Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Implicancias del gen FMR1 en la función ovárica |
| Título alternativo: | Role of FMR1 gene in ovarian function |
| Autor: | Ferder, Ianina C. |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME)
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| Publicación en la Web: | 2014-07-04 |
| Fecha de defensa: | 2014 |
| Fecha en portada: | 2013 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Director: | Dain, Liliana B. |
| Consejero: | Ceballos, Nora |
| Jurado: | Varone, Cecilia; Vissio, Paula; Barañao, Rosa I. |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | GEN FMR1; FOLICULOGENESIS; OVARIO; INSUFICIENCIA OVARICA PRIMARIA; PREMUTACIONFMR1 GENE; FOLLICULOGENESIS; OVARY; PRIMARY OVARIAN INSUFFICIENCY; PERMUTATION |
| Tema: | biología/biología molecular y celular
biología/biomedicina
biología/genética
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5469_Ferder |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n5469_Ferder.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n5469_Ferder |
| Ubicación: | Dep.BIO 005469 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Ferder, Ianina C.. (2013). Implicancias del gen FMR1 en la función ovárica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5469_Ferder |
Resumen:
El gen FMR1, responsable del Síndrome de Fragilidad del X (SFX), se localiza en el sitio FRAXAen el brazo largo del cromosoma X (Xq27.3), está compuesto por 17 exones, abarcaaproximadamente 38 kilobases (kb) y su producto transcripcional es un ARN mensajero de 3,9 kbque puede sufrir splicing alternativo. En su región 5’ no codificante presenta una zona de tripletes CGG que puede variar en longitud. Según el tamaño de la expansión, los alelos se clasifican ennormales (5- 44 repeticiones), intermedios (45-54 repeticiones), premutados (55- 200repeticiones) o con mutación completa (>200 repeticiones). Mientras que la mutación completaes la causante del SFX, el estado de premutación se asocia a otros 2 desórdenes clínicos: Síndrome de temblor/ ataxia asociado a la Fragilidad del X (FXTAS), un desordenneurodegenerativo de inicio tardío y a la Insuficiencia Ovárica Primaria (IOP) asociada a la Fragilidad del X (FXPOI). La IOP se define como la presencia de amenorrea (de al menos 4 meses) antes de los 40 años, quese acompaña de un aumento en los niveles séricos de FSH (a niveles menopáusicos) y de bajosniveles de estradiol (hipoestrogenismo). Es un síndrome muy heterogéneo de patogénesismulticausal tales como alteraciones cromosómicas, enzimáticas, autoinmunidad, causasiatrogénicas e infecciosas. Tiene una incidencia del 1% en mujeres menores de 40 años y del 0,1%en menores de 30. FXPOI es la causa genética conocida más común de la IOP 46, XX y la premutación en FMR1 esresponsable del 4- 6% de todos los casos de IOP 46, XX. Aproximadamente el 2% de las mujeres 46, XX con IOP aislada y el 14% de la mujeres 46, XX con IOP familiar son portadoras de lapremutación en el gen FMR1. Asimismo, se ha descripto que alrededor del 20% de las mujeresportadoras de la premutación desarrollan IOP. A su vez, las mujeres portadoras se vuelvenmenopáusicas aproximadamente 5 años antes que las no portadoras. Si bien no todas las mujeresportadoras de la premutación experimentan una temprana pérdida de la fertilidad, todas ellasenfrentan el potencial adelantamiento en la aparición de condiciones asociadas con la deficiencia estrogénica (aumento en el riesgo de osteoporosis y de enfermedades cardiovasculares). Estudiosgenéticos epidemiológicos sugieren que el comienzo y la gravedad de la disfunción ováricaasociada a FXPOI son variables y podrían estar moduladas, potencialmente, por el largo de lasrepeticiones CGG y otros factores ambientales. El status de premutación per se pareciera estar influyendo en la expresión de la enfermedad. Dehecho, no se ha descripto que mujeres que poseen expansión completa de tripletes (>200repeticiones y con signos clínicos de Síndrome de Fragilidad del X) desarrollen IOP. Si bien no seconoce el mecanismo por el cual la premutación del gen FMR1 puede causar la disfunción ováricay la insuficiencia ovárica primaria, se ha postulado que puede ocurrir una disminución inicial delnúmero de folículos o una velocidad acelerada de la atresia. Es sabido que la proteína que codificaeste