Registro:
Documento: | Tesis Doctoral |
Disciplina: | biologia |
Título: | Clonado y caracterización de un antígeno rico en aminoacidos ácidos de Trypanosoma cruzi y su posible rol en la inmunopatogenia de la cardiopatía chagásica crónica |
Título alternativo: | Cloning and characterization of an acid aminoacid rich antigen of Trypanosoma cruzi and its role posible in the immunopathogeny of the chronic Chagas' heart disease |
Autor: | Ghio, Sergio Claudio |
Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
Filiación: | Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI). Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas
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Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
Fecha de defensa: | 2003 |
Fecha en portada: | 2003 |
Grado Obtenido: | Doctorado |
Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
Director: | Levin, Mariano |
Director Asistente: | Levitus, Gabriela |
Idioma: | Español |
Palabras clave: | GARP (GLUTAMIC ACID RICH PROTEIN); TRYPANOSOMA CRUZI; INMUNIZACION CON ADN; PROTEINAS RIBOSOMALES PGARP (GLUTAMIC ACID RICH PROTEIN); TRYPANOSOMA CRUZI; DNA INMUNIZATION; RIBOSOMAL P PROTEINS |
Tema: | biología/biología molecular y celular biología/inmunología biología/parasitología
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Formato: | PDF |
Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3535_Ghio |
PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3535_Ghio.pdf |
Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3535_Ghio |
Ubicación: | Dep.BIO 003535 |
Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Ghio, Sergio Claudio. (2003). Clonado y caracterización de un antígeno rico en aminoacidos ácidos de Trypanosoma cruzi y su posible rol en la inmunopatogenia de la cardiopatía chagásica crónica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3535_Ghio |
Resumen:
Se ha postulado la hipótesis de un origen autoinmune para explicar la etiologíade la enfermedad de Chagas. Este proceso autoinmune podría ser el resultado deuna respuesta inmune cruzada contra componentes específicos de célulascardíacas que comparten epítopes con antígenos de Trypanosoma cruzí (mimetismo molecular). En trabajos anteriores demostramos que los anticuerposde pacientes crónicos, inmunopurificados con el péptido correspondiente a los 13aa C-terminales de la proteína ribosomal P28 de T. cruzi (TcP2β),alteraron lafrecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ya que también podían reconocerel segundo bucle de los receptores cardiacos (M2 muscarínicos y β-adrenérgícos). Lo mismo ocurrió con los inmunopurificados contra un péptido correspondientea la proteína ribosomal P0 (TcP0). Tanto los epítopes parasitarios como los delhospedador reconocidos por estos anticuerpos estaban formados por secuenciasaminoacídicas ácidas. En la búsqueda de nuevos antígenos que pudieranproducir este tipo de reacción cruzada, se propuso el rastreo de ESTs (Expressed Sequence Tags) producidos en el Proyecto Genoma T. cruzi que codificaran paraproteínas ricas en secuencias ácidas. De este modo se aisló un EST de 718 pb. Seobtuvo la secuencia completa del gen que denominamos garp (glutamic acid richprotein) de 3500 pb, que es de copia única y origina un único ARNm deaproximadamente 4 kb. Según la comparación de secuencias se encontró unaidentidad de hasta 72% con secuencias de T. brucei. La proteína es de 130 KDa, ysegún ensayos de Western blot e inmunofluorescencia se localiza en el citoplasmadel parásito. Aproximadamente el 20% de los sueros de pacientes con laenfermedad de Chagas crónica fueron capaces de reconocer la proteínarecombinante GARP, y todos ellos lo hicieron con la región más C-terminal de laproteína, que contiene los aminoácidos ácidos. La inmunización con la proteínarecombínante GARP provocó la aparición de anticuerpos dirigidos contra toda laproteína. Estos anticuerpos no modificaron la frecuencia de latidos de loscardiocítos en cultivo, y consecuentemente los ratones no sufrieron alteracioneselectrocardiográficas. Como un método alternativo de inmunización, ensayamos la metodologia deinmunización con ADN. Con esta técnica de inmunización se pretendía reflejarmejor la situación de la infección crónica, ya que la presentación constantes de losantígenos parasitarios por las células musculares del hospedador podría ser masadecuada para estudiar la patogenicidad de la enfermedad. Para poner a puntoesta metodología, realizamos inmunizaciones con las proteínas ribosomales TcP2β y TcP0. Las inmunizaciones de ADN con TcP2β ,TcP0 y GARP generaronanticuerpos capaces de reconocer epítopes diferentes a los reconocidos en lainfección natural. Los anticuerpos no provocaron alteraciones en la frecuencia delatidos de cardiocitos en cultivo ni se observaron alteracioneselectrocardiográficas tales como las ocurridas cuando ratones fueroninmunizados con proteínas recombinantes TcP2β y TcP0. Por tanto concluimosque la inmunización con ADN es capaz de generar anticuerpos que reconocenepítopes diferentes a los inducidos por inmunizaciones con proteínasrecombinantes o por la infección natural, lo cual es de utilidad al momento degenerar una vacuna contra T. cruzi.
