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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Inmunología [ 112 tesis ]

Strusberg, Sylvia Teresa. "Mecanismos de replicación del ácido deoxiribonucleico : ADN polimerasas en linfocitos humanos" (1977) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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De Titto, Ernesto Horacio. "Regulación de la respuesta inmune en la enfermedad de Chagas" (1983) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Dellepiane, Nora Ida. "Estudio de las cepas de virus rábico utilizadas en la preparación de vacuna de cerebro de ratón lactante (tipo Fuenzalida - Palacios)" (1984) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo se comparó la capacidad inmunogénica de la vacuna antirrábica del cerebro de ratón lactante (CRL) trivalente con la de tres vacunas monovalentes elaboradas con cada una de las cepas virales que componen antigénicamente la vacuna clásica. Tanto la vacuna trivalente, como las monovalente CVS y 51, alcanzaron valores antigénicos elevados en pruebas de potencia NIH. No ocurrió lo mismo con la vacuna monovalente 91, que mostró ser un inmunógeno pobre. La vacuna trivalente fue superior a todas las monovalentes cuando se compararon la velocidad en inducir la respuesta de anticuerpos y los títulos alcanzados al administrarlas en diluciones crecientes. Los títulos de anticuerpos obtenidos con las vacunas trivalente y monovalentes CVS y51, así como su duración en el tiempo, fueron comparables; la vacuna 91 en cambio, indujo bajos títulos de anticuerpos neutralizantes. El estudio de la capacidad de neutralización cruzada de los anticuerpos inducidos, mostró que el virus 91 difiere antigénicamente de los virus CVS y 51. Al compararse la eficacia de cada vacuna en proteger a ratones inmunizados con ellas del desafío intracerebral con los virus fijos CVS, 51 y 91 y los virus calle 1026/80 y 1426/79, se comprobó que excepto la 91, todas protegían frente a todos estos virus con excepción del 91, frente al cual lo hacían sólo parcialmente. En contraposición, la vacuna 91 fue la única realmente eficaz para proteger a los ratones del posterior desafío con la cepa de virus homóloga, y fue ineficiente para protegerlos del desafío con los virus CVS, 51 y 1426/79. Los resultados de los tratamientos postexposición mostraron que tanto la vacuna trivalente como las monovalentes CVS y 51, a diferencia de la 91, protegen de la infección letal por vía parenteral con virus calle. No se pudo detectar interferón en el suero de los ratones inmunizados con ninguna de las vacunas. Por consiguiente no se pudo establecer que exista una relación directa entre producción de interferón y protección en tratamientos postexposición. Se demostró que la técnica de CIE utilizada para cuantificar anticuerpos en el suero de ratones inmunizados, daba títulos de anticuerpos correlacionados con los obtenidos con la prueba in vivo.

Slobodianik, Nora Haydée. "Estudio de las interrelaciones entre nutrición y respuesta inmune en modelo experimental, en ratas en crecimiento" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El tipo de respuesta y la vulnerabilidad de un tejido a los efectos del desequilibrio nutricional dependen de la velocidad de recambio celular. La cinética de proliferación celular en los órganos linfoides sugiere que estos tejidos deben ser particularmente susceptibles a los efectos de la desnutrición proteica. Teniendo en cuenta que la respuesta se inicia en dichos órganos, y debido a la multiplicidad de aspectos involucrados con el sistema inmune, en este trabajo se han estudiado los efectos de la deficiencia proteica severa y de la posterior realimentación sobre timo y ganglio mesentérico de ratas en crecimiento. Los resultados de este modelo experimental han permitido describir los efectos específicos de la malnutrición proteica severa al destete y analizar el impacto de la posterior recuperación con diferentes niveles de proteína sobre los órganos de importancia fundamental a nivel de inmunidad celular y secretoria. Para este estudio se utilizaron ratas de la cepa Wistar ( 6- 8 crias por madre) que se destetaron al llegar a un peso entre 35-40 grs., (21-23 dias de vida); a partir de ese momento se mantuvieron con dieta libre de proteínas hasta pérdida de 20% a 25% del peso inicial. Sobre estos animales se estudió: a) el efecto de la depleción proteica y b) el efecto de la realimentación. Sobre aquellos animales que perdieron no menos del 25% del peso al destete -lográndose así un modelo experimental para malnutrición de tercer grado (LP 25) (67, 68)- estudió el efecto de la recuperación nutricional durante períodos cortos (5 y 9 días) y prolongados (21 y 40 días). Sobre aquellos animales que durante el período de depleción proteica perdieron alrededor del 20 % del peso inicial- modelo de desnutrición de segundo grado (LP 20) (67, 68)- se estudió el efecto de la recuperación nutricional sólo durante períodos cortos. Como control de nutrición normal se utilizaron grupos de ratas que desde el destete recibieron dieta stock de vivero. Estos animales fueron sacrificados a los 12 días, al destete (21-23 días) y a los 39, 45, 60 y 80 días de vida. Al final del período experimental, y luego de 4 horas de ayuno, los animales fueron pesados y sacrificados previa anestesia con éter extrayéndoseles timo y ganglio mesentérico, los cuales fueron pesados. Se prepararon suspensiones celulares sobre las cuales se determinó el recuento celular y se caracterizaron los determinantes antigénicos en la superficie de la membrana celular de timocito y de las células T de ganglio mesentérico; en este órgano linfoide también se estudiaron las células B que expresan y/o contienen IgA. Para la caracterización de la población celular T se utilizó el anticuerpo monoclonal xenogeneico W3/13+ y para la determinación de los marcadores de la población celular B se utilizó el antisuero anti IgA específico para cadena alfa; todas estas determinaciones se realizaron por la técnica de inmunofluorescencia indirecta (25,74).

Galassi, Nora Virginia. "Maduración de la competencia inmunológica en la rata" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Castillo, Marta Beatriz. "Acción de los glucocorticoides y la insulina en el sistema inmune" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Nepomnaschy, Irene. "Inmunoregulación en ratones F1 híbridos recíprocos" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Pérez Filgueira, Daniel Mariano. "Efecto de diferentes inmunomoduladores en la respuesta inmune al virus de la fiebre aftosa en un modelo experimental y en el huésped natural" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se estudió la respuesta de isotipos en ratones de la cepa Balb/c luego de la infección experimental con VFA o de la inmunización con vacunas formuladas con virus inactivado con y sin el agregado de adyuvantes. Se utilizaron tres inmunomoduladores para formular diferentes vacunas usando vehículos acuosos y oleosos: la fracción hidrosoluble de pared celular de Micobacterium sp. (PCM), un extracto purificado de lipopolisacárido de Brucella ovis (LPS) y una amina lipoidal sintética, Avridine (AV). Los animales infectados mostraron respuestas dominadas por el isotipo IgG2b y seguidas por IgG1, IgG2a, IgG3, entre los 14 y 60 d.p.i. o se detectó actividad de IgG3 específicas para la VFA en ninguno de los animales vacunados. Las formulaciones conteniendo adyuvantes presentaron altos y persistentes niveles de IgG2b, similares a los de los animales infectados, hasta los 180 d.p.i., mientras que en las vacunas convencionales este isotipo fue detectado sólo hasta los 60 d.p.i. Los animales vacunados con formulaciones conteniendo estos adyuvantes presentaron una resistencia aumentada al desafío viral realizado a los 210 d.p.i., en relación con aquellos inmunizados con vacunas convencionales. Dos de estos inmunomoduladores (PCM y AV) fueron también probados en bovinos, incluidos en vacunas oleosas. Se elaboraron 11 diferentes formulaciones que fueron inoculadas en grupos de 8 animales. Nuestros resultados muestran que la inclusión de cualquiera de estos dos adyuvantes en sus mayores concentraciones a vacunas formuladas con baja cantidad de antígeno viral, indujeron niveles inactivado sin el agregado de adyuvantes. Los isotipos de IgG inducidos en estas vacunas experimentales también diferían de las formulaciones convencionales y control sin adyuvantes. Se discute la posible relación entre estos cambios inducidos y la inmunidad conferida en cada caso.

Abstract:
The IgG isotype response in Balb/c mice infected with FMDV or immunized with different vaccine formulations using inactivated virus particles as antigen was analyzed at various times post-inoculation. Three immunomodulators, were employed to formulate different vaccines using aqueous and oil vehicles: a water-soluble fraction of the cell wall of Mycobacterium sp.(PCM), apurified extract of lipopolysacharide from Brucella ovis (LPS) and a synthetic lipoamide, Avridine (AV). Infected animals between 14 and 60 days post-inoculation (d.p.i.) showed responses dominated by IgG2b, followed by IgG1, IgG2a and IgG3, respectively. No IgG3 activity was detected in vaccinated animals at any time. With formulations including immunomodulators, persisting high levels of IgG2b (similar to those of infected animals) were detected until 180 d.p.i. while with conventional vaccines IgG2b responses were detected up to 60 d.p.i. Animals vaccinated with formulations including these immunomodulators presented an augmented resistance to viral challenge at 210 d.p.i. in relation with thoseimmunized with conventional vaccines. Two of these immunomodulators (PCM and AV) were also tested in oil vaccines in experiments conducted in bovines. Eleven different formulations were used to vaccinate 8 animals per group. Our results showed that the inclusion of these adjuvants in the higher concentrations to vaccines formulated with a low antigen concentration, induced antibody levels similar to those of vaccines containing twice the concentration of virus and no adjuvants. The IgG isotypes profiles induced in these experimental vaccines also differed from the elicited by the control vaccines without immunomodulators. The possible relation ship of these differences in the isotype response and protection is discussed.

Wigdorovitz, Andrés. "Mecanismos involucrados en la duración de la respuesta inmune humoral al virus de la fiebre aftosa" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La fiebre aftosa constituye un serio problema sanitario que afecta a las especies biunguladas que genera severas consecuencias económicas a nivel mundial. Las vacunas formuladas con virus inactivado como antígeno (Ag) inducen respuestas de anticuerpos seroneutralizantes (AcN) de corta duración y es necesaria la revacunación periódica. La infección experimental en ratón adulto genera una continua e intensa respuesta de AcN tal como sucede en el huésped natural. Esta prolongada síntesis de Acs anti-VFA hace del modelo murino un excelente sistema para el estudio de los mecanismos involucrados en una prolongada respuesta humoral. Aunque este fenómeno es conocido desde hace tiempo, las bases inmunológicas responsables de la prolongada inmunidad inducida luego de la infección se encuentran aún sin dilucidar. Con la intención de comprender la causa de la respuesta inmune humoral al VFA, la primera parte de este trabajo de tesis estuvo dirigida a aclarar si el mantenimiento de los niveles de Acs puede ser explicado por un fenómeno de infección persistente del individuo, o mediante una persistencia antigénica mediada por células presentadoras de antígeno (CPA). La segunda parte del trabajo de tesis fue dirigida a estudiar los mecanismos de acción de dos efectivos inmunomoduladores (Avridine -AVR- y la pared de Mycobacterium -PCM) en la inducción de una prolongada respuesta humoral. Es importante enfatizar que los ensayos de transferencia utilizados en este trabajo permitieron acotar el sistema a los esplenocitos transferidos, debido a que estas células resultaron suficientes para inducir una prolongada respuesta humoral en los animales receptores normales (Tabla 1). La hipótesis de la existencia de una infección persistente fue descartada mediante la utilización de varios métodos, en especial la falta de detección del genoma utilizando un ensayo de PCR cuya sensibilidad es de 10-3 DIRL 50%.(Tabla 3 A y B). Además, el hecho de que haya sido posible obtener resultados similares a través de la inmunización de los animales dadores con antígenos inertes corroboró que la replicación viral definitivamente no es una condición indispensable para que se induzca una prolongada respuesta humoral (figura 6B). La transferencia de esplenocitos irradiados provenientes de animales infectados a animales receptores presensibilizados y negativizados (inmunizados con bajas dosis de virus inactivado) permitió la detección funcional de CPA específicas para el virus aftoso. La inhibición de la presentación antigénica (PA) in vitro, los ensayos de inhibición de la PA in vivo y el establecimiento de una correlación entre la capacidad de presentar el Ag y el título de Acs del animal dador corroboraron que, en el modelo utilizado, la presencia de CPA es el mecanismo que media la prolongada respuesta humoral anti-VFA que se observa en animales que fueron infectados. Dos datos experimentales merecen ser destacados: (i) Las células B son suficientes para la producción del fenómeno (figura 16B). (ii) Las CPA fueron capaces de permanecer en el animal dador por lo menos 365 días después de la infección (figura 15 B) Conociendo que la presencia de CPA es el mecanismo que media la prolongada respuesta humoral anti-VFA en los animales infectados, se analizó: la capacidad de inducir CPA en los animales inmunizados con diferentes formulaciones vacunales. Los ensayos realizados demostraron que tanto las CPA que provenían de animales infectados así como las obtenidas de ratones que fueron inmunizados con las diferentes formulaciones fueron capaces de inducir Acs detectables por ELISA. Sin embargo, solamente los esplenocitos de animales infectados o inmunizados con la vacuna inmunomodulada con AVR indujeron Acs de tipo neutralizante en los ratones receptores presensibilizados (figura 20 B). La utilización del ensayo de doble transferencia (figura 22) demostró que la presencia de Ag circulante en el animal dador no es necesaria para el mantenimiento de las CPA (figura 24). Estos resultados son coincidentes con la continua presencia de CPA en los animales infectados (hasta los 365 días post-infección) en los cuales no es posible encontrar antígeno viral ni partículas infecciosas. Se utilizó un sistema de PA donde el antígeno a ser considerado es mucho más simple en términos de cantidad de determinantes antigénicos para intentar explicar la diferencia observada entre las respuestas inducidas por las distintas vacunas utilizadas. Los esplenocitos extraídos de los animales inmunizados con dosis crecientes correspondiente a la secuencia 135-160 de VP1 del VFA O1C (P1) indujeron respuestas correlativamente incrementadas de Acs detectables primero, por ELISA y, posteriormente, por SN. Estos resultados apuntalan la hipótesis que sostiene que las diferencias entre la inducción de anticuerpos neutralizantes y aquellos detectados solamente por ELISA puede ser meramente debida a la masa antigénica presentada. Posteriormente, se analizó el efecto de los dos inmunomoduladores en un posible procesamiento diferencial de las distintas porciones del P1 Los resultados demostraron que, en efecto, estas diferencias existen, ya que los patrones de reactividad demostrados por los sueros de los animales infectados e inmunizados con AVR resultaron similares y cualitativamente diferentes a aquellos presentados por los sueros de los animales inmunizados con PCM o el vehículo oleoso per se (figura 25). Esto sustentaría que adicionalmente a un fenómeno de tipo cuantitativo, también existe un factor cualitativo como explicación a las diferencias encontradas en la respuesta humoral inducida en los animales receptores de células provenientes de dadores inmunizados con diferentes inmunomoduladores. La estrecha correlación entre la presencia y actividad de las CPA específicas para VFA, y los titulos de Acs observados en los animales que fueron estimulados antigénicamente de la forma más diversa con (infectados experimentalmente o inmunizados con virus inactivo bajo muy diferentes condiciones), poderosamente sugiere que el mecanismo involucrado en el mantenimiento de la respuesta inmune es la presencia de CPA reestimulando en forma permanente la producción de Acs anti-VFA. Estos resultados son de importancia para el diseño y desarrollo de nuevas vacunas en las cuales se debería principalmente focalizar la atención en metodologías que estimulen la inducción y un eficaz mantenimiento de CPA especificas para VFA en los individuos vacunados.

