoglobulin heavy chain variable gene), permitió caracterizar a nuestra población de pacientes con LLC, mostrando una distribución similar a la de los países Occidentales (IGVH3>IGVH1>IGVH4) con diferencias respecto de Asia y Brasil, sustentando variaciones en el background genético y/o en factores ambientales entre poblaciones. La evaluación de los niveles de expresión de los genes SEPT- 10, MCL-1, LPL, ADAM-29 y CLLU-1, mostró gran heterogeneidad que refleja la variabilidad característica de la LLC, y permitió establecer la asociación de la expresión LPL y ADAM-29 con las características citogenéticas de los pacientes, aspecto no explorado previamente. Estos estudios resaltan la importancia de profundizar la caracterización biológica y la comprensión de los mecanismos patogénicos de esta enfermedad tendiente a definir nuevos grupos de riesgo específicos.

Abstract:
Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent form of leukemia in Western world, characterized by a highly variable clinical course, being necessary the search for new prognostic markers. In this study, we described cytogenetic, citomolecular and molecular analysis of 223 CLL patients. Cytogenetic and citomolecular results showed 35 new structural abnormalities not previously described in the literature, being chromosome 8 the most frequently involved. The mutational status of the IGVH (immunoglobulin heavy chain variable genes) gene in our cohort showed a family distribution similar to that observed in Western countries (IGVH3>IGVH1>IGVH4) and different to CLL patients from Asia and Brazil, that may reflect variations in the genetic background and/or environmental factors of their populations. Expression profiles of SEPT-10, MCL- 1, LPL, ADAM-29 and CLLU-1 genes showed great heterogeneity that may reflect characteristic variability of CLL patients, and showed association between LPL and ADAM-29 with cytogenetic features in our cohort, data not previously described in the literature. This results remarks the importance of biological characterization and understanding of pathogenic mechanisms of this disease in order to define specific risk groups.

Fox, Ana Romina. "Fototransducción de señales en Arabidopsis thaliana. Dos casos de estudio: participación de la subunidad alfa de la proteína G heterotrimérica; e identificación de proteínas diferencialmente expresadas en el cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El desarrollo de las plantas es un proceso que ocurre bajo fluctuaciones del ambiente lumínico que son percibidas por fotorreceptores específicos, principalmente los fitocromos phyA y phyB, y los criptocromos cry1 y cry2. El estudio de las respuestas de mutantes simples y múltiples de fotorreceptores en diferentes condiciones lumínicas es una herramienta muy útil para analizar las vías de señalización. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo principal estudiar los mecanismos moleculares y bioquímicos de la transducción de señales lumínicas mediadas por fitocromos y criptocromos durante el desarrollo de Arabidopsis thaliana. En el primer capítulo estudiamos la participación de la subunidad α de la proteína G heterotrimérica (GPA1) en los caminos de señalización de los fotorreceptores. Los mutantes cry1 fueron los únicos simples mutantes que mostraron una reducción en la unión de GTPγS35, a niveles similares a los observados en el mutante gpa1. Hallamos interacción génica entre cry1 y GPA1 en la apertura del gancho apical en oscuridad y en la acumulación de antocianas en luz azul. Estas respuestas fueron dependientes de la presencia de sacarosa en el medio. Análisis moleculares nos llevaron a proponer un modelo en el que la posible modificación posttraduccional de GPA1 mediada por cry1 alteraría su actividad. En el segundo capítulo realizamos un estudio comparativo de los perfiles proteicos entre plántulas cuádruples mutantes phyA phyB cry1 cry2 y plántulas salvajes utilizando la técnica de geles bidimensionales. La identificación de proteínas sub-expresadas en el cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 fue consistente con la drástica reducción en la tasa fotosintética, el contenido de clorofila y el concomitante retraso en el desarrollo del mutante. Las proteínas sobreexpresadas en el cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 estuvieron involucradas en respuesta a estrés por temperatura y por sequía. Sin embargo, sólo la expresión de éstas proteínas no permitió explicar el comportamiento del cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 en condiciones de estrés. La reducción en la cantidad relativa de ácidos grasos insaturados de las membranas del cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 fue consistente con una mayor sensibilidad a un shock de bajas temperaturas y una mayor tolerancia a un shock de altas temperaturas. Las posibles significancias fisiológicas y ecológicas de estos resultados son discutidas en esta tesis.

Abstract:
Plant development is a process that occurs under fluctuating light environment which is perceived by specific photoreceptors, mainly by phytochromes phyA and phyB, and cryptochromes cry1 and cry2. The study of the behaviour of simple and multiple photoreceptor mutants in different light conditions is a useful tool to analyze signalling pathways. The main objective of this thesis was to study the molecular and biochemical transduction of light signalling mediated by phytochromes and cryptochromes during Arabidopsis thaliana development. In the first chapter we studied the involvement of the α- subunit of the Heterotrimeric G protein (GPA1) in photoreceptors signalling pathways. cry1 mutants were the only single mutants that showed GTPγS35 binding reduction, at similar levels to that observed for the gpa1 mutant. We found genetic interaction between cry1 and GPA1 on apical hook opening in darkness and anthocyanin accumulation under blue light. These responses were dependent on the presence of sucrose. Molecular approaches conducted us to propose a model where a potential post-translational modification of GPA1 mediated by cry1 would alter its activity. In the second chapter we made a comparative study of the protein profiles between the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant and wild type seedlings using the two-dimensional gel electrophoresis technology. Under-expressed proteins in the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant were consistent with the drastic reduction in photosynthetic rates, reduced chlorophylls contents and retarded development in the mutants. Over-expressed proteins were involved in temperature and drought stresses. However, the expression of these proteins does not explain the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant behaviours under stress conditions. The reduction in the relative contents of unsaturated fatty acid of the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant membranes was consistent with its sensitivity to a low temperature shock and its tolerance to a high temperature shock. The physiological and ecological significance of these results are discussed in this thesis.

Monti Hughes, Andrea. "Eficacia terapéutica y toxicidad de la terapia por captura neutrónica en boro (BNCT) en tejido con cancerización de campo: Estudio radiobiológico en un modelo experimental de cáncer bucal" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
BNCT se basa en la reacción de captura entre el boro depositado preferencialmente en tumor y los neutrones térmicos, generando partículas letales de corto alcance que dañan al tumor, preservando el tejido normal. Previamente, demostramos el éxito terapéutico del BNCT en tumores de la bolsa de la mejilla del hámster. El desafío pendiente era inhibir el desarrollo de segundos tumores primarios (STP) a partir de tejido con cancerización de campo, minimizando la mucositis limitante de dosis. Los STP son frecuentemente la causa del fracaso terapéutico clínico en tumores de cabeza y cuello. El objetivo general de la presente tesis doctoral fue evaluar, por primera vez, la radiotoxicidad y potencial inhibitorio a largo plazo de BNCT sobre el desarrollo tumoral en un modelo de mucosa bucal con cancerización de campo desarrollado en la bolsa de la mejilla del hámster para seguimiento a largo plazo (8 meses). Estudiamos la radiotoxicidad y capacidad inhibitoria de diferentes protocolos de BNCT, variando las dosis y los protocolos de fraccionamiento. Por primera vez, evidenciamos el efecto inhibitorio de BNCT en un tejido con cancerización de campo a largo plazo. Para optimizar BNCT, determinamos la influencia de las condiciones de tratamiento sobre la ventaja terapéutica y radiotoxicidad.

Abstract:
BNCT combines selective accumulation of 10B carriers in tumor tissue with subsequent neutron irradiation, giving rise to lethal, short-range particles. Damage is limited largely to cells containing 10B. Previously, we demostrated the therapeutic efficacy of BNCT to treat tumors in the hamster cheek pouch. However, the inhibition of tumor development from field-cancerized tissue was still an unresolved challenge. In a clinical scenario, tumor development from field-cancerized tissue is frequently the cause of therapeutic faliure. The aim of the present PhD thesis was evaluate, for the first time, BNCT-induced potential radiotoxicity and long-term inhibition of tumor development in a model of oral field-cancerized tissue. We developed an oral precancer model in the hamster cheek pouch for long-term studies (8 months). We studied radiotoxicity and the potential inhibitory effect of different BNCT protocols, evaluating different dose levels, dose fractionation and interval between applications. For the first time, we evidenced the long-term inhibitory effect on tumor development of BNCT in field-cancerized tissue and showed that treatment conditions are pivotal to therapeutic advantage and radiotoxicity. The knowledge of BNCT radiobiology for experimental oral precancer contributes to the optimization of the technique.

Moiola, Cristian Pablo. "Nuevos blancos moleculares en el cáncer de próstata" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El cáncer de próstata (PCa) es el segundo tipo de cáncer más frecuente en el mundo. En la Argentina, es el de mayor incidencia y el segundo en mortalidad. La edad, el origen étnico, la historia familiar, el estilo de vida y la obesidad son importantes factores de riesgo asociados al desarrollo de esta patología. En este trabajo de tesis nos centralizamos en el rol de BRCA1 en diferentes vías que contribuyen al desarrollo del PCa. Estudiamos la regulación transcripcional mediada por BRCA1 del gen ATM, clave en el mantenimiento de la estabilidad genómica celular. Determinamos que el complejo formado por las proteínas BRCA1, E2F1 y CtIP, se asocian al promotor de ATM y activan su transcripción. Asimismo, cuando se induce estrés genotóxico, BRCA1 y CtIP se liberan reprimiendo su transcripción. Además, estudiamos la regulación transcripcional de BRCA1. Encontramos que los andrógenos, la principal hormona masculina, regula la expresión de BRCA1 en líneas celulares de PCa. Esta hormona reprime la transcripción de BRCA1 en las células LNCaP, sensibles a andrógenos. Mientras que en las células PC3, insensibles a andrógenos, la testosterona aumenta los niveles de expresión de BRCA1. Esta diferencia en la respuesta a la testosterona en las células tumorales de próstata parece responder a un efecto en la síntesis de estrógenos a partir de andrógenos. En este trabajo de tesis también determinamos que las proteínas CtBP1 y BRCA1 se encuentran asociadas a la región proximal del promotor de BRCA1 reprimiendo su transcripción. En la línea tumoral PC3, la testosterona provoca que estos factores se liberen del promotor de BRCA1 activando su transcripción. Utilizando líneas celulares que sobre-expresan o tienen disminuida en forma estable la expresión de CtBP1, encontramos que la sobreexpresión de CtBP1 aumenta la transformación y la viabilidad celular. En un modelo de xenotransplantes generado por inoculación de estas células estables en ratones nude, determinamos que la disminución de la expresión de CtBP1disminuyó drásticamente el crecimiento tumoral solo cuando los animales habían sido alimentados con una dieta hipercalórica. Asimismo, la incubación de las líneas estables de PC3 con el suero proveniente de animales alimentados con una dieta hipercalórica aumento la proliferación celular de las células que sobre-expresan CtBP1 al igual que se ven favorecidos la activación de procesos de EMT que podrían conducir al establecimiento de metástasis. En resumen, en este trabajo de tesis describimos por primera vez un mecanismo de regulación transcripcional de ATM por BRCA1 en respuesta al estrés genotóxico. Además determinamos que los andrógenos y la dieta hipercalórica pueden influenciar el desarrollo tumoral prostático alterando la vía de CtBP1/BRCA1. Por lo tanto, estos resultados aportan nuevas evidencias en cuanto a la regulación transcripcional de BRCA1 y su función co-reguladora de otros blancos moleculares fortaleciendo así su rol supresor tumoral en el PCa.

Abstract:
Prostate cancer (PCa) is the second most frequently diagnosed cancer in the world. In Argentina, has the highest incidence rate and is the second leading cause of deaths in males. Several factors, such as ethnicity, age, family history, lifestyle and obesity, have been associated with and increase risk of developing this pathology. In this thesis we focus on BRCA1’s role in different molecular pathways that contribute to the development of PCa. We studied ATM transcriptional regulation mediated by BRCA1 and its importance in the maintenance of cellular genomic stability. We determined that the molecular complex formed by BRCA1, CtIP and E2F1 proteins are associated with ATM promoter and activate its transcription. In addition, CtIP and BRCA1 are release and repressed ATM promoter under genotoxic stress conditions. On the other hand, we studied BRCA1 transcriptional regulation. We found that androgens regulate BRCA1 expression in PCa cell lines. Particularly, testosterone represses BRCA1 transcription in androgens sensitive LNCaP cells. However, testosterone increases BRCA1 expression levels in PC3 insensitive to androgens cell lines. This contradictory behavior in PCa cell lines may be due to an effect on the synthesis of estrogens from androgens. Moreover, we found that CtBP1 and BRCA1 proteins are associated to BRCA1 proximal promoter to repress its transcription. However, in PC3 cell lines, testosterone induces BRCA1 transcription causing the release of these factors. Furthermore, we generated PC3 cell lines with stable overexpression or knockdown CtBP1 expression. We found that CtBP1 overexpression enhanced cellular transformation and increased cell viability. We also determined, in a xenograft nude mice model generated by PC3 stable cell lines inoculation, that the decreased expression of CtBP1 drastically diminished the tumor growth only when the animals had been high-calorie diet fed. In addition, incubation of stable lines PC3 with serum from animals fed with a hypercaloric diet, increased cell proliferation of cells that overexpress CtBP1. Finally CtBP1 overexpressing cells have enhanced EMT activation toward CtBP1 silencing cell lines leading to the establishment of metastasis. In summary, we describe for the first time a transcriptional regulation mechanism of ATM by BRCA1 in response to genotoxic stress. We also determined that androgens and high caloric diet modulate CtBP1/BRCA1 pathway affecting prostate tumor development. Therefore, these results provide further evidence of BRCA1 transcriptional regulation and BRCA1 transcriptional co-regulatory function, strengthening its tumor suppressor role in PCa.

Argüello, Rafael José. "Mecanismos de regulación negativa de la respuesta inmune en pacientes con enfermedad de Chagas" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La enfermedad de Chagas es causada por el parásito protozoario intracelular Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y afecta alrededor de 10 millones de personas. Aproximadamente un 20 a 30% de los sujetos crónicamente infectados muestran la progresión a miocardiopatía, después de padecer infección asintomática durante un período de años a décadas. La miocardiopatía de la enfermedad de Chagas es la causa más frecuente de miocardiopatía infecciosa en el mundo. Las respuestas inmunes mediadas por células CD8 y células T CD4 son cruciales para el control de esta infección crónica. En el pasado, debido a la escasez de los parásitos en el corazón, prevaleció la hipótesis de que la miocarditis chagásica crónica era atribuible exclusivamente a reacción cruzada autoanticuerpos al tejido cardiaco, y que la presencia del parásito era dispensable para la inflamación y fisiopatogénesis. Esta idea, en combinación con la elevada toxicidad y la falta de estudios controlados sobre la eficacia del tratamiento, exacerbó el escepticismo sobre la conveniencia de un tratamiento antiparasitario durante la infección crónica. Este escepticismo se mantuvo hasta finales de la década de los 90. Por otra parte, las pruebas serológicas convencionales pueden mantenerse positivas durante años o incluso décadas después de tratamiento antiparasitario exitoso y los resultados de un ensayo clínico doble ciego controlado con placebo para determinar la eficacia del tratamiento benznidazol no están disponibles actualmente. En el presente trabajo hemos estudiado los mecanismos inmunoregulatorios presentes en células T de sangre periférica, específicas o no contra T. cruzi y también en el corazón de pacientes humanos infectados con este parásito. Así mismo evaluamos el impacto del tratamiento tripanocida (benznidazol) sobre, la expresión de las moléculas de inmunoregulatorias y sobre los niveles de subpoblaciones de células T (ítems 1, 2 y 3). 1) Caracterización funcional de moléculas inmunoregulatorias y producción de citoquinas por parte de linfocitos T específicos contra T. cruzi. 2) Evaluación del impacto del tratamiento con benznidazol en subpoblaciones de linfocitos T en pacientes con infección crónica. 3) Composición celular, grado de diferenciación celular y perfil funcional de las células reclutadas hacia el corazón de pacientes con miocarditis crónica de Chagas. 1) Caracterización funcional de moléculas inmunoregulatorias y producción de citoquinas por parte de linfocitos T específicos contra T. cruzi. En los individuos infectados, más del 80% de los linfocitos T específicos contra el parásito productores de IFN-γ, presenta expresión del receptor inhibitorio CTLA-4, pero no de LIR-1. Por el contrario, en los mismos sujetos los linfocitos T específicos contra antígenos de la vacuna TetaDif productores de IFN-γ, no expresan ni CTLA-4 (3%), ni LIR-1 (5%). Además demostramos que la expresión de CTLA-4 en células T específicas contra T. cruzi tiene consecuencias funcionales, debido a la activación de CTLA-4 conduce a la disminución de la producción de IFN-γ en respuesta a antígenos de parásitos. Interesantemente, detectamos expresión de CTLA-4 en linfocitos T en el corazón de pacientes con miocarditis chagásica crónica. Luego de la activación policlonal, la expresión de CTLA-4 aumenta en mayor medida en pacientes sintomáticos en comparación con la inducción de la misma en sujetos asintomáticos y no infectados (P<0,001). La expresión de este receptor inhibitorio en células T específicas contra el parásito en repetidas ocasiones durante la exposición antigénica crónica, podría resultar en el agotamiento immunológico observado en el compartimento total de células T después de 10-20 años de la infección inicial. 2) Evaluación del impacto del benznidazol en subpoblaciones de linfocitos T que se encuentran aumentadas en pecientes crónicamente infectados. La administración del fármaco tripanocida en adultos con infección crónica por T. cruzi induce una disminución temprana, duradera y significativa (5 años de seguimiento) en los niveles de linfocitos T altamente diferenciados, los cuales vuelven a niveles normales. Este cambio se observa en la mitad (7 de 14) de los individuos infectados tratados, pero en ninguno de los individuos infectados no tratados seguidos en el tiempo (0 de 12). La serología convencional acompaña a la disminución de los CD4 + LIR-1 + obtenido en los primeros tiempos después del tratamiento y, por tanto constituiría un marcador precoz subrogante de la eficacia del tratamiento. 3) Composición celular, grado de diferenciación celular y perfil funcional de las células reclutadas hacia el corazón de pacientes con miocarditis crónica de Chagas. Con el fin de caracterizar los tipos celulares presentes y su posible rol durante la miocarditis de la enfermedad de Chagas, se analizaron la composición celular (i.e. CD3, CD4, CD8, CD20, CD21, CD68, CD57), la expresión de moléculas coestimuladoras (i.e. CD27), receptores inhibitorios (i.e. HLA-G, PD-1, CTLA-4), factores de transcripción de TH1 o células T reguladoras (i.e. Tbet, FOXP3), marcadores de senescencia (i.e. CD57, CD45RA) y un marcador de ciclo celular activo (i.e. Ki67). 3a. El porcentaje de células T (CD3 + , CD4 + y CD8 + células) se encuentra incrementado significativamente en las regiones con mayor grado de inflamación (hasta 70% del total infiltrado). Por el contrario, el porcentaje de macrófagos (% CD68 + ) fue similar en regiones de alto y bajo nivel de infiltración (20% del infiltrado). Por otro lado, las células B (i.e. células CD20 + ) se observaron sólo en algunas áreas con alto grado de inflamación y en bajo porcentaje (i.e. mediana, rango; 2%, 0-13%). 3b. La mayoría de los linfocitos infiltrantes mostraron expresión de CD45RO y CD27, marcadores de células con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación. Por el contrario, la expresión de PD-1, CD57 y CD45RA fue muy baja o ausente en el corazón de pacientes con enfermedad de Chagas independientemente del grado de miocarditis. 3c. La expresión del factor de transcripción maestro de TH1, Tbet, se observó en una importante proporción de células durante la miocarditis chagásica. En contraste, el nivel de células T reguladoras (i.e. FOXP3 + ) mostró ser escaso. Se observaron altos niveles del células expresando el marcador del ciclo celular activo, Ki67, las cuales a su vez resultaron coexpresar CD3, pero no CD8. 3d. Mediante un análisis de estadística de dos dimensiones pudimos demostrar la infección del miocardiocito humano durante el curso natural de la infección induce un reclutamiento eficiente de linfocitos T con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación (i.e. CD45RO + CD57 – ). En resumen, hemos encontrado que las células T reclutadas por el corazón infectado de pacientes con Chagas miocarditis poseen bajo grado de diferenciación y un fenotipo similar al de los linfocitos T específicos contra T. cruzi en presentes en sangre periférica. Además, se observó que las células T proliferarían in situ, y que los linfocitos T con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación son reclutadas por los miocitos infectados de manera eficiente.

Abstract:
Chagas disease, caused by the intracellular protozoan parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi), affects around 10 million people. An estimated 20 to 30% of the chronically infected subjects show progression to cardiomyopathy, after being asymptomatic for a period of years to decades. Chagas heart disease is the most frequent cause of infectious cardiomyopathy in the world. Immune responses mediated by CD8 and CD4 T cells are crucial for the control of this chronic infection. In the past, due to the scarcity of parasites in the heart, it was hypothesized that chronic chagasic myocarditis was exclusively attributable to cross-reacting autoantibodies to cardiac tissue and that the presence of the parasite was unnecessary for pathogenesis. This belief, in combination with the high toxicity of treatment and lack of treatment efficacy tests led to skepticism about the convenience of antiparasitic treatment for chronic T. cruzi infection, which persisted until late 1990s. Moreover, conventional serologic assays remain positive after years or even decades after successful treatment and results of a double-blind placebo controlled clinical trial to determine benznidazole treatment efficacy are not available. During my thesis I studied immunoregulatory mechanisms in total peripheral T cells, T. cruzi- specific T cells, and also in heart infiltrating cells from infected human patients. I was able to evaluate the impact of trypanocidal treatment (benznidazole) on the expression of immunoregulatory molecules and T cell subsets in the blood and heart of these patients (item 1, 2, and 3). In order to contribute to the progress towards drug discovery in this neglected and poverty related disease, I developed an automatized method for highthroughput screenings of drugs against trypanosome parasites. 1) Evaluation of the impact of benznidazole treatment in T cell subsets that are increased in chronically infected subjects. 2) Functional characterization of immunoregulatory molecules and cytokine production by T. cruzi-specific T cells from peripheral blood of infected subjects. 3) Cellular composition, grade of differentiation and functional profile of cells recruited by the heart of patients with chronic Chagas myocarditis. 1) Evaluation of the impact of benznidazole on T cell subsets that are increased in chronically infected subjects. Trypanocidal drug administration in chronically infected adults induces a significant, early and long lasting (5 years of follow-up) decrease on highly differentiated effector T cells that return to normal levels. This change is observed in half (7 out of 14) of the infected individuals but in none of their untreated counterparts (0 out of 12). Conventional serology accompanies the decrease in CD4 + LIR-1 + obtained at earlier times after treatment and thus would constitute an early surrogant marker of treatment efficacy. 2) Functional characterization of immunoregulatory molecules and cytokine production by T. cruzi-specific T cells from peripheral blood of infected subjects. More than 80% of the IFN-γ producing T. cruzi-specific T cells from chronically infected patients show high expression of the inhibitory receptor CTLA-4, but not LIR-1. In contrast, IFN-γ-producing vaccine antigen-specific T cells from the same infected subjects do not express neither CTLA-4 (3%), nor LIR-1 (5%). We demonstrated that CTLA-4 expression in T.cruzi-specific T cells has functional consequences, because activating CTLA-4 leads to decreased IFN-γ production in response to parasite antigens. Moreover, the expression of CTLA-4 was observed in T cells in the heart of patients with chronic Chagasic myocarditis. Interestingly, we found that after policlonal activation, CTLA-4 expression was more significantly increased (P<0.001) in symptomatic subjects in comparison with asymptomatic and uninfected subjects. The expression of this inhibitory receptor in parasite specific T cells in conjunction with the chronic antigenic exposure could result in the observed exhaustion of the total T cell compartment after 20-40 years of the initial infection. 3) Cellular composition, grade of differentiation and functional profile of the cells recruited by the heart of patients with chronic Chagas myocarditis. In order to determine their role in the pathogenesis of chronic Chagas heart disease, we analyzed the cellular composition (CD3, CD4, CD8, CD20, CD21, CD68, CD57), the expression of co-stimulatory molecules (CD27), inhibitory receptors (HLA-G, PD-1, CTLA-4), transcription factors of TH1 or regulatory T cells (Tbet, FOXP3), senescence (CD57, CD45RA) and active cell cycle markers (Ki67). 3a. The percentage of T cells (CD3 + , CD4 + and CD8 + cells) are highly increased in regions with the highest degree of inflammation (up to 70% of the total infiltrate). Conversely, the percentage of macrophages (%CD68 + cells) was similar in regions with high and low level of infiltration (20% of the infiltrate). On the other hand, B cells (CD20 + cells) were only observed in some areas bearing high degree of inflammation (Median, range; 2%, 0-13%). 3b. Most heart infiltrating T cells showed CD45RO and CD27 expression, markers of antigen experienced T cells with low grade of differentiation. In contrast, PD-1, CD57 and CD45RA expression were absent, being this in agreement with the absence of terminally differentiated effector T cells and NKs in the heart of Chagas disease patients. 3c. TH1 (Tbet) were highly abundant during Chagas myocarditis. In contrast, regulatory T cells were scarce (FOXP3 + ). Cells expressing high levels of the active cell cycle marker, Ki67, showed CD3 expression but lacked CD8. 3d. Using two dimensional statistics I demonstrated that in-vivo infected human cardiac myocytes efficiently recruit antigen experienced (CD45RO + CD57 – ) T cells with low grade of differentiation. In summary, we found that T cells recruited by the infected heart of patients with Chagas myocarditis bear low grade of differentiation and a strikingly similar phenotype to T. cruzi- specific T cells present in peripheral blood. Moreover, we determined that T cells proliferate in situ, and that antigen experienced T cells are more efficiently recruited than other mononuclear cells by the infected myocytes (2-Dimensional statistics and Monte-Carlo simulations).

Crocco, Carlos Daniel. "Rol de las proteínas B-box en las respuestas de escape al sombreado en Arabidopsis thaliana" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Cuando las plantas crecen a altas densidades perciben la presencia temprana de plantas vecinas sensando los cambios en la calidad de luz que las rodea. Esta percepción es mediada principalmente por los fitocromos, una familia de fotorreceptores que detectan una reducción en la relación rojo:rojo lejano (R:RL) causada por la proximidad de plantas vecinas induciendo un conjunto de respuestas morfo-fisiológicos tales como la elongación de hipocotilo y tallo, dominancia apical, aceleración de la floración, entre otros. Este conjunto de respuestas plásticas constituye “el síndrome de escape al sombreado”, SAS (del inglés, Shade Avoidance Syndrome). Si bien en los últimos años se ha comenzado a comprender los mecanismos moleculares involucrados en la SAS, aún nuestro conocimiento es escaso. En esta tesis estudiamos la función de las proteínas B-Box (BBX) en la señalización de la SAS en plántulas de Arabidopsis thaliana, enfocando nuestra atención en un subgrupo de esta familia que se caracteriza por presentar un doble dominio B-box en su región amino terminal. La caracterización fisiológica de algunos mutantes simples nos permitió demostrar que BBX18 y BBX24 promueven, mientras que BBX19, BBX21, BBX22 inhiben la respuesta de elongación por sombra. En particular, estudiamos el mecanismo de acción de BBX21 y BBX24 en la señalización de las SAS mediante aproximaciones genéticas-moleculares y fisiológicas. La escasa similitud que detectamos entre los transcriptomas asociados a BBX21 y BBX24 en respuesta a las señales de sombra sugiere que ambas proteínas participarían por vías distintas de señalización. En sombra prolongada, la función de BBX21 es inhibir la expresión de genes que codifican para proteínas involucradas en el crecimiento y proliferación celular, mientras que BBX24 promueve la expresión de genes del metabolismo y señalización de hormonas vinculadas a la SAS. Por medio de aproximaciones genéticas demostramos que BBX21 modula esta respuesta interaccionando genéticamente con COP1 (CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC1), un represor maestro de la fotomorfogénesis que promueve la SAS. También demostramos que BBX24 participa en la misma vía de señalización que PIF4 (PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4), un factor de transcripción que promueve la elongación, y que interviene en la síntesis de giberelinas para promover la SAS. En base a los resultados obtenidos, se propone un posible mecanismo de acción de estas proteínas BBX en la modulación de la respuesta de escape al sombreado.

Abstract:
Plants grown at high densities perceive the presence of neighboring plants by sensing changes in light quality that surrounds and adapt their growth and development (Ballaré et al., 1990). This perception is mediated primarily by phytochrome, a family of photoreceptors that detect a reduction in the red:far red (R:RL) ratio as reliable indicator of future competition. Low R:FR light is perceived by the phytochromes, triggering dramatic changes in gene expression which lead to changes at morpho-physiological levels of shaded plants, such as hypocotyl and stem elongation, apical dominance and acceleration of flowering, which are collectively known as the shade-avoidance syndrome (SAS). Using Arabidopsis thaliana as model system, we study the role of B-Box proteins (BBX) in the SAS signaling pathway. Our study focused on the characterization of a subset of these BBX proteins, which have a high homology between their sequences and two Bbox domains at the N-terminal region. The physiological characterization of some single mutants allowed us to demonstrate that while BBX18 and BBX24 promote elongation, BBX19, BBX21 and BBX22 inhibit elongation response under shade. We use physiological, genetic and molecular approach to understand the mechanism of action of BBX21 and BBX24 in the SAS signalling pathway. The low similarity between the transcriptomes of BBX24 and BBX21 suggested that both proteins participate by different signaling pathways to modulate SAS. In long term shade, BBX21 inhibits the expression levels of genes that promote cell growth and proliferation, while BBX24 is promoting genes involve in hormones biosynthesis and signaling pathway related to the shade. Applying genetic approaches, we demonstrated that BBX21 interacting genetically with COP1 (CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC1), a master repressor of photomorphogenesis, in the regulation of SAS. We also demonstrated that BBX24 and PIF4 (PHYTOCHROMEINTERACTING FACTOR 4) are part of the same signaling pathway and that BBX24 promoted gibberellin biosynthesis during the SAS. Based on these results, we propose a possible mechanism of action of these BBX proteins in shade avoidance response.

Hernández, Silvia Fátima. "Regulación de la luteólisis funcional y estructural. Rol de la esfingosina 1-fosfato (S1P) y del sistema Notch" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El primer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar si la administración local de S1P en el ovario de ratas preñadas bloquea efectivamente la luteólisis inducida por prostaglandina F2 alfa (PGF2α). Se utilizaron ratas preñadas en el día 19 de la gestación a las cuales se les administró en forma local S1P o su vehículo y dos horas después una dosis luteolítica de PGF2α. Los animales se sacrificaron a las 0, 4 y 36 hs de la PGF2α. Se midió la actividad de las caspasas que contribuyen a los eventos iniciales (caspasa -2, -8 y -9) y finales (caspasa-3) de la apoptosis en grupos de CLs de cada animal. Se evaluó también la expresión de las formas fosforiladas de AKT y ERK y los niveles del factor de necrosis tumoral alfa (TNF- α) mediante la técnica de ELISA. Además se estudió la muerte celular por la técnica de ME y TUNEL y la funcionalidad luteal midiendo como parámetro la progesterona (P4) luteal. La actividad de la caspasas -2, -3 y -8 aumentó significativamente a las 4 horas de la inyección de PGF2α, no así la actividad de caspasa -9. Además aumentó el número de células apoptóticas. De forma contraria la expresión de pAKT y TNF-α y el contenido de P4 luteal disminuyó considerablemente. El tratamiento con S1P pudo prevenir el incremento en la actividad de las caspasas -2, -8 y -3 inducido por PGF2α, redujo el número de células apoptóticas, restauró la funcionalidad luteal y aumentó la expresión de pAKT, pERK y TNF-α. El tratamiento con PGF2α incrementó el número de células luteales con signos avanzados de apoptosis, (por ejemplo: fragmentación nuclear, condensación de la cromatina y la presencia de cuerpos apoptóticos) a las 36 horas de la PGF2α. En cambio S1P pudo suprimir estos efectos y además aumentó la densidad vascular en los CL. Estos resultados demuestran, por primera vez, que la administración in vivo de S1P es capaz de bloquear la acción luteolítica de la PGF2α en ratas preñadas. El segundo capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la expresión y la localización celular de los receptores Notch1, Notch4 y el ligando Dll4 en CL de ratas durante la gestación y la luteólisis inducida por PGF2α. También estudiamos el contenido de P4 sérica y de proteínas luteales relacionadas a la apoptosis luego de la administración local de un inhibidor de esta vía llamado DAPT (N- -S-phenylglycine t-butyl ester). Se detectó marca específica de los receptores NOTCH1 y 4 principalmente en las células luteales grandes y pequeñas. Además la inmunomarcación fue evidente en los núcleos de las células luteales, de forma coincidente con el hecho de que el dominio intracelular de Notch (NICD) una vez activo se transloca al núcleo. Además, se detectó marca citoplasmática difusa para DLL4 en las células luteales grandes y pequeñas, coincidiendo con el hecho de que Dll4 se somete a la degradación proteolítica después de unión al receptor. La expresión del ARNm de Notch1, Notch4 y Dll4 en CL aislados en el día 19 de preñez se redujo significativamente después de la administración de PGF2α. En forma coincidente, la PGF2α disminuyó el fragmento activo de los receptores NOTCH1 y 4, por el contrario, no se detectaron cambios significativos en los niveles proteicos del ligando DLL4. La administración intraovárica de DAPT disminuyó los niveles séricos de P4, aumentó los niveles del fragmento activo de la caspasa-3 y la relación BAX: BCL2 24 horas después del tratamiento. También se demostró que la inhibición in vitro de la síntesis de P4 en CL de ratas preñadas con aminoglutetimida (inhibidor específico de la enzima P450scc) disminuyó el contenido proteico de NOTCH1, pAKT, y pERK. Sin embargo no se observaron diferencias significativas en los niveles proteicos de NOTCH4 y el factor de transcripción HES1. Estos resultados respaldan el rol luteotrópico de la vía de señalización de Notch para promover la viabilidad celular y la esteroidogénesis luteal, y sugieren que la hormona luteolítica PGF2α puede actuar, en parte, disminuyendo la expresión de algunos miembros del sistema Notch.

Abstract:
The first chapter of this thesis was designed to study if local administration of the antiapoptotic agent sphingosine 1-phosphate (S1P) to pregnant rats effectively blocks the luteolytic action of prostaglandin F-2alpha (PGF2α). On day 19 of pregnancy, 2 hr before systemic PGF2α administration, rats were injected intrabursa with either S1P or vehicle and euthanized at 0, 4 and 36 hr after PGF2α injection. The activity of four caspases, which contribute to the initial (caspase-2, -8, and - 9) and final (caspase-3) events in apoptosis was measured. The expression of the phosphorylated form of AKT (pAKT), ERK (pERK) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) was analyzed by ELISA. In addition, cell death was evaluated by TUNEL technique and electronic microscopy. We also examined luteal progesterone. The activity of caspase-2, -3, and -8 was significantly greater by 4 hr after PGF2α, but not the caspase-9 activity and the number of apoptotic cells in CL was higher. In contrast, expression of pAKT and TNF-α decreased significantly. Administration of S1P suppressed these effects, decreasing caspase activities and increasing pAKT, pERK and TNF-α expression. The administration of S1P also significantly decreased the percentage of luteal apoptotic cells induced by PGF2α. PGF2α treatment increased the prevalence of luteal cells with advanced signs of apoptosis (i.e., multiple nuclear fragments, chromatin condensation, or apoptotic bodies). S1P treatment suppressed these changes and increased the blood vessel density. These results suggest for the first time that S1P blocks the luteolytic effect of the PGF2α in pregnant rats. The second chapter of this thesis was designed to investigate the expression and cell localization of NOTCH1, NOTCH4, and the delta-like ligand DLL4 in corpus luteum (CL) from rats during pregnancy and PGF2α-induced luteolysis. We also examined serum progesterone (P4) and CL proteins related to apoptosis after local administration of the Notch inhibitor N--S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT). Specific staining for NOTCH1 and NOTCH4 receptors was detected predominantly in large and small luteal cells. Furthermore, in line with the fact that the notch intracellular domain (NICD) is translocated to the nucleus, where it regulates gene expression, staining was evident in the nuclei of luteal cells. In addition, we detected diffuse cytoplasmic immunostaining for DLL4 in small and large luteal cells, in accordance with the fact that DLL4 undergoes proteolytic degradation after receptor binding. The mRNA expression of Notch1, Notch4, and Dll4 in CL isolated on Day 19 of pregnancy decreased significantly after administration of PGF2α. Consistent with the mRNA results, administration of PGF2α to pregnant rats on Day 19 of pregnancy decreased the protein fragment corresponding to the cleaved forms of NOTCH1/4 CL receptors. In contrast, no significant changes were detected in protein levels for the ligand DLL4. The local intrabursal administration of DAPT decreased serum P4 levels and increased luteal levels of active caspase 3 and the BAX:BCL2 ratio 24 hr after the treatment. In addition we demonstrated that in vitro treatment of pregnat rat CL with aminoglutethimide (blocker of cytochrome P450scc), decreased luteal levels of NOTCH1, pAKT and pERK. In contrast, no significant changes were detected in protein levels for the receptor NOTCH4 and the transcriptional factor HES1. These results support a luteotropic role for Notch signaling to promote luteal cell viability and steroidogenesis, and they suggest that the luteolytic hormone PGF2α may act in part by reducing the expression of some Notch system members.

Chiappini, Florencia Ana. "Efecto del hexaclorobenceno sobre la regulación del crecimiento de células foliculares tiroideas. Estudios in vivo e in vitro" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El hexaclorobenceno (HCB) es un contaminante ambiental altamente persistente y ubicuo, que produce efectos deletéreos para la salud humana. La exposición de animales de laboratorio al mismo, induce disfunciones endocrinas tiroideas (Kleiman de Pisarev et al., 1990, Alvarez et al., 2004), reproductivas (Foster et al., 1992; Alvarez et al., 2000) e inmunomodulación (Ezendam et al., 2004) entre otros efectos. El HCB se localiza en una variedad de tejidos y fluidos humanos con un amplio rango de concentraciones según el contenido lipídico y el grado de exposición al mismo. En trabajos previos demostramos que el tratamiento de ratas con HCB (1000 mg/kg p.c.) produce una disminución de los niveles circulantes de 3,3’,5,5’-tetraiodotironina (T4) total, y un aumento en la concentración sérica de la hormona estimulante de la tiroides (TSH), sin alterar el peso tiroideo (Kleiman de Pisarev et al., 1989). Estos datos sugerían la existencia de algún mecanismo inhibitorio del crecimiento tiroideo, o pro-apoptotico desencadenado por el HCB. En base a los antecedentes de la literatura y a nuestros resultados previos, nos propusimos como objetivo general, investigar las bases bioquímicas y moleculares del mecanismo de acción del HCB sobre la regulación del crecimiento celular tiroideo. Para ello estudiamos la apoptosis, la proliferación celular, el estado oxidativo y las cascadas de señalización de receptores de factores de crecimiento (RFC), realizando estudios in vivo en ratas hembras Wistar e in vitro en células foliculares tiroideas de rata Fisher (FRTL-5). Demostramos que el HCB administrado a ratas durante 30 días, en dosis que no modifican el status tiroideo (1-100 mg/kg p.c.), aumenta la expresión del factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) y la apoptosis a través de la vía mitocondrial, promoviendo la liberación del citocromo c, de la mitocondria hacia el citosol y la activación de la caspasa-9. Los estudios en células FRTL-5, demostraron que el HCB incrementa la expresión de TGF-β1, disminuye la expresión de tiroglobulina (TG) e induce la apoptosis a través de mecanismos dependientes e independientes de caspasas. El aumento en la producción de ROS y subsecuente activación de ERK1/2, están asimismo involucrados en el efecto apoptótico del HCB. Por otra parte, el plaguicida induce un desbalance en proteínas involucradas en el control de la progresión del ciclo celular llevando a un arresto en las fases G1 y G2/M, del mismo. En conclusión, nuestros resultados demuestran por primera vez, que el HCB induce un desbalance en la homeostasis del crecimiento celular y disfunción tiroidea.

Abstract:
Hexachlorobenzene (HCB) is a widespread and persistent environmental pollutant with deleterious effect on human health. Chronic administration of HCB to laboratory animals elicits a number of effects including, thyroid (Kleiman de Pisarev et al., 1990, Alvarez et al., 2004) and reproductive dysfunctions (Foster et al., 1992; Alvarez et al., 2000) and immunopathology (Ezendam et al., 2004). HCB is found in a variety of human tissues and fluids with a wide range of values depending on the dose and time of exposure, and on the tissue lipid content. We have demonstrated that HCB administration (1000 mg/kg b.w), reduced total serum 3,3’,5,5’-tetraiodothyronine (T4) levels, increased thyroid stimulating hormone (TSH) levels, but had no effect on thyroid weight in rats (Kleiman de Pisarev et al., 1989). As TSH stimulates thyroid follicular cell proliferation, our data suggested the existence of a thyroid growth inhibitory mechanism, or a pro-apoptotic effect, triggered by the HCB. The aim of the present study was to determine the biochemical and molecular mechanism of action of HCB, on the regulation of thyroid follicular cells growth. We examined parameters of apoptosis, cell proliferation, oxidative status and growth factor receptor (GFR) signaling pathways in vivo, in female Wistar rats, and in vitro, in Fischer rat thyroid cell line (FRTL-5). Our results showed that HCB administered to Wistar rats during 30 days, at doses that do not disrupt thyroid economy (1-100 mg/kg p.c.), induce transforming growth factor-β1 (TGF-β1) expression and apoptosis in the thyroid gland, involving the mitochondrial pathway. HCB promotes cytochrome c release from the mitochondria and caspase-9 activation. In FRTL-5 cell line, HCB increases TGF-β1 expression, decreases thyroglobulin (TG) protein levels, and induces apoptosis through a caspase dependent and independent mechanism, involving ROS production and ERK1/2 activation. In addition, HCB induces alterations in cell cycle regulatory proteins, and G1 and G2/M cell cycle arrest. In conclusion, our results show for the first time, that HCB induces an imbalance in the homeostasis of follicular thyroid cells growth and thyroid dysfunction.

Alaimo, Agustina. "Neurotoxicidad inducida por manganeso. Vías de muerte apoptóticas y rol de la dinámica mitocondrial" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El Manganismo es un desorden neurológico originado por exposición crónica al manganeso (Mn) que presenta características clínicas y vías de señales similares a las de la enfermedad de Parkinson Idiopático (EPI). El Mn se acumula preferentemente en los ganglios basales y en particular, en las mitocondrias de los astrocitos. Estas organelas son dinámicas y de morfología variable como resultado del balance entre eventos de fusión y fisión mitocondrial, el cual está alterado en varias enfermedades neurodegenerativas. En el presente trabajo, se estudiaron las cascadas de señalización molecular implicadas en la muerte celular inducida por Mn, con particular énfasis en el rol de la dinámica mitocondrial. Los estudios in vitro realizados en la línea C6 de astrocitoma de rata indicaron que el Mn indujo muerte celular apoptótica dependiente de caspasas con participación de las Vías Extrínseca e Intrínseca, la cual estuvo mediada por la generación de especies reactivas de oxígeno. Aún más, el Mn promovió la fragmentación exacerbada de las redes mitocondriales y disturbios en los niveles de expresión de las proteínas de fusión y fisión Opa-1 y Drp-1, generando un desequilibrio hacia éste último evento, lo cual contribuyó a la muerte celular. Por otra parte, estudios in vivo realizados en ratas expuestas a Mn indicaron la presencia de lesiones en el tejido estriatal y de alteraciones en los niveles de expresión de las proteínas reguladoras de la dinámica mitocondrial. En conjunto, nuestros resultados contribuyen al esclarecimiento de los mecanismos moleculares participantes en la apoptosis inducida por Mn y demuestran por primera vez que las proteínas Opa-1 y Drp-1 juegan roles protagónicos en la ejecución de la vía apoptótica mitocondrial.

Abstract:
Manganism is a neurological disorder caused by chronic exposure to Mn, closely resembling Idiophatic Parkinson´s Disease (IPD) at both clinical characteristics and molecular signaling pathways. Mn accumulates predominantly in the basal ganglia, particularly in the mitochondria of astrocytes. These are dynamic organelles which morphology is variable as a result of a delicate equilibrium between mitochondrial fission and fusion events. This balance is known to be altered in neurodegenerative diseases. In this research, we studied the molecular signaling pathways involved in Mn-induced cell death, with special focus on the role of mitochondrial fusion and fission proteins. In vitro studies conducted in rat astrocytoma C6 cells demonstrated that Mn induced cell death by caspase-dependent apoptosis mediated by ROS. A detailed analysis of signaling pathways showed the involvement of the Extrinsic and Intrinsic pathways. Moreover, Mn induced exacerbated mitochondrial network fragmentation and disturbances in the expression levels of fusion and fission proteins, Opa-1 and Drp-1, shifting the balance towards to the fragmentation event and contributing to cell death. Furthermore, in vivo studies conducted in rats exposed to Mn showed that Mn produce lesions in the striatal tissue and alterations in mitochondrial dynamics regulatory proteins. Taking together, these findings contribute to a deeper elucidation of the molecular signaling mechanisms underlying Mn-induced apoptosis and demonstrate for the first time that Opa-1 and Drp-1 are central protagonists in the execution of mitocondrial apoptotic pathway.

Sonzogni, Silvina Verónica. "Participación de p19INK4d en la inducción de senescencia genotóxica y replicativa" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
A lo largo de la evolución, los organismos con tejidos renovables han desarrollado mecanismos para prevenir la tumorigénesis. Entre ellos, podemos mencionar a la senescencia celular y a la apoptosis. La senescencia se caracteriza por el arresto permanente del ciclo celular en respuesta a insultos tanto endógenos como exógenos. En los últimos años se han estudiando las moléculas involucradas en la activación de este mecanismo, destacándose la participación de los inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CKIs) p21Cip1, p16INK4a y p15INK4b. En nuestro laboratorio se ha demostrado que la proteína p19INK4d (p19), un miembro de la familia INK4 de CKIs, se induce significativamente en respuesta a diversos genotóxicos aumentando la eficiencia de la reparación del ADN. El daño al ADN es un agente causal común de la respuesta senescente, independientemente del estímulo que le da origen. Los efectos provocados por diferentes inductores, tales como las especies reactivas de oxigeno (considerablemente aumentadas a lo largo del envejecimiento), los agentes genotóxicos (frecuentemente empleados en quimioterapia) o la activación de oncogenes, culminan dañando al ADN y activando en consecuencia mecanismos de arresto del ciclo celular. El arresto es dependiente de factores que controlan la progresión del ciclo tales como p53 y pRb-p16. Si bien estos son lo principales efectores moleculares involucrados en la iniciación y mantenimiento del estado de senescencia, las proteínas que participan en los mecanismos que sostienen la irreversibilidad del arresto del ciclo no han sido aún identificadas. La proteína p19 desempeña un papel importante en la respuesta celular frente al daño al DNA, además de ser un inhibidor del ciclo celular en la fase G1. Estas propiedades la convierten en un factor con potencial para participar en la iniciación y/o mantenimiento del estado de senescencia. El objetivo general de este trabajo de investigación consiste en determinar la participación de p19 en la inducción y/o mantenimiento de la senescencia. En este trabajo demostramos por primera vez que p19 induce su expresión en respuesta a distintos tipos de senescencia. Dicha inducción va acompañada de un arresto irreversible del ciclo y se correlaciona con la aparición de distintos marcadores de senescencia. Entre ellos, el aumento en la expresión p16INK4a y p21. La inducción de estos dos genes se corresponde temporalmente con la de p19, lo que indica que p19 se induce tempranamente en respuesta a un estímulo que dispara la senescencia. Demostramos que hay una relación directa entre la inducción de p19 y el establecimiento de la senescencia, dado que modulando los niveles de p19 se observó una alteración en el arresto del ciclo y en la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia. Se observó que la inducción de p19 esta regulada a nivel transcripcional. En senescencia genotóxica la inducción depende de E2F, sin embargo en senescencia fisiológica, pese a que hay un efecto inductor a nivel transcripcional, es independiente de este factor. La activación de p19 en senescencia está mediada por la vía de señalización relacionada a la respuesta general al daño, es decir la vía ATM/ATR--Chk1--p53. Por otro lado también se observó que p38 esta involucrada en la inducción de p19. En respuesta a un estímulo senescente, p19 se transloca al núcleo y se une fuertemente a la cromatina, particularmente a la fracción correspondiente a la heterocromatina. Cuando se analizaron los niveles de mRNA y proteína de p19 en diversos tejidos de ratones de distintas edades, se observó un aumento en los niveles de p19 directamente correlacionado a la edad de los ratones. Esto nos indica que la inducción de p19 no se limita solamente a los modelos de cultivos celulares utilizados, sino que también hay una correlación entre el aumento de expresión de p19 y el envejecimiento de un mamífero. Descifrar los mecanismos involucrados en senescencia así como identificar las proteínas que participan tanto en su inducción como en su mantenimiento en respuesta a diferentes insultos, resulta un gran desafío para el desarrollo de estrategias para combatir el cáncer y enfermedades asociadas al envejecimiento.

Abstract:
During evolution, organisms with renewable tissues have developed mechanisms to prevent tumorigenesis, including cellular senescence and apoptosis. Cellular senescence is characterized by a permanent cell cycle arrest triggered by endogenous as well as exogenous stress. Over the years, studies on the molecules involved in the activation of this mechanism have highlighted the role of the cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs) p21Cip1, p16INK4a and p15INK4b. In our laboratory, the p19INK4d protein, a member of the INK4 family of CKIs, has been shown to become significantly induced in response to various types of genotoxic stress and to stimulate DNA repair. DNA damage is a common trigger of cellular senescence, independently of the stimulus that originated it. As such, oxygen reactive species (significantly increased during aging), genotoxic drugs (frequently used in chemotherapy) or oncogene activation lead to DNA damage and consequently activate the cell cycle arrest machinery. The arrest requires factors that regulate cell cycle progression such as p53 and pRb-p16. Although these are the main molecular effectors involved in the initiation and maintenance of the senescent state, the proteins responsible for the irreversibility of the cell cycle arrest remain yet to be identified. The p19 protein plays an important role in the cellular DNA damage response, in addition to being a G1-phase cell cycle inhibitor. These attributes point to p19 as a potential factor involved in the initiation and/or maintenance of the senescent state. The aim of this thesis is therefore to examine the role of p19 in the induction and/or maintenance of cellular senescence. The data presented here shows for the first time that p19 expression is upregulated by different types of senescence. This induction is associated with an irreversible cell cycle arrest and correlates with the appearance of multiple markers of cellular senescence, including an increase in p16INK4a and p21 expression. The up regulation of these two genes temporarily correlates with that of p19, suggesting that p19 is early induced following stimuli that trigger the senescence program. Modulation of p19 levels affected cell cycle arrest and senescence-associated β-galactosidase activity, indicating a direct link between p19 induction and the establishment of cellular senescence. Although this induction occurs at the transcriptional level for both genotoxic-induced and physiological (replicative) senescence, it is mediated by distinct mechanisms, requiring the E2F transcription factors only in the first context. p19 activation during senescence is mediated by the canonical DNA damage signaling pathway ATM/ATR--Chk1--p53. Finally, p38 is also shown to be involved in p19 induction. Following a senescence-triggering stimulus, p19 translocates to the nucleus and tightly associates with chromatin, particularly the fraction corresponding to heterochromatin. Analysis of p19 mRNA and protein levels in several tissues from differently aged mice revealed an up regulation of p19 that correlates with age. This indicates that p19 induction is not limited to the cell culture models used and that there is a correlation between p19 expression and the aging of a mammal. To elucidate the mechanisms involved in senescence and to identify the proteins that mediate its induction as well as its maintenance constitute an important challenge for the development of therapeutic strategies aiming to overcome cancer and aging-associated diseases.

Auzmendi, Jerónimo Andrés. "Desarrollo de tecnología para el estudio de la activación rápida de canales iónicos" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los canales iónicos son proteínas multiméricas que regulan el pasaje de iones a través de la membrana celular acoplando su funcionamiento a factores externos como el voltaje de membrana y/o presencia de ligandos específicos. Sus dinámicas de cambio de estado pueden ser descriptas cuantitativamente en términos de un proceso de Markov, aleatorio y sin memoria. Las constantes cinéticas de estos procesos pueden ser obtenidas, a partir de resultados experimentales, con la estimación de la máxima verosimilitud (EMV), empleando el algoritmo recursivo de cadenas ocultas de Markov. En el caso particular de los canales activados por ligando se han postulado estados parciales de energía intermedia (FLIP-STATE), para explicar retardos durante la activación del receptor. Para dilucidar si la existencia de estos estados es una propiedad del receptor o de cada una de las subunidades es necesario poder realizar aplicaciones de agonista aún más breves que las del estado de arte (0.2 ms). Por tal motivo en esta tesis se presenta la creación de un método que permite realizar aplicaciones discretas de agonista ultra-rápidas (20 μs), sobre una preparación de outside-out patch clamp, marcando una mejora sustancial de 10- 50 veces comparado con el estado del arte actual y a los dispositivos comerciales, respectivamente. Se analizó el rango de condiciones en el que esta técnica puede s er empleada y se realizaron modificaciones para generar aplicaciones arbitrarias del agonista maximizando la información cinética obtenida por experimento. Por último, se realizó un análisis teórico, bajo la óptica de la estadística Bayesiana, de la respuesta de canales a aplicaciones ultra-cortas de agonista. Empleando esta técnica y método de análisis puede discriminarse entre modelos que ajustan igualmente los datos experimentales.

Abstract:
Ion channels are multimeric proteins that regulate the passage of ions through cell membrane coupling their functioning to external factors like membrane voltage and/or the presence of specific ligands, etc. Their change of state dynamics can be quantitatively descripted in terms of a Markov’s process, random and without memory. The kinetic constants of these processes can be obtained, from experimental results, with the maximum likelihood estimation (MLE), using the recursive algorithm of hidden chains of Markov. In the particular case of ligandactivated channels there had been postulated states of intermediate energy (FLIPSTATE), to explain delays during the activation of the receptor. To elucidate whether the existence of these states is a property of the receptor or each one of the subunits it is necessary to make applications of agonist even shorter than art state (0.2 ms). Therefore in this thesis presents the creation of a method that allows discrete ultra-fast applications of agonist (20 μs), on an outside-out patch clamp preparation, marking a substantial 10-50 fold improvement compared with actual art state and commercial devices, respectively. We analyzed the range of conditions in which this technique can be used and we made modifications to generate random applications of agonist maximizing the kinetic information obtained by experiment. Finally, we made a theoretical analysis, under the viewpoint of Bayesian statistics, of the response of channels to ultra-fast applications of agonist. Using this technique and this method of analysis can discriminate between models that also fit the experimental data.

Cámara, María de los Milagros. "Avances en el estudio de la Adenilato Quinasa Nuclear de Trypanosoma cruzi" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Trypanosoma cruzi, el agente etiológico del Mal de Chagas es un eucariota inferior en donde el control de la expresión génica recae mayormente en mecanismos postraduccionales. Durante todo su ciclo de vida se observan fluctuaciones en la expresión génica. En la presente tesis se realizó el estudio de una adenilato quinasa nuclear (TcADKn) que se encuentra involucrada en la biogénesis ribosomal. Las adenilato quinasas nucleares han sido descriptas en muy pocos organismos, se las ha asociado al metabolismo del ARN, pero su función en el núcleo todavía es incierta. Todas las isoformas descriptas son esenciales para la viabilidad celular. La función de TcADKn es llevar a cabo el procesamiento del 18S, en el sitio D en el citoplasma, vía interacción directa con la proteina ribosomal S14 (Rps14). Establecimos la presencia de una señal de localización nuclear atípica en su extremo amino terminal, que involucraría la región del sitio activo. Además identificamos una posible señal de exportación nuclear hacia el carboxilo terminal de la proteína. Por otra parte determinamos que su localización nuclear es dependiente de la transcripción activa del ARN ribosomal, el ensamblado correcto de los ribosomas, la integridad del ADN, los niveles de nutrientes en el medio y posiblemente involucre a la vía TOR (“Target of Rapamycin”). Además detectamos que los niveles de TcADKn disminuyen a lo largo de la curva de crecimiento de epimastigotes en cultivo, pudimos determinar que las secuencias responsables de dicha regulación se encontrarían en su 3’ UTR y probablemente exista un mecanismo de autorregulación de la expresión de TcADKn. Finalmente se comenzó con el estudio del locus ribosomal de T. cruzi tanto a nivel de su secuencia como así también en cuanto a la biogénesis ribosomal identificándose los sitios de procesamiento del ribosoma.

Abstract:
Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, is an early divergent eukaryote in which the control of gene expression relies mainly in post-transcriptional mechanisms. Translation process is globally up and down regulated during the transition between proliferating and non-proliferating life-cycle stages. In this thesis we report the presence of a nuclear isoform of adenylate kinase (TcADKn) which is involved in ribosome biogenesis. Nuclear adenylate kinases have been recently described in a few organisms; however their role in nuclear and ribosomal processes is still unclear. Depending on ribosomal RNA transcription and assembly, TcADKn is located in the nucleolus or cytoplasm. Nuclear transport and the signals that determine this process were also identified for the first time. A non-canonical nuclear localization signal was mapped towards the N-terminal of the protein, being the phosphate-binding loop of the catalytic site essential for its localization. Nucleolar localization presented a nutrient availability, oxidative stress and probably by the equivalent in T. cruzi of the mammalian TOR pathway regulation. TcADKn is involved in ribosomal 18S RNA processing which involves its interaction with the ribosomal protein S14 (Rps14). Furthermore, TcADKn expression is regulated by its 3’ UTR. Finally we started with the study of T. cruzi ribosomal locus, at a sequence and biogenesis level.

Diez, Berenice Andrea. "Estudios sobre la terapia fotodinámica a partir de ALA en células leucémicas sensibles y resistentes a drogas de quimioterapia" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Terapia Fotodinámica (TFD) es utilizada para el tratamiento del cáncer y otras patologías no malignas. Se basa en la administración un compuesto fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido maligno y al recibir fotones interactúa con el O2 produciendo especies reactivas del oxígeno (ROS), que son altamente tóxicas y desencadenan la muerte celular. La administración exógena del ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de los tetrapirroles, induce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), un FS muy eficiente. La quimioterapia administrada en altas dosis, seguida del transplante autólogo de médula ósea es una de las modalidades terapéuticas más utilizadas para el tratamiento de la leucemia. Sin embargo, una pequeña proporción de células leucémicas indiferenciadas que se encuentran en un estado quiescente, pueden resultar resistentes a la quimioterapia y ser reinsertadas en el paciente luego del transplante. Por este motivo actualmente se estudian métodos de purgado potencialmente efectivos para eliminar a las células malignas remanentes. Además, el uso de quimioterapia presenta otras limitaciones como el desarrollo de fenotipos celulares resistentes a drogas y efectos secundarios no deseados. En esta tesis hemos estudiado los efectos de la TFD basada en ALA (TFD-ALA) en tres líneas celulares leucémicas murinas, LBR-, sensible a drogas de quimioterapia, LBR-D160 y LBR-V160, resistentes a doxorubicina (DOX) y vincristina (DOX), respectivamente. Para ello evaluamos la síntesis y acumulación de PpIX sintetizada a partir de ALA, y observamos que en las tres líneas estudiadas esta síntesis aumentó en función de la concentración y del tiempo de incubación con ALA. Estudios de microscopía confocal indicaron que las mitocondrias son el principal sitio de localización de PpIX. Mediante estudios de viabilidad celular demostramos la eficacia de la TFD-ALA en las tres líneas celulares, indicando la falta de resistencia cruzada en el caso de las líneas resistentes a drogas de quimioterapia. Por otra parte estudiamos los mecanismos involucrados en la muerte celular producida por la TFD, donde observamos un aumento en los parámetros de estrés oxidativo como la despolarización de la membrana mitocondrial, la producción de oxígeno singulete y de anión superóxido, indicando la importancia de las mitocondrias en los efectos de la TFD. El análisis de parámetros tanto morfológicos como bioquímicos demostró la predominancia de apoptosis como principal mecanismo de muerte, en particular a través de la vía intrínseca, lo que concuerda con el rol activo de las mitocondrias previamente mencionado. Evaluamos además los efectos al combinar la TFD-ALA con los agentes antineoplásicos DOX y VCR, en un modelo in vitro in vivo, utilizando la línea LBR-. En ambos casos observamos un beneficio significativo al utilizar las terapias combinadas, evidenciando la ventaja de esta modalidad frente a las terapias utilizadas en forma independiente. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran el beneficio potencial de utilizar la TFD-ALA como método de purgado de la médula ósea de pacientes con leucemia, especialmente para eliminar fenotipos resistentes a drogas. Además, los estudios utilizando las terapias combinadas indican la posibilidad de disminuir las dosis de drogas de quimioterapia, minimizando así las limitaciones ocasionadas por este tratamiento.

Abstract:
Photodynamic therapy (PDT) is a cancer treatment modality which involves the administration of a given photosensitizing agent (PS), its preferential accumulation in malignant tissue and the subsequent activation by light of appropriate wavelength. Interaction between the excited PS and molecular oxygen produces singlet oxygen as well as other reactive oxygen species (ROS) selectively destroying the target cells. Exogenous administration of 5-aminolevulinic acid (ALA) induces the accumulation of protoporphyrin IX (PpIX), a highly photosensitive compound. Autologous bone marrow transplantation (ABMT) after high dose chemotherapy is a widely accepted therapeutic modality for the management of hematologic malignancies. The major disadvantage of this approach is the possible contamination of the autograft with remaining leukemic cells which leads to recurrence of the disease. Besides, the use of chemotherapy agents promotes the development of drug resistant phenotypes and produces serious side adverse effects in many patients. In this work we studied the effects of ALA-based PDT (ALA-PDT) in three leukemic murine cell lines: LBR-, drug sensitive, LBR-D160 resistant to doxorubicin (DOX) and LBR-V160, resistant to vincristine (VCR). The synthesis and accumulation of PpIX after ALA administration was evaluated, which increased with the concentration and incubation time with ALA. Confocal microscopy studies revealed that PpIX was mainly localized in mitochondria. Cell viability studies demonstrated that ALA-PDT was effective in the three cell lines, indicating the lack of cross-resistance in LBR-D160 and LBR-V160 cells. The mechanisms involved in the death caused by ALA-PDT were also studied. It was observed an increase in oxidative stress parameters, such as mitochondrial membrane depolarization, singlet oxygen and superoxide anion production. Morphological and biochemical studies showed that apoptosis, especially involving intrinsic pathway, was the main death mechanism induced by ALA-PDT. We also evaluated on the LBR- cell line the effects of ALA-PDT combined with DOX or VCR using an in vitro-in vivo model, and a significant benefit for combination therapies, with respect to each one independently, was found. The results obtained in this work show that ALA-PDT could be useful as a purging method during ABMT in leukemia patients, especially to eliminate drug resistant cells. Besides, the use of combined therapies allows the possibility of reducing the doses of chemotherapeutic agents, thus minimizing the limitations of this therapy.

