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Tesis > TEMA

Química [ 574 tesis ]

Química Biológica [ 148 tesis ]

Daleo, Gustavo Raúl. "Propiedades bioquímicas de los microtúbulos : Asociación de componentes lipídicos y actividades enzimáticas relacionadas" (1976) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Levy Sabaj, José A.. "Biosíntesis de un lípido-trisacárido intermediario en animales superiores : Papel en la biosíntesis de glicoproteínas" (1976) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo se estudió la síntesis de un lípido-trisacárido y su papel en la biosíntesis de la porción azúcar de las glicoproteínas. Se pueden considerar tres aspectos en esta investigación: Biosíntesis del Dolicol-P-P-N-acetilglucosamina. Microsomas de oviducto de gallina incubados con dolicol-P, Mg++, detergente y UDP 14C GlcNac catalizan la transferencia de la GlcNac a un compuesto soluble en la fracción lipídica. Por hidólisis ácida suave del lípido-azúcar, seguida de cromatografía en papel, se obtiene unicamente 14C GlcNac. La formación del lípido- de N-acetilglucosamina se incrementa por la adición de cantidadas crecientes de dolicol-P. Se estudiaron también las condiciones óptimas de incubación. Se compararon estos resultados con los obtenidos a partir de microsomas de hígado de rata. Biosíntesis del Dolico-P-P-di-N-acetilquitobiosa. lncubando dolicol-P-P-N-acetilglucosamina radioactivo y UDPGIcNac, no marcado, con microsomas de oviducto de gallina, en presencia de Mg++ y detergente, se obtiene la formación de un nuevo lípidoazúcar. Este nuevo compuesto es lábil al tratamiento ácido suave y el resto hidrofílico fue identificado por cromatografía en papel y por digestión con β-N-acetilglucosaminidasa como la di-N-acetilquitobiosa (2-acetoamido-2deoxi-0- β -D-glucopiranosil-( 1-4)-2 acetoamido-2 deoxi-D-glucosa).Se estudió también la síntesis de este disacárido en distintos tejidos y las condiciones óptimas para obtener un mejor rendimiento. Se presentan evidencias de que este lípido-disacárido, al igual que el de GlcNac son derivados del dolicol-pirofosfato. La biosíntesis de estos dos lípido-azúcares había sido descripta anteriormente en este Instituto, (110), con preparaciones de microsomas de hígado. Biosíntesis del lípido-trisácarido. Manosa puede ser transferida desde guanosina difosfato manosa al dolicol-P-P-di-N-acetilquitobiosa cuando estos sustratos se incuban con microsomas de oviducto de gallina en presencia de Mg++ y detergente. Por hidrólisis-ácida suave del compuesto formado se obtiene un oligosacárido que por cromatografía en papel con distintos solventes y por acción de diferentes glicosidasas parece ser el siguiente trísacarido: β-manosil-β-N-acetilglucosaminil-( 1-4)-N-acetilglucosamina. Se estudiaron las condiciones experimentales para la formación de este lípido-trisacárido. El lípido-trisacárido puede ser sintetizado con microsomas preparados a partir de otros tejidos. En ciertas condiciones experimentales se puede transferir más moléculas de manosa formándose un lípido-oligosacárido de mayor tamaño. Parte de estos resultados se han presentado en la IX y X Reunión Nacional de la Sociedad Argentina de Investigaciones Bioquímicas (151) (152) y han sido publicadas en el Biochemical and Biophysical Research Communications, (153).

Revuelto, Sara Concepción. "Estudios de suplementación de aislados proteicos vegetales por coprecipitación con proteínas de alta calidad procedentes de subproductos animales : Coprecipitación de proteína de lino con caseína comercial" (1976) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Romero Martinez, Pedro Antonio. "Función de los poliprenoles en la síntesis de polisacáridos" (1977) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
a) En A. xylinum se había descrito la formación de glicofosfolípicos de acuerdo a las siguientes reacciones: 1) Lípido-P + UDP-Gal ⇄ Lípido-P-Gal + UDP 2) Lípido-P + UDP-Glu ⇄ Lípido-PP-Glu + UMP El lípido-P formaba parte del preparado enzimático utilizado. En este trabajo se demuestra que en ambos casos el lípido es un poliprenol alílico, muy probablemente undecaprenol. Ello se logró utilizando un preparado enzimático y las condiciones adecuadas para formar estos compuestos, a partir de Lípido-P exógeno de estructura conocida. Tanto Ficaprenol-P (FMP) como Dolicol-P (DolMP) actúan como sustratos de la reacción 1), aunque las propiedades de los productos formados son diferentes: Solamente el sintetizado con FMP se comporta como el obtenido con el lípido-P endógeno, frente a tratamientos tales como reducción catalítica o degradación con fenol. También se aisló el Lípido-P endógeno y se lo purificó por cromatografía en columnas de DEAE-celulosa. Sus propiedades son análogas a las del FMP y algo diferentes alas del DolMP. El análisis por espectrografía de masa de este lípido endógeno confirmó su naturaleza poliprenólica pero no permitió establecer inequívocamente su estructura. En la reacción 2) solamente se logró utilizar el FMP como sustrato exógeno. b) En los mismos preparados enzimáticos de A. xylinum se detectó también la presencia de las siguientes actividades enzimáticas, vinculadas al metabolismo de los prenil fosfatos: 3) Prenil-PP → Prenil-P + Pi 4) Prenol + ATP → Prenil-P + ADP La reacción 3) sería catalizada por una prenil pirofosfato fosfatasa y la 4) por una prenil quinasa. c) Utilizando este mismo organismo se intentó aislar polisacáridos que contuvieran galactosa. Ello no se logró, pero en cambio se pudo caracterizar parcialmente cuatro polisacáridos: 2 neutros y 2 aniónicos. d) Finalmente se investigó la presencia de glicofosfolípidos en plantas. El sistema utilizado (epicotilos de arveja, Pisum sativum), en presencia de UDP-Glu, permitió aislar un compuesto con las propiedades del DolMP-Glu. EL lípido-P aceptor es endógeno, pues se encuentra en el preparado enzimático y la reacción se puede representar en la siguiente forma: Lípido endógeno-P + UDP-Glu ⇆ Lípido endógeno-P-Glu + UDP Las propiedades del lípido endógeno-P son similares a las del DolMP y diferentes de las del FMP. La función de este Lípido-P glucosilado se desconoce, pero posiblemente participe en la síntesis de polisacáridos y/o glicoproteínas.

León, Marta Esther Lucrecia. "Drogas inhibidoras de la multiplicación del virus Junín" (1978) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Fernandez, Graciela. "Efecto de la prometazina (Fenergan) sobre las enzimas que metabolizan tóxicos y fármacos" (1978) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se estudió el efecto de la administración única o repetida de prometazina (Fenergan) sobre los componentes del sistema enzimático de microsomas hepáticos que metabolizan tóxicos y fármacos; el citocromo P-450 y la citocromo C reductasa (P-450 reductasa). También se observaron los efectos que la adminis- tración única o repetida de prometazina tiene sobre la acción hipnótica del pentobarbital y se trató de entender las interacciones observadas en términos de los efectos que la prometazina ejerce sobre el metabolismo desintoxicante del pentobarbital mediado por las enzimas antes mencionadas. Se encontró que una única dosis de prometazina prolonga significativamente el tiempo de hipnosis por pentobarbital y no cambia el contenido de P-450 o la actividad de la citocromo C reductasa. EL efecto prolongador observado parece deberse a una acción aditiva de efectos depresores sobre el sistema nervioso central de la prometazina y el pentobarbital. Si la dosis de prometazina fuese alta también podrían actuar efectos inhibidores detectados en este estudio de este compuesto sobre las enzimas que metabolizan fármacos y tóxicos de microsomas hepáticos. Si el animal recibe más de dos dosis (una diaria) de prometazina, entonces el efecto hipnótico del pentobarbital se acorta y ello parece claramente deberse a que en esas condiciones aumenta el contenido de citocromo P-450, citocromo C reductasa y la actividad global del sistema para desintoxicar al organismo de pentobarbital (medida a través de la actividad de la etil-morfina N-demetilasa). EL aumento de contenido de P-450 microsomal se logra por el aporte del proceso de síntesis de proteína aunque éste no esté acelerado tal cual lo demuestran los estudios de incorporación del isótopo 14 de carbono-leucina en animales tratados y controles. Los estudios de efectos de la prometazina sobre el proceso de degradación proteica medidos con isótopo 14 de carbono-guanidino - arginina sugieren que en el aumento de contenido de citocromo P-450 microsomal el bloqueo de los procesos degradativos por la prometazina desempeña un papel importante. El aumento de actividad de la citocromo C reductasa por efecto de la adminitración de prometazina no depende de los procesos de síntesis o degradación proteica y podrá deberse ya sea a una acción tipo detergente de la prometazina sobre la enzima o alternativamente a que ésta funcionaría como acelerador del transporte de electrones entre el NADPH y el citocromo C. Los resultados obtenidos revisten potencial importancia en toxicología y farmacología, puesto que la exposición simultánea de un individuo a tóxicos o fármacos y a prometazina podría generar interacciones que van desde la consecuencia leve hasta una de tipo grave. Ello se debe a que al interactuar la prometazina sobre las enzimas de microsomas hepáticos que desintoxican algunos compuestos y potencian a otros, ella estaría modulando los efectos de los mismos. El uso frecuente de este antihistamínico en terapéutica hace más probable que ocurran este tipo de interacciones y por lo tanto estos resultados sugieren que se tenga particular cautela cuando se la emplea combinada con otros compuestos o cuando el individuo está expuesto a otros agentes tóxicos.

Vaamonde, Graciela. "Estudio del comportamiento de diferentes variedades de maní en relación a la producción de aflatoxinas por Aspergillus Parasiticus" (1978) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Damonte, Elsa Beatriz. "Arenavirus : Persistencia de los virus Junín (FHA) y Tacaribe en células cultivadas in vitro" (1978) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Kornblihtt, Alberto Rodolfo. "Adenilil ciclasas dependientes de Mn++ : Purificación y propiedades" (1980) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Beconi, Martha Teresa. "Actividad de oxidasa alternativa y respiración mitocondrial en plantas superiores" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se estudió la actividad de oxidasa alternativa y la respiración mitocondrial en mitocondrias aisladas de diferentes tejidos de plantas superiores. Incubando tejido de tubérculos de papa en una cámara húmeda (envejecimiento) durante 24 y 48 horas se observó un incremento de la proteína mitocondrial con un concomitante aumento en la actividad de oxidasa alternativa. Además en dichas mitocondrias se observó un incremento en el consumo de oxígeno y una disminución en el control respiratorio con el tiempo de incubación. Al determinar la producción de anión superóxido en mitocondrias aisladas de tubérculos de papa se encontró que representa una pequeña fracción del consumo de oxígeno total y que no se incrementa con el envejecimiento. El envejecimiento del tejido produce un considerable incremento en la actividad de superóxido dismutasa citosólica (enzima Cu-Zn) lo cual es consistente con un incremento en la producción citosólica de Ō¯2̄ en condiciones fisiológicas. En la determinación de la actividad de oxidasa alternativa en mitocondrias aisladas de ejes embrionarios de semillas de soja no se observó una actividad apreciable de oxidasa alternativa durante los primeros estadíos de incubación como habían propuesto Yentur y Leopold (1976) y su nivel se mantuvo bajo entre las 2 y las 14 horas de imbibición. En embriones de soja se observó un incremento en el consumo de oxígeno que es paralelo al observado en el peso fresco entre las 2 y las 14 horas de imbibición. En mitocondrias aisladas de ejes embrionarios de soja se observó un incremento en la respiración por el agregado de citocromo c exógeno, y una disminución del efecto del citocromo c con el tiempo de imbibición. Al medir la respiración de embriones de soja se observó que el 46-50% del consumo de oxígeno total es de origen mitocondrial siendo el resto del consumo de oxígeno extramitocondrial y debido a la actividad de otras enzimas como oxidasas, oxigenasas (por ej. tirosinasa, lipoxigenasa, etc.). Esto coincide con trabajos realizados con quimioluminiscencia (Boveris y col., 1980) donde se obtiene una gran actividad de lipoxigenasa en homogenados de semillas de soja. Esta actividad de lipoxigenasa es insensible al cianuro y a la antimicina, pero es sensible al SHAM, similarmente a la oxidasa alternativa que es sensible al SHAM e insensible a los otros dos inhibidores. En mitocondrias de raíces de maiz que crecen en una solución nutritiva, se encontró una actividad de oxidasa alternativa que da cuenta del 41% del consumo de oxígeno total. En dichas mitocondrias la actividad de la oxidasa alternativa parece asociarse a la denominada "respiración salina" donde se produce exceso de ácidos orgánicos cuya función es mantener la electroneutralidad frente a la absorción de iones. Se observó con el uso de inhibidores de la respiración, que en mitocondrias de raíces de maíz, el SHAM y la antimicina actúan en sitios separados, pero que muestran una ligazón cooperativa entre ambos sitios. Los estudios realizados sobre la actividad de oxidasa alternativa y su papel fisiológico se han hecho sobre tejidos y mitocondrias aisladas de los mismos. En los trabajos realizados con tejidos enteros, no se puede afirmar que la actividad medida sea la que corresponde a la oxidasa alternativa, porque hay que considerar otros factores que pueden influir en su determinación. En el trabajo realizado para esta tesis utilizando tejidos y mitocondrias aisladas de los mismos permite concluir que para determinar la actividad de la oxidasa alternativa de un tejido hay que aislar las mitocondrias del mismo.

Moreno, Silvia N. J.. "Mecanismo de acción de drogas tripanocidas" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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De Larminat, María Ana. "Regulación hormonal de la función epididimaria" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En vista de la importancia de los andrógenos 5α-reducidos para el adecuado funcionamiento de las estructuras epididimarias involucradas en la maduración de los espermatozoides, se estudiaron las características de la enzima 5α-reductasa en el epidídimo de la rata. Se determinó su localización subcelular, con la ayuda de marcadores específicos, y los parámetros de su actividad in vitro. Se pudo demostrar la disminución de la actividad (específica y total) luego de la castración, o sea al ser removida la fuente de andrógenos endógenos. Dicha disminución fue proporcional al tiempo transcurrido entre la castración y el análisis de la actividad de la 5α-reductasa: 83, 63, 38, y 13% de la actividad específica control a los 2, 4, 8, y 14 días después de la orquidectomía. Al tratar con testosterona animales castrados 30 días antes, se observó una clara recuperación de la actividad in vitro de la 5α -reductasa; 12 días de terapia (200 ug de TP al día) devuelven la actividad nuclear en un 83%, mientras 8 días de terapia bastan para recobrar los niveles control detectados en la enzima microsomal. Demostrada la andrógeno-dependencia de la enzima 5α-reductasa en el epidídimo adulto, se pasó a estudiar el desarrollo ontogénico de esta actividad en el epidídimo de ratas de 15 a 40 días. También se determinó el de la enzimas 3-hidroxiesteroide deshidrogenasa, que metaboliza la 5α-dihidrotestosterona a 5α-androstandioles, los cuales podrían también tener actividad biológica. Mientras no se registraban mayores cambios respecto del órgano adulto en lo que concierne a localización subcelular y parámetros cinéticos, se encontró un pico en la actividad específica de las dos enzimas alrededor de los 25 días de edad. Además, la relación diol/DHT se hallaba aumentada entre 2 y 5 veces durante el período de 20-25 días. Por último, se midieron en ratas prepúberes de distintas edades algunos parámetros morfológicos y bioquímicos relacionados con la función epididimaria, con el objeto de investigar sobre eventuales correlaciones entre metabolización de testrosterona y desarrollo del órgano. Fueron medidos: los niveles tisulares de andrógenos, la incorporación de 14C Timidina, el contenido en ADN, proteínas totales, humedad, y sustancias específicas como ácido siálico, glicerilfosforilcolina, cinc, y proteínas específicas epididimarias (PEE). También se realizaron cortes histológicos para evaluar en cada edad el desarrollo del conducto epididimario. Los resultados indican que la edad prepuberal se caracteriza por una muy activa metabolización epididimaria de la testosterona a DHT y dioles, coincidente con una intensa proliferación celular. En tanto, la mayoría de las actividades diferenciativas, tales como la secreción de productos específicos (Andrógeno- dependientes en el adulto), quedan relativamente postergadas en esta etapa.

Ritta, Mónica Nora. "Prostaglandinas y función pineal : Su participación en la síntesis y mecanismo de acción de la hormona pineal melatonina" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Ríos de Molina, María del Carmen. "Porfiria experimental por hexaclorobenceno : estudios sobre porfirinógeno carboxilasa y ferroquelatasa" (1982) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Juvenal, Guillermo Juan. "Mecanismos no convencionales de regulación tiroidea" (1983) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Lampuri, Jorge Salvador. "Infección experimental del Calomys masculinus con virus Junín : Modelo de infección crónica" (1984) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Lederkremer, Gerardo Zelmar. "Biosíntesis de glicoproteínas en Mucor Rouxii : Metilación in vivo de residuos de manosa en oligosacáridos con unión N-glicosídica a asparagina" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Parera, Victoria Estela. "Desórdenes en el metabolismo del hemo : Estudios sobre el carácter hereditario de la porfiria cutánea tarda y la porfiria aguda intermitente" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Fraga, César Guillermo. "Quimioluminiscencia y lipoperoxidación en hígado de mamíferos en condiciones fisiológicas y de estrés oxidativo" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se estudió la quimioluminiscencia de hígado de rata y ratón, tanto en condiciones fisiológicas como de estrés oxidativo. La quimioluminiscencia fisiológica del hígado de rata fue de 24 ± 1 cps/cm² y del hígado de ratón fue de 109 ± 6 cps/cm². Estos valores correspondieron a una capa superficial de tejido de aproximadamente 100 μm de espesor y daban cuenta de un 2 % del oxígeno total consumido por el hígado. El 95 % de la emisión del hígado de ratones se midió a longitudes de onda mayores de 600 nm. La administración de CCl4 a ratones, produjo un 64 % de aumento de la emisión del hígado de esos animales. El tratamiento con barbital, no modificó la emisión espontánea del hígado, pero sí produjo aumentos de la emisión estimulada por CCl4, que a los 15 días de tratamiento fue del 135 %. Este aumento de la quimioluminiscencia estimulada por CCl4, se correlacionó con un aumento de la proteína microsomal. También aumentaron las actividades de las enzimas antioxidantes: superóxido dismutasa (109 %), catalasa (90 %) y glutatión peroxidasa (103 %) y del contenido de glutatión (18 %). El tratamiento crónico con etanol, produjo aumentos del 45 % de la velocidad fisiológica de producción microsomal de O2 (1.5 ± 0.1 nmoles/min/mg de proteína), del 54 % de la quimioluminiscencia espontánea del hígado y del 63 % de la emisión del hígado estimulada por CCl4. La actividad de la superóxido dismutasa citosólica no se modificó y la quimioluminiscencia iniciada por BOOH, estaba aumentada en los homogeneizados (57 %), en las mitocondrias (43 %) y en los microsomas (28 %) aislados a partir del hígado de los animales tratados. La administración aguda de etanol llevó a aumentos de la emisión espontánea del hígado del 60 %, de la formación de malondialdehido (48 %) y de la formación de dienos conjugados (65 %). La deficiencia de vitamina E y Se, produjo aumentos de la amisión fisiológica del hígado de ratas, que al cabo de 18 días de tratamiento fueron del 100 %, y precedieron a la aparición de necrosis en ese órgano. Al cabo de 18 días, la quimioluminiscencia de hígado se incrementó en un 23 % en las ratas deficientes en vitamina E y en un 64 % en las deficientes en Se (en las cuales la ectividad de la Se-glutatión peroxidasa se redujo de 7.6 a 1.0 U/g de hígado). La administración de (+)-catequina inhibió el 100 % del incremento de la emisión de hígado producido por la administración aguda de etanol. El eriodictiol, la catequina, la cinarina y el ácido 3,4-dicafeoilquínico, disminuyeron en un 38 %, 31 % y 0 %, respectivamente, la emisión estimulada por CCl4. Estas sustancias fueron elegidas entre 21 polifenoles, a partir de sus DI50 calculadas por su capacidad de disminuir la quimioluminiscencia de homogeneizados de hígado de ratón iniciada por BOOH. Todos estos resultados indican una clara correlación entre lipoperoxidación y quimioluminiscencia de hígado in situ. Se observó que diferentes situaciones de estrés oxidativo, modificaron la emisión del hígado por distintos mecanismos bioquímicos.

Pignataro, Omar Pedro. "Mecanismos moleculares en la regulación de la biosíntesis esteroidogénica" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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González, Mario Daniel. "Síntesis y análisis espectroscópico de pregnanesteroides : Su aplicación al estudio de la correlación estructura - actividad glucocorticoide" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Castillo, Marta Beatriz. "Acción de los glucocorticoides y la insulina en el sistema inmune" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Weisenberg, Liliana Sara. "Receptores para hormonas sexuales en pituitaria y sistema nervioso central" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Radicella, Juan Pablo. "Mecanismo de acción de la hormona luteinizante y esteroidogénesis en células de Leydig" (1986) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Vila, María del Carmen. "Efecto de paration, malation, clordano, lindano y endosulfan sobre el camino metabólico del hemo" (1986) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Cozza, Eduardo Néstor. "Metabolismo y transformaciones espontáneas de la 18-hidroxicorticosterona con énfasis en sus condiciones precursoras para la aldosterona" (1986) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Kotliar, Natalio. "Incorporación de L-Leucina en Saccharomyces Cerevisiae : Sistemas transportadores en células enteras y protoplastos" (1986) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estudio de la incorporación de L-leucina en levaduras S.cerevisiae, cepas silvestre JB65 y mutante deficiente en el translocador ATP/ADP mitocondrial JB64, permitió establecer que la metabolización de sustratos generadores de energía son capaces de estimular el proceso de incorporación del aminoácido. Asimismo, en células energizadas por preincubación con D-glucosa o etanol, la incorporación de L-leucina es significativamente mayor que en células ayunadas, y resulta inhibida por el protonóforo 2,4-dinitrofenol. En la medida de la entrada del aminoácido a la célula se distinguen dos etapas, una de ligado y otra de translocación a través de la barrera de permeabilidad. El estudio cinético de la translocación señala la existencia de dos sistemas definidos como sistemas S1, de alta afinidad y baja velocidad máxima, y sistema S2, de baja afinidad y alta velocidad máxima. Como respuesta a la energización se produce un incremento en las velocidades máximas, sin verificarse variaciones en las constantes de afinidad. En la etapa de ligado se determinó la existencia de dos poblaciones de sitios de unión que operan en el rango de concentraciones de los sistemas de translocación y se definieron, por extensión, S1 y S2. La energización por preincubación con D-glucosa produce un incremento del número de sitios de unión en el sistema S1 (N1). Por digestión enzimática de la pared celular: se obtuvieron protoplastos de levadura de las dos cepas en estudio, verificándose su capacidad para llevar a cabo la incorporación de L-leueina. En protoplastos se estableció la existencia de los dos sistemas de translocación y de ligado definidos en células enteras. La comparación de los parámetros cinéticos calculados en protoplastos, con los calculados en células enteras, sugieren que los componentes esenciales para el ligado y la translocación que determinan los valores de dichos parámetros, se hallan íntimamente asociados a la membrana citoplasmática; no se pierden al llevar a cabo la digestión de la pared celular. Por otro lado, el estudio de los efectos de reactivos de grupos tioles sobre la entrada de L-leucina en células enteras y protoplastos, permitió establecer la participación de distintos grupos sensibles a estos compuestos, distinguiéndose, por su respuesta diferencial, las etapas de ligado y translocación de los dos sistemas. No se detectaron sitios sensibles orientados hacia el medio externo y mediante el empleo de reactivos capaces de penetrar a través de la barrera de permeabilidad se observaron estimulaciones e inhibiciones de la incorporación de L-leucina. En algunos casos, los efectos inhibitorios se relacionaron con un déficit en el aporte energético ya que se verificaron inhibiciones de la respiración celular, concomitantes con la inhibición de la entrada del aminoácido. Finalmente, se evaluó el gradiente de pH de membrana citoplasmática mediante el estudio de distribución intraextracelular de ácido benzoico. Se puso en evidencia que por consumo de sustratos generadores de energía se produce un incremento del ΔpH, que como parte del ΔμH+, constituye la fuerza impulsora del transporte. Esto permite interpretar, en términos de la hipótesis quimiosmótica, la estimulación observada sobre la entrada de L-leucina por el etanol y la D-glucosa y el efecto inhibitorio del 2,4-dinitrofenol, reactivo que produjo un colapso de dicho gradiente.

Mendelzon, Daniel Hugo. "Mecanismo de glicosilación de proteínas en organismos de la familia Trypanosomatidae" (1986) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Bianchini, Graciela Mabel. "Estudio del AMP cíclico en sistemas fotosintéticos" (1988) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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De Las Heras, Marcelo Antonio. "Regulación hormonal del metabolismo de poliaminas en tejidos testicular y epididimario" (1989) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Taira, María Cristina. "Acción de heptaclor y lindano sobre el metabolismo del hemo" (1990) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Pregliasco, Laura Beatriz. "Aspectos moleculares de la regulación de la función tiroidea" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Fastame, Inés Gabriela. "Regulación de síntesis proteica en bacterias y parásitos" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Mladovan, Alejandro G.. "Modulación de oncogenes en cancer mamario humano" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de mama es el tumor más frecuente en el sexo femenino afectando en la actualidad a una de cada diez mujeres. La complejidad de esta patología y el escaso conocimiento acerca de su etiología y desarrollo dificultan el entendimiento fisiopatológico de dicho desorden y, por consiguiente, la prevención y el tratamiento. Los estudios diferenciales sobre la proliferación y los mecanismos moleculares involucrados en los procesos de duplicación celular en células normales y neoplásicas aportan nuevas ideas para la comprensión del desarrollo de esta enfermedad. En tal sentido, los trabajos realizados en la presente Tesis tuvieron como principal objetivo estudiar diversos par metros involucrados en la proliferación de células mamarias humanas bajo la acción de hormonas peptídicas y de agentes que actúan como promotores tumorales. De la amplia gama de señales moleculares se analizaron especialmente aquellas relacionadas con la expresión de proto-oncogenes nucleares y la activación de ciertas kinasas que participan en la vía de señales que regulan la expresión de dichos genes. Estos estudios se realizaron utilizando como modelo de trabajo diversas líneas celulares, principalmente la línea no tumorigénica establecida a partir de tejido mamario humano normal, MCF-10A, su contraparte transformada con el oncogén H-ras, MCF-10T y líneas neoplásicas de mama humana ampliamente descriptas en la literatura como MCF-7, MDA-453 y SKBR3. La caracterización celular y molecular de MCF-10T evidenció la presencia de un gen H-ras mutado en el codón 12 y la sobre-expresión de dicho gen. Si bien se comprobó que MCF-10T es capaz de proliferar en forma independiente del anclaje, su duplicación es inhibida por la alta densidad celular siendo incapaz de proliferar en forma estratificada. Las células provenientes de tejido normal evidenciaron una tasa proliferativa mayor que las de origen neoplásico en condiciones de cultivo favorable, mientras que células no transformadas como las MCF-10A no sobreviven en ausencia de nutrientes. De los agentes que promueven la proliferación en células MCF-10, el EGF ejerció un potente efecto mitogénico seguido por el IGF-I y la insulina a altas dosis. Los estudios determinaron que en estas células el EGF y el PMA, pero no la insulina o el IGF-I, son capaces de aumentar los niveles de ARNm del gen c-fos. Los estudios demostraron que el EGF y el PMA inducen la expresión de los proto-oncogenes c-fos, c-jun, fosB y junB con cinéticas particulares para cada gen no mostrando diferencias significativas entre las células MCF-10A y MCF-10T, siendo válida esta observación para los dos agentes analizados. Otros genes como c-myc, junD o fra1, evidenciaron escasa variación en sus niveles de transcriptos ante dichos estímulos. Si bien ambas líneas exhibieron una dosis dependencia del EGF en cuanto a su proliferación, inducción de la síntesis de ADN y expresión de proto-oncogenes nucleares, la línea transformada MCF-10T manifestó un menor requerimiento de nutrientes y una mayor sensibilidad a otros mitógenos comparado con MCF-10A, posiblemente debido a una mayor proliferación autócrina. La combinación del EGF con otros agentes estudiados promueve un mayor efecto proliferativo que el ejercido por cada uno de ellos individualmente sin afectar los niveles de transcriptos de proto-oncogenes nucleares inducidos por el EGF. Se comprobó que el EGF ejerce su acción inductora sobre los proto-oncogenes nucleares a través de la autofosforilación de su receptor específico con la subsecuente activación de MAP kinasas involucradas en la cascada de señales mitogénicas. Se observó además, que las diversas líneas celulares analizadas difieren cuantitativamente en los tipos de MAP kinasas que expresan según su origen normal o neoplásico. Esto establece un hecho relevante por cuanto podría inferirse que tales especies constituyen marcadores específicos de desórdenes asociados al tipo de neoplasia analizado. Si bien la acción de agentes que inducen la formación del segundo mensajero AMPc resultan inhibitorios de la proliferación en ciertas líneas celulares de mama, en ningún caso estos agentes, o drogas que mimetizan la acción del AMPc, bloquearon la activación de MAP kinasas mediada por el EGF como se ha descripto en otros sistemas celulares. Por último, el gen c-myc, cuyos transcriptos se encuentran elevados en las células MCF-10A y MCF-10T durante su crecimiento exponencial o en estadio de aquiescencia, no solo es regulado por agentes mitogénicos como el EGF, sino también por las condiciones extracelulares (densidad celular y factores de crecimiento autócrinos) y por agentes inhibitorios de la proliferación como el TGFb1. Por lo tanto se ha demostrado que la transformación in vitro de células de mama normales por el oncogén H-ras, a diferencia de lo que ocurre en otros modelos celulares, altera en forma pleiotrópica diversas funciones celulares relacionadas con el proceso neoplásico, como el crecimiento en ausencia de sustrato de anclaje, requerimiento de nutrientes y diversos cambios morfológicos, sin afectar ciertos mecanismos involucrados en la respuesta primaria que conducen a la duplicación celular como la inducción de proto-oncogenes nucleares o la activación de la vía de MAP kinasas. Asimismo, se deduce que el proceso neoplásico difícilmente pueda ser atribuido a la alteración de un solo gen; resulta más adecuado sugerir que tales desórdenes son consecuencia de un número mayor de fenómenos que actúan en forma coordinada para desarrollar todo su potencial neoplásico. Es mi más firme deseo que los estudios detallados en esta Tesis puedan contribuir de alguna forma al entendimiento de la patogenia y el desarrollo de las enfermedades neoplásicas que afectan al ser humano.

Abstract:
Breast cancer is the most frequent female tumor affecting at present one out of ten women. The complexity of this pathology and our limited knowledge of its etiology and biology hinder the understanding, prevention and treatment of the disease. Studies on the proliferation and molecular mechanisms involved in cell division from both normal and neoplastic cell lines would contribute with new insights in the the development of this affliction. In this sense, the aim of this Thesis was to study several parameters involved in the proliferation of human mammary cells exposed in culture to peptide hormones and tumor promoters. Among the broad range of molecular signals, those involved with the expression of proto-oncogenes and related kinases that regulates this process, were analyzed. These studies were carried out on several cell lines, namely MCF-10A, established from normal human breast tissue; MCF-10T, the same line transformed with an H-ras oncogene and several well-known neoplastic human breast cell lines: MCF-7, MDA-453 and SKBR3. The cellular and molecular characterization of MCF-10T showed the presence of the H-ras gene mutated in codon 12 and its overexpression. Although MCF-10T is capable of anchorage-independent growth, its duplication is inhibited by high cell density and cannot proliferate in a stratified fashion. Cells from normal tissue displayed a higher growth rate than those from neoplastic sources in a suitable culture condition, but non-tumorigenic cells, as MCF-10A cannot survive in the absence of appropriate growth factors. From the proliferating agents studied on MCF-10A and MCF-10T cells, EGF exerted the most potent mitogenic effect, followed by IGF-I and insulin at high dose. Both EGF and PMA, but neither IGF-I nor insulin, were able to modify c-fos mRNA levels. Studies demonstrated that EGF and PMA induced the expression of c-fos, c-jun, fosB and junB with a particular kinetic for each gene without any significant differences between MCF-10A and MCF-10T nor among EGF and PMA. Other genes, such as c-myc, junD or fra-1 showed only a poor variation in its transcript levels with those stimuli. Although growth rate, DNA synthesis and proto-oncogene induction were dependent on the EGF concentration in both lines, the transformed MCF-10T cell line exhibited a lower requirement for nutrients and an increased sensitivity to other mitogens, probably due to an autocrine proliferation. The association of EGF with other agents increased the proliferative effect exerted by each agent alone, without affecting the proto-oncogene mRNA levels induced by EGF. EGF exerts its action on nuclear proto-oncogenes through autophosphorylation of its specific receptor with the subsequent activation of MAP kinases. Each cell line expressed different classes of MAP kinases, according to their normal or neoplastic origin. This constitutes a significant finding, as it could be inferred that such species make up specific markers associated to the type of neoplasia analyzed. Though cAMP inducing agents inhibit proliferation of certain mammary cell lines, this action is not mediated through the control of MAP kinase activity as it was widely described in other systems. c-myc gene, whose transcripts are elevated in both proliferating and quiescent MCF-10 cells, is regulated by mitogens such as EGF and also by extracellular conditions (cellular density and autocrine factors) and TGF(1, an inhibitor of cell growth. Thus, in vitro transformation of breast cells with an activated H-ras gene alters in a pleiotropic mode several cellular functions associated to the neoplastic process, such as independent-anchorage growth, nutrient requirement and morphological changes. However, it does not affect those mechanisms involved in the early responses which trigger cell duplication, such as the induction of nuclear proto-oncogenes or activation of MAP kinases. Therefore, these results suggest that the neoplastic process cannot be attributed to the alteration of only one gene; instead, it would be more adequate to consider this disease as a consequence several events acting in coordination to fulfill their neoplastic potential. I hope the studies analyzed in this Thesis could contribute in part to the understanding of the pathogenesis and development of the neoplastic disease affecting the human being.

Bassi, Daniel Ernesto. "Biosíntesis de succinoglicano y de compuestos relacionados en Agrobacterium radiobacter" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Agrobacterium radiobacter produce un polisacárido extracelular (EPS), el succinoglicano, cuya unidad repetitiva (U.R.) es un octasacárido constituído por Glc, Gal, piruvato y succinato en relación 7:1:1:1 (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal—4-6-4Pyr (ver en versión PDF). Este polisacárido tiene gran importancia en la industria del petróleo, y el producto comercial, se extrae de la bacteria en estudio debido a que lo produce en cantidades elevadas. En otros sistemas, se ha demostrado que la biosíntesis de EPS se realiza fundamentalmente en cuatro etapas (Ielpi et al, 1993, J. Bacteriol, 175: 2490-2500). En la primera, se sintetizan los nucleótido-azúcares precursores. En una segunda etapa, se forma la U.R. por transferencia secuencial de los distintos monosacáridos que la componen a partir de los respectivos nucleótido-azúcares a un prenil-fosfato aceptor ubicado en la membrana plasmática. Estas reacciones están catalizadas por enzimas específicas, las glicosiltransferasas. Una vez completada la U.R., ésta actúa como monómero en una reacción de polimerización, siendo el producto final el EPS. Es probable que la polimerización y el transporte al exterior celular (cuarta etapa) del polímero sean simultáneos. En este estudio, se describe la biosíntesis "in vitro" del succinoglicano en A. radiobacter. Se obtuvieron y caracterizaron algunos prenil difosfato azúcares intermediarios y el producto final, es decir el succinoglicano sintetizado "in vitro". Para estudiar la posible formación de compuestos relacionados con la síntesis de EPS, se realizaron incubaciones con células permeabilizadas con EDTA (García et al, 1974, Eur. J.Biochem. 43:93-105) en presencia de UDP-Glc y/o UDP-Gal uno de los dos marcado con -Glc. La mezcla de incubación se centrifugó y el precipitado de células se lavó con buffer acuoso y luego se trató con solventes orgánicos, que extraen los lípido-azúcares formados. Los lavados se unieron al sobrenadante y en esta fracción se investigó la presencia de EPS. Al realizar incubaciones con células provenientes de la cepa silvestre en presencia de UDP--Glc, si bien se observó la síntesis de numerosos compuestos, algunos de ellos de propiedades novedosas, ninguno presentó las propiedades esperables para los compuestos intermediarios, es decir, los prenil fosfo-azúcares. Sin embargo, fue posible observar polímero en los lavados acuosos aunque en muy baja cantidad. En caso de incubar en presencia de UDP--Gal se pudieron obtener algunos compuestos de interés, uno de ellos liberaba Gal, pero en cantidades no adecuadas como para ser analizadas. Cuando se incubó en presencia de ambos dadores, uno de ellos radioactivo, se obtuvo menor cantidad de radioactividad en los extractos orgánicos que en el caso de incubar en presencia de un solo nucleótido. Este hecho se atribuyó a la dilución de la marca radioactiva, debido a que la cepa silvestre contiene la UDP-Gal-4-epimerasa, enzima que cataliza la interconversión de UDP-Glc en UDP-Gal. Se buscó, entonces resolver el problema utilizando una mutante, defectiva en la síntesis de esta enzima, de forma tal de poder realizar incubaciones con ambos nucleótidos sin observar el efecto de dilución mencionado anteriormente. En efecto, al utilizar la cepa SGN-1, defectiva en la síntesis de la epimerasa, se pudo lograr la síntesis de los siguientes compuestos: Gal-P-P-prenol, celobiosil- galactosa-P-P-prenol y los prenil difosfato derivados de un octasacárido y de su derivado piruvilado, estrechamente relacionados con la U.R. del succinoglicano. La cantidad de polímero obtenida fue sensiblemente mayor que en el caso de la cepa silvestre. Mediante incubaciones en dos etapas, se demostró también que los prenilfosfo-azúcares analizados eran los precursores del polisacárido. Por otro lado, se estudió el efecto de los dadores de grupos no glicosídicos sobre la síntesis del polímero. El PEP estimula discretamente la formación de polímero, probablemente por un aumento en la piruvilación de la U.R., que es, aparentemente un sustrato mas adecuado para la polimerasa, es decir la enzima o grupo de enzimas que catalizan la polimerización de la U.R. El SuccCo-A ejerce un efecto dual. A una concentración de 0,1 mM estimula en forma notoria la polimerización, mientras que a una concentración diez veces mayor se observó una reducción gradual en dicha estimulación. Finalmente, estos estudios se extendieron a una bacteria estrechamente relacionada, patógena de plantas, Agrobacterium tumefaciens que también produce succinoglicano. En esta cepa, se habían aislado y caracterizado parcialmente varios prenil-fosfo-azúcares, pero no se había logrado su polimerización (Staneloni et al, 1984, J. Gen. Microbiol., 130: 869-879). Con la experiencia lograda en A. radiobacter, se logró obtener succinoglicano "in vitro"también en A. tumefaciens.

Abstract:
Agrobacterium radiobacterium produces an extracellular polysaccharide (EPS), succinoglycan, containig an octasaccaharide repeating unit (R.U.) constituted with Glc, Gal, piruvate and succinate in a 7:1:1:1 molar ratio (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal--4-6-4Pyr. This polysaccharide is widely used in the oil industry, and Agrobacterium radiobacter is regularly employed to produce it because of the good yields reached. As it was demonstrated for other systems, the biosynthesis of the EPS takes place mainly in four stages (Ielpi et al, 1993, J.Bacteriol. 175:2490-2500). In the first one, the donor sugar nucleotides are synthesized. In a second stage, the R.U. is made by the secuential transfer of the different monosaccharides that constitute it, from the proper sugar nucleotides, to a plasmatic membrane bound prenyl phosphate. Once the R.U. is completed, it acts as a monomer in a polymerization reaction, the EPS being the final product. It is likely that polimerization and the transport to the extracellular compartment (fourth stage) are simultaneous. In this study, the "in vitro" biosynthesis of succinoglycan in A. radiobacter is described. Some intermediate prenyl phospho sugars and the final product, the "in vitro" synthesised succinoglycan were obtained. In order to search for the posible formation of compounds related to the synthesis of polysaccharide, incubations with EDTA permeated cells (García et al., 1974, Eur. J. Biochem.43:93-105) in the presence of UDP-Glc and/or UDP-Gal, one of them radioactively labelled, were performed. The reactions were ended by dilution and centrifugation and the cell pellet was washed several times with buffer and then extracted with organic solvents, that dissolve the lipid-sugars. The presence of EPS was investigated in the combined supernatants and washings. When the incubations were done using wild type cells, in the presence of UDP--Glc several lipidic compounds were obtained, some with unusual properties, but none of them behaved as expected for prenyl-phospho-sugars. However, polymer was observed in the aqueous supernatant though in very low amounts. When incubating in the presence of UDP--Gal, it could be found some compounds of our interest, one of them liberating Gal, but in quantities not suitable to be analized. Incubations done in the presence of both nucleotides, one of them radioactively labelled, yielded smaller amounts of radioactivity soluble in organic solvents, probably because of the dilution of the labell, due to the activity of UDP-Gal-4-epimerase, the enzime which catalizes the interconversion of UDP-Glc into UDP-Gal. The idea was then to look for a mutant defective in this enzyme activity to be able to perform incubations in the presence of both sugar nucleotides, one of them labelled, in order to avoid this dilution effect. As expected, the synthesis of compounds with the properties of prenylphosphosugars was achieved when the SGN-1 strain, a mutant not able to synthesise the UDP-Gal-4-epimerase, was used as enzime source. The following compounds were characterized: Gal-P-P-prenol; (cellobiosyl)-galactose-P-P- prenol , and the prenyl diphosphate derivatives of an octasaccharide and of its pyruvilated octasaccharide closely related to the structure of the R.U. of succinoglycan. The amount of radioactive labelled polymer was significatively higher and could be identified as succinoglycan. Performing two steps incubations, it was demonstrated that the prenyl-phospho-sugars were the precursors of the EPS. On the other hand, the effects of the non glycosidic donors on the polymer synthesis was studied. Phosphoenolpyruvate stimulates moderately polymer formation, probably due to the rise in the amounts of the pyruvulated R.U., which is apparently a more adequate sustrate for the polimerase. Succinyl coenzyme A excerts a dual effect. At concentrations of 0,1 mM greatly enhances the polimerization, but with a tenfold increase (1 mM) a reduction in the activation was observed. Finally these studies were extended to the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens, a closely related bacteria that also produces succinoglycan. Enzymatic preparations from this strain allowed the synthesis of several prenyl-phospho sugars, but no polymerization was observed (Staneloni et al, 1984 J. Gen. Microbiol, 130: 869- 879). With the experience acquired with A. radiobacter system, "in vitro" succinoglycan synthesis was also obtained.

Vojnov, Adrian Alberto. "Síntesis de exopolisacáridos en Xanthomonas sp." (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Xanthomonas campestris es un patógeno de plantas causando la putrefacción negra en las hojas de las crucíferas. Además, produce un polisacárido extracelular (EPS), de gran importancia industrial, llamado xantano. La estructura de su unidad repetitiva es ( Jansson, P. E. et al., 1975. Carbohydr. Res. 45: 274): (ver figura en el pdf). La biosíntesis in vitro de xantano ha sido estudiada en detalle en nuestro laboratorio (Ielpi et al., 1993. Bacteriol., 175:2490). Se ha determinado que ésta ocurre en al menos dos etapas. En la primera etapa, la unidad repetitiva se ensamba secuencialmente sobre un poliprenol pirofosfato. En una segunda etapa, las unidades repetitivas son polimerizadas y el EPS formado liberado en el medio de crecimiento. Se conoce que los genes involucrados en la biosíntesis del xantano, 12 genes, están agrupados en un segmento de ADN de 16 Kb ( Barrre et al., 1986.Int. Biol. Macromol, 8: 372) y parte de los genes involucrados en la transferencia de azúcares estan identificados (Vanderslice et al., 1990. Synergen, Inc., EEUU), pero no se realizó un estudio detallado de la caracterización de mutantes no productoras de xantano, como asi también, aún se desconoce la ubicación de los genes responsable del proceso de polimerización y exportación. En este trabajo de tesis, presentamos la caracterización de algunas mutantes defectuosas en la producción de EPS, en la cual, en dos de ellas, se realizó un estudio más detallado: X. campestris 8004:: Tn525 y 8004:: Tn570. La primera mutante falló en producir el pentasacárido, unidad repetitiva del xantano, y solamente tres azúcares fueron transferidos al prenil pirofosfato intermediario, esta unidad repetitiva truncada no obstante pudo ser polimerisada. El polímero truncado formado tiene la estructura de una celulosa sustituida alternadamente por residuos de manosa y tiene un potencial interés industrial. El transposón, responsable de la mutación, fue localizado dentro del gen gumk. Por lo tanto, este gene codificaría la glicosil transferasa IV, que cataliza la transferencia de ácido glucurónico al trisacárido manosil-celobiosa. La segunda mutante estudiada resultó ser capaz de sintetizar in vitro el lípido pentasacárido, unidad de repetitiva, con cualquiera de los tres dadores de azúcares utilizados: UDP-Glc, GDP-Man y UDP-GlcA, pero incapaz de polimerizar estas unidades. El Tn5, en la cepa N °70, fue localizado 15 bp "upstream" del sitio de iniciación del gen gumB (primer gen del grupo). Esto suguiere que gumB está involucrado en el proceso de polimerización. Un segundo aspecto desarrollado en este trabajo de tesis fue el efecto de los grupos no glicosídicos en el proceso de polimerización. Se demostró que los niveles más altos de polimerización, en el EPS producido por la cepa mutante N° 25, fueron obtenidos cuando 30 % de las unidades repetitivas truncadas se encontraban acetiladas. Por otra parte, el fosfoenolpiruvato (dador de los grupos piruvatos) se comportó, sobre este polímero, como un regulador positivo en las reacciones de polimerización. En la cepa silvestre solo se observó cierta inhibición en la reacción de polimerización con ambos dadores de grupos no glicosídicos estudiados. Es importante destacar que la unidad truncada que sintetiza la cepa N° 25 no posee grupos piruvatos en su estructura. Finalmente, estudios preliminares mostraron la obtención in vitro de glucanos β -( 1,2 ) lineales y cíclicos utilizando diferentes preparaciones de X. campestris. Algunos resultados preliminares suguieren un posible rol de estos glucanos en el proceso de infección.

Abstract:
Xanthomonas campestris is a plant pathogen causing the disease called black rot. In addition, it produces an extracellular polysaccharide (EPS), of great industrial importance, called xanthan. The structure of its repeating unit is (Jansson, P.E. et al., 1975.Carbohydr.Res.45:274). (see in pdf). The in vitro biosynthesis of xanthan gum has been studied in our laboratory in detail (Ielpi et al., 1993. J. Bacteriol., 175: 2490). It occurs in at least two stages. In the first, the repeating unit is sequentially assembled linked to a polyprenol trough a diphosphate bridge. In a second stage, the repeating units are polimerized and liberated into the growth medium. It has been reported that the genes involved in xanthan biosynthesis are located in a cluster of 12 genes (Barrère et al., 1986. Int. J. Biol. Macromol, 8:372). This cluster was found to have about 16 Kb and some of the genes involved in the sugar transfer were identified (Vanderslice et al., 1990. Synergen, Inc., USA), but the location of the genes responsible for the polimerization and export process is until unclear. In this thesis work, we reported the characterization of some EPS defective strains, two of them in more detail: X. campestris 8004::Tn525 and 8004::Tn570. The first mutant failed to produce the pentasaccharide repeating unit. Only three sugars were transferred to the prenil phosphate intermediate and polimerized. The truncated polymer formed has the structure of a mannose substituted cellulose and has potential industrial interest. The transposon responsible of the mutation was located within gumK gene. Therefore, this gene codify for the glycosyl transferase IV, which catalyzes the glucuronic acid transfer to the mannosil-cellobiosetrisaccharide. The second mutant turned out to be able to synthesize in vitro the lipid linked pentasaccharide repeating unit, from the three sugar donors: UDP-Glc, GDP-Man and UDP-GlcA, but unable to polimerize it. The Tn5 was located 15 bp upstream of the initiation site of gumB gene (first gene of the cluster). It was suggested that gumB is involved in the polimerization process. A second aspect developed in this thesis work was the effect of non glycosidic group on polymerization process. It was shown that higher polymerization levels was obtained when 30 % of the repeating units were acetylated. On the other hand, the phosphoenolpiruvate itself (cetal pyruvic donor) behaved as a positive regulator on the polymerization reactions. On the wild strain only certain inhibition on the polimerization reaction was observed with both donors of groups non glicosydic studied. It is important to emphasize that the truncated unity that synthesizes the strain N° 25 is not possessing pyruvil groups in its srtructure. Finally, preliminary studies showed the in vitro synthesis of lineal and cyclic ß(1,2) glucans by different preparations of X. campestris. A possible rol of these glucans in the infection process was suggested.

Fernández, Sandra Viviana. "Estudio de la estructura y regulación de la expresión de los genes Cab en plantas superiores" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se aislaron seis genes Lhc a partir de una biblioteca genómica de papa(Solanum tuberosum). Estos genes codifican polipéptidos que formarían parte de los complejos que captan la luz que luego es utilizada en la fotosíntesis. Estos genes se hallan en tandem y están separados por regiones de 1.3-1.4 kb. Todos poseen la misma orientación 5'( 3' y cada uno de ellos tiene su propio promotor localizado 5' río arriba de la región de código. Las proteínas deducidas a partir de las secuencias de bases, poseen todos los aminoácidos característicos de las proteínas CAB del PSII, Tipo I, las cuales están codificadas por los genes Lhcb1. Por lo tanto los genes aislados fueron denominados: Lhcb1*1, Lhcb1*2, Lhcb1*3, Lhcb1*4, Lhcb1*5 y Lhcb1*6. La región codificante de estos genes posee 798 pb excepto el Lhcb1*6 el cual fue aislado en forma incompleta (411 pb). Estos genes codifican proteínas de 265 aminoácidos, incluyendo el péptido señal. Los genes estudiados poseen un 94-98 por ciento de homología en sus secuencias de bases y codifican proteínas que poseen entre un 97.5 por ciento a 99.75 por ciento de identidad. Las regiones 5' flanqueantes de los seis genes poseen secuencias conservadas y que están presentes en otros genes cuya expresión es regulada por la luz (el fragmento de 62 pb localizado entre las cajas CAAT y TATA contiene tres secuencias GATA). La expresión de los genes Lhcb1 en las plantas de papa mostró ser específica de órgano. Diferentes transcriptos fueron detectados en las hojas de las plantas mientras que solo uno se detectó en los tallos y no hubo expresión en las raíces. Se determinó el sitio de iniciación de la transcripción para el gen Lhcb1*2. El mismo esta localizado a 69 nucleótidos río arriba del codón de iniciación de la traducción (codón ATG). Los resultados indicaron que la C en la secuencia CTTCAT constituye el primer nucleótido en el ARNm correspondiente al gen Lhcb1*2. La región localizada río arriba del gen Lhcb1*2 que se extiende hasta -1300pb fue secuenciada. Esta región contiene un motivo "G" (5'TGGTTGTGTC3') localizado entre las bases -162 a -171 con respecto al sitio de iniciación de la transcripción. Recientemente fue demostrado que el factor citosólico GBF, el cual se une al motivo "G", se transloca al núcleo en presencia de luz, mientras que en la oscuridad permanece en el citoplasma (Harter et al, 1994). Las funciones regularais de la región 5' flanqueaste del gen Lhcb1*2 fueron analizadas en plantas transgénicas de tabaco. En la construcción realizada, la región promotora del gen Lhcb1*2 dirige la expresión del gen reportero uidA, el cual codifica la enzima (-glucuronidasa (GUS). El análisis de las plantas transgénicas reveló que la región 5' flanqueante (-1300 a +10) del gen Lhcb1*2 es suficiente para conferir una respuesta a la luz a través del fotoreceptor fitocromo así como también una respuesta específica de órgano. Por otra parte, la expresión del gen uidA fue detectada en las plántulas transgénicas de tabaco a partir de las 72 hs luego de la germinación de las semillas. Este resultado se correlaciona con el tiempo de maduración de los cloroplastos (Oemüller et al,1986). Además, no se detectó expresión del gen uidA cuando las plántulas de tabaco transgénicas fueron cultivadas en presencia de un herbicida que impide el desarrollo de los cloroplastos. Por lo tanto, estos resultados indican que la presencia de cloroplastos maduros es necesaria para la expresión del GUS dirigida por el promotor del gen Lhcb1*2 aislado de plantas de papa. Se realizaron deleciones de la región promotora las cuales fueron fusionadas al gen uidA. De estos experimentos se pudo concluir que la región del promotor comprendida entre las bases -690 a +10 es suficiente para conferir una respuesta específica de órgano así como también una respuesta a la luz a través del fotoreceptor fitocromo.

Abstract:
A potato (Solanum tuberosum) genomic library was used to isolate five full-length genes and part of a sixth one, encoding the apoproteins of a light-harvesting complex (LHC). These genes are arrange in tandem with a spacing of 1.3-1.4 kb between neighboring genes. They present the same orientation and they have their own promoters 5'-upstream of the coding regions. All the Lhcb1 genes have 798 bp open reading frame coding for a protein of two hundred and sixty-five amino acids, including a transit peptide. The nucleotide homology among the five genes is between 94-98 per centum. The nucleotide sequences showed that they encoded very similar proteins (99.75 per centum o 97.50 per centum identities). The deduced amino acid sequences were homologous to the PSII Type I CAB proteins encoded by the Lhcb1 genes, so these genes were named Lhcb1*1, Lhcb1*2, Lhcb1*3, Lhcb1*4, Lhcb1*5 and Lhcb1*6, respectively. The 5'-flanking regions of the six potato genes shared conserved sequences already detected in other light-responsive genes (62 bp fragment located between the CAAT and TATA boxes containing three GATA motifs). The expression of Lhcb1 genes in potato was organ-specific. At least nine different transcripts can be recognized in leaves by the primer extension method. A unique transcript could be detected in stems and not in roots. The transcription start site for the Lhcb1*2 gene was determinated. It is located 69 nucleotides upstream from the ATG codon. Our results indicated that the C in the sequence CTTCAT would be the first nucleotide in the Lhcb1*2 mRNA. The 5' upstream region of Lhcb1*2 extending from -1300 bp to the cap site was sequenced. This region contained a G-box motif (TGGTTGTGTC) located between -162 and -171 from the transcription start site. It has been recently demonstrated that the translocation of the cytosolic GBFs (G-box binding factor) to the nucleus is light-regulated (Harter et al, 1994). The regulatory function of the 5'-flanking region of the potato Lhcb1*2 was analyzed in transgenic tobacco plants. The construct used contained the uidA gene which was under the control of the potato Lhcb1*2 promoter. Analysis of transgenic plants revealed that the 5'-flanking region (-1300 to +10, relative to the transcription start site) of the Lhcb1*2 gene is sufficient to confer a phytochrome response as well as organ-specific expression. In ours experiments, the expression of the uidA gene was detected in the transgenic tobacco seedlings around 72 h after germination. This result correlates well with the time of maturation of the chloroplasts (Oemüller et al, 1986). Furthermore, the expression of uidA was not detected when transgenic seedlings were grown in presence of Norflurazon. These results correlates the presence of mature chloroplasts with the GUS expression directs by the Lhcb1*2 promoter. We have obtained constructs in which the uidA gene was under the control of deletions of the 5'-flanking region of potato Lhcb1*2. The -690 to +10 flanking region of the Lhcb1*2 is enough to confer organ-specific and phytochrome-regulated expression on the uidA coding sequence.

Hagelin, Karin. "Estudios estructurales y cinéticos de variantes de la fructosa-1,6- bisfosfatasa de los cloroplastos de trigo generadas en Escherichia coli" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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La Fructosa-1,6-bisfosfatasa de los cloroplastos (CFBPasa) de las plantas superiores es un homotetrámero de peso molecular c.a 160000 que cataliza la siguiente reacción: fructosa 1,6-bisfosfato + H2O----> fructosa 6-fosfato + Pi Mg2+ (o Mn2+) La actividad CFBPasa es modulada por la luz, tal como ocurre con otras enzimas regulatorias del cloroplasto. La actividad de la enzima aumenta luego de la transición oscuridad-luz debido a que ocurre (a) un aumento del pH y de la concentración de Mg2+ en el estroma del cloroplasto, (b) la modificación de otros metabolitos y iones del cloroplasto y (c) la reducción de grupos -S-S- de la enzima. La influencia de la luz se debe al efecto del Sistema de Transporte de Electrones mediado por el Sistema Ferredoxina-Tiorredoxina. In vitro, la actividad de la CFBPasa es modulada por componentes tanto fisiológicos (tiorredoxina) como no fisiológicos (cosolventes, aniones caotrópicos, alta presión). Los cambios conformacionales inducidos por estos moduladores son los responsables del aumento de su actividad específica. A fin de analizar las características cinéticas y estructurales de la enzima, el gen de la CFBPasa de los cloroplastos de trigo fue subclonado en el plásmido pGEX-1. La expresión del gen de la proteína de fusión conteniendo a la Glutation-S-transferasa en su extremo N-terminal y a la CFBPasa de trigo en el C-terminal produjo los cuerpos de inclusión. En consecuencia, la CFBPasa particionó en la fracción insoluble del lisado bacteriano. Con esta suspensión fue analizado el proceso de recuperación de las propiedades funcionales de la CFBPasa mediante técnicas de desnaturalización y resolubilización de proteínas. Además se estudió el efecto de moduladores -fisiológicos y no fisiológicos- y de anticuerpos sobre la reconstitución de las actividades CFBPasa como Glutation-S-transferasa en la proteína quimérica. En contraste con las CFBPasas homotetraméricas obtenidas de otras fuentes, la capacidad catalítica residía en un dímero. A fin de caracterizar a la enzima de cloroplastos y comparar su comportamiento con el de la CFBPasa contenida en la proteína de fusión, la secuencia nucleotídica que codifica para la CFBPasa de trigo fue clonada y expresada en otro vector: el plásmido pET-22. Este plásmido condujo a la obtención de la enzima libre del fragmento GST, en la fracción soluble del lidado bacteriano. A partir del mismo, la CFBPasa fue purificada a homogeneidad y caracterizada estructural y cinéticamente. Al igual que las contraparte de otros orígenes, la CFBPasa de trigo era un homotetrámero activable por reductores (ditiotreitol) y moduladores fisiológicos (tiorredoxina) y no-fisiológicos (perturbantes proteicos). De particular interés en estos estudios fue que la ausencia de 20 aminoácidos de la región N-terminal de la CFBPasa no afectara la capacidad catalítica de la enzima. De manera que una región altamente variable en las FBPasas, cloroplásticas y no cloroplásticas, no tendría participación en el mecanismo catalítico.

Abstract:
In higher plants chloroplasts, a homotetrameric enzyme (MW 160000), fructose-1,6-bisphosphatase (CFBPase) catalyzes the cleavage of fructose 1,6-bisphosphate to fructose 6-phosphate and inorganic phosphate. Like other regulatory steps in this organelle, the striking feature of CFBPase is the modulation of activity by the concerted action of stromal metabolites and the light-stimulated Ferredoxin-Tiorredoxin System. In vitro, the enzyme activity is activated by physiological (thioredoxin) and non-physiological (cosolvents, caotropic anions and high preassure) modulators. Hence the modification of intramolecular non-covalent interaction contribute to enhance the reductive activation of CFBPase. In order to determine the kinetic and structural characteristics of the enzyme, the cDNA encoding wheat CFBPase was cloned in the plasmid pGEX-1. The expressed polipeptide comprised the chloroplast enzyme bound to the C-terminus of the Glutation-S-transferase was purified by affinity chromatography. Given that most of this novel protein accumulated in the particulate fraction of the lysate in the form of Inclusion Bodies, the recovery of functionality was essayed. After the insoluble material was resuspended under different conditions, the effect of physiological and non-physiological compounds as well as antibodies were analized on the recovery of CFBPase and Glutation-S-transferase catalytic activity. At variance with homotetrameric CFBPases from other sources, the catalytic capacity of the chimeric enzyme resided in a dimer. In order to evaluate the alterations that the Glutation-S-transferase moiety introduced on the enzyme activity and the formation of Inclusion Bodies, the cDNA that encodes the CFBPase was inserted in the plasmid pET-22. The homotetrameric, soluble and active enzyme was subsequently characterized. Like counterparts from other sources, wheat CFBPase is activable by reductants (dithiothreitol) and physiological (thioredoxin) and non-physiological (protein perturbants) modulators. Interestingly, the absence of 20 aminoacid residues in the N-terminal region does not influence the catalytic activity.

Heuck, Alejandro Pablo. "Estudio del intercambio tiol/disulfuro en las proteínas: Caracterización y análisis de la Protein Disulfuro Isomerasa de colza (Brassica napus)" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La modificación de los enlaces disulfuro en las proteínas (escisión, formación e isomerización) es asistida por una creciente familia de proteínas denominadas protein disulfuro oxidoreductasas (PDOR). El mecanismo de acción de estas enzimas se basa en la rápida velocidad con la cual los residuos cisteína de su sitio activo (-Cys-X-Y-Cys-) llevan a cabo los intercambios tiol-disulfuro con los grupos sulfhidrilo o enlaces disulfuro de las proteínas sustrato. En el presente trabajo se desarrolló un novedoso procedimiento para determinar la actividad de las PDORs (Capítulo 1) y se purificó a homogeneidad y se caracterizó tanto estructural, como cinéticamente, la Protein Disulfuro Isomerasa (PDI) de colza (Brassica napus) (Capítulo 2). El método desarrollado para la medición continua de la actividad de las PDORs se basa en la escisión de los enlaces disulfuro de la insulina derivatizada en sus extremos amino terminales con una sonda fluorescente (fluoresceína). La velocidad del incremento en la fluorescencia de la "di Insulina-fluoresceintiocarbamilada" (di Ins-FTC) es lo suficientemente sensible para estimar concentraciones de Tiorredoxina (Trx) de E. coli desde 5 nM hasta 500 nM. Además, el ensayo permite estudiar, empleando reductores no-fisiolólogicos (DTT), el efecto del pH sobre la actividad de estas enzimas sin la interferencia de enzimas accesorias (e.g. NADP-Trx-reductasa). Utilizando este ensayo, se purificó por primera vez, una PDI de semillas de una planta dicotiledónea. Los estudios estructurales revelaron que la PDI de colza es una glicoproteína homodimérica (57 kDa la subunidad) sustituida con un solo oligosacárido del tipo alta manosa. La PDI es estable a la desnaturalización térmica, y la presencia del oligosacárido no alteraría su estabilidad. Sin embargo, la remoción del oligosacárido disminuyó un 60% la actividad reductasa de la PDI. La PDI cataliza tanto la formación, la escisión como la isomerización de los enlaces disulfuro en varias proteínas sustrato. Dos factores son fundamentales en estas reacciones de intercambio tiol-disulfuro: a) el pH y b) el potencial redox del medio. El empleo de la di Ins-FTC como sustrato para medir la actividad reductasa de la PDI y de la Trx, permitió determinar que a pesar de compartir un sitio activo característico y una similitud estructural, ambas enzimas poseen pH óptimos distintos. La Trx cataliza esta reacción a pH neutro o ligeramente alcalino, mientras que la PDI lo hace más eficientemente a pH levemente ácido. Sin embargo, cuando se analizó la efectividad de la PDI en la catálisis de la formación y de la isomerización de las cistinas, la mayor eficiencia se obtuvo a pH levemente alcalinos. Por otra parte, a potenciales redox equivalentes a los que existirían dentro del retículo endoplásmico, la PDI acelera tanto la formación como la isomerización de los enlaces disulfuro. Pero a potenciales más reductores, estas actividades disminuyen y aumenta la capacidad para escindir estos enlaces. Estos estudios sugieren que tanto el pH intracelular, como los niveles de GSH reducido y oxidado (potencial redox) pueden modular la tendencia a la formación o a la escisión de los enlaces disulfuros cuando la PDI es el catalizador. Finalmente, la PDI de colza fue efectiva en la reducción de los enlaces disulfuro de una proteína de reserva presente en la semilla de colza: la napina. Estos resultados en conjunto, sugieren que la PDI podría proveer una vía alternativa para la reducción de varias proteínas presentes en la semilla, además de la ya propuesta para la Trx-h, en los eventos tempranos de la germinación.

Abstract:
The modification of disulfide bonds in proteins (cleavage, formation, and isomerization) is assisted by a growing protein family named protein disulfide oxidoreductases (PDOR). The action mechanism relies on the fast rate of the thiol-disulfide exchange reaction between cysteines of the active site (-Cys-X-Y-Cys-) and the thiol groups or disulfide bonds of the protein target. The present work reports a novel assay for the measurement of the PDOR activity (Chapter 1) and the purification of Protein Disulfide Isomerase (PDI) to near homogeneity, as well as the characterization of kinetic and structural properties (Chapter 2). The method for the continuous assay of the PDOR activity is based on the cleavage of the disulfide bonds of insulin molecule, in which both N-terminal amino groups are chemically modified with a fluorescent probe (fluorescein). The rate of fluorescence increment of di-fluoresceinthiocarbamyl-insulin (di FTC-Ins) is sensitive enough for the estimation of E. coli thioredoxin (Trx) concentrations from 5 nM to 500 nM. Moreover, this assay allows the analysis of the pH effect on the activity of PDORs without the interference of accessory enzymes (e.g. NADP-Trx-reductase). Using this assay, a PDI was purified from Brassica napus germinating seeds. The structural studies showed that this PDI was an homodimeric glycoprotein (subunit of 57 kDa), containing only one high mannose type oligosaccharide. Although the oligosaccharide was not responsible for the unusual resistance of PDI to thermal denaturation, cleavage of the carbohydrate moiety reduced 60% the activity of the enzyme. PDI catalyzed the formation, the cleavage, and the isomerization of disulfide bonds in a variety of target proteins. Two factors were crucial in this thiol-disulfide exchange reactions: a) the pH and b) the redox potential of the milieu. The use of di FTC-Ins as substrate for the reductase activity of PDI and Trx, unveiled that these enzymes have different pH optimum. Whereas Trx catalyzed this reaction at neutral or slightly alkaline pH, PDI was more effective at a slightly acidic pH. However, when the effectiveness of PDI in the catalysis of the formation or isomerization of cystines was assayed, the greatest efficiency was obtained at slightly alkaline pH. At redox potentials similar to that prevailing in the endoplasmic reticulum, PDI catalyzed the formation as well as the isomerization of disulfide bonds. But at more reducing conditions, these activities decreased and the capacity to cleave disulfide bonds increased. These studies suggested that the intracellular pH, as well as the levels of reduced GSH and GSSG (redox potential) can modulate the formation or the cleavage tendency of the disulfide bonds when PDI was the catalyst. Finally, PDI was also effective in the cleavage of the disulfide bonds of a B. napus storage protein: napin. Taking together, these results suggested that, like Trx-h on the early events in the seed germination, PDI could provide an alternative mechanism for the reduction of important seed proteins.

Noriega, Guillermo Osvaldo. "Estudios sobre la porfobiblinógeno-deaminasa de hígado y riñón de rata" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La porfobilinógeno-deaminasa (PBG-D) cataliza la condensación de cuatro moléculas de porfobilinógeno (PBG) para formar el hidroximetilbilano, el cual en presencia de la enzima isomerasa, origina el uroporfirinógeno m, precursor fisiológico en la síntesis de hemos, clorofilas y corrinas. Dado que bajo ciertas condiciones, la PBG-D podría actuar como segundo sitio de regulación, se resolvió estudiar la PBG-D de hígado y de riñón de rata, con un enfoque cinético. Se purificaron ambas enzimas empleando las siguientes técnicas: fraccionamiento con sulfato de amonio, filtración molecular (Sephadex G-lOO), intercambio aniónico (Q-Sepharosa) y cromatografla de afinidad (Blue Sepharosa). La purificación a homogeneidad de la enzima renal se logró mediante una electroforesis preparativa, que mostró una sola banda proteica con actividad, confirmada a través de Western blots. La actividad máxima se detectó en incubaciones a 65°C, a pH’s 7,8 y 8,2 con una energía de activación calculada de 16,8 kcal/mol y 19,3 kcal/mol y se detemiinaron las masas moleculares relativas: 41,7 ± 4,2 kDa y 39,8 ± 4,0 kDa para las enzimas hepática y renal respectivamente. La PBG-D de hígado de rata presenta un comportamiento michaeliano, con valores aparentes de Km y Vm de 12 ± 1,4 μM y 17,0 ± l,4 pmoles/mg.min. respectivamente y un n de Hill de 1, determinados a pH 8,2 y a 37°C. Estudios cinéticos revelaron que los iones Mg2+ (0-80 mM) y fosfato (0-20 mM) actúan como inhibidores incompetitivos, mientras que el amonio (0-50 mM) y la sulfarnerazina (0-2,0 mM) son inhidores no competitivos. En cambio, el ácido fólico (0-2,0 mM) actúa como un activador no esencial de la reacción. Para la enzima renal, los estudios cinéticos mostraron un comportamiento complejo, con una primera zona de saturación comprendida entre 5,0 y 7,0 μM y una segunda a partir de 66-70 μM. Los gráficos de dobles recíprocas son no lineales y exhiben un carácter bimodal que se traduce en dos constantes aparentes de afinidad, Km1: 0,8 ± 0,1 μM y Km2: 3,5 ± 0,4 μM. Comparando estas constantes cinéticas con las correspondientes para médula (Km: 0,8 ± 0,1 μM y Km2: 3,3 ± 0,4 μM) y corteza renal (Km: 0,9 ± 0,1 μM y Km2: 5,1 ± 0,6 μM), se sugiere que no existirian dos poblaciones proteicas distintas confinadas en diferentes estructuras. Además, la banda única obtenida (pI: 4,9) mediante la técnica de isoelectroenfoque, permitió descartar la presencia de isofonnas en riñón. Estudios cinéticos revelaron que el ion sodio (0-2,0 M) produjo un desplazamiento del punto de inflexión hasta obtener gráficos de inversas con una sola pendiente. A altas concentraciones de sustrato (7-66 uM) los iones Mg2+ (0-50 mM), fosfato (0-40 mM) y amonio (0-300 mM) actúan como inhibidores no competitivos. A bajas concentraciones de sustrato (0,8-7,0 pM) el Mg2+ es un inhibidor incompetitivo, el fosfato presenta un efecto dual y el amonio desplaza el punto de inflexión conforme aumenta su concentración. Estudios de inhibición realizados con PCMB, NEMI y DTNB demostraron la presencia de aminoácidos cisteína en el sitio activo, lo cual fue confirmado a través de estudios de grupos ionizables en la enzima y en los complejos enzima-sustrato. Se propone para la enzima renal, la existencia de por lo menos dos estados confonnacionales diferentes inducidos en el mismo sitio catalítico, ya sea por la unión del sustrato PBG o la no liberación del producto amonio o de ambos. La presencia de tales cambios confonnacionales permitiría la continuidad en la unión de las otras moléculas de PBG al sitio S, en presencia de intermediarios ES1, ES2 o ES3 en el sitio C, lo que originaria una diferente afinidad y actividad catalítr'ca final. Estos reordenamientos podrian producir finalmente cambios en los pasos limitantes de la reacción, lo cual sucedería a diferentes concentraciones de sustrato y daría lugar entonces a distintas constantes cinéticas.

Finkielstein, Carla V.. "Caracterización molecular de una fosfoproteína novel intermediaria en el mecanismo de acción de hormonas proteicas" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Trabajos previos de nuestro laboratorio han permitido caracterizar una fosfoproteína novel (p43), intermediaria en la síntesis de esteroides en la zona fasciculata de la corteza adrenal de rata (Paz C. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 224:709-716). En la presente Tesis, se describe la caracterización molecular de p43 asi como también la regulación hormonal del transcripto. Los resultados obtenidos mostraron que p43 es homóloga a una acil-CoA tioesterasa mitocondrial. La secuencia aminoacídica deducida de la proteína presentó sitios consenso de fosforilación para diferentes proteínas quinasas y un motíf para serina Lipasa. Anticuerpos dirigidos contra un péptido sintético que incluye dicho motif y otro contra la región N-terminal de p43, bloquearon la actividad biológica de la proteína. El transcripto de p43 fue detectado en ovario de ratas pseudopreñadas, en zona fasciculata y glomerulosa de adrenal de rata, en una línea tumoral de células de Leydig, en cerebro de ratón y en placenta humana. El tratamiento de ratas con dexametasona (Dx) provoca una disminución en los niveles del ARNm de p43 de manera dosisdependiente en adrenales de rata. El tratamiento posterior con ACTH no sólo revierte el efecto de la Dx, sino que produce un aumento rápido (5 min) en los niveles del mensajero alcanzando un máximo a los 15 min (62%) y retornando a los valores basales a los 30 min posteriores al estímulo. El tratamiento con actinomicina D o cicloheximida antes del estímulo con ACTH provoca una disminución o un aumento en los niveles del ARNm de p43 respectivamente. Estos resultados relacionan por primera vez que una actividad de acil-CoA tioesterasa está involucrada en los procesos esteroidogénicos.

Abstract:
We have previously reported the purification of a phosphoprotein (p43) intermediary in steroid synthesis from adrenal zona fasciculata (Paz C. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 224:709-716). Here we describe the cloning and sequencing of a cDNA encoding p43 as well as the hormonal regulation of p43 transcript. The protein resulted homologous to a very recently described mitochondrial peroxisome proliferator-induced very-long-chain acyl-CoA thioesterase. The deduced amino acid sequence of the protein shows consensus sites for phosphorylation by different protein kinases, and a Lipase serine motif. Antibodies raised against a synthetic peptide that includes the Lipase serine motif and against the N-terminal region of p43 block the action of the protein. The transcript of p43 was detected in ovary of pseudopregnant rats, rat adrenal zona fasciculata and glomerulosa, mouse Leydig tumor cell line, rat brain and human placenta. Inhibition of adrenocorticotropin hormone (ACTH)release and steroid synthesis by dexamethasone produced a dosedependent decrease in the abundance of the adrenal transcript. The transcript was induced by in vivo stimulation of the adrenals with ACTH. The effect had a rapid onset (5 min), reached maximal stimulation (62%) at 15 min and returned to basal levels at 30 min. ACTH effect on p43 transcript was inhibited by actinomycin D and enhanced by cycloheximide. Our results provide the first evidence linking acyl-CoA thioesterases, with very-long-chain specificities, and a protein intermediary in steroid synthesis, thereby supporting a regulatory role for acyI-CoA thioesterases in steroidogenic tissues.