Abstract:
The hypothesis of an autoimmune origin has been postulated to explain theetiology of the Chagas' heart disease. This autoimmune process could be theresult of an immune response capable of cross-reacting to specific components ofheart (issues that share epitopes with antigens of Trypanosoma cruzi (molecularmimicry). As we have previously reported, antibodies of chronic patients,recognizing a peptide corresponding to the 13 aminoacid C-terminus (peptide R13) of the T. cruzi ribosomal P2 β protein (TcP2β) altered the frequency ofcardiomyocyte beating culture. This antibodies were also able to recognize thesecond extracellular loop of the G-protein coupled receptors (M2 muscarinic andβ-adrenergic receptors). Antibodies immunopurified against the C-terminus ofthe T. cruzi ribosomal P0 protein (TcP0) present a similar functional and physicochemicalfeatures. Both the parasitic and the host epitopes recognized by theseantibodies are composed of acidic sequences. In the search of new antigens thatcould produce this type of cross-reaction, we looked for ESTs (Expressed Sequence Tags) in the Genome Project of T. cruzi coding for acidic residues richproteins. So we identified a EST of 718 bp. The complete sequence of the gene (3500 bp) was obtained and we named it garp (glutamic acid rich protein). Thisgene exists in a single copy and gives origin to only transcript of approximately 4kb. Its sequence was compared with database, finding a identity up to 72% with T. brucei sequences. The protein has 130 KDa, and both Western blot andimmunofluorescence assays located it into cytoplasm. Approximately 20% of thesera of chronic chagasic patients were capable to recognize the recombinantprotein GARP, and all of them recognized only the C-terminus of GARP, whichcontains the acidic sequences. When we immunized mice with the recombinantprotein GARP, we achieved antibodies against the whole protein GARP. Withanti-GARP serum we carried out assays on beating rat cardiomyocytes. Withneither of the antisera beating frequency was altered and immunized mice withhigh anti-GARP titers showed no electrocardiografic alterations. As alternative method of immunization, we assayed immunizations with DNAplasmids. With this immunization technique we attempted to reflect better thesituation of the chronic infection, since the constant presentation of the parasiticantigens from the host’s muscular cells could be more appropriate to study thepathogenicity of the disease. To set up this methodology we achievedimmunizations with DNA coding genes of ribosomal TcP2β and TcP0 proteins. The DNA immunizations with TcP2β, TcP0 and GARP generated antibodiescapable to recognize different epitopes to those obtained in the natural infection. No alterations in cardyocytes culture nor electrocardiografics recording in micewere observed. In contrast, immunization with TcP2β and TcP0 recombinantproteins generated functionally active antibodies. So we conclude that DNAimmunization is useful to generate antibodies against epitopes that are differentthan the antibodies obtained in immunization with recombinant protein o in thenatural infection. This could be useful to generate a vaccine against T. cruzi.
Citación:
---------- APA ----------
Ghio, Sergio Claudio. (2003). Clonado y caracterización de un antígeno rico en aminoacidos ácidos de Trypanosoma cruzi y su posible rol en la inmunopatogenia de la cardiopatía chagásica crónica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3535_Ghio
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Ghio, Sergio Claudio. "Clonado y caracterización de un antígeno rico en aminoacidos ácidos de Trypanosoma cruzi y su posible rol en la inmunopatogenia de la cardiopatía chagásica crónica". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2003.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3535_Ghio
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