Porcel, Betina Mabel. "Caracterización molecular del gen que codifica para una proteína flagelar ligadora de calcio del Trypanosoma cruzi, altamente consevado en Tripanosomátidos" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La fracción flagelar de epimastigotes de Trypanosoma cruzi, enriquecida en flagelos y elementos de membrana, ha mostrado en modelos experimentales murinos las mejores propiedades inmunogénicas, protectivas y no agresivas contra el desafío con el T. cruzi Quizás sólo un pequeño número de los componentes de esta fracción están involucrados en esta inmunidad protectiva en el huésped, en tanto que el resto de ellos podrían actuar en otros procesos esenciales para el parásito. Las señales de calcio juegan un papel preponderante en diversos mecanismos de transducción de señales en parásitos, tanto en relación a la invasión a la célula hospedadora como en los cambios morfo-fisiológicos del mismo a lo largo de su ciclo de vida. Asimismo, la alta conservación de las proteínas moduladoras de calcio en distintos tripanosomátidos, ha sugerido su posible implicancia en dichos procesos de transducción. En este trabajo se describe la caracterización a nivel molecular del gen que codifica para una proteína flagelar ligadora de calcio en T. cruzi, y su versión homóloga en Trypanosoma rangeli. Varios clones de ADN recombinante fueron detectados en una genoteca de expresión construida a partir del ADN total de la forma epimastigote de T. cruzi (clon Miranda/76), en el vector de expresión λgt11 , utilizando suero de conejo anti-fracción flagelar. Dos de esos clones recombinantes fueron seleccionados para la caracterización de sus productos de expresión. La expresión de estos clones recombinantes en bacterias produjo proteínas fusionadas a la enzima g-galactosidasa, las que mostraron poseer epitopes reconocidos por anticuerpos dirigidos contra la fracción flagelar del parásito. La adsorción del suero anti-fracción flagelar por las proteínas expresadas, permitió obtener anticuerpos que identificaron por "inmunoblotting" moléculas de 29 kDa en ambos casos, en homogeneizado total de epimastigotes y fracción flagelar, mientras no reaccionaron con antígenos de Leishmania brasiliensis. Posteriormente, el análisis de la secuencia de bases de ambos fragrnentos confirmaron que los insertos provenientes de ambos clones codifican para una misma proteína de 29 kDa. en T. cruzi. La presencia de este antígeno F29 en la superficie del parásito fue comprobada por inmunofluorescencia. La expresión del gen completo que codifica para la proteína flagelar F29 en el vector pMAL-p2 permitió obtener una proteína recombinante fusionada a proteína de unión a maltosa, que mostró ser ligadora de calcio. Cuando se ensayó la inmunogenicidad del antígeno recombinante F29-MBP, utilizando Bordetella pertussiscomo adyuvante, se observó que esta proteína es capaz de generar una respuesta inmune humoral contra el T. cruzi, demostrada por anticuerpos dirigidos contra la proteína pura y el homogenato total del parásito. Los epitopes generadores de respuesta en F29-MBP fueron reconocidos en un gran número de otras proteínas en el parásito, a igual que se mostraron altamente representados en el T. rangeli. El gen que codifica para la proteína flagelar ligadora de Ca++ F29 mostró encontrarse organizado en al menos 20 copias, altamente conservadas entre cepas pertenecientes a distintos zimodemas, adyacentes una a la otra con una disposición cabeza-cola en el genoma del parásito. Dicho gen se expresa en epimastigotes de T. cruzi transcribiendose a un mensajero policistrónico, el cual podría sufrir un procesamiento post-transcripcional de clivaje y poliadenilación, también observado para otros genes del parásito. El perfil encontrado para diferentes clones y cepas de T. cruzi estudiados por hibridización a cromosomas enteros fraccionados por electroforesis en campo pulsado reveló que el gen que codifica para la proteina flagelar F29 se halla ampliamente representado en T cruzi, mostrando una conservación intraspecífica en las cepas y clones evaluados. Asimismo, estos patrones de hibridización mostraron una alta correlación con la clasificación isoenzimática de las distintas cepas y clones analizadas de acuerdo a su perfil isoenzimático basado en 2, 12, 13 y 19 loci. A su vez, la existencia de al menos dos arreglos de repeticiones de genes, ubicados en un par de cromosomas homólogos fue observada al enfrentar la misma sonda a productos de digestión provenientes de la digestión de cromosomas enteros de distintas cepas, con enzimas sin sitios de corte dentro del inserto. La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa sobre ADN genómico total de T. rangeli (aislado LDG) usando como iniciadores de la síntesis oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia completa del gen que codifica en T cruzi para la proteína flagelar ligadora de calcio F29, permitió la obtención de un fragmento de ADN que codifica para una proteína de 23 kDa con alta homología con proteínas flagelares responsables de la unión a Ca2+ en otros tripanosomátidos. La hibridación a ARN de T. rangeli reveló que esta proteína se expresa como un transcripto poliadenilado de 1.6 kb, a raiz, al igual que en T. cruzi, de un procesamiento post-transcripcional. El gen que codifica para TrCaBP en T. rangeli tambien se encontró organizado en al menos 20 copias por célula, en dos cromosomas de gran tamaño en ciertos aislados del T. rangeli, y a dos pequeños en otros aislados. Los resultados presentados demuestran que la información genética que codifica para la proteína flagelar ligadora de Ca2+ F29 del T. cruzi se encuentra altamente conservada en el genoma de otros tripanosomátidos, sin encontrarse presente en el género Leishmania.

Abstract:
The flagellar fraction of Trypanosoma cruzi epimastigotes contains flagellar membrane components such as glycoproteins and parasite surface enzymes. This fraction has the best immunoprotective properties in the murine model. Just a few of these components would be involved in this protective response, whereas others would play a key role in parasite's essential processes. Calcium signals would play an important regulatory role in signal transduction processes in parasites, being critically involved in the coordination of life cycle events and cell invasion. Likewise, the high conservation of calcium-modulated proteins among different trypanosomatides supports the notion that these cell-surface calflagins would play common roles in these caZ+-transduction processes. In the present study, we report the cloning and molecular characterisation of genes encoding EF-hand calcium-binding proteins in Trypanosoma rangeli and T. cruzi, showing that these genes are highly conserved in these related trypanosomes. A T. cruzi, Miranda/76 clone, genomic Agtl 1 expression library was screened with rabbit anti flagellar fraction polyclonal antibodies and several clones were obtained. Two of them, with inserts of 550 and 750 bp respectively, were selected for recombinant protein production. The IS-galactosidase fusion proteins produced in bacteria by IPTG induction possesed epitopes recognized by antibodies raised against T. cruzi flagellar fraction. Antibodies selected from the anti-flagellar fraction polyclonal sera using these fusion proteins, detected a 29 kDa. protein in T. cruzi epimastigote whole homogenate and flagellar fraction by immunoblotting, whereas no reactivity was observed against Leishmania brasiliensis . Subsequently sequence analysis showed that both inserts encoded for the same 29 kDa. protein in T. cruzi. The presence of F29 antigen on the parasite surface was confirmed by indirect immunofluoresence. Expression of the complete F29 encoded-gene into pMAL-p2 expression vector showed that F29 is a calcium-binding protein. Furthermore, this recombinant protein was inmunogenic in mice, using Bordeteila pertussis as adyuvant. Antibodies raised against F29recognized several proteins in T. cruzi by immunobloting as well as in T. rangeli. F29 is encoded by at least twenty tandemly arranged highly conserved genes, organized in a head-to-tail fashion in the parasite genome. F29-encoding gene is transcribed as a polyadenylated transcript in the parasite. PFGE hybridization experiments revealed the presence of the F29 genes in different T. cruzi isolates, cloned stocks and strains, with common features between T. cruzi isoenzimatic classification and chromosomal hybridization patterns. Similar pattern of one or two bands were seen after PFGE-Southern analysis with rare cutting restriction enzymes, which do not cut inside the tandem array, indicating a disomic chromosomal constitution for F29 genes. PCR amplification of T. rangeli genomic DNA, using primers derived from the T. cruzi F29-encoding sequence made it possible to isolate the homologous gene in T. rangeli, encoding a 23 kDa highly homologous to calcium-binding proteins from trypanosomatids. Northern blot analysis revealed that the Tr CaBP gene is also expressed in T. rangeli as a polyadenylated transcript. The TrCaBP-encoding genes are present in at least 20 copies per cell, organized in tandem arrays on large T. rangeli chromosomes in some isolates, and on two smaller in others. Hence, the calcium-modulated proteins encoding genes, as well as their genomic organization, are well conserved in trypanosomes. The gene, however, seems to be absent from Leishmania sp.

Panebra Alvarado, Alfredo. "Respuesta humoral en Leishmaniasis del Perú : Proteínas HSP70 y ribosomales P" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la presente tesis, se abordó el clonado de la hsp70 de L.(V.) peruviana y la caracterización de la respuesta humoral en pacientes con Leishmaniasis Tegumentaria Americana, la Enfermedad de Chagas y la enfermedad mixta Chagas/Leishmaniasis. Se determinó el tamaño del inserto de U4 en 1,6 Kpb. Se mostró que U4 presentaba un marco de lectura abierto de 525 pb. que codifican para los 174 aminoácidos C-terminales de la hsp70 de L.(V.) peruviana. U4 presenta una homología de 98% con Lbb1 (97% de identidad y 1% de cambios conservativos) y con RA1 un 87% (74% de identidad y 13% de cambios conservativos). Se determinó la organización genómica de los genes hsp70 por Southern-blot de ADN genómico de clones de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis. Se encontró 2 locus genómicos, uno de los cuales contenía un tandem de genes hsp70 para ambas especies de Leishmania sp. Los ADNc de U4 y Lbb1 se subclonaron pGEX1l T para caracterizar la respuesta humoral en Leishmaniasis Tegumentaria Americana, Enf. de Chagas y la Inf. mixta Chagas/Espundia por Ensayo de Placa de Lisis, Western-blot y ELISA. Los resultados obtenidos por las 3 técnicas indican que U4/Lbb1 se pueden usar en el diagnóstico de L. Mucocutánea (Espundia) y junto a JL7, permitiría un diagnóstico diferencial de la enfermedad mixta Chagas/Espundia. El clonado y la caracterización de la respuesta humoral de las proteínas ribosomales P2 de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis. El clonado de las proteínas ribosomales ácidas de tipo P2 de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis se realizó mediante rastreo de bibliotecas de expresión en l gt11 con sondas de las proteínas ribosomales P2a y P2b de L.(L.) infantum. En la biblioteca de expresión de L.(V.) peruviana se aisló un recombinante con cada sonda. El recombinante LbpP2a tenía un inserto de aprox. 900 pb., presentando un marco de lectura abierto de 327 pb. que codifican 108 aminoácidos, faltándole sólo los 3 primeros residuos N-terminales para estar completa. El recombinante LbpP2a presenta una homología de aminoácidos de 95% (89% de identidad y 6% de cambios conservativos) con la proteína homóloga de L.(L.) infantum, un 87% (74% de identidad y 13% de cambios conservativos) con la de T. cruzi y un 65% (44% de identidad y 21% de cambios conservativos) con la proteína P2 humana. El otro recombinante (LbpP2b ) aislado de la misma biblioteca continua un inserto de 271 pb., presentando un marco de lectura abierto de 144 pb. que codifican los 44 últimos aminoácidos C-terminales. Cuando se compara el recombinante LbpP2b con sus homólogas de otras especies de Trypanosomátidos, la más alta homología la presenta con la proteína ribosomal P2b de L.(L.) infantum con un 90% (81% de identidad y 9% de cambios conservativos), con la P2b de T. cruzi alcanza un 86% (78% de identidad y 8% de cambios conservativos), con la P2b de T. brucei un 78% (66% de identidad y 12% de cambios conservativos) y con la P2 humana un 73% (59% de identidad y 14% de cambios conservativos). En la biblioteca de expresión de L.(V.) braziliensis se aisló un recombinante (LbbP2b -like) con la sonda la P2a de L.(L.) infantum. Este recombinante contiene un inserto de aprox. 750 pb., presentando un marco de lectura abierto de 264 pb. que codifican los 87 aminoácidos C-terminales de una proteína ribosomal P2b atípica de L.(V.) braziliensis. La comparación de aminoácidos es mayor con el recombinante LbpP2b con un 72% (52% de identidad y 20% de cambios conservativos), un 69% con la de L.(L.) infantum (49% de identidad y 20% de cambios conservativos), con la P2 humana un 64% (35% de identidad y 29% de cambios conservativos), con la T. brucei 58% (38% de identidad y 20% de cambios conservativos) y finalmente con la de T. cruzi un 53% (31% de identidad y 22% de cambios conservativos). Al analizar la respuesta humoral de pacientes con L. Mucocutánea contra los recombinantes LbpP2a y LbbP2b -like, se vió que el epítope inmunodominante no se localiza en el extremo C-terminal, mientras que en las proteínas ribosomales P de T. cruzi, se había determinado el extremo C-terminal como el epítope inmunodominante (péptido R-13). De otro lado, pacientes con la Enfermedad de Chagas no reaccionaban con las proteínas ribosomales de tipo P2 de Leishmania sp., indicando que inducen anticuerpos Leishmania-específicos y que no cros-reaccionan con las de T. Cruzi.

Abstract:
I have performed the cloning of the hsp70 of Leishmania (Viannia) peruviana (recombinant U4) and characterization of the humoral inmune response in patients with American Tegumentary Leishmaniasis (ATL), Chagas’ disease (CH) and the mixed infection Chagas/Leishmaniasis (CH/L) against this protein. The recombinant U4 has an insert of 1,6 Kbp., presenting an open reading frame (ORF) of 525 bp, coding for the last 174 aminoacids. The recombinant U4 presents a high degree of homology with the recombinant Lbb1 (C-terminal domain of the hsp70 of L.(V.) braziliensis) of 98% (97% identity and 1% non conservative substitutions) and with the recombinant RA1 (C-terminal domain of the hsp70 of T. cruzi) of 87% (74% identity and 13% non conservative substitutions). I found two hsp70 genomic loci in the genome of the related species L.(V.) peruviana and L.(V.) braziliensis as determined by Southern blot. One locus comprised the tandem repeat of the hsp70 genes, which present a repetitive unit of 3,7 Kbp. I have cloned the U4, Lbb1 and RA1 cDNAs in the expression vector pGEX1l T to characterize the humoral inmune response in ATL, CH and CH/L as measured by ELISA, Phage dot array immunoassay and Western blot. I found a high reactivity of Mococutaneous Leishmaniasis sera with the U4/Lbb1 recombinant proteins, whereas most of the Cutaneous Leishmaniasis, Chagasic and non-related sera did not. I have also cloned the ribosomal P2-type proteins of L.(V.) peruviana (LbpP2a and LbpP2b ) and L.(V.) braziliensis (LbbP2b -like) by screening of the expression libraries with P2-type ribosomal proteins from L.(L.) infantum as probes. The recombinant LbpP2a has an insert of 900 bp. An ORF of 327 bp, codifying 108 aminoacids, lacking the three N-terminal residues to be a full length protein. This recombinant presents an homology of 95% (89% identity and 6% conservative substitution) with the homologous of L.(L.) infantum, 87% of homology (74% identity and 13% conservative substitutions) with the corresponding of T. cruzi and 65% of homology (44% identity and 25% conservative substitutions) with the human P2 protein. The recombinant LbpP2b has an insert of 271 bp, presenting on ORF of 144 bp, coding for the last 44 C-terminal aminoacids. It has an homology of 90% (81% identity and 9% conservative substitutions) with the corresponding of L.(L.) infantum, 86% of homology (78% identity and 8% conservative substitutions) with that of T. cruzi, 78% of homology (66% identity and 12% conservative substitutions) with the P2b protein of T. brucei and 73% of homology (59% identity and 14% conservative substitutions) with the human P2 protein. The LbbP2b -like protein has an insert of 750 bp, presenting an ORF of 264 bp. coding for the 87 C-terminal aminoacids. It has 72% of homology (52% identity and 20% conservative substitutions) with that of L.(V.) braziliensis, 69% (49% identity and 20% conservative substitutions) with that of L.(L.) infantum, 64% (35% identity and 29% conservative substitutions) with the human P2 protein, 58% (38% identity and 20% conservative substitutions) with the P2b of T. brucei and a 53% (31% identity and 22% conservative substitutions) with that of T. cruzi. In both Leishmania P2 proteins (LbpP2a and LbbP2b -like) evaluated, the most antigenic epitope was not located at the C-terminus, whereas in the T. cruzi P2 proteins the inmunodominant epitope was the last 13 C-terminal residues (R-13 peptide). Chagasic sera did not react with the ribosomal P2 proteins from Leishmania sp.