Chianelli, Mónica Silvia. "Sistemas de transporte de aminoácidos neutros en Saccharomyces cerevisiae, cepas silvestres y mutantes transporte-defectivas" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Evidencias cinéticas y genéticas muestran que en Saccharomyces cerevisiae, la incorporación de los aminoácidos de cadena ramificada L-leucina, L-isoleucina y L-valina es mediada por al menos tres sistemas funcionalmente distintos: la permeasa general de aminoácidos GAP1 (inactiva en presencia de iones amonio) y dos sistemas de transporte más específicos S1 y S2, previamente descriptos para el transporte de L-Leucina. En celulas silvestres cultivadas en medio conteniendo L-prolina, cada uno de los aminoácidos de cadena ramificada exhibe un solo sistema de transporte de alta afinidad y muy alta capacidad. Una mutante gap1 muestra dos sistemas de transporte para Leucina con valores de KT y Jmáx similares a aquellos descriptos previamente como S1 y S2, y un solo sistema de transporte de baja afinidad- alta capacidad para isoleucina o valina. Una cepa mutante defectiva en los sistemas S1 y S2 que transportan Leucina fue aislada a partir de la parental ya deficiente en la permeasa general de amingácidos, GAP1. La mutante fue seleccionada como una cepa espontánea resistente a triflúorleucina (TFL). Esta mutante fue cruzada con una cepa testigo gap1, y el análisis de tetradas indicó que la resistencia completa a TFL dependió de la presencia de al menos dos genes mutantes no ligados, denominados let (leucine transport). La mutación let1 inactiva completamente el sistema de transporte de Leucina de alta afinidad-baja capacidad definido cinéticamente como S1. Aunque la mutación let2 causó una marcada disminución en la Jmax del sistema S2 de baja afinidad, el transporte residual de Leucina en la mutante gap1let1let2 tuvo el mismo KT que el de la cepa parental gap1LET1LET2. Resultados similares se obtuvieron para los únicos sistemas de transporte de isoleucina o valina. La mutante gap1let1let2 exhibió una marcada disminución en el crecimiento sobre medio minimo conteniendo Leucina, isoleucina o valina como únicas fuentes de nitrógeno. Además, la asimilación de metionina, fenilalanina, serina, treonina y norleucina estuvo impedida severamente, mientras los aminoácidos básicos y ácidos sostuvieron un crecimiento normal. Esto indica que al menos una de las permeasas de Leucina tiene una considerablemente amplia pero aún limitada especificidad. La reversión del gen gap1 restauró el transporte de los aminoácidos de cadena ramificada. La cepa revertante fue sensible a TFL cuando creció en prolina, pero resistente cuando amonio fue la fuente de nitrógeno. La segregante (sensible a TFL) gap1let2 exhibió para cada uno de los aminoácidos de cadena ramificada, solamente un sistema de transporte de alta afinidad-baja capacidad. Esta cepa mostró parámetros cinéticos para el transporte de Leucina muy similares a aquellos caracterizados para el sistema S1 en la cepa gap1. Cada uno de los sistemas de transporte de alta afinidad de los aminoácidos de cadena ramificada es inhibido competitivamente por los otros dos aminoácidos de cadena ramificada. Además, metionina, norleucina y TFL actúan como inhibidores competitivos del transporte de Leucina por el sistema de alta afinidad. En la mutante gap1let2 la deficiencia en la actividad de S2 resulta en la perdida de la capacidad de crecer significativamente en medios de cultivo conteniendo treonina, serina y norleucina como únicas fuentes de nitrógeno y un crecimiento reducido sobre los aminoácidos de cadena ramificada individuales, metionina y fenilalanina. Por lo tanto, el gen LET1 codifica la permeasa de L-aminoácidos de cadena ramificada de alta afinidad-baja capacidad S1, y posiblemente transporte también metionina y -fenilalanina. La permeasa LET1 (St) es primariamente responsable de la acumulación intracelular de TFL a niveles tóxicos, porque este sistema no es detectable en la mutante resistente a TFL gap1let1let2. En contraste, la segregante gap1/eN exhibió para cada uno de los aminoácidos de cadena ramificada solamente un sistema de transporte de baja afinidad- alta capacidad. Esta cepa mostró para el transporte de Leucina un valor de KT muy similar a aquel caracterizado para el sistema S2 en la cepa gap1 aunque con un valor de Jmax mas alto. Un único sistema de transporte de baja afinidad -alta capacidad para isoleucina o valina mostró similares características. Esta cepa crece normalmente como la cepa gap1 sobre todas las fuentes de nitrógeno ensayadas. Isoleucina, valina, metionina, alanina y norleucina son inhibidores competitivos del transporte de Leucina por el sistema S2. Los valores de Ki están en el orden de los valores de KT determinados para el transporte de Leucina, isoleucina y valina. DL-TFL es un inhibidor competitivo del sistema S2 pero el valor Kies más grande que el valor de KTpara el transporte de Leucina. Por Io tanto. el sistema S2 de baja afinidad- alta capacidad tiene una relativamente amplia especificidad. transportando no sólo los aminoácidos de cadena ramificada sino también metionina, alanina, serina. treonina y norleucina. Estos resultados sugieren que el gen LET2 codifica un componente asociado a la óptima actividad del sistema S2. La regulación de la actividad de transporte por la fuente de nitrógeno presente en el medio de cultivo indica que la permeasa LET1 (S1) no está sujeta a la represión catabólica por nitrógeno ni a la inactivación catabólica por nitrógeno (NCI). En contraste, en la cepa gap1 la actividad de transporte de L-leucina por S2 es regulada negativamente por los iones amonio. Más aún, en esta condición, el transporte de L-leucina por el sistema S2 en las cepas gap1 y gap1let1let2 exhibió parámetros Cineticos similares. En la segregante gap1/en el comportamiento regulatorio fue diferente. Las activdades de transporte de los aminoácidos de cadena ramificada por S2 fueron más altas que aquellas obtenidas en las células mutantes gap1 o gap1let1let2 crecidas en los medios de cultivo conteniendo L-prolina o iones amonio como únicas fuentes de nitrógeno. Estos resultados sugieren una tercera mutación además de let1 y let2 que podría interferir con la incorporación de los aminoácidos de cadena ramificada o de una interacción entre los productos de los genes LET1 y LET2.

Abstract:
Kinetic and genetic evidence show that the uptake of L-branched-chain amino acids into Saccharomyces cerevisiae is mediated by at least three functionally distinct systems: the general amino acid permease GAP1 (inactive in the presence of ammonium ions), and two transport systems more specific S1 and 82, previously described for L-leucine transport. Wild type cells grown in medium containing L-proline as nitrogen source, exhibit a single transport system for each of the L-branched-chain amino acids of high-affinity and very high-capacity A gap1 mutant shows two transport systems for leucine wrth KTand Jma, values Similar to those previously described as S1 and 82, and a single low affinity-high capacity transport system for isoleucine or valine. A strain mutant defective in Systems S1 and S2 transporting L-leucine was isolated from the parental strain already deficient in the general amigo acid permease, GAP1. The mutant was selected as a spontaneous, trifluoroleucine-resistant (TFL) strain. This mutant was crossed with gap1 tester strain. and tetrad analysis indicated that full resistance to TFL was dependent upon the presence of at least two unlinked mutant genes, denominated let (leucine transport). The let1 mutation completely inactivates the high affinity-low capacity leucine transport system kinetically defined as S1. Although the let2 mutation caused a marked decrease in the Jmax of the low affinity system S2, residual transport in the gap1let1let2 mutant had the same KT as in the gap1LET1LET2 parental strain. Similar results were obtained for the single transport system of L-isoleucine or L-valine. The gap1let1let2 mutant exhibited a marked decrease in growth on minimal medium containing leucine, isoleucine or valine as a sole nitrogen source. Moreover, assimilation of methionine, phenylalanine, serine, threonine and norleucine, was severely impaired, whereas basic and acidic amino acids supported normal growth. This indicates that at least one of leucine permeases has a fairly broad, but yet limited specificity. Reversion of the gap1 gene restored branched-chain amino acids transport. The revertant strain was sensitive to TFL when grown on proline but resistant to TFL when ammonia was the nitrogen source. The gap1let2 (TFL-sensitive) segregant exhibited for each of the L-branched-chain amino acids only one transport system of high affinity-low capacity. This strain showed transport kinetic parameters for L-Leucine very similar to those characterized for system S1 in a gap1 strain. Each of the high-affinity transport systems for the L-branched-chain amino acids is inhibited competitively by the other two branched chain amino acids. ln addition, methionine, norleucine and trifluoroleucine act as competitive inhibitors of the high affinity transport system of leucine. In mutant gap1let2 the deficiency in L-leucine S2 activity results, in the loss of its ability to grow significantly in culture media containing threonine, serine or norleucine as the sole nitrogen source and in a decreased growth on individual branched chain amino acids, methionine and phenylalanine. Therefore, the gene LET1 encodes for the high affinity-low capacity L-branched-chain amino acids permease S1 and very likely for methionine and phenylalanine as well. The LET1 permease (S1) is primarily responsible for the intracellular accumulation of TFL up to toxic levels, because this system is not detectable in the TFL-resistant mutant gap1let1let2. In contrast, the gap1let1 segregant exhibited only one system transport of low affinity-high capacity for each of the Lbranched-chain amino acids. This strain, showed a transport KT value for leucine very similar to that characterized for system S2 in a gap1 strain although with the higher Jmax value. A single low affinity-high capacity transport system for isoleucine or valine shown similar characteristics. This strain, alike gap1 strain grows normally on all nitrogen sources assayed. lsoleucine, valine, methionine, alanine and norleucine are competitive inhibitors of the Ieucrne transport system S2. The Ki values are of the same order as the KT values determined for leucine, isoleucine and valine transport. TFL is a competitive inhibitor of the S2 system but its Ki value is larger than the KT value for -Leucine transport. Therefore, the low affinity-high capacity system S2 has a relatively broad specificity, transporting not only branched chain aminoacids but also methionine, alanine, serine, threonine and norleucine. These results suggest that LET2 encodes for a component which is associated to optimum activity of transport system S2. Regulation of transport activity by the nitrogen source indicates that S1 permease is not subject to nitrogen catabolite repression (NCR) nor to nitrogen catabolite inactivation (NCI). In gap1 strain the leucine transport S2 activity is negatively regulated by ammonium ions. Moreover, under this condition leucine transport by S2 system in gap1 and gap1/et1/e12 strains, exhibited similar kinetic parameters. In the segregant gap1let1 the regulatory behaviour was different. The branched-chain amino acids transport activities by S2 were higher that those obtained in gap1 or gap1let1/et2 mutant cells grown in culture media containing L-proline or ammonium ions as sole nitrogen source. These results suggest the existance of a third mutation, besides let1 and let2 which could interfere with the L-branched chain amino acids uptake or of an interaction between the products of the genes LET1 and LET2.

Labriola, Carlos Alberto. "Purificación de la cruzipaína por cromatografía de afinidad : Su aplicación en el estudio del control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Parte I: Purificación de cisteína proteinasas de trypanosomátidos por cromatografía de afinidad. Trypanosoma rangeli es un trypanosoma de América del sur capaz de infectar mamíferos pero aparentemente incapaz de causar patología. Tiene una alta reactividad inmunológica cruzada con Trypanosoma cruzi, el agante de la enfermedad de Chagas. La diferencia principal entre ambos parásitos parece ser la localización de las formas infectivas de T. rangeli en las glándulas salivales, comparada con la localización rectal de los trypomastigotes metacíclicos de T. cruzi, y la aparente pérdida de un estadío intracelular en el mamífero, en el caso del primer parásito. El último punto sugiere que algunos o todos de los diferentes factores postulados a estar involucrados en el reconocimiento, adherencia a, y penetración dentro de la célula de mamífero por los trypomastigotes de T. cruzi, podrían estar ausentes o fuertemente disminuidos en T. rangeli. Entre un número de factores de virulencia propuestos, la cruzipaína, cisteína proteinasa principal de T. cruzi ha sido descripta como una enzima esencial en distintos puntos del ciclo biológico del parásito y podría estar directamente involucrada en la penetración. Por esta razón, decidimos investigar actividades de cisteína proteinasa en epimastigotes de T. rangeli. Hemos purificado cruzipaína a homogeneidad proteica (de T. cruzi) y una cisteína proteinasa (de T. rangeli) utilizando cromatografía de afinidad, tanto en cistatina-Sepharosa, específica para cisteína proteinasas, como en concanavalina-A (ConA), específica para glicoproteínas con oligosacáridos de alta manosa, partiendo de extractos crudos de epimastigotes. La última enzima se expresa a un nivel de dos órdenes de magnitud menor que la cruzipaína en epimastigotes de T. cruzi. Ambas enzimas tienen masa molecular aparente, idéntica secuencia N-terminal y reacción inmunológica cruzada, pero difieren en la secuencia completa y en algunos parámetros cinéticos. Parte II: Control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi. Las N-glicoproteínas son al principio glicosiladas con la transferencia de un oligosacárido (Glc3Man9GlcNAc2, en la mayoría de las células) desde un derivado de dolicol-P-P a un residuo de Asn en el lúmen del retículo endoplásmico (RE). Los oligosacáridos unidos a proteína son procesados en la misma localización subcelular por la glucosidasa I (GI) que remueve la unidad de glucosa (Glc) mas externa y la glucosidasa II (GII) que remueve las dos glucosas remanentes. Un proceso adicional en el RE es la reacción catalizada por la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima agrega una unidad de Glc a oligosacáridos libres de glucosa en glicoproteínas que no presentan su plegamiento terciario correcto. La GII deglucosila los oligosacáridos monoglucosilados generados por la GT. Las glicoproteínas adquiren su estructura terciaria final en el RE. Las glicoproteínas que fracasan en adquirir su plegamiento correcto son retenidas en el RE y posteriormente transportadas al citosol donde son degradadas en el proteasoma. Por otro lado, las moléculas que se pliegan correctamente pueden continuar su tránsito a través del camino secretorio a su destino final. Se han descripto en el lúmen del RE, dos chaperones no convencionales, calnexina (Cnx) y calreticulina (Crt). Se ha demostrado que la interacción de la Cnx/Crt con glicoproteínas monoglucosiladas facilita el plegamiento de las glicoproteínas en células de mamíferos previniendo la agregación y la supresión de uniones disulfuro incorrectas. Mas aún, la interacción antes mencionada provee uno de los mecanismos por los cuales las células retienen en el RE glicoproteínas mal plegadas. Las interacción Cnx/Crt con glicoproteínas monoglucosiladas fue considerado por lo tanto, como un control de calidad de plegamiento de glicoproteínas. Este modelo predice que la inhibición de la remoción de la Glc agregada por la GT, retardaría (o aboliría) la salida de las glicoproteínas del RE. Esta predicción no puede ser comprobada, sin embargo, en la mayoría de las células dado que la GII es la responsable de la remoción de ambas unidades de Glc unidas en α(1,3). Mas aún, los inhibidores conocidos de GII también inhiben GI. La adición de estas drogas a las células lleva a la acumulación de oligosacáridos con dos o tres Glc que no son reconocidos por la Cnx/Crt. La predicción puede ser comprobada en T. cruzi. Este parásito transfiere “in vivo” oligosacáridos no glucosilados (Man9GlcNAc2) a los polipéptidos nacientes y, por lo tanto, los oligosacáridos monoglucosilados se forman en ellos solamente vía GT. La cruzipaína, una cisteína proteinasa lisosomal de T. cruzi, teniendo tres sitios potenciales de N-glicosilación, al menos dos de los cuales están ocupados, se aisló en la forma glucosilada de células crecidas en presencia de 1-deoxinojirimicina (DNJ), un inhibidor de la GI y GII. El oligosacárido presente en el único sitio de glicosilación del dominio carboxilo-terminal de la cruzipaína se glucosiló en algunas moléculas de enzima pero no en otras, este resultado es consistente con un plegamiento asincrónico de las glicoproteinas en el RE. A pesar de no afectar la velocidad de crecimiento celular o el metabolismo celular general en incubaciones cortas y largas, la DNJ causó un marcado retraso en el arribo de la cruzipaína a los lisosomas. Este resultado es compatible con el modelo propuesto por el cual las glicoproteinas monoglucosiladas podrían ser transitoriamente retenidas en el RE por anclas tipo lectinas reconociendo oligosacáridos monoglucosilados. También se encontró que este protozoo expresa una molécula tipo Crt, el tercer componente (además de GT y GII) del control de calidad de plegamiento de glicoproteínas. No se detectó un gen que codifique para Cnx. La Crt recombinante de T. cruzi reconoció especificamente oligosacáridos monoglucosilados del tipo alta manosa. El agregado de suero anti-Crt a extractos obtenidos de células de un experimento de “pulse-Chase” con Met más Cys inmunoprecipitó dos proteínas que fueron identificadas como Crt y cruzipaína. La última proteína pero no la primera desapareció durante el período de “chase”. Contrariamente a lo que sucede en células de mamíferos, la adición de DNJ promovió la interacción Crt-cruzipaína. Este resultado es consistente con la vía conocida de N-glicosilación de proteínas y procesamiento de oligosacáridos que ocurren en T. cruzi y explica el retraso en el arribo de la cruzipaína a los lisososmas causado por la DNJ. El tratamiento de los complejos Crt-cruzipaína con endo-β-N-acetilglucosaminidasa H (Endo H) tanto antes como después del agregado del suero anti-Crt abolió por completo la interacción Crt-cruzipaína. Además, la cruzipaína madura monoglucosilada pero no la no glucosilada aislada de los lisosomas interactuó con la Crt recombinante. Concluimos que la Crt de T. cruzi se une a oligosacáridos monoglucosilados pero no a motivos proteicos en la cruzipaína. Mas aún, las evidencias indican que la GT glucosiló a la cruzipaína en sus últimos estados de plegamiento.

Abstract:
Part I: Purification of cysteine proteinases of Trypanosomatids by affinity chromatography. Trypanosoma rangeli is a South American trypanosome able to infect mammals, but apparently unable to elicit pathology. lIt has a high immunological cross-reactivity with Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease. The major differences between both parasites seem to be the salivary gland location of the infective forms of T. rangeli, as compared with the rectal localization of the metacyclic trypomastigotes of T. cruzi, and the apparent lack of an intracellular stage in the mammal, in the case of the former parasite. The latter point suggest that some or all of the different factors postulated to be involved in recognition, adherence to, and penetration into the mammalian cell by T. cruzi trypomastigotes might be absent or strongly diminished in T. rangeli. Among a number of proposed virulence factors, cruzipain, the major cysteine proteinase of T. cruzi has been implied as an essential enzyme in several points of the biological cycle of the parasite, and may also be directly involved in penetration. For this reason, we decided to search for cysteine proteinase activities in epimastigotes of T. rangeli. We have purified to protein homogeneity cruzipain (from T. cruzi) and a cysteine proteinase (from T. rangeli), using affinity chromatography, both on cystatin-Sepharose, specific for cysteine proteinases, and ConA-Sepharose, specific for high mannose type N-linked glycoproteins, starting from crude epimastigote extracts. The latter enzyme is expressed at a level at least two orders of magnitude lower than is cruzipain in T. cruzi epimastigotes. Both enzymes have similar apparent molecular mass and identical N-terminal sequence, and cross-react immunologicaly, but differ in full sequence and in some kinetic parameters. Part II: The quality control of glycoprotein folding in Trypanosoma cruzi. N-glycoproteins are first glycosylated upon transfer of an oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2 in most cells) from a dolichol-P-P derivative to Asn residues in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). Protein-linked oligosaccharides are then processed in the same subcellular location by glucosidase I (GI) that removes the more external glucose (Glc) unit and glucosidase II (GII) that excises the two remaining Glc. An additional ER processing reaction is that catalyzed by the UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (GT). This enzyme adds a single Glc unit to Glc-free, high mannose-type oligosaccharides in glycoproteins not displaying their properly folded tertiary structures. GII deglucosylates the monoglucosylated oligosaccharides generated by GT. Glycoproteins acquire their proper tertiary structure in the ER. Glycoproteins that fail to properly fold are retained in the ER and further transported to the cytosol where they are degraded in the proteasomes. On the other hand, properly folded species may continue their transit through the secretory pathway to their final destinations. Two unconventional chaperones calnexin (Cnx) and calreticulin (Crt), have been described in the ER lumen of mammalian cells. It has been shown that interaction of Cnx/Crt with monoglucosylated glycoproteins facilitates glycoprotein folding in mammalian cells by preventing aggregation and suppressing formation of non-native disulfide bonds. Moreover, the above mentioned interaction provides one of the mechanisms by which cells retain misfolded glycoproteins in the ER. The Cnx/Crt interaction with monoglucosylated glycoproteins has been considered to be, therefore, a quality control of glycoprotein folding. This model predicts that inhibition of removal of the Glc unit added by GT would delay (or abolish) exit of glycoprotein from the ER. This prediction can not be tested, however, in most eukaryotic cells as GII is responsible for removal of both α(1,3) linked Glc units. Moreover, known inhibitors of GII also inhibit GI. Addition of those drugs to cells leads to the accumulation of oligosaccharides having two or three Glc that are not recognized by Cnx/Crt. The prediction can be tested in T. cruzi. This parasite transfers “in vivo” unglucosylated oligosaccharides (Man9GlcNAc2)to nascent polypeptide and, therefore, monoglucosylated oligosaccharides are formed in them only by GT. Cruzipain, a T. cruzi lysosomal cysteine proteinase having three potential N-glycosilation sites, at least two of which are occupied, was isolated in a glucosylated form from cells grown in the presence of the GI and GII inhibitor 1-deoxynojirimycin (DNJ). The oligosaccharide present at the single glycosylation site of the carboxy-terminal domain of cruzipain was glucosylated in some enzyme molecules but not in others, this result being consistent with an asyncronous folding of glycoproteins in the ER. In spite of not affecting cell growth rate or the cellular general metabolism in short and long term incubation, DNJ caused a maeked delay in the arrival of cruzipain to lysosomes. This results is compatible with the model proposed by which monoglucosylated glycoproteins may be transiently retained in the ER by lectin-like anchors recognizing monoglucosylated oligosaccharides. It was found also that this protozoan expresses a Crt-like molecule, the third component (in addition to GT and GII) of the quality control of glycoprotein folding. No Cnx-encoding gene was detected. Recombinant T. cruzi calreticulin specifically recognized free monoglucosylated high mannose-type oligosaccharides. Addition of anti-Crt serum to extracts obtained from cells pulse-chased with Metplus Cys immunoprecipitated two proteins that were identified as Crt and the lysosomal proteinase cruzipain. The latter but not the former protein disappeared upon chasing cells. Contrary to what happens in mammalian cells, addition of DNJ promoted Crt-cruzipain interaction. This result is consistent with the known pathway of protein N-glycosylation and oligosaccharide processing occurring in T. cruzi and explains the delay in cruzipain arrival to lysosomes caused by DNJ. A treatment of the Crt-cruzipain complexes with endo-β-N-acetylglucosaminidase H (Endo H) either before or after addition of anti-Crt serum completely disrupted Crt-cruzipain interaction. In addition, mature monoglucosylated but not unglucosylated cruzipain isolated from lysosomes was found to interact with recombinant Crt. It was concluded that T. cruzi Crt binds monoglucosylated oligosaccharides but not the protein moiety of cruzipain. Furthermore, evidence is presented indicating that GT glucosylated cruzipain at its last folding stages. Journal of Cell Biology 130, N° 4 (1995) 771-

Zaremberg, Vanina. "Estudio del mecanismo de activación de la quinasa de proteínas dependiente de cAMP" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo general de esta tesis es contribuir al estudio del mecanismo de activación de las proteinas quinasas dependientes de cAMP (PK A). Algunos de los grandes problemas a dilucidar en este tema son: si la enzima necesita disociarse en sus subunidades catalltica y regulatoria para activarse por cAMP , si el cAMP es el único agente necesario para la activación de la enzima y cómo se adquiere la selectividad de sustratos. Para este trabajo se han utilizado como modelos dos eucariontes inferiores. 1) PKA parcialmente purificada del hongo dimórflco Mucor rouxii, y ensayos in vitro. 2) Mutantes de subunidad regulatoria (bcy1) de la PKA de la levadura Saccharomyces cerevisiae con un abordaje genético-bioquímico-molecular. Utilizando el primer modelo y trabajando a concentraciones de holoenzima del orden de nM hemos llegado a las siguientes conclusiones (Mechanism of activation of cAMP-dependent protein kinase. In Mucor rouxii the apparont specific activity of the CAMP activated holoenzyme is different to that of its free catalytic subunit”. V.Zaremberg, A.Donnella-Deana and S.Moreno. Enviado a Archives in Biochemistry and Biophysics). - en este rango de concentración la actividad enzimática utilizando péptidos sintéticos como sustratos no es lineal con la concentración de enzima. Con la proteina protamina, utilizada como referencia, la actividad es casi lineal en el mismo rango de concentración. - la dependencia de la actividad fosforilante de cada péptido, con el cAMP, el grado de inhibición por un péptido inhibidor especifico y la modulación por policationes dependen del péptido utilizado. - en todos los ensayos arriba mencionados la relación de las actividades fosforilantes de la enzima con los distintos péptidos, comparados entre si o con la protamina, es diferente a la misma relación estimada a partir de las actividades medidas con la subunidad catalitica libre. Estos resultados se explican con dos modelos posibles: a) la subunidad catalitica libre es la entidad que fosforila los sustratos y el nivel de producción de subunidad C depende del cAMP y del sustrato; b) a altas concentraciones de holoenzima, existe holoenzima sin disociar con cAMP unido; esta especie es cataliticamente activa y la selectividad de esta especie por los sustratos es diferente a la de la subunidad catalitica libre. En el segundo modelo se han utilizado mutantes espontáneas, cedidas por el Dr. Kelly Tatchell, en el gen que codifica para la subunidad regulatoria (bcy1) de la PKA. En un primer trabajo (Analysis of the mechanism of activation of cAMPdependent protein kinase through the study of mutants of the yeast regulatory subunit. ” V.Zaremberg and S.Moreno, Eur.J.Biochem. 237: 136-142, 1996) trabajando con las cepas mutantes se obtuvieron los siguientes resultados: - los niveles de las subunidades regulatoria ( R) y catalltica (C ) en las cepas mutadas son similares a los de la cepa salvaje. - Una medida aproximada de la afinidad de las subunidades R mutadas por el CAMP, indicó que se encuentra disminuida. - Midiendoactividad de PKA en células penneadas en ausencia y presencia de cAMP, se encontró que las mutantes demuestran actividad dependiente de cAMP,aunque tienen una actividad basal elevada. - Los fenotipos se hicieron más severos si el fondo genético de las levaduras era RAS2; y permanecieron iguales por sobreexpresión del gen para PDE2. En la tercera parte de la tesis, y utilizando el mismo modelo de S.cerevisiae se encaró la sobreexpresión de algunas de las mutantes bcy1: construcción de los vectores correspondientes, estudio de la sobreexpresión y análisis de los fenotipos resultantes. El conjunto de estos resultados (manuscrito en preparación) confirma la conclusión que obtuviéramos en la primera parte: las holoenzimas mutadas tienen actividad enzimática. Del conjunto de los resultados genético-bioquímicos obtenidos hasta ahora en el sistema de las mutantes de levadura hemos concluido, que las holoenzimas mutadas tienen actividad fosforilante de proteinas sin necesidad de disociarse en sus subunidades, que la capacidad fosforilante de proteinas es diferente para cada mutante (diferentes fenotipos) y proponemos que los cambios conformacionales producidos por las mutaciones pueden ser similares a los introducidos por el cAMP al interactuar con la holoenzima.

Abstract:
The general aim of this thesis is to contribute to the study of the mechanism of activation of CAMP-dependent protein kinases (PKA). Some of the questions to solve on this field are the following: is it necessary for the holoenzyme to dissociate to be activated by CAMP? ls cAMP the only agent that promotes activation? How do the holoenzymes select the substrate to phosphorylate? In this work we have used two lower eukaryotic models. 1) Partially purified PKA from the dimorphic fungus Mucor rouxii and in vitro assays. 2) Mutants of the regulatory subunit (bcy1) of protein kinase A from the yeast Saccharomyces cerevisiae , using a molecular-genetic-biochemical approach. Using the first model and working at holoenzyme concentrations in the range of nM we have arrived to the following conclusions (Mechanism of activation of cAMP dependent protein kinase. In Mucor muxii the apparent specific activity of the cAMP activated holoenzyme is different to that of its free catalytic subunit, V.Zaremberg, A.Donnella-Deana and S.Moreno; submitted to Archives in Biochemistry and Biophysics) - under this range of enzyme concentration, the enzymatic activity using peptide as substrates is non linear; while it is almost linear when using protamine as substrate. - the dependency of each peptide phosphorylating activity with cAMP, the degree of inhibition by a specific peptide inhibitor, and the activation by polycations depends on the peptide used as substrate. - in all the above mentioned assays. the relationship of the apparent specific activity of the holoenzyme with each peptide , is different from the one displayed by the isolated free catalytic subunit. These results can be explained by two posible models: a) the free catalytic subunit is the enzymatic species that phosphorylates the substrates and the level of production of free C depends on cAMP and on the protein or peptide substrate; b) at high holoenzyme concentration, the existance of the species cAMP-bound holoenzyme is posible; this species is catalytically active and the selectivity for the substrates of this species is different from the one of the free catalytic subunit. In the second model we have used spontaneous mutants on the bcy1 gene, isolated and generously provided by Dr. Kelly Tatchell. In first stage of this approach we have obtained the following results: (Analysis of the mechanism of activation of CAMP-dependent protein kinase through the study of mutants of the yeast regulatory subunit, V.Zaremberg and S. Morenoi, Eur.J.Biochem. 237: 136-142, 1996.) - the levels of the regulatory (R) and catalytic (C) subunits of PKA in the mutated strains is similar to the levels of the wild type strain. an approximate measurement of the affinity of the mutated R subunits for cAMP indicates that the affinity is decreased. measurement of PKA activity in the abscence and presence of CAMP in permeabilized mutated and wild type cells indicates that the holoenzymes are dependent on CAMP and that basal activity is high. - the phenotypes were more severe when working on a wild type RAS2 background; and were maintained alike when over expression the gene for PDE2 (CAMP phosphodiesterase). In the third part of this thesis, and using the same model of S.cerevisiae mutant strains, we began the over expression of some of the bcy1 mutants: vector construction, analysis of the over expression and analysis of the derived phenotypes. These results suggest that the mutated holoenzymes are active. From the results obtained from the molecular genetic approaches, taken as a whole, we conclude that the mutated holoenzymes have catalytic phosphorylating activity without dissociating into its subunits; that the selectivity of substrate phosphorylation for each mutated holoenzyme ¡s different (different phenotypes) and we propose that the conformational structural changes produced by the mutatioon can be similar to the changes promoted by cAMP upon interaction with the holoenzyme.

Ceballos, Nora Raquel. "Biosíntesis de aldosterona y su regulación en Bufo arenarum (Amphibia, anura)" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la presente Tesis Doctoral se realizaron estudios sobre la biosíntesis de aldosterona, en la glándula interrenal de Bufo arenarum, a partir de distintos sustratos tales como corticosterona, 18-hidroxicorticosterona (18-OH-B) y el compuesto "N" que se biosintetiza a partir de pregnenolona pero no de progesterona. A diferencia de lo que ocurre con la 18-OH-B comercial o de rata, la proveniente de interrenales de sapo presenta una forma menos polar única y distinta de las conocidas hasta el momento. Con respecto a la precursoriedad de aldosterona que posee este esteroide 18-hidroxilado, los resultados mostrados indican que esta hormona no es intermediario en la biosíntesis de aldosterona, por lo menos en las condiciones utilizadas para los experimentos presentados en esta Tesis. También se ensayó la capacidad precursora de aldosterona que tiene corticosterona y la conclusión a la que se arribó es que la capacidad biosintética de este conocido intermediario en la síntesis de aldosterona es, también, muy baja. Se caracterizó por diversos métodos el compuesto "N", esteroide muy polar con movilidad intermedia entre 18-OH-B y cortisol en el sistema Bush B5, como el 3β -hidroxi-5-ene análogo de aldosterona (3β ,11β ,21-trihidroxi-5-pregnen-20-ona-18-al). Cuando se estudiaron las propiedades biosintéticas del compuesto "N", este esteroide demostró ser un muy buen precursor para la síntesis de aldosterona. La importante capacidad precursora de aldosterona que posee "N", a la menor precursoriedad de corticosterona y a la falta de capacidad de 18-OH-B, indican que en Bufo arenarum, la isomerización del doble enlace Δ 5 a Δ 4 es un paso muy tardío en el camino biosintético de aldosterona. La transformación del análogo de aldosterona en el mineralocorticoide es catalizada por la enzima 3β -hidroxiesteroide deshidrogenasa-Δ 4 isomerasa de localización mitocondrial. La actividad de la enzima mencionada es regulada por la concentración de sodio del medio, la que parece regular la cantidad de enzima presente en aquella fracción.

Abstract:
This thesis describes studies on the biosynthesis of aldosterone by the interrenal gland of Bufo arenarum from substrates such as corticosterone, 18-hydroxycorticosterone (18-OH-B) and compound "N", a metabolite synthesized from pregnenolone but not from progesterone. At variance with commercial or rat 18-OH-B, toad 18-OH-B exhibits only one single "less polar form". This form differs from those currently described. Under the present conditions, that 18-hydroxylated steroid is not an intermediate in the biosynthesis of aldosterone. Likewise, corticosterone proved to be a poor precursor for the mineralocorticoid. Several methods were applied to the study and characterization of compound "N", a highly polar metabolite migrating in the Bush B5 paper-chromatographic system as migrates the 3β -hydroxy-5-ene analog of aldosterone (3β ,11β ,21-trihydroxy-5-pregnen-20-one-18-al). This steroid showed to be a good precursor for aldosterone. Its precursorship, surpassing by far those exhibited by 18-OH-B or even corticosterone, suggests that isomerization Δ 5 Δ 4 is a final step of aldosterone biosynthesis. The transformation of the aldosterone-analog into aldosterone is catalised by the enzyme 3β hydroxysteroid dehydrogenase-Δ 4 isomerase, of mitochondrial localization. Enzyme activity is regulated by the sodium concentration of the medium, which apparently controls the amount of enzyme in mitochondria.

Cremona, María Laura. "TRANS-SIALIDASA en Trypanosoma cruzi: estudio de la estructura y función de esta familia de antígenos de superficie" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enfermedad de Chagas es una de las parasitosis endémicas más importantes de América. Dieciocho millones de personas infectadas releva un informe reciente de la Organización Mundial de la Salud (WHO, 1998). Tryparzosoma cruzzi es el parásito responsable de esta enfermedad. Presenta en su superficie la trans-sialidasa, una enzima unida a la membrana por un enlace glicofosfatidilinositol. Esta enzima le otorga la capacidad de adquirir ácido siálico a partir de sialiglicoconjugados del organismo que infecta, ya que T cruzles incapaz de sintetizar este monosacárido. La trans-sialidasa fue involucrada en aspectos clave de la infección y la supervivencia del parásito en sangre. La familia de proteínas de la trans-sialidasa está codificada por al menos 140 genes que pueden clasificarse en tres sub-familias de acuerdo a la estructura y la función de sus productos proteicos. Dos de estos grupos son expresados en tripomastigotes, la forma infectiva del parásito, y se distinguen en su capacidad de trans-glicosidar: las trans-sialidasas activas y las trans-sialidasas inactivas. La comparación de la secuencia de la región N-terminal de proteínas de ambos grupos permitió deducir que la sustitución Tyr-His en la posición 342 de la proteína madura determina su capacidad de actuar como trans-sialidasa. Esta tirosina es imprescindible para que la molécula pueda actuar como enzima y su reemplazo por histidina, residuo presente en los integrantes de la familia sin actividad enzimática, determina la pérdida total de la capacidad trans-glicolítica. Además de la Tyr342,otro aminoácido, Pro231, también es necesario para la actividad enzimática: el cambio Pro231Ala resulta en una trans-sialidasa parcialmente activa con respecto a la enzima natural. Se examinó la capacidad de las proteínas inactivas para unir ácido siálico y galactosa en un ensayo de aglutinación y se comprobó que las trans-sialidasas enzimáticamente inactivas aglutinan glóbulos rojos desialidados que presentan betagalactosas terminales, la misma especificidad que requiere la enzima. La trans-sialidasa podría definirse como una sialidasa particular. En lugar de hidrolizar ácido siálico lo transfiere preferencialmente a beta-galactosas terminales presentes en glicoproteínas y glicolípidos y difiere de las sialil y glicosil-transferasas conocidas en que no requiere un nucleótido-azúcar como dador. De los 16 aminoácidos que constituyen el sitio activo de la sialidasa de Salmonella typhimurium, 14 aminoácidos, incluyendo la Tyr342, están presentes en las mismas o en similares posiciones en la estructura primaria de la trans-sialidasa. Tryparzosoma rangeli, parásito de origen americano no patógeno para el hospedador humano, libera al medio una sialidasa cuya secuencia primaria es 70 % homóloga a la trans-sialidasa de T. cruzi La estructura cristalográfica de la sialidasa obtenida en nuestro laboratorio permitió obtener el modelo de la trans-sialidasa. La comparación de ambas estructuras permitió la identificación de unos pocos aminoácidos que modularían la actividad de transferencia. Los experimentos de mutagénesis dirigida sugirieron la presencia de un sitio distinto de unión para el carbohidrato aceptor del grupo sialilo, y una probable diferencia en la arquitectura de ambos sitios activos.

Abstract:
Trypanosoma cruzzi is the protozoan haemoflagelate responsible for Chagas’ disease, which affects almost 18 million people in America, as reported recently by the World Health Organization (WHO, 1998). T. cruzzi trypomastigotes acquire sialic acid from host glycoconjugates by means of a plasma membrane associated trans-sialidase, as it is unable to synthesize this sugar. This enzyme differs from all other known sialyl- and glycosyl- transferases in that it does not require a nucleotide sugar as donor. It has been involved in key aspects of parasite’s infection and survival. This enzyme belongs to a large family of proteins encoded by at least 140 genes. These proteins contain the enzymatic region at the N-terminus, the only one required for trans-sialidase activity and an antigenic domain on the C-terminus. Some members of the family lack the enzymatic activity. Gene encoding inactive members are not a few, but rather are present in the same copy number, 60-80 per haploid genome, as those encoding active trans-sialidase. The complete sequences of the enzymatic region of active an inactive members were compared and it showed a limited divergence among them: 20 out of the 642 amino acids in the region were found to differ. From these 20 amino acids, only one was found to be essential for enzymatic activity. A Tyr residue at position 342 of the mature protein is deduced in active proteins while an His at the same position is present in inactive ones. This naturally occurring Tyr324His substitution completely abolished trans-sialidase activity. In addition to Tyr, a second amino acid, Pro231, was found to be necessary for full enzymatic activity. A Pro231Ala change rendered the trans-sialidase protein partially active. Recombinant inactive proteins were purified and assayed for sialic acid and galactose binding activity in agglutination tests. The enzymatically inactive trans-sialidases were found to agglutinated de-sialilated erythrocytes but not untreated red blood cells. Assays made with mouse and rabbit red blood cells suggest that inactive trans-sialidases bind to beta, rather than alpha terminal galactoses, the same specificity required by active trans-sialidases. At least some molecules in the trans-sialidase family that have lost their enzymatic function still retain their Gal-binding properties and might have a function as lectins in the parasite-host interaction. The trans-sialidase could be defined as a particular sialidase that, instead of hydrolyzing sialic acid, it preferentially transfers the monosaccharide to a terminal beta-galactose in glycolipids and glycoproteins. Fourteen amino acids residues, including Tyr342, out of the 16 amino acids that build the active site of the sialidase from Salmonella typhymurium, are present at the same or similar positions in the primary structure of trans-sialidase. The crystal structure of the sialidase from the closely related American trypanosome T. rangeli allowed the modeling of T. cruzi trans-sialidase. Comparison of these structures allowed the identification of few amino acids that may modulate transferase activity. Mutagenesis experiments suggest the presence of a distinct binding site for the acceptor carbohydrate and different arquitectural arrangements of both active sites.

Mazzobre, María Florencia. "Propiedades de no equilibrio en sistemas vítreos y sobreenfriados en relación con la estabilidad enzimática" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo del presente trabajo fue analizar propiedades de no equilibrio en sistemas amorfos o sobre-enfriados obtenidos por liofilización o congelación (transición vítrea (Tg), cristalización de hielo o azúcar, propiedades de sorción) y su influencia sobre la estabilidad enzimática (β-galactosidasa). Se estudió en particular el impacto de la cristalización de la matriz sobre la capacidad protectora de azúcares en sistemas de baja humedad. La estabilidad enzimática se vio afectada por cambios moleculares independientes de Tg en matrices vítreas y por la cristalización del azúcar en estado sobreenfriado. Los azúcares no reductores trehalosa y rafinosa en estado amorfo ofrecieron mayor protección que las matrices poliméricas de Tg más elevada, lo cual sugiere un mecanismo de protección no relacionado con el estado físico del medio pero sí con interacciones intermoleculares específicas. La dependencia de la cinética de inactivación enzimática y de la cristalización de azúcar con la temperatura se pudo describir con las ecuaciones de Arrhenius, VTF y WLF, empleando los coeficientes adecuados. El uso de excipientes como azúcares, sales o polímeros permitió retrasar la cristalización de azúcares o la formación de hielo y extender el efecto protector a la zona de liquido sobreenfriado. Tanto la inactivación enzimática en matrices vitreas como el retraso de la cristalización de hielo o azúcar se asociaron con cambios microestructurales (a nivel molecular) no relacionados con cambios en el valor de Tg del sistema (nivel supramolecular). Los mecanismos por los cuales los azúcares y las sales retrasan la cristalización del azúcar, analizados por la ecuación de JMAK, serían distintos.

Abstract:
The objective of present work was to analyze several non-equilibrium properties in amorphous or supercooled liquid systems prepared by freeze-drying or freezing (glass transition (Tg), ice or sugar crystallization, sorption properties) and their influence on enzyme stability ((β-galáctosidase). The impact of crystallization on the protective effect of sugars in low moisture systems was particularly investigated. Enzyme stability was affected by molecular changes, not related with Tg in the glassy matrices, and by sugar crystallization in the supercooled region. The stability in the reducing sugars trehalose and raffinose, was better than in the polymeric matrices of higher Tg, indicating that the protective mechanism was more related with specific molecular interactions than with physical properties of the system. Arrhenius, VTF and WLF equations described fairly well the temperature dependence of both, the kinetic of enzyme inactivation and sugar crystallization, using the adequate coefficients. The addition of sugars, salts or polymers promoted a delay on sugar or ice crystallization, being the protective effect extended to the supercooled region. Enzyme inactivation in glassy systems and the delay on sugar or ice crystallization were associated with microstructural changes (at a molecular level) not related with changes of the Tg value (supramolecular level). However, the mechanisms by which sugars or salts delay sugar crystallization (analyzed using equation JMAK),seem to be different.

Levi, Valeria. "La estabilidad térmica de la bomba de calcio de membrana plasmática" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estudio estructural y funcional de las proteínas de membrana se ve dificultado por la gran complejidad de los sistemas en las cuales éstas se hallan insertas, y porque, en general, estas proteínas se inactivan espontáneamente. La estructura tridimensional de una proteína está determinada por la interacción entre los grupos que componen la cadena polipeptídica, y entre estos grupos y el medio en el cual se halla inserta. Estas fuerzas intra e intermoleculares también definen su estabilidad. Además, para que una proteína cumpla su función biológica, se requiere que conserve su estructura nativa. Estas observaciones muestran una estrecha relación entre la estructura, la estabilidad y la función de las proteínas, y sugieren que se pueden evaluar características estructurales y funcionales de las mismas a partir del estudio de su estabilidad. Este enfoque fue empleado en el estudio de la bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA), una proteína integral de membrana, de Mr 134000, responsable del transporte de Ca2+ hacia el exterior de células eucariotas. La energía requerida para esta función proviene directamente de la hidrólisis del ATP. En una primera etapa, determinamos que la pérdida espontánea de la actividad Ca2+-ATPasa de la bomba de calcio purificada y reconstituida en micelas de fosfolípidos y detergente, sería consecuencia de la desnaturalización de la proteína. La inactivación siguió una cinética de pseudo-primer orden, que estaria asociada a una transición entre dos estados y ocurriría a través de un único mecanismo en el intervalo 33-45 °C. Dado que el proceso es irreversible, el coeficiente cinético de la inactivación es inversamente proporcional a la estabilidad de la enzima. Una vez caracterizado este proceso, estudiamos los cambios en la disposición estructural de la enzima durante la desnaturalización térmica. Para ello empleamos un análisis combinado que incluyó el análisis de la fluorescencia de un conjunto de sondas específicas y ensayos de actividad enzimática. Establecimos que el dominio de unión a calmodulina se desnaturaliza antes que el dominio catalítico, en tanto que el dominio transmembránico permanece plegado durante la desnaturalización térmica. Como la función vinculada a los distintos dominios es afectada por ligandos específicos de la enzima, exploramos el efecto de éstos en la estabilidad. Determinamos que Ca2+, calmodulina y un análogo no hidrolizable del ATP estabilizan al dominio catalítico. Exploramos además el efecto de un ligando cuya relevancia sobre la estructura y función de la bomba no ha sido determinada, i.e., la propia bomba de calcio. La dimerización fue caracterizada empleando la transferencia de energía entre la bomba de calcio marcada con la sonda fluorescente FITC y la marcada con EITC. El mecanismo molecular de la dimerización fue estudiado determinando la eficiencia de la transferencia de energía entre FITC-PMCA y EITC-PMCA luego de desplegar distintas regiones de la enzima. Estos ensayos permitieron definir que la dimerización involucra la interacción entre el dominio de unión a calmodulina y dos segmentos de la bomba a las cuales se une el péptido C28W cuya secuencia se encuentra incluida en la del mencionado dominio. La relevancia biológica del proceso de dimerización fue estudiada determinando la dependencia de la estabilidad de la bomba de calcio con su concentración. El análisis teórico de los resultados obtenidos permitió determinar que la estabilidad de la bomba de calcio dimérica es 200 veces mayor que la monomérica. La estructura y función de las proteínas de membrana se encuentran íntimamente relacionadas con los sistemas micelares en el cual se hallan insertas. Por este motivo, exploramos la dependencia de la estabilidad de la bomba purificada con la composición de las micelas. Basándose en los resultados obtenidos en tres sistemas micelares diferentes, postulamos un modelo que propone que la estabilidad de la enzima aumenta a medida que la monocapa de anfifilos que recubre la superficie hidrofóbica del dominio transmembránico se enriquece en fosfolípidos. La composición de la monocapa está relacionada con la afinidad de los fosfolípidos respecto a la del detergente por esta superficie (KLD). Desarrollamos un método que permite determinar KLD utilizando transferencia de energía entre los residuos triptofano de la PMCA y un fosfolípido marcado con pireno. Los valores de KLD obtenidos por este procedimiento son consistentes con los determinados a partir del modelo. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis sugieren que el estudio de la estabilidad de proteínas podría constituir una metodología general de gran utilidad para explorar aspectos estructurales y funcionales de una amplia gama de proteínas.

Abstract:
Structural and functional studies on membrane proteins are limited by the complexity of the micellar system in which these proteins are inserted. In addition, these proteins undergo spontaneous inactivation. Protein structure is determined by intra and intermolecular forces that also define its stability. Moreover, the proteins are biologically functional only if they preserve their native structure. These observations show the close relation among structure, stability and function, and suggest that structural and functional characteristics of a protein could be evaluated from stability studies. This approach was applied to an integral membrane protein, i.e., the plasma membrane calcium pump (PMCA) reconstituted in mixed micelles of phospholipids and detergent. This protein of Mr 134000 is responsible for the active Ca2+ transport through the membrane to the external milieu in the eukaryotic cells. Initially, we characterized the spontaneous lost of the Ca2+ ATPase activity, and determined that this process is a consequence of the enzyme denaturation. The inactivation followed a first-order kinetics that could be associated with a transition between the native and the denatured states with a common mechanism in the range 33-45 °C. Since this process was irreversible, the kinetic coefficient of the enzyme inactivation provides a measure of the enzyme stability. The structural domain organization of the enzyme was studied by using a combined spectroscopic and kinetic approach that allows the parallel evaluation of the structural and functional changes occurring at specific regions of the protein. We established that the calmodulin-binding domain unfolds earlier than the catalytic domain while the transmembrane domain remains folded during thermal inactivation. Since specific ligands of the pump affect the enzyme function, we explored their effects on protein stability. We determined that Ca2+, calmodulin and a nonhydrolyzable analog of ATP increased the enzyme stability. In addition, we studied the effects of the plasma membrane calcium pump self-association on the structural stability of the enzyme. Energy transfer measurements between the enzyme labeled with the fluorescent probes FITC and EITC were employed to evaluate the dimer and monomer distributions as a function of the total enzyme concentration. The enzyme thermal stability was assayed at different dimer/monomer ratios and analyzed in terms of a model that considers the equilibria among dimers, monomers and mixed dimers formed by a thermal-inactivated and an active monomers. Each of these species is inactivated following an irreversible step. The dimer stability was 200 fold higher that the stability of the monomeric enzyme indicating that thermal inactivation of the calcium pump proceeds mainly through the monomeric pathway. To explore the molecular mechanism of dimerization, energy transfer efficiency was determined after the unfolding of different enzyme domains by using different thermal treatments. We demonstrated the existence of two regions involved in the self-association process: the calmodulin-binding domain and the C28W-binding regions. The structure and the function of membrane proteins are intimately related to the micellar systems in which they are inserted. Therefore, we studied the calcium pump thermal stability in three micellar systems. The obtained results were explained in terms of a model that considers that thermal stability of the pump depends on the composition of the amphiphile monolayer directly in contact with the transmembrane protein surface. Application of this model shows that the maximal pump stability is attained when 80% of this surface is covered by phospholipids. This analysis also provides an indirect measure of the relative affinity phospholipid/detergent for the hydrophobic transmembrane surface of the protein (KLD) showing that those phospholipids with higher affinity provide greater stability to the Ca2+ pump. KLD values obtained by this procedure agreed with those obtained by measuring fluorescence resonance energy transfer from the protein tryptophan residues to a pyrene-labeled phospholipid. In summary, the results shown in this thesis, suggest that the study of protein stability could constitute a general methodology to explore structural and functional properties of membrane proteins.

Scassa, María Elida. "Mecanismos de acción de la insulina en la represión de la transcripción : el gen de la 5-aminolevulinato sintetasa como modelo experimental" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La insulina desempeña un papel clave en la regulación de múltiples procesos celulares. La unión de la hormona a su receptor en la superficie celular activa la actividad intínseca de quinasa de tirosinas del mismo, ocasionando la autofosforilación del receptor y la fosforilación de sustratos intracelulares denominados IRSs. Los IRSs actúan como moléculas adaptadoras en la transducción de señales, reclutando a una gran variedad de proteínas que contienen dominios de homología Src (SH2), entre ellas: la subunidad regulatoria (p85) de la PI3K a la “growth factor receptor binding protein 2”(Grb2). Este evento conduce a la activación de las cascadas de la PI3K y de Ras/MAPK, respectivamente. En el presente trabajo hemos examinado la acción de la hormona peptídica sobre la expresión del gen de la 5-aminolevulinato sintetasa (ALAS) en hepatocitos de rata y en células de hepatoma humano HepG2. La ALAS es la primera enzima y regulatoria de la biosíntesis del hemo, su nivel es normalmente bajo en el hígado pero se incrementa marcadamente en respuesta a drogas porfirinogénicas como el fenobarbital. El tratamiento con insulina 5nM produjo una notable disminución en los niveles del mRNA de ALAS tanto en condiciones basales como de estimulación con fenobarbital. Este efecto fue dosis dependiente como pudo observarse mediante ensayos de Northern y slot blot. Por otra parte la vida media del mRNA de ALAS no fue modificada por la presencia de la hormona lo que sugiere que la acción ejercida por la insulina sería relevante a nivel transcripcional. Con la finalidad de determinar la actividad transcripcional del promotor, realizamos una construcción (pACAT) que contiene 876 pb de la región 5’ flanqueante del gen de ALAS dirigiendo la expresión de la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT). En cotransfecciones transientes de células HepG2 observamos una significativa disminución de la actividad CAT cuando se incubaron las células con la hormona. Considerando estos resultados, utilizamos dos metodologías diferentes para caracterizar las vías de transducción de señales involucradas en la represión hormonal de ALAS. En un primer abordaje empleamos agentes químicos, permeables a la membrana plásmatica, que inhiben específicamente a proteínas intermediarias de la señalización de insulina, para evaluar la contribución de estos efectores a la respuesta final. Los inhibidores de la PI3K (wortmanina y LY294002), de la famesilación de Ras (lovastatina y PD152440) y de MEK (PD98059) abolieron la acción de la insulina, mientras que el inhibidor de mTOR/p70RSK (raparnicina) no tuvo efecto alguno sobre la represión hormonal. Por otra parte, analizamos el efecto de la sobrexpresión de formas dominantes negativas o constitutivamente activas de intermediarios de las vías de Ras/MAPK y de la PI3K para evaluar el papel de estas cascadas en la inhibición transcripcional de ALAS. La cotransfección de células HepG2 con versiones dominantes negativas de SOS, Ras, Raf, MEK y MAPK interfirió la acción de la insulina, mientras que la cotransfección con formas constitutivamente activas de Ras, MEK y p90RSK mimetizó la inhibición hormonal per se, independientemente del estímulo en el receptor. Un comportamiento similar se obtuvo cuando empleamos versiones dominantes negativas de PI3K y PKB o a la PKB miristoilada, respectivamente. Estos resultados nos permiten proponer que la señalización a través de ambas vías es requerida para obtener la totalidad del efecto final. Por último, la regulación hormonal fue mediada por un fragmento de ll7 pb (-469/354) del gen de ALAS, capaz de conferir sensibilidad a insulina cuando fue subclonado río arriba del promotor heterólogo de la quinasa de tímidina (pALIRE). Esta región presenta la secuencia GTTTTG, muy similar al IRE canónico reportado para genes reprimidos por la insulina, que resultó crucial para la inhibición. En EMSAs pudo observarse la formación de complejos por unión a secuencias con alta homología a las de HNF3 y NF1 presentes en esta región. Todos estos hallazgos sugieren que la insulina requiere la acción orquestada de efectores celulares (intermediarios de las cascadas Ras/MAPK/p90RSK y PI3K/PKB) y de factores de transcripción que reconocen secuencias específicas y abre la posibilidad de considerar que miembros de las familias HNF3 y NF1 podrían intervenir en la respuesta.

Abstract:
Insulin plays a key role in regulating a wide range of cellular processes. The binding of insulin to its cell surface receptors activates their intrinsic tyrosine kinase activity leading to receptor autophosphorylation and phosphorylation of citosolic proteins known as IRSs, which serve as adapters in intracellular signaling. IRS binds a variety of Src homology 2 (SH2) domain containing proteins, when specific tyrosines are phosphorylated, including the regulatory subunit of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and the growth factor receptor binding protein 2 (Grb2). This give rise to the activation of PI3K and Ras, and hence to the activation of serine/threonine protein kinases. We have explored the action of the peptidic hormone on 5-aminolevulinate synthase (ALAS) gene expression in rat hepatocytes and HepG2 cells. The ALAS is the first enzyme in the heme biosynthetic pathway and in liver at least is rate limiting, its level is normally very low in hepatocytes but is greatly increased in response to the addition of certain porphyrinogenic drugs such as phenobarbital. Treatment with 5 nM insulin led to a significant decrease of both basal and phenobarbital induced ALAS mRNA, in a dose dependent manner as measured by Northern and slot blot. Moreover ALAS mRNA half life was not modified by the presence of the hormone, suggesting that insulin plays an important role in regulating ALAS gene transcription. In a different approach, we fused a 876 bp fragment corresponding to the 5' flanking region of the hepatic rat ALAS gene to the bacterial reporter gene for CAT, to determine promotor activity. CAT activity was highly impaired in HepG2 cells transiently transfected with this fusion gene (pACAT plasmid) when treated with insulin as measured by CAT assay. In view of the preceding findings we undertook the present work to characterize the signal transduction pathways involved in insulin inhibition of ALAS gene expression. We used small cell permeant molecules that are specific inhibitors of particular proteins involved in insulin signaling to asses the contribution of these effectors to the hormonal regulation. Inhibitors of PI3K (wortmannin and LY 294002 ), Ras famesylation (lovastatin and PD 152440) and MEK (PD 98059) abolished insulin inhibition, however, inhibitor of mTOR/p70RSK (rapamycin) had no effect upon insulin action. To examine the role of the Ras/MAPK and PI3K pathways in insulin signaling relevant to ALAS inhibition we determined the effects of dominant negative and dominant active forms of regulatory enzymes involved in these cascades. Cotransfection of HepG2 cells with dominant negative forms of SOS, Ras, Raf, MEK and MAPK interfered inhibition by insulin, while cotransfection with dominant active forms of Ras, MEK and p90RSK mimicked the hormone action per se, independently of signaling input. A similar behaviour was observed with dominant negative versions of PI3K and PKB and myristoilated PKB, respectively. With the present results we propose that signaling through the PI3K and the Ras/MAPK cascades are required for insulin inhibition of ALAS gene expression. Finally, the regulation by insulin was mediated by a ll7 bp fragment (-469/—354), which confered hormonal sensitivity to the heterologous thymidine kinase promotor in transient transfection assays in HepG2 cells. EMSAs showed that multiple nuclear proteins bind to this region at conserved HNF3 and NF1 sequences. Taken together, these results suggest that the effect of insulin is due to a complex interplay of effectors (PI3K/PKB and Ras/MAPK/p90RSK cascade intermediaries) and of transcription factors, and underline the contribution of HNF3 and NF1 like proteins.

Gallo, Mariana. "Desarrollo de oligonucleótidos modificados químicamente con potencial aplicación en terapia génica" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Dentro del campo de la Terapia Génica, el concepto de oligonucleótidos como potenciales agentes terapéuticos ha ganado credibilidad y atención. El fundamento de la estrategia antisentido consiste en inhibir selectivamente la expresión de un determinado gen, impidiendo asi la producción de una dada proteína mediante la acción de un oligonucleótido de secuencia complementaria al ARN mensajero que codifica para esa proteina. Dentro de este enfoque, las ribozimas, moléculas de ARN con una secuencia de bases y una estructura tridimensional definidas y que presentan actividad enzimática, aparecen como una alternativa interesante, ya que permiten incorporar a la acción antisentido de los oligonucleótidos su actividad catalitica. Debido a que los oligonucleótidos son degradados rápidamente por nucleasas presentes tanto en suero como intracelularmente, surge la necesidad de modificados químicamente, lo cual permite obtener drogas con tiempos de vida medio adecuados. En el caso particular de las ribozimas y otros análogos de ARN, es importante que las modificaciones introducidas no afecten los requerimientos estructurales para la actividad o función particular de estas moléculas. Entre las diversas modificaciones desarrolladas, las modificaciones en la posición 2’ demostraron ser de utilidad. La presencia del hidroxilo-2’ probó ser de suma importancia en determinadas posiciones para el correcto plegamiento de las moléculas de ARN. Debido a que ninguna de las modificaciones desarrolladas en la posición 2' mantiene esta función, la utilización de una nueva generación de oligonucleótidos modificados en la posición 2' del azúcar que conserven esta función resulta atractiva y prometedora para el diseño de ribozimas estables en medios biológicos. Aquí se propone, por lo tanto, una nueva clase de nucleótidos modificados, los 2'—C-metilnucleótidos, potencialmente útiles para ser incorporados en determinadas posiciones de análogos de ARN resistentes a la degradación por nucleasas. Se espera que cuando un 2'—C-metilnucleótido sustituya un ribonucleótido particular proveerá un hidroxilo-2' disponible para reproducir las interacciones terciarias del ARN; mientras que la presencia del metilo, brindará resistencia a la degradación mediada por nucleasas. En este trabajo, se sintetizó la 2'—C-metiluridina siguiendo una ruta estereoselectiva, así como también, la fosforamidita adecuada para la sintesis automatizada de oligonucleótidos, incluyendo la protección regioselectiva del grupo hidroxilo-2'. Asimismo, se realizó un estudio confonnacional de la 2'-C-metiluridina en solución por RMN y se comparó con resultados obtenidos por cálculos computacionales. Los resultados mostrarón que la conformación preferida de este nucleósido es la misma que la de la uridina natural, con lo cual ambas moléculas posicionarían el hidroxilo-2' con la misma orientación. Con el fin de ensayar la hipótesis de la aplicabilidad de la nueva modificación, se eligió como modelo biológico la ribozima cabeza de martillo. Un estudio preliminar usando modelado molecular sugirió que la introducción de estos monómeros en las posiciones de esta ribozima para las cuales se había detectado que sus hidroxilos-2' tenían interacciones de orden terciario no parecía afectar la conformación global de la ribozima, excepto en una posición particular. La 2'-C—metiluridina fue, entonces, introducida en ribozimas cabeza de martillo dirigidas contra la región 5'-lider/gag del virus HIV-1 en las posiciones de la uridina del core catalítico cuyos hidroxilos-2' demostraron ser importantes. Las ribozimas resultaron ser activas y tener una incrementada estabilidad frente a nucleasas. Tambien se midió la afinidad por hebras complementarias de DNA y de RNA de oligodesoxinucleótidos conteniendo uridina, la nueva modificación o la (2’S)-2'-desoxi-2’-C-metiluridina.

Abstract:
Oligonucleotides have gained credibility and attention as potential therapeutic agents based on the gene therapy principle. The fundament of the antisense strategy consists in the selective inhibition of the gene expression by means of an oligonucleotide carrying a complementary sequence to that of the mRNA that codifies for the target protein. In particular, ribozymes, RNA molecules with a defined sequence and three-dimensional structure that show enzymatic activity; appear as an interesting alternative, due to the fact that they combine the antisense action with a catalytic activity. Since oligonucleotides are rapidly degraded by nucleases present both, in serum and intracellularly, it is mandatory to chemically modify them in order to obtain drugs with proper half life times. In the case of ribozymes and other RNA analogues, additional structural requirements must be taken into account in order to preserve activity or a particular function. Among the modifications developed so far, those involving the 2'-position proved to be useful, but they lack the 2'-hydroxyl group. The presence of this function showed to be of great importance for the correct folding of RNA molecules. Therefore, the development of a new generation of 2'-modified oligonucleotides carrying the 2'-hydroxyl is a promising alternative for the design of resistant ribozymes. Having in mind this goal, a new kind of analogues is proposed in this work, the 2'-C-methylnucleotides. They are expected to be potentially useful for generating RNA mimics resistant to the degradation by nucleases. This assumption is based on the hypothesis that when a 2'-C-methylnucleotide substitutes a particular ribonucleotide, it will provide a 2'-hydroxyl group available for reproducing RNA tertiary interactions; and additionally, the presence of the 2’methyl group will bring resistance to degradation mediated by nucleases. The 2'-C-methyluridine was syntehsized by a stereoselective strategy, the 2'-hydroxyl group was regioselectively protected and the corresponding phosphoramidite for solid phase synthesis of oligonucleotides was prepared. In addition, a conformational study of the 2'-C-methyluridine in solution was carried out by RMN techniques and these data were compared with those obtained by computational calculations. The results showed that the preferred sugar conformation of this nucleoside is the same than the one adopted by the natural uridine, and therefore, it is expected that both molecules will position the 2'-hydroyl group with the same orientation. With the aim of testing our hypothesis, the new monomer was introduced in the catalytic core of a hammerhead ribozyme in those positions where the 2'-hydroxyl group showed to be important for the activity. The ribozymes were targeted against the 5'-lider/gag region of the HIV-1. The modified ribozymes were active in vitro and displayed an increased resistance to nucleases. The affinity for RNA and DNA complementary sequences of oligonucleotides containing the new modification and the (2'S)-2'deoxy-2'-C-methyluridine is also reported.

Scherlis Perel, Damián Ariel. "Simulación de reactividad química en hemoproteínas" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El trabajo de tesis puede subdividirse en dos incisos generales: el desarrollo de técnicas de simulación computacional orientadas al tratamiento de los efectos del entorno en sistemas moleculares de gran tamaño, y la aplicación de estas y otras metodologías de cálculo a diversos problemas atenientes a la reactividad de las hemoproteínas. En relación con el primer ítem, se halla la implementación de un método híbrido que combina el cálculo de estructura electrónica con un campo de fuerzas clásico, introduciendo de manera autoconsistente en el hamiltoniano mecanocuántico el potencial electrostático proveniente de una distribución de cargas parciales. Esta clase de técnicas, denotada habitualmente con las siglas QM-MM (Quantum Mechanics-Molecular Mechanics), resulta útil para el estudio de los efectos del entorno, por ejemplo un solvente o una proteína. La implementación del método híbrido fue realizada sobre el programa SIESTA, un algoritmo de cómputo basado en la teoría de los funcionales de la densidad (DFT) que utiliza funciones de base numéricas y pseudopotenciales. En lo que respecta al segundo inciso, se realiza en primer término un estudio metodológico tendiente a evaluar la aptitud de los diferentes tratamientos mecanocuánticos para describir la configuración electrónica de las metaloporfirinas. Seguidamente la investigación se focaliza sobre tres problemas específicos: (i) inhibición del citocromo P450 por el óxido nítrico; (ii) relación entre la afinidad por el oxígeno molecular y las uniones hidrógeno en la cavidad distal de la hemoglobina; (iii) modulación del efecto trans negativo del NO en el sitio activo de diferentes hemoenzimas, y sus implicancias en la activación de la guanilato ciclasa. A través de estos ejemplos se realiza una lectura microscópica de la actividad de las hemoproteínas, de sus propiedades reactivas, y de la modulación que sobre el sitio activo ejerce el entorno. Se estudian los efectos de los residuos proximales y distales, y se caracterizan distintos aspectos energéticos, estructurales y electrónicos que contribuyen a la interpretación de observaciones experimentales.

Abstract:
This thesis has two main goals: the development of computer simulation schemes to model environment effects in large systems and the application of these techniques to the investigation of chemical reactivity in heme proteins. Regarding the first goal, we have implemented a hybrid methodology combining an electronic structure calculation with a classical force field, including the electrostatic effects of the classical subsystem self-consistently in the Hamiltonian of the quantum subsystem. This kind of techniques, known usually as QM-MM (Quantum Mechanics- Molecular Mechanics), are specially useful to model environment effects in solution and in proteins. We have employed the SIESTA pseudopotential numerical basis set implementation of density functional theory (DFT) to describe the quantum subsystem, due to its computational performance. The implemented computational schemes have been used to investigate the following problems: (i) inhibition of cytochrome P450 by nitric oxide; (ii) role of hydrogen bonding in oxygen affinity of hemoglobins; (iii) modulation of nitric oxide negative trans effect in the active site in different heme proteins and its connection with the activation of guanylate cyclase. Through these examples, we have tried to provide a microscopic insight of the role of the environment on the chemical reactivity of heme proteins. We have investigated the effects of the distal and proximal residues, characterizing structural and energetical parameters which contribute to the interpretation of experimental results.

Chiocconi, Alejandro Andrés. "Síntesis de desoxi-ß-D-galactofuranósidos. Su uso para estudios de especificidad de exo ß-D-galactofuranosidasa" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La síntesis de desoxiazúcares es un tema de gran interés no sólo por ser éstos componentes de productos naturales, sino por considerarlos como herramientas para estudios relacionados con la actividad de enzimas. La bibliografía es extensa en desoxiazúcares piranósicos, que han sido utilizados para determinar la especificidad de glicosidasas y glicosiltransferasas, y por su potencial como inhibidores de esas enzimas. Los monosacáridos más comunes como glucosa, galactosa y manosa se encuentran sólo en configuración piranósica en células de mamíferos, de ahí el interés por la síntesis de desoxiazúcares en esa configuración. Sin embargo en las últimas décadas se ha encontrado que la β-D-galactofuranosa es constituyente de glicoconjugados muy importantes de la superficie de microorganismos patógenos, entre ellos Trypanosoma cruzi y Mycobacterium tuberculosis. Las enzimas responsables del metabolismo de la galactofuranosa, como las galactofuranosidasas y las galactofuranosiltransferasas son un buen blanco para el diseño de inhibidores que afectarian la viabilidad de los microorganismos sin afectar al mamífero infectado que no tiene glicoconjugados con galactofuranosa. En este trabajo de tesis de doctorado se han sintetizado por primera vez β-D-galactofuranósidos desoxigenados en las posiciones 2, 3 ó 6, y se ha utilizado como compuesto de partida a la D-galactono-1,4-lactona, que es un producto comercial, buen precursor del anillo furanósico y da lugar a sustituciones selectivas. Se han caracterizado los desoxiazúcares y sus precursores y se han utilizado los β-D-glicósidos para investigar su capacidad de actuar como sustratos de una exo β-D-galactofuranosidasa de Penicillium fellutanum. Esta enzima es un buen modelo pues es secretada al medio por un microorganismo no patógeno, y la producción y purificación de la enzima se han optimizado en nuestro laboratorio. Se ha determinado en este trabajo de tesis que ninguno de los derivados desoxigenados es sustrato de la enzima, o sea que los hidroxilos de C-2, C-3 y C-6 de la D-galactofuranosa son importantes para la interacción con el sitio activo.

Abstract:
The synthesis of deoxysugars is an area of great interest as components of natural products and as tool for studies related with the activity of enzymes. The common monosaccharides, glucose, mannose and galactose are present in mammal cells only in the pyranosic configuration, thus the interest for the synthesis of deoxysugars in this configuration. However. in the last decades it was reported that β-D-galactofuranose is constituent of important glycoconjugates of the surface of patogenic microorganisms such as Trypanosoma cruzi and Mycobacterium tuberculosis. The enzymes responsible for the metabolism of galactofuranose, like galactofuranosidases and galactofuranosyltransferases are good targets for the design of inhibitors that would affect the viability of the microorganisms without effect on the infected mammal, who lacks glycoconjugates with galactofuranose. In the present doctoral thesis, β-D-galactofuranosides deoxygenated in positions 2, 3 or 6 have been synthesized for the first time. As starting material, D-galactono- 1,4-lactone, commercially available, that may be selectively substituted, was used as a good precursor of the furanosic ring. The deoxysugars and their precursors have been characterized, and the β-D-glycosides have been used to study their suitability as substrates for the exo β-D-galactofuranosidase of Penicillium fellutanum. This enzyme is a good model because P. felutanum is a non pathogenic microorganism, the enzyme is secreted to the medium and its production and purification have been optimized in our laboratory. It was found that none of the deoxygenated compounds are substrates for the enzyme, that is that the hydroxyls of C-2, C-3 and C-6 of D-galactofuranose are important for interaction with the active site.

Ferreiro, Diego U.. "Mecanismo de unión a ADN del dominio C-terminal de la proteína E2 del papilomavirus humano, principal regulador de la expresión génica viral" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La interacción proteína-ADN juega un papel central en la fisiología celular. Dentro de éstas, se identifica al reconocimiento secuencia especifico con un rol regulatorio clave, pues de éstas interacciones depende la orquestación de los patrones de expresión génica de un organismo. Utilizando el dominio de unión a ADN del factor de transcripción E2 del papilomavirus humano, nos propusimos analizar la interacción en condiciones en las cuales fuera posible extraer datos fisicoquímicos precisos del proceso de unión. Confiamos en que la interpretación de éstos en términos termodinámicos provee un marco para relacionar las estructuras proteicas con su funcionalidad biológica Caracterizamos un mecanismo de unión E2c-ADN al equilibrio en el cual E2c presenta dos modos diferentes de unión de ADN diferentes. Estos modos resultan estar estrechamente relacionados con la ocurrencia de poblaciones conformacionales del estado plegado de E2c. Mostramos ademas que ésto no sucede en un homólogo cercano con el que comparte una alta identidad de secuencia y una topología de plegamiento idéntica, sugiriendo que ésto puede estar relacionado con los distintos roles funcionales que E2c presenta. El camino cinétíco de interacción E2c-ADN se inicia con una colisión rápida, limitada por la difusión de las macromoléculas en solución. Esto da lugar a un "complejo de encuentro" estabilizado por interacciones electrostáticas, en el cual E2c tiene la posibilidad de deslizarse sobre la doble hélice. Si el ADN contiene un sitio E2, el complejo sufre fuertes rearreglos conformacionales que, luego de una fase de expulsión de solvente. resultan en la formación de un complejo estable proteina:ADN. Este último paso involucra un ocultamiento de superficie accesible al solvente y es allí donde se consolidan las interacciones cercanas aminoácido-base. Experimentos de doble-mezcla por flujo detenido nos permitieron asignar el orden secuencial de los rearreglos y demostrar que la unión puede también proceder por una ruta macroscópica paralela. caracterizada como de dos estados. Utilizando una estrategia de mutagénesis sitio-dirigida realizamos un mapeo energético de la interfase de unión. Pudimos asignar las contribuciones que cada residuo realiza, en forma aditiva, a la energía libre de asociación. Las asignaciones energéticas resultaron estar en excelente concordancia con las estructuras de alta resolución, y correlacionan con el carácter altamente dinámico de la interfase de asociación. Lon conjuntos de estados de transición del camino cinético fueron analizados con 23 mutantes sitio-dirigidas. Esto nos permitió disectar las contribuciones energéticas de los residuos independientes a nivel atómico e inferir los cambios conformacionales que ocurren durante las etapas de unión y reconocimiento de secuencia. Mostramos que la plasticidad estructural que E2c presenta está íntimamente ligada a su capacidad de reconocimiento sitio-específico. Por último, presentamos un modelo funcional plausible de regular la actividad biológica de E2c y su capacidad de reconocimiento de secuencias de ADN.

Abstract:
Protein-DNA interactions play a central role in cellular physiology. Within these, site specific recognition is a primary topic that underprints the expression profile of whole genomes. Although many biological aspects of these non-covalent interactions are becoming clearer, detailed biophysical understanding of site specific recognition is lacking. Using the human papilomavirus (HPV) E2c transcription factor as a model system we aim a physicochemical dissection of its DNA binding properties. We set-up an spectroscopic binding essay, readily done in solution, which allowed us to quantify DNA binding parameters in energetic terms, detect conformational changes exerted on both macromolecules upon binding and relate them to the high resolution structures available. We characterized an equilibrium DNA binding mechanism where the HPV-16 E2c domain is capable of two distinct binding modes, which correspond to different conformational ensembles of the E2c molecule. Despite having a strong sequence identity and an identical folding topology, a close homolog does not show this behaviour under the same experimental conditions. The differences observed may be related to the distinctive transcriptional roles in which these proteins are involved. The kinetic DNA-binding mechanism is initiated by the diffusion controlled formation of an encounter complex stabilized by electrostatic interactions, in which E2c has the possibility to slide along the DNA duplex. If the target DNA contains an E2-binding site, substantial conformational rearrangements take place, and a solvent exclusion step leads to the formation of a highly stable protein-DNA complex. This last step involves the largest burial of surface area from the interface and the direct readout of the DNA bases is proposed to occur. Double-Jump stopped flow experiments allowed us to characterize the sequence of intermediate events and demonstrate that a last-formed final complex can be formed through a parallel two-state macroscopic route. An extensive site-directed mutagenesis analysis over the entire DNA binding reglon led us assign the energetic contributions of individual sidechains to the overall binding free energy. We show that each sidechain contribute in a small amount to the total free energy in an additive way. These contributions are in excelent agreement with the high resolution structures and correlate with the highly dynamic character of the interface. The transition state ensembles of the kinetic binding pathway were probed with 23 site-directed mutants. This led us to dissect the sidechain energetic contributions at almost atomic resolution, and infer the conformational changes that take place in each kinetic event. We show that the conformational plasticity this protein presents is intimately linked to its DNA recognition capacity. Finally, a plausible biological model for functional E2c regulation and specific DNA recognition is presented.