Bolcic, Federico Martín. "Coinfección HIV-Hepatitis C: análisis molecular de factores genéticos del HCV que influyen sobre la respuesta al interferón" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El virus de la hepatitis C y el HIV comparten las mismas vías de transmisión, lo que conlleva a una elevada tasa de coinfección. En este escenario, la tasa de respuesta al peg-IFN+RBV es más baja que en pacientes monoinfectados con HCV. El objetivo central de este trabajo fue estudiar si diferentes proteínas del HCV, estructurales (E2) y no estructurales del HCV (NS5A), son capaces de interrumpir las acciones antivirales desencadenadas por el IFN, contribuyendo hacia una respuesta disminuida a la terapia. El genotipo de HCV implicado en la infección denotó una prevalencia elevada del 1a así como un crecimiento del 4. Ambos son conocidos por su baja tasa de respuesta al IFN. Se encontró una relación temporal en la introducción en Argentina del genotipo 1a del HCV y el subtipo BF de HIV. La glicoproteína E2 no dio evidencia de rol alguno en la respuesta al tratamiento. Dominios definidos de la proteína NS5A arrojaron resultados encontrados dependiendo de la población bajo estudio. La co-presencia de HIV no parece impactar en la génesis de variantes de escape de HCV, ni modificar la composición de cuasiespecies. No obstante el HCV tendría capacidad replicativa en sitios extrahepáticos aunque las variantes virales halladas en células mononucleares de sangre periférica no exhibieron diferencias con las presentes en plasma. La menor respuesta al tratamiento con peg-IFN+RBV en la coinfección guardaría relación con la mayor presencia de genotipos 1a y 4. La proteína NS5A podría contribuir en tal sentido. Es necesario analizar el rol que desempeñan factores inherentes al hospedador.

Abstract:
The HIV and HCV share the same transmission routs which lead to a high prevalence of coinfection. In this scenario, the rate of response to peg-IFN + RBV is lower than in HCV monoinfected patients. The aim of this work was to analyze whether different HCV proteins, structural (E2) and nonstructural HCV (NS5A), are able to disrupt viral actions triggered by IFN, contributing to a decreased response to therapy. The HCV genotype infection epidemiology denoted that the most prevalent was 1a and growth of 4. Both are known for their low response rate to IFN. We found a temporal relationship in the introduction in Argentina of HCV genotype 1a and BF subtype of HIV. The E2 glycoprotein gave no evidence of any role in the response to treatment. Defined domains of the NS5A protein yielded results depending on the population under study. The co-presence of HIV does not appear to impact the selection of HCV resistant variants, or modify the composition of quasispecies. However, the HCV may have replicative capacity in extrahepatic compartments but viral variants found in peripheral blood mononuclear cells did not differ with those present in plasma. The lower response to treatment with peg-IFN + RBV in HIV coinfected patients would be related to the increased presence of genotypes 1a and 4. NS5A protein could contribute to this effect. It is necessary to analyze the role that factors inherent to the host.

Teijo, María Julieta. "Mecanismos de muerte y supervivencia celular por terapia fotodinámica basada en ácido 5-aminolevúlico" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Terapia Fotodinámica (TFD) es utilizada para el tratamiento del cáncer y otras patologías no malignas. Se basa en la administración un compuesto fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido maligno y al recibir luz de longitud de onda adecuada, éste interactúa con el O2 produciendo especies reactivas del oxígeno (ROS), que son altamente tóxicas y desencadenan la muerte celular. La administración exógena del ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de los tetrapirroles, induce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), el único FS endógeno. En la erradicación de tumores mediante TFD intervienen diferentes procesos de muerte celular, los que incluyen apoptosis, necrosis, y autofagia. En el presente trabajo se estudiaron los mecanismos que llevan a la muerte celular por TFD basada en ALA en células de adenocarcinoma de pulmón humanas (A549) cultivadas de modo convencional -en monocapa- o en esferoides multicelulares (EMCs, agregados celulares compactos que desarrollan gradientes de nutrientes y oxígeno), y en una variante resistente derivada mediante sucesivos ciclos de tratamiento fotodinámico y recuperación. La acumulación de PpIX a partir de ALA aumentó con el tiempo de incubación y la concentración de ALA hasta alcanzar un plateau con 1 mM tanto en monocapas como en EMCs. Estudios de microscopía confocal indicaron que las mitocondrias son el principal sitio de localización de PpIX endógena pero no de PpIX administrada exógenamente, la cual se localiza en la membrana plasmática. Los EMCs presentaron una capacidad de síntesis de PpIX similar a las células en monocapa, mientras que en células resistentes se observaron niveles menores de acumulación. La TFD-ALA reduce significativamente la supervivencia celular de manera dosis lumínica dependiente aunque en menor medida tanto en células resistentes como en EMCs. La TFD-ALA induce en las células la generación de ROS tales como ¹O2, O2ֿ y peróxidos, en células en monocapa pero no en EMCs; y esa producción puede ser modulada por agentes antioxidantes de alto grado de protección como el ascorbato y el trolox, con un consecuente aumento en la viabilidad celular. Se observaron eventos asociados a apoptosis 1 h luego de la TFD: reducción del tamaño celular, irregularidades en la membrana plasmática, condensación de la cromatina, despolarización de la membrana mitocondrial, liberación de citocromo c al citoplasma, externalización de fosfatidilserina y activación de caspasa-3. En cambio, tanto en EMCs como en células resistentes se observó una reducción notable en la producción de ROS y en los parámetros de apoptosis. Por otro lado, en todos los casos se hallaron indicios de un proceso autofágico, caracterizado por la formación de vacuolas de doble membrana y la detección de LC3-II, así como la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2. La activación del factor nuclear NFκB únicamente se halló en células tratadas con dosis bajas de TFD, mientras que las células resistentes mostraron presencia de este factor en el núcleo en todos los tiempos de irradiación, de manera creciente. Los resultados obtenidos en este trabajo permiten determinar que los mecanismos de muerte celular post-TFD ocurren principalmente por la vía apoptótica intrínseca, pueden ser modulados por agentes antioxidantes, y coexisten con procesos autofágicos. Por otro lado, el modelo de EMCs es más adecuado para el estudio de los efectos de la TFD-ALA respecto de la monocapa, ya que simula la estructura de microtumores avasculares y refleja características histológicas como la secreción de mucopolisacáridos y la expresión del factor inducido por hipoxia (HIF1-α). La autofagia es el mecanismo principal de respuesta a TFD en células resistentes, las cuales a su vez incrementan mecanismos de sobrevida como la activación de NFκB. Estos son factores condicionantes de la eficacia del tratamiento a considerar al aplicar TFD repetidamente en el tratamiento de tumores y al emplear agentes antioxidantes para minimizar el fotodaño a tejidos no tumorales.

Abstract:
Photodynamic therapy (PDT) is a treatment for malignant and non malignant pathologies. It consists on the administration of a photosensitizing drug (PS) which selectively accumulates in tumor cells and upon irradiation with appropriate wavelength light reacts with O2 and produces reactive oxygen species (ROS) leading to cell death. Exogenous administration of 5-aminolevulinic acid (ALA) induces the accumulation of the endogenous PS, protoporphyrin IX (PpIX). Different cell death pathways develop after PDT, such as apoptosis, necrosis, and autophagy. Mechanisms of cell death after ALA-PDT were evaluated in a human adenocarcinoma cell line (A549) cultured in conventional monolayers, or as multicellular spheroids (MCSs, compact cell aggregates which generate nutrient and oxygen gradients) and in a derived PDT-resistant cell culture obtained after repetitive PDT-recovery cycles. PpIX accumulation from exogenous ALA increased with incubation time and ALA concentration reaching a plateau at 1 mM, both in monolayers and MCSs. Confocal microscopy images showed that endogenously generated PpIX localized in mitochondria, and exogenous PpIX in the plasma membrane. Similar PpIX accumulation rates were found in MCSs with respect to monolayers, whereas derived resistant cells showed lower levels. ALA-PDT significantly reduced cell survival in a light-dose dependent manner, but to a lesser extent in resistant cells and MCSs. Cells subjected to ALA-PDT in monolayers produce ROS like ¹O2, O2ֿ and peroxides, but not in MCSs. They can be modulated by high protection grade antioxidants such as ascorbate or trolox, with the consequent increase in cell viability. Several apoptosis related features were observed after PDT: cell shrinking, membrane blebbing, chromatin condensation, mitochondrial membrane despolarization, cytocrome c release to the cytoplasm, phosphatidylserine externalization and caspase-3 activation. MCSs and resistant cells showed a marked reduction in ROS production and apoptotic features; as well as autophagic signs including doble membrane vacuoles and LC3-II detection, in addition to antiapoptotic protein Bcl-2 expression. Nuclear factor NFκB was detected only after low dose PDT, but in resistant cells all irradiation times showed presence of NFκB in the nucleus, increasing with irradiation time. Results presented in this work indicate that cell death mechanisms induced by ALA-PDT occur mainly by the apoptotic intrinsic pathway, which can be modulated by antioxidant agents, and coexist with autophagic processes. In addition, MCSs are an appropriate model for the study of ALA-PDT because they mimic avascular microtumors and present hystological features like mucopolysacharides secretion and hipoxia-inducible factor expression (HIF1-α). Autophagy is the principal cell death pathway occurring in resistant cells in which increased survival mechanisms, like NFκB activation, were found. Factors conditioning PDT efficacy should be considered when applying repetitive PDT for tumor treatment together with the use of antioxidants to minimize photodamage to non malignant tissue.

Blidner, Ada G.. "Efecto del antiinflamatorio no esteroideo indometacina sobre las células mieloides supresoras en microambientes inflamatorios normales y tumorales" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células mieloides supresoras (CMS) constituyen una población de células con actividad regulatoria que controla las respuestas inflamatorias crónicas y promueve el escape tumoral. En este proyecto de tesis mostramos que el efecto del antiinflamatorio no esteroide indometacina (Indo) sobre las CMS es dependiente del contexto en el que se diferencie esta población celular. Ratones BALB/c inoculados con el adenocarcinoma de pulmón singeneico LP07 (3x105 células) se trataron in vivo con una dosis de 10 μM de Indo en el agua de beber. El tratamiento inhibió la acumulación de CMS en el tumor y en órganos linfáticos secundarios producida durante la progresión tumoral, inhibió la actividad supresora de las CMS esplénicas sobre la respuesta linfocitaria a un aloantígeno e inhibió el crecimiento tumoral en un ensayo de transferencia adoptiva, p<0.001. En línea con estos resultados, observamos la misma actividad en las CMS cuando se trataron in vitro con Indo (10 μM) en presencia de medio condicionado de células LP07, simulando el microambiente tumoral. Sin embargo, en ausencia del microambiente tumoral, la administración de Indo generó un aumento en la capacidad supresora (MLR; p< 0.05) y pro-tumoral (transferencia adoptiva, p<0.01) de las CMS. Además, las CMS de ratones normales tratadas con Indo en ausencia del microambiente tumoral suprimieron el desarrollo de la encefalomielitis aguda experimental (EAE), un modelo de esclerosis múltiple en ratones C57BL/6, mientras que las CMS tumorales tratadas con Indo aumentaron la severidad de los síntomas e impidieron su resolución (p<0.05). Analizando los mecanismos de inmunosupresión, Indo redujo la actividad arginasa (4,794 vs 2,077 μg urea/ mg total proteína, p<0.001) y la producción de óxido nítrico (9.2 vs 4.4 μM; P<0,05) y de especies reactivas de oxígeno (124 vs 87 MFI P<0.05) en CMS tumorales pero no en CMS normales. Este estudio revela el rol dual de un agente antiinflamatorio en el control de una población celular regulatoria con implicancias críticas en cáncer y en desórdenes autoinmunes.

Abstract:
Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) have emerged as a regulatory cell population that controls chronic inflammatory responses and promotes tumor-immune escape. To date no specific immunomodulatory drug has proven efficacy in targeting the expansion and/or function of these cells. Here we show a context-dependent effect of the non-steroidal antiinflammatory drug indomethacin (Indo) on MDSCs. BALB/c mice were injected with 3x105 LP07 lung adenocarcinoma cells and treated with a non-cytotoxic dose of Indo (10 μM; IC50 LP07: 60 μM). Indo treatment inhibited the suppressive activity of splenic MDSCs in mixed lymphocyte reactions (MLR) (p<0.05), and restrained tumor growth in adoptive transfer experiments (p<0.001). Accordingly, the same effect was observed when MDSCs were treated with Indo in vitro (10 μM; IC50 MDSCs: 125 μM) in the presence of conditioned media from LP07 cells. However, in the absence of a tumoral context, Indo administration increased the suppressive activity of these cells (MLR; p< 0.05) and their pro-tumoral effect (p<0.01). In keeping with these observations, Indo-treated normal MDSCs suppressed the development of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), a model of multiple sclerosis in C57BL/6 mice, while Indo-treated tumoral MDSCs enhanced the severity of EAE and delayed its resolution (p<0.05). Mechanistically, Indo reduced arginase activity (4,794 vs 2,077 μg urea/ mg total protein,p<0.001) and production of nitric oxide (9.2 vs 4.4 μM; p<0,05) and reactive oxygen species (ROS) (124 vs 87 MFI P<0.05) in tumoral MDSCs, but not in normal MDSCs. Our study unveils the dual role of a widely used anti-inflammatory agent in the control of regulatory cell compartments with critical therapeutic implications in cancer and autoimmune disorders.

Degese, María Sol. "Estudio de los caminos de señalización involucrados en la terminación de la señal de c-fos. Apagado de la activación a nivel del ARN mensajero" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La llegada de distintos tipos de señales a la superficie de las células altera la expresión génica mediante la activación de distintos caminos de transducción de señales. En este trabajo, nos enfocamos en el estudio de estímulos proliferativos y en como estos alteran la expresión del gen de respuesta inmediata, c-fos, factor de transcripción considerado como un proto-oncogén. Si bien tanto mensajero como la proteína Fos están ausentes en la mayor parte del ciclo celular, ambos aparecen y desaparecen rápidamente luego del estímulo. Nos hemos propuesto investigar la regulación de la estabilidad del ARN mensajero de c-fos dada por MAPKs. Una de las proteínas reguladoras de la estabilidad de los ARNm en la que centramos nuestro estudio es HuR, la cual se une al mensajero de c-fos en su región ARE o rica en adeninas y uracilos presente en la parte 3´UTR. Encontramos que p38 SAPK regula la asociación de HuR promoviendo su liberación del ARNm y llevándolo a degradación. Además p38 SAPK inhibe la fosforilación de HuR, sugiriendo la posible acción de alguna fosfatasa p38 dependiente. Encontramos también que KSRP se uniría al ARE de c-fos en los mismos sitios que HuR y su asociación puede revertir la estabilización dada por HuR o por la inhibición de p38, sugiriendo un rol positivo en la degradación del ARNm de c-fos.

Abstract:
Signals arriving to the cell surface may alter gene expression through the activation of different signaling pathways. In this work we focus in the study of proliferative stimuli and how they alter the expression of the immediate-early responsive gene c-fos, a transcription factor considered, as well, a proto-oncogene. Both messenger RNA and Fos protein are absent in most of the cell cycle, but they appear and disappear very fast upon stimulation. We have proposed to investigate the MAPKs´-dependent mRNA stability regulation. One of the most important regulators of the mRNA stability in which we focus our study is HuR that binds to the c-fos mRNA´s ARE (Adenine and uracil rich region) present in its 3´UTR. We found that p38 SAPK regulates the binding of HuR, promoting its dissociation from the mRNA and leading it to degradation. Besides, p38 SAPK inhibits HuR phosphorylation, suggesting a possible action of a p38 dependent phosphatase. We also found that KSRP may be binding to the c-fos ARE in the same sites as HuR and its association to this region is sufficient to revert the stabilization due both to HuR binding and to p38 activity inhibition, suggesting a positive role in c-fos mRNA degradation process.

Astort, Francisco. "Mecanismos involucrados en la inducción del gen de HO-1 en células adrenales. Efecto de ACTH, NO y LPS" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La actividad de HO-1 ha sido asociada a una plétora de efectos biológicos. En particular estudios previos de nuestro grupo de trabajo han demostrado su rol como modulador autócrino/parácrino de la esteroidogénesis en la corteza adrenal de ratas estimuladas con ACTH y LPS , así como su acción citoprotectora como parte del sistema antioxidante adrenal. En el presente trabajo de tesis estudiamos mecanismos de inducción de HO-1 en células adrenales. Los resultados obtenidos confirman que el tratamiento de células Y1 con ACTH induce la transcripción de HO-1. Se localizó una zona del promotor murino de HO-1 de 400 pb aledaña al inicio de la transcripción, donde se encontraron secuencias consenso para la unión de los factores de transcripción CREB y AP-1. Se demostró también la participación de la vía de transducción de señales de AMPc/PKA/CREB y de Akt/PKB en el mecanismo de inducción de HO-1 por ACTH. El LPS incrementó la transcripción de HO-1 por un mecanismo que involucra una zona del promotor de aprox. 516 pb (entre -3216 y -2700). Tras el estímulo con LPS constatamos, además, la activación del factor de transcripción NFκB y la regulación de la expresión de HO-1 por la vía de la PKA. Finalmente, encontramos evidencias que nos permiten afirmar que el NO también induce a la HO-1 incrementando su transcripción, por un mecanismo que involucra la activación del factor de Nrf2, la actividad de PKC, la activación de la GCs y la generación de GMPc. En suma, demostramos que diferentes estímulos son capaces de activar la transcripción de HO-1, en células adrenales Y1, utilizando diferentes mediadores y factores de transcripción. Dado su rol modulatorio en la síntesis de glucocorticoides adrenales además de sus efectos citoprotectores, este conocimiento podría utilizarse para diseñar estrategias dirigidas a inducir HO-1 como un blanco novel alternativo en el tratamiento de patologías que cursan con disfunción adrenal.

Abstract:
HO-1 activity has been involved in a plethora of biological effects. In particular, previous studies from our group have demonstrated an autocrine/paracrine modulatory role in steroidogenesis in the adrenal cortex of the rat under the stimulation of ACTH or LPS . In addition, HO-1 induction was shown to exert a citoprotective effect in these cells . Present studies were designed to analyze different mechanisms of HO-1 induction in adrenal cells. Our results confirm that ACTH treatment of Y1 adrenal cells results in an increase in the transcription of the HO-1 gene. Results showed a 400 bp zone of the murine HO-1 promoter near the initiation of the transcription site housing consensus sequences for the binding of CREB and AP-1. The involvement of the cAMP/PKA/CREB and Akt/PKB transduction pathways in ACTH-induced regulation of the HO-1 gene was also demonstrated. HO-1 transcription was also increased by LPS, and this effect was dependent on the presence of a ~516 bp zone in the murine promoter (between -3216 y -2700 bp). LPS-dependent HO-1 gene induction was mediated by the activation of the NFκB transcription factor. The modulation of this pathway by PKA was also demonstrated. Finally, we also showed that NO also increased HO-1 mRNA expression levels through the activation of Nrf2, PKC, and sGC with the resulting production of cGMP. In summary we demonstrated that different stimuli are able to induce HO-1 in the murine adrenocortical cell line Y1, using several signaling pathways that ultimately activate this enzyme’s gene by means of different transcription factors. Considering its role as a modulator of adrenal glucocorticoid synthesis, in addition to its cytoprotective effects, this knowledge could be used to design strategies aimed at inducing HO-1 as a novel alternative target in the treatment of diseases that presents with adrenal dysfunctions.

Ferré, Lilian Elizabeth. "Niveles de vitelogenina en la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus (Decápoda: Parastacidae): ensayos in vitro e in vivo" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Se determinaron los niveles de vitelina (Vn) y vitelogenina (Vg) en hembras de la langosta dulceacuícola Cherax quadricarinatus durante todo su ciclo reproductivo y además en respuesta a tratamientos tanto in vitro como in vivo con las siguientes hormonas o neuroreguladores: metil farnesoato (MF), 17α-hidroxiprogesterona (17PG) y naloxona (Nx), ensayando adicionalmente 17β-estradiol (E2) in vitro. Los niveles de Vn y Vg se midieron en ovario (OV), hemolinfa (HL) y hepatopáncreas (HP) mediante la técnica inmunoenzimática ELISA puesta a punto especialmente para el desarrollo de esta Tesis. En el estudio del ciclo reproductivo, se determinó la variación anual de los niveles de Vn yVg en hemolinfa, ovario y hepatopáncreas de hembras adultas de C. quadricarinatus y se correlacionaron tales niveles con los índices gonadosomático (IGS) y hepatosomático (IHS). Se encontró una concentración máxima de vitelogenina circulante en el período reproductivo medio, en correlación con valores elevados de IHS y de contenido de Vg en hepatopáncreas. En el caso de los ensayos in vitro, los compuestos ensayados se agregaron al medio de incubación, mientras que en el ensayo in vivo se incorporaron al alimento. Los resultados obtenidos tanto in vitro como in vivo, indican que el MF estimula la síntesis endógena de vitelina en el ovario, durante la maduración temprana e intermedia del mismo, siendo incluso capaz de inducir la síntesis de Vn en un ovario en quiescencia reproductiva (periodo postreproductivo). El MF no mostró efectos sobre la producción de vitelogenina en sitios extraováricos. Las hormonas esteroideas estimularon la vitelogénesis endógena (en el ovario) durante el periodo pre-reproductivo ó reproductivo temprano. El antagonista encefalinérgico naloxona no tuvo efecto sobre la s vitelogénesis indicando que la hormona estimulante gonadal, cuya secreción es estimulada por naloxona, no estaría involucrada directamente en la síntesis de Vn, aunque sí tendría efecto sobe la síntesis de otras proteínas ováricas. El presente trabajo provee herramientas de potencial aplicación en acuicultura a fin de optimizar la producción de la especie en estudio.

Abstract:
Vitellin (Vn) and vitellogenin (Vg) levels were determined in females of the freshwater crayfish Cherax quadricarinatus during the entire reproductive cycle, and also in response to the following hormones and neuroregulators: methyl farnesoate (MF), 17α- hidroxyprogesterone (17PG) and naloxone (Nx); additionally, 17β-estradiol (E2) was assayed in vitro. Vn and Vg levels were measured in hemolymph (HL), ovary (OV) and hepatopancreas, by means of the immunoenzymatic technique ELISA, specially developed for this Thesis. In the study of the reproductive cycle, the annual variation of Vn and Vg levels in ovarty, hemolymph and hepatopancreas was determined and correlated to both the gonsadosomatic (GSI) and hepatosomatic (HSI) indexes. A maximum concentration of circulating Vg was found in the mid reproductive period, in correlation to high values of both HIS and Vg content in hepatopancreas.. For the in vitro assays, the assayed compounds were added to the incubation medium, while for the in vivo assay, the same compounds were incorporated to the provided food. The results obtained both in vitro and in vivo indicate that MF stimulates the endogenous Vn synthesis in the ovary, during both its early and intermediate maturation, even being able to induce the Vn synthesis in a quiescent ovary (i.e., during the post-reproductive period). On the other hand, MF did not show any stimulating effect on Vg synthesis in extra-ovarian sites. Steroid hormones stimulated endogenous vitellogenesis (in the ovary) during either the prereproductive or early reproductive period. The enkephalinergic antagonist naloxona showed no effect on vitellogenesis process, indicating that the gonad stimulating hormones, whose secretion is stimulated by naloxona, would not be directly involved in the Vn synthesiss; instead, it would be stimulating the synthesis of other ovarian proteins. The current study provides tools of potential application in aquaculture, to improve the production of the studied species.

Gabelloni, María Laura. "Mecanismos moleculares involucrados en la secreción de IL-1ß por los neutrófilos humanos" (2012-03-09) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La interleuquina-1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos, sintetizada como un precursor (proIL-1β) que debe ser procesado proteolíticamente para la generación de su forma activa. En esta Tesis determinamos que los neutrófilos humanos altamente purificados liberan IL-1β en respuesta a estímulos infecciosos como el lipopolisacárido (LPS) y estériles, como los cristales de urato monosódico (MSU), así como también frente al primado con LPS y posterior estimulación con ATP. Los efectos de inhibidores específicos y la capacidad de los agonistas de inducir la activación de la caspasa-1 sugirieron que la secreción de IL-1β es dependiente de caspasa-1 y de las serinproteasas elastasa y/o proteinasa 3. Nuestros hallazgos realizados con neutrófilos de pacientes incapaces de activar a la enzima generadora de intermediarios reactivos del oxígeno (IRO) NADPH oxidasa, con una línea celular neutrofílica carente de actividad de esta enzima, y con un inhibidor específico de la misma, sugirieron que el evento de secreción de IL-1β madura de la célula requiere de la actividad de la NADPH oxidasa. Sin embargo, el procesamiento de la proIL-1β es regulado negativamente por los IRO, los cuales ejercen un efecto inhibitorio sobre la caspasa-1. Esta compleja regulación de la secreción de IL-1β que depende del estado rédox celular podría constituir un mecanismo fisiológico de control de procesos inflamatorios dependientes de IL-1β donde el neutrófilo cumple un papel destacado.

Abstract:
Interleukin-1β (IL-1β) is a major pro-inflammatory cytokine involved in pathophysiological processes. It is synthesized as a precursor (pro-IL-1β) which must be cleaved to become biologically active. In this work we determined that highly purified human neutrophils release IL-1β in response to infectious and sterile stimuli, like LPS or monosodium urate crystals, respectively, and also to LPS-priming plus ATP stimulation. By using specific inhibitors and monitoring caspase-1 activation induced by the above-mentioned agonists, we determined that IL-1β secretion is dependent on caspase-1 and the serine-proteases elastase and/or proteinase-3. Our findings with neutrophils from patients lacking NADPH oxidase activity, as well as with both, a NADPH oxidase-deficient neutrophilic cell line and a specific inhibitor of this enzyme, showed that the event of mature IL-1β release requires the activity of the NADPH oxidase. However, pro-IL-1β processing is negatively regulated by reactive oxygen species, which inhibit caspase-1 activity. These findings show a complex redox regulation of IL-1β secretion that could constitute a physiological mechanism to control IL-1β-dependent inflammatory processes where neutrophils play a pivotal role.

Ricci, Analía Gabriela. "Estudio de nuevas terapias naturales y antiangiogénicas para el tratamiento de la endometriosis" (2012-03-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La endometriosis se define como la presencia de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina y sus principales síntomas asociados son el dolor y la infertilidad. Las terapias médicas disponibles actualmente resultan insuficientes debido a las altas recidivas de la enfermedad y los efectos adversos que generan. Asimismo, en los últimos años, se ha propuesto a los inhibidores de la angiogénesis como posible alternativa terapéutica, así como también el uso de compuestos naturales presentes en alimentos que formen parte de nuestra dieta. El objetivo general de esta tesis consistió en evaluar el efecto de un agente antiangiogénico, el bevacizumab, y de dos polifenoles naturales, el resveratrol y el galato de epigalocatequina (EGCG); sobre el crecimiento de lesiones endometriósicas en un modelo murino de endometriosis. Asimismo, se estudió el efecto in vitro de los polifenoles sobre la supervivencia de células epiteliales de endometrio eutópico provenientes de pacientes con endometriosis y mujeres controles. Nuestros resultados sugieren que el resveratrol y el EGCG tendrían un efecto inhibidor del crecimiento del endometrio ectópico, regulando los niveles de apoptosis y proliferación celular, así como la vascularización de la lesión endometriósica. El bevacizumab también mostró ser efectivo en la inhibición de la endometriosis en el modelo murino. No obstante, es importante considerar sus posibles efectos secundarios y su costo como tratamiento. Siendo así, sugerimos que el resveratrol y el EGCG serían una opción terapéutica promisoria. Los resultados obtenidos en esta tesis avalan continuar investigando estos compuestos naturales para poder definir los mecanismos de acción que participan en el efecto inhibitorio observado, y determinar también las concentraciones plasmáticas efectivas en pacientes para poder esclarecer su potencial utilidad como agentes preventivos en el tratamiento de la endometriosis.

Abstract:
Endometriosis is defined as the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity being its main associated symptoms, pain and infertility. Medical therapies available up to date are unsatisfactory due to their adverse effects and the frequent pathology recurrences. In the last few years, antiangiogenic agents and several natural compounds present in different dietary sources have been proposed as a potent alternative therapy. Given this scenario, the general objective of the present thesis was to evaluate the effect of bevacizumab, known for its antiangiogenic properties, as well as the effect of two natural polyphenols, resveratrol and epigallocatechin-3-gallate (EGCG), on the growth of endometriotic lesions in a mouse model of endometriosis surgically induced. Moreover, the effect of both polyphenols on the survival of epithelial endometrial cells from endometriosis patients and control subjects was evaluated in vitro. Our results suggest that resveratrol and EGCG would have a repressive effect on endometriotic growth, by increasing apoptosis and reducing cell proliferation and vascularization within the epithelial fraction of the endometriotic lesion. Bevacizumab was also effective in the inhibition of endometriosis development in the mouse model. Nevertheless, it is important to take into account its adverse effects as well as its cost. Based on these data, we propose that resveratrol and EGCG become a promising therapeutic option. Our results support to keep ongoing with the research in order to elucidate the mechanisms of action involved in the observed inhibitory effects, and determine the effective doses for patients to clarify the usefulness of these agents in endometriosis treatment.

Baltanás, Rodrigo. "Estudio integrativo de vías de señalización de MAP quinasas de Saccharomyces cerevisiae" (2012-07-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El objetivo principal de esta tesis fue estudiar la interacción entre las vías de MAP quinasas de Saccharomyces cerevisiae. Estas vías están representadas en humanos, donde su mal funcionamiento puede conducir a patologías tales como cáncer o problemas en el desarrollo. La complejidad de los circuitos de señalización de MAP quinasas en células de mamíferos dificulta la comprensión de como estas integran las señales que los activan. Para resolver este problema, una estrategia es analizar sistemas biológicos más simples que comparten propiedades con los más complejos. En este sentido, nos propusimos caracterizar exhaustivamente sistemas de señalización de MAP quinasas en un sistema biológico simple, la levadura S. cerevisiae. En esta tesis decidimos determinar los puntos de flujo de información entre las vías de "Respuesta a Shock Hiperosmótico" (HOG) y de "Respuesta a Feromona" (PR) de levaduras, ya que estas vías comparten componentes en sus vías de señalización y existe controversia sobre sus interacciones. A su vez, estudiamos estas vías en células individuales, estimulando las mismas controlando la dosis de los estímulos utilizados y en una variada serie de condiciones experimentales. Finalmente, medimos las respuestas de estas vías de un modo cuantitativo, estudiando su dinámica temporal y analizando el mayor número de respuestas posible en cada célula. Resumiendo los resultados obtenidos, podemos decir, que la vía de HOG no presenta osmoadaptación perfecta como se había afirmado previamente y permanece activa en estado estacionario. Su activación es mayor cuanto mayor es la osmolaridad externa, y también depende del gradiente químico de glicerol. Además, vemos una alta variabilidad de la respuesta de HOG en células individuales. A nivel de las interacciones entre las vías de MAP quinasas, determinamos que la vía PR es capaz de activar a la vía HOG en células adaptadas a alta osmolaridad. Esta compleja activación requiere de la MAPK de la vía de integridad de la pared celular (CWI) Slt2/Mpk1 y del polarisoma. La activación de HOG es pulsátil y presenta una alta variabilidad en células individuales. Los picos de actividad de HOG coinciden con eventos morfogenéticos inducidos por PR en los cuales se activa Slt2/Mpk1. La vía PR induce una salida de glicerol, que estaría mediada por Slt2/Mpk1, y este sería el mecanismo que llevaría a la activación de la vía HOG. La inducción de HOG también puede lograrse a través de la activación de Slt2/Mpk1 mediante shock térmico. Ambos tipos de activaciones (por feromona o alta temperatura) son proporcionales a la osmolaridad externa y dependen del gradiente químico de glicerol. Una consecuencia fisiológica de esta activación de HOG promovida por la vía PR es que las células en estas condiciones presentan una mejor capacidad de osmoadaptación. Finalmente, podemos agregar que los shocks hiperosmóticos inhiben a la vía PR durante la etapa de respuesta aguda, pero no hemos establecido aún los actores moleculares que median esta inhibición. Sin embargo, podemos descartar algunos componentes de la vía de HOG como Sho1, Ssk1 y Hog1. Para terminar, la alta osmolaridad, a largo plazo, en células ya adaptadas, cambia la dinámica de la respuesta de la vía PR reduciendo su sensibilidad a α factor. Esta reducción es proporcional a la osmolaridad externa. Esperamos que los resultados encontrados en este sistema biológico sean de utilidad, para pensar de una manera más integrativa, como se comporta la dinámica de la respuesta en un dado sistema frente a múltiples señales externas, de acuerdo a como el mismo las integra globalmente.

Abstract:
The main objective of this thesis was to study the interaction between MAPK signaling pathways in Saccharomyces cerevisiae. These pathways are represented in humans, were the malfunction of them can lead to pathologies such as cancer or developmental problems. The complexity of MAPK signaling circuits in mammalian cells difficult the understanding of how they integrate the signals activating them. As a means to solve this problem, one strategy is to analyze simpler biological systems that share properties with the more complex ones. In these sense, we ought to characterize thoroughly MAPK signaling pathways in a simple biological system, the yeast S. cerevisiae. In this thesis we decided to determine the points of information flow between the yeast "High Osmolarity" (HOG) and the "Pheromone Response" (PR) pathways, because they share components in their signaling cascades and there is controversy in how they interact. In addition to these, we studied these pathways in individual cells, stimulating them by controlling the stimulus doses and under a several experimental conditions. Finally, we measured the output of these pathways in a quantitative way, studying their temporal dynamics and analyzing the most number of possible readouts. Summing up the results obtained, we can say that, the HOG pathway does not present perfect adaptation as it was previously stated and it remains active in steady state. Its activation is higher the higher the external osmolarity and it also depends on the chemical gradient of glycerol. Besides, we see high variability in the HOG output of individual cells. At the level of interactions between the MAPK pathways, we determined that the PR pathway can activate the HOG pathway in cells adapted to high osmolarity. This complex activation requires the Cell Wall Integrity (CWI) MAPK Slt2/Mpk1 and the polarisome. This HOG activation occurs in pulses and presents high variability in single cells. The peaks of HOG activity coincide with PR induced morphogenetical events where Slt2/Mpk1 is activated. The PR pathway induces a glycerol efflux, which would be controlled by Slt2/Mpk1, and that would be the mechanism leading to HOG pathway activation. HOG induction can also be achieved through Slt2/Mpk1 heat shock activation. Both kinds of activations (by pheromone or high temperature) are proportional to the external osmolarity and depend on the glycerol chemical gradient. One physiological consequence of these PR promoted HOG activation is that the cells present a better osmoadaptation capacity in these conditions. Finally, we can add that hyperosmotic shocks inhibit PR pathway during the acute hyperosmotic phase, but we have not established yet the molecular actors that mediate this inhibition. However, we can rule out some of HOG pathway components like, Sho1, Ssk1 and Hog1. To finish, high osmolarity, at longer times in cells already adapted, changes the dynamics of PR response reducing its sensitivity to α factor. This reduction is proportional to the external osmolarity. We hope the results found in this biological system are helpful, to think in a more integrative way, how the output dynamics of a system behaves, facing multiple external signals, depending on how it integrates them globally.

Bertucci, Paola Yanina. "Efectos del receptor de progesterona sobre la elongación transcripcional del gen bcl-x humano" (2012-08-06) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los Receptores de Esteroides (SRs) regulan la expresión génica mediante su interacción con Elementos de Respueta a Hormona (HREs) ubicados en las regiones promotoras de sus genes blanco. Según el modelo clásico de activación transcripcional, los SRs reclutan complejos que relajan el estado de la cromatina favoreciendo, así, los pasos tempranos de la transcripción. Sin embargo, a partir del uso de la técnica de inmunoprecipitacion de cromatina seguida de secuenciación masiva (ChIP-seq), se encontró que una gran parte de los sitios de unión de los SRs al ADN se encuentra ubicada en regiones intragénicas. Adicionalmente, algunos de los complejos modificadores de la cromatina asociados a los efectos de los SRs en las regiones promotoras de sus genes blanco, también fueron encontraron favoreciendo la elongación transcripcional a lo largo de las regiones transcribibles. El objetivo de esta tesis es estudiar el posible efecto de los SRs unidos a las regiones intragénicas sobre la elongación de la Pol II en genes endógenos. Para ésto se utilizaron células humanas T47D tratadas con el progestágeno sintético R5020 y al gen bcl-x como modelo de estudio. Los resultados mostraron que el Receptor de Progesterona (PR) se recluta únicamente a sitios intragénicos, conjuntamente con las histonas acetiltransferasas CBP y GCN5 y el factor positivo de elongación P-TEFb. El reclutamiento de estos factores correlaciona con un aumento en la acetilación de las histonas, el desplazamiento parcial de los nucleosomas, un aumento en la abundancia de la Pol II principalmente en el extremo 3´del gen y una mayor procesividad de la Pol II a lo largo del mismo. En su conjunto los resultados presentados en este trabajo sugieren que la modulación de elongación de la Pol II en bcl-x humano supondría un nuevo mecanismo de regulación de la expresión génica mediada por el PR.

Abstract:
Steroid Receptors (SRs) regulate gene expression througth their interaction with the Hormone Response Elements (HREs) located in the promoter regions of their target genes. The classical mechanism of SR transcriptional activation explains that the SRs recruit modifying complexes to these regions, which in turn open the target chromatin thus, favoring the first steps of gene transcription. However, recently developed genome wide technologies, as ChIP-seq, revealed that a main part of SRs binding sites are located in intragenic regions. Additionaly, some chromatin modifying complexes classically found in the promoter regions of the SRs target genes were also found favoring the elongation process. In this sense, it was propossed that changes in the chromatin context in intragenic regions would affect Pol II elongation. The aim of this thesis is to analyze the putative effect of the SRs bound to their intragenic sites on Pol II elongation in hormone-regulated endogenous genes. To tackle this, we used T47D human breast cancer cell line treated with the synthetic progestin R5020 and bcl-x as a gene model. The results showed that, after the progestin addition, the Progesterone Receptor (PR) is recruited together with the acetyltransferases CBP and GCN5 and with the elongation factor PTEFb to different binding sites distributed along the intragenic region of bcl-x gene. The recruitment of these factors correlates with an increase of histone acetylation levels, the pantial decrease in nucleosome occupancy and the improvement of Pol II processivity along this gene. All together, these results suggest a new mechanism which involves the PR control of endogenous Pol II elongation.

Di Yorio, María Paula. "Regulación de la expresión de los receptores de leptina en el eje reproductivo de la rata" (2012-09-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Leptina, proteína de 16 kDa sintetizada y secretada principalmente por el tejido adiposo, parece ser un regulador de la función reproductiva. En este trabajo evaluamos la acción de distintos niveles de leptina sobre la expresión de las principales isoformas de su receptor en el eje hipotálamo-hipófisis- ovario, y el efecto de NPY y 17β-estradiol sobre estos receptores en el eje hipotálamo-adenohipófisis, ambos durante el proceso ovulatorio. Utilizamos como modelo biológico ratas inmaduras estimuladas con gonadotrofinas y evaluamos mediante estudios in vivo e in vitro la expresión del mensajero (RTPCR) y de la proteína (western blot) de los receptores de leptina. Encontramos que tanto leptina como las gonadotrofinas son capaces de regular diferencialmente la expresión del mensajero y de la proteína de ambos tipos de isoformas en el eje reproductivo, en forma dosis y tejido dependiente. Por otro lado, NPY y 17β-estradiol fueron capaces de inducir la expresión del mensajero y de la proteína de ambas isoformas en el eje hipotálamo-adenohipófisis a través del receptor de NPY tipo 1 y de los receptores estrogénicos α y/o β, respectivamente. Como el efecto estimulatorio o inhibitorio de leptina sobre la función ovárica podría depender de la activación diferencial de sus receptores, estudiamos las vías JAK2/STAT3 y ERK1/2, y la expresión de SOCS3 (western blot) en el eje reproductivo durante el proceso ovulatorio. Utilizamos ratas estimuladas con gonadotrofinas las que recibieron los siguientes tratamientos: i) tratamiento agudo, las que recibieron 5 dosis de leptina (5 μg c/u) o vehículo durante el proceso ovulatorio, o ii) tratamiento diario, las que recibieron 3 μg de leptina o vehículo por día durante 12 días a partir del destete. Observamos que el tratamiento agudo, que inhibe la función ovárica, i) disminuye la expresión de p-ERK1/2 en hipotálamo, adenohipófisis y ovario; ii) disminuye la expresión de p-STAT3 en adenohipófisis y ovario; y iii) aumenta la expresión de SOCS3 en adenohipófisis y ovario. En el tratamiento diario, que estimula la función ovárica, observamos que i) aumenta la expresión de p-STAT3 y p-ERK1/2 en hipotálamo y en ovario; ii) disminuye la expresión de SOCS3 en ovario; y iii) no hubo cambios en estas vías en adenohipófisis. Al evaluar in vitro la acción directa de leptina sobre estos caminos de señalización en ovario observamos que la presencia de leptina es capaz de aumentar la expresión de p-STAT3 a bajas y altas concentraciones, la expresión de p-ERK1/2 a bajas concentraciones y los niveles de SOCS3 a altas concentraciones. Con estos resultados podemos concluir que las gonadotrofinas, leptina, NPY y 17β-estradiol son capaces de regular la sensibilidad a leptina a lo largo del eje reproductivo por modular la expresión de sus receptores, y que los cambios observados en las distintas vías de señalización inducidos por diferentes niveles de leptina pueden ser, al menos en parte, responsables del efecto positivo o negativo que leptina ejerce sobre el proceso ovulatorio. Palabras claves: receptor de leptina, leptina, NPY, 17β-estradiol, hipotálamo, adenohipófisis, ovario, proceso ovulatorio, JAK2/STAT3, ERK1/2, SOCS3.

Abstract:
Leptin, a 16 kDa protein synthesized and secreted mainly by adipocytes, modulates the reproductive function. The aims of the present work were to investigate the expression of leptin receptors in the hypothalamic-pituitary-ovarian axis, and to assess whether different levels of leptin in this axis were able to modulate the expression of both the long and the shorts isoforms of its receptors. Moreover, we also evaluated the direct effects of some factors involved in the reproductive function, like NPY and 17β-oestradiol, on the expression of these receptors in the hypothalamic-pituitary axis. Immature rats primed with gonadotropins were used and either in vivo or in vitro assays were performed to evaluate the expression of both RNA messenger (RT-PCR) and proteins (western blot) of the leptin receptors. Gonadotropins and leptin were able to regulate the expression of RNA messenger and proteins of both isoforms in the reproductive axis in a differential way and in a dose and tissue dependent manner. Furthermore, NPY and 17β-oestradiol up-regulated the receptor expression in the hypothalamic-pituitary axis by the interaction with the receptor Y type 1 and the oestrogen receptors α and/or β, respectively. Leptin is able to both stimulate and inhibit the ovarian function and this effect could be induced by a differential activation of its receptors. Thus, we investigated whether changes in the signalling pathways, mediated by JAK2/STAT3 or ERK1/2 and the SOCS3 expression (western blot), were involved in this biphasic response in the hypothalamic-pituitary-ovarian axis during the ovulatory process. Immature rats primed with gonadotropins received one of the following treatment: i) acute treatment, in which the rats received five ip injection of leptin (5 μg each) or vehicle during the ovulatory process, and ii) daily treatment, at 22 days of age, in which the rats received an ip injection of leptin (3 μg) or vehicle per day for 12 days. We found that the acute treatment, which inhibits the ovulatory process, caused a reduction in the expression of p-ERK1/2 in hypothalamus, pituitary and ovary; p-STAT3 in pituitary and ovary; and an increase in SOCS3 expression in pituitary and ovary. The daily treatment, which induces the ovulatory process, increased the expression of both p-STAT3 and p-ERK1/2 in hypothalamus and ovary; caused a reduction of SOCS3 expression in the ovary; but no changes were found in pituitary. In vitro studies were performed to evaluate a direct effect of leptin on those signaling pathways in the ovarian tissue. Leptin was able to activate both STAT3 and ERK1/2 in the presence of physiological levels, but only STAT3 at high concentrations. In addition, the expression of SOCS3 protein increased at high levels of leptin. These results indicate that gonadotropins, leptin, NPY and 17β-oestradiol are able to modulate the responsiveness to leptin by regulating the expression of its receptors. Furthermore, changes in different signaling pathways throughout the reproductive axis, induced by different levels of leptin may be, at least in part, responsible for the positive or negative effects of leptin on the ovulatory process. Key words: Leptin receptor, leptin, NPY, 17β-oestradiol, hypothalamus, pituitary, ovary, ovulatory process, JAK2/STAT3, ERK1/2, SOCS3.

Ernesto, Juan Ignacio. "Caracterización de distintos miembros de la familia de proteínas CAP en tracto reproductor masculino y femenino y su participación en el proceso de fertilización" (2012-10) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
A pesar de la importancia del proceso de fertilización, es aún muy escasa la información disponible acerca de las moléculas involucradas. Las evidencias de nuestro laboratorio indican que las proteínas de la familia CRISP, miembro de la superfamilia CAP, serían claros mediadores del proceso de interacción de gametas. Teniendo en cuenta que las CRISP se expresan principalmente en el tracto reproductor masculino, el primer objetivo de esta Tesis ha sido investigar si las mismas también se expresan en el tracto reproductor femenino y cumplen un rol en el proceso de fertilización. Los resultados obtenidos utilizando los modelos de rata y ratón indicaron que mientras CRISP1 se encuentra presente en útero, oviducto, ovario, y células del cúmulus, CRISP2 se detecta sólo en ovario, y CRISP4 no se expresaría en el tracto de la hembra. Ensayos de fertilización in vitro utilizando espermatozoides y COC (complejos ovocito-cúmulus) provenientes de ratones knockout para CRISP1 indicaron que la proteína presente en el cúmulus cumpliría una función en el proceso de fertilización. Estudios posteriores revelaron que CRISP1 exhibe propiedades quimioatractantes hacia los espermatozoides, sugiriendo que éste podría ser el mecanismo por el cual CRISP1 del cúmulus participa en el proceso de fertilización. Dada la gran homología entre las CRISP y las GLIPR1, las cuales constituyen las dos familias mejor caracterizadas de la superfamila CAP, el segundo objetivo de este trabajo consistió en estudiar la presencia de proteínas GLIPR1 en el tracto reproductor masculino y su participación en la fertilización. Los resultados indicaron la expresión de GLIPR1L1 a nivel testicular y de GLIPR1L2 tanto en testículo como en epidídimo de ratón. La generación de ambas proteínas en forma recombinante y de sus correspondientes anticuerpos confirmó la presencia de las mismas en el espermatozoide y su participación específica en la primera etapa de unión a la zona pellucida. La información obtenida acerca del rol de las proteínas CRISP y GLIPR1 contribuirá a una mayor comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la interacción de gametas como así también al desarrollo de futuros métodos de regulación de la fertilidad tanto en animales como en el humano.

Abstract:
Despite the importance of the fertilization process, there is still little information about the molecules involved in it. Evidence from our laboratory indicates that proteins from de CRISP family, members of the CAP super family, would be clear mediators of the gamete interaction process. Considering that the CRISP are expressed primarily in the male reproductive tract, the first objective of this thesis was to investigate whether these proteins are expressed in the female reproductive tract and if they play a role in the fertilization process. The results indicated that while CRISP1 is present in uterus, oviduct, ovary and cumulus cells, CRISP2 is detected only in the ovary and CRISP4 is not expressed is the female reproductive tract. In vitro fertilization assays using both sperm and COC (oocyte-cummulus complex) from CRISP1 knockout mice indicated that the protein present in the cumulus fulfill a role in the fertilization process. Further studies revealed that CRISP1 exhibit sperm chemoattractant properties, suggesting that this might be the mechanism by which CRISP1 present in the cumulus participates in the fertilization process. Given the high homology between CRISP and GLIPR1, which are the two best characterized families from the CAP super family, the second objective of the present work was to study the presence of GLIPR1 proteins in the male reproductive tract and their participation in the fertilization process. Our results indicated that GLIPR1L1 is expressed in the testis while GLIPR1L2 is present in the testis and the epididymis. The generation of both recombinant proteins and their corresponding antibodies confirmed the presence of these proteins in the sperm (human and mouse) and their specific involvement in the first stage of binding to the zona pellucida. The information obtained about the role CRISP and GLIPR1 proteins will contribute to a greater understanding of the molecular mechanisms involved in gamete interaction as well as to the development of future methods to regulate fertility both in animals and humans.

Elguero, María Belén. "Rol de HO-1 en la regulación de la inflamación asociada al cáncer de próstata. Compartimentalización subcelular y función" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por esta enfermedad entre los hombres occidentales. Los andrógenos y el receptor de andrógenos (AR) son críticos para el desarrollo del PCa. El AR recluta varios co-activadores/co-represores y factores de transcripción modificando la expresión de genes blanco. Se han identificado varios mecanismos que activan al AR entre ellos la vía de señalización de STAT3. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron la expresión nuclear de HO-1 en carcinomas primarios de próstata. In vitro la inducción de HO-1 disminuyó la proliferación, la invasión y la migración celular y retardó el crecimiento tumoral y la angiogénesis in vivo. Nuestra hipótesis es que HO-1 podría actuar como un co-regulador de receptores nucleares o bien modificar el microambiente tumoral modulando la expresión de factores que actuarían como coreguladores. En este trabajo de tesis nos propusimos investigar si HO-1 afecta la actividad transcripcional del AR a través del eje STAT3. Demostramos que la inducción de HO-1 en las células de PCa reprime la activación del AR, disminuyendo la actividad del promotor y los niveles del ARNm del antígeno prostático específico (PSA). Comprobamos que la sobreexpresión de HO-1 induce arresto del ciclo celular en G2/M. Mediante inmunoprecipitación de la cromatina determinamos que HO-1 se asocia a promotores génicos, revelando una nueva función nuclear para esta proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación mostramos que HO-1 y STAT3 interaccionan directamente. Por medio de microscopía confocal demostramos que HO-1 provoca la retención citoplasmática de STAT3. El tratamiento con hemina (inductor específico de HO-1) impidió la inducción de la expresión de los genes targets de STAT3, coincidente con la disminución de los niveles de pSTAT3 en el núcleo. Estudios in vivo confirmaron la reducción de la localización nuclear de STAT3 en los xenotransplantes de células PC3 que sobre-expresan HO-1. Adicionalmente, NFκB, un factor relevante en la inflamación y que forma complejos con STAT3, también queda inactivo retenido en el citoplasma cuando se induce HO-1. Estos resultados proveen una función nueva para HO-1 reprimiendo la actividad transcripcional del AR en PCa e interfiriendo con la señalización de STAT3. Estos hallazgos sustentan nuestra proposición acerca del nuevo rol que posee HO-1, más allá de su actividad catalítica.

Abstract:
Activation of the androgen receptor (AR) is a key step in the development of prostate cancer (PCa). Several mechanisms have been identified in AR activation, among them signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling. Recent studies suggest that heme oxygenase 1 (HO-1) may play a key role in PCa, independent of its catalytic function. We sought to explore whether HO-1 operates on AR transcriptional activity through the STAT3 axis. Our results display that HO-1 induction in PCa cells represses AR activation by decreasing the prostate-specific antigen (PSA) promoter activity and mRNA levels. We also show that HO-1 over expression in PC3 cells induces the arrest of the cell cycle in G2/M. Strikingly, this is the first report to show by chromatin immunoprecipitation analysis that HO- 1 associates to gene promoters, revealing a novel function for HO-1 in the nucleus. Furthermore, HO-1 and STAT3 directly interact as determined by co-immunoprecipitation studies. Forced expression of HO-1 increases in vitro and in vivo STAT3 cytoplasmic retention. When PCa cells were transfected with a constitutively active STAT3 mutant, PSA and STAT3 downstream target genes were abrogated under hemin treatment. Additionally, a significant decrease in pSTAT3 protein levels was detected in the nuclear fraction of these cells. Confocal microscopy images exhibit a decreased rate of AR/STAT3 nuclear colocalization under hemin treatment. The inflammatory key factor NFκB was shown to interact with both STAT3 and AR and its nuclear translocation was impaired by hemin treatment. These results provide a novel function for HO-1 down-modulating AR transcriptional activity in PCa cells, interfering with STAT3 signaling, evidencing HO-1 role beyond heme degradation.

Gómez, Natalia Valeria. "MAP quinasa fosfatasa-2 (MKP-2): regulación hormonal y rol funcional en células de Leydig" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La hormona luteinizante (LH) regula las funciones de las células de Leydig, principalmente la esteroidogénesis, a través de un mecanismo que incluye la activación de PKA y ERK1/2. Las MAPK fosfatasas (MKPs, MAP Kinase Phosphatase) desfosforilan específicamente a las MAPKs (MAP Kinase) y, consecuentemente, regulan procesos fisiológicos dependientes de MAPK. En este trabajo se demostró que, en células de Leydig MA-10, la activación del receptor de LH con gonadotrofina coriónica humana (hCG) o el aumento de AMPc intracelular provocan la acumulación de MKP-2 y su translocación al núcleo. La acumulación es consecuencia de la activación transcripcional y de la estabilización de la proteína por modificaciones posttraduccionales. El bloqueo de la expresión de MKP-2 mediante un shARN – desarrollado en el marco de este trabajo– aumentó la fosforilación de ERK1/2 inducida por AMPc, particularmente a tiempos prolongados de estimulación. El bloqueo de la expresión de MKP-2 también aumentó la actividad del promotor y los niveles del ARNm correspondiente al gen CYP11A1, que codifica para una enzima esteroidogénica y se induce por LH/hCG vía ERK1/2. Se concluye que LH/hCG regula estrictamente la expresión de MKP-2 para controlar la fase terminal de actividad de ERK1/2 y “apagar” la expresión de genes inducidos por LH vía ERK1/2.

Abstract:
The Luteinizing hormone (LH) regulates Leydig cell functions, mainly steroid synthesis, through a mechanism including PKA and ERK1/2 activation. MKPs (MAP Kinase Phosphatases) specifically dephosphorylate MAPKs (MAP Kinases) and, consequently, regulate MAPK-dependent physiological processes. The aim of this work was to analyze the regulation and function of MKP-2 in MA-10 Leydig cells. Results show that the increase in intracellular cAMP and the activation of the LH receptor with human Chorionic Gonadotropin promote MKP-2 accumulation and protein translocation to the nucleus. This accumulation results from gene transcription activation and posttranslational modifications that increase protein stabilization. The specific downregulation of MKP-2 by a shRNA –developed as part of this work– increased cAMPinduced ERK1/2 phosphorylation, particularly after prolongued stimulation. MKP-2 down-regulation by shRNA also increased both the promoter activity and mRNA levels of CYP11A1, which codifies for a steroidogenic enzyme induced by LH/hCG through an ERK-dependent mechanism. These findings demonstrate that LH/hCG tightly regulates MKP-2 expression to control the terminal phase of ERK1/2 activity and “turn off” the expression of LH/ERK-dependent genes.

Calderazzo Pereyra, Julio César. "Consecuencias de mutaciones y polimorfismos sobre la actividad de ADAMTS13" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los objetivos de esta tesis fueron: 1- Optimizar la amplificación de los 29 exones correspondientes al gen de ADAMTS13 y realizar la secuenciación completa del gen en pacientes con PTT congénita y 2- Realizar la expresión “in vitro" de la primera nueva mutación descripta en Argentina A4085T (sustitución de un ácido aspártico (D) por una valina (V) en la posición 1362). Evaluar la actividad proteolítica intra y extracelular de la ADAMTS13 resultante para analizar cómo impacta sobre los mecanismos de biosíntesis y secreción de la ADAMTS13. Los experimentos se realizaron en cultivos de células HEK 293 transfectadas con las construcciones plasmídicas de la secuencia WT y del mutante A4085T sintetizado a partir del plásmido WT por mutagénesis sitio-dirigida para evaluar cuál es el dominio afectado y cómo impacta sobre los mecanismos de biosíntesis y secreción de la ADAMTS13. Estos estudios ayudaron a una mejor evaluación del exón 29 del dominio CUB-2. Para medir el antígeno y la actividad de ADAMTS13 en células, sobrenadantes y células transfectadas con vector de expresión de ADAMTS13 WT y de A4085T, se utilizaron técnicas de ELISA con sustratos cromogénicos, técnicas de SDS-PAGE, inmuno-transferencia y microscopia de inmunofluorescencia. Se observó que la mutación produce acumulación intracelular de ADAMTS13. La nueva mutación D1362V identificada en el dominio CUB-2 codificada por el exón 29, donde aún no se han reportado mutaciones de sentido erróneo, produce una deficiencia plasmática de ADAMTS13 que estaría inducida por una secreción reducida de la proteasa a la circulación.

Abstract:
The aims of this thesis were: 1- To optimize the amplification of the ADAMTS13 gene 29 exons, and to perform the complete sequencing of this gene in patients with hereditary TTP, and 2- To perform the in vitro expression of the first new mutation described in Argentina, A4085T (substitution of an aspartic acid for valine at position 1362). The resulting ADAMTS13 intra and extracellular proteolytic activity will be evaluated to analyze its impact on ADAMTS13 biosynthesis and secretion mechanisms. The experiments were performed in cultures of HEK 293 cells transfected with plasmid constructions of the WT sequence, and of the A4085T mutant synthesized from the WT plasmid through site-directed mutagenesis, in order to evaluate which the affected domain is and how it impacts on ADAMTS13 biosynthesis and secretion mechanisms. These studies have helped to improve the evaluation of exon 29 at CUB-2 domain. ADAMTS13 antigen and activity on cells, supernatants and cells transfected with expression vector of ADAMTS13 WT and of A4085T, were measured by ELISA with chromogenic substrates, SDS-PAGE, immune transference technics applied and immunofluorescence microscopy. It was observed that the mutation produces intracellular accumulation of ADAMTS13. The new D1362V mutation identified in CUB-2 domain and encoded by exon 29, where no missense mutations have been reported yet, produces a plasmatic deficiency of ADAMTS13 that could be induced by a reduced secretion of circulating protease.

von Bilderling, Catalina. "Detección, localización y análisis de eventos singulares de reconocimiento molecular mediante microscopías avanzadas" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células pueden ser concebidas como dispositivos capaces de procesar información bioquímica, cuya respuesta al entorno depende del estado funcional de proteínas organizadas espacialmente en una compleja red. Entender la función celular integrando la actividad molecular con la organización espacial representa un gran desafío para la biología moderna. Las fuerzas mecánicas tienen un papel importante en la organización, crecimiento, maduración y función de los tejidos. A nivel celular la transmisión de las fuerzas externas, a través de las adhesiones focales (FAs) y uniones adherentes, parece controlar la maduración o el ensamblado de estas adhesiones e iniciar las cascadas de señalización. En respuesta a las fuerzas aplicadas externamente, las células reacondicionan activamente la organización y la actividad contráctil del citoesqueleto y redistribuyen sus fuerzas intracelulares. Con el objetivo de estudiar la regulación dinámica de los contactos adhesivos y la arquitectura del citoesqueleto de la célula así como su influencia en la señalización celular, en este trabajo de Tesis se estudió la relación entre una fuerza (local o global) aplicada a la célula y el ensamblado, mecánica y dinámica de las adhesiones focales. El objetivo principal de este trabajo fue estudiar la respuesta dinámica de las proteínas de las FAs ante un estímulo mecánico controlado. En este contexto, se implementaron y desarrollaron técnicas de Microscopía de Fluorescencia, Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) y Espectroscopía de Fuerza (FS) aplicadas a distintos sistemas biomoleculares, desde plataformas biomiméticas hasta células vivas. Se optimizaron las mediciones de fuerza a nivel intermolecular y se investigaron la dinámica de las proteínas y las interacciones proteína-proteína en las FA de células vivas. Se implementó la FS mediante el estudio de las fuerzas de interacción entre grupos funcionales químicos y el sistema modelo ligando-receptor, biotina-estreptavidina. Se logró caracterizar la fuerza de interacción a nivel de moléculas individuales entre el sitio de unión RGD de la fibronectina y su receptor, la proteína integrina, en la membrana de células HC11 in vivo. Se obtuvo una fuerza característica de ruptura del complejo RGD-integrina de (37.6 ± 0.7) pN. Se expresaron las proteínas de las FAs zixina, vinculina, FAK, paxilina, integrina y actina unidas a proteínas fluorescentes visibles (VFPs) en células epiteliales mamarias de ratón HC11. Se diseñó y construyó un dispositivo estirador de células, para explorar la relación entre un estímulo mecánico global y los cambios en la dinámica y en las interacciones entre las proteínas. Mediante técnicas de microscopía de fluorescencia como FRAP (Recuperación de la Fluorescencia luego del Fotoblanqueo), FRET (Transferencia de Energía Resonante de Förster) y N&B (Número y Brillo), se estudió el estado mecánico general de las FAs, determinando la tasa de disociación de las proteínas a las FAs (koff) y el estado de agregación de las mismas. Se trabajó en la adaptación de un microscopio combinado AFM/ Fluorescencia desarrollado en el Laboratorio de Electrónica Cuántica (FCEN-UBA) para su utilización en condiciones fisiológicas y con células vivas. Se demostró que dicho microscopio es capaz de obtener imágenes combinadas en condiciones fisiológicas, con alta calidad óptica y con un rango vertical para AFM que permite que la visualización de células in vivo sea de rutina. Mediante la medición de las fuerzas de interacción entre el par ligando-receptor biotina-estreptavidina, se corroboró que el microscopio combinado alcanza la resolución requerida para cuantificar fuerzas de interacción entre moléculas individuales. Utilizando este nuevo microscopio combinado, se estudió mediante fluorescencia la evolución temporal de las proteínas de las FAs, zixina y vinculina, en respuesta a un estímulo mecánico local aplicado por AFM con un sensor de fuerza funcionalizado. Se observó el remodelado de las FAs maduras y el reclutamiento de la proteína vinculina para la formación de nuevas FAs en respuesta a la fuerza local aplicada. En este contexto, se presenta una estrategia novedosa que permite obtener imágenes de alta resolución y medir fuerzas al nivel de moléculas individuales en tiempo real. Nuestra estrategia combina metodologías de alta resolución para sensar y caracterizar cambios físicos/bioquímicos en células vivas. En conclusión, se implementaron técnicas de AFM y fluorescencia para estudiar algunos aspectos de la compleja maquinaria celular. De la correlación directa de estas técnicas en el nuevo microscopio combinado estaríamos en condiciones de abordar nuevos desafíos fundamentales en el entendimiento de la biofísica y la biología celular.