Trevani, Analía S.. "Factores capaces de condicionar la actividad biológica de los anticuerpos IgG : Acción de las enzimas proteolíticas e impacto de la carga eléctrica" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la presente Tesis, se estudió la capacidad de factores propios a los entornos inflamatorios e inherentes a los complejos inmunes (CI), de condicionar distintas respuestas biológicas inducidas a consecuencia de la interacción del fragmento Fc de los anticuerpos IgG con sus receptores celulares específicos (RFcg). Respecto a los primeros se evaluó el efecto de dos enzimas proteolíticas de distinta especificidad, pronasa y quimotripsina. Los resultados obtenidos indicaron que estas proteasas incrementan marcadamente la avidez y la funcionalidad del RFcgII expresado por neutrófilos, condicionando la magnitud de las respuestas biológicas que involucran la participación de este receptor. Este efecto, sin embargo, parece ser dependiente de las características del CI empleado como estímulo, puesto que las proteasas aumentaron notablemente las respuestas inducidas por eritrocitos sensibilizados con anticuerpos IgG y por CI solubles, pero no modificaron aquellas inducidas por CI precipitantes. La acción potenciadora de las proteasas parece ser selectiva del RFcgII, pues este efecto no fue observado en otros receptores operativos en neutrófilos. Considerando la existencia de altos niveles de proteasas en reas inflamatorias, es posible que este mecanismo sea relevante in vivo en la regulación de la actividad del RFcgII del neutrófilo humano. En cuanto a los factores inherentes a los CI, se analizó el impacto de la carga eléctrica de los antígenos y anticuerpos que los conforman, sobre su capacidad de inducir respuestas proinflamatorias y trombóticas mediadas por células fagocíticas y plaquetas, respectivamente. La cationización de la fracción IgG de los CI, procedimiento que incrementó sus pI desde 5,8-8,2 hasta 8,0-9,5, aumentó, al menos en un orden de magnitud, su capacidad de inducir funciones dependientes de los RFcg expresados por células fagocíticas tales como la citotoxicidad, la emisión de quimioluminiscencia y la liberación extracelular de elastasa. El efecto potenciador de la cationización fue a£n m s notable empleando plaquetas. Los CI que incluían anticuerpos IgG cationizados fueron capaces de inducir fuertes respuestas de activación de plaquetas lavadas, filtradas o plaquetas suspendidas en plasma, mientras que aquellos formados con componentes nativos fueron incapaces de inducir la activación plaquetaria bajo condiciones experimentales similares. La cationización del componente antigénico de los CI, también incrementó marcadamente su potencia biológica. En conjunto, estos hallazgos indican que la carga eléctrica de los CI constituye una propiedad critica que condiciona su capacidad de inducir la activación celular y sugieren que los anticuerpos y antígenos catiónicos podrían ser relevantes en eventos inflamatorios asociados a enfermedades que cursan con altos niveles de CI circulantes. Durante el transcurso de estos estudios se realizaron observaciones adicionales relacionadas con el desarrollo de procesos inflamatorios agudos. El paradigma corriente asume que las capacidad quimiot ctica de la IgG reside en su habilidad para formar CI e inducir la activación del sistema complemento y la subsecuente producción de péptidos quimiot cticos como el C5a. En la presente Tesis, se observó que los CI son capaces, per se, de estimular la quimiotaxis de neutrófilos a través de su interacción con el RFcgII. Esta actividad quimiot ctica intrínseca de los CI podría ser responsable, al menos en parte, delreclutamiento de neutrófilos observado en sitios inflamatorios de huéspedes deficientes de complemento.

Abstract:
In the current Thesis it was studied the ability of different factors to condition biological functions induced by the interaction of the Fc fragment of IgG antibodies with their cellular specific receptors (FcgR). Both factors belonging to inflammatory focus and IC-intrinsecal factors were evaluated. Among the formers, the effect of two proteolytic enzymes with distinct specificity, pronase and chymotrypsin, was analyzed. The results obtained showed that proteases markedly increase the avidity and functionallity of FcgRII, conditioning the magnitude of the biological responses that involve this receptor. However, this effect appears to be dependent on the characteristics of the IC employed as stimulus judging by the capacity of proteases to increase functions induced by erythrocytes coated with IgG antibodies and soluble IC but not those induced by precipitating IC. The enhancing action of proteases seems to be restricted to FcgRII-dependent functions since proteases did not up-regulate the activity of other receptors expressed by neutrophils. Taking into account the high levels of proteases in inflammatory areas, these findings suggest that a mechanism involving the action of proteolytic enzymes could be relevant for the in vivo regulation of human neutrophil FcgRII activity. Among IC-intrinsecal factors, the impact of electric charge of their antibodies and antigens on their ability to induce proinflammatory and thrombotic responses mediated by phagocytes and platelets was analyzed. Cationization of the IgG fraction of IC, procedure that increased its pI from 5.8-8.2 to 8.0-9.5, enhanced at least by tenfold their ability to induce RFcg-dependent functions by phagocytic cells such as cytotoxicity, chemiluminescence emission and the elastase extracellular release. Noteworthy, it was observed that IC prepared with cationized antibodies were able to trigger platelet activation either in washed platelets, gel-filtered platelets or plasma suspended platelets. By contrast, IC formed with native components did not induce platelet activation under similar experimental conditions. Additional experiments showed that antigen cationization also markedly increses IC biological activity. These findings suggest that the electric charge of IC constitutes a critical property that conditions their ability to induce cellular activation and support a role of cationic antibodies and antigens in the development of inflammatory events associated to certain IC-induced diseases. During the course of these studies, additional observations related to the development of acute inflammatory processes were made. The current paradigm for the mechanism by which IgG induce neutrophil chemotaxis assert that this ability lies on its capacity to form IC and induce complement activation with the subsequent generation of chemotactic peptides such as C5a. In the current Thesis, it was observed that IC are able, per se, to induce neutrophil chemotaxis through their interaction with FcgRII. This intrinsic chemotactic activity of IC may account, at least in part, for the neutrophil recruitment that is observed at inflammatory sites in complement-deficient hosts.

Mirkin, Gerardo A.I.. "Mecanismos inmunopatogénicos en la neuromiopatía chagásica experimental" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los mecanismos patogénicos subyacentes a las alteraciones neuromusculares producidas durante la infección con Trypanosoma cruzi fueron estudiados en un modelo murino empleando una cepa miotrópica de escasa virulencia (CA-I) y una cepa letal pantrópica (RA), mediante técnicas electrofisiológicas, histológicas e inmunológicas. Ratones C3H/HeN infectados con la cepa CA-I manifestaron un patrón electromiográfico de compromiso muscular primario, en tanto los infectados con RA, revelaron un patrón neuropático primario. Los estudios histopatológicos evidenciaron alteraciones inflamatorias de severidad creciente en los tejidos afectados estudiados en este modelo: músculo isquiotibial, nervio ciático y médula espinal. Las lesiones musculares eran de mayor intensidad en la infección con CA-I y las de tejido nervioso predominaban con RA, lo cual está de acuerdo con el tropismo parasitario. El fenotipo celular predominante en los infiltrados inflamatorios dependió de la cepa de T.cruzi, del tejido y del tiempo post-infección. Los rasgos más destacados en la infiección con la cepa CA-I fueron: a) Predominio de linfocitos T CD4 en músculo esquelético durante la fase aguda y crónica temprana y, b) Presencia de linfocitos B con IgM de superficie en la fase crónica tardía en todos los tejidos. Las características más relevantes de la infección con RA fueron: a) predominio de linfocitos T CD8 en tejido nervioso durante todo el curso de la infección, b) presencia de células NK (asialo-GMl+) en tejido muscular durante la fase crónica y, c) presencia células CD4-, CD8- en tejido nervioso durante la fase crónica. Estudios de proliferación linfocitaria realizados durante la infección crónica con el clon K-98 de CA-I demostraron la existencia de linfocitos T CD4 y CD8 autorreactivos frente a Ag de tejido muscular esquelético y sistema nervioso. En estudios similares con la cepa RA ambassubpoblaciones de linfocitos T sólo proliferaron frente a Ag de SN. La transferencia pasiva de linfocitos T CD4 de ratones infectados con K-98, indujo miositis con predominio de células T CD4+ y macrófagos en ratones singeneicos normales, sugiriendo el desarrollo de hipersensibilidad retardada (HR), frente a Ag musculares. Los linfocitos T CD8 de los mismos ratones no desencadenaron patología neuromuscular en los receptores. La transferencia de linfocitos T CD4 y CD8 de ratones infectados con RA, indujo neuritis y leptomeningitis, sugiriendo el desarrollo de mecanismos de HR como de citotoxicidad dependiente de linfocitos T frente a Ag de sisterna nervioso.

Abstract:
The pathogenic mechanisms underlying the newomuscular alterations during manosoma d infedion were studied in a mnurh?e model by means of electrophysiological, histological and immunological techniques in inbred mice infected with a low virulence myotropic strain (CA-I) and a highly virulent pantropic strain by means of electrofisiological, histological and immunological techniques. C3H/HeN mice infected with CA-I showed an electromyographic pattern of primaxy muscle compromise while those infected with RA disclosed a primary neuropathic pattern. Histological studies revealed inflammation of increasing severity in the affected tissues studied in this model: hamsting muscle, sciatic nerve and spinal cord. The muscle lesions were more intense in mice infected with CA-I, and those in nervous tissue were more intense in mice infected with RA in agreement with the parasite tropism. The predominant phenotype in the inflammatory infiltrates depended on the T.cruzi strain, the tissue and post-infection time studied. The relevant features in the infection with CA-I were: a) Predominance of CD4 T lymphocytes in skeletal muscle during the acute and early chronic phases and, b) Presence of surface IgM positive B lymphocytes during the late chronic phase in all tissues. The relevant fatures in the infection with RA were: a) Predominance of CD8 T lymphocytes in nervous tissue during the course of infection, b) Presencia of NK cells (asialo-GMl+) in muscle tisuue during the chronic phase and, c) Presence of CD4-, CD8- cells in nervous tissue during the chronic phase. Lymphocyte proliferation studies performed during the chronic phase with the K-98 clone of CA-I showed the existence of nervow system Ag and muscle Ag autoreactive CD4 and CD8 T lymphocytes. In similar studies with the RA strain both T cell subsets proliferated against nervous tissue Ag only. Pasive cell transfer of CD4 T lymphocytes fiom K-98-infected mic, induced myositis with predominance of CD4 T cells and macrophages in normal syngeneic mice, suggesting the development of delayed-type hypemdtivity (DTH) against muscle Ag. CD8 T lymphocytes fiom the same donors did not develop neuromuscular pathology in recipients. The transfer of CD4 and CDS T lymphocytes fiom RA-infected mice induced neuritis and leptomeningitis in recipients, suggesting the development of both DTH and T lymphocyte-dependent cytotoxicity against nervous system Ag.

Monte, Martín. "Estudio sobre la activación de linfocitos para inducir angiogénesis durante la portación tumoral" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La angiognésis tumoral es el proceso que involucra la proliferación de vasos sanguíneos hacia el tumor en desarrollo. Los capilares que llegan al tumor aportan nutrientes y oxígeno y la vía de acceso de las células tumorales a circulación. Por lo tanto, este proceso es indispensable para el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica. Además de existir factores angiogénicos liberados por la células tumorales, se ha descripto que células del huésped pueden colaborar en este proceso. En este laboratorio se demostró que los linfocitos T provenientes de ratones portadores de tumor, tienen actividad angiogénica. El objetivo de este trabajo fue identificar factores que estuvieran alterados durante el crecimiento tumoral y que fueran capaces de estimular los linfocitos para desencadenar la respuesta angiogénica (SLIA). Particularmente se estudió la importancia de la síntesis de poliaminas (PA) y de la producción de radicales libres de oxígeno (ROS) en este proceso. Se encontró que si bien la síntesis activa de PA es indispensable para la actividad angiogénica de los linfocitos, estos metabolitos no son inductores de SLIA. Cuando se investigó la importancia de la producción de ROS en la SLIA, se observó: a) el bloqueo de la SLIA por la administración de secuestradores de ROS a ratones portadores de tumor; b) aumento de peroxidación lipídica en el bazo de ratones portadores de tumor; c) aumento en el cociente entre la actividad de las enzimas antioxidantes SOD y CAT en el bazo normal, que continuaba incrementándose durante el crecimiento tumoral. Luego se determinó in vitro que el peróxido de hidrógeno era el único ROS capaz de inducir esta respuesta angiogénica, coherentemente con los hallazgos realizados in vivo sobre la peroxidación lipídica y el desbalance SOD/CAT. Finalmente se observó que la administración in vivo de esta molécula estimula la respuesta SLIA en forma análoga a la inducida por las células tumorales.

Abstract:
Solid tumors induce an angiogenic response by the host blood vessels to form a new vascular network for the supply of fresh nutrients and oxygen. This neovascular response is responsible for tumor growth and metastatic spread. We have previously observed that, in addition to tumor cells, T-lymphocytes from tumor-bearing mice induced angiogenesis in syngeneic combination. This response was called SLIA (syngeneic lymphocyte-induced angiogenesis). The aim of this work was to identify factors related to tumor development capable to stimulate lymphocytes to induce angiogenesis. Since polyamine biosynthesis and reactive oxygen specis (ROS) production were increased during tumor growth, we focused the study on these processes. Using the irreversible inhibitor of the Ornithine Decarboxilase, a-DFMO we observed the in vivo and in vitro inhibition of the SLIA, but the treatment of lymphocytes with the polyamine putrescine failed to stimulate these cells induce angiogenesis. These results suggest that lymphocytes would require an active polyamine biosynthesis to induce angiogenesis but polyamines are not molecules capable to trigger this process. On the other hand, we blocked the SLIA by the administration of an antioxidant to tumor-bearing mice. Moreover, we stimulate normal lymphocytes to induce angiogenesis by the incubation of the cells in a ROS generator medium. Studies on lymphocytes stimulated in vitro by ROS to induce angiogenesis, showed that only the enzyme catalase could block the activation. The incubation of normal lymphocytes with H2O2 stimulated these cells to induce angiogenesis. The administration of hydrogen peroxide or an oxidative stress-producing drug (doxorubicin) to normal mice activated in vivo the SLIA response. On the other hand, we observed evidences of oxidative stress measuring high contents of lipid peroxidation products in the spleen. Moreover, when the ROS scavenger enzymes (superoxide dismutase-SOD and catalase-CAT) were determined, we observed low CAT activity in normal spleens, reflected on a high SOD/CAT ratio, when compared to liver or kidney values. We also showed an increasing value of the SOD/CAT ratio along with tumor growth. These results strongly suggest that hydrogen peroxide could be involved on the mechanisms of lymphocyte activation to induce angiogenesis during tumor growth.

Ballaré, Cecilia J.. "Heterogeneidad celular en carcinomas mamarios humanos" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Dos objetivos principales fueron planteados en este trabajo: 1) investigar la heterogeneidad celular en carcinomas mamarios humanos, caracterizando distintas subpoblaciones celulares respecto a proliferación y expresión de diversos marcadores tumorales; 2) obtener anticuerpos monoclonales (AMC) contra estos tumores, con propiedades citotóxicas, que reconozcan células indiferenciadas, de alto potencial proliferativo. Los estudios de heterogeneidad celular fueron realizados utilizando muestras tumorales humanas, la proliferación evaluada mediante incorporación de Timidina y marcadores por inmunohistoquímica. Los resultados permitieron establecer una secuencia de expresión de marcadores a medida que progresa la diferenciación celular y disminuye la capacidad proliferativa. Pudieron identificarse marcadores asociados a distintas etapas de la diferenciación (NCA90, receptor estroncio, receptor de progesterona, TAG72, CaMBr1, CEA) y otros que comienzan a expresarse en células indiferenciadas, altamente proliferativas, y continuarían durante todo el proceso de diferenciación (Ag2.15, PEM). Se investigaron también las propiedades del AMC FC-2.15 (anti-Ag2.15) desarrollado utilizando como inmunogeno un carcinoma mamario humano indiferenciado. FC-2.15 presento una potente citotoxicidad contra células Ag2.15+ mediando lisis por complemento humano, reconocio un antígeno presente en membrana plasmática en alta densidad (2,8x10 6 /célula) y fue lentamente internalizado. Los resultados presentados en este trabajo sugieren que FC-2.15 podría ser útil en inmunoterapia de pacientes con neoplasias Ag2.15+.

