Estudios moleculares sobre la UDP-GLC : Glicoproteína glucosiltransferasa : relación estructura-función

Guerin, Marcelo Eduardo

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Estudios moleculares sobre la UDP-GLC : Glicoproteína glucosiltransferasa : relación estructura-función
Autor:	Guerin, Marcelo Eduardo
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Instituto de Investigaciones Bioquímicas "Fundación Campomar"
Publicación en la Web:	2017-03-01
Fecha de defensa:	2002
Fecha en portada:	2002
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Químicas
Director:	Parodi, Armando J.
Idioma:	Español
Palabras clave:	RETICULO ENDOPLASMATICO; PLEGAMIENTO DE GLICOPROTEINAS; ESTRUCTURA DE PROTEINAS; GLUCOSILTRANSFERASAS; CONTROL DE CALIDADENDOPLASMIC RETICULUM; GLYCOPROTEIN FOLDING; PROTEIN STRUCTURE; GLUCOSYLTRANSFERASES; QUALITY CONTROL
Tema:	biología/biología molecular y celular
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3506_Guerin
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3506_Guerin.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3506_Guerin
Ubicación:	Dep.QUI 003506
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Guerin, Marcelo Eduardo. (2002). Estudios moleculares sobre la UDP-GLC : Glicoproteína glucosiltransferasa : relación estructura-función. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3506_Guerin

Resumen:

El retículo endoplasmático (RE)es el compartimiento subcelular involucrado en lasíntesis, modificación post-traduccional y plegamiento de proteínas yglicoproteínas que serán destinadas a secreción, membrana plasmática o distintasorganelas de los sistemas endocítico y exocítico. Una de las modificaciones post-traduccionalesmás frecuentes, la N-glicosilación, está relacionada con elplegamiento de las proteínas. Numerosas proteínas son incapaces de alcanzar suconformación nativa sin la adición de N-oligosacáridos. Los intermediarios de plegamiento, las proteínas no totalmente ensambladas, lasproteínas mal plegadas y los agregados proteicos son selectivamente retenidos enel RE. El transporte hacia los complejos de Golgi se lleva a cabo exclusivamentecuando las proteínas se han plegado correctamente y se han ensamblado losmultímeros. Este importante fenómeno, que asegura la integridad funcional de lasproteínas que salen del RE,ha sido denominado "control de calidad". En el caso delas glicoproteínas, la estructura y el grado de procesamiento de sus N-oligosacáridosresulta ser una señal para la retención en el RE o el transporte hacialos complejos de Golgi. La N-glicosilación de proteínas comienza en la mayoría de las células eucariotas,con la transferencia de un oligosacárido de estructura Glc3Man9GlcNAc2 desde unintermediario lipídico (dolicol-P-P-oligosacárido), a cadenas polipeptídicasnacientes en el lumen del RE.Sin embargo la Glc no es un componente normal delas N-glicoproteínas maduras. Inmediatamente luego de la transferencia, losresiduos de Glc son removidos por las glucosidasas I (GI) y II (GII). Los N-oligosacáridoslibres de Glc son reglucosilados transitoriamente por la UDPG-Glc:glicoproteínaglucosiltransferasa (GT)y deglucosilados posteriormente por la GII. De acuerdo al modelo actualmente aceptado, la calnexina (CNX), la calreticulina (CRT), la GII y la GT intervienen en el control de calidad de plegamiento deglicoproteínas en el RE. A medida que las glicoproteínas van adquiriendo susconformaciones nativas, alternan entre formas no glucosiladas ymonoglucosiladas por efecto de las actividades catalíticas opuestas de la GII y dela GT. Las dos chaperonas moleculares no convencionales con propiedades delectinas, CNX y CRT, que reconocen exclusivamente N-oligosacáridosmonoglucosilados, unirían glicoproteínas en proceso de plegamiento oincorrectamente plegadas, reteniéndolas en el RE. Los ciclos de deglucosilación yreglucosilación continuarían hasta que el plegado correcto de las glicoproteínas sehaya completado. Cuando las mismas adoptan su conformación nativa, seconvertirían en sustrato de la GII, pero no de la GT, y se liberarían de las lectinas. Las glicoproteínas bien plegadas continuarían su camino por la vía secretoriahacia su destino mientras que las que se encuentran en proceso de plegamiento,serían retenidas en el RE y eventualmente translocadas al citoplasma para serdegradadas en el proteasoma. ' En este ciclo la GT funcionaría como un sensor del estado conformacional de lasglicoproteínas, marcándolas o no con el residuo de Glc que determinará su unióna CNX o CRT. La GT fue purificada a homogeneidad a partir de Drosophila melanogaster,Rattusnorvegicus y Schizosaccharomyces pombe,y demostró ser una proteína soluble del REque depende de Ca2+ para su actividad y que utiliza UDP-Glc como dador de Glc. En cuanto a la glicoproteína aceptora, en un ensayo libre de células, ésta debe estardesnaturalizada para funcionar eficientemente como aceptor. La enzima reconoceel residuo más interno de GlcNAc de los N-oligosacáridos, y amino ácidoshidrofóbicos expuestos en las conformaciones no nativas de las glicoproteínassustrato. Experimentos presentados en este trabajo de tesis demuestran que: (a) la GT de S. pombe es una enzima conformada por dos dominios: el dominio C-terminal (400 amino ácidos, altamente conservados entre GTS, 20% de lamolécula), responsable de la interacción con UDP-Glc; y el dominio N-terminal (1100 amino ácidos, pobremente conservados entre GTs, 80% de la molécula)posiblemente responsable de la interacción de la GT con amino ácidoshidrofóbicos, confiriéndole a la enzima especificidad por glicoproteínas nototalmente plegadas. La unión entre ambos dominios se puede clivarproteolíticamente, pero ellos interaccionan a través de uniones no covalentes y nopueden separarse sin pérdida de la actividad enzimática. Esto explicaría el porquéla GT solo glucosila N-oligosacáridos muy cercanos al sitio mal plegado de laparte proteica (ver Discusión). Esta estructura de dos dominios está conservadadesde levaduras a eucariotes superiores. (b) Los dominios N-terminal y C-terminal correspondientes a la GT de S. pombe,expresados separadamente en una misma célula S. pombe GT pueden formar unaenzima activa y ser capaces de transferir Glc a glicoproteínas mal plegadas. (c) Los dominios N-terminal y C-terminal correspondientes a GTS de distintasespecies, resultan ser intercambiables. (d) El dominio C-terminal correspondiente a la GT de S. pombe requiere lapresencia del dominio N-terminal para plegarse correctamente y formar uncomplejo biológicamente activo, y/o para ser estable en el lumen del RE.