Abstract:
The cell can be conceived as a biochemical information-processing device whose response to the environment depends on the state of spatially organized networks of protein activities. Understanding cell function by integrating molecular activities with spatial organization is an important challenge for modern biology. Mechanical forces play an important role in the organization, growth, maturation, and function of living tissues. At the cellular level, many of the biological responses to external forces originate at two types of specialized structures: focal adhesions and adherent junctions. In order to explore the dynamic regulation of adhesive contacts and of the cytoskeleton architecture of cells, as well as its resultant influence on cellular activities, we are focused on the relationship between local force applied to the cell and the assembly, mechanics and dynamics of focal adhesions (FA). The goal of our work is to study the dynamic response of FA proteins when a precise and punctual force is applied. In this context, we have applied Fluorescence Microscopy (FM), Atomic Force Microscopy (FM) and Force Spectroscopy (FS) techniques on different biomolecular systems -from biomimetic platforms to living cells- in order to optimize force measurements at the intermolecular level and investigate protein dynamics and protein-protein interactions on FA of living cells. We have implemented FS measurements by studying the interaction forces between chemical functional groups and the well known ligand-receptor pair, biotinstreptavidin. We were able to characterize the fibronectin binding site RGD-integrin interaction at the single molecule level by measuring rupture forces between RGD functionalized probe-tips and the integrin receptors in the membrane of living HC11 cells. We found a characteristic interaction force of (37.6 ± 0.7) pN for the single RGDintegrin complex. We have expressed in HC11 epithelial mammalian living cells the FA component proteins zyxin, vinculin, FAK, paxilin, integrin and actin tagged with visible fluorescent proteins (VFPs), and also designed and constructed a cell stretching device to explore the relationship between a global mechanical stimulus and changes in protein dynamics and interactions. By fluorescence techniques such as fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), Förster Resonance Energy Transfer (FRET) and Number and Brightness (N&B), we studied the mechanical state of the FAs, determining the dissociation rate constant parameter (kOFF) and the aggregation state of different FAs proteins. We worked on the adaptation of a combined AFM/Fluorescence microscope, designed and assembled at the Quantum Electronics Lab (FCEyN-UBA) for working under physiological conditions in liquid environments. The combined microscope was tested and validated by successfully imaging of living cells. We also validated the possibility of measuring interaction forces based on molecular recognition of the pair biotin-streptavidin. With this novel combined microscope we studied by fluorescence the temporal evolution of the FAs proteins, vinculin and zyxin, in response to a mechanical local and functional stimulus applied with an AFM force-probe. We were able to observe the remodeling of mature FAs and the recruitment of vinculin to form nascent FAs in response to the locally applied force. In this context, we present a new approach that can be employed for real-time, high-resolution imaging and measurements of forces at the single molecule level. Our strategy combines very highly sensitive technologies for probing and detection of biochemical/physical changes within living cells. In summary, we implemented both AFM and fluorescence techniques to study some aspects of the complex molecular machinery of the cell. From the direct correlation of these techniques in the new combined microscope we may now afford a new level of insight into cell biology and biophysics.

Bonfiglio, Juan José. "Mecanismos moleculares involucrados en la señalización celular de la hormona CRH en el sistema nervioso central" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La hormona liberadora de corticotrofina (CRH) juega un rol clave en la coordinación de la respuesta neuroendocrina, autonómica, inmune y comportamental frente al estrés. Se ha visto que el receptor de CRH de tipo 1 (CRHR1) estimulado por CRH activa ERK1/2 en función del contexto celular. En trabajos previos realizados en nuestro laboratorio, demostramos que CRH activa ERK1/2 en zonas límbicas del cerebro de ratón (hipocampo y amígdala basolateral). ERK1/2 es un mediador esencial de los procesos fisiológicos del hipocampo, incluyendo el comportamiento emocional, la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la memoria. Para dilucidar los mecanismos moleculares mediante los cuales CRH activa ERK1/2 en neuronas del hipocampo, utilizamos una línea celular ampliamente empleada como modelo neuronal hipocampal, las HT22. En este trabajo demostramos por primera vez que la activación de ERK1/2 en respuesta a CRH es de tipo bifásica, con una primera fase mediada por cAMP y B-Raf, y una segunda fase que depende fundamentalmente de la proteína β-arrestina2 y de la internalización de CRHR1. Teniendo en cuenta el hecho de que las interacciones biomoleculares juegan un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, decidimos analizar el interactoma de B-Raf mediante estudios de espectrometría de masa. En una primera etapa describimos el interactoma de B-Raf en células en estado basal. Habiendo encontrado interactores de esta MAPKKK que podrían ser componentes clave en la regulación de la señalización vía B-Raf- MEK1/2-ERK1/2, nos propusimos, en una segunda etapa, estudiar complejos proteicos asociados a B-Raf después de la activación de CRHR1 a tiempos cortos, donde B-Raf juega un rol clave. Usando herramientas farmacológicas y moleculares, evaluamos el impacto funcional de algunas de las proteínas identificadas en asociación a B-Raf en dichos tiempos cortos. Nuestros resultados indican que las proteínas 14-3-3, PKA, y Rap1, son esenciales para la etapa temprana de activación de ERK1/2 inducida por CRH, mientras que dinamina y vimentina son necesarias para la fase dependiente de la internalización de CRHR1. Demostramos que ambas fases de pERK1/2 dependen de la entrada de calcio y se ven afectadas por la inhibición de la CaMKII. Por lo tanto, este trabajo describe la dinámica y la naturaleza bifásica de la activación de ERK1/2 río abajo CRHR1 en un contexto neuronal e identifica nuevos componentes críticos de la maquinaria de señalización de CRHR1 que controlan selectivamente, o bien la fase temprana, o bien la fase tardía de la activación de ERK1/2, proporcionando así nuevos posibles blancos terapéuticos para trastornos relacionados con el estrés.

Abstract:
Corticotropin-releasing hormone (CRH) is a key regulator of neuroendocrine, immune, autonomic and behavioral response to stress. CRH-stimulated CRH receptor 1 (CRHR1) activates ERK1/2 depending on intracellular context. In a previous work from our laboratory, we demonstrated that CRH activates ERK1/2 in limbic areas of the mouse brain (hippocampus and basolateral amygdala). ERK1/2 is an essential mediator of hippocampal physiological processes including emotional behavior, synaptic plasticity, learning and memory. To elucidate the molecular mechanisms by which CRH activates ERK1/2 in hippocampal neurons, we employed the mouse hippocampal cell line HT22, widely used as a model of hippocampal neuronal cells. We document for the first time that ERK1/2 activation in response to CRH is biphasic, involving a first cAMP and B-Raf-dependent early phase, and a second phase that critically depends on CRHR1 internalization and β-arrestin2. Considering the fact that biomolecular interactions play a crucial role in many cellular processes, we decided to analyze the B-Raf interactome by means of mass spectrometry analysis. In a first step, we described the B-Raf interactome in non-stimulated cells. Having found interactors of this MAPKKK which could be key components in the regulation of the B-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway, we decided, in a second stage, to study the B-Raf partners after CRHR1 activation at short times, where B-Raf plays a key role. Using molecular and pharmacological tools, the functional impact of selected B-Raf partners in CRH-dependent ERK1/2 activation was dissected. Our results indicate that 14-3-3 proteins, PKA, and Rap1, are essential for early CRHinduced ERK1/2 activation, whereas dynamin and vimentin are required for CRHR1 internalization-dependent phase. Both phases of ERK1/2 activation depend on calcium influx and are affected by CaMKII inactivation. Thus, this report describes the dynamics and biphasic nature of ERK1/2 activation downstream neuronal CRHR1 and identifies several new critical components of the CRHR1 signaling machinery that selectively controls the early and late phases of ERK1/2 activation, thus providing new potential therapeutical targets for stress-related disorders.

Tkach, Mercedes. "Desarrollo de una inmunoterapia contra el cáncer de mama mediante el bloqueo de stat3 (proteína transductora de la señal y activadora de la transcripción 3)" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La proteína transductora y activadora de la transcripción 3 (STAT3) es un nodo de señalización para múltiples vías oncogénicas y se encuentra frecuentemente activada en diversos tipos de cánceres, incluyendo el de mama. Las evidencias experimentales y clínicas vinculan a los progestágenos con la carcinogénesis mamaria. Por ello, estudiamos la participación de los progestágenos en la activación de STAT3. En esta Tesis demostramos que los progestágenos inducen la fosforilación de STAT3 en el residuo serina 727 por medio de la activación de la vía c-Src/p42/p44 MAPK y que ésta fosforilación es necesaria para su completa activación transcripcional y para promover la proliferación tumoral mediada por progestágenos. Por otro lado, considerando que la inhibición de STAT3 en células tumorales induce la expresión de citoquinas y quimioquinas pro-inflamatorias, desarrollamos una inmunoterapia basada en la utilización de células de cáncer de mama que tienen inhibida la activación de STAT3 como inmunógeno. La administración de estas células en ratones indujo una respuesta anti-tumoral mediada por células T CD4+ y células NK citotóxicas que inhibió el crecimiento del tumor primario y la de sus metástasis. Además, la inhibición de la activación de STAT3 indujo un programa de senescencia celular, contribuyendo probablemente con su fenotipo inmunogénico. Los resultados expuestos demuestran el papel crítico de STAT3 en la tumorigénesis mamaria inducida por progestágenos y proporcionan las primeras evidencias preclínicas que la inhibición de STAT3 en células de cáncer de mama resulta en inmunoterapia eficaz contra el crecimiento tumoral.

Abstract:
Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is a signaling node of multiple oncogenic pathways and is therefore frequently activated in breast cancer. As experimental and clinical evidence reveals that progestins are key players in controlling mammary gland tumorigenesis, we studied STAT3 participation in this event. In this Thesis we demonstrate that progestins induce STAT3 phosphorylation at Ser727 residue which occurs via activation of c-Src/p42/p44 mitogen-activated protein kinase pathways and that this phosphorylation is required for full transcriptional activation and for progestin-dependent tumor growth. Moreover, considering that STAT3 inhibition in tumor cells induces the expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines, we proposed to apply Stat3-inhibited breast cancer cells as a source of immunogens to induce an antitumor immune response. Immunization with these cells inhibited wild-type tumor growth and metastasis in vivo in BALB/c mice through the activation of cellular immune responses involving CD4+ T cells and cytotoxic NK cells. Furthermore, inhibition of STAT3 activation induced a cellular senescence program, which probably contributes to the inmunogenic phenotype. The results presented here demonstrate the critical role of STAT3 in progestin-dependent mammary tumorigenesis and provide preclinical proof of concept that ablating STAT3 signaling in breast cancer cells results in an effective immunotherapy against breast cancer growth and metastasis.

Naipauer, Julián. "Mecanismos moleculares involucrados en la regulación del ARN mensajero de Integrina Beta 1 en glándula mamaria" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las integrinas son receptores heterodiméricos de la superficie celular que juegan un papel crítico en el desarrollo normal y tumoral de los tejidos. Nuestros resultados muestran que el ARNm que codifica para la subunidad β1 de integrina (Itgb1) posee una señal (PAS1) y sitio de corte y poliadenilación alternativa que produce una isoforma del ARNm, 578 pares de bases más corta (Itgb1-C) que la isoforma reportada en las bases de datos. Esta isoforma no presenta en su 3’UTR, a diferencia de la isoforma larga (Itgb1-L) antes reportada, ni motivos ricos en AU ni secuencias blanco para miRNA que podrían estar implicados en la regulación de la estabilidad, localización y/o traducibilidad del ARNm. Hemos encontrado, además, que estas dos isoformas de Itgb1 se expresan de manera diferencial en los distintos tejidos de ratón analizados. Determinamos que la secuencia 3’UTR de la isoforma larga (Itgb1-L) es capaz de ser reconocida por proteínas de unión a secuencias ricas en AU (AUBP) que pueden modular su estabilidad. Encontramos también que las isoformas Itgb1-C e Itgb1-L se expresan de manera diferencial a lo largo de los distintos estadios del desarrollo de la glándula mamaria de ratón, la isoforma larga se encuentra estable durante la lactancia y en la diferenciación in vitro de células HC11. Por otro lado, la involución post-lactancia y el estiramiento de células HC11 disminuyó la expresión de esta isoforma y aumento la expresión de la isoforma corta. Por lo tanto, nuestros datos identifican una nueva instancia de regulación para el control de la expresión de Itgb1 durante del desarrollo de la glándula mamaria.

Abstract:
Integrins are heterodimeric cell surface adhesion receptors that play a critical role in tissue development. Characterization of the full length mRNA encoding the β1 subunit (Itgb1) revealed an alternative functional cleavage and polyadenylation site that yields a new Itgb1 mRNA isoform, 578bp shorter than that previously reported. Using a variety of experimental and bioinformatic approaches, we found that the two Itgb1 isoforms are expressed at different levels in a variety of mouse tissues, including the mammary gland, where they are differentially regulated at successive developmental stages. The longer mRNA species is privileged during lactation, while the shorter is induced after weaning. In 3D cultures, where expression of Itgb1 protein is required for normal formation of acini, experimental blockade of the longer isoform induced enhanced expression of the shorter species that allowed normal morphological mammary differentiation. The short isoform lacks AU-rich motifs and miRNA target sequences that are potentially implicated in the regulation of mRNA stability and translation efficiency. We further determined that the AU binding protein HuR appears to selectively stabilize the longer isoform in the mammary gland. In summary, our data identify a new regulatory instance involved in the fine‐tuning of Itgb1 expression during mammary gland development and function.

Angelo, María Florencia. "Papel del receptor RAGE en la determinación de la sobrevida neuronal en un modelo experimental de apnea del sueño por hipoxia intermitente" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Apnea del Sueño (AS) es un grave problema para la Salud Pública que afecta a una notable proporción de la población. En animales de laboratorio la AS se modela a través de la exposición a hipoxia intermitente (HI) que induce alteraciones neuronales, gliosis reactiva, expresión del receptor RAGE y de su ligando S100B en el SNC. En esta tesis, desarrollamos un modelo de exposición a HI en cultivos primarios de hipocampo de roedores y ello nos ha permitido disecar algunas de las rutas de señalización que serían responsables de la neurodegeneración y la gliosis reactiva que se observa en modelos experimentales de AS. Así, demostramos que la exposición a HI induce stress oxidativo, activación de HIF-1 y NF-κB, un fenotipo reactivo en la astroglía y el acortamiento de las neuritas. Estas alteraciones, que correlacionan con los cambios observados en los animales expuestos al modelo de AS por HI, fueron prevenidos por la aplicación en el medio de cultivo de anticuerpos neutralizantes de RAGE así como por la sobreexpresión de un dominante negativo de RAGE entregado por un vector viral o el bloqueo farmacológico de NF-κB y Akt. La manipulación experimental de los niveles de S100B no fue tan efectiva para reducir estas alteraciones. Basándonos en estos resultados utilizamos el mismo enfoque para intentar disminuir las alteraciones neuro-gliales en el modelo experimental de AS por HI en roedores. Así, el bloqueo de RAGE con anticuerpos neutralizantes administrados intrahipocampalmente o la expresión del dominante negativo de RAGE entregado por un vector viral, tanto como el bloqueo farmacológico de NF-κB fueron efectivos para disminuir la gliosis reactiva y la neurodegeneración. Estos resultados indican que RAGE y NF-κB estarían involucrados en las alteraciones neuronales y la gliosis reactiva inducidas por la AS. Estas rutas de señalización serian así interesantes blancos moleculares para el desarrollo de estrategias de neuroprotección útiles en la AS.

Abstract:
Sleep Apnea (SA) is a serious problem for Public Health that affects a prominent proportion of the population. In laboratory animals SA is mimicked by the exposition to Intermittent Hypoxia (IH) that induces neuronal alterations, reactive gliosis, RAGE receptor expression and its ligand S100B in the central nervous system (CNS). In this Thesis, we developed a model of IH exposition in primary cultures from rodent hippocampus and this has allowed us to dissect some of the signaling pathways that would be responsible of the neurodegeneration and reactive gliosis that is observed in SA models. Thus, we showed IH exposition induces oxidative stress, HIF-1 and NF-κB activation, astroglial reactive phenotype and neurite reduction. These alterations, that correlate with the observed changes in animals exposed to the AS model by IH, were prevented by culture medium application of RAGE neutralizing antibodies as well as RAGE dominant negative overexpression delivered by a viral vector or the NF-κB and Akt pharmacological blockade. The manipulation of S100B levels was not so effective to reduce these alterations. Attending these results, we used the same approach to diminish neuro-glial alterations in the SA experimental model by IH in rodents. Thus, RAGE blockade with hipocampal administered neutralizing antibodies or the RAGE dominant negative delivered by a viral vector, as well as the pharmacological blockade of NF-κB were effective to diminish reactive gliosis and neuronal degeneration. These results suggest that RAGE and NF-κB would be involved in the neuronal alterations and reactive gliosis induced by SA. These signaling pathways would be interesting molecular targets for the development of neuroprotection strategies useful for SA treatment.

Di Giorgio, Noelia Paula. "GABA y receptores GABA B en el eje reproductivo: su relación con GnRH y kisspeptinas" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Kisspeptina, GnRH y GABA juegan un papel fundamental en la regulación del eje gonadotrófico, si bien la interacción entre ellos está poco caracterizada. Estudios previos en ratones carentes del RGABAB funcional (GABAB1KO) sugerían alteraciones reproductivas, principalmente en la hembra. Nuestra hipótesis fue que GABA, a través de sus RGABAB, interviene en la regulación de la reproducción impactando sobre los sistemas GnRH/kisspeptina en el cerebro, durante el desarrollo y en la adultez. Demostramos por primera vez la co‐localización del RGABAB1 en neuronas Kiss1 del AVPV/PeN y ARC. La falta de un RGABAB funcional impacta diferencialmente según la edad evaluada. En ratones de 4 días de edad los cambios se observan en el hipotálamo medio basal, mientras que en ratones adultos aparecen en el hipotálamo anterior. Sin embargo, no se deberían a alteraciones hipotalámicas de Kiss1 ni a los niveles de esteroides circulantes. Además, los ratones GABAB1KO adultos presentaron un aumento drástico de Kiss1 en áreas extra hipotalámicas (MeA, BNST y Septum) relacionadas con la reproducción y la conducta sexual. En conclusión, GABA, a través de sus RGABAB, interactuaría con GnRH y kisspeptina en la regulación del eje gonadotrófico de manera diferencial durante el desarrollo y entre los sexos, alterando la reproducción.

Abstract:
Kisspeptin, GnRH and GABA play an important role in the control of the gonadotrophic axis, although the interaction between them is not well known. Previous studies in mice which lack of functional GABAB receptors (GABAB1KO) point to reproductive alterations, mainly in females. Our hypothesis was that GABA, through GABAB receptors (GABABRs), acts in the regulation of reproduction and impacts on the GnRH/Kisspeptin systems in the brain, along development and in adulthood. We demonstrated for the first time the co-localization of the RGABAB1 subunit in AVPV/PeN and ARC Kiss1 neurons. The lack of functional GABABRs impact differentially according to the stage of life evaluated. While at postnatal day 4 we observed changes in the medial basal hypothalamus, in adulthood we found them in the anterior hypothalamus. However, these changes were not due to alterations in hypothalamic Kiss1 or serum steroid levels. Moreover, adult GABAB1KO mice showed a dramatic increase in Kiss1 expression in extra-hypothalamic areas (MeA, BNST y Septum), which are related to reproduction and sexual behaviour. In conclusion, GABA, through GABABR, interacts with GnRH and kisspeptin in the regulation of the gonadotrophic axis in a different way between sexes and along development. Lack of GABABRs impairs normal reproduction in females.

Ferrando, María Mercedes Catalina. "HO-1 en la progresión ósea del cáncer de próstata" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por cáncer entre los hombres en Argentina. La angiogénesis es crucial para el crecimiento y progresión del PCa. El perfil de diseminación de estos tumores muestra tendencia a desarrollarse en el hueso como único sitio de progresión, donde las células tumorales interactúan con el microambiente interrumpiendo el equilibrio formación/degradación del hueso. Sin embargo, la naturaleza molecular de dicha interacción aún no se conoce completamente. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos que el aumento de expresión de hemo oxigenasa-1 (HO-1) en líneas de PCa disminuye su proliferación, invasión y migración in vitro y el crecimiento tumoral in vivo. En este trabajo de tesis nos propusimos estudiar el efecto de HO-1 sobre la angiogénesis y progresión del PCa. Comprobamos que la sobre-expresión de HO-1 en PC3 disminuye la expresión de genes pro-angiogénicos in vitro. Un ensayo de angiogénesis in vivo mostró que la inoculación intradérmica de las células con expresión estable de HO-1 (PC3HO-1), generaba tumores menos vascularizados, con reducida densidad de la microvasculatura e inmunomarcación disminuida de marcadores angiogénicos. Mediante un sistema de co-cultivo de células PC3 con cultivos primarios de osteoblastos de ratón (PMOs), comprobamos que la disminución de la proliferación de los PMOs inducida por las células tumorales, se restauraba cuando éstas fueron pre-tratadas con el inductor farmacológico de HO-1 (hemina). No se observaron alteraciones en la expresión de genes involucrados en la diferenciación y resorción ósea. Sin embargo, el tratamiento con hemina indujo DKK-1 en las células PC3 co-cultivadas y el estrés oxidativo y la vía de FoxO en los osteoblastos. Estos resultados se confirmaron utilizando explantes de calvarias. La inyección intra-ósea de PC3HO-1 produjo una robusta remodelación ósea. Mediante un microarray de tejidos derivados de metástasis de pacientes resistentes a la castración creciendo como xenotransplantes en ratones SCID se determinó que HO-1 presentaba inmunomarcación heterogénea. En conjunto, estos resultados demuestran que HO-1 es un factor clave para el control de la angiogénesis y altera el microambiente tumoral impactando sobre la progresión ósea del PCa.

Abstract:
Prostate cancer (PCa) is a leading cause of death among males. The switch to an angiogenic phenotype is known to be critical for its progression. PCa is dominated by complications arising from metastasis to the bone where the tumoral cells interact with the bone microenviroment impairing the balance between bone formation and degradation. However, the molecular nature of this interaction is not completely understood. Previous studies from our laboratory showed that heme oxygenase 1 (HO-1) expression decreased PCa cells proliferation, invasion and migration in vitro and decreased tumor growth in vivo. The goal of this thesis is to study the role of HO- 1 in PCa angiogenesis and progression. We demonstrated that pro-angiogenic genes were down-modulated in response to HO-1 over-expression in PC3 cells (PC3HO-1). An in vivo angiogenic assay showed that intradermic inoculation of PC3HO-1 cells generated tumors less vascularized, with decreased microvessel density and reduced expression of angiogenic markers. Using a co-culture system of PC3 cells with primary mouse osteoblasts (PMOs), we demonstrated that HO-1 pharmacological induction (hemin treatment) abrogated the diminution of PMOs proliferation induced by PCa cells. No changes were detected in the expression of genes involved in differentiation and bone resorption. However, co-culture of hemin pre-treated PC3 cells with PMOs induced DKK-1 expression in tumor cells and oxidative stress and FoxO signaling in osteoblasts. These findings were confirmed using a co-culture system of PCa cells with calvaria explants. In vivo bone injection of PC3HO-1 cells in the femur of SCID mice produced strong bone remodeling. Heterogeneous HO-1 immunoreactivity was detected in a tissue microarray of human prostate cancer metastasis from castrated resistant patients growing as xenografts in SCID mice. These results suggest that HO-1 is a key regulator of the angiogenic switch in PCa and has the potentiality to modify the bone micro-environment modulating PCa bone metastasis.

Buzzi, Lucila Inés. "Caracterización bioquímica y funcional de las dos UDP-Glc: glicoproteína glucosiltransferasas codificadas en el genoma de C. elegans" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT) es el sensor de la conformación de las glicoproteínas en el “Control de Calidad de Plegamiento de Glicoproteínas” ya que sólo presenta actividad sobre glicoproteínas que no se encuentran en su conformación nativa. Las glicoproteínas que presentan oligosacáridos monoglucosilados interaccionan con lectinas-chaperonas presentes en el Retículo endoplásmico (RE) como Calnexina y Calreticulina lo cual previene que los intermediarios de plegamiento inmaduros continúen su camino hacia el Aparato de Golgi. En C. elegans existen dos genes, uggt-1 y uggt-2, homólogos a los que codifican para las UGGT en diferentes organismos. La expresión de las proteínas UGGT-1 y UGGT-2 en S. pombe alg6 gpt1-, que carece de actividad de UGGT, permitió demostrar que uggt-1 codifica para una UGGT activa (CeUGGT-1), mientras que la proteína codificada por uggt-2 carece de actividad de UGGT (CeUGGT-2). Mediante la construcción de proteínas quiméricas, se determinó que el dominio C-terminal de CeUGGT-2 es incapaz de transferir glucosa a proteínas mal plegadas. El estudio del gusano mutante de uggt-2 (VC1961) reveló que CeUGGT-2 es esencial para la viablidad del nematodo ya que los gusanos uggt-2 -/- se arrestan en estadíos embrionarios y en L1 mostrando un tamaño menor y posibles defectos en la cutícula. Mediante Real Time PCR observamos que ambos genes se expresan durante todo el ciclo de vida de C. elegans. Mediante la construcción de gusanos transgénicos pudimos detectar expresión de CeUGGT-1 en todas las células y tejidos del nematodo. uggt-1 se induce en condiciones de estrés de RE a través de la vía de señalización de ire-1 en la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), mientras que uggt-2 no lo hace. El silenciamiento de la expresión de la proteína UGGT-1 y UGGT-2 por ensayos de RNAi produjeron un retraso en el desarrollo en gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) y resultaron en una disminución de la sobrevida de gusanos uggt-1(RNAi). CeUGGT-1 y CeUGGT-2 juegan un rol protector ante condiciones de estrés de RE ya que con 10 μg/ml de Tunicamicina (TN) se arrestó el crecimiento de gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) en L2/L3 pero no el de gusanos control. Además ensayos de RNAi a bajas concentraciones de TN en ausencia de ire-1, sugirieron que CeUGGT-2 es importante para aliviar los bajos niveles de estrés de RE en ausencia de esta vía de la UPR. Estos resultados indicarían que ambos homólogos de UGGT de C. elegans poseerían distintas funciones biológicas.

Abstract:
The UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (UGGT) is the sensor of glycoprotein conformations in the glycoprotein folding quality control as it exclusively glucosylates glycoproteins not displaying their native conformations. Monoglucosylated glycoproteins thus formed may interact with the lectin-chaperones calnexin and calreticulin. This interaction prevents premature exit of folding intermediates to the Golgi. Bioinformatic analysis showed that in C. elegans there are two genes, uggt-1 and uggt-2, coding for UGGT homologues. Expression of both genes in S. pombe mutants devoid of UGGT activity showed that uggt-1 codes for an active UGGT protein (CeUGGT-1). On the other hand, uggt-2 coded for a protein (CeUGGT-2) apparently not displaying a canonical UGGT activity and conversely to what happens in humans, the C-terminal domain of CeUGGT-2 is inactive. However, uggt-2 is not a pseudogene as we can detect its expression along the entire development. The study of the mutant worm VC1961 revealed that CeUGGT-2 is essential for viability. Worms uggt-2 -/- were arrested in embryonic and L1 stages and they showed smaller size and possible defects in the cuticle. Furthermore, Real-time PCR analysis showed that both uggt-1 and uggt-2 genes are expressed during the entire C. elegans life cycle. Moreover, transgenic worms constructed by fosmid recombineering technique carrying the gfp under the control of uggt-1 promoter indicated that that CeUGGT-1 is expressed in all cells and tissues of the nematode. uggt-1, but not uggt-2, is upregulated under ER stress through the ire-1 arm of the unfolded protein response (UPR). RNAi-mediated depletion of CeUGGT-1 but not of CeUGGT-2 resulted in a reduced lifespan and that of CeUGGT-1 and CeUGGT-2 in a developmental delay. We found that both CeUGGT1 and CeUGGT2 play a protective role under ER stress conditions, since 10 μg/ml tunicamycin (TN) arrested development at the L2/L3 stage of both uggt-1(RNAi) and uggt-2(RNAi) but not of control worms. Furthermore, we found that the role of CeUGGT-2 but not CeUGGT-1 is significant in relieving low ER stress levels simulated with TN in the absence of the ire-1 unfolding protein response signaling pathway. Our results indicate that both C. elegans UGGT homologues may have distinct biological functions.

Losino, Noelia Ivana. "Las células madre pluripotentes son propagadas en un medio de cultivo novedoso que preserva sus propiedades fundamentales y aumenta su proliferación, asociada a la presencia de una isoforma de fibronectina que incluye el exón EDA" (2013-03-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células madre (CM) pluripotentes, entre ellas, las CM embrionarias (CME) y CM pluripotentes inducidas (CMPI) son capaces de propagarse indefinidamente en cultivo y de diferenciarse a todos los tipos celulares del organismo. Encontramos un medio de cultivo que permite su propagación, preservando sus propiedades básicas, evaluadas por análisis de expresión de marcadores y diferenciación in vitro e in vivo; y aumentando paralelamente su proliferación. Este medio es condicionado por una línea celular de granulosa bovina, mitogénico sobre otros tipos celulares, adjudicándose dicho efecto a la fibronectina (FN) que incluye el exón EDA (FN+EDA). En este contexto, decidimos analizar si esta isoforma de FN aumenta la proliferación de las CME. Estudiamos los niveles de proliferación de las CME en presencia de EDA exógeno, mediante dos estrategias. Utilizamos medios condicionados por líneas de fibroblastos embrionarios de ratón genéticamente modificadas, que secretan sólo FN+EDA, FN sin EDA o ambas isoformas. Por otra parte, evaluamos el efecto de un péptido correspondiente a una porción de FN que incluye o no dicho exón. En todos los casos, observamos que la presencia de este dominio produjo un aumento en la proliferación en CME de ratón y humanas, evaluada por MTT, cristal violeta y ensayos de sanado de herida. Esperamos que nuestros hallazgos contribuyan al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la proliferación de CM y a la optimización de sus condiciones de cultivo.

Abstract:
Pluripotent stem cells, which include Embryonic Stem Cells (ESC) and induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) can be propagated indefinitely in culture and are able to differentiate into all cell types of the organism. We found a culture medium that allows their propagation, preserving their basic properties, evaluated by analysis of marker gene expression and in vitro and in vivo differentiation protocols. This medium also increased pluripotent stem cell's proliferation. This is a medium conditioned by a bovine granulosa cell line, previously reported to be mitogenic for other cell types, ascribing this effect to fibronectin (FN) containing EDA exon (FN+EDA). In this context, we decided to study if this FN isoform increases the proliferative rate of ESC. We studied the mitogenic effect on ESCs in the presence of exogenous EDA, by two strategies. We used conditioned media from genetically modified lines of mouse embryonic fibroblasts that secrete only FN+EDA, FN without EDA or both isoforms. Furthermore, we evaluated the effect of a peptide corresponding to a portion of FN comprising or not EDA exon. In all cases, we observed that the presence of this domain resulted in an increase in the proliferation rate of both mouse and human ESC, assessed by MTT, crystal violet, and wound healing assays. We hope that our findings contribute to the understanding of the molecular mechanisms involved in the proliferation of pluripotent stem cells and optimization of culture conditions.

Portal, Patricio. "Citocromo P450 reductasas y metabolismo redox en Trypanosoma cruzi" (2013-03-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La citocromo P450 reductasa (CPR) es una flavoproteína que coordina la transferencia de electrones desde el NADPH hacia distintas hemoproteínas, como los citocromo P450 (CYPs), el citocromo b5, y la hemooxigenasa. Los CYPs se encuentran involucrados tanto en la síntesis de compuestos endógenos, tales como esteroles y ácidos grasos, como en la activación y detoxificación de compuestos exógenos. Pese a que existen numerosos genes CYP funcionales en mamíferos, existe sólo una CPR en cada especie. La producción de una clase especial de esteroles, entre los que se incluyen el ergosterol y otros metil-esteroles, es una importante vía metabólica involucrada en el crecimiento y la viabilidad celular de microorganismos eucarióticos, como protozoos u hongos, que se encuentra ausente en mamíferos. En T. cruzi se han identificado y caracterizado bioquímicamente una familia de genes integrada por tres putativas CPRs, llamadas TcCPR-A, TcCPR-B y TcCPR-C, cuyas secuencias poseen los dominios conservados para FMN, FAD y NADPH. TcCPR-A carece del domino hidrofóbico amino terminal. La sobreexpresión de TcCPR-B en epimastigotes incrementa su resistencia a drogas, sugiriendo su participación en el metabolismo de detoxificación del parásito. En la búsqueda de un rol fisiológico para las TcCPRs, en el presente trabajo se analizó el efecto de la sobreexpresión de las mismas, centrándose principalmente en su posible participación en la biosíntesis de esteroles. Una cepa de Saccharomyces cerevisiae deficiente para CPR fue utilizada en ensayos de complementación con las TcCPRs recombinantes de T. cruzi. La baja tasa de crecimiento y la disminución de la resistencia al ketoconazole de la levadura mutante, lograron revertirse parcialmente sólo con TcCPR-B y -C. La sobreexpresión de TcCPR-A en células de epimastigotes resulta letal, produciendo un aumento del contenido de ADN, una morfología aberrante y numerosas alteraciones ultraestructurales. La sobreexpresión de TcCPRB y -C incrementó la biosíntesis de ergosterol y la relación NADP+/NADPH. Los parásitos transgénicos con mayor contenido de ergosterol presentaron un aumento en el orden de membrana, con la respectiva disminución de la endocitosis. Notablemente, TcCPR-B se ha encontrado en reservosomas mientras que TcCPR-C se ha localizado en el retículo endoplasmático. Los resultados obtenidos en esta Tesis junto al correspondiente análisis bibliográfico permiten proponer un rol para las TcCPRs en mecanismos de estrés (TcCPR-A), en reacciones de detoxificación (TcCPR-B) y en la biosíntesis de esteroles (TcCPR-C).

Abstract:
Cytochrome P450 reductase (CPR) is a flavoprotein that coordinates transfer of electrons from NADPH to various hemoproteins such as cytochrome P450 (CYPs), cytochrome b5, and heme oxygenase. CYPs are involved both in the synthesis of endogenous compounds, such as sterols and fatty acids, as in the activation and detoxification of exogenous compounds. Although there are numerous functional CYP genes in mammals, there is only one CPR in each species. Sterol production is an important metabolic pathway involved in cell growth and viability. Eukaryotic microorganisms such as protozoa and fungi produce a special class of sterols absent in mammals, including ergosterol and other methyl-sterols. It has been identified and biochemically characterized three putative CPRs in Trypanosoma cruzi, called TcCPR-A, TcCPR-B and TcCPR-C. These sequences have the characteristic conserved domains for FMN, FAD and NADPH. However TcCPR-A lacks the Nterminal hydrophobic domain. Overexpression of TcCPR-B epimastigotes of T. cruzi increased drug resistance, suggesting it involvement in detoxification metabolism of the parasite. In search for a physiological role of TcCPRs, function of these enzymes and the effect of overexpression were analyzed, focusing mainly on their possible involvement in sterol biosynthesis. A Saccharomyces cerevisiae mutant, CPR deficient strain, was used in complementation assays with recombinant TcCPRs. Only TcCPR-B and -C partially succeed to reverse low growth rate and decreased resistance to ketaconazole of the mutant. Overexpression of TcCPR-A is lethal in epimastigote cells, producing an increase in DNA content, aberrant morphology and numerous ultrastructural alterations. TcCPR-B and -C overexpression increased ergosterol biosynthesis and NADP+/NADPH ratio. Moreover, transgenic parasites present more ergosterol and higher membrane order, with a corresponding decrease in endocytosis. Notably, TcCPR-B was found in reservosomas, while TcCPR-C was located in the endoplasmic reticulum. Results obtained in this Thesis suggest a role for TcCPRs in stress mechanisms (TcCPR-A), in detoxification reactions (TcCPR-B) and in biosynthesis of sterols (TcCPR-C).

Risso, Guillermo Javier. "Regulación de la proteína quinasa Akt por conjugación a SUMO" (2013-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La proteína quinasa Akt está involucrada en una gran variedad de procesos celulares tales como supervivencia, crecimiento, proliferación, migración, angiogénesis, metabolismo, resistencia a estrés, entre otros. Durante el desarrollo de esta tesis doctoral descubrimos una nueva modificación post-traduccional para esta quinasa, la conjugación a SUMO. Realizando mutaciones puntuales pudimos mapear los sitios blanco de SUMOilation en esta proteína, los aminoácidos lisina 276 y 301. Una proteína doble mutante en K276R y K301R (2KR) mostró niveles disminuídos de SUMOilación. De modo interesante, la sobre-expresión de Akt1 2KR no aumenta, y hasta inhibe, los niveles de fosforilación de un patrón global de sustratos de Akt. En este sentido demostramos que la conjugación de SUMO a Akt es necesaria para la mayoría de los procesos estudiados en los que esta quinasa participa, tales como activación del factor de transcripción NFkB, regulación del splicing alternativo, progresión del ciclo celular y supervivencia celular. Sin embargo, la función inhibitoria de Akt sobre el factor de transcripción FOXO1 no depende de su SUMOilación. Por otro lado, alteraciones en los niveles de fosforilación de Akt1 no afectan los niveles de SUMOilación de esta quinasa, y viceversa. Por último observamos altos niveles de SUMOilación en una variante hiperactiva de esta quinasa (Akt E17K) encontrada en diferentes tumores humanos. Esta hiperactividad de Akt E17K se ve afectada por la disminución en sus niveles de SUMOilación. Estos resultados son muy alentadores y permitirán en el futuro intentar determinar la relación de la conjugación de SUMO a Akt con la participación de esta proteína en el desarrollo y progresión tumoral.

Abstract:
The protein kinase Akt is involved in a large variety of cellular processes such as survival, growth, proliferation, migration, angiogenesis, metabolism, stress resistance, among others. During the course of this thesis we discovered a new post-translational modification for this kinase, SUMO conjugation or SUMOylation. Performing point mutations we mapped the SUMO conjugation sites within this protein, the lysine residues 276 and 301. A double mutant protein K276R and K301R (“2KR”) showed lower levels of SUMOylation. Interestingly, over-expression of Akt1 2KR does not increase, and even inhibits phosphorylation levels of a global pattern of Akt substrates. In this regard, we demonstrated that SUMO conjugation to Akt is necessary for most of the studied processes in which this kinase participates, such as activation of the transcription factor NFkB, alternative splicing regulation, cell cycle progression and cell survival. However, the inhibitory role of Akt on FOXO1 transcription factor does not depend on its SUMOylation. Furthermore, alteration of Akt1 phosphorylation levels does not affect its SUMOylation levels and vice versa. Finally, we observed increased levels of SUMOylation in a hyperactive variant of this kinase (Akt E17K) found in various human tumors. This hyperactivity of Akt E17K is affected by the decrease on its SUMOylation levels. These results are very encouraging and will allow determining the connection between the conjugation of SUMO to Akt with the participation of this protein in tumor development and progression.

Fassolari, Matías. "Estudio funcional de la familia de enzimas Aurora quinasa en Trypanosoma cruzi" (2013-05-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Artuso, María Carolina. "Rol de los polisacáridos sulfatados y variantes del virus Herpes simplex tipo 1 en la patogenia viral" (2013-05-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El virus Herpes simplex (HSV) es responsable de una variedad de manifestaciones clínicas desde ulceras oro-faciales y genitales hasta encefalitis y alteraciones respiratorias. Los síntomas son usualmente autolimitantes pero pueden ser extensivos y prolongados en individuos inmunocomprometidos. En estos casos, puede requerirse una larga terapia antiviral, lo que resulta en la generación de virus resistentes a las drogas como el aciclovir (ACV). El HSV ingresa a las células mediante una interacción primaria entre las glicoproteínas virales y el heparán sulfato (HS), molécula presente en la superficie celular y en la matriz celular. Los carragenanos (CGNs) son polisacáridos sulfatados derivados de algas rojas cuya estructura es similar a la del HS. Ellos actúan como inhibidores potentes y selectivos de HSV, al bloquear la interacción de virus con su receptor primario en la etapa de adsorción viral. En estudios previos realizados en nuestro laboratorio se seleccionaron y caracterizaron variantes virales de HSV-1 cepa F. Éstas fueron obtenidas bajo presión de selección con un CGN natural μ/n denominado 1C3 de estructura relacionada con los CGNs kappa (k) e iota (ɩ)-(1C3syn14-1 y 1C3syn17-2). A fin de evaluar la reproducibilidad del método utilizado para generar las variantes virales se realizaron pasajes seriados de HSV-1 cepa KOS en células Vero en presencia de concentraciones crecientes de CGN ɩ o heparina (H). Se seleccionaron 4 clones, ɩ16-6, ɩ16-11, H17-5 y H17-16, los cuales exhibieron características similares en: resistencia relativa al compuesto usado durante el tratamiento selectivo y al ACV, al igual que su curva de replicación viral. Además, fueron menos virulentos que la cepa patrón en ratones BALB/c por inoculación intravaginal pero no por vía intranasal, a excepción de la variante ɩ16-11 que fue atenuada por ambas vías. Por otro lado, se profundizó el estudio de la caracterización citopática y patogénica de las variantes virales, derivadas de HSV-1 F, en mucosa respiratoria. Se demostró la activa participación de los macrófagos como protagonistas en la patología viral y se la correlacionó con la menor activación de citoquinas inflamatorias (TNF-α, IL-6) en relación con la cepa control. Alteraciones puntuales detectadas en el gen de la glicoproteína D de las variantes virales podrían ser parte responsable de la liberación disminuida de citoquinas proinflamatorias. Mientras que las moléculas de adhesión VCAM e ICAM no se vieron afectadas. Por otro lado se mostró, que el procedimiento empleado usando CGNs permitió la selección y/o modificación de los genes de la Timidina Quinasa y la ADN polimerasa sin alterar la resistencia viral al ACV. El conjunto de estos resultados indican que la regulación de los niveles de las citoquinas TNF-α e IL-6 juega un rol importante en la patología respiratoria de HSV y además que el método utilizado de obtención de las variantes permite la selección de virus con características estables. Estos resultados contribuyen a la caracterización de las variantes virales con el objetivo de profundizar los conocimientos de la respuesta inflamatoria en el tracto respiratorio luego de una infección por HSV. Palabras Claves: virus Herpes simplex, Carragenanos, variantes virales, atenuación, inmunopatología.

Abstract:
Herpes simplex virus (HSV) is responsible for a variety of clinic manifestations, from oro-facial and genital ulcers to encephalitis and respiratory disorders. Symptoms are usually self-limiting but they can be extensive and prolonged in immunocompromised patients. In these cases, it might be required a long antiviral therapy, resulting in the generation of drugresistant viruses such as Acyclovir-resistant viruses. HSV enters the cell by a primary interaction between viral glycoproteins and the heparan sulfate (HS), molecule present in the cell surface and cellular matrix. Carrageenans (CGN) are sulfated polysaccharides derived from red algae with a chemical structure similar to HS. CGN were identified as potent and selective inhibitors of HSV by blocking the interaction between the virus and HS during the adsorption. In previous studies carried out in our laboratory, viral variants from HSV-1 strain F were selected and characterized. They were obtained under selective pressure of the μ/n -1C3 natural CGN with a chemical structure related to the kappa (k) and iota (ɩ) CGNs (1C3syn14-1 and 1C3syn17-2). In order to evaluate the reproducibility of the method used to generate viral variants, serial passages were done with HSV-1 strain KOS in Vero cells in the presence of increasing concentrations of the ɩ CGN or heparine (H). Four clones were selected: ɩ16-6, ɩ16-11, H17-5 and H17-16, which exhibited similar characteristics such as relative resistance to the compound used for the selective treatment and ACV, as well as theirs viral replication curve. Furthermore, they were less virulent than the parental strain in BALB/c by intravaginal inoculation but not intranasally, except for the variant ɩ16-11 which was attenuated by both routes. On the other hand, the cytopathic and pathogenic effect of the viral variants, derived from HSV-1 F virus, were characterized in the respiratory mucosa. It was demonstrated that the active involvement of macrophages as key players in the viral pathology correlated with the lower release of the inflammatory cytokines (TNF-a and IL-6) in relation with the parental strain. Punctual mutations detected in the gene of glycoprotein D of the viral variants could be partially responsible for the low concentration of the inflammatory cytokines. Moreover, the expression of adhesion molecules VCAM and ICAM was not altered. It was also shown that the use of the CGN allowed the selection and/or modification of the Timidine Kinase and DNA polimerase genes without modifying resistance to ACV. All these results indicate that the regulation of TNF-a and IL-6 play a key role in the respiratory pathology of HSV and that the method used to obtain the viral variants allows the selection of virus with stable and attenuated characteristics. Results obtained in the present study contribute to characterize viral variants in order to extend the knowledge about the cellular inflammatory response induced in the respiratory tract by HSV-1. Keywords: virus Herpes simplex virus, Carrageenans, viral variants, attenuation, inmunopathology

Salinas, Silvina R.. "Caracterización bioquímica y estructural de glicosiltransferasas bacterianas" (2013-06-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los polisacáridos juegan un papel esencial en el metabolismo celular y en el funcionamiento de los organismos. Son sintetizados empleando enzimas glicosiltransferasas (GTs), cuyas propiedades determinan el tamaño y la estructura del producto final. Muchas GTs están localizadas en membranas celulares, dificultando su purificación y caracterización. En este trabajo de Tesis se estudian bioquímica y biofísicamente dos GTs que participan en la síntesis del polisacárido xantano producido por Xanthomonas campestris. La primer GT es GumI, de la cual sólo había escasos antecedentes genéticos. En esta Tesis se presenta la primera caracterización bioquímica y funcional de GumI, demostrando su actividad glicosiltransferasa previamente propuesta. Se realizaron ensayos de complementación funcional, demostrando su actividad manosiltransferasa in vivo. Además, se demostró que GumI está unida a la membrana, y que la interacción está mediada por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. GumI fue purificada y su actividad fue estudiada in vitro, obteniéndose los parámetros óptimos de reacción. GumI dio origen a una nueva familia, GT-94, en la clasificación Carbohydrate Active EnZymes. Finalmente, mediante ensayos de cristalización se obtuvieron agujas bidimensionales que al presente no fueron aptas para resolver la estructura de GumI por cristalografía de rayos-X. La segunda GT es GumK, cuya estructura cristalina se resolvió en el laboratorio y, como GumI, es una GT monotópica de membrana. Se profundizó sobre las bases moleculares de la unión a sus sustratos y a la membrana. Se realizaron diferentes mutaciones sobre la zona propuesta de unión a la membrana, demostrando la complejidad de dicha interacción. Además, se realizaron estudios por simulación computacional con el fin de obtener la estructura del complejo GumK/UDP-GlcA. El modelo obtenido explicaría la especificidad por este sustrato. Estudios realizados en este trabajo mediante diversas técnicas -tales como proteólisis limitada, fluorescencia, dicroísmo circular, calorimetría isotérmica de titulación, resonancia magnética nuclear y dispersión de rayos-X a bajo ángulo- sugieren fuertemente la presencia de cambios conformacionales disparados por la unión de UDP-GlcA.

Abstract:
Polysaccharides, which play a crucial role in cellular metabolism and in the performance of organisms, are synthesized by glycosyltransferase (GT) enzymes, whose properties determine the size and structure of the final product. Many GTs are localized in cellular membranes, difficulting their purification and characterization. In this Thesis, two GTs (GumI and GumK) which participate in the synthesis of the polysaccharide xanthan produced by Xanthomonas campestris were studied biochemically and biophysically. The genetic background data on GumI is limited. This Thesis reports the first functional and biochemical characterization of GumI, demonstrating its previously proposed glycosyltransferase activity. Functional complementation demonstrated its in vivo mannosyltransferase activity. Results also show that GumI is a membrane-associated protein, and that the interaction is mediated by hydrophobic and electrostatic forces. GumI was purified and its activity was studied in vitro, obtaining optimal reaction parameters. Finally, crystallization experiments allowed obtaining bidimensional needles, which were not suitable to resolve GumI structure by X-ray crystallography. GumK, whose structure was resolved in the laboratory, is a monotopic GT, like GumI. This Thesis deepened on the molecular basis of the binding to its substrate and the membrane. Mutagenesis of residues of the region proposed for membrane binding was performed, resulting in no-soluble protein and thus demonstrating the complexness of membrane interaction. Moreover, computational simulation studies were carried out with the aim to obtain a model of the GumK/UDP-GlcA structure. The model obtained may explain the GumK specificity for this substrate. Studies performed by various techniques, such as fluorescence, circular dichroism, isothermal titration calorimetry, nuclear magnetic resonance, and small-angle X-ray scattering, strongly suggest the presence of conformational changes in GumK triggered by the UDP-GlcA binding.

Sterle, Helena Andrea. "Modulación in vivo del desarrollo y evolución de linfomas T por el estado tiroideo" (2013-10-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las hormonas tiroideas (HTs) son importantes reguladoras de la respuesta inmune, pero su participación en el desarrollo tumoral es controversial. El objetivo de este trabajo fue estudiar la modulación de las HTs sobre el comportamiento biológico y evolución del linfoma T EL-4 creciendo in vivo en ratones singeneicos eu- (controles), hiper- (hiper) o hipotiroideos (hipo). El tratamiento de las células EL-4 in vitro con HTs indujo un aumento en la proliferación y cambios en los niveles de expresión de reguladores del ciclo celular a tiempos cortos, pero llevó a la apoptosis a tiempos más largos de cultivo. La inoculación de las células EL-4 en animales hiper desarrolló tumores sólidos de mayor volumen que el de los Controles, pero los hipo presentaron un mayor número de metástasis. Adicionalmente, los tumores hiper mostraron un aumento en los niveles de expresión de ciclinas, mientras que en los hipo encontramos niveles incrementados de p16, p27 y p53. Los tumores hiper también exhibieron mayor angiogénesis por inmunohistoquímica y una expresión aumentada de metaloproteasas, por qRT-PCR, junto con incrementada apoptosis. Por otra parte, los ratones hiper mostraron un menor infiltrado linfocitario tumoral, compuesto por un menor porcentaje de linfocitos CD8+ que los ratones control. Por otra parte, los bazos de estos animales presentaron una aumentada proporción y actividad de células NK, junto con un menor porcentaje de células supresoras de origen mieloide. Los ratones hipo, sin embargo, mostraron una reducción en la actividad citotóxica específica contra células tumorales. Nuestros resultados sugieren que el estado tiroideo es capaz de modular el crecimiento tumoral a través de mecanismos que involucran la regulación de proteínas relacionadas con la progresión y/o arresto del ciclo celular y de la angiogénesis, y a través del control de la respuesta inmune antitumoral que puede limitar su diseminación.

Abstract:
Thyroid hormones (THs) are important regulators of immune response, but their role in tumor development is still controversial. The aim of this work was to evaluate THs involvement in the biological behavior and evolution of the EL-4 T lymphoma, growing in vivo in singeneic eu- (controls), hyper- (hyper) or hypothyroid (hypo) mice. The in vitro treatment of EL-4 cells for short periods of time with THs increased cell proliferation and led to changes in the expression of cell cycle regulators. However, longer treatment with THs induced apoptosis in these cells. Hyperthyroid mice that were inoculated with EL-4 cells showed an increased solid tumor volume compared to controls, while hypo exhibited a higher number of metastases. These results were associated with an increment in the expression of cyclins in hyper tumors, and higher levels of p16, p27 and p53 in tumors from hypo mice. An immunohistochemical analysis of tumor sections demonstrated an increased angiogenesis in hyper tumors, which was accompanied with an augmented expression of metalloproteases, measured by qRT-PCR, and an increased apoptosis. Furthermore, a lower number of tumor infiltrating lymphocytes was found in hyper mice, which was comprised of a decreased percentage of CD8+ lymphocytes compared to controls. However, the spleens obtained from these animals showed an increased proportion and activity of NK cells, together with a diminished percentage of tumor derived suppressor cells. Hypo mice, on the other hand, displayed a reduced tumor-specific cytotoxic activity. Our results suggest that thyroid status can directly modulate tumor development through the regulation of proteins that are involved with the cell cycle progression and/or arrest and through the regulation of angiogenesis. Together with this, thyroid status can also regulate tumor dissemination as a result of the modulation of the anti-tumor immune response.

Giraldez, Adrián Nicolás. "Diseño de un sistema de genética reversa del virus de la fiebre aftosa" (2013-11-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El presente trabajo tiene como objetivo generar un sistema para ser utilizado como herramienta en técnicas de genética reversa vinculadas al estudio del virus de la Fiebre Aftosa. Se diseñó y construyó un clon basado en una copia en ADN del genoma completo de la cepa O1/Campos, que se transcribe a partir del promotor de la polimerasa del fago T7. A pesar de detectar replicación del genoma viral por identificación de ARN de cadena negativa en las células transfectadas y en pasajes sucesivos de éstas, no se observó generación de efecto citopático en células BHK-21. Se valoró la influencia de algunos cambios en nucleótidos sobre esta incapacidad, tales como mutaciones en la secuencia amino acídica, estructura secundaria del ARN, estructura secundaria y terciaria de las proteínas involucradas, y se generaron reversiones de las mutaciones que se consideraron más importantes. Se desarrolló un sistema de cuantificación de ARN viral por RT-PCR en Tiempo Real. Por otro lado, se generaron dos replicones mediante el remplazo parcial o completo de las proteínas de la cápside viral por el gen reportero Luc, incapaz de generar virus infeccioso, de modo de poder realizar estudios en laboratorios de nivel bioseguridad menos estrictos. Este sistema puede usarse para el estudio funcional de las proteínas no estructurales del virus, así como de las regiones 5’ y 3’ no codificantes. Se detectó replicación por identificación de ARN de cadena negativa en las células transfectadas así como traducción de proteínas virales por medio de técnicas de inmunofluorescencia indirecta.

Abstract:
The aim of the present work was to build a reverse genetic system for the molecular study of Foot-and-mouth Disease virus (FMDV). A full-length cDNA clone based on the genomic sequence of O1/Campos strain was cloned downstream of the T7 polymerase promoter. Genomic RNA was transcribed in vitro from this clone after linearization of the plasmid cDNA. Although replication of the viral genome was confirmed through the detection of negative strand RNA in transfected cells and subsequent passages, cytopathic effect on BHK-21 cells was not observed. The influence of nucleotide changes on this phenotype, such as aminoacid changes, RNA secondary structure, protein secondary and tertiary structure, were carefully analyzed, and several reversions of mutations were carried out. A Real Time RT qPCR assay to quantify FMDV RNA was developed. In a second step of this work, two replicons derived from the full length clone were constructed by partial or complete replacement of the sequences encoding the viral capsid proteins with those of the Luc gene. These replicons have the advantage that they are unable to generate infectious virus, and therefore require less strict biosecurity conditions. This system can be used for the study of the role of FMDV nonstructural proteins and the 5’ and 3’ UTRs during viral replication. Replication of the constructs was confirmed in transfected cells through detection of negative strand RNA by RT-PCR and detection of translation of viral proteins by indirect immunofluorescence techniques.

Lafaille, Celina. "Regulación del splicing alternativo por la elongación de la ARN Polimerasa II" (2013-11-29) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El splicing alternativo amplía las posibilidades de expresión génica a partir de un número limitado de genes. El splicing está funcionalmente acoplado a la transcripción, y la velocidad de elongación de la ARN Polimerasa II (Pol II) regula algunos eventos de splicing alternativo. Se postula que una menor velocidad de elongación favorece el reconocimiento de sitios débiles por la maquinaria de splicing antes de la síntesis de sitios fuertes competidores río abajo. El exón alternativo EDI de fibronectina está río abajo de un sitio 3’ subóptimo y su inclusión aumenta en situaciones de baja elongación; esto puede deberse a que el reconocimiento del sitio débil antes de la síntesis del sitio fuerte en el intrón siguiente lleva a la escisión del intrón con el sitio débil, forzando la posterior inclusión. Aplicamos una estrategia para estudiar del orden de remoción de los intrones que rodean a un exón determinado. Estudiamos un exón con inclusión reprimida por elongación (EDI), un exón que baja su inclusión a menor elongación (CFTR9), un exón alternativo que no responde a elongación (EDII) y un exón constitutivo (E28). El orden de remoción de intrones se modifica según la línea celular, la presencia de mutaciones en cis o la abundancia diferencial de factores reguladores, pero no se modifica por cambios en la elongación asociados a cambios en la inclusión de EDI. Los resultados sugieren un nuevo mecanismo de regulación de la inclusión de CFTR9 y nos obligan a replantearnos nuestro modelo de regulación cinética de EDI. Aplicamos un método para medir la elongación de Pol II in vivo en genes particulares, y comprobamos que la camptotecina baja la velocidad de transcripción de fibronectina. Medimos el reclutamiento de U2AF65 al sitio débil de EDI y al sitio fuerte río abajo en células tratadas con camptotecina y en células control y observamos un aumento de la unión de U2AF65 al sitio débil con respecto a la unión al sitio fuerte en las células tratadas. Comprobamos así que una menor elongación favorece el reconocimiento por la maquinaria de splicing del sitio débil a expensas del sitio fuerte, y la posterior inclusión del exón independientemente de la cinética de remoción de intrones.

Abstract:
Alternative splicing broadens the scope of genic expression from a limited set of genes. Splicing is functionally coupled to transcription, and the rate of RNA Polymerase II (Pol II) elongation modifies the outcome of some alternative splicing events. A hypothesis holds that slower elongation favours the recruitment of the splicing machinery to weak regulatory sites before the synthesis of strong competing sites downstream of them. Human fibronectin alternative exon EDI starts downstream of a suboptimal 3’ splite site, and its inclusion is enhanced under slow elongation; this may be due to an enhanced recognition of the weak site before the strong site is synthetised, leading to the excision of the upstream intron harbouring the weak splice site and ultimately to exon inclusion. We have used a strategy for determining the order of intron removal around a particular exon. We have studied an exon with a level of inclusion inversely proportional to elongation (EDI), an exon with lower inclusion in slow elongation (CFTR9), an alternative exon unresponsive to elongation (EDII) and a constitutive exon (FN E28). The order of intron removal changes with cell line, cis mutations or regulatory factor abundance, but it is not modified by changes in elongation rate associated with EDI inclusion enhancement. Our intron removal experiments have suggested the existence of a new mechanism for CFTR9 inclusion and they have also made us rethink our model of EDI kinetic regulation. We have successfully applied a method for measuring Pol II elongation rates in vivo in any endogenous gene, and we have found that, as it was expected, camptothecin treatment slows transcription rate on the fibronectin gene. We have measured U2AF65 recruitment to the weak splice site upstream of EDI in camptothecin treated versus control cells and we have detected an increase of U2AF65 binding to the weak site compared to the strong site in camptothecin treated cells. In this way we have ascertained that slower elongation favours the recognition of the weak splice site at the expense of the strong splice site, thereby favouring exon inclusion independently of intron removal kinetics.

Granata, Bárbara Xoana. "Porfirias hepáticas agudas : Relación con el estrés oxidativo y patologías asociadas" (2013-12-09) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las porfirias son desórdenes metabólicos causados por la deficiencia parcial primaria de alguna de las enzimas involucradas en el camino de biosíntesis del grupo hemo. En particular, las Porfirias Hepáticas Agudas, comprenden la Nueva Porfiria Aguda (NPA), Porfiria Aguda Intermitente (PAI), la Coproporfiria Hereditaria (CPH), y la Porfiria Variegata (PV). Individuos con estas patologías padecen ataques neuroviscerales. Por otra parte, en PV y CPH pueden aparecer además síntomas cutáneos. En cuanto a la naturaleza del ataque porfirico, si bien no se conoce exactamente el mecanismo por el cual se generan los disturbios neurológicos, se sabe que el precursor neurotóxico ALA puede autooxidarse generando ROS. Siendo estas enfermedades genéticas, se describieron diversas mutaciones en los genes que codifican las enzimas deficientes. En este trabajo nos focalizamos en el estudio molecular de la PV y diagnosticamos, mediante PCR y secuenciación automática, 10 nuevas familias Argentinas a nivel molecular. Encontramos 5 mutaciones nuevas en la literatura mundial y otras 5 previamente descriptas. Estas familias, sumadas a las anteriormente diagnosticadas en el CIPYP, elevan el total de familias Argentinas PV a 36. Comparamos los tipos de mutaciones con el tipo de sintomatología en todas las familias, con el objeto de hallar alguna correlación entre dichos parámetros. Sin embargo, como ocurre en la mayoría de las poblaciones, no pudimos establecer una relación genotipofenotipo en nuestros pacientes. Con el objetivo de comprobar que la alteración genética presente en cada paciente es efectivamente la causante de la patología, procedimos con la caracterización funcional de las mutaciones nuevas. Empleando un sistema de expresión procariotico en el caso de las mutaciones missense y un sistema de minigenes en el caso de mutaciones de splicing, pudimos corroborar que las primeras reducen la actividad enzimática de la PPOX y que las segundas provocan la exclusión del exón afectado durante el procesamiento del ARNm de este gen. Las porfirias son patologías genéticamente heterogéneas y cada mutación es privativa de una o a lo sumo dos familias. En nuestro país se destaca la mutación c.1.042_1.043insT, dado que no sólo fue descripta únicamente en Argentina, sino que también está presente en el 40% de las familias diagnosticadas genéticamente. De esta forma, hipotetizamos la posible existencia de un ancestro común para la mutación en nuestra población y en función de ésta realizamos un análisis de haplotipos basado en microsatélites o STRs. Encontramos un haplotipo común a todos los pacientes portadores de la mutación en cuestión, el cual es significativamente diferente al de los controles y de otros pacientes PV. Así concluimos que existe un efecto fundador en nuestra población para esta mutación en particular. Por último, teniendo en cuenta la relación existente entre el ataque porfirico y el estrés oxidativo, nos propusimos estudiar parámetros de estrés oxidativo en pacientes y controles, con el fin de identificar algún marcador de la disfunción neurológica. Los resultados obtenidos no son concluyentes dado que el número de individuos analizados es aún bajo y además porque se trata de pacientes controlados y/o en tratamiento, cuyo sistema de defensa antioxidante ya logró, probablemente, adaptarse al cuadro porfirico.