Turjanski, Adrián G.. "Interacción de la melatonina con radicales libres" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de este trabajo de tesis fue el estudio a nivel molecular de la interacción de la melatonina (N-acetil-S-metoxitriptamina) con dos radicales libres de relevancia biológica, el radical oxhidrilo (OH·) y el óxido nítrico (NO). Para el desarrollo del presente trabajo se analizaron estas interacciones químicas desde un enfoque teórico, mediante técnicas de simulación computacional, desde un enfoque experimental, a través del estudio de las mismas en condiciones aisladas y controladas, y a través de la evaluación de los alcances fisiológicos de las reacciones propuestas. Para evaluar las interacciones con los diferentes blancos se analizó, en primer término, la superficie de energía potencial de la melatonina mediante técnicas de dinámica molécular basadas en campos de fuerzas clásicos y métodos semiempíricos. Se prestó especial atención a los aspectos relacionados con su libertad conformacional en vacío y en solución acuosa. Asimismo, se analizó la dependencia de las propiedades moleculares con la conformación. La reacción con el radical oxhidrilo se estudió mediante técnicas de estructura electrónica, evaluando los posibles mecanismos de reacción y realizando una exhaustiva caracterización de los intermediarios. El estudio de la interacción con NO se puede dividir en dos partes: i) la identificación y caracterización de los productos de reacción y la elucidación de los mecanismos operantes en diversos medios; y ii) el estudio del efecto de la melatonina sobre la biosíntesis de NO en la retina de hámster. Finalmente, mediante el uso de técnicas de resonancia magnética nuclear y de dinámica molecular, se realizó un estudio detallado de la interacción entre la melatonina y la calmodulina, una proteína con probado efecto estimulatorio en la biosíntesis del NO.

Abstract:
The goal of this thesis was the study at a molecular level of the interactions of melatonin (N-Acetyl-5-metoxytriptamine) with two free radicals of biological relevance, hydroxyl (OH·) radical and nitric oxide (NO). The evaluation of the different interactions has been performed by a theoretical approach using molecular modeling tools; through the study of these reactions in isolated and controlled conditions, and finally by the evaluation of their physiological relevance. In order to evaluate the interactions with these different targets, the potential energy surface of melatonin has been analyzed by classical molecular dynamics and semiempirical electronic structure methodologies. Special attention has been paid to the conformational behavior in vacuum and aqueous solution. Moreover, the influence of conformation on several properties has been studied. The reaction with OH· has been analyzed with electronic structure methods. Feasible reaction mechanisms have been evaluated along with a thorough characterization of the intermediates. The research on the interaction with NO consisted of: i) the identification and characterization of the products, and the elucidation of the mechanisms operative in different environments ii) by the analysis of the effect of melatonin on NO biosynthesis in the hamster retina. Finally, by means of nuclear magnetic resonance and molecular dynamics techniques, a detailed study of the interaction of melatonin with calmodulin, a stimulatory protein of NO biosynthesis has been carried out.

Vittori, Daniela Cecilia. "Mecanismos de acción del aluminio sobre la eritropoyesis" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La exposición a aluminio (Al) afecta la eritropoyesis. Sin embargo, poco se conoce acerca de las características de este efecto, así como de los mecanismos involucrados. En el presente trabajo de investigación se planteó, como primer objetivo, la necesidad de caracterizar la anemia producida por sobrecarga oral crónica con Al. Después de ocho meses de tratamiento, los animales desarrollaron anemia no ferropénica. La disminución de la concentración plasmática de haptoglobina, el aumento de reticulocitos y la presencia de esquistocitos apoyan la naturaleza hemolítica de la anemia desarrollada. A causa del tratamiento, se observó una importante inhibición del desarrollo de CFU-E en ensayos ex vivo de células de médula osea. El otro signo notable fue la aparición de severas alteraciones morfolófgicas en eritrocitos de sangre periférica, lo que sugirió una acción directa del A1 sobre las células eritroides maduras. Esa posibilidad fue corroborada en ensayos in vitro de eritrocitos humanos incubados en presencia del metal, en los cuales el rasgo persistente fue la desaparición de la típica forma bicóncava. El aumento de la degradación de la proteína estructural banda 3, observado junto con la detección de depósitos de A1 en la membrana, apoya no sólo la estrecha relación entre la morfología celular y la estructura y organización de la membrana del eritrocito, sino también una acción directa del metal sobre componentes de la membrana. La disminuida respuesta de las células progenitoras CFU-E a la eritropoyetina (Epo), después de la exposición crónica a Al, motivó la investigación de los efectos del metal sobre mecanismos involucrados en la vía de activación del receptor para Epo (EpoR). La exposición a A1 provocó disminución del EpoR a nivel de ARNm y de proteína, hallazgo que coincidió con la anulación del efecto antiapoptótico de la Epo sobre células K562. En la línea UT-7, altamente dependiente de Epo, sólo una exposición crónica a Al modificó la respuesta a la 1a hormona. Después de esa exposición, el aumento del EpoR a nivel de ARNm y de proteína, detectado bajo condiciones de carencia de Epo, sugiere un aumento de la sensibilidad de esta línea celular a1 factor de crecimiento. En conclusión, es evidente que el Al no resulta un elemento inocuo. Actúa sobre el sistema eritropoyético afectando a las células eritroides en distintos estadios de maduración. Los resultados sugieren una acción directa del metal sobre los componentes de la membrana celular de los eritrocitos maduros y un mecanismo de interferencia en distintos caminos de activación de células eritroides inmaduras mediados por la formación del complejo eritmpoyetina-receptor.

Mangone, Constanza Pía. "Biocatálisis en medio orgánico: Lipasas en la preparación de amidas y derivados de vitamina B6. Células enteras en la reducción de compuestos carbonílicos" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Una serie de aciloxi derivados de piridoxina (l), uno de los tres miembros del grupo de la vitamina B6, fueron preparados mediante reacciones de esterificación y transesterificación catalizadas por lipasas en medio orgánico. En las condiciones de trabajo, las lipasas mostraron un comportamiento altamente regioselectivo catalizando la acilación de piridoxina únicamente en la posición 5 del anillo piridínico. La misma clase de selectividad fue observada en la alcohólisis de derivados acetilados de l al emplear la lipasa de Candida antarctica (CAL). La metodología enzimática permitió la síntesis de once nuevos derivados de l, diez de ellos preparados a partir de ácidos grasos. Teniendo en cuenta la actividad tensioactiva, su composición y lo poco contaminante que resulta el método enzimático para su preparación, estos compuestos podrían ser útiles como ingredientes en formulaciones cosméticas o farmacéuticas o bien como aditivos alimentarios. Continuando el trabajo con lipasas, se describe un procedimiento enzimático muy eficiente para la preparación de carboxamidas N-sustituidas a partir de sus correspondientes ácidos carboxílicos. El procedimiento consiste en un solo paso e involucra la formación in-situ del éster etílico y la subsecuente aminólisis del mismo. La metodología resultó aplicable a una gran variedad de ácidos carboxílicos: de estructura lineal, cíclicos, saturados e insaturados, dicarboxílicos, con otros grupos funcionales presentes (hidroxiácidos), etc. Además, la enzima mostró un comportamiento selectivo frente a aminas con más de un grupo fiincional presente. Finalmente, se presenta la reducción enantioselectiva de cetoésteres catalizadas por células enteras. Como biocatalizador se empleó al hongo Mucor rouxii, un microorganismo dimórfico que puede desarrollarse como micelio o como levadura dependiendo de las condiciones de aireación del medio de cultivo. La morfología micelio catalizó el proceso de manera eficiente únicamente en agua, mientras que las levaduras, resultaron activas tanto en agua como en solventes orgánicos. Las esporas, producidas por el hongo como mecanismo de defensa y de preservación, también resultaron catalizadores eficientes y estereoselectivos del proceso reductivo. Asimismo, las técnicas de secado del microorganismo (liofilización y secado por corriente de aire caliente) resultaron muy convenientes para la conservación de la biomasa de Mucor rouxii. Las células de levadura liofilizada, rehidratadas en un pequeño volumen de agua, mantuvieron la misma eficiencia y selectividad en las reducciones en medio orgánico que los cultivos frescos durante al menos 4 meses.

Abstract:
A series of acyloxy derivatives of pyridoxine (1), one of the three members of Vitamin B6 group, has been prepared by lipase-catalyzed esterification and transesterification reactions of l with carboxylic acids or ethyl carboxylates in organic media. Lipases showed a remarkable regioselective behavior: acylation of pyridoxine only occurred at C(5) of the pyridine ring. Moreover, acetylated derivatives of l were selectively deacetylated by enzymatic catalysis. This enzymatic approach allowed the preparation of novel fatty acids derivatives of l. The surfactant activity, composition and clean enzymatic methodology applied to the preparation of these products make them useful as ingredients in cosmetic and pharmnaceutical formulations or food additives. Continuing the work with lipases, an enzyme-catalde procedure is described for the onepot conversion of carboxylic acid into substituted amides via in-situ formation of the ethyl ester and subsequent aminolysis. This methodology proved to be general and can be applied to open chain, cyclic, hydroxy-, dicarboxylic-, various chain length , and unsaturated acids. Moreover, the enzyme showed a regioselective behavior in relation to primary and secondary amino groups. Finally, the efficient enantioselective reduction of a number of ketoesters by mycelial and yeast-like forms of the dimorphic fungus Mucor rouxii in a whole-cell process is presented. Mycelial cells, grown in aerobiosis, were efficient in water, whereas the yeast-like cells, grown in an anaerobic medium, were both efficient in water and in organic solvents. The fungal spores, which are the physiologically resistant form of the fungus, also catalyzed the reductive process efficiently and in a stereoselective way. The freeze-dried yeast-like cells, rehydrated in a small volume of water, maintained the same efficiency and selectivity of the reaction in organic solvents as the fresh biomass up to at least 4 months.

Pérez, Gladys Mabel. "Interferencia del aluminio con el metabolismo del hierro" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El aluminio (Al) es un elemento ampliamente distribuido en la Naturaleza, de hecho, el tercero en abundancia. A pesar de su ubicuidad, no posee una función biológica conocida, por lo tanto, su incorporación a los seres vivos puede provocar signos de toxicidad. La sobrecarga con Al ha sido asociada con la aparición de diferentes desórdenes, tales como: defectos óseos, encefalopatía y alteraciones hematológicas. Estos signos de toxicidad, aunque fueron inicialmente detectados en pacientes con insuficiencia renal crónica, pueden presentarse también en individuos con función renal intacta. El extenso uso de este elemento en la vida cotidiana lo convierte en un riesgo potencial para la población en general. Una vez ingresado al organismo, el Al es conducido a través del torrente sanguíneo por la misma proteína que transporta hierro (Fe), la transferrina (Ti) y acumulado en distintos órganos y tejidos. Diversos antecedentes permitieron relacionar la acumulación de Al con el desarrollo de anemia. Por lo tanto, el objetivo planteado para desarrollar este trabajo de investigación fue estudiar la interferencia del Al con el metabolismo normal de Fe. Para ello, se emplearon células de la línea eritroleucémica K562, las cuales expresan receptores específicos para Tf (RTf y RTf2) en su membrana y experimentan maduración eritroide por la acción de inductores, tales como hemina y butirato de sodio. Los resultados demostraron que el Al interfiere con el proceso de diferenciación celular, ya que provoca disminución del número de células hemoglobinizadas. El cálculo de las Kd correspondientes mostró que el RTf posee afinidad similar por los complejos Tf-Fe y Tf-Al, lo cual conlleva al establecimiento de una relación competitiva cuando ambos están presentes simultáneamente en el entorno celular. Esta situación trae como consecuencia la disminución de la incorporación total de Fe y, por lo tanto, de su utilización en la síntesis de hemo. Sin embargo, cuando el Al es removido, dependiendo de la duración de la exposición a este metal y de las condiciones de inducción, la captación de Fe excede a la de las células que no fueron expuestas previamente a Al. Esta observación sugiere la activación de algún mecanismo destinado a compensar la menor incorporación del metal esencial por efecto del Al. La posibilidad de que la expresión del RTf o RTf2 fuera regulada positivamente fue descartada, ya que los niveles de ARNm y de proteína no fueron modificados como consecuencia de la exposición a Al. Además de las vías que median la incorporación de Fe unido a Tf, existen mecanismos alternativos para la captación del metal esencial cuando está presente en la forma de compuestos de bajo peso molecular. La remoción de Al, después de un tratamiento previo, indujo una regulación positiva de estos sistemas de transporte de Fe independientes de Tf. Puede concluirse que la presencia de Al en el entorno celular interfiere la normal incorporación y utilización de Fe. Ello induce una adaptación celular tendiente a alcanzar los niveles del metal esencial requeridos para el metabolismo. La regulación positiva de las vías alternativas de captación de Fe, las cuales no participan en la incorporación de Al, da cuenta de parte de esta respuesta, aunque no puede ser descartada la posibilidad de que la afinidad de los receptores para Tf pueda ser modificada. Sin embargo, a pesar de estas adaptaciones, la presencia continua de Al en el medio impide a las células lograr la utilización adecuada de Fe en la síntesis de hemoglobina.

Abstract:
Aluminum (Al) is widely distributed in Nature and, in fact, it is the third element more abundant. In spite of this, its biological function is not known, and its incorporation to living beings proved to have toxic effects. The exposure to Al has been associated to different disorders, such as: bone defects, encephalopathy, and hematologic alterations. Even though these toxicity signs were first detected in patients with chronic renal deficiency, they may be also observed in people with intact renal functions. The wide use of this metal in everyday life turns it into a potential hazard to the population in general. Once it enters the organism, Al is transported through the bloodstream by transferrin (Tf), the same protein that transports iron (Fe), and it is accumulated in different organs and tissues. Several facts related Al accumulation to the development of anemia. Therefore, the aim of this work was to study Al interference with normal Fe metabolism. Assays were carried out using cells from the erythroleukemic line K562, which express specific receptors for Tf (TfR and TfR2) in their membranes and experienced erythroid maturity due to the action of inducers such as hemin and sodium butyrate. Results showed that Al interferes with the cellular differentiation process causing a decrease in the number of hemoglobinized cells. The determination of the corresponding Kd showed that TfR has similar affinity for complexes Tf-Fe and Tf-Al, thus establishing a competitive relation between them when they are simultaneously present in the cellular environment. This situation triggers a reduction in the total incorporation of Fe and, thus, in its utilization in the synthesis of heme. However, when Al is removed, depending on the length of the exposure and on the induction conditions, Fe incorporation is higher than in cells not previously exposed to Al. This suggests the existence of a certain mechanism developed to compensate the lower essential metal incorporation caused by Al. Positive regulation of TfR or TfR2 expression was discarded since RNAm and protein levels were not modified by Al exposure. Apart from the pathways that mediate Tf-Fe incorporation, there are alternative mechanisms for essential metal uptake when it is in the form of low molecular weight compounds. The removal of Al after a previous treatment induced the positive regulation of these transport systems of Tf-independent Fe. We may conclude that the presence of Al in the cellular environment interferes with normal Fe incorporation and utilization. This induces a cellular adaptation intended to reach the essential metal levels necessary for metabolism. The positive regulation of the alternative Fe uptake pathways, which do not participate in Al incorporation, partly explains this response, but the possibility that the affinity of Tf receptors may be modified should not be discarded. However, in spite of these adaptations, the continuous presence of Al in cellular environment prevents the adequate utilization of Fe in hemoglobin synthesis.

Santos, Javier. "Estudio del plegado proteico: la ß-lactamasa" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las propiedades biológicas de las proteínas dependen de su estructura tridimensonal (3D). Hoy sabemos que el plegado proteico permite la conversión de la información existente en la secuencia de aminoácidos en información 3D, pero no sabemos cómo se lleva adelante este proceso. Tampoco se conoce la lógica con que se distribuye la información 3D en la secuencia y no existe una opinion unificada sobre el grado de estructura presente en los estados parcialmente plegados ni sobre el papel de estos últimos en el plegado proteico. Sí existen algunas pruebas de que la información conformacional no estaria distribuida homogéneamente en la secuencia proteica. En una misma cadena polipeptídica existen fragmentos o bloques que pueden ser eliminados sin producir alteraciones en el plegado final, por lo que no formarían parte del conjunto de residuos determinantes de la estructura 3D nativa. Por el contrario, otros fragmentos aparentemente no pueden ser removidos sin abortar el proceso de plegado. En este trabajo de tesis se utilizó a la β-lactamasa de Bacillus Licheniformis. ES-βL como modelo experimental para estudiar el proceso de conversión de información 1D → 3D e investigar la existencia de módulos de información para el plegado. Se eligió a ES-βL como modelo principalmente porque a) la existencia de proteína correctamente plegada (nativa) es fácilmente detectable por actividad enzimática. aún en trazas; b) se conoce su estructura cristalográfica con gran resolución; c) no posee puentes disulfuro que compliquen adicionalmente el plegado; y d) ES-βL no es un modelo excesivamente reduccionista: posee dos dominios y una topología medianamente intrincada. Para caracterizar el modelo experimental se estudiaron aspectos generales de la estructura, el plegado, y estados intermediarios de ES-βL, tanto desde un punto de vista cinético como en el equilibrio. La estructura de formas parcialmente plegadas también se estudió a partir de experimentos de modificación química de cisteínas introducidas a tal fin en la cadena polipeptídica como sondas conformacionales. El desplegado de ES-βL inducido por urea presentó más complejidad que el desplegado por GdmCl. En el primer caso, se detectaron por lo menos cuatro estados parcialmente plegados. Inesperadamente, el reemplazo de Ser265 → Cys265 tuvo consecuencias importantes para el plegado. El efecto desestabilizador de la mutación sobre los estados parcialmente plegados indicó que el residuo formaría parte de un módulo estructurado en dichos estados. La observación de estados parcialmente plegados, curvas de desnaturalización no coincidentes, transiciones multifásicas, cores resistentes e intermediarios cinéticos es compatible con un mecanismo de ensamblado modular o plegado por partes de la β-lactamasa. Por otra parte, en este trabajo se manipuló la secuencia de la proteína para estudiar la interdependencia de los niveles jerárquicos de estructura en el proceso de plegado. Se evaluó el contenido de información para el plegado de ES-βL codificado por la hélice α C-terminal. Para estudiar el papel de esta hélice se prepararon y caracterizaron tres variantes de ES-βL acertadas, en nueve, catorce y diecinueve residuos desde el C-terminal. ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 y ES-βLͨΔ19, respectivamente. Los lisados de bacterias expresando ES-βLͨΔ19 no presentaron actividad β-lactamasa. Por el contrario, dicha actividad sí fue detectada en lisados conteniendo tanto ES-βLͨΔ9 como ES-βLͨΔ14, demostrando de manera preliminar que una fracción de estas moléculas, puede adquirir estructura nativa. La caracterización rigurosa de ES-βLͨΔ9 permitió demostrar que la secuencia de residuos eliminada tiene un rol en el mecanismo de plegado pero que su ausencia no impide la formación de estructura 3D nativa. También se caracterizó en detalle Ip ES-βLͨΔ9, un estado parcialmente plegado, que está conectado con la forma nativa de ES-βLͨΔ9. Ip ES-βLͨΔ9 sólo posee estructura secundaria residual, pero es muy compacto. Posee las características de un glóbulo fundido y puede esmbilizarse formando un dímero. La eliminación de los residuos 287-295 afecta dramáticamente la velocidad de replegado de la β-lactamasa: ES-βLͨΔ9 se pliega 10 4 veces más lentamente que ES-βL. A partir del estudio tennodinámico y cinético de ES-βLͨΔ9 se concluyó que los residuos eliminados proveen información para formar estructura secundaria, evitar trampas cinéticas y asociación errónea de unidades de plegado, acelerar el pasaje a través del estado de transición y estabilizar al estado nativo. Los resultados obtenidos con la β-lactamasa se compararon con otros datos de literatura referidos a proteínas que a pesar de carecer de partes de su secuencia alcanzan un plegado nativo. El conjunto de las evidencias experimentales parece sugerir que la cadena polipeptídica tiende a plegarse guiada principalmente por información local en la secuencia. Las interacciones entre residuos alejados secuencialmente jugarían un papel secundario en el proceso de plegado y aparecerían posteriormente, luego de que la cadena polipeptídica adopte el recorrido espacial apropiado.

Abstract:
The biological properties of proteins rest upon their specific native three-dimensional structure. and it is known that protein native structure is the result of a folding process by which sequential information is spontaneously converted into three-dimensional information. However, it is unknown how the three-dimensional information is encoded by the sequence. Moreover, although the native, biologically active, conformation can be characterized in atomic detail, a clear understanding of the structure of unfolded and partially folded states is also lacking. There are evidences suggesting that the information content is not homogenously distributed in the protein sequence: there exist particular fragments or blocks of sequence that can be eliminated without producing major alterations in the native structure, whereas other fragments, or even single residues, cannot be removed without impeding the folding process. In this work, β-lactamase of Bacillus licheniformis (ES-βL) was used as an experimental model to study the conversion of sequential information into three-dimensional information, and to investigate the existence of information modules embedded in the polypeptide chain. ES-βL was chosen as a protein folding model because: a) even traces of its native state can be detected by measuring enzymatic activity; b) its crystal structure is known with high resolution; c) it does not have disulfide bridges that would additionally complicate the folding reaction; d) it is representative of medium-size proteins with two domains and a moderately intricate topology. In the first part of the work, to characterize the experimental model, native and intermediary states of ES-βL, were studied by kinetics, equilibrium unfolding experiments, and chemical modification of Ser → Cys mutants. At least four partially folded states with different spectroscopic properties or thiol accessibility were detected in ES-βL equilibrium unfolding. Unexpectedly, it was found that a Ser265 → Cys265 replacement destabilized selectively ES-βL partially folded intermediates indicating Ser265 is establishing fixed interactions in these states. In addition the results showed the presence of partially folded states, no coincident curves when unfolding was monitored by different probes, multiphase transitions, protease resistant cores, and kinetic intermediaries. All these features suggest a modular assembling mechanism for β-lactamase. In the second part of the work, the sequence of β-lactamase was manipulated to study the interdependence of the hierarchic levels of structure (modules, independent units, topomer, native structure, etc.) in the folding process. Sequential information was eliminated with the expectation of stopping folding at different levels of structural complexity. In particular, the information content encoded by the C-terminal helix of ES-βL was evaluated. Three variants shortened by nine, fourteen and nineteen residues from the C-terminal were prepared and characterized (ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 and ES-βLͨΔ19, respectively). For ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14, most of the protein was was found forming inclusion bodies (insoluble aggregates) in transformed E. coli cells. Neither lysates of untransformed E. coli cells nor cells expressing ES-βLͨΔ19 had detectable lactamase activity. Contrastingly, lysates containing ES-βLͨΔ9 or ES-βLͨΔ14 exhibited enxymatic activity, which demonstrated that a fraction of these proteins acquired a properly folded structure in vivo. A thorough characterization of ES-βLCͨΔ19(hydrodynamics, spectroscopic and thermodynamic properties, enzymatic activity and resistance to proteolysis) allowed demonstrating that the eliminated sequence does have a role in the folding mechanism, but its absence does not prevent the acquisition of native structure. Also Ip ES-βLͨΔ9, a partially folded state, was discovered and characterized. Ip ES-βLͨΔ9 lacks tertiary structure, but it is compact and possesses residual secondary structure. These features are typical of molten globules, but this one is unusual because it forms a dímer in a concentration dependent process. ES-βLͨΔ9 folds 10 4 times more slowly than ES-βL. From a thorough thermodynamic and kinetic study of ES-βLͨΔ9, it is concluded that the eliminated residues (287-295) participate in folding at different levels: (a) encoding secondary structure; (b) encoding tertiary structure indirectly, avoiding kinetic traps and erroneous association of folding units; (c) participating in the folding transition state; (d) stabilizing the native state. Finally, in this thesis work it is discussed available experimental information on native proteins lacking parts of their sequences, and the relevance of these results to protein folding.

García, Cybele Carina. "Actividad inhibitoria de compuestos reactivos contra motivos Zn-fingers sobre la infección con arenavirus" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los virus de la familia Arenaviridae incluyen patógenos humanos causantes de severas fiebres hemorrágicas, como los virus Lassa (LASV)y Junín (JUNV). La proteína Z de los arenavirus, posee un motivo RING finger altamente conservado entre los distintos arenavirus, necesario para la interacción con proteínas celulares y virales, y por lo tanto es un punto de ataque ideal para la quimioterapia antiviral contra las fiebres hemorrágicas. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la actividad inhibitoria de compuestos electrofílicos reactivos con motivos Zn fingers. provistos por el National Cancer Institute (USA), comprobar que Z es el blanco de acción de dichos compuestos y demostrar que su rol es esencial en el ciclo de multiplicación viral. Los compuestos, que incluyeron disulfuros alifáticos y aromáticos, derivados azoicos e hidrazidas fueron inicialmente evaluados por su capacidad inhibitoria sobre la infección de células Vero contra los arenavirus JUNV y Tacaribe (TCRV). De un total de 15 compuestos ensayados, 2 presentaron similar eficacia en sus propiedades antivirales y virucidas, 6 presentaron una actividad virucida superior a su efecto antiviral, 3 fueron estrictamente antivirales, 1 ejerció únicamente acción inactivante y 2 fueron inactivos. Los compuestos inactivantes mostraron ser efectivos también contra el virus de la coriomeningitis linfocitaria (LCMV), arenavirus prototipo de la familia. El análisis de los parámetros (tiempo y temperatura) que afectan la inactivación de JUNV y TCRV, demostró que la cinética de inactivación es rápida y que la reacción es dependiente de la temperatura, ya que no hubo inactivación del virus a 4°C. La interacción entre el virus y el compuesto inactivante lleva a un bloqueo del ciclo de multiplicación viral a nivel de la transcripción y replicación, ya que el mismo se adsorbe y penetra en las células con igual eficacia que el virus control, pero no se detecta RNA correspondiente a los genes N, GPC y Z, en los viriones inactivados. Este hecho se verificó por la ausencia total de síntesis de proteínas virales cuando se infectan células con virus inactivado. Sin embargo, los viriones inactivados mantienen la funcionalidad de las proteínas externas, ya que se observaron títulos comparables de anticuerpos neutralizantes en animales inoculados con viriones inactivados con respecto a los inoculados con JUNV y TCRV infecciosos, indicando así la preservación de la capacidad antigénica de las glicoproteínas luego del tratamiento inactivante. La acción diferencial de estos agentes sobre HSV-1 y los arenavirus confirma que la proteína Z de los arenavirus juega no sólo un rol regulatorio durante el ciclo viral, sino que tiene también importancia estructural, ya que los compuestos ejercen su acción tanto en la célula infectada, como directamente sobre el virión.Los resultados del estudio del efecto inhibitorio sobre la proteína Z purificada de LCMV y LASV, indicarían que los compuestos están dirigidos particularmente hacia la proteína Z de los arenavirus, interaccionando con ella y provocando su multimerización, con la consiguiente pérdida de funcionalidad y capacidad infectiva del virión. Por otro lado, se sabe que la infección con LCMV conduce a la recolalización de cuerpos nucleares de la proteína celular con homeodominios ricos en prolina (PRH) al citoplasma de la célula infectada. En células infectadas con LCMV se observó que el tratamiento con NSC20625 inhibe la replicación del RNA viral, sin afectar la transcripción del gen celular prh. Además, el tratamiento con NSC20625, no sólo inhibió la expresión de la proteína viral Z en las células infectadas con LCMV, sino que además revirtió el patrón de distribución de la proteína PRH al patrón de PRH observado en células normales. Por último, el compuesto azoico ANNB mostró un amplio rango de acción contra los arenavirus, ya que fue también inhibidor de la multiplicación de otras cepas de JUNV, asi como de TCRV, Pichinde y LCMV. El estudio del modo de acción antiviral manifestó que el ANNB afecta las etapas tardías del ciclo de multiplicación viral; esto se comprobó al observar que ni las etapas tempranas de adsorción e internalización viral, ni la síntesis y expresión de proteínas virales estaban afectadas. La producción de virus asociado a células está igualmente afectada que el virus extracelular, por lo que el ANNB estaría bloqueando el correcto ensamblado dentro de la célula. Estos resultados demuestran por primera vez que una proteína esencial para los arenavirus es el blanco de acción de compuestos que representan agentes antivirales promisorios contra estos patógenos, mostrando similar eficacia in vitro que la ribavirina, la única droga conocida que ha sido ensayada en los pacientes infectados con arenavirus.

Abstract:
The Arenaviridae family includes several human pathogens like Lassa virus (LASV) and Junín virus (JUNV) causing hemorrhagic fevers. The Z protein of arenavirus presents a highly conserved RING finger motif which turns this protein an attractive target for antiviral therapy. In the present study, we have evaluated fifteen selected Zn fingers reactive compounds, provided by the National Cancer Institute, for their capacity to act as inhibitors of arenavirus infection. From the total of compounds evaluated against JUNV and Tacaribe (TCRV), 2 presented similar effectiveness in their antiviral and virucidal properties, 6 presented a virucidal activity superior to the antiviral effect, 3 were exclusively antivirals, 1 exerted only virucidal action and 2 were totally inactive. The virucidal compounds demonstrated to be effective also against the Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). The time course of virucidal activity showed that the inactivation started a few minutes after addition of the compound to the virus suspension and proceeded in a time dependent manner. Arenavirus inactivation was also energy-dependent since a temperature higher than 30°C was required to destroy virus infectivity. The mode of inactivation of these compounds rendered non-infectious virus particles but preserving the conformational integrity of the virion glycoproteins. This conclusion was supported by the following results: binding of inactivated virions to cellular receptor was performed with the same efficacy as native virions; internalization via fusion between viral and endosome membranes was not affected in inactivated virions; after inoculation of adult mice with 10 4 PFU of either JUNV and TCRV control or treated virus with NSC20625, comparable levels of antibodies were detected indicating that the inmunogenecity of viral glycoproteins was preserved. In order to further understand the antiviral mechanism we studied the transcription and replication of inactivated JUNV virions on Vero cells by detection of the N, GPC and Z genes. No amplification products were detected, demonstrating a blockade in viral transcription. The differential inhibitory action observed against arenavirus and HSV-1 confirmed that Z is playing structural and regulatory roles during the multiplication cycle. These zinc finger inhibitors were reported to establish disulfides linkages between zinc finger motifs in proteins. The results obtained after investigating the extent of Z multimer formation exhibited significant altered patterns showing high-molecular-weight multimers, suggesting the establishment of inter-and possibly intramolecular disulfide bonds, leading to the formation of Z multimers. It has been reported that LCMV gene expression and replication affect the subcellular localization of PRH in human hepatocytes and that the PRH protein can be physically associated with the arenavirus Z protein. It was observed that the treatment with NSC20625 of LCMV infected-cells inhibited the replication of the viral RNA, without affecting the transcription of the cellular gene prh. The NSC20625 treatment, not only inhibited the expression of Z viral protein in LCMV infected-cells, but in addition, reverted the distribution pattern of PRH protein in these treated cells to the observed pattern of PRH in normal cells. On the other hand, the azoic compound ANNB showed a broad spectrum of action against arenavirus, since it was also inhibitor of the multiplication of several strains of JUNV, as well as of TCRV, Pichinde and LCMV. The mode of action showed that ANNB affects late stages of the viral multiplication cycle; this was verified when observing that neither the early stages of adsorption and internalization, nor the viral protein synthesis and expression were affected. The production of associated virus to cells was affected, so the ANNB would be blocking the correct assembly within the cell. The present work demonstrate for the first time that an arenavirus protein is the target of compounds that represent a promising class of agents against highly pathogenic arenaviruses showing similar effectiveness in vitro to the ribavirin, the only well-known drug that has been used in patients with hemorrhagic fevers caused by arenavirus.

Pérez, Martín Mariano. "Catecolamina - beta alanil ligasa (cbal), enzima clave en el metabolismo de neurotransmisores en los insectos" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la presente Tesis se ha estudiado la enzima NBAD-sintetasa, responsable de la síntesis de NBAD, el principal precursor de esclerotización de las cutículas marrones de los insectos. Se la caracterizó en detalle y se estudió su expresión en el ciclo de vida de C. capitata. El aporte principal ha sido, justamente, el estudio en detalle de esta enzima. Anteriormente a esta Tesis, ésta era una enzima prácticamente desconocida. Si bien se había postulado que el NBAD era el principal precursor de esclerotización de las cutículas marrones de los insectos, excepto nuestro laboratorio, nadie había publicado nada sobre la enzima que lo sintetiza. Se determinó la expresión de la NBAD-sintetasa en la metamorfosis. Se la caracterizó y se demostró que la misma posee una amplia especificidad de sustratos. Se demostró por primera vez la actividad de esta enzima en sistema nervioso y respuesta inmune. Se clonó y secuenció por primera vez un mutante melánico de D. melanogaster, carente de esta actividad enzimática. Por su amplía especificidad de sustratos hemos denominado a esta enzima como Catecolamina-B-alanil ligasa (CBAL). Los principales resultados obtenidos son: -Se determinó el patrón de expresión de la enzima en el tejido epidérmico durante el ciclo de vida de C. capítata. La actividad de esta enzima se detectó en momentos muy acotados del ciclo de vida, coincidiendo con los momentos en que los individuos necesitan esclerotizar sus cutículas. Esta actividad es dependiente de la hormona de la muda 20-OH-ecdisona. La actividad está ausente en el tegumento de las larvas, pues las mismas son de cutícula blanda y no sufren el proceso de esclerotización. El primer momento durante el ciclo de vida en que se detectó la actividad fue en las prepupas cuando se forma el pupario. Luego de varias horas la actividad fue indetectable hasta el estadío de adulto farado donde se volvió a registrar la actividad extendiéndose ésta hasta la emergencia del adulto. -Se descubrió y se dosó por primera vez in vitro la actividad NBAD-sintetasa en tejido nervioso. Se estudió el patrón de expresión y se determinó que la actividad en este tejido es constante a lo largo del ciclo de vida. Incluso se detectó actividad en el “cerebro” de las larvas, hecho significativo puesto que en este estadío nunca se detectó esta actividad en la epidermis. En adultos se demostró que la actividad en el sistema nervioso permanece constante durante todo el estadío, mientras que en la epidermis, luego de las primeras 48 horas, cuando ya ha finalizado el proceso de la esclerotización, no se detecta más la actividad. - Por primera vez se observó que la NBAD-sintetasa participa en la respuesta inmune innata de los insectos. Esta actividad se manifiesta solamente cuando los individuos son invadidos por un patógeno o cuando se produce una injuria en la cutícula. También se determinó la función antibacteriana del NBAD. - Se caracterizaron las diferentes actividades enzimáticas y se concluyó que todas corresponderían a una misma enzima. La misma mostró una amplia especificidad de sustrato, siendo capaz de conjugar β-alanina con catecolaminas, indolaminas e imidoaminas. Por primera vez se logró sintetizar in vitro: NBANE, NBAOA; NBATA, NBASHT, NBAHA (carcinina) y NBATyr (sarcofagina). Debido a la amplia especificidad de sustrato que mostró, hemos denominado a esta enzima como “Catecolamina-β-alanil ligasa” (CBAL). - Se estudiaron los mutantes melánicos niger de C. capitata y ebony de D. melanogaster. Se determinó que ambos mutantes son homólogos; los dos carecen de la actividad NBAD-sintetasa en epidermis (esclerotización y respuesta inmune) y en sistema nervioso. Ambos mutantes muestran deficiencias en el comportamiento. El estudio de los mutantes demostró que las proteínas responsables de las actividades enzimáticas corresponden a un único gen. - Se clonó y secuenció el gen ebony de D. melanogaster en la cepa salvaje y el mutante e4. Se demostró, mediante Northern blots, que el ARNm del mutante es de menor tamaño que el de la cepa salvaje. Luego se secuenció y se comprobó que el gen del mutante posee una deleción de 447 pb en el primer exón. Además se observó que en el sitio de la deleción se insertaron 15 nucleótidos pertenecientes a una secuencia extraña, la cual fue analizada y arrojó homología con una secuencia perteneciente a un gen de baculovirus. Se analizó, además, la región promotora y se encontraron secuencias de reconocimiento para genes que responden a 20-OH-ecdisona, factores de transcripción que actúan en tejido epidérmico, tejido nervioso o en la respuesta inmune. - Se comenzó a estudiar preliminarmente la enzima NBAD-hidrolasa. La misma mostró un patrón de expresión diferente a la sintetasa. La expresión de esta enzima se registró durante todo el ciclo de vida. También se observó que se expresa en tejido nervioso. Esta enzima también mostró una amplia especificidad de sustrato, siendo capaz de hidrolizar los diferentes productos que sintetiza la NBAD-sintetasa. Los resultados obtenidos han permitido poner en evidencia la actividad de la enzima CBAL durante el ciclo de vida de C. capitata y los procesos fisiológicos en los que interviene, claves en la evolución de los insectos. También se abrió un nuevo panorama en el estudio del metabolismo de aminas biogénicas y se aportó información para conocer el metabolismo de β-alanina en insectos.

Abstract:
In the present Thesis it has been studied the enzyme NBAD-synthase, responsible for the syntesis of NBAD the main precursor for tanning and sclerotization the insect brown cuticles. This enzyme has been characterized and was studied its expression profile in the C. capitata life cycle. The principal contribution has been the detailed study of this enzyme. Before this Thesis, it was an almost unknown enzyme. It has been postulated that the NBAD is the main precursor for the sclerotization of insect brown cuticles, but except our laboratory, nobody has published anything about the synthesizing enzyme. It has been determined the expression profile of the enzyme during C. capitata metamorphosis. It has been observed that this enzyme showed a wide substrate specificity. For the fisrt time it has been demonstrated the activity of this enzyme in nervous tissue and in innate immune response. It has been cloned and sequenced for the first time a Drosophila melanogaster melanic mutant, lacking the NBAD-synthase activity. Due to its wide substrate specificity we proposed identify it as Catecholamine B-alanyl-ligase (CBAL). The main obtained result are: - It has been determined the expression profile of the enzyme in the epidermal tissue during the life cycle of C. capitata. The activity of this enzyme has been detected in narrow developmental windows in differents stages during the life cycle. All those developmental windows where the enzyme was expressed were in coincidence with the momment when the fly must sclerotize its cuticle. This activity is absent in the larval integument, this is because they are maggots with soft cuticle and it never suffer the sclerotization process. The first time when this activity has been observed was in the prepupa, during puparium formation. After several hours the activity disappeared until the pharate adult stage when it was evident again and remained until the imago emergence. - It has been discovered and determined for the first time the activity of this enzyme in the nervous system of insects and we showed that this activity is expressed constitutively during the whole life cycle. Indeed the activity was measured in the larval brain, this is striking because the activity is absent from the epidermal tissue. It has been shown that in the adult stage while the epidermal activity drops to undetectable levels, after the first 48 hours, when the sclerotization process had finished, in nervous tissue it kept on constant. - It was observed for the first time that NBAD-synthase is activated during the immune response in insects. The NBAD-synthase is activated only when the insect is infected by a microorganism. It has been also demonstrated the antibacterial activity of NBAD. - It has been characterized the different enzymatic activities and it was observed that all of them belong to the same enzyme. This enzyme showed a wide substrate specificity, being capable of synthesize different β-alanyl derivatives of catecholamines, phenolamines, indolamines and imidoamines. It has been synthesized, for the first time in vitro: NBANE, NBAOA, NBATA, NBASHT, NBAHA (carcinine) and NBATyr (sarcophagine). Due to its broad substrate specificity we proposed identify it as Catecholamine β-alanyl ligase (CBAL). - It has been studied the melanic mutants niger of C. capitata and ebony of D. melanogaster. It has been shown that both mutant are homologous, this two mutants lack the NBAD-synthase activity in the integument (sclerotization and immune response) and in the nervous tissue. These both mutants also have behavioural anomalies. The studies carried out on these mutants demonstrated that the responsible enzymatic activities are codified by an unique gene. - It has been cloning and sequenced the ebony gene from D. melanogaster wild type and ebony4 (e4) strains. By Northern blot assays has been observed that the mutant mRNA is smaller than the wild type one. Thereafter by sequencing it has been demonstrated that the mutant gene has a 447 bp deletion in its first exon. Moreover it has been observed in the deletion site 15 exogenous nucleotides inserted, and it sequence showed great similarity with a baculovirus gene. It has been studied the expression pattern in the D. melanogaster life cycle. Using a computational program it has been analized the promoter region of this gene and it has been observed the presence of sequences for different transcription factor recognition sites, such as those that respond to 20-OH ecdysone, transcription factor that are expressed in epidermal or nervous tissue and those that modulate the immune response. - Preliminary it has begun to be studied the enzyme NBAD-hydrolase. This enzyme showed an expression pattern different for that of NBAD-synthase. The expression of the former has been detected during the whole life cycle of C. capitata. As it occurs with the NBAD-synthase, the NBAD-hydrolase is also expressed in nervous system and is capable to hydrolisate the alternative products synthesized by the NBAD-synthase. All these results has allowed to show the activity of CBAL during the whole life cycle of C. capitata and the physiological process where it participates, very important during the evolution of insects. A new subjet in the study of metabolism of biogenic amines has been opened and it has been given a new information on the metabolism of β-alanine in insects.

Ruiz, Jimena Alicia. "Rol de los polihidroxialcanoatos en la resuesta al estrés desarrollada por P. putida GPo1" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La supervivencia de los microorganismos en la naturaleza depende de su habilidad para adaptarse rápidamente a los cambios en las condiciones ambientales. Por este motivo, las bacterias han desarrollado estrategias de supervivencia, mecanismos de control activos que les permiten hacer frente a las condiciones adversas y que facilitan el reajuste de la célula a nuevas situaciones. Uno de estos mecanismos es la Respuesta general a estrés que se induce en bacterias Gram-negativas ante distintas condiciones de estrés ambiental, tales como escasez en nutrientes, estrés osmótico, estrés oxidativo y cambios bruscos de temperatura. Los genes involucrados en la resistencia al estrés se encuentran bajo el control de una subunidad sigma alternativa de la RNA polimerasa denominada σˢ, codificada por el gen rpoS. El nivel intracelular de σˢ se regula a nivel transcripcional, traduccional y de estabilidad de la proteína. Otra respuesta desencadenada ante condiciones de estrés es la Respuesta Estricta, que se caracteriza por un aumento en el nivel intracelular de la alarmona (p)ppGpp. Dicha molécula modula la expresión de varios genes, entre ellos el rpoS. Tanto en E. coli como en Pseudomonas se demostró que el ppGpp tiene un efecto positivo sobre la transcripción de rpoS. Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polímeros de reserva bacterianos cuya acumulación y degradación favorece la supervivencia de los microorganismos en el ambiente. Resultados obtenidos previamente en el laboratorio, demostraron que la degradación del PHA acumulado incrementaba la supervivencia y la resistencia al estrés de la bacteria Pseudomonas putida en microcosmos de agua de río. Teniendo en cuenta estos aspectos, el objetivo general de la presente tesis doctoral fue estudiar el papel de los polihidroxialcanoatos en los mecanismos de repuesta al estrés en P. putida. Para esto se utilizó una cepa salvaje y una cepa con una mutación en la enzima PhaZ, encargada de degradar PHA, y se analizó el contenido intracelular de ppGpp en condiciones de depolimerización de PHA, así como también la resistencia a estrés térmico y oxidativo, y el contenido intracelular de os durante ayuno en carbono. Los resultados obtenidos mostraron que existe un aumento transitorio en el nivel intracelular de ppGpp, aproximadamente 5 hs después del comienzo de la degradación de PHA. No se observó incremento en el contenido de ppGpp en la cepa mutante incapaz de degradar el polímero. La complementación de la mutación phaZ restauró el fenotipo salvaje. Asimismo, se observó que la capacidad de degradación de PHA incrementaba el nivel intracelular de σˢ y la resistencia a estrés térmico y oxidativo durante ayuno en carbono. La introducción del gen que codifica para la depolimerasa de PHA en la cepa mutante phaZ incrementó el contenido de RpoS y la tolerancia al estrés. Estos resultados sugieren que existe una relación entre la depolimerización de PHA y la Respuesta general a estrés controlada por RpoS, que tal vez se encuentre mediada por ppGpp.

Abstract:
Survival of microorganisms in nature depends on their ability to adapt to changes in environmental conditions. For this reason, bacteria have developed survival strategies, active control mechanisms that allow them to cope with adverse conditions and facilitate the cell readjustment to new situations. One of these mechanisms is the General stress response induced in Gram-negative bacteria in response to several environmental stresses, such as nutrient starvation, osmotic stress, oxidative stress and abrupt temperature changes. The genes involved in stress resistance are under the control of an alternative sigma subunit of the RNA polymerase, σˢ, encoded by the rpoS gene. The intracellular level of σˢ is regulated at several levels, including transcription, translation and protein stability. Another mechanism triggered by stress conditions is the Stringent response. This response is characterized by an increase in the intracellular level of the alarmone (p)ppGpp. This molecule modulates the expression of several genes, including rpoS. The involvement of ppGpp as a positive signal for rpoS expression has been reported in E. coli and Pseudomonas. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are bacteria] reserve polymers that enhance survival and competition abilities of microorganisms in the environment. Previous results of our laboratory, demonstrated that PHA degradation increased survival and stress resistance of Pseudomonas putida in river water microcosms. Considering all these aspects, the general purpose of this PhD. thesis was to study the role of PHAs in the stress response mechanisms in P. putida. For this purpose we used a P. putida wild type strain and a mutant in the PhaZ enzyme, which is involved in PHA degradation, to analyze the ppGpp intracellular levels in PHA depolymerization conditions; as well as the resistance to thermal and oxidative stress, and the intracellular σˢ content during carbon starvation. The results showed that PHA degradation is followed by an increase in ppGpp intracellular levels. This increase was not observed in the mutant strain unable to degrade the polymer. The complementation of the phaZ mutant restored the wild type phenotype. Moreover, it was observed that the capacity of PHA degradation increased the intracellular σˢ level and the resistance to heat shock and oxidative stress during carbon starvation. The introduction of the gene that codes for the PhaZ depolymerase in the mutant strain, increased RpoS content and tolerance to stress agents. These results suggest a relation between PHA depolymerization and the General stress response controlled by RpoS, that could be mediated by ppGpp.

Perotti, Christian Pablo. "Terapia fotodinámica a partir de ALA: acerca de estrategias para aumentar su eficacia y selectividad" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Rosignoli, Florencia. "Caracterización de la sialoadenitis en los ratones NOD: participación del óxido nítrico en la disfunción secretoria" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La autoinmunidad es una causa importante de enfermedad en los seres humanos. El síndrome de Sjögren es una enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por una pérdida progresiva de la secreción salival y lagrimal. La cepa de ratones diabéticos no obesos (NOD) es el modelo murino más ampliamente utilizado para el estudio de esta enfermedad debido a que el desarrollo de la sialoadenitis está acompañado por una disminución de la respuesta secretoria. Estudios en las glándulas salivales sugieren que el óxido nítrico podría tener un papel en la regulación de la secreción salival. Por tal motivo nuestro objetivo es investigar si la disfunción secretoria de los ratones NOD está asociada a alteraciones en la actividad de la óxido nítrico sintasa y su relación con la aparición de infiltrados linfocitarios en las glándulas o la expresión de citoquinas en las mismas. Los resultados expuestos indican que las glándulas salivales de ratones NOD presentan una menor actividad de NOS a partir de las 12 semanas comparada con la de BALB/c de la misma edad y ratones NOD de 8 semanas. La disminución es total en el caso de las glándulas submaxilares. El efecto sobre la NOS coincide con una reducción del flujo salival estimulado por pilocarpina sola o pilocarpina y VIP. Ambos efectos preceden al aumento de los niveles de citoquinas proinflamatorias en las glándulas y en el suero y a la aparición de infiltrados linfomononucleares en las glándulas. Además los resultados apoyan la hipótesis de una regulación negativa de la NOS por CaM KII, como el mecanismo responsable de la disminución de la actividad observada.

Abstract:
Autoimmunity is an important cause of disease in human beings. Sjögren´s syndrome is a chronic autoimmune disorder characterized by histological and functional alterations of exocrine glands that result in a severe dryness of the mouth and the eyes. The non obese diabetic (NOD) mouse model of Sjögren´s syndrome is the widest model used due to the fact that the development of sialoadenitis is associated to a decrease of salivary secretion. Studies in salivary glands suggest that nitric oxide could play a role in the regulation of the salivary secretion. Our objetive is to determine if the secretory dysfunction of NOD mice is associated to alterations in the activity of nitric oxide synthase and if this is previous to the appearance of lymphocytic infiltrates or cytokine expression in the glands. Our results show that the salivary glands of NOD mice present a diminished activity of NOS compared with BALB/c of same age and NOD mice of 8 weeks old. The loss of activity is complete in submandibular glands. The effect of NOS is associated with a reduction of the salivary flow stimulated by pilocarpine or pilocarpine and VIP. Both effects precede the increase of the levels of proinflammatory cytokines in glands and serum and the appearance of infiltrates in the glands. In addition the results support the hypothesis of a negative regulation of NOS by CaMKII, as the responsible mechanism for the decrease of the activity observed.

Yep Rodríguez, Alejandra. "Relaciones entre estructura y función en la glucógeno sintetasa de Escherichia coli" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Pazos, Adriana Alejandra. "Caracterización de un sustituto de piel humana a base de dermis porcina" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las lesiones cutáneas que abarcan una gran superficie de la piel, requieren el recubrimiento inmediato de la zona afectada para reducir riesgos se sepsis y facilitar la regenración tisular. Entre los múltiples procedimientos terapéuticos aplicados en el tratamiento de estas lesiones, los injertos de piel proveen un medio adecuado y seguro para la regeneración tisular. En esta tesis se estudió un sustituto de piel humana a base de dermis porcina utilizado para ese fin terapéutico, el cual essometidopara su comercialización a un tratamiento industrial que incluye liofilizacipon. El objetivo de la tesis, consistió en la caracterización de este producto comercial, su comparación con la dermis fresca original, y la descripción de ciertos aspectos de su actividad biológica. El análisis consistió en desarrollar la metodología adecuada para el aislamiento y cuantificación de los componentes de importancia biológica. Estos fueron los colágenos del tipo I y III, las proteínas fibronectina y laminina, y los proteoglicanos de ácido hialurónico, keratán sulfato, dermatán sulfato y condroitín sulfatos A y C. Los resultados se esta etapa sugieren que el tratamiento industrial aplicado para su comercialización, no los modificó de manera importante, ya que no hubo alteraciones cuali-cuantitativas relevantes. Además, el análisis de su actividad biológica en un " modelo de cultivo in vitro" de fibroblastos humanos, mostró que la dermis induce un aumento de la proliferación celular. Por lo tanto, este sustituto dérmico puede considerarse una excelente herramienta para el tratamiento de pacientes con heridas cutáneas extensas.

Abstract:
Extended skin damage requires immediate covering of the wounded area in order to avoid sepsis and to facilitate tissue regeneration. There are multiple approaches to treat these injuries, however skin graft is one of the most suitable and safe measures to accomplish this issue. In the present thesis, it was examined a human skin substitute based on porcine dermis used for this kind of treatments, which was previously submitted to an industrial treatment that includes dried-freeze. The objective of this was, characterization of the product, later comparison to the original fresh tissue, and description of certain aspects of this biological activity. The analysis was focused on the development of an appropriate methodology to isolate and quantify those components considered of biological interest. These compounds were collagen types I and III, fibronectin, laminin, and hyaluronic acid, keratan sulphate, dermatan sulphate, and chondroitin sulphates A and C-containing proteoglycans. The results of this step suggest that the industrial treatment applied to the dermis for marketing purposes did not modify greatly the product, since there were no relevant qualitative and quantitative alterations. Besides, the biological activity analysis performed in an "in vitro culture model" of human fibroblasts showed that the dermis induces an increment of cellular proliferation and DNA synthesis, and a consequent shorten of cell cycle. Therefore, the studied dermal substitute could be considered as an excellent tool for the treatment of patients with extended skin injuries.

Proietti, Cecilia Jazmín. "Cross-talks entre las vías de señalización del transductor de la señal y activador de la transcripción 3 (Stat3) y el receptor de progesterona en células de cáncer de mama" (2006) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se han descripto interacciones entre las vías de los receptores de hormonas esteroideas y de las proteínas transductoras de señales y activadoras de la transcripción (Stats). En este trabajo, se exploró la capacidad de los progestágenos de modular la activación transcripcional de Stat3 en un modelo experimental de carcinogénesis hormonal en donde el progestágeno sintético acetato de medroxiprogesterona (MPA) indujo adenocarcinomas mamarios en ratones hembras de la cepa BALB/c y en la línea celular de cáncer de mama humano, T47D. Se encontró que las células epiteliales C4HD, del modelo tumoral C4HD inducido por MPA, expresan Stat3 y que el tratamiento de las células C4HD con MPA aumenta la expresión de la proteína Stat3. Además, el MPA induce un efecto no genómico, rápido de fosforilación en tirosina de Stat3, Jak1 y Jak2 en las células C4HD y en las T47D. El tratamiento con MPA de las células C4HD también resultó en una rápida fosforilación en tirosina de c-Src. Estos efectos fueron completamente inhibidos por el antagonista de progestágenos RU486. El bloqueo de las actividades de Jak1 y Jak2 mediante la transfección transiente de las células C4HD con vectores dominantes negativos (DN) para Jak1 o Jak2, o la inhibición de la actividad de c-Src con el inhibidor selectivo de quinasas de la familia Src, PP2, bloqueó la capacidad del MPA de inducir la fosforilación de Stat3. El tratamiento de las células C4HD con MPA indujo la unión de Stat3 al ADN. También, el MPA promovió una fuerte activación transcripcional de Stat3 en las células C4HD y en las T47D, la cual fue inhibida por RU486 y por el bloqueo de las actividades de Jak1, Jak2 y Src. Para investigar la correlación entre la activación de Stat3 inducida por MPA y el crecimiento celular, las células C4HD fueron transfectadas con un vector de expresión para una forma DN de Stat3, Stat3Y705-F, o con un mutante de Stat3 constitutivamente activo, Stat3-C. Mientras que la expresión del mutante Stat3Y705-F ejerció un efecto inhibitorio en el crecimiento celular inducido por MPA de las células C4HD, la transfección con el vector de Stat3 constitutivamente activo, provocó proliferación independiente del MPA. Finalmente, se investigó el efecto de bloquear la activación de Stat3 en el crecimiento in vivo de los tumores mamarios C4HD. La inhibición de la activación de Stat3 mediante la transfección de las células C4HD con el vector de expresión para DN Stat3Y705-F, inhibió significativamente la habilidad de estas células de formar tumores en ratones singeneicos. Estos resultados demuestran por primera vez, que los progestágenos son capaces de inducir la activación transcripcional de Stat3, la cual es un requisito obligatorio para la estimulación del crecimiento inducido por MPA de las células tumorales mamarias, tanto in vivo como in vitro.

Abstract:
Interactions between steroid hormone receptors and signal transducers and activators of transcription (Stats)-mediated signaling pathways have already been described. In the present study, we explored the capacity of progestins to modulate Stat3 transcriptional activation in an experimental model of hormonal carcinogenesis in which the synthetic progestin medroxyprogesterone acetate (MPA) induced mammary adenocarcinomas in female Balb/c mice, and in the human breast cancer cell line T47D. We found that C4HD epithelial cells, from the MPA-induced mammary tumor model, expressed Stat3 and that MPA treatment of C4HD cells up-regulated Stat3 protein expression. In addition, MPA induced rapid, nongenomic, Stat3, Jak1, and Jak2 tyrosine phosphorylation in C4HD and T47D cells. MPA treatment of C4HD cells also resulted in rapid c-Src tyrosine phosphorylation. These effects were completely abolished by the progestin antagonist RU486. Abrogation of Jak1 and Jak2 activity by transient transfection of C4HD cells with dominant negative (DN) Jak1 or DN Jak2 vectors, or inhibition of Src activity by preincubation of cells with the Src family kinase inhibitor PP2, blocked MPA capacity to induce Stat3 phosphorylation. Treatment of C4HD cells with MPA induced Stat3 binding to DNA. In addition, MPA promoted strong Stat3 transcriptional activation in C4HD and T47D cells, which was inhibited by RU486 and by blockage of Jak1, Jak2 and Src activities. To investigate the correlation between MPA-induced Stat3 activation and cell growth, C4HD cells were transiently transfected with a DN Stat3 expression vector, Stat3Y705-F, or with a constitutively activated Stat3 mutant, Stat3-C. While expression of Stat3Y705-F mutant had an inhibitory effect on MPA-induced growth of C4HD cells, transfection with the constitutively activated Stat3-C vector resulted in MPA-independent proliferation. Finally, we addressed the effect of targeting Stat3 in in vivo growth of C4HD breast tumors. Blockage of Stat3 activation by transfection of C4HD cells with the DN Stat3Y705-F expression vector significantly inhibited these cells ability to form tumors in syngeneic mice. Our results have for the first time demonstrated that progestins are able to induce Stat3 transcriptional activation, which is in turn an obligatory requirement for progestin stimulation of both in vitro and in vivo breast cancer growth.

Sacca, Paula Alejandra. "Eventos moleculares en el cáncer de próstata" (2007) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La HO-1 es una enzima que ejerce funciones citoprotectoras previniendo el daño oxidativo. Dado que existen reportes controvertidos sobre su función en cáncer, en esta tesis se estudió el rol de HO-1 en cáncer de próstata (PCa), planteándonos la hipótesis de que su inducción en células neoplásicas podría contrarrestar el daño peroxidativo. Evaluamos la expresión y localización celular de HO-1 en tumores primarios y en líneas celulares de PCa (sensibles e insensibles a andrógenos) luego de inducir daño oxidativo y/o exposición a un inductor de esta proteína. Estudiamos proteínas regulatorias del ciclo celular y de la apoptosis. Nuestros resultados muestran que en PCa la marcación nuclear de HO-1 está asociada a la carcinogénesis y a la progresión tumoral. Las líneas celulares mostraron diferente expresión basal de HO-1, probablemente relacionado con el nivel de estrés oxidativo endógeno. La exposición a hemina indujo sobre-expresión y translocación de HO-1 al núcleo en ambas líneas celulares. El estrés oxidativo inducido y/o el tratamiento con hemina moduló diferencialmente el control del ciclo celular, la apoptosis y la distribución en las distintas fases en ambos casos. Demostramos por primera vez que la expresión y localización nuclear de HO-1 puede definir un nuevo subgrupo de pacientes con PCa y que la modulación de estos parámetros puede representar una nueva estrategia terapéutica.

Abstract:
Heme oxygenase-1 (HO-1) is a cytoprotective enzyme that prevents oxidative damage. This protein has been detected in several cancer cell lines and tumors, but its role is still controversial and yet to be defined. This dissertation aimed to study its role in prostate cancer (PCa) hypothesizing that its induction in neoplastic cells could counteract the oxidative damage. We assessed the expression and cellular localization of HO-1 in primary tumors of PCa and in androgen-sensitive and androgen-independent cell lines after oxidative stress and/or exposure to a specific HO-1 inductor. Moreover, we studied cell cycle and apoptosis related proteins. Our results showed that nuclear HO-1 staining is associated with carcinogenesis and tumor progression in PCa. Cell lines had different basal levels of HO-1, probably related to the endogenous oxidative stress level. Hemin, a potent inducer of HO-1, up-regulated and translocated it into the nucleus in both cells lines. Oxidative stress and/or hemin exposure differentially modulated the cell cycle, apoptosis and the distribution in the different phases for both cell lines. Furthermore, we have demonstrated for the first time that HO-1 expression and nuclear localization can define a new subgroup of PCa primary tumors and that the modulation of HO-1 expression and its nuclear translocation can represent a new therapeutic avenue.

Petrera, Erina. "Acción dual de meliacina, un compuesto aislado de Melia azedarach L., como agente antiherpético e inductor de citoquinas" (2007) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Meliacina (MA), un limonoide presente en las hojas de la planta Melia azedarach L., es capaz de inhibir in vitro la replicación de un amplio espectro de virus y actuar también como un potencial inmunomodulador. En este trabajo de tesis se demuestra la efectividad de meliacina como antiviral contra el patógeno HSV-2, ya sea inhibiendo la replicación del virus en cultivos celulares o por su efecto terapéutico administrado en forma tópica en un modelo de infección genital en ratones. Se confirma, además, su actividad como inmunomodulador por su efecto sobre macrófagos peritoneales murinos cultivados in vitro. MA aumenta la producción de citoquinas, en especial el TNF-α, cuando es administrada sola o en combinación con distintos inductores y este aumento está relacionado con la activación del factor de transcripción NF-kB. Por otro lado, MA inhibe la replicación del virus HSV-2 en células Vero suministrada sola o en forma aditiva en combinación con IFN-α, IFN-γ o los dos juntos indicando que aumenta la acción de ambas citoquinas. Estos resultados en conjunto sugieren que MA puede ejercer distintos efectos dependiendo del tipo celular sobre el que actúa: como antiviral en células epiteliales y como modulador de la producción de citoquinas en los macrófagos. A estas acciones combinadas podría deberse el efecto terapéutico ejercido en el modelo in vivo.

Abstract:
Meliacine (MA), a limonoid present in leaf extracts of Melia azedarach L., exhibits a broad range of virus inhibition in vitro and is able to act as a potential immunomodulator. In this work we demonstrate meliacine effectiveness as antiviral against HSV-2, inhibiting virus replication in cell cultures or due to the therapeutic effect exerted on murine genital infection. The immunomodulator activity of meliacine was confirmed, studding its action on peritoneal macrophages in vitro cultured. MA enhances cytokine production, especially TNF-α, when is administered alone or in combination with different inductors. This increase is associated with transcription factor NF-kB activation. On the other hand, MA inhibits HSV-2 replication and enhances IFN-α and IFN-γ inhibition on epithelial cells. In addition, MA increases, in an additive way, the synergistic inhibition produced by IFN combination. These results suggest that meliacine improves interferon action. These results together suggest that meliacine is able to exert different effects depending on the cellular type which is acting on: as antiviral on epithelial cells and a cytokine modulator on macrophages. The therapeutic effect exhibited on in vivo infection could be due to these combined actions.

Pregi, Nicolás. "Estudio de la eritropoyetina como agente neuroprotector" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La eritropoyetina (Epo) es una hormona cuya función mas conocida es su participación en el proceso de eritropoyesis, aunque, cada vez adquieren mas trascendencia otras funciones. En particular, a través de una acción antiapoptótica, aseguraría la supervivencia para que las células eritroides puedan cumplir con su programa de diferenciación. Una actividad similar cumpliría en otros tejidos. Así, el efecto de Epo a nivel del sistema nervioso central tendría un efecto neurotrófico y neuroprotector, previniendo la muerte de las neuronas ante el estimulo hipoxico o de shock. Aunque el mecanismo por el cual Epo ejercería el efecto neuroprotector no se conoce con exactitud, han sido implicados distintos mecanismos de activación celular. En el presente trabajo de tesis buscamos dilucidar algunos de los caminos de señalización de la actividad antiapoptotica atribuida al a Epo. Para ello, se estudio la acción de la hormona en modelos de apoptosis en una linea celular de origen neuronal, así como también algunas de sus potenciales vías de acción, a nivel de procesos que involucran la inactivación de caspasas, la modulación de factores de la familia Bcl-2 y de receptores de muerte y caminos mediados por JAK/STAT y PI3K7Akt. En este estudio se evaluó, inicialmente, una potencial acción protectora de la Epo en la linea celular SH-SY5Y inducida a diferenciación con staurosporina (STP), sustancia que, ademas, constituye un potente agente proapoptótico. El pretratamiento de las células con Epo previno el desarrollo de células apoptoticas por mecanismos mediados por la regulación positiva de la expresión de receptores de Epo (REpo) y la inducción de Bcl-XL. La Epo ha sido también postulada como factor anti inflamatorioo, ya que existen evidencias que le adjudican un efecto deneutralizaciónn de los efectos de algunas citoquinaspro inflamatorias.. En base a estos hallazgos, y una vez demostrada la acción antiapoptotica de la Epo en nuestro modelo celular, enfocamos la siguiente etapa a describir una potencial accion protectora frente al daño celular inducido por la citoquina pro inflamatoria TNF-α. Observamos un efecto proapoptotico de la citoquina con resultados cuali y cuantitativos coincidentes entre la aparición de células apocalípticasas, lcondensaciónón de cromatina, ldegradaciónón del ADNasísí como el aumento de la actividad de las caspasas 8 y 3 y ldegradaciónon de PARP. La sensibilidad de las células a la acción del TNF-α se encontró relacionada con un aumento de la expresión del receptor 1 de TNF. Cuando las células fueron incubadas en presencia de Epo previo a la inducción de apoptosis por TNF-α, se observó un efecto protector similar al encontrado en ensayos con STP. La Epo impidió la modulación positiva de los receptores de muerte e inhibió la activación de caspasas por mecanismos que involucran caminos de señalización mediados por JAK/STAT y PI3K, e inducen aumento de Bcl-2 y activación de NF-κB. La activación de este ultimo también fue inducida por acción de TNF-α, aunque este efecto no alcanzo para impedir el efecto proapoptotico de la citoquina. En conclusión, en el presente trabajo se describen mecanismos relacionados con el efecto antiapoptotico de la Epo frente a la muerte celular programada de células de origen neuronal inducida por STP y por TNF-α. Además, se detectó posible cross-talk entre caminos de señalización mediadores de la activacion de NF-κB que involucran tanto a receptores de muerte como la activacion por Epo/REpo. Los resultados sugieren que la sensibilidad celular a la apoptosis inducida por receptores de muerte puede ser regulada por diversos factores y que modificaciones del balance llevarían a supervivencia o muerte celular. El estudio realizado sustenta la capacidad de la Epo en su acción como factor anti inflamatorio, lo que podría marcar un rol muy importante como agente neuroprotector.

Abstract:
Since apoptosis appears to be related to neurodegenerative processes, neuroprotection has been involved in investigation of therapeutic approaches focused upon pharmacological agents to prevent neuronal programmed cell death. In this regard, erythropoietin (Epo) seems to play a critical role. Initially, the present work was focused on the study of Epo protective effects upon human neuroblastoma SH-SY5Y cells subjected to differentiation by staurosporine. Under this condition, profuse neurite outgrowth due to cell differentiation was associated to programmed cell death induced by staurosporine (STP) A previous treatment with recombinant human Epo prevented apoptosis and this effect proved to be acccompanied by an increased expression of the specific receptor for Epo (REpo) and the induction of Bcl-XL. It has been reported that Epo is capable of dealing with cellular inflammation by inhibition of several proinflammatory cytokines. Therefore, it was attractive to investigate the Epo potential antiapoptotic ability in the presence of these cytokines. We looked further into the possibility that cell death would be also triggered by the inflammatory cytokine TNF-alfa , a potent cytokine that exerts pleiotropic functions related to immunity, inflammation, and apoptosis. We have identified apoptosis as the type of cell death induced by TNF-alfa . Congruent results were found among qualitative and quantitative data, such as those detecting chromatin condensation and DNA fragmentation, as well as activation of caspases 8 and 3, and PARP degradation. Similar Epo protective effect as that observed in assays of apoptosis induced by STP was also detected when SH-SY5Y cells were preincubated with Epo before cultured in the presence of TNF-alfa. In order to gain further insight into the mechanisms involved in this antiapoptotic effect of Epo, modulation of death receptors and expression of transcription factors have been evaluated. A significant Epo-prevention of the TNFR1 expression upregulation induced by TNF-alfa coincided with an attenuated deleterious effect of the proinflammatory cytokine. This means that the sensitivity shown by SH-SY5Y cells to TNF-alfa may be due to the increase in TNFR1 expression after cell incubation with the cytokine. Therefore, at least one mechanism leading to the Epo neuroprotective effect may be related to prevention of the increase in number sites of this receptor. On the other hand, JAK/STAT and PI3K signalling pathways were found to be involved in the Epo protective action on SH-SY5Y cells induced to apoptosis. As regards the regulation of antiapoptotic factors induced by Epo neuroprotection, we detected upregulation of Bcl-2 and nuclear translocation of NF-kappa B. It is known that the proinflammatory cytokine TNF plays a key role in a wide variety of physiological processes, and that it is capable of activating two pathways simultaneously, leading to both the induction of apoptosis and the activation of NF-kappa B. We found increased nuclear localization of NF- B not only due to cell activation by Epo but also caused by the presence of TNF-alfa . Moreover, additivenuclear levels of NF-kappa B were observed when cell cultures were developed in the presence of both factors, Epo and TNF-alfa . Nevertheless, the protective effect of NF- B was not enough to impede the TNF-alfa-induced apoptosis of the SH-SY5Y cell line. In conclusion, we have described mechanisms related to the antiapoptotic effect of Epo against STP- and TNF-alfa -induced cell death as well as cross-talk between death receptor and Epo/EpoR signalling pathways. The results let us suggest that cell sensitivity to death receptor-induced apoptosis can be regulated by several factors and their balance might decide between survival and death of the cell. That is why, in our experimental design, the incubation of SH-SY5Y cells with TNF-alfa leads to apoptosis in spite of the cytokine ability to induce NF-kappa B nuclear translocation. The high expression of TNF receptor 1 and the lack of contribution of the Bcl-2 family members may explain cell sensitivity to TNF-alfa . On the other hand, cell activation by Epo becomes resistant to cell death through mechanisms that prevent upregulation of death receptors, block caspase activation and induce high expression of protective factors, such as Bcl-2 and NF-kappa B. This study underlined the Epo capacity as an anti-inflammatory factor which may play a significant role in stimulating neuroprotection.

Powazniak, Yanina. "Activación de vías involucradas en la apoptosis y proliferación en huvec. Agonistas relacionados con hormonas determinantes del sexo. Efecto sobre la liberación del factor Von Willebrand y Adamts13" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El VWF es una glicoproteína adhesiva, sintetizada en las CE y megacariocitos. Se sintetiza en forma monomérica, luego se organiza en dímeros y se multimeriza. El VWF media la adhesión de plaquetas al subendotelio vascular dañado y lel transporte del factor FVIII. La ADAMTS13, proteasa que cliva al VWF, pertenece a la familia de metaloproteasas ADAMTS, llamadas así por la combinación característica de una desintegrina y una metaloproteasa con motivos trombospondina tipo 1. La ADAMTS13 es sintetizada en el hígado. Además, se ha demostrado que se sintetiza y almacena en las CE, y que tiene actividad en los lisados celulares en condiciones estáticas y de flujo. La ADAMTS13 está involucrada en el proceso fisiológico de clivar a los multímeros extragrandes altamente trombogénicos, que cuando están presentes en el plasma o en la superficie de las CE llevan a una agregación intravascular y a la formación de un trombo plaquetario. Hemos observado que los niveles de ADAMTS13 descienden, mientras que los del VWF aumentan a medida que progresa el embarazo. En 1972, varios autores han descripto el aumento del 17β estradiol. También se ha observado que la administración de estradiol a las CE en dosis no fisiológicas produce un aumento de VWF. Hay antecedentes acerca de la acción de las hormonas determinantes del sexo en la muerte o proliferación celular en distintas líneas celulares y cultivos primarios. Se demostró la existencia de un factor embrionario liberador de histamina y una alta expresión de receptores para histamina durante la gestación en humanos. Además, se observó un aumento en los niveles de histamina en las últimas semanas de gestación en modelos de ratas y hamsters dorados. Los objetivos de esta tesis fueron: 1- analizar si los cambios hormonales que inducen o inhiben la síntesis o liberación de VWF y ADAMTS13 tienen influencia en la muerte o proliferación celular y 2- qué modificaciones producen las hormonas y concentraciones altas de histamina en la producción de VWF y ADAMTS13. Los experimentos se realizaron en cultivos de HUVEC. Se analizaron los efectos de las hormonas, a distintas dosis, en la proliferación o apoptosis, mediante el uso de técnicas de citometría de flujo y ensayo por colorimetría (MTS). Para evaluar el mecanismo de señalización se analizó la fosforilación de MAPK utilizando la técnica de SDS-PAGE e inmunotransferencia. Se observó que el efecto proliferativo del estradiol en HUVEC, ocurre a través de un aumento de la fosforilación de ERK2, inducido por el estímulo de la deprivación del suero. La progesterona y testosterona en dosis suprafisiológicas promovieron la apoptosis de HUVEC vía activación de p38 y JNK. Además se analizaron los niveles de mRNA (por Real Time PCR) y proteína intracelular y liberada (por SDS-PAGE e inmunotransferencia y ELISA) de VWF y ADAMTS13, en respuesta a los distintos tratamientos hormonales y con histamina. El estradiol, la progesterona y testosterona, no produjeron ningun cambio en la liberacion de VWF en las HUVEC, sin embargo combinadas con histamina, agonista de la liberación de VWF, produjeron inhibición de la actividad de la histamina. Por otra parte el estradiol, la progesterona y la testosterona no produjeron cambios significativos en la liberación de ADAMTS13, sin embargo el tratamiento con histamina indujo una disminución en los niveles de ADAMTS13, que fue revertida en la combinación con estradiol y progesterona. Finalmente, el estradiol, produjo un aumento en los niveles de mRNA de VWF y ADAMTS13. En la síntesis de ambos mRNA, el estradiol y la histamina presentan un efecto antagónico y la combinación de la progesterona y la histamina presentarían un efecto sinérgico.