gen, FMRP, se expresa en altas cantidades en células germinales del ovario fetal. Asimismo,se ha descripto que esta proteína actúa como inhibidor de la traducción de algunos ARNmensajeros formando parte de los procesos de silenciamiento génicos mediados por miRNAs. Teniendo en cuenta su función, se ha postulado como posible hipótesis de la patogenia, que unaumento de FMRP en estadios tempranos del desarrollo de los ovocitos podría conducir a unahaploinsuficiencia de proteínas involucradas en este proceso, provocando una disminución delpool inicial de folículos. Sin embargo, y dado que en FXTAS se ha observado un aumento del ARN mensajero del gen como consecuencia de la premutación, se postula como mecanismosalternativo la existencia de un aumento del ARN mensajero en el ovario que ejerza un efectotóxico en el tiempo, con el consecuente incremento de la atresia folicular. Ninguno de estosmecanismos han sido aún comprobados en el ovario, más aún la función fisiológica de la proteínaen el mismo no está establecida. No se conoce además, si existe expresión diferencial a lo largodel desarrollo folicular. Considerando la escasa información que existe acerca de FMR1 y su expresión en ovario, nuestrotrabajo consistió, en una primera fase, en el estudio de la expresión de la proteína FMRP y sumensajero a lo largo de la foliculogénesis, en un modelo de rata. Se utilizaron 3 grupos de ratas: ratas prepuberales de 18 días, ratas prepuberales de 21-23 díastratadas con dietilestilbestrol (DES) para enriquecer a los ovarios en folículos antrales tempranosy ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con gonadotrofina coriónica equina (PMSG) paraenriquecer los ovarios en folículos preovulatorios. En la primera parte del trabajo analizamos, por inmunohistoquímica, la expresión de FMRP en losdistintos tipos celulares del folículo. Hallamos que la proteína se expresa en células de lagranulosa, de la teca y en células estromales, con excepción de un grupo de células que rodea alfolículo. La expresión se detectó en los folículos en los tres estadios del desarrollo estudiados:preantrales, antrales tempranos y preovulatorios. La expresión de la proteína FMRP fue estudiada también por Western blot en los tres tiposfoliculares. Observamos una menor expresión en folículos preantrales y una mayor expresión enestadios más avanzados de la foliculogénesis. Por otra parte, se detectaron al menos 4 isoformasde la proteína cuyos patrones de expresión resultaron diferentes a los observados en testículo ycerebro. Teniendo en cuenta la función de la proteína como parte del complejo de silenciamientopost-transcripcional, estos resultados nos permitirían estimar que las diferencias observadas en losniveles de expresión de la proteína tendrían un rol en el correcto desarrollo del folículo. Asimismo, la presencia de isoformas distintivas en el ovario sugeriría una función específica paraalgunas de ellas en la gónada. La segunda parte del trabajo consistió en el estudio de la expresión del ARN mensajero de Fmr1en los 3 estadios foliculares. Por PCR en tiempo real observamos que el patrón de expresión eraopuesto al que se obtuvo para la proteína. En los folículos preovulatorios, el nivel del ARN fuemenor respecto al de los estadios anteriores. Estos resultados sugerirían que la expresión delmensajero y su proteína en el ovario están regulados de manera diferente y posiblementeindependiente. Por otro lado, identificamos por RT-PCR y posterior secuenciación, la existenciade varias isoformas del ARNm del gen, resultantes del splicing alternativo del mismo. Entre ellas,detectamos la isoforma que contiene al exón 12, la cual no ha sido previamente descripta en rata. El último aspecto que quisimos abordar en nuestro estudio fue el efecto biológico de laintroducción de tripletes en el rango de la premutación sobre una línea celular de células degranulosa humana (KGN). Par tal fin se transfectaron las células con un plásmido conteniendotripletes en el rango normal o de la premutación, río arriba de un gen reportero (GFP). Luego de 18 horas de transfección, los niveles de ARNm del gen reportero resultaron más elevados en lascélulas que poseían los tripletes en el rango de la premutación, en concordancia con lo observadoen diferentes experimentos y pacientes con FXTAS. Asimismo, detectamos una menor