Abstract:
The porphyrias are a group of metabolic disorders caused by the partial deficiency of one of the enzymes involved in the heme biosynthetic pathway. Particularly, acute hepatic porphyrias comprise ALA-D Deficiency Porphyria (ADP), Acute Intermittent Porphyria (AIP), Hereditary Coproporphyria (HCP), and Variegate Porphyria (VP). Individuals with these conditions suffer neurovisceral attacks. Moreover, in VP and HCP cutaneous symptoms may also appear. Regarding the nature of the porphyric attack, although the mechanism by which neurological disturbances are produced is not well characterized, it is known that the neurotoxic precursor ALA may oxidize itself resulting in the formation of ROS. As these diseases are genetic, various mutations in the genes that are responsible of each porphyria have been described. We focused on the genetic study of VP and we diagnosed, by means of PCR and automated sequencing, 10 new Argentinean families at the molecular level. We found five novel mutations in the literature and another 5 previously described. These families, together with those previously diagnosed at the CIPYP, bring the total up to 36 Argentinean VP families. We compared the types of mutations with the type of symptom in all of these families, in order to find a correlation between these parameters. However, as in most populations, we could not establish a genotype-phenotype relationship in our patients. Aiming to ensure that the genetic alteration present in each patient is indeed the cause of the pathology we performed the functional characterization of the novel mutations. Using a prokaryotic expression system in the case of missense mutations and a minigene system in the case of splicing mutations, we describe the first ones reduce PPOX enzymatic activity and the second ones lead to the exclusion of the affected exon during the mRNA processing of this gene. The porphyrias are genetically heterogeneous diseases and each mutation is exclusive to one or two families. Among the mutations responsible for VP, in our country c.1.042_1.043insT stands out, since it was described only in Argentina and is present in 40% of genetically diagnosed families. Thus, we hypothesized the possible existence of a common ancestor for the mutation in our population and thus we conducted a study based on microsatellite haplotypes or STRs haplotypes. We found a common haplotype in all of the patients carrying the mutation, which is significantly different from controls and other PV patients. Therefore we conclude that there is a founder effect in our population for this particular mutation. Finally, taking into account the relationship between the porphyric attack and oxidative stress, we decided to study oxidative stress parameters in patients and controls, in order to identify a marker of neurological dysfunction. Results obtained in this work were not conclusive since the number of individuals analyzed is still low and because the patients are either controlled or treated so their antioxidant defense system is probably adapted to the pathology.

Raffo, Diego Alejandro. "Terapia endócrina y enriquecimiento en células con propiedades "stem" de cáncer de mama: implicancias para la respuesta a la terapia" (2013-12-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El 75% de los tumores de mama son positivos para receptores de estrógeno y progesterona y el tamoxifeno es la terapia más utilizada. Se propone que las células stem podrían ser iniciadoras de tumores y que tendrían una menor susceptibilidad a la quimio y radioterapia. El objetivo fue estudiar el efecto del tamoxifeno y de los elementos del microambiente tumoral sobre las poblaciones con propiedades stem y los mecanismos involucrados utilizando las líneas LMO5-E murina y MCF-7 humana in vitro y el tumor M05 in vivo. Se realizaron ensayos de mamoesferas, de actividad de la enzima ALDH1 y clonogénicos para estudiar a las células con propiedades stem y también se evaluó el crecimiento de los tumores in vivo y de las líneas in vitro y su expresión génica y proteica. Se observó que el tamoxifeno llevó a un enriquecimiento de células con propiedades stem in vivo e in vitro y que estos cambios perduraron luego de finalizado el tratamiento. Los elementos del microambiente tumoral redujeron la proporción de células con estas propiedades probablemente induciendo su diferenciación. De los resultados podemos concluir que el tamoxifeno podría llevar a un enriquecimiento de células con propiedades stem el cual podría ser responsable de las recurrencias observadas luego de la finalización del tratamiento apoyando los estudios que indican que prolongar el tratamiento a 10 años es más efectivo.

Abstract:
Seventy-five percent of breast tumors are positive for estrogen and progesterone receptors and tamoxifen is the therapy of choice. It has been proposed that stem cells could be tumor initiating cells and are more resistant to radio and chemotherapy. The aim of this work was to study the effect of tamoxifen and tumor microenvironmental factors on the proportion of cells with stem cells properties, and the mechanisms involved. To do so we used the LM05-E murine cell line and MCF-7 human cell line in vitro and the M05 tumor in vivo. Mammospheres, ALDH1 and clonogenic assays were performed in order to study cells with stem cell properties. In addition, tumor growth, cell line proliferation and genes and protein expression were studied. Tamoxifen led to an enrichment in cells with stem cell properties both in vivo and in vitro and this enrichment was maintained even after treatment was removed. Microenvironmental elements led to a reduction of cells with stem cells properties, probably due to an induction of differentiation of these cells. From these results we can conclude that endocrine therapy could lead to an enrichment of cells with stem cells properties that would be responsible for late recurrences observed after treatment interruption, supporting studies that indicate that ten-year treatment with tamoxifen is a better clinical alternative.

Rascovan, Nicolás. "Abriendo la caja negra de los microbiomas ambientales argentinos. Caracterizaciones funcionales y ecológicas en lagunas de altura andinas y suelos de la pampa húmeda con secuenciación de alto rendimiento" (2013-12-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La metagenómica basada en tecnología de secuenciación de alto rendimiento revolucionó en los últimos años el campo de la microbiología. Esta metodología permite estudiar a las comunidades de microorganismos ambientales, tanto cultivables como no cultivables, a partir de su información genética. Para poder realizar este tipo de estudios fue necesario instalar, por primera vez en nuestro país, una plataforma de genómica y bioinformática que contara con el equipamiento necesario para la secuenciación masiva de ADN y el análisis posterior de los datos. Los estudios metagenómicos realizados en este trabajo se enfocaron en dos ambientes contrastantes: Las lagunas de altura de la Puna Andina (LAPA) y los suelos de los agroecosistemas de la pampa húmeda (SAPH). Los microbiomas de LAPA en ambientes prístinos presentaron una biodiversidad relativamente baja y no caracterizada previamente. Esto sirvió como modelo de análisis Taxonómico-funcional para describir los primeros estromatolitos vivos de altura en el mundo y biofilms compuestos por haloarqueas encontrados por primera vez en la naturaleza. Los SAPH, por otro lado, son ambientes altamente biodiversos y con alto impacto antropogénico sirviendo como modelo de estudio del impacto ecológico sobre el microbioma en dichas condiciones. Específicamente para este fin, se generó el set de datos PAMPA de casi 8000 millones de bases de ADN que ha sido posteriormente abierto públicamente para el análisis comunitario. Esta investigación es pionera en nuestro país en el emergente campo de la metagenómica ambiental por secuenciación masiva y es a su vez la más detallada caracterización de microbiomas hecha hasta el momento en Argentina.

Abstract:
Metagenomics by high throughput sequencing (HTS) has revolutionized the field of microbiology in the past few years. This method is a powerful tool for the study of environmental microbial communities of both, culturable and nonculturable organisms, based on their genetic information. To be able to perform these type of studies in Argentina, it became necessary to set up a genomic and bioinformatic platform with the appropriate HTS and data analysis equipment. The metagenomic studies presented here were focused in two contrasting environments: the high altitude Andean lakes (HAAL) and the soils from humid Pampas agroecosystems (HPAS). The HAAS microbiomes in pristine environments have been poorly characterized and presented a relatively low biodiversity. they were chosen as a model for taxonomic/functional analyses of the first high-altitude living stromatolites and the first haloarchaea biofilms found in nature. In contrast, the HPAS are highly diverse environments with high impact from anthropogenic activities. Ecological oriented analyses were performed to study the effects of agricultural practices on microbial communities. Specifically for this study, we generated the PAMPA datasets with almost 8 Gb of soil metagenomic data that has been now opened to the scientific community for crowdsourcing analyses. This is a pioneer work in Argentina in the metagenomic emerging field and the most detailed characterization until date of argentinean microbiomes.

López Fernández, María Paula. "Estudio de la muerte celular programada durante el desarrollo de la semilla de quinoa" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En semillas de quinoa, el perisperma, junto al embrión y al endosperma, constituyen los tres compartimentos del grano donde se almacenan las diferentes reservas de la semilla madura. Aun cuando de origen diferente, el perisperma de quinoa comparte con el endosperma amiláceo de las Gramíneas las características de ser el principal tejido reservante de la semilla, estar formado por células muertas a la madurez y almacenar almidón como la principal reserva. En la presente tesis se estudió el desarrollo del perisperma de quinoa y el programa de muerte celular (MCP) que lo afecta. Este análisis se extendió al desarrollo del endosperma, del suspensor, de los tegumentos seminales y del pericarpio. La caracterización de la MCP se evaluó mediante estudios sobre la degradación del ADN nuclear, la expresión de proteasas tipo caspasas y de nucleasas, la endo-reduplicacion y los cambios morfológicos que se producen en el núcleo y en el citoplasma. Adicionalmente se comprobó, mediante técnicas inmunológicas, la presencia de ricinosomas como marcador asociado a la MCP de las células del suspensor y del endosperma predestinadas a morir durante el desarrollo de la semilla; los resultados de estos estudios demostraron la correspondencia entre la presencia de CysEP con la fragmentación del ADN. Como parte del desarrollo del perisperma, se analizaron aspectos relacionados con la síntesis del almidón de reserva en granos compuestos y se identificaron algunas de las enzimas involucradas en su síntesis. A partir de estos estudios fue posible concluir que en la semilla de quinoa: (i) diferentes tipos de muerte celular ocurren de forma simultánea, en los diferentes tejidos; (ii) el perisperma acumula almidón y degenera simultáneamente, durante el desarrollo; (iii) la detección muy temprana de ricinosomas prevé con anticipación la ocurrencia de la MCP; (iv) los granos de almidón compuesto del perisperma se originan en amiloplastos; en los últimos estados del desarrollo, los granos de almidón simple que llenan espacio entre los granos compuestos tienen origen extra- plastídico. Los resultados obtenidos constituyen aportes a la construccion de la sistemática filogenética de la familia Amaranthaceae.

Abstract:
In mature quinoa seeds, the perisperm is one of the three compartments that store reserves, in addition to the embryo and endosperm. Despite their different origins, the quinoa perisperm and starchy cereal endosperm share some characteristics, such as being the main reserve tissue, formed by dead cells at maturity and having starch as their main reserves. In this thesis we studied quinoa perisperm development and the program cell death (PCD) that affects this tissue. This study included the development of the endosperm, suspensor, seed integuments and pericarp. PCD was assessed by studies of nuclear DNA degradation, expression of caspase like-proteases and nucleases, endoreduplication and morphological changes in the nuclei and cytoplasm. Additionally, using immunological techniques we were able to identify associations between the presence of ricinosomes and other PCD hallmark in suspensor and endosperm cells predestined to die during quinoa seed development. These studies showed the relationship between the presence of CysEP and DNA fragmentation in the endosperm, the only seed tissue that dies without leaving a "corpse". As part of perisperm development, we analyzed aspects related to starch synthesis in simple and compound grains, including the detection of starch synthesis enzymes and starch pattern accumulation, among others, and concluded that: (i) simultaneous different cell death programs occurring simultaneously in different tissues of the same seed (ii) the quinoa perisperm accumulates starch while it degenerates, both processes occurring during quinoa seed development, (iii) the early detection of ricinosomes predicts the occurrence of the PCD; (iv) monitoring the development of perisperm can prove the plastidic and extra-plastic origin of the starch grains. The findings generated here are invaluable as they provide novel insight into the Amaranthaceae, as well as a starting point for phylogenetic studies.

Dodes Traian, Martín Miguel. "Estudio de las interacciones entre fosfolípidos y proteínas integrales de membrana. Efectos sobre la actividad enzimática de una ATPasa transportadora de Ca2+" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las membranas celulares son estructuras dinámicas complejas de composición bioquímica muy diversa. Las interacciones específicas lípidolípido y lípido-proteína pueden generar dominios estables o transientes de composición y función biológica diferenciales. En este trabajo, abordamos el estudio de la regulación de la actividad de una proteína integral de membrana, la bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA) por anfifilos que integran el sistema en el cual se la reconstituye. En micelas de lípidos y detergente, pudimos verificar que la actividad depende de la proporción relativa de estas especies y postulamos un modelo que explica esta dependencia en base al intercambio de anfifilos a nivel del dominio transmembrana. El análisis realizado con diversos métodos espectroscópicos mostró que los cambios estructurales asociados a la activación por lípidos serían sutiles pero suficientes para transducir una señal de activación al dominio citoplasmático de PMCA. Utilizando espectroscopía de correlación de fluorescencia y la sonda fluorescente Laurdan observamos que la actividad depende además de la fluidez del entorno y del tamaño de las micelas. Para extender este estudio al entorno natural de las proteínas -la membrana celular- evaluamos diversas sondas fluorescentes y pudimos determinar que la sonda C-Laurdan permite estudiar por microscopía confocal la organización de membranas biológicas.

Abstract:
Cellular membranes are dynamic complex structures with a highly diverse biochemical composition. Specific lipid-lipid and lipid-protein interactions can generate transient or stable domains of particular composition and biological function. In this work, we study the regulation of the activity of an integral membrane protein, the plasma membrane calcium pump (PMCA), by phospholipids that make up the reconstitution system. Working in a mixed micelles lipid/detergent system, we verify that the activity depends on the relative proportion of these species and we posited a model that explains this relationship by the exchange between amphiphiles at the protein transmembrane domain. The analysis performed by spectroscopic methods showed that the structural changes associated with the activation by lipids are subtle but enough to transduce an activation signal to the cytoplasmic domain of PMCA. Using fluorescence correlation spectroscopy and the fluorescent probe Laurdan, we observed that the activity is also related to micelle size and the fluidity of the protein lipidic microenvironment. To extend this study to the natural environment of the protein –the cellular membrane- we assayed the performance of several fluorescent probes and we could determine that the probe CLaurdan allows studying the organization of biological membranes by confocal microscopy.

Gasulla, Javier. "Modulación por óxido nítrico de receptores ionotrópicos de GABA" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El NO es una molécula altamente difusible y reactiva producida en el sistema nervioso que actúa como mensajero neuronal y participa en procesos fisiológicos y patológicos. El NO modula la actividad de numerosos receptores de neurotransmisores y canales iónicos. En particular, los GABAARs pueden ser modulados por agentes rédox y por NO, aunque los efectos y mecanismos de este último no están claros. En esta tesis, caracterizamos los efectos del NO sobre GABAρ1Rs expresados de forma heteróloga y estudiamos la actividad de los GABAARs fásicos y tónicos de células piramidales en rebanadas de hipocampo con distintos niveles de NO. Los receptores homoméricos GABAρ1 se expresaron en ovocitos de Xenopus laevis, y las respuestas evocadas por GABA se registraron electrofisiológicamente, en presencia y ausencia de donantes de NO. Las respuestas se potenciaron significativamente por el NO de forma rápida, reversible y dosis-dependiente. El bloqueo químico de las cisteínas mediante reactivos selectivos para sulfhidrilos previno la potenciación por NO, indicando que las cisteínas participan de la modulación. Cada subunidad ρ1 tiene solo tres cisteínas, las dos extracelulares que forman el cys-loop (C177 y C191) y una intracelular (C364). El reemplazo por alanina de la C364 no modificó los efectos del NO sobre el receptor, lo que sugiere que el NO potencia los GABAρ1Rs a través de una interacción con el cys-loop extracelular. Por otra parte, en rebanadas de hipocampo, se realizaron registros con la técnica de patch-clamp en configuración célula entera, y se estudiaron los efectos del NO sobre los GABAARs. Las corrientes fásicas se registraron aplicando puffs de GABA y, las corrientes tónicas se midieron analizando la IH antes y después de la aplicación de bicuculina (BIM). El nivel de NO se incrementó por la aplicación de donantes de NO y se disminuyó bloqueando la producción de la NOS. El incremento en los niveles de NO no modificó significativamente la actividad de los GABAARs. Sin embargo, el bloqueo de la síntesis de NO endógeno potenció la corriente GABAérgica tónica y la evocada por puffs de GABA. Estos resultados indican que los efectos del NO sobre los GABAARs son dependientes de la subunidad y sugieren que las acciones del NO en el hipocampo estarían en parte mediadas por la modulación de la actividad inhibitoria.

Abstract:
NO is a highly diffusible and reactive molecule produced in the nervous system that act as a neuronal signal mediating both physiological and pathological mechanisms. NO can modulate the activity of neurotransmitter receptors and ion channels. In particular, GABAAR can be modulated by several redox agents and by NO, but the effects and mechanisms of this modulation were not clearly determined. In the present work, we characterized the effects of NO on the GABAρ1R and examined the function of phasic and tonic GABAAR on pyramidal cells of acute hippocampal slices under different NO levels. Homomeric GABAρ1Rs were heterologously expressed in Xenopus oocytes and GABA-evoked responses electrophysiologically recorded in the presence or absence of NO donors. Responses were significantly enhanced in a dose-dependent, fast and reversible manner by NO. Chemical protection of cysteines by selective sulfhydryl reagents prevented the NO effects indicating that cysteines are involved in NO actions. The ρ1 subunits contain only three cysteine residues, two extracellular at the cys-loop (C177 and C191) and one intracellular (C364). Mutation of C364 by alanine did not change the effects of NO on GABAρ1R, suggesting that GABAρ1R function can be enhanced by NO acting at the extracellular cys-loop. On the other hand, in hippocampal slices, whole-cell patch clamp technique was used to study the effects of NO on GABAAR. Phasic currents were evoked by puff application of GABA and tonic currents were determined through monitoring IH before and after application of bicuculine. NO level was increased by application of NO donors or decreased by blocking the NOS. Exogenously applied NO, had no effects on GABAARs. Meanwhile, depletion of endogenous level of NO enhanced both types of GABAergic currents. These results indicate that NO actions on GABAARs are extremely subunit dependent and suggest that physiological effects of NO on hippocampus can be in part mediated by modulation of the inhibitory synaptic activity.

Mori Sequeiros Garcia, María de las Mercedes. "Expresión y función de las MAP quinasas fosfatasas 1 y 3 (MKP-1 y MKP-3) en células de Leydig" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
MKP-3 es una enzima inducible sólo por estímulos proliferativos que desfosforila específicamente a ERK1/2. En cambio MKP-1 desfosforila diferentes MAPKs y se induce por diversos tipos de estímulos. En este trabajo se analizaron aspectos regulatorios y funcionales de ambas enzimas en células de Leydig MA-10 bajo la estimulación del receptor de LH (RLH) con hCG o en presencia del derivado del segundo mensajero correspondiente, 8Br-AMPc. Este estudio pone en evidencia, por primera vez, que la activación del RLH regula la expresión de MKP-3. hCG y 8Br-AMPc aumentan los niveles de MKP-3 activando la expresión génica por eventos dependientes e independientes de ERK1/2 y promoviendo modificaciones post-traduccionales que estabilizan la proteína. Se demostró que la activación del RLH conduce a la inducción p21, un inhibidor de la proliferación, y que este efecto es dependiente de MKP-3. Respecto de la enzima nuclear MKP-1, se determinó que el AMPc regula su estabilidad por múltiples fosforilaciones, involucrando la fosforilación por ERK1/2 en sitios consenso relacionados con la estabilidad (S359 y S364) y con la inestabilidad (S296 y S323) de la proteína. Se demostró que la inducción del factor de transcripción NUR77 por 8Br-AMPc, factor que participa en expresión de genes cruciales para la esteroidogénesis, es dependiente de ERK1/2 y se determinó que MKP-1 y sus modificaciones post-traduccionales impactan en la inducción de NUR77 por 8Br-AMPc. Se concluye que la inducción de MKP-1 y MKP-3 por estimulación del RLH modula las acciones de LH sobre la esteroidogénesis y la proliferación de las células de Leydig.

Abstract:
MKP-3 is an enzyme inducible only by proliferative stimuli and involved specifically in ERK1/2 dephosphorylation. In contrast, MKP-1 is an enzyme inducible by different stimuli and able to dephosphorylate different MAPKs. This work analyzes regulatory and functional aspects of both phosphatases in MA-10 Leydig cells under the stimulation of the luteinizing hormone receptor (LHR) with human chorionic gonadotropin hormone (hCG) or a permeable derivative of the corresponding second messenger (8Br-cAMP). The present study demonstrates, for the first time, the expression of MKP-3 by the activation of LHR. hCG and cAMP increase MKP-3 levels by activating gene expression –through ERK1/2-dependent and independent events- and promoting posttranslational modifications that increase protein stabilization. This work also demonstrates that the activation of LHR leads to the induction of p21, an inhibitor of cell proliferation, by a mechanism involving MKP-3 expression. Regarding the nuclear enzyme MKP-1, this work shows that cAMP regulates MKP-1 half life by ERK1/2-mediated phosphorylation in sites involved in protein stabilization (S359 and S364) and destabilization (S259 and S263). It is also established that transcription factor NUR77, whose action is essential for the expression of crucial steroidogenic genes, is cAMP-induced by an ERK-dependent mechanism. In line with this finding, this study also demonstrates that MKP-1 and its post-translational modifications impact on MKP-3 expression. It is concluded that the induction of MKP-1 and MKP-3 by LHR activation modulates LH actions on steroidogenesis and proliferation of Leydig cells.

Ferder, Ianina C.. "Implicancias del gen FMR1 en la función ovárica" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El gen FMR1, responsable del Síndrome de Fragilidad del X (SFX), se localiza en el sitio FRAXA en el brazo largo del cromosoma X (Xq27.3), está compuesto por 17 exones, abarca aproximadamente 38 kilobases (kb) y su producto transcripcional es un ARN mensajero de 3,9 kb que puede sufrir splicing alternativo. En su región 5’ no codificante presenta una zona de tripletes CGG que puede variar en longitud. Según el tamaño de la expansión, los alelos se clasifican en normales (5- 44 repeticiones), intermedios (45-54 repeticiones), premutados (55- 200 repeticiones) o con mutación completa (>200 repeticiones). Mientras que la mutación completa es la causante del SFX, el estado de premutación se asocia a otros 2 desórdenes clínicos: Síndrome de temblor/ ataxia asociado a la Fragilidad del X (FXTAS), un desorden neurodegenerativo de inicio tardío y a la Insuficiencia Ovárica Primaria (IOP) asociada a la Fragilidad del X (FXPOI). La IOP se define como la presencia de amenorrea (de al menos 4 meses) antes de los 40 años, que se acompaña de un aumento en los niveles séricos de FSH (a niveles menopáusicos) y de bajos niveles de estradiol (hipoestrogenismo). Es un síndrome muy heterogéneo de patogénesis multicausal tales como alteraciones cromosómicas, enzimáticas, autoinmunidad, causas iatrogénicas e infecciosas. Tiene una incidencia del 1% en mujeres menores de 40 años y del 0,1% en menores de 30. FXPOI es la causa genética conocida más común de la IOP 46, XX y la premutación en FMR1 es responsable del 4- 6% de todos los casos de IOP 46, XX. Aproximadamente el 2% de las mujeres 46, XX con IOP aislada y el 14% de la mujeres 46, XX con IOP familiar son portadoras de la premutación en el gen FMR1. Asimismo, se ha descripto que alrededor del 20% de las mujeres portadoras de la premutación desarrollan IOP. A su vez, las mujeres portadoras se vuelven menopáusicas aproximadamente 5 años antes que las no portadoras. Si bien no todas las mujeres portadoras de la premutación experimentan una temprana pérdida de la fertilidad, todas ellas enfrentan el potencial adelantamiento en la aparición de condiciones asociadas con la deficiencia estrogénica (aumento en el riesgo de osteoporosis y de enfermedades cardiovasculares). Estudios genéticos epidemiológicos sugieren que el comienzo y la gravedad de la disfunción ovárica asociada a FXPOI son variables y podrían estar moduladas, potencialmente, por el largo de las repeticiones CGG y otros factores ambientales. El status de premutación per se pareciera estar influyendo en la expresión de la enfermedad. De hecho, no se ha descripto que mujeres que poseen expansión completa de tripletes (>200 repeticiones y con signos clínicos de Síndrome de Fragilidad del X) desarrollen IOP. Si bien no se conoce el mecanismo por el cual la premutación del gen FMR1 puede causar la disfunción ovárica y la insuficiencia ovárica primaria, se ha postulado que puede ocurrir una disminución inicial del número de folículos o una velocidad acelerada de la atresia. Es sabido que la proteína que codifica este gen, FMRP, se expresa en altas cantidades en células germinales del ovario fetal. Asimismo, se ha descripto que esta proteína actúa como inhibidor de la traducción de algunos ARN mensajeros formando parte de los procesos de silenciamiento génicos mediados por miRNAs. Teniendo en cuenta su función, se ha postulado como posible hipótesis de la patogenia, que un aumento de FMRP en estadios tempranos del desarrollo de los ovocitos podría conducir a una haploinsuficiencia de proteínas involucradas en este proceso, provocando una disminución del pool inicial de folículos. Sin embargo, y dado que en FXTAS se ha observado un aumento del ARN mensajero del gen como consecuencia de la premutación, se postula como mecanismos alternativo la existencia de un aumento del ARN mensajero en el ovario que ejerza un efecto tóxico en el tiempo, con el consecuente incremento de la atresia folicular. Ninguno de estos mecanismos han sido aún comprobados en el ovario, más aún la función fisiológica de la proteína en el mismo no está establecida. No se conoce además, si existe expresión diferencial a lo largo del desarrollo folicular. Considerando la escasa información que existe acerca de FMR1 y su expresión en ovario, nuestro trabajo consistió, en una primera fase, en el estudio de la expresión de la proteína FMRP y su mensajero a lo largo de la foliculogénesis, en un modelo de rata. Se utilizaron 3 grupos de ratas: ratas prepuberales de 18 días, ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con dietilestilbestrol (DES) para enriquecer a los ovarios en folículos antrales tempranos y ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con gonadotrofina coriónica equina (PMSG) para enriquecer los ovarios en folículos preovulatorios. En la primera parte del trabajo analizamos, por inmunohistoquímica, la expresión de FMRP en los distintos tipos celulares del folículo. Hallamos que la proteína se expresa en células de la granulosa, de la teca y en células estromales, con excepción de un grupo de células que rodea al folículo. La expresión se detectó en los folículos en los tres estadios del desarrollo estudiados: preantrales, antrales tempranos y preovulatorios. La expresión de la proteína FMRP fue estudiada también por Western blot en los tres tipos foliculares. Observamos una menor expresión en folículos preantrales y una mayor expresión en estadios más avanzados de la foliculogénesis. Por otra parte, se detectaron al menos 4 isoformas de la proteína cuyos patrones de expresión resultaron diferentes a los observados en testículo y cerebro. Teniendo en cuenta la función de la proteína como parte del complejo de silenciamiento post-transcripcional, estos resultados nos permitirían estimar que las diferencias observadas en los niveles de expresión de la proteína tendrían un rol en el correcto desarrollo del folículo. Asimismo, la presencia de isoformas distintivas en el ovario sugeriría una función específica para algunas de ellas en la gónada. La segunda parte del trabajo consistió en el estudio de la expresión del ARN mensajero de Fmr1 en los 3 estadios foliculares. Por PCR en tiempo real observamos que el patrón de expresión era opuesto al que se obtuvo para la proteína. En los folículos preovulatorios, el nivel del ARN fue menor respecto al de los estadios anteriores. Estos resultados sugerirían que la expresión del mensajero y su proteína en el ovario están regulados de manera diferente y posiblemente independiente. Por otro lado, identificamos por RT-PCR y posterior secuenciación, la existencia de varias isoformas del ARNm del gen, resultantes del splicing alternativo del mismo. Entre ellas, detectamos la isoforma que contiene al exón 12, la cual no ha sido previamente descripta en rata. El último aspecto que quisimos abordar en nuestro estudio fue el efecto biológico de la introducción de tripletes en el rango de la premutación sobre una línea celular de células de granulosa humana (KGN). Par tal fin se transfectaron las células con un plásmido conteniendo tripletes en el rango normal o de la premutación, río arriba de un gen reportero (GFP). Luego de 18 horas de transfección, los niveles de ARNm del gen reportero resultaron más elevados en las células que poseían los tripletes en el rango de la premutación, en concordancia con lo observado en diferentes experimentos y pacientes con FXTAS. Asimismo, detectamos una menor cantidad de células que expresan la proteína GFP, en presencia del plásmido con la premutación, en todos los tiempos de transfección estudiados. A nivel neuronal se ha relacionado al estado de premutación con posibles efectos apoptóticos en la célula. Si bien nuestros estudios aún no demuestran que el efecto de la introducción de tripletes en el rango de la premutación resulte en un aumento en la apoptosis de las células KGN, los resultados obtenidos en esta tesis abren la posibilidad de que este mecanismo sea analizado en un futuro. En conclusión, en esta tesis se describe por primera vez la expresión de la proteína FMRP y de su mensajero a lo largo del desarrollo folicular, y la presencia de algunas isoformas distintivas, producto del splicing alternativo del gen. Asimismo, se iniciaron los estudios tendientes a demostrar el efecto patogénico que posee la expresión de tripletes expandidos en células del ovario.

Abstract:
The FMR1 gene, responsible for the Fragile X Syndrome (FXS), is located in the FRAXA site of chromosome X. The gene is composed of 17 exons, spans about 38 kb and encodes an messenger RNA (mRNA) of 3.9 kilobases (kb) that can be alternatively spliced into a number of different isoforms. The 5’ UTR of the FMR1 gene presents a CGG repeat that is unstable and therefore variable. Based on the size of the expansion, alleles are classified as normal (5–44 trinucleotide repeats), intermediate (45- 54 repeats), premutated (55–200 repeats), or fully mutated (>200 repeats). While full mutation is the responsible for FXS, the premutation condition has been associated to other 2 clinical disorders: Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS), a neurodegenerative disorder of late onset and to the Fragile X- associated primary ovarian insufficiency (FXPOI). Primary ovarian insufficiency (POI) is defined as amenorrhea (for at least 4 months) before age of 40, an increase in serum levels of FSH (to menopausal levels) and low levels of estradiol (hypoestrogenism). This syndrome is very heterogeneous with a multicausal pathogenesis, and any of the following: chromosomal, enzymatic, iatrogenic, autoimmune or infectious aberration may be the cause of the disease. It has an incidence of 1% in women under age of 40 and of 0.1% below 30 years of age. FXPOI is the most common known genetic cause for IOP and the premutation condition is responsible for 4-6% of all cases of 46, XX IOP. About 2% of women 46, XX with IOP and 14% of women 46, XX with familial IOP, carry the premutation in the FMR1 gene. Moreover, it has also been described that around 20% of women carrying the premutation, become menopausal around 5 years earlier than not carriers. The premutation status seems to influence the expression of the disease. In fact, no full mutated women with IOP have been described. While not all women carries of the permutation experience an early loss of fertility, all carriers face the potential advance in the onset of the conditions associated with estrogenic deficiency (higher risk for osteoporosis and hearth diseases). Epidemiologic genetic studies also suggest that the onset and severity of ovarian dysfunction associated to FXPOI is variable, and could be potentially modulated by the CGG repeat length and environmental factors. Even though the underlying mechanism by which the FMR1 premutation is responsible for the ovarian dysfunction and POI is not known, it has been suggested that an initial decrease of the number of follicles or an accelerated rate of atresia may take place. The protein encoded by the FMR1 gene, FMRP, is highly expressed in germ cells in the fetal ovary. The protein acts as a translation inhibitor of some target mRNA, most likely via the microRNA silencing complex. Given that in FXTAS an increase in FMR1 mRNA has been observed, another possible mechanism for FXPOI is that high levels of mRNA exert a toxic effect causing an increase in follicular atresia. None of the postulated pathogenic mechanisms has been demonstrated in the ovary. Moreover, the physiological role of FMRP in the gonad has not been established, and the expression pattern of the protein during follicular growth remains unknown. Considering that there is limited information related to FMR1 expression and function in the ovary, the goal of our work was, initially, to study the expression of FMRP protein and its messenger during folliculogenesis in a rat model. For this propose, three groups of rats were used: 1- prepubertal rats of 18 days, 2- prepubertal rats of 21-23 days treated with Diethylstilbestrol (DES) to enrich ovaries with early antral follicles and 3- prepubertal rats of 21-23 days treated with equine chorionic gonadotropin (PMSG) to enrich ovaries with preovulatory follicles. The expression of FMRP in the rat ovarian follicular cells was analyzed by immunohistochemistry (IHQ) and Western blot (WB). By IHQ we found that the protein is expressed in granulosa, theca and stromal cells, except in a group of cells surrounding the follicle, mainly in the cytoplasm. Expression was detected in follicles at all stages of folliculogenesis: preantral, early antral and preovulatory. After WB assays, lower expression in preantral follicle was detected, whereas higher levels of FMRP were observed in later stages of folliculogenesis. Moreover, at least 4 isoforms of the protein were detected whose expression pattern differed from that observed in testis and brain. Considering FMRP’s function as part of the post -transcriptional silencing complex, these results may suggest that the differences observed at FMRP expression levels, could exert a role in the proper development of the follicle. Furthermore, the presence of distinctive isoforms in the ovary could imply a specific function for some of them in de gonad. In the second part of the work we studied the messenger RNA (mRNA) expression of Fmr1 in the three follicular development stages. Using quantitative RT-PCR (qRT-PCR) we found that the mRNA expression pattern was opposite to that observed for the protein: in preovulatory follicles, mRNA level was lower compared to earlier stages. These results suggest that mRNA and protein expression in the ovary may be regulated at different and perhaps independent levels. In addition, by RT-PCR and subsequent sequencing, we identified several messenger isoforms resulting from alternative splicing. Among them, we detected the variant including exon 12, which has not been previously described in other rat tissues so far analyzed. The last aspect we addressed in our work was the biological effect that the CGG repeats in the permutation range could exert on a human ovarian granulosa cell line (KGN). Cells were transfected with a plasmid containing repeats in the normal or in the premutation range cloned upstream of the GFP reporter gene. After different times of transfection, mRNA of the reporter gene was measured by qRT- PCR. We found that after 18 hours, the levels of mRNA was higher in cells transfected with the repeats in the premutation range comparing to the levels found for those with the normal one. These results are in agreement with the observations reported for FXTAS patients and for animal models of the syndrome. Moreover, when cells were transfected with the permutated plasmid, we detected fewer cells expressing the GFP protein in all the transfection times assayed. In neurons, the permutation state has been associated with possible apoptotic effects in the cell. Even though our preliminary studies do not yet show that transfection of KGN cells with the premutation plasmid results in increased apoptosis, the results obtained in the present work open the possibility for this mechanism to be analyzed in a future. In conclusion, this work describes, for the first time, the expression of the FMRP protein and its messenger during folliculogenesis in a rat model. Moreover, the presence of some distinctive isoforms resulting from the alternative splicing of the gene in the ovary is also described. Although we found an increase in mRNA levels and reduced protein expression of the reporter gene containing permutated repeats, further studies are needed to elucidate the pathogenic mechanism of the expanded triplets in the ovary.

Pretel, Miguel Esteban. "La proteína no-estructural NS1 exclusiva del virus respiratorio sincicial: mecanismo de plegamiento y ensamblado quasi-espontáneo de oligómeros esféricos estables" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los Paramixovirus son una familia diversa de virus ARN de cadena negativa pertenecientes al orden de los Mononegavirales. Estos virus han evolucionado diversas estrategias para bloquear los mecanismos de respuesta inmune innata del huésped en el curso de un proceso infeccioso. El virus respiratorio sincicial (RSV) es la mayor causa de enfermedad pediátrica en el mundo. Este virus, contiene a dos proteínas no estructurales (NS1/NS2) la cuáles sólo se encuentran en RSV y no muestran homología con ninguna otra proteína. NS1 y NS2 han sido postuladas como los principales factores de virulencia de RSV, interviniendo en el bloqueo de la respuesta inmune inducida por el virus. Se han identificado múltiple blancos celulares que interactúan con NS1 y NS2, principalmente relacionados a las vías de inducción y respuesta a interferón. En este trabajo de tesis, se realizó el estudio de la conformación de NS1 en solución, haciendo uso de métodos bioquímicos y biofísicos para su estudio. Como primera medida, se desarrolló un protocolo de expresión y purificación que permitió obtener un rendimiento de 10 mg/L de proteína homogénea en solución. Se determinó que NS1 es un monómero plegado globular, el cual contiene regiones flexibles que presentan intercambio conformacional. La temperatura induce cambios estructurales que llevan a la formación de oligómeros esféricos solubles (NS1SOs) los cuales presentan propiedades amiloides. Se analizó la cinética de formación de estos oligómeros, a partir de lo cual se propone un modelo de ensamblado identificando eventos clave para el proceso. Por otro lado, estudios de plegamiento al equilibrio indican que NS1 se despliega cooperativamente en un proceso reversible de dos estados (Nativo – Desplegado), mientras que NS1SOs primero se disocia a monómeros nativos y luego se despliega. Estudios de cinética de plegado de NS1, indican que mientras que el desplegado de la proteína es relativamente sencillo, su plegado es complejo y limitado cinéticamente por la presencia de múltiples intermediarios, compatible con heterogeneidad cis/trans de prolinas en el estado desplegado. En resumen, en el presente trabajo se describe la diversidad conformacional de la proteína NS1. Esta proteína se encuentra en cuasi-equilibrio con oligómeros esféricos y estables, los cuales se forman en condiciones compatibles con un entorno celular. Estos estudios constituyen los primeros en analizar los equilibrios conformacionales para esta proteína y podrían explicar sus múltiples blancos y funciones reportadas.

Abstract:
Paramixoviruses are a diverse family of negative-strand RNA viruses that belong to the order of Mononegavirales. These viruses evolved different strategies in order to block the host innate immunity during infection. Respiratory Syncytial Virus (RSV) is the major infectious agent that causes pediatric respiratory disease worldwide. RSV contains the two non structural proteins (NS1 and NS2) which are unique to RSV and show no homology to any other protein in relation to its primary structure. These two proteins were postulated as the RSV major virulence factors, and play a central role in blocking the immune response induced by the virus. Multiple cellular targets have been reported for NS1 and NS2, mainly related to the interferon pathways. In this thesis, we studied the NS1 conformation in solution, making use of different biochemical and biophysical techniques. First, we developed an expression and purification protocol which allowed us to obtain 10 mg/L of highly purified protein. We observed that NS1 is a folded and globular monomer which contains some flexible regions subject to slow conformational motions. Temperature induces a cooperative structural change leading to soluble and spherical oligomers (NS1SOs) with amyloid properties. We performed a kinetic analysis which allowed us to propose a model in relation to oligomer formation, identifying key events of the process. Equilibrium folding studies revealed that NS1 unfolds following a two-state reaction, in a fully reversible process, whereas NS1SOs first dissociates into native monomers and them unfolds. On the other hand, kinetic folding studies indicated that although unfolding is a rather simple process, refolding is complex, limited by multiple kinetic intermediates, compatible with prolyl cis/trans heterogeneity in the unfolded state. In summary, the present work describes the conformational diversity of the NS1 protein. NS1 exists in quasi-equilibrium with stable and spherical oligomers, which are formed in conditions compatible with a cellular environment. This work represents the first study in relation to conformational equilibria of the NS1 protein and may explain its multiple binding partners and functions reported.

Fuertes, Mariana. "Rol y mecanismos de acción de RSUME en la regulación de PTTG e impacto en un modelo tumoral hipofisario" (2014-03-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los tumores de hipófisis son adenomas benignos de incidencia frecuente que se originan a partir de los distintos tipos celulares hipofisarios por expansión clonal. En todos los tipos de adenomas hipofisarios se ha visto una sobreexpresión de pituitary tumor transforming gene (PTTG). PTTG facilita la progresión del ciclo celular ya que actúa como securina, regulando la correcta separación de las cromátidas hermanas en metafase, entre otras funciones. Por tratarse de un regulador del ciclo celular, el balance de los niveles de expresión de PTTG en la célula es importante, y la desregulación de estos niveles por defecto o exceso conduce a inestabilidad genómica, aneuploidía, apoptosis, daño al ADN, y conlleva al desarrollo de tumores. Se desconoce la causa que provoca el desbalance de PTTG al momento inicial del desarrollo de tumores de hipófisis. En este trabajo identificamos y describimos por primera vez un mecanismo de desregulación de los niveles de expresión de la proteína PTTG, que desencadena su acción como oncogen, permitiendo el avance de la tumorigenicidad hipofisaria. El mismo involucra la sobreexpresión de RWD-containing sumoylation enhancer (RSUME) al momento inicial del proceso tumoral y, como consecuencia, la inducción de la modificación de PTTG por SUMO, reduciendo su degradación por ubiquitinación y aumentando su estabilidad proteica. Este efecto de RSUME conduce a un aumento de la actividad PTTG y conlleva a hiperactividad del ciclo celular, aneuploidía, anormalidades cromosómicas, células multinucleadas y otros efectos tumorigénicos mediados por PTTG. Además, demostramos que PTTG y RSUME colocalizan a nivel celular y su expresión correlaciona positivamente en adenomas hipofisarios humanos.

Abstract:
Pituitary tumors are benign adenomas of frequent incidence originating from different pituitary cell types by clonal expansion. In all types of pituitary adenomas has been an overexpression of pituitary tumor transforming gene (PTTG). PTTG facilitates cell cycle progression by acting as securin, regulating the correct separation of sister chromatids in metaphase. Being a cell cycle regulator, the balance of PTTG expression levels in the cell is important, and deregulation of these default levels or excess leads to genetic instability, aneuploidy, apoptosis, DNA damage, among others, and leads to the development of tumors. The underlying cause of the imbalance of PTTG the initial stage of development of pituitary tumors is unknown. In this paper we identify and describe for the first time a mechanism for deregulation of the expression levels of PTTG protein, which triggers its action as oncogene, allowing the advance of pituitary tumorigenicity. It involves overexpression of RWD-containing sumoylation enhancer (RSUME) at the initial moment of the tumor process and, as a result, induction of PTTG by SUMO modification, reducing degradation by ubiquitination and increasing protein stability. This effect of RSUME leads to an increase of PTTG activity and leads to hyperactivity of the cell cycle, aneuploidy, chromosomal abnormalities, multinucleated cells and other tumorigenic effects mediated by PTTG. Furthermore, we demonstrate that PTTG and RSUME colocalize at the cellular level and its expression correlates positively in human pituitary adenomas.

Baccarini, Leticia Cecilia. "Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae" (2014-03-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La regulación de la expresión génica mediada por proteínas quinasas es esencial para la correcta adaptación celular frente a un estímulo extracelular. En S. cerevisiae, la PKA está formada por tres subunidades catalíticas: Tpk1, Tpk2 y Tpk3 y una subunidad regulatoria: Bcy1. Existen antecedentes que indican la asociación de Tpk1 y Tpk2 a la cromatina durante el crecimiento en glucosa, glicerol y estrés oxidativo (Pokholok et al, 2006). El rol de la vía cAMP/PKA sobre la expresión génica en glucosa ha sido ampliamente estudiado (Livas et al, 2011). Por otro lado, se ha descripto, que la activación de la PKA limita la expresión de genes de respuesta a estrés (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). Durante el desarrollo de esta tesis analizamos la unión de Bcy1, Tpk1 y Tpk2 a diferentes regiones génicas en respuesta a estrés osmótico y oxidativo. Describimos que tanto las subunidades catalíticas como la subunidad regulatoria de la PKA se encuentran asociadas tanto a regiones transcriptas como a promotores de los genes blancos de manera estrés-dependiente. Además analizamos el requerimiento de la actividad quinasa y el papel de Bcy1 en la asociación de las Tpks a la cromatina. Versiones inactivas de Tpk1 y Tpk2 no se asociaron a la cromatina. La deleción de Bcy1 promueve una mayor asociación de Tpk1, mientras que anuló la asociación de Tpk2. Luego analizamos el posible rol de las Tpk en el remodelado de la cromatina en respuesta a estrés a través del análisis de la cinética de unión de factores remodeladores de la cromatina a las regiones donde encontramos asociadas a Tpk1 y Tpk2. Observamos unión transitoria a la cromatina de Arp8, Rsc1 y Snf2 seguido temporalmente por la asociación de las Tpk. Observamos también, la ocupación concomitante de Tpk2 y el factor de transcripción de unión al DNA Rap1. En conjunto los datos existentes y los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la PKA podría participar en la expresión génica mediante fosforilación in situ de los reguladores transcripcionales o de la cromatina. La distribución núcleo-citoplasmática permite regular la actividad diferencial de muchas proteínas quinasas. Hemos analizado la localización subcelular de las subunidades de PKA y su mecanismo de transporte durante estrés. Hemos observado que Tpk1-GFP y Tpk3-GFP acumulan en el núcleo post-estrés oxidativo y osmótico, sin embargo Tpk2- GFP y Bcy1-GFP no cambian su acumulación nuclear. El análisis cinético de la acumulación nuclear de Tpk1 mostró mayor velocidad en respuesta a estrés osmótico versus oxidativo. Hemos determinado que la acumulación nuclear de Tpk1, Tpk2, Tpk3 y Bcy1 es un mecanismo de transporte activo. Sorprendentemente, cada una de las subunidades de PKA es importada al núcleo por diferentes carioferinas. Por otra parte, las cepas defectivas en carioferinas las cuales impiden la acumulación nuclear específicamente de Tpk1 o Tpk2 no mostraron asociación a la cromatina las Tpks, lo que sugiere el requerimiento de acumulación nuclear de las subunidades catalíticas para la asociación a sus genes blancos.

Abstract:
Regulation of gene expression by intracellular stimulus-activated protein kinases is essential for cell adaptation to environmental changes. There are three PKA catalytic subunits in S. cerevisiae: Tpk1, Tpk2 and Tpk3 and one regulatory subunit: Bcy1. Previous data indicates that Tpk1 and Tpk2 were found associated to the chromatin during growth on glucose, glycerol and oxidative stress (Pokholok et al, 2006). Using ChIP-real time assay we analyzed the Bcy1, Tpk1 and Tpk2 association to 5 genes regions in response to osmotic and oxidative stresses. We had demonstrated that both catalytic and regulatory subunits of PKA were associated to transcribed regions and promoters of target genes in a stress dependent manner. Furthermore we analyze the requirement of kinase activity and the role of Bcy1 protein on Tpk chromatin association. Inactive versions of Tpk1 and Tpk2 do not associate to chromatin. Deletion of BCY1 promotes higher Tpk1 association, whereas it abolished Tpk2 association. We then analyze the possible role of Tpk on chromatin remodeling in response to stress conditions. We analyze the kinetics of binding chromatin remodelers in the regions bound by Tpk1 and Tpk2 in response to stress. During stress stimulus there is a transient binding to chromatin of Arp8, Rsc1 and Snf2 - chromatin remodelers followed temporarily by Tpk association. We also observe cooccupancy of Tpk2 and DNA-binding transcription factor Rap1. The role of cAMP / PKA on gene expression in glucose has been extensively studied (Livas et al, 2011). However PKA activation limits the expression of stress responsive genes (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). These results suggest that PKA could participate in gene expression by in situ phosphorylation of transcriptional or chromatin regulators. Actually it is known that a single protein kinase distributed dynamically between cytoplasm and nucleus, can regulate target genes expression by both nuclear and cytoplasmic signaling mechanisms. Thus, the nucleus-cytoplasmic kinases transport would be important to regulate differential activity in both compartments. Here we analyze stress subcellular localization of PKA subunits and their transport mechanism, using fluorescence microscopy. We observed that Tpk1 and Tpk3 accumulate in the nucleus post-oxidative and osmotic stress however Tpk2 and Bcy1 not change their nucleus-cytoplasmic distribution, staying preferentially nuclear. Our results over Tpk1 stress re-localization kinetics suggest that under osmotic stress is necessary its faster nuclear accumulation. We determined that Tpk1, Tpk2, Tpk3 and Bcy1 nuclear accumulation is ATP dependent suggesting an active transport mechanism. Surprisingly, we found that each PKA subunits is transported into the nucleus by different karyopherins. Moreover, karyopherin mutant strains which prevent nuclear accumulation of Tpk1 or Tpk2 prevented its association with chromatin, suggesting that nuclear accumulation of catalytic subunits to association to their targets genes is required.

Sganga, Leonardo. "Identificación de ejes quimiotácticos que guían células madre mesenquimales al estroma tumoral en adenocarcinomas mamarios" (2014-03-31) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El crecimiento tumoral depende en gran medida en la interacción de las células tumorales con el microambiente que las circunda. Entre otras células que componen el estroma tumoral se encuentran precursores locales y precursores estromales o células madre mesenquimales (MSCs) que se alojan en el tumor tras ser reclutadas desde la médula ósea. En base a esto surge la pregunta: ¿cuáles de los factores del microambiente tumoral son los responsables de la migración de MSCs provenientes de médula ósea? Utilizando un modelo in vitro del microambiente tumoral representado por medios condicionados (MC) por muestras humanas de adenocarcinomas mamarios realizamos un estudio proteómico de citoquinas y quimioquinas sobre 8 muestras tumorales, destacándose IL-6, GRO, IL-8 y MCP-1 como los factores más representados de los medios condicionados por tumores, siendo el perfil muy similar entre todas las muestras tumorales. En busca de un modelo que remede el aporte de factores quimiotácticos por parte de los tumores humanos, se crecieron tumores ortotópicos en ratones nude combinando una línea tumoral mamaria humana con fibroblastos humanos adultos. Utilizando este modelo, se logró cuantificar las MSCs llegadas tras migración local luego de ser inyectadas de modo peritumoral. En una validación técnica y funcional in vitro, IL-6 resultó ser quimiotáctico para MSCs pero en concentraciones mucho mayores a las encontradas en los tumores; sin embargo no se descarta un rol de IL-6 directo o indirecto. Por otra parte los ejes quimiotácticos de GRO, IL-8 y MCP-1 no revelaron un aporte significativo sobre la migración de MSCs. Por otro lado, de un análisis estadístico y funcional comparando los MC provenientes de tumores y tejidos adyacentes libres de patología, resultó una lista de factores diferencialmente representados de los cuales MIP-3α o proteína inflamatoria de macrófagos 3 alfa surge como el factor más relevante como posible mediador del reclutamiento de las MSCs hacia el tumor. La validación funcional del eje quimiotáctico MIP-3α / CCR6 sugiere que este eje estaría involucrado, al menos en parte, en la migración de MSCs hacia tumores. En suma, hemos logrado identificar un factor relevante para la modulación de la migración de las MSCs hacia el tumor, factible de ser utilizado en estudios posteriores para el diseño de terapias celulares contra el cáncer.

Abstract:
Tumor growth depends greatly on the interaction of tumor cells with the surrounding microenvironment. Among other cells comprising the tumor stroma, there are local precursors and stromal precursors or mesenchymal stem cells (MSCs) that home into the tumor after being recruited from the bone marrow. Based on this, the question arises: which of the factors from the tumor microenvironment are responsible for the migration of bone marrow-derived MSCs? Using an in vitro model for the tumor microenvironment represented by conditioned media (CM) from human samples of breast adenocarcinomas, we performed a proteomic study of cytokines and chemokines in 8 tumor samples, highlighting IL-6, GRO, IL-8 and MCP-1 as the most represented factors in tumor -conditioned media, with a very similar profile among all tumor samples. Looking for a model that represents the contribution of chemotactic factors from human tumors, orthotopic tumors were grown in nude mice by combining a human mammary tumor cell line with human adult fibroblasts. Using this model, we were able to quantify MSCs arriving after local migration after being injected in a peritumoral way. In a technical and functional in vitro validation, IL-6 was found to be chemotactic for MSCs but at much higher concentrations than those found in tumors; however, we cannot disregard a direct or indirect role for IL-6. Moreover, chemotactic axis involving GRO, IL-8 and MCP-1 did not reveal a significant contribution on MSCs migration. Furthermore, a statistical and functional analysis comparing MC from tumors and adjacent tissues free of pathology, resulted in a list of factors differentially represented where MIP-3α or macrophage inflammatory protein- 3 alpha emerges as the most relevant factor as possible mediator for the recruitment of MSCs to the tumor. Functional validation of the chemotactic axis MIP-3α / CCR6 suggested that this axis would be involved, at least in part, on MSCs migration to tumors. In summary, we could identify a factor relevant for the modulation of MSCs migration into the tumor, likely to be used in subsequent studies to design cell therapies against cancer.

Kamm, Gretel Betiana. "Bases genéticas de la evolución del cerebro humano: estudio evolutivo y funcional del gen NPAS3" (2014-04-24) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Comprender el origen y la evolución del cerebro humano es uno de los desafíos más sobresalientes que enfrenta la ciencia. Los cambios genéticos que llevaron a la adquisición de las capacidades distintivas del cerebro humano están codificados en nuestro genoma. La disponibilidad de más de cincuenta genomas de vertebrados permite hoy reconstruir nuestra historia evolutiva. Nuestra hipótesis es que la adquisición de nuevos patrones de expresión de genes relacionados con el desarrollo y la función cerebral en el linaje humano, habría sido crítica para la evolución de las capacidades cognitivas excepcionales de nuestro cerebro. Haciendo uso de bases de datos públicas de secuencias no codificantes conservadas con evidencia de evolución acelerada en el linaje humano (denominados HAEs por human accelerated elements), se encontró que el factor de transcripción neuronal PAS domain-containing protein 3 (NPAS3) contiene 14 HAEs, el mayor número de HAEs para un solo gen en todo el genoma humano. Usando un ensayo de expresión en peces cebra transgénicos se demostró que 11 de los 14 HAEs son capaces de activar la expresión de la proteína reportera EGFP durante el desarrollo embrionario, particularmente en el sistema nervioso. Además, utilizando ratones transgénicos, se realizó un análisis comparativo estudiando los patrones de expresión de uno de los HAEs de NPAS3 y secuencias ortólogas de chimpancé y ratón. El enhancer humano muestra una extensión del patrón de expresión en el telencéfalo. Este cambio humano específico pudo haber contribuido con la evolución de alguna de las características de nuestro cerebro.

Abstract:
Understanding the origin and evolution of the human brain is one of the greatest challenges that today science faces. The genetic changes that led to the acquisition of the distinctive capacities of the human brain are encoded in our genome. The availability of more than fifty vertebrate genomes allows unraveling our evolutionary history. Our hypothesis is that the acquisition of new expression patterns in the human lineage of genes involved with the development and functioning of the brain would have been critical for the evolution of our unique cognitive capacities. Using public databases of human accelerated conserved non coding sequences (HAEs or human accelerated elements), we found that the transcription factor neuronal PAS domain-containing protein 3 (NPAS3) contains 14 HAEs, the largest number detected for a human gene. Using an enhancer transcription assay in transgenic zebrafish we show that 11 out of the 14 HAEs activated the expression of the reporter gen EGFP during zebrafish development in the central nervous system. In addition, using transgenic mice we performed an expression pattern comparative analysis of human, chimpanzee and mouse ortholog sequences of a selected HAE. We found that the human enhancer shows an extended expression pattern in the forebrain. This human-specific change could have contributed to the evolution of some of the distinctive capacities of our brain.

Krzymuski, Martín Javier. "Determinantes moleculares involucrados en la relación cuantitativa entre el tiempo a floración y el fotoperíodo en Arabidopsis thaliana" (2014-06-10) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El éxito reproductivo de las angiospermas se encuentra fuertemente afectado por el momento del año en que ocurra la floración, que en numerosas especies es ajustado mediante la percepción del fotoperíodo. En la presente tesis se demuestra que en Arabidopsis thaliana el requerimiento de varios días largos para florecer se vincula a la necesidad de mantener elevados niveles de expresión de FLOWERING LOCUS T (FT) durante varios días para inducir la expresión de genes florales del meristema, siendo los tiempos a floración proporcionales a la integral de la expresión de FT. A su vez, este proceso presenta un ritmo de sensibilidad a FT, cuya fase de alta sensibilidad se encuentra entre ZT12 y ZT20. Por otro lado, CONSTANS (CO), que promueve la expresión de FT en condiciones fotoperiódicas inductoras, demora la floración en Arabidopsis bajo días cortos. Este efecto no está mediado por la represión de FT, como sucede en arroz con el homólogo de CO, sino vía el represor meristemático TERMINAL FLOWER 1 (TFL1). CO modula el momento diario expresión de TFL1, registrándose los mayores valores en la ventana del día en que plantas son más sensibles a FT. La presencia de TFL1 en este rango ayudaría a establecer un umbral mínimo de FT. En conjunto, los resultados sugieren que los mecanismos de integración de la señal fotoperiódica tenderían a reducir las probabilidades que la floración ocurra cuando las condiciones externas son adversas, debido a fluctuaciones en la expresión de FT vinculadas a otros factores del ambiente.

Abstract:
Reproductive success in angiosperms is closely related to the time of the year when flowering occurs, which in many species is adjusted via the perception of the photoperiod. This thesis shows that in Arabidopsis thaliana the requirement of several long days for flowering to occur is related to the need of maintaining high levels of FLOWERING LOCUS T (FT) expression for several days to induce the expression of floral identity genes. This process involves a rhythm of sensitivity to FT, in which the phase of high sensitivity is between ZT12 and ZT20. Additionally, CONSTANS (CO), which promotes FT expression under inductive photoperiod conditions, delays flowering in Arabidopsis under short days. This effect is not mediated by FT repression, as it occurs in rice with the CO homolog, but it involves the meristem repressor TERMINAL FLOWER 1 (TLF1). CO modulates the daily pattern of TFL1 expression, with higher values within the daily window in which plants are actually more sensitive to FT. Taken together, the results suggest that the mechanism of photoperiod signal integration could reduce the chances of flowering when the external conditions are adverse, due to fluctuations in FT expression linked with other environmental factors.

Langle, Yanina Verónica. "Participación del estroma en la regresión del cáncer de vejiga inducida por Bacilo Calmette-Guérin (BCG)" (2014-07-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Bacilo Calmette-Guérin (BCG) es el tratamiento estándar para prevenir recidivas y progresión del cáncer vejiga (CaV) no invasor de alto grado histológico. Utilizando un modelo de CaV murino (MB49) demostramos que BCG reduce el crecimiento tumoral a través de a) la inhibición del crecimiento de las células tumorales y b) la generación de un estroma anti-tumoral. El crecimiento de células tumorales es inhibido por la activación del receptor activador de la proliferación de peroxisomas (PPARɣ) y la regulación negativa del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR3). BCG también induce la remodelación del estroma, incrementando la proliferación y diferenciación de los fibroblastos en forma directa o a través de factores producidos por los macrófagos. Este proceso es regulado negativamente por el óxido nítrico. Uno de los factores liberados por los macrófagos es el FGF-2, el cual induce esta activación de los fibroblastos. En tumores, se observa que BCG induce la disminución de la expresión del FGFR3 en las células tumorales y el incremento en la expresión de FGFR1 y FGFR2 en el estroma. En el 50% de los tumores de vejiga de pacientes, la expresión del FGFR3 disminuye por tratamiento ex vivo con BCG. El presente trabajo describe un nuevo mecanismo de acción de BCG, plantea nuevos blancos terapéuticos y posibles marcadores pronósticos para pacientes con CaV.

Abstract:
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the standard treatment to prevent recurrences and progression of non-muscle invasive high histological grade bladder cancer (BCa). Using a murine BCa model (MB49) we have demonstrated that BCG reduces tumor growth by a) inhibiting the growth of tumor cells b) generating an anti-tumor stroma. Tumor cell growth is inhibited by activating peroxisome proliferation activated receptor gamma (PPARɣ) and the fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) down-regulation. BCG also induces stromal remodeling, increasing fibroblast proliferation and differentiation, directly or indirectly through soluble factors produced by macrophages. This process is negatively regulated by nitric oxide. FGF-2 is one of the factors released by macrophages, which induces activation and proliferation of fibroblasts. BCG induces a decrease of FGFR3 expression in tumoral cells, while inducing an increase of FGFR1 and FGFR2 expression in stromal cells. Ex vivo treatment of bladder tumors patients with BCG produced a down-regulation of FGFR3 expression in the 50% of the cases. This paper describes a novel mechanism of action of BCG that could be useful to find new therapeutic targets and prognostic markers for patients with BCa.

Saborido, Mariano Diego. "Bases farmacológicas y moleculares de las disquinesias inducidas por L-dopa en un modelo experimental de la enfermedad de Parkinson" (2014-07-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La enfermedad de Parkinson se caracteriza por una deficiencia de dopamina estriatal debida a la pérdida progresiva de neuronas de la substantia nigra pars compacta. La L-dopa es el antiparkinsoniano más eficaz, aun cuando luego de algunos años de tratamiento la mayoría de los pacientes presentan complicaciones motoras como las disquinesias. Éstas reducen la calidad de vida del paciente e interfieren con el beneficio terapéutico de la Ldopa. Se sabe que la exposición repetida a agonistas dopaminérgicos, la estimulación pulsátil de receptores dopaminérgicos estriatales y una severa degeneración nigroestriatal favorecen la aparición de disquinesias. Existe consenso respecto a que la aparición de disquinesias involucra profundos y persistentes cambios moleculares en el estriado. El objetivo general del presente trabajo fue examinar los mecanismos farmacológicos y moleculares que dan origen a las complicaciones motoras que se presentan durante la terapéutica sustitutiva con L-dopa en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Nuestros resultados avalan la participación de los receptores dopaminérgicos D1 y sugieren la participación de la proteína Fyn en el desarrollo de disquinesias. Aunque no hemos sido capaces de reducir la severidad de las disquinesias mediante la inhibición de la vía mediada por mTOR, no podemos descartar su participación en el desarrollo y consolidación del fenómeno disquinético.

Abstract:
Parkinson's disease is characterized by a deficiency of striatal dopamine due to the progressive loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. L-dopa is the most effective anti-Parkinsonian drug, even though after a few years of treatment, the majority of patients present motor complications such as dyskinesias. They reduce the quality of life of the patients and interfere with the L-dopa therapeutic benefit. It is known that repeated exposure to dopamine agonists, pulsatile stimulation of striatal dopaminergic receptors and a severe striatonigral degeneration favor the emergence of dyskinesias. There is consensus that the occurrence of dyskinesias involves deep and persistent molecular changes in the striatum. The general objective of this work was to examine the pharmacological and molecular mechanisms that give rise to complications that arise during substitutive therapy with L-dopa in an animal model of Parkinson´s disease. Our results support the participation of D1 dopamine receptors and suggest the involvement of the protein Fyn in the development of dyskinesias. Although we have not been able to reduce the severity of dyskinesias by inhibiting the mTOR-mediated pathway, we cannot dismiss its participation in the development and maintenance of the dyskinetic phenomenon.