Abstract:
The main purposes of this study were: 1) to investigate the cell heterogeneity in human breast cancer and characterize the different cell subpopulations with regard to proliferation and expression of tumor markers; 2) to obtain monoclonal antibodies (MAb) against these tumors which recognize highly undifferentiated (stem) cells, and mediate specific cytotoxicity. Cell heterogeneity was studied in human tumor samples, proliferation was evaluated by thymidine incorporation and markers by immunohistochemistry. According to the results, it could be defined a regular sequence of marker expression as cell differentiation proceeds and proliferation decreases. Some markers were identified which are expressed in different stages of the differentiation pathway (NCA90, estrogen receptor, progesterone receptor, TAG72, CaMBr1, CEA). Conversely, the expression of other markers (Ag2.15, PEM) would start in undifferentiated-highly proliferative cells and remain throughout the whole differentiation process. It was also investigated the properties of MAb FC-2.15 (anti-Ag2.15) generated using an undifferentiated human breast carcinoma as immunogen. Results showed that FC-2.15 exhibits strong human complement-mediated cytotoxicity against Ag2.15+ cells. It recognizes a high-density antigen (2.8x10 6/cell) in the cell membrane and is slowly internalized. The results obtained in this study suggest that FC-2.15 could be a useful agent for passive immuntherapy.

Bigi, Fabiana. "Identificación y caracterización de antígenos de Mycobacterium bovis" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Franco, Marcela. "Resistencia concomitante antitumoral inducida por tumores murinos de distintos grados de inmunogenicidad" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La resistencia concomitante antitumoral (RC) es la capacidad de un individuo portador de un tumor de inhibir el crecimiento de un segundo implante tumoral realizado en un sitio distinto del primero. Se estudió este fenómeno en ratones eutímicos y atímicos, usando nueve tumores murinos con distintos grados de inmunogenicidad. Se describieron dos picos de RC durante el desarrollo del tumor primario. El primer pico fue generado sólo por tumores inmunogénicos pequeños, file específico e irreversible y estuvo asociado a mecanismos inmunológicos convencionales dependientes del timo. El segundo pico de RC fue compartido por tumores inmunogénicos y no inmunogénicos de gran volumen, fire inespecífico, timo-independiente y al menos en parte, reversible y estuvo asociado a la actividad de un factor/es inhibidor de aproximadamente 1000 D de peso molecular, presente en el suero de ratones portadores de tumor. Este factor ejercería un efecto inhibitorio directo e indirecto sobre el tumor secundario: el efecto directo se ejercería sobre las propias células tumorales; el efecto indirecto se ejercería a través de la inhibición de la neovascularización. El efecto inhibitorio se manifiesto como una inhibición de la proliferación —condisminución en el número de células en mitosis y de células positivas para el Antígeno Nuclear de Proliferación Celular (PCNA)- y como un aumento en el número de células en apoptosis. Asimismo, se observaron alteraciones en la cinética del ciclo celular, con un aumento de la fase S y disminución de las fases (G0-G1) y (G2-M).

Abstract:
Antitumor concomitant resistance is the phenomenon according to which a tumor-bearing host inhibits the development of secondary tumor implants carried out in a different site. This phenomenon was studied in euthymic and athymic mice, using nine murine tumors with widely different immunogenicity. Two temporally separate peaks of concomitant resistance were detected during primary tumor development. The first one was exhibited only by small immunogenic tumors; it was tumor-specific, irreversible and mediated by classical immunological T cell dependent mechanisms. The second peak was shared by both immunogenic and non-immunogenic large tumors; it was nonspecific, thymus-independent and partially reversible and correlated with the activity of an antitumor factor/s (molecular weight = 1000 D aprox.) present in the serum of tumor-bearing mice. This factor/s would exert direct and indirect inhibitory effects on secondary tumor growth, the former affecting tumor cells themselves and the latter limiting neovascularization. The inhibitory effect was associated with a decrease in the number of both cells in mitosis and cells expressing the Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), with an increase in the number of apoptotic cells and alterations in cell cycle kinetics, such as an increase in the proportion of cells in S phase and a decrease in (G0-G1) and (G2-M) phases.

O’Donnell, Vivian K.. "Diferenciación de animales vacunados de infectados por el virus de la fiebre aftosa por métodos serológicos" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de la Fiebre Afiosa (VFA), un Aftovirus de la familia Picornaviridae, es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa y de tremenda importancia económica, que afecta al ganado de pezuña hendida. La diferenciación entre animales infectados y vacunados así como la detección de animales portadores del virus o “carriers” es esencial para evaluar la efectividad de campañas de control y erradicación. La detección de anticuerpos (Ac) contra un antígeno (Ag) no estructural asociado con la replicación del virus, el Ag Asociado a la Infección Viral (Ag VIA), cuyo componente principal es la ARN polimerasa o proteína 3D, altamente conservada entre los diferentes serotipos, ha sido una herramienta útil para monitorear programas de control y erradicación, como un indicador indirecto para la evaluación de la actividad viral a nivel poblacional. Es conocido que vacunas inactivadas contra el VFA pueden inducir Ac contra el Ag VIA, si bien los niveles de estos Ac son muy bajos y su permanencia mas corta que en animales infectados. Esta respuesta transitoria y variable se atribuye a la presencia de restos de la polimerasa viral en el Ag vacunal, el cual sería antigénico y resultaría en la producción de Ac contra el Ag VIA. El método más ampliamente utilizado para medir Ac contra el Ag VIA es la Inmunodifusión en Agar Gel (IDAG). Este método es simple de realizar, pero su baja sensibilidad y el uso de un Ag parcialmente purificado derivado de cultivos infectados con el virus, llevó al desarrollo de otras metodologías. Con el objeto de sobrellevar estos inconvenientes, se desarrollaron ensayos inmunológicos capaces de detectar Ac contra proteínas no estructurales del VFA, para la identificación de animales infectados con el virus. Las proteínas no estructurales, 3D y 2C, se expresaron en Escherichia coli, como proteínas de fusión a glutation-S-transferasa (GST). Se desarrolló un método de ELISA en fase-líquida (ELISA-3D) capaz de detectar Ac específicos contra la proteína 3D o RNA polimerasa del VFA. El ELISA-3D, fue capaz de detectar Ac contra la proteína 3D en suero de bovinos luego de una infección natural o experimental, desde los 5 días postinfección (dpi) hasta los 565 dpi, mientras que sueros de bovinos provenientes de zona libre de Fiebre Aftosa, así como sueros de referencia de bovinos y porcinos infectados con diferentes virus ARN y ADN, fueron negativos, resultando en una especificidad del 100%. Los resultados de la comparación del ELISA-3D con la técnica de IDAG y con un ELISA-VIA descripto previamente (Alonso y col., 1990), los que utilizan el Ag VIA semipurificado, mostraron que el ELISA-3D es altamente sensible (95.2 %), específico (100%) y reproducíble (C.V. 2.75 %). Los ensayos en sueros de animales vacunados, mostraron una respuesta transitoria de Ac inducida por algunas vacunas. La evaluación del método de “Western blot” utilizando como Ag la proteína no estructural 2C, mostró una reacción positiva cuando se analizaron sueros de bovinos infectados, mientras que sueros de bovinos de zona libre no mostraron ninguna reactividad. El estudio de sueros de bovinos vacunados mostró 1/79 sueros con reactividad positiva para Ac contra 2C. Estos resultados indican que el método de ELISA-3D, es recomendable para ser utilizado como método complementario en estudios seroepidemiológicos para monitorear actividad viral. La respuesta de Ac contra 3D inducida por la vacunación en animales con una o dos vacunaciones es transitoria. El aumento en la frecuencia de reacciones positivas luego de la revacunación, indica que para el monitoreo de actividad viral en planes de control bajo vacunación, es necesario considerar los parámetros de reacción postvacunal contra 3D para una mejor interpretación de los resultados obtenidos por éstas técnicas. Finalmente, el uso de proteínas biosintéticas tiene ventajas en su estabilidad y pureza, evita el manejo de virus vivo y provee una fuente consistente de Ag. La detección de Ac contra otras proteínas no estructurales del VFA, como es el caso de 2C, proveería un mayor grado de confianza en la identificación de animales infectados con VFA.

Abstract:
Foot-and-mouth disease virus (FMDV), an Aphtovirus of the Picomaviridae family, is the causal agent of a highly contagious and economically important disease of cloven-hooved animals. Differentiation between infected and vaccinated animals and the detection of carriers animals are essential to evaluate the effectiveness of control and eradication campaigns. Detection of antibodies against a non-structural antigen associated with the replication of the virus, the virus-infection-associated (VIA) antigen, the main component of which is the viral RNA polymerase or 3D protein, highly conserved among all serotypes, has been a useful tool in monitoring control and eradication programmes, as an indirect indicator of viral activity at the population level. It is well known that inactivated vaccines against FMDV can induce antibodies against the VIA antigen, although the levels of antibodies and their persistence are lower than in infected animals. This transitory and variable response is attribuited to the presence of traces of the viral polymerase in the vaccine antigen, which could be antigenic and result in the production of antibodies against the VIA antigen. The most widely used method for measuring antibody to the VIA antigen is the Agar Gel Immunodiffusion (AGID). The method is simple to perform, but its low sensitivity and the use of partially purified antigen derived from infected cell cultures, made necesary the development of other methods. With the aim of overcome this difficulties, immunochemical assays were developed, able to detect antibodies against FIVHDV non-structural proteins for the identification of infected animals with the virus. Recombinant non-structural proteins, 3D and 2C, were expressed in Escherichia coli, as fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST). A liquid-phase blocking sandwich ELISA assay (ELISA-3D) able to detect specific antibodies to the 3D protein or RNA polymerase of FMDV was developed. The ELISA-3D, was able to detect antibodies against the 3D protein in cattle sera after natural or experimental infection as early as 5 days postinfection (dpi) and at later stages, 565 dpi, whereas sera from naive cattle from the FMD free area as bovine and porcine reference sera raised against different RNA and DNA viruses were negative, resulting in a specificity of 100%. Comparison of the ELISA-3D with the AGID and the ELISA-VIA previously described (Alonso et al., 1990), which used the semipurified VIA antigen, shows that the ELISA-3D is highly sensitive (95.2%), specific (100%) and reproducible (C.V. 2.75%). Assays in vaccinated cattle sera, demostrated a transitory antibody response induced by some vaccines. The evaluation of the “Western blot”, using as antigen the non-structural 2C protein, shows a positive reaction with sera from infected cattle, whereas sera from naive cattle from FMDV free area did not react. One of 79 sera from vaccinated cattle shows a positive antibody reaction against 2C. The results obtained here indicate that the ELISA-3D method must be used as a complementary method for seroepidemiological studies for monitoring viral activity. Antibody response to 3D induce in vaccinated or revaccinated animals was transient. The increase in the frequency of positive reactions after revaccination, suggest that to monitor viral activity in control programmes under vaccination, it is necessary to take into account the parameters of the post-vaccination anti-3D response, to make a better evaluation of the results obtained. Finally, the use of bioengineered proteins has advantages such as stability and purity, it does not require handling infective virus and provied a consistent source of antigen. The detection of antibodies to other non-structural proteins, as 2C, provides confirmatory evidence for the identification of FMDV infected animals.

Tami, María Cecilia. "Evaluación de vacunas peptídicas contra el virus de la fiebre aftosa en bovinos : Aislamiento y caracterización de mutantes de escape" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
EI virus de la fiebre aftosa (VFA) pertenece a la familia Picomaviridae y es el agente causal de la fiebre aftosa (FA). Esta enfermedad causa grandes pérdidas económicas en el mundo y se controla mediante vacunación regular con una vacuna a virus inactivado. Esta vacuna presenta desventajas relacionadas principalmente con la manipulación de grandes cantidades de virus vivo y la inactivación incompleta de las preparaciones virales. En este trabajo se evaluó el potencial de vacunas peptídicas representando los sitios antigénicos A y C derivados del VFA serotipo C3 unidos a un epitope para células T derivado del VFA de seotipo O, como alternativa a las vacunas convencionales. Con este fin, se realizaron 5 experimentos de vacunación que involucraron 120 bovinos en total y se estudiaron los efectos de diferentes esquemas de vacunación y distintas dosis de inmunógeno. En cada experimento se evaluó la inducción de anticuerpos neutralizantes, la linfoproliferaciónen respuesta a antígenos virales y la protección frente al desafío con virus homólogo. Los mayores niveles de protección alcanzados fueron del 40% y no fue posible establecer una correlación entre protección y título de anticuerpos neutralizantes o respuesta linfoproliferativa frente a virus entero. En 12 de 29 lesiones rescatadas de los bovinos vacunados con péptidos sintéticos que no resultaron protegidos frente al desafío viral, se aislaron virus mutantes con sustituciones aminoacídicas únicas en la región del sitio A, en posiciones críticas para la antigenicidad del VFA. Las posiciones que se vieron alteradas fueron R (141) —>G incluida en el triplete RGD altamente conservado en los diferentes serotipos de VFA, L (144) —>P y L (147) —>P. Las variantes virales se caracterizaron fenotipicamente en cuanto al tamaño de placa y a su velocidad de crecimiento y antigénicamente mediante ensayos de ELISA y neutralización con un panel de anticuerpos monoclonales secuenciales y conformacionales. Los resultados mostraron que las sustituciones L(144)—P y L(147)-P tienen un efecto muy importante en la antigenicidad del VFA y afectaron múltiples epitopes dentro del sitio antigénico A. La mutación R(141)-G, en cambio, tuvo un efecto menor afectando sólo la reactividad con un AcM. Se discuten las posibles modificaciones en la formulación de las vacunas peptidicas para aumentar su capacidad protectiva y las implicancias de las sustituciones aminoacídicas encontradas en las variantes virales.

Abstract:
Foot-and-mouth disease virus (FMDV) belongs to the Picomaviridae family and is the causative agent of foot-and-mouth disease (FMD). FMD is the economically most important disease of cattle and other farm animals and its control is based on regular vaccination with an inactivated whole-virus vaccine. However, there are several disadvantages in the use of such vaccines related to the risk of reintroduction of the disease by the handling of large ammounts of infectious virus or by incomplete inactivation of the antigen. In this work, the potential of peptide vaccines bearing antigenic site A and C regions and a T-cell epitope of FMDV serotype C3. was evaluated as an alternative to conventional vaccines. For this purpose, 5 different vaccination experiments, involving a total of 120 bovines, were carried out and the efects of modifications in the timing of the immunizations and of different doses of peptides were studied. Induction of neutralizing antibodies, lymphoproliferation in response to viral antigens and protection against challenge with homologous infectious virus were examined. The highest level of protection achieved was of 40% and protection showed a limited correlation with serum neutralization activity and lymphoproliferation in response to whole virus. In 12 out of 29 lesions from peptide vaccinated cattle that were not protected after challenge, FMDV mutants with a unique amino acid substitutions at antigenic site A, were identified. The replacements found were R(141)-G, at the highly conserved RGD motif, L(144)-P and L(147)-P. The results showed that substitutions L(144)-P and L(147)-P were critically involved in FMDV antigenicity afecting multiple epitopes within antigenic site A. However, substitution R(141)—G had a minor effect, affecting the reactivity of just one Mab. Variant viruses were also phenotipically and antigenically characterized. Possible modifications of the vaccine formulation to increase protective activity as well as implications of the substitutions identified in the viral mutants are discussed.

López Bergami, Pablo. "Estudio molecular y funcional de la patología cardíaca inducida por inmunización con proteínas ribosomales P de Trypanosoma cruzi" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estudio de la respuesta inmune contra las proteínas ribosomales P de Trypanosoma cruzi en el suero de pacientes chagásioos crónicos sugirió que esta respuesta inmune podria jugar un importante rolen el desarrollo de la cardiomiopatía chagásica. En función de esos resultados se encaró una tarea de clonado de las proteinas ribosomales P213 y P0 de T. cruzi en vectores procariontes con el objeto de expresar y purificar abundantes cantidades de proteínas recombinantes. Estas proteínas se utilizaron para desarrollar modelos de inmunización en ratones. En primer término se determinó la especificidad de la respuesta inducida mediante estos modelos. Luego se estudió la respuesta contra los principales epítopes de éstas proteínas localizados en el extremo C-terminal (péptido R13 en TcP2β y P015 en TcP0). Se determinó que la respuesta contra estos epitopes fue similar a la observada en sueros humanos. Paralelamente, se realizaron estudios tendientes a determinar alteraciones en la función cardíaca de los animales inmunizados. De esta forma, mediante la realización de electrocardiogramas, se estableció el desarrollo de alteraciones en la generación del impulso nervioso (arritmias), alteraciones en la conducción intraventricular y en la repolarización. La participación de los anticuerpos anti-P en la generación de alteraciones cardíacas también fue confirmada en ensayos realizados sobre corazones aislados de conejo.