cantidadde células que expresan la proteína GFP, en presencia del plásmido con la premutación, en todoslos tiempos de transfección estudiados. A nivel neuronal se ha relacionado al estado de premutación con posibles efectos apoptóticos enla célula. Si bien nuestros estudios aún no demuestran que el efecto de la introducción de tripletesen el rango de la premutación resulte en un aumento en la apoptosis de las células KGN, losresultados obtenidos en esta tesis abren la posibilidad de que este mecanismo sea analizado en unfuturo. En conclusión, en esta tesis se describe por primera vez la expresión de la proteína FMRP y de sumensajero a lo largo del desarrollo folicular, y la presencia de algunas isoformas distintivas,producto del splicing alternativo del gen. Asimismo, se iniciaron los estudios tendientes ademostrar el efecto patogénico que posee la expresión de tripletes expandidos en células delovario.
Abstract:
The FMR1 gene, responsible for the Fragile X Syndrome (FXS), is located in the FRAXA site ofchromosome X. The gene is composed of 17 exons, spans about 38 kb and encodes an messenger RNA (mRNA) of 3.9 kilobases (kb) that can be alternatively spliced into a number of differentisoforms. The 5’ UTR of the FMR1 gene presents a CGG repeat that is unstable and thereforevariable. Based on the size of the expansion, alleles are classified as normal (5–44 trinucleotiderepeats), intermediate (45- 54 repeats), premutated (55–200 repeats), or fully mutated (>200repeats). While full mutation is the responsible for FXS, the premutation condition has beenassociated to other 2 clinical disorders: Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS), aneurodegenerative disorder of late onset and to the Fragile X- associated primary ovarianinsufficiency (FXPOI). Primary ovarian insufficiency (POI) is defined as amenorrhea (for at least 4 months) before age of 40, an increase in serum levels of FSH (to menopausal levels) and low levels of estradiol (hypoestrogenism). This syndrome is very heterogeneous with a multicausal pathogenesis, andany of the following: chromosomal, enzymatic, iatrogenic, autoimmune or infectious aberrationmay be the cause of the disease. It has an incidence of 1% in women under age of 40 and of 0.1%below 30 years of age. FXPOI is the most common known genetic cause for IOP and the premutation condition isresponsible for 4-6% of all cases of 46, XX IOP. About 2% of women 46, XX with IOP and 14%of women 46, XX with familial IOP, carry the premutation in the FMR1 gene. Moreover, it hasalso been described that around 20% of women carrying the premutation, become menopausalaround 5 years earlier than not carriers. The premutation status seems to influence the expressionof the disease. In fact, no full mutated women with IOP have been described. While not all women carries of the permutation experience an early loss of fertility, all carriersface the potential advance in the onset of the conditions associated with estrogenic deficiency (higher risk for osteoporosis and hearth diseases). Epidemiologic genetic studies also suggest thatthe onset and severity of ovarian dysfunction associated to FXPOI is variable, and could bepotentially modulated by the CGG repeat length and environmental factors. Even though the underlying mechanism by which the FMR1 premutation is responsible for theovarian dysfunction and POI is not known, it has been suggested that an initial decrease of thenumber of follicles or an accelerated rate of atresia may take place. The protein encoded by the FMR1 gene, FMRP, is highly expressed in germ cells in the fetalovary. The protein acts as a translation inhibitor of some target mRNA, most likely via themicroRNA silencing complex. Given that in FXTAS an increase in FMR1 mRNA has beenobserved, another possible mechanism for FXPOI is that high levels of mRNA exert a toxic effectcausing an increase in follicular atresia. None of the postulated pathogenic mechanisms has been demonstrated in the ovary. Moreover,the physiological role of FMRP in the gonad has not been established, and the expression patternof the protein during follicular growth remains unknown. Considering that there is limited information related to FMR1 expression and function in theovary, the goal of our work was, initially, to study the expression of FMRP protein and itsmessenger