Gorojod, Roxana Mayra. "Rol de la vía autofágica-lisosomal en la muerte celular inducida por manganeso en células gliales" (2014-07-17) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El manganismo es un desorden neurodegenerativo originado por la sobreexposición crónica a Mn, cuyo cuadro clínico y vías de señales se asemejan a los de la Enfermedad de Parkinson Idiopática. El Mn se acumula preferentemente en los ganglios basales y en particular, en las mitocondrias y lisosomas, donde puede generar especies reactivas de oxígeno y afectar las membranas de estas organelas. La permeabilización de la membrana lisosomal (PML) conduce a la liberación de hidrolasas al citosol y a la apoptosis y puede también comprometer la degradación autofágica. En el presente trabajo se investigó el daño lisosomal inducido por Mn y el impacto de este evento en la muerte de las células C6 de glioma de rata. Parte de los resultados obtenidos fueron trasladados a un modelo in vivo de intoxicación aguda con Mn. Por lo tanto, el enfoque estuvo dirigido al estudio de la posible participación de la vía lisosomal en la apoptosis inducida por Mn y al rol potencial de la autofagia en este contexto celular. Los ensayos in vitro se realizaron empleando células expuestas a MnCl2 en distintas condiciones de incubación. Se demostró que el Mn induce un aumento en el tamaño de las vesículas ácidas que puede ser totalmente prevenido por preincubación con antioxidantes. Asimismo, la exposición al metal genera PML y liberación de Catepsina D (CatD) al citosol, procesos que tienen lugar rio arriba de la injuria a la mitocondria. El estudio del rol de las catepsinas en la vía de muerte celular apoptótica demostró que las CatD y B regulan los niveles de expresión de FasL, intervienen en el clivaje de caspasa-8 y Bid y en la activación de la vía de muerte mitocondrial. En este contexto, el Mn activó la autofagia como un mecanismo de supervivencia celular. Los estudios in vivo sugieren que los efectos tóxicos del Mn resultan en un daño a los astrocitos del striatum y en la alteración de los niveles de expresión de la CatD en las neuronas de ciertos ganglios basales involucrados en el manganismo. En conjunto, nuestros resultados demuestran por primera vez que los lisosomas constituyen un blanco estratégico de la toxicidad del Mn, integrando la cascada de señales implicadas en la apoptosis. En este escenario, la autofagia se desencadena en un intento de rescatar a las células de la muerte. Estos hallazgos contribuyen al conocimiento de los mecanismos de daño posiblemente activados en el manganismo y probablemente en otras enfermedades neurodegenerativas.

Abstract:
Manganism is a neurodegenerative disorder caused by chronic Mn overexposure whose symptoms and signaling pathways resemble those of idiopathic Parkinson's disease. Mn accumulates within the basal ganglia, particularly in mitochondria and lysosomes. Hence, Mn- induced reactive oxygen species may disrupt the integrity of these organelles. Lysosomal membrane permeabilization (LMP) causes the release of cathepsins and other hydrolases from the lysosomal lumen to the cytosol leading to apoptotic cell death. Moreover, LMP may induce alterations in the autophagic degradation pathway. In the present study, Mn-induced lysosomal damage and its impact on C6 rat glioma cell death were investigated. Some of these results were validated in an acute Mn intoxication in vivo model. Our approach was to study the possible involvement of the lisosomal pathway in manganese-induced apoptosis and the potential role of autophagy in this cellular context. For in vitro assays, cells were exposed to MnCl2 in different incubation conditions. We found that Mn induces an increase in acidic vesicles size, which is completely prevented by antioxidants. Moreover, Mn exposure generates PML and the release of cathepsin D (CatD) to the cytosol, both processes taking place upstream to the mitochondrial damage. CatD and B are involved in both caspase-8 and Bid cleavage, leading to the activation of the mitochondrial apoptotic pathway. Moreover, they regulate FasL expression levels. In this context, autophagy is activated as a survival pathway. In vivo studies suggested that the toxic effects of Mn result in both striatal astrocyte damage and altered expression of CatD in neurons of the basal ganglia. Taken together, our results demonstrate for the first time that lysosomes are a strategic target for Mn toxicity, integrating the signal cascades involved in apoptosis. In this scenario, autophagy is triggered as an attempt to rescue the cells from death. These findings contribute to the understanding of the damage mechanisms possibly activated in manganism and probably in other neurodegenerative diseases.

Torres Fuenzalida, José Hugo. "Biología molecular y celular de las células troncales hepáticas" (2014-08-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células troncales se definen por su con capacidad de automantenimiento y por la potencialidad de generar tipos celulares diferenciados. El hígado posee una notable capacidad regenerativa; frente a un daño extenso o reiterado la regeneración se produce por la activación de las células troncales hepáticas. Estas células se originan durante la embriogénesis hepática y se mantienen latentes durante toda la vida adulta del individuo. La historia del estudio de las células troncales hepáticas ha estado marcada por diversas controversias en torno a su existencia, su origen e identificación. Objetivo: aislar, identificar y caracterizar células troncales hepáticas y evaluar la potencialidad de la utilización de éstas como herramienta en el tratamiento de enfermedades degenerativas del hígado. Resultados: las células troncales/progenitoras hepáticas (LSPC) de rata expresaron OC2, OC3 y Thy-1, y fueron capaces de proliferar (dando origen a las células tipo ovales) cuando se cultivaron in vitro en presencia del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). La expresión de EpCAM de las LSPC de ratón se utilizó como criterio de selección para su aislamiento. La subpoblación EpCAM (+) presentó (por PCR en tiempo real) una expresión significativamente superior de citoqueratina 19, Claudina3, alfa-fetoproteína y Dlk-1. La subpoblación EpCAM (+) mostró una distribución espacial característica de secuencias repetitivas pericentroméricas y un patrón homogéneo de acetilación (K14, K23) y metilación (K9) de la histona H3. Las células EpCAM (+) fueron capaces de anidar en el bazo y migrar hacia el hígado luego del trasplante intraesplénico en ratones. Conclusión: las células EpCAM (+) presentan un patrón de expresión de genes característico y una organización nuclear particular que se correlaciona con el carácter troncal que se les atribuye a las LSCP. En este trabajo se presenta un método sencillo y eficiente para aislar LSPC de ratón.

Abstract:
Stem cells are defined by their capacity of self-renewal and by the potential to give rise to differentiated cell types. The liver has a remarkable regenerative capacity; when the damage is extended or repeated the regeneration is carried out by the activation of the liver stem cells. These cells are originated during the hepatic embryogenesis and they stay latent during the whole life of the individual. The history of the study of liver stem cells was characterized by controversies around their existence, their origin and identification. Objective: to isolate, identify and characterize liver stem cells and to evaluate their potential use as tools for the treatment of degenerative disorders of the liver. Results: the liver stem/progenitor cells (LSPC) from rat expressed OC2, OC3 and Thy-1, and they were capable of proliferate (giving rise to oval-like cells) when they were cultured in vitro in presence of hepatocyte grow factor (HGF). The expression of EpCAM by the LSPC was used as selection criteria for the isolation. The subpopulation EpCAM (+) showed (by Real-time PCR) a significantly superior expression of citoqueratin 19, claudin3, alpha-fetoprotein and Dlk-1. The sub-population of EpCAM (+) cells presented a characteristic spatial distribution of the repetitive sequences peri-centromeric and a homogeneous pattern of acetylation (K14, K23) and methylation (K9) of the histone H3. The EpCAM (+) cells were able to home in the spleen and migrate to the liver after the intra-splenic transplant in mice. Conclusion: EpCAM (+) cells exhibit a characteristic pattern of gene expression and a distinctive nuclear organization that correlate with the stemness attributed to LSPC. In this thesis, I present a simple and efficient method to isolate mouse LSPC.

Díaz Carrasco, Juan María. "Compartimentación de variantes virales entre plasma y células mononucleares de sangre periférica en pacientes con infección crónica por virus de hepatitis C" (2014-08-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El virus de hepatitis C (VHC) afecta al 3% de la población mundial, representando una de las principales causas de hepatitis crónica y trasplante hepático. En el paciente infectado, el virus existe como un espectro de mutantes que difieren en su potencial de replicación, denominado cuasiespecie. La extensa variabilidad del VHC proporciona a la cuasiespecie una alta plasticidad fenotípica y capacidad de adaptación, que favorece el mantenimiento de la infección crónica. Si bien el principal sitio de replicación del VHC es el hígado, numerosos estudios han descripto la replicación del virus en tejidos extrahepáticos, en particular en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y esto se ha asociado con el desarrollo de distintas manifestaciones extrahepáticas. Se ha relacionado a distintos genes del VHC con la compartimentación en CMSP, pero aún no está claro cuáles son los factores celulares y virales requeridos para la infección de las células linfoides, por lo que la búsqueda de patrones moleculares asociados con el linfotropismo podría aportar datos valiosos para la comprensión de este fenómeno. Además, la gran mayoría de los estudios de compartimentación se han realizado en pacientes adultos y se basan únicamente en la región HVR1 de E2. El objetivo del trabajo fue evaluar la compartimentación del VHC en CMSP y su dinámica durante la infección crónica por VHC en pacientes pediátricos mediante el análisis de genes virales involucrados en distintas etapas del ciclo de replicación viral. Se evaluó la compartimentación y la existencia de patrones moleculares asociados con el linfotropismo mediante el análisis filogenético de las secuencias de tres regiones del genoma viral: IRES, E1E2 y NS5B, obtenidas a partir de muestras seriadas de plasma y CMSP de 6 niños. Se demostró estadísticamente que existe compartimentación viral en niños, principalmente en regiones discretas dentro de E1E2 que incluyen sitios de unión a receptores, lo que sugiere que el linfotropismo del VHC podría estar determinado por restricciones en la interacción de las glucoproteínas con factores celulares involucrados en el proceso de adsorción y entrada. Si bien no se evidenció un patrón molecular asociado con el linfotropismo común a todos los casos estudiados, se observó que las regiones identificadas están sujetas a presiones selectivas diferentes en plasma y CMSP y se describieron variaciones aminoacídicas asociadas con las variantes linfotrópicas. Además de contribuir al conocimiento general acerca de la compartimentación del VHC, nuestro trabajo pone de manifiesto el importante papel que juegan las CMSP como reservorios de variabilidad genética y como compartimentos de replicación extrahepática, favoreciendo la persistencia y contribuyendo al mantenimiento de la cronicidad durante la infección por VHC en niños.

Abstract:
Worldwide prevalence of chronic hepatitis C virus (HCV) infection is estimated at 3%, representing the major cause of chronic hepatitis and liver transplantation. Within the infected patient, the virus exists as a spectrum of mutants which differ in their replication potential, termed quasispecies. The large variability of HCV quasispecies provides high phenotypic plasticity and adaptability, which favors the maintenance of chronic infection. Although the primary site of HCV replication is the liver, numerous studies have described replication in extrahepatic tissues, particularly in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and this has been associated with the development of different extrahepatic manifestations. Several viral genes have been linked to HCV PBMCs compartmentalization, but the factors required for the infection of lymphoid cells still remain unclear, and therefore the search for molecular patterns associated with lymphotropism could provide valuable data for the understanding of this phenomenon. In addition, most studies examining compartmentalization have been conducted in adult patients and are based solely on the HVR1 region of E2. The aim of this study was to assess the compartmentalization of HCV in PBMCs and its evolution dynamics during chronic HCV infection in pediatric patients by means of the analysis of certain genes involved in different stages of the viral replication cycle. Compartmentalization and the existence of molecular patterns associated with lymphotropism were evaluated by phylogenetic analysis of the sequences of three viral genes, namely IRES, E1E2 and NS5B, which were obtained from serial samples of plasma and PBMCs of 6 children. We showed that there is statistically significant compartmentalization in children, mainly in discrete regions within E1E2 that includes receptor binding sites, suggesting that HCV lymphotropism could be influenced by restrictions in the interaction of the glycoproteins with cellular factors involved in viral attachment and entry. While a common molecular pattern associated with lymphotropism was not evident in all the studied cases, it was found that the identified regions were influenced by different selective pressures both in plasma and PBMCs. Moreover, amino acid variations associated with lymphotropic variants were described. Besides contributing to general knowledge about the compartmentalization of HCV, our work highlights the important role played by PBMCs as reservoirs of genetic variability and as compartments for extrahepatic replication, favoring persistence and contributing to the maintenance of chronicity during HCV infection in children.

Fernández Bell Fano, Pablo. "Infección persistente del virus Junín in vitro: perturbación del equilibrio virus-célula como estrategia de estudio del mecanismo involucrado en este tipo de infecciones" (2014-10-31) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, pertenece a la familia Arenaviridae. Los virus pertenecientes a esta familia son capaces de causar infecciones persistentes en roedores, los cuales actúan como reservorios naturales, asegurándose así su evolución y perpetuación en la naturaleza. Asimismo, son capaces de multiplicar en una amplia variedad de cultivos celulares pudiendo desarrollar el estadio de persistencia en la mayoría de ellos. El objetivo de este trabajo fue determinar las diferencias existentes entre infecciones agudas y persistentes en cultivos de células Vero frente a tratamientos que tienden a desestabilizar el equilibrio virus célula. A tal fin, mediante la infección experimental de células Vero con la cepa XJCl3, se obtuvo una línea celular persistentemente infectada con dicho virus, denominada V3, que se utilizó como modelo de estudio. En los ensayos realizados con el agente mutagénico 5-fluoruracilo (5-FU) se observó que la susceptibilidad a la inhibición ejercida por esta droga sobre JUNV dependió del lapso transcurrido entre el momento de la infección y el tratamiento, y de la m.o.i. utilizada sugiriendo que la proporción de células infectadas al momento de tratar definía la resistencia a la droga. En este sentido, las células V3 resultaron menos afectadas por el 5-FU en comparación con las células infectadas y tratadas durante la etapa aguda. Por otro lado, el análisis del ciclo celular de células Vero mostró que la infección con JUNV generó alteraciones en la respuesta del cultivo frente a estímulos como la confluencia de las células de la monocapa y el tratamiento con agentes inductores de arresto del ciclo. Durante ensayos de transfección con proteínas virales dicha alteración del ciclo fue asociada a la nucleoproteína viral N. Sin embargo, a pesar de la aparente manipulación del ciclo celular por parte del virus no se pudo asociar alteraciones inducidas del ciclo, a una disminución en el rendimiento viral. Teniendo en cuenta que los cultivos persistentemente infectados no presentan el efecto citopático (EC) típico de las infecciones agudas de este virus en células Vero, se evaluó en primer lugar la naturaleza de dicho fenómeno. El estudio de distintos indicadores de apoptosis mostró que dicho evento seguía una cinética similar a la desarrollada por el EC viral, observándose además un incremento en la expresión de p53 y en el clivaje de la caspasa 3. Cuando estos indicadores se analizaron en células V3, los valores encontrados presentaron valores similares a los de células Vero sin infectar. Por otro lado, al analizar la respuesta de los distintos cultivos frente a la inducción de apoptosis con staurosporina (STS) o luz ultravioleta (UV) los cultivos persistentemente infectados resultaron más resistentes que los cultivos infectados de forma aguda y las células sin infectar frente a la apoptosis inducida por luz UV y todos se comportaron de manera similar frente a la STS. Este comportamiento sugiere que JUNV podría estar modulando negativamente la apoptosis durante la persistencia de manera específica frente a ciertos estímulos aunque no frente a un inductor fuerte como la STS. La resistencia al estrés térmico también fue evaluada como un parámetro diferencial entre los distintos tipos de cultivos. En forma similar a lo que sucedió con el 5-FU el virus resultó más resistente al tratamiento con calor cuando éste se aplicó a tiempos de tratamiento p.i. tardíos y a mayores m.o.i.. La síntesis de HSP-70, principal efector de la respuesta celular al shock térmico, no se asoció temporalmente con la reducción de los títulos virales. De manera similar a lo observado con la respuesta al shock térmico, el tratamiento con arsenito de sodio (Ars), inductor de estrés oxidativo, resultó menos efectivo cuanto mayor era la proporción de células infectadas en los cultivos. El conjunto de resultados permite concluir que las características diferenciales presentadas por los cultivos infectados en forma persistente serían adquiridas durante el transcurso de la infección, al menos en el caso de la resistencia a los inductores de: extinción viral (5-FU), estrés térmico y oxidativo (HS y Ars) y alteraciones del ciclo. Esta estrategia estaría basada en la acumulación de suficiente cantidad de proteínas, en particular, la nucleoproteína N, a fin de controlar las respuestas a estrés, ya sea por intervención directa de dichas proteínas o a través de la modulación en la formación de gránulos de estrés citoplasmáticos y/o de cuerpos nucleares asociados a la proteína de leucemia promielocítica.

Abstract:
Junín virus (JUNV), the etiological agent of the Argentine Hemorrhagic Fever, belongs to the family Arenaviridae. Viruses belonging to this family are able to cause persistent infections in rodents, which act as natural reservoirs, thus ensuring their evolution and perpetuation in nature. They are also able to multiply in a wide variety of cell cultures having the capacity to develop persistence stage in most of them. The aim of this study was to determine the differences in the response of acute and persistent infection of JUNV in Vero cells to treatments that tend to disrupt the virus-cell equilibrium typical of the latter. To this end, we obtained a cell line persistently infected with the virus, called V3, through experimental infection of Vero cells with JUNV XJCl3 strain, which was used as a study model. Studies performed with the mutagenic agent 5-fluorouracil (5-FU) showed that susceptibility to inhibition exerted by this drug on JUNV depended on the time elapsed between the time of infection and treatment, and the m.o.i. used suggesting that the proportion of infected cells when treatment was applied defined the degree of drug resistance. In this sense, the V3 cells were less affected by the 5-FU compared with treated acutely infected cells. On the other hand, cell cycle profile of Vero cells infected with JUNV was different from acutely and non infected cultures when subjected to conditions of cell cycle arrest. During transfection assays with plasmids expressing viral proteins, alterations of cell cycle, similar to those observed by infection, were associated with the expression of the viral nucleocapsid N. However, despite the apparent alteration of cell cycle by the virus, no effect on viral replication could be associated with experimentally induced cell cycle alterations. Given that persistently infected cultures do not exhibit the typical cytopathic effect (CE) characteristic of acutely infected Vero cells, the nature of this phenomenon was evaluated in first place. The study of various indicators of apoptosis showed that this event followed similar kinetics as the CE that took place in infected cells, with a concomitant increase in expression of p53 and cleavage of caspase-3. By contrast, the level of these apoptotic markers was similar for V3 and non-infected Vero cells. On the other hand, the response to two apoptosis inducers, staurosporine (STS) and UV radiation revealed that persistently infected cultures showed resistance to the latter whereas acutely, persistently and non-infected cells were equally susceptible to STS. This is probably due to the fact that induction of apoptosis by UV treatment is carried out by a specific cellular pathway that might be modulated by the virus during persistence, while STS exerts its effect as a multitarget agent. The tests performed to determine the effect of HSP-70 induction on JUNV replication of the virus showed that this protein was not involved in the reduction of viral titer. Similar to the results obtained with 5-FU, the virus was more resistant at late p.i. treatment times and high m.o.i.. Both heat-shock and treatment with the oxidative stress-inducing drug sodium arsenite (Ars) were effective in reducing viral titers. Further analysis of the activity of heat shock showed that its range of action embraced 2 steps of the viral cycle: the processes leading to the budding of virions and protein translation. Heat-shock response was also evaluated as a differential parameter among the different types of infected and non-infected cell cultures. Similarly to the conclusions withdrawn with 5-FU, JUNV infections were more resistant to heat-shock when treatment was applied late during infection or when high m.o.i. were employed. Synthesis of HSP-70, main effector of heat-shock response, could not be associated to the decrease in virus titer observed in heat-shocked cultures. Also, arsenite, an oxidative stress inducer, diminished viral replication. The degree of arsenite inhibition was dependent of the proportion of infected cells in the monolayer. Altogether, the results allow to conclude that the differential characteristics between JUNV acutely and persistently infected Vero cells would be acquired during the course of infection, at least for the resistance to 5-FU, heat shock, oxidative stress and altered cell cycle. This strategy would be based on the premise of accumulation of viral proteins, particularly the nucleoprotein, in order to control cellular response to stress, either directly or by modulating stress granules formation and/or nuclear bodies associated to the promielocytic leukemia protein.

Velásquez, Silvia Melina. "Las modificaciones post-traduccionales en extensinas son esenciales en la expansión polarizada de pelos radiculares en Arabidopsis thaliana" (2014-12-02) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los pelos radiculares son células individuales especializadas en la absorción de agua y nutrientes que crecen mediante expansión polarizada, proceso compartido con los tubos polínicos, axones, e hifas de hongos. No obstante, las paredes celulares imponen límites al crecimiento por lo cual, en plantas, se debe estar constantemente incorporando nuevas moléculas para lograr el crecimiento. Sus paredes celulares están compuestas por polisacáridos y proteínas ricas en hidroxiprolina (hydroxyproline-rich glycoproteins; HRPGs) que incluyen a las extensinas (EXTs). La hidroxilación de Prolinas (Hyp), una modificación post-traduccional (MPT) temprana de las HRGPs, catalizada por las Prolil-4-hidroxilasas (P4Hs), define los subsecuentes sitios de Oglicosilación en las EXTs, que son principalmente arabinosiladas. En este trabajo se exploró la función biológica de las P4Hs, las arabinosiltransferasas y las EXTs asociadas al desarrollo del pelo radicular. Inhibición bioquímica o disrupción genética de las P4Hs resultó en una interrupción del crecimiento polarizado en los pelos radiculares y en una reducción de la arabinosilación de las EXTs. En segundo lugar, se demostró que la prolil-4-hidroxilasa 5 (P4H5) y en menor medida P4H2 y P4H13, son centrales para el desarrollo del pelo mediado por EXTs. Mediante experimentos de intercambio de promotores y regiones catalíticas, se pudo mostrar que P4H2 y P4H13 tienen funcionalidades intercambiables pero son incapaces de reemplazar a P4H5. Estas tres P4Hs son direccionadas a la vía secretoria, más específicamente al Retículo y Aparato de Golgi, donde P4H5 forma dímeros con P4H2 y P4H13, sugiriendo la existencia de complejos de proteínas P4Hs. En tercer lugar, se exploró la localización sub-celular y la especificidad de sustrato de P4H5, como también la arquitectura de la pared celular resultante en el mutante p4h5. También se analizó la significancia fisiológica de las MPTs en las EXTs. Específicamente, mutantes deficientes en Hyp-O-arabinosilación o en Ser-O-galactosialción mostraron pelos más cortos, debido al efecto conjunto de una tasa de crecimiento más lenta y una interrupción temprana del crecimiento. A su vez, nuestros hallazgos resaltan que ambos tipos de O-glicosilación (Hyp-O-arabinosilación y Ser-O-galactosilación) son necesarios y tienen efectos aditivos en el correcto funcionamiento de las EXTs durante la expansión del pelo radicular. Finalmente, a través de simulaciones de dinámicas moleculares se pudo explorar la influencia de los O-glicanos en una putativa, auto-ensamblada, conformación de triple hélice de EXTs. Nuestros resultados demostrarían que una correcta O-glicosilación de las EXTs sería esencial para el auto-ensamblado de la pared celular y por lo tanto en la elongación del pelo radicular en Arabidopsis thaliana.

Abstract:
Root hairs are single cells that develop by tip growth and are specialized in the absorption of nutrients, a process shared with pollen tubes, axons, and fungal hyphae. However, structural cell walls imposed constraints prompt utilization of new molecules to accomplish tip growth in plants. Their cell walls are composed of polysaccharides and hydroxyproline-rich glycoproteins (HRGPs) that include extensins (EXTs). Proline hydroxylation, an early post-translational modification (MPT) of HRGPs that is catalyzed by prolyl 4-hydroxylases (P4Hs), defines the subsequent O-glycosylation sites in EXTs, which are mainly arabinosylated. Here, we explored the biological function of P4Hs, arabinosyltransferases and EXTs in root hair cell growth. Biochemical inhibition or genetic disruption of P4Hs resulted in the blockage of polarized growth in root hairs and reduced arabinosylation of EXTs. Secondly, we demonstrate that prolyl-4- hydroxylase 5 (P4H5), and to a lower extent P4H2 and P4H13, are pivotal for EXT-mediated root hair tip-growth. By P4H promoter and protein swaps approaches, it was shown that P4H2 and P4H13 have interchangeable functionalities but they cannot replace P4H5. These three P4Hs are targeted to the secretory pathway, most specifically to the ER and Golgi compartments, where P4H5 forms dimers with P4H2 and P4H13 suggesting the existence of P4Hs protein complexes. Thirdly, we explored the subcellular localization and substrate specificity of the P4H5, as well as the resulting cell wall architecture in the p4h5 mutant. We also addressed the physiological significance of the MPTs of EXTs. In particular, mutants who were deficient in Hyp-Oarabinosylation or in Ser-O-galactosylation showed shorter root hairs, due to both slower kinetics and premature growth termination. In addition, our findings highlights that both Oglycosylation types (Hyp-O-arabinosylation and serine-O galactosylation) are required and have additive effects for correct EXT function in root hair cell expansion. Finally, molecular dynamics simulations addressed the influence of O-glycans on a putative EXT self-assembled triple helix conformation. Our results demonstrate that correct O-glycosylation on EXTs is essential for cell wall self-assembly and hence root hair elongation in Arabidopsis thaliana.

Luque, Guillermina María. "La disrupción específica del receptor dopaminérgico D2 en lactotropos devela un rol de la prolactina en el control de la ingesta y el metabolismo" (2015-03-12) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La prolactina es una hormona altamente versátil secretada principalmente por los lactotropos de la hipófisis anterior. Su función en la reproducción y fertilidad ha sido muy estudiada, pero poco se sabe de su acción en la regulación del peso corporal y el metabolismo. Altos niveles de prolactina se observan durante la preñez y la lactancia, estados en los que se favorece la hiperfagia. Durante la preñez, los mecanismos normales que regulan el apetito son modificados para generar un balance energético positivo, incrementando la ingesta y los reservorios grasos para abastecer el requerimiento del feto en crecimiento, y ser utilizados posteriormente en la lactancia. Existen numerosos resultados que apoyan la hipótesis de que la prolactina posee un rol significativo en la regulación del peso corporal. Por ejemplo, el ratón deficiente del receptor de prolactina presenta peso corporal y depósitos de grasa disminuidos, la administración de prolactina estimula la ingesta de alimento, y niveles elevados de esta hormona de manera crónica (como ocurre durante la preñez) incrementan la ingesta posiblemente por la inducción de una resistencia a leptina. Sin embargo, ratones macho conteniendo hipófisis ectópicas muestran sólo un mínimo incremento en el peso corporal con un descenso en el tejido adiposo, y ratones hembra que sobreexpresan prolactina no muestran modificaciones en el peso. Por otro lado, en nuestro laboratorio hemos descripto que los ratones hembra carentes del receptor de dopamina D2 en todo su organismo (Drd2-/-) presentan una hiperprolactinemia crónica e hiperplasia hipofisaria, pero con pesos corporales y niveles de ingesta similares a los ratones salvajes. Cabe destacar, que el ratón Drd2-/- no resultaría un modelo óptimo para el estudio de los efectos de altos niveles de prolactina en el balance energético, dada la importancia fundamental de los receptores de dopamina D2 (RD2s) centrales en las adicciones y los mecanismos de recompensa relacionados al comportamiento alimenticio. La evidencia disponible sugiere que la falta de RD2s centrales en el ratón Drd2-/- podría estar activando mecanismos compensatorios para limitar finalmente la ingesta de alimento en este modelo hiperprolactinémico. Por lo tanto, nuestra hipótesis sostiene que la deleción específica de los RD2s solamente en lactotropos nos permitiría estudiar los efectos de altos niveles de prolactina en la ingesta y adiposidad, sin los efectos solapados, fisiológicos y patofisiológicos, presentes en el modelo mutante knockout global. Para ello usamos ratones carentes de los RD2s solamente en lactotropos (lacDrd2KO) generados por la tecnología Cre LoxP. Las hembras presentaron hiperprolactinemia crónica e hiperplasia hipofisaria, relacionada a un aumento en la proliferación celular y angiogénesis, resultando un modelo ideal para el estudio de prolactinomas resistentes a agonistas dopaminérgicos. Presentan, por otra parte, un eje de GH conservado. En los ratones hembra lacDrd2KO, pero no los machos, la hiperprolactinemia se asoció a un incremento en el peso corporal relacionado a mayores los niveles de ingesta. En cuanto a la regulación de la ingesta, en el hipotálamo observamos una expresión incrementada del péptido orexigénico Npy, mientras que los niveles de Pomc y Ppo no se vieron alterados (en contraste con los resultados previamente obtenidos en los ratones Drd2-/-). Determinamos a su vez, una posible resistencia a la leptina. Es decir que en este nuevo contexto, pudimos determinar un efecto orexigénico de la prolactina, mediado por una acción hipotalámica sobre la expresión del neuropéptido Npy. Se evidenció, además, un incremento significativo en los depósitos de grasa, tamaño de los adipocitos, triglicéridos y ácidos grasos no esterificados séricos, como consecuencia de una disminución en la expresión de enzimas lipolíticas en el tejido adiposo. A nivel hepático, el ratón hembra lacDrd2KO también presentó adiposidad incrementada, con aumento en los triglicéridos hepáticos, que no se relacionó a cambios en la expresión de enzimas lipogénicas/lipolíticas, pero sí al aumento de factores de transcripción que estimulan la lipogénesis mediada por glucosa. A su vez, los ratones hembra lacDrd2KO presentaron una intolerancia a la glucosa y deficiencia en la liberación de insulina, sin resistencia a la misma. Nuestros resultados revelan un rol fundamental de la prolactina en la ingesta y adiposidad e ilustran el valor de estudiar modelos transgénicos tejido específicos, para evaluar mecanismos patofisiológicos, de otra manera enmascarados en mutantes nulos o animales tratados con agentes farmacológicos.

Abstract:
Prolactin is a pleiotropic hormone secreted by lactotropes in the anterior pituitary gland. Although its role in reproduction and fertility has been extensively studied, less is known about its action on metabolism and body weight regulation. The high prolactin levels typically observed in pregnant and lactating females contribute to a hyperphagic state. During pregnancy, the normal homeostatic mechanisms regulating appetite are modified to generate a state of positive energy balance, increasing food intake and fat storage to supply the growing fetus with its energy requirements and to be used during lactation. Consistent with the hypothesis that prolactin has a significant role in the regulation of body weight, prolactin receptor deficient mice exhibit lower body weight and reduced fat mass, prolactin administration stimulates food intake, and chronically elevated prolactin levels, such as those seen during pregnancy, increase food intake, probably by inducing a state of leptin resistance. However, male mice bearing ectopic pituitary glands show a small increase in body weight with a decline in fat mass, and female mice overexpressing prolactin do not show greater body weight. Furthermore, we found that female mice lacking dopamine D2 receptors (Drd2-/-) exhibit chronic hyperprolactinemia and pituitary lactotrope hyperplasia but have body weight similar to that of wild-type females in adulthood as well as food intake. However, Drd2-/- mice are not an optimal model to study the effects of chronic hyperprolactinemia on energy balance, given the fundamental importance of central dopamine D2 receptors (D2Rs) in addiction and reward mechanisms related to feeding behavior. The available evidence suggests that lack of central D2Rs in the Drd2-/- model might activate compensatory mechanisms that could ultimately limit food intake in this hyperprolactinemic transgenic model. Therefore, we hypothesize that limiting Drd2 ablation specifically in lactotropes would allow us to study the effect of high prolactin secretion on food intake and adiposity, without the confounding physiological and pathophysiological mechanisms present in global null allele Drd2 mutants. We used conditional mutant mice lacking D2Rs in pituitary lactotropes (lacDrd2KO) performed by Cre loxP technology. LacDrd2KO female mice exhibited chronic hyperprolactinemia and pituitary hyperplasia related to an increase in proliferation and angiogenesis, being an excellent animal model for the study of dopamine resistant prolactinomas. They also present a preserved GH axis. In lacDrd2KO female, but not male mice, hyperprolactinemia was associated with increased body weight and food intake. Hypothalamic Npy mRNA expression was increased, while Pomc and Ppo mRNA levels were unaltered (in contrast to results in global D2R knockout mice). In addition, a state of leptin resistance was shown. Thus, the orexigenic effect of prolactin and its action on hypothalamic Npy expression were fully evidenced, leading to increased food intake. Marked increments in fat depots, adipocyte size, serum triglycerides, and nonesterified fatty acid levels were seen as a consequence of a decrease in lipolytic enzymes in adipose tissue. On the other hand, the liver of female lacDrd2KO mice had increased lipid content as indicated by oil red staining and triglyceride content, which was not related to changes in lipogenic/lipolytic enzyme expression, but with an increase in mRNA expression of lipogenic transcription factor regulated by glucose. Furthermore, lacDrd2KO female mice had glucose intolerance, deficient insulin secretion but a preserved response to it. Our results highlight an important role of prolactin in the regulation of food intake and adiposity and illustrate the value of studying cell-specific mutant mice to disentangle the pathophysiological mechanisms otherwise masked in null allele mutants or in animals treated with pervasive pharmacological agents.

Solari, Claudia María. "Generación de células madre pluripotentes inducidas y estudio de la regulación de la expresión del gen Sod2 en células madre pluripotentes" (2015-03-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células madre embrionarias (CME) son células derivadas del macizo celular interno del blastocisto de mamíferos. Poseen la capacidad de auto-renovarse indefinidamente en cultivo en condiciones apropiadas mientras que, ante los estímulos adecuados, pueden dar origen a células de las tres capas germinales, propiedad conocida como pluripotencia. En la última década ha sido posible reprogramar células terminalmente diferenciadas obteniendo así las denominadas células madre pluripotentes (CMP) inducidas (CMPI), que presentan características similares a las CME, como el perfil de expresión génica, las modificaciones epigenéticas, y sus propiedades fundamentales, auto-renovación y pluripotencia. Por esta razón y dado que además presentan ciertas ventajas, las CMPI son consideradas posibles sustitutos de las CME para diferentes aplicaciones. En el área de la medicina regenerativa, la posibilidad de generar células específicas para grupos de pacientes disminuye el riesgo de rechazo en terapias de trasplante. Por otra parte, a partir de estas células pueden desarrollarse modelos de enfermedades y evaluar fármacos en diferentes contextos genómicos. A pesar del gran avance desde el establecimiento de las CMPI, su obtención y propagación aún es un área de gran interés. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue desarrollar CMPI, como modelo complementario a las CME para estudiar diversos mecanismos moleculares relevantes para el mantenimiento de las propiedades fundamentales de estas células. Para tal fin, hemos generado CMPI mediante reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón y comprobado que las líneas obtenidas son capaces de auto-renovarse y son pluripotentes, evaluado tanto in vitro como in vivo. Una vez validadas, las utilizamos como sistema de estudio en distintos proyectos. En primer lugar, en base a resultados obtenidos previamente en el laboratorio y a la semejanza de las CMPI con las CME, estudiamos si el medio condicionado por una línea celular de granulosa bovina que permite el cultivo de CME, también proporcionaba un contexto favorable para las CMPI. Mediante la detección de la expresión de marcadores específicos y de protocolos de diferenciación in vitro e in vivo, determinamos que las CMPI pueden ser propagadas en este medio condicionado, conservando sus propiedades fundamentales. En una segunda parte de este trabajo nos centramos en el estudio de la regulación de genes relacionados con uno de los mecanismos que aseguran la estabilidad genómica de las CMP, el sistema de defensa frente al estrés oxidativo. A pesar de que ha sido reportado que la actividad antioxidante disminuye a lo largo de la diferenciación, poco se sabe acerca de la regulación transcripcional de los genes involucrados. Dada la importancia de este sistema, nos propusimos estudiar su regulación a partir de la hipótesis de que algunos de estos genes podrían ser modulados por los factores de transcripción (FT) esenciales para la auto-renovación y la pluripotencia de las CMP. Estudiamos el perfil de expresión de genes seleccionados, tanto en líneas comerciales de CME como en las CMPI obtenidas. Si bien hallamos perfiles de expresión muy variados para la mayoría de los genes analizados, observamos que el gen de la superóxido dismutasa 2 (Sod2) fue reprimido durante el proceso de diferenciación, en todos los modelos estudiados. A continuación estudiamos su regulación mediante la modulación de la expresión de los FT. Además generamos construcciones reporteras y evaluamos la actividad del promotor de Sod2 en ensayos de trans-activación. En conjunto, los resultados obtenidos a partir de las diferentes estrategias experimentales empleadas nos permitieron confirmar nuestra hipótesis, concluyendo que el gen de Sod2 es regulado por los factores fundamentales en CMP. Esperamos que las herramientas generadas y los resultados obtenidos en este trabajo contribuyan a la comprensión de los mecanismos moleculares relevantes en el mantenimiento de las propiedades fundamentales de las CMP, crítico para sus aplicaciones futuras.

Abstract:
Embryonic stem cells (ESC) are derived from the inner cell mass of the blastocyst in mammals. They have the ability to self-renew indefinitely in culture under appropriate conditions whereas, with the appropriate stimuli, they can give rise to cells of all three germ layers, property known as pluripotency. In the last decade, it has been possible to reprogram terminally differentiated cells obtaining the so-called induced pluripotent stem cells (iPSC), which have similar characteristics to the ESC, like the profile of gene expression, epigenetic modifications, and their essential properties, self-renewal and pluripotency. For this reason and since iPSC have some advantages, they are considered as possible substitutes for ESC for several uses. In the area of regenerative medicine, the possibility to generate specific cells for groups of patients decreases the risk of rejection in transplantation therapies. Moreover, disease models can be developed from these cells and drugs can be evaluated in different genomic backgrounds. Despite great progress since the establishment of iPSC, their production and propagation is still an area of great interest. One aim of this thesis was to develop iPSC as a complementary model to ESC for the study of relevant molecular mechanisms for the maintenance of the fundamental properties of these cells. To this end, we generated iPSC by reprogramming mouse embryonic fibroblasts and found that the obtained lines are capable of self-renew and are pluripotent, and this was tested in vitro and in vivo. Once validated, we used them in different projects. First, based on results previously obtained in our laboratory and the similarity of iPSC and ESC, we examined whether the conditioned medium by a bovine granulosa cell line that allows the maintenance of ESC, also provided a favorable context for iPSC culture. We detected the expression of specific markers and performed in vitro and in vivo differentiation protocols, and we determined that iPSC can be propagated in this conditioned medium, while retaining their basic properties. In the second part of this thesis, we focused on the study of gene regulation related to one of the mechanisms that ensure genomic stability of pluripotent stem cells (PSC), the defense system against oxidative stress. Although it has been reported that the antioxidant activity decreases along differentiation, little is known about the transcriptional regulation of the genes involved. Because of the relevance of this system, we decided to study its regulation based on the hypothesis that some of these genes could be modulated by transcription factors (TF) essential for PSC’ self-renewal and pluripotency. We studied the expression profile of selected genes in commercial ESC lines and in the obtained iPSC. Though we found very different expression profiles for most of the analyzed genes, we observed that superoxide dismutase 2 gene (Sod2) was repressed during the differentiation process in all studied systems. Next, we studied its regulation by modulating the expression of the mentioned TF. We also generated reporter constructions and evaluated Sod2 promoter activity in transactivation assays. Overall, the results obtained from the different experimental strategies allowed us to confirm our hypothesis, concluding that Sod2 gene is regulated by the fundamental factors in PSC. We hope that the tools generated and the results obtained in this study contribute to the understanding of the molecular mechanisms relevant for PSC’s fundamental properties, critical for future applications.

Schlesinger, Mariana. "Clonado, caracterización y estudios funcionales de las enzimas poli (ADP-ribosa)polimerasa y poli (ADP-ribosa) glicohidrolasa de Trypanosoma brucei" (2015-03-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El metabolismo de polímeros de ADP-ribosa (PAR) está involucrado en múltiples funciones celulares, como la señalización y reparación del ADN, el mantenimiento de la integridad genómica, la decisión entre la supervivencia y muerte celular y el mecanismo de muerte. Poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) y poli(ADPribosa) glicohidrolasa (PARG) son las proteínas involucradas en esta vía metabólica. PARP es la enzima encargada de sintetizar al polímero, mientras que PARG es responsable de su degradación. En Trypanosoma brucei ambas proteínas, denominadas TbPARP y TbPARG, son codificadas por un gen de copia única. En la presente tesis se muestra la caracterización de la actividad de TbPARP in vitro en la reacción de PARilación. Estudios funcionales de TbPARP y TbPARG en el contexto del parásito permitieron identificar su localización subcelular en condiciones normales y de estrés oxidativo. También se describe aquí la cinética de aparición de PAR en el núcleo. Mediante la obtención de líneas transgénicas de parásitos procíclicos sobreexpresantes de TbPARP y silenciados (ARNi) para ambas enzimas se realizaron ensayos de supervivencia a distintas concentraciones del agente genotóxico H2O2. Los mismos presentaron diferentes grados de citotoxicidad y variaciones en el mecanismo de muerte celular de acuerdo a la presencia o ausencia de polímero en el núcleo. También se estudió el efecto de la acumulación nuclear del polímero sobre la progresión del ciclo celular en cultivos transgénicos sincronizados. Palabras claves: Trypanosoma brucei, PARP, PARG, PAR, ciclo celular, estrés oxidativo, Enfermedad del sueño.

Abstract:
Poly(ADP-ribose)polymerase (PAR) metabolism is involved in multiple cellular functions such as DNA signaling and repair, maintenance of genomic integrity, switching between cell survival and death, and decision of death pathways. Poly(ADPribose) polymerase (PARP) and poly(ADP-ribose)glycohydrolase (PARG) are proteins involved in this metabolic pathway. PARP synthesizes the polymer while PARG is in charge of its hydrolysis. In Trypansoma brucei both proteins, named TbPARP and TbPARG, are codified by a single copy gene. The present thesis shows the characterization of in vitro activity of TbPARP carried out in the PARylation reaction. Functional studies of TbPARP and TbPARG in the context of the parasite allowed the identification of their subcelular localization in normal conditions and under oxidative stress. Kinetics of PAR appearance in the nucleus is also described here. We obtained transgenic lines of procyclic parasites which over-expressed TbPARP or downregulated both enzymes to perform survival assays at different concentrations of the genotoxic agent H2O2. They presented variation in the cytotoxicity levels and in the death pathway involved according to the presence or absence of PAR in the nucleus. It has also been studied the effect of PAR nuclear accumulation on cell cycle progression in synchronized transgenic cultures. Key words: Trypanosoma brucei, PARP, PARG, PAR, cell cycle, oxidative stress, African trypanosomiasis.

Beltrán González, Andrea Natalia. "Modulación de los receptores GABA Ap1 por especies reactivas del oxígeno y benzodiazepinas" (2015-03-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las especies reactivas del oxígeno (ROS) se asocian generalmente con estrés oxidativo celular, pero también tienen un importante rol como mensajeros celulares en la señalización redox, por ejemplo, modulando la actividad de los receptores de neurotransmisores y canales iónicos. Hasta el momento no se habían demostrado acciones directas de las ROS sobre los receptores GABAA. En este trabajo se estudiaron los efectos de las ROS sobre la función del receptor GABAAρ1. Se expresaron receptores homoméricos GABAAρ1 humanos en oocitos de Xenopus laevis y se registraron electrofisiológicamente las respuestas evocadas por GABA en presencia o ausencia de ROS. Las respuestas GABAAρ1 se potenciaron significativamente en presencia de H2O2, en forma reversible y dosis dependiente. Los efectos potenciadores se atenuaron en presencia de un scavenger de radicales libres, ácido lipoico, y un inhibidor de la reacción de Fenton, deferoxamina. Para identificar los residuos involucrados en las acciones de las ROS se realizaron ensayos de protección química de cisteínas con agentes selectivos de sulfhidrilos y mutagénesis sitio dirigida. Cada subunidad ρ1 contiene solo tres residuos de cisteína, dos extracelulares en el Cys-loop (C177 y C191) y una intracelular (C364) en el bucle TM3-TM4. La sustitución de la C364 por alanina o serina generó receptores mutantes completamente insensibles a la potenciación por ROS. Las cisteínas del Cys-loop no resultaron esenciales para la modulación por ROS. Nuestros resultados muestran que las ROS potencian la función de los receptores de GABAAρ1 y que la cisteína intracelular C364 es el sensor para las acciones de ROS. Por otro lado, varios subtipos de receptores GABAA son modulados alostéricamente por benzodiazepinas (BZD), drogas ampliamente usadas como ansiolíticos, hipnóticos sedantes y anticonvulsivos. Se identificó un sitio de unión a BDZs de alta afinidad y al menos tres sitios adicionales de baja afinidad en variantes heteroméricos y homomericos de receptores GABAA. Sin embargo, nunca se había reportado la modulación de receptores GABAAρ1 por BDZs y durante mucho tiempo se los asumió como completamente insensibles. En el presente estudio, se expresaron heterólogamente receptores GABAAρ1 en oocitos y se registraron las respuestas evocadas por GABA en presencia y ausencia de BDZs. El diazepam y 4'-Cl diazepam modularon las respuestas GABAAρ1 en el rango micromolar de forma reversible, dependiente de la concentración e independiente del voltaje. El diazepam potenció las corrientes de Cl- evocadas por GABA y el 4'- Cl diazepam produjo efectos bifásicos dependiendo de la concentración de GABA, mientras que Ro15-4513 y alprazolam actuaron como moduladores negativos. Las acciones de las BDZs resultaron insensibles a flumazenil. Otras BZDs no mostraron actividad significativa en condiciones experimentales equivalentes. Nuestros resultados sugieren que las BZDs pueden modular la función del receptor GABAAρ1 de forma selectiva y diferencial.

Abstract:
Reactive oxygen species (ROS) are normally involved in cell oxidative stress but also play a role as cellular messengers in redox signaling, for example modulating the activity of neurotransmitter receptors and ion channels. However, the direct actions of ROS on GABAA receptors were not previously demonstrated. In the present work, we studied the effects of ROS on GABAAρ1 receptor function. Human homomeric GABAAρ1 receptors were expressed in Xenopus laevis oocytes and GABA-evoked responses electrophysiologically recorded in the presence or absence of ROS. GABAAρ1 receptor-mediated responses were significantly enhanced in a dose-dependent and reversible manner by H2O2. Potentiating effects were attenuated by a free radical scavenger, lipoic acid, or an inhibitor of the Fenton reaction, deferoxamine. Chemical protection of cysteines by selective sulfhydryl reagents and site-directed mutagenesis studies were used to identify protein residues involved in ROS actions. Each ρ1 subunit contains only three cysteine residues, two extracellular at the cys loop (C177 and C191) and one intracellular (C364) at the TM3-TM4 linker. Mutant GABAAρ1 receptors in which C364 was exchanged by alanine or serine were completely insensitive to ROS potentiation implying that this site, rather than a cystein in the Cys-loop, is essential for ROS modulation. Our results show that the function of GABAAρ1 receptors is enhanced by ROS and that the intracellular C364 is the sensor for ROS actions. On the other hand, many GABAA receptor subtypes are allosterically modulated by benzodiazepines (BDZs), which are drugs extensively used as anxiolytics, sedative-hypnotics and anticonvulsants. One high-affinity site and at least three additional low-affinity sites for BDZ recognition have been identified in several heteromeric and homomeric variants of the GABAA receptors. However, the modulation of homomeric GABAAρ1 receptors by BDZs was not previously revealed, and these receptors, for a long a time, were assumed to be fully insensitive to the actions of these drugs. In the present study, GABAAρ1 receptors were heterologously expressed in oocytes and GABA-evoked responses electrophysiologically recorded in the presence or absence of BDZs. GABAAρ1 receptor-mediated responses were modulated by diazepam and 4´-Cl diazepam in the micromolar range, in a concentration-dependent, voltage-independent and reversible manner. Diazepam produced potentiating effects on GABA-evoked Cl- currents and 4´-Cl diazepam induced biphasic effects depending on the GABA concentration, whereas Ro15-4513 and alprazolam were negative modulators. BDZ actions were insensitive to flumazenil. Other BDZs showed negligible activity at equivalent experimental conditions. Our results suggest that GABAAρ1 receptor function can be selectively and differentially modulated by BDZs.

Mazaira, Gisela Ileana. "Modulación de la localización subcelular de factores nucleares por proteínas TPR" (2015-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los dominios TPR están constituidos secuencias en tándem de 34 aminoácidos organizadas en α-hélices antiparalelas. Las proteínas TPR mejor caracterizadas son las que forman complejos con receptores de esteroides (REs) vía la heat-shock protein de 90-kDa, Hsp90, afectando su plegamiento y ensamblado. Nuestro laboratorio demostró que las inmunofilinas FKBP51 y FKBP52 son factores TPR que regulan antagónicamente la actividad transcripcional y localización subcelular de GR y MR. El objetivo de esta tesis fue estudiar el efecto de otras proteínas TPR como PP5, SGT1α y 14-3-3σ sobre GR y AR. Demostramos que PP5 favorece la retención nuclear de REs, 14-3-3σ retrasa la importación y acelera la exportación, mientras que SGT1α no afecta su distribución subcelular, aunque inhibe la actividad transcripcional de ambos receptores. En tal sentido, PP5 y 14-3-3σ muestran una respuesta bifásica, es decir, un aumento leve de la expresión estimula la transcripción, pero se inhibe con niveles más altos. Por ende, el balance de expresión de estos factores TPR debería afectar casos como el cáncer prostático en donde estas proteínas aumenta su expresión pudiendo potencialmente afectar el balance de actividad entre AR y GR, lo que influirá en el desarrollo y progresión de la patología. Al presente no existen drogas específicas para cada proteína TPR, por lo que realizamos un abordaje farmacológico que las afecte indirectamente usando como blanco a la chaperona Hsp90 con la que forman una unidad estructural y funcional. Estudiamos una serie de compuestos diseñados por modelado computacional como potenciales inhibidores de la actividad ATPasa de Hsp90, la que siempre se ha considerado clave para su función biológica. Algunos compuestos son bases de Schiff derivadas del 2,4-dihidroxibenzaldehido o del 5-cloro-2,4-dihidroxibenzaldehido, otros son derivados del resorcinol. Como control se usó geldanamicina, una benzoquinona ansamicina que es un conocido inhibidor de Hsp90. En contraste con el efecto de esta droga, la importación de REs no se vio afectada por las drogas sintéticas. No obstante, varias de ellas inhibieron la actividad de ATPasa de la chaperona y promovieron la pérdida de viabilidad de células tumorales prostáticas, mostrando en algunos casos efectos comparables al de geldanamicina. Ninguno de estos efectos guardó relación directa con la capacidad inhibitoria de ATPasa o la estructura química del compuesto. Nuestros resultados demuestran que tanto la localización subcelular como la actividad biológica de los REs se ve regulada por el balance de expresión de las proteínas TPR con las que interactúan. Además, se demuestra que, contrario al dogma dominante en la literatura, la actividad de ATPasa de Hsp90 no guarda correlación directa con tales efectos, a la vez que se describen nuevas drogas inhibitorias.

Abstract:
TPR domains consist of tandem arrangements of 34 amino acids organized in antiparallel α-helices. The best characterized TPR proteins are those able to form complexes with steroid receptors (SRs) via the heat-shock protein of 90 kDa, Hsp90, affecting their folding and assembly. Our laboratory showed that the immunophilins FKBP51 and FKBP52 are TPR factors that regulate transcriptional activity and subcellular localization of GR and MR in an antagonistic fashion. The aim of this thesis was to study the effect of other TPR proteins such as PP5, SGT1α and 14-3-3σ on GR and AR action. We demonstrate that PP5 promotes nuclear retention of SRs, 14-3-3σ delayed both nuclear import and nuclear export rates of SRs, while SGT1α shows no affect on the receptor subcellular distribution. Nonetheless, SGT1α inhibits the transcriptional activity of both receptors. In this sense, PP5 and 14-3-3σ show biphasic response, that is, a slight increase in expression stimulates transcription, but transcription is inhibited by higher levels of expression. Therefore, the expression balance between these TPR factors should influence cases like prostate cancer, where the balance of activity between AR and GR affects the development and progression of the pathology. Because there are no specific drugs for each TPR protein, we performed a pharmacological approach to indirectly affect them using the Hsp90 chaperone partner as target.. We studied a series of compounds designed by computer modeling as potential inhibitors of the ATPase activity of Hsp90, which has always been considered key to the biological function of Hsp90. Some compounds are Schiff bases derived from 2,4-dihydroxybenzaldehyde and 5-chloro-2,4-dihydroxybenzaldehyde, others are resorcinol derivatives . Geldanamycin, a known benzoquinone ansamycin that inactivates Hsp90, was used as control. In contrast to geldanamycin, the import of SRs was not affected by the synthetic drugs. Nevertheless, they did affect tumor cell viability and inhibited the ATPase activity of the chaperone being as effective as geldanamycin itself. However, these effects were not directly related to their ATPase inhibitory activity. Our results demonstrate that both the subcellular localization and the biological activity of the SRs are regulated by the expression balance of their interacting TPR domain proteins. Furthermore, it is shown that the ATPase activity of Hsp90 is not directly related to these effects. A novel set of inhibitory compounds is also described.

Izzo, Franco. "Regulación del factor de transcripción GATA3 por progestágenos y su participación en la proliferación de células de cáncer de mama" (2015-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El factor de transcripción maestro GATA3 se encuentra involucrado en el desarrollo de la glandula mamaria y es requerido para el mantenimiento del estado diferenciado de las células epiteliales luminales. El rol de GATA3 en cáncer de mama como supresor tumoral ha sido establecido, a pesar de que el mecanismo de la pérdida de expresión de GATA3 es no ha sido descrito hasta el momento. En el presente trabajo, demostramos que la activación del Receptor de Progesterona (RP) promueve el co-reclutamiento de la metiltransferasa de histonas Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) río arriba del locus de GATA3, incrementando los niveles de trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3) e induciendo la compactación de la cromatina, lo cual resulta en la disminución de los niveles del ARNm de GATA3. Esta regulación se encuentra acoplada a una disminución de la estabilidad de la proteína GATA3, mediante la fosforilación inducida por progestágenos en el residuo serina 308 (pSer308-GATA3), seguida por degradación vía proteasoma 26S. Ambos mecanismos moleculares convergen para lograr reducir la expresión de GATA3 en células de cáncer de mama tras la activación del RP. Además, demostramos que la reducción en los niveles de GATA3 es requerida para lograr el incremento inducido por progestágenos de la ciclina A2, la cual media la transición de la fase G1 a S del ciclo celular, y se encuentra asociada a un peor pronóstico en pacientes de cáncer de mama. Finalmente, demostramos que la disminución de los niveles de GATA3 son necesarios para la proliferación celular in vitro y el crecimiento tumoral in vivo inducidos por progestágenos.

Abstract:
The master transcription factor GATA3 is involved in the development of the mammary gland and is required for the maintainance of the differentiated status of luminar epithelial cells. The role of GATA3 as a tumor suppressor has been established, although the mechanism of GATA3 expression loss has not been described so far. In the present work, we demonstrated that Progesterone Receptor (PR) activation promotes the co- recruitment of the histone methyltransferase Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) upstream of the GATA3 locus, increasing the tri-methyl lysine 27 histone H3 (H3K27me·) levels and inducing chromatin compaction, which results in GATA3 mRNA dowregulation. This regulation is coupled with a decrease of GATA3 protein stability, through progestin- induced GATA3 phosphorylation at serine 308 (pSer308-GATA3), followed by 26S- proteasome mediated degradation. Both molecular mechanisms converge to accomplish the reduction of GATA3 expression levels in breast cancer cells upon PR activation. In addition, we demonstrate that GATA3 downregulation is required to accomplish progestin-induced cyclin A2 upregulation, which mediates the G1 to S cell phase transition of the cell cycle, and is associated with a worst prognosis in breast cancer patients. Finally, we demonstrate that GATA3 downregulation is required for in vitro progestin-driven breast cancer cell proliferation and for in vivo tumor growth.

Márquez, María Mercedes. "Caracterización hidráulica del fruto de Fragaria x ananassa durante el proceso de maduración" (2015-04-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Durante la maduración de los frutos, procesos como la división celular, la expansión celular y la pérdida de turgencia requieren un control estricto de los flujos de agua. Estos flujos tienen lugar a través del sistema vascular en coordinación con los movimientos de agua celulares, dando como resultado un fenómeno hidráulico complejo. Si bien son pocos los estudios sobre procesos hidráulicos en frutos, se pudo comprobar que en etapas tardías de la maduración se pierde relación con el estado hídrico del resto de la planta. Este fenómeno se asocia a menudo con una alteración o pérdida de la función del xilema que en consecuencia determina un descenso en la conductancia hidráulica. Y si bien es sabido que los canales de agua (acuaporinas) expresados en las membranas celulares pueden jugar un rol importante en estos procesos, su participación específica resta ser elucidada. El trabajo de tesis aquí presentado se centró fundamentalmente en llevar a cabo un estudio integral de la frutilla contemplando aspectos anatómicos, fisiológicos y moleculares, que nos permitió entender el proceso general del movimiento de agua de este fruto compuesto en diferentes estadios madurativos. En base a los datos anatómicos y fisiológicos aquí presentados pudimos determinar que no existe en frutilla interrupción de la continuidad física de los vasos del xilema o pérdida de funcionalidad de los mismos. El conjunto de resultados aquí expuestos, en consonancia con los trabajos publicados acerca de la maduración de la frutas, nos ha permitido además exponer y discutir que los cambios en las fuerzas impulsoras serían responsables de la disminución de la entrada de agua vía xilema en las frutas maduras. Nuestros resultados también indican que las acuaporinas PIP1 y PIP2 presentan un patrón de expresión asociado a diferentes etapas de la maduración y que ambos subtipos se encuentran localizados en la misma membrana plasmática. En cuanto a las posibilidades de modulación del flujo de agua a través de la membrana plasmática detectamos la capacidad de regularlo mediante la co-expresión e inhibición por pH citosólico. En resumen, estos hallazgos integran la dinámica hidráulica en el proceso de maduración como un aspecto que debería ser considerado en el análisis de este proceso, no solamente para comprender la fisiología del fruto sino también para aumentar las herramientas que permitan introducir mejoras en el manejo comercial de las frutas.

Abstract:
Fruit ripening includes processes as cell division, cell expansion and loss of turgor, that request a strict control of water flows. These flows take place not only through the fruit vascular system but also are coordinated with the transcellular water movements resulting in a complex hydraulic phenomenon. Despite studies on fruits hydraulic processes are scarce, it is generally stated that at later stages of ripening the relationship between fruit and the plant water status is lost. This phenomenon is often associated with a disruption or loss of function of the xylem which consequently determines a drop in hydraulic conductance. In this context, although evidence is fueling that water channels (aquaporins) expressed in cell membranes should play an important role in these processes, their participation and specific function still demands to be elucidated. The thesis presented here intends to perform a comprehensive study of strawberry fruits, contemplating anatomical, physiological and molecular aspects, allowing us to understand the general process of water movement in different stages of fruit ripening. Based on anatomical and physiological data we determined that there is neither interruption of the physical continuity nor loss of functionality of the xylem vessels in the strawberry fruit unto the later stages (100% Red). On the other hand, the results presented here, in line with published work on other fruits, allowed us to discuss that changes in the driving forces would be responsible for the decrease in water intake by xylem in mature fruits. At the cellular level, our results also indicate that PIP1 and PIP2 aquaporins are both located in the same plasma membrane, have an expression pattern associated with different stages of ripening and can be regulated by co-expression (increasing water permeability) and cellular acidification (decreasing water permeability). In summary, these findings are integrated at hydraulic dynamics into the ripening process, as a trait that should be considered in the analysis of the overall process not only to understand the fruit physiology but also to consider when exploring the management of fruit.

Bogetti, María Eugenia. "Neurotrofinas y neuroprotección en el SNC en desarrollo: rol del NGF y sus receptores tras un evento de hipoxia perinatal" (2015-04-09) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los eventos hipóxicos que ocurren sobre el SNC en desarrollo, poseen consecuencias nocivas dada la alta vulnerabilidad del tejido nervioso a la falta de oxígeno. El presente trabajo estudia los efectos sobre el Téctum óptico en desarrollo de un evento hipóxico agudo normobárico sobre embriones de aves. Encontramos que la disminución de oxígeno en tales condiciones produce una discreta pero significativa muerte neuronal de fenotipo mayoritariamente apoptótico. Mediante la inmunomarcación observamos que existe un aumento en la expresión de NGF como estrategia de rescate celular frente a la injuria, mientras que ésta produce paralelamente una disminución en la activación del receptor TrkA. Este fenómeno es correlacionado con la muerte apoptótica observada a las 6 horas de reoxigenación. Observamos además un efecto neuroprotector por parte del NGF sobre las neuronas sometidas a hipoxia, efecto que se ve abolido en presencia de un inhibidor de la activación del receptor TrkA. Concluimos que el efecto neuroprotector ejercido por el NGF ante un evento de injuria hipóxica, posee al receptor TrkA como una molécula iniciadora clave y consideramos el momento de finalización de la hipoxia, como un período de susceptibilidad y regulación en el que el balance y estado de receptores, serían críticos en el destino de las células que sufren daño por hipoxia.

Abstract:
Hypoxic insults during CNS development have deleterious outcomes due to high vulnerability of nervous tissue to low oxygen concentration. In the present thesis, we analize the effects of a normobaric acute hypoxic event in the chick Optic Tectum embryo. We find that the low oxygen produces a discrete but significative neuronal death whose fenotype is mainly apoptotic. By immunohistochemistry technique, we determine that there is a significative increase in the NGF expression as a neuronal rescue strategy. In addition, the hypoxic injury produces a decrease in the TrkA receptor activation. This fact is correlationed with the apoptotic neuronal death observated 6 hours after reoxigenation. Additionally, we determine a NGF neuroprotector effect over neurons subject to hypoxic conditions. This condition is suppressed in presence of a TrkA activation inhibitor. We conclude that the NGF neuroprotector effect in presence of a hypoxic insult has the TrkA receptor, like an essential and initial molecule and we consider the hypoxia end like a susceptibility and regulation period. In this time, the receptors balance and state would be critic in the damaged neurons destiny in a hypoxic acute insult.

Sycz, Gabriela. "Caracterización de la vía de señalización de LOVHK implicada en mecanismos de respuesta a estrés y virulencia en Brucella spp" (2015-04-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Brucella spp. son bacterias Gram-negativas que pertenecen al grupo de las α-2- proteobacterias. Son el agente causal de la brucelosis, una enfermedad zoonótica que produce abortos e infertilidad en animales, y fiebre en humanos. Brucella es un patógeno intracelular facultativo, el cual reside en un nicho replicativo derivado del retículo endoplásmico. Su capacidad de sobrevivir dentro de las células hospedadoras se debe a los diversos mecanismos que ha desarrollado para tolerar las distintas condiciones de estrés presentes en el proceso de infección. Las bacterias pueden detectar y responder a cambios en el ambiente por medio de los sistemas de dos componentes, los cuales están formados por una Histidina Quinasa sensora (HK) y un Regulador de Respuesta (RR). Previo al inicio de este trabajo, se caracterizó en Brucella abortus 2308 una proteína histidina quinasa (LOVHK), la cual posee un dominio LOV sensible a la luz azul, un dominio PAS, seguido de un domino HK. Cuando la proteína es iluminada con luz azul, el dominio LOV inicia un fotociclo, el cual promueve la autofosforilación del dominio HK iniciando una cascada de transducción de señales que culmina con un incremento en la virulencia de Brucella. En el presente trabajo se ha estudiado la vía de señalización iniciada por LOVHK en Brucella abortus 2308. Por medio de ensayos de doble híbrido y experimentos de fosfotransferencias, se identificaron dos RRs como compañeros de interacción de LOVHK: PhyR y LovR. Los resultados in vitro sugieren que LovR podría funcionar como un sink de fosfato de LOVHK. Ensayos realizados in vivo sugieren que LOVHK, por medio de PhyR, contribuye a la activación del sistema de Respuesta General a Estrés (GSR- por sus siglas en inglés). Además, en ausencia de LOVHK la expresión de virB se encuentra alterada. Estos resultados sugieren que LOVHK podría participar en más de una vía de señalización intracelular. En resumen, los hallazgos del presente trabajo contribuyen al conocimiento del mecanismo de señalización de LOVHK y el efecto de dicha vía en la virulencia de Brucella.