Abstract:

The endoplasmic reticulum (ER)is the intracellular location responsible for post-translationalmodifications and proper folding of proteins bound for secretion, theplasma membrane or organelles of the endocytic system. N-glycosylation is one ofthe most frequent post-translational modifications and is related to proteinfolding, as many species are unable of properly fold without N-glycan addition. Folding intermediates, incompletely assembled oligomers, misfolded proteins andaggregates are selectively retained in the ER. Transport to Golgi compartmentstakes place only if proteins are in their native conformations and properlyassembled. The mecanism that ensures the functionality of proteins that exit the ER, is the so called "quality control" (QC) of glycoprotein folding. Forglycoproteins, the structure and processing degree of the N-oligosaccharidesappeared to be a signal for the retention or transport to the Golgi complex. In most eukariotic cells, N-glycosylation is initiated upon oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2)transfer from a lipid-carrier (dolichol diphosphate) to nascentproteins in the ER lumen. However, the Glc unit is not usually found in foldedglycoproteins. The three Glc residues of the transferred oligosaccharide areimmediately trimmed by two ER resident enzymes, glucosidases I and II (GII). The Glc-free N-linked oligosaccharides are then transiently reglucosylated by the UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (GT)and further deglucosylated by GII. According to a currently accepted model, calnexin (CNX), calreticulin (CRT), GIIand GT are involved in the ER glycoprotein-specific folding and QC. Asglycoproteins acquiere their native conformations, they switch betweennonglucosylated and monoglucosylated forms by the opposing activities of GIIand GT. CNX and CRT are lectins that specifically bind monoglucosylated highmannose-type oligosaccharides in newly synthesized glycoproteins. The lectin-monoglucosylatedglycoprotein interaction retains not properly folded orassembled species in the ER. The deglucosylation and reglucosylation cyclecontinues until proper folding is achieved. Once glycoproteins have adopted theirmature, fully folded conformations, they are no longer recognized by GT. Subsequent GII-mediated deglucosylation liberates them from their lectin anchors,thus allowing properly folded species to continue their maturation along thesecretory pathway. In addition, the lectin-glycoprotein interaction enhancesfolding efficiency by preventing aggregation, premature' oligomerization andincorrect disulfide bond formation. GT is the key element of the QC mechanism asit is the only element discriminating between glycoprotein conformations. GT was purified to homogeneity from Drosophila melanogaster, Rattus norvegicusand Schizosaccharomyces pombe. The enzyme is a soluble ER protein that has anabsolute requirement of millimolar Ca2+ concentrations for activity and uses UDPGlcas sugar donor. In cell-free assays GT glucosylates glycoproteins only if the Noligosaccharidesare linked to a polypeptide backbone displaying a non-nativeconformation. It has been proposed that GT senses the exposure of hydrophobicregions normally buried in native conformations. GT sequence analysis suggests that it is composed of two domains, the N-terminalthat comprises 80% of the molecule, has no homology to other known proteinsand is presumably involved in recognition of non-native conformers and the C-terminalor catalytic domain that binds UDP-Glc homologs and displays a similarsize and significant homology to members of glycosyltransferase family 8. Herewe show that N- and C-terminal domains from either R. norvegicusor S. pombe GTSremained tightly but not covalently bound upon mild proteolytic treatment andcould not be separated by a variety of different procedures without loss ofenzymatic activity. Further, the notion of a two domain protein was reinforced bythe synthesis of an active enzyme on transfection of S.pombe GT null mutants withtwo expression vectors, each of them encoding one of both domains. The tightassociation between N- and C-terminal domains may explain why N-glycans inthe close proximity to protein structural perturbations are preferentiallyglucosylated by the enzyme. In spite of displaying practically no homology with S.pombe N-terminal domain (15.5-16.3%),the same portions from R. norvegicus and D. melanogaster enzymes linked to the C-terminal domain of yeast GT werefunctionally active when expressed in S. pombe thus indicating that all N-terminaldomains share a common role. No functional enzyme was obtained on expressionof the C-terminal domain, thus reinforcing the idea that the N-terminal domain isresponsible for recognition of non-native conformers.

Citación:

---------- APA ----------

Guerin, Marcelo Eduardo. (2002). Estudios moleculares sobre la UDP-GLC : Glicoproteína glucosiltransferasa : relación estructura-función. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3506_Guerin

---------- CHICAGO ----------

Guerin, Marcelo Eduardo. "Estudios moleculares sobre la UDP-GLC : Glicoproteína glucosiltransferasa : relación estructura-función". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2002.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3506_Guerin

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