during folliculogenesis in a rat model. For this propose, three groups of rats were used: 1- prepubertal rats of 18 days, 2- prepubertal ratsof 21-23 days treated with Diethylstilbestrol (DES) to enrich ovaries with early antral follicles and 3- prepubertal rats of 21-23 days treated with equine chorionic gonadotropin (PMSG) to enrichovaries with preovulatory follicles. The expression of FMRP in the rat ovarian follicular cells was analyzed byimmunohistochemistry (IHQ) and Western blot (WB). By IHQ we found that the protein isexpressed in granulosa, theca and stromal cells, except in a group of cells surrounding the follicle,mainly in the cytoplasm. Expression was detected in follicles at all stages of folliculogenesis:preantral, early antral and preovulatory. After WB assays, lower expression in preantral follicle was detected, whereas higher levels of FMRP were observed in later stages of folliculogenesis. Moreover, at least 4 isoforms of the protein were detected whose expression pattern differed fromthat observed in testis and brain. Considering FMRP’s function as part of the post -transcriptionalsilencing complex, these results may suggest that the differences observed at FMRP expressionlevels, could exert a role in the proper development of the follicle. Furthermore, the presence ofdistinctive isoforms in the ovary could imply a specific function for some of them in de gonad. In the second part of the work we studied the messenger RNA (mRNA) expression of Fmr1 in thethree follicular development stages. Using quantitative RT-PCR (qRT-PCR) we found that themRNA expression pattern was opposite to that observed for the protein: in preovulatory follicles,mRNA level was lower compared to earlier stages. These results suggest that mRNA and proteinexpression in the ovary may be regulated at different and perhaps independent levels. In addition,by RT-PCR and subsequent sequencing, we identified several messenger isoforms resulting fromalternative splicing. Among them, we detected the variant including exon 12, which has not beenpreviously described in other rat tissues so far analyzed. The last aspect we addressed in our work was the biological effect that the CGG repeats in thepermutation range could exert on a human ovarian granulosa cell line (KGN). Cells weretransfected with a plasmid containing repeats in the normal or in the premutation range clonedupstream of the GFP reporter gene. After different times of transfection, mRNA of the reportergene was measured by qRT- PCR. We found that after 18 hours, the levels of mRNA was higherin cells transfected with the repeats in the premutation range comparing to the levels found forthose with the normal one. These results are in agreement with the observations reported for FXTAS patients and for animal models of the syndrome. Moreover, when cells were transfectedwith the permutated plasmid, we detected fewer cells expressing the GFP protein in all thetransfection times assayed. In neurons, the permutation state has been associated with possible apoptotic effects in the cell. Even though our preliminary studies do not yet show that transfection of KGN cells with the premutation plasmid results in increased apoptosis, the results obtained in the present work openthe possibility for this mechanism to be analyzed in a future. In conclusion, this work describes, for the first time, the expression of the FMRP protein and itsmessenger during folliculogenesis in a rat model. Moreover, the presence of some distinctiveisoforms resulting from the alternative splicing of the gene in the ovary is also described. Although we found an increase in mRNA levels and reduced protein expression of the reportergene containing permutated repeats, further studies are needed to elucidate the pathogenicmechanism of the expanded triplets in the ovary.
Citación:
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Ferder, Ianina C.. (2013). Implicancias del gen FMR1 en la función ovárica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5469_Ferder
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Ferder, Ianina C.. "Implicancias del gen FMR1 en la función ovárica". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2013.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5469_Ferder
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