Abstract:
Brucella spp. are Gram-negative bacteria that belong to the α-2-proteobacteria group. They are the causative agent o brucellosis, a zoonotic infection that causes miscarriage and infertility in animals, and a febrile disease in humans. Brucella is a facultative intracellular pathogen, which resides in a replicative niche derived from the endoplasmic reticulum. Its ability to survive inside its host is due to the different mechanisms that it has developed in order to cope with the different stress conditions that it encounters during the infection process. Bacteria can detect and respond to environmental changes through two-component signalling systems (TCS), which consist of a sensor Histidine Kinase (HK) and its cognate Response Regulator (RR). Previously, it has been characterized in Brucella abortus 2308 a histidine kinase protein (LOVHK), which has a LOV domain sensible to blue-light, a PAS domain and a C-terminal HK domain. After exposure to blue-light, the LOV domain initiates a self-contained photocycle, which promotes autophosphorylation of the HK domain, initiating a signal transduction pathway that produces an increment in Brucella virulence. In the present work, the intracellular signalling pathway initiated by LOVHK in Brucella abortus 2308 is characterized. Using two-hybrid assays and phosphotransfer experiments we identified two RRs as interacting partners of LOVHK: PhyR and LovR. These in vitro results suggest that LovR could be functioning as a phosphate-sink for LOVHK. In vivo results suggest that LOVHK, through PhyR, contributes to the activation of the General Stress Response System (GSR). Furthermore, the expression of virB is altered in the absence of LOVHK. Altogether, these results suggest that LOVHK could be involved in more than one intracellular signaling pathway. In conclusion, the results obtained in the present work contribute to the understanding of the signaling mechanism initiated by LOVHK and the effect of this pathway on Brucella virulence.

Coll, Tamara Anahí. "Mecanismos vasoactivos, metaloproteásicos y oxidantes embrio-placentarios ante la ingesta periconcepcional de alcohol" (2015-04-29) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La formación placentaria normal influencia el desarrollo embrionario a término. Alteraciones en factores que regulan la interacción materno-fetal temprana, tales como la disrupción de los niveles de óxido nítrico (NO), las metaloproteasas (MMPs) y desbalances en el estado oxidativo, son causa de placentopatía y anomalías embrionarias tempranas. Con la hipótesis que la exposición materna a alcohol desde antes de la preñez (17 días previos a la preñez) y hasta la organogénesis (día 10 de gestación (D10) genera cambios en la expresión y actividad de MMPs y de moléculas de la matriz extracelular, afecta la regulación del sistema nitridérgico, incrementa las especies reactivas del oxígeno en la interfase trofoblásticodecidual y en el embrión, y conduce a anomalías de la placentación temprana y disrupción del desarrollo embrionario durante la organogénesis, se plantearon los siguientes objetivos, luego de la administración perigestacional de 10% de alcohol a hembras murinas: 1) determinar los efectos materno en variables biométricas y reproductivas; 2) en el embrión: a) analizar la morfogénesis embrionaria, la calidad histológica y la adhesión celular, b) evaluar la expresión de moléculas de la MEC y MMPs, c) evaluar la expresión y actividad de las óxido nítrico sintasas (NOS), d) analizar los cambios en el sistema oxidativo y sus consecuencias en macromoléculas embrionarias. 3) En el tejido trofoblástico-decidual (T-D): a) analizar cambios histológicos y nucleares; b) evaluar la expresión de colágenos, proteoglicanos, ácido hialurónico y MMPs; c) analizar las alteraciones en el sistema nitridérgico; d) determinar el estado oxidativo y efectos lipídicos, proteicos y nucleares. La ingesta perigestacional de alcohol induce, al D10, pérdida de los sitios de implantación, aumento de las reabsorciones, retraso del desarrollo embrionario, disminución del crecimiento y anomalías morfológicas e histológicas embrionarias por disrupción de la expresión de cadherinas y de MMPs, colágenos y proteoglicanos, efectos posiblemente relacionados con alteraciones del sistema nitridérgico, aumento de estrés oxidativo y efectos nitrosativos y apoptóticos. El tejido trofoblástico y decidual de las hembras tratadas presentó cambios en la morfología nuclear, alteraciones del lecho vascular, disminución de los colágenos fibrilares en la MEC y alteraciones en la expresión y actividad de MMP-2. El sistema nitridérgico también fue afectado por la exposición a alcohol, evidenciado por alta concentración de nitritos, aumento de estrés oxidativo y lipoperoxidación. En conclusión, el daño histomorfológico embrio-placentario temprano por exposición perigestacional a alcohol, vinculado a alteraciones en las moléculas de la MEC, podrían ser producto, al menos en parte, de desbalances en la producción de agentes moduladores como las especies reactivas de oxígeno y el óxido nítrico en la interfase materno-embrionaria temprana.

Abstract:
Normal placental formation influences embryonic development to term. Changes in early regulating factors of maternal-fetal interaction, such as the disruption of nitric oxide levels, of metalloproteases (MMPs) and imbalances in oxidative status, cause placentophaties and early embryonic abnormalities. With the hypothesis that maternal exposure to alcohol before pregnancy (17 days prior to pregnancy) and through organogenesis (up to day 10 of gestation) causes changes in the expression and activity of MMPs and extracellular matrix (ECM) molecules, affect the regulation of the nitric oxide system, increases the reactive oxygen species in the trophoblast - decidual interface and in the embryo, leading to abnormal placentation and early disruption of embryonic development during organogenesis, it was planed the following objectives after the perigestationally administration of 10% alcohol to murine females: 1) to determine the maternal and reproductive effects in biometric variables, 2) in the embryo: a) to analyze the embryonic morphogenesis, the histological quality and cell adhesion, b) to evaluate the expression of ECM molecules and MMPs, c) to evaluate the expression and activity of nitric oxide synthases, d) to analyze changes in the oxidative system and its consequences on embryonic macromolecules. 3) In the trophoblastic - decidual tissue: a) to analyze histological and nuclear changes, b) to evaluate the expression of collagens, proteoglycans, hyaluronic acid and MMPs, c) to analyze the changes in the nitric oxide system, d) to determine the oxidative status and lipid, protein and nuclear effects. The perigestational alcohol intake induces, at D10, loss of the implantation sites, increased resorption, embryonic development retardation, decreased growth and morphological and histological embryonic abnormalities by disrupting cadherin expression and MMPs, collagen and proteoglycan defects possibly related to alterations of nitric oxide system, increased oxidative, nitrosative stress and apoptosis. The trophoblast and decidual tissue from treated females showed changes in nuclear morphology, abnormal vascular bed, fibrillar collagens decrease and altered expression and activity of MMP-2. The nitridergic system was also affected by exposure to alcohol, by showing high concentrations of nitrite, increased oxidative stress and lipid peroxidation. In conclusion, the histomorphological placental and embryo damage after perigestational early exposure to alcohol was linked to alterations in the ECM molecules, and could be due to, at least in part, imbalances in the modulating agents such as reactive oxygen species and nitric oxide in the early maternal-embryonic interface.

Castronuovo, Cynthia Celeste. "Análisis de las bases moleculares de la resistencia a la quimioterapia y estrategias para su optimización: rol de las proteínas ABC, la apoptosis y la transformación celular" (2015-05-21) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El objetivo principal de esta tesis doctoral fue contribuir a la búsqueda de soluciones más eficaces para el tratamiento de diferentes enfermedades hepáticas como la hepatitis crónica causada por el HBV y el HCC. Los resultados más relevantes son: A) diferentes co-polímeros de PEO-PPO produjeron una reducción en la expresión de BCRP –bomba transportadora de drogas, entre otros compuestos- y un aumento en la acumulación intracelular del antitumoral doxorrubicina, en líneas celulares derivadas de HCC. La sensibilidad a la doxorrubicina se incrementó hasta 41 veces, lo cual muestra una posible capacidad de los mismos de quimiosensibilizar células MDR. B) estos copolímeros indujeron apoptosis y un aumento en los niveles de ARNm de bax y h-tert. C) uno de los análogos nucleosídicos estudiados presentó actividad anti-HBV. D) uno de los co-polímeros analizados redujo la replicación del HBV. E) la proteína X del HBV (HBx) -salvaje o mutante (I127T/K130M/V131I)- presentó efectos pro y antiapoptóticos. F) HBx y la replicación de HBV en su conjunto aumentaron la expresión de diversas proteínas -MRP1, MDR1 y BCRP- involucrados en el transporte de drogas antivirales y anticancerosas. Estos resultados en conjunto tendrían potenciales nuevas implicancias en la oncogénesis hepática y en la terapéutica antiviral y anticancerosa.

Abstract:
The main objective of this thesis was to contribute to the discovery of more effective treatments of various liver diseases such as chronic hepatitis caused by HBV and HCC. The most important results are the following: A) Different PEO-PPO co-polymers produced a reduction in the expression of BCRP -drug pump transporter, among other compounds-, and an increased intracellular accumulation of the antitumor doxorubicin, in cell lines derived from HCC. Doxorubicin sensitivity increased to 41 times, which shows a possible ability of co-polymers to chemosensitisation MDR cells. B) These copolymers induced apoptosis and increased mRNA levels of bax and h-tert. C) One of the nucleoside analogues studied herein had anti-HBV activity. D) One of the copolymers analyzed decreased HBV replication. E) The HBV X protein (HBx) -wild type or mutant (I127T/K130M/V131I)- had pro and anti-apoptotic effects. F) HBx and HBV replication as a whole increased expression of various proteins -MDR1, MRP1 and BCRP- involved in the transport of antiviral and anticancer drugs. These results together would have potential new implications in hepatic oncogenesis and in antiviral and anticancer therapeutics.

Toledo, María Fernanda. "Estudio sobre funciones específicas de proteínas MAGE-I y su relevancia en oncología" (2015-06-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las proteínas MAGE-I (Melanoma Antigen Gene) constituyen una de las familias multigénicas más grandes con expresión tumoral, la cual agrupa a los Mage-A, Mage-B, Mage-C. Estos genes se caracterizan por su expresión específica en tumores, por su alta conservación de secuencia (todos contienen un dominio común llamado MHD, Mage Homology Domain) y por su localización en el cromosoma X. Las primeras observaciones funcionales mostraron una correlación entre los altos niveles de expresión algunos Mage-A y la resistencia a drogas antitumorales. Así es que en los últimos años se ha investigado la potencial función de estos genes en distintos modelos. Nuestro grupo de trabajo ha aportado al estudio de los genes mage-I el mecanismo por el cual MageA2 causa la resistencia a ciertos agentes quimioterapéuticos e impide el gatillado de la senescencia inducida por PML mediante la activación de oncogenes como Ha-Ras. Estos mecanismos involucran, por un lado, la interacción de MageA2 con el oncosupresor p53 y la inhibición de su actividad transcripcional por la unión MageA2/HDAC3 (deacetilasa de histonas 3) formando el complejo inhibitorio p53/MageA2/HDAC3; y, por otro lado, une en forma directa a PML-IV (proteína de la leucemia promielocítica–3) interfiriendo en el eje PML-IV/p53. Las observaciones sobre la función y/o localización de otros MAGE-I nos llevaron a elaborar nuestra primera hipótesis: la conservación de secuencia dentro de esta familia de proteínas no implicaría necesariamente una redundancia funcional. Por otro lado, dada la relevancia de la función de p53, nos llevó a formular nuestra segunda hipótesis de trabajo: podrían existir vías intracelulares capaces de proteger a p53 de la actividad de MageA2. En la primera parte de este trabajo de Tesis caracterizamos otro miembro de la familia MAGE-I, del subgrupo B: la proteína MageB2 logrando evidenciar que la expresión de MageB2 induce proliferación en distintas líneas celulares en forma independiente de la inhibición de p53. Vinculamos la actividad de MageB2 a la regulación de factores de transcripción pro-oncogénicos como de la familia E2Fs y c-Myc. Además MageB2 se acumula en el nucléolo, aunque su distribución comprende tanto en citoplasma como en el núcleo también, dato que nos llevó a evaluar y evidenciar su asociación a los ribosomas. En la segunda parte de este trabajo de Tesis determinamos que la expresión de p14ARF (p14, Alternative Reading Frame) revierte la inhibición que MageA2 ejerce sobre p53 causando la relocalización de MageA2 del núcleo a los nucléolos en forma similar a lo que hace con Mdm2, un inhibidor de la función de p53. En conjunto, estos resultados demuestran que las proteínas MAGE-I podrían participar en el balance que existe en las células tumorales entre factores prooncogénicos y proteínas supresoras de tumor. Ciertas proteínas MAGE-I como MageA2 puede bloquear la actividad de p53, pero a su vez ser regulada por p14- ARF (en el caso que la célula tumoral la expresara). Por otro lado MageB2 colabora con el fenotipo proliferativo mediante la regulación de factores de transcripción oncogénicos como E2Fs y c-Myc.

Abstract:
MAGE-I (Melanoma Antigen Gene) proteins are one of the larger tumor expression multigenic families, which bring together the Mage-A, Mage-B, Mage-C. These genes are characterized by its specific expression in tumors, by its high sequence conservation (all contain a common domain called MHD, Mage Homology Domain) and because of its location on the X chromosome. The first functional observations showed a correlation between the Mage-A high expression levels and its resistance to antitumor doxorubicin and paclitaxel drug. So, among this past few years it have been published works about the potential function of these genes. Our working group had contributed to the mage-I genes study describing the mechanism by which MageA2 causes the resistance to certain chemotherapeutic agents in human melanoma cells and reduces the senescence induced by oncogenes such as ha-Ras in normal cells. This mechanism involves inhibition of the transcriptional activity of the p53 oncosupresor by the action of histone deacetylases, HDACs. More recently, we have shown that MageA2 is capable to bound directly to PML-IV (promyelocytic leukemia protein-IV) interfering with the senescence induced by the PML-IV/p53 axis. Our observations on the function and/or localization of others MAGE-I proteins led us to develop our a first hypothesis: the conservation of sequence within the MAGE-I family not necessarily implies functional redundancy. On the other hand, given the importance of p53 function, our second hypothesis is that: there might be some intracellular pathway able to protect p53 activity from MageA2. In the first part of this Thesis work we have characterized another MAGE-I family member from B group: the MageB2 protein, showing that its expression induces induces proliferation in different cell lines independently of p53. MageB2 links this activity to the regulation of pro-oncogenic transcription factors, as c-Myc and E2Fs family. Also, MageB2 accumulates in the nucleolus, although distribution comprises both in cytoplasm and nucleus too. These data prompted us to verify and evidence that MageB2 could be linked to ribosome function. In the second part of this thesis we determined that p14ARF (p14, Alternative Reading Frame) expression reverses the MageA2 inhibition exerted on p53. We observed that p14ARF expression causes MageA2 relocalization from the nucleoplasm to the nucleoli in a similarly way that relocates Mdm2, an inhibitor of p53 function. Taken together, these results demonstrate that MAGE-I proteins may participate in the balance that exists in tumor cells between pro-oncogenic factors and tumor suppressor proteins. Certain MAGE-I proteins such as MageA2 can block the p53 activity, but in turn can be regulated by p14ARF (in the case that the tumor cell express it). On the other hand, MageB2 collaborates with the proliferative phenotype through regulation of oncogenic transcription factors such as E2Fs and c-Myc.

Blüguermann, Carolina. "Estudio de la participación de la citoquina LIF en el proceso de diferenciación de células madre embrionarias humanas a cardiomiocitos" (2015-06-29) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células madre embrionarias humanas (CMEh) se caracterizan por su capacidad para auto-renovarse, sin perder sus propiedades, casi ilimitadamente. Una de las principales propiedades de estas células es la pluripotencia, es decir la capacidad para diferenciarse y dar origen a las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo. Debido a su capacidad de autorenovación y a su naturaleza pluripotente las CMEh representan un modelo experimental único para numerosas áreas de investigación en biología y medicina. Estudios recientes realizados para dilucidar los mecanismos que dirigen la diferenciación de CMEh a cardiomiocitos in vitro, han recapitulado muchos de los procesos que ocurren in vivo durante el desarrollo cardíaco temprano. Numerosos trabajos han demostrado que el factor inhibitorio de leucemia (LIF por su nombre en inglés) puede promover la proliferación o inducir la diferenciación celular de manera específica, dependiendo del tipo celular o estadío del desarrollo en el que actué. No obstante, poco se sabe acerca de la relevancia biológica de esta citoquina durante el proceso de diferenciación cardíaca humana. El objetivo principal de nuestro proyecto de investigación consistió en estudiar el rol de LIF durante la generación y el mantenimiento de cardiomiocitos a partir de CMEh. Para ello, en primera instancia, desarrollamos un nuevo protocolo de diferenciación de CMEh a cardiomiocitos, que incluye el uso de un medio de composición definida y el agregado secuencial de factores específicos que dirigen la diferenciación hacia mesodermo cardíaco. A continuación, evaluamos el efecto del agregado de LIF en diferentes etapas de la diferenciación cardiaca. Nuestros resultados nos permiten postular que la presencia de LIF a lo largo de la diferenciación cardíaca ejerce un efecto citoprotector que estaría asociado a una diminución de los niveles de apoptosis. En una segunda etapa logramos generar en nuestro laboratorio una línea de células pluripotentes inducidas (CMPIs) a partir de la reprogramación de fibroblastos dérmicos y evaluamos su rendimiento al ser sometidas al protocolo de diferenciación cardíaca. Las CMPIs presentan expresión génica, proteica y modificaciones epigenéticas muy similares a las CMEh. Estas características las equiparan a las CMEh, y por ende son vistas como substitutos accesibles. Palabras clave: Células madre embrionarias humanas, mesodermo, diferenciación cardíaca, LIF, gp130/STAT3, células madre pluripotentes inducidas.

Abstract:
Human embryonic stem cells (hESCs) are commonly defined as undifferentiated cells that can proliferate indefinitely and have the capacity of both self-renewal and differentiation, giving rise to all three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm. Because of their capacity for self-renewal and their pluripotent nature, hESCs represent a unique experimental model for many areas of research in biology and medicine. Recently, numerous studies on the mechanisms that direct the differentiation of hESCs into cardiomyocytes in vitro, have recapitulated many of the processes that occur in vivo during early cardiac development. However, one of the most important challenges that the application of stem cells in cardiovascular regenerative medicine faces, is the great difficulty to obtain these specialized cells in sufficient quantity and purity. Numerous studies have shown that leukemia inhibitory factor (LIF) can promote proliferation or induce cell differentiation, depending on the cell type or stage of development in which it acts. However, little is known about the biological relevance of this cytokine during human cardiac differentiation. The main objective of our research was to study the role of LIF in the generation and maintenance of cardiomyocytes from hESCs. To this end, we developed a new differentiation protocol of hESCs into cardiomyocytes, which includes the use of a defined composition medium and the sequential addition of specific factors (in restricted time windows) that direct differentiation into cardiac mesoderm. Finally, we evaluated the effect of the addition of LIF at various stages of cardiac differentiation. Our results allow us to postulate that the presence of LIF during cardiac differentiation exerts a cytoprotective effect as a consequence of the reduction in the level of apoptosis. As a second objective, we generate in our laboratory, a line of induced pluripotent stem cells (hiPSC) from dermal fibroblasts and evaluate its performance when subjected to the cardiac differentiation protocol. hiPSC have very similar gene, protein and epigenetic expression profile when compared to hESCs, and therefore, are considered as accessible substitutes. Key words: Human embryonic stem cell, mesoderm, cardiac differentiation, LIF, gp130/STAT3, Induced pluripotent stem cells.

Ferrero, Florencia Victoria. "Función de las protocadherinas en cluster alfa en interacciones intercelulares" (2015-06-29) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las protocadherinas en cluster (Pcdh) son un grupo de glicoproteínas de la superficie de las neuronas que se expresan en regiones específicas del sistema nervioso central (SNC) de los vertebrados (cerebro, corteza, bulbo olfatorio, médula espinal, hipocampo). Dada su similitud con otras moléculas de adhesión (pertenecen a la superfamilia de las Cadherinas, involucradas en adhesión celular dependiente de calcio -Ca(2+)- y a que su presencia está enriquecida en las sinapsis, podrían ayudar a determinar la especificidad de algunas conexiones sinápticas. Su función es aún desconocida. Consisten en más de 50 genes, codificados por tres clusters de genes muy relacionados entre sí: alfa, beta y gama. A través de splicing alternativo se generan múltiples isoformas alfa y gama, lo que potencialmente genera una enorme variabilidad en moléculas de la superficie celular. La expresión combinada de estas variantes podría ayudar a establecer, hasta cierto punto, la identidad neuronal. Se sabe que neuronas individuales expresan distintas isoformas de Pcdh en forma monoalélica y estocástica, a excepción de la isoforma c2. En este trabajo de tesis intentamos comenzar a comprender el rol biológico de esta diversidad. Logramos determinar que las isoformas Pcdh alfa 4 y c2 entablan interacciones intercelulares exclusivamente homofílicas. Este hallazgo tiene importantes implicancias respecto del posible rol de las Pcdh en la generación de diversidad neuronal ya que es compatible con modelos de interacción proteína-proteína que conducen a la distinción entre terminaciones “propias” y “no propias” de las neuronas. Además, encontramos indicios de que ciertas isoformas de Pcdh podrían tener comportamientos diferentes respecto de otros miembros del mismo cluster. Por ejemplo, en cultivos celulares donde sobreexpresamos la isoforma alfa c2, esta muestra una mejor localización en los contactos célula-célula a medida que transcurre el tiempo, a diferencia de lo que ocurre con las isoformas alfa 4 o alfa 8. A pesar de que, como mencionamos más arriba, estas proteínas pertenecen a la superfamilia de las cadherinas y conservan algunos motivos típicos de las mismas, observamos que se comportan distinto de las cladherinas clásicas. Comparando las isoformas de Pcdh alfa con la cadherina clásica E-cadherina (Ecad), logramos demostrar que no están involucradas en procesos de reciclado de la membrana plasmática, que no median una fuerte adhesión célula-célula, y que el Ca2+ no parece afectar su localización en los contactos célula-célula ni su procesamiento proteolítico. Por otro lado, encontramos que las Pcdh alfa pueden sufrir proteólisis en la membrana de una manera similar a la de las cadherinas clásicas. Nuevamente observamos diferencias entre las Pcdh, esta vez en el nivel de clivaje proteico entre distintas isoformas de Pcdh del cluster alfa. Palabras clave Protocadherina, cluster, adhesión, homofílico, interacción célula-célula

Abstract:
Clustered protocadherins (Pcdh) are a group of neuronal surface glycoproteins that are expressed in specific regions of the central nervous system (CNS) of vertebrates (brain cortex, olfactory bulb, spinal chord, hippocampus). Because of their similarity with other adhesion molecules (they belong to the Cadherin superfamily, involved in calcium -Ca(2+)- dependent cell adhesion) and enriched presence at synapses, they could be involved in determining the specificity of some synaptic connections. Their function remains unknown. They consist of over 50 genes encoded by three closely related gene clusters: alpha, beta and gamma. Alternative splicing generates multiple alpha and gamma isoforms, potentially producing enormous variability in cell surface molecules. The combinatorial expression of these variants could help to establish, to some extent, neuronal identity. It is known that single neurons express Pcdh isoforms monoallelically and stochastically, with the exception of the "c2 type" isoform. In this project we attempted to begin to understand the biological role of this diversity. We were able to establish that Pcdh alpha 4 and c2 isoforms engage exclusively in homophilic intercellular interactions. This finding has important implications regarding a possible role for Pcdh in the generation of neuronal diversity because it is compatible with protein-protein interaction models that lead to distinction of “self” and “non-self” projections from neurons. Also, we found evidence that certain Pcdh isoforms may have a different behaviour from other members of the same cluster. For example, when we overexpress the alpha c2 isoform in cultured cells, it shows a better localization to cell-to-cell contacts over time, unlike what happens for alpha 4 or alpha 8 isoforms. Even though, as we mentioned above, this proteins belong to the cadherin superfamily and they posses some of their typical motifs, we observed they behave differently from classic cadherins. By comparing Pcdh alpha isoforms against Ecadherin (Ecad), we could demonstrate that they are not involved in membrane recycling processes, that they do not mediate strong cell-cell adhesion and that Ca2+ does not seem to affect their localization to cell-cell contacts nor their proteolytic processing. On the other hand, we found that Pcdh alpha can undergo proteolysis at the cell membrane in a way similar to that of classic cadherins. Again, we observed differences among Pcdh, this time at the level of protein cleavage between different Pcdh alpha isoforms. Key words Protocadherin, cluster, adhesion, homophilic, cell-cell interaction

Pautasso, María Constanza. "Regulación transcripcional de las subunidades de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae" (2015-07-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células deben mantener un específico y delicado balance de su fisiología interna para el crecimiento y funcionamiento óptimos. El mantenimiento de este balance interno es crítico y variaciones del ambiente pueden resultar en una variedad de perturbaciones celulares que pueden romper el equilibrio interno celular, provocando de esta forma una interrupción de flujos metabólicos, desestabilización de estructuras celulares y perturbación de gradientes químicos, entre otros, que conducen a una inestabilidad general. Las células deben ser capaces de proteger y mantener la homeostasis interna frente a la variabilidad de las condiciones externas. La levadura Saccharomyces cerevisiae, ha evolucionado sistemas de sensado y redes de señalización complejas para responder eficientemente a las variaciones repentinas y frecuentes en el ambiente externo, como son fluctuaciones de temperatura, osmolaridad, acidez del ambiente, presencia de tóxicos, y largos períodos de hambreado nutricional. Dichos mecanismos, le permiten controlar la expresión de numerosos genes que están involucrados en la división celular, caminos metabólicos, resistencia a estrés y diferenciación celular. En Saccharomyces cerevisiae una gran variedad de los procesos celulares es controlada por la vía de la proteína kinasa A dependiente de cAMP (PKA), la que consiste en un heterotetrámero formado por dos subunidades catalíticas (C) codificadas por los genes TPK1, TPK2 y TPK3, y por dos subunidades regulatorias (R) codificadas por un único gen BCY1. Entre los estímulos mejor descriptos frente a los que la PKA se activa se encuentra la presencia de fuentes de carbono fermentables en el medio. Por el contrario, tanto para el cambio a metabolismo respiratorio que permite el consumo de fuentes de carbono no fermentables, como para dar una respuesta que permita la adaptación a situaciones de estrés térmico y osmótico, es necesario que la PKA se inactive. La especificidad de la respuesta frente a distintos estímulos es determinada por varios factores como son la concentración local de cAMP, los niveles de expresión de la quinasa y del sustrato, la presencia o ausencia de proteínas de anclaje que limitan la interacción de la quinasa con su sustrato y la secuencia alrededor del sitio de fosforilación de éste. La regulación de los niveles de expresión génica de las subunidades de PKA en Saccharomyces cerevisiae ha sido poco estudiada hasta el momento. En este trabajo se buscó caracterizar la actividad transcripcional de los promotores de los genes de las subunidades de PKA en distintas condiciones de crecimiento, así como identificar globalmente vías metabólicas y específicamente proteínas de importancia en la regulación. En primer lugar, mediante la técnica de genes reporteros y la medición de los niveles de mRNA, se determinó que los niveles de actividad de los promotores de los genes de PKA son diferentes a lo largo del crecimiento, ordenándose de mayor a menor de la siguiente forma: TPK1, TPK2, TPK3 y BCY1. Empleando mutantes que exhiben una actividad de PKA desregulada o nula, se describió el comportamiento autorregulatorio negativo isoforma-dependiente de la enzima sobre los niveles de expresión de sus propios genes. En condiciones de estrés térmico y salino, sólo el promotor TPK1 es activado, y mediante el empleo de cepas mutantes de deleción de proteínas involucradas en la vía de respuesta al estrés térmico, se determinó que la quinasa Rim15, y no la quinasa Yak1, interviene en su regulación. Más aún, Msn2/4, Gis1 y Sok2, factores de transcripción río abajo de ambas quinasas, participan en la activación del promotor TPK1, y su reclutamiento fue confirmado por experimentos de ChIP. Por otra parte, el estudio de la respuesta de los promotores al crecimiento en glicerol (metabolismo oxidativo), indicó un marcado incremento de la actividad, respecto al crecimiento en glucosa (metabolismo fermentativo). El uso de mutantes de deleción de genes que codifican para proteínas que participan en la transducción de la señal de fuente de carbono permitió identificar al factor de transcripción Mig1 como represor de los promotores TPK1 y TPK2; a Mig2 como represor de los promotores de TPK2 y BCY1, y a Mig3 como represor del promotor de BCY1. Se corroboró la presencia de Mig1 en el promotor TPK1 transcripcionalmente activo mediante ensayos de ChIP. La quinasa Snf1y sus efectores río abajo, los factores de transcripción Cat8 y Sip4, que cumplen un rol importante en la respuesta al hambreado de glucosa, regulan la actividad de los cuatro promotores en presencia de esta fuente de carbono. Teniendo en cuenta que la PKA está implicada en numerosas vías de transducción de señales, y habiendo corroborado que las vías de respuesta a estrés y a fuente de carbono regulan la actividad de los promotores de los genes de sus subunidades, se realizó un estudio a nivel genómico a través del empleo de tecnología robótica (técnica Reporter-Synthetic Genetic Array), con el objetivo de identificar de forma global nuevos reguladores de la transcripción. Este estudio se llevó a cabo con células crecidas en fuente de carbono fermentable. Este análisis masivo permitió identificar distintas vías que regulan diferencialmente la actividad de los cuatro promotores de las subunidades de PKA. Los reguladores identificados fueron clasificados según la base Gene Ontology para determinar el enriquecimiento en distintas categorías. Distintos genes asociados a las categorías de transcripción, función mitocondrial, función vacuolar y metabolismo de fosfato afectan la actividad de los cuatro promotores. A su vez se identificaron también genes pertenecientes a distintas categorías regulatorias que no son compartidas por los promotores, como metabolismo de lípidos, que afecta la transcripción de TPK1, TPK2 y TPK3. Fue llamativo además, que dentro de una misma categoría que surgió como reguladora de los cuatro promotores, los genes identificados son diferentes para cada subunidad de PKA. Del análisis surgieron también los metabolitos inositol, polifosfatos de inositol, colina y fosfato como señales que regulan la transcripción de los genes de las subunidades de PKA. De este trabajo se desprende que muchos de los blancos de fosforilación conocidos de PKA que forman parte de estas rutas metabólicas, juegan a su vez un rol en la regulación transcripcional de sus subunidades, sugiriendo la posibilidad de una regulación recíproca en la que PKA coordinaría diferentes vías de señalización y estos procesos a su vez regularían la expresión de la quinasa. Este concepto está además en relación con los resultados de la primera parte del trabajo, que muestran una regulación inhibitoria de los promotores de PKA por la propia actividad de la quinasa. Como conclusión general se puede afirmar que la regulación diferencial de la expresión de las subunidades que conforman la quinasa dependiente de cAMP juega un rol importante en la determinación de la especificidad de la respuesta en el camino de señalización cAMP-PKA.

Abstract:
Yeast cells must maintain a specific and delicate balance of their internal physiology to the optimal growth and function. Variations in the environment conditions can result in a variety of cellular perturbations that break the cellular internal equilibrium, and the cells use myriad strategies to maintain these internal conditions in the face of variable and often harsh external. The yeast Saccharomyces cerevisiae has evolved sensing systems and complex signaling pathways to efficiently respond to drastic and abruptly variations in the external environment, as fluctuations of the temperature, osmolarity, acidity, presence of toxics compounds, and large periods of starvation. When environmental conditions change abruptly, the cell must rapidly adjust its genomic expression program to adapt to the new conditions. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the cAMP dependent protein kinase A (PKA) controls a wide variety of cellular processes. Yeast PKA consists in a heterotetramer with two catalytic (C) subunits encoded by the TPK1, TPK2 and TPK3 genes, and a dimer of regulatory (R) subunit encoded by the BCY1 gene. One of the best described stimuli activating the PKA is the presence of a fermentable carbon source in the growth medium; while it is necessary to inactivate PKA to allow the switch from fermentative to respiratory metabolism to occur, and to respond to heat and osmotic stress. In general, the specificity of the response to numerous stimuli is determined by several factors as the local cAMP concentration, the expression levels of the kinase and its substrates, the presence or absence of scaffold proteins which limit the interaction among the kinase and its substrates, and the sequence around the phosphorylation site in the substrate. Little is known about the expression levels of the genes encoding PKA subunits. The aim of this work was to characterize the regulation of the promoters transcriptional activity of the genes encoding the subunits of PKA in different growth conditions, including different carbon source and stress, as well as the globally identification of novel metabolic pathways and specific proteins that act as regulators of the PKA subunits transcription. As a first step, employing the reporter gene approach and measuring mRNA levels we determined that the expression level of PKA subunit promoters is different during the growth curve, having TPK1 the highest, then TPK2 and TPK3, and belonging to BCY1 the lowest one. Taking advantage of mutant strains that exhibit a deregulated activity of PKA, or a null activity of PKA, we described the negative isoform-dependent autoregulatory behavior of the enzyme in the expression regulation of its own genes. In heat and osmotic stress conditions, only TPK1 promoter is activated. Employing several strains with simple deletions of genes involved in the heat stress response, we determined that the kinase Rim15 and not the kinase Yak1, participates in TPK1 regulation. Moreover, Msn2, Msn4, Gis1 and Sok2, which are transcription factors downstream of both Rim15 and Yak1 kinases, contribute to the upregulation of TPK1 promoter, and ChIP assays revealed its presence on the promoter. On the other hand, the study of the promoters activity in the presence of glycerol as carbon source (respiratory metabolism), showed a marked increment in the promoters activity in comparison with the growth in glucose (fermentative metabolism). Using deletion mutants of proteins involved in the carbon source signal transduction pathway, we identify the Mig1 transcription factor as a repressor of the TPK1 and TPK2 promoters; Mig2, as a repressor of TPK2 and BCY1 promoters, and Mig3, as a repressor of BCY1 promoter. By ChIP assays we corroborate the presence of Mig1 on the transcriptionally active TPK1 promoter. The kinase Snf1, and its downstream effectors, the transcription factors Cat8 and Sip4, all of them having an important role under glucose starvation, regulate the activity of the four PKA subunits promoters in the presence of this carbon source. Taking into account the implication of PKA in several transduction pathways, and that the heat stress response pathway and the carbon source pathway are implicated in the regulation of the activity of the promoters of the genes encoding PKA subunits, we carried out a genomic study using robotic technology (Reporter-Synthetic Genetic Array technique), with the aim of globally identify novel regulators of the transcription. This study was performed with cells grown in fermentable carbon source. The massive analysis let us discovering distinct pathways that differentially regulate the activity of the four promoters of the PKA subunits. The identified regulators were classified according to Gene Ontology database to determine enrichment in categories. Distinct genes belonging to transcription, mitochondria functioning, vacuolar functioning and phosphate metabolism affected the activity of the four promoters. Besides we identified genes in different regulatory categories which are not shared by the four promoters, as lipid metabolism which affects the TPK1, TPK2 and TPK3 transcription. Moreover the list of genes belonging to categories regulating the four promoters is not equal. Further characterization of the results pointed to inositol and inositol polyphosphates, choline and phosphate as novel upstream signals that regulate transcription of PKA subunit genes. In general, from this work we conclude that many of the known targets of PKA phosphorylation are associated with the transcriptional regulation of PKA subunits, opening the possibility of a reciprocal regulation in which PKA would be coordinating different metabolic pathways and these processes would in turn, regulate expression of the kinase subunits. This concept is in concordance with the results of the first part of this work that showed an inhibitory regulation of the PKA promoters by its own kinase activity. The overall conclusion is that the differential expression regulation of the PKA subunits plays an important role in determining the specificity of the response in the cAMP-PKA signaling transduction pathway.

Hollender, Daiana. "Brucella abortus: tipificación molecular por MLVA en aislamientos locales, análisis in silico de sus lipoproteínas e implicancia de las lipoproteínas en virulencia" (2015-07-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La brucelosis es una enfermedad zoonótica de distribución mundial, con un alto impacto en la salud pública y en la economía. De las 10 especies de Brucella reconocidas, B. abortus es la causante de la brucelosis bovina. La publicación del genoma de varias especies de Brucella facilitó el diseño de distintos esquemas basados en marcadores moleculares. El objetivo de la primera parte de la tesis fue emplear un esquema de análisis multilocus de VNTR (Multiple Locus VNTR Analysis, MLVA) en 58 aislamientos de B. abortus de Argentina. El empleo de este esquema de MLVA nos permitió discriminar entre las dos biovariedades de B. abortus analizadas y poner de manifiesto la gran diversidad de genotipos de esta especie circulantes en el país. Además, a través del análisis mediante goeBURST se pudo relacionar a todos los genotipos entre sí y proponer al genotipo de la biovariedad 2, E1, como genotipo fundador. Este hecho ya había sido propuesto por Margaret Meyer en los años 90 basándose únicamente evidencias bioquímicas, en este trabajo se aportan, además, evidencias moleculares. Dada su localización expuesta, las lipoproteínas bacterianas cumplen una gran variedad de funciones, muchas de ellas asociadas a virulencia. En la actualidad, solo tres lipoproteínas de B. abortus, Omp10, Omp16 y Omp19, se encuentran bien caracterizadas. Como primer objetivo de la segunda parte de la tesis, nos propusimos conocer cuántas lipoproteínas están codificadas por el genoma de B. abortus S2308 y qué roles cumplen en la bacteria. Se identificaron 58 lipoproteínas de B. abortus mediante herramientas bioinformáticas. Para determinar su rol en virulencia, se generaron cepas mutantes mediante disrupción integrativa de los genes que codifican para 24 de ellas y posteriormente, se evaluó si presentan fenotipo atenuado en el modelo murino de infección esplénica. Una de las mutantes resultó atenuada (B. abortus Lp1, siendo BAB1_0009 el marco de lectura interrumpido) por lo que se realizaron diferentes estudios para caracterizarla. Posteriormente, se analizó la capacidad de generar una respuesta inmune protectora de la cepa mutante atenuada empleando el modelo de protección esplénica en ratones BALB/c. Los resultados mostraron una capacidad protectiva superior a la generada por la cepa B. abortus S19, empleada como cepa vacunal en la actualidad en bovinos. Para determinar si la 3 atenuación en virulencia de la mutante en B. abortus también se observa al interrumpir los genes ortólogos de B. suis y B. melitensis, se construyeron las respectivas cepas mutantes, se evaluó su virulencia y se caracterizaron. Se confirmó el fenotipo atenuado sólo en la cepa mutante de B. suis. Esta parte de la tesis contribuyó a determinar los posibles roles que cumplirían las lipoproteínas en B. abortus y a identificar a una lipoproteína, OppA, codificada por BAB1_0009, que participaría en virulencia en B. abortus y B. suis y que, al menos la cepa mutante B. abortus Lp1, sería capaz de generar una respuesta inmune protectora en el modelo murino. Estos resultados sientan las bases para el diseño y evaluación de nuevas vacunas contra la brucelosis.

Abstract:
Brucellosis is a zoonotic disease, worldwide spread, which remains an important problem due to economic loss and public health concern. Of the ten species described, B. abortus is the causative agent of bovine brucellosis. Publication of microorganism genomes facilitates the design of molecular markers. The aim of the first part of the thesis was to employ Multiple Locus VNTR Analysis (MLVA) scheme for strains from Argentina isolated in our laboratory. This scheme allowed differentiating each isolate to B. abortus biovar 1 or biovar 2 and to show a wide diversity among the genotypes present in our country. Also, through goeBURST analysis all the genotypes were related and the genotype of biovar 2, E1, was proposed as founder genotype. This fact have been previously proposed by Margaret Meyer based only in biochemical evidence. Our work, also, provides molecular evidence in this sense. Since lipoproteins are surface exposed, they accomplish a wide variety of roles, some of them related with virulence. Currently, only three lipoproteins of B. abortus, Omp10, Omp16 and Omp19, are well characterized. Our aim was to know how many lipoproteins are encoded by B. abortus S2308 genome and what their roles in the bacterium are. A total of 58 lipoproteins were identified by bioinformatic tools. To determine whether lipoproteins participate in functions related with virulence, 24 mutant strains were generated by integrative disruption of the genes that codes to the lipoproteins. Then, it was evaluated if they are attenuated in the murine model of spleenic infection. One of them was attenuated (B. abortus Lp1, being BAB1_0009 the ORF interrupted) and therefore it was characterized. Also, the ability to induce a protective immune response was analyzed through the spleenic protection model in BALB/c mice. The results show that the protection induced by B. abortus Lp1 was greater than the protection induced by B. abortus S19, which is the strain used as vaccine in bovine. In order to determine whether attenuation in virulence is also observed when the ortholog genes are interrupted in B. suis and B. melitensis, the corresponding mutant strains were constructed and characterized. Virulence of the mutant strains was evaluated. An attenuated phenotype was observed only in B. suis mutant strain. This part of the thesis contribute to determine the putative roles of lipoproteins in B. abortus and to identify a lipoprotein, OppA, enconded by BAB1_0009 5 that would be involved in virulence in B. abortus and B. suis. And, at least in B. abortus S2308, it would induce a protective immune response in the murine model. These results establish the basis for the development of new vaccines against brucellosis.

Questa, María. "Efectos del cultivo hipóxico sobre la reprogramación de fibroblastos humanos a células madre pluripotentes inducidas" (2015-10-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células somáticas pueden ser reprogramadas a células pluripotentes denominadas Células Madre Pluripotentes Inducidas (CMPi) y éstas, a su vez, pueden diferenciarse a cualquier tipo celular adulto. Esto es de gran importancia en los campos de la medicina regenerativa, las pruebas farmacológicas in vitro y la investigación de trastornos genéticos, dado que pueden obtenerse células pluripotentes sin enfrentar la barrera ética de la manipulación de embriones y con el valor agregado de ser genéticamente idénticas al donante de células somáticas. Por lo tanto, el estudio del proceso de reprogramación se ha vuelto cada vez más importante para mejorar los métodos en eficiencia, rapidez y seguridad. Teniendo en cuenta su interacción con factores de transcripción implicados en el estado pluripotente de la célula, los factores inducibles por hipoxia, HIF por su sigla en inglés, podrían ser de interés en el proceso de reprogramación. En el presente trabajo hemos aislado distintos tipos de células somáticas humanas, como fibroblastos, queratinocitos y células mononucleares de sangre periférica, los hemos cultivado, y hemos intentado reprogramarlos. Además estudiamos distintas condiciones de generación de CMPi, utilizando distintos vectores necesarios para la reprogramación, moléculas que modifican la estructura de la cromatina como Ácido Valproico y Butirato de Sodio, y diferentes protocolos, hasta llegar a un método confiable y reproducible. A partir de ello, hemos generado CMPi en condiciones de normoxia e hipoxia, y posteriormente las hemos cultivado a largo plazo también en ambas condiciones. Hemos validado la legitimidad bona fide de las líneas celulares generadas, evaluando la expresión de genes marcadores de estado indiferenciado y por otra parte, la pluripotencia, mediante protocolos de diferenciación in vitro, e in vivo, por formación de teratomas. Asimismo, encontramos que ambas líneas exhiben características morfológicas y proliferativas, y patrones de metilación del ADN propios de células madre pluripotentes. Estudiamos además el comportamiento de las líneas celulares en cultivo en cuanto a eficiencia de reprogramación, expresión de factores del estado pluripotente, proliferación y apoptosis. Encontramos que la hipoxia aumentó la cantidad de colonias generadas pero éstas resultaron más pequeñas en tamaño, en comparación con las colonias generadas en normoxia. Además, fue menor la expresión de marcadores del estado pluripotente en colonias de CMPi evaluadas en estadios tempranos luego de ser establecidas en hipoxia, que en las colonias generadas en normoxia. Esta expresión no aumentó cuando las colonias fueron establecidas y cultivadas a largo plazo, y luego expuestas a hipoxia aguda, pero se indujo después de una hipoxia crónica. Por otro lado, encontramos una mayor tasa de proliferación celular en CMPi cultivadas en hipoxia sin diferencias en los niveles de apoptosis. Finalmente, a fin de sentar las bases para la continuación del proyecto, generamos vectores retrovirales para poder introducir los genes de los factores HIF-1α y HIF-2α en células a reprogramar, junto con los vectores de reprogramación. Los factores HIF clonados en los plásmidos retrovirales fueron wild type y también formas mutadas que le confieren a las proteínas HIF una mayor estabilidad, y en algunos casos también una mayor capacidad de activación de la transcripción. En último lugar, investigamos el efecto de los vectores generados, en células somáticas plausibles de ser reprogramadas, y encontramos un posible efecto tóxico, probablemente debido a la acumulación de altas cantidades de proteína HIF en la célula, o de una actividad transcripcional de los genes blanco tan alta que conlleva muerte celular. Dado que la expresión del gen introducido por el vector retroviral se puede controlar debido a que utilizamos un sistema modulable Tet-Off, encontramos que un tratamiento con el agente represor disminuye la muerte celular, y podría ser necesario a la hora de co-transducir con estos vectores y los vectores de reprogramación. Esperamos que los resultados y las herramientas generadas en este trabajo contribuyan a la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la reprogramación y al desarrollo de protocolos para la generación de CMPi de alta calidad y con alta eficiencia. PALABRAS CLAVE células madre, células madre embrionarias humanas, células madre pluripotentes inducidas, hipoxia celular, reprogramación nuclear, pluripotencia, estado pluripotente, diferenciación

Abstract:
Somatic cells can be reprogrammed into pluripotent cells called Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) and these, in turn, can be differentiated into adult cell type. This is of great importance in the fields of regenerative medicine, pharmacological in vitro testing and genetic disorder research, as pluripotent stem cells can now be obtained without facing the ethical barrier of embryo manipulation, and with the added value that these are genetically identical to the somatic cell donor. Hence, through the study of the reprogramming process itself, it has become increasingly important to improve reprogramming methods in terms of efficiency, speed and safety. Given their interaction with transcription factors involved in stemness, Hypoxia Inducible Factor, HIF, may be of interest in the reprogramming process. In the present work we isolated different types of human somatic cells, like fibroblasts, keratinocytes and peripheral blood mononuclear cells, we have cultured them and tried to reprogram them. Moreover, we have studied different conditions for the generation of iPSC, using different vector necessary for reprogramming, molecules that modify the structure of chromatin like Valproic Acid and Sodium Butyrate, and different protocols, until we obtained a reliable and reproducible method. Based on this, we have generated iPSC in normoxia and in hypoxia, and subsequently cultured them long-term in both conditions as well. We validated the bona fide legitimacy of the cell lines generated, by evaluating the expression of stemness marker genes and, on the other hand, by evaluating pluripotency, through in vitro differentiation protocols, and in vivo, by teratoma formation. Also, we have found that both lines exhibited morphological and proliferative characteristics and DNA methylation patterns typical of pluripotent stem cells. Furthermore, we studied the cell lines’ behavior in culture regarding reprogramming efficiency, expression of stemness factors, proliferation and apoptosis. We found that hypoxia increased the amount of colonies generated but these turned out to be smaller in size, when compared to colonies generated in normoxia. Moreover, stemness marker expression was lower in iPSC colonies evaluated in early stages after being established in hypoxia, than in colonies established in normoxia. This expression did not increase when colonies were established and cultured in the long-term, and then exposed to acute hypoxia. Nevertheless, these markers’ expression was up-regulated after chronic hypoxic culture. In addition, we also found a higher proliferation rate for stem cells in hypoxia and no differences in apoptosis levels. Finally, in order to provide a continuation to the project, we generated retroviral vectors to be able to introduce HIF-1α and HIF-2α genes in cells to be reprogrammed, together with the reprogramming vectors. The HIF cloned in the retroviral plasmids were wild type and also mutated forms, which provide the HIF proteins with more stability and in some cases, also increased transcriptional activation ability. Lastly, we investigated the effect of these vectors, on somatic cells capable of being reprogrammed, and we found a possible toxic effect, probably due to the accumulation of high amounts of HIF proteins in the cell, or such a an elevated target gene transcriptional activity, that it generated cell death. Given the fact that the gene introduced by the retroviral vector can be controlled, since we used a modulable Tet-Off system, we found that a treatment with the repressor agent decreases cell death, and might be necessary for the co-transduction with these vectors and the reprogramming vectors. We hope that the results obtained and the tools generated in this work will contribute to the understanding of the molecular mechanisms involved in reprogramming, and to the development of high quality and highly efficient iPSC generation protocols. KEYWORDS stem cells, human embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, cell hypoxia, nuclear reprogramming, pluripotency, stemness, differentiation

Regueira, Mariana. "Mecanismos moleculares involucrados en la regulación de la oxidación de ácidos grasos en células de Sertoli" (2015-11-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La célula de Sertoli (CS), componente somático del tubo seminífero, provee el soporte estructural y nutricional para el desarrollo de las células germinales. La CS metaboliza glucosa a lactato, principal sustrato energético para las células germinales, por lo que se ha postulado que utiliza ácidos grasos (AG) como fuente energética propia. Los factores de transcripción de la familia de los PPARs son receptores activados por ligando que participan en la regulación del metabolismo de AG en diversos tejidos. El objetivo general del presente trabajo de tesis fue estudiar los mecanismos moleculares que intervienen en la regulación del metabolismo energético en el túbulo seminífero. Para ello se utilizó como modelo experimental el cultivo de CS de rata de 20 días de edad. Se observó que la activación farmacológica de PPAR α y PPAR β/δ produce un aumento en la oxidación de AG y en la expresión de genes vinculados con su transporte y metabolismo (FAT/CD36, CPT1, LCAD y MCAD). Además, se observó que sólo la activación de PPAR β/δ regula de manera simultánea la oxidación de AG y la producción de lactato. Asimismo, se evaluaron posibles mecanismos fisiológicos que podrían conducir a la activación de los PPARs en el túbulo seminífero. Se observó que las células germinales apoptóticas (CGA) y el ácido palmítico, AG que podría provenir de la hidrólisis de las gotas de lípidos –generadas por la fagocitosis de CGA– o del exterior de la célula, regulan la expresión de genes vinculados con el transporte y metabolismo de AG y por otra parte, que en dicha regulación participa la activación del PPAR β/δ. Por último, se evaluó la posible regulación hormonal de la oxidación de AG en CS y la participación del PPAR β/δ en dicha regulación. Se demostró que existe una modulación diferencial del metabolismo de AG por FSH y bFGF en CS. Se observó que FSH –hormona anabólica de la CS– disminuye la oxidación de AG y aumenta la expresión génica sin participación de PPAR β/δ, mientras que bFGF regula positivamente el catabolismo de AG y la producción de lactato de manera PPAR β/δ dependiente. En su conjunto, estos resultados revelan la existencia de una compleja regulación de los mecanismos moleculares que participan en la oxidación de ácidos grasos y la producción de lactato en CS que refleja el ajuste fino del metabolismo energético en el túbulo seminífero necesario para una adecuada espermatogénesis.

Abstract:
The purpose of this study was to evaluate the molecular mechanisms involved in the regulation of the energetic metabolism in the seminiferous tubule. To achieve this purpose Sertoli cell (SC) cultures obtained from 20-day-old rats were used. We observed that the pharmacological activation of PPAR α and PPAR β/δ increases fatty acid (FA) oxidation and the expression of genes involved in FA transport and metabolism. However, only activation of PPAR β/δ increases SC lactate production as a result of an increase in pyruvate availability. Next, we evaluated possible physiological mechanisms implicated in PPARs activation in the seminiferous tubule. SC were cocultured with apoptotic germ cells or treated with palmitic acid. We observed that both treatments increase the expression of genes that are involved in FA transport and metabolism with the participation of PPAR β/δ activation. Finally, we evaluated the possible hormonal regulation of FA metabolism in SC. We observed that FSH –the SC trophic hormone– decreases FA oxidation and increases gene expression and lactate production in a PPAR β/δ independent manner. On the other hand, we observed that bFGF –a growth factor secreted by germ cells– increases FA oxidation, CPT1 expression and lactate production in a PPAR β/δ dependent manner. Altogether, these results suggest that in SC a fine-tuning of FA metabolism and lactate production occurs in order to ensure the energetic requirements of SC and germ cells simultaneously.

Rodríguez, María Cecilia. "Estudio del rol de la proteína de cápside del virus TMV-Cg en la modulación de la expresión génica y en la alteración de factores endógenos del hospedante Arabidopsis thaliana" (2015-12-03) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las enfermedades producidas por patógenos virales generan cuantiosas pérdidas en la producción de cultivos de importancia agropecuaria. El impacto de los virus en la alteración de la expresión génica explica, en parte, las reducciones en el rendimiento de estos cultivos. Por este motivo, entender los mecanismos por los cuales los virus modulan la expresión de genes del hospedante es de vital importancia para proponer estrategias antivirales efectivas o perfeccionar las que se están utilizando en la actualidad. En este estudio, se empleó una línea transgénica de Arabidopsis thaliana que expresa la proteína de cápside del virus TMV-Cg (CgCP) con el objetivo de estudiar el efecto de esta proteína en las alteraciones de la expresión génica y su concomitante impacto sobre los mecanismos de defensa. Inicialmente, se analizó el efecto de la CgCP sobre la expresión de genes implicados en vías de defensa, observándose que la CgCP modula negativamente la expresión de genes que participan de la vía de defensa mediada por ácido salicílico (SA, por sus siglás en inglés) y que, además, tienen un rol reportado frente a defensa antiviral. A continuación, se procedió a analizar el impacto global de la CgCp sobre el transcriptoma de A. thaliana por medio de un microarreglo realizado en plantas que expresan la CgCP. Los resultados indicaron que la CPCg altera la expresión de genes que están implicados en una amplia variedad de procesos. El uso de herramientas bio-informáticas permitió determinar que la CgCP regula negativamente la expresión de una red de genes que presentan en sus regiones promotoras motivos de respuesta a los factores de transcripción W-BOX y al factor Non-Expressor of PR 1(NPR1), un factor central en la vía del SA. Paralelamente, se observó que durante la infección con el virus TMV-Cg los genes dependientes de la vía de SA son incrementados a tiempos tempranos de infección, mientras que su expresión disminuye a tiempos tardíos. Por otra parte, se observó que la expresión de la CgCP en plantas de A. thaliana produce un retraso en el crecimiento. En base a estas observaciones, se procedió a estudiar la capacidad de la CgCP de alterar la estabilidad de las proteínas DELLA, las cuales están implicadas en la regulación de vías de desarrollo, como también en la supresión de la vía de defensa mediada por SA. Se observó que la proteína CgCP altera la estabilidad de la proteína RGA, una de las cinco proteínas DELLAs codificadas por el genoma de A. thaliana. Por otra parte, ensayos realizados con el virus TMV-Cg mostraron que el virus altera la estabilidad de otra proteína DELLA, la proteína GAI. Además, plantas mutantes para cuatro de los cinco genes que codifican proteínas DELLAs acumularon menores niveles del virus TMV-Cg que las plantas salvajes. En conclusión, los resultados de esta tesis muestran que la CgCP altera la expresión de un amplio conjunto de genes de A. thaliana. En particular, esta proteína modula negativamente un grupo de genes de defensa, dependientes de la vía de SA, a través de la estabilización de las proteínas DELLA. Estos resultados sugieren que la CgCP alteraría la estabilidad de las proteínas DELLAs como un mecanismo para modular negativamente las respuestas de defensa antivirales.

Abstract:
Phytopathogenic viruses produce significant losses on economically important crops species. Those losses are mostly dependent on the alterations of gene expression during viral infections. Consequently, the study of the virus-induced alterations in the gene expression profile is important for the development of strategies to reduce the losses caused by plant virus. In this study we used transgenic Arabidopsis plants that express the capsid protein of TMV-Cg (CgCP) with the aim of studying alterations in gene expression and defense mechanisms. First, we studied a subset of genes involved in antiviral defense pathways that are regulated by salicylic acid (SA), and found that CgCP negatively modulates the SA mediated defense pathways. Then, we studied the global impact of CgCP expression in the A. thaliana’s transcriptome. The results indicate that the CgCP alters the expression of genes that are involved in a wide range of processes. By means of the use of bioinformatic tools, we found CgCP negatively regulates a gene network dependent on Non-Expressor of PR 1(NPR1), which is a central player in the SA mediated response. In parallel, we observed that the expression of this set of genes is also altered during TMV-Cg virus infection. The expression is up-regulated at early time post infection and downregulated at late time of TMV-Cg infection. Also, we observed that the CgCP expression reduces plant growth of A. thaliana. Based on these data, we proceeded to study the alterations of DELLA proteins by CgCP, which are involved in the regulation of development and defense pathways. We found that the CgCP alters the stability of RGA, which is one of the five DELLA proteins codified by A. thaliana. Furthermore, the stability of DELLAs proteins was altered during the TMV-Cg infection. Moreover, it was observed that DELLA proteins negatively modulated the defense transcript profiles during TMV-Cg infection. As a result, TMV-Cg accumulation was significantly lower in the quadruple-DELLA mutant Arabidopsis plants than in wild type plants. Taken together, in this study we demonstrated that CgCP alters the expression of genes involved in a wide range of processes, particularly, negatively regulates the salicylic acid-mediated defense pathway by stabilizing the DELLA proteins. These results suggest that CgCP alters the stability of DELLAs as a mechanism of negative modulation of antiviral defense responses.

Jaramillo Ortiz, José Manuel. "Desarrollo de candidatos vacunales contra Babesia bovis basados en vectores virales y proteínas recombinantes" (2016-03-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La babesiosis bovina es una enfermedad parasitaria trasmitida por garrapatas y causada por los protozooarios intraeritrocíticos Babesia bovis y B. bigemina. Esta infección provoca importantes pérdidas económicas en varias regiones tropicales y subtropicales del mundo donde el vector está presente. En nuestro país, la zona ganadera afectada incluye el noreste y noroeste por encima del paralelo 33°S en donde la garrapata vector Rhipicephalus microplus encuentra las condiciones ecológicas adecuadas para su desarrollo. La vacunación contra la babesiosis bovina es una de las medidas de control existente para esta parasitosis y se realiza en terneros menores a los nueve meses de edad utilizando principalmente hemovacunas refrigeradas a base de cepas vivas atenuadas de estos parásitos. Si bien esta vacuna es efectiva en una única dosis, confiriendo protección durante toda la vida útil del bovino, presenta algunas desventajas en su producción, vida media y logística de distribución. Por este motivo, el desarrollo de alternativas vacunales que superen estas dificultades resulta de interés para mejorar las condiciones sanitarias de la región y aumentar la competitividad del sector. En este presente trabajo de tesis, se han desarrollado tres candidatos vacunales basados en las regiones inmunodominantes de tres antígenos de B. bovis altamente conservados e inmunodominantes para el bovino; estos son las proteínas MSA-2c (del inglés, Merozoite Surface protein – 2c), RAP-1 (Rhoptry Associated Protein – 1) y HSP20 (Heat Shock Protein 20). Estos 3 antígenos se han obtenido en dos plataformas de expresión diferentes: como vectores virales no replicativos y como proteínas recombinantes. El primer candidato es un virus vaccinia Ankara modificado (rMVA), un poxvirus no replicativo que codifica en un único marco de lectura estas tres regiones antigénicas como un multiantígeno al que denominamos rMABbo. Asimismo se ha desarrollado un Adenovirus recombinante (rAd) que codifica el mismo multiantígeno. También, se han obtenido en un sistema procariota las tres proteínas por separado y el multiantígeno recombinante como única poliproteína. Con los tres inmunógenos desarrollados, se estudió la respuesta inmune celular y humoral inducida por los mismos en el modelo murino en esquemas de vacunación “prime – boost” homólogos y heterólogos. Los resultados mostraron que la vacunación heteróloga que combinó el prime con rAd o con el rMABbo y el boost con el virus rMVA resultaron ser más efectivas que sus esquemas homólogos, pudiendo detectarse en ambos tipos de esquemas heterólogos altos títulos de anticuerpos específicos de tipo IgG con una mayor proporción del isotipo IgG2a, niveles significativos de IFN secretado y un alto porcentaje de células CD4+ y CD8+ productoras de una y ambas citoquinas de perfil Th1: IFNγ y TNFα Los aportes de este trabajo de tesis permitieron desarrollar nuevos inmunógenos recombinantes basados en un diseño racional de antígenos y plataformas de expresión para optimizar la respuesta inmune protectiva hacia Babesia bovis. Además se ha caracterizado la respuesta inmune inducida en el modelo murino, permitiendo dilucidar los aspectos claves a tener en cuenta para seleccionar la mejor estrategia vacunal a ser evaluada frente al desafío con Babesia bovis en bovinos, único modelo biológico para este parásito.

Abstract:
Bovine babesiosis is a tick – borne disease caused by the intraerythrocytic protozoan parasites Babesia bovis and B. bigemina. This infection causes economic losses in tropical and subtropical areas where the tick is present. In Argentina, the livestock area affected includes the northeast and northwest of the parallel 33° S, where the natural vector Rhipicephalus (Boophilus) microplus finds the ecological conditions for its development. To prevent babesiosis outbreaks in endemic areas, 4-9-month-old calves are vaccinated with live attenuated strains of both parasites. Even though these vaccines are effective in a single dose, conferring protection throughout the life of the bovine, they have some disadvantages in their production, half-life and distribution logistics. Hence, the development of alternative vaccines to overcome these difficulties is of great interest to improve sanitary conditions in order to increase the competitiveness of the livestock production. In this present work, three vaccine candidates have been developed. These immunogens are based on the immunodominant regions of three highly conserved B. bovis antigens that are also immunodominant for cattle: MSA-2c (Merozoite Surface protein - 2c), RAP-1 (Rhoptry Associated Protein - 1) and HSP20 (Heat Shock Protein 20). These three antigens were obtained on two different expression platforms: as non-replicative viral vectors and as recombinant proteins. The first candidate is a recombinant modified vaccinia Ankara vector (rMVA), a nonreplicative poxvirus which encodes an open reading frame of a multi-antigen (rMABbo) . This multi-antigen includes B and T cells epitopes of the three antigens mentioned above. In addition, a recombinant adenovirus (rAd) expressing the same rMABbo was developed. Besides, the complete rMABbo and each of the three antigens were expressed separately in E.coli and purified by affinity chromatography for delivery as subunit vaccines. The humoral and cellular immune responses induced by the three vaccine candidate were evaluated in both homologous and heterologous prime – boost immunizations. The results show that heterologous immunization combining the rAd or the rMABbo as a prime, with rMVA as a boost elicit the most effective immune response in terms of high specific IgG antibody titters with a major IgG2a subclass proportion (indicating a Th1 immune response), a significant level of secreted IFNγ and high percentages of both CD4+ and CD8+ T cells producing both IFNγ and TNFα cytokines. The present work contributes to the development of a new generation vaccine candidates based on a rational design and antigen expression platforms to optimize the protective immune response to Babesia bovis. The characterization of the immune response in the murine model is also an accessible approach to optimize the best vaccination strategy to be evaluated in cattle which is the only biological model against Babesia bovis infection.