Abstract:
The study of the immune response against ribosomal P proteins of Trypanosoma cruzi in chronic Chagas disease patient's sera suggested that this immune response might play an important role in the development of Chagasic Cardiomiopathy. The molecular cloning of the ribosomal P26 and P0 proteins allowed us to express and purify high amounts of recombinant proteins. These proteins were used to develop animal models of immunization. First, we assessed the specificity of the induced response and determining the induction of high levels of anti-P antibodies. Then, we determined that the response against the C-terminal epitopes of these proteins (peptide R13 in Tc2β Band peptide P015 in TcP0) was similar to those observed in human sera. Immunized animals showed a modified electrocardiographic pattern compared to that in control mice. The participation of anti-P antibodies in the induction of cardiac disturbances was also assessed in a whole rabbit heart isolated system.

Ellerman, Diego A.. "Relación estructura-función de la proteína epididimaria de rata "DE", y su potencial uso para el desarrollo de un método de regulación de la fertilidad" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La glicoproteína epididimaria de rata "DE" se asocia al espermatozoide durante la maduración, y participa en el proceso de fusión de gametas a través de sitios complementarios presentes en la superficie del ovocito. Con el fin de comprender los mecanismos involucrados en la participación de DE en dicho proceso, se estudió la importancia de la estructura de DE para la actividad de la proteína. El clonado del ADNc de DE permitió obtener la secuencia de los 227 aminoácidos (aa) de la proteína. El análisis de dicha secuencia indicó que DE pertenece a la familia CRISP (cystein rich secretory proteins), y la presencia de 16 cisteínas en la molécula. El ADNc fue utilizado luego para expresar la proteína recombinante en bacterias (recDE). El estudio de recDE y de la proteína nativa deglicosilada, indicó que la actividad biológica residiría en la porción peptídica de la molécula. Por otro lado, el análisis del estado de oxidación de las cisteínas indicó que la mayoría de ellas formaría puentes disulfuro, y que la ruptura de los mismos afectaría la actividad de la proteína. La expresión de distintos fragmentos recombinantes de DE y su empleo en ensayos biológicos, reveló que la actividad de la proteína residiria en la región comprendida entre los aa 62-158. Resultados previos de nuestro laboratorio indican que la inmunización de ratas con proteína DE produce una respuesta inmune y una inhibición significativa de la fertilidad. El presente trabajo indica que los mecanismos responsables de dicha inhibición involucrarían la entrada de anticuerpos anti-DE al tracto reproductivo, su interacción con los espermatozoides, y la disminución de la capacidad fertilizante de los mismos, abriendo la posibilidad del potencial uso de DE para el desarrollo de un método inmunológico de regulación de la fertilidad. Dado que para ello es necesario poder disponer del antígeno en grandes cantidades, la proteína recombinante fue utilizada en ensayos de inmunización, que indicaron que recDE, al igual que la proteína nativa, es capaz de producir una respuesta inmune y una reducción de la fertilidad. Con el fin de investigar la posible aplicación de este método inmunológico en el hombre, la capacidad inmunogénica de la proteína humana homóloga a DE, proteína ARP, fue estudiada en un modelo de primates no humanos, observándose la inducción de una elevada respuesta inmune en los animales inmunizados. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo contribuyen al esclarecimiento de los mecanismos involucrados en la participación de DE en el proceso de fusión de gametas, y apoyan el potencial uso de esta proteína y sus homólogos para el desarrollo de un método inmunológicode regulación de la fertilidad tanto en animales como en el hombre.

Abstract:
Rat epididymal glycoprotein “DE” associates with sperm during maturation and participates in gamete fusion through complementary sites localized on the egg surface. To get a better understanding of the molecular mechanisms underlying the participation of DE in this process, the relevance of protein DE structure for its biological activity was studied. Cloning of DE cDNA allowed obtaining the sequence of the 227 aminoacids (aa) of the protein. The analysis of the sequence, indicated that DE belongs to the CRISP (cystein rich secretory proteins) family, and the presence of 16 cysteines in the molecule. DE cDNA was then used for the bacterial expression of the recombinant protein (recDE). The study of recDE as well as of the deglycosilated native DE (nDE) indicated that the activity of the protein resides on the peptidic portion of the molecule. The evaluation of the oxidative state of cysteines indicated that most of them would be involved in disulfide bridges, and that the rupture of these bridges would affect the protein activity. The expression of different recombinant fragments of DE, and their use in biological assays indicated that the biological activity of DE would be located within the region encompassed by aa 62-158. Previous results from our laboratory indicate that immunization of rats with protein DE induces an immune response and a significant inhibition of fertility. The present study indicated that the mechanisms responsible for this inhibition would involve the entry of antibodies into the reproductive tract, their association to sperm, and the reduction of sperm fertilizing ability. These results suggested the potential use of DE for developing and immunological method of fertility regulation. Since an important requirement for this purpose, is the possibility of obtaining the antigen in large quantities, recombinant DE was used in immunization studies, which revealed that, like native DE, recDE is able to produce an immune response as well as an inhibition of fertility. In order to explore the potential application of this immunological approach to humans, the immunogenic ability of the human protein homologue of DE, protein ARP, was evaluated in a non human primate model. The induction of a high immune response was observed in all the immunized animals. Together, the results obtained in this work contribute to a better understanding of the molecular mechanisms underlying the participation of DE in sperm-egg fusion, and support the potential use of DE for the development of an immunological method of both animal and human fertility regulation.

Tekiel, Valeria. "Autoinmunidad en la infección experimental por Trypanosoma cruzi" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En Argentina, el 10% de la población crónicamente infectada con Trypanosoma cruzi presenta patología en sistema nervioso periférico (SNP). En la presente Tesis se estudió la participación de mecanismos inmunes en la inducción de patología a nivel de lo que denominamos genéricamente SNP, representado por el arco médula espinal-nervio ciático-músculo isquiotibial. Empleamos como modelo, ratones C3H/HeN infectados con las cepas RA o CA-I de T. cruzi que evidencian signos de daño principalmente en nervio ciático y médula espinal o en músculo esquelético, respectivamente. Además, linfocitos T (LT) de estos animales son capaces de injuriar de manera selectiva los órganos antes mencionados por transferencia pasiva en ausencia de parásitos. Hemos definido esos tejidos como blanco de daño para cada una de las cepas de T. cruzi. La respuesta inmune humoral, evaluada por IFI sobre cortes de tejido normal, no mostró diferencias cepa-dependientes; los patrones de marcación evidenciaron depósitos de IgG en intersticio de músculo y en vainas de mielina en nervio. Los sueros con reactividad positiva hacia antígenos conformacionales de nervio fueron definidos como Ne+. La inyección epineural de sueros Ne+ altera la conducción del nervio ciático de manera cepadependiente. Así, sueros de ratones infectados con la cepa RA/Ne+ inducen aumento del tiempo de latencia y disminución en la amplitud del potencial de acción nervioso (PAN) en los animales receptores, 4 días post- inyección (dpy). Por el contrario, sueros de animales infectados con la cepa CA-I no afectan ningún parámetro del PAN. La inyección de IgG purificada de sueros RA/Ne+ también disminuye la amplitud del PAN, indicando la presencia de un menor número de axones funcionantes. En coincidencia se observan depósitos de IgG marcando fibras axonales y/o vainas de mielina e infiltrados inflamatorios leves en los nervios inyectados con suero RA/Ne+ pero no en los inyectados con suero CA-I/ Ne+, a los 4 dpy. No se detecta presencia de parásitos en los nervios de animales receptores de sueros (PCR). Las alteraciones del PAN luego de la inyección de suero RA/Ne+ son similares a las detectadas en animales crónicamente infectados y en ratones inyectados con tripomastigotes en el epineuro l7 dpy. En conjunto, estos resultados indican la participación directa de autoanticuerpos en las alteraciones electrofisiológicas observadas en sistema nervioso periférico en la enfermedad de Chagas. En relación con la participación de LT en esta patología, se estudió el repertorio de las cadenas variables β del receptor de células T (TCRVβ) en distintos tejidos de animales crónicamente infectados con ambas cepas de T. cruzi. En bazo, se observa la sobreexpresión del segmento TCRVβ l3 y sub-expresión del segmento TCRVβ l4, lo cual podría ser marcador de infección. En SNP, se detecta un alto número de cadenas expresadas en los tejidos blanco de daño, que refleja la presencia de un importante infiltrado inflamatorio. Significativamente, se observa el uso relativo aumentado del segmento TCRVβ9 en los tejidos blanco de daño para cada cepa: nervio y médula en los animales infectados con RA y músculo en los infectados con CA-I. Esto demuestra la existencia de un patrón de expresión diferencial de segmentos en el sitio de lesión con respecto a la expresión periférica. El clonado, secuenciación y análisis del polimorfismo de secuencia de la región CDR3 de los segmentos TCRVβ9 sobre-expresados demostró una alta proporción de clones idénticos en animales infectados con RA (médula y nervio), que podría estar indicando la presencia de LT autorreactivos en el sitio de lesión. Además, la elevada producción de citoquinas pro-inflamatorias en los tejidos blanco de daño sugiere que la respuesta inmune local tiene un papel relevante en el proceso inflamatorio. Por otro lado, en los órganos que no son blanco principal de daño para cada una de las cepas de T. cruzi, donde no se encontraba sobre-expresión del segmento TCRVβ9, se observó dominancia clonal en la secuencias de la región CDR3. Este hecho, conjuntamente con la imposibilidad de reproducir daño por transferencia pasiva de células, el hallazgo de material parasitario y la baja producción de IL-6 y TNFα, sugiere que los clones mayoritarios detectados en los tejidos que no son blanco principal de daño están dirigidos hacia antígenos parasitarios contribuyendo al control local de la infección.

Abstract:
In Argentina, l0% of the chronically Trypanosoma cruzi-infected population develops peripheral nervous sytem (PNS) pathology. Herein we studied the participation of immune mechanisms in the pathology of the PNS (spinal cord-sciatic nerve- hamstring muscle axis). Using the C3H/HeN mouse strain and two T. cruzi subpopulations (RA and CA-I) it is possible to induce pathology mainly in skeletal muscle (CA-I) or in sciatic nerve and spinal cord (RA). T cells are able to injure the organs above mentioned in absence of parasites in a strain-dependent way. Therefore, we have defined these organs as target of pathology for each T. cruzi strain. The humoral immune response, evaluated by IFAT, against comformational muscle and nerve antigens was simmilar for RA and CA-I antisera; deposits of IgG were observed at the interstitial matrix in skeletal muscle and in the myelin sheats in sciatic nerve. Sera with positive reactivity against sciatic nerve were defined as Ne+. The epineural injection of sera from infected mice in syngeniec recipients altered the sciatic nerve conduction. This effect was parasite-strain dependent since just recipients of sera obtained from mice infected with the RA strain showed electrophysiological alterations. Moreover, among the sera from RA-infected mice, only those RA/Ne+ were able to induce prolonged latencies and diminished amplitudes of the sciatic nerve action potential (SNAP). On the contrary, sera fron CA-I-infected mice did not alter any SNAP parameter. The abnormalities observed in the amplitude of SNAP seemed to be mediated by IgG since purified antibodies from RA/Ne+ injected epineurally provoke the same effect than the whole sera, demonstrating the expression of a lower number of functional axons. In accordance with these results, IgG deposits labeling the axonal course and/or mielyn sheats as well as mild inflamatory infiltrates were found in the nerves injected with RA/Ne+ sera but not in those injected with CA-I/Ne+ sera 4 days post-injection (dpi). No parasite DNA was detected in the nerves. SNAP alterations in serum recipients are simmilar to those observed in chronically-infected animals or in mice injected in the epineurum with trypomastigotes, l7 dpi. Results presented here indicate the direct participation of autoantibodies in the pathology observed in PNS in chronic Chagas’ disease. To analyze the participation of TL in pathology in our model, we have studied the T cell receptor Vβ (TCRVβ) repertoire in different tissues of chronically-infected mice. Overexpression of TCRVβ 13 and underexpression of TCRVβ l4 segments were observed in spleen of infected mice, suggesting that these peripheral TCRVβ usages can be markers of infection. In PNS tissues, it was deteceted a high number of segments expressed in the target organ of damage, reflecting the strong inflammatory infiltrate. There was an over representation of TCRVβ 9 segment in sciatic nerve and spinal cord in RA- and in skeletal muscle in CA-I-infected mice, showing a differential expression pattern between the target organ of disease and the peripheral repertoire. The sequence polymorphism analysis of the CDR3 region of over-expressed TCRVβ9 segments showed a high proportion of identical clones in sciatic nerve and spinal cord in RA-infected mice, that could denote the presence of autoreactive TL. Moreover, the elevated production of pro-inflammatory cytokines in situ suggests that the local immune response is contributing to the severe pathology observed in those organs. On the other hand, clonal dominance was observed in TCRVβ9 segments not-over-expressed in the tissues that are not the main target of damage for each T. cruzi strain. This fact, together with the fail to induce damage by passive cell transfer in these tissues, the presence of parasite in situ and the low production of TNFα and IL-6, suggest that the the main clones are directed to parasite antigens and contribute locally to the control of the infection.

Romera, Sonia Alejandra. "Inmunomodulación de la respuesta inmune inducida por vacunas inactivadas contra herpesvirus bovino-1" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se evaluó en bovinos la respuesta inmune humoral y celular inducida después de la vacunación con vacunas contra HVB-l y el subsecuente desafío con la cepa LA de HVB-l. Los animales fueron vacunados intramuscularmente (IM) con vacunas inactivadas contra HVB-I conteniendo aceite mineral , aceite mineral con Avridine (emulsiones agua en aceite), o aceite no mineral (squalane) con un sulfolipocliclodextrin (SL-CD/S/W, emulsión aceite en agua). No se registraron diferencias significativas en los niveles de anticuerpos inducidos por las 3 vacunas evaluadas. Sin embargo la respuesta celular fue más elevada y temprana cuando estaba incluido en la formulación vacunal el SL-CD/S/W. Se evaluó la eficacia de las vacunas después del desafpio intranasal con la cepa virulenta LA de HVB-I. Los animales vacunados con SL-CD/S/W tuvieron menor excreción viral y menores síntomas clínicos que los animales controles sin vacunar. Cuando se relacionaron los niveles de IgG2 e IgG1 con la reducción de excreción viral se observó que, independientemente del adyuvante utilizado, el grupo que presentó al momento del desafío, niveles de la relación IgG2/IgG1 mayores a l fue el grupo que presentó menor número de animales con excreción viral. Además los animales inoculados con SL-CD/S/W no presentaron reacciones adversas. Todos estos factores combinados con la gran eficacia y la fácil manipulación del aceite biodegradable hace de la vacuna formulada con este nuevo adyuvante una importante contribución para la industria de vacunas veterinarias.

Abstract:
The antibody and cell mediated immune responses induced by BHV-l were analysed in cattle after vaccination and challenge exposure to the virulent strain LA of BHV-l. Animals were vaccinated intramuscularly (IM) with inactivated virus vaccines against BHV-I containing either a water in mineral oil adjuvant (W/O), a water in mineral oil adjuvant plus Avridine (W/0+Avridine) or sulfolipo-cyclodextrin in squalane in-water emulsion (SL-CD/ S/W). No significatives difierences were registered in the antibody response induced by the three evaluated vaccines. However, the BHV-l specific cell-mediated immunite response was stronger and appeared earlier when SL-CD/S/W was included in the formulation. The efficacy of the vaccines was also evaluated after intranasal challenge of the calves with a virulent BHV-1 LA strain. Animals vaccinated with SL-CD/S/W had reduced virus excretion and clinical symptoms compared with the mock-vaccinated animals. Comparison of levels of BHV-1 specific IgG2 and IgG1 with virus shedding revealed that, regardless of the adjuvant administered, animals showing BHV-l specific IgG2/IgG1 ratios higher than 1 were those with a significant lower number of individuals shedding virus. Additionally, animals vaccinated with SL-CD/S/W presented no postvaccinal reactions. These factors, combined with the higher efficacy and the ease of manipulation of the biodegradable oil, makes the vaccine formulated with this new adjuvant an important contribution for the veterinary vaccines industry.