Abstract:
VWF is a multimeric protein produced by endothelial cells and megakaryocytes. It is synthesized into a monomeric form, arranged into dimmers and multimers. VWF promove the platelet adhesion to the vascular subendothelium, also plays critical role in blood coagulation as it is the carrier protein for FVIII. ADAMTS13, the 13th member of the ADAMTS family of metalloprotease characterized by the combination of A disintegrin-like metalloprotease with ThromboSpondin type 1 motif, is the main physiological modulator of the size of VWF in plasma. ADAMTS13 is synthesized in liver cells. Recently it has been shown that ADAMTS13 it is synthesized and stored in the EC, and it has enzymatic activity using both stationary and flow assays. ADAMTS13 impairs the physiological process of cleavage of the largest, higly thrombogenic multimers of VWF wich, when present in plasma and/or on the endothelial cell surface, lead to massive intravascular aggregation and platelet thrombus formation in the terminal circulation. We have observed that during pregnancy VWF levels increased and ADAMTS13 levels decreased. Since 1972, several authors have described the increase of 17β estradiol levels. Also, it has been observed that the treatment of EC with estradiol induced an increase in VWF,in non physiological dose. There are several reports about the sexual hormones action in different cell lines and primary cultures, either in cell death or cell proliferation. It was shown the existence of an embryonic histamine-releasing factor and a high expression of receptors for histamine during gestation in humans. In addition, there was an increase of histamine levels in the final weeks of gestation in models of golden hamsters and rats. The thesis objectives were: 1- to analyze if the hormonal changes that induce or inhibit the synthesis or release of VWF and ADAMTS13 have influence in the cell death or cell proliferation and 2- what changes are produced with hormone and high histamine levels in the production of VWF and ADAMTS13. The experiments were carried out in HUVEC cultures. The effects of different doses of hormones on the proliferation or apoptosis were analyzed by flow cytometry techniques and testing by colorimetry (MTS). The MAPK phosphorylation was tested by SDS-Page and immunoblotting to check the signal mechanism. It was noted that the proliferative effect of estradiol on HUVEC, occurred through an increase in phosphorylation of ERK2, induced by the deprivation of serum. Progesterone and testosterone promoted apoptosis, via activation of p38 and JNK, in supraphysiological doses. In addition, VWF and ADAMTS13 were analyzed by: 1- levels of mRNA (Real Time PCR) and 2- levels of intracellular VWF and ADAMTS13 and their release induced by hormonal and histamine treatments (by SDS-Page, inmunoblotting and ELISA). Estradiol, progesterone and testosterone did not produce any change in the VWF and ADAMTS13 released from HUVEC. However, when the hormones were combined with histamine (agonist for VWF release), they induced the inhibition of the histamine effect. On the other hand, the treatment with histamine produced a decrease in ADAMTS13 levels, which was reversed by the combination of histamine with estradiol and progesterone. Finally, estradiol increased mRNA levels of VWF and ADAMTS13. Estradiol and histamine had an opposite effect in the synthesis of both mRNA. The combination of progesterone and histamine present a synergistic effect.

Irusta, Griselda. "Mecanismos involucrados en la atresia del folículo ovárico: relación entre esteroidogénesis, angiogénesis y apoptosis" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo se han realizado experimentos para dilucidar la función local en el ovario de la Hormona Liberadora de Gonadotrofinas (GnRH-I). Se han estudiado procesos fundamentales del desarrollo folicular como la síntesis de esteroides sexuales y la angiogénesis ovárica en su relación con la apoptosis folicular. En nuestro laboratorio se postuló que el GnRH-I ejerce una acción inhibitoria durante el desarrollo folicular actuando como modulador intraovárico. En ratas estimuladas con gonadotrofinas analizamos los niveles de esteroides sexuales y la expresión y contenido de enzimas ováricas responsables de la síntesis de esteroides luego del tratamiento con un agonista de GnRH-I, Acetato de Leuprolide (LA). Los efectos observados se han corroborado con experimentos realizados in vitro utilizando este mismo agonista. Además, estudiamos factores angiogénicos esenciales para el desarrollo y establecimiento de la vasculatura en el folículo ovárico, como también parámetros de la atresia folicular. El tratamiento con el agonista afectó la síntesis de esteroides ováricos al igual que el contenido folicular de las enzimas esteroidogénicas, produciendo una disminución en la síntesis de andrógenos y como consecuencia, en la producción de estradiol. Estos resultados se observaron en los experimentos realizados in vivo e in vitro. También se observó una disminución en el contenido de factores angiogénicos y de sus receptores, acompañado de un aumento de la actividad de caspasa-3, enzima efectora clave en el proceso de apoptosis folicular. Se concluyó que el factor GnRH-I actuaría en el ovario localmente afectando factores esenciales para el desarrollo folicular. Este factor interfiere en la foliculogénesis inducida por gonadotrofinas, alterando la síntesis de esteroides gonadales e inhibiendo la angiogénesis folicular. Esto alteraría el balance de los factores de supervivencia de las células foliculares, causando la activación de proteínas reguladoras de la apoptosis, llevando a los folículos en desarrollo al proceso de atresia.

Abstract:
In the present work, we have performed experiments to elucidate the local ovarian role of Gonadotropin Releasing Hormone-I (GnRH-I). Main processes of the follicular development were studied as sexual steroids synthesis, angiogenesis and its relationship with the follicular apoptosis. In our laboratory, it was proposed that GnRH-I exerts an inhibitory action of follicular development acting as a local ovarian modulator. In gonadotropin-stimulated rats treated with a GnRH-I agonist, Leuprolide Acetate (LA), we analyzed the sexual steroids levels and the expression and content of steroidogenic enzymes. The in vivo results were compared and corroborated by performing in vitro experiments using the agonist. Moreover, we analyzed essential angiogenic factors for the development and stabilization of the vascular vessels in the ovarian follicle as well as, follicular atresia parameters. The agonist treatment altered the ovarian steroids synthesis and the follicular content of the steroidogenic enzymes, diminishing the androgen synthesis and as a consequence, the estradiol production. These results were observed in in vivo and in vitro experiments. We also observed a decrease in follicular angiogenic factors and their receptors content, and this was parallel to an increase in the activity of caspase-3 enzyme, key effector of the follicular apoptosis process. We concluded that GnRH-I would act locally in the ovary affecting essential factors for follicular development. In addition it interferes in the gonadotropin-induced folliculogenesis, altering gonadal steroids synthesis and inhibiting follicular angiogenesis. This will lead to an imbalance of the survival factors of the follicular cells, causing the activation of apoptotic regulatory proteins and inducing atresia in the developing follicles.

Pallarola, Diego Andrés. "Desarrollo de un ensayo competitivo para la detección de endotoxinas" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La sepsis y el shock séptico son serias causas de muerte. Estas condiciones pueden iniciarse por una liberación masiva de lipopolisacárido (LPS) proveniente de la pared celular de las bacterias Gram-negativas, el cual activa en forma inapropiada el sistema inmune innato. Actualmente, el ensayo enzimático del lisado de amebocitos del Limulus Polyphemus (LAL) se utiliza ampliamente en la detección y cuantificación de endotoxinas en muestras clínicas y no clínicas. Sin embargo, este procedimiento posee varias limitaciones. El LPS está organizado en tres dominios estructurales, un heteropolisacárido que representa la superficie antigénica de la bacteria llamado antígeno O, una porción central constituido por un oligosacárido, denominado núcleo sacárido y una porción lipídica llamada lípido A, responsable de la actividad endotóxica del LPS. Debido a las propiedades químicas del LPS, el estudio de sus rutas metabólicas, su interacción con moléculas de reconocimiento o superficies modificadas, se realiza empleando LPS marcado. Por otra parte, dada su tendencia a formar agregados, su derivatización con técnicas comúnmente utilizadas en polisacáridos rinde resultados pobres y pérdida de su actividad endotóxica. En el presente trabajo de tesis se estudiaron distintas estrategias para la síntesis de conjugados de LPS de Salmonella Minnesota. La derivatización de LPS se llevó a cabo en la región polisacárida lejos del lípido A. Se han sintetizado conjugados con diversas sondas incluyendo, dansilo, biotina, peroxidasa de rábano picante (HRP) y complejos electroactivos. Los conjugados con biotina y HRP se utilizaron en el desarrollo de ensayos competitivos amperométricos para la detección de endotoxinas. La configuración de los ensayos involucra una superficie de oro modificada con un derivado del dextrano y como elemento de reconocimiento una proteína recombinante, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), que reconoce específicamente la región del lípido A del LPS. Para estos ensayos se ha estudiado la modificación de la superficie de oro con polímeros hidrofílicos con el objetivo de minimizar la interacción inespecífica de los componentes del ensayo con la superficie. La construcción de los electrodos se evaluó por medidas electroquímicas, elipsometría y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS). Con el sistema utilizando el conjugado de LPS-HRP se alcanzó un límite de detección de 0,06 UE mL-1.

Abstract:
Sepsis and septic shock are major causes of death. These conditions can be initiated by the massive release of lipopolysaccharide (LPS) from the cell wall of Gramnegative bacteria, which then inappropriately activates the innate immune system. Currently, the enzymatic Limulus Polyphemus amebocyte lysate (LAL) assay is used most widely to detect and quantify endotoxin in clinical and nonclinical samples. However, there are several limitations to this procedure. LPS is organized in three structural domains, a heteropolysaccharide which represents the antigenic surface of the bacteria called O-antigen, a short oligosaccharide, which is the core region and a fatty-acylated region called lipid A, which is the active moiety of LPS. Because of the chemical properties of LPS, studies of its biological pathways, its interactions with recognition molecules, and its interactions with modified surfaces are carried out mainly using labeled LPS. In contrast, because its ability to form aggregates, the modification of LPS using polysaccharides common labeling protocols gives poor yields and endotoxic activity loss. In this thesis work, different strategies were studied for the synthesis of Salmonella Minnesota LPS conjugates. The LPS labeling were carried out in the polysaccharide region, away from lipid A. We have synthesized conjugates with different probes including, dansyl, biotin, horseradish peroxidase (HRP) and electroactive complexes. The biotin and HRP derivatives were used in the development of competitive electrochemical assays for the detection of endotoxins. The assay configuration involves a dextran-derivative modified gold surface and a recombinant protein, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), as the recognition element, which specifically recognizes the LPS lipid A portion. For these assays, we have studied the gold surface modification with hydrophilic polymers with the objective of reducing the nonspecific interaction of the assay components with the surface. The construction of the electrodes was evaluated by electrochemical and ellipsometric measurements and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The device using the LPSHRP conjugate was able to detect the presence of endotoxins in concentrations as low as 0.06 EU mL-1.

Valacco, María Pía. "Avances en el estudio de las funciones de p8 a través del análisis de su localización subcelular y de la identificación de sus proteínas interactoras" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
p8 es una proteína de 8 kDa que fue identificada en rata debido a su inducción durante la fase aguda de la pancreatitis. Los niveles de expresión de p8 aumentan en líneas celulares en respuesta al estrés y a factores mitogénicos. Se postula un rol importante para p8 en la progresión tumoral, ya que, al anular su expresión en fibroblastos transformados, se inhibe el desarrollo tumoral. El objetivo de este estudio es comprender más profundamente las funciones de p8 así como las vías celulares en las que está involucrada. Un análisis de homología de secuencias nos permitió identificar a p8 en diferentes especies de eucariotas superiores, y no en eucariotas inferiores. Se encontró una NLS (señal de localización nuclear) altamente conservada en su secuencia. Ensayos de inmunocitoquímica nos permitieron estudiar su localización subcelular. Observamos que se encuentra nuclear en cultivos de células subconfluentes y uniformemente distribuida en toda la célula en cultivos superconfluentes. Su importación al núcleo es dependiente de energía, y su localización depende del estadio del ciclo celular, y del estado de acetilación. Demostramos que la NLS de p8 es funcional. p8 es lo suficientemente pequeña como para difundir libremente entre el núcleo y el citoplasma. Su NLS y el estricto control de su localización, indican que formaría parte de complejos multiproteicos. Para profundizar en esta hipótesis, identificamos por abordaje proteómico las proteínas que copurifican con p8. A partir de las proteínas identificadas construimos el interactoma de p8. El análisis de este interactoma indica que p8 es una proteína multifuncional que puede interactuar con distintas proteínas con diversas funciones en diferentes compartimentos celulares.

Abstract:
p8 is an 8 kDa protein that was first identified in rat due to its induction during the acute phase of pancreatitis. Various functions related to cell growth control and stress have been attributed to p8. An important role in tumor progression was also assigned to p8 since it was observed that transformed p8-/- fibroblasts do not induce tumors when injected in nude mice. In this study we aim to understand further, the functions of p8 and to find the pathways in which it is involved. Through sequence homology analysis we identified p8 in different species of higher eukaryotes, but not in lower eukaryotes. We saw that there is a highly conserved NLS (Nuclear Localization Signal). Through immunocytochemistry, we found that p8 presents nuclear localization in sub-confluent cells, but it localizes in the cytoplasm of confluent cells. We also observed that nuclear import of p8 is energy dependent, and that its sub- cellular localization changes with the cell cycle stage and the acetylation state of the cells. We proved the functionality of its NLS. p8 is small enough to diffuse between nucleus and cytoplasm passively. The fact that it presents a NLS and a strictly controlled sub-cellular localization suggests that it is forming part of multiprotein complexes. To study this, and to identify the proteins associated to p8 we performed co purification experiments and mass spectrometry analysis. With the identified proteins we built the p8 interactome, and conclude that p8 is a multifunctional protein that is capable of interacting with different proteins associated to different pathways in different cellular compartments.

Gueron, Geraldine. "Inflamación en la progresión del cancer de prostata. Hemo oxigenasa 1: regulación y significado funcional" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres. La inflamación es un factor de riesgo para esta enfermedad. La Hemo oxigenasa 1 (HO-1), es la isoforma inducible de la enzima limitante en la degradación del hemo y actúa contrarrestando el estrés oxidativo e inflamatorio. En este trabajo investigamos la expresión de HO-1 y sus consecuencias funcionales en líneas tumorales de próstata sensibles (MDA PCa 2b y LNCaP) e insensibles (PC3) a andrógenos. Comprobamos que los niveles basales de HO-1 son menores en PC3 respecto a MDA PCa 2b y LNCaP. El tratamiento con hemina aumentó la expresión de HO-1 tanto a nivel proteico como del mRNA en todas las líneas tumorales y disminuyó significativamente la proliferación e invasión en PC3 y MDA PCa 2b. Por fotografía time-lapse' comprobamos que el tratamiento de PC3 con hemina disminuyó marcadamente la motilidad celular. Se generó la línea estable PC3HO-1, en la cual la sobre-expresión de HO-1 redujo significativamente la proliferación y migración celular respecto a la línea transfectada con el vector vacío. El silenciamiento de HO-1 mediado por siRNA en la línea con altos niveles endógenos de esta proteína (MDA PCa 2b) incrementó significativamente la proliferación y la invasión respecto a las células tratadas con un siRNA control. Mediante array de genes involucrados en inflamación y angiogénesis, identificamos a MMP9 como un nuevo blanco, cuya actividad y expresión fue modulada por manipulación genética y farmacológica de HO-1 en las líneas de PCa. Más aún, células de la línea PC3HO-1 y su respectivo control fueron injectadas s.c. en ratones atímicos nu/nu para el análisis in vivo de tumores creciendo como xenógrafos. El crecimiento tumoral y la expresión de MMP9 se redujeron significativamente en los tumores PC3HO-1 comparado con los xenógrafos controles. Estos resultados implican por primera vez a HO-1 en la proliferación, migración e invasión celular de cáncer de próstata sugiriendo su rol potencial como blanco terapéutico en ensayos clínicos.

Abstract:
Prostate cancer is the second leading cause of cancer-associated death in men. Inflammation has been recognized as a risk factor for this disease. Heme Oxygenase 1 (HO-1), the inducible isoform of the rate-limiting enzyme in heme degradation, counteracts oxidative and inflammatory damage. Here we investigated the regulated expression of HO-1 and its functional consequences in PCa. We studied the impact of genetic and pharmacological disruption of HO-1 in the growth, invasion and migration in androgen sensitive (MDA PCa 2b and LNCaP) and insensitive (PC3) PCa cell lines. Our results show that HO-1 levels are markedly decreased in PC3 compared to MDA PCa 2b and LNCaP). Hemin treatment increased HO-1 at both protein and mRNA levels in all cell lines and decreased cell proliferation and invasion. Furthermore, overexpression of HO-1 in PC3 resulted in markedly reduced cell proliferation and migration. Accordingly, siRNA-mediated silencing of HO-1 expression in MDA PCa 2b cells resulted in increased proliferation and invasion. Using RT-qPCR-generated gene array, a set of inflammatory and angiogenic genes were upor down-regulated in response to HO-1 overexpression identifying MMP9 as a novel downstream target of HO-1. MMP9 production and activity was down-regulated by HO-1 over3expression. Furthermore, PC3 cells stable transfected with HO-1 (PC3HO-1) and controls were injected into nu/nu mice for analysis of in vivo tumor xenograft phenotype. Tumor growth and MMP9 expression was significantly reduced in PC3HO-1 tumors compared to control xenografts. Taken together, these results implicate HO-1 in PCa cell migration and proliferation suggesting its potential role as a therapeutic target in clinical settings.

Pontiggia, Rodrigo Martín. "Síntesis y caracterización de 2´-c-metilnucleósidos en aplicaciones de silenciamiento génico" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El presente trabajo se enmarca dentro del campo de los oligonucleótidos, más específicamente los empleados como silenciadores génicos. El uso de ácidos nucleicos en terapia antisentido posee dos limitaciones generales, su baja estabilidad en fluidos biológicos y su pobre biodistribución. Estos problemas pueden ser abordados mediante el uso de modificaciones químicas de los mismos. Según trabajos previos de nuestro laboratorio los 2'-C-metilnucleósidos (2CMNs) producen un aumento de la vida media de ribozimas cabeza de martillo cuando son incorporados en zonas simple cadena manteniendo niveles de actividad in vitro aceptables. En este contexto, el principal objetivo de este trabajo fue realizar la caracterización de los 2CMNs realizando ensayos en células con la ribozima cabeza de martillo modificada y estudiar la posible utilización de los 2CMN en aplicaciones doble cadena como siRNA. El primer paso consistió en el diseño de una ruta sintética que permitiera obtener los 2CMNs en forma eficiente y utilizando reactivos más económicos que los empleados en otras estrategias. Para poder preparar los oligonucleótidos a partir de los nucleósidos obtenidos fue necesario resolver problemas asociados a la protección de la posición 2'. Una vez realizado esto, se logró incorporar los 2CMN en oligonucleótidos de 12 monómeros de longitud para el estudio de las propiedades de hibrización y potencial uso en siRNA. Además, estas estructuras fueron modeladas y utilizadas en un estudio computacional que permitió conocer en detalle el impacto de la introducción de los 2CMN en una hélice doble cadena, justificando los resultados experimentales obtenidos. Para cumplir con el objetivo principal del trabajo, se diseñaron y sintetizaron ribozimas cabeza de martillo para reducir los niveles de expresión del receptor de estrógeno en células de cáncer de mamas, pudiendo cuantificar la relación actividad/resistencia en un contexto celular. La ribozima con 2'-C-metiluridina presentó mayores niveles de actividad que la no modificada, llegándose a observar el efecto en los niveles de receptor hasta 36 hs después de la transfección.

Abstract:
The present work can be included in the gene silencing oligonucleotide field. In general, oligonucleotide based technologies suffer two main drawbacks, low stability in biological fluids and bioavailability problems. According to previous research done in our laboratory 2'-C-methylnucleosides (2CMNs) are capable of increasing the half life of ribozymes when they are introduced in certain single chain positions. They have also shown to maintain acceptable activity levels in in vitro assays. These first experiments showed that is was possible to apply 2CMNs in an in vitro system. The main objective of this work is to further characterize 2CMNs, carrying out experiments with modified ribozymes in cells and studying their applicability in double stranded systems, with special interest in siRNA. To accomplish the main objective of the thesis different hammerhead ribozymes were designed and synthesized. They were successfully used to reduce the estrogen receptor alpha-transcription levels in breast cancer cells, finding that the ribozyme containing 2-C-methyluridine showed to be more active than the non modified ones; the activity was detectable up to 36 hours after the transfection. The first step consisted in finding a synthetic route which enabled the possibility of obtaining 2CMNs efficiently and using low price reagents. The synthesis of oligonucleotides using 2CMNs required to find a suitable protecting group for the tertiary 2'-alcohol. After solving these important tasks the building blocks were used to synthesize 12 mer oligonucleotides and used in melting point and circular dichroism experiments. These structures were simulated in silico and used to describe their properties.

Romanato, Marina. "Papel del heparan sulfato en el proceso de descondensación de la cromatina del espermatozoide humano" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Nuestro laboratorio estudia la descondensación nuclear del espermatozoide humano in vitro, intentando ahondar en la comprensión de las etapas del proceso y las moléculas involucradas en el mismo. La descondensación requiere la reducción de puentes disulfuro en las protaminas y la remoción de las mismas para ser reemplazadas por histonas ovocitarias. Los espermatozoides humanos pueden descondensarse in vitro con heparina y glutatión. Observamos en estudios previos que el heparán sulfato (HS), análogo estructural de la heparina, pero no así otros glicosaminoglicanos, presenta actividad descondensante in vitro similar a la heparina y propusimos que HS actuaría in vivo como aceptor de protaminas. El presente trabajo tuvo como objetivos (1) acercarse a las condiciones in vivo analizando el comportamiento de núcleos aislados frente a la descondensación con heparina y glutatión in vitro y (2) demostrar que HS está presente en el ovocito y podría funcionar como agente descondensante. Se utilizaron espermatozoides de donantes normospérmicos (OMS) y ovocitos de ratón. Los núcleos espermáticos aislados descondensaron con glutatión y heparán sulfato o heparina pero no con otros glicosaminoglicanos. El análisis por microscopía confocal reveló localización de HS en el citoplasma y el espacio perivitelino del ovocito. La utilización de enzimas específicas indicó que la capacidad descondensante del ovocito podía atribuirse a la presencia de HS. Estas son las primeras evidencias de la presencia de HS en el ovocito y de su posible rol como aceptor de protaminas durante la descondensación del espermatozoide humano in vivo.

Abstract:
Our laboratory studies human sperm nuclear decondensation in vitro, in an attempt to further understand the different stages of the process and the molecules involved in it. Decondensation requires protamine disulfide bond reduction followed by protamine removal to allow replacement by oocyte histones. Human spermatozoa can be decondensed in vitro with heparin and glutathione. In previous studies we showed that heparan sulfate (HS), structural analogue of heparin, but not other glycosaminoglycans, has a similar decondensing ability in vitro and we proposed that HS could function as protamine acceptor in vivo. The aims of the present study were (1) to approach in vivo conditions analyzing the decondensation of isolated sperm nuclei in vitro with heparin/HS and glutathione and (2) to demonstrate that HS is present in the oocyte and could thus function as decondensing agent in vivo. Spermatozoa obtained from normozoospermic (OMS) donors and mouse oocytes were used. Isolated sperm nuclei decondensed in vitro with HS or heparin but not with other glycosaminoglycans. Confocal microscopy revealed that HS is present in the ooplasm and perivitelline space of the oocyte. The use of specific glycosidases showed that oocyte decondensing capacity in vitro could be attributed to HS. These results provide the first evidence on the presence of HS in the oocyte and its possible role as sperm protamine acceptor during human sperm decondensation in vivo.

Antico Arciuch, Valeria Gabriela. "Mecanismos de proliferación dependientes del estado redox celular: rol de AKT y otras kinasas involucradas en la progresión del ciclo celular" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En las últimas décadas se demostró que la producción transitoria de peróxido de hidrógeno (H2O2) constituye un evento muy importante de señalización disparado a través de la activación de receptores de superficie o determinado por el estado metabólico mitocondrial, y que modula el grado de fosforilación de determinadas proteínas. En este contexto, estudios recientes han confirmado la presencia de kinasas en la mitocondria que hemos interpretado como un mecanismo modulatorio en la disponibilidad celular de las kinasas. Las mitocondrias normales poseen la mayor concentración celular de ATP y H2O2 en el estado estacionario y contribuyen naturalmente al grado de fosforilación y oxidación de proteínas, dos modificaciones post-traduccionales centrales en la activación de las kinasas. Sobre estas bases, formulamos la hipótesis que el estado redox produce efectos celulares diferenciales en consonancia con la activación de Akt1 y ERK1/2 en la mitocondria, y que en este compartimiento, el H2O2 determina cambios conformacionales que favorecen la fosforilación y posterior translocación nuclear de las mismas. Los estudios realizados en esta Tesis confirmaron que: 1) en la línea celular NIH/3T3, el H2O2 efectivamente modula la progresión del ciclo celular a través de la oxidación y fosforilación selectiva de Akt1 en mitocondrias; 2) en la línea tumoral LP07, el H2O2 asimismo promueve la oxidación selectiva de ERK1/2 o p38-JNK1/2 y posterior translocación al núcleo con efectos ulteriores en la proliferación celular; y 3) el sistema de tiorredoxinas (Trx) modula el destino celular regulando el nivel de oxidantes en las líneas celulares y provocando una activación selectiva en el eje central de Akt1 en el modelo tumoral analizado in vivo. En la línea NIH/3T3, la modulación por H2O2 involucró la entrada de P-Akt1 Ser473 a las mitocondrias, donde fue fosforilada en Thr308 por PDK1. A concentración celular limitada de H2O2, la fosforilación de Akt1 en Thr308 en mitocondrias fue significativa, determinó su pasaje al núcleo y disparó mecanismos genómicos que favorecieron la proliferación celular. En cambio, a elevadas concentraciones de H2O2, la asociación Akt1-PDK1 fue interrumpida y P-Akt1 Ser473 fue retenida en la mitocondria en detrimento de su translocación nuclear. La actividad disminuida de Akt1 favoreció la liberación de citocromo c al citosol conduciendo a la apoptosis. Los efectos diferenciales en la interacción Akt1-PDK1 dependieron de la oxidación selectiva de la Cys310 de Akt1 a ácido sulfénico y sulfónico. Las respuestas celulares observadas en la línea tumoral LP07 involucraron la activación selectiva de ERK1/2 y la interacción eficiente con MEK1/2 determinada por la oxidación de cisteínas conservadas pertenecientes a dominios redox sensibles. Estas modificaciones post-traduccionales que tuvieron lugar en la mitocondria determinaron el pasaje de la kinasa al núcleo. Considerando que las mitocondrias tumorales son disfuncionales, su incapacidad para incrementar la producción de H2O2 podría interrumpir la oxidación sincronizada de ERK1/2 y la regulación del ciclo celular causando la persistencia del fenotipo proliferante. En el mismo modelo tumoral analizado in vivo, el silenciamiento de Trx1 y 2 fue capaz de revertir el efecto de las condiciones redox proliferativas por una activación diferencial de Akt1. Los resultados obtenidos indicaron que al revertir la baja condición redox proliferante, P-Akt1 Ser473 aumentó en la mitocondria en detrimento de la translocación al núcleo, mientras que en los tumores que exhibieron bajo H2O2, P-Akt1 Ser473 se encontró predominantemente en el núcleo, sugiriendo una marcada modulación en la activación de la kinasa y su posterior translocación al núcleo. En esta Tesis, se demuestra el rol central del H2O2 en la activación y tráfico mitocondrial de Akt1 y ERK1/2 en la progresión del ciclo celular. Se concluye que la localización subcelular de estas kinasas en mitocondrias aporta un nuevo modelo para explicar la regulación de la activación por la oxidación de cisteínas específicas y la fosforilación en los residuos correspondientes. De esta forma, el ciclo intramitocondrial de Akt1 y ERK1/2 constituye un eje central para la modulación redox del destino celular en células normales o tumorales.

Abstract:
Over the last decades, it has been demonstrated that the transitory production of hydrogen peroxide (H2O2) constitutes a very important event in signaling that can be triggered by activation of surface receptors or determined by mitochondrial metabolic state, and that modulates the phosphorylation level of certain proteins. In this context, recent studies have confirmed the presence of kinases in the mitochondria that we interpreted as a modulatory mechanism in the cellular availability of the kinases. Normal mitochondria have the major cellular ATP and H2O2 steady state concentrations and naturally contribute to the phosphorylation level and protein oxidation, two main postranslational modifications in the activation of kinases. On these bases, we postulated the hypothesis that redox state produces differential cellular effects in accord to Akt1 and ERK1/2 activation in mitochondria, and that in this compartment, H2O2 determines conformational changes that favor their phosphorylation and subsequent nuclear translocation. The studies performed in this Thesis confirmed that: 1) in NIH/3T3 cell line, H2O2 effectively modulates cell cycle progression through the oxidation and selective phosphorylation of Akt1 in mitochondria; 2) in the tumoral cell line LP07, H2O2 promotes as well the selective oxidation of ERK1/2 or p38-JNK1/2 and further translocation to nucleus with later effects in cell proliferation; and 3) the thiorredoxin system (Trx) modulates cell fate regulating the oxidant level and inducing a selective activation in the central axis of Akt1 in the tumoral model analyzed in vivo. In NIH/3T3 cell line, the modulation by H2O2 involved the entrance of P-Akt1 Ser473 to mitochondria, where it was phosphorylated in Thr308 by PDK1. At H2O2 cellular limiting concentrations, the phosphorylation of Akt1 in Thr308 in mitochondria was pronounced, determined its passage to nucleus and triggered genomic mechanisms that favoured cell proliferation. Oppositely, at higher H2O2 concentrations, Akt1-PDK1 association was disrupted and P-Akt1 Ser473 was retained in mitochondria in detriment of its nuclear translocation. Akt1 low activity favoured the release of cytochrome c to cytosol triggering apoptosis. The differential effects in Akt1-PDK1 interaction depended on the selective oxidation of Cys310 in Akt1 to sulfenic and sulfonic acid. The cellular responses observed in LP07 cell line engaged the selective activation of ERK1/2 and the efficient interaction with MEK1/2 determined by the oxidation of conserved cysteines belonging to redox sensitive domains. These postranslational modifications that took place in mitochondria determined the passage to nucleus. Considering that tumoral mitochondria are dysfunctional, the incapacity to increase H2O2 concentration could disrupt the synchronized oxidation of ERK1/2 and the regulation of cell cycle causing the persistence of the proliferative phenotype. In the same tumoral model analyzed in vivo, Trx1 and 2 silencing was able to revert the effect of redox proliferative conditions by a differential activation of Akt1. The obtained results indicated that in these conditions P-Akt1 Ser473 increased in mitochondria instead of translocating to nucleus, while in tumors with low H2O2 condition, P-Akt1 Ser473 was found predominantly in nucleus, suggesting a pronounced modulation in the activation and translocation of the kinase. In this Thesis, we demonstrated the key role of H2O2 in the activation and mitochondrial traffic of Akt1 and ERK1/2 in cell cycle progression. We conclude that the subcelullar localization of these kinases in mitochondria provides a new model to explain the regulation of the activation by oxidation of specific cysteines and the phosphorylation in the corresponding residues. In this sense, the intramitochondrial cycle of Akt1 and ERK1/2 constitutes a central axis for the redox modulation of cell fate in normal and tumoral cells.

Alvarez, Lautaro Damián. "Síntesis, actividad biológica y bases moleculares de acción de análogos rígidos de esteroides neuroactivos y hormonas esteroidales" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta tesis se investigó la influencia de la conformación global del esqueleto esteroidal sobre la actividad de los esteroides neuroactivos y de los glucocorticoides. Por un lado, se diseñaron y sintetizaron tres 1,11-epoxiesteroides y un 11,19-epoxiesteroide, análogos de esteroides neuroactivos cuya conformación está restringida por la presencia del puente epóxido. Por otra parte, se estudió la actividad glucocorticoide y las bases moleculares de acción de dos análogos rígidos: 21-hidroxi-6,19-epoxiprogesterona (21OH-6,19OP), y su 21-hemisuccinato derivado, 21-hemisuccinoiloxi-6,19-epoxiprogesterona (21HS-6,19OP). La actividad transcripcional de ambos compuestos se determinó utilizando el gen reportero MMTV-LUC y evaluando la capacidad de los mismos de inhibir la actividad del factor de transcripción NFκB. También se estudió el efecto apoptótico de estos compuestos en los fibroblastos de ratón L929. El conjunto de estos resultados muestra que estos análogos rígidos poseen potenciales aplicaciones como drogas glucocorticoides. Finalmente, utilizando la herramienta computacional denominada simulación por dinámica molecular se investigaron las bases moleculares de acción de 21OH- 6,19OP y 21HS-6,19OP. Para ello se determinó el comportamiento dinámico del dominio de unión a ligando del receptor de glucocorticoides unido a cada uno de estos análogos rígidos. Los resultados muestran que cambios en regiones claves del receptor podrían ser utilizadas para explicar los resultados experimentales obtenidos.

Abstract:
This thesis explores the influence of global conformation of the steroid skeleton on the activity of neuroactive steroids and glucocorticoids. In the first part, three 1,11-epoxysteroids and one 11,19-epoxysteroid analogs of neuroactive steroids with their conformation restricted by an oxygen bridge, were designed and synthesized. On the second part, the glucocorticoid activity and the molecular basis of action of two rigid analogs, 21-hydroxy-6,19-epoxyprogesterone (21OH-6,19OP) and its hemisuccinate 21-hemisuccinoyloxy-6,19-epoxyprogesterone (21HS-6,19OP), was studied. Transcriptional activity of both compounds was determined using the reporter gene MMTV-LUC and evaluating their capacity to inhibit the activity of the transcription factor NFκB. The apoptotic effect of these compounds was also studied in mouse fibroblasts L929. The results obtained show that these rigid analogs have potential aplications as glucocorticoid drugs. Finally the computational tool known as molecular dyamics simulation was used to investigate the molecular basis of action of 21OH-6,19OP and 21HS-6,19OP. Thus the dynamic behavior of the ligand binding domain of the glucocorticoid receptor bound to these rigid analogs was determined. The results show that changes in key regions of the receptor may explain the experimental results.

Ladelfa, María Fátima. "Estudio de las propiedades replicativas in vitro de la cepa A663 de Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5) y de la función de la proteína Us3" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Este trabajo de tesis contribuyo a la caracterizacion de la cepa argentina A663 de Herpesvirus Bovino tipo 5 (BoHV-5) mediante el estudio de sus propiedades replicativas in vitro y del rol de la proteina Us3. En el primer caso se realizaron cineticas de crecimiento y se evaluaron los tamanos de las placas de lisis y de infeccion de las cepas A663 y N569 de BoHV-5. La produccion total de particulas virales infectivas en funcion del tiempo fue similar entre ambas cepas, sin embargo la cepa A663 resulto menos eficiente en la liberacion de particulas virales al medio extracelular y en la dispersion celula a celula, observandose para la cepa A663 una reduccion del 90% y del 80% en el tamano de la placa de lisis y de infeccion, respectivamente. Por otro lado, se secuencio la region codificante para la proteina Us3 de la cepa A663 de BoHV-5 y se observo un alto porcentaje de homologia con las secuencias correspondientes a otras cepas de BoHV-5. Mediante las tecnicas de Northern y Western blot se demostro que el gen us3 se expresa tempranamente (desde los 30 minutos post infeccion) y de manera prolongada (hasta las 48 horas post infeccion). Los ensayos in vitro se realizaron utilizando construcciones que expresaban la proteina Us3 wt o una version mutante de esta proteina que carece de actividad de proteina quinasa, fusionadas a la proteina fluorescente ECFP (US3-ECFP y Us3K261D-ECFP). Se observo que la proteina Us3 de BoHV-5 induce el redondeamiento celular y provoca el desensamblado de las fibras de estres, siendo estos efectos independientes de su funcion de quinasa. Ademas, la proteina mutante Us3K261D disminuyo la formacion de proyecciones de celulares y modifico la localizacion subcelular de la proteina Us3 de BoHV-5. En conjunto, los resultados obtenidos permitieron conocer las propiedades replicativas in vitro de la cepa A663 de BoHV-5 y constituyeron el primer reporte sobre el estudio de la funcion de la proteina Us3 de BoHV-5.

Abstract:
This thesis contributed to the characterization of the Argentinean bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) A663 strain by studying its in vitro growth properties and the function of the Us3 protein. Firstly, growth kinetics, lysis and infection plaque size assays were performed for BoHV-5 A663 and N569 strains. The total amount of infection virus produced was similar between both strains at each time assayed; however, A663 strain was less efficient than N569 strain in releasing infective viral particles to the extracellular media and in cell-to-cell spread, as shown by a reduction of 90% and 80% in its lysis and infection plaque size, respectively. On the other hand, the region encoding the Us3 protein of BoHV-5 A663 strain was sequenced and high homology was observed between it and other sequences of BoHV-5 strains. Then, early (from 30 minutes post infection) and prolong (up to 48 hours post infection) expression of us3 gene was demonstrated by Northern and Western blots assays. Finally, in vitro studies were performed with genetic constructions to express wt Us3 protein or a mutated version of this protein lacking its kinase activity, fused to the fluorescent protein ECFP (Us3-ECFP and Us3K261D-ECFP). In transient transfection assays it was observed that Us3 BoHV-5 protein induced cell rounding and stress fiber breakdown independently of its kinase activity. Besides, the point mutation in the Us3K261D protein reduced cell projections formation and modified the subcellular localization of BoHV-5 Us3 protein. Taken together, these results allowed the assessment of the in vitro growth properties of BoHV-5 A663 strain and constituted the first report of the function of the BoHV-5 Us3 protein.

Larocca, Luciana. "Perfil de activación de macrofagos de ratones nod: efecto de la preñez y modulación por el péptido intestinal vasoactivo (VIP)" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Una de las consecuencias de una mala resolución de la inflamación aguda es el establecimiento de un proceso inflamatorio crónico con diversos eventos asociados como, por ejemplo, alteración de la homeostasis, falla funcional y la posibilidad de inducción de pérdida de la tolerancia inmunológica. El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por una severa disfunción secretoria salival y lagrimal conocida como sintomatología sicca. Como la mayoría de las enfermedades reumáticas afecta en mayor medida a mujeres. Los ratones diabéticos no obesos (NOD) ofrecen un modelo interesante para estudiar procesos de mantenimiento y ruptura de la homeostasis tisular que conducen a pérdida de tolerancia y autoinmunidad. En este modelo a partir de las 12 semanas, en el estado prediabético desarrollan una sialadenitis espontánea a predominio Th1 con pérdida de la función secretoria, semejante en algunos aspectos a la enfermedad en humanos. Por otro lado, en el modelo NOD prediabético observamos una disminución de la tasa de natalidad a partir de la tercera preñez y en esos casos hemos observado procesos re reabsorción embrionaria a los 10 días de gestación. Los macrófagos son células del sistema inmune que están altamente especializadas y cumplen un papel destacado en la inmunidad anti-infecciosa ya que tienen alta capacidad fagocítica, microbiostática y microbicida. El VIP por su naturaleza como factor anti-inflamatorio que se lo ha propuesto como agente terapéutico para patologías autoinmunes, como la artritis reumatoide (AR) y la enfermedad de Crohn. En la primera y segunda parte de este trabajo quisimos ver como respondían los macrófagos NOD frente a LPS y presentamos evidencias que producen mayores niveles de mediadores pro-inflamatorios y menor cantidad de IL-10; VIP, por su parte, modula la respuesta inflamatoria actuando a través de al producción de IL-10 y metabolitos de COX, como por ejemplo la PGE2, que limitan la producción de nitritos. Asimismo los macrófagos NOD presentan una translocación basal de la subunidad p65 de NF-kB y VIP inhibe la translocación. La preñez normaliza todos los factores antes mencionados. En una tercera y cuarta parte quisimos determinar cómo respondían los macrófagos NOD frente a timocitos apoptóticos y como se modifica durante la preñez y observamos que producen mayores niveles de mediadores pro-inflamatorios y menor cantidad de IL-10, también observamos translocación basal en la subunidad p65; de NF-kB y el VIP prodría modular la respuesta inflamatoria como pasaba frente a LPS. Mientras que durante la preñez no se observa translocación a nivel basal de p65 y los macrófagos producen menores niveles de nitritos en presencia del estimulo apoptótico y se induce la producción de IL-10 por este estímulo, no requiriendo del VIP. Finalmente, en la quinta parte estudiamos cómo se comportan los macrófagos NOD frente a células acinares y pudimos ver que en presencia de ese estimulo tanto los nitriros como IL-10 se comportan a lo observado frente a LPS.

Abstract:
The establishment of a chronic inflammatory process is one of the various consequences of an impaired resolution of the acute inflammatory response. It involves several associated events such as homeostatic imbalance, functional failure and immunotolerance loss.Sjögren's syndrome (SS) is an autoimmune disease characterized by a severe secretory dysfunction known as sicca syndrome and, as most autoimmune diseases, it affects women with higher incidence. Non obese diabetic (NOD) mice offer an interesting model to study tissue homeostasis maintenance or disruption that might lead to tolerance loss and autoimmunity. At 12 weeks of age in the prediabetic stage mice develop a Th1 prodominant spontaneous sialoadenitis resembling SS. On the other hand, a reduced birthrate was observed in prediabetic NOD females that were 16 weeks of age at the time of mating with an increased resorption rate as determined at 10 days of gestation. Macrophages are immune cells highly specialized and with a major role in anti-infectious immunity due to their high phagocytic and anti-microbial activity. Vasoactive intestinal Peptide (VIP) has strong anti-inflammatory effects and it has been proposed as a therapeutic agent for autoimmune pathologies as Rheumatic Arthiritis and Crohn Disease. In the first and second parts of this work we analyzed the macrophage response upon LPS stimulus and we present evidence of their higher levels of pro-inflammatory mediators and lower of IL-10; and that VIP modulates the inflammatory response through the production of IL-10 and COX metabolites as PGE2 thus limiting nitrites production. Likewise, NOD macrophages present a basal translocation of p65 subunit of NF-kB and VIP inhibits this effect. Pregnancy, in turn, normalizes these parameters. The third part of this Thesis shows the response of macrophages upon a phagocytic stimulus as that of apoptotic thymocytes and how this may change during pregnancy. We observed that they produce higher levels of proinflammatory mediators and lower levels of IL-10; we have also seen p65 basal translocation to the nucleus in these cells. VIP could also modulate the inflammatory response as observed in LPS stimulated macrophages. Macrophages isolated from pregnant NOD mice do not show basal translocation of p65, they do not produce nitrites when faced with a phagocytic stimulus and they secrete IL-10 even in the absence of VIP. Finally, we determined the response of macrophages co-cultured with acinar cells and we found that acini induce a similar inflammatory response to the observed with LPS.

Girotti, María Romina. "Análisis proteómico de los mecanismos moleculares de progresión tumoral relacionados con la proteína Sparc" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
SPARC (proteína secretada acídica y rica en cisteínas) es una glicoproteína sobreexpresada en una gran variedad de tumores favoreciendo la progresión tumoral y metástasis. Su rol biológico ha sido demostrado además en remodelación de tejidos, migración celular endotelial, morfogénesis y angiogénesis. Nuestro laboratorio ha demostrado que la transfección estable de células tumorales de melanoma con una secuencia de ADN antisentido de SPARC, promovió la inhibición del crecimiento tumoral en un modelo murino in vivo. Sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares por los cuales SPARC ejerce su efecto protumoral. Esta tesis de doctorado se enfocó en la búsqueda de intermediarios moleculares por los cuales SPARC favorece la progresión tumoral. Mediante análisis proteómicos globales aplicados al modelo de melanoma humano con disminución forzada de la expresión de SPARC, pudimos dilucidar un mecanismo molecular por el cual SPARC actúa sobre la progresión tumoral. Esta vía se centra en el eje TGFbeta1/ colágeno tipo I/ integrinas alfa2beta1 a través del cual SPARC regula la invasividad celular mediada por catepsina B. Por otro lado, se demostró que SPARC induce el cambio de E‐ a N‐caderina de membrana permitiéndoles a las células de melanoma transmigrar a través de una monocapa de células endoteliales mediante un mecanismo molecular independiente al descripto para la inducción de catepsina B. Además, las células deficientes en SPARC presentaron una expresión disminuida de genes asociados con propiedades mesenquimales revelando que SPARC está involucrada activamente en la transición epitelio‐mesenquimal y en la progresión metastásica.

Abstract:
SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteins) is a secreted glycoprotein related to tumor progression and metastasis and overexpressed in different tumors. Its role has been described in several biological processes that include tissue remodelling, endothelial cell migration, morphogenesis and angiogenesis. Our laboratory showed that the stable transfection of tumor cells with antisense SPARC DNA abolished tumorigenicity in an in vivo melanoma murine model. However, little is known about the molecular mechanisms affected by SPARC during tumor growth. This thesis was focused in the search of molecular mediators of SPARC protumoral effect and to address this objective a proteomic strategy was applied. Global protein expression analysis of the melanoma proteome following enforced downregulation of SPARC expression led us to elucidate a molecular mechanism where SPARC makes use of TGFbeta1/collagen I and integrin alfa2beta1 to promote cathepsin B‐mediated melanoma invasiveness. SPARC also induces E‐ to N‐cadherin switch enabling melanoma cells to transmigrate across an endothelial layer through a mechanism that does not involve the molecular mediators showed for cathepsin B. In addition, SPARC‐deficient cells also exhibited decreased expression of genes associated with the acquisition of mesenchymal traits revealing that SPARC plays a key role in the promotion of epithelial to mesenchymal transition and melanoma aggressiveness.

Marazita, Mariela C.. "P19INK4D y su fosforilación secuencial son críticas para el mantenimiento de la integridad del genoma" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas INK4 (p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c, y p19INK4d) componen una familia de inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CDKs) que funcionan en la fase G1 bloqueando la actividad de las quinasas CDK4 y CDK6. Mientras que comparten similitudes en sus estructuras formadas por repeticiones de motivos ankirina, estas proteínas difieren en sus patrones de expresión durante el desarrollo y en el adulto. Más allá de la aparente redundancia de su función en el control del ciclo celular, algunos de sus miembros han sido involucrados en distintos procesos tales como diferenciación, senescencia y supresión tumoral. En este trabajo demostramos que p19INK4d es inducido por radiación UV en diferentes tipos celulares (células de Leydig MA-10, cultivos primarios de células de Leydig, BHK-21 y WI-38) y que la inducción es específica de este miembro de la familia. Planteamos que la inducción podría implicar una posible participación de p19INK4d en la reparación del ADN. Mediante diversas estrategias, establecimos que p19INK4d efectivamente tiene una función en este proceso. Además, frente a daño genotóxico la disminución en los niveles de p19INK4d aumentó el número de aberraciones cromosómicas, concluyendo que la actividad de p19INK4d afecta el mantenimiento de la integridad del genoma. Sumado a esto, las células con niveles reducidos de p19INK4d resultaron con menor capacidad de sobrevivir al tratamiento con radiación UV. En respuesta al daño al ADN se encienden una serie de cascadas de señales que involucran diversas proteínas quinasas. Estas quinasas activan a su vez diferentes sustratos efectores de la respuesta conduciendo a la reparación, o no, del daño. Habiendo descripto una función de p19 en este proceso el siguiente objetivo consistió en estudiar si p19 formaba parte de este grupo de proteínas efectoras fosforiladas frente al daño. Encontramos que p19 es fosforilada por agentes que inducen diferentes tipos de daño (radiación UV, péptido β-amiloide y cisplatino). Identificamos dos sitios de fosforilación, serina 76 y treonina 141, los cuales son fosforilados en forma secuencial. Los resultados señalan a CDK2 y CDK5 como responsables de la fosforilación en serina 76 y a PKA en treonina 141. La fosforilación de ambos sitios ocurre en el citoplasma y la serina 76 es necesaria para la translocación de p19 al núcleo en esta respuesta. Evaluamos luego la relevancia fisiológica de la fosforilación en estos sitios. Encontramos que tanto la serina 76 como la treonina 141 son estrictamente necesarias para la función de p19 en la reparación del ADN. Sin embargo, mutantes en estos sitios incapaces de ser fosforiladas, mantienen la misma capacidad de inhibir la proliferación del ciclo celular cuando son sobreexpresadas. Esto señala que existe una independencia en la función de reparación respecto de la función inhibitoria de CDK4/CDK6. Por último, iniciamos el estudio referido a las posibles proteínas que interactúan con p19INK4d relacionadas a la función de reparación del ADN. Describimos seis interactores encontrados por análisis de doble híbrido en levaduras que resultan de particular interés porque presentan funciones en procesos comunes a p19INK4d. Estos posibles interactores participan en la reparación del ADN, en la remodelación de la cromatina y en la regulación de factores de transcripción del ciclo celular y la apoptosis. En vista de la participación de p19INK4d en respuesta a diversos agentes genotóxicos, que activan distintos mecanismos de reparación, postulamos que p19INK4d actuaría en la reparación del ADN específicamente en una etapa temprana de la respuesta celular al daño al ADN. El análisis de los potenciales interactores de p19INK4d, luego de la injuria genotóxica, permite sugerir la participación de esta proteína en los complejos remodeladores de la cromatina necesarios para permitir el acceso de las maquinarias de reparación en los sitios de daño.

Abstract:
INK4 proteins are members of a family of cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors that function in G1 to block the activity of CDK4 and CDK6. While they share clear structural similarities, numerous studies have shown that INK4 proteins differ in their expression patterns during development and in the adult, and have differing roles in differentiation, senescence and tumor suppression. We demonstrated that p19INK4d is induced in response to UV radiation in different cell types (Leydig MA-10 cell line, primary Leydig cell culture, BHK-21 y WI-38) and that this induction is specific of this family member. We hypothesized that this fact could be related to a role of p19INK4d in DNA repair. Taking advantage of diverse strategies, we found that p19INK4d effectively participates in this process. Adding to this, diminished p19INK4d levels when cells are exposed to genotoxics leads to an increase in the number of chromosomal aberrations. From these facts we concluded that p19INK4d influences the maintenance of genome integrity. Furthermore, cells with reduced p19 expression resulted in a significant decrease of the survival rate upon UV damage. In DNA damage response different pathways are triggered involving the activity of protein kinases. These kinases in turn activate diverse substrates that act as effectors of the response leading or not to DNA repair. Having described a function of p19INK4d in this process, the next aim leaded the study to analize whether p19INK4d is part of the effector proteins phosphorylated after DNA damage. We found out that p19 is phosphorylated by treatment with agents which induce different types of DNA damage (UV light, β-amyloid peptide and cisplatin). We identified two phosphorylation sites, serine 76 and threonine 141, which are sequentially phosphorylated. Our results pointed out CDK2 and CDK5 as responsible kinases to act on serine 76 and PKA as the one acting on threonine 141. Both sites are phosphorylated in the cytoplasmic space but only serine 76 is required for p19INK4d translocation to the nucleus in this response. We investigate the physiological relevance of the phosphorylation process in these sites. We showed that serine 76 and threonine 141 are strictly necessary for p19 function in DNA repair. However, those mutants of p19 not able to be phosphorylated have full capacity for inhibiting cell proliferation when they are overexpressed. This fact indicates the independence of p19INK4d functions. Lastly, we began the study related to potential proteins interacting with p19INK4d linked to DNA repair. We described six interactors found by a yeast two hybrid screening which appear particularly interesting because they have functions in common processes to p19INK4d. These interactors participate in processes such as: DNA repair, chromatin remodelling and regulation of transcription factors of the cell cycle and apoptosis. Taking into account p19INK4d participation in response to diverse genotoxic agents which activate different DNA repair mechanisms, we finally raised the hypothesis that p19 would be taking part in an early step in DNA damage response, specifically in DNA repair. The analysis of potential p19INK4d interactors, after genotoxic injury, suggests that this protein could play a role as a member of chromatin - remodeling complexes necessary for the accessibility of DNA repair machineries to DNA damaged sites.

Llorente, Briardo Ernesto. "Un rol biológico propuesto para las misteriosas polifenol oxidasas vegetales" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las polifenol oxidasas son ciertamente enzimas muy intrigantes. A pesar de haber sido estudiadas durante décadas y ser sus reacciones catalíticas ampliamente conocidas, no ha sido posible asignarles una localización precisa dentro de ninguna ruta metabólica. Aún más notable es que, incluso luego de más de 110 años de investigación transcurridos desde su descripción inicial en 1896, su función biológica es todavía un misterio. Las PPO son enzimas plastídicas ubicuas en vegetales que catalizan la conversión oxígeno-dependiente de fenoles a quinonas. Los sustratos fenólicos de PPO se localizan en la vacuola y entran en contacto con la misma cuando se producen daños en la compartimentación intracelular. Las quinonas formadas por la actividad de PPO son especies altamente reactivas, capaces de reaccionar con virtualmente todos los componentes celulares. Estas conducen a la formación y precipitación de polímeros oscuros similares a la melanina, un fenómeno conocido con el nombre de pardeamiento enzimático. Este fenómeno es responsable de cuantiosas pérdidas económicas en el mercado de frutos y vegetales y, actualmente, sólo puede ser parcialmente controlado mediante el uso de aditivos potencialmente dañinos para la salud humana. Con el propósito de contribuir al entendimiento del rol biológico y la evolución de estas enzimas, y a su vez generar un cultivo exento del deterioro oxidativo mediado por PPO, diversas líneas transgénicas (-PPO) de papa (Solanum tuberosum) con reducida actividad PPO fueron obtenidas mediante ingeniería genética y caracterizadas tanto a nivel fisiológico como molecular. El cultivo de papa fue elegido como modelo para este trabajo por ser el tercer cultivo de mayor consumo en el mundo y una de las alternativas principales para suplir las próximas necesidades alimentarias de la creciente población mundial. Considerando la relevancia intelectual y económica de estas enzimas, esta tesis trata tanto con aspectos biológicos como prácticos del estudio de las PPO. Un exhaustivo análisis de seguridad reveló que las papas -PPO son seguras para el consumo, si bien son metabólicamente diferentes a sus parentales silvestres (WT, de sus siglas en ingles Wild Type). Este estudio instauró el debate sobre la relevancia de los conceptos actualmente utilizados para la evaluación de la seguridad de cultivos transgénicos. En esta línea, diversos estudios sensoriales realizados en ratones y humanos revelaron que, además de su vida útil más prolongada, los tubérculos -PPO poseen mejoras organolépticas. Esta serie de estudios representaron el primer ejemplo exitoso de la aplicación de un modelo animal y paradigmas neurobiológicos en el estudio de un cultivo genéticamente modificado. Paralelamente, experimentos con patógenos e insectos fueron llevados a cabo para explorar las potenciales implicancias de PPO en los procesos de resistencia a estrés biótico. El desarrollo de un nuevo método para estudiar la enfermedad más devastadora del cultivo de papa, el tizón tardío, causado por el oomiceto Phytophthora infestans, permitió identificar que las plantas -PPO son más resistentes a este patógeno mediante mecanismos que parecen involucrar la participación de compuestos fenólicos. Inversamente, experimentos realizados con el insecto plaga Cyclocephala signaticollis mostraron que los tubérculos -PPO eran consumidos en una mayor proporción que los tubérculos WT por este coleóptero. A su vez, los análisis filogenéticos sugieren que las PPO vegetales fueron adquiridas por transferencia génica horizontal a partir de bacterias como una adaptación de las plantas primitivas al ambiente terrestre. En conjunto, estos estudios añaden una pequeña pero importante contribución a la comprensión de la evolución y la función biológica de las enzimas PPO que podría ser útil para el futuro desarrollo de nuevos cultivos mejorados. Finalmente, y probablemente el aspecto más interesante de esta tesis, es que, de la síntesis de los experimentos realizados durante el transcurso de este estudio, ha emergido una hipótesis que propone por primera vez una sugestiva explicación sobre el rol biológico de las PPO vegetales como parte de un sistema de defensa contra la depredación. El modelo propuesto aporta una explicación para el mecanismo de acción de PPO que es coherente con las evidencias evolutivas y, a su vez, permite interpretar una serie de intrigantes resultados previamente reportados por otros grupos de investigación.

Abstract:
The polyphenol oxidases are certainly very intriguing enzymes. Despite having been studied for decades and their catalytic reactions are well known, no precise location has been assigned to this enzyme in any known metabolic pathway. Remarkably, even after over 110 years of research since its initial description in 1896, its biological function is still a mystery. The PPOs are ubiquitous plastid plant enzymes that catalyze the oxygen-dependent conversion of phenols to quinones. PPO phenolic substrates are located in the vacuole and come into contact with the enzyme when disruption of the intracellular compartmentalization takes place. The quinones formed by PPO activity are highly reactive species that can react with virtually all cellular components, leading to the formation and precipitation of dark melanin-like polymers, a phenomenon known as enzymatic browning. This phenomenon is responsible for enormous economic losses in the fruit and vegetable industry and is currently partially controlled through the use of additives which have some adverse effects on human health. In an attempt to contribute to the understanding of the biological function and evolution of these enzymes, and to generate a quality improved crop exempt from the PPO-mediated oxidative damage, several transgenic potato (Solanum tuberosum) lines (-PPO or nonbrowning) with reduced PPO activity were genetically engineered and characterized both at the physiological and molecular levels. Potato was chosen as a model for this study because it is currently the third most important food crop consumed worldwide and a critical alternative for feeding the world’s growing population. Considering the intellectual and economic relevance of these enzymes, this thesis deals with both biological and practical aspects of the study of PPO. A comprehensive evaluation of the safety assessment of the transgenic lines revealed that the nonbrowning potatoes present no risk for adverse health effects. Although, they are metabolically different from wild-type (WT) potatoes. An exhausted safety assessment analysis evidenced no adverce health effects, establishing a debate about the relevance of the concepts currently used to assess the safety of genetically modified crops. In line with these aspects, sensory studies in mice and humans revealed that, in addittion to their extended shelf life, nonbrowning potatos have organoleptic improvements over the WT potatos. This series of studies represented the first successful example of the implementation of an animal model and neurobiological paradigms in the study of a genetically modified crop. In parallel, studies with pathogens and insects were carried out to study the potential implications of PPO in biotic stress resistance processes. A new method to study the most devastating disease affecting potato, the “late blight”, caused by the oomycete Phytophthora infestans, was developed and applied to evaluate the disease resistance of -PPO plants. The transgenic plants presented an increased resistance to this pathogen through mechanisms that seem to involve the participation of phenolic compounds. Conversely, experiments performed with the insect pest Cyclocephala signaticollis showed that -PPO tubers were consumed in greater proportions than WT tubers by this coleopteran. In turn, phylogenetic analyses suggests that plant PPOs were acquired by horizontal gene transfer from bacteria as an adaptation of primitive plants to the terrestrial environment. In summary, these studies provide a small but important contribution to the understanding of the evolution and biological function of PPO enzymes that could be useful for the future development of new improved crops. Finally, and perhaps the most interesting and relevant aspect of this thesis, is that a new hypothesis that provides an suggestive explanation for the biological role of plant PPOs as part of a defense system against predation has emerged from the work done. The proposed model provides an explanation for the mechanism of action of PPO that, is consistent with the evolutionary evidence, and also allows to interpret a number of intriguing results previously reported by other research groups.

Prado Acosta, Mariano. "S-layer de Lactobacillus acidophilus: caracterización y análisis funcional" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las S-layers son estructuras externas de una sola especie de (glico) proteína, Se calcula que aproximadamente 5×105 monómeros de la proteína S-layers son necesarios cubrir una célula bacilar procariótica. Las funciones biológicas que se han sugerido para las S-layer son aún hipotéticas y requieren de mayor comprobación experimental. Se las asocia con roles de protección contra enzimas hidrolíticas, cambios de pH y estrés, la captación de moléculas y iones. Otra posible función que cumplirían sería la de adhesina, facilitando que la bacteria se adhiera a distintas superficies y ayudar a mantener la forma y rigidez de la célula. Durante el transcurso de mi tesis de Doctorado, he elegido a la proteína S-layer de Lactobacillus acidophilus, la opción de este microorganismo se debió a las características probióticas y la importancia del mismo en la industria alimentaria. Se caracterizó una nueva función biológica para la proteína S-layer de Lactobacillus acidophilus ATCC4356 que no había sido descripta previamente. La capacidad de murein-hidrolasa es una característica nueva que cumpliría un rol adaptativo en esta bacteria. La actividad lítica de la proteína S-layer de demostró sobre la pared celular y células enteras de Salmonella entérica serovar Newport el cual fue usada como patógeno modelo. Esta actividad respaldaría la característica probiótica de la cepa de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (Prado Acosta et al. 2008). También se utilizó a la S-layer como compuesto sinérgico con el antibiótico nisina, esto sirvió para disminuir la concentración inhibitoria minima casi un 50 % en organismos patógenos del tracto intestinal como Bacillus cereus y Staphylococcus aureus (Prado Acosta et al. 2009). Nuestros resultados también mostraron una variación de la expresión de S-layer en Lactobacillus acidophilus creciendo en condiciones de alta salinidad y se mostró que son de gran importancia para la supervivencia de la célula en estas condiciones.

Abstract:
Lactobacillus acidophilus is one of the major species found in human intestines. Some strains of lactobacilli are believed to be probiotic and are extremely used in food industry Many species of the genus Lactobacillus possess S-layers, this proteins are arrays composed of a single protein that constitute the outermost cell envelope in numerous Bacteria, they have been considered to function as protective coats, cell shape determinants, and be involved in cell adhesion. To date several studies focus on the structure of S-layers, but their biological functions remain poorly understood. Zymogram analysis with cell-wall extracted from Salmonella enterica serovar Newport as substrate revealed a true uncharacterized lytic activity coincident with that identified by western blot. This activity was also observed with both cell wall and whole cells. The analysis of the peptidoglycan breakage products showed an increase of free amino- acids suggesting that this S-layer acts as an endopeptidase. This gene was sequenced and showed 99% homology with other slpA from Lb. acidophilus strains and in silico analysis of the deduced protein showed a C-terminal motif which aligned with murein hydrolases of several Lactobacillus strains. The C-terminal motif was cloned and expressed in Bacillus subtilis where it conserved the murein hydrolase activity. Due to this enzymatic activity we show that in combination with nisin they act synergistically to inhibit the growth of Salmonella, Staphylococcus and Bacillus. We postulate that S-layer enhanced nisin incorporation into the cell membrane enabling it to penetrate the cell wall resulting in increased inhibitory activity. We also proved the S-layer protein is essential in the adaptation of the Lactobacillus during osmotic stress. We analyzed the role of the S-layer by exposing cells to osmotic stress, we found an over expression in this condition demonstrate by Western blot and real time PCR to quantify mRNA. We also tested the growth aptitude of Lactobacillus acidophilus in high osmotic conditions with and without S-layer protein showing its importance in the adaptation to this kind of stress.

Chemes, Lucía Beatriz. "La proteína supresora de tumores Retinoblastoma: caracterización de su dominio AB y mecanismo de interacción con la oncoproteína E7 del papilomavirus humano" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La proteína supresora de tumores retinoblastoma (Rb) es una proteína "hub" o central que juega un rol central en el control del ciclo celular en células eucariotas, y su inactivación funcional se encuentra asociada a la progresión del cáncer en humanos. En particular, la interacción de la proteína HPV-E7 con Rb se encuentra relacionada al poder oncogénico del papilomavirus humano (HPV). El atraso en los estudios estructura-función de Rb se debe en gran medida a la dificultad para la producción recombinante y el estudio en solución de esta proteína o sus dominios. En la presente tesis, nos avocamos al estudio en solución del dominio RbAB humano, que media una gran parte de las funciones de esta proteína incluyendo la interacción con HPV E7. Para ello, desarrollamos un protocolo para su expresión recombinante que permitió obtener rendimientos de 6 mg/litro con una pureza final mayor al 95%. Estudios biofísicos revelaron que RbAB se encuentra en solución como un monómero plegado a 20°C. RbAB es marginalmente estable a temperatura fisiológica, y estudios de plegamiento sugieren que los sub-dominios RbA y RbB tienen diferente estabilidad en solución. Estos estudios representan el primer análisis sobre las propiedades conformacionales en solución de este dominio. En la segunda parte de la tesis realizamos un análisis termodinámico y cinético de la interacción entre RbAB y HPV16-E7 en solución. Estos estudios revelaron que el 90% de la energía de interacción es aportado por el motivo lineal de alta afinidad LxCxE, pero que otros sitios secundarios en E7 participan de la interacción con el dominio RbAB, indicando que la misma es de carácter modular. El caracter intrínsecamente desordenado de E7 modula la interacción, y la fosforilación de la región CKII-PEST potencia la afinidad del complejo. Estudios cinéticos revelaron que la unión del motivo LxCxE a RbAB sigue un mecanismo de dos estados, con una asociación rápida y un tiempo de vida en el órden de 20-200 seg. El complejo E7-RbAB se encuentra estabilizado por interacciones de tipo electrostático, que podrían determinar al menos en parte la especificidad de la interacción de las diferentes proteínas E7 de papilomavirus. El estudio mecanístico de las interacciones proteína-proteína es esencial para comprender el funcionamiento de las intrincadas redes de interacción presentes en las células, y la presente tesis aporta información sobre una de estas interacciones, tomando como proteína modelo a una proteína clave para el desarrollo de tumores humanos. Dado que el motivo LxCxE se encuentra conservado en numerosas proteínas virales y celulares que unen a Rb, los estudios presentados sientan las bases para el análisis de los mecanismos que permiten la discriminación de diversas proteínas que compitan por la unión al "surco LxCxE"

Abstract:
The retinoblastoma tumor suppressor protein (Rb) is a hub protein wich plays a central role in cell cycle regulation in eukaryotic cells, and whose functional inactivation is associated with tumor progression in humans. In particular, the oncogenicity of high-risk human papillomavirus (HPV) depends critically on the interaction of one of its proteins, HPV-E7, with Rb. The delay in the understanding of structure-function relationships for Rb is due, to a large extent, to the difficulty in obtaining large quantities of pure protein which is amenable to biophysical analyses. In the present thesis, we studied the biophysical and interaction properties of the human RbAB domain, which mediates many of Rb's functions, amongst them the interaction with E7. We developed a protocol for its recombinant expression which allowed us to obtain up to 6 mg/liter of recombinant protein with >95% purity. Biophysical studies showed that RbAB is a folded monomer at 20°C, but that it has marginal stability at the mammalian body temperature (37°C). Folding studies strongly suggest that the A and B domains have different thermodynamic stability. This work represents the first study of conformational properties of the RbAB domain in solution. In the second part of this thesis, we performed thermodynamic and kinetic analysis of the interaction between HPV-E7 and RbAB. These studies showed that 90% of the binding free energy is provided by the high affinity LxCxE linear motif, but that multiple regions in E7 additionally participate of the interaction, pointing to its modular nature. The intrinsically disordered nature of E7 modulates binding, and phosphorylation at a conserved CKII-PEST site potentiates binding affinity. Kinetic studies revealed that the LxCxE motif binds through a two-state route with a fast association, which is favoured by electrostatic interactions, and a complex lifetime of 20-200s. The electrostatic nature of the interaction may explain at least in part the binding specificity of different papillomavirus E7 proteins. The mechanistic study of protein-protein interactions is essential to the understanding of the complex cellular protein interaction networks, and the present thesis provides biophysical information on one of these interactions, using the E7-Rb interaction as a model system. Given that the LxCxE motif is conserved throughout viral and cellular Rb partners, the information provided by this work may set the grounds for analyzing the mechanisms of discrimination of multiple possible targets which bind the "LxCxE cleft".

Jurado, Javier Oscar. "Estudio de las vías de señalización de CD31 y PD-1 en la regulación de la respuesta inmune contra Mycobacterium tuberculosis" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La respuesta de citoquinas Th1 es critica en la inmunidad contra Mycobacterium tuberculosis. Por ello, es crucial comprender el establecimiento y mantenimiento de las respuestas efectoras de los linfocitos T. En este trabajo de tesis, se investigo el rol de proteinas de senalización en la modulación de respuestas de citoquinas y citótoxicas de los linfocitos T durante la infección por M. tuberculosis. Los resultados obtenidos demostraron que la interacción entre las proteinas inhibitorias CD31 y SAP participa en la regulación de las vias que conducen a la producción de IFN-Y durante la tuberculosis pulmonar activa. Más aún, en individuos con una fuerte Inmunidad mediada por células contra el patogeno, la estimulación especifica con el antigeno induce en las células productoras de IFN-Y el fenotipo CD31-SLAM+. Asimismo, se demostró el rol inhibitorio de la via PD-1:PD-Ls sobre las funciónes efectoras de las células Th1 en la tuberculosis. Ademas, se comprobo que la via de PD-1:PD-Ls inhibe la expansion de las poblaciónes Th1 y Th17 durante la infección por M. tuberculosis. Por lo tanto, se concluye que PD-1 modularia la activación y la expansion de las células Th1 y Th17, impidiendo la exacerbación de cada una de estas respuestas. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el uso de anticuerpos bloqueantes y agonistas podria tener importantes implicancias en potenciales terapias para combatir infecciónes bacterianas cronicas como la tuberculosis.

Abstract:
The cytokine Th1 response is crucial in the immunity against Mycobacterium tuberculosis. For that reason, its critical to understand the establishment and maintenance of T lymphocyte effector functions. In this work, the role of signaling proteins on the modulation of cytokine and cytotoxic responses of T lymphocytes during M. tuberculosis infection was investigated. The results demonstrated that the interaction of the inhibitory proteins CD31and y SAP participates in the regulation of the pathways that lead to IFN-Y production during active pulmonary tuberculosis. Moreover, in individuals with strong cell-mediated immunity against the pathogen, specific antigen stimulation induces the CD31-SLAM+ phenotype in IFN-Y producing cells. Furthermore, we demonstrated the inhibitory role of the PD-1:PD-Ls pathway on Th1 effector functions in pulmonary tuberculosis. Besides, we showed that the PD-1:PD-Ls pathway inhibits the expansion of the Th1 and Th17 subsets during M. tuberculosis infection. Thus, we conclude that PD-1 would modulate the activation and expansion of Th1 and Th17 cells, avoiding exacerbation of each of these responses. Together, the results of this work demonstrate that the use of blocking and agonistic antibodies might have significant implications in potential therapies to fight chronic bacterial infections like tuberculosis.

Soler Bistué, Alfonso Juan de la Cruz. "Dispersión del gen de resistencia a amikacina aac (6´)-Ib y estrategias para su inhibición por tecnología antisentido" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los antibióticos fueron uno de los grandes logros de la medicina del siglo pasado. Sin embargo, el (ab)uso intensivo de los mismos en los últimos 50 años ha generado la emergencia de bacterias de fenotipo resistente a varios antibióticos conocidas como cepas multirresistentes. Su aparición es causa de complicaciones y muertes de otra manera evitables y const ituye un problema de salud gravísimo a nivel nacional y global debido a que las pocas opciones de tratamiento existentes se están agotando. Por otro lado, los escasos antibióticos nuevos que se desarrollan al poco tiempo generan la emergencia de resistencias preexistentes en el metagenoma. En particular, es preocupante la creciente frecuencia de aparición en la clínica del gen aac(6')-Ib que genera resistencia a aminoglicósidos, entre ellos la amikacina. Una opción a explorar es el silenciamiento de genes de resistencia mediante tecnologías antisentido con el fin de prolongar la vida útil de los antibióticos existentes. En esta Tesis por un lado se exploran las plataformas genéticas en las que este gen se ha dispersado a nivel molecular y celular. Por otro lado se muestra que la expresión de pequeños ARNs antisentido, llamados secuencias guiadas externamente (EGS), es capaz de inhibir la expresión del gen de resistencia a aminoglucósidos aac(6')-Ib. Sin embargo, estas moléculas de ARN son sumamente susceptibles a las nucleasas. Se explora entonces también el uso de análogos de acidos nucleicos no hidrolizables como EGSs. Se muestra cómo la administración exógena de EGSs de cooligómeros de ácidos nucleicos cerrados (LNA) y ADN es también capaz de convertir un fenotipo resistente a un antibiótico a uno susceptible por un mecanismo mediado por ARNasa P. Estos resultados sugieren que el silenciamiento de genes de resistencia con cooligómeros de ADN y LNA podría servir para prolongar la utilidad de los antibióticos existentes.

Abstract:
Antibiotic discovery was one of the main achievements in medicine in the last century. However, their intensive (ab)use in the last 50 years has lead to the emergence of bacteria resistant to multiple drugs known as multiresistant strains. These strains cause treatment complications and avoidable deaths constituting a serious health issue at national and global level as the scarce treatment options are getting exhausted. On the other hand, the few new antibiotics generate resistance shortly after released as they act as selecting agents of the preexistent resistance genes present on the metagenome. Notably, the increasing prevalence of aac(6')-Ib in the clinical setting is a serious concern as it generatesresistance to several aminoglycosides including amikacin. Silencing of antimicrobial resistance genesusing antisense techniques is a good alternative for the rational design of drugs that may permit to prolong the usefulness of the currently employed antibiotics. In this Thesis work, the genetic platforms that allow aac(6')-Ib dispersion at the cellular and molecular level are explored. On the other hand, it is shown that expression of small antisense RNAs called external guide sequences (EGS) is capable of inhibiting the expression of this gene, rendering resistant strains, susceptible to amikacin. However, small RNA molecules such as EGSs are rapidly degraded by cellular nucleases. Hence, the use of non-hydrolysable nucleic acid analogs cooligomers as EGS is explored. The exogenous administration of a Locked Nucleic Acid (LNA)/DNA cooligomer as EGS is capable of converting an amikacin resistant phenotype to a susceptible one by an RNAse P mediated mechanism. These results suggest that gene silencing using LNA/DNA cooligomers might be useful to prolong the use of amikacin.

Ocampo, Josefina. "Estudio bioquímico de las isoformas de las subunidades R y C de la proteína quinasa A de Mucor circinelloides y sus efectos en el desarrollo y la diferenciación" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La vía de señalización por cAMP-proteína quinasa A (PKA) juega un rol importante en la regulación del desarrollo, crecimiento y virulencia en un variado número de hongos. La PKA está compuesta por un dímero de subunidades regulatorias (R) y dos subunidades catalíticas (C). La subunidad R posee una estructura modular con un dominio de dimerización y anclaje (D/D) en el extremo Nterminal y dos dominios de unión de cAMP en el extremo C-terminal, entre ambos se encuentra una zona bisagra que incluye el sitio inhibitorio (IS). A ambos lados del IS se definen el linker I y linker II. Nuestro modelo de estudio es el hongo Mucor circinelloides cuya holoenzima PKA se diferencia de las de otras especies por su mayor fuerza de interacción R-C. En esta tesis demostramos la participación del linker I en la interacción R-C y la importancia de su naturaleza química, dada por la presencia de un grupo residuos ácidos, para establecer la alta fuerza de interacción entre las subunidades. Definimos por primera vez en hongos la existencia de cuatro isoformas de subunidad R, PKAR1, PKAR2, PKAR3 Y PKAR4, las cuales se expresan en forma diferencial a lo largo del desarrollo de M. circinelloides. Mediante la construcción de dos cepas que poseen anulados los genes de pkaR1 y pkaR2 demostramos que cada una de las isoformas posee roles diferentes en la diferenciación y morfología del hongo. M. circinelloides también presenta múltiples isoformas de subunidad C, de las cuales hemos ahondado en el estudio de una en particular denominada PKAC. Caracterizamos la isoforma como una posible pseudoquinasa por las características de su secuencia aminoácidica y por la falta de actividad catalítica. Finalmente demostramos la existencia de variantes de R modificadas posttraduccionalmente por ubiquitinación, en particular se definieron isoformas multiubiquitinadas de alto PM y la monoubiquitinación de PKAR2.