Sahores, Ana. "Rol de la vía FGF2/FGFR en la resistencia a la terapia hormonal en cáncer de mama" (2016-03-17) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El 75% de los carcinomas mamarios expresan receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP) y son susceptibles a una terapia endocrina. Sin embargo, con el tiempo, algunos pacientes desarrollan resistencia (resistencia hormonal adquirida) y otros no responden al tratamiento desde el comienzo (resistencia constitutiva). En nuestro laboratorio, utilizando modelos de carcinomas mamarios murinos y humanos, hemos demostrado que los tumores respondedores a la terapia con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) tienen mayor expresión de la isoforma A del RP (RPA) que de la isoforma B (RPB). A su vez, los tumores con resistencia constitutiva o adquirida, se caracterizan por manifestar la relación inversa (RPB>RPA). Se han propuesto diversas hipótesis para explicar los mecanismos que conducen a la resistencia endócrina, entre ellas, la activación constitutiva de vías de transducción de señales. La vía que involucra al FGF2 y sus receptores está constituida por cuatro receptores (FGFR1-4) y cinco isoformas de FGF2 con distinto peso molecular: la isoforma de 18 kDa o LMW-FGF2 y las de alto peso o HMW-FGF2 de 22; 22,5; 24 y 34 kDa. En trabajos previos demostramos que, en muestras de carcinomas mamarios humanos, existe una asociación significativa entre la expresión de FGFR2 y REα; también observamos una correlación positiva entre la expresión de FGFR1 y un alto grado histológico. Demostramos también que, en tumores sensibles a la terapia endocrina, el FGFR2 activado por el FGF2 estromal participa en el crecimiento tumoral a través de la activación de los RP. Si bien se ha demostrado que la vía del FGF2/FGFR se encuentra desregulada en numerosas neoplasias y patologías del desarrollo, en muestras de pacientes con cáncer de mama aún es controvertida la asociación entre la expresión de FGF2 y el pronóstico de la enfermedad. En base a estos antecedentes, nuestra hipótesis de trabajo es que durante la adquisición de la resistencia endocrina se produce un cambio en la expresión y señalización de FGF2 que favorece el crecimiento y la progresión tumoral. Nuestro objetivo general fue evaluar el rol de la vía FGF2/FGFR en el crecimiento y la progresión del cáncer de mama. En primer lugar, utilizamos el modelo murino de carcinomas mamarios generados en nuestro laboratorio. Observamos, tanto por inmunohistoquímica como por Western blot, que las variantes resistentes de tres familias tumorales diferentes (C4, 59 y C7) expresan mayores niveles de FGFR1 y FGF2 que los tumores sensibles. Por inmunohistoquímica, observamos que el FGF2 se localiza predominantemente en el epitelio o en el estroma tumoral de las variantes resistentes y sensibles, respectivamente. Es interesante observar que, el análisis de la expresión de las distintas isoformas de FGF2 reveló que las variantes resistentes expresan mayores niveles de las isoformas HMW-FGF2 que las variantes sensibles. Asimismo, mediante ensayos de ELISA mostramos que, en los tumores resistentes adquiridos y constitutivos, la localización es mayormente intracelular y extracelular, respectivamente. Luego, evaluamos la funcionalidad de la vía de FGF2/FGFR en cultivos primarios de células epiteliales de las tres familias tumorales. Observamos que el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular de tumores sensibles y resistentes constitutivos, pero no afecta la proliferación celular de los tumores resistentes adquiridos de la familia C4. Por otra parte, el tratamiento con dos inhibidores distintos de FGFR, PD 173074 y BGJ398, inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres familias tumorales, lo que indica un rol proliferativo de esta vía. Sin embargo, al realizar ensayos in vivo con el inhibidor BGJ398, éste sólo reduce parcialmente el crecimiento tumoral de las variantes C4-HI (sensible) y C7-HI (resistente constitutiva). El inhibidor no tuvo efectos significativos sobre el crecimiento tumoral de las variantes resistentes de la familia C4, aunque indujo signos de regresión tumoral temprana en todas las variantes tumorales ensayadas (C4-HI, C4-2-HI, C4-HIR, 59-HI, C7-HI). Las diferencias en el alcance de los efectos observados en cultivo e in vivo sugieren que deben desarrollarse inhibidores con mayor eficacia in vivo. En conjunto, los resultados obtenidos con el modelo murino muestran una correlación positiva entre la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 con la resistencia hormonal y sugieren que, en la progresión tumoral, habría un aumento en la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 en el epitelio tumoral. Este aumento conduce a un cambio de una señalización paracrina en las variantes sensibles, a una autocrina o intracrina en los tumores resistentes constitutivos o adquiridos, respectivamente. A continuación, validamos los resultados en un modelo de cáncer de mama humano, para lo cual utilizamos la línea celular T47D-WT y sus variantes: la línea T47D-YA, con alta expresión de RPA y sensible a MFP, y la línea T47D-YB, con alta expresión de RPB y resistente a MFP. Por inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y Western blot, observamos que la línea T47D-YB expresa mayores niveles de FGFR1, FGFR2 y HMW-FGF2 respecto de la línea T47DYA. Por otro lado, el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular en las líneas T47D-WT e -YA pero no altera su proliferación en las células T47D-YB. La línea resistente presenta mayor actividad basal de la vía de FGF2/FGFR, ejemplificada en la fosforilación de FRS2 y activación predominantemente de la vía de AKT, en comparación con la línea sensible. El LMW-FGF2 modularía principalmente la activación de las vías mencionadas en las líneas T47D-WT e -YA, lo que sugiere una activación constitutiva en la línea resistente. El BGJ398 inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres líneas celulares, indicando que la vía de FGF2/FGFR cumple un rol proliferativo. Finalmente, generamos variantes de la línea T47D-YA que sobreexpresan las isoformas de 18 y 22,5 kDa de FGF2 y evaluamos su efecto sobre la sensibilidad a MFP, TLP y TAM. En ensayos de recuento celular observamos que la sobreexpresión de las isoformas de 18 y 22,5 kDa promovió un aumento en la tasa de proliferación celular y resistencia al tratamiento endocrino en comparación con la línea T47D-YA infectada con el plásmido vacío (T47D-YA-Vac). La resistencia a MFP se mantuvo aún en ensayos in vivo y se observaron signos de malignidad en los tumores primarios, particularmente en la línea T47D-YA-22,5. Esto se evidenció en la capacidad para invadir tejidos adyacentes al tumor, como piel, músculo y tejido adiposo. Si bien algunos de los animales portadores de tumores T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa focos metastásicos en los pulmones, 100% de los ratones con T47D-YA-22,5 presentaron metástasis pulmonares y un mayor número de focos con respecto a T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa. Nuestras observaciones indican que el FGF2 promueve el crecimiento tumoral en ambas variantes, sensibles y resistentes. Sin embargo, los resultados sugieren que, en los tumores sensibles, el estroma proveería el FGF2 que induciría el crecimiento tumoral a través de sus receptores de membrana y el RP de forma paracrina. Por otro lado, en los tumores resistentes, el propio parénquima tumoral expresaría elevados niveles de FGF2 (particularmente LMW-FGF2) y que, a través de un loop autocrino que involucra al FGFR1, gatillaría señales de proliferación, independientemente de la presencia de progestágenos o antiprogestágenos. No descartamos que exista también un loop intracrino, donde el FGF2 intracelular, particularmente las HMW-FGF2, serían responsables de la proliferación celular, resistencia a endocrina y diseminación metastásica. Nuestros estudios contribuyen a esclarecer el rol de las isoformas de FGF2 en la progresión tumoral mamaria y representan la primera evidencia de resistencia hormonal vinculada a HMW-FGF2.

Abstract:
Two-thirds of breast cancers express estrogen and progesterone receptors (ER and PR, respectively) and are standard targets for endocrine therapy. Most tumors initially respond to endocrine therapy, but many will eventually develop resistance (acquired hormone resistance) while others will fail to respond from the beginning (constitutive hormonal resistance) despite expressing hormone receptors. In our lab, using murine and human mammary carcinomas, we have demonstrated that tumors which respond to antiprogestin therapy (mifepristone; MFP) express higher levels of the isoform A of PR (PRA) than the isoform B (PRB), whereas tumors with constitutive or acquired hormonal resistance have the inverse ratio (PRB>PRA). Many hypothesis have been proposed to explain the mechanisms that lead to endocrine resistance, among them, the constitutive activation of proliferative pathways. In humans, the FGF2/FGFR pathway is formed by four receptors (FGFR1-4) and five FGF2 isoforms with different molecular weight: low molecular weight isoform or LMW-FGF2 of 18 kDa and high molecular weight isoform or HMW-FGF2 of 22; 22,5; 24 and 34 kDa. In previous experiments and using human breast cancer samples, we found a significant association between the expression of FGFR2 and ERα, and reported a positive correlation between the expression of FGFR1 and a higher histological grade. We also demonstrated that stromal FGF2 activates FGFR2 and PR pathways, inducing tumor growth in hormone responsive carcinomas. It has been proved that the FGF2/FGFR pathway is dysregulated in numerous neoplasias and developmental pathologies. However, its association with breast cancer progression is still controversial. Taking into account these findings, our working hypothesis is that during tumor progression there is a switch in FGF2 expression and signaling that favors tumor growth and progression. Our main goal, therefore, was to study the role of the FGF2/FGFR pathway in breast tumor growth and progression. We used a murine model of mammary carcinomas developed in our laboratory. By immunohistochemistry and Western blot assays, we observed that all the resistant variants of three different tumor families (C4, 59 y C7) express higher FGFR1 and FGF2 levels than the responsive variants. By immunohistochemistry assays we observed that FGF2 labeling was predominantly localized in the epithelium and in the tumor stroma of the resistant and responsive variants, respectively. Analysis of the expression of the different FGF2 isoforms revealed that the resistant variants express higher levels of total FGF2, especially HMW-FGF2, compared to the responsive variants. We confirmed these findings using an ELISA assay and observed that acquired and constitutive resistant tumors differ in their FGF2 localization; whereas the former predominantly accumulate it within the cell, the latter also secrete it to the conditioned media. Next, we studied the activity of the FGF2/FGFR pathway in primary cultures of epithelial cells from three tumor families (C4, 59, and C7). Treatment with LMW-FGF2 induced cell proliferation in responsive and constitutive resistant tumors, though failed to affect cell proliferation of acquired resistant tumors of the C4 family. Furthermore, treatment with two different FGFR inhibitors, PD 173074 and BGJ398, significantly inhibited basal and FGF2- induced cell proliferation in the three tumor families, indicating a proliferative role of FGF2/FGFR pathway. In in vivo experiments, BGJ398 only inhibited tumor growth of C4-HI (responsive) and C7-HI (constitutive resistant) tumors. However, blocking the pathway induced early signs of regression in all evaluated variants (C4-HI, C4-2-HI, C4-HIR, 59-HI, and C7-HI). The observed differences in the in vitro and in vivo assays suggest that more efficient inhibitors should be developed. Altogether, these findings show a positive correlation between HMW-FGF2, FGFR1 expression, and hormone resistance. Moreover, during tumor progression there would be an increase in HMW-FGF2 and FGFR1 expression in the tumor epithelium, leading to a switch from a paracrine signaling in the responsive variants to an autocrine or intracrine loop in constitutive and acquired resistant tumors, respectively. Later, we validated the results in a human breast cancer model using the T47D-WT cell line and its variants: T47D-YA with high expression of PRA and responsive to MFP, and T47D-YB with high expression of PRB and resistant to MFP. By immunofluorescence, immunohistochemistry and Western blot, we observed that T47D-YB cells express higher levels of FGFR1, FGFR2, and HMW-FGF2 compared to the T47D-YA cells. By contrast, treatment with LMW-FGF2 induces cell proliferation only in T47D-WT and -YA cells and does not affect cell proliferation in the -YB line. The resistant variant presents higher basal activation of the FGF2/FGFR pathway, evidenced by phosphorylation of FRS2 and activation of the AKT pathway, compared to the responsive cell line. Consistent with the results obtained in the murine model, LMW-FGF2 regulates the activation of the mentioned pathways only in T47D-WT and -YA cells, suggesting a constitutive activation in the resistant cell line. Treatment with BGJ398 significantly inhibits basal and FGF2-induced cell proliferation in the three cell lines, indicating that the FGF2/FGFR pathway has a proliferative role in these cell lines. Finally, we generated T47D-YA cell line variants over-expressing the 18 and 22,5 kDa FGF2 isoforms, and studied their effect over MFP, TLP, and TAM sensibility. The over-expression of both isoforms increased cell proliferation and conferred resistance to endocrine therapy compared to the T47D-YA cell line infected with the control plasmid (T47D-YA-Vac). The MFP resistance was confirmed in in vivo assays and interestingly, we even observed malignant signs in the primary tumors, particularly in the YA-22,5 kDa cell line. These tumors were able to invade adjacent tissue, such as skin, muscle, and adipose tissue. Only some animals bearing -YA-Vac and -YA-18 kDa primary tumors registered lung metastasis, while 100% of the mice bearing -YA 22,5 kDa tumors presented lung metastasis and had more foci compared to YA-Vac and -YA-18 kDa. Our results suggest that FGF2 promotes tumor growth in both responsive and resistant tumor variants. However, we believe the underlying mechanisms are not the same, given that in responsive variants the stroma is the main producer of FGF2, which induces tumor growth through its membrane receptors and PR forming a paracrine loop. In resistant tumors, the parenchyma expresses high levels of FGF2 (mostly LMW-FGF2) that triggers proliferative and survival signals through an autocrine loop involving membrane FGFR1, regardless of the presence of progestins or antiprogestins. We still cannot rule out the existence of an intracrine loop, where the intracellular FGF2 (mostly HMW-FGF2) would be responsible for cell proliferation, resistance to antiprogestins, and metastatic dissemination. Altogether, these findings help to clarify the role of the FGF2 isoforms in breast tumor progression and are the first evidence of endocrine resistance associated to HMW-FGF2.

De Rossi, María Cecilia. "Dinámica y transporte de organelas en células vivas estudiados por técnicas de partícula única" (2016-03-17) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La organización intracelular depende de motores moleculares, proteínas que transportan diversos componentes celulares con una alta precisión espacio-temporal. En los últimos años, el desarrollo de nuevas técnicas de molécula y partícula única aplicadas a motores aislados han provisto información valiosa sobre las propiedades biomecánicas de estas proteínas. Sin embargo, el mecanismo de acción de las mismas en las células aún se desconoce. El objetivo general del presente trabajo es comprender los principios que gobiernan la dinámica de organelas en células vivas. Utilizando técnicas avanzadas de microscopía y de seguimiento de partícula única, estudiamos los procesos difusivos y activos que experimentan las organelas en el entorno citoplasmático. Por un lado, exploramos cómo diversos componentes del citoesqueleto influyen en el transporte conducido por motores moleculares en la célula. En una segunda instancia, evaluamos cómo se ve afectada la dinámica del transporte bidireccional al variar las propiedades biofísicas de los motores moleculares involucrados. Los resultados obtenidos nos permitieron construir un modelo teórico para comprender ciertos aspectos claves del transporte activo en células vivas.

Abstract:
Molecular motors transport a wide variety of cellular components in the cytoplasm with high spatio-temporal accuracy ensuring the correct organization within the cell. In recent years, the development of new single molecule and single particle techniques applied to isolated motors have provided valuable information on the biomechanical properties of these proteins. However, the mechanism of action of motors in living cells is still poorly understood. The aim of this study was to understand the principles that govern the intracellular dynamics of organelles in living cells. We used advanced optical microscopy and single particle tracking techniques to study the diffusive and active processes experienced by organelles in the complex cytoplasmic environment. First, we explored how different cytoskeleton components influence the transport driven by molecular motors in the cell. Then, we assessed how the biophysical properties of molecular motors affect the dynamics of transport. The obtained results allowed us to construct a theoretical model to understand certain key aspects of transport in living cells.

Perez-Santangelo, Ma. Soledad. "El rol de los genes LSM en la regulación de los ritmos circadianos" (2016-03-17) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los relojes circadianos son mecanismos auto-regulatorios endógenos que controlan la periodicidad de múltiples procesos biológicos. Éstos proporcionan a los organismos una ventaja adaptativa que permite sincronizar distintos eventos fisiológicos y del desarrollo al momento más adecuado del día. La regulación del reloj circadiano ocurre principalmente mediante circuitos de retroalimentación transcripcional. Sin embargo, estudios recientes muestran que se requiere de mecanismos post-transcripcionales para el correcto funcionamiento del reloj. Uno de estos mecanismos es el splicing alternativo, mediante el cual se producen múltiples variantes de ARNm a partir de un único gen. En esta tesis se caracterizó el comportamiento circadiano de mutantes de factores de splicing cuyos transcriptos están regulados por el reloj. Se encontró que mutaciones en los genes LSM5 y LSM4, que codifican para componentes del complejo spliceosomal U6 snRNP, alteran el período circadiano. Un análisis global del transcriptoma de ambas mutantes reveló enriquecimiento en genes implicados en la regulación de la transcripción y respuestas de estrés, así como alteraciones en el splicing alternativo de un subconjunto de genes, incluyendo genes centrales y de vías de salida del reloj. Los genes LSM también forman parte de otro complejo involucrado en el decaimiento del ARNm. Dado que LSM4 y LSM5 son parte de los dos complejos nos preguntamos si parte del efecto circadiano observado era debido a su rol sobre el decaimiento de ARNm. Se encontró que mutaciones en varios genes involucrados en decaimiento de ARNm también generan alteraciones en los ritmos circadianos. Estos resultados apoyan la idea de que ciertos genes LSM desempeñan un rol en los ritmos circadianos, mediante la regulación del splicing alternativo y del decaimiento de ARNm, lo cual contribuye a la sincronización de los ritmos biológicos con cambios ambientales.

Abstract:
Circadian clocks are endogenous self-regulatory mechanisms that control the periodicity of multiple biological processes. These provide organisms with an adaptive advantage that allows them to synchronize different physiological and developmental events to the most appropriate time of day. The regulation of the biological clock occurs mainly through transcriptional feedback loops. However, recent studies show that post-transcriptional mechanisms are required for proper functioning of the clock. One of these mechanisms is alternative splicing, a process through which multiple mRNA variants are produced from a single gene. In this thesis we characterized the circadian behavior of splicing factors mutants, affected in genes whose transcripts are regulated by the clock. We found that mutations in LSM5 and LSM4 genes, encoding U6 snRNP spliceosomal complex components, change the circadian period. Genome-wide transcriptome analysis of both mutants revealed enrichment in genes involved in transcriptional regulation and stress responses, as well as changes in alternative splicing of a subset of genes, including central and output clock genes. The LSM genes are also part of another complex involved in mRNA decay. Since LSM5 and LSM4 are part of both complexes, we wondered if part of the circadian effect observed in the mutants was due to their role on mRNA decay. We found that mutations in other genes involved in mRNA decay also generate changes in circadian rhythms. These findings support the idea that some LSM genes play a role in circadian rhythms through the regulation of alternative splicing and mRNA decay, which helps synchronize biological rhythms with environmental changes.

Belgorosky, Denise. "Rol del óxido nítrico en la progresión del cáncer de vejiga" (2016-03-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El óxido nítrico (NO) es un radical libre altamente reactivo, que puede actuar como mensajero intracelular e influir en el desarrollo tumoral. Resultados de nuestro grupo de investigación indican que la expresión de la enzima óxido nítrico (NO) sintasa inducible (iNOS) en tumores vesicales humanos es un factor de mal pronóstico que se asocia con recurrencias más tempranas y con un mayor grado histológico. Teniendo en cuenta que iNOS no se expresa en el urotelio vesical de individuos sanos, y que es una entidad clave del proceso inflamatorio, característico del cáncer de vejiga (CaV), surgió la hipótesis de que la inhibición de esta enzima puede ser un blanco terapéutico para pacientes cuyos tumores expresen iNOS. Para analizar esta hipótesis comenzamos estudiando el rol del NO como consecuencia de la expresión de iNOS, en la progresión del CaV. Para ello utilizamos un modelo murino de CaV que imita muy bien la patología en humanos. Cuando las líneas celulares MB49 y MB49-I son inoculadas en la vejiga de ratones singeneicos generan tumores no invasores del musculo (NMI) y tumores invasores del músculo detrusor (MI), respectivamente. La línea invasora MB49-I, expresa altos niveles de iNOS, y en consecuencia mayores niveles de NO, comparado con la línea MB49. Asimismo, posee incrementados varios pasos del proceso de invasión y metástasis como es su capacidad de migración e invasión, la actividad de enzimas proteolíticas, y la capacidad de generar metástasis pulmonares. Detectamos que el NO es un factor de sobrevida para células de CaV, que expresan iNOS y que al inhibirlo, se reduce la activación de vías de proliferación como la vía de las MAPK, y parámetros de progresión tumoral como la producción de enzimas proteolíticas, migración, angiogénesis y el crecimiento metástatico en pulmón. Analizamos, por otra parte las consecuencias de la inhibición de iNOS en el crecimiento tumoral empleando tres estrategias. La primera fue evaluar la actividad de L-NAME (inhibidor farmacológico pan NOS) de manera sistémica en ratones portadores de tumores de vejiga creciendo en el subcutáneo o en la vejiga de ratones singeneicos. La segunda, fue también una inhibición farmacológica, utilizando el inhibidor específico de iNOS 1400w, en forma local, y la tercera aproximación involucró el silenciamiento genético de la enzima iNOS en la línea invasora. Las tres estrategias mostraron resultados similares demostrando que tanto L-NAME sistémico, como 1400w local y la ablación genética reducen significativamente el crecimiento tumoral de células que expresan iNOS. Asimismo, hemos demostrado que los niveles urinarios de NO, determinados como nitrito, son un marcador de seguimiento en tumores de vejiga, y que la disminución de dichos niveles está asociado a una respuesta a tratamiento. Es así que proponemos que la inhibición de la actividad iNOS sería una terapia promisoria para pacientes cuyos tumores expresen la enzima.

Abstract:
Nitric oxide (NO) is a highly reactive free radical, which may act as an intracellular messenger and influence tumor development. Results of our research group indicate that the nitric oxide (NO) production through inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression is a poor prognostic factor associated to earlier recurrences and progression in patients with bladder cancer (Bca). Since iNOS it is not express in bladder urothelium of healthy individuals, and it is a key on inflammatory processes, -characteristic of Bca-, we hypothesize that the inhibition of this enzyme may be a therapeutic target for Bca patients whose tumors express iNOS. To test this hypothesis we began studying the role of NO produced by iNOS, in Bca progression. We used a murine Bca model that mimics well the pathology in humans. When Bca cell lines MB49 and MB49-I were inoculated in bladders of syngeneic mice, non-muscle invasive tumors (NMI) and invasive muscle tumors (MI), respectively, were generated. Invasive MB49-I cell line expressed high levels of iNOS and therefore higher levels of NO, compared with MB49. Several properties involved in metastases and invasion such as the activity of proteolytic enzymes, migration ability and angiogénesis were higher in the invasive line. We detected that NO is a survival factor for Bca cells that express iNOS, and that inhibition of NO, reduced proliferation pathways, such as MAPK and parameters involved in tumor progression, like the activity of metalloproteinase, migration, angiogénesis and metastases development. We also analyze the consequences of iNOS inhibition in tumor growth, using three different strategies. The first one was administered systemically, L-NAME (pan NOS pharmacological inhibitor). The second one consisted on using 1400w (specific pharmacological iNOS inhibitor) directly on the bladder, and the third approach involved iNOS gene silencing in the invasive line. The three strategies showed similar results, demonstrating that systemically L-NAME, intravesical 1400w and iNOS genetic ablation, significantly reduced tumor growth of Bca cells. Several substances have been described as markers to monitor or predict patients with Bca, but none of them has proved to be useful enough. We have shown urinary levels of NO determined as nitrite, are a marker for monitoring bladder tumors and their reduction is associated with response to treatment. In conclusion, we propose iNOS inhibition as a promising therapy for Bca patients whose tumors express the enzyme.

Bush, Alan. "Robustez y sensibilidad en la respuesta a feromona de Saccharomyces cerevisiae" (2016-03-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células deben sensar y responder a cambios en su ambiente para poder sobrevivir, reproducirse y desempeñar sus funciones fisiológicas. En particular, las células eucariotas usan muchos y variados mecanismos a en de transducir señales del exterior al interior de la célula. Uno muy importante es el que involucra a receptores acoplados a proteínas G heterotriméricas. Estos receptores de siete pasos de membrana, al ser ocupados por sus ligandos, catalizan el intercambio de GDP por GTP en la subunidad Gα de la proteína G asociada, lo que causa la disociación de la proteína G heterotrimérica en Gα y Gβγ. La respuesta a feromona sexual de levaduras es un sistema prototípico de este tipo de mecanismos, muy estudiado bioquímica y genéticamente. En esta vía de transducción de señales, la proteína de andamiaje Ste5 se une a Gβγ libre, lo que causa su reclutamiento a membrana y la activación de una cascada de MAP kinasas, resultando en arresto del ciclo celular y cambios en el patrón de expresión génica. Las curvas dosis-respuesta (DoR) a feromona medidas en distintos puntos de la vía de transducción, como ocupación del receptor, fosforilación de la MAPK del sistema o inducción transcripcional, muestran una sensibilidad muy similar, un fenómeno al que llamamos alineamiento de las curvas dosis-respuesta (DoRA). En esta tesis estudiamos de manera cuantitativa los primeros pasos en la activación de la respuesta a feromona en levaduras; la ocupación del receptor, la activación de la proteína G heterotrimérica y el reclutamiento a membrana de Ste5. Encontramos que el sistema es notablemente robusto a variaciones en la cantidad de receptores, algo que no es fácilmente explicable por la teoría clásica de receptores. Estudiamos el mecanismo responsable de esta robustez, cuyo punto de acción pudimos mapear río arriba del reclutamiento de Ste5. Construimos un modelo matemático completo de la interacción entre el receptor y la proteína G: el modelo Carrousel. El análisis del mismo nos sugirió un mecanismo por el cuál el sistema puede medir la fracción de receptores ocupados en lugar de la cantidad de los mismos, lo que además explica el fenómeno de DoRA. Este mecanismo depende de la interacción fósica reportada entre la proteína RGS (reguladora de la señalización por proteína G, que inactiva al sistema) y el receptor (que lo activa). Pudimos probar que cepas mutantes en las que esta interacción no está presente, no muestran robustez a la cantidad de receptores. Por otro lado medimos curvas DoR del cambio de localización de Ste5 en células con cantidades variables de Ste5. En base a esta información pudimos estimar la afinidad entre esta proteína de andamiaje y sus sitios de unión a membrana en células vivas, y cómo esta afinidad se modula durante la respuesta. Además, estudiamos el efecto de cambios en la abundancia de Ste5 sobre la respuesta, encontrando que la cantidad de esta proteína es un parámetro crítico del sistema.

Abstract:
Cells need to respond to changes in their environment to be able to survive and proliferate. Here, we study in a quantitative manner the pheromone response pathway in Saccharomyces cerevisiae, a canonical GPCR signal transduction system. Upon activation of the pathway, occupied receptors increase the exchange rate of GDP for GTP in the Gα subunit of the heterotrimeric G protein. This causes the dissociation of the G protein, liberating free Gβγ, which in turn recruits to the membrane the scaffold protein Ste5, activating the MAP kinase cascade and downstream effectors. Dose-response (DoR) curves measured at different activation steps of this pathway show very similar sensitivity, a phenomena we call dose-response alignment (DoRA). In this thesis we study the first activation steps of the pheromone response; receptor occupation by ligand, activation of the G protein and recruitment of Ste5. We found the system to be notoriously robust to changes in the levels of the receptors, something not easily explained by classical receptor theory. We mapped the mechanism responsible for this robustness upstream of Ste5 membrane recruitment. Therefore, we built a complete mathematical model of the G protein activation process: the Carrousel model. This model suggested that the system responds to the fraction of occupied receptor and not to the absolute amount of ligand-receptor complexes. As predicted by the model, this mechanism requires the reported physical interaction between the RGS of the system and the receptor, since disruption of this interaction abolishes robustness to receptor abundance. We also determined the affinity with which Ste5 binds to free Gβγ, causing its membrane recruitment. We determined this in live cells, and studied the way in which the affinity is modulated during the response. Furthermore, we studied the effect of changes in the abundance of Ste5, finding that the expression level of this protein is critical for a normal sensitivity of the response.

Peña Cárcamo, José Rafael. "Viperina, un factor de restricción en la infección con el arenavirus Junín" (2016-03-23) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Viperina (VIP) es una proteína cuya expresión es inducida por interferón (IFN) y se ha reportado como factor de restricción viral de diversos virus. En el presente trabajo se analizó por primera vez la acción antiviral de viperina en células A549 sobre la multiplicación del virus Junín (JUNV). Asimismo, se analizó la importancia de las estructuras lipídicas en el ciclo de mutiplicación de JUNV y la localización subcelular en la cual VIP ejerce su acción antiviral. Mediante distintos ensayos se pudo comprobar que la respuesta de IFN/VIP se encuentra activada en las células A549 infectadas con JUNV. Del análisis de sobreexpresión de VIP se confirmó que esta proteína tiene un efecto antiviral sobre la multiplicación de JUNV. Cabe destacar que los aumentos de los niveles relativos de mRNAs/proteínas VIP encontrados se correlacionan con la progresión de la infección con JUNV. Interesantemente, las estructuras lipídicas denominadas lipid droplets (LDs) se observaron aumentadas tanto en número como en tamaño en los cultivos infectados con JUNV. Por otro lado, la disminución de los LDs afectó negativamente la producción de viriones extracelulares, y las imágenes de microscopía revelaron que en las células infectadas las nucleoproteínas virales se encuentran cerca de los LDs, lo que sugiere que los complejos de replicación de JUNV podrían estar utilizando estas estructuras. Por último, los estudios de localización en membrana plasmática de las glicoproteínas virales sugieren que la acción de VIP no sería directamente en membrana pero sí podría ser a través de un paso previo relacionado con el transporte de glicoproteínas a microdominios rafts. En su conjunto, estos resultados no solamente incrementan el conocimiento sobre la biología del arenavirus Junín, sino que ofrece un nuevo blanco para la intervención del ciclo de replicación y la búsqueda de agentes quimioterapéuticos específicos.

Abstract:
Viperin (VIP) is a cellular protein induced by interferon (IFN) reported as restriction factor for several viruses. In the present work and for the first time it has been analyzed viperin antiviral action in A549 cells infected with Junín virus (JUNV). The importance of cellular lipidic structures in JUNV multiplication and putative subcellular localization where VIP action could take place, were also studied. Different assays showed that IFN/VIP response is activated in A549 cells upon JUNV infection. Overexpression of VIP showed to exert a strong antiviral effect on JUNV multiplication. In this line relative amounts of mRNA/protein levels correlate with the progression of JUNV infection. Interestingly, lipid droplets structures (LDs) in infected cells were augmented both in numbers and size. Accordingly diminished of LDs negatively affected extracellular virion production. Microscopy analysis revealed viral nucleoproteins close to LDs, suggesting that viral replication complexes may make use of these structures. Finally, immunofluorescense assays and localization studies showed that the viral glycoproteins is almost absent from plasma membrane suggesting that VIP action might be exerted in an indirect fashion through lipids rafts negative modulation. All together these results enlighten the knowledge about the biology of the arenaviruses and additionally reveal a very new and interesting target for the intervention design and screening of specific chemotherapeutic agents to combat JUNV.

Bianchi, Micaela. "Mecanotransducción celular. Correlación entre las propiedades mecánicas y la organización-dinámica de proteínas de adhesión focal en células vivas" (2016-03-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de señales externas, químicas y físicas, integrar y analizar esta información y, en consecuencia, cambiar su morfología, dinámica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivel celular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos tipos de estructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y uniones adherentes (célula-célula). Las adhesiones focales son complejos de proteínas dispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a través de receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitios de adhesión son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadrados que a menudo están localizadas en la periferia de las células, y que además funcionarían como organelas de señalización en el proceso de mecanotransducción celular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poder integrar y combinar distintas técnicas que nos permitan analizar la dinámica intracelular, la biomecánica de la célula/sustrato, detección de las fuerzas generadas en/por la célula, y observar la respuesta global de la célula en las distintas condiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecánica y dinámica de las proteínas de adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico en células vivas requiere de técnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada la dinámica de eventos localizados en la célula. Estos métodos deben contar con una resolución espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventos transientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en este trabajo de Tesis, distintas microscopías y espectroscopías de alta resolución espacial y temporal, en combinación con técnicas de biología molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecánicas de sustratos y células, en una primera etapa se implementó un modo de operación avanzado en microscopía de fuerza atómica (AFM), denominado PF-QNM (del inglés, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultáneamente la imagen de topografía, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades de elasticidad, adhesión, dureza, disipación de energía y deformación superficial. Se utilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecánicas de manera tal de cubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades de sustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), así también como la línea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesión focal, la estrategia fue transfectar células de epitelio mamario de ratón (HC11), con proteínas componentes de la adhesión (por ejemplo, zixina, FAK, vinculina, paxilina) fusionadas a proteínas fluorescentes visibles. De esta forma, empleando microscopías y espectroscopías de fluorescencia, es posible visualizar la expresión de las proteínas, registrar su localización y evolución en el tiempo y, mediante diferentes análisis, extraer información cuantitativa de dinámica, cinética y organización de los complejos de adhesión focal. El análisis de la dinámica y difusión de los complejos de adhesión focal y sus interacciones, fueron realizados mediante la espectroscopía por correlación de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron los coeficientes efectivos de difusión de las proteínas mencionadas. El análisis de la correlación cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteínas de adhesión focal (FCCS) permitió evidenciar la interacción entre distintas proteínas adhesivas de la adhesión focal. La cinética de disociación de proteínas desde la adhesión focal fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia luego del fotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organización y dinámica de adhesiones focales en células vivas en respuesta a un estímulo mecánico externo global, se empleó un dispositivo de tracción equibiaxial adaptado para ser usado en simultáneo con el microscopio confocal FV1000. La tensión mecánica aplicada por el dispositivo de tracción es capaz de inducir cambios en el área de las células vivas al igual que en las adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecánico se observó un mayor reclutamiento y translocación de la proteína zixina acompañado de una disminución significativa de su constante de disociación. Con el fin de correlacionar las propiedades mecánicas del sustrato y la fuerza de tracción generada por la célula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista la organización y dinámica de las proteínas en la adhesión focal, se implementó la Microscopía de Fuerzas de Tracción (TFM). Esta técnica posee la sensibilidad necesaria para medir la fuerza de tracción generada por la célula sobre un sustrato elástico y transparente, la cual se puede combinar con otras técnicas de microscopía de fluorescencia como FRAP o FCS. El análisis de los datos TFM para la proteína zixina permitió obtener los mapas de deformación y de fuerzas de tracción, a la vez que se evaluó la cinética de disociación mediante FRAP.

Abstract:
Cells can detect, generate and respond to a wide range of external, chemical and physical signals, integrate and analyze this information and, consequently, change their morphology, dynamics, behavior and, eventually, their fate. At the cellular level, biological responses to external forces are originated from two types of specialized structures: focal adhesions (cell-extracellular matrix) and adherens junctions (cell-cell). Focal adhesions are protein complexes arranged in multi-molecular assemblies that bind extracellular matrix, through integral membrane receptors, to cytoskeletal components. These adhesion sites are flat, elongated and few square microns which are often located in the periphery of the cells, and also function as signaling organelles in the cellular mechanotransduction process. One of the challenges presented to study the system is to be able to integrate and combine different techniques that allow us to analyze the intracellular dynamics, biomechanics of the cell/substrate, detection of the forces generated in/by the cell, and observing the global response of the cell in different conditions. Thus, the study of the structure, mechanics and dynamics of focal adhesion proteins in response to a mechanical stimulus in living cells requires to visualize and characterize in an integrated way the dynamics of events located in the cell. These methods must have a high spatial and temporal resolution, so as to detect transients and highly localized events. In this context, they have been implemented in this thesis, different microscopies and spectroscopies with high spatial and temporal resolution, combined with the techniques of molecular and cell biology. In order to characterize the mechanical properties of substrates and cells, in a first step, an advanced mode operation was implemented in atomic force microscopy (AFM), called PF- QNM (Peak Force Quantitative nanomechanical Property Mapping). This mode allows simultaneously obtaining the topography, together with quantitative maps of the properties such as elasticity, adhesion, hardness, energy dissipation and surface deformation. Various systems were used with different mechanical properties so as to cover the wide range from GPa to kPa, and study the properties of substrates (glass, silicone membranes and polyacrylamide gels), as well as the cell line used in the Thesis. At focal adhesion level, the strategy was to transfect mouse mammary epithelial cells (HC11), with adhesion proteins (eg zixina, FAK, vinculin, paxillin) fused to visible fluorescent proteins. Thus, using fluorescence microscopy and spectroscopy, it is possible to visualize the expression of proteins, register their location and evolution over time and through different analysis, extract quantitative information about the dynamics, kinetics and organization of focal adhesion complexes. The analysis of the dynamics and distribution of focal adhesion complexes and their interactions were performed by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). The effective diffusion coefficients of the proteins mentioned were characterized. The analysis of the crosscorrelation of fluorescence fluctuations of pairs of focal adhesion proteins (FCCS) allowed to demonstrate the interaction between various adhesive proteins in focal adhesion. The dissociation kinetics of proteins from the focal adhesion was evaluated by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) under different conditions. To study the changes generated in the organization and dynamics of focal adhesions in living cells, in response to a global external mechanical stimulus, an equibiaxial traction device adapted to be used simultaneously with the FV1000 confocal microscope was used. Mechanical tension applied by the pulling device is able to induce changes in the area of living cells as well as in focal adhesions. In response to mechanical stretch increased, the recruitment and translocation of the protein zyixin accompanied by a significant decrease in the dissociation constant was observed. To correlate the mechanical properties of the substrate and the traction force generated by the cell at a focal adhesions level, without losing sight of the organization and dynamics of proteins in focal adhesion, traction force microscopy was implemented (TFM). This technique has the sensitivity necessary to measure the traction force generated by the cell on an elastic and transparent substrate, which can be combined with other fluorescence microscopy techniques such as FRAP or FCS. Analysis of TFM data for zyxin yielded deformation and traction forces maps, while the dissociation kinetics was evaluated by FRAP.

Díaz Bessone, María Inés. "Efecto de la sobreexpresión de distintas isoformas de la Proteína Quinasa C (PKC) en la modulación del fenotipo maligno de células mamarias epiteliales. Alteración en la sensibilidad al tratamiento con retinoides" (2016-03-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El cáncer de mama representa actualmente el tipo de cáncer más frecuente en mujeres y se calcula que más de un millón de nuevos casos son diagnosticados por año en todo el mundo. Se trata de una enfermedad compleja, que presenta una variedad de subgrupos con características histopatológicas y genéticas diferentes y por lo tanto con diversas respuestas a los tratamientos. De las múltiples vías de señalización comprometidas en la progresión maligna, algunas constituyen prometedores blancos de intervención terapéutica, entre ellas la vía de la proteína quinasa C (PKC), implicada en eventos celulares como proliferación, diferenciación y apoptosis y el sistema retinoideo ampliamente involucrado en diferenciación celular. Dado que los distintos carcinomas mamarios presentan una expresión diferencial de las isoformas de PKC, desarrollamos modelos celulares mamarios (humanos y murinos) que sobreexpresan las isoformas α o δ de PKC. Utilizando estos modelos estudiamos de qué manera la sobreexpresión de PKCα o PKCδ afecta parámetros celulares implicados en la progresión tumoral y diseminación metastásica evaluando al mismo tiempo la respuesta al tratamiento con retinoides (ATRA). Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de PKCα torna a las células más sensibles a la acción del ácido retinoico, en líneas respondedoras, mediante un arresto en la fase G0/G1 del ciclo celular. La sobreexpresión de PKCδ, en las células MDA-MB231, confirió un fenotipo menos agresivo, disminuyendo significativamente su capacidad invasiva. Por último la falta de respuesta de esta línea celular al ATRA, se debería a la incapacidad de trans-reprimir los sitios AP-1.

Abstract:
Breast cancer represents the most common kind of cancer in women and it is estimated that more than one million new cases are diagnosed each year worldwide. It is a complex disease, which presents a variety of subgroups with different genetic and histopathologic features and therefore with different responses to treatments. Multiple signaling pathways are involved in malignant progression. Some of them are promising targets for therapeutic intervention, including protein kinase C (PKC), involved in cellular events such as proliferation, differentiation and apoptosis and the retinoid system, widely implicated in cell differentiation. Since different mammary malignancies exhibit differential expression of PKC isoforms, we have developed (human and murine) mammary cell models overexpressing α or δ PKC isoforms. Using these models we studied how PKCα or PKCδ alters cell parameters associated with tumor progression and metastatic dissemination while we assessed the response to treatment with retinoids (ATRA). Our results suggest that PKCα overexpression confers to the cells a retinoic acid-sensitive phenotype, through an arrest in the G0 / G1 phase of the cell cycle. Overexpression of PKCδ, in MDA-MB231 cells, induced a less aggressive phenotype, significantly reducing its invasive capability. Finally the lack of response of this cell line to ATRA treatment could be due to the inability to trans-repress AP-1 sites.

Piegari, Estefanía. "Interacción entre geometría y dinámica en la modulación de señales intracelulares de calcio" (2016-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las señales de Ca²⁺ son ubicuas y juegan un rol importante en numerosos procesos fisiológicos como la fertilización o la muerte celular. Su versatilidad se basa en la variedad de comportamientos espacio-temporales que puede mostrar la concentración de calcio intracelular y en que distintos comportamientos pueden inducir respuestas diferentes. La liberación de Ca²⁺ desde el retículo endoplasmático (RE) hacia el citosol a través de receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (RIP3s) es una componente clave dentro de los mecanismos de señalización por Ca²⁺. Los RIP3s necesitan unir IP3 y Ca²⁺ para abrirse por lo que la liberación de Ca²⁺ a través de un único RIP3 puede inducir la apertura de otros canales vecinos, mecanismo que se conoce como liberación de calcio inducida por calcio o CICR por las siglas en inglés. Los RIP3s aparentemente se organizan en cúmulos sobre la membrana del RE (clusters). Si el CICR se encuentra limitado a un cluster, las señales pueden permanecer localizadas (puffs). En caso contrario, pueden convertirse en ondas que se propagan entre clusters. Los puffs son los ladrillos de construcción de esas señales más globales que se propagan por toda la célula. Por este motivo, existe un gran interés en la determinación de las propiedades de los puffs, especialmente en vista de la actual controversia sobre la distribución espacial de los RIP3s activables. Las señales de calcio, por otro lado, pueden remodelarse a través de varios mecanismos, entre ellos, el atrapado del Ca²⁺ por parte de buffers. Éstos no sólo disminuyen la concentración de Ca²⁺ libre sino que modifican su distribución espacio-temporal de distintos modos dependiendo de su cinética. Los puffs de Ca²⁺ se han observado en células intactas con técnicas ópticas mostrando que son intrínsecamente estocásticos. La obtención de una imagen correcta de la dinámica de los eventos entonces implica ser capaz de detectar todo el rango de tama~ nos de puffs. Éstos se observan usando indicadores de Ca²⁺ de una longitud de onda visible y buffers exógenos lentos (por ej; EGTA) para disrumpir el CICR entre clusters. Los indicadores de única longitud de onda aumentan su uorescencia al ligar calcio. De esta manera, generan imágenes que dependen fuertemente de su cinética, transporte y propiedades fotofísicas. Por este motivo, es de particular importancia determinar los artefactos que generan las condiciones del experimento. La propia existencia de los puffs depende de que los RIP3s están organizados en cúmulos. Una distribución uniforme de receptores debería dar lugar típicamente a señales propagantes tipo ondas. Los ovocitos de Xenopus laevis son un sistema experimental ventajoso para estudiar estas señales. Durante la fertilización se evoca una onda de Ca²⁺ que se propaga por toda la célula. La fertilización ocurre en el huevo maduro. Se ha observado que, al madurar el ovocito, su RE se configura y la distribución de los RIP3s parece ser más uniforme. Esto tiene un correlato en las características de las señales evocadas en los ovocitos maduros. En esta Tesis se combinaron experimentos, un análisis teórico y simulaciones numéricas para evaluar de qué modo la geometría de la distribución de canales se combina con alguno de los otros aspectos que in uyen sobre la distribución de calcio libre para determinar las características de las señales. El primer aporte fue introducir un método que permite establecer clases equivalentes de experimentos de obtención de imágenes realizados en condiciones diferentes, donde la clase está determinada por la relación señal-ruido que predice el método. Éste también puede utilizarse para estimar el tamaño de las señales más pequeñas que pueden observarse de manera confiable con cada arreglo y para generar imágenes de uorescencia numéricamente con ruido realista. Esta Tesis también contribuyó a estudiar si la presencia del indicador o del EGTA en distintas condiciones experimentales altera la dinámica intracelular de Ca²⁺, en particular, analizar si son capaces de detectar puffs de Ca²⁺ con similar precisión y de qué modo las distintas configuraciones experimentales afectan las propiedades de los puffs observados y la dinámica del Ca²⁺ subyacente. Se pudo determinar que aunque el indicador o el EGTA no alteran la dinámica intracluster del Ca²⁺, el conjunto de eventos observables del experimento es diferente dependiendo del grado de acoplamiento entre clusters. El estudio, por otro lado, permitió inferir que los puffs con mayor liberación de Ca²⁺ provienen de cúmulos donde los RIP3s están muy cerca unos de otros. Para estudiar en más detalle la disrupción del CICR entre clusters vecinos que inducen los buffers lentos, se realizaron experimentos utilizando simultáneamente dos indicadores de calcio de distinta cinética. Utilizando el método introducido pudimos confirmar nuestra conclusión previa sobre cómo se modifica el conjunto de eventos que se evoca en presencia de buffers lentos. Por otro lado, determinamos que la presencia de buffers rápidos da lugar a liberaciones de Ca²⁺ más prolongadas tal vez debido a que reducen el efecto inhibidor del Ca²⁺ sobre los RIP3s. En relación a la razón por la que los buffers lentos disrumpen el acoplamiento entre clusters pudimos concluir que su presencia disminuye el Ca²⁺ basal, aunque no tanto como para explicar la disrupción. El análisis de la diferente distribución espacio-temporal de los buffers lentos y rápidos parecería indicar la presencia de RIP3s en el espacio entre clusters que podrían ser "silenciados" por los buffers lentos evitando así la propagación de las señales entre cúmulos. Finalmente, en la Tesis se han mostrado también resultados preliminares de señales de calcio que se observan en células maduradas, cuyos cambios pueden explicarse en términos de una distribución espacial distinta de RIP3s.

Abstract:
Ca²⁺ signals are ubiquitous and play a relevant role in numerous physiological processes as fertilization or cell death. Their versatility relies on the variety of spatiotemporal behaviors that the intracellular calcium concentration can display and that different behaviors can induce different end responses. Ca²⁺ release from the endoplasmic reticulum (ER) into the cytosol through inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP3Rs) is a key component of the Ca²⁺ signaling toolkit. IP3Rs need to bind IP3 and Ca²⁺ to become open an therefore. Therefore, Ca²⁺ released through one open IP3R can induce the opening of neighboring ones, a mechanism that is knwon as Calcium Induced Calcium Release (CICR). IP3Rs are apparently organized in clusters. The signals can remain localized (i.e., Ca²⁺ puffs) if CICR is limited to one cluster or become waves that propagate between clusters. Puffs are the building blocks of global signals that propagate throughout the cell. Thus, there is great interest in determining puff properties, especially in view of the current controversy on the spatial distribution of activatable IP3Rs. Moreover, calcium signals can be remodeled through various mechanisms, such as Ca²⁺ buffers. Buffers not only decrease the concentration of free Ca²⁺ but also modify its spatial and temporal distribution in different ways depending on their kinetics. Ca²⁺ puffs have been observed in intact cells using optical techniques showing that they are intrinsically stochastic. Obtaining a correct picture of their dynamics then entails being able to detect the whole range of puff sizes. Puffs are usually observed using visible single-wavelength dyes and slow exogenous buffers (e.g., EGTA) to disrupt intercluster CICR. Single-wavelength dyes increase their uorescence upon calcium binding producing images that are strongly dependent on their kinetic, transport and photophysical properties. Thus, determining the artifacts that the imaging setting introduces is particularly relevant. The very existence of puffs depends on the fact that IP3Rs are organized in clusters. A uniform distribution of receptors should typically lead to waves-like (propagating) signals. Xenopus laevis oocytes are an advantageous biological system to study these signals since Ca²⁺ release from the ER only occurs through IP3Rs. During fertilization a Ca²⁺ wave that propagates throughout the cell is evoked. Fertilization occurs in the mature egg. It has been observed that maturation of the oocyte induces a reorganization of the ER whereas IP3Rs seem to be distributed more uniformly on its membrane. This has its counterpart on the properties of the Ca²⁺ signals that are evoked in mature oocytes. In this Thesis we have combined experiments, theoretical analyses and numerical simulations to evaluate in which ways the geometry of the channel distributions interacts with the other aspects that affect the intracellular Ca²⁺ dynamics to determine the characteristics of the signals. The first contribution of this Thesis was to introduce a method that establishes equivalence classes of Ca²⁺ imaging experimental conditions, where the class is determined by the signal-to-noise ratio that is predicted by the method. The method can also be used to estimate the smallest signals that can reliably be observed with each experimental setting and to produce numerically generated Ca²⁺ images with realistic noise. The Thesis also contributed to study to what extent experiments performed with different dyes and/or alter the intracellular Ca²⁺ dynamics, in particular, if they are able to detect Ca²⁺ puffs with similar accuracy and in which ways the different experimental conditions affect the observed puff properties or the underlying dynamics of Ca²⁺ itself. We could determine that, although the dye or EGTA does not alter the intra-cluster dynamics, the set of observable events is different depending on the degree of inter-cluster coupling/uncoupling that is induced by the experimental conditions. An analysis of the observations allowed us to show that the events with the largest amounts of released Ca²⁺ came from clusters with densely packed active IP3Rs. To study in more detail the way in which slow buffers disrupt the inter-cluster CICR experiments were performed using two calcium dyes of different kinetics simultaneously. Applying the method introduced previously in the Thesis we could confirm our previous conclusion on how the set of events that is evoked is modified in the presence of slow buffers. We determined that the presence of fast buffers, on the other hand, results in longer periods of Ca²⁺ release perhaps because they reduce the inhibitory effect of Ca²⁺ on IP3Rs. With respect to the way in which the slow buffers disrupt the inter-cluster coupling we could conclude that their presence decreases basal Ca²⁺, although not enough to explain the disruption. The analysis of the different spatial and temporal distribution of Ca²⁺ bound to slow and fast buffers that is observed in the experiments seems to indicate that there are IP3Rs in the space between clusters that could be silenced by the slow buffers thus preventing the propagation of signals between clusters. Finally, in the Thesis we have also shown preliminary results on calcium signals observed in mature cells, whose changes can be explained in terms of a different spatial distribution of IP3Rs with respect to the case of immature oocytes.

Di Napoli, Jennifer. "Rol del sistema Eph/ephrinas en el desarrollo del sistema nervioso central y su posible utilidad en estrategias de regeneración de las conexiones topográficamente ordenadas" (2016-04-08) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El objetivo central de este trabajo es estudiar los mecanismos moleculares que regulan la potencialidad evolutiva de las células madre/progenitoras de la retina, haciendo hincapié en el rol del sistema Eph/ephrinas. Se pretende que los hallazgos de este trabajo aporten: a) conocimientos básicos sobre los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo del SNC y del sistema visual y b) conocimientos que sirvan de base para el diseño de estrategias de terapias regenerativas en la retina. Para tal efecto se emplea el sistema retinotectal del embrión de pollo como modelo experimental. El principal nicho de células madre/progenitoras de la retina reside en un anillo tisular que rodea a la retina llamado margen ciliar (MC). Éste contiene a las células madre/progenitoras del cuerpo ciliar (CC) y las células madre/progenitoras localizadas en la zona marginal ciliar (ZMC). Esta zona provee células retinianas durante la vida postnatal en peces y anfibios, permitiendo el crecimiento de la retina y su regeneración. Las aves y los mamíferos en cambio, pierden esta capacidad regenerativa. En aves, donde el crecimiento retiniano se produce durante el desarrollo, un pequeño MC persiste postnatalmente pero carece de la potencialidad evolutiva para aportar todos los tipos celulares de la retina. Las células madre/progenitoras del MC son capaces de 1) proliferar in vitro formando neuroesferas ó 2) de proliferar in vivo al ser estimuladas formando nueva retina neural. Sin embargo, se ha mostrado que no todas las células madre “son iguales” y que varían en su potencialidad evolutiva. En el presente trabajo: 1. Se evalúa si las células madre del MC se diferencian in vitro en células ganglionares de la retina (CGR) que posean información posicional y que sean competentes para responder a las moléculas del sistema Eph/ephrinas que guían el crecimiento axonal durante la formación del mapa retinotectal. 2. Se investiga si las retinas regeneradas a partir del MC y de la transdiferenciación expresan las moléculas del sistema Eph/ephrinas y presentan información posicional. 3. Se determina si la estimulación de la vía de señalización de Shh con su análogo activador SAG permite obtener retinas con regeneración completa a partir de las células madre/progenitoras del MC. En este trabajo se han establecido las condiciones in vitro que permiten obtener un alto grado de diferenciación de CGR a partir de células madre provenientes del MC. Estas CGR expresan moléculas del sistema Eph/ephrinas en forma topográficamente específica y son competentes para responder a moléculas del sistema Eph/ephrinas que guían a los axones durante la formación del mapa retinotectal. Se ha demostrado que la activación de la vía canónica de Shh con SAG induce la regeneración completa de la retina a partir de las células madre/progenitoras del MC in vivo y que las CGR de la misma tienen información posicional expresando el sistema Eph/ephrinas en forma de gradiente como las retinas en desarrollo. Nuestros resultados aumentan las probabilidades de obtener una eferencia que establezca conexiones topográficamente ordenadas en el tectum.

Abstract:
The central aim of this work is to study the molecular mechanisms that regulate the evolutionary potential of the stem/progenitor cells of the retina, focusing on the role of the Eph/ephrin system. It is intended for the findings on this work to provide: a) basic knowledge on the cellular and molecular mechanisms of the CNS and visual system development, and b) knowledge to be used to design of regenerative therapy strategies for the retina. For this work we used the chick embryo retinotectal system is used as experimental model. The retina stem/progenitor cell niche resides in a ring around the retina called the ciliary margin (CM), which holds the stem/progenitor cells of the ciliary body (CB) and of the ciliary margin zone (CMZ). This zone provides retinal cells during the postnatal life in fish and amphibians, allowing for retinal growth and regeneration. However, avian and mammals have lost this regenerative capability. In avian, where retina growing takes place during development, a small CM persists postnatally, but it lacks of potenctial to generate all the cellular types of retina. The stem/progenitor cells of the CM are capable of 1) proliferating in vitro forming neurospheres, or 2) proliferating in vivo when stimulated forming new neural retina. However, it has been shown that not all the stem cells are ‘equal’ and that they vary in their evolutionary potentiality. In the present work: 1. Stem/progenitor cells of the CM are evaluated for their differentiation potential in vitro into retinal ganglion cells (RGC) which have positional information and are competent to respond to molecules of the Eph/ephrin system which guies axonal growth during the retinotectal map formation. 2. The expression patterns of Eph/ephrin and their positional information are studied during retina regeneration initiated from the CM and from retinal pigmented epithelium (RPE) transdifferentiation. 3. The sonic hedgehog (Shh) pathway and its analog activator SAG are evaluated for their potential to induce complete retina regeneration from the stem/progenitor cells of the CM. In this work we defined in vitro conditions that optimized for a high degree of RGC differentiation from the stem/progenitor cells present in the CM. These RGCs express molecules of the Eph/ephrin system in a topographic specific way and respond to the cues that guide the axons during the formation of the retinotectal map. We also show that activating the Shh canonical with SAG induces the complete retina regeneration from the CM stem/progenitor cells in vivo and that the RGCs from this regenerated retina have the same positional information expressing the Eph/ephrin system in a gradient form just as the retinas during development. Our results increase the probability of obtaining an efference that establishes a topographic order of connections in the tectum.

Villordo, Sergio Manuel. "Estudios de estructuras de ARN que regulan la replicación del virus del dengue en humanos y mosquitos" (2016-04-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El virus de dengue es el principal patógeno humano transmitido por mosquitos para el cual aún no existen tratamientos antivirales efectivos. El genoma viral es una molécula de ARN compuesta por un único marco de lectura abierto flanqueado por las regiones 5' y 3' no codificantes. Mediante la manipulación genética de clones infecciosos y ensayos funcionales hemos, demostrado que la estructura del ARN en los extremos del genoma es dinámica y que la formación regulada de conformaciones alternativas es necesaria para la síntesis del ARN viral en células de mamíferos. Experimentos complementarios en células de mosquito confirmaron además la importancia de este fenómeno en ambos hospedadores y permitieron detectar una secuencia en el extremo 3' del genoma que funciona como un determinante específico para la replicación del virus en insectos. Por otro lado, la combinación de estudios de mapeo químico y análisis de conservación de la región 3' no codificante han revelado la existencia de estructuras de ARN que se mantienen conservadas entre distintos flavivirus transmitidos por insectos. El análisis de esta región mediante experimentos de adaptación en células y técnicas de secuenciación masiva ha permitido caracterizar una estructura de ARN que se adapta de manera diferencial durante la infección en mosquitos y mamíferos. Además a través de ensayos de mutagénesis dirigida y el estudio del fitness viral en células y mosquitos adultos se demostró que la duplicación de dicha estructura facilita la alternancia de hospedadores con requerimientos diferentes. En conjunto los resultados de esta tesis proveen nuevos conocimientos sobre la biología del dengue de posible utilidad para el desarrollo racional de estrategias antivirales. Asimismo, la información aquí presentada permitirá entender aspectos epidemiológicos y evolutivos de virus de ARN transmitidos por insectos con relevancia en salud pública.

Abstract:
Dengue virus is the most important mosquito-borne human pathogen for which there are no vaccines and no effective antiviral treatments available. The viral genome is an RNA molecule coding for a single open reading frame flanked by highly structured 5' and 3' non coding regions. Using infectious clones and evaluating replication of recombinant viruses, we have demonstrated that the ends of the viral genome are dynamic and that the regulation of alternative conformations of the viral RNA is crucial for infectivity. Additional experiments using mosquito cells confirmed the relevance of our findings for mosquito and human hosts, and allowed the identification of specific sequence requirements for viral replication in insects. Furthermore, by combining chemical probing and sequence conservation analysis of viral 3' non coding regions, the existence of RNA structure motifs that are conserved in mosquitoborne flaviviruses was demonstrated. In this regard, new models and patterns of 3’UTR conservation among all known flaviviruses were constructed. Employing host adaptation assays and deep sequencing analysis, different viral populations were characterized from distinct hosts. Interestingly, the sequence variations detected modified the secondary structure of a single RNA structure. Mutational analysis and virus fitness measurements in mosquito cells and infected mosquitoes showed the requirement of RNA structure duplication as a mechanism to maintain high viral fitness during host mosquito-human switch. Together, these results provide new knowledge about dengue virus biology useful for rational development of antiviral strategies. Importantly, in these studies we present new mechanisms of virus-host adaptation that will help the understanding of epidemiological and evolutionary aspects of viral pathogens transmitted by insects.

Riggio, Marina. "Rol de la vía PI3K/AKT/mTOR en la progresión del cáncer de mama" (2016-04-12) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Antecedentes: El cáncer de mama es la neoplasia maligna más común en mujeres y una de las primeras causas de muerte por cáncer en el mundo. A pesar de los avances en el diagnóstico y en el tratamiento para esta enfermedad, un alto porcentaje de los tumores progresan y metastatizan en órganos distantes. PI3K/AKT/mTOR es la vía mutada con mayor frecuencia en tumores sólidos; alrededor del 70% de los tumores de mama presentan alguna mutación en esta vía, lo cual se asocia con un peor pronóstico y resistencia a la terapia endócrina, contra HER-2, radio y quimioterapia. Existen tres isoformas para Akt: AKT1, AKT2 y AKT3, con discrepancias sobre sus funciones específicas. Objetivo: El objetivo de este trabajo fue estudiar el rol diferencial de AKT1 y AKT2 en los procesos de proliferación, migración e invasión celular a lo largo de la progresión tumoral en cáncer de mama. Antecedentes: En trabajos previos del laboratorio utilizando un modelo de carcinomas mamarios murinos habíamos demostrado que la sobreactivación de la isoforma AKT1 era capaz de inducir el crecimiento tumoral hormono-independiente. Los tumores generados resultaron ser más diferenciados que los tumores de los que derivaron, con formación de estructuras ductales y mayor expresión de citoqueratina 8 y laminina I, y menor expresión de citoqueratina 14. Metodología: Para extrapolar los resultados obtenidos en otros modelos experimentales, utilizamos tres líneas celulares humanas de cáncer de mama (IBH-7, IBH-6 y T47D), analizamos el efecto de sobreactivar o silenciar específicamente cada isoforma sobre el fenotipo tumoral en cultivo y en xenotransplantes. Resultados: En las líneas celulares IBH-7 e IBH-6 demostramos que AKT1 induce el crecimiento de tumores mamarios, a través de la activación de la proteína ribosomal S6 y el aumento en la expresión de ciclina D1. Además, la sobreactivación de AKT1 induce el crecimiento tumoral hormono-independiente a través de la fosforilación de receptores hormonales en ausencia de agergado exógeno de hormona. En consecuencia, la sobreactivación de AKT1 fue capaz de inducir resistencia al tratamiento con ICI182780 (Fulvestrant), un antagonista del receptor de estrógenos. Coincidente con los antecedentes mencionados, el fenotipo tumoral obtenido con la sobreactivación de AKT1 es de tipo glandular diferenciado, con aumento en la expresión de las proteínas luminales E-cadherina y laminina-I. Sorprendentemente, el silenciamiento de AKT1 endógeno disminuyó la proliferación e incrementó la migración e invasión celular in vitro a través de la inducción del eje β1-integrina/FAK/MMP9, e in vivo, siendo los tumores resultantes altamente infiltrantes. Por otro lado, la sobreactivación de AKT2 también indujo tumores con características infiltrantes pero sin modificar el crecimiento tumoral. Por el contrario, el silenciamiento de AKT2 endógeno disminuyó la motilidad celular en cultivo, regulando proteínas del citoesqueleto como F-actina y vimentina. El grado de invasión de los xenotransplantes IBH-6 y T47D con distintos niveles de AKT1 y AKT2 se asoció con la pérdida en la expresión de E-cadherina y un aumento en la expresión de vimentina, marcadores de progresión tumoral. Encontramos además que el silenciamiento de AKT1 induce un aumento en la expresión de AKT2 endógeno, sugiriendo una regulación entre isoformas. Por último, en un ensayo preliminar encontramos que el tratamiento con inhibidores de PI3K/AKT/mTOR si bien disminuye el crecimiento tumoral, aumenta la incidencia de metástasis pulmonares. Este resultado puede ser relevante en el diseño de terapias con inhibidores específicos de dicha vía. En conjunto, nuestros resultados muestran funciones diferentes, y en algunos casos opuestas, para AKT1 y AKT2 en la progresión del cáncer de mama. Demostramos que AKT1 tiene un rol relevante en el crecimiento tumoral, regulando proteínas involucradas en la sobrevida y proliferación celular y activando en forma ligando-independiente los receptores hormonales, esto último conlleva a la adquisición de resistencia a la terapia endócrina. En un estadio tumoral más avanzado, tanto la disminución de AKT1 a través de la activación del eje β1-integrina/FAK/MMP9, como el aumento de AKT2 a través de la regulación del citoesqueleto de actina, llevarían a una mayor agresividad tumoral dada por un aumento de la invasión celular. Conclusión: En base a nuestros resultados, proponemos que tanto la pérdida de AKT1 como la ganancia de AKT2 podrían ser consideradas como biomarcadores para clasificar a los tumores mamarios con características más agresivas. La relevancia de nuestro trabajo radica en el análisis exhaustivo de la función de la vía PI3K/AKT/mTOR, diferenciando el rol particular de AKT1 y AKT2 y de sus proteínas target downstream, que a futuro podría aplicarse en el diseño de terapias dirigidas a cada tipo y estadio tumoral para lograr un mayor efecto terapéutico.