Schettini, Jorge L.. "IgA y plaquetas como moduladores del fenómeno apoptótico en granulocitos neutrófilos y eosinófilos" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la presente Tesis desarrollamos dos líneas de investigación, relacionadas ambas con la identificación y caracterización de factores propios al microambiente inflamatorio capaces de modular la apoptosis de granulocitos neutrófilos y eosinófilos. En relación a los neutrófilos hemos demostrado que Ia IgA inmovilizada, tanto plasmática como secretoria, promueve notoriamente el proceso apoptótico. En contraste, las formas solubles de la IgA plasmática y secretoria, como así también la IgA agregada soluble no mostró actividad modulatoria alguna. El mecanismo subyacente a la capacidad de la IgA inmovilizada de promover la apoptosis del neutrófilo mostró depender de la actividad de la molécula MAC-1 (CD11b/CD18) y de la activación del estallido respiratorio. Por el contrario, no involucró la actividad del sistema Fas/FasL. En relación a los eosinófilos hemos demostrado que las plaquetas ejercen un poderoso efecto preventivo sobre el proceso apoptótico, prolongando dramáticamente la sobrevida celular. Hemos demostrado que las plaquetas producen GM-CSF y que esta citoquina juega un papel central en la prevención de la apoptosis de eosinófilos mediada por plaquetas. La posible relevancia de las observaciones realizadas, en relación al curso y/o etiopatogenia de entidades patológicas tales como la nefropatía por IgA y el fenómeno alérgico es discutida en la presente Tesis.

Abstract:
In the current Thesis we develop two lines of investigation, both related with the identification and characterization of the own factors from inflammatory microenviroments able to modulate the apoptotic rate of neutrophilic and eosinophilic granulocytes. We found that culture of neutrophils on immobilized plasma IgA (ilgAp) or secretory IgA (iIgAs) induced a marked increase in apoptotic rates. By contrast, soluble IgAp, IgAs, or aggregated-plasma lgA (algAp) exerted no effect. Promotion of apoptosis by iIgA was almost completely prevented by blocking antibodies directed to either CD18 or CD11b, and showed to be dependent on the activation of the respiratory burst. We also report here that platelets delay apoptosis enhancing eosinophil survival. A marked inhibition of spontaneous apoptosis was observed using eosinophil:platelet ratios of 1:50, 1:25 and 1:10. Moreover, we found that promotion of apoptosis by either pronase or dexamethasone was also markedly inhibited when the cellular cultures were performed in the presence of platelets. The anti-apoptotic effect mediated by platelets was depended on the release of soluble products, and was markedly inhibited by neutralizing antibodies directed to GM-CSF. Studies performed by flow cytometry, directed to analyze the cellular source of this cytokine, demonstrated that intracellular GM-CSF is present in resting platelets. Moreover, GM-CSF was found in platelet supernatants, at concentrations able to prevent eosinophil apoptosis. The possible significance of our findings, in relation to the development of pathologic entities such as lgA nephropathy and the allergic phenomenon are discussed in the current Thesis.

Rubel, Carolina Julieta. "Modulación de la funcionalidad y sobrevida de neutrófilos humanos por fibrinógeno a traves de beta sub 2 integrinas : análisis de los caminos transduccionales involucrados" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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La regulación de los procesos inflamatorios ocupa un lugar central en el mantenimiento de la homeostasis, ya sea durante el proceso de eliminación del agente agresor, durante las etapas posteriores de reparación de tejidos, o durante los procesos inflamatorios crónicos. El evento más importante en un proceso inflamatorio agudo lo constituye el acúmulo de neutrófilos (PMN) en el tejido injuriado. Durante estos procesos diversos factores como citoquinas, quemoquinas, agentes quimiotácticos (C5a, C3a), productos generados de la destrucción de las bacterias y factores del sistema de coagulación generan en los PMN una serie de cambios fenotípicos y morfológicos que llevan a la activación de los mismos y a su migración hacia los focos inflamatorios: en un primer momento los PMN interaccionan con el endotelio capilar a través de moléculas de adhesión denominadas L-selectinas, que les permiten unirse a sus paredes; luego dicha interacción se hace más firme a través de otras moléculas de adhesión como son las β2-integrinas. Aunque este es proceso fisiológico que tiende a mantener la homeostasis, bajo ciertas circunstancias, la interacción del endotelio con los PMN, células con un alto potencial citotóxico, puede llevar al daño endotelial y tisular. Por otra parte, las integrinas no sólo son responsables del reclutamiento leucocitario sino que desencadenan también diversas señales intracelulares. El fibrinógeno (Fbg), componente central del sistema de coagulación y proteína de fase aguda, es uno de los ligandos fisiológicos de la Bgintegrina Mac-l, CR3 o CD11b/CD18, presente en la superficie de los PMN. El objetivo del trabajo fue analizar si la interacción del Fbg soluble (sFbg) con los PMN activados durante un proceso inflamatorio, es capaz de modular su funcionalidad y sobrevida. Los resultados obtenidos permiten concluir que cuando los PMN han recibido señales inflamatorias se modifica la conformación del CDllb/CD18, de tal forma que aumenta su avidez por el sFbg, presente en el plasma o que ha trans-sudado a sitios inflamatorios. Dicha interacción resulta en la activación funcional de los PMN y en la inhibición de su mecanismo apoptótico. Así los PMN presentan una mayor actividad fagocítica y citotóxica y una mayor capacidad para volcar el contenido de sus gránulos con enzimas microbicidas y liticas. Estos resultados implican una conexión entre la cascada de coagulación y la respuesta inflamatoria. Sin embargo, los productos de degradación del sFbg pierden su actividad reguladora, resguardando procesos que descontrolados pueden tomarse sumamente dañinos para el huésped. Esta modulación de la actividad biológica no es más que la expresión de señales intracelulares específicas que resultan del balance de los distintos estímulos recibidos por las células. Aqui también se demuestra que la modulación de los PMN por el sFbg está mediada por una secuencia ordenada de fosforilaciones en residuos de tirosina de distintas proteinas, fundamentalmente la "Focal Adhesion Kinase" o Quinasa de Adhesión Focal (FAK) y la "extracellular regulated kinase" ERKl/2, proteína perteneciente a la familia de las "mitogen activated protein kinases" o proteinas quinasas activadas por mitógenos (MAPK). La activación de esta cascada juega un papel central en la inducción de degranulación, el aumento de la fagocitosis y el retardo de la apoptosis. Estos hallazgos aportan evidencias a favor de que la activación de la proteína ERKl/2 está asociada con un aumento en la actividad biológica y una disminución en los procesos de muerte celular en los PMN. El mecanismo apoptótico involucra además otras señales intracelulares, como la inducción de distintos factores nucleares y genes. Los factores de transcripción NF-kB son una familia de proteinas capaces de unirse a sitios reguladores del DNA modulando la expresión de diferentes genes entre ellos varios anti-apoptóticos. En esta tesis se demuestra que en los PMN el sFbg también activa el NF-kB, en forma secuencial a la activación de la ERKl/2 y que la translocación al núcleo del NF-kB, es responsable de la inhibición de la apoptosis. El conocimiento detallado de estos caminos intracelulares es de suma importancia para entender y, eventualmente, intervenir farrnacológicamente en enfermedades con un componente inflamatorio importante.

Fernández, Gabriela C.. "Participación de la respuesta inflamatoria en el desarrollo del Síndrome Urémico hemolítico" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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La forma típica del síndrome urémico hemolítico (D+SUH) es una microangiopatía trombótica caracterizada por anemia hemolítica con fragmentación de eritrocitos, trombocitopenia con agotamiento de la función plaquetaria y daño renal agudo. Esta enfermedad es la principal causa de daño renal en la población pediátrica y nuestro país presenta la mayor incidencia del mundo. Si bien la mortalidad es baja debido a las terapias de soporte empleadas en el tratamiento de los síntomas, existe una alta proporción de niños (hasta un 50%) que puede presentar secuelas renales y neurológicas. El D+SUH se desarrolla luego de la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas con bacterias productoras de una exotoxina denominada toxina Shiga (Stx). La bacteria coloniza el intestino, y comienza a producir la toxina que pasa a la circulación y se une a un receptor (Gb3) en los tejidos blanco (principalmente el riñón), donde se internaliza e inhibe la síntesis de proteínas. Si bien la Stx es absolutamente necesaria para el desarrollo de la enfermedad, existen evidencias que demuestran que el sistema inflamatorio puede influenciar el curso del D+SUH. El objetivo de esta tesis fue determinar la importancia de distintos componentes centrales de la respuesta inflamatoria como los neutrófilos (PMNs), las plaquetas y el óxido nítrico (NO) en la fisiopatología del SUH en un modelo murino por inyección endovenosa de la variante tipo 2 de la Stx (Stx2) pura. Asimismo, se investigó el estado de activación y funcionalidad de los PMNs periféricos de pacientes cursando el período agudo del D+SUH y luego de la recuperación clínica. Los resultados mostraron una disminución en la muerte y daño renal de los animales inyectados con Stx2 en ausencia de PMNs. Sin embargo, la depleción de plaquetas no tuvo ninguna influencia en estos aspectos. En los animales inyectados con Stx2 se observó una marcada neutrofilia, la cual correlacionó con el daño renal. Estos PMNs periféricos poseían mayor capacidad citotóxica, adhesión a la vasculatura y expresión del marcador de activación CD1lb. Estos datos evidencian una activación de los PMNs luego de la inyección de la Stx2 y demuestran la importancia de este tipo celular en el desarrollo del SUH como un factor de exacerbación del daño. Por otra parte, también se demostró una activación plaquetaria termprana en respuesta a la Stx2, con una inhibición posterior por agotamiento, similar a la observada en los pacientes. La inhibición de la producción de NO provocó un aumento del daño renal y la mortalidad inducidos por la Stx2. Estos fenómenos fueron mediados, al menos en parte, por una mayor activación plaquetaria en ausencia de NO. Los estudios histológicos apoyaron estos hallazgos y evidenciaron, por primera vez, la formación de coágulos intraglomerulares en los animales tratados con Stx2. Estos resultados sugieren un papel protector del NO en la fisiopatologia del SUH, mediado por su acción antitrombótica e inhibitoria de la activación plaquetaria. El estudio de los PMNs de los pacientes con D+SUH reveló una disminución en los marcadores de activación FcyRIII (CD16) y CD1lb, y en el marcador de degranulación mieloperoxidasa (MPO) y una menor respuesta citotóxica dependiente de anticuerpos y de degranulación con respecto a una población de niños sanos. Los PMNs de los pacientes presentaron una disminución del FcyRIII, la MPO y las respuestas citotóxicas con respecto a una población de niños con neutrofilia no relacionada con el D+SUH, aunque la capacidad de respuesta de degranulación entre ambas poblaciones fue muy similar. El fenotipo y funcionalidad de los PMNs de los pacientes en el momento en que acuden al hospital indica que este tipo celular se encuentra parcialmente agotado, debido a un fenómeno de activación previo. Probablemente, los efectos de la toxina sobre los PMNs sean indirectos y mediados a través de la activación y daño endotelial, ya que en nuestras condiciones y por distintas metodologías, la Stx fue incapaz de unirse y/o de causar ningún efecto en PMNs provenientes de individuos adultos normales. En conclusión, en este trabajo pudimos demostrar el papel central y modulador de distintos componentes de la respuesta inflamatoria en la fisiopatología del SUH.

Jancic, Carolina Cristina. "Células dendríticas humanas : caracterización de su interacción con proteínas de matriz extracelular y de su capacidad inmunoreguladora" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células dendríticas (DC) son las más eficientes células presentadoras de antígenos y cumplen un rol central en la inducción de la respuesta inmune primaria. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la interacción de las DC con otros tipos celulares y con la matriz extracelular (MEC); los factores que modulan dicha interacción; y la capacidad de las DC para inducir la proliferación de células T. Para ello se utilizaron DC obtenidas a partir de monocitos de sangre periférica (moDC) empleando interleuquina (IL) 4 y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), en presencia de suero humano (SH) o suero bovino fetal (SBF). Las moDC fueron capaces de adherirse a células endoteliales obtenidas a partir de vena de cordón umbilical humano (HUVEC) y a distintas proteínas de MEC. Esta adhesión fue modulada por citoquinas como el TNFα y la IL1β. Mientras que el tratamiento de las células endoteliales con TNFα indujo una mayor adhesión y migración de moDC, el tratamiento de las moDC con dicha citoquina provocó una disminución en la adhesión tanto a endotelio como a fibronectina (FN) y laminina (LM), pero no a colágeno tipo IV (Col tipo IV). Los efectos de esta citoquina fueron mediados por el receptor de tipo 11, cuya expresión disminuyó cuando las células se trataron con TNFα. La interacción de las moDC con HUVEC no activado fue parcialmente mediada por CD18, C029, CD49e y CD31. Por otro lado, la adhesión a proteínas de MEC fue mediada por las integrinas CD49e (para FN), CD49c y CD49f (para LM). La expresión de estas moléculas no se modificó con el tratamiento de las moDC con TNFα. Sin embargo, la activación de las integrinas con PMA revirtió el efecto inhibitoriodel TNFα sobre la adhesión a FN. Además de disminuir la adhesión a proteínas de MEC, el tratamiento de las moDC con TNFα e IL1β disminuyó el contenido intracelular de AMPc. Las células no adherentes a FN presentaron menores niveles de AMPc, mayor expresión de IL12 y mejor capacidad estimuladora de linfocitos T, comparadas con las células adherentes. En estas moDC el aumento del contenido de AMPc utilizando un inhibidor de la fosfodiesterasa o análogos de AMPc, revirtió el efecto del TNFα sobre la adhesión a FN y sobre su capacidad inmunoestimuladora. Por otro lado, estímulos “no clásicos” como el aumento de la osmolaridad extracelular modifican ciertas propiedades de las moDC, disminuyendo su capacidad endocítica. su adhesión a proteínas de MEC y su habilidad para inducir la proliferación de linfocitos T alogeneicos. El tratamiento hiperosmolar, además, provocó una disminución en el contenido de IL12, sin modificar la expresión de las moléculas HLA-I, HLA-DR, CD18, CD54 y CD86. Las moDC generadas bajo diferentes condiciones de cultivo presentaron características particulares. Las células cultivadas en presencia de SBF (moDC-SBF) expresaron CD80 en la superficie celular a diferencia de las células cultivadas en presencia de SH (moDC-SH). Estas últimas presentaron reservorios intracelulares de dicha molécula. Además, las moDC-SBF mostraron una mayor expresión de IL12 y una alta eficiencia para inducir la proliferación de células T durante una respuesta inmune antígeno específica, comparadas con las moDC-SH. Los resultados obtenidos en el presente trabajo sugieren que el TNFα actuaría sólo sobre la población de moDC que expresa el RTNF tipo II, posiblemente inactivando las integrinas que participan en la interacción con las proteínas de MEC, lo que resulta en una menor adhesión. Además, existiría una correlación entre el contenido de AMPc y los cambios inducidos por el TNFα en las moDC, tanto en la adhesión a FN como en su capacidad inmunoestimuladora. Por otro lado, el aumento en la osmolaridad extracelular podría generar moDC con baja habilidad para estimular la proliferaciónde células T, lo cual podría estar en parte debido a la menor producción de IL12 y la menor capacidad para incorporar antígenos bajo condiciones hiperosmolares. Finalmente, la expresión de CD80 podría depender de factores presentes en el suero utilizado durante el cultivo de las moDC. Resumen

Abstract:
Dendritic cells (DC) are professional antigens presenting cells that play a critical role in the induction of acquired immune responses. The aim of the present study was to analyze the cell-DC and extracellular matrix (ECM) proteins-DC interactions. The factors that modulate this interactions and the immunostimulatory capacity of DC were further examined. Monocytes derived DC (moDC) were used for these experiments. MoDC were able to adhere to endothelial cells obtained from human umbilical vein (HUVEC) and to ECM proteins. This adhesion was modulated by cytokines such as TNFα and IL1β. TNFa treated HUVEC increased moDC adhesion and migration. In contrast, TNFα treated moDC were less adherent to endothelium, fibronectin (FN) and laminin (LM), but not to collagen type IV (Col type IV). TNFα effect was mediated through TNF receptor II, which was downmodulated on TNFα-treated moDC. The moDC-HUVEC interaction was partially mediated by CD18, CD29, CD49e and CD31. The moDC adhesion to ECM proteins was mediated by CD49e for FN, and CD49c and CD49f for LM. The expression of these molecules did not change on TNFα treated moDC. However, PMA reversed the inhibitory effect of TNFα on FN adhesion, probably by integrin inactivation. TNFα also decreased the cAMP levels on moDC. Indeed, TNFα treated cells non-adhered to FN showed lower levels of cAMP, higher IL12 expression and better immunostimulatory capacity compared with FN adhered moDC. By increasing the cAMP content with a phosphodiesterase inhibitor (IBMX) or cAMP analogues (8Br-cAMP) was possible to reverse the TNFα effect on adhesion and T-cell stimulatory capacity. Alternatively, moDC incubated with high extracellular osmolarity detached from ECM proteins and showed lower immunostimulatory capacity, compared with cells in iso-osmolar conditions. The effect of hiperosmolarity could be mediated by IL12, since those treated moDC showed lower level of IL12 without changes in the expression of surface molecules. Some features of moDC were modified depending on the culture conditions. Cells cultured in the presence of fetal bovine serum (FBS) (moDC-FBS) expressed CD80 while CD80ˉ moDC were generated by using human serum (HS) (moDC-HS). However, the moDC-HS showed intracellular expression of this molecule. Other differences observed between these two moDC were the higher IL12 production and the capacity to stimulate antigen-specific T cells of moDC-FBS, compared with moDC-HS. Overall, these results suggest that TNFα and other non-classical stimuli act on some moDC decreasing the adhesion, probably by modulating the activation state of integrins. Furthermore, cAMP levels correlate with TNFα-induced changes of moDC adhesion and allostimulatory capacity. Finally, expression of CD80 on cellular membrane may depend on different factors present in serum, being FBS able to generate CD80+ moDC with better immunostimulatory capacity.