Abstract:
The PKA signal transduction pathway plays an important role in growth, development, morphology and virulence of many fungi. PKA is composed of a dimer of regulatory subunits (R) and two catalytic subunits (C). The R subunits has a modular structure: a dimerization docking domain (D/D) at the N-terminus; two tandem cAMP binding domains at the C-terminal region (CNB) and a hinge variable region that includes an inhibitory sequence (IS). At both sides of the IS the regions linker I and linker II are defined. Our experimental model is the fungus Mucor circinelloides with a PKA holoenzyme that differs from other species for its high affinity interaction between R and C subunits. In this work we show the importance of linker I region in the R-C interaction and also the importance of its chemical nature in determining the high affinity interaction between its subunits. The existence of four R subunits isoforms, PKAR1, PKAR2, PKAR3 and PKAR4 is reported. These isoforms show a differential expression through M. circinelloides development. The construction of two strains with deletions in pkaR1 and pkaR2 genes, allowed to demonstrate the role of PKA in the regulation of morphological and cellular development.in M. circinelloides. This fungus also has multiple genes coding for C subunits; we have particularly studied the characteristics and the role of PKAC. This isoform has been characterized as a putative pseudokinase since it is catalytically inactive and has unusual aminoacidic sequence. Finally, we show that some R isoforms are modified post-translationally by ubiquitination, particularly the multiubiquitinated high molecular weight isoforms and the monoubiquitinated PKAR2.

Berini, Carolina Andrea. "Virus linfotrópico T-humano tipo 1 y 2 (HTLV-1/2): optimización del diagnóstico y epidemiología molecular en distintas poblaciones de Argentina" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo principal de esta tesis es ampliar los conocimientos sobre el diagnóstico, la prevalencia y la epidemiología molecular del HTLV-1/2 y brindar datos que permitan un diagnóstico más eficiente en Argentina. Con tal fin, se analizaron equipos de tamizaje frecuentemente utilizados en nuestro país, y se demostró la importancia de confirmar los resultados seroindeterminados por WB mediante una técnica molecular para obtener un diagnóstico final. En cuanto a la prevalencia de HTLV-1/2 en las distintas poblaciones estudiadas, hemos demostrado que ambos virus se encuentran circulando con prevalencias altas en poblaciones de riesgo y bajas en las de no riesgo en la mayor parte del país, manteniendo la característica epidemiológica de su restricción étnico/geográfica ya demostrada. Es por ello, que debemos considerar también el riesgo de infección en aquellos casos que presenten antecedentes de riesgo como, por ejemplo, haber nacido, ser descendientes o haber sido pareja sexual de individuos provenientes de áreas endémicas. Mediante estudios filogenéticos se demostró que todas las cepas estudiadas del HTLV-1, resultaron subtipo a subgrupo A, mientras que para el HTLV-2 el subtipo b fue el mayoritario ambos en poblaciones no originarias sugiriendo que estos subtipos han sido introducidos en nuestra población caucásica a partir de la interacción con comunidades originarias.

Abstract:
The main objectives of this thesis work were to widen the knowledge about the molecular epidemiology of HTLV-1/2 infection in Argentina and to collaborate with the implementation of an optimal algorithm for its diagnosis. Therefore, different commercial kits frequently used in blood banks along South America were analyzed, showing their efficiency and demonstrating that the further molecular confirmation of seroindeterminate results by WB is an important tool for obtaining a final diagnosis and the real serostatus of this infection. Regarding the prevalence of HTLV-1/2 in the different study populations, we demonstrated that both circulating viruses have high prevalence in at-risk populations and low prevalence in non at-risk populations in most of the country, maintaining the epidemiologic characteristics according to the ethnic/geographic restriction areas already demonstrated. In relation to HTLV- 1/2 infection risk, this data should be considered especially in the cases that have risk antecedents such as being born, being descendent or being a sexual partner of an individual coming from endemic areas. As for HTLV-1 phylogeny, all the circulating strains belong to subtype a subgroup A while for HTLV-2 the major subtype in non-aboriginal populations was b suggesting that these subtypes (HTLV-1aA and HTLV-2b) have been introduced to the general population due to closer interactions with aboriginal communities.

Yokobori, Noemí. "Evaluación de la respuesta inmune frente a cepas locales de Mycobacterium tuberculosis multirresistentes a drogas" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La tuberculosis multirresistente a drogas (MDR-TB) representa un gran desafío sanitario. En el presente trabajo evaluamos en monocitos (Mo) y macrófagos (MΦ), las estrategias de evasión de la respuesta inmune de dos aislados clínicos MDR de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) relacionados genéticamente: la cepa M causante de un extenso brote y la cepa 410 de baja virulencia. Nuestros resultados muestran que: 1) la inducción de citoquinas (CK) y respuesta linfoproliferativa Mtb-específica dependen tanto del status inmunológico del huésped como del genotipo de Mtb, 2) estas diferencias podrían deberse en parte al aumento en el subset de Mo-CD16+ en sangre periférica, 3) la cepa M es pobre inductora de TNF-α tanto en Mo como en MΦ, 4) ambas cepas MDR indujeron una cinética retardada de expresión de IL-1β en Mo, 5) algunos mecanismos de evasión, como la down-regulación del receptor de IFN-γ serían comunes a las cepas estudiadas, 6) la replicación intracelular de la cepa M fue lenta, mientras que 410 se multiplicó rápidamente dentro del MΦ, 7) la infección del MΦ con la cepa 410 induce tempranamente una fuerte secreción de TNF-α e IL-10, 8) la cepa M es capaz de interferir con señales proapoptóticas de la vía intrínseca y probablemente de la vía extrínseca, 9) la cepa 410 indujo predominantemente muerte por necrosis. En base a estos resultados, y a diferencia de lo reportado para otros genotipos virulentos de Mtb, proponemos que el éxito de M se debería a su capacidad de mantenerse en un estado de quiescencia, preservando su nicho y minimizando la respuesta inflamatoria en las etapas tempranas de la infección.

Abstract:
Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is a major challenge to public health. We tested in monocytes (Mo) and macrophages (MΦ), the immune evasion strategies of two MDR clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) genetically related: strain M, responsible for a large outbreak and the low virulence strain 410. Our results show that: 1) induction of cytokines (CK) and Mtb-specific T-cell proliferation are dependent on both the host's immune status and the genotype of Mtb, 2) these differences could be, in part, due to the increase in CD16+Mo-subset in peripheral blood, 3) strain M is poor inducer of TNF-α in both Mo and MΦ, 4) both MDR strains induced a delayed kinetics of IL-1β expression in Mo, 5) some immune evasion mechanisms such as the down-regulation IFN-γ receptor would be common to the strains tested, 6) intracellular replication of strain M was slow, while 410 multiplied rapidly within the MΦ, 7) infection of MΦ with strain 410 induces an early and strong secretion of TNF-α and IL-10, 8) strain M is capable of interfering with proapoptotic signaling of the intrinsic and, probably, also the extrinsic pathways, 9) 410-induced cell death was predominantly by necrosis. Our results suggest that, in contrast with previous reports with other virulent genotypes Mtb, the success of M is due to its ability to stay in a state of quiescence, preserving its niche and minimizing the inflammatory response in the early stages of infection.

Gonzalez, Betina. "Caracterización de un modelo de ratones transgénicos hipersecretores de hCG que desarrolla tumores gonadales" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta Tesis Doctoral se estudiaron distintos aspectos de la regulación del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal (HHG) en un modelo de ratones transgénicos que produce niveles elevados de la hormona gonadotrofina coriónica humana (hCG) y desarrolla tumores gonadales (ratones hCGDE+). Se partió de la hipótesis que los elevados niveles de esteroides sexuales inducidos por la hipersecreción de hCG desde edades tempranas del desarrollo, actuarían sobre el eje HHG alterando la síntesis y secreción de hormonas y factores claves en la función reproductiva, participando directa o indirectamente en el inicio y progresión de los tumores gonadales que presentan estos ratones. En una primera etapa se caracterizó en profundidad el fenotipo de machos y hembras hCGDE+, estudiando parámetros morfológicos, bioquímicos y moleculares de la función gonadal e hipotálamo- hipofisaria. Se observaron marcadas diferencias sexuales en el modelo, donde los machos transgénicos resultaron severamente comprometidos a nivel de la regulación de la unidad hipotálamo-hipofisaria desde edades tempranas del desarrollo, mientras que las hembras mostraron alteraciones gonadales que condujeron al desarrollo de teratomas ováricos al inicio de la edad reproductiva. En una segunda etapa se aplicaron tratamientos antihormonales y gonadectomía, siendo nuestro particular interés estudiar el rol de los esteroides sexuales en el fenotipo de los machos y hembras hCGDE+. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la hipersecreción de hCG, a través de la estimulación de la esteroidogénesis gonadal, altera la funcionalidad del eje reproductivo y participa en el desarrollo de patologías gonadales.

Abstract:
In the present Doctoral Thesis, several aspects of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis were evaluated in a transgenic mouse model that produces elevated levels of human chorionic gonadotropin (hCG) and develops gonadal tumours (hCGDE+ mice). We hypothesized that the elevated levels of sex steroids induced by hCG hypersecretion from early development, would act on the HPG axis by altering the synthesis and secretion of key hormones and factors involved in the reproductive function, thus participating either directly or indirectly in the onset and progression of the gonadal tumours. First, we characterized in deep the male and female phenotype of hCGDE+ mice, through morphological, biochemical and molecular studies of the gonadal and hypothalamic-pituitary function. Sex differences were observed in this model, where transgenic males were severely compromised at the hypothalamic- pituitary unit regulation, whereas transgenic females showed gonadal alterations that derived in the development of ovarian teratomas at the beginning of the reproductive age. Further in this study, we carried out antihormonal treatments and gonadectomy, being our particular interest to study the role of sex steroids in the hCGDE+ male and female phenotype. Our results demonstrate that hCG hypersecretion, through the stimulation of gonadal steroidogenesis, alters the reproductive axis function and participates in the development of gonadal pathologies.

Rodríguez, Ana María. "Relevancia de la inmunidad celular subtipo específica en el desarrollo de estrategias de vacunación frente a VIH-1" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Han pasado casi 30 años de la detección de los primeros casos de VIH-1 y aún no se ha conseguido desarrollar una vacuna efectiva y segura. La epidemia de VIH en Argentina está caracterizada por una alta prevalencia de infecciones causadas por virus pertenecientes al subtipo B y formas recombinantes circulantes BF (CRF12_BF). A pesar de la amplia gama de trabajos dedicados a la caracterización de la respuesta inmune y al desarrollo de vacunas frente a VIH, no queda claro cuál es el impacto de la variabilidad en la elección del antígeno. Nef es una de las proteínas virales elegida como antígeno en los ensayos clínicos y pre- clínicos para vacunas. En este trabajo de Tesis, Nef fue usada como una herramienta para evaluar la importancia de las variantes recombinantes BF de VIH en el diseño de futuras vacunas. Vectores de ADN, MVA y VV que expresan NefBF y NefB fueron generados y caracterizados. Luego de la inmunización en ratones Balb/c con una dosis simple de ADN seguida por otra de MVA, se encontró que NefBF generó una respuesta altamente específica sin detectarse reactividad cruzada frente a Nef del subtipo B. Sin embargo, luego de aplicar un esquema de inmunización más extenso (tres dosis de ADN más una dosis de MVA) se indujo una respuesta específica mayor, acompañada con el aumento de la reactividad cruzada frente a B, aunque de menor magnitud que frente al antígeno homólogo NefBF. Por otro lado, al aplicar el vector VVnefBF se obtuvo una respuesta específica cerca de tres veces mayor que con MVA, pero con el mismo grado de reactividad cruzada; mientras que la inmunización con VVnefB generó una respuesta de menor magnitud, pero con mayor grado de reactividad cruzada contra NefBF. La aplicación de IL-12 y GM-CSF desde vectores de ADN (como moléculas adyuvantes) aumentó la respuesta hasta seis veces, al aplicarse por separado, y 14 veces al aplicarse juntas. Este nivel de respuesta permitió caracterizar los epítopes de mayor inmunogenicidad. Estos resultados son de crucial importancia para el desarrollo de una futura vacuna para nuestra región, indicando que antígenos de estas variantes virales BF deberían ser considerados en el diseño de las mismas.

Abstract:
It has been almost 30 years since the detection of the first HIV-1 cases and yet an effective and safe vaccine has not been developed. The HIV epidemic in Argentina is characterized by the high prevalence of infections caused by subtype B and BF variants. Despite the wide range of publications on the immune response against HIV and the vaccine development effort, the impact of variability on vaccine antigen selection is still unclear. Nef is a viral protein that has been selected as antigen in clinical and pre-clinical vaccine trials. In this thesis, Nef protein was used as a tool to study the impact of HIV-1 BF variants on the design of future vaccines. DNA, MVA and VV vectors expressing Nef from the CRF12_BF recombinant form or from subtype B of HIV-1 were generated and characterized. After the administration of single DNAprime/MVAboost immunization schedules in Balb/c mice, it was found that NefBF delivered from these vectors generated a response of high specificity without cross-reactivity against subtype B. But, when a more potent response was induced after 3 priming DNA doses and a booster with MVA recombinant virus, cross-reactivity against NefB was detected, although of lower magnitude than the NefBF specific response. Furthermore, the application of VVnefBF vector generated a nearly three-fold enhanced immune response than the schedule using MVA, but with the same level of low cross-reactivity, whereas immunization with VVnefB generated a slightly lower response, but with a greater cross-reactivity against NefBF. The application of IL-12 or GM-CSF as molecular adjuvants increased the specific response by six-fold, and 14-fold when they were applied together. This level of response allowed the characterization of the most immunogenic epitopes. These results will be pivotal for HIV vaccine design in our region, indicating that antigens from these viral variants should be considered for a future vaccine.

Gutiérrez, Gerónimo. "Estudio de la dinámica de la infección perinatal con BLV en un rodeo de tambo de alta prevalencia" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo se estudió la progresión de la infección natural con BLV en un rodeo con alta prevalencia, desde el nacimiento hasta el ingreso al ciclo productivo. El objetivo central fue proponer una alternativa para interrumpir el ciclo epidemiológico de transmisión, debido a que en la actualidad parece no haber soluciones factibles para el control de esta infección. Como objetivo complementario, se estandarizó un ensayo de ELISA que permitirá confirmar el estado de infección. Se expresó la proteína p24 de BLV en Escherichia coli, se purificó por columna de afinidad, y se la utilizó como antígeno en un ensayo de ELISA (rp24-ELISA). Se evaluó la performance del ensayo según recomendaciones internacionales, observándose evidencia de que el rp24-ELISA es una herramienta exacta y precisa en la detección de anticuerpos contra la p24 de BLV como para ser utilizada en el tamizaje de animales infectados en nuestro país. En el estudio de la progresión de la infección se observó que alrededor del 11% de los animales se encuentra infectado desde los primeros días de vida y que este porcentaje se mantiene constante durante el primer año. Se evidenciaron nuevas infecciones a partir de los 15 meses y se observó un salto brusco de la prevalencia, del 24 a más del 60% de animales infectados, durante la parición y entrada al tambo. Al analizar la carga proviral se encontró que alrededor del 30% de los animales tiene una carga proviral en sangre baja o indetectable. Se detectó provirus en el 50% de los calostros y 40% de las leches, siendo esta detección más frecuente en animales con carga proviral alta o media en sangre, y se observó que tanto los calostros como las leches poseen una bajo nivel de carga proviral. El hallazgo más importante de este trabajo fue que aún cuando se aplican prácticas de manejo que previenen la transmisión sanguínea de BLV, no se observaron cambios significativos en la prevalencia luego de 3 años. Por último, se propuso una estrategia alternativa de control, basada en la segregación selectiva de los animales de acuerdo a su carga proviral en sangre periférica; interpretándola como un marcador del riesgo de transmisión de la infección. Esta estrategia permitirá la segregación de animales jóvenes, seronegativos, y animales adultos, infectados, con carga proviral baja o indetectable, que en conjunto con la aplicación de prácticas que previenen el contacto iatrogénico de sangre y el testeo de BLV al nacimiento, podría reducir potencialmente la infectividad del BLV y prevenir futuras transmisiones del virus.

Abstract:
In this work, the progression of natural BLV infection from birth to the entry into the milking herd, in a highly infected dairy herd, was assessed. The main goal was to suggest alternative control measures to effectively break the BLV cycle of transmission, based in the fact that there is no current practical solution for the control of this infection. As a complementary objective of this work, an ELISA test that will confirm the sanitary status was standardized. The BLV-p24 protein was expressed in Escherichia coli, affinity purified and used as antigen in an ELISA test (rp24-ELISA). The performance of the assay was assessed following international recommendations, showing evidence that rp24-ELISA is an accurate and precise tool in the detection of anti-p24 antibodies and could be used in the screening of infected animals in Argentina. The progression of infection study showed that about 11% of the animals are already infected during the first days of life and that this rate remained constant during the first year. New infections were detected since 15 months old, but the higest increase in the rate of infection, from 24 to more than 60% of infected animals, was observed during parturition and entrance of the animals into the milking herd. Proviral load analysis showed that about 30% of the animals had either low or undetectable peripheral-blood proviral load. BLV provirus was detected in 50% of colostrum and 40% of milk samples, being more frequently detected in animals with high or medium peripheral-blood proviral load. All colostrum and milk samples showed low levels of provial load. The most important finding was that even when management procedures to prevent BLV iatrogenic transmission were followed, no significant change was observed in the prevalence after three years. Finally, an alternative control strategy was proposed, based on selective segregation of the animals according to their peripheral-blood proviral load as a potential indicator of risk transmission. This strategy will allow to segregate young non-infected animals and adult infected animals with low or undetectable levels of proviral load, that coupled with the application of management practices to prevent iatrogenic blood contact and BLV early testing from birth, could potentially reduce the infectivity of BLV and prevent further transmission of the virus.

Alzogaray, Vanina A.. "Anticuerpos de llama de dominio único como inhibidores intracelulares de una toxina bacteriana" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los camélidos poseen anticuerpos que carecen de cadena liviana y de una fracción de la cadena pesada. El sitio de unión al antígeno está formado por el dominio variable de la cadena pesada, denominado VHH. Su largo CDR3 resulta especialmente apto para la unión a epitopes cóncavos, como los sitios activos enzimáticos. Salmonella tyhimurium es una bacteria intracelular patógena que posee una ADP‐ribosiltransferasa denominada SpvB, esencial para la virulencia. SpvB induce la depolimerización de los filamentos de actina, llevando a la muerte celular. En este trabajo de Tesis, mostramos la generación de una biblioteca de expresión en fagos, a partir de linfocitos de llamas inmunizadas con el dominio catalítico de SpvB, para obtener VHHs que reconocen a SpvB e inhiben su actividad enzimática. Los clones de VHHs anti‐SpvB se secuenciaron y clasificaron de acuerdo al CDR3. Fueron seleccionados 5 clones, los cuales se expresaron y purificaron como proteína recombinante. Mediante dos ensayos independientes, mostramos que estos VHHs inhiben a SpvB. Uno de los ensayos nos permitió cuantificar la relación molar VHH:SpvB para lograr un 100% de inhibición identificando así a VHH5, que inhibe a SpvB en relación equimolar. Se transfectaron macrófagos con VHH5 y se infectaron con Salmonella typhimurium. El análisis de las células por microscopía de fluorescencia mostró claramente que VHH5 expresado en el interior celular, tiene la capacidad de proteger su citoesqueleto. Por otro lado, mediante la translocación de SpvB al citoplasma, realizamos un ensayo en células transfectadas con VHH5 para discriminar el efecto de SpvB de otros factores de virulencia. Los resultados mostraron que la expresión intracelular de VHH5 protege el citoesqueleto del efecto citopático causado por SpvB. Estos resultados constituyen una prueba de concepto sobre el uso de anticuerpos de dominio único de llama para la inhibición de enzimas intracelulares.

Abstract:
Camelids produce unusual antibodies composed only of heavy chains. The antigen combining site of these antibodies is formed solely by the heavy‐chain variable domain (VHH). Their CDR3s form long finger‐like extensions that can protrude into cavities on antigens, e.g. the active site crevice of enzymes. Salmonella tyhimurium are pathogenic intracellular bacteria that express an ADP‐ ribosyltransferase called SpvB, which is essential for its virulence. SpvB induces the depolymerization of actin filaments leading to cell death. In the present work, we show the generation of an expression phage library from SpvB‐immunized llama lymphocytes to obtain VHHs that inhibit SpvB activity. SpvB‐recognizing VHHs clones were sequenced and classified according to their CDR3. Five independent clones were isolated, and the VHH proteins codified by them were expressed and purified. All VHHs were able to inhibit SpvB in two different assays. We quantitatively analyzed the inhibition of SpvB activity by fluorescence using pyrene‐labelled actin as substrate. VHH5 completely inhibited SpvB activity in an equimolar ratio. Furthermore, VHH5 was subcloned in a vector for eukaryotic expression. As such, eukaryotic cells were transfected and cells expressing VHH5 were infected with Salmonella typhimurium to test their effect on virulence. Fluorescence microscopy analyses clearly showed that VHH5, when expressed as an intrabody, effectively protected cells from wild type SpvB‐ expressing strains of Salmonella. Transfected cells were also protected against the cytotoxic activity of a translocation competent chimeric SpvB‐C2 toxin. These results constitute a proof of principle of the use of single domain antibodies for the specific intracellular inhibition of normal or pathogenic enzymatic functions.

de Almeida, Alejandra. "Análisis de cepas recombinantes de Escherichia coli productoras de poli (3-hidroxibutirato): efecto de la acumulación del polímero y de la proteína PhaP sobre el metabolismo y la expresión génica" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El poli(3-hidroxibutirato) (PHB) en un polímero biodegradable de gran interés biotecnológico, debido a que presenta propiedades físicas similares a las de los plásticos derivados del petróleo. Con el fin de optimizar su producción, se construyó una cepa recombinante de Escherichia coli que expresa los genes responsables de la síntesis de PHB de Azotobacter sp. FA 8. Esta cepa recombinante también expresa la proteína PhaP, la cual se asocia a los gránulos de PHB y afecta positivamente la síntesis del polímero. Se estudió la acumulación de biomasa y PHB, y las propiedades físicas del polímero, en esta cepa y en la cepa sin PhaP, observándose que la cepa que expresa PhaP produce más PHB y biomasa que la cepa isogénica. En estudios realizados en biorreactor se observaron variaciones en la síntesis de PHB y de diferentes productos metabólicos, al utilizar distintas fuentes de carbono y niveles de aireación, lo que le permitiría a las bacterias adaptar los flujos de carbono y energía a las diferentes condiciones ensayadas. Con el fin de determinar las modificaciones en E. coli cuando acumula PHB, y los posibles efectos de PhaP, se estudió la expresión de diferentes genes mediante qRT-PCR y arrays de DNA en cepas productoras y no productoras de PHB. Se observaron grandes diferencias en la expresión de genes relacionados con el hambreado en nitrógeno, cuya expresión fue mayor en las cepas productoras. Esto podría deberse a la competencia por los metabolitos precursores, acetil-CoA y poder reductor. Inesperadamente, se encontró una menor expresión de genes de estrés al comparar la cepa de E. coli que acumula el polímero y expresa PhaP con la cepa control (que no acumula el polímero ni expresa PhaP). A raíz de estos resultados, se estudió el efecto de PhaP sobre la fisiología de E. coli, en ausencia de PHB. Se observó que PhaP promueve el crecimiento de E. coli, y que además la protege contra estrés térmico. Estos resultados sugieren que PhaP tendría un efecto protector en E. coli, el cuál podría ser de gran utilidad en la producción de compuestos heterólogos.

Abstract:
Poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) is a biodegradable polymer of great biotechnological interest, because it has physical properties similar to fuel-derived plastics. In order to optimize the production of PHB, we constructed a recombinant Escherichia coli strain that expresses the phb genes from Azotobacter sp. FA8. This recombinant strain also produces the protein PhaP, which is found associated to PHB granules and positively affects PHB synthesis. We studied the accumulation of biomass, PHB, and physical properties of the polymer produced in this strain, and in the strain lacking PhaP. The strain that expresses PhaP produced more PHB and biomass that the isogenic strain. The production of PHB and several metabolic products varied in bioreactor cultures when using different carbon sources and aeration conditions, allowing bacteria to adjust carbon and energy flow. To study the effect of PHB and PhaP on recombinant E. coli, we studied the expression of different genes by qRT-PCR and microarray analysis. In the PHB-producing strains there was an increase in the expression of genes related with nitrogen metabolism, which could be related to the fact that acetyl-CoA and reducing power are needed for the production of PHB. We also observed that the production of the polymer generates a stress response in E. coli, similar to a heat shock response, which is diminished in the presence of PhaP. Surprisingly, the expression of stress-related genes was lower in the PHB and PhaP producing strain, that in the strain which does not express either PHB or PhaP. Based on these results, we studied the effect of PhaP on the physiology of E. coli, in the absence of PHB. PhaP-bearing strains grew more, and were more resistant to heat stress. These results suggest that PhaP has a protective effect on E. coli, which could be very useful for the production of heterologous products.

Posadas, Diana M.. "Transporte y adhesión en Brucella suis: caracterización de una proteína de la familia TolC en el eflujo de compuestos tóxicos y de tres posibles adhesinas en la colonización del hospedador" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Brucella es un patógeno intracelular facultativo, responsable de una infección zoonótica llamada brucelosis. Un aspecto clave en la virulencia de este género es su habilidad para invadir y proliferar dentro de células fagocíticas y no fagocíticas, en las que se establece. En esta tesis se identificaron y caracterizaron factores imprescindibles para la interacción de este patógeno con su hospedador. Uno de estos factores fue la proteína BepC, que pertenece a la familia TolC de proteínas de membrana externa. BepC resultó crucial en la detoxificación de la bacteria tanto in vivo como in vitro, probablemente formando parte de sistemas tripartitos de eflujo. Los otros factores fueron tres adhesinas que pertenecen a la familia de autotransportadores de tipo I. Estas proteínas, a las que denominamos BmaA, B y C (por Brucella monomeric autotransporter), participarían en: i) la adhesión de Brucella suis a las células del hospedador, ii) la interacción con otras superficies como la matriz extracelular y iii) las interacciones bacteria-bacteria, para ambas, BmaA y BmaB. Estos factores pueden ser base de estudios futuros más específicos y profundos que lleven al desarrollo de vacunas o terapias que mejoren el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de la brucelosis.

Abstract:
Brucella is an intracellular pathogen responsible of the zoonotic disease called brucellosis. A key feature of Brucella virulence is its ability to invade and proliferate inside professional and non-professional phagocytic cells, were it establishes. In this thesis, essential factors for the interaction of this pathogen with its host were identified and characterized. One such factor was the BepC protein, that belongs to the TolC family of outer membrane proteins. BepC was shown to be crucial for the detoxification of the bacteria both in vivo and in vitro, probably as part of tripartite efflux systems. The other factors were three adhesins belonging to the type I autotransporters family. These proteins that we called BmaA, B and C (Brucella monomeric autotransporter) were shown to be involved in: i) Brucella suis adhesion to host cells, ii) the interaction of B. suis with other surfaces such as the extracellular matrix and iii) for both BmaA and BmaB, in bacteria-bacteria interactions. These factors can be the basis of future studies, more specific and profound, that lead to the development of vaccines or therapies that improve the diagnosis, prevention and treatment of brucellosis.

Canepa, Gaspar Exequiel. "Genomica funcional de transportadores de aminoacidos y poliaminas de Trypanosoma cruzi" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El trabajo en el que se basa esta tesis representa un aporte al conocimiento de nuevos elementos del metabolismo del parásito Trypanosoma cruzi. En particular, describe genes encargados de transportar metabolitos esenciales para este organismo. Pero, más que nada, es un aporte para una futura sistematización en el estudio de moléculas transportadoras. Acerca del organismo estudiado podemos describir al Trypanosoma cruzi como el agente causal de la enfermedad de Chagas, una enfermedad endémica en Argentina y en toda América Latina. Este parásito presenta numerosas características metabólicas diferenciales respecto a sus hospedadores insectos y mamíferos, siendo incapaz de sintetizar numerosos componentes celulares. Sin embargo, esta incapacidad metabólica es compensada mediante sistemas transportadores de múltiples metabolitos desde el hospedador. Luego de la reciente secuenciación del genoma de T.cruzi, se estima que existen al menos 374 genes que codifican para distintos transportadores distribuidos en tres grupos principales: canales iónicos, transportadores dependientes de ATP y transportadores secundarios. En este trabajo se estudio con énfasis a la familia de transportadores de aminoácidos denominada AAAP (Amino Acid Auxin Permease) de T. cruzi (TcAAAP). El estudio bioinformático de esta familia demostró que todos sus miembros poseen diferencias en sus extremos amino terminales pero tienen un alto nivel de identidad en el resto de sus secuencias, llegando hasta el 75% de similitud. Luego de evaluar diferentes estrategias para la correcta expresión heteróloga de estas moléculas, se encontraron exitosas las llevadas a cabos en ovocitos de Xenopus laevis y células de Saccharomyces cerevisiae. El modelo de ovocitos de Xenopus permitió identificar y caracterizar a un transportador con afinidad para la poliamina espermidina, la cual T. cruzi es incapaz de sintetizar de novo. En cuanto al estudio en diferentes modelos de levaduras, se logró expresar funcionalmente tres transportadores específicos para los aminoácidos prolina, arginina y lisina. En el caso de los dos primeros, estos pudieron ser caracterizados desde el punto de vista molecular y relacionados con datos bioquímicos previos, que integran el transporte de estos aminoácidos con el metabolismo energético del parásito. Finalmente, la permeasa de lisina fue extensamente estudiada. Se realizó una caracterización bioquímica del transporte de este aminoácido en epimastigotes en cultivo y se produjeron numerosas construcciones para su manipulación génica. Esta metodología se utilizó para comprobar la actividad y especificidad de la permeasa, además de su localización subcelular en el bolsillo flagelar, donde, probablemente, ocurre el ingreso de diversos metabolitos a la célula a través de transportadores. Por lo tanto y como se mencionó anteriormente, en este trabajo se identificaron y estudiaron por primera vez moléculas involucradas en el transporte de aminoácidos y poliaminas en Trypanosoma cruzi, nutrientes esenciales para la vida de este parásito.

Abstract:
The work in behind this thesis represents a contribution to knowledge of new features of the metabolism of the parasite Trypanosoma cruzi. In particular, it describes genes responsible for transporting essential metabolites for this organism. But more than anything is a contribution for future systematization in the study of carrier molecules. About the studied organism Trypanosoma cruzi, it can be described as the ethiological agent of Chagas disease, endemic in Argentina and throughout Latin America. This parasite has many differential metabolic characteristics with respect to their vector insects and host mammals, being unable to synthesize many cell components. However, this metabolic inability is compensated by multiple conveyor systems of metabolites from the host. Following recent sequenciation of the T. cruzi genome, it is estimated that there are at least 374 different genes that encode transporters distributed in three main groups: ion channels, ATP-dependent and secondary transporters. In this study we focus on the amino acid transporter family called AAAP (Amino Acid Auxin permease) of T. cruzi (TcAAAP). The bioinformatic study of this family showed that all members have differences in their amino terminal but have a high level of identity in the rest of the sequences, reaching 75% of similarity. After evaluating different strategies for the successful heterologous expression of these molecules, we found that the best ones were those carried on Xenopus laevis oocytes and Saccharomyces cerevisiae cells. The model of Xenopus oocytes allowed the identification and characterization of a transporter with affinity for the polyamine spermidine, which T. cruzi is unable to synthesize de novo. Regarding the study on different models of yeast, functional expression was achieved with three transporters specific for the amino acids proline, arginine and lysine. For the first two, they could be characterized molecularly and biochemically, findings that could be related to prior data, which includes the link between transport of these amino acids to energy metabolism of the parasite. Finally, the lysine permease was extensively studied. We performed a biochemical characterization of this amino acid transport in T. cruzi epimastigotes cultures and there were produced numerous constructs in order to manipulate its gene. This methodology was used to test the activity and specificity of the permease, in addition to its subcellular localization in the flagellar pocket, where, presumably, occurs the entry of various metabolites into the cell through transporters. Therefore, and as mentioned above, in this work were identified and first studied, molecules involved in the transport of amino acids and polyamines in Trypanosoma cruzi, nutrients essential for the life of this parasite.

Bueno, Carlos Alberto. "Un terpenoide natural con actividades inmunomoduladora y antiangiogénica como potencial agente antiherpético" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Queratitis Estromal Herpética (QH) se produce por una respuesta inflamatoria que ocurre en el ojo humano como secuela de la infección causada por el virus Herpes simplex tipo 1 (HSV-1), siendo la primera causa epidemiológica de ceguera infecciosa en los países desarrollados. Uno de eventos característicos de la evolución de la QH es la neovascularización. Para limitar la progresión de la enfermedad se utilizan los corticosteroides y el aciclovir (ACV) que mitigan la inflamación e impiden la diseminación viral, respectivamente. Teniendo en cuenta los efectos adversos generados por los corticoides y el fenómeno de emergencia de mutantes del HSV-1 resistentes al ACV, se pone de relieve la necesidad de encontrar nuevas drogas antivirales. La búsqueda no sólo debería estar orientada a la obtención de compuestos que interfieran con alguna etapa del ciclo de multiplicación viral, sino que también contemple el hecho que la droga en cuestión interfiera con alguna señal intracelular, produciendo un efecto final tanto antiviral como inmunomodulador. En nuestro laboratorio se ha demostrado que un extracto parcialmente purificado obtenido a partir de hojas de Melia azedarach L., denominado meliacina (MA), inhibe la multiplicación de virus pertenecientes a distintas familias, en condiciones in vitro y en ausencia de citotoxicidad. In vivo, MA inhibe la incidencia y la severidad de la QH murina, lo cual sugiere que ejercería un efecto antiinflamatorio, además de actuar como antiviral. Uno de los principios antivirales presentes en dichos extractos es el tetranortriterpenoide 1-cinamoil-3,11-dihidroximeliacarpina (CDM), que inhibe la multiplicación del HSV-1 in vitro, basifica los endosomas, y afecta el transporte de las glicoproteínas virales a la membrana plasmática. En el presente trabajo de tesis se investigó el mecanismo de acción antiviral e inmunomodulador de CDM en células epiteliales del tejido ocular y en células inflamatorias, así como también el efecto antiangiogénico del compuesto en células endoteliales. Así fue posible avanzar en la comprensión de mecanismos moleculares y celulares que podrían explicar el efecto curativo de MA en la enfermedad ocular inducida por HSV-1 en ratón.

Abstract:
Ocular Herpes Simplex virus type 1 (HSV-1) infection may result in a inflammatory lesion in the eye termed Herpetic stromal keratitis (HSK). Such HSK lesions represent the commonest infectious cause of blindness in developed countries. Neovascularization stands for a major step in HSK pathogenesis. The current standard of care includes topical corticosteroids and acyclovir (ACV). Corticosteroids are used to combat the inflammatory component of the disease, and the antiviral prevents viral disemination. Considering the adverse effects caused by steroids and the phenomenon of emergence of mutant HSV-1 strains resistant to ACV, highlights the need for new antiviral drugs. The search should not only be aimed at obtaining compounds that interfere with some stage of viral multiplication cycle, but should also affect an intracellular signal, gathering together both antiviral and immunomodulatory effects. Our laboratory has demonstrated that a partially purified extract obtained from leaves of Melia azedarach L., called meliacine (MA), inhibits the multiplication of viruses belonging to different families in the absence of cytotoxicity, in vitro. In vivo, MA inhibits the incidence and severity of the murine HSK, suggesting that it exerts an anti- inflammatory effect in addition to its antiviral action. One of the main antiviral principles obtained in these extracts is the 1-cinnamoyl-3,11-dihydroxymeliacarpin (CDM), which inhibits HSV-1 multiplication in vitro provokes the basification of the endosomal vesicles, and affects the trafficking of viral glycoproteins. In this thesis we investigated the antiviral and immunomodulatory activities of CDM in epithelial cells of ocular tissue and inflammatory cells, as well as its antiangiogenic effect in endothelial cells. Thus, it was possible to advance in the understanding of the molecular and cellular mechanisms involved in the healing effect of MA in the ocular HSV-1 infection in mice.

Poncini, Carolina Verónica. "Funcionalidad de las células dendríticas en la infección por Trypanosoma cruzi" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Una de las características más relevantes de la infección por Trypanosoma cruzi es la presencia de desordenes inmunológicos. Previamente, nuestro grupo demostró que la infección aguda con la cepa virulenta RA regula negativamente la expresión de moléculas del CMHII en células presentadoras de antígeno (CPA) y altera la capacidad de células dendríticas (CD) esplénicas de estimular células T. Dado que las CD poseen un rol central en el inicio y desarrollo de la respuesta inmune, en el siguiente trabajo de tesis analizamos la capacidad del estadio de tripomastigote (Tp) de modular el estado de diferenciación y funcionalidad de CD derivadas de médula ósea in vitro. En dicho modelo, observamos que específicamente el estadio de Tp de T. cruzi fracasa a la hora de inducir activación de CD. Estas preservan la expresión basal de moléculas del CMHII y coestimulatorias, así como su capacidad endocítica. Asimismo, los Tp inducen secreción de TGF- β e incrementan la producción de interleuquina (IL)-10, observándose un aumento de la relación IL-10/IL-12p70 durante el tratamiento conjunto con LPS. Además, los Tp modulan la activación de CD inducida por LPS, regulando negativamente la expresión del CMHII y su capacidad de estimular linfoproliferación. La neutralización de IL-10 durante la diferenciación de las CD in vitro en presencia de Tp+LPS, revierte parcialmente la incapacidad de las CD de inducir alorespuesta durante una reacción linfocitaria mixta (RLM). Contrariamente, la neutralización simultánea de IL-10 y TGF-β durante la RLM no modifica la falta de alorespuesta observada. Ambas citoquinas, TGF-β e IL-10 son inmunomoduladoras y se encuentran asociadas a la inducción de tolerancia. Por lo tanto, estos resultados demuestran por primera vez que los Tp modulan la diferenciación de CD en presencia de LPS in vitro. Dichas CD presentan propiedades tolerogénicas (CDreg). Asimismo, Tp muertos por calor (Tpmc), pero no fijados con paraformaldehído o productos de excreción secreción parasitaria inducen CDreg. Las CD son responsables de modular la respuesta de células T, inclusive mediante la diferenciación de células T regulatorias (Tregs). Aquí se describe que tanto los Tp vivos como Tpmc alteran la capacidad de CD activadas con LPS de estimular linfocitos. En el cultivo de células T con CDreg se detectó producción de IL-10 y bajos niveles de IFN-γ. Asimismo, las CDreg alteran la respuesta ag-específica in vitro (OVA), utilizando células T CD4+ purificadas de ratones OT-II. Las células T CD4+ diferenciadas en presencia de CDreg (inducidas por Tp o Tpmc), muestran una menor expresión del marcador de activación temprana CD69 en comparación con las estimuladas con CD activadas con LPS. Además, estos CD4+ suprimen la alorespuesta en el marco de una RLM secundaria. Pese a no detectar diferencias respecto al número de Tregs CD4+CD25+FoxP3+, los resultados descriptos sugieren que las CD con propiedades tolerogénicas inducidas por T. cruzi, in vitro diferencian células T CD4+ potencialmente supresoras. La activación de la respuesta inmune depende del reconocimiento de señales de daño. El reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) por CD, juega un importante papel en el desarrollo de inmunidad. Numerosas moléculas de T. cruzi, capaces de activar CPA, han sido descriptas como ligandos de TLR2. Sin embargo, el modelo en CD se encuentra pobremente caracterizado. Las CDreg son inducidas por Tpmc, independientemente de infección. El fenotipo regulatorio se caracteriza por un estado particular de activación de CD: aumento en la activación de ERK 1/2 inducida por LPS y fosforilación de STAT3. Asimismo, los Tp no alteran la activación de p38, degradación de IκB-α o translocación a núcleo de NF-κB inducida por LPS. La vía de ERK es central en la inducción del fenotipo tolerogénico ya que su bloqueo regula negativamente la producción de IL-10 y restaura la capacidad de estimulación de las CD. La activación de NF-kB pero no la fosforilación de STAT3 está involucrada en la modulación de IL-10 por Tp. Un trabajo reciente demuestra que la señalización conjunta vía TLR2 y TLR4 induce sinergismo en la liberación de citoquinas anti-inflamatorias en CD murinas. El estímulo de TLR2 y TLR4 utilizando Pam3Cys o LPS y Tpmc en CD de ratones TLR2KO o mutantes para el TLR4, demuestra que los altos niveles de IL-10 son independientes del reconocimiento del parásito por TLR2 pero asociados a la señalización vía TLR4. En conclusión, estos resultados sugieren la importancia de la vía de ERK, la señalización por TLR4 y activación de NF-kB en la modulación de IL-10 inducida por T. cruzi y sugiere la existencia de interacciones parásito-CD aún no descriptas. La modulación de la diferenciación de CD por T. cruzi, puede explicarse como una estrategia de evasión desplegada por el parásito sobre una célula con potencial de desarrollar inmunidad con subsecuente control y erradicación de la infección. Sin embargo, muchos de los mecanismos inmunomoduladores que explican la persistencia parasitaria, favorecen el control de una respuesta proinflamatoria exacerbada, contrarrestándose el daño tisular concomitante. Futuros estudios permitirán descifrar el papel e impacto de los mecanismos inmunomoduladores en el balance entre tolerancia e inmunidad durante la infección experimental.

Abstract:
A main feature of acute infection with Trypanosoma cruzi is the presence of immunological disorders. Previously, our group demonstrated that acute infection with the virulent RA strain downregulates the expression of MHCII on antigen presenting cells (APC) and impairs the T-cell stimulatory capacity of splenic dendritic cells (DC). Since DC have a main role in the initiation and subsequent development of immune responses, here we assess the ability of trypomastigotes (Tp) to modulate the differentiation stage and functionality of bone marrow-derived DC in vitro. In this model, we observe that specifically Tp stage of T. cruzi fails to activate DC, which preserved low expression of MHCII and costimulatory molecules as well as endocytic activity. We also describe that Tp induce TGF-β secretion by DC, and enhance the gap between interleukin (IL)-10 and IL-12 p70 production, showing a higher IL-10/IL-12p70 ratio upon LPS-treatment. In addition, we observe that Tp modulate full activation induced by LPS, thereby downregulating their MHCII surface expression and inhibiting DC capacity to stimulate lymphocyte proliferation. In vitro IL-10 neutralization during DC-differentiation process with Tp+LPS, partially reverts poor aloresponse during mixed lymphocyte reaction (MLR). In contrast, simultaneous neutralization of both IL-10 and/or TGF-β during MLR does not restore linfoproliferation. Since both TGF-β and IL-10 are immunosuppressive cytokines related to the immunoregulation and tolerance induction, our results suggest for the first time that Tp modulate LPS-treated DC differentiation in vitro. DC described, display tolerogenic properties (DCreg). In addition, Tp heat-killed (Tphk), but not fixed with paraformaldehyde or parasite excretion-secretion products induce the DC-differentiation profile described for live-Tp. DC modulate T cells responses also by inducing differentiation of regulatory T cells. In the present work we describe that live or heat-killed Tp affect T-cell stimulatory capacity of LPS-treated DC. T cells cultured with DCreg show impaired aloresponse, produce IL-10 and low levels of IFN-γ. DCreg are unable to induce ag-specific responses to OVA using CD4+ T cells from OT-II mice in vitro. Alogenic CD4+ T cells primed with DCreg (induced by live or Tphk) show reduce expression of the early-activation marker CD69 compared with the ones cultured with activated DC (LPS). In addition, CD4+ T cells primed with DCreg suppress aloresponse in the context of a secondary MLR. Eventhough, we fail to find CD4+CD25+FoxP3+ Tregs, these results suggest DC with tolerogenic properties induced by T. cruzi prime potentially regulatory CD4+ T cells. Activation of immune responses depends on recognition of danger signal. Recognition of pathogens associated molecular pattern (PAMPs) by DC plays a key role in the first steps related to development of immunity. Several T. cruzi molecules that stimulate APC were described as Toll-like receptor 2 (TLR2) ligands. However, DC models are poorly characterized. Here, we show that DCreg are induced by Tphk stimulation, ruling out infection as a key mechanism involved in Tp-DC modulation. Regulatory phenotype is characterized by a particular DC activation state, with increased LPS-induced activation of extracellular regulated kinase (ERK) 1/2 and phosphorylation of signal transducer and activator of transcription (STAT) 3. We also observe that Tp does not affect p38 activation, IκB-α degradation or NF-κB translocation to the nucleus induced by LPS. ERK has a central role in DC differentiation since its blockade down-regulates IL-10 production and restores DC stimulatory capacity. NF-kB activation but not STAT3 phosphorylation is associated to IL-10 modulation by Tp. A recent work shows that signaling via TLR4 and TLR2 induces a synergism in anti-inflammatory cytokine production in murine DC. Upon TLR2 and TLR4 stimulation using Pam3Cys or LPS and Tphk in DC from TLR2 knock out (KO) or TLR4-mutant mice, we show that high levels of IL-10 are independent of TLR2 but associated to TLR4 signallization. In conclusion, all these findings demonstrate a key role of ERK and TLR4 in association to NF-kB in IL-10 modulation induced by T. cruzi and suggest that this regulatory effect involves parasite-DC interactions not described yet. Modulation of DC differentiation program by T. cruzi might be an evasion mechanism displayed by the parasite with immunosuppressive effects and consequences in the eradication of the parasite. However, immunoregulatory mechanisms in general associated with parasite persistence, may also control pro- inflammatory responses and counteract host tissue damage. Future goals will undercover the role and impact of immunomodulation in the balance between tolerance and immunity during the experimental infection in vivo

Careaga Quiroga, Valeria P.. "Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos polares de holotureos con potencial actividad biológica" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo se describe el aislamiento y la elucidación estructural de metabolitos polares presentes en cuatro holotureos provenientes del Mar Argentino y uno del Mar Chileno. La primer especie estudiada fue Psolus patagonicus. A partir del extracto etanólico del organismo se aislaron los glicósidos triterpenoidales sulfatados Patagonicósidos A (1), B (2) y C (3). El compuesto mayoritario 1 fue aislado por primera vez en nuestro laboratorio a partir de ejemplares de P. patagonicus recolectados en Bahía Ensenada (Tierra del Fuego). Los glicósidos minoritarios 2 y 3 son compuestos novedosos. Los compuestos disulfatados 1 y 3 se diferencian únicamente en la posición de uno de los grupos sulfato unido a los monosacáridos de la cadena glicosídica, mientras que el compuesto 2 es monosulfatado y presenta una cadena glicosídica diferente a la de 1 y 3. Los compuestos 1-3 presentaron actividad citotóxica y antiproliferativa frente a las líneas celulares tumorales A549, Hep3B, MDA-MB231 y actividad antifúngica frente a Cladosporium cladosporoides, Cladosporium fulvus, Fusarium oxysporum y Monilla sp. Los glicósidos triterpenoidales bioactivos Patagonicósidos A (1), B (2) y C (3) también fueron aislados del holotureo Psolus squamatus, especie estudiada por primera vez desde el punto de vista químico en este trabajo de tesis doctoral. Del extracto etanólico de Pseudocnus dubiosus leoninus se aislaron dos glicósidos triterpenoidales (4 y 5). El compuesto novedoso 4 presenta la aglicona 16-cetoholost- 7-en-3β-ol y su cadena glicosídica corresponde a identificada previamente en los glicósidos Cucumechinósidos A y C, aislados del holotureo Cucumaria echinata y en Hemoiedemósido A, aislado del holotureo Hemioedema spectabilis. Hemioedema spectabilis fue la cuarta especie estudiada. Se aislaron dos compuestos, Hemoiedemósidos A (6) y B (7), previamente caracterizados en nuestro laboratorio. Ambos compuestos presentan la misma aglicona y se diferencian en el grado de sulfatación de sus cadenas glicosídicas. Los glicósidos presentaron actividad citotóxica y antiproliferativa frente a las líneas celulares A549 y HeLa. El compuesto trisulfatado B (7) resultó más activo en ambas líneas celulares. De H. spectabilis se aisló además una mezcla compleja de glucosilceramidas compuesta por gluco- y galactocerebrósidos no informados anteriormente para este holotureo. Los compuestos aislados presentaron actividad citotóxica y antiproliferativa frente a la línea celular A549. El holotureo Athyonidium chilensis es una especie comestible explotada comercialmente por Chile. A partir de los extractos polares de su parte interna, epidermis y túbulos se aislaron fosfolípidos como componentes mayoritarios en las tres partes del organismo, además de glicósidos triterpenoidales minoritarios. Los ácidos grasos componentes de los fosfolípidos presentaron mezclas complejas de ácidos grasos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados, incluyendo los ácidos araquidónico y eicosapentanoico. La gran concentración de fosfolípidos en A. chilensis, su composición en ácidos grasos esenciales y la baja concentración de saponinas tóxicas demuestran por primera vez el valor nutritivo de esta especie. Todos los extractos de las especies estudiadas fueron purificados mediante distintas técnicas cromatográficas. La elucidación estructural de los compuestos se realizó mediante una combinación de experimentos de RMN (1D y 2D), espectrometría de masa de alta resolución y reacciones químicas para la obtención de derivados.

Abstract:
In this work, the isolation and structural elucidation of polar metabolites from four sea cucumbers from the Argentinian Sea and one from the Chilean Sea are described. Psolus patagonicus was the first sea cucumber studied. After purification of the ethanolic extract of the organism, sulfated triterpene glycosides Patagonicosides A (1), B (2) and C (3) were isolated. Compound 1 had been isolated for the first time in our laboratory from specimens of P. patagonicus collected in Bahía Ensenada (Tierra del Fuego). Minor glycosides 2 and 3 are novel compounds. Disulfated compounds 1 and 3 differ in the position of one sulfate in the glycosidic chain, while monosulfated compound 2 presents a glycosidic chain different from that in 1 and 3. Compounds 1-3 showed cytotoxic and antiproliferative activities against tumor cell lines A549, Hep3B and MDA-MB231 as well as antifungal activity against Cladosporium cladosporoides, Cladosporium fulvus, Fusarium oxysporum and Monilla sp. Bioactive triterpene glycosides Patagonicosides A (1), B (2) and C (3) were isolated from the sea cucumber Psolus squamatus. This species was studied for the first time in this work. From the ethanolic extract of Pseudocnus dubiosus leoninus two triterpene glycosides (4 and 5) were isolated. Glycoside 4 is a new compound with 16-cetoholost- 7-en-3β-ol as the aglycone and as the glycosidic chain. This oligosaccharide chain has been previously characterized in the glycosides Cucumechinosides A and C, isolated from the sea cucumber Cucumaria echinata and in Hemoiedemoside A, isolated from Hemioedema spectabilis. Hemioedema spectabilis was the fourth species studied. Two compounds, Hemoiedemosides A (6) and B (7), previously characterized in our laboratory were isolated. Both compounds have the same aglycone and differ in the number of sulfate groups in their glycosidic chains. Both glycosides showed cytotoxic and antiproliferative activities against tumor cell lines A549 and HeLa. Trisulfated compound B (7) was more active in both cell lines. A complex mixture of gluco- and galactocerebrosides was isolated from H. spectabilis for the first time. The isolated compounds showed cytotoxic and antiproliferative activities against tumor cell line A549. Athyonidium chilensis is an edible sea cucumber of high commercial value in Chile. Phospholipids were isolated as the major components from tubules, body wall and the internal part of the organism, together with minor triterpene glycosides. Phospholipids were composed by a complex mixture of saturated, monounsaturated and polyunsaturated fatty acids, including arachidonic and eicosapentaenoic acids. The high concentration of phospholipids in A. chilensis, the presence of esential fatty acids in the polar lipids and the low concentration of toxic saponins demonstrate for the first time the nutrional value of this species. The extracts of the sea cucumbers were purified by diverse chromatographic techniques. The structural elucidation of the compounds was performed by a combination of NMR experiments (1D and 2 D), high resolution mass spectrometry and synthesis of derivatives.

Camicia, Federico. "Caracterización de transportadores de aminoácidos en Echinococcus granulosus" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Echinococcus granulosus es un pequeño parásito cestode cuyo estadío larval causa la equinococcosis quística o hidatidosis. El objetivo de esta tesis fue analizar el transporte de aminoácidos en el estadío de metacestode y diseccionar los componentes moleculares involucrados en el mismo. Los análisis bioinformáticos realizados han mostrado que en Echinococcus spp. los transcriptos codificantes para transportadores de aminoácidos de la familia DAACS (transportadores de aminoácidos/ dicarboxilatos y catión) se encuentran entre los más representados, siendo los transportadores de aminoácidos excitatorios los más expresados dentro de los miembros de esta familia. Los ensayos de transporte efectuados en quistes hidatídicos infértiles indican que la incorporación de glutamato se daría mediante difusión simple, lo cual sugiere que dicho aminoácido podría ser sintetizado endógenamente. Este resultado estaría en concordancia con el hallazgo bioinformático de genes codificantes para enzimas que intervendrían en la síntesis de novo del aminoácido glutamato. Los análisis transcriptómicos sugieren que habría un aumento muy importante en la expresión de transportadores a nivel del parásito adulto con respecto a la forma lavaria, lo cual sugiere que en el estadío adulto la incorporación de glutamato en forma mediada podría ser esencial. Así mismo, en el protoescólex se han identificado ADNs copia codificantes para transportadores de aminoácidos que podrían estar involucrados en dicho transporte y se han denominado egat1-4. Con el fin de caracterizarlos, se han clonado y determinado las secuencias completas de los ADNs copia correspondientes y se ha hallado que poseen similaridad de secuencia y estructura con miembros de la familia DAACS. Los ensayos de hibridación in situ mostraron que el mensajero de egat1 se localiza en la zona tegumentaria del protoescólex y el correspondiente de egat3 en células del parénquima del protoescólex y en brotes de la capa germinal. Los anticuerpos contra fragmentos de EgAT1 y EgAT2 reconocieron proteínas en extractos del metacestode en ensayos de Western-blot. Se ha observado que EgAT1 se localiza en el subtegumento del protoescólex, ventosas, almohadilla rostelar y en fibras internas. EgAT1 también se localiza en capa germinal y en el subtegumento del parásito adulto. Por otro lado, EgAT2 se localiza en el parénquima del protoescólex y en brotes de la capa germinal. La diferente expresión espacial y temporal de los transportadores de aminoácidos analizados sugiere que cada uno de ellos cumpliría con las distintas necesidades de aminoácidos en diferentes territorios celulares y/o estadíos del ciclo de vida del parásito. EgAT1 se logró expresar en células de mamífero y los estudios funcionales efectuados en dichas células mostraron un pequeño pero significativo nivel de transporte de glutamato. La expresión de los transportadores a lo largo del ciclo de vida del parásito, su localización en estructuras claves para la interacción con el hospedador, su capacidad aunque limitada de incorporar glutamato, junto a las diferencias de estructura primaria y secundaria con sus ortólogos en mamíferos sugieren que estas moléculas podrían ser blancos de drogas contra la hidatidosis, además de proveer las bases moleculares para profundizar en la biología del parásito en lo que respecta al intercambio de metabolitos con el hospedador.

Abstract:
Echinococcus granulosus is a small parasitic cestode whose larval stage causes cystic echinococcosis or hydatidosis. The aim of this thesis was to analyse the amino acid transport in the metacestode stage and characterise the involved molecules. Bioinformatic analysis performed in Echinococcus spp showed that the transcripts coding for amino acid transporters of the DAACS family (Dicarboxylate/Amino Acid Na+ and/or H+ Cation Symporter family) are among the more represented, being the excitatory amino acid transporters the more expressed among the members of this family. Transport assays have shown that infertile hydatid cysts incorporate the amino acid glutamate from the external milleu by simple difussion. This is in concordance with the bioinformatic finding of the genes encoding enzymes possibly involved in glutamate synthesis. However, the transcriptomic analyses suggest an important increase in the expression levels of amino acids transporters in the adult form and this could imply that glutamate uptake is essential in the adult stage. Also, in the protoscolex stage, cDNAs encoding amino acid transporters were identified and named egat1-4. The corresponding cDNAs were cloned and their sequences were determined. The bioinformatic analyses revealed that they have sequence and structure similarity to DAACS family members. The in situ hybridization labelling indicates the distribution of egat1 mRNA throughout the tegument and egat3 mRNA in parenchimal cells of the protoscolex as well as in buds of the germinal layer. Monospecific polyclonal antibodies against the hydrophilic portions of EgAT1-3 were obtained from which only anti-Egat1 and anti-EgAT2 recognised metacestode proteins by Western-blot. These antibodies showed that EgAT1 protein is localized in the subtegumental region of the metacestode, particularly around suckers and rostellum of protoscoleces and in internal fibers compatible with nervous or muscular structures. EgAT1 was also localised in the germinal layer of the metacestode and in the subtegumental region of the adult worm. EgAT2 was localised in the parenchima of the protoscolex and in buds of the germinal layer. The differencial spatial and temporal expression of the amino acid transporters analysed in this thesis, suggest that each of them fulfil the specific amino acid requirements of the different cellular territories and/or life cycle stages. In addition, EgAT1 was expressed in mammal cells in which functional studies were performed. These studies showed a low but significant glutamate transport level. The low level of transport detected in this system could be due to the difficulty of the mammal cells to get the correct folding, subcellular location and post-translational modifications of the heterologous protein. The expression of the E. granulosus amino acid transporters all along the life cycle, their localisation in organs like suckers and rostellum, which are of major importance for the survival in the final host, and in buds of the germinal layer which give rise to protoscoleces, together with the capacity to transport glutamate and the structural differences with their mammal orthologous, suggest that these molecules could be amenable target for antihelmintics. The results obtained in this thesis could also help to understand the molecular basis of the metabolites interchange between the parasite and their hosts.

Matzkin, María Eugenia. "Prostaglandinas y su participación en la regulación de la función testicular" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las prostaglandinas son biomoléculas derivadas del ácido araquidónico por acción de la enzima ciclooxigenasa, que participan en el control de procesos fisio-patológicos en reproducción. No obstante, se desconoce aún el papel que desempeñarían en el testículo. En este Trabajo de Tesis Doctoral se investigaron los mecanismos regulatorios de la síntesis de prostaglandinas en el testículo, enfatizando en el análisis de aquellos factores locales involucrados en la modulación de la expresión de ciclooxigenasa 2 en células de Leydig y Sertoli. Los estudios realizados han permitido establecer: a) la participación de hormonas hipofisarias (LH, FSH y PRL) y andrógenos (testosterona, DHT) en la regulación de la expresión de ciclooxigenasa 2 y la síntesis de prostaglandinas en cultivos primarios de células de Leydig y Sertoli de hámsteres Dorados, b) la existencia de análogos moleculares de carga de la PRL hipofisaria que presentan bioactividades diferenciales sobre la expresión de ciclooxigenasa 2 en testículos de hámsteres, y c) el rol estimulatorio ejercido por IL-1β sobre la producción de prostaglandinas en el testículo de pacientes que padecen infertilidad idiopática. Así, las prostaglandinas desempeñarían un rol clave en la regulación de la actividad testicular en situaciones fisiológicas en el hámster, así como también durante el desarrollo y/o mantenimiento de ciertas disfunciones gonadales que conducen a una espermatogénesis alterada en el testículo humano.

Abstract:
Prostaglandins are bioactive molecules derived form arachidonic acid by the action of cyclooxygenase. Although prostaglandins exert their control over both physiological and pathological events in reproduction, very little is known about their role in the testis. In this Doctoral Thesis, the regulatory mechanisms for prostaglandins synthesis in the testis were studied, paying particular interest to local factors that, acting as modulators of cyclooxygenase 2 expression may regulate the functioning of Leydig and Sertoli cells. Studies performed in this Thesis have allowed us to establish: a) the participation of pituitary hormones (LH, FSH, PRL) as well as androgens (testosterone, DHT) as modulators of cyclooxygenase 2 expression and prostaglandins synthesis in Syrian hamster Leydig and/or Sertoli cells primary cultures, b) the existence of differentially bioactive pituitary PRL molecular charge analogues, and c) the stimulatory role exerted by IL-β on cyclooxygenase 2 expression in testes from men suffering from idiopathic infertility. Thus, prostaglandins would play a key role in the regulation of testicular activity under physiological situations in the golden hamster, as well as in the development and/or maintenance of certain testicular malfunctions that could lead to an altered spermatogenesis in the human testis.

García, María Noé. "Rol de los eritrocitos en la patogenia de HIV-1" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La relación entre HIV y las células CD4 positivas en las que replica ha sido ampliamente estudiado. Sin embargo el virus puede asociarse extracelularmente a células CD4 negativas incluyendo los eritrocitos. Si bien se ha reportado que el HIV se une a eritrocitos de individuos HIV negativos in vitro y es capaz de trans-infectar a otras células, no hay estudios equivalentes utilizando eritrocitos de individuos infectados. Esta tesis aporta información sobre la población viral asociada a eritrocitos en pacientes infectados por HIV y del rol que esta población podría tener en la fisiopatología de la infección. En la misma, se demostró la asociación de RNA y antígeno viral de HIV con eritrocitos de individuos infectados cursando distintos estadios virológicos de la infección. Incluso en individuos con carga viral plasmática indetectable por un año en los cuales la detección de antígeno podría ser útil para detectar rebrote de la replicación. Por primera vez se han detectado anticuerpos anti-HIV específicos asociados a eritrocitos. La presencia de los mismos estuvo asociada con replicación viral activa. Se demostró que la capacidad de los eritrocitos de pacientes infectados de capturar virus es muy superior a la de eritrocitos de individuos no infectados. A su vez, se encontró una relación positiva entre esa capacidad de captura y la presencia de anticuerpos anti-glicoproteína sobre la superficie de los eritrocitos. La presencia de HIV y la gran capacidad de captura viral por parte de los eritrocitos de individuos infectados demuestran que pueden ser transportadores de un importante pool viral. Más aun, se demostró in vitro que el virus unido a los eritrocitos conserva su infectividad sobre macrófagos derivados de monocitos, donde la unión mediada por complemento resulta en una infección productiva que genera progenie viral infectiva. Este mecanismo de infección de macrófagos resultó eficaz para una cepa macrofagotrópica pero ineficaz para una cepa linfotrópica pudiendo constituir un factor de selección en las primeras etapas de la infección. Haber determinado la infección de macrófago por el virus asociado a los eritrocitos es relevante dada la característica de aquellas como reservorio y por su capacidad de invasión de distintos tejidos. Los estudios llevados a cabo ponen de relevancia incluir el virus asociado a eritrocitos para comprender cabalmente la dinámica y la fisiopatogenia de la infección. Esto podría conducir a mejorar decisiones clínicas en situaciones tales como inicio o cambios en los tratamientos antirretrovirales así como analizar la posible importancia del virus asociado a eritrocitos como blanco para la terapia antirretroviral.

Abstract:
The relationship between HIV and CD4-positive cells in which HIV replicates has been widely analyzed. However, the virus can be extracellularly related to CD4-negative cells including erythrocytes. Some reports have stated that HIV is bound to erythrocytes of HIV-negative individuals in vitro and that transfection to other cells may occur, but no studies have yet reported the use of erythrocytes of HIV-infected individuals. This thesis provides information on the viral population associated to erythrocytes in HIV-infected individuals and the role this viral population may play on infection physiopathology. Here, the association of RNA and the HIV viral antigen to erythrocytes in infected individuals undergoing different infection stages is demonstrated, including those with undetectable plasma viral load for a year in which time antigen detection might contribute to detecting an outbreak of viral replication. For the first time, specific anti-HIV antibodies associated to erythrocytes have been detected. The presence of erythrocytes is associated to an active viral replication. The ability of erythrocytes in infected individuals to capture/retain the virus is much stronger than erythrocytes in healthy individuals. Besides, a positive relationship was observed between such ability and the presence of anti-glycoprotein antibodies on erythrocytes surface. The presence of HIV and this viral capture ability of erythrocytes in HIV-infected individuals demonstrate that they can be carriers of a significant viral pool. Besides, it has been demonstrated in vitro that the virus bound to erythrocytes retains infectivity on monocytes-derived macrophages. This mechanism to infect macrophages was effective for a macrophage-tropic strain but ineffective for a lymphotropic strain, being able to construct a selection factor during the first infection stages. The determination of macrophages infection by the virus associated to erythrocytes is very important given the characteristics of these cells as a reservoir and their capacity to invade different tissues. The assays carried out in this thesis on the virus associated to erythrocytes are relevant to better understand the dynamics and physiopathogenesis of the infection. This could lead to enhance clinical decision-making in situations such as the start or changes in antiretroviral therapy as well as to analyze the potential viral importance of erythrocytes as a target for the antiretroviral therapy.

Malamud, Florencia. "Bases moleculares del desarrollo de biofilms en Xanthomonas axonopodis pv citri y su rol en el proceso infectivo" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis de los cítricos, una enfermedad endémica en nuestro país. Xac es capaz de desarrollar biofilms in vitro y sobre hojas, propiedad importante para el desarrollo de esta enfermedad. En esta tesis se buscaron nuevos genes involucrados tanto en la adhesión como en el desarrollo del biofilm. Para esto, se realizaron mutantes en genes candidatos y se utilizó una biblioteca de mutantes generadas al azar. Mediante mutagénesis dirigida se estudiaron los roles del flagelo, de la adhesina FhaB y de los dos sistemas de secreción de tipo II presentes en la bacteria. Todas las mutantes deficientes en estos sistemas tuvieron problemas en la adhesión in vitro. Se observó que las bacterias mutantes en el gen que codifica para las proteínas que conforman el gancho flagelar además presentaron dificultades en el desarrollo del biofilm in vivo y deficiencias en la patogenicidad. A través de la realización de un screening donde se utilizó una colección de mutantes generadas al azar, mediante la inserción del transposón Tn5, se encontraron genes cuya participación en el desarrollo del biofilm de Xac ya se conocía: gumB (codifica para una proteína involucrada en la exportación del xantano), xcsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xcs), xpsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xps). También se encontraron nuevos genes implicados en la adhesión de esta bacteria, algunas de estas mutantes presentaron además una importante disminución en su patogenicidad. Se siguió caracterizando en mayor profundidad a una de ellas. La mutante posee una inserción en el gen hrpM, que codifica una glucosiltransferasa implicada en la síntesis de glucanos lineales, de acuerdo a lo que se conoce en otras bacterias. Se observó que esta mutante tiene disminuida su patogenicidad y además es incapaz de sintetizar glucanos cíclicos.

Abstract:
Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) is the causative agent of citrus canker. This disease is endemic in our country and it attacks different types of cultivars. Xac is able to develop biofilms in vitro and on leaves, a very important property for the development of the disease. In this thesis we look for new genes that were involved in adhesion and biofilm formation. For this, both a generation of mutants in candidate genes and and a library of of randomly generated mutants were used. By directed mutagenesis of candidate genes the roles of flagellar proteins, FhaB adhesin, and two proteins of the two type II secretion systems present in Xac were studied. All these defective mutants had problems with adhesion in vitro. Bacteria lacking the gene coding for the flagellar hook also had problems in the development of biofilm in vivo and was also deficient in pathogenicity. With the aim of finding new genes implicated in the biofilm formation a library of mutants was generated using a Tn5 transposon and tested. Some of the mutants found here were previously known as deficient in adhesion: gumB (polysaccharide export outer membrane protein), xcsD (type II secretion system protein D), xpsD (general secretion pathway protein D). New genes implicated in adhesion were also found, some of these mutants were also severely impaired in the development of canker disease. We continue with the characterization of one mutants. The mutant has an insertion in the hrpM gene, implicated in the elaboration of lineal glucans. We observe that this mutant was impaired in canker development. The synthesis of cyclic glucan was also affected.

Tribelli, Paula María. "Influencia del regulador global Anr en la fisiología de Pseudomonas extremaustralis, una bacteria productora de polihidroxibutirato" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Pseudomonas extremaustralis es un organismo Antártico, que presenta alta resistencia al estrés y produce polihidroxibutirato (PHB). En este trabajo, se estudió su metabolismo microaeróbico, que está regulado en Pseudomonas por Anr. Se observó que es capaz de utilizar nitrato, reduciéndolo solo a nitrito. El genoma posee todos los genes involucrados en la desnitrificación, con excepción de los genes nir. Los genes de la fermentación de L-arginina son funcionales en esta especie. Anr afectó positivamente la síntesis de PHB. Asimismo, influenció el estado redox celular, el consumo de oxígeno, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la producción de exopolisacáridos (EPS) y proteínas extracelulares, la biosíntesis de aminoácidos y la utilización de distintas fuentes de carbono. Los biofilms presentan gradientes de O2. El PHB contribuyó a la supervivencia en forma planctónica en biofilms en frío y su ausencia resultó en una mayor formación de biofilms y EPS y menor movilidad. Anr también afectó el desarrollo de biofilms, dado que mutantes anr mostraron defectos en su formación, así como menor adhesión, agregación y mayor movilidad. En el genoma de esta especie se detectaron 167 probables blancos de regulación (Regulon Anr). Los resultados en conjunto muestran la importancia de Anr sobre la fisiología de P.extremaustralis.

Abstract:
Pseudomonas extremaustralis is an Antarctic organism that shows high stress resistance and polyhydroxybutyrate (PHB) production. We studied the microaerobic metabolism, which is controlled by Anr in Pseudomonas species. This strain was capable to reduce nitrate, used as an electron acceptor, to nitrite. P.extremaustralis genome presented the genes involved in denitrification, excepting the nir genes. The genes involved in L-arginine fermentation were also functional in this species. Anr positively affected PHB synthesis. In addition, this regulator influenced the cellular redox state, oxygen consumption, the presence of oxygen reactive species, the exopolysaccharides (EPS) and extracellular proteins production, the aminoacid biosynthesis and carbon source utilization. Biofilms show oxygen gradients. PHB contributed to the survival of planktonic cells in the biofilm at cold conditions and its absence resulted in higher biofilm formation and EPS production and also lower motility. Additionally, Anr affected biofilm development; since an anr mutant strain showed defects in biofilm formation and cellular adhesion and aggregation and motility alterations. We detected 167 putative regulated target genes at the P.extremaustralis genome. These results show the important role of Anr in the P.extremaustralis physiology.

Cardillo, Sabrina Beatriz. "Regulación de la expresión del gen UGA4 de Saccharomyces cerevisiae: mecanismos moleculares involucrados en la respuesta a los aminoácidos extracelulares" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La levadura Saccharomyces cerevisiae es capaz de incorporar y metabolizar el ácido γ-aminobutírico (GABA) gracias a los productos de tres genes: UGA4, UGA1 y UGA2. El primero de ellos, UGA4, codifica para una permeasa específica de GABA que es capaz de incorporar este aminoácido a las células. Luego, el GABA puede ser degradado por las enzimas GABA transaminasa y succinato semialdehído deshidrogenasa, codificadas por los genes UGA1 y UGA2, respectivamente. Estos genes son inducibles por GABA y esta inducción depende de los factores de transcripción Uga3 y Uga35/Dal81. Estudios previos reportaron que la inducción del gen UGA4 se ve afectada por la presencia de aminoácidos en una forma dependiente del sensor SPS. En este trabajo demostramos no sólo que el sensor SPS interviene en la regulación por leucina del gen UGA4, sino que también los factores Stp1 y Stp2 intervienen en esta regulación. En presencia de leucina, se observó un menor reclutamiento de los factores Uga3 y Uga35/Dal81 al promotor UGA4, lo que sería la causa de la menor inducción observada en esas condiciones. Por otra parte, se demostró que esta alteración en la interacción de dichos factores con el promotor UGA4 es causada por una señal disparada por el sensor SPS. Ambos factores, Uga3 y Uga35/Dal81, actúan a través del elemento UASGABA presente en el promotor UGA4 y dependen uno del otro para poder interactuar con dicho elemento. Más aún, nuestros resultados sugieren que el factor de transcripción Uga35/Dal81 interactúa con el promotor UGA4 a través del factor Uga3. Por otra parte, se demostró que la inducción de la expresión de los otros genes miembros del regulón UGA, UGA1 y UGA2, es también inhibida por aminoácidos en una forma dependiente del sensor SPS y que esta regulación ocurre muy probablemente a través del mecanismo establecido para UGA4. Por último, demostramos que el factor de transcripción Leu3 regula negativamente la expresión de los genes UGA4 y UGA1 pero no interviene en la regulación de UGA2.

Abstract:
Saccharomyces cerevisiae yeast cells are able to transport and metabolize γ-aminobutyric acid (GABA) using the product of three genes: UGA4, UGA1 and UGA2. The first one, UGA4, encodes a GABA specific permease, while the other two genes, UGA1 and UGA2, encode the GABA transaminase and semialdehyde dehydrogenase enzymes, both responsiblefor GABA degradation. These genes are inducible by GABA and this induction depends on Uga3 and Uga35/Dal81 transcription factors. Previuos reports demonstrated that UGA4 induction is inhibited by the presence of extracellular amino acids being this effect mediated by the SPS amino acid sensor. In this work we demonstrated that the effect of leucine on UGA4 induction is not only mediated by the SPS sensor, but also by the Stp1 and Stp2 transcription factors. Uga3 and Uga35/Dal81 recruitment to UGA4 promoter was affected by the presence of leucine, wich would be the reason of the low induction levels observed in these conditions. We also demonstrated that the low recruitment of these transcription factors to the UGA4 promoter was mediated by a signal triggered by the SPS amino acid sensor. Both transcription factors, Uga3 and Uga35/Dal81, act trough the UASGABA element present in the UGA4 promoter and they depend on each other to interact with that element. In adittion, our results suggest that the Uga35/Dal81 transcription factor interacts with the UGA4 promoter through Uga3. Moreover, we demonstrated that the induction of the other two members of the UGA regulon, UGA1 and UGA2, is also inhibited by extracellular amino acids by the same mechanism we established for UGA4. Finally, we demonstrated that the Leu3 transcription factor negatively regulates UGA4 and UGA1 expression, but does not participate in UGA2 regulation.