Abstract:
Background: Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of cancer death among females worldwide. Despite the early diagnosis and the improvement in the treatments, a considerable amount of tumors progress and metastasize. PI3K/AKT/mTOR is the most frequently mutated pathway in solid tumors; approximately 70% of breast tumors display an activating mutation in one component of the pathway, and it is associated with a poor outcome and resistance to conventional therapy. There are three AKT isoforms: AKT1, AKT2 and AKT3, with different specific functions. Specific aims: The main aim of this thesis was to study the specific role of AKT1 and AKT2 during proliferation, cell migration and invasion through breast cancer progression. Background: We have previously demonstrated that AKT1 overactivation was sufficient to induce hormone-independent breast tumor growth. The resultant tumors were differentiated, with high levels of cytokeratin 8 and laminin-I and low levels of cytokeratin 14 expression. Methodology: In this study, we used three human breast cancer cell lines, IBH-7, IBH-6 and T47D and we analyzed the effect of up- or downregulation of AKT1 or AKT2 on tumor phenotype, in culture and in xenografts. Results: We demonstrated that AKT1 induced tumor growth through ribosomal S6 protein and cyclin D1 increase. Moreover, AKT1 upregulation lead to hormone-receptors activation, even in the absence of exogenous hormone supply. Consequently, AKT1 overexpression induced resistance to the estrogen receptor downregulator, ICI182780 (Fulvestrant). Moreover, AKT1 overexpressing tumors displayed glandular differentiation, with high levels of E-cadherin and laminin-I. AKT1 silencing decreased cell proliferation and, surprisingly, increased cell migration and invasion in cell culture, through the β1-integrin/FAK/MMP9 axe. Besides, silenced AKT1 tumors were highly invasive of the adjacent adipose and muscle tissue, and induced lung metastasis. On the other hand, AKT2 overactivation also induced more invasive tumors and lung metastasis, with no changes in tumor growth although. On the opposite, AKT2 downregulation decreased motility in cell culture, by regulating citoskeleton proteins as F-actin and vimentin. We also found that AKT1 silencing induced an upregulation in AKT2 expression, suggesting a cross regulation between the two isoforms. Finally, in a preliminary study we found that PI3K/AKT/mTOR inhibitors are capable of decreasing breast tumor size but of inducing more aggressive tumors and lung metastasis. This effect could have great implications in the management of new targeted therapies against the pathway. Altogether, our results clearly show different, and in some cases opposite roles for AKT1 and AKT2 isoforms in breast cancer progression. We demonstrated that AKT1 has a relevant role in tumor growth, through the regulation of proteins involved in cell survival and proliferation, and trough the activation of hormone receptors, ultimately leading to endocrine resistance. On the other hand, the downregulation of AKT1, as well as the upregulation of AKT2, can increase cell invasion and tumor aggressiveness. Conclusion: We propose that AKT1 loss and/or AKT2 gain should be considered as biomarkers to better classify invasive mammary tumors. The relevance of this work is the deep analyses of PI3K/AKT/mTOR pathway, differentiating AKT1 and AKT2 functions, and its downstream proteins in breast cancer progression, which could be useful in the future to design targeted therapies for each tumor type and stage.

Mild, Jesica Gabriela. "Búsqueda de extractos naturales con propiedades antiparasitarias y nuevos blancos moleculares para la terapia contra la enfermedad de Chagas" (2016-04-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los tratamientos disponibles contra la Enfermedad de Chagas son poco efectivos y pueden presentar efectos secundarios severos. Existe una urgente necesidad de encontrar nuevos blancos moleculares y nuevas terapias antiparasitarias. El primer objetivo de este trabajo consistió en la búsqueda de extractos naturales con capacidad de interrumpir interacciones entre proteínas que participan en procesos esenciales del parásito y presentan características divergentes respecto de su contraparte en humanos. El rastreo se realizó sobre la interacción entre las proteínas p14 y Sf3b155 a través de un ensayo basado en la transferencia de energía resonante bioluminiscente (BRET). Contrariamente al objetivo original, encontramos que un extracto de Nardophyllum bryoides provocó un aumento de la señal de BRET, lo cual reflejaría su capacidad de modular positivamente la interacción; asimismo, el extracto presentó propiedades antiproliferativas sobre cultivos de epimastigotes. Por otra parte, se planteó la identificación de nuevos blancos moleculares a partir de dos estrategias. La primera se basó en la caracterización de potenciales interacciones entre proteínas del parásito, en particular, a través de la búsqueda de ligandos de una proteína exclusiva de T. cruzi, TcCLB.504427.180, que presenta dominios WW y podría participar en diversos procesos fisiológicos. La segunda, se enfocó en la búsqueda de nuevos efectores de la vía del AMPc en T. cruzi. Si bien la primera estrategia no arrojó resultados positivos, el segundo enfoque nos permitió demostrar que la proteína TcCLB.508523.80 es capaz de unir AMPc y que podría estar involucrada en la invasión de la célula hospedadora. Estas evidencias sugieren que TcCLB.508523.80 sería un novedoso sensor primario del AMPc en la biología del parásito.

Abstract:
Available treatments against Chagas Disease are not completely effective and may present severe side effects. There is an urgent need to find new molecular targets and new antiparasitic therapies. The first objective of this work was to search for natural extracts with the ability to interrupt interactions between proteins that are involved in essential processes of the parasite and posses divergent characteristics regarding its human counterparts. The screen was performed on the interaction between the proteins p14 and Sf3b155 through a bioluminescent resonance energy transfer (BRET) assay. Contrary to the original goal, we found that an extract of Nardophyllum bryoides caused an increase in BRET signal, which might reflect its ability to positively modulate the interaction; in accordance, the extract showed antiproliferative properties on epimastigote cultures. Moreover, we intended to identify new molecular targets by using two approaches. The first was based on the characterization of potential interactions between parasite proteins, in particular, through searching ligands for TcCLB.504427.180, a T. cruzi exclusive protein, which contains WW domains and could be involved in various physiological processes. The second, was focused on finding new effectors of the cAMP pathway in T. cruzi. While the first strategy showed no positive results, the second approach allowed us to demonstrate that the protein TcCLB.508523.80 is able to bind cAMP and could be involved in host cell invasion. These evidences suggest that TcCLB.508523.80 could be a novel primary cAMP sensor in the parasite biology.

Venturutti, Leandro. "Rol de los micro-ARN 21 y 16 en la diseminación metastásica y resistencia a terapias dirigidas en el cáncer de mama ErbB-2 positivo" (2016-05-04) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La sobreexpresión/amplificación del receptor con actividad tirosina-quinasa ErbB-2 define un subtipo agresivo de cáncer de mama (CM) con incidencia elevada de metástasis, denominado ErbB-2 positivo. En esta Tesis revelamos un nuevo sentido de la interacción entre el ErbB-2 y Stat3, otro actor clave en CM, la cual subyace la diseminación metastásica. Encontramos que Stat3 no solo induce la expresión del ErbB-2, sino que también lo recluta como coactivador en el promotor del microARN-21, un microARN promotor de metástasis. El ErbB-2 induce además la expresión del microARN-21 actuando como factor de transcripción. El microARN-21, a su vez, inhibe la expresión de PDCD4, un supresor de metástasis. En la clínica, encontramos en tumores ErbB-2 positivos una correlación inversa entre la coexpresión nuclear Stat3/ErbB-2 y la expresión de PDCD4, la expresión del microARN-21 y de PDCD4, y la expresión de PDCD4 y la presencia de metástasis ganglionares. A pesar de que terapias dirigidas al ErbB-2, como el trastuzumab y el lapatinib, han probado ser beneficiosas, las respuestas tienden a ser limitadas en magnitud y duración. Aquí, describimos un mecanismo de acción novedoso para estos agentes. Encontramos que el trastuzumab y el lapatinib, a través del bloqueo de las vías de PI3K/AKT y MAPK, inhiben al oncogén c-Myc, lo cual aumenta los niveles del microARN-16, un potente supresor tumoral. La incapacidad de inducir la expresión del microARN-16 subyace fenómenos de resistencia. Identificamos a CCNJ y FUBP1 como blancos novedosos del microARN-16, responsables de sus efectos antiprolfierativos, y demostramos que los niveles del microARN-16 y FUBP1 predicen la respuesta al trastuzumab en adyuvancia, en pacientes con CM ErbB-2 positivo. Postulamos al microARN-16 como un agente terapéutico innovador para tumores resistentes al trastuzumab y/o lapatinib.

Abstract:
Overexpression/amplification of the receptor tyrosine kinase ErbB-2 accounts for an aggressive breast cancer (BC) subtype (ErbB-2 positive) with increased incidence of metastases. In the present Thesis, we revealed a novel direction of the interaction between ErbB-2 and Stat3 (another key player in BC), underlying BC metastasis. We found that Stat3 not only induces ErbB-2 expression, but it also recruits ErbB-2 as its co-activator at the promoter of microRNA-21, a metastasis-promoting microRNA. ErbB-2 also up-regulates microRNA-21 through its direct role as transcription factor. MicroRNA-21, in turn, downregulates the expression of the metastasis-suppressor protein PDCD4. In the clinic, we found an inverse correlation between ErbB-2/Stat3 nuclear coexpression and PDCD4 expression, microRNA-21 and PDCD4 expression, and PDCD4 expression and nodal metastasis in ErbB-2 positive tumors. Although the ErbB-2-targeted therapies trastuzumab and lapatinib have proven beneficial, responses are usually limited in length and magnitude. Here, we revealed a novel mechanism of action of these agents. We found that that blockade of PI3K/AKT and MAPK by trastuzumab or lapatinib inhibits the oncogene c-Myc, resulting in upregulation of microRNA-16, a potent tumor suppressor. Accordingly, we found that failure to upregulate microRNA-16 underlies resistance. We identified two novel microRNA-16 targets, CCNJ and FUBP1, which mediate microRNA-16 antiproliferative effects, and identified microRNA-16 and FUBP1 as predictive biomarkers of adjuvant trastuzumab response in patients with ErbB-2 positive BC. We propose microRNA-16 as an innovative therapeutic agent for trastuzumab- and lapatinib-resistant tumors.

Fiszbein, Ana. "Regulación ¨epigenética¨ del splicing alternativo durante la diferenciación neuronal" (2016-05-17) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las modificaciones epigenéticas son cruciales para el establecimiento y mantenimiento de programas de diferenciación celular. Un posible mecanismo de regulación está determinado por el efecto de la estructura de la cromatina en los patrones de splicing alternativo. Las marcas epigenéticas pueden provocar cambios en la tasa de elongación de la ARN polimerasa II, así como afectar el reclutamiento de diversos factores y, de esta manera, modular los patrones de splicing alternativo. Aquí descubrimos el mecanismo por el cual el splicing alternativo de la molécula de adhesión celular neural (NCAM) es regulado durante la diferenciación neuronal mediante la estructura cromatínica. Por otra parte, nos centramos en la regulación del splicing alternativo de G9a, la enzima responsable de la dimetilación en lisina 9 de histona H3 (H3K9me2) en eucromatina de mamíferos. Demostramos que G9a es necesaria para la diferenciación de la línea celular neuronal de ratón N2a y que la inclusión de su exón alternativo (E10) aumenta la localización nuclear de G9a, probablemente debido a la mayor exposición de una secuencia de localización nuclear cercana. Por último, mostramos que la isoforma de G9a que incluye el E10 es necesaria para la diferenciación neuronal y que regula el patrón de splicing alternativo de su propio ARN mensajero precursor promoviendo una mayor inclusión del E10. Nuestros resultados indican que, mediante el control de su splicing alternativo, G9a promueve la diferenciación neuronal y gatilla un mecanismo de retroalimentación positiva que reafirma el compromiso a la diferenciación celular.

Abstract:
Epigenetic modifications are critical for the establishment and maintenance of differentiation programs. One possible mechanism of regulation is determined by the effect of chromatin structure on alternative splicing patterns. Epigenetic marks can cause changes in elongation rate of RNA polymerase II, as well as affect the recruitment of different factors, and thus modulate alternative splicing choices. Here we discovered the mechanism by which the alternative splicing of the neural cell adhesion molecule (NCAM) is regulated during neuronal differentiation by chromatin structure. Moreover, we focused on the regulation of G9a alternative splicing, the enzyme responsible for dimethylation of lysine 9 in histone H3 (H3K9me2) in mammalian euchromatin. We demonstrate here that the G9a methyltransferase is required for differentiation of the mouse neuronal cell line N2a and that inclusion of its alternative exon 10 (E10) increases during neuronal differentiation of cultured cells, as well as in the developing mouse brain. Although E10 inclusion greatly stimulates overall H3K9me2 levels, it does not affect G9a catalytic activity. Instead, E10 increases G9a nuclear localization, predictably due to higher exposure of a neighboring nuclear localization signal. We show that G9a inclusion of E10 isoform is necessary for neuron differentiation and regulates the alternative splicing pattern of its own pre-mRNA, enhancing E10 inclusion. Overall, our findings indicate that, by regulating its own alternative splicing, G9a promotes neuron differentiation and creates a positive feedback loop that reinforces the cellular commitment to differentiation.

Maselli, Gustavo Ariel. "Fosfatasas de proteínas con dominios Kelch en Arabidopsis thaliana. Estudios funcionales, estructurales y evolutivos" (2016-05-31) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las fosfatasas de proteínas con dominios Kelch (PPKL) son miembros de la familia PPP de fosfatasas de serinas y treoninas que están presentes sólo en algas verdes, plantas y alveolados. Las PPKL son proteínas bimodulares con un dominio N-terminal de tipo turbina β y un dominio catalítico en el extremo C-terminal, separados por una extensa secuencia conectora sin homología con otras conocidas. En las plantas, las PPKLs han sido descriptas como efectoras de la señalización por brassinosteroides y aparecen involucradas en el control de la proliferación celular. En este trabajo se han reevaluado los roles de los cuatro miembros de la familia PPKL presentes en Arabidopsis thaliana (BSL1, BSL2, BSL3 y BSU1) mediante análisis filogenéticos, funcionales y genéticos. BSL1 y BSL2/BSL3 pertenecen a dos clados evolutivos antiguos que han sido altamente conservados en las plantas terrestres; en cambio, los genes de tipo BSU1 se encuentran exclusivamente en la familia Brassicaceae y muestran una notable divergencia de secuencia, incluso entre especies estrechamente emparentadas. La pérdida de función simultánea de dos parálogos cercanamente relacionados, BSL2 y BSL3, causa un conjunto de alteraciones fenotípicas peculiares y novedosas; la pérdida de función de BSL1 es, en cambio, fenotípicamente silenciosa. Sin embargo, los tres parálogos más importantes cumplen juntos un papel esencial en etapas tempranas del desarrollo, en el cual BSU1 no puede suplantarlos. Estos patrones evolutivos se ven reflejados en un comportamiento inusual de las PPKL que las diferencia del resto de las fosfatasas de tipo PPP: su capacidad de participar en interacciones homotípicas. BSL1, BSL2 y BSL3 se comportan in vivo como homodímeros, mientras que BSU1 sólo es capaz de realizar interacciones débiles y/o transitorias consigo misma. Curiosamente, se encontró que los determinantes de la interacción son diferentes entre los miembros de los clados principales. En BSL1, el dominio catalítico es el principal impulsor de la interacción; en contraste, el dominio catalítico de BSL2 es necesario, pero no suficiente, y la dimerización requiere de dos porciones de secuencia en el dominio conector. El dominio conector de BSL2 se comporta en solución como una proteína intrínsecamente desordenada propensa a formar elementos de estructura secundaria frente a perturbaciones leves del medio. La presencia de un miembro altamente divergente, en conjunto con la inusual capacidad de formar homodímeros y las diferencias presentes entre parálogos con alto grado de conservación, ponen de manifiesto la complejidad de esta pequeña y esencial familia génica, al tiempo que cuestionan los fundamentos de la asignación de sus roles funcionales.

Abstract:
Protein phosphatases with Kelch-like domains (PPKL) are members of the PPP family present in green algae, plants and alveolates. PPKL are bimodular proteins with a β-propeller domain at the N-terminus and a catalytic domain akin to PP1 at the C-terminus; both domains are tethered by an intermediate sequence of unknown affiliations. In plants, PPKLs have been described as effectors of brassinosteroid signaling and cell proliferation. We reappraised the roles of the four members of the family present in Arabidopsis thaliana -BSL1, BSL2, BSL3 and BSU1- through phylogenetic, functional and genetic analyses. BSL1 and BSL2/BSL3 belong to two ancient evolutionary clades that have been highly conserved in land plants; in contrast, BSU1-type genes are exclusively found in the Brassicaceae and display a remarkable sequence divergence, even among closely related species. Simultaneous loss of function of the closely related paralogs BSL2 and BSL3 causes a peculiar array of phenotypic alterations; loss of function of BSL1 is, in turn, phenotypically silent. However, the three major paralogs play together an essential role in early stages of development, that BSU1 is unable to supplement. These evolutionary patterns mirror an unusual behaviour in PPP phosphatases: the ability of PPKL to form homotypic interactions. BSL1, BSL2 and BSL3 behave in vivo as homodimers, whereas BSU1 is only able of transient interactions. The interaction determinants are, however, different among members of the main clades. In BSL1, the catalytic domain is the main driver of interaction; in contrast, the catalytic domain of BSL2 is necessary but not sufficient, and dimerization requires two conserved sequence stretches in the linker domain. The linker domain of BSL2 behaves in solution as an intrinsically disordered protein prone to form secondary structure elements upon mild perturbations. The presence of a highly divergent member, together with the unusual ability to form homodimers and the existing differences between paralogs with a high degree of conservation, reveal the complexity of this small and essential gene family, while questioning the foundations of their functional role assignment.

Hita, Francisco Javier. "La familia de proteínas Lrig: nuevas funciones biológicas y mecanismos de señalización en neuronas" (2016-07-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Estudios recientes aportaron evidencias convincentes acerca de las funciones que cumplen diversas proteínas transmembrana que contienen dominios extra-celulares ricos en leucina (LRR) durante el desarrollo del sistema nervioso. Los procesos celulares que subyacen al establecimiento de la conectividad neuronal, como la regulación del guiado axonal, el crecimiento dendrítico, la formación de contactos sinápticos y en parte, la plasticidad sináptica; a menudo requieren la participación de proteínas que contienen estos dominios. En efecto, existe una gran variedad de proteínas con dominios LRR altamente enriquecidas en el hipocampo y la corteza cerebral de mamíferos, que juegan roles claves en el armado de los circuitos neuronales. Se sabe que un mal funcionamiento de estos genes en ocasiones puede comprometer la función neuronal y derivar en enfermedades del neurodesarrollo, déficits cognitivos y/o desórdenes neuropsiquiátricos. Evidencias previas demostraron que la proteína transmembrana Lrig1 (proteína rica en dominios leucina e inmunoglobulina) se asocia con múltiples receptores tirosina kinasa y regula así la actividad trófica inducida por los factores de crecimiento EGF, HGF y el factor neurotrófico GDNF, entre otros. A pesar de que Lrig1 se expresa en neuronas centrales (motoneuronas espinales) y periféricas (del ganglio anexo de la raíz dorsal) en desarrollo, su contribución fisiológica para el desarrollo del sistema nervioso, aún no ha sido determinada. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo de tesis, fue caracterizar las poblaciones neuronales Lrig1 positivas en las estructuras cerebrales estudiadas y determinar la contribución de las Lrigs para el desarrollo y el desempeño del sistema nervioso central. Basándonos principalmente en su prominente patrón de expresión durante el desarrollo hipocampal y utilizando ensayos de pérdida y ganancia de función, hemos determinado que Lrig1 es un regulador de la arborización dendrítica y de la espinogénesis hipocampal. Nuestros ensayos celulares y bioquímicos indican que Lrig1 controla la formación de dendritas primarias y la ramificación dendrítica de neuronas hipocampales, a través de un mecanismo de regulación negativa de la actividad neurotrófica de BDNF. Debido a que los otros dos miembros de la familia, Lrig2 y Lrig3 también se expresan en neuronas hipocampales en desarrollo, se ha estudiado de qué manera la pérdida de función de Lrig2 o Lrig3 podría afectar la morfología de neuronas hipocampales. Nuestros resultados sugieren que a diferencia de Lrig1, la ausencia de Lrig2 o Lrig3 inhibe la dendritogénesis de neuronas primarias hipocampales. Por otra parte, ensayos conductuales llevados a cabo con ratones transgénicos deficientes en Lrig1 han demostrado que la ausencia de Lrig1 afecta procesos de memoria dependientes de hipocampo y corteza, tales como la codificación de información espacial y la capacidad de reconocer la identidad de objetos novedosos. De esta manera, nuestros estudios demuestran que Lrig1 controla la morfología neuronal y la plasticidad estructural de las neuronas hipocampales, así como también la plasticidad funcional del hipocampo. En este trabajo de tesis doctoral hemos identificado a las proteínas Lrig como nuevos reguladores endógenos de la complejidad dendrítica hipocampal y a la vez hemos establecido por primera vez un fenotipo conductual asociado a funciones hipocampales y corticales, en los ratones deficientes para Lrig1. En su conjunto nuestros hallazgos revelan un nuevo rol de Lrig1 en el control de los procesos morfogénicos que forman el sistema nervioso durante su desarrollo; y evidencian la relevancia fisiológica de Lrig1 en el comportamiento animal.

Abstract:
Recent studies provided convincing evidence about the roles driven by various trans-membrane proteins containing extracellular Lucine-rich domains (LRR) during development of the nervous system. Cellular processes underlying the establishment of neuronal connectivity, regulation of axon guidance, dendrite growth, or formation of synaptic contacts and synaptic plasticity, often require the involvement of proteins containing these domains. In fact, there are a variety of proteins with LRR domains, highly enriched in the hippocampus and cerebral cortex of mammals, playing key roles in the assembly of neural circuits. It is known that a malfunction of these genes can sometimes compromise neuronal function and lead to neurodevelopmental diseases related to cognitive deficits and / or neuropsychiatric disorders. Previous evidence showed that the trans-membrane protein LRIG1 (Lucine-rich protein and immunoglobulin domains) is associated with multiple receptor tyrosine kinases regulating trophic activity through growth factors like EGF, HGF and GDNF, among others. Although LRIG1 is expressed in central (spinal motor neurons) and peripheral (Dorsal root ganglion) neurons, its physiological contribution to the development of the nervous system, has not been determined yet. Therefore, the objective of this thesis was to characterize the LRIG1 positive neuronal populations in brain structures, and determine the contribution of LRIG1 for the development and function of the central nervous system. Based mainly on its prominent expression pattern during hippocampal development and through loss and gain of function experiments, we have determined that LRIG1 is a regulator of dendrite arborization and hippocampal spine genesis. Our biochemical and cellular assays indicate that LRIG1 controls the formation of primary dendrites and dendrite branching of hippocampal neurons through a mechanism involving down-regulation of BDNF neurotrophic activity. Given that other two members of the family, Lrig3 and Lrig2, are also expressed in hippocampal neurons during development, we asked ourselves how the loss of function of Lrig2 or Lrig3 could affect the morphology of hippocampal neurons too. Our results suggest that unlike Lrig1, the absence of Lrig2 or Lrig3 inhibits 14 hippocampal primary neurons dendritogenesis and reduces their complexity. Moreover, behavioral tests conducted with mutant mice, deficient in LRIG1, have shown that absence of LRIG1 affects memory processes dependent of cortical and hippocampal circuitry. Among them, the encoding of spatial information and recognition of objects identity or novelty. Thus, our studies show that LRIG1 controls neuronal morphology and structural plasticity of hippocampal neurons as well as functional hippocampal plasticity. In this doctoral thesis we have identified Lrigs proteins as new endogenous regulators of hippocampal dendrite complexity and at the same time we have established for the first time a behavioral phenotype associated with hippocampal and cortical functions in mice deficient for LRIG1. Taken together our findings reveal a new role for LRIG1, in controlling morphologic processes that form the nervous system during development; and also, the physiological relevance of LRIG1 in animal behavior.

Gantuz, Magdalena. "Identificación y caracterización molecular y funcional de variantes de la Proteína Latente de Membrana 1 del virus de Epstein Barr" (2016-08-24) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El Virus de Epstein Barr (EBV), agente etiológico de la mononucleosis infecciosa (MNI), se asocia también a neoplasias. Si bien las causas por las cuales contribuye a la linfomagénesis están aún en estudio, la identificación de variantes virales asociadas a tumores podrían responder en parte este interrogante. Dado que LMP1 es la principal proteína oncogénica de EBV, el objetivo fue identificar y caracterizar las variantes moleculares en sus regiones promotora y codificante, y determinar su participación en la patogenia de las enfermedades asociadas. Se incluyeron 29 pacientes pediátricos con linfomas asociados a EBV, 30 con MNI y 14 controles con hiperplasia reactiva. Se amplificaron mediante PCR las regiones promotora ED-L1 y codificante, se secuenciaron y se realizó análisis filogenético. Se analizó además in vitro la actividad del promotor. Región ED-L1: se definieron 4 clados denominados según las líneas celulares B95.8, Cao, Raji and P3HR1. B95.8 fue el más frecuente (47%), pero no se asoció a a ninguna patología en particular. Se observaron mutaciones en sitios de unión a factores de transcripción, la pérdida del C/EBP disminuye 3 veces la actividad de ED-L1. Región codificante: se identificaron 6 clados (China1, China2, Med-, Alaskan, B95.8 and Argentina ) de los cuales prevaleció la variante de circulación local, Arg, (46%) potencialmente originada por recombinación Raji/China1 y que podría tener un origen africano. No se observó una asociación entre variantes específicas y linfomagénesis, aunque algunos polimorfismos tuvieron mayor frecuencia en linfomas. Se estimó una tasa de evolución acelerada en comparación a lo esperado para un herpesvirus, quizás influenciado por la presión de selección positiva sobre codones específicos. Este análisis muestra una evolución compleja de este gen y revela la importancia de su potencial utilización como marcador de variantes virales geográficas.

Abstract:
Epstein Barr virus (EBV), the etiological agent of infectious mononucleosis, is also associated with neoplasia. Little is known about variants prevalence and their influence in EBV diseases. Our aim was to study viral LMP1 variant distribution among children with EBV+ malignant and benign conditions as well as healthy carriers. Oral secretions (OS) and blood cells (PBMC) from 30 children with IM, and biopsies from 14 EBV+ reactive hyperplasia (RH) and 29 EBV+ lymphomas (L) were included. LMP1 sequences were amplified by nested PCR. Sequencing and phylogenetic analysis was performed. Promoter activity was assayed in EDL1 variants. ED-L1: Phylogenetic reconstruction defined 4 clades termed after B95.8, Cao, Raji and P3HR1. B95.8 clade was the most frequent (47%), but it was not associated with any particular condition. Mutations were found in transcription factor binding sites; the abolition of C/EBP caused a 3-fold diminish in EDL1 activity. Coding region: 6 clades were defined (China1, China2, Med-, Alaskan, B95.8 and Argentine (Arg)). Arg clade, the most prevalent (46%), proved to be a Raji and China1 recombinant. No pathology or compartment associations were observed for LMP1 variants, however some polymorphisms presented a higher prevalence in lymphoma patients. Viral evolutionary rate estimated from LMP1 was faster than the expected for a herpesvirus, perhaps due to positive selection influence. These results contribute to the knowledge of EBV genetic diversity and evolution. LMP1 appears to have a complex evolution pattern and reveals the importance of its potential use as a marker of geographical viral variants.

Fernández, Natalia Brenda. "Caracterización de los mecanismos moleculares y celulares activados por ROR1 durante la progresión de melanoma" (2016-08-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El receptor huérfano de tipo tirosina quinasa, ROR1, se expresa y cumple diversas funciones durante el desarrollo embrionario, mientras que en la adultez, su expresión en los tejidos normales es baja o nula. Sin embargo, se ha descripto que ROR1 se expresa abundantemente en diversos tipos de tumores y leucemias. A su vez, ROR1 actúa como un receptor celular de Wnt5a, un ligando extracelular que ha sido implicado en la tumorigénesis. Es por esto que decidimos determinar la expresión y participación de ROR1 en los procesos celulares y moleculares implicados en la progresión de melanoma. Nuestros resultados indican que ROR1 se expresa en líneas celulares y muestras tumorales de melanoma humano, y que su expresión se asocia con una menor sobrevida postrecurrencia de los pacientes. Empleando estrategias de pérdida y ganancia de función determinamos que ROR1 favorece el crecimiento celular, tanto de manera dependiente como independiente de un sustrato sólido. A su vez, ROR1 disminuye la adhesión y aumenta la motilidad y migración de las células de melanoma. Estos procesos son mediados, en parte, a través de la regulación positiva de la vía de Akt y del aumento de la expresión de los marcadores mesenquimales N-cadherina y vimentina. La regulación de N-cadherina depende tanto de la presencia de ROR1 como de la activación de la vía de Akt. En conclusión, demostramos que ROR1 contribuye a la progresión de melanoma y constituye un posible nuevo marcador pronóstico y blanco terapéutico.

Abstract:
The Receptor tyrosine kinase-like Orphan Receptor 1, ROR1, is primarily expressed during different stages of embryogenesis, while in the adult its expression in the normal tissues is downregulated. However, it has been shown that ROR1 re-express in various types of cancers and leukaemias. Interestingly, ROR1 acts as a Wnt5a receptor, an extracellular ligand that has been implicated in tumorigenesis. For these reasons, we decided to study ROR1 expression in melanoma and its role in the cellular and molecular processes implicated in melanoma progression. Here we show that ROR1 is aberrantly expressed in melanoma cell lines and tumours, and that its expression associates with poor post-recurrence survival of patients with melanoma. Using gain- and loss-of-function approaches we found that ROR1 enhances both anchoragedependent and -independent growth of melanoma cells. In addition, ROR1 decreases cell adhesion and increases cell motility and migration. These processes are mediated, in part, by an upregulation of the Akt pathway and an increased expression of the mesenquimal markers N-cadherin and vimentin. The regulation of N-cadherin relies on the presence of ROR1 and the activation of Akt. In summary, we show that ROR1 contributes to melanoma progression and is a candidate biomarker and a prospective therapy target.

Zalcman, Gisela Patricia. "Regulación de la expresión de genes de respuesta temprana y tardía en la formación y mantenimiento de la memoria de largo término" (2016-09-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
A lo largo de los últimos años, se ha acumulado una vasta evidencia experimental señalando a NF-κB como uno de los factores de transcripción (FT) más relevantes en la formación y reprocesamiento de memorias de largo término (MLT) en distintos modelos animales y tareas de aprendizaje. Sin embargo, poco se sabe de los genes que son regulados por este FT durante procesos mnésicos. El objetivo de mi tesis fue identificar y caracterizar algunos de los genes que son regulados por este FT durante la consolidación de la memoria de reconocimiento de objetos en el hipocampo de ratón. Los resultados obtenidos indican que durante este proceso, NF-κB regula la expresión de genes de respuesta temprana y tardía, en particular, del FT ZIF268 y de la proteinquinasa Ca(2+)-Calmodulina-quinasa II δ (CaMKIIδ), una sub-unidad de CaMKII cuya función en el sistema nervioso central se desconoce. El entrenamiento al paradigma de Reconocimiento de Objetos Novedosos, que lleva a la formación de una memoria de reconocimiento de largo término, indujo la expresión de ambos genes. ZIF268 se expresa de manera rápida y transitoria dentro de las primeras horas postentrenamiento y su expresión es necesaria para la formación de una MLT. Por el contrario, la expresión de CaMKIIδ se induce en forma tardía y sostenida, y persiste hasta por lo menos 7 días luego del entrenamiento. Sorprendentemente, nuestros resultados indican que CaMKIIδ no afecta la formación de la MLT, sino la formación y mantenimiento de una forma de MLT más persistente. A continuación, mostramos que la ocupación nucleosomal en ciertas regiones claves del promotor de CaMKIIδ se ve afectada hasta 7 días luego del entrenamiento. Esta es la primera vez que se demuestra que este tipo de modificaciones epigenéticas tienen lugar durante la formación y mantenimiento de la MLT. Por último, hallamos que, en neuronas piramidales del hipocampo, CaMKIIδ se localiza principalmente en el núcleo, dendritas y terminales pre-sinapticas. Nuestros estudios funcionales, junto con los de localización sub-celular aportan los primeros indicios respecto a los mecanismos moleculares en los que podría intervenir CaMKIIδ en el sistema nervioso central.

Abstract:
An important body of evidence supports NF-kappaB as one of the most relevant transcription factors (TF) involved in the consolidation of long-term memories (LTM) in different animal models and behavioural tasks. However, little is known about the genes that are regulated by this TF in mnemonic processes. The aim of my PhD research was to identify and characterize some of the genes that are regulated by this TF during the consolidation of object recognition memory in the mouse hippocampus. The results obtained indicate that during this process NF-kappaB regulates the expression of immediate-early and late genes, which include TF ZIF268 and Calcium- Calmodulin Kinase II δ- (CaMKIIδ), an isoform of CaMKII whose precise function in the central nervous system is unknown. Training on the Novel Object Recognition task, which leads to the formation of an object recognition LTM, induced the expression of both genes. Zif268 was expressed rapidly and transiently within the first hours after training and its expression was required for the formation of LTM. On the contrary, CaMKIIδ expression was induced in a late and sustained manner, being up-regulated upto 7 days after training. Surprisingly, inhibition of CaMKIIδ expression did not affect the formation of LTM, but it impaired the formation and mainteinance of a persistenf form of LTM. Moreover, we showed that nucleosomal occupancy in certain key regions of CaMKIIδ promoter was affected as a result of NOR training upto 7 days later. This is the first evidence that this type of epigenetic modification occurs during the formation and mainteinance of LTM. Finally, we found that in hippocampal pyramidal neurons, CaMKIIδ is primarily located in the nucleus, dendrites and pre-synaptic terminals. The information on its subcellular-localization together with our functional studies provide the first hint regarding the signaling mechanisms that may be affected by CaMKIIδ in the CNS.

Belingheri, Ana Verónica. "Endocitosis rápida en células cromafines de ratón: mecanismos asociados, su regulación por Ca2+ y su participación en el reciclado vesicular" (2016-09-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En las células cromafines se han descripto varios tipos de endocitosis (clatrina dependiente, kiss and run, bulk endocitosis), las cuales contribuyen a la recuperación y el reciclado de la membrana plasmática, de sus proteínas, y de las vesículas que se han fusionado por exocitosis. En esta Tesis doctoral se ha medido electrofisiológicamente la endocitosis rápida en células cromafines de ratón, observándose dos modalidades. Por un lado, una endocitosis compensatoria que evoluciona con una única constante temporal rápida de ~8 seg, e internaliza aproximadamente la misma cantidad de membrana que fue exocitada durante la estimulación. Esta modalidad se dispara en respuesta a una entrada de Ca2+ menor a 79 pC (grupo LCG, por “low current group”). Por otro lado, se identificó una endocitosis en exceso que internaliza una cantidad de membrana mayor a la exocitada previamente, evolucionando con dos constantes temporales, una rápida de cinética similar a la del LCG y una ultra-rápida de ~0,6 seg. Esta última modalidad es disparada por una entrada de Ca2+ mayor a 79 pC (grupo HCG, por “high current group”). Por medio de la utilización de fármacos específicos, se demuestra en esta Tesis que la endocitosis rápida depende específicamente tanto de la entrada de Ca2+ a través de canales dependientes de voltaje (CCDV) de tipo L como del Ca2+ liberado desde el retículo endoplasmático. Además, la utilización de BAPTA demostró que la endocitosis rápida sería dependiente de una señal de Ca2+ localizada. Por otro lado, dos inhibidores del reclutamiento de clatrina inhibieron totalmente la endocitosis en el grupo LCG, y parcialmente en el grupo HCG. Esto sugiere que en este último grupo, se activaría un mecanismo clatrino-independiente. En HCG ambos componentes cinéticos se vieron afectados por los inhibidores de clatrina, sugiriendo que cuando la entrada de Ca2+ es muy alta la endocitosis clatrina-dependiente puede evolucionar a velocidades aún no reportadas en la literatura. Finalmente, experimentos de imaging con FM1-43 mostraron que la endocitosis en exceso inducida por una despolarización con alto K+ se compone de una fracción reciclable a vesículas liberables y de otra no reciclable en un período de 30 minutos, siendo la primera inhibida parcialmente por un bloqueante del reclutamiento de clatrina. Estos resultados en su conjunto nos permiten sugerir un modelo en el cual: (a) la entrada localizada de Ca2+ por CCDV tipo L induce la liberación de más Ca2+ del retículo endoplásmico. (b) El consecuente aumento de este catión induce la activación de una endocitosis clatrina dependiente, que debido a su Ca2+ dependencia se muestra muy rápida al comienzo mientras el Ca2+ alto persiste en el citosol, y más lenta luego de que la concentración citosólica del catión ha disminuido. Esto explicaría la clatrino dependencia de ambos componentes. (c) Esta endocitosis clatrina dependiente resulta parcialmente en la generación de nuevas vesículas liberables. (d) La gran entrada de Ca2+ en el grupo HCG induciría además la activación de un proceso clatrina independiente, que no se recicla en vesículas liberables en los tiempos del experimento.

Abstract:
Chromaffin cells have various types of endocytosis (clathrin-dependent, kiss and run, bulk endocytosis), which allow the recovery and recycling of membrane and proteins of the previously fused vesicles. We measured two modes of rapid endocytosis in mouse chromaffin cells. On one hand, compensatory endocytosis (compensates approximately the same amount of membrane that was added during stimulation) is associated with a Ca2+ entry lower than 79 pC (LCG group) and a single time constant of ~8 sec. On the other hand, excess retrieval (the endocytosis surpasses the amount of the previously exocytosed membrane), is triggered by a Ca2+ entry bigger than 79 pC (HCG group) and has two time constants, a fast one (~8 sec) and an ultrafast one (~0,6 sec). The results of this Thesis show that the activation of rapid endocytosis is dependent on a localized Ca2+ signal, and specifically depends on Ca2+ influx through L-type voltage dependent Ca2+ channels (VDCC) and Ca2+ released from the endoplasmic reticulum. Additionally, we found that rapid endocytosis is clathrin dependent, almost entirely for the LCG group, and partially for the HCG group. Particularly in HCG, it is interesting that clathrin specific blockers inhibited the fast, but also the ultrafast component, what suggests that clathrin dependent endocytosis can progress at rapid speeds not previously reported when the Ca2+ entry is very big. The electrophysiological study on endocytosis was complemented with experiments of imaging using the membrane fluorescent probe FM1-43. After applying a high K+ depolarization that allows a large Ca2+ influx, we recorded an endocytosis that surpassed the previous exocytosis. We found that the internalized membrane was partially recycled to releasable vesicles, by a mechanism that is at least in part clathrin dependent. There was also a large internalized membrane fraction which was not releasable during the experimental period. We propose a tentative model in which: (a) Ca2+ entry through L-type VDCC triggers the release of more Ca2+ from endoplasmic reticulum; (b) the resulting increase of Ca2+ activates a rapid clathrin dependent endocytosis, and particularly in HCG the higher Ca2+ concentration during the first hundreds of milliseconds after the stimulus provokes the appearance of the ultrafast component; (c) clathrin dependent endocytosis partially results in the generation of new releasable vesicles in less than 30 min; (d) in HCG, the high Ca2+ entry also provokes the activation of a clathrin independent endocytosis that does not produce releasable vesicles in the experimental period.

Moya Díaz, José. "Mecanismos involucrados en el desarrollo y sostenimiento de la exocitosis altamente acoplada en células cromafines" (2016-10-25) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En esta tesis se estudiaron los mecanismos asociados con la exocitosis vesicular altamente acoplada al estímulo, su recuperación, y su mantenimiento frente a la aplicación de potenciales de acción a bajas frecuencias de estimulación, propias del estado basal de estas células. En primer lugar, se evidenció que frente a la aplicación de un estímulo que simula un potencial de acción se libera un grupo de ≈ 8 vesículas, al que denominamos ETAP (por exocytosis triggered by action potential). Este pool vesicular está incluido en el pool inmediatamente liberable (IRP, ≈ 25 vesículas), y su exocitosis depende en un 50% de fuentes de Ca2+ extracelulares y en un 50% de un mecanismo independiente del influjo de Ca2+. Mientras que IRP recupera lentamente (τ ≈ 7 s) luego de ser deprimido, ETAP presenta una rápida cinética de recuperación (τ ≈ 0.7 s). Esta recuperación depende de dos procesos: (i) transferencia de vesículas desde pooles vesiculares río arriba, y (ii) una endocitosis rápida dependiente de dinamina y altamente acoplada a la exocitosis precedente. En la segunda parte de esta tesis se investigó el mecanismo de exocitosis independiente del influjo Ca2+ mencionado previamente. Utilizando despolarizaciones cuadradas de 100 ms (máxima respuesta), se determinaron la siguientes características para dicho fenómeno: (i) independencia de fuentes extracelulares e intracelulares de Ca2+; (ii) dependencia de la proteína SNARE sinaptobrevina; (iii) dependencia sigmoidea con el voltaje aplicado; (iv) los resultados sugieren que el sensor de voltaje sería el canal de Ca2+ tipo P/Q, y que interaccionaría con la maquinaria exocitótica a través de la secuencia synprint. En resumen, los resultados muestran que un potencial de acción induce una exocitosis altamente acoplada y sincrónica al estímulo que es dependiente en parte de un mecanismo activado por Ca2+ y en parte de otro activado directamente por voltaje. Finalmente, demostramos que esta exocitosis, gracias a su rápida velocidad de recuperación vesicular, es capaz de mantener la secreción de manera continua a frecuencias basales fisiológicas.

Abstract:
In resting conditions, chromaffin cells fire action potentials at frequencies of 0.2-0.5 Hz, while under stress the frequency increases to 10-15 Hz. In this thesis we studied the mechanisms involved in the development and maintenance of exocytosis in response to the application of action potentials, individually and at low frequencies. In first place, we showed that the application of a stimulus that resembles a single action potential induced the release of a group of ≈ 8 vesicles that we defined as “exocytosis triggered by action potential” (ETAP). Our results show that this pool is part of the immediately releasable pool (IRP ≈ 25 vesicles), and its exocytosis depends 50% on extracellular Ca2+ sources and 50% on a mechanism that is independent of Ca2+ influx. While IRP refilling is slow (τ ≈ 7 s) after depletion, ETAP showed a fast kinetic of recovery (τ ≈ 0.7 s). This recovery depends on two processes: (i) vesicular transference from upstream pools, and (ii) a fast dynamin-dependent endocytotic process, which is tightly coupled to the precedent exocytosis. In the second part of this thesis we investigated the Ca2+- independent exocytotic mechanism previously mentioned. Using square depolarizations pulses of 100 ms (maximal response), the following characteristics were determined for this phenomenon: (i) independence on external and internal Ca2+ sources; (ii) dependence on the SNARE protein synaptobrevin; (iii) sigmoidal dependence with the voltage applied; (iv) the results suggest that the voltage sensor could be the P/Q type Ca2+ channel, which can interact with the exocytotic machinery through its synprint sequence. In summary, our results show that an action potential induces an exocytotic response highly coupled, and synchronous with the stimuli, which depends in part on a mechanism activated by Ca2+ and in part on other mechanism activated directly by voltage. Finally, we demonstrated that this exocytosis, due to its fast vesicular recovery, is able to maintain the secretion under the application of action potentials at basal physiological frequencies.

Cambados, Nadia. "Impacto del sistema renina angiotensina en la involución mamaria y en la progresión tumoral" (2016-10-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El desarrollo de la glándula mamaria es un proceso dinámico que involucra ciclos continuos de proliferación, diferenciación y regresión. Luego de la lactancia, comienza la involución de la misma. Dicho proceso, consiste en una masiva apoptosis de las células epiteliales alveolares y en un intenso remodelado tisular, acompañado de un aumento en la expresión de factores pro-inflamatorios, devolviéndole a la glándula una estructura similar al de una hembra virgen. Por otro lado, el sistema renina angiotensina (RAS) se vincula, actualmente, a una multiplicidad de procesos biológicos, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. La mayoría de los efectos de la AngII, principal efector del RAS, son mediados por el receptor AT1 (AT1-R), y se discute aún la participación del AT2 (AT2-R). En los últimos años, se descubrió que múltiples actividades biológicas del RAS involucran no sólo la acción de la AngII, sino también la de un conjunto de péptidos bioactivos como la Ang-(1-7). Diversas publicaciones indican que la Ang-(1-7) tendría una actividad antiproliferativa y antiangiogénica, contrarrestando los efectos de AngII en diversos tipos celulares. Dado que AngII puede actuar como una citoquina pro-inflamatoria, investigamos en primer lugar, si el RAS cumple algún rol durante la involución mamaria. Demostramos por primera vez, que la AngII induce una marcada activación de STAT3 en el epitelio mamario in vivo. Dicho efecto, es medidado por el AT1-R. Asimismo, observamosque la inyección de AngII intramamario induce una rápida activación de ERK1/2 y un aumento significativo en el porcentaje de células apoptóticas. Para evaluar el rol de AngII endógena, se trataron ratones con el inhibidor de AT1-R losartan, durante la involución mamaria. El bloqueo del AT1-R desencadenó un aumento en los niveles de factores de supervivencia celular AKT y Bcl-XL, y una disminución de la expresión de los genes de respuesta temprana LIF y TNF-α, del porcentaje de células apoptóticas y de la actividad de MMP-2 y MMP-9. Investigamos además, la relevancia de los dos subtipos del AT1-R, AT1a-R y AT1b-R, en la involución mamaria, mediante el uso de ratones deficientes para dichos receptores. Encontramos un retardo significativo en involución a las 72 y 96 hs en los ratones dobles KO AT1a/AT1b. Dicho retardo, se correlacionó con una disminución de células apoptóticas y de fibras de colágeno y reticulina. A continuación, estudiamos el rol de AngII y Ang-(1-7) en células mamarias normales y tumorales. En células normales epiteliales mamarias, encontramos que ambos péptidos inducen activación de AKT y ERK1/2. Sin embargo, Ang-(1-7) induce menor activación y, la estimulación simultánea con ambas angiotensinas, produce un patrón de activación de AKT similar al desencadenado por Ang-(1-7). Asimismo, AngII es capaz de promover la transición epitelio mesenquimal (TEM) en dichas células, induciendo la expresión de marcadores mesenquimales y disminuyendo la expresión de marcadores epiteliales. Nuevamente, dicho efecto es contrarrestado en células pre-tratadas con Ang-(1-7). En ensayos de migración e invasión, observamos que AngII aumenta significativamente la capacidad migratoria e invasiva de líneas celulares tumorales mamarias, mientras que el pre-tratamiento con Ang-(1-7) disminuye la migración inducida por AngII a valores similares al control. Por último, demostramos que Ang-(1-7) inhibe el aumento desencadenado por AngII sobre los niveles de expresión de ARNm de VEFG y MMP-9, así como en la actividad de dicha metaloproteasa. En conjunto, nuestros resultados sugieren que AngII, a través del receptor AT1-R, juega un papel preponderante en la involución mamaria, identificándose un nuevo rol para el RAS. Asimismo, mientras que AngII promueve el desarrollo tumoral, Ang-(1-7) contrarresta los efectos desencadenados por AngII en células tumorales mamarias.

Abstract:
Mammary gland development is a complex, dynamic process, which undergoes repeated cycles of growth, differentiation, and regression. After lactation, a rapid switch from survival to death signaling occurs, leading to involution. This process consists in massive apoptosis of alveolar epithelial cells and extensive tissue remodeling, together with an increase in the expression of pro-inflammatory factors. The gland is returned to a virgin-like state. On the other hand, the renin angiotensin system (RAS) is actually associated to multiple biological processes, both in physiological and pathological conditions. Most of the effects of AngII, the main effector peptide of the RAS, are mediated by the AT1 receptor (AT1-R), while the role of AT2 (AT2-R) receptor is still controversial. During the last years, it was discovered that multiple of the biological activities of the RAS involve not only the effects of AngII, but also of a group of bioactive peptides, like Ang-(1-7). Several publications suggest that Ang-(1-7) has an antiproliferative and antiangiogenic activity, counteracting the effects of AngII in different cell types. Since AngII can act as a pro-inflammatory cytokine, we first investigated the role of the RAS during mammary involution. We demonstrated for the first time, that AngII strongly induces STAT3 phosphorylation in the mammary epithelial cells in vivo. This effect is mediated by the AT1 receptor. Furthermore, we observed that intra-mammary injection of AngII induces a rapid activation of ERK1/2 and a significant increase in the percentage of apoptotic cells. To define the role of endogenous AngII, mice were treated with the AT1-R blocker losartan, during involution. Blocking the AT1-R triggered an increase in the levels of the survival factors AKT and Bcl-XL, and decreased the expression of the early responsive genes LIF and TNF-α, the percentage of apoptotic cells and the MMP-2 and MMP-9 activity. Moreover, we analyzed the relevance of the AT1 receptor isoforms, AT1a-R and AT1b-R, during involution, in mice deficient for one or both receptor’s subtypes. We found a significant delay in involution by 72 and 96 h in double KO mice AT1a/AT1b, which was correlated with a significantly lower rate of apoptotic epithelial cells and reduced collagen and reticulin deposition. We next studied the role of AngII and Ang-(1-7) in normal and tumor mammary cells. In normal epithelial cells, both peptides induce phosphorylation of AKT and ERK1/2, although Ang-(1-7) activated it in a lesser extent. However, pre-treatment with Ang-(1-7) prior to stimulation with AngII, produces an activation pattern similar to the one triggered by Ang-(1-7) alone. Furthermore, AngII is capable of promoting epithelial mesenchymal transition (EMT) in these cells, inducing the expression of mesenchymal markers and inhibiting the expression of epithelial ones. Once again, this effect was counteracted in cells pre-treated with Ang-(1-7). In migration and invasion assays, we found that AngII significantly increase the migration and invasion capacity of mammary tumor cell lines treated with AngII, while pre-treatment with Ang-(1-7) reduced this effect to control levels. Finally, we demonstrated that Ang-(1-7) inhibits AngII induced mRNA expression levels of VEGF and MMP-9, as well as the activity of this metalloprotease. Our results suggest that AngII, through AT1 receptor, plays a critical role in post-lactational regression, identifying a new function for the RAS. Moreover, while AngII promotes tumor progression, Ang-(1-7) counteracts the effects triggered by AngII in mammary tumor cells.

Mancini, Estefanía. "Identificación y caracterización de eventos de splicing alternativo en Arabidopsis thaliana utilizando herramientas de transcriptómica de alto rendimiento" (2016-12-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El mecanismo de splicing alternativo es un mecanismo de regulación post-transcipcional presente en los organismos eucariotas que amplía las capacidades regulatorias y funcionales de los genes mediante la generación de múltiples isoformas. Las consecuencias de este proceso son proteínas funcional y estructuralmente diferentes como así también productos no traducibles con funciones regulatorias en sí mismos. El advenimiento de las nuevas tecnologías de secuenciación masiva, incluyendo las que se utilizan para ARN (RNA-Seq) permiten estudiar cambios transcripcionales incluyendo splicing alternativo de una manera inusitada. Sin embargo, la descripción de los cambios en los patrones de splicing bajo diferentes condiciones no es trivial y ha dado lugar durante los últimos años al desarrollo de múltiples herramientas bioinformáticas. En este trabajo de tesis, se describe ASpli, un paquete de R integrativo y fácil de usar que facilita el análisis de los cambios en el splicing alternativo tanto en eventos anotados como nuevos a partir de datos de RNA-Seq. Nuestra propuesta es combinar la información estadística del uso diferencial de exones, intrones y junturas junto con las métricas de inclusión (PSI) y retención de intrón (PIR) que se obtienen por el análisis de las junturas sobre cada región genómica en estudio. La utilización de este abordaje integral intenta cuantificar de manera más exacta la ocurrencia de eventos de splicing alternativo. El desarrollo del paquete fue fundamental para el análisis de la remodelación del transcriptoma ante numerosos tratamientos en la planta modelo Arabidopsis thaliana así como en otros organismos. Como parte de los resultados, se describen los análisis del efecto de un pulso de luz en plantas y sus consecuencias globales en la regulación del splicing alternativo.

Abstract:
Alternative splicing (AS) is a common mechanism of post-transcriptional gene regulation in eukaryotic organisms that expands the functional and regulatory diversity of a single gene by ge- nerating multiple mRNA isoforms that encode structurally and functionally distinct proteins. The development of novel high-throughput sequencing methods for RNA (RNA-Seq) has provided a powerful means of studying AS under multiple conditions and in a genome-wide manner. Despite the fact that a plethora of bioinformatic tools have been developed in the last few years, using RNA-Seq to study changes in AS under different experimental conditions is not trivial. In this thesis, we describe ASpli, an integrative and user-friendly R package that facilitates the analysis of changes in both annotated and novel AS events. Our method combines statistical information from exon, intron, and splice junction differential usage, with information from splice junction reads to calculate differences in the percentage of exon inclusion (PSI) and intron retention (PIR), which reliably reflect the magnitude of changes in the relative abundance of different annotated and novel AS events. This approach is intended to improve the analysis of RNA-Seq data for the quantification and discovery of AS events. The package has been intensively used for the analysis of alternative splicing in a genome-wide manner in Arabidopsis thaliana as well as other organisms. As part of the results, we present the analysis of the accute effects of light on alternative splicing in light-grown plants.

Inda, María Carolina. "Caracterización de distintas fuentes de cAMP en la señalización del GPCR CRHR1" (2017-03-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son los mediadores de las respuestas celulares a una gran cantidad de estímulos, así como también el blanco de muchas drogas terapéuticas. El rol clásico de los GPCRs es acoplar la unión de ligandos a la activación de proteínas G heterotriméricas, que a su vez regulan a múltiples proteínas efectoras. Recientemente se ha demostrado que los modos de señalización de los GPCR son mucho más complejos, involucrando también mecanismos independientes de proteínas G y señalización dependiente de la internalización del receptor. La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol clave en la respuesta integrada al estrés. Además de regular la activación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), CRH está ampliamente distribuida en el sistema nervioso central, donde funciona como un neuromodulador, integrando aspectos comportamentales y afectivos de la respuesta a estrés. Se ha demostrado que la desregulación de la acción de CRH a través de su receptor de alta afinidad, CRHR1, se encuentra involucrada en el desarrollo de estadios patológicos asociados al estrés como ansiedad y depresión. CRHR1 es un GPCR de clase B, que al activarse principalmente se acopla a proteína Gs y lleva a un aumento del segundo mensajero AMP cíclico (cAMP) y la activación de múltiples vías de señalización. Es de particular interés la fosforilación de la MAPK ERK1/2, que induce la transcripción de Pomc para activar el eje HPA en corticotrofos, y se dispara en estructuras del cerebro asociadas a aspectos comportamentales de la respuesta a estrés frente a la estimulación con CRH. Habíamos descripto previamente que CRHR1 activa mecanismos de señalización dependientes de proteína G y otros dependientes de la endocitosis del receptor. Estos dos componentes de respuesta pueden evidenciarse como dos fases diferentes de activación de ERK1/2 en la línea celular hipocampal murina HT22 transfectada establemente con CRHR1 (HT22-CRHR1). En este trabajo, nos focalizamos en la respuesta de cAMP mediada por CRHR1, utilizando métodos clásicos de biología molecular en combinación con biosensores basados en la transferencia de energía resonante de Förster (FRET) para estudiar por visualización dinámica de célula única los mecanismos de señalización de CRH. En primer lugar demostramos que al estimular CRHR1, el aumento en los niveles de cAMP no sólo está mediado por las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también por una adenilil ciclasa soluble (sAC) en las células HT22-CRHR1. sAC es una fuente atípica de cAMP ya que es insensible a proteína G y es regulada por calcio y bicarbonato. Además, se ha reportado que sAC está presente en distintas localizaciones subcelulares, formando microdominios de señalización. La respuesta de cAMP a CRH también se encontró mediada tanto por tmAC como por sAC en la línea celular derivada de corticotrofos AtT20, pero no así en las células 3T3L1-CRHR1. Sin embargo, observamos que tanto en células HT22-CRHR1 como en AtT20, sAC no participa en la señalización de otros ligandos de GPCRs, como isoproterenol o PACAP38, respectivamente. Estos resultados indican que el rol de sAC en la transducción de señales de un GPCR depende del contexto celular y del receptor involucrado. La estimulación con CRH genera un aumento en los niveles de calcio intracelular, y al bloquear la respuesta de calcio se observó un patrón de cAMP y ERK1/2 en respuesta a CRH similar al que se obtiene al bloquear sAC. Esto sugiere que calcio es el activador de sAC río abajo de CRHR1. Luego, nos propusimos caracterizar si ambas fuentes de cAMP contribuyen a un pool común de cAMP o si pueden identificarse roles particulares para cada adenilil ciclasa en la respuesta. Observamos que tanto tmACs como sAC participan en la fase aguda de activación de ERK1/2, pero que en la fase sostenida de fosfo-ERK1/2, dependiente de la internalización de CRHR1, sólo sAC está involucrada. Más aún, demostramos que el CRHR1 continúa generando cAMP desde estaciones endocíticas, y que es sAC la responsable de esta producción una vez internalizado CRHR1. En conclusión, a través de la caracterización de los mecanismos moleculares activados por CRHR1, se hallaron nuevas evidencias que refuerzan el modelo emergente de señalización por GPCR en el que la respuesta de cAMP no ocurre exclusivamente a nivel de la membrana plasmática y donde sAC representa una fuente alternativa de cAMP regulada por GPCRs.

Abstract:
G protein–coupled receptors (GPCRs) are the mediators of cellular responses to a wide variety of stimuli, as well as the target of many therapeutic drugs. The classical role of GPCRs is to couple the binding of ligands to the activation of specific heterotrimeric G proteins, leading to the regulation of downstream effector proteins. Recently, it has been demonstrated that GPCR signaling is much more complex, including G protein–independent mechanisms and receptor internalization dependent signaling. Corticotropin-releasing hormone (CRH) plays a critical role in the integrated stress response. Besides being the driver of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis, CRH is widely distributed in the central nervous system, where it functions as a neuromodulator, integrating affective and behavioral aspects of the stress response. It has been demonstrated that the dysregulation of CRH action through its high-affinity type 1 receptor (CRHR1) is crucial in the pathogenesis of stress-related affective disorders. CRHR1 is a class B GPCR that, upon ligand activation, signals mainly by Gs coupling, leading to the increase of the second messenger cyclic AMP (cAMP) and the activation of multiple signaling cascades. Of particular interest is the phosphorylation of the MAPK ERK1/2, which is involved in the induction of Pomc transcription to activate the HPA axis in pituitary corticotrophs, and that is activated in specific brain structures related to behavioral aspects of the stress response upon CRH stimulation. We have previously described that CRHR1 activates G protein-dependent and receptor endocytosis-dependent mechanisms. These two components of the response can be evidenced as two distinct phases of ERK1/2 activation in the mouse hippocampal cell HT22 stably transfected with CRHR1 (HT22-CRHR1). In this work, we focused on the cAMP response of CRHR1, using classical cell biology tools in combination with Förster resonance energy transfer (FRET)–based biosensors, to study CRH signaling mechanisms at the single cell level by live imaging. First, we demonstrated that upon CRHR1 stimulation, cAMP level increase is not only mediated by transmembrane adenylyl cyclases (tmACs), but also by a soluble adenylyl cyclase (sAC) in HT22-CRHR1 cells. sAC is an atypical cAMP source, insensitive to G protein but regulated by bicarbonate and calcium. In addition, it has been reported that sAC is localized in different intracellular locations, generating particular signaling microdomains. cAMP response to CRH was also found mediated by both tmACs and sAC in the corticotroph-derived cell line AtT20, but sAC was not involved in the response in 3T3L1-CRHR1 cells. However, we determined that in HT22-CRHR1 cells as well as AtT20 cells, sAC does not participate in the signaling pathway of other GPCR ligands such as isoproterenol or PACAP38, respectively. These results indicate that the role of sAC in the signal transduction of a GPCR depends on the cellular context and the receptor involved. CRH stimulation leads to a rise in intracellular calcium levels, and when the calcium response is blocked the cAMP and ERK1/2 pattern in response to CRH is similar to the one observed when sAC is blocked. This suggests that calcium is the activator of sAC downstream CRHR1. Then, we aimed to characterize if both cAMP sources contribute to a common cAMP pool or if particular roles for each type of adenylyl cyclase may be identified in the response. We observed that both tmACs and sAC participate in the acute activation of ERK1/2, but in the sustained phospho-ERK1/2 phase only sAC is involved. Moreover, we demonstrated that CRHR1 continues to generate cAMP from endocytic stations, and that sAC is the enzyme responsible for this production once CRHR1 is internalized. In conclusion, by characterizing the molecular mechanisms activated by CRHR1, we found new evidences that strengthen the emerging model of GPCR signaling in which the cAMP response does not occur exclusively at the plasma membrane and introducing the notion of sAC as an alternative source of cAMP.

http://digital.bl.fcen.uba.ar

Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34