Mahler, Evelina Bárbara. "Rol de las proteínas ribosomales P de Trypanosoma cruzi en lasgeneración de anticuerpos con autorreactividad funcional en la cardiomiopatía crónica chagásica" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La cardiomiopatía crónica chagásica (CCCh) se caracteriza por su compleja sintomatología arritmogénica presentando diversos disturbios que incluyen arritmias ventriculares y disfunción de nódulo sinusal, cuya progresión puede llevar a la muerte súbita. Pese a que la CCCh es la resultante de un complejo número de factores, nuestro grupo ha demostrado que los anticuerpos que se generan contra las proteínas ribosomales P de T.cruzi en los pacientes podrían ejercer efectos patogénicos “no deseados” por reacción cruzada sobre el tejido cardíaco (estimulando los receptores β1-A y M2-Ch). En este trabajo demostramos la prevalencia de anticuerpos que reconocen receptores cardiovasculares en la CCCh y su correlación con la sintomatología arritmogénica de los pacientes. Investigamos el rol que desempeña la región C-terminal de la proteína ribosomal TcP2β,el péptido R13, en la generación de los anticuerpos que reaccionan en forma cruzada por un tanto con los receptores β1-A como con los receptores M2-Ch por un mecanismo de mimetismo molecular. Se demostró que los anticuerpos anti-R13 ejercen un efecto sobre la contractilidad de cardiomiocitos y sobre la cascada de señalización asociada a los receptores acoplados a proteína G. El estudio fino de los anticuerpos anti-R13 de diversos pacientes con CCCh y la caracterización de un anticuerpo monoclonal anti-R13 demostraron la heterogeneidad entre estos anticuerpos que fueron generados por un mismo antígeno pero con especificidad diferencial hacia los receptores cardíacos. El estudio de la especificidad de estos anticuerpos explicaría elementos de la compleja sintomatología en la CCCh. Finalmente, se construyó una biblioteca combinatorial de anticuerpos a partir de médula ósea de un paciente con CCCh y se identificaron anticuerpos recombinantes humanos anti-R13 que reproducen algunas de las características de los anticuerpos policlonales y el anticuerpo monoclonal. Esta biblioteca constituye una herramienta importante para comprender más profundamente los mecanismos moleculares implicados en la generación de anticuerpos con efectos cardíacos patogénicos y podrían permitir el diseño de estrategias terapéuticas para mejorar la calidad de vida del paciente con CCCh.

Abstract:
Chronic Chagas' Heart Disease (cChHD) is characterized by a complex arrhythmogenic symptomatology, displaying various dísturbances including ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction, leading in many cases to sudden death. Even if the pathogenesis of cChHD is the result of a multiple símultneaous events, our group demonstrated that cross-reactive antibodies raised against T.cruzi ribosomal P proteins could exert pathogenic effects on heart membranes (stimulating β1-adrenergic and M2-cholínergic receptors). In this work, we investigated the prevalence of antibodies that stimulate G protein coupled receptors (GPCR) and their clinical correlation with electrical disorders amongst patients with cChHD. We further investigated the role of the C-terminal region of TcP2β, peptide R13, in raising antibodies that cross react with both β1-adrenergic and M2-cholinergic receptors by a mechanism of molecular mimicry. The ability of anti-R13 antibodies to exert various effects on the contractility and signal transduction associated with GPCR in cardiomyocytes was demonstrated. The detailed studies on anti-R13 antibodies purified from different cChHD patients and the characterization of an anti-R13 monoclonal antibody provided further insight on the heterogeneous features of these antibodies that are generated against a common antigen but display differential specificity on cardiac receptors. The study of the fine specificity of anti-R13 antibodies allowed us to understand part of the complex symptomatology of cChHD. Finally, a combinatorial antibody library, made from bone marrow of a cChHD donor, was constructed. Anti-R13 recombinant human Fab fragments were identified and their properties compared to the observed features in the policlonal response and the murine monoclonal antibody. This library represents an important tool to gain further insight into the molecular mechanisms underlying the generation of cross-reactive antibodies with pathogenic effects on the human heart in cChHD and could provide some elements to design new therapeutic strategies.

Gamberale, Romina. "Regulación de la sobrevida de los linfocitos B de Leucemia Linfática Crónica : papel de los receptores para el fragmento Fc de la IgG" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La leucemia linfática crónica de células B (LLC-B) se caracteriza por la progresiva acumulación de linfocitos B clonales, que presentan muy baja tasa proliferativa y resistencia a morir por apoptosis. El objetivo de este trabajo de Tesis fue investigar el papel que cumplen los leucocitos no-malignos como posibles reguladores de la apoptosis de las células leucémicas. Por otro lado, considerando que las células LLC-B expresan receptores para el fragmento Fc de la IgG (RFCγ)y que es frecuente la presencia de complejos inmunes (Cl) en el suero de los pacientes, se analizó el papel de los RFcγ en la modulación de la sobrevida de las células leucémicas. Los resultados obtenidos demuestran que los monocitos y las células NK son capaces de prolongar la sobrevida de las células leucémicas en cultivo a través de distintos factores, tanto solubles como de contacto celular. Para tratar de identificar la producción de alguno de ellos se realizaron cultivos en presencia de anticuerpos neutralizantes anti-IFNγ,anti-IL-4 y anti-IL-10, encontrándose una marcada heterogeneidad entre los distintos pacientes evaluados. La misma variabilidad de respuesta se obtuvo al bloquear la interacción de CD40 con su ligando mediante anticuerpos anti-CD40. En conjunto, estos resultados sugieren que la capacidad de los monocitos y las células NK de favorecer la sobrevida de las células leucémicas depende de una sumatoria de señales que parecen ser particulares de cada paciente. Cuando los cultivos de células LLC-B y leucocitos accesorios se llevaron a cabo en presencia de Cl fue posible no sólo inhibir la apoptosis espontánea sino también la inducida agentes quimioterápicos como la fludarabina, el clorambucilo y la dexametasona. Es decir, que la activación de monocitos y células NK por entrecruzamiento de sus RFCγ estaría favoreciendo la acumulación del clon leucémico. Teniendo en cuenta que las células LLC-B sobre expresan la proteína antiapoptótica Bcl-2 y que la expresión de la misma se inhibe a medida que progresa la apoptosis ¡n vitro, se examinaron los niveles de Bcl-2 en las células leucémicas cultivadas con o sin leucocitos accesorios. Los resultados indican que la presencia de monocitos y células NK retarda la down-regulación de Bol-2 en las células leucémicas. Por el contrario, cuando la inhibición de la apoptosis de las células LLC-B se da a consecuencia de la activación de los leucocitos accesorios por Cl , el bol-2 no parece estar involucrado. La última parte de esta Tesis comprende el estudio de la expresión y funcionalidad de los RFcγ expresados por las leucémicas. Los datos presentados demuestran que las células B-CLL expresan no sólo el RFcγIIb característico de las linfocitos B normales, sino también la isoforma RFcγIIa. Debido a que portan dominios ITAM en su porción citoplasmática. los RFCγIIa transducen señales de activación. Sin embargo, ni la utilización de distintos tipos de Cl, ni el entrecruzamiento selectivo de los RFCγIIa logró inducir la activación de las células LLC-B, medida como cambios en los flujos de calcio. Tampoco fue posible modular la apoptosis en las Leucémicas purificadas, Lo que sugiere que este receptor no seria funcional en LLC-B.

Abstract:
B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is characterized by the progressive accumulation of clonal B lymphocytes caused by defects in programmed cell death rather than increased proliferation. The aim of the current Thesis was to investigate the role of non-malignant leucocytes in the regulation of B-CLLcells apoptosis. On the other hand, considering that leukemic cells express receptors for the Fc fragment of IgG (FCγR) and the presence of immune complexes (IC) is frequently found in B-CLL patients, we analized whether IC could modulate leukemic cells survival. Our results show that monocytes and NK cells were able to prolong the survival of cultured leukemic cells through different factors, not only soluble factors, but also cell-cell interactions. In an attempt to determine which are the factors involved in the protective effect mediated by accessory leukocytes, we performed cultures in the presence of neutralizing antibodies (Ab) directed to IL-4, IFNγ or IL-10, as well as blocking Ab to CD40. We found a marked heterogeneity among different patients, suggesting that the mechanisms involved in the regulation of apotosis might differ among B-CLL samples. In addition, it is conceivable that an array of factors rather than a single factor may account for the protective effect exerted by monocytes and NK cells. The anti-apoptotic effect was also observed when B-CLL cells and non-malignant Ieukocytes were cultured in the presence of immune complexes (IC). In this case, IC were able to inhibit,not only spontaneous apoptosis, but also the one induced by different chemotherapeutic agents, like fludarabine, chIorambuciI or dexamethasone. Thus, the activation of monocytes and NK cells by their FcγR crosslinking, may favor the accumulation of the leukemic clone. Taking into account that B-CLL cells over express the anti-apoptotic protein Bcl-2 and its expression was inhibited in vitro during the culture, we analized the expression of Bcl-2 in leukemic cells cultured with or without accessory leukocytes. Our results showed that the presence of monocytes and NK cells delays Bcl-2 down-regulation. However, when the cultures were done with IC, Bcl-2 seems not to be involved in the protective effect exerted by accessory cells. The last part of the current Thesis involves the study of the expression and functionality of FCyRexpressed by leukemic cells. We here present that B-CLL cells express no only FcγRIIb,found on normal B cells, but also FcγRIIa. which have ITAM domains related to activating signals. Surprisingly, neither the IC interaction with FeyRs on B-CLL cells, nor the FCγRIIa crosslinking with specific Ab, could modulate leukemic cells apoptosis or activation, measured by calcium mobilization. Our results suggest that FcγRIIa expressed on B-CLL cells may not be functional.

Di Paolo, Nelson César. "Estudio del efecto del factor de Necrosis tumoral -alfa sobre las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra en relación a la enfermedad de Parkinson" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enfermedad de Parkinson (PD, “Parkinson Disease”) es una enfermedad neurodegenerativa crónica, de desarrollo muy lento. Su característica neuropatológica sobresaliente es la pérdida de las neuronas dopaminérgicas de la substantía nigra (s.n.) del cerebro. No se conoce la causa cierta, ni existe una cura para esta enfermedad. Las citoquinas inflamatorias han sido halladas en el cerebro de pacientes con diversas enfermedades neurodegenerativas, inclusive con PD. El Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF) es una citoquina de particular interés, porque puede inducir tanto la sobrevida como la muerte de neuronas. El TNF y sus receptores han sido detectados en la s.n. de pacientes con PD, pero no de personas sanas. Sin embargo, no se tiene ninguna evidencia de cual podría ser la función del mismo en dicha patología. Utilizando ratones knock-in “hipomórficos” y un promotor específico de la s.n. (engrailed), se logró la expresión constitutiva de TNF en la s.n. de ratones. Combinando lo previo con dos elementos más (vectores adenovirales y el sistema Cre-LoxP), se desarrolló un modelo para lograr la expresión crónica de diferentes niveles de TNF en el cerebro de ratones in vivo. El mismo fue utilizado para analizar el papel de esa citoquina en la sobrevida o muerte de las neuronas dopaminérgicas. Realizando una única inyección estereotáxica de vectores adenovirales (Ad), se logró transducir las neuronas dopaminérgicas de la s.n. del ratón casi en un 100%. Así, cuando animales knock-in fueron inoculados en la s.n. con un adenovector codificante para la recombinasa Cre (AdCre), se observó la recombinación y escisión de un cassette que interfería con la expresión del transgén (cassette “PGK-neo”). El mismo estaba flanqueado por sitios llamados Lox-P (“floxeado”), los cuales son reconocidos por la recombinasa Cre. Seguidamente se demostró un aumento específico en la expresión del TNF respecto del basal en la s.n. de los animales knock-in inyectados con el AdCre, pero no cuando fueron inyectados con un Angal, o en animales silvestres (wt) inyectados con cualquiera de los dos adenovectores. Esos resultados demostraron que el mencionado cassette PGK-neo ejerce un efecto de “interferencia transcripcional” sobre el transgen de interés. Así, la combinación de las estrategias mencionadas ha permitido lograr la expresión constitutiva, e inducida, de una proteína de interés (TNF) en la s.n. del ratón. El análisis funcional de estos animales reveló que el TNF crónico inducido en algún momento de la vida adulta del animal provoca la lenta y progresiva desaparición de las neuronas dopaminérgicas de la s.n., representando un nuevo modelo de PD. Por otro lado, fue muy interesante observar que la expresión constitutiva de TNF logró aumentar 3 veces más el número de neuronas sobrevivientes que en los grupos controles ante el tratamiento de los animales con 6-hidroxidopamina (6-OHDa), una droga utilizada para modelar la PD. Estos resultados son un indicio para comenzar a comprender datos previos contradictorios de la literatura, referidos a la muerte o protección de neuronas mediado por TNF (el efecto final en cada caso podría depender de la concentración). La información aquí presentada será útil al considerar la posibilidad de una terapia que de alguna manera u otra afecte al TNF, o a cualquier otra citoquina (anti-inflamatorios, por ejemplo), como se ha realizado recientemente para esclerosis múltiple. Finalmente, la estrategia utilizada permitirá el estudio de las funciones de proteínas expresadas en la s.n. en forma controlada, y abre la posibilidad de establecer nuevos modelos animales de PD. Aún más, utilizando otros promotores endógenos, podrá permitir el estudio de otras patologías crónicas en el cerebro.