Galello, Fiorella Ariadna. "Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependiente de cAMP: proteínas sustrato y de anclaje de PKA de Saccharomyces cerevisiae" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La especificidad en la vía de transducción de señales de cAMP-PKA está determinada por el reconocimiento de la secuencia blanco en el sustrato y por la localización de la quinasa en compartimentos subcelulares. En Saccharomyces cerevisiae los determinantes de la especificidad de la proteína quinasa A (PKA) están menos caracterizados que en mamíferos. Analizamos el comportamiento de los sustratos y los determinantes de secuencia alrededor del sitio de fosforilación de tres proteínas sustrato: Piruvato quinasa 1 (Pyk1), Piruvato quinasa 2 (Pyk2) y Trehalasa neutra (Nth1). La proteína Nth1 es mejor sustrato que la proteína Pyk1 y ambas son fosforiladas tanto por Tpk1 como por Tpk2, dos de las isoformas de la subunidad catalítica de la PKA de levaduras. Las tres proteínas contienen uno o más motivos consenso de PKA, Arg-Arg-X-Ser, pero no todos ellos son fosforilados. Análisis de esos sitios permitieron determinar que los residuos ácidos en la posición P+1 o en el extremo N-terminal son deletéreos para la reacción catalítica, mientras que los residuos positivos presentes más allá de las posiciones P-2 y P-3 la favorecen. Un residuo hidrofóbico voluminoso en posición P+1 no resulta crítico, a diferencia de lo que ocurre con los sustratos de la PKA de mamíferos. El mejor sustrato tiene en la posición P+4 un residuo ácido, equivalente al que se encuentra en la secuencia inhibitoria de Bcy1, la subunidad regulatoria de la PKA de levaduras. Se analizó también el efecto del sustrato sobre la activación de la holoenzima y demostramos que tanto los sustratos peptídicos como las proteínas enteras sensibilizan en diferentes grados, dependiendo de sus secuencias, a la holoenzima para la activación por cAMP. Los resultados también sugieren que las proteínas enteras son mejores co-activadores que los péptidos. Se determinaron los catalitic turnover numbers de las isoformas Tpk1 y Tpk2, y ambas enzimas mostraron el mismo valor, 3 seg-1, diez veces menor que el valor determinado para las subunidades C de mamíferos. La compartimentalización de la señal del cAMP, otro punto de regulación de la especificidad, es mantenida por el agrupamiento de las enzimas de la vía de señalización en unidades discretas a través de las proteínas de anclaje de la proteína quinasa A (AKAPs), las cuales interactúan con la subunidad regulatoria de la holoenzima. Hasta el momento no habían sido identificadas proteínas de anclaje en levaduras. Definimos, utilizando abordajes in silico y bioquímicos de copurificación e identificación por espectrometría de masa, proteínas que hacen interacción con Bcy1, entre ellas: GTPase activating protein 2 (Ira2), Myosin2 (Myo2), Heat shock protein 60 (Hsp60) and Protein Tyrosine Phosphatase 1 (Ptp1). Utilizando arrays de péptidos se identificaron los residuos críticos para la interacción en las proteínas de anclaje. Los dominios definidos como claves de la interacción presentan una estructura posible de α-hélice con residuos cargados positivamente que son importantes para la interacción. Usando mutantes de deleción se definió que las proteínas estudiadas hacen interacción con la región N-terminal de Bcy1. Se verificó la interacción in vitro por ensayos de pull-down, e in vivo por inmunoprecipitación. También se demostró que Bcy1 e Ira2 localizan en la misma fracción subcelular y que péptidos derivados de Ira2 son fosforilados por las Tpks in vitro. Se analizó la relevancia fisiológica de la interacción entre Bcy1 y Hsp60 y se observó que la actividad quinasa de PKA disminuye en ausencia de la chaperona, indicando que la Hsp60 tendría una función estabilizadora sobre las Tpks y además que frente a un estrés térmico Bcy1, Tpk1 y Hsp60 aumentan su localización en la fracción mitocondrial, lo que permitiría modular el transporte de proteínas mitocondriales por fosforilación

Rigano, Luciano Ariel. "Aspectos moleculares de la interacción xanthomonas-planta" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El género Xanthomonas incluye a más de 300 especies que atacan a una gran variedad de plantas, entre ellas muchas de interés comercial. En esta tesis se trabajó en la caracterización de la interacción entre dos patovariedades de Xanthomonas y sus hospedadores. En la primera parte de la tesis se describe la interacción entre Xanthomonas campestris pv. campestris, agente causal de la putrefacción negra de las crucíferas y su hospedador Arabidopsis thaliana, y Nicotiana benthamina, un nuevo modelo de interacción, focalizándonos en cual es el rol del glucano cíclico beta-(1,2) en el proceso infectivo. Este compuesto demostró ser un supresor de la respuesta de defensa de la planta, a través de un mecanismo que involucra su capacidad de diseminarse sistémicamente dentro de la misma. En la segunda parte de estas tesis se estudió la interacción entre Xanthomonas citri susp. citri, uno de los agentes causales de la Cancrosis Bacteriana de las Cítricos (CBC) y su hospedador Citrus limon. En particular se estudió el rol de exopolisacárido xantano producido por la bacteria en la formación de biofilms y en su virulencia. Encontramos que el xantano es fundamental para la formación de complejos multicelulares bacterianos, y que la formación de estos mismos tiene un rol central en la sobrevida de la bacteria en la planta y en la virulencia de la misma. En la tercera, y última sección de esta tesis, se propuso la aplicación de los conocimientos adquiridos sobre la CBC en el desarrollo de un método de diagnóstico para la enfermedad. El método desarrollado se basó en una amplificación de ADN isotérmica acoplada a tiras del tipo test de embarazo. Los resultados obtenidos muestran que el desarrollo es altamente específico, sensible, transportable y fácil de ser llevado a cabo.

Abstract:
The genus Xanthomonas contains more than 300 species that attack a wide variety of plants, including many commercial cultivars. In this thesis we worked on the characterization of the interaction between two pathovars of Xanthomonas and their hosts. The first chapter of this thesis describes the interaction between Xanthomonas campestris pv. campestris, the causative agent of crucifer black rot and its host, Ababidopsis thaliana, and in the new model plant Nicotiana benthamiana, focusing on what is the role of cyclic beta-(1,2) gucan, produced by the bacteria, in the interaction. This compound proved to be a suppressor of defense response of the plant, which has the ability to spread systemically within the host. In the second part of this thesis, we have studied the interaction between Xanthomonas citri subsp citri, one of the causal agents of Citrus Bacterial Canker (CBC) and its host, Citrus lemon. In particular we studied the role of the exopolysaccharide xanthan produced by the bacteria, in biofilm formation and virulence. We found that xanthan is essential for the survival of bacteria within the plant and their virulence. In the third and final section of this thesis, we have used the knowledge acquired on CBC, in the development of a diagnostic method for this disease. The method developed was based on an isothermal DNA amplification technique couple with lateral flow dipsticks. The results show that the test is highly specific, sensitive, portable and easy to be carried out.

Robaldo, Laura. "Síntesis, caracterización y aplicaciones de dnazimas modificadas con 2´-desoxi-2´-c-metilnucleósidos" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las enzimas de ADN (DNAzimas) son moléculas catalíticas formadas por una cadena simple de desoxirribonucleótidos. Estas moléculas no se encontraron en la naturaleza sino que fueron obtenidas a través de procesos de selección molecular in vitro. En particular, la DNAzima 10-23 es una enzima de ADN que fue descripta por Santoro y Joyce en 1997. Es la más utilizada en estudios de silenciamiento génico en sistemas biológicos debido a su capacidad de reconocer, unirse e hidrolizar una molécula de ARNm. Su secuencia se compone de un núcleo catalítico conservado de 15 desoxirribonucleótidos y dos brazos de reconocimiento a ambos lados del núcleo. Luego de unirse por complementariedad de bases, la DNAzima 10-23 puede hidrolizar al ARNm blanco entre una purina desapareada (A, G) y una pirimidina apareada (U, C) en presencia de Mg2+. La estabilidad de una DNAzima se puede mejorar mediante la incorporación de nucleósidos modificados tanto en el núcleo catalítico como en los brazos de reconocimiento. Estas modificaciones pueden aumentar la estabilidad y prolongar la vida media de la DNAzima en sistemas biológicos. Por otro lado, el uso de modificaciones químicas permite estudiar y resolver interrogantes respecto a la relación entre la estructura y la función de estas moléculas. Esta tesis consiste en la síntesis y caracterización de DNAzimas modificadas en el núcleo catalítico con (2'R) y (2'S)-2'-desoxi-2'-C-metilnucleósidos. Estos nucleósidos presentan una restricción de la conformación del anillo furanósico dependiendo de la configuración del carbono 2 ́. Por otra parte, al incluir estas modificaciones en secuencias de oligonucleótidos, se ve aumentada la estabilidad ante la degradación por nucleasas. El objetivo principal fue obtener DNAzimas resistentes a la degradación nucleolítica que pudieran ser útiles en la inhibición de la expresión de ARNms terapéuticos. Por otra parte, se analizaron las consecuencias funcionales y estructurales generadas por la incorporación de estas modificaciones a la estructura de la DNAzima 10-23. Los resultados obtenidos muestran que las modificaciones (2'R) y (2'S)-2'-desoxi-2'-C- metilnucleósidos pueden ser estratégicamente introducidas en diferentes posiciones del núcleo catalítico de la DNAzima 10-23 sin observarse una pérdida significativa de la actividad. También se observó que estas modificaciones aumentan la vida media de las DNAzimas en diferentes sistemas biológicos. En base a estos resultados, podemos concluir que las DNAzimas sintetizadas en este trabajo podrían ser útiles como molécula antisentido en la inhibición de la expresión de ARNms terapéuticos.

Abstract:
DNA enzymes (DNAzymes) are catalytic molecules composed of a single strand of deoxyribonucleotides. They are unnatural sequences that were discovered through molecular in vitro selection processes. The 10 23 DNAzyme is a specific DNA enzyme that was described by Santoro and Joyce in 1997. It is the most commonly used in biological studies of gene silencing because it shows the ability to recognize, bind and then cleave RNA. The 10 23 DNAzyme sequence is composed of a conserved catalytic domain of 15 deoxyribonucleotides and two substrate recognition arms on both sides. It can cleave any RNA substrate between an unpaired purine (A, G) and a paired pyrimidine (U, C) in presence of Mg2+. DNAzyme stability may be improved by employing chemically modified nucleotides at either the core or the flanking regions. The modifications can increase the stability of the macromolecule and extend DNAzyme half life in biological systems. On the other hand, the inclusion of modifications could also solve questions related to structure function relationships of these molecules. This thesis involves the synthesis and characterization of modified 10-23 DNAzymes in the catalytic core with (2 R) and (2 S)-2 -deoxy-2 -C-methylnucleosides. These nucleosides show differential preferred sugar conformation depending on the configuration of the 2 ́-carbon. The inclusion of these modifications into oligonucleotides sequences increases the stability to nuclease degradation. The main objective was to obtain active modified DNAzymes with increased resistance to nucleolitic degradation and could therefore be useful for targeting interesting mRNA. On the other hand, the functional and structural implications of the introduction of these restricted modifications in the catalytic core of the 10-23 DNAzyme were also studied. The results presented herein show that (2 R) and (2 S)-2 -deoxy-2 -C- methylnucleosides can be strategically introduced in different positions of the catalytic core without significant loss of activity. They also show that these modifications enhance the half life of modified DNAzymes in different biological systems. For these reasons we concluded that the modified DNAzymes synthesized in this work could potentially be used as resistant antisense molecules against therapeutics mRNA targets.

Dansey, María Virginia. "Síntesis y actividad biológica de análogos de esteroides neuroactivos y hormonas esteroidales" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta tesis se detallan los resultados obtenidos en la síntesis, actividad biológica y la relación estructura-actividad de nuevos análogos de esteroides bioactivos. Por un lado, se sintetizó un análogo no hidrolizable del 21-hemisuccinoiloxi-6,19-epoxiprogesterona (21HS-6,19OP), para lo cual se desarrolló una metodología one-pot sencilla de alquilación para la posición C-21 de 20- ceto pregnanos que consiste en la formación del sililenoléter, seguido de la condensación de Mukaiyama con un aldehído. El análogo obtenido resultó ser biológicamente inactivo a diferencia de su líder. Por otro lado, se diseñaron y sintetizaron cuatro A-homoanálogos del neuroesteroide allopregnanolona. A partir de progesterona comercial, se preparó un ciclopropilcarbinol que fue sometido a un reordenamiento catiónico catalizado por ácidos y promovido por microondas para dar un A-homo-3,5-pregnadieno. Este se epoxidó regioselectivamente con dioxiranos generados in situ, con un derivado de fructosa como catalizador y oxone® como oxidante para dar los análogos. Uno de ellos resultó tener una actividad in vitro sobre el receptor GABAA similar a la pregnanolona; los otros tres resultaron levemente activos demostrando que la libertad conformacional del anillo A de 7 miembros les permitiría a los análogos alcanzar conformaciones activas. A dos de los A-homoesteroides intermediarios de la síntesis, que por poseer una funcionalidad ceto en el anillo A son análogos de progesterona, se les ensayó la actividad sobre el receptor progestágeno (PR) y mineralocorticoide (MR), encontrando que estos actúan selectivamente sobre el primero, probablemente debido a un aumento en la hidrofobicidad del anillo A.

Abstract:
This thesis describes the synthesis, biological activity and structure-activity relationships of seven novel bioactive steroid analogues. In the first part, a non hydrolyzable analogue of 21- hemisuccinoyloxy-6,19-epoxyprogesterone (21HS-6,19OP) was synthesized. To achieve this goal, a straightforward one-pot alkylation methodology at C-21 of 20-keto pregnanes was developed, consisting of silylenol ether formation followed by a Mukaiyama aldol reaction. In contrast with the lead compound, the resulting analogue was biologically inactive. In the second part, four Ahomo neurosteroids analogues where designed and synthesized. Starting from commercially available progesterone, a ciclopropylcarbinol derivative was prepared, which was subjected to an acid catalyzed-microwave promoted cationic rearrangement to give an A-homo-3,5-pregnadiene. This diene was regioselectively epoxydized with a bulky dioxirane generated in situ from a fructose derivative and Oxone®. One of the analogues exhibited an in vitro activity on the GABAA receptor similar to pregnanolone; the other three analogues where only slightly active, proving that the conformational freedom provided by the seven membered A ring would allow the compounds to explore active conformations. Two A-homo synthetic intermediates with a ketone functionality on the A ring proved to be selective progesterone receptor (PR) agonists, lacking mineralo/antimineralocorticoid activity. The selectivity achieved might be due to the enhanced hydrofobicity of the expanded A ring.

Julianelli, Vanina Laura. "El Heparán Sulfato y la descondensación del núcleo espermático humano: estudio de su rol específico en dicho proceso y caracterización molecular de la interacción Heparán Sulfato-ADN-Protaminas" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
A diferencia de las células somáticas, el espermatozoide posee su cromatina empaquetada principalmente por protaminas en lugar de histonas. Las protaminas son proteínas pequeñas y básicas, debido a su alto contenido de residuos lisina, arginina y cisteína. Las cisteínas forman puentes disulfuro intra e intercatenarios, lo que le proporciona al núcleo espermático gran estabilidad y resistencia para poder atravesar el tracto masculino, el femenino y llegar con su ADN intacto hasta el sitio de fecundación. Una vez que el espermatozoide penetra en el ovocito, es imprescindible que se produzca la descondensación de su cromatina, es decir el desempaquetamiento del ADN para poder reemplazar las protaminas por histonas ovocitarias. La descondensación de la cromatina consiste en dos eventos, deben reducirse los puentes disulfuro (tiorreducción) y removerse las protaminas. Las moléculas involucradas en estos procesos son el glutatión reducido (GSH) y el heparán sulfato (HS) ovocitarios. Hasta el momento se consideraban eventos independientes y sucesivos: primero el GSH tiorreduce las protaminas, y luego el HS las remueve. Sin embargo, nuestros resultados indican que estos procesos podrían ser simultáneos y cooperativos. El objetivo de esta tesis fue avanzar en el estudio del mecanismo de la descondensación de la cromatina del espermatozoide humano in vitro en presencia de heparina (análogo estructural del HS) y GSH y su extrapolación al mecanismo in vivo durante la fertilización. Al coincubar espermatozoides humanos o núcleos espermáticos aislados con heparina y GSH, se produce un mayor porcentaje de descondensación de la cromatina, con respecto a la incubación en forma secuencial con los mismos agentes, independientemente del orden de los mismos. Utilizando naranja de acridina como técnica para evaluar en forma indirecta el estado de tiorreducción de los núcleos espermáticos, se observa que la heparina colabora con el GSH en la tiorreducción, durante la descondensación. Estos resultados fueron confirmados utilizando monobromobimane como método directo para evaluar tiorreducción. Los resultados aportados por esta tesis indican que la tiorreducción producida por el GSH, y la remoción de las protaminas producida por la heparina, durante la descondensación de la cromatina de espermatozoides humanos in vitro, ocurriría en forma simultánea, y no secuencial, ya que ambos factores cooperarían entre sí.

Abstract:
Unlike somatic cells, sperm have a highly packed chromatin due to the presence of protamines instead of histones. Protamines are small basic proteins, very rich in cysteine, lysine and arginine. Cysteine residues form disulfide bonds, both intra and interchain, rendering the sperm nucleus high stability and resistance during transit along the male and female reproductive tracts, thus enabling the spermatozoon to arrive at the fertilization site intact. Once the sperm penetrates the oocyte, chromatin decondensation must occur, implying the unpacking of DNA through the replacement of protamines by oocyte histones. Decondensation comprises two steps: disulfide bonds must be reduced (thioreduction) and protamines must be removed. The molecules involved in these steps are reduced glutathione (GSH) and heparan sulfate (HS) from the oocyte. Until now, these events were considered independent and consecutive: first GSH thioreduced protamines and, then HS removed them. Our results indicate otherwise, suggesting that both processes could be simultaneous and cooperative. The aim of this thesis was to advance in the study of the mechanism of nuclear decondensation of human sperm in vitro, using heparin (HS structural analog) and GSH and the extrapolation to the in vivo mechanism during fertilization. A higher degree of decondensation was observed upon coincubating of human sperm or isolated nuclei with heparin and GSH, compared to sequential incubation with the same agents, regardless of the order in which they were added. Use of an acridine orange staining technique as a means to indirectly evaluate the thioreduced status of sperm chromatin, revealed that heparin enhanced GSH thiol reducing activity, suggesting the existence of a cooperative effect between both reagents during decondensation. These results were confirmed by direct thiol reduced status evaluation uthrough labeling of free thiols in sperm chromatin with monobromobimane. The results presented herein indicate that protamine thiol reduction by GSH and removal of protamines by heparin during chromatin decondensation of human sperm in vitro, occur simultaneously rather than sequentially, since a cooperative effect could be observed between both decondensing agents.

Ogara, María Florencia. "Mecanismo de activación de P191NK4d y su papel como factor neuroprotector frente a la injuria genotóxica" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La permanencia de la mayoría de las neuronas durante toda la vida del organismo necesaria para mantener sus funciones, y el hecho de que estas células no se dividan luego del desarrollo sugieren que, durante la evolución, se ha ejercido una fuerte presión sobre el sistema nervioso de modo de desarrollar diversos mecanismos que lo protejan contra la muerte celular. Las dramáticas consecuencias de la neurodegeneración enfatizan la importancia de estos mecanismos que promueven la supervivencia y plasticidad neuronal. Por lo tanto, la identificación de los factores implicados en la regulación de la homeostasis y supervivencia neuronal es imprescindible para comprender el desarrollo y establecimiento de las enfermedades neurodegenerativas y para el diseño de una terapia racional para su tratamiento. La expresión temprana y extensa de p19INK4d, un miembro de la familia INK4 de inhibidores del ciclo celular, en el cerebro y su participación en la reparación del DNA y en la apoptosis sostienen la hipótesis de que esta proteína participaría en mecanismos de protección de las neuronas frente a la muerte celular. El objetivo del presente trabajo consistió en evaluar el potencial rol de p19 en este sentido, así como también su mecanismo de activación. Se utilizaron células SH-SY5Y diferenciadas con ácido trans-retinoico como modelo neuronal y cultivos primarios de neuronas hipocampales de rata. Los tratamientos con genotóxicos como el péptido β-amiloide o neocarzinostatina indujeron la expresión y fosforilación de la proteína de p19. Ambos efectos fueron dependientes de la movilización de calcio intracelular, ya que la incubación con el ionóforo de calcio A23187 o con una concentración aumentada de potasio, recapitularon la acción de los genotóxicos sobre p19. La inhibición de la actividad de CDK5 o la incubación con calpeptina, un inhibidor de la calpaína, responsable de la proteólisis de p35, subunidad regulatoria de CDK5, a p25, su forma más activa, causaron la inhibición de la fosforilación de p19 en respuesta a genotóxicos, demostrando que la quinasa CDK5 es la enzima efectora de dicha fosforilación. Se establecería un balance entre la síntesis y degradación de la proteína p19, ya que la misma parecería ser un sustrato de la calpaína, proteasa que se activa en presencia de los genotóxicos mencionados. Por otro lado, el factor de transcripción E2F1 participaría en la inducción de la expresión de p19 frente al péptido β-amiloide. Las células neuronales con sobrexpresión inducida de p19 repararon más eficientemente el DNA dañado y mostraron niveles reducidos de muerte celular en respuesta al tratamiento con el péptido β-amiloide o neocarzinostatina. Resultados opuestos se obtuvieron en células deficientes en esta proteína. La presencia de los genotóxicos también produjo la inducción del gen de p19 en neuronas de hipocampo. Estas células con niveles disminuidos de p19 presentaron una menor eficiencia en la reparación del DNA y un mayor grado de apoptosis luego del tratamiento con los genotóxicos. La presencia de p19 influenció la sensibilidad neuronal a largo plazo y confirió resistencia al estrés neurotóxico. Ensayos in vivo llevados a cabo en el hipocampo del ratón mostraron que en ausencia de p19 existía un mayor porcentaje de células dañadas luego de la inyección de neocarzinostatina. De esta forma, los resultados obtenidos en esta tesis nos permiten hablar de p19 como un factor neuroprotector, implicado no sólo en los mecanismos de reparación del DNA en respuesta al estrés genotóxico exógeno, sino también en la resistencia y en la supervivencia de las neuronas en respuesta a procesos endógenos que conducen a la neurodegeneración.

Abstract:
The permanence of most neurons throughout the life span of an organism is required to maintain its functions. The fact that these cells do not undergo division after the developmental stage suggests that, during evolution, the nervous system was subjected to a strong selective pressure to develop appropriate mechanisms to prevent cell death. The dramatic consequences of neurodegeneration highlight the importance of these mechanisms that promote neuron survival and plasticity. Therefore, the identification of the factors involved in the regulation of neuron homeostasis and survival is critical to understanding the development and progress of neurodegenerative diseases, as well as for the design of rational therapies for their treatment. p19INK4d, a member of the INK4 family of cell cycle inhibitors, is expressed in an early and long-lasting manner in the brain and is involved in DNA repair and apoptosis. This supports the hypothesis that this protein might participate in the mechanisms that protect neurons from cell death. The aim of this thesis was to examine a potential role for p19 in this context, as well as its mechanism of activation. SH-SY5Y cells differentiated with all-trans-retinoic acid and primary cultures of rat hippocampal neurons were used as neuronal models. Genotoxic stimuli such as the β- amyloid peptide and neocarzinostatin induced the expression and phosphorylation of the p19 protein. Both effects appear to depend on intracellular calcium mobilization since they were recapitulated by treatment with the calcium ionophore A23187 or high extracellular potassium levels. Inhibition of CDK5 activity or treatment with the calpain inhibitor calpeptin prevented p19 modification in response to genotoxic stress. The protease calpain cleaves p35, CDK5 regulatory subunit, to its more active form p25. These results indicate that CDK5 is the kinase responsible for p19 phosphorylation. An equilibrium between p19 synthesis and degradation likely exists since p19 appears to be a substrate for calpain, which becomes activated following genotoxic stress. Finally, the E2F1 transcription factor is shown to be involved in p19 transcriptional regulation in response to β-amyloid peptide treatment. Neuronal cells overexpressing p19 promoted DNA repair more efficiently and exhibited reduced levels of cell death in response to β-amyloid peptide or neocarzinostatin treatment, compared to control cells. The opposite effect was observed in cells with reduced p19 expression. The same genotoxic stimuli also induced the p19 gene in hippocampal neurons and, in these cells, downregulation of p19 led to impaired DNA repair and enhanced apoptosis following genotoxic stress. The presence of p19 influenced long-term neuronal sensitivity and conferred resistance to neurotoxic stress. In vivo studies showed that ablation of p19 in mouse hippocampal neurons correlates with an increased percentage of cells displaying signs of DNA damage after neocarzinostatin injection. In summary, the data described in this thesis supports the hypothesis of p19 as a neuroprotective factor, implicated not only in the mechanisms of DNA repair in response to exogenous genotoxic stress, but also affecting neuronal cell resistance and survival in response to the endogenous processes leading to neurodegeneration.

Bonifazi, Evelyn Lucía. "Síntesis de naftoquinonas relacionadas a lapachol y ß-lapachona. Evaluación como agentes antitumorales" (2012-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Este trabajo de tesis describe la síntesis de naftoquinonas relacionadas a las quinonas naturales lapachol y β-lapachona, que presentan una amplia variedad de actividades biológicas entre las cuales se destaca su actividad antitumoral. El fin fue lograr compuestos con acción citotóxica mejorada y poder determinar los requerimientos estructurales de este tipo de quinonas, para facilitar así el racional desarrollo de nuevos compuestos específicos. Se llevó a cabo la síntesis de 1,2 y 1,4-naftoquinonas dihidropirano y dihidrofurano con modificaciones en el anillo aromático, principalmente con la introducción de un grupo hidroxilo. En primer lugar se obtuvieron derivados hidroxilados de lapachol y dunniol, para luego mediante reacciones de ciclación adecuadas obtener las naftoquinonas tricíclicas deseadas. Se exploraron distintas metodologías para lograr una síntesis más eficiente de los hidroxilapacholes de interés. Con el fin de sintetizar el derivado 10-hidroxi-β-lapachona mediante la ciclación de 5-hidroxilapachol en medio ácido, se realizó una amplia búsqueda de condiciones, que luego fue extendida hacia la síntesis eficiente de derivados de β- lapachona sustituidos en el anillo aromático. En dicho contexto se ensayó la reacción de ciclación en distintas condiciones ácidas de derivados de lapachol sustituidos en C-5 por diferentes grupos funcionales, con el fin de esclarecer la influencia de dichos sustituyentes y del ácido utilizado en los productos obtenidos. Los compuestos sintetizados en esta tesis fueron evaluados como agentes antiproliferativos contra un panel representativo de cuatro líneas celulares de tumores sólidos humanos. En función de la actividad biológica se establecieron relaciones de estructura-actividad para el diseño y síntesis de nuevos compuestos con actividad mejorada. El compuesto 7-hidroxi-β-lapachona resultó ser el más activo presentando mejor actividad que el compuesto líder β-lapachona.

Abstract:
This thesis describes the synthesis of naphthoquinones related to the natural quinones β-lapachone and lapachol, featuring a wide variety of biological activities among which highlights its antitumor activity. The aim was to obtain compounds with enhanced cytotoxic activity and to shed light on the structural requirements of these quinones, thereby facilitating the rational development of new specific compounds. The synthesis of 1,2-and 1,4-naphthoquinones fused to dihydropyran and dihydrofuran rings carrying modifications on the aromatic ring, mostly the introduction of a hydroxyl group, was performed. First hydroxylated derivatives of dunniol and lapachol were obtained and then, by appropriate cyclization reactions, the desired tricyclic naphthoquinones were synthesized. Different methodologies were explored to achieve a more efficient synthesis of hydroxylapachol analogues. In order to synthesize 10-hydroxy-β-lapachone by cyclization of 5- hydroxylapachol in acid media, an extensive search of reaction conditions was carried out, which was later extended for the efficient synthesis of β-lapachone derivatives substituted on the aromatic ring. In this context the cyclization reaction of lapachol derivatives substituted at C-5 by different moieties, was tested under different acidic conditions in order to elucidate the influence of these substituents and the acid employed. The compounds obtained in this thesis were evaluated as anti-proliferative agents against a representative panel of four cell lines of human solid tumors. According to the biological activity, structure-activity relationships were established aimed at the design and synthesis of new compounds with improved activity. The compound 7-hydroxy-β-lapachone was the most active showing better activity than the lead compound β-lapachone.

Alvarez Paggi, Damián Jorge. "Bases moleculares de los mecanismos regulatorios de los procesos de transferencia electrónica proteica" (2012-10-02) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta tesis doctoral se abordó el estudio de los parámetros que regulan las reacciones de transferencia electrónica (TE) en sistemas proteicos dentro del marco teórico desarrollado por Marcus. Para ello se emplearon métodos espectroscópicos, electroquímicos, espectroelectroquímicos y computacionales. En particular, se investigaron dos componentes de la cadena de transporte respiratorio: el citocromo c (Cyt), un transportador soluble de electrones y el centro de CuA, el aceptor primario de la citocromo c oxidasa. En primer lugar, se estudió el rol de la dinámica proteica del Cyt y su modulación por campos eléctricos de relevancia biológica. Se verificó que dicha dinámica es crucial en la regulación de las reacciones de TE que tienen lugar en la cadena de transporte de electrones a través de la modulación del acoplamiento electrónico entre donor y aceptor. Por otro lado, se encontró evidencia de que el campo eléctrico regularía la alternancia entre dos conformaciones del Cyt que difieren principalmente en la magnitud de la energía de reorganización. Finalmente, se constató el rol fundamental de las fluctuaciones térmicas y la dinámica proteica para las reacciones de TE en centros de CuA. Dichos centros podrían alternar entre dos estados electrónicos distintos, en los cuales el balance entre la energía de reorganización y el acoplamiento electrónico permitiría conferir direccionalidad a las reacción de TE a pesar de presentar un ΔG≈0. El conjunto de los resultados obtenidos sugiere que los procesos de TE en sistemas biológicos se encuentran finamente regulados, y en particular nos permiten postular un mecanismo de retroalimentación negativa cuyo actor principal es el campo eléctrico interfacial.

Abstract:
This Ph.D. thesis is dedicated to disentangling the parameters that regulate protein electron transfer (ET) reactions, within the theoretical framework developed by Marcus. To that end, spectroscopic, electrochemical, spectroelectrochemical and computational methods were employed. The proteins investigated are two components of the respiratory electron transport chain: cytochrome c (Cyt), a soluble electron shuttle, and the CuA center, the primary electron acceptor of cytochrome c oxidase. Part of the thesis deals with the role of protein dynamics and their modulation by biologically relevant electric fields for the specific case of Cyt. Such dynamics are proposed to be crucial in the regulation of the ET reactions that take place at the electron transport chain by modulating the electronic coupling between donor and acceptor. Moreover, we found evidence of the electric field acting as a switch between two different Cyt conformations that exhibit different reorganization energies. Finally, we verified that thermal fluctuations and protein dynamics play a fundamental role in the ET reaction of CuA centers. These centers could switch between two different electronic ground states in which the interplay between reorganization energy and electronic coupling may confer directionality to the ET reactions in spite of occurring with ΔG≈0. Altogether, these results suggest that ET process in biological systems are finely tuned, and allow us to postulate a mechanism of negative feedback whose main actor is the interfacial electric field.

Título :	Bases moleculares de los mecanismos regulatorios de los procesos de transferencia electrónica proteica = Molecular basis of the fine-tuning mechanisms of protein electron transfer
Autor :	Alvarez Paggi, Damián Jorge
Director :	Murgida, Daniel H.
Consejero de estudios :	Dicelio, Lelia
Jurados :	Olabe, José Antonio ; Vela, María Elena ; Brondino, Carlos Dante
Año :	2012-10-02
Editor :	Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación :	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física. Instituto de Química Física de los Materiales, Medio Ambiente y Energía (INQUIMAE)
Grado obtenido :	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Inorgánica, Analítica y Química Física
Ubicación :	Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5212_AlvarezPaggi
Idioma :	Español
Area Temática :	Química / Química Biológica Química / Electroquímica Química / Química Inorgánica
Palabras claves :	CITOCROMO C; CITOCROMO C OXIDASA; CENTRO DE CUA; CADENA DE TRANSPORTE ELECTRONICO; CAMPO ELECTRICO; TRANSFERENCIA ELECTRONICA; MARCUS; ELECTROQUIMICA; BIOELECTROQUIMICA; RAMAN; RAMAN RESONANTE; SERS; SERRS; DINAMICA MOLECULAR; DFT; MONOCAPAS AUTOENSAMBLADAS; MODELO DE PATHWAYS; ENERGIA DE REORGANIZACION; ACOPLAMIENTO ELECTRONICO; MECANISMO DE GATING; DINAMICA PROTEICA; CYTOCHROME C; CYTOCHROME C OXIDASE; CUA CENTER; ELECTRON TRANSPORT CHAIN; ELECTRIC FIELD; ELECTRON TRANSFER; MARCUS; BIOELECTROCHEMISTRY; RAMAN; RESONANCE RAMAN; SERS; SERRS; MOLECULAR DYNAMICS; DFT; SELF-ASSEMBLED MONOLAYERS; PATHWAYS MODEL; REORGANIZATION ENERGY; ELECTRONIC COUPLING; GATING MECHANISM; PROTEIN DYNAMICS; ELECTROCHEMISTRY
URL al Documento :	http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_5212_AlvarezPaggi.pdf
URL al Registro :	http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5212_AlvarezPaggi

Fauerbach, Jonathan Arturo. "Caracterización de las etapas tempranas de la agregación de alfa-sinucleína in vitro mediante sondas fluorescentes ESIPT y microscopia de fuerza atómica" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Enfermedad de Parkinson (EP) es el desorden neurodegenerativo motor más frecuente, caracterizado por la presencia de agregados proteicos amiloideos intra y extraneuronales conocidos como Cuerpos de Lewy (CL). El principal componente de estas estructuras es alfa-sinucleína (AS), una proteína presináptica de 140 aminoácidos abundante en células dopaminérgicas del cerebro aunque su función fisiológica permanece aún desconocida. En su forma libre nativa AS carece de una estructura secundaria definida pudiendo adoptar múltiples conformaciones en solución y en asociación con otras proteínas y membranas. Se cree que los CL y las fibras amiloides maduras (mafs) son el resultado de un proceso de mal plegamiento, auto-ensamblado y asociación de AS y que posiblemente sirven como mecanismos de protección para la célula, a través de la redistribución en la población de las especies tóxicas intermediarias solubles asociadas a etapas tempranas. Estudio in vitro de las especies y procesos involucrados en la agregación de AS brindan la posibilidad de entender los mecanismos subyacentes en EP. El diseño de nuevas formas de detección de las especies intervinientes en el proceso de agregación y el estudio de los mecanismos de formación de dichos intermediarios tempranos poseen una alta importancia. En esta tesis, se sintetizaron sondas fluorescentes sensibles a cambios en la polaridad de su microentorno que permiten monitorear el proceso de auto-ensamblado y asociación de AS marcada covalentemente con estos compuestos. Dichas sondas demuestran una muy alta sensibilidad al proceso en estudio, proveyendo una novedosa metodología de monitoreo en continuo con la mínima perturbación del sistema. Diversas sondas fueron sintetizadas basándose en la familia de las 3-hidroxicromonas (3HC), compuestos altamente sensibles a los cambios de polaridad de su entorno. Su particular estructura química posibilita el fenómeno conocido como ESIPT (‘Excited State Intramolecular Proton Transfer o Transferencia Protónica Intramolecular en el Estado Excitado’). En ESIPT se produce una transferencia protónica intramolecular en el estado excitado obteniendo dos formas excitadas cada una con un nivel de energía distinto. Con lo cual estos compuestos fluorescentes ESIPT presentan dos bandas de emisión en lugar de una sola. La posición, intensidad y relación entre las bandas de emisión se modifican de acuerdo a los cambios en la polaridad, formación de enlaces por puentes de hidrógeno, y acidez/basicidad del microentorno de la sonda. Las nuevas sondas 3HC sintetizadas resultaron reporteros muy versátiles para el proceso de agregación de AS, particularmente sensibles a las etapas tempranas a cuyos agregados de AS se les adjudica la mayor citotoxicidad. La combinación de distintas sondas de polaridad han permitido obtener datos experimentales acerca de la formación y desaparición de intermediarios pre-amiloideos transientes. Las curvas de agregación obtenidas y sus cambios espectroscópicos fueron complementadas con un análisis por Microscopia de Fuerza Atómica (AFM). Mediante un estudio sistemático por AFM se lograron identificar las diferentes especies provenientes del proceso de autoensamblado de AS, donde cada una de las especies fue caracterizada y catalogada. Estudios a diferentes temperaturas permitieron evaluar su influencia en la cinética y termodinámica del proceso de agregación. Incubaciones a baja temperatura (4°C) permitieron definir un mínimo local de energía en la coordenada de la agregación, revelando una novedosa especie supramolecular (la "acuna") que muestra indicios de estar directamente involucrada en el paso clave de la formación de estructuras fibrilares. Estudios preliminares sobre células SH-SY5Y en cultivo dan indicios de que las acunas son citotóxicas. A través de la Crio-Microscopía de Transmisión Electrónica (Cryo-ET) se obtuvo información estructural con resolución sub-nm de esta novedosa especie supramolecular. Los estudios dieron lugar a la formulación de un nuevo esquema secuencial de agregación (SAS) para AS, basándose en conceptos de química coloidal, de polímeros y supramolecular. SAS distingue 3 etapas de la agregación: molecular, coloidal y fibrilar, en función de las estructuras halladas, su orden secuencial lineal y orquestado de interconversión, su presencia transiente (aparición y desaparición) y morfología característica. Además, SAS distingue etapas exergónicas y endotérmicas del proceso global, señalando un mínimo local de energía correspondiente con la formación de la acuna. Se prevé que este modelo pudiera ser útil no sólo para AS sino para otras proteínas amiloideas “intrínsicamente desordenadas” asociadas a enfermedades neurodegenerativas similares, abriendo la posibilidad de la existencia de un mecanismo común y unificado. Esta tesis doctoral involucra un estudio desde lo sintético orgánico y la biofísica estructural, utilizando microscopias de alta resolución y herramientas fluorescentes avocadas al estudio y la descripción del proceso integro de agregación de AS, obteniendo nuevos datos relevantes al área que son interesantes de continuar y ser explorados por el aporte que puedan rendir en el contexto biomédico.

Abstract:
Parkinson's disease (PD) is the most common neurodegenerative motor disorder, characterized by the presence of intra and extraneuronal amyloid protein aggregates known as Lewy bodies (LB). The main component of these structures is alpha-synuclein (AS), a presynaptic protein of 140 aminoacids abundant in dopaminergic brain cells, although its function is not fully understood. In its native form AS has no defined secondary structure and can adopt multiple conformations in solution and in association with other proteins and membranes. It is believed that LB and mature amyloid fibers (mafs) are the result of a process of AS misfolding, self-assembly and association (where the trigger remains unknown), which are believed to play a neuroprotective role through the redistribution of the population of intermediate toxic soluble species associated with early stages. In vitro studies of the process provide the means for controlling the conditions under which aggregation occurs and offer the possibility to study their dynamics so as to understand the underlying mechanisms. The design of new means for detecting the involved species in AS aggregation has high priority in order to elucidate the mechanisms of formation of these early intermediates and certain their potential role in the context of PD. This thesis describes the synthesis of fluorescent probes sensitive to changes in the polarity of their microenvironment’s which have served to monitor the process of self-assembly and association of AS. Such probes show a high sensitive for the early stages of the process under study, providing a novel continuous monitoring methodology with minimal perturbation of the system. Different probes based on the family of 3-hydroxychromones (3HC) were synthesized, being organic compounds highly sensitive to changes in the polarity of their environment. Their unique chemical structure leads to the phenomenon known as ESIPT (‘Excited State Intramolecular Proton Transfer’), a process by which an intramolecular proton is transfered in the excited state leading two the formation of two states with different energy levels. As a consequence, these compounds exhibit two emission bands instead of one. The position, intensity and ratio of the bands are modified according to changes in the polarity, hydrogen-bonding potential, and acidity/basicity of the microenvironment of the probe. The new probes are versatile reporters of AS aggregation, particularly sensitive to the early stages and species to which the highest cytotoxicity is attributed. The combination of different polarity probes have provided experimental data on the formation and disappearance of pre-amyloid transient intermediates. Spectroscopic data for the progress curves of aggregation were complemented by analysis by Atomic Force Microscopy (AFM). Through a systematic study by AFM it was possible to identify the different species in the self-assembly process of AS, where each species was characterized and cataloged. Studies at different temperatures allowed the evaluation of their influence on the kinetics and thermodynamics of the aggregation. Incubations at low temperature (4°C) helped to define a local energy minimum of the aggregation coordinate, revealing a novel supramolecular species (the "acuna") with evidence that it is directly involved in key steps leading to the formation of fibrillar structures. Preliminary studies on SH-SY5Y cells provided evidence that these species are cytotoxic. Through cryotransmission electron microscopy (Cryo-ET) structural information was obtained with subnm resolution of the so-called "latent" acunas. These studies have led to the formulation of a new sequential aggregation scheme (SAS) for AS, based on concepts of colloidal, polymers and supramolecular chemistry. SAS distinguishes 3 stages of aggregation: molecular, colloidal and fibrillar according to the found structures, their sequential orchestrated interconversion, their transient presence (or absence) and their particular morphology. In addition, SAS distinguishes exergonic and endothermic stages of the overall process, pointing to a specific local energy minimum. It is anticipated that this model could be useful not only for AS and PD but for other "intrinsically disordered" amyloid proteins associated with neurodegenerative diseases, opening the possibility that a common and unified mechanism may exist. This thesis features a study encompassing synthetic organic chemistry and structural biophysics, using high-resolution microscopy and fluorescent tools to study and describe the entire process of the in vitro aggregation of AS, obtaining new relevant data to the field and with implications in the biomedical context, which required and justify further exploration.

Acebedo, Sofía Lorena. "Síntesis y bioactividad de brassinosteroides con modificaciones funcionales y estructurales en el anillo A" (2013-07-03) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los brassinosteroides (BRs) son hormonas vegetales de amplia distribución en la naturaleza y escenciales para el desarrollo normal de las plantas. Debido a su baja concentración en fuentes naturales, los compuestos utilizados para los estudios sobre sus propiedades, mecanismos de acción y aplicaciones deben oberese por síntesis química a partir de precursores accesibles. Durante el trabajo desarrollado en esta Tesis se sintetizaron, purificaron e identificaron totalmente 8 nuevos análogos de brassinosteroides a partir del estigmasterol. Las modificaciones químicas consistieron en introducir átomos de flúor en las posiciones C-2 y/o C-3, o en cambios estructurales en el anillo A, que en los compuestos naturales es alifático y de seis carbonos, logrando su aromatización y la contracción del mismo a cinco carbonos. Se evaluó la actividad biológica de cada uno de los compuestos sintetizados. Las bioactividades se estudiaron mediante un ensayo vonovifo pata BRs (inclinación de la lámina de arroz) y, en el caso de los BRs fluorados, además se empleó un ensayo novedoso (detección de la producción de óxido nítrico en cultivos celulares) aplicado por primera vez para este trabajo de tesis.

Abstract:
Brassinosteroids (BRs) are plant hormones widely distributed in the plant kingdom and essential for the normal development of plants. In order to study their properties, mechanisms of action and applications BRs must be obtained by chemical synthesis from precursos accesible due to their low concentrations in natural sources. This work has been devoted to the synthesis of brassinosteroids, ysubg stigmasterol as starting material. Eight new BRs analogues were synthesized, fluorinated at C-2 and / or C-3 or with structural modifications in the ring A, such as aromatization and contraction. Biological activity has been evaluated for each synthetic compound. The bioactivities have been studied by a known assay (the rice lamina inclination test), and by a novel one (detection of nitric oxide) first applied for BRs in this Thesis work.

Pallarés, María Eugenia. "Participación de los andrógenos en la formación de las vías dopaminérgicas mesocórtico-límbicas en un modelo de estrés prenatal" (2013-05-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Existen numerosas evidencias en la literatura que demuestran que la exposición a situaciones de estrés durante el período de la gestacion produce alteraciones a largo plazo en los niveles de hormonas sexuales y en el desarrollo del sistema dopaminérgico de la descendencia. En nuestro laboratorio, empleando un modelo en la rata, observamos que dichas alteraciones en el sistema dopaminérgico variaban según si éstas se evaluaban antes o después de la adolescencia. Por otra parte, en el ser humano se ha demostrado ampliamente que varias psicopatologías tales como la esquizofrenia, adicciones a sustancias de abuso y depresión se desencadenan durante o hacia el final de la adolescencia. Definida como el período de transición entre la niñez y la vida adulta, la adolescencia es una etapa donde las hormonas gonadales ejercen sus efectos sobre los tejidos periféricos induciendo la aparición de los caracteres sexuales secundarios, pero también actúan centralmente influyendo sobre el remodelado y desarrollo final del cerebro. Teniendo en cuenta estos antecedentes hipotetizamos que el estrés prenatal estaría interfiriendo con el desarrollo del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal, a la vez que modificaría la maduración del sistema dopaminérgico mesocórticolímbico deviniéndolo vulnerable a los cambios hormonales que ocurren durante la adolescencia. En este contexto, el objetivo general en el que se encuadra este trabajo de tesis consiste en avanzar sobre el conocimiento del rol de las hormonas gonadales masculinas sobre las alteraciones de la neurotransmision dopaminérgica en la cría estresada prenatalmente. En una aproximación hacia la evaluación de este objetivo se caracterizó el efecto del estrés prenatal sobre el eje reproductor masculino y sobre ciertos aspectos del sistema dopaminérgico, para por último intentar simular el efecto del estrés prenatal administrando prenatalmente a un antagonista del receptor de andrógenos: la flutamida. Mediante el empleo de un modelo de estrés prenatal por inmovilización de la madre durante la última semana de gestación en ratas Wistar, se evaluó la reactividad del sistema de estrés de las crías macho, al mismo tiempo que se estudiaron los efectos del estrés prenatal sobre diversos aspectos morfológicos, bioquímicos y moleculares del eje reproductor. En el mismo modelo, en crías macho prepuberales y adultas, se examinó la expresión de los receptores dopaminérgicos del tipo D2, de andrógenos y de estrógenos en diversas áreas cerebrales pertenecientes al sistema dopaminérgico mesocórtico-límbico y se estudiaron las arborizaciones dendríticas en las mismas áreas. Finalmente mediante la administración de la flutamida durante la última semana de gestación, se estudió si la disminución perinatal en los niveles de andrógenos circulantes podría influir sobre el desarrollo del sistema dopaminérgico. Los resultados obtenidos mostraron que el estrés prenatal indujo modificaciones a largo plazo en los niveles de las hormonas pertenecientes al eje reproductor masculino. A su vez, el estrés prenatal modificó parámetros de la morfología sexual externa y de la histomofometría gonadal de la descendencia. Por su parte, los efectos del estrés gestacional sobre los receptores dopaminérgicos del tipo D2 y a hormonas sexuales presentes en el cerebro, mostraron variaciones conforme al área en la cual se estaba realizando la observación y a la edad de las crías, mientras que la reducción en las arborizaciones dendríticas inducida por el estrés prenatal se registró en todas las áreas evaluadas y en ambas edades. Por último demostramos que la administración prenatal de flutamida afecta la morfología sexual interna y externa de la descendencia, al mismo tiempo que induce alteraciones en parámetros morfológicos del sistema dopaminérgico mesocórtico-límbico. De esta manera, la manipulación prenatal de andrógenos mostró consecuancias similares a las observadas en individuos que habían recibido estrés prenatal, sugiriendo que uno de los mecanismos por los cuales el estrés gestacional podría interferir sobre el desarrollo del cerebro es mediante la alteración del rol organizacional de los andrógenos y la modulación del rol activacional de los mismos.

Abstract:
Several studies have demonstrated that stress exposure during pregnancy impairs the dopaminergic system in the offspring. Employing a rat prenatal stress paradigm we have observed that several alterations of the dopaminergic pathway vary if evaluated before or after puberty. It is well known that numerous psychopathologies (i.e. schizophrenia, substance abuse disorder and depression) develop during, or after, the adolescence period. Adolescence is defined as a transient and dynamic phase of development, when gonadal hormones act not only on peripheral tissues to cause the appearance of secondary sex characteristics, but they also act centrally to influence both the remodeling of the adolescent brain and behavioral maturation. Taking this background into account, we hypothesized that prenatal stress might be impairing the hypothalamic-pituitary-testicular axis development, while affecting the mesocortico-limbic dopaminergic system by becoming vulnerable to the hormonal changes that take place during the adolescence. In this context, the general aim or this research was to study the role of sexual hormones on the dopaminergic neurotransmission of prenatally stressed male offspring. Our first approach was to characterize the prenatal stress effects on the reproductive axis development and on the mesocortico-limbic dopaminergic pathway to finally simulate prenatal stress effects by prenatally administering the androgen receptor antagonist flutamide. Employing a prenatal stress paradigm that consisted on immobilization of the pregnant dam during the last week of gestation, we characterized the stress system of the gestant mother and of the male offspring, and the effects of early programming on morphological, biochemical and molecular parameters of the male reproductive axis. In the same model, we evaluated the androgen, oestrogen and D2-dopamine receptors expression, as well as the dendrite arborization status on several brain areas of the mesocortico-limbic dopaminergic pathway of prenatally stressed male offspring at prepubertal and adult stages. Finally, we administered flutamide during the last week of gestation in order to evaluate if decreased androgen levels might affect the dopaminergic system development. Our results show that repeated exposure to maternal restraint stress markedly modulates the development of the offspring reproductive axis by inducing longterm changes in sexual maturation, hormone secretion patterns, testicular histology, and testicular biochemistry. Moreover, prenatal stress induces impairment on the D2- dopamine receptors and sexual hormone receptors depending on the area, and the age of the offspring. Finally, prenatal administration of flutamide affected sexual morphology of the descendants, as well as the mesocortico-limbic dopaminergic dendrite morphology that resemble those described for prenatally stressed animals. In summary, prenatal androgen manipulations induce similar consequences as prenatal stress suggesting that one of the possible mechanisms of action is by affecting the organizational role of androgens and differentially modulating their activational role on brain development.

Bonetto, María Celina. "Desarrollo de biosensores/bioensayos para la determinación rápida de parámetros indicadores de calidad de agua : Técnicas electroquímicas, BOD y toxicidad" (2013-12-03) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta Tesis se presenta un bioensayo microbiano amperométrico para la determinación rápida de BOD (demanda bioquímica de oxígeno) en muestras de agua basado en la utilización de ferricianuro como aceptor de electrones del metabolismo bacteriano. Se logró simplificar la metodología generalmente utilizada en este tipo de bioensayos y el rango lineal obtenido representa una gran mejora frente al rango lineal que presenta el ensayo BOD5. Mediante este bioensayo se determinó la BOD de varias muestras de agua obteniéndose una buena correlación con los resultados del test BOD5 y un RSD ≤ 10%. De manera de diseñar un sistema portátil a partir de este bioensayo amperométrico, se obtuvieron cultivos liofilizados de K. pneumoniae metabólicamente activos, hasta 35 días después de realizar la liofilización y se estudió la posibilidad de utilizar electrodos de tinta de Au descartables realizados por screen-printing, en ensayos de convección forzada. Otra alternativa analizada para la determinación rápida de BOD de muestras reales fue el desarrollo de un biosensor potenciométrico basado en el empleo de un electrodo potenciométrico sensible a CO2 y la inmovilización en membrana de distintos microorganismos. Este biosensor también permitió determinar la BOD de muestras de agua reales obteniéndose una buena correlación con los resultados del test BOD5. Como último trabajo de esta Tesis, se desarrolló un bioensayo para la determinación de toxicidad aguda de nanopartículas de Ag, basado en la técnica de espectroscopía de impedancia electroquímica, empleando electrodos interdigitados de Au y células NHDF (normal human dermal fibroblasts) como material biológico. Este trabajo se realizó en parte en el Austrian Institute of Technology (AIT) bajo la dirección del Dr. Peter Ertl.

Abstract:
In this Thesis, we propose an amperometric microbial bioassay for the rapid determination of BOD (biochemical oxygen demand) in water samples based on the use of ferricyanide as electron acceptor of bacterial metabolism. The methodology generally used in this type of bioassays has been successfully simplified and the linear range obtained represents a great improvement over the linear range that the BOD5 test presents. Through this bioassay, the BOD of real wastewater samples was determined, obtaining a good correlation with the results of the BOD5 test and a RSD ≤ 10%. In order to design a portable system from this amperometric bioassay, freeze-dried cultures from K. pneumoniae, metabolically active, were obtained up to 35 days after freeze drying and it was studied the possibility of using disposable ink electrodes of gold made by screen-printing in forced convection assays. Another alternative analyzed for the rapid determination of BOD of real wastewater samples was the development of a potentiometric biosensor, based on the employment of a potentiometric electrode sensitive to CO2, and the immobilization of diverse microorganisms in membrane. This biosensor has also allowed us to determine the BOD of real wastewater samples obtaining a good correlation with the results of the BOD5 test. The last work of this Thesis has been the development of a bioassay for the determination of acute toxicity of Ag nanoparticles, based on the technique of electrochemical impedance spectroscopy, using interdigitated electrodes of Au and NHDF cells (normal human dermal fibroblasts) as biological material. This work was carried out in part, at the Austrian Institute of Technology (AIT) under the direction of Dr. Peter Ertl.

Dodes Traian, Martín Miguel. "Estudio de las interacciones entre fosfolípidos y proteínas integrales de membrana. Efectos sobre la actividad enzimática de una ATPasa transportadora de Ca2+" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las membranas celulares son estructuras dinámicas complejas de composición bioquímica muy diversa. Las interacciones específicas lípidolípido y lípido-proteína pueden generar dominios estables o transientes de composición y función biológica diferenciales. En este trabajo, abordamos el estudio de la regulación de la actividad de una proteína integral de membrana, la bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA) por anfifilos que integran el sistema en el cual se la reconstituye. En micelas de lípidos y detergente, pudimos verificar que la actividad depende de la proporción relativa de estas especies y postulamos un modelo que explica esta dependencia en base al intercambio de anfifilos a nivel del dominio transmembrana. El análisis realizado con diversos métodos espectroscópicos mostró que los cambios estructurales asociados a la activación por lípidos serían sutiles pero suficientes para transducir una señal de activación al dominio citoplasmático de PMCA. Utilizando espectroscopía de correlación de fluorescencia y la sonda fluorescente Laurdan observamos que la actividad depende además de la fluidez del entorno y del tamaño de las micelas. Para extender este estudio al entorno natural de las proteínas -la membrana celular- evaluamos diversas sondas fluorescentes y pudimos determinar que la sonda C-Laurdan permite estudiar por microscopía confocal la organización de membranas biológicas.

Abstract:
Cellular membranes are dynamic complex structures with a highly diverse biochemical composition. Specific lipid-lipid and lipid-protein interactions can generate transient or stable domains of particular composition and biological function. In this work, we study the regulation of the activity of an integral membrane protein, the plasma membrane calcium pump (PMCA), by phospholipids that make up the reconstitution system. Working in a mixed micelles lipid/detergent system, we verify that the activity depends on the relative proportion of these species and we posited a model that explains this relationship by the exchange between amphiphiles at the protein transmembrane domain. The analysis performed by spectroscopic methods showed that the structural changes associated with the activation by lipids are subtle but enough to transduce an activation signal to the cytoplasmic domain of PMCA. Using fluorescence correlation spectroscopy and the fluorescent probe Laurdan, we observed that the activity is also related to micelle size and the fluidity of the protein lipidic microenvironment. To extend this study to the natural environment of the protein –the cellular membrane- we assayed the performance of several fluorescent probes and we could determine that the probe CLaurdan allows studying the organization of biological membranes by confocal microscopy.

Belluscio, Laura María. "Malnutrición proteica como modelo de adversidad perinatal y su influencia sobre el desarrollo de capacidades cognitivas y socioemotivas" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El desarrollo perinatal representa un período crítico en la vida de un individuo caracterizado por una sensibilidad extrema a experiencias e interacciones con el medio ambiente que originan efectos duraderos, y muchas veces permanentes, sobre la estructura y función del cerebro. La calidad del período embrionario como la calidad del ambiente y experiencias postnatales tempranas tienen una enorme influencia sobre el desarrollo emocional y cognitivo con consecuencias que se extienden durante toda la vida. Una de las causas más difundidas entre la población mundial y con consecuencias más deletéreas sobre el desarrollo y la plasticidad neuronal es la que proviene de la desnutrición o la malnutrición. Esta provoca, según su severidad, desde problemas y retardos en el aprendizaje hasta retrasos mentales con profundas consecuencias en la sociabilidad del sujeto a lo largo de toda su vida. Los modelos en roedores han demostrado ser útiles ya que se observaron alteraciones neuroanatómicas comparables y deficiencias similares en las capacidades de aprendizaje y memoria(1). Estas evidencias convergentes sugieren una relación causal entre malnutrición proteica y alteraciones neurofisiológicas. Sin embargo, y pese a los avances realizados al respecto en los últimos años, diversos interrogantes permanecen aún sin respuesta. Algunas de estas cuestiones abiertas se refieren a cuales son las alteraciones conductuales y cognitivas afectadas por la malnutrición en la etapa perinatal, si las deficiencias observadas presentan dimorfismo sexual, cuáles son los mecanismos moleculares que median los efectos permanentes de la malnutrición en etapas tempranas de la vida y si los efectos observados son transmitidos a las siguientes generaciones que no hayan sido sometidas a esta adversidad perinatal. En este trabajo de tesis nos centramos en el establecimiento de un modelo de malnutrición proteica perinatal en ratones, estudiando el efecto sobre el comportamiento de las crías a diferentes edades, con el fin de dilucidar si las diferencias encontradas en la bibliografía se debían a la edad a la que se realizaron los estudios. Además se trabajó con crías machos y hembras con el objeto de identificar posibles efectos diferenciales de la dieta de acuerdo al sexo. Nuestra evaluación inicial del desarrollo morfológico y neurológico de las crías reveló un claro retraso en el grupo cuyas madres sufrieron una reducción del 55% en el contenido proteico de la dieta. Estas últimas sufrieron una alteración en su comportamiento tanto en lo referido al cuidado dedicado a las crías como en la presencia de un comportamiento de tipo ansioso. Este comportamiento de tipo ansioso también fue observado en las crías mediante los test de laberinto elevado en cruz y de campo abierto, junto con una menor motivación exploratoria revelada por el test de escape de la jaula. En relación a las capacidades cognitivas de las crías se encontró un defecto en la memoria declarativa de largo término y la memoria espacial de corto término solamente en machos. En hembras se evidenció además un mayor componente de comportamiento tipo depresivo, que no fue observado en machos. Con el fin de develar las bases moleculares de los defectos observados, realizamos un análisis de la expresión de génica y de los niveles de modificaciones epigenéticas, a diferentes edades en ambos sexos. Encontrando una disminución en la cantidad de mensajero de la neurotrofina BDNF y una acetilación diferencial global de las histonas 3 y 4. Este hallazgo resulta interesante debido a que está ampliamente documentado que BDNF es fundamental para el desarrollo del sistema nervioso y cumple diversos roles en procesos de aprendizaje y memoria. Además se ha visto que su expresión se encontraba disminuida en ratones que sufrieron de un estrés perinatal (como períodos de separación materna), y en modelos de enfermedades neurológicas y psiquiátricas. Por otro lado, la expresión de este gen es finamente regulada a través de diversas modificaciones epigenéticas por lo que es sensible a factores ambientales. En nuestro modelo, la acetilación anormal observada en ratones malnutridos perinatalmente podría producir un desbalance general en la expresión de diversos genes que podría llevar a una menor expresión de BDNF. Ambas alteraciones moleculares observadas podrían formar parte de los mecanismos moleculares causantes de las deficiencias cognitivas y conductuales observados. Finalmente, los diferentes niveles de acetilación observados, posibilitarían la herencia de las diferencias observadas a una generación sucesiva que nunca fue expuesta a este tipo de malnutrición. Un estudio preliminar realizado a partir de la descendencia de ratones que sufrieron de una malnutrición hipoproteica perinatal, mostró una tendencia hacia un retraso en el desarrollo de estas crías y a una alteración en la conducta motivacional, tal como se había visto en sus progenitores. En resumen, los resultados aquí presentados demostraron que una malnutrición materna durante una etapa perinatal afecta la maduración del sistema nervioso, provocando cambios que perduran a lo largo de la vida, más allá del tiempo de exposición a la dieta deficiente. Estos cambios se pueden observar a nivel molecular y en un amplio rango de comportamientos. Cabe destacar también que el trabajo de la presente tesis permitió establecer dicho modelo de estrés perinatal, el cual servirá de base para futuros estudios en el laboratorio y que podrá utilizarse para generar y responder numerosas preguntas.

Abstract:
Perinatal development represents a critical period in the life of an individual. It is characterized by extreme sensitivity to experiences and environmental interactions which may cause lasting and often permanent changes in brain’s structure and function. The quality of the embryonic period as the quality of the environment and early postnatal experiences, have a huge influence on emotional and cognitive development with consequences that extend throughout life. A common cause of poor development that has deep deleterious effects on brain’s growth and plasticity is that which comes from under nutrition or malnutrition. This provokes from problems and delays in learning to mental retardation with profound consequences for the sociability of the subject throughout his life. Rodents have proven useful as a model as they mimic the neuroanatomical disturbances and the learning and memory deficiencies observed in humans. These multiple evidences point to a causal relationship between protein malnutrition and neurophysiological alterations. However, despite the progress made in recent years in this regard, many questions remain unanswered. Some of these open questions concern which are the behavioral and cognitive alterations affected by malnutrition in the perinatal period, if these deficiencies are sexually dimorphic, which are the molecular mechanisms that mediate the permanent effects of malnutrition in early stages of life and whether the observed effects are transmitted to subsequent generations that have not been subjected to perinatal adversity. During this thesis we focused on the establishment of a perinatal protein malnutrition (pregnancy and lactation) model in mice, and studied the effect on the offspring behavior at different ages, in order to determine whether the differences found in the literature were due to the age at which the studies were conducted. We analyzed male and female offspring in order to identify possible differential effects of diet according to sex. Our initial evaluation of the offspring morphological and neurological development revealed a clear delay in the group whose mothers experienced a 55% reduction in the protein content of the diet. The latter suffered an alteration in their behavior both in terms of the care dedicated to the pups and in the presence of an anxiety-like behaviour. This anxiety-like behaviour was also observed in the offspring through the elevated plus maze and open field tests, along with a smaller exploratory motivation revealed by the cage escape test. We also found a defect in long-term declarative memory and spatial short-term memory, restricted to male individuals of the offspring. There was also evidence of a depression-like behaviour restricted to females. In order to unravel the molecular basis of the defects observed we analyzed gene expression and epigenetic modifications levels at different ages in both sexes. We found reduced BDNF mRNA levels and a differential global acetylation of histones 3 and 4. This is an interesting finding because it has been extensively reported that BDNF is crucial for brain development and has different roles in memory and learning. A reduced expression of BDNF has also been described in mice that had suffered from maternal separation during lactation, and for several neurological and psychiatric diseases models. Furthermore, BDNF expression is tightly regulated by epigenetic modifications so it is sensitive to environmental factors. In our model, the abnormal acetylation observed in perinatally malnourished mice could produce an overall imbalance in the expression of various genes that could lead to a lower expression of BDNF. Together, these molecular alterations could be part of the molecular mechanisms causing the cognitive and behavioral deficits observed. Finally, the different levels of acetylation observed would enable the inheritance of the observed differences to a later generation that was never exposed to this type of malnutrition. A preliminary study from the offspring of mice who suffered perinatal lowprotein malnutrition, showed a trend towards a delay in the development of these offspring and an alteration in motivational behavior, as was seen in their parents. In summary, the results presented here demonstrate that the quality of maternal nutrition during the perinatal stage affect maturation of the nervous system and causes changes that persist throughout life, even long after the exposure to the poor diet. These changes can be observed at the molecular level and in a wide range of behaviors. It is also noteworthy that the work of this thesis allowed us to establish a model of perinatal stress, which will be the basis for future studies in the laboratory and can be used to generate and answer many questions.

Jacobs, Melisa. "Análisis estructural y bioquímico de la proteína de membrana externa GumB de Xanthomonas campestris, y su participación en la síntesis del exopolisacárido xantano" (2014-02-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Muchas bacterias producen polisacáridos extracelulares que pueden asociarse a la superficie celular o ser secretados al medio extracelular. Numerosos polisacáridos bacterianos se encuentran asociados al desarrollo de patogenicidad, convirtiéndose en un importante factor de virulencia. Por otro lado, existe un gran interés industrial sobre muchos polisacáridos bacterianos debido a sus amplias aplicaciones. En general, se ha descripto en detalle los primeros pasos de la síntesis de polisacáridos, pero aún no se han esclarecido los mecanismos involucrados en la polimerización y transporte de los mismos hacia la superficie bacteriana o al medio extracelular. Se ha postulado que estos procesos serían llevados a cabo gracias a la formación de complejos proteicos que podrían atravesar la membrana plasmática, de forma similar a lo observado para los sistemas de secreción de proteínas. En esta tesis se presenta el estudio estructural y bioquímico de la proteína de membrana externa GumB, la cual se encontraría asociada a la síntesis/secreción del polisacárido xantano en Xanthomonas campestris. Fue posible sobreexpresar y purificar cantidades suficientes para ensayos estructurales de esta proteína de membrana, al expresarla en el citoplasma. Se obtuvieron cristales de la proteína nativa y de su derivado de selenio-metionina, a partir de los cuales fue posible resolver la estructura a 2,54 Å. Se encontró que en el cristal GumB forma un tetrámero, esta característica también se ha observado en solución mediante ensayos de dispersión de luz estática y entrecruzamiento químico. Por otro lado, ensayos de dispersión de neutrones a bajos ángulos mostraron que la forma de GumB en solución es similar a la observada en el cristal. El tetrámero de GumB mostró una gran cavidad con cargas positivas que podrían estar involucradas en la interacción con el xantano, el cual posee cargas negativas debido a sus residuos de ácido glucurónico y grupos cetalpiruvato. Asimismo, se presenta evidencia que sugiere la participación de GumB en un complejo proteico. Mediante ensayos de entrecruzamiento químico in vivo se observó que GumB forma complejos de alto peso molecular. Electroforesis azul nativa permitió identificar potenciales interacciones entre GumB y otras proteínas de X. campestris.

Abstract:
Many bacteria produce extracellular polysaccharides, which can be associated with the cell surface or secreted to the extracellular medium. Several bacterial polysaccharides are associated with pathogenesis development, making them an important virulence factor. On the other hand, there is an important industrial interest in many bacterial polysaccharides because of their broad applications. The steps involved in polysaccharide synthesis are well described, but less is known about polysaccharide transport to the extracellular medium. It is believed that secretion is achieved due to a protein transenvelope complex, similar to those observed for protein secretion systems. In this thesis, the outer membrane protein GumB was studied structurally and biochemically. It has been previously shown that GumB is involved in the synthesis/secretion of xanthan gum in Xanthomonas campestris. Protein overexpression and purification, in quantities enough to set up structural assays, were achieved when this protein was expressed in the cytoplasm. Crystals of native protein and its selenium-methionine derivative were obtained, allowing the determination of GumB crystal structure to 2.54 Å. In the crystal, GumB is a tetramer, a feature also observed in solution by static light scattering and chemical crosslinking assays. Besides, small angle neutron scattering assays showed that GumB envelope in solution was similar to that observed in the crystal. GumB tetramer exhibited a cavity with positive charges that could be involved in the interaction with xanthan, which is a negatively charged polysaccharide due to its glucuronic acid residues and ketalpyruvate groups. In addition, evidence suggesting that GumB is part of a protein complex is presented. By in vivo chemical crosslinking, it was observed that GumB forms high molecular complexes. Blue native electrophoresis allowed the identification of potential interactions between GumB and other proteins from X. campestris.

Chamorro, María Eugenia. "Modificación de la funcionalidad de la eritropoyetina por carbamilación. Mecanismos de acción sobre células eritroides y neuronales" (2014-03-25) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La eritropoyetina (Epo) es conocida como la hormona que regula la producción de células eritroides. Sin embargo, su rol biológico se expandió a partir del hallazgo de la expresión de receptores específicos en otros tejidos, incluyendo el nervioso. Además, se describió un efecto neuroprotector de la hormona, el cual estaría asociado a inhibición de apoptosis. Debido al interés por expandir el uso farmacológico de la Epo hacia la protección de tejidos no hematopoyéticos, se intensificó la búsqueda de estructuras modificadas de la proteína. La entidad que merece, actualmente, mayor investigación es la Epo carbamilada en los residuos lisina (cEpo). Evidencia derivada de estudios in vitro y en animales de experimentación indican que esta forma de Epo mantiene su actividad neuroprotectora mientras que carece de actividad eritropoyética. Esta diferente función evitaría un aumento innecesario de la masa eritroide en el tratamiento de pacientes no anémicos con enfermedades neurodegenerativas. Con el objeto de profundizar el conocimiento sobre las diferencias observadas en la función de Epo debido a la carbamilación, en el presente trabajo se utilizó un modelo que involucra células fisiológicas y varias líneas celulares para evaluar, en conjunto y comparativamente, los efectos de cEpo y de Epo en ensayos paralelos. Fueron utilizados cultivos de células progenitoras eritroides de médula ósea de ratón, distintas líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide, tales como UT-7, dependiente de Epo para su supervivencia, TF-1, dependiente de GM-CSF y puede proliferar en presencia de Epo por períodos cortos y K562, independiente de factores de crecimiento específicos, así como la línea de origen neuronal SH-SY5Y. El primer paso consistió en realizar la carbamilación de Epo recombinante, utilizando cianato de potasio, empleando distintos tiempos y concentraciones de cianato apropiadas para asegurar un completo bloqueo de los residuos lisina de la Epo. El éxito de la carbamilación fue verificado mediante electroforesis en gel y Western blotting, demostrándose el aumento de la carga neta negativa de cEpo con respecto a la de Epo. La modificación de la estructura de la proteína por carbamilación puede causar alteraciones funcionales, cuyo estudio constituye el objetivo de este trabajo de tesis. Los cultivos de células UT-7 y TF-1 en presencia de cEpo mostraron una significativa disminución de la viabilidad celular, provocando la muerte celular por apoptosis, mientras que la Epo mantuvo la viabilidad e indujo la proliferación celular de ambas líneas celulares. La cEpo tampoco pudo estimular el desarrollo de unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E) en cultivos de células de médula ósea de ratón, ni previno la apoptosis inducida por la citoquina proinflamatoria TNF-α en células eritroileucémicas K562. En cambio, cEpo, al igual que Epo, actuó como factor antiapoptótico frente a la inducción de muerte celular programada inducida por TNF-α o staurosporina en células neuronales SH-SY5Y. Los resultados de ensayos de inhibición de vías de señalización intracelular permiten sugerir que las acciones neuroprotectoras de Epo y cEpo son mediadas por la activación de Jak2/PI3K. Estos resultados confirmaron que las modificaciones moleculares introducidas en la molécula de Epo por el proceso de carbamilación generan la pérdida de su habilidad para mantener la supervivencia de las células con capacidad de diferenciación eritroide pero no afecta su acción neuroprotectora mostrando, en este caso, una actividad similar a la de la Epo nativa. Mediante ensayos competitivos y de inhibición por anticuerpos, tanto en las células SH-SY5y como en las TF-1, se observó que la Epo puede actuar a través del receptor homodimérico (REpo/REpo) y el heterodimérico formado por una subunidad REpo y una subunidad ß common (Rßc), que es también subunidad del receptor de GM-CSF. En cambio, cEpo necesita de las subunidades REpo y Rßc para prevenir la apoptosis de las células neuronales. A partir de la hipótesis de que la carbamilación de Epo le permite conservar su capacidad neuroprotectora pero le impide inducir la proliferación de células eritroides, el siguiente objetivo fue la investigación de vías de señalización que juegan un papel clave en la proliferación celular inducida por Epo. Si bien en cultivos de células eritroides UT-7 y TF-1 cEpo indujo la fosforilación de Jak2, primer paso de activación celular, demostramos por primera vez la incapacidad de cEpo para mantener la fosforilaión de Akt y FOXO3a por el mismo periodo que lo hace Epo. Esto lleva a la translocación de FOXO3a al núcleo promoviendo la expresión de la proteína regulatoria del ciclo celular p27Kip1 y generando, así, el arresto del ciclo celular por cEpo. Dado que el efecto diferencial de cEpo y Epo con respecto a la proliferación celular se encontraría asociado al silenciamiento de vías de señalización por aumento de la velocidad de defosforilación analizamos la expresión y actividad de una fosfatasa, la tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), involucrada en la desregulación de la señalización por Epo. Comprobamos que la inducción de PTP1B es significativamente mayor en presencia de cEpo, incremento que parece estar asociado al aumento de calcio intracelular inducido por este factor. La colocalización de PTP1B con el Rßc sustenta la conclusión de que la fosfatasa desfosforila la señalización de cEpo, interrumpiendo la vía de supervivencia y, en consecuencia, la proliferación celular, explicando, al menos en parte, la acción diferencial entre Epo y cEpo sobre células eritroides. Palabras claves: eritropoyetina carbamilada, eritropoyetina, proliferación celular, receptor de eritropoyetina, receptor ß common, tirosina fosfatasa 1B, eritropoyesis, neuroprotección.

Abstract:
Erythropoietin (Epo) is known as the hormone regulating the production of erythroid cells. However, its biological role was expanded after the discovery of specific receptors expressed in other tissues, including the nervous tissue. Moreover, a neuroprotective effect that could be associated to apoptosis inhibition was described for the hormone. Due to the interest in expanding the pharmacological use of Epo over the protection of non-hematopoietic tissues, the search for modified structures of the protein became more intense. The chemical entity currently under investigation is the Epo carbamylated in lysine residues (cEpo). Results from in vitro and in vivo experiments indicate that this form of Epo retains its neuroprotective ability, while lacking in erythropoietic activity. This different function would prevent an unnecessary increase in erythroid mass in non-anemic patients under treatment for neurodegenerative diseases. With an aim to further the existing knowledge of the changes observed in Epo after carbamylation, in the present work we used a model involving physiological cells as well as cell lines, to globally and comparatively evaluate the effects of Epo and cEpo in parallel assays. Erythoid progenitor cells from mouse bone marrow were used to study the development of colony-forming units-erythroid (CFU-E). The cell lines capable of erythroid differentiation employed were UT-7, dependent on Epo for survival, TF-1, dependent on GM-CSF and able to proliferate in the presence of Epo for short periods, and K562, independent of any specific growth factor where cell line of neuronal origin was SH-SY5Y. The first step in the work consisted in the carbamylation of rhuEpo using potassium cyanide. This salt decomposes when dissolved generating an anion which allows it to bind the protein’s lysine residues. The carbamylation process was carried out at different times and cyanide concentrations to ensure complete binding, and therefore the blockage of Epo’s lysine residues. The carbamylation of Epo was confirmed by gel electrophoresis, electrotransfer and immunodetection, where cEpo showed a decrease in positive charge due to the blockage of lysines, and consequently an increase in its net negative charge in comparison to Epo. In the carbamylation product (cEpo), a carbamyl group is coupled to each lysine residue in the Epo molecule, thus modifying the protein structure and potentially causing functional alterations. In the presence of cEpo, cultures of UT-7 and TF-1 cells showed a significant decrease in cell viability, leading to cell death by apoptosis, whereas Epo maintained viability and induced proliferation of both cell lines. cEpo did not support the development of colony-forming units-erythroid (CFU-E) in cultures of mouse bone marrow cells, nor did it prevent apoptosis induced by the proinflammatory cytokine TNF-α in erythroleucemic K562 cells differentiated with hemin. On the other hand, both cEpo and Epo acted as antiapoptotic agents protecting from the induction of programmed cell death by TNF-α or staurosporin in neuronal SH-SY5Y cells. Based on inhibition assays for intracellular signaling pathways, it may be suggested that the antiapoptotic action of cEpo and Epo is mediated by the activation of Jak2/PI3K. Our results confirmed that the modifications introduced in the Epo molecule after carbamylation produce a loss of its ability to support the survival of cells capable of erythroid differentiation, but it does not affect its neuroprotective action on SH-SY5Y cells, showing an activity similar to that of the native Epo. By carring out inhibition and competence assays, we found that Epo can act through both receptors involved in neuronal SH-SY5Y and TF-1 cells: the homodimer (REpo/REpo) and the heterodimer comprising a REpo monomer and a ßcommon subunit (Rßc), which is also present in the GM-CSF receptor. We observed that cEpo requires both REpo and the R c subunit to prevent apoptosis in neuronal cells. Owing to the fact that after carbamylation Epo maintains its antiapoptotic ability but can no longer induce erythroid cell proliferation, the following objective of this work was to investigate the signaling pathways playing a key role in Epoinduced cell proliferation. Although in cultures of erythroid UT-7 and TF-1 cells cEpo induced Jak2 phosphorylation, which is the first step of cell activation, we demonstrated for the first time that cEpo was unable to maintain Akt and FOXO3a phosphorylated for the same period of time as did Epo. Dephosphorylation of FOXO3a, which promotes its translocation to the nucleus as the transcription factor for the cell cycle regulatory protein p27kip1, was demonstrated through an increase in the expression of the latter in cultures with cEpo. Since the differential effect of Epo and cEpo on cell proliferation may be associated to the silencing of transduction pathways by an increase in the dephosphorylation rate, we analyzed the expression and activity of the tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), involved in the the desregulation of Epo’s signalling. We found that PTP1B induction is significantly higher with cEpo, an increase which seems to be linked with the rise in intracellular calcium induced by this factor. Co-localization of PTP1B and Rßc supports the conclusion that the enzyme dephosphorylates Epo’s signalling faster than that of cEpo, thus interrupting pathways of survival, and consequently, of proliferation. This explains, at least in part, the differential effects of Epo and cEpo on erythroid cells. Keywords: erythropoietin, carbamylated erythropoietin, cell proliferation, erythropoietin receptor, ß common receptor, tyrosine phosphatase 1B, erythropoiesis, neuroprotection.

Godoy, Manuel Santiago. "Efectos del sistema regulador CreBC sobre el flujo de carbono en Escherichia coli y su manipulación para incrementar la síntesis de compuestos de interés industrial" (2014-03-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La supervivencia de un organismo depende, al menos en parte, de su habilidad para sensar y responder a cambios en el ambiente. En las bacterias, los cambios en las características físicas y nutricionales del ambiente generan respuestas inmediatas, a través de la regulación de conjuntos de genes en respuesta a un estímulo específico del ambiente y a señales metabólicas. En el presente trabajo se evaluó el efecto de cambios en CreC, el sensor del sistema regulador de dos componentes CreBC, sobre el metabolismo central de E. coli. Se estudió el efecto de mutaciones en el gen creC en cepas crecidas en medio mineral M9 con glucosa y glicerol como fuente de carbono, y en distintas condiciones de aerobiosis. La ausencia de CreC generó mayores efectos en M9 glucosa y en bajas tensiones de oxígeno tanto para la secreción de metabolitos (acetato, formiato, lactato y succinato) como para las actividades enzimáticas acetato quinasa (ACK) y lactato deshidrogenasa (LDH). De los cuatro metabolitos mencionados, la cepa ΔcreC (DC1060) produjo más acetato, formiato y succinato y menos lactato, y reportó una mayor actividad ACK y menor actividad LDH. El estudio de los niveles de transcripción a través de fusiones trascripcionales del gen gfp (codifica la proteína verde fluorescente, Gfp) a los promotores de los genes de las enzimas estudiadas ackA (ACK) y ldhA (LDH) confirmaron que la menor actividad LDH de la cepa DC1060 se correspondía con niveles inferiores de transcripto del gen (en la fase exponencial). Para la fusión ackA-gfp, en cambio, los niveles de transcripción fueron leve pero significativamente menores en la cepa mutante respecto a la salvaje (K1060) en esta fase, en contraposición a lo observado para la actividad ACK. La trascripción de este gen en la fase estacionaria, pasó a ser mayor en la cepa DC1060, demostrando un alto nivel de complejidad en la dinámica regulatoria de CreC sobre ackA. Mediante estudios similares a los antes descriptospero realizados con mutantes para los genes ΔcreB, ΔcreC y la doble mutante ΔcreBC, se estableció que los efectos de CreC están mediados exclusivamente por CreB. Se realizaron ensayos fisiológicos en los que se observó que la cepa mutante es más sensible a agentes oxidantes como el peróxido de hidrógeno y el paraquat, probablemente como resultado de un estado intracelular más oxidado respecto de la cepa salvaje (como se pudo establecer a partir de los coeficientes /, y los niveles de NADH/NAD+ intracelulares). También se observó que esta cepa tiene un consumo de oxígeno más bajo (- 30%) que la salvaje. Se realizaron ensayos en biorreactor con diferentes niveles de aireación (bajo, medio y alto) y dos fuentes de carbono (glicerol y glucosa) para caracterizar fermentativamente a las cepas K1060 y DC1060, a fin de establecer una estrategia para mejorar la producción de succinato y PHB, en conjunto con los resultados mencionados. Las mayores diferencias entre ambas cepas se observaron nuevamente a bajas concentraciones de oxígeno. De estas diferencias se destacan los siguientes resultados: (i) No hubo producción de lactato, y los niveles de etanol fueron muy bajos para ambas cepas y fuentes de carbono; (ii) el succinato fue detectable sólo en la cepa mutante con glucosa, pero a niveles inferiores que los obtenidos en los cultivos de frasco agitado; (iii) el formiato y el acetato, en medio mineral con glucosa, se produjeron en mayor cantidad para la cepa ΔcreC; (iv) la relación / volvió a reflejar un estado de mayor oxidación intracelular en la cepa ΔcreC (sólo con glucosa); (v) en glicerol como fuente de carbono, se observó un lag más pronunciado y una mayor energía de mantenimiento en la cepa DC1060 respecto a la K1060. Cuando se evaluó la producción de PHB mediante la expresión heteróloga de los genes phaCAB de R. eutropha, se vio que en glucosa la cepa mutante produce casi un 50% más de este polímero. Al probar los efectos del bicarbonato sobre la producción de succinato, vimos que la síntesis de este último aumentaba sólo en la cepa mutante. Para ver si era posible mejorar la producción de estos metabolitos, construimos una colección de cepas con distintas mutaciones de forma de anular las vías metabólicas competitivas. Estas mutaciones involucraron a los genes ackA, ldhA, ptsG, adhE y, por su puesto, creC. En el caso del PHB, ninguna de las cepas mejoró el desempeño de la simple mutante ΔcreC, quizás debido a que ya se alcanzó el máximo nivel de polímero tolerable por la célula. En el caso del succinato, además se sobre-expresaron dos carboxilasas de E. coli (la PEP carboxilasa y la PEP carboxiquinasa), cada una en combinación con la enzima formiato deshidorgenasa (Fdh1) de Candida Boidinii. De las distintas combinaciones estudiadas, la cepa que tuvo mayor producción de succinato fue la triple mutante ΔcreC, ΔackA, ΔadhE, sobreexpresando las enzimas PEP carboxilasa y la Fdh1, llegando a alcanzar una concentración de 6 mM de succinato.

Abstract:
The survival of an organism depends, at least in part, on its ability to sense and respond to changes in the environment. In bacteria, changes in the physical and nutritional characteristics of the environment generate immediate responses, controlled through the regulation of sets of genes in response to specific environmental stimuli and metabolic signals. The effect of changes in CreC, the sensor of the two component CreBC control system, on the central metabolism of E. coli was evaluated In this work. The effect of mutations in creC on central metabolism, were analyzed in M9 mineral medium with glucose and glycerol as the carbon source, and under different oxygen availability conditions. The absence of CreC generated more changes in glucose and low oxygen tensions for the secretion of metabolites (acetate, formate, lactate and succinate) and for the activity of the enzyme acetate kinase (ACK) and lactate dehydrogenase (LDH). Of the four metabolites mentioned, the ΔcreC (DC1060) strain produced more acetate, formate and succinate and less lactate, and reported a higher activity of ACK and lower activity of LDH. The study of the transcription levels via transcriptional fusions of gfp (coding for the green fluorescent protein, Gfp), to the promoters of the genes of the enzymes studied: ackA (ACK) and ldhA (LDH), confirmed that the reduced LDH activity of strain DC1060 matched lower levels of gene transcript (in exponential phase) For the ackA-gfp fusion, however, transcript levels were slightly but significantly lower in the mutant strain compared to the wild type (K1060) at this stage, as opposed to the enzymatic activity observed for ACK. The transcript of this gene in the stationary phase became higher in the DC1060 strain, demonstrating a high level of complexity in the regulatory dynamics of CreC over ackA. On similar studies using a ΔcreB mutant, and a ΔcreBC double mutant, it was established that the observed effects are exclusively mediated by CreB. Physiological studies indicated that the mutant strain is more sensitive to oxidizing agents such as hydrogen peroxide and paraquat, probably resulting from a more oxidized intracellular state when compared to the wild type (as could be established through the / ratio, and the intracellular levels of NADH / NAD+). It was also noted that this strain has a lower oxygen consumption rate than the wild type (-30 %). Tests were performed in a bioreactor with different aeration levels (low, medium and high) and two carbon sources (glycerol and glucose) to characterize the fermentation behavior of K1060 and DC1060 strains in order to establish a strategy to improve the production of succinate and PHB. The largest differences between the two strains were again observed at low oxygen concentrations. These differences can be summarized as : (i) there was no lactate production, and ethanol levels were very low for both strains and carbon sources , (ii) succinate was detectable only in the mutant strain with glucose, but to lower levels than in shake flask cultures , (iii) acetate and formate were produced in greater quantities by the ΔcreC strain in mineral medium with glucose, (iv) the ratio /

Guardia, Carlos M.A.. "Del átomo a la célula: determinantes moleculares que definen la función de galectinas humanas" (2014-05-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las galectinas constituyen una familia de proteínas altamente conservadas a través de la evolución con capacidad de unir carbohidratos presentes en diferentes glicoproteínas de la membrana plasmática y la matriz extracelular. Estas proteínas reconocen en forma específica unidades repetidas de N-acetil lactosamina presentes en N- y O-glicanos. El énfasis del trabajo se centró en determinar los detalles estructurales que diferencian a cada una de estas proteínas, buscando correlaciones entre la dinámica molecular, la estabilidad y la selectividad de unión a glicanos para desencadenar la función celular para la que han sido evolutivamente selecccionadas. A través de una aproximación multidisciplinaria, se empleó una variedad de técnicas de simulación computacional y diversas estrategias experimentales para estudiar los mecanismos y determinantes moleculares de regulación de la unión a glicanos en galectinas y posterior activación de su función en diversos cultivos celulares. Las metodologías empleadas consistieron desde simulaciones de dinámica molecular clásica hasta la expresión y purificación de proteínas recombinantes y ensayos de unión al ligando, cinéticas de oxidación y apoptosis in vitro mediantes citometría de flujo y diversas técnicas de microscopía óptica y electrónica. En primer lugar, este estudio se ha centrado en la caracterización y comparacion estructural y dinámica de cada galectina y su especificidad por diversos glicanos fisiológicamente relevantes. En segundo lugar, se ha estudiado el mecanismo de oxidación y función de enlaces disulfuro en galectina-1, proponiendo la existencia de un interruptor molecular presente sólo en este miembro de la familia. El mismo explicaría el cambio de función al cambiar de estado redox. Por último, se estudió el impacto de la estructura cuaternaria en la unión a glicanos específicos en glicoproteínas y la formación de redes supramoleculares de glicanos en la superficie de la célula.

Abstract:
Galectins are members of a family of highly conserved proteins characterized by the ability to bind saccharide motifs in various cell glycoproteins and the extracellular matrix. These proteins specifically recognize repeating units of N-acetyl lactosamine present in N- and O-glycans. The aim of this work was to define the details and structural motifs that distinguish each individual member of the galectin family, seeking for correlations between the molecular dynamics, stability and selectivity for glycans displayed by these lectins and their proposed functional activity. Using a multidisciplinary approach, in the present study we used a wide variety of computational simulation tools and different experimental approaches to explore the mechanisms and molecular determinants that regulate glycan binding of galectins in cell cultures. The employed methodologies ranged from classical molecular dynamics simulations to the expression and purification of recombinant proteins and ligand-binding assays, oxidation kinetics and apoptosis assays using flow cytometry and various optical and electronic microscopy techniques. First, we have focused on the structural characterization and comparison of molecular dynamics of each galectin in the vicinity of their ligand binding site and mechanism of oxidation and disulfide bond formation in galectin-1 protein, seggesting the presence of a molecular switch that explains the function change during redox state turnover. Finally, we studied the impact of the quaternary structure in the binding properties of galectins to specific glycans and analyzed the ability of galectin-1 to form supramolecular membrane structures called lattices when they interact with specific glycans on the surface of target cells.

Capdevila, Daiana A.. "Mecanismos de inducción y regulación de la función alternativa del citocromo c: fundamentos estructurales" (2015-03-10) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta Tesis Doctoral se abordó el estudio de la regulación funcional del citocromo c (Cyt); una hemoproteína multifuncional que se comporta como transportador electrónico mitocondrial y como enzima lipoperoxidasa en la activación de la muerte celular. Considerando sus funciones tan disímiles es de esperar que esta proteína esté fuertemente regulada, sin embargo el Cyt no forma parte de ninguna cadena de señalización. Para estudiar los factores que determinan su función se emplearon métodos espectroscópicos, electroquímicos y computacionales. Se investigaron los cambios de la estructura y función del Cyt debidos a la presencia de concentraciones fisiológicamente relevantes de especies reactivas de nitrógeno y oxígeno (NOS y ROS) y a la formación complejos con sistemas miméticos de sus receptores naturales. En primer lugar, se investigó el efecto de la adsorción sobre superficies de distinta naturaleza química; concluyendo que el Cyt se adsorbe sobre lípidos zwiteriónicos y aumenta su reactividad frente a ROS, en particular peróxido de hidrógeno. Esta especie oxida específicamente al ligando axial del hemo del Cyt cuando se encuentra unido a estos lípidos, dando como producto una peroxidasa estable. Por otro lado, se caracterizó el cambio estructural promovido por el tratamiento del Cyt con peroxinitrito. Se observó que la nitración de una de las tirosinas desencadena su deprotonación que está acoplada a un cambio de ligando Met/Lys, resultando en un aumento de actividad peroxidasa. Finalmente, se estudió como ambas modificaciones postraduccionales afectan la interacción con la cardiolipina y determinan la actividad del Cyt como enzima lipoperoxidasa. El conjunto de los resultados obtenidos sugieren que la regulación de la función alternativa del Cyt tiene un mecanismo cuyos actores principales son las interacciones con los lípidos de la membrana y las modificaciones postraduccionales debidas al estrés nitrooxidativo.

Abstract:
This Ph.D. Thesis is dedicated to disentangling the parameters that regulate Cytochrome c (Cyt); a highly conserved monohemic protein that serves as an electron shuttle in the respiratory chain and as a lipo-peroxidase during the early steps of apoptosis. Considering the multiple roles of Cyt, one would expect this enzyme to be tightly regulated. However, Cyt is not recognized as a target for any cellular signaling pathway. Spectroscopic, electrochemical, spectroelectrochemical and computational methods were employed to study the signaling events that determine Cyt function. The changes in the structure and function of Cyt due to the exposure to physiologically relevant concentrations of oxygen and nitrogen reactive species (ROS and NOS) and to the formation of biomimetic complexes were investigated. Part of the Thesis deals with the effect of adsorption on surfaces with different functionalities; our results suggest that Cyt is able to interact electrostatically with zwitterionic phospholipids increasing its reactivity towards ROS, particularly hydrogen peroxide. The rise of ROS that characterizes the initiation of apoptosis can specifically oxidize the axial ligand of the heme iron of Cyt bound to zwitterionic phospholipids, yielding a stable peroxidase. Furthermore, we studied the structural changes promoted by peronitrite-induced modifications of Cyt. We showed that nitration of Tyr74 induces Tyr deprotonation, which is coupled to Met/Lys axial ligand exchange, and results in a concomitant gain of peroxidatic activity. Finally, we characterize how both post-translational modifications affect Cyt interaction with cardiolipin and determine the lipo-peroxidase activity of the complex. Altogether, these results suggest that the regulation of Cyt function follows a mechanism where protein-membrane interactions and post-translational modifications induced by oxidative stress are the main actors.

González Bardeci, Nicolás Diego. "Estructura y función del dominio D/D de la subunidad regulatoria de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae" (2015-03-25) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) es una quinasa de serina y treonina de amplio espectro que fosforila a sus proteínas blanco en respuesta a estímulos específicos. Se encuentra involucrada en la regulación de una gran diversidad de procesos fisiológicos en una amplia variedad de organismos, motivo por el cual es un miembro modelo de estudio de la superfamilia de las Proteínas Quinasa. En la mayoría de los organismos, en condiciones de baja concentración de cAMP existe como una holoenzima inactiva heterotetramérica conformada por dos subunidades catalíticas (C) y un dímero de subunidades regulatorias (R). En respuesta a estímulos extracelulares específicos, las concentraciones intracelulares del segundo mensajero aumentan; como consecuencia, dos moléculas de cAMP se unen a cada subunidad R, generando un cambio conformacional que disocia la holoenzima en un dímero de subunidades R y dos subunidades C activas. En mamíferos existen cuatro isoformas de la subunidad R, que presentan una estructura de dominios bien conservada entre los distintos organismos. Ésta consiste de dos dominios de unión a cAMP hacia el extremo C-terminal, y una región responsable de la dimerización hacia el extremo N-terminal. Esta pequeña región de apenas 50 aminoácidos se denomina dominio de dimerización y anclaje (D/D), ya que constituye además una superficie de interacción para una familia de proteínas denominadas AKAPs (A-Kinase Anchoring Proteins). Estas proteínas tienen como función proporcionar a la holoenzima de la PKA la localización subcelular necesaria para garantizar la propagación adecuada de las señales disparadas por cAMP. Todas ellas presentan una hélice anfipática de unos 20 aminoácidos cuya cara no polar interactúa con alta afinidad con una superficie hidrofóbica proporcionada por los dominios D/D. Se conocen las estructuras de alta resolución de los dominios D/D de mamíferos, tanto en su forma apo como en complejo con péptidos derivados de distintas AKAPs. Sin embargo, hasta la fecha no se han llevado a cabo estudios estructurales de estos dominios en otros organismos. El objetivo principal de este trabajo consiste en obtener una caracterización estructural y funcional del dominio D/D de Bcy1, la subunidad R de la PKA de S. cerevisiae. La motivación principal radica en contribuir con el primer estudio de estos dominios en organismos no mamíferos, a efectos de establecer una comparación con éstos. S. cerevisiae es un organismo modelo por excelencia en bioquímica y biología molecular, y resulta muy pertinente para este trabajo dado que en este organismo la PKA es una enzima fundamental involucrada en la regulación de los procesos relacionados con la respuesta a la disponibilidad de nutrientes, respuesta a estrés, desarrollo y entrada en fase estacionaria. En primer lugar, se realizó un mapeo del dominio D/D de Bcy1 por análisis bioinformático de secuencias y experimentos de entrecruzamiento químico utilizando mutantes de deleción de Bcy1 en su extremo N-terminal. En segundo lugar, se procedió al clonado, sobreexpresión en bacterias, y desarrollo de un protocolo de purificación del fragmento recombinante Bcy1 1-50. Posteriormente, se procedió a su caracterización estructural, para lo cual se utilizaron dos abordajes generales: estudiar la estructura en solución y elucidar la estructura cristalina. Para la primera parte, se determinó el estado oligomérico en solución y se obtuvieron parámetros hidrodinámicos característicos utilizando cromatografía de exclusión molecular (SEC), dispersión estática de la luz (SLS) y dispersión de rayos X a bajo ángulo (SAXS). Por otro lado, se estudió la estructura secundaria utilizando dicroísmo circular (CD). Finalmente, se construyó un modelo de la estructura en solución consistente con los datos experimentales, mediante herramientas de modelado molecular. En segundo lugar, se logró resolver la estructura cristalina utilizando difracción por rayos X (XRD). Recientemente, en nuestro grupo de investigación se han identificado varias proteínas interactoras de Bcy1. Estas proteínas son consideradas “candidatas” a ser las primeras AKAPs reportadas en levaduras. Para concluir este trabajo, se estudió la interacción entre el fragmento Bcy1 1-50 y un péptido sintético derivado de una de estas proteínas, Ira2. Para ello se utilizaron técnicas de dicroísmo circular y espectroscopía de fluorescencia.

Abstract:
The cAMP dependent protein kinase (PKA) is a broad spectrum serine/threonine kinase which phosphorylates its target proteins in response to specific stimuli. It is involved in the regulation of a great diversity of physiological processes in many organisms. Therefore, it is a model member of study of the Protein Kinase superfamily. In most organisms, when cAMP levels are low, it exists as an inactive heterotetrameric holoenzyme which is formed by two catalytic (C) subunits and a regulatory (R) subunit dimer. In response to specific extracellular stimuli, the intracellular concentrations of the second messenger rise; as a consequence, two molecules of cAMP bind each R subunit, thus triggering a conformational change that dissociates the holoenzyme in an R subunit dimer and two active C subunits. In mammals there exist four isoforms of the R subunit, which present a well conserved domain structure among many organisms. It consists of two cAMP binding sites at the Cterminus, and a region responsible for dimerization at the N-terminus. This small region of 50 amino acids is called the dimerization and docking (D/D) domain since it presents a surface for interaction with proteins of the AKAP (A-Kinase Anchoring Proteins) family. These proteins are responsible for the appropriate subcellular localization of the holoenzyme, which is required for the propagation of the signaling events triggered by cAMP. They all present an amphipathic helix of 20 amino acids with a non-polar face that interacts with high affinity with a hydrophobic surface in the D/D domains. The high resolution structures of mammalian D/D domains are well known, both in their apo forms and in the AKAP peptide complex. However, to date no structural studies of these domains in other organisms have been performed. The main goal of this work consists in performing a structural and functional characterization of the D/D domain of Bcy1, the R subunit of PKA from S. cerevisiae. The motivation for this work consists in contributing with the first structural study of these domains in non-mammalian organisms, in order to compare with mammalian features. S. cerevisiae is a prototypic organism in biochemistry and molecular biology, and it is of great interest for this work because PKA is a key enzyme involved in the regulation o nutrient availability, stress response, development and entry into stationary phase. As a first approach, we performed a mapping of the D/D domain of Bcy1 using sequence analysis and chemical crosslinking experiments with deletion mutants of the N-terminus of Bcy1. Secondly, we cloned, overexpressed, and purified a recombinant fragment, Bcy1 1-50. Finally, we proceeded with its structural characterization, which consisted of two general approaches: to study the solution structure and the crystal structure. For the solution structure analysis, we determined the oligomeric state and obtained hydrodynamic parameters using size-exclusion chromatography (SEC), static light scattering (SLS), and small-angle X-ray scattering (SAXS). On the other hand, we studied the secondary structure using circular dichroism (CD). Finally, we generated a model of the solution structure which is consistent with the experimental data, using molecular modelling tools. Finally, we solved the crystal structure using X-ray diffraction (XRD). Recently, in our group, several proteins that interact with Bcy1 have been identified. These proteins are considered “candidates” to be the first AKAPs reported in yeast. To conclude this work, we studied the interaction between the fragment Bcy1 1-50 and a synthetic peptide derived from one of these proteins, Ira2. To accomplish this goal, we used CD and fluorescence spectroscopy techniques.

Mon, María Laura. "Nuevas estrategias para el diagnóstico de la tuberculosis y paratuberculosis bovina" (2015-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Tuberculosis (TBB) y Paratuberculosis bovina (PTB) son las principales enfermedades que limitan el desarrollo de la industria lechera y de la carne en Argentina, siendo importantes en el contexto de la Sanidad animal debido a las grandes pérdidas económicas que producen en el ganado bovino. La TBB es producida por M. bovis. El hospedador primario es el bovino, pero otras especies de interés económico, así como también especies salvajes se infectan con esta micobacteria. La TBB es considerada una de las zoonosis más importantes en Argentina, siendo más expuestos los trabajadores rurales y de frigorífico, así como, los que consumen leche cruda sin pasteurizar. No existen vacunas comerciales contra la TBB, por lo tanto disponer de métodos de diagnóstico confiables para la identificación de los animales enfermos es esencial. La prueba oficial de diagnóstico más empleada, aprobada por el SENASA, es la intradermoreacción (IDR) con PPD-B, la cual consiste en la inoculación intradérmica de un derivado proteico purificado de la cepa de M. bovis AN5 (PPD-B), y la posterior medición de la reacción de hipersensibilidad retardada producida. La PPD-B es una mezcla de componentes, principalmente proteínas y lípidos de M. bovis. El principal inconveniente de la IDR radica en que algunas proteínas presentes en la PPD-B se encuentran en otras micobacterias, lo cual disminuye la especificidad, ya que animales sensibilizados por exposición previa a otras micobacterias también responden a este reactivo. En la última década se desarrollaron nuevas pruebas para el diagnóstico de tuberculosis, la más difundida consiste en la medición de IFN- luego de la estimulación de linfocitos con PPD-B o antígenos específicos de M. bovis. Otro método utilizado para el diagnóstico de TBB es la prueba de ELISA, sin embargo esta sólo permite detectar animales en estados severos de la enfermedad o en estado de anergia. Por otro lado, la PTB es una enfermedad infecciosa, producida por M. avium subsp. paratuberculosis (MAP), la cual se caracteriza por una enteritis crónica que resulta en un deterioro progresivo del animal enfermo. Afecta principalmente al ganado bovino, ovino y caprino. El diagnóstico de certeza de PTB es el aislamiento de MAP, pero este es un microorganismo de crecimiento muy lento. Por estas razones, los métodos inmunológicos para el diagnóstico de PTB resultan más efectivos para aplicar en una campaña de erradicación de la enfermedad que el cultivo. El diagnóstico inmunológico de PTB es principalmente serológico debido a que en estadios tempranos de la enfermedad se detectan anticuerpos. Contrariamente a lo que sucede con TBB, el diagnóstico serológico en PTB permite detectar con mayor especificidad los animales infectados que las pruebas que miden respuesta celular. Actualmente hay varios kits comerciales serológicos disponibles con diferentes antígenos, pero estos han demostrado discrepancia en la capacidad de ser detectados por todos los animales infectados. También hay vacunas comerciales disponibles para PTB, pero estas no son utilizadas en nuestro país debido a que interfieren con el diagnóstico de TBB. Por lo mencionado, en este trabajo se identificaron y evaluaron antígenos específicos de M. bovis y MAP para mejorar el diagnóstico de ambas enfermedades y poder contar en el futuro con herramientas que permitan la utilización de vacunas en desarrollo para la erradicación de la TBB y PTB. Para este fin, se identificaron por técnicas de proteómica, antígenos en aquellas fracciones proteicas más inmunogénicas de la PPD-B. A partir de las proteínas identificadas, se evaluaron 2 mezclas de antígenos altamente inmunogénicos identificados ya en trabajos previos en nuestro laboratorio, ESAT- 6, CFP-10, MPB-83, MPB-70, HSPX y TB10.3. Además de ser altamente inmunogénicos ESAT-6 y CFP-10 tienen la ventaja de que no se encuentran en la vacuna BCG, con lo cual son útiles para un diagnóstico DIVA (diferenciando vacunados de infectados). Estas mezclas resultaron ser más específicas que la PPD-B al no ser detectadas por animales vacunados con BCG, ni animales con PTB o sanos. Para mejorar la sensibilidad de estas mezclas se incluyeron otras proteínas identificadas en este estudio, no estudiadas hasta el momento: FixB y CFP2. Las nuevas mezclas incluyendo a estas proteínas, fueron evaluadas por las técnicas de IFN- e IDR, en animales naturalmente infectados con M. bovis, animales con PTB y animales sanos. En base a estos resultados, se observó que FixB aumentó la sensibilidad de las mezclas sin comprometer la especificidad. Luego estas mezclas fueron evaluadas en una prueba serológica, siendo detectadas también específicamente por los sueros de animales infectados con M. bovis. Nuestros resultados demuestran que una nueva mezcla compuesta por las proteínas recombinantes CFP-10, ESAT-6, MPB83 y FixB, es un promisorio nuevo reactivo para aplicar al diagnóstico específico de TBB tanto celular como serológico, sin interferencias con animales sensibilizados con otras micobacterias o vacunados con BCG. En cuanto la evaluación de antígenos de MAP para utilizar en el diagnóstico de PTB, se evaluó un panel de 51 antígenos por la técnica de MAPIA. Esto permitió seleccionar 7 antígenos específicos: Map2513, Map1693c, Map2020, Map0038, Map1272, CSP, Map0210c, los cuales fueron detectados específicamente por los sueros de animales con PTB. En base a esto, se realizó una mezcla con los 7 antígenos (M1-PTB), la cual se evaluó también por MAPIA. Por otra parte se identificaron proteínas antigénicas a partir de PPD-A (Derivado proteico purificado a partir de M. avium por técnicas de proteómica identificándose 3 proteínas las cuales también se evaluaron por la técnica de MAPIA, conformando una segunda mezcla (M2-PTB). esta mezcla resultó sensible, pero no específica. Luego M1-PTB y M2-PTB fueron evaluadas con mayor cantidad de sueros de animales con PTB y con un grupo de animales con TBB por la técnica de ELISA, comparando con el ELISA convencional PPA-3 que utiliza un antígeno protoplasmático de MAP. M1- PTB tuvo sensibilidad del 33% y no exhibió reacción cruzada con sueros de animales sanos y la reactividad con el suero de animales con TBB fue muy baja mostrando una mayor especificidad que el ELISA-PPA-3. El panel de 51 antígenos también fue evaluado por la técnica de IFN-ningún antígeno de MAP demostró capacidad de liberar esta citoquina en valores que permitan su utilización en un test que mida respuesta celular. Los resultados presentados en este trabajo sugieren que varios antígenos específicos tanto de M. bovis como de MAP pueden mejorar la detección de la infección pudiendo permitir además el uso de vacunas tanto contra PTB como TBB, sin que estas interfieran en el diagnóstico.

Abstract:
Tuberculosis (TBB) and bovine paratuberculosis (PTB) are the main diseases that limit the development of dairying and beef in Argentina, being important in the context of animal health, due to the large economic losses that occur in cattle. TBB is produced by M. bovis. The primary host is cattle but other species of economic interest as well as wild species are infected with this mycobacterium. TBB is considered one of the most important zoonoses in Argentina where rural workers and those who consume raw unpasteurized milk are primarily exposed. There are no commercial vaccines against TBB therefore having reliable diagnostic methods its essential. The official diagnostic test, approved by SENASA is the tuberculin test (IDR), which involves intradermal inoculation of a purified protein derivative of M. bovis strain AN5 (PPD-B), and subsequent measuring of the delayed hypersensitivity reaction. PPD-B is a mixture of components, proteins and lipids from M. bovis. The main disadvantage of the IDR is that some proteins present in the PPD-B are in others mycobacteria, which decreases the specificity, since animals sensitized by previous exposure to other mycobacteria also respond to this reagent. In the last decade, new tests for the diagnosis of tuberculosis were developed; the most widespread is the measurement of IFN- after lymphocyte stimulation with PPD- B or specific M. bovis antigens. Another method used for TBB- diagnosis is the ELISA, but this only allows detecting anergic animals in severe disease states. Furthermore, PTB is an infectious disease caused by M. avium subsp. paratuberculosis (MAP), which is characterized by chronic enteritis resulting in a progressive deterioration of the animal. Primarily affects cattle, sheep and goats. Definitive diagnosis of PTB is the isolation of MAP, but this is a very slow growing organism. For these reasons, immunological methods for PTB diagnosis are more effective to implement in a campaign to eradicate the disease than culture. Immunological PTB diagnosis is primarily serologic because in the early stages of the disease antibodies are detected. Contrary to what happens with TBB, serological PTB diagnosis has a greater specificity to detect infected animals than cellular response test. Currently, several serological commercial kits are available with different antigens, but these have shown discrepancy in the ability to detect all infected animals. There are also commercial PTB-vaccines available, but these are not used in our country because they interfere with TBB diagnosis. In this study M. bovis and MAP specific antigens were identified and evaluated to improve the diagnosis of both diseases and to have tools in the future that allow the use of vaccines in development for the eradication of TBB and PTB. For this purpose, antigens were identified by proteomic techniques in those immunogenic PPD-B protein fractions. From this, 2 mixtures composed by highly immunogenic antigens identified in previous studies in our laboratory, ESAT-6, CFP-10, MPB-83, MPB-70, HSPX and TB10.3, were evaluated. Besides, being highly immunogenic ESAT-6 and CFP- 10 have the advantage of not to found in BCG, thereby serve as a diagnostic DIVA (differentiating vaccinated from infected). These mixtures were more specific than PPD-B not reacting with BCG-vaccinated animals, or PTB-infected or healthy animals. To improve the sensitivity of these cocktails, two unknown proteins, CFP2 and FixB were included. These new cocktails were evaluated by IFN- release assay and IDR. Based on these results, it was observed that FixB increased the sensitivity without compromising the specificity. Our results demonstrate that a novel mixture comprising the recombinant proteins CFP-10, ESAT-6, MPB83 and FixB, is a promising new reagent for specific diagnosis applied to both cellular and serological TBB without interference with other mycobacteria sensitized animals. Thus, the mixture can be used for diagnosis of TBB, and also applied in BCG vaccinated animals without interfering. As the evaluation of MAP antigens for PTB-diagnosis, a panel of 51 antigens was evaluated by MAPIA (multi-print antigen immunoassay). This allowed selecting 7 specific antigens: Map2513, Map1693c, Map2020, Map0038, Map1272, CSP, and Map0210c. Based on this, a mixture with the seven antigens (M1-PTB) was performed, which was also evaluated by MAPIA. Moreover, PPD-A antigenic proteins were identified by proteomic techniques. Three proteins from these were also evaluated by the technique of MAPIA, forming a second mixture (M2 -PTB). After this, both cocktails were evaluated with greater amount of sera from MAP and M. bovis infected animals by ELISA, comparing with conventional ELISA-PPA-3 using a M. avium protoplasmic antigen. M1-PTB had a sensitivity of 33% and exhibited no crossreaction with healthy animals and the reactivity of TBB animals was very low, being more specific than ELISA-PPA-3. The panel of 51 antigens was also evaluated by the technique of IFN-any antigen was very inmunogenic to allow their use in a test to measure cellular response. The results presented in this thesis suggest that several specific M. bovis and MAP antigens can improve the detection of infection and also allow the use of vaccines for both PTB as TBB, without interfering with the diagnosis.

Mazaira, Gisela Ileana. "Modulación de la localización subcelular de factores nucleares por proteínas TPR" (2015-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los dominios TPR están constituidos secuencias en tándem de 34 aminoácidos organizadas en α-hélices antiparalelas. Las proteínas TPR mejor caracterizadas son las que forman complejos con receptores de esteroides (REs) vía la heat-shock protein de 90-kDa, Hsp90, afectando su plegamiento y ensamblado. Nuestro laboratorio demostró que las inmunofilinas FKBP51 y FKBP52 son factores TPR que regulan antagónicamente la actividad transcripcional y localización subcelular de GR y MR. El objetivo de esta tesis fue estudiar el efecto de otras proteínas TPR como PP5, SGT1α y 14-3-3σ sobre GR y AR. Demostramos que PP5 favorece la retención nuclear de REs, 14-3-3σ retrasa la importación y acelera la exportación, mientras que SGT1α no afecta su distribución subcelular, aunque inhibe la actividad transcripcional de ambos receptores. En tal sentido, PP5 y 14-3-3σ muestran una respuesta bifásica, es decir, un aumento leve de la expresión estimula la transcripción, pero se inhibe con niveles más altos. Por ende, el balance de expresión de estos factores TPR debería afectar casos como el cáncer prostático en donde estas proteínas aumenta su expresión pudiendo potencialmente afectar el balance de actividad entre AR y GR, lo que influirá en el desarrollo y progresión de la patología. Al presente no existen drogas específicas para cada proteína TPR, por lo que realizamos un abordaje farmacológico que las afecte indirectamente usando como blanco a la chaperona Hsp90 con la que forman una unidad estructural y funcional. Estudiamos una serie de compuestos diseñados por modelado computacional como potenciales inhibidores de la actividad ATPasa de Hsp90, la que siempre se ha considerado clave para su función biológica. Algunos compuestos son bases de Schiff derivadas del 2,4-dihidroxibenzaldehido o del 5-cloro-2,4-dihidroxibenzaldehido, otros son derivados del resorcinol. Como control se usó geldanamicina, una benzoquinona ansamicina que es un conocido inhibidor de Hsp90. En contraste con el efecto de esta droga, la importación de REs no se vio afectada por las drogas sintéticas. No obstante, varias de ellas inhibieron la actividad de ATPasa de la chaperona y promovieron la pérdida de viabilidad de células tumorales prostáticas, mostrando en algunos casos efectos comparables al de geldanamicina. Ninguno de estos efectos guardó relación directa con la capacidad inhibitoria de ATPasa o la estructura química del compuesto. Nuestros resultados demuestran que tanto la localización subcelular como la actividad biológica de los REs se ve regulada por el balance de expresión de las proteínas TPR con las que interactúan. Además, se demuestra que, contrario al dogma dominante en la literatura, la actividad de ATPasa de Hsp90 no guarda correlación directa con tales efectos, a la vez que se describen nuevas drogas inhibitorias.

Abstract:
TPR domains consist of tandem arrangements of 34 amino acids organized in antiparallel α-helices. The best characterized TPR proteins are those able to form complexes with steroid receptors (SRs) via the heat-shock protein of 90 kDa, Hsp90, affecting their folding and assembly. Our laboratory showed that the immunophilins FKBP51 and FKBP52 are TPR factors that regulate transcriptional activity and subcellular localization of GR and MR in an antagonistic fashion. The aim of this thesis was to study the effect of other TPR proteins such as PP5, SGT1α and 14-3-3σ on GR and AR action. We demonstrate that PP5 promotes nuclear retention of SRs, 14-3-3σ delayed both nuclear import and nuclear export rates of SRs, while SGT1α shows no affect on the receptor subcellular distribution. Nonetheless, SGT1α inhibits the transcriptional activity of both receptors. In this sense, PP5 and 14-3-3σ show biphasic response, that is, a slight increase in expression stimulates transcription, but transcription is inhibited by higher levels of expression. Therefore, the expression balance between these TPR factors should influence cases like prostate cancer, where the balance of activity between AR and GR affects the development and progression of the pathology. Because there are no specific drugs for each TPR protein, we performed a pharmacological approach to indirectly affect them using the Hsp90 chaperone partner as target.. We studied a series of compounds designed by computer modeling as potential inhibitors of the ATPase activity of Hsp90, which has always been considered key to the biological function of Hsp90. Some compounds are Schiff bases derived from 2,4-dihydroxybenzaldehyde and 5-chloro-2,4-dihydroxybenzaldehyde, others are resorcinol derivatives . Geldanamycin, a known benzoquinone ansamycin that inactivates Hsp90, was used as control. In contrast to geldanamycin, the import of SRs was not affected by the synthetic drugs. Nevertheless, they did affect tumor cell viability and inhibited the ATPase activity of the chaperone being as effective as geldanamycin itself. However, these effects were not directly related to their ATPase inhibitory activity. Our results demonstrate that both the subcellular localization and the biological activity of the SRs are regulated by the expression balance of their interacting TPR domain proteins. Furthermore, it is shown that the ATPase activity of Hsp90 is not directly related to these effects. A novel set of inhibitory compounds is also described.

Ziblat, Andrea. "Regulación del fenotipo y funcionalidad de las células Natural Killer humanas por IL-23 e IL-27, nuevas citoquinas de la familia de IL-12" (2015-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células NK son células del sistema inmune, críticas en la defensa contra células tumorales y células infectadas, que se activan luego de sensar señales a través de receptores activadores y por acción de citoquinas secretadas por macrófagos y células dendríticas (CD), entre las cuales IL-12 es considerada una de las más relevantes. Recientemente se han descripto nuevos miembros de la familia de IL-12, entre ellos IL-23 e IL-27. IL-23 posee efectos pro-inflamatorios, pero existen datos contradictorios en cuanto a su rol en el contexto tumoral. En cambio, IL-27 induce una potente respuesta anti-tumoral, pero posee efectos tanto pro- como anti-inflamatorios. Debido a que el efecto de estas citoquinas sobre las células NK humanas aún no ha sido investigado, el objetivo de esta tesis doctoral fue estudiar el efecto de IL-23 e IL-27 sobre estas células. En primer lugar, demostramos que IL-23 e IL-27 secretadas por CD contribuyen a estimular la producción de IFN-γ por células NK. Mediante el empleo de inhibidores farmacológicos, demostramos que la estimulación de células NK con las citoquinas recombinantes indujo la producción de IFN-γ a través de la activación de las vías de JNK, PI3K, MEK1/2, NF-κB y mTOR, y que IL-27 activó además a STAT-1. Observamos también que tanto IL-23 como IL-27 generaron un efecto de priming para IL-18, exhibiendo estas citoquinas un efecto sinérgico con IL-18 para la secreción de IFN-γ. En el caso de IL-27, dicho efecto involucró un aumento en la expresión de T-bet y del receptor de IL-18. A su vez, ambas citoquinas indujeron un aumento en la expresión de los marcadores de activación celular CD25 y CD69, y potenciaron la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. IL-27, pero no IL-23, estimuló la respuesta citotóxica de las células NK de manera dependiente de NKp46 y de las vías de NF-κB y mTOR, a través de la vía secretoria y de TRAIL, pero no la de FasL. Detectamos además que IL-18 potenció la actividad citotóxica inducida por IL-27 a través de la inducción de un aumento en la expresión de ICAM-1 en las células blanco mediado por IFN-γ. En conjunto estos resultados indican que IL-23 e IL-27 estimulan las funciones efectoras de las células NK, lo que puede ser relevante durante situaciones tanto fisiológicas como patológicas.

Abstract:
NK cells are immune cells, critical during immunity against intracellular infections and tumors, that became activated after recognition through activating receptors and macrophage and dendritic cell (DC)-derived cytokines, among which IL-12 is considered to be one of the most relevant. New members of the IL-12 family have been recently described, including IL-23 and IL-27. IL-23 display pro-inflammatory properties, however its role during the anti-tumor immune response is controversial. On the other hand, IL-27 induces a potent anti-tumor immune response, but shows pro- and anti-inflammatory effects. The effect of these cytokines on human NK cells has not been yet studied, thus the objective of this doctoral thesis was to study the effects of IL-23 and IL-27 on human NK cells. We first demonstrated that DC-derived IL-23 and IL-27 induced an enhanced production of NK cell-derived IFN-γ through the activation of JNK, PI3K, MEK1/2, NF-κB and mTOR pathways. In addition, IL-27 also activated the STAT-1 pathway. We also observed that IL-23 as well as IL-27-primed NK cells for IL-18-induced IFN-γ secretion, showing a synergistic effect, which in the case of IL-27 was associated with upregulation of T-bet and IL-18 receptor expression. Moreover, both cytokines induced upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and enhanced the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. IL-27, but not IL-23, stimulated NKp46-dependent NK cell-mediated cytotoxicity through NF-κB and mTOR pathways. In addition, the TRAIL and secretory pathways, but not Fas-FasL interaction, are involved in this effect. We have also observed that IL-18 enhanced the IL-27-induced cytotoxic activity through the upregulation of ICAM-1 on target cells, mediated by IFN-γ. Together our results show that IL-23 and IL-27 stimulate NK cell effector functions, which may be relevant during different physiological as well as pathological situations.

Carro, Ana Clara. "La entrada de virus dengue a líneas celulares humanas en la infección primaria en ausencia o presencia de anticuerpos" (2015-04-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Actualmente, casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de contraer virus dengue (DENV), agente patógeno que puede causar una infección aguda febril autolimitada o progresar a formas más severas de enfermedad, con una tasa de mortalidad de 2,5 %. A pesar de representar un grave problema para la salud pública, no existen vacunas ni quimioterapias disponibles para DENV. La entrada del virus a la célula huésped es una interesante estrategia antiviral ya que permite bloquear el comienzo de la infección viral. En el caso de DENV, sólo se ha estudiado hasta el presente el modo de entrada en líneas celulares epiteliales o fibroblásticas de mamíferos y de mosquito, con resultados controversiales. El presente trabajo de tesis se enfocó en el estudio del mecanismo de entrada de este patógeno a células mieloides humanas, más representativas de la infección natural, y la implicancia que pudiese tener en la quimioterapia antiviral. Mediante la utilización de inhibidores químicos de las distintas vías endocíticas, medida de infectividad por formación de placas, determinaciones de RNA viral por RT-PCR en tiempo real y técnicas de microscopía de fluorescencia y electrónica, se demostró que los dos serotipos DENV-1 cepa Hawaii y DENV-2 cepa NGC utilizan una vía clásica de endocitosis dependiente de clatrina y dinamina para entrar en células humanas U937, de origen monocítico, y K562, de origen ertitroleucémico. En la infección de ambas células en presencia de anticuerpos no neutralizantes anti-DENV, condiciones en que hay incremento de la infección in Vitro y pueden explicarse las formas más severas de la enfermedad in vivo, se observó que DENV-2 utiliza diferentes vías de entrada, mediadas o no por clatrina, según el receptor FcR involucrado en el proceso. También se evaluó en los mismos sistemas la actividad antiviral del carragenano , polisacárido sulfatado que inhibe la adsorción e internalización de DENV-2 en células Vero, encontrándose también una relación entre la susceptibilidad antiviral y el tipo de receptor empleado para la entrada mediada por anticuerpos. Finalmente, se realizó un estudio de la dependencia de colesterol para la infección con DENV, concluyendo que el contenido adecuado de colesterol en la envoltura viral, no así en la membrana celular, sería determinante para lograr la fusión de ambas membranas y alcanzar una infección productiva. La caracterización de la vía de entrada en células mieloides y el rol del colesterol viral aporta nueva información para comprender los factores involucrados en la infección de DENV y favorecer el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales más efectivas.

Abstract:
At present, a high proportion of world population is at risk of infection with dengue virus (DENV), a pathogen causing either a mild febrile illness or more severe forms of disease, with 2.5 % mortality. Although DENV represents a serious health problem worldwide, no specific chemotherapy or vaccine is currently available. Virus entry is an attractive antiviral strategy to block initiation of infection. For DENV, the mode of entry into the host cell has been studied only in fibroblastic or epithelial cell lines, derived from mammals or mosquitoes, with controversial results. In the present study, the entry of DENV into human myeloid cell lines, a model more representative of the natural infection, was analyzed as well as the relationship between mode of entry and antiviral susceptibility to sulfated polysaccharides. By using biochemical inhibitors of endocytic routes, infectivity titrations by plaque formation, viral RNA determinations by quantitative RT-PCR, fluorescence and electron microscopy, a clathrin- and dynamin-mediated endocytosis was demonstrated for entry of both serotypes DENV-2 strain NGC and DENV-1 strain Hawaii into human myelomonocytic U937 and erithroleukaemic K562 cell lines. When both cells were infected with DENV-2 in the presence of nonneutralizing anti-DENV antibodies, conditions which allow an enhancement of infection in vitro and lead to severe forms of disease in vivo, the route of entry was clathrin-mediated or not, according to the receptor FcR involved in the infective process. Furthermore, the antiviral activity in both cell systems of carrageenan, a sulfated polysaccharide known to inhibit DENV-2 adsorption and uncoating in Vero cells, was also evaluated. A relationship between antiviral susceptibility to carrageenan and the type of receptor employed for antibody-mediated entry was observed. Finally, studies about the cholesterol-dependence for DENV infection have shown that the envelope cholesterol is a critical factor in the fusion process for DENV entry whereas cell membrane cholesterol is not involved. The characterization of the mode of entry in myeloid cells and the role of viral cholesterol contributes to the knowledge of factors involved in DENV infection and the design and usage of new and more effective antiviral therapies.

Sycz, Gabriela. "Caracterización de la vía de señalización de LOVHK implicada en mecanismos de respuesta a estrés y virulencia en Brucella spp" (2015-04-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Brucella spp. son bacterias Gram-negativas que pertenecen al grupo de las α-2- proteobacterias. Son el agente causal de la brucelosis, una enfermedad zoonótica que produce abortos e infertilidad en animales, y fiebre en humanos. Brucella es un patógeno intracelular facultativo, el cual reside en un nicho replicativo derivado del retículo endoplásmico. Su capacidad de sobrevivir dentro de las células hospedadoras se debe a los diversos mecanismos que ha desarrollado para tolerar las distintas condiciones de estrés presentes en el proceso de infección. Las bacterias pueden detectar y responder a cambios en el ambiente por medio de los sistemas de dos componentes, los cuales están formados por una Histidina Quinasa sensora (HK) y un Regulador de Respuesta (RR). Previo al inicio de este trabajo, se caracterizó en Brucella abortus 2308 una proteína histidina quinasa (LOVHK), la cual posee un dominio LOV sensible a la luz azul, un dominio PAS, seguido de un domino HK. Cuando la proteína es iluminada con luz azul, el dominio LOV inicia un fotociclo, el cual promueve la autofosforilación del dominio HK iniciando una cascada de transducción de señales que culmina con un incremento en la virulencia de Brucella. En el presente trabajo se ha estudiado la vía de señalización iniciada por LOVHK en Brucella abortus 2308. Por medio de ensayos de doble híbrido y experimentos de fosfotransferencias, se identificaron dos RRs como compañeros de interacción de LOVHK: PhyR y LovR. Los resultados in vitro sugieren que LovR podría funcionar como un sink de fosfato de LOVHK. Ensayos realizados in vivo sugieren que LOVHK, por medio de PhyR, contribuye a la activación del sistema de Respuesta General a Estrés (GSR- por sus siglas en inglés). Además, en ausencia de LOVHK la expresión de virB se encuentra alterada. Estos resultados sugieren que LOVHK podría participar en más de una vía de señalización intracelular. En resumen, los hallazgos del presente trabajo contribuyen al conocimiento del mecanismo de señalización de LOVHK y el efecto de dicha vía en la virulencia de Brucella.

Abstract:
Brucella spp. are Gram-negative bacteria that belong to the α-2-proteobacteria group. They are the causative agent o brucellosis, a zoonotic infection that causes miscarriage and infertility in animals, and a febrile disease in humans. Brucella is a facultative intracellular pathogen, which resides in a replicative niche derived from the endoplasmic reticulum. Its ability to survive inside its host is due to the different mechanisms that it has developed in order to cope with the different stress conditions that it encounters during the infection process. Bacteria can detect and respond to environmental changes through two-component signalling systems (TCS), which consist of a sensor Histidine Kinase (HK) and its cognate Response Regulator (RR). Previously, it has been characterized in Brucella abortus 2308 a histidine kinase protein (LOVHK), which has a LOV domain sensible to blue-light, a PAS domain and a C-terminal HK domain. After exposure to blue-light, the LOV domain initiates a self-contained photocycle, which promotes autophosphorylation of the HK domain, initiating a signal transduction pathway that produces an increment in Brucella virulence. In the present work, the intracellular signalling pathway initiated by LOVHK in Brucella abortus 2308 is characterized. Using two-hybrid assays and phosphotransfer experiments we identified two RRs as interacting partners of LOVHK: PhyR and LovR. These in vitro results suggest that LovR could be functioning as a phosphate-sink for LOVHK. In vivo results suggest that LOVHK, through PhyR, contributes to the activation of the General Stress Response System (GSR). Furthermore, the expression of virB is altered in the absence of LOVHK. Altogether, these results suggest that LOVHK could be involved in more than one intracellular signaling pathway. In conclusion, the results obtained in the present work contribute to the understanding of the signaling mechanism initiated by LOVHK and the effect of this pathway on Brucella virulence.

Zalazar, Florencia. "Nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de próstata" (2015-05-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres en la población argentina. El instituto Nacional del Cáncer (USA) describe diferentes tratamientos para los pacientes con PCa: cirugía, radiación y hormono-terapia. Para los pacientes con PCa avanzado, el tratamiento más común es el docetaxel, sin embargo esta terapia no extiende significativamente la sobrevida de los pacientes. Por lo tanto, es crítico el desarrollo de nuevos agentes y combinaciones para el tratamiento de esta etapa de la enfermedad. Previamente en estudios in vitro se determinó que el compuesto antiangiogénico análogo de la talidomida CPS49, selectivamente elimina a las células de leucemia aumentando las especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de la modulación de diversas vías transcripcionales, cuando se lo combina con flavopiridol, un potente inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas (CDKs). En el presente trabajo se investigaron los efectos de nuevos análogos de la talidomida en el PCa. En base a los resultados in vitro obtenidos elegimos el CPS49 para combinar con otros agentes y estudiar su capacidad antitumoral. Cuando combinamos CPS49 con flavopiridol observamos que este inhibidor de CDKs aumentó la citotoxicidad del CPS49 en todas las líneas celulares de PCa analizadas. En PC3 observamos que la combinación arrestó el ciclo celular, indujo la apoptosis e inhibió la formación de colonias. Estudios in vivo utilizando xenotransplantes generados a partir de la inoculación de células PC3 en ratones nude demostraron que el CPS49 y el flavopiridol disminuyeron el crecimiento tumoral en una concentración efectiva de las drogas cercanas a la mitad de las previamente publicadas. Análisis histológicos de los tumores extraídos mostraron extensas áreas de necrosis inducidas por el tratamiento. Además evaluamos la expresión de 23 genes mediante un arreglo de RT-qPCR en células PC3 expuestas a las drogas y a su combinación y en los tumores de los ratones xenotransplantados, y observamos que el CPS49 junto con el flavopiridol disminuyó la expresión de genes involucrados en adhesión, migración e invasión celular. Teniendo en cuenta que el paclitaxel es el quimioterapéutico más utilizado actualmente para el tratamiento del PCa avanzado, se analizó el efecto de la combinación del CPS49 con este compuesto. Demostramos que la combinación de bajas dosis de CPS49 aumentó la citotoxicidad producida por paclitaxel en líneas celulares de PCa, aunque esta combinación no redujo el volumen tumoral en los ratones xenotransplantados. Debido a que las mutaciones en BRCA1 o la disminución de su expresión alteran la sensibilidad a diferentes drogas antitumorales, en este trabajo estudiamos la respuesta al flavopiridol y CPS49 luego de variar los niveles de expresión de BRCA1 en las distintas líneas celulares de PCa. La baja expresión de BRCA1 aumentó la sensibilidad a dicha combinación. Además utilizamos olaparib, un inhibidor de PARP que se usa para el tratamiento del cáncer de mama en pacientes que poseen BRCA1 mutado. Este agente resultó ser selectivo para las líneas celulares de PCa con baja expresión de BRCA1, y aumentó la sensibilidad a flavopiridol y CPS49 en la línea celular PC3. En resumen, en este trabajo de tesis doctoral se estudiaron distintas estrategias terapéuticas en ensayos pre-clínicos para el PCa. Aunque las terapias propuestas requieren una profundización del estudio, podemos concluir que la propuesta más completa y prometedora para el tratamiento del PCa es la combinación de CPS49 con flavopiridol.

Abstract:
Prostate cancer (PCa) still ranks as the second most frequently cause of men cancer death in Argentina. National Cancer Institute (USA) describes different treatments for PCa: surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and approved experimental clinical trials. For patients with metastatic castration-resistant prostate cancer (CRPC) the most common treatment is docetaxel chemotherapy. This therapy is only palliative and does not significantly extend the overall survival rate in patients. Thus, there is a need for the discovery of new agents and regimens for this disease. CPS49, an analog of thalidomide, was reported to selectively kill leukemic cells by increasing intracellular reactive oxygen species (ROS) and further targeting multiple transcriptional pathways, when is co-administrated with flavopiridol, a semisynthetic flavonoid that inhibits cyclin dependent kinases (CDKs). In this work, the effects of new thalidomide analogues in PCa were investigated. Based on the in vitro results, CPS49 was chosen to combine with other agents and study its antitumor capacity in PCa. The combination of flavopiridol and CPS49 enhanced CPS49 cytotoxicity in all PCa cell lines analyzed. In PC3 cell line we observed that this combination induced cell cycle arrest, apoptosis and inhibited colony formation. In vivo studies using xenograft generated from PC3 cell inoculation in nude mice demonstrated that flavopiridol and CPS49 combination decreased tumor growth using a half effective concentration of drug that was previously published. Histological analysis of xenograft PC3 tumor samples from CPS49/flavo combination showed extensive areas of necrosis induced by the treatment. RT-qPCR array containing 23 genes from PC3 cells or PC3 xenografts exposed to CPS49/flavo combination showed that this treatment shut down the expression of several genes involved in adhesion, migration or invasion. Given that paclitaxel is the chemotherapeutic treatment most currently used for advanced PCa, the effect of combining paclitaxel with CPS49 was analyzed. We find that the combination of low doses of CPS49 increased cytotoxicity produced by paclitaxel in PCa cell lines, but this combination did not significantly reduce tumor growth in PC3 xenografts. BRCA1 mutations or its decreased expression modulates sensitivity to various antitumor drugs. In this thesis, we studied the effects of flavopiridol and CPS49 in PCa cell lines with different BRCA1 expression levels. BRCA1 depletion increased cell sensitivity to this combination. Furthermore we investigated the effects of olaparib in BRCA1 depleted PCa cell lines. Olaparib is a PARP inhibitor used for the treatment of breast cancer in BRCA1 mutations carrier patients. This agent was found to be selective for BRCA1 depleted PCa cell lines, and increased sensitivity to CPS49/ flavopiridol combination in PC3 cell line. In summary, in this doctoral thesis, different therapeutic strategies were tested in PCa pre-clinical studies. Although all the proposed therapies require a more detailed study, we can conclude that the most complete and promising therapy assayed for PCa is the combination of CPS49 with flavopiridol.

Pautasso, María Constanza. "Regulación transcripcional de las subunidades de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae" (2015-07-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células deben mantener un específico y delicado balance de su fisiología interna para el crecimiento y funcionamiento óptimos. El mantenimiento de este balance interno es crítico y variaciones del ambiente pueden resultar en una variedad de perturbaciones celulares que pueden romper el equilibrio interno celular, provocando de esta forma una interrupción de flujos metabólicos, desestabilización de estructuras celulares y perturbación de gradientes químicos, entre otros, que conducen a una inestabilidad general. Las células deben ser capaces de proteger y mantener la homeostasis interna frente a la variabilidad de las condiciones externas. La levadura Saccharomyces cerevisiae, ha evolucionado sistemas de sensado y redes de señalización complejas para responder eficientemente a las variaciones repentinas y frecuentes en el ambiente externo, como son fluctuaciones de temperatura, osmolaridad, acidez del ambiente, presencia de tóxicos, y largos períodos de hambreado nutricional. Dichos mecanismos, le permiten controlar la expresión de numerosos genes que están involucrados en la división celular, caminos metabólicos, resistencia a estrés y diferenciación celular. En Saccharomyces cerevisiae una gran variedad de los procesos celulares es controlada por la vía de la proteína kinasa A dependiente de cAMP (PKA), la que consiste en un heterotetrámero formado por dos subunidades catalíticas (C) codificadas por los genes TPK1, TPK2 y TPK3, y por dos subunidades regulatorias (R) codificadas por un único gen BCY1. Entre los estímulos mejor descriptos frente a los que la PKA se activa se encuentra la presencia de fuentes de carbono fermentables en el medio. Por el contrario, tanto para el cambio a metabolismo respiratorio que permite el consumo de fuentes de carbono no fermentables, como para dar una respuesta que permita la adaptación a situaciones de estrés térmico y osmótico, es necesario que la PKA se inactive. La especificidad de la respuesta frente a distintos estímulos es determinada por varios factores como son la concentración local de cAMP, los niveles de expresión de la quinasa y del sustrato, la presencia o ausencia de proteínas de anclaje que limitan la interacción de la quinasa con su sustrato y la secuencia alrededor del sitio de fosforilación de éste. La regulación de los niveles de expresión génica de las subunidades de PKA en Saccharomyces cerevisiae ha sido poco estudiada hasta el momento. En este trabajo se buscó caracterizar la actividad transcripcional de los promotores de los genes de las subunidades de PKA en distintas condiciones de crecimiento, así como identificar globalmente vías metabólicas y específicamente proteínas de importancia en la regulación. En primer lugar, mediante la técnica de genes reporteros y la medición de los niveles de mRNA, se determinó que los niveles de actividad de los promotores de los genes de PKA son diferentes a lo largo del crecimiento, ordenándose de mayor a menor de la siguiente forma: TPK1, TPK2, TPK3 y BCY1. Empleando mutantes que exhiben una actividad de PKA desregulada o nula, se describió el comportamiento autorregulatorio negativo isoforma-dependiente de la enzima sobre los niveles de expresión de sus propios genes. En condiciones de estrés térmico y salino, sólo el promotor TPK1 es activado, y mediante el empleo de cepas mutantes de deleción de proteínas involucradas en la vía de respuesta al estrés térmico, se determinó que la quinasa Rim15, y no la quinasa Yak1, interviene en su regulación. Más aún, Msn2/4, Gis1 y Sok2, factores de transcripción río abajo de ambas quinasas, participan en la activación del promotor TPK1, y su reclutamiento fue confirmado por experimentos de ChIP. Por otra parte, el estudio de la respuesta de los promotores al crecimiento en glicerol (metabolismo oxidativo), indicó un marcado incremento de la actividad, respecto al crecimiento en glucosa (metabolismo fermentativo). El uso de mutantes de deleción de genes que codifican para proteínas que participan en la transducción de la señal de fuente de carbono permitió identificar al factor de transcripción Mig1 como represor de los promotores TPK1 y TPK2; a Mig2 como represor de los promotores de TPK2 y BCY1, y a Mig3 como represor del promotor de BCY1. Se corroboró la presencia de Mig1 en el promotor TPK1 transcripcionalmente activo mediante ensayos de ChIP. La quinasa Snf1y sus efectores río abajo, los factores de transcripción Cat8 y Sip4, que cumplen un rol importante en la respuesta al hambreado de glucosa, regulan la actividad de los cuatro promotores en presencia de esta fuente de carbono. Teniendo en cuenta que la PKA está implicada en numerosas vías de transducción de señales, y habiendo corroborado que las vías de respuesta a estrés y a fuente de carbono regulan la actividad de los promotores de los genes de sus subunidades, se realizó un estudio a nivel genómico a través del empleo de tecnología robótica (técnica Reporter-Synthetic Genetic Array), con el objetivo de identificar de forma global nuevos reguladores de la transcripción. Este estudio se llevó a cabo con células crecidas en fuente de carbono fermentable. Este análisis masivo permitió identificar distintas vías que regulan diferencialmente la actividad de los cuatro promotores de las subunidades de PKA. Los reguladores identificados fueron clasificados según la base Gene Ontology para determinar el enriquecimiento en distintas categorías. Distintos genes asociados a las categorías de transcripción, función mitocondrial, función vacuolar y metabolismo de fosfato afectan la actividad de los cuatro promotores. A su vez se identificaron también genes pertenecientes a distintas categorías regulatorias que no son compartidas por los promotores, como metabolismo de lípidos, que afecta la transcripción de TPK1, TPK2 y TPK3. Fue llamativo además, que dentro de una misma categoría que surgió como reguladora de los cuatro promotores, los genes identificados son diferentes para cada subunidad de PKA. Del análisis surgieron también los metabolitos inositol, polifosfatos de inositol, colina y fosfato como señales que regulan la transcripción de los genes de las subunidades de PKA. De este trabajo se desprende que muchos de los blancos de fosforilación conocidos de PKA que forman parte de estas rutas metabólicas, juegan a su vez un rol en la regulación transcripcional de sus subunidades, sugiriendo la posibilidad de una regulación recíproca en la que PKA coordinaría diferentes vías de señalización y estos procesos a su vez regularían la expresión de la quinasa. Este concepto está además en relación con los resultados de la primera parte del trabajo, que muestran una regulación inhibitoria de los promotores de PKA por la propia actividad de la quinasa. Como conclusión general se puede afirmar que la regulación diferencial de la expresión de las subunidades que conforman la quinasa dependiente de cAMP juega un rol importante en la determinación de la especificidad de la respuesta en el camino de señalización cAMP-PKA.

Abstract:
Yeast cells must maintain a specific and delicate balance of their internal physiology to the optimal growth and function. Variations in the environment conditions can result in a variety of cellular perturbations that break the cellular internal equilibrium, and the cells use myriad strategies to maintain these internal conditions in the face of variable and often harsh external. The yeast Saccharomyces cerevisiae has evolved sensing systems and complex signaling pathways to efficiently respond to drastic and abruptly variations in the external environment, as fluctuations of the temperature, osmolarity, acidity, presence of toxics compounds, and large periods of starvation. When environmental conditions change abruptly, the cell must rapidly adjust its genomic expression program to adapt to the new conditions. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the cAMP dependent protein kinase A (PKA) controls a wide variety of cellular processes. Yeast PKA consists in a heterotetramer with two catalytic (C) subunits encoded by the TPK1, TPK2 and TPK3 genes, and a dimer of regulatory (R) subunit encoded by the BCY1 gene. One of the best described stimuli activating the PKA is the presence of a fermentable carbon source in the growth medium; while it is necessary to inactivate PKA to allow the switch from fermentative to respiratory metabolism to occur, and to respond to heat and osmotic stress. In general, the specificity of the response to numerous stimuli is determined by several factors as the local cAMP concentration, the expression levels of the kinase and its substrates, the presence or absence of scaffold proteins which limit the interaction among the kinase and its substrates, and the sequence around the phosphorylation site in the substrate. Little is known about the expression levels of the genes encoding PKA subunits. The aim of this work was to characterize the regulation of the promoters transcriptional activity of the genes encoding the subunits of PKA in different growth conditions, including different carbon source and stress, as well as the globally identification of novel metabolic pathways and specific proteins that act as regulators of the PKA subunits transcription. As a first step, employing the reporter gene approach and measuring mRNA levels we determined that the expression level of PKA subunit promoters is different during the growth curve, having TPK1 the highest, then TPK2 and TPK3, and belonging to BCY1 the lowest one. Taking advantage of mutant strains that exhibit a deregulated activity of PKA, or a null activity of PKA, we described the negative isoform-dependent autoregulatory behavior of the enzyme in the expression regulation of its own genes. In heat and osmotic stress conditions, only TPK1 promoter is activated. Employing several strains with simple deletions of genes involved in the heat stress response, we determined that the kinase Rim15 and not the kinase Yak1, participates in TPK1 regulation. Moreover, Msn2, Msn4, Gis1 and Sok2, which are transcription factors downstream of both Rim15 and Yak1 kinases, contribute to the upregulation of TPK1 promoter, and ChIP assays revealed its presence on the promoter. On the other hand, the study of the promoters activity in the presence of glycerol as carbon source (respiratory metabolism), showed a marked increment in the promoters activity in comparison with the growth in glucose (fermentative metabolism). Using deletion mutants of proteins involved in the carbon source signal transduction pathway, we identify the Mig1 transcription factor as a repressor of the TPK1 and TPK2 promoters; Mig2, as a repressor of TPK2 and BCY1 promoters, and Mig3, as a repressor of BCY1 promoter. By ChIP assays we corroborate the presence of Mig1 on the transcriptionally active TPK1 promoter. The kinase Snf1, and its downstream effectors, the transcription factors Cat8 and Sip4, all of them having an important role under glucose starvation, regulate the activity of the four PKA subunits promoters in the presence of this carbon source. Taking into account the implication of PKA in several transduction pathways, and that the heat stress response pathway and the carbon source pathway are implicated in the regulation of the activity of the promoters of the genes encoding PKA subunits, we carried out a genomic study using robotic technology (Reporter-Synthetic Genetic Array technique), with the aim of globally identify novel regulators of the transcription. This study was performed with cells grown in fermentable carbon source. The massive analysis let us discovering distinct pathways that differentially regulate the activity of the four promoters of the PKA subunits. The identified regulators were classified according to Gene Ontology database to determine enrichment in categories. Distinct genes belonging to transcription, mitochondria functioning, vacuolar functioning and phosphate metabolism affected the activity of the four promoters. Besides we identified genes in different regulatory categories which are not shared by the four promoters, as lipid metabolism which affects the TPK1, TPK2 and TPK3 transcription. Moreover the list of genes belonging to categories regulating the four promoters is not equal. Further characterization of the results pointed to inositol and inositol polyphosphates, choline and phosphate as novel upstream signals that regulate transcription of PKA subunit genes. In general, from this work we conclude that many of the known targets of PKA phosphorylation are associated with the transcriptional regulation of PKA subunits, opening the possibility of a reciprocal regulation in which PKA would be coordinating different metabolic pathways and these processes would in turn, regulate expression of the kinase subunits. This concept is in concordance with the results of the first part of this work that showed an inhibitory regulation of the PKA promoters by its own kinase activity. The overall conclusion is that the differential expression regulation of the PKA subunits plays an important role in determining the specificity of the response in the cAMP-PKA signaling transduction pathway.

Questa, María. "Efectos del cultivo hipóxico sobre la reprogramación de fibroblastos humanos a células madre pluripotentes inducidas" (2015-10-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células somáticas pueden ser reprogramadas a células pluripotentes denominadas Células Madre Pluripotentes Inducidas (CMPi) y éstas, a su vez, pueden diferenciarse a cualquier tipo celular adulto. Esto es de gran importancia en los campos de la medicina regenerativa, las pruebas farmacológicas in vitro y la investigación de trastornos genéticos, dado que pueden obtenerse células pluripotentes sin enfrentar la barrera ética de la manipulación de embriones y con el valor agregado de ser genéticamente idénticas al donante de células somáticas. Por lo tanto, el estudio del proceso de reprogramación se ha vuelto cada vez más importante para mejorar los métodos en eficiencia, rapidez y seguridad. Teniendo en cuenta su interacción con factores de transcripción implicados en el estado pluripotente de la célula, los factores inducibles por hipoxia, HIF por su sigla en inglés, podrían ser de interés en el proceso de reprogramación. En el presente trabajo hemos aislado distintos tipos de células somáticas humanas, como fibroblastos, queratinocitos y células mononucleares de sangre periférica, los hemos cultivado, y hemos intentado reprogramarlos. Además estudiamos distintas condiciones de generación de CMPi, utilizando distintos vectores necesarios para la reprogramación, moléculas que modifican la estructura de la cromatina como Ácido Valproico y Butirato de Sodio, y diferentes protocolos, hasta llegar a un método confiable y reproducible. A partir de ello, hemos generado CMPi en condiciones de normoxia e hipoxia, y posteriormente las hemos cultivado a largo plazo también en ambas condiciones. Hemos validado la legitimidad bona fide de las líneas celulares generadas, evaluando la expresión de genes marcadores de estado indiferenciado y por otra parte, la pluripotencia, mediante protocolos de diferenciación in vitro, e in vivo, por formación de teratomas. Asimismo, encontramos que ambas líneas exhiben características morfológicas y proliferativas, y patrones de metilación del ADN propios de células madre pluripotentes. Estudiamos además el comportamiento de las líneas celulares en cultivo en cuanto a eficiencia de reprogramación, expresión de factores del estado pluripotente, proliferación y apoptosis. Encontramos que la hipoxia aumentó la cantidad de colonias generadas pero éstas resultaron más pequeñas en tamaño, en comparación con las colonias generadas en normoxia. Además, fue menor la expresión de marcadores del estado pluripotente en colonias de CMPi evaluadas en estadios tempranos luego de ser establecidas en hipoxia, que en las colonias generadas en normoxia. Esta expresión no aumentó cuando las colonias fueron establecidas y cultivadas a largo plazo, y luego expuestas a hipoxia aguda, pero se indujo después de una hipoxia crónica. Por otro lado, encontramos una mayor tasa de proliferación celular en CMPi cultivadas en hipoxia sin diferencias en los niveles de apoptosis. Finalmente, a fin de sentar las bases para la continuación del proyecto, generamos vectores retrovirales para poder introducir los genes de los factores HIF-1α y HIF-2α en células a reprogramar, junto con los vectores de reprogramación. Los factores HIF clonados en los plásmidos retrovirales fueron wild type y también formas mutadas que le confieren a las proteínas HIF una mayor estabilidad, y en algunos casos también una mayor capacidad de activación de la transcripción. En último lugar, investigamos el efecto de los vectores generados, en células somáticas plausibles de ser reprogramadas, y encontramos un posible efecto tóxico, probablemente debido a la acumulación de altas cantidades de proteína HIF en la célula, o de una actividad transcripcional de los genes blanco tan alta que conlleva muerte celular. Dado que la expresión del gen introducido por el vector retroviral se puede controlar debido a que utilizamos un sistema modulable Tet-Off, encontramos que un tratamiento con el agente represor disminuye la muerte celular, y podría ser necesario a la hora de co-transducir con estos vectores y los vectores de reprogramación. Esperamos que los resultados y las herramientas generadas en este trabajo contribuyan a la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la reprogramación y al desarrollo de protocolos para la generación de CMPi de alta calidad y con alta eficiencia. PALABRAS CLAVE células madre, células madre embrionarias humanas, células madre pluripotentes inducidas, hipoxia celular, reprogramación nuclear, pluripotencia, estado pluripotente, diferenciación

Abstract:
Somatic cells can be reprogrammed into pluripotent cells called Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) and these, in turn, can be differentiated into adult cell type. This is of great importance in the fields of regenerative medicine, pharmacological in vitro testing and genetic disorder research, as pluripotent stem cells can now be obtained without facing the ethical barrier of embryo manipulation, and with the added value that these are genetically identical to the somatic cell donor. Hence, through the study of the reprogramming process itself, it has become increasingly important to improve reprogramming methods in terms of efficiency, speed and safety. Given their interaction with transcription factors involved in stemness, Hypoxia Inducible Factor, HIF, may be of interest in the reprogramming process. In the present work we isolated different types of human somatic cells, like fibroblasts, keratinocytes and peripheral blood mononuclear cells, we have cultured them and tried to reprogram them. Moreover, we have studied different conditions for the generation of iPSC, using different vector necessary for reprogramming, molecules that modify the structure of chromatin like Valproic Acid and Sodium Butyrate, and different protocols, until we obtained a reliable and reproducible method. Based on this, we have generated iPSC in normoxia and in hypoxia, and subsequently cultured them long-term in both conditions as well. We validated the bona fide legitimacy of the cell lines generated, by evaluating the expression of stemness marker genes and, on the other hand, by evaluating pluripotency, through in vitro differentiation protocols, and in vivo, by teratoma formation. Also, we have found that both lines exhibited morphological and proliferative characteristics and DNA methylation patterns typical of pluripotent stem cells. Furthermore, we studied the cell lines’ behavior in culture regarding reprogramming efficiency, expression of stemness factors, proliferation and apoptosis. We found that hypoxia increased the amount of colonies generated but these turned out to be smaller in size, when compared to colonies generated in normoxia. Moreover, stemness marker expression was lower in iPSC colonies evaluated in early stages after being established in hypoxia, than in colonies established in normoxia. This expression did not increase when colonies were established and cultured in the long-term, and then exposed to acute hypoxia. Nevertheless, these markers’ expression was up-regulated after chronic hypoxic culture. In addition, we also found a higher proliferation rate for stem cells in hypoxia and no differences in apoptosis levels. Finally, in order to provide a continuation to the project, we generated retroviral vectors to be able to introduce HIF-1α and HIF-2α genes in cells to be reprogrammed, together with the reprogramming vectors. The HIF cloned in the retroviral plasmids were wild type and also mutated forms, which provide the HIF proteins with more stability and in some cases, also increased transcriptional activation ability. Lastly, we investigated the effect of these vectors, on somatic cells capable of being reprogrammed, and we found a possible toxic effect, probably due to the accumulation of high amounts of HIF proteins in the cell, or such a an elevated target gene transcriptional activity, that it generated cell death. Given the fact that the gene introduced by the retroviral vector can be controlled, since we used a modulable Tet-Off system, we found that a treatment with the repressor agent decreases cell death, and might be necessary for the co-transduction with these vectors and the reprogramming vectors. We hope that the results obtained and the tools generated in this work will contribute to the understanding of the molecular mechanisms involved in reprogramming, and to the development of high quality and highly efficient iPSC generation protocols. KEYWORDS stem cells, human embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, cell hypoxia, nuclear reprogramming, pluripotency, stemness, differentiation

Serer, María Inés. "Estudio de la Síntesis de flavinas en Brucella abortus como potencial blanco terapéutico contra la brucelosis" (2015-11-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los miembros del género Brucella son bacterias Gram-negativas intracelulares facultativas que se adaptan a la vida intracelular en una gran variedad de mamíferos. Brucella spp causan brucelosis, la zoonosis de mayor incidencia en el mundo que afecta al ganado y a humanos, y para la cual aún no se dispone de una vacuna segura y confiable. A pesar de que Brucella no presenta factores de virulencia clásicos, exhibe una gran flexibilidad metabólica la cual le permite adaptar su fisiología en respuesta a los distintos microambientes encontrados durante su ciclo de vida intracelular. Esta adaptación fisiológica se basa en un ágil ajuste de la expresión de distintos subconjuntos de genes, entre los que se encuentran aquellos involucrados en el metabolismo de flavinas. La riboflavina (vitamina B2) es el precursor de FMN y FAD, dos cofactores esenciales que están implicados en una amplia variedad de procesos celulares en todos los organismos. Esta vitamina es sintetizada en microorganismos y plantas, pero no en humanos y animales, los cuales deben adquirirla a través de su dieta. Los dos últimos pasos de la biosíntesis de riboflavina son catalizados por las enzimas Lumazina Sintasa (LS) y Riboflavina Sintasa (RS). Debido a la ausencia de esta vía metabólica en animales y el hecho de que las bacterias patógenas muestran una estricta dependencia de su biosíntesis de riboflavina, se ha propuesto a LS y RS como dianas potenciales para el desarrollo de fármacos antimicrobianos. En este trabajo se presentan datos que sugieren una regulación diferencial de los genes involucrados en la biosíntesis de riboflavina en B. abortus. Asimismo, se resolvió la estructura cristalográfica de RS de B. abortus unida al producto de reacción riboflavina y a dos análogos de producto. Para complementar estos resultados, se realizaron también estudios cinéticos y de unión sobre RS; y se llevó a cabo un ensayo de high throughput screening de microelectroforesis capilar de una biblioteca de 44.000 compuestos en colaboración con la empresa farmacéutica Novartis en Suiza. A partir de éste se identificaron diez compuestos con potencia micromolar del cual se identificó una serie de cinco compuestos con actividad in vivo contra B. abortus en cultivo bacteriano. En conclusión, la determinación de nuevas estructuras de RS unida a ligandos, su caracterización bioquímica y el hallazgo de nuevos inhibidores con actividad contra B. abortus in vivo representan un avance en la búsqueda de los antimicrobianos contra la brucelosis.