Abstract:
Parkinson Disease (PD) is a debilitating, long-term neurodegenerative disease, which most important neuropathological feature is the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra (s.n.) of the brain. It is not known its cause, nor exists a cure for this disease. Immune cytokines have been found in the brain of patients with many neurodegenerative diseases, including PD. Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF) is a cytokine of particular interest, because it can induce both the survival or death of neurons. Importantly, it has been found in the s.n. of PD patients, but not in control subjects. Nevertheless, it is not known which function could have TNF in this disease. Combining “hypomorphic” knock-in mice and a promoter specific for the s.n. (engrailed), we obtained constitutive expression of TNF in the s.n. of mice. Combining two more elements (adenoviral vectors and the Cre-LoxP system), we had developed a model to obtain chronic expression of different levels of TNF in vivo in the s.n. of mice. This system was used to study the role of this cytokine in the survival or death of dopaminergic neurons. We found that we could transduce dopaminergic neurons of the s.n. of adult mice with almost 100% efficiency with a single stereotaxic injection of adenoviral vectors. When knock-in mice were inoculated in this brain region with an adenoviral vector coding for Cre recombinase, a “floxed” PGK-neo cassette was recombined. In addition, s.n.-specific TNF expression was up-regulated in the AdCRE-injected knock-in mice but not in knock-in mice injected with Adbetagal or in AdCRE-injected control animals. These results showed that the PGK-neo cassette had a “transcriptional interference” effect on TNF expression. Moreover, the combination of the mentioned strategies allowed for the basal expression, and the temporal onset of an up-regulation, of a protein of interest in the s.n. of mice. When we analyzed the functional effects of TNF on neuronal viability, we found that longterm TNF up-regulation was deleterious, inducing the progressive death of dopaminergic neurons. This has provided us with a new animal model of PD. On the other hand, it was very interesting to observe that the constitutive expression of TNF could protect 3 times more neurons than wt mice in an accepted PD model injecting 6-OHDa, a neurotoxin used as an accepted PD model, into the striatum. These results should help to understand previous contradictory data in the literature related to the neuroprotective or neurodegenerative effects of TNF (the final effect could depend on subtle differences on the TNF concentration). Even more, the information presented here should be considered when designing a possible therapy for PD that could affect cytokines expression (and TNF in particular) in the s.n., as has recently been tested for multiple sclerosis. Finally, the strategy used in this work provides the means to analyze the function of proteins expressed in the s.n. in a temporal and regional controlled manner, and opens up the possibility to establish other new animal models of PD. Even more, using other endogenous promoters, it should facilitate the study of other chronic pathologies in the adult mouse brain.

Beigier Bompadre, Macarena. "Efecto de los péptidos formilados en la regulación del receptor para el fragmento Fc de inmunologlobulina G de tipo I (FcyRI) en monocitos humanos" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En un fenómeno inflamatorio se produce la migración unidireccional (quimiotaxis) de los polimorfonucleares neutrófilos hacia el foco inflamatorio, seguidos luego por los monocitos sanguíneos. Esta migración es la respuesta al gradiente de concentración de un agente quimiotáctico determinado, como el leucotrieno B4 o las quimioquinas. También existen productos como los péptidos formilados, que son quimiotácticos para monocitos y neutrófilos. Estos péptidos formilados son productos de clivaje de proteínas bacterianas o mitocondriales. Los receptores para la porción Fc de lgG (FcγRs) son capaces de interconectar la especificidad de los anticuerpos con las funciones efectoras de los monocitos y neutrófilos. Tres clases de FCyRshan sido identificados en los leucocitos humanos: FcγRI, FcγRII y FcγRIII. El FcγRI es un receptor de alta afinidad capaz de mediar Ia fagocitosis y Ia citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Este receptor se expresa constitutivamente en la superficie de los fagocitos mononucleares y su expresión es aumentada por citoquinas como el interferón-γ (IFN-γ)y la interleukina-10 (IL-10). En este trabajo, se ha demostrado que la preincubación de los monocitos humanos con el péptido formilado prototipo N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (FMLP) fue capaz de inhibir la expresión del FcγRI inducida por IFN-γ e IL-10. Esta inhibición se correlacionó con la inhibición de funciones dependientes del FcγRI como la ADCC y Ia fagocitosis, pero el FMLP no afectó otras funciones mediadas por el IFN-γ o la IL-10. El mecanismo de acción del FMLP cuando fue agregado antes que las citoquinas, involucraría la activación de las Mitogen Activated Kinases (MAPKs) p38 y Erk1/2, pero no de la proteín kinasa C (pKC). A su vez, el FMLP no modificó ni la expresión de los receptores para IFN-γ o IL-1O ni la fosforilación del factor de transcripción STAT-1. Por otra parte, el FMLP también inhibió la expresión del FcγRI en monocitos humanos previamente activados con IFN-γ. Sin embargo, en este caso, el FMLP no modificó la expresión del FcγRI en células pretratadas con IL-10. Sobrenadantes obtenidos de monocitos tratados primero con IFN-γ y luego con FMLP, indujeron la disminución de la expresión del FcγRI en monocitos naive. Este efecto estaria mediado por serin y metaloproteasas. A su vez, sobrenadantes provenientes de neutrófilos tratados con FMLP también fueron capaces de inducir la disminución del FcγRI en monocitos naive. En un modelo murino de inflamación crónica, el FMLP indujo la disminución de la expresión de FcγRs en macrófagos activados con IFN-γ. En pacientes con tuberculosis pulmonar activa, el IFN-γ y la IL-1O indujeron el aumento en la expresión del FCγRI en los monocitos. Sin embargo, el FMLP no fue capaz de disminuir la expresión del FCγRI inducida por estas citoquinas. Además, sobrenadantes de neutrófilos tratados con FMLP provenientes de estos pacientes no alteraron la expresión del FCγRI en monocitos naive. Este trabajo contribuye a la comprensión global de los mecanismos mediante los cuales agentes conocidos como pro-inflamatorios pueden tener funciones anti-inflamatorias en determinadas circunstancias. Este efecto antiinflamatorio del FMLP funcionaría como mecanismo de atenuación de una respuesta inflamatoria exacerbada por parte del huésped. El hecho de que los monocitos de los pacientes con tuberculosis pulmonar activa no presenten estos mecanismos concuerda con esta interpretación.

Abstract:
In the course of the inflammatory phenomenon, polymorphonuclear neutrophils migrate unidirectionally (chemotaxis) towards the inflammatory focus, followed by monocytes. This migration occurs in response to the concentration gradient of a chemotactic agent, such as leukotriene B4 or chemokines. Molecules such as formylpeptides are chemotactic for neutrophils and monocytes. These peptides are cleavage products of bacterial and mitochondrial proteins. The receptors for the Fc portion of IgG (FCγRs) act as a bridge between the specificity of antibodies and the effector functions of monocytes and neutrophils. Three classes of FcγRs have been identified on human leukocytes: FcγRI, FcγRII and FcγRIII. FcγRI is a high affinity receptor that mediates phagocytosis and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). This receptor is constitutively expressed on mononuclear phagocytes and its expression is enhanced by interferon-γ (IFN-γ) and interleukine-1O (IL-10). In this study, it has been demonstrated that pre-incubation of human monocytes with the prototypic formyl peptide N-formyI-methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP) inhibited the expression of FcγRI induced by IFN-γ or IL-10. This inhibition correlated with the inhibition of FcγRI-dependent functions such as ADCC and phagocytosis. However, FMLP did not affect other functions modulated by IFN-γ or IL-10. When FMLP was added to human monocytes before these cytokines, Mitogen Activated Kinases (MAPKs) p38 and Erk1/2, but not protein kinase C (pKC), were involved in the FMLP-mediated inhibition. FMLP altered neither the expression of IFN-γ/IL-10 receptors nor the phosphorylation of the transcription factor STAT1. On the other hand, FMLP also inhibited the expression of FcγRI in human monocytes that had been previously treated with IFN-γ. However, FMLP did not alter the expression of FcγRI in monocytes previously treated with IL-10. Supernatants obtained from monocytes treated first with IFN-γ and later with FMLP downregulated the expression of FcγRI on naive human monocytes. This effect was mediated by serine and metalloproteases. Moreover, this effect was also observed when using supernatants from FMLP-treated human neutrophils. In a murine model of chronic inflammation, FMLP downregulated the expression of FcγRd on IFN-γ-activated macrophages. In patients with active pulmonary tuberculosis, IFN-γ and IL-1O upregulated the expression of FcγRI. However, FMLP was not capable of downregulating the expression FcγRI induced by these cytokines. Besides, FMLP-treated neutrophils from these patients did not modify the expression of FcγRI on naive monocytes. This study contributes to the understanding of inflammatory phenomena. We have demonstrated that well-known pro-inflammatory molecules could behave, under certain circumstances, as anti-inflammatory agents. This antiinflammatory effect of FMLP would attenuate an exacerbated host immune response. The fact that monocytes from tuberculosis patients lack these antiinflammatory mechanisms is in agreement with this interpretation.

Martin, Valentina. "Regulación de la respuesta inmune contra el toxoplasma gondii en la mucosa intestinal y análisis del valor inmunoprofiláctico de antígenos del parásito en el modelo murino" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Toxoplasma gondii, es un parásito protozoario que infecta al hospedador mediante la ingestión oral de quistes tisulares u ooquistes induciendo una respuesta inmune en el intestino y sistémica del tipo Thl, produciendo inmunidad contra una re-infección. La infección experimental oral de diferentes cepas de ratones resulta en dos modelos interesantes de regulación de la respuesta inmune. Los ratones C57BL/6 (H-2b) desarrollan una ileitis inflamatoria aguda (IBD), caracterizada por la sobreproducción de IFN-γ y la síntesis de óxido nítrico en el intestino delgado dentro de los primeros siete días que, dependiendo de la dosis parasitaria inicial, puede producir la muerte debido al proceso inflamatorio. En cambio los ratones C3H/HeJ y CBA/J (H-2k) muestran solo pequeños procesos inflamatorios, cursando una infección aguda normal con establecimiento de la infección crónica. En el presente estudio, se demuestra que los linfocitos intraepiteliales (IELs) primados con antígeno de T. gondii previenen la ileitis aguda en ratones susceptibles (C57BL/6), e in virro reducen la producción de quemoquinas inflamatorias por enterocitos infectados, evento que estaría mediado por el TGF-β que secretan. Los IELs serían un componente esencial en la homeostasis del intestino luego de la infección oral con este parásito. Como un primer acercamiento en el conocimiento de la respuesta que este parásito genera en ratones que cursan una infección aguda normal, se caracterizó la respuesta de la línea celular enterocítica MODE-K (H-2k)frente a la infección para estudiar su valor como modelo in vitro. Estas células mostraron activarse frente a la infección con taquizoitos del T. gondii, secretando un patrón de citoquinas y quemoquinas cuya cinética resulta cepa específica. Los IELs derivados de los ratones CBA/J mostraron reducir la expresión de quemoquinas en los enterocitos infectados, y este efecto fue observado tanto en IELs no primados como primados. Estos IELs de ratones naïve, a diferencia de los provenientes de ratones susceptibles, producirían citoquinas anti-inflamatorias en forma endógena lo cual podría ser un componente importante en la resistencia al desarrollo de la ileitis aguda frente a la infección. La segunda parte de esta tesis estuvo enfocada al estudio de la habilidad de antígenos específicos del parásito de estimular in vitro una respuesta a nivel sistémico y de mucosas luego de una infección oral de ratones susceptibles (C57BL/6) y resistentes (BALB/c

Abstract:
Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that infects the host by oral ingestion of tissue cysts or oocysts, with the induction of a systemic and intestinal Thl immune response resulting in the production of immunity against re-infection. There are two interesting models of the immune response regulation in the experimental oral infection with cysts of different strains of mice. C57BL/6 mice (H-2^b) develop acute inflammatory ileitis (IBD) characterized by the overproduction of IFN-γ and nitric oxide synthesis in the gut after seven days of infection, and depending on the initial parasite-dose this inflammatory response can result lethal. In contrast, oral infection of C3H/HeJ and CBA/J (H-2^k) reveal only mild inflammation in the gut, resulting resistant to the acute phase of the infection with the establishment of the chronic infection. In the present study, we report that T. gondii antigen-primed intraepithelial lymphocytes (IELs) prevent the acute ileitis in C57BL/6 susceptible mice, and in vitro, reduce the production of inflammatory chemokines by infected enterocytes, event that would be mediated by TGF-β secretion. IELs could be an essential component in the gut homeostasis after oral infection with this parasite. As a first attempt to study the immune response induced by this parasite in mice resistant to the acute infection, we have characterized the response elicited by the infection of the enterocyte cell line MODE-K (H-2^k)to evaluate its value as an in vitro model. Infection with T. gondii tachyzoites induced the activation of these cells, with the secretion of a cytokine and chemokine pattem with a strain-specific kinetics. Both unprimed and antigen-primed IELs isolated from CBA/J mice reduce chemokine expression by infected enterocytes. These IELs from naïve resistant mice, in contrast to the IELs from naïve susceptible mice, would produce endogenous anti-inflammatory cytokines that could result in an important component in the resistance to acute ileitis after infection. The second part of this thesis, has been focused on the study of the ability of specific parasite antigens in stimulating in vitro a systemic and mucosal response in orally infected susceptible (C57BL/6) and resistant (BALB/c

Salamone, Gabriela V.. "TNF-alfa y modulación del fenómeno apoptótico en neutrófilos humanos" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El presente trabajo examinó la capacidad del TNF-a. de modular la apoptosis de neutrófilos humanos. Observamos que los neutrófilos cultivados sólo con TNF-a.sufren un pequeño pero significativo incremento en sus porcentajes de apoptosis. Llamativamente. observamos además que aquellos neutrófilos pretratados con TNF-a por 1-2 minutos a 37°C y expuestos luego a una variedad de agentes tales como IgG inmovilizada (IgGi), eritrocitos recubiertos por anticuerpos lgG (lgG-E), eritrocitos tratados con complemento (EC), zimosán (Z), ácido forbol miristico (PMA), suero activado por zimosán (ZAS), N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), Escherichia coli, y factor estimulador de la formación de colonias para granulocitos y macrófagos (GM-CSF) por 3 horas a 37°C, experimentaron un marcado incremento en sus porcentajes de apoptosis. Resultados similares fueron obtenidos en neutrófilos pretratados con TNF-a por 30 minutos, 1, 3 y 18 horas. Las concentraciones a las cuales el TNF-a. medió este efecto promotor de la apoptosis se hallaron comprendidas entre 1 y 100 nglml. En contraste con las observaciones realizadas en neutrófilos pretratados con TNF-a, no observamos promoción alguna de la apoptosis cuando el TNF-a fue añadido a neutrófilos previamente activados por agonistas convencionales. Las experiencias realizadas a fin de determinar el mecanismo responsable de la promoción de apoptosis por TNF-a mostraron que el mismo no es dependiente de la generación de intermediarios reactivos del oxígeno (IRO) ní de la participación del sistema Fas/FasL. Por el contrario, pareciera involucrar la activación de las vias intrínseca y extrinseca del mecanismo apoptótico y asociarse a una dramática disminución en la expresión de la proteina anti-apoptótica Mol-1. Nuestros resultados sugieren que el TNF-a juega un papel critico en el control de la sobrevida del neutrófilo en virtud de su capacidad de inducir la puesta en marcha del proceso apoptótioo, proceso que es 'gatillado' por una amplia variedad de agonistas convencionales.

Abstract:
This work examined the ability of TNF-a to modulate human neutrophil apoptosis. Neutrophils cultured with TNF-a alone undergo a low but significant increase in the number of apoptotic cells. More interestingly, when neutrophils were pretreated with TNFa. for 1-2 min at 37°C, and then were exposed to a variety of agents such as immobilized lgG (ilgG), IgG-coated erythrocytes (lgG-E), complement-treated erythrocytes (CE), zymosan (Z), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA),zymosan-activated serum (ZAS), N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), Escherichia coli, and granulocytemacrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) for 3 h at 37°C, a marked stimulation of apoptosis was observed. Similar results were obtained in neutrophils pretreated with TNFa for 30 min, 1 h, 3 h, and 18 h. Bose-dependent studies showed that TNF-a enhances neutrophil apoptosis at oonoentrations ranging from 1 to 100 ng/ml. ln contrast to the observations made in neutrophils pretreated with TNF-a, there was no stimulation of apoptosis when TNF-a was added to neutrophils previously activated by conventional agonists. Experiments performed to establish the mechanism through which TNF-a promotes neutrophil apoptosis showed that: a) it was not dependent on the generation of reactive oxygen interrnediates (ROI) nor the participation of the Fas/FasL system, b) it appears to involve the activation of both, the extrinsic and ¡ntn'nsicpathway of apoptosis, and c) it was associated to a dramatic down regulation of the expression of anti-apoptotic protein Mol-1. Our results suggest that TNF-a plays a critical role in the control of neutrophil survival by virtue of its ability to induce an apoptotic death program which could be tiiggered by a variety of conventional agonists.

Alemán, Mercedes. "Papel de los polimorfonucleares neutrófilos en el proceso inflamatorio crónico de la tuberculosis : efecto del Mycobacterium tuberculosis y mecanismos involucrados" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La tuberculosis (TB) es una enfermedad inflamatoria crónica