Abstract:
Brucella spp. are facultative intracellular Gram-negative bacteria, which are adapted to intracellular life within cells of a large variety of mammals. They cause brucellosis, a zoonotic infection with the highest incidence in the world affecting livestock and humans and for which a safe and completely reliable vaccine is still unavailable. Although Brucella has not classical virulence factors, it exhibits high metabolic flexibility, which allows it to adapt its physiology in response to different microenvironments found during its intracellular life cycle. This physiological adaptation is based on a flexible adjust of the expression of different subsets of genes, among which are those involved in the metabolism of flavins. Riboflavin (vitamin B2) is the precursor of FMN and FAD, two essential cofactors for all organisms that are involved in a wide variety of cellular processes. This vitamin is biosynthesized in microorganisms and plants but not in humans and animals, which must acquire it through their diet. The last two steps of riboflavin biosynthesis are catalyzed by Lumazine Synthase (LS) and Riboflavin Synthase (RS). Owing to the absence of this pathway in animals and the fact that most pathogenic bacteria show a strict dependence on riboflavin biosynthesis, it has been proposed that these enzymes may be promising targets for the development of new antimicrobial agents for the treatment of brucellosis. In this work, we show data that suggest a differential regulation of genes involved in the biosynthesis of riboflavin in B. abortus. Furthermore, we present the crystallographic structure of RS from B. abortus. In order to describe its substratebinding sites, we solved the structure of the enzyme in the presence of bound ligands, namely one of the products of the reaction (riboflavin) and two product analogues. To complement these findings, we performed kinetic and binding studies on the enzyme. A newly High-throughput Screening capillary electrophoresis assay of 44.000 compounds library was developed in collaboration with Novartis in Switzerland, which identified 10 compounds with micromolar potency. From this subset we identified a series of 5 compounds with in vivo activity against B. abortus. In conclusion, these newly determined structures, biochemical characterization of RS and finding of novel inhibitors with activity against B. abortus represent a progress in the pursuit of antimicrobial compounds against brucellosis.

Mercau, María Elisa. "Mecanismos celulares involucrados en la regulación del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal en un modelo animal de insulinorresistencia inducida por la ingesta de carbohidratos simples" (2016-02-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Diversas evidencias experimentales demostraron que el desarrollo de insulinorresistencia (IR) se acompaña de cambios en la actividad del eje hipotálamo-hipófiso_adrenal (HHA) que se traducen en variaciones en los niveles sanguíneos de glucocorticoides (GC), tanto en pacientes como en modelos animales de la enfermedad. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos un aumento en los niveles de GC en animales tratados con una dieta rica en sacarosa (DRS) durante 7 semanas que se asoció con una respuesta adrenal disminuida en la prueba de estimulación con la hormona adrenocorticotropina (ACTH). Dado que la principal hormona reguladora de la secreción de GC es la ACTH, el objetivo central de este trabajo de tesis consistió en evaluar los efectos de la administración de DRS sobre la producción de ATCH en distintos estadios del dearrollo de IR y estudiar los mecanismos subyacentes a las alteraciones encontradas a nivel adenohipofisario. En ese marco, evaluamos los efectos del tratamiento antioxidante sobre cambios tempranos inducidos por el consumo de DRS y del ejercicio moderado como medida preventiva de los efectos de la exposición prolongada a la dieta. Los resultados obtenidos indicaron que en el modelo animal de IR por la administración de DRS, los animales presentaron cambios en la secreción de ACTH y corticosterona. En etapas tempranas del tratamiento (3 semanas) encontramos un aumento en la actividad del eje HHA, que fue previa a la detección de cambios en la insulinosensibilidad sistémica (evidente a partir de la séptima semana del inicio del consumo de DRS). Sin embargo, en animales tratados por períodos más prolongados (15 semanas) observamos una disminución de los niveles circulantes de ACTH y de corticosterona. Postulamos que la hiperactivación temprana del eje podría estar asociada con la generación de estrés oxidativo a nivel adenohipofisario, dado que el tratamiento antioxidante sistémico previno tanto el aumento de marcadores de este proceso como la hipersecreción de ACTH. La disminución en la actividad del eje HHA detectada en etapas más tardías del tratamiento podría ser consecuencia de la exposición crónica del tejido hipofisario al estrés oxidativo, inducido por concentraciones elevadas de ácidos grasos no esterificados (AGNE) circulantes, un efecto que podría ser medido por la inducción de autofagia. Demostramos que el ejercicio moderado previno la inducción de estos procesos y la inhibición de la secreción de ACTH en animales alimentados con DRS durante 15 semanas, además de evitar el incremento de AGNE. Finalmente, estudiamos con mayor profundidad estos procesos en células adenohipofisarias en cultivo evaluando el efecto de la incubación de células de la línea ArR-20 con ácido palmítico (C16:O) y con inductores de estrés oxidativo y autofagia. En suma, nuestros resultados indican que la administración de una DRS produce un incremento temprano en la expresión de Pomc y ACTH posiblemente mediada por la generación de estrés oxidativo tisular. Una exposición prolongada del tejido a niveles incrementados de nutrientes, como los ácidos grasos, adicionalmente induce el proceso autofágico, lo que lleva a una hipofunción de la glándula. Los GC afectan el metabolismo estimulando la movilización de las reservas energéticas. Sin embargo, un aumento sostenido de los niveles de estas hormonas podría contribuir al agravamiento de las características metabólicas del síndrome de IR, y precipitar la aparición de las complicaciones a largo plazo relacionadas con la enfermedad. En nuestro modelo, el estado de IR crónico se correlacionó con una inhibición de la actividad basal del eje HHA, lo que contribuiría al restablecimiento de la homeostasis metabólica. Sin embargo, también podría dar lugar a complicaciones adicionales, como la insuficiencia adrenal, afectando la respuesta del organismo frente a situaciones de estrés, lo que representaría otro factor de riesgo para los pacientes con IR.

Abstract:
It has been previously described that insulin resistant (IR) individuals (humans and animals) have an altered function of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA), which translates into changes in their blood levels of glucocorticoids (GC). Previous studies from our group have shown that animals fed a sucrose-rich diet (SRD) for 7 weeks exhibit an increase in basal GC secretion, associated with an impairment os adrenal response to an exogenous ACTH challenge. Given that the adrenocorticotropic hormone (ACTH) secreted by the pituitary gland is the main regulator of adrenal function, the main goal of the present study was to analyse the effect of SRD consumption on ACTH production at different stages of the development of IR, and elucidate possible underlying mechanisms operating at pituitary level. In this context, we analyzed the effects of antioxidant treatment on the early changes induced by SRD consumption, and of moderate exercise as a preventive measure to counteract the effects of prolonged exposure to SRD. Our results indicate that in the experimental model of SRD-induced IR, animals present alterations in the production and blood levels of ACTH and corticosterone. In this sense, we observed that SRD treatment induces an early hyperactivation of the HPA axis (3rd week), which was prior to the observed changes in insulin sensitivity (only evident after 7 weeks os treatment). However, as treatment progresses, prolonges SRD-consumption (15 weeks) inhibits basal HPA activity, as evidenced by lower circulating ACTH and corticosterone levels. We propose that the early hyperactivation of the HPA axis found in SRD-treated animals could be associated with the generation of oxidative stress at pituitary level, given that systemic antioxidant treatment prevented the induction of these processes and also ACTH hypersecretion. The impairment in HPA activity induced by long-term SRD treatment (15 weeks), could ba a consequence of chronic overexposure of the pituitary tissue to increased levels of circulating non-esterified fatty acids (NEFA), which could trigger oxidative-stress induced autophagy in ACTH-producing cells. Our results show that moderate exercise prevented the induction of these cellular processes, as well as SRD-induced corticotroph dysfunction, while also normalizing NEFA levels. In order to confirm these results, we studied the underlying mechanisms in cultured corticotrophs by incubating ArT-20 cells in the presence of plamitic acid (C16:O), a main component of the NEFA fraction, or with oxidative stress and autophagy inductors. From these studies we concluded that oxidative stress generation and autophagy mediate POMC inhibition triggered by palmitic acid treatment. Taken together, our results show that SRD administration induces an early increase in Pomc expression and ACTH release, possibly mediated by an increase in oxidative stress at pituitary level. Chronic exposure of pituitary tissue to an increased concentration of nutrients (e.g. fatty acids, among others) additionally induces autophagy in corticotroph cells, which could lead to inhibition of ACTH production. Among other actions, GC affect metabolism by stimulating the mobilization of energy stores in order to cope with increased metabolic demands. However, a sustained increase in circulating GC levels could contribute to aggravate the clinical manifestations of metabolic syndrome. In our animal model, chronic IR correlated with inhibition of basal HPA axis activity, which could help to restore metabolic homeostasis. However, this could also lead to complications, such as adrenal insufficiency, that might affect the response to stressful stimuli, representing an additional risk for patients with IR.

Título :	Mecanismos celulares involucrados en la regulación del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal en un modelo animal de insulinorresistencia inducida por la ingesta de carbohidratos simples = Cellular mechanisms involved in the regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in a animal model of sucrose-induced insulin resistance
Autor :	Mercau, María Elisa
Director :	Cymeryng, Cora B.
Consejero de estudios :	Pecci, Adalí
Jurados :	Silberstein, Susana I. ; Perone, Marcelo J. ; Giovambattista, Andrés
Año :	2016-02-22
Editor :	Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación :	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Bioquímica Humana. Laboratorio de Endocrinología Molecular Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO)
Grado obtenido :	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación :	Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5865_Mercau
Idioma :	Español
Area Temática :	Química / Química Biológica Biología / Endocrinología
Palabras claves :	INSULINORRESISTENCIA; EJE HIPOTALAMO-HIPOFISO-ADRENAL; ACTH (ADRENOCORTICOTROFINA); POMC (PROOPIOMELANOCORTINA); CORTICOSTERONA; ESTRES OXIDATIVO; MACROFAGOS; ESTRES DE RETICULO ENDOPLASMATICO; AUTOFAGIA; CELULAS ATT-20; ACIDO PALMITICO; TRATAMIENTOS ANTIOXIDANTES; MELATONINA; ACIDO ALFA-LIPOICO; EJERCICIO MODERADO; INSULIN RESISTANCE; HYPOTHALAMIC-PITUITARY-ADRENAL AXIS; ACTH (CORTICOTROPIN HORMONE); POMC (PROOPIOMELANOCORTIN); CORTICOSTERONE; OXIDATIVE STRESS; MACROPHAGES; ER STRESS; AUTOPHAGY; ATT-20 CELLS; PALMITIC ACID; ANTIOXIDANT TREATMENT; MELATONIN; ALFA LIPOIC ACID; MODERATE EXERCISE
URL al Documento :	http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_5865_Mercau.pdf
URL al Registro :	http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5865_Mercau

Sabbione, Florencia. "Propiedades inmunomodulatorias de las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs)" (2016-03-04) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La injuria pulmonar produce la liberación de ácido úrico que, a concentraciones locales elevadas, precipita formando cristales de urato monosódico (MSU). Estos cristales producen una considerable inflamación asociada a infiltración neutrofílica. Luego de la estimulación con MSU, los neutrófilos liberan trampas extracelulares (NETs), compuestas por cromatina y proteínas granulares, nucleares y citoplasmáticas asociadas. En este trabajo se estudió si las NETs inducidas por MSU (NETs-MSU), poseen propiedades inmunoregulatorias tanto sobre células epiteliales pulmonares como sobre otras células del sistema inmune innato como células dendríticas y macrófagos. Se observó que las NETs-MSU incrementaron significativamente la secreción de interleuquina (IL) 8 e IL-6 por células epiteliales pulmonares y bronquiales. Estos efectos no fueron reproducidos por sobrenadantes de neutrófilos estimulados con MSU en presencia de inhibidores de la netosis, como un inhibidor de elastasa o el inhibidor de la NADPH oxidasa DPI. Las NETs-MSU no afectaron la viabilidad de las células epiteliales, ni su morfología, como tampoco la integridad de la barrera epitelial formada por células epiteliales polarizadas. La capacidad estimulatoria de citoquinas de las NETs no fue afectada por la degradación del ADN con nucleasa micrococal, ni tampoco por el tratamiento de las mismas con heparina o cuando la actividad de la elastasa asociada a las NETs fue bloqueada con un inhibidor. Sin embargo, el efecto observado fue revertido al tratar a las NETs con un anticuerpo bloqueante de la proteína del grupo de alta movilidad (HMGB1). El efecto proinflamatorio de las NETs se observó también en macrófagos humanos derivados de monocitos pero no en células dendríticas derivadas de monocitos, indicando que las propiedades proinflamatorias de las NETs-MSU son específicas de ciertos tipos celulares. En conjunto, los resultados de esta tesis indican que las NETs inducidas por MSU inducen efectos proinflamatorios en células de las vías respiratorias, que podrían contribuir al reclutamiento de neutrófilos in vivo y a la perpetuación de la inflamación y al daño del tejido pulmonar. Nuestros hallazgos podrían ser relevantes para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una inflamación marcada del tracto respiratorio, como la fibrosis quística y el daño pulmonar agudo (ALI). En estas patologías, a pesar de haberse corroborado la presencia de grandes cantidades de NETs en el tracto respiratorio, el tratamiento con DNasas no logra resolver el cuadro inflamatorio. Los resultados de este trabajo de tesis, indicando que el tratamiento de las NETs con MNasa no reduce su capacidad proinflamatoria permiten especular que tratamientos tendientes a limitar la producción de las NETs o a bloquear a la molécula HMGB1, podrían representar opciones terapéuticas más apropiadas a fin de mitigar la inflamación que acompaña a estas patologías.

Abstract:
Lung tissue injury leads to the release of uric acid which at high local concentrations forms monosodium urate crystals (MSU). These crystals trigger robust neutrophilic inflammation. Upon MSU stimulation, neutrophils release extracellular traps (NET) composed by chromatin and antimicrobial proteins associated. Here we investigated whether MSU-induced NET could be involved in the development of inflammation by stimulating cytokine release by airway epithelial cells and other relevant innate immune cells such as dendritic cells and macrophages. We found that MSU-induced NET significantly increased the secretion of IL-8 and IL-6 by lung and bronchial epithelial cells. These effects were not observed when NETosis was impaired by Diphenyleneiodonium or elastase inhibitor. Furthermore, NET did not affect the viability of airway epithelial cells, neither did they modify their morphology nor the barrier integrity of polarized cells. The epithelial stimulatory capacity of NET was not affected by degradation of DNA with micrococcal nuclease (MNase), treatment of NET with heparin or inhibition of the elastase immobilized to DNA, but was significantly reduced by pretreatment of NET with an anti-high mobility group box-1 blocking antibody (HMGB1). Additionally this proinflammatory effect was also observed in human monocyte- derived macrophages and not in human monocyte-derived dendritic cells. This indicates that the proinflammatory response is restricted to certain cell types. Altogether, our findings indicate that MSU-induced NET exert direct proinflammatory effects on airway epithelial cells that might contribute in vivo to further recruitment of neutrophils and perpetuation of inflammation upon lung tissue damage. These results could be relevant for treatment of pulmonary inflammatory pathologies, like cystic fibrosis and acute lung injury (ALI). Despite the fact that it has been proved the presence of large amounts of NET in these diseases, the current treatment with DNases does not resolve the associated inflammation. Our findings indicating that MNase treatment does not reduce the inflammatory capacity of NET suggest that treatments with NETosis inhibitors or HMGB1 blocking antibodies could be relevant therapeutics options to mitigate the inflammation in these pathologies.

De Rossi, María Cecilia. "Dinámica y transporte de organelas en células vivas estudiados por técnicas de partícula única" (2016-03-17) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La organización intracelular depende de motores moleculares, proteínas que transportan diversos componentes celulares con una alta precisión espacio-temporal. En los últimos años, el desarrollo de nuevas técnicas de molécula y partícula única aplicadas a motores aislados han provisto información valiosa sobre las propiedades biomecánicas de estas proteínas. Sin embargo, el mecanismo de acción de las mismas en las células aún se desconoce. El objetivo general del presente trabajo es comprender los principios que gobiernan la dinámica de organelas en células vivas. Utilizando técnicas avanzadas de microscopía y de seguimiento de partícula única, estudiamos los procesos difusivos y activos que experimentan las organelas en el entorno citoplasmático. Por un lado, exploramos cómo diversos componentes del citoesqueleto influyen en el transporte conducido por motores moleculares en la célula. En una segunda instancia, evaluamos cómo se ve afectada la dinámica del transporte bidireccional al variar las propiedades biofísicas de los motores moleculares involucrados. Los resultados obtenidos nos permitieron construir un modelo teórico para comprender ciertos aspectos claves del transporte activo en células vivas.

Abstract:
Molecular motors transport a wide variety of cellular components in the cytoplasm with high spatio-temporal accuracy ensuring the correct organization within the cell. In recent years, the development of new single molecule and single particle techniques applied to isolated motors have provided valuable information on the biomechanical properties of these proteins. However, the mechanism of action of motors in living cells is still poorly understood. The aim of this study was to understand the principles that govern the intracellular dynamics of organelles in living cells. We used advanced optical microscopy and single particle tracking techniques to study the diffusive and active processes experienced by organelles in the complex cytoplasmic environment. First, we explored how different cytoskeleton components influence the transport driven by molecular motors in the cell. Then, we assessed how the biophysical properties of molecular motors affect the dynamics of transport. The obtained results allowed us to construct a theoretical model to understand certain key aspects of transport in living cells.

Lanzarotti, Esteban. "Herramientas bioinformáticas para la predicción y análisis de estructuras de proteínas: de genomas a motivos estructurales" (2016-03-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Durante la última decada, varios estudios han mostrado que la anotación automática de genomas resuelve muy bien el problema de recuperar informaci ón a partir de una secuenciación. A su vez, esto favoreció el crecimiento desmedido en la cantidad de genomas depositados en bases de datos que poseen una anotación automática, para los cuales se volvería imposible realizar experimentos sobre cada uno de los genes presentes en éstos genomas de manera de mejorar el conocimiento disponible. Es por esto que, obtener una estructura molde para construir un modelo 3D de una determinada secuencia, es una herramienta poderosa para entender las funciones de las proteínas. Una vez modelada la estructura, las interacciones presentes en ella aportan información de la función proteica. En esta tesis desarrollamos un pipeline bioinformático que a partir de la secuencia de un genoma bacteriano puede identificar las regiones codificantes, anotar su función y computa diversas propiedades de las proteínas codificadas. En una segunda etapa desarrollamos un pipeline de predicción de estructura secundaria y terciaria de proteínas que se integró con el sistema anterior. Finalmente, mediante el desarrollo de una base de datos de interacciones de amino ácidos basada en el PDB, estudiamos en detalle las interacciones aromáticas. Los anillos aromáticos forman clusters de interacciones que tienen particularidades que difieren según hayan sido encontrados en el interior de las proteínas o regiones de interacción proteína-ligando o interfaces de interacción proteína-proteína.

Abstract:
During the last decade, numerous studies have shown that automatic genome anotation performs quiet well in solving the problem of information retrieval from sequenced genomes. Also, this has favored an excesive growth of deposited (automatically) anotated genomes, which is imposible to design experiments over each of these genes present in each genome in order to improve the available knowledge. For this reason, obtaining a template structure to build a 3D model for a fixed sequence, is a powerful tool to understand protein functions. Once obtained the structure, the interactions involved in it, bring information about protein function. In this thesis we developed a bioinformatic pipeline which from a genomic sequence, identifies coding regions, anotates their functions and computes diverse properties. In a second stage, we developed a pipeline for prediction of protein secondary and tertiary structure, which was integrated to the previous system. Finally, by developing a structural database of amino acid interactions based ob PDB, we studied in detail aromatic interactions. Aromatics clusters have features that difer according they have been found i) in the core of the protein, ii) in small ligand binding regions and, iii) protein-protein interaction interfaces.

Sánchez, Melisa Celeste. "La descondensación de la cromatina de espermatozoides de mamíferos: estudio de su mecanismo molecular y su posible utilidad como bioindicador del efecto de disruptores endócrinos" (2016-03-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
A diferencia de las células somáticas, el espermatozoide posee su cromatina empaquetada principalmente por protaminas en lugar de histonas. Las cisteínas presentes en las protaminas forman puentes disulfuro intra e intercatenarios, lo que le proporciona al núcleo espermático gran estabilidad y resistencia para poder atravesar el tracto masculino, el femenino y llegar con su ADN intacto hasta el sitio de fecundación. Luego que el espermatozoide penetra el oocito es imprescindible que se produzca la descondensación de su cromatina para que se reemplacen las protaminas espermáticas por histonas oocitarias. La descondensación de la cromatina involucra dos eventos: se deben reducir los puentes disulfuro (tiorreducción) y removerse las protaminas. Las moléculas involucradas en estos procesos serían el glutatión reducido (GSH) y el heparán sulfato (HS) oocitarios. Cuando este proceso de condensación de la cromatina, que ocurre durante la espermatogénesis para mantener la integridad del espermatozoide, se ve afectado por diversas causas, puede resultar en fallas de la descondensación que se evidencian una vez que el oocito es penetrado. Por otro lado, es sabido que la exposición a tóxicos ambientales puede provocar efectos deletéreos sobre la calidad de los espermatozoides y la fertilidad masculina. Las técnicas de reproducción asistida han podido resolver problemas de motilidad, defectos espermáticos, concentración de gametas muy reducida en el fluido seminal (oligozoospermia) pero todavía no pueden solucionar los defectos de la descondensación del núcleo espermático dentro del oocito. Esto pone en evidencia la importancia del proceso de descondensación, que no puede ser reemplazado por las técnicas de reproducción asistida, y permite pensar en utilizarlo como un posible indicador del efecto de disruptores endocrinos, tanto in vivo como in vitro. Los objetivos de esta tesis fueron (1) avanzar en el estudio del mecanismo de la descondensación de la cromatina de espermatozoides, así como también en su (2) rol como posible bioindicador de efectos deletéreos causados por tóxicos ambientales o ingeridos, tales como el alcohol y el plaguicida endosulfán. En primer lugar, fue posible caracterizar el sistema de descondensación in vitro en el modelo de ratón al coincubar los espermatozoides con distintos glicosaminoglicanos y GSH, determinándose de esta manera las moléculas candidatas a ser posibles agentes descondensantes, las concentraciones y tiempos óptimos de incubación. Como consecuencia de esto, fue posible detectar un efecto sinérgico existente entre la heparina (utilizada como equivalente molecular del heparán sulfato) y el dermatán sulfato, los únicos glicosaminoglicanos estudiados con potencial capacidad descondensante. El efecto de estos dos glicosaminoglicanos también fue evaluado mediante la técnica de microscopia electrónica de transmisión, la cual puso en evidencia los cambios sufridos por los espermatozoides durante el proceso de descondensación. Una vez caracterizado el sistema, se logró evidenciar el aumento de la descondensación in vitro que ocurre cuando se incuban los espermatozoides con endosulfán o etanol, como también luego de la ingesta de etanol. Además, fue posible evaluar el efecto del plaguicida sobre la fragmentación del ADN, así como también si existe alguna correlación entre la misma y la descondensación de la cromatina. Los efectos del etanol observados in vitro fueron confirmados en experimentos in vivo, en los cuales se intoxicaron ratones macho para realizar experimentos de fecundación in vitro. Estos son los primeros resultados obtenidos descondensando in vitro en presencia de heparina y GSH, espermatozoides previamente incubados con endosulfán o etanol, que ponen de manifiesto que este ensayo podría utilizarse como centinela para evaluar posibles efectos de tóxicos ambientales o ingeridos.

Abstract:
In contrast to somatic cells, sperm has its DNA packed mainly by protamines rather than histones. The presence of cystein in protamines allows for the formation of intra and interchain disulfide bonds, giving great stability and resistance to the sperm nucleus, enabling it to travel through the male and female reproductive tracts and reach the site of fertilization with its DNA intact. An essential step, once the sperm enters the oocyte, is the decondensation of its chromatin by replacing sperm protamines by oocyte histones. Chromatin decondensation involves two events: disulfide bridges should be reduced (thio-reduction) and the protamines removed. The molecules involved in these processes in vivo would be reduced Glutathione (GSH) and heparan sulfate (HS) present in the oocyte. When this process of chromatin condensation, which occurs during spermatogenesis to maintain the integrity of sperm, is affected by various causes, decondensation failure may result following oocyte penetration at fertilization. It is also well known that exposure to a toxic environment can cause deletereous effects on sperm quality and male fertility. Assisted reproduction techniques have been successful in solving problems of motility, various sperm defects, very low concentration of gametes in seminal fluid (oligozoospermy) but still cannot solve the shortcomings of the decondensation of the sperm nucleus within the oocyte. This highlights the importance of the decondensation process, which cannot be replaced by assisted reproduction techniques and led us to think of its possible use as a bioindicator of the effect of endocrine disruptors, both in vivo and in vitro. The objectives of this thesis were (1) to advance in the study of the mechanism of sperm chromatin decondensation as well as (2) its role as a possible bioindicator of environmental toxicity caused by toxic agents, such as alcohol and the pesticide endosulfán. First, it was possible to characterize the process of decondensation in vitro in the mouse by incubating sperm with different glycosaminoglycans and GSH, which led us to identify molecules which could behave as putative decondensing agents, concentrations and optimal incubation times. Subsequently, it was possible to detect a synergistic effect between heparin (as a substitute for heparan sulfate) and dermatan sulfate, the only glycosaminoglycans studied with potential to decondense the sperm nucleus in vitro. The effect of these two glycosaminoglycans was also evaluated on sperm morphology and ultrastructure through transmission electron microscopy, which allowed us to visualize the changes suffered by sperm during the decondensation process. Once the system was characterized, we were able to demonstrate the increase in in vitro decondensation that occurs when sperm are incubated with endosulfán or ethanol, as well as after ethanol ingestion. In addition, it was possible to assess the effect of this pesticide on DNA fragmentation as well as its possible correlation to chromatin decondensation. The alcohol effects observed in vitro were confirmed with in vivo experiments in which male mice were intoxicated and their sperm subsequently used to perform in vitro fertilization. These are, to our knowledge, the first results obtained decondensing in vitro in the presence of heparin and GSH, sperm previously incubated with endosulfán or ethanol, suggesting that the sperm decondensation assay could be used as sentinel to evaluate possible effects of environmental or ingested toxic agents.

Parra, Rodrigo Gonzalo. "Estructuras, simetrías y paisajes energéticos en la familia de proteínas con repeticiones de Ankirina" (2016-03-23) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas repetitivas están compuestas por repeticiones en tándem de motivos estructurales. Estas unidades interaccionan entre sí de forma tal que coalescen en arquitecturas del tipo solenoidal o toroidal. Por su simplicidad topológica constituyen modelos útiles para el estudio del plegado de proteínas. Esta tesis se centra en el estudio de los miembros de la familia de proteínas con repeticiones de Ankirina (ANKs) que contienen entre 3 y 34 copias de un motivo de 33 residuos de largo. Siendo principalmente descriptas como mediadoras de interacciones proteína-proteína, las ANKs poseen una versatilidad para el reconocimiento de otras moléculas comparable a la de los anticuerpos. A pesar de su simplicidad estructural, las proteínas repetitivas presentan varios desafíos inherentes a su no globularidad. Las repeticiones pueden ser muy degeneradas en sus secuencias dificultando la deteccióon y definición de límites entre ellas, siendo este un problema aún no resuelto en este campo de estudio. Dado que las estructuras están mucho más conservadas que las secuencias, hemos desarrollado un método, llamado Teselado proteico" capaz de detectar repeticiones estructurales de forma objetiva, rigurosa y eficiente. Dicho algoritmo es independiente de la secuencia de las moléculas analizadas y es además generalizable a todos los tipos de proteínas repetitivas. Su aplicación a distintas clases de proteínas nos permitió caracterizar sus periodicidades y espectro de simetrías. Hemos aplicado nuestro algoritmo a todos los miembros de la familia ANK. Haciendo uso de nociones de la teoría de paisajes energéticos y con la hipótesis de que las repeticiones constituyen unidades de plegado, fuimos capaces de definir el largo y la fase de las repeticiones en todos los casos. Este estudio representa el primer caso reportado en que una estrategia de anotación de las unidades repetitivas consistente es aplicada a lo largo de toda una familia, lo cual permite realizar análisis comparativos al nivel de las repeticiones individuales. Los análisis subsiguientes muestran que las repeticiones ANKs pueden clasificarse en 3 tipos diferentes que corresponden a las repeticiones ubicadas en la región N-terminal, interna o C-terminal. Cada tipo de repetición muestra patrones de conservación en secuencia y en su energía de plegado específicos de su tipo. Pudimos observar además que los niveles de conservación de la secuencia y de la energía de plegado se encuentran correlacionados de forma lineal y positiva, lo cual indica que aquellas secuencias parecidas al consenso que se obtiene a partir del alineamiento múltiple de secuencias son más plegables que aquellas que se alejan del mismo. Existe una red de interacciones conservadas y energéticamente favorables en todas las repeticiones internas de las ANKs que conectan aquellos residuos más conservados en secuencia y que por tanto constituyen un núcleo de estabilidad estructural de las mismas. Al analizar en cambio todos los elementos que no forman parte de la estructura canónica de las repeticiones (inserciones y deleciones), las regiones cercanas a las mismas, se encuentran enriquecidas en interacciones frustradas, es decir, son desfavorables para el plegado de las mismas. Lo anterior sugiere que la presencia de inserciones y deleciones indica adaptaciones funcionales de las proteínas en que se encuentran. Este enriquecimiento de interacciones frustradas se observa también en los sitios de interacción con otras proteínas. Finalmente hemos estudiado la dinámica de plegado de estas moléculas usando métodos basados en estructura. Hemos caracterizado los mecanismos de plegado de varios miembros de la familia ANK y relacionando los mismos con los patrones energéticos previamente descriptos a partir de los estados nativos. Nuestros resultados ofrecen nuevas perspectivas acerca del funcionamiento de las proteínas de la familia ANK y pueden ser de gran utilidad para aquellos interesados en el dise~no de este tipo de moléculas para diferentes fines y el entendimiento biofísico de estas moléculas en forma general.

Abstract:
Repeat proteins are composed of specific structural motifs that are tandemly repeated. These units interact between each other leading to solenoidal or toroidal architectures. Given their topological simplicity these molecules constitute useful models to study the protein folding problem. This thesis is focused in studying the Ankyrin Repeat Protein Familiy (ANKs). Proteins from this family contain between 2 and 34 copies of a structural motif of 33 residues long. Being mainly described as protein-protein interactors, the ANKs have a high versatility to recognize other molecules, comparable to that of antibodies. Despite their structural simplicity, repeat proteins present several challenges that are inherent to their non-globularity. Repeats can be highly degenerated in their sequences difficulting their detection and the definition of limits in between them. Given that the structure is more conserved than the sequence, we have developed a method called Protein tiling" that is able to detect structural repetitions in an objective, rigorous and efficient manner. This algorithm is independent from the sequences of the proteins being analyzed and also it is generalizable to other repeat protein families and types. Its application to different protein classes allowed us to characterize their periodicities and symmetry spectra. We have applied the Protein Tiling algorithm to all the members in the ANK family. Using notions from the energy landscapes theory and the hypothesis of repeats as protein folding units, we were able to define the length and phase for the repeating units in all the ANKs. This study represents the first reported case in which a consistent repeats annotation strategy is applied to a whole family which allows to perform comparative analysis of repeats as individual units. Subsequent analysis showed that ANK repeats can be classified into 3 different types that correspond to repetitions localized at the N-terminal, internal or C-terminal regions. Each repeat type shows specific sequence and energy conservation patterns. We observed that the conservation degree at the sequences and the energy patterns are linearly and positively correlated, indicating that those sequences that are similar to the consensus obtained from the multiple sequence alignment are more foldable than those that have more differences with it. There exists a network of conserved interactions along all internal ANK repeats that connect those residues that are highly conserved in sequence and hence constitute a structural stability core for the overall structure. On the contrary, when analyzing those elements that do not belong to the canonical repeats structure (insertions and deletions), those regions that are close to them are enriched in frustrated interactions, i.e. where local folding is unfavorable. The latter suggests that the presence of insertions and deletions indicate functional adaptations of the proteins in which they are contained. This enrichment of frustrated interactions is also observed at the interaction sites of ANKs with other proteins. Finally we have studied the folding dynamics of several ANK members using state of the art computational methods. We have characterized the folding mechanisms of several members in the ANK family and related those with the energetic patterns previously described from the native states. Our results offer new insights into how ANK proteins function and can be of great value to those researchers that are interested in using these type of molecules for protein design with different aims and for the biophysical understanding of these molecules in general.

Noval, María Gabriela. "Proteínas virales intrínsecamente desordenadas: disección estructural de la oncoproteína E7 del virus del papiloma humano y de la fosfoproteína P del virus sincicial respiratorio" (2016-04-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDPs) son proteínas funcionales que carecen de estructura secundaria y terciaria definidas en solución. Este tipo de categoría estructural se encuentra sobrerepresentada en proteínas virales, otorgándole multifuncionalidad y versatilidad en las interacciones que establecen. Debido a flexibilidad asociada a las distintas transiciones conformacionales que presentan, las IDPs son muy difíciles de caracterizar estructuralmente, debiéndose recurrir principalmente a técnicas de estudio en solución. En este trabajo se estudiaron dos modelos de IDPs virales: el dominio amino-terminal de la oncoproteína E7 (E7N) del virus del papiloma humano (HPV-16) y la fosfoproteína P del virus sincicial respiratorio humano (RSV). En primer lugar, utilizando un abordaje de fragmentación en conjunto con medidas de dicroismo circular y resonancia magnética nuclear, se estudiaron las tendencias conformacionales del dominio E7N. Identificamos tres regiones con estructura secundaria local y transitoria: dos α- hélices dentro de las regiones conservadas CR1 y CR2, y una región que adopta hélice de poliprolinas tipo II (PII) dentro del CR2. Las dos α-hélices se encuentran pobladas en forma parcial, representando solo al 20% de la población de moléculas de E7N. Por otro lado, demostramos que la hélice-II presenta transiciones conformacionales entre PII y α-hélice moduladas por cambios de pH. Estas regiones de estructura local coinciden con los motivos lineales de interacción descriptos para este dominio, así como con sitios que experimentan modificaciones post-traduccionales. Estas características sugieren que dichas transiciones estructurales podrían modular la accesibilidad a estos motivos, regulando la interacción con sus proteínas blanco. En segundo lugar, utilizando distintas proteínas recombinantes, demostramos por primera vez la naturaleza IDP de la proteína P de RSV. La misma contiene dos módulos intrínsecamente desordenados, los cuales presentan distinto contenido de desorden. Definimos al dominio Cterminal de P como un dominio con características en solución de tipo pre-molten globule like IDP, y al dominio N-terminal como un dominio con características de tipo random-coil like IDP. Describimos que P presenta un comportamiento térmico anómalo, conteniendo en el dominio C-terminal un elemento marginalmente estable modulable por variaciones de temperatura dentro del rango de temperaturas fisiológico. En conclusión, estos ejemplos resaltan la flexibilidad funcional inherente de las IDPs, la cual les permite ser moduladas por cambios en el entorno. Esta capacidad permite a su vez explicar la plétora de procesos biológicos en los cuales se encuentran involucradas.

Abstract:
The intrinsically disordered proteins (IDPs) are functional proteins that lack defined secondary or tertiary structure in solution. This type of structural category is overrepresented in viral proteins, giving multi-functionality and versatility in interactions. Because of the flexibility generated by the different structural transitions, the structural characterization of IDPs represents a challenging task, being necessary to use in solution techniques for their characterization. In this work we studied the structural and functional determinants of two IDP models: the human papilloma virus E7 aminoterminal IDP domain (E7N HPV-16) and the respiratory syncytial virus P phosphoprotein. First, using a fragmentation approach in combination with circular dichroism and nuclear magnetic resonance experiments we studied the conformational tendencies within the E7N domain. We identified three regions with local secondary structure: two α-helixes within the CR1 and CR2 conserved regions, and a polyproline type II helix (PII) within the CR2. The two α- helixes were partially populated, representing only the 20% of the conformational ensemble within E7N. On the other hand, we demonstrated that the Helix-II presents a conformational transition between PII and α-helix triggered by pH changes. The small linear motifs as well as the post-translational modification sites are located within the mapped local secondary structural elements within E7N, suggesting that the structural transitions within these regions modulated the accessibility of the motives and in consequence regulates the interactions with target proteins. In the second part of this thesis, we experimentally demonstrate for the first time the IDP nature of the P phosphoprotein, reveling the existence of two IDPs modules with different degree of disorder. The C-terminal domain behaves as a pre molten globule like IDP, whereas the N- terminal domain presents random coil-like IDP features. P presents a pronounced reversible secondary structure transition. We identified a marginal stable element within the C-terminal domain which could be tuned by temperature changes in the physiological range. To conclude, these examples highlights the capability of the IDPs to be modulated by changes in their environment, bringing functional flexibility that may explain the plethora of biological processes where their are involved.

Gillanders, Florencia. "Diheteroariletenos fluorescentes como sondas para microscopía de fluorescencia" (2016-05-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las técnicas modernas de microscopía de fluorescencia requieren sondas cuyos comportamientos fotoquímicos, combinados con las características ópticas del equipamiento, permitan resolver estructuras de dimensiones menores al límite impuesto por la difracción natural de la luz. Además de ser brillantes, estables, pequeñas y compatibles con el medio biológico, las sondas ideales fluorescen y se tornan oscuras de manera controlada y conocida. En esta tesis se diseñaron nuevas sondas basadas en los diheteroariletenos oxidados (DHAOs) como plataforma de fluorescencia controlada. Los DHAOs son compuestos fotocrómicos que presentan dos isómeros fotoestables, uno fluorescente y uno oscuro, alcanzados por irradiación con luz ultravioleta y visible respectivamente. Las propiedades espectroscópicas de los DHAOs se optimizaron estudiando el efecto de sustituyentes dadores y aceptores de electrones sobre las mismas. La demandante caracterización espectrofotométrica de los DHAOs se abordó con un espectrofotómetro y fotomodulador de construcción propia, el cual permitió automatizar las mediciones y explorar sistemáticamente diferentes condiciones de fotoconversión. Se descubrió que al aumentar el carácter dador de electrones del sustituyente, se estabiliza particularmente el estado excitado del isómero fluorescente, resultando en un aumento del desplazamiento de Stokes y un pronunciado solvatocromismo del fluoróforo. El solvatocromismo se utilizó para estudiar el cambio de polaridad del entorno de monómeros de α-sinucleína durante su agregación. A fin de conservar la fluoresencia fotomodulable de los DHAOs en agua, se exploraron diversas estrategias de solubilización con modificaciones covalentes y no-covalentes. La inclusión en cavidades de ciclodextrina, la adsorción a albúmina, y la funcionalización con grupos hidrofílicos sirvieron para solubilizar efectivamente a los DHAOs en medios acuosos. Las propiedades de fluorescencia y fotoconversión se retuvieron exitosamente dentro de la cavidad de las proteínas de unión de ácidos grasos y mediante la conjugación a entidades protéicas de mayor tamaño, indicando la preferencia de los DHAOs a un entorno protegido del agua. Anticuerpos secundarios conjugados a DHAOs se utilizaron para marcar β-tubulina en neuronas, y se lograron fotoconvertir selectivamente distintas áreas de las muestras en un microscopio que incorpora un arreglo programable para generar patrones espaciales de excitación. El particular comportamiento fotoquímico de los diheteroariletenos permitió desarrollar una estrategia para aumentar la resolución microscópica combinando DHAOs con fotocrómicos no-fluorescentes. Utilizando el fenómeno de transferencia de energía por resonancia de Förster, se postulan sondas que requieren de múltiples estímulos para la activación de la emisión, disminuyendo el volúmen de activación por debajo del límite de difracción de la luz y aumentando la resolución axial. La aplicación de las sondas sintetizadas y la propuesta de nuevas estrategias relacionadas con los DHAOs denotan el potencial que tienen los mismos en la búsqueda de mayor resolución en la microscopía de fluorescencia.

Abstract:
Modern fluorescence microscopy techniques require probes whose photochemical behaviour, combined with the optical characteristics of the microscope, enable the resolution of structures smaller than the natural diffraction limit of light. In addition to being bright, stable, small and compatible with the biological environment, the ideal probe’s fluorescence is activated and deactivated in a controlled and predictable manner. New probes were designed using oxidized diheteroarylethenes (ODHAs) as a platform for controlled fluorescence and are presented in this thesis. ODHAs are photochromic compounds with two photostable isomers, one fluorescent and one dark, which are formed upon irradiation with ultraviolet and visible light, respectively. In order to optimize their spectroscopic and photochemical properties, the ODHAs were modified with electron-donating and -withdrawing substituents. The demanding spectroscopic characterization of the photochromes was tackled with a custom built spectrophotometer and photoconverter, which enabled automatization of the measurements and the systematic exploration of varying photoconversion conditions. By increasing the electron-donating character of the substituents, the excited state of the fluorescent isomer is particularly stabilized, resulting in an increase in the Stokes shift and pronounced solvatochromism of the fluorophore. The solvatochromic ODHA was used to probe the changes in local polarity around monomers of the amyloid protein α-synuclein during their aggregation. Diverse solubilization strategies involving both covalent and non-covalent modifications were employed with the aim of conserving the photoswitchable fluorescence of ODHAs in water. Inclusion in cyclodextrin cavities, adsorption onto albumin, and functionalization with hydrophilic groups all served to effectively solubilize the ODHAs in aqueous solutions. The fluorescence and photoconversion properties were conserved inside the cavities of fatty acid binding proteins and by conjugation to larger protein entities, indicating the preference of the ODHAs for surroundings devoid of water. Secondary antibodies conjugated to ODHAs were used to immunostain β-tubulin in fixed neurons, and different areas of the sample were selectively photoconverted using structured illumination with a structured illumination (programmable array) microscope. A new strategy for increasing microscopic resolution was developed, harnessing the unique photochemical behaviour of diheteroarylethenes by combining ODHAs with non-fluorescent photochromes. The proposed probes require multiple stimuli for activation of the Förster resonance energy transfer-modulated emission, reducing the activation volume below the diffraction limit and increasing axial resolution. The application of the synthesized probes and the description of novel strategies related to ODHAs denote their potential in the search for increased resolution in fluorescence microscopy.

Toro, Ayelén Rayen. "Leptina regula la supervivencia e invasión de células trofoblásticas" (2016-06-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En los mamíferos el crecimiento y la supervivencia del feto durante su desarrollo dependen exclusivamente de la placenta, un órgano altamente especializado que produce un gran número de factores de crecimiento. Leptina, una hormona producida principalmente por el tejido adiposo que se asocia con la saciedad y el balance energético, presenta un papel importante en reproducción. Se ha evidenciado la expresión de leptina y de sus receptores en placenta y se ha demostrado que durante la gestación tiene efectos sobre el crecimiento, la angiogénesis y la inmunomodulación, afectando tanto funciones maternas como fetales. Sin embargo, muchos de los mecanismos de acción de leptina sobre la implantación y el crecimiento embrionario son aún desconocidos. El presente trabajo ha sido desarrollado con el objetivo de investigar la acción de leptina sobre la supervivencia e invasión de células placentarias. Se utilizaron como modelos la línea celular Swan-71 y explantos de placenta humana a término bajo distintas condiciones de estrés celular y daño como el hambreado de factores de crecimiento, la radiación UV, la hipertermia y la acidificación del medio de cultivo. Determinamos que leptina promueve la proliferación de células Swan-71, aumentando la expresión de ciclina D1, Ki-67 y p21. Asimismo demostramos que leptina disminuye la muerte celular por apoptosis evidenciada por la disminución de distintos parámetros como la activación de caspasa-3, el clivado de PARP-1 y la fragmentación del ADN. También hallamos que leptina modifica los niveles de intermediarios mitocondriales aumentando la relación Bcl-2/Bax y disminuyendo la expresión de Bid. Al profundizar en el mecanismo involucrado en el efecto de leptina sobre la sobrevida de células trofoblásticas, evidenciamos que leptina disminuye los niveles de expresión, actividad y fosforilación en serina 46 del factor de transcripción p53, pieza clave en la modulación del ciclo celular y apoptosis. Leptina además aumenta los niveles de la proteína Mdm-2, reguladora principal de la vida media de p53. Más aún, por ensayos con cicloheximida demostramos que la vida media de p53 disminuye en presencia de leptina. Por otro lado mediante el uso de inhibidores farmacológicos y de ensayos de transfección transitoria, observamos que las vías de MAPK (ERK 1/2) y PI3K/Akt median los efectos de leptina sobre p53. En último lugar, demostramos que leptina promueve la migración e invasión trofoblástica. Analizamos la expresión de proteínas involucradas en la adhesión celular y observamos que en presencia de leptina disminuye la expresión de E-cadherina y aumentan los niveles de Integrina β1. Probamos también que leptina modula la expresión y actividad de metaloproteasas, favoreciendo la invasión celular. Los resultados obtenidos refuerzan la noción de leptina como una citoquina placentaria involucrada en la regulación de procesos de suma relevancia durante la gestación como la proliferación, apoptosis e invasión, sustentando su importancia en la biología de la reproducción.

Abstract:
In mammals the growth and survival of the fetus during its development depend exclusively on the placenta, a highly specialized organ that produces several growth factors. Leptin, a hormone produced mainly by adipose tissue that is associated with satiety and energy balance, has an important role in reproduction. It has been found that leptin and its receptor are expressed in placenta and it has been shown that during pregnancy leptin modulates growth, angiogenesis and immunomodulation, affecting both maternal and fetal functions. However, many of the mechanisms of leptin action on embryo implantation and growth are still unknown. This work has been developed in order to investigate leptin action on survival and invasion of placental cells. Swan-71 cell line and human placental explants were used as models and were exposed under different conditions of cellular stress and damage as starved of growth factors, UV irradiation, hyperthermia and acidification of the culture medium. We found that leptin promotes proliferation of Swan-71 cells by increasing cyclin D1, Ki-67 and p21 expressions. We demonstrated that leptin decreases cell death by apoptosis as evidenced by reduction of various parameters such as the activation of caspase-3, cleaved PARP-1 and DNA fragmentation. We also found that leptin influences mitochondrial intermediates by augmenting Bcl-2/Bax ratio and decreasing Bid expression. By delving into the mechanisms involved in leptin effect on the survival of trophoblast cells, we showed that leptin decreased expression, activity and phosphorylation of serine 46 of p53 transcription factor, a key element in the modulation of cell cycle and apoptosis. Leptin also increases the levels of Mdm-2, the main regulator of p53 protein half-life. Moreover, using cycloheximide we showed that p53 half-life decreases in the presence of leptin. Furthermore by using pharmacological inhibitors and transient transfection assays, we observed that MAPK (ERK 1/2) and PI3K/Akt pathways mediate leptin effects on p53. Moreover, we showed that leptin promotes trophoblastic migration and invasion. We analyzed the expression of proteins involved in cell adhesion and found that leptin decreases E-cadherin expression and increased β1 integrin levels. We also demonstrated that leptin modulates the expression and activity of metalloproteinases, promoting cell invasion. In summary, our results reinforce the notion of leptin as a placental cytokine involved in the regulation of processes extremely important during pregnancy as proliferation, apoptosis and invasion, supporting the importance of leptin in the biology of reproduction.

Martínez, Jimena Hebe. "Rol de alfa-sinucleína en la función y dinámica mitocondrial en modelos experimentales de la Enfermedad de Parkinson" (2016-06-10) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enfermedad de Parkinson es una patología neurodegenerativa que afecta al 1% de la población mayor de 60 años. Se caracteriza por déficits motores, temblor en reposo y una pérdida selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la Substantia Nigra Pars Compacta. Otro rasgo típico es la aparición de agregados proteicos conocidos como cuerpos de Lewy cuyo principal componente es una pequeña proteína, α-sinucleína. Esta proteína se une a las membranas lipídicas y en su conformación de α-hélice podría modular la fusión de las vesículas sinápticas con las membranas pre-sinápticas e influiría en la liberación de neurotransmisores. En condiciones patológicas, α-sinucleína sería capaz de unirse a las mitocondrias y se ha propuesto que esta unión provocaría disfunción mitocondrial y estrés oxidativo que colaborarían en el desarrollo de la enfermedad. La hipótesis de este trabajo propone que AS se incorpora a la mitocondria y se distribuye en sus distintos compartimientos. En esas localizaciones, esta proteína generaría disfunción mitocondrial incidiendo negativamente sobre distintos parámetros metabólicos, sobre la dinámica mitocondrial y la autofagia. En el presente trabajo se estudió la localización específica de α-sinucleína en mitocondrias aisladas de cerebro de rata. Se emplearon técnicas de microscopía de fluorescencia, microscopía electrónica de transmisión, Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), fraccionamientos celulares y mitocondriales, western blots y distintos ensayos bioquímicos. Los resultados obtenidos en mitocondrias aisladas mostraron que AS 1μM se asocia a la mitocondria, mayoritariamente en la membrana externa y AS 10μM y 50 μM se encuentra principalmente internalizada. La microscopía electrónica confirmó la localización de α-sinucleína en el interior de la mitocondria y también en la periferia. Mediante un experimento de FRET se demostró un posible rol para el transportador de membrana externa TOM en la incorporación de AS. El análisis de la funcionalidad mitocondrial reveló que α-sinucleína altera el consumo de O2, el potencial de membrana, la producción de ATP y aumenta la generación de especies reactivas de oxígeno. Por otra parte, se utilizaron células SH-SY5Y transfectadas con α-sinucleína para estudiar el efecto sobre la viabilidad celular, la producción de ATP, la generación de especies reactivas de oxígeno, la dinámica mitocondrial y la autofagia. Los resultados revelaron una disminución significativa de la viabilidad, en paralelo a una disminución en la producción de ATP y generación aumentada de especies reactivas. Además, α-sinucleína indujo disipación del potencial de membrana mitocondrial, desbalance de los procesos de fisión-fusión y desencadenamiento de la autofagia y mitofagia. Estos últimos procesos actuarían como un mecanismo de rescate celular disminuyendo la muerte y eliminando la mitocondrias dañadas. Este trabajo agrega evidencia novedosa al conocimiento de la localización de α-sinucleína en los distintos compartimientos mitocondriales, sus efectos sobre la funcionalidad mitocondrial y la relevancia de la disfunción de la organela en el destino celular. De este modo representan una contribución a la comprensión de los procesos que llevan a la patogénesis de la Enfermedad de Parkinson.

Abstract:
Parkinson disease is a neurodegenerative pathology of the central nervous system affecting 1% of the population over 60 years old. This disease is characterized by motor deficiency, rest tremor, and the selective loss of dopaminergic neurons of the Substantia Nigra Pars Compacta. Another typical feature is the occurrence of protein aggregates known as Lewy’s bodies. The main component of Lewy’s bodies is a small protein named α-synuclein. This protein binds to lipidic membranes. The α-helix conformation could regulate the fusion between synaptic vesicles and pre-synaptic membranes modulating the neurotransmitter release. In pathological conditions, α-synuclein is associated to mitochondria. This interaction would trigger mitochondrial impairment and reactive oxygen species generation both events involved in the development of Parkinson's disease. This study hypothesizes that α-synuclein could be incorporated into the mitochondria and distribute in their different compartments. In these locations, this protein would be able to impair the mitochondrial function implying processes such as metabolic imbalance, mitochondrial dynamics and autophagy. The present work studies the specific location of α-synuclein in isolated rat brain- mitochondria. Techniques of fluorescence microscopy, transmission electron microscopy, Förster Resonance Energy Transfer (FRET), cellular and mitochondrial fractionation, western blots and several biochemical assays were used. Results showed that α-synuclein 1μM was associated to mitochondria mainly on the outer membrane while α-synuclein 10μM and 50μM were internalized. Electron microscopy supported α-synuclein location inside the mitochondrion and also in the periphery. A possible role for the transporter outer membrane (TOM) in the incorporation of α-synuclein to mitochondria was suggested by FRET assay. The analysis of mitochondrial functionality revealed that α-synuclein alters O2 consumption, mitochondrial membrane potential and ATP production. In addition, an increase in the reactive oxygen species generation was observed. On the other hand, employing a cellular experimental model (SH-SY5Y cells transfected with α-synuclein) we demonstrated that this protein diminished cell viability and reduced ATP production with a concomitant increase in reactive oxygen species generation. In addition, α-synuclein was able to trigger mitochondrial membrane dissipation, imbalance in fission-fusion processes, autophagy and mitophagy. Both autophagy and mitophagy could act as rescue cellular mechanisms by decreasing cell death and damaged mitochondria. Taken together, these results add new evidence to the knowledge of mitochondrial specific α-synuclein location, the effects of this protein on the mitochondrial functionality and the relevance of this organelle dysfunction on cell viability. Thereby, these studies represent a contribution to understand the processes leading to development of Parkinson Disease.

Merlotti Ippólito, Antonela. "Clusterina Fucosilada: una nueva glicoforma de clusterina capaz de interactuar con células dendríticas y de modular su funcionalidad" (2017-03-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Clusterina es una glicoproteína de 70 kDa, secretada por diferentes tipos celulares y presente en casi todos los tejidos y fluidos corporales. Nuestro grupo de investigación demostró anteriormente que la clusterina presente en el semen se une a la molécula DC-SIGN, un receptor expresado por las células dendríticas (CDs), inhibiendo su interacción con el HIV. Esta propiedad no es compartida por la clusterina sérica debido a que clusterina del plasma seminal expresa un patrón inusual de glicosilación, caracterizado por la presencia de abundantes motivos fucosilados que le confieren la habilidad de unirse a DC-SIGN. De esta forma, la clusterina fucosilada presente en el semen representa una nueva glicoforma con propiedades biológicas diferentes a la clusterina sérica, la cual se encuentra glicosilada principalmente con motivos sialidados. Clusterina fue la primera chaperona extracelular descripta. La principal propiedad de las chaperonas extracelulares es su capacidad de interactuar con proteínas estresadas previniendo su agregación e inhibiendo el desarrollo de las enfermedades por depósito de proteínas. Posteriormente, los complejos chaperona- proteína son endocitados por diferentes tipos celulares y degradados. En la presente tesis demostramos que clusterina fucosilada aislada del plasma seminal, de igual forma que su contraparte sérica, actúa como chaperona extracelular interactuando con proteínas estresadas y previniendo su agregación. Demostramos la capacidad de clusterina fucosilada de dirigir proteínas estresadas hacia DC-SIGN presente en CDs, promoviendo la endocitosis de las mismas y su posterior degradación. Este proceso podría modular la función de las CDs y favorecer la presentación de los péptidos derivados de estas proteínas estresadas a los linfocitos T. En este sentido, demostramos que la unión de clusterina fucosilada a las CDs a través de DC-SIGN ejerce un importante efecto modulatorio ya que es capaz de estimular la expansión células T CD4+FOXP3+CD25+ promoviendo la tolerancia inmunológica. Estos hallazgos sugieren que clusterina fucosilada presente en el semen podría promover la tolerancia hacia antígenos paternos y de esta forma, la tolerancia materno-fetal. Numerosos trabajos demuestran que la producción de clusterina se encuentra incrementada en diferentes tumores malignos. Más aún, la producción exagerada de clusterina suele asociarse a una mayor agresividad tumoral y a un peor pronóstico. Sin embargo, la naturaleza de esta asociación no ha sido aún definida. En una segunda parte de la tesis, nos preguntamos si la clusterina producida por tumores podría expresar, tal como lo hace la clusterina seminal, un patrón de glicosilación que le permitiese interactuar con DC-SIGN y, de este modo, modular la funcionalidad de las CDs promoviendo la tolerancia hacia antígenos tumorales. Para contestar esta pregunta, realizamos una serie de ensayos utilizando muestras de tumores de mama de tipo Luminal. Los principales hallazgos luego de realizar estos ensayos fueron los siguientes: a) Clusterina presente en los tumores mamarios presenta motivos fucosilados; b) es capaz de unirse a DC-SIGN; c) DC-SIGN es expresado por células mieloides intratumorales. Estos resultados sugieren que clusterina fucosilada podría actuar como un mecanismo de escape tumoral a la respuesta inmune.

Abstract:
Clusterin is a secreted glycoprotein of 80 kDa present in almost all tissues and body fluids. Our group previously showed that semen clusterin binds to DC-SIGN, a C-type lectin receptor present on dendritic cells (DCs), inhibiting the interaction of HIV. This activity was dependent on fucosylated Lewis X and Lewis Y type glycans that confer clusterin the ability to bind with high affinity to DC-SIGN. Interestingly, in contrast with seminal plasma clusterin, serum clusterin does not interact with DC-SIGN. Clusterin was the first extracellular chaperone described. Extracellular chaperones bind to stress-damaged proteins, preventing the formation and deposition of insoluble aggregates and promoting the clearance of extracellular stressed proteins by receptor-mediated endocytosis followed by lysosomal degradation. Failure of these mechanisms contributes to the development of the so-called protein deposition diseases. In this thesis, we showed that fucosylated clusterin from seminal plasma, as its serum counterpart, acts as an extracellular chaperone interacting with stressed proteins and preventing their aggregation. We proved that fucosylated clusterin targets stressed proteins to DC-SIGN present on DCs, promoting their endocytosis and degradation. This process could modulate DC function favoring the presentation of stressed protein derived peptides to T lymphocytes. We demonstrated that fucosylated clusterin binding to DCSIGN on DCs promotes the expansion of CD4+FOXP3+CD25+ T-cells. These findings suggest that fucosylated clusterin present in semen could promote tolerance to paternal antigens favoring fetomaternal tolerance. Several works have shown that clusterin production is increased in malignant tumors. Moreover, the over-expression of clusterin is associated with more aggressive tumors and bad prognosis. Nevertheless, the nature of this association has not been defined. In the second part of this thesis, we analyzed the properties of clusterin expressed on Luminal breast cancer samples. The main results were the following: a) clusterin produced by breast tumors bears fucosylated motifs; b) it is able to bind to DCSIGN; c) DC-SIGN is expressed by intra-tumoral macrophages. We propose that fucosylated clusterin could be a novel mechanism of tumor escape from the immune response.

Ibarra, Jose Gervasio. "Estudios microbiológicos relacionados con el mejoramiento de cultivos vegetales en zonas desfavorables" (2017-03-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El desarrollo de estrategias para incrementar la producción agrícola es de relevancia debido a la importancia de los vegetales en la alimentación humana. Entre estas estrategias se incluyen la expansión de la frontera agrícola a zonas menos aptas, como los ambientes fríos o áridos, pero es necesario que las plantas puedan resistir y prosperar en esas condiciones. El uso de cultivos transgénicos resistentes a la sequía constituye una buena alternativa que puede ser mejorada con el uso de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB), que puedan desarrollarse en condiciones de estrés, manteniendo sus actividades. El objetivo de este trabajo consistió en el análisis de cepas bacterianas aisladas de suelos, con diferentes regímenes hídricos, y de Pseudomonas extremaustralis, procedente de un ambiente extremo, en cuanto a su potencialidad para ser utilizadas como promotoras de crecimiento vegetal. Además se analizó la influencia de cultivos de maíz genéticamente modificados (GM) resistentes a la sequía sobre la composición de las comunidades bacterianas del suelo por técnicas secuenciación masiva. Las características de PGP en P. extremaustralis se analizaron en comparación con P. protegens Pf-5, una conocida PGPB. P. extremaustralis presentó una buena capacidad de solubilización y mineralización de fósforo, tanto a 28°C como en frio. El perfil de ácidos orgánicos, responsables de la solubilización de fosfato inorgánico, fue diferente al de P. protegens Pf-5. Estas diferencias se correlacionaron con la ausencia del gen gad responsable de la producción de 2-ceto-gluconato, en el genoma de P. extremaustralis. Esta bacteria también fue capaz de producir ácido indol acético (AIA) y posee genes relacionados a la resistencia a ácido fusárico y otros que la capacitan para resistir la desecación. Posee también la ruta metabólica completa para la síntesis y liberación de pioverdinas y se observó un efecto del regulador global anaeróbico Anr sobre la producción de estos compuestos. Ensayos de quimiotaxis mostraron que P. extremaustralis es atraída por exudados radiculares de plantas de trigo y es capaz de colonizar raíces de trigo y maíz de forma estable e incrementar el peso seco de vástago de plantas de trigo, mostrando que además de sus características como PGPB es capaz de interactuar con vegetales. También se analizaron características de PGP en aislamientos bacterianos obtenidos a partir de suelos de la provincia de Buenos Aires con distinto régimen de lluvias. Se obtuvieron 19 cepas bacterianas capaces de solubilizar fósforo, 3 de las cuales mostraron una alta capacidad de solubilización. Se encontraron 22 aislamientos positivos para la producción de AIA. Se observó un efecto positivo sobre el crecimiento de plantas de maíz en un sistema axénico autotrófico de 2 de las cepas, IIM-Man4 e IIA-Man30, indicando que pueden ser buenas candidatas como PGPB. Para analizar si existe un impacto de plantas GM resistentes a la sequía sobre la comunidad bacteriana del suelo se realizaron experimentos en macetas con suelo de dos localidades Río Cuarto(RC) e Inés Indart (II) en cámaras de cultivo con condiciones controladas, utilizando cultivares de maíz portadores del gen Hahb4 que confiere resistencia a sequía y salinidad. Las plantas fueron sometidas a dos tratamientos hídricos: alta y baja irrigación. Se analizó la diversidad bacteriana de las muestras de suelo mediante la secuenciación de amplicones del gen que codifica el 16S rRNA. Los suelos analizados fueron diferentes en cuanto a la α diversidad. En II no hubo diferencias en β diversidad, mientras que en RC se encontraron diferencias al utilizar los índices cuantitativos (Bray Curtis y Weighted UniFrac) al comparar el tipo de planta. La composición de los grupos mayoritarios fue similar, siendo las Proteobacterias el más representado en ambos suelos con alrededor del 30%, seguido por Acidobacterias con alrededor del 17% y Planctomycetes y Verrucomicrobia representando aproximadamente un 10% del total cada uno. En todas las muestras el género predominante fue Acidobacterium con 14 a 20 % de los registros (lecturas). La mayoría de los géneros presentó una abundancia relativa de 0,01-0,1 %. Se realizó un análisis para determinar que géneros bacterianos son afectados por cada condición de riego. Se detectaron 10 géneros en II y 16 géneros en RC que estuvieron significativamente (p<0,05) más representados en la condición de sequía con respecto a buena irrigación; siendo Chromatium, perteneciente a las Gamma Proteobacterias, el que mayor proporción de cambio mostró en II y Amycolatopsis, perteneciente al grupo de las Actinobacterias, y Nevskia, dentro de las Gamma Proteobacterias, en RC. También se observaron 29 géneros que mostraron diferencias significativas en relación al tipo de planta en II y 61 géneros en suelo de RC. Los tratamientos tuvieron menos efecto en II en comparación con RC. En II no se observaron diferencias significativas ni con el régimen de irrigación ni con el tipo de planta y hubo un menor número de géneros afectados. EN RC se observó un efecto significativo del tipo de planta pero no de la irrigación.

Abstract:
Due to the continuous human population growth, food production may be insufficient in the coming years, so it is necessary to implement strategies to increase crop production. These strategies include expanding the agricultural frontier to less suitable areas, such as cold or arid environments. To reach this goal it is necessary that plants can withstand and thrive in these conditions. The use of genetically modified (GM) crops resistant to drought can be a good option, as well as the use of plant growth promoting bacteria (PGPB) that can grow under stress conditions, maintaining their plant-beneficial traits. The objective of this study was to analyze bacterial strains isolated from environments under different rainfall regimes and cold, in relation to their potential as PGPB under unfavorable conditions. We also assessed the influence of drought-tolerant GM maize on the composition of the soil bacterial communities, using high throughput sequencing techniques. Pseudomonas extremaustralis isolated from an extreme environment (Antarctica) was analyzed for PGP traits in comparison with P. protegens Pf-5, a well known PGPB. P. extremaustralis presented a good solubilization and mineralization capacity of phosphate in comparison to P. protegens Pf-5, both at 28°C and under cold conditions. The profile of organic acids, responsible for the inorganic phosphate solubilization, was different from that of P. protegens Pf-5. These differences were correlated with genetic differences between both genomes, including lack of the gad gene in P. extremaustralis genome, related to 2-ketogluconate production. P. extremaustralis was also able to produce indole acetic acid (IAA); possesses genes encoding fusaric acid resistance and genes that enable it to withstand desiccation. It is, also a good siderophore producer, posses a complete genetic pathway to produce and release pyoverdine. We observed that pyoverdine production was influenced by the global anaerobic regulator Anr. Chemotaxis and colonization assays showed that P. extremaustralis was attracted to wheat root exudates and was able to colonize wheat and maize roots forming stable colonies in root surface, improving the dry weight of the stem in wheat plants. In addition, different characteristics related to the ability to promote plant growth in bacterial isolates obtained from soils with different rainfall regimes were analyzed. We found 19 isolates able to solubilizing inorganic phosphate, three of which showed a high solubilizing capacity and 22 isolates that were positive for IAA production, some of which reached high production (up to 60 μg / ml). Two strains, IIM-Man4 and IIA-Man30, showed a positive effect on the growth of maize plants in an autotrophic axenic system. The results indicate that P. extremaustralis, as some of the isolated bacterial strains, could be good candidates for their analysis in experimental plots subjected to stress conditions. Another expanding strategy to improve crop yield involves the use of GM plants. However, the evaluation of the impact of these organisms on the soil communities has not been deeply analyzed yet. We evaluated the effect of drought tolerant GM corn plants carrying the Hahb4 gene, on soil microbial community. Experiments were carried out in pots with soil from two locations Río Cuarto (RC) and Inés Indart (II) in culture chambers under controlled conditions. The plants were subjected to two soil irrigation regimes. Bacterial diversity of the soil community was analyzed using global amplicon sequencing techniques of the gene encoding the 16S rRNA. Soils were different in terms of α diversity. In II there were not differences in β diversity, while in RC differences were found when comparing the type of plant using the quantitative index (Bray Curtis and Weighted UniFrac). The composition of the major groups was similar, with Proteobacterias being more represented in both soils with about 30%, followed by Acidobacterias with around 17% and Planctomycetes and Verrucomicrobia representing approximately 10% of the total. In all the samples the genus Acidobacterium was predominant with 14 to 19% of the records (readings). Most genera had a relative abundance of 0.01-0.1%. Analysis of bacterial genera affected by irrigation conditions was performed. Ten genera in II and 16 genera in RC were detected that were significantly (p <0.05) more represented in drought conditions in comparison with good irrigation; being Chromatium belonging to GammaProteobacteria that showed the highest proportion of change in II soil, and Amycolatopsis belonging to Actinobacterias and Nevskia within the GammaProteobacteria in RC. We also observed 29 genera that showed significant differences in relation to the type of plant in II and 61 genera in RC soil. Treatments had less effect on II as compared to RC. In II, no significant differences were observed either with the irrigation regime or the type of plant and there were fewer affected genera. The analysis of bacterial community of RC soils showed a significant effect of the type of plant but not of irrigation regimes.

Grodzielski, Matías. "Estudio de los mecanismos patogénicos relacionados con la trombopoyesis en la trombocitopenia autoinmune" (2017-03-23) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La presente Tesis de Doctorado propuso investigar la existencia de alteraciones en el proceso de trombopoyesis en la trombocitopenia inmune (PTI). Para ello se utilizó un modelo in vitro de diferenciación de megacariocitos a partir de progenitores hematopoyéticos CD34+ normales. Al día 13 de cultivo, los megacariocitos maduros se incubaron con muestras de plasma de pacientes con PTI evaluando su efecto sobre la formación de proplaquetas, la capacidad de adhesión y spreading, la apoptosis celular y la activación de señales intracelulares al contacto con proteínas de matriz de médula ósea. Los plasmas de PTI produjeron una inhibición dosis-dependiente de la trombpoyesis, lo que se acompañó de alteraciones morfológicas en las proplaquetas. Además, estos plasmas no afectaron la madurez ni la sobrevida de los megacariocitos, lo que sugiere que las alteraciones en la producción plaquetaria son ocasionadas por un efecto directo sobre el proceso de trombopoyesis. La fracción de inmunoglobulinas G purificadas de los pacientes reprodujo la inhibición, mientras que la eliminación de los autoanticuerpos del plasma la revirtió, demostrando que son los autoanticuerpos los responsables, al menos en parte, de estas alteraciones. Además de la trombopoyesis, los plasmas con autoanticuerpos dirigidos contra las glicoproteínas IIb- IIIa y Ia-IIa afectaron la capacidad de adhesión y spreading de los megacariocitos a los ligandos medulares de estos receptores, fibrinógeno y colágeno I, respectivamente. En particular, la presencia de anticuerpos anti-GPIa-IIa de PTI provocó una pérdida de la capacidad fisiológica del colágeno I de inhibir la trombopoyesis, lo que sugiere que podría ocurrir liberación de plaquetas en forma prematura en el contexto del nicho osteoblástico medular. La existencia de alteraciones trombopoyéticas en presencia de plasmas de PTI sin autoanticuerpos detectados sugiere la existencia de autoanticuerpos dirigidos contra blancos alternativos. La presente Tesis de Doctorado expone resultados novedosos que demuestran que los autoanticuerpos de PTI tienen un efecto nocivo sobre la trombopoyesis y sobre otras funciones megacariocíticas, revelando nuevos mecanismos que contribuyen a la disminución del recuento de plaquetas en esta entidad.

Abstract:
This PhD thesis was aimed at investigate possible alterations in the thrombopoietic process in immune thrombocytopenia (ITP). To this end, an in vitro model of megakaryocyte differentiation from normal CD34+ hematopoietic progenitors was used. At day 13 of culture, mature megakaryocytes were incubated with plasma samples from patients with ITP and the effect on proplatelet formation was evaluated. Besides, we studied the ability of megakaryocytes to adhere and spread on different matrices, cellular apoptosis and the activation of intracellular signalling after contact with bone marrow matrix proteins. ITP plasmas induced a dose-dependent inhibition on thrombopoiesis, that was accompanied by morphological alterations in proplatelet architecture. In addition, these samples did not affect either maturity or survival of megakaryocytes, suggesting that alterations in platelet production are due to a direct effect on the thrombopoietic process. The purified fraction of immunoglobulins G from ITP patients reproduced the inhibition, while elimination of autoantibodies from plasma reverted it, demonstrating that autoantibodies are responsible, at least in part, for these alterations. In addition to thrombopoiesis, plasmas containing autoantibodies directed against glycoproteins IIb- IIIa and Ia-IIa affected megakaryocyte adhesion and spreading to the corresponding ligands, fibrinogen and collagen I, in bone marrow. In particular, the presence of anti- GPIa-IIa autoantibodies caused a loss of the physiological ability of collagen I to inhibit thrombopoiesis, suggesting that premature platelet release could occur in the context of the bone marrow osteoblastic niche. The finding of abnormalities on thrombopoiesis in the presence of ITP plasmas with no detectable autoantibodies suggests the presence of alternative targets of autoimmunity in these samples. This PhD thesis presents new results demonstrating that ITP autoantibodies have a deleterious effect on thrombopoiesis and other megakaryocytic functions, revealing new mechanisms that contribute to the decrease of the platelet count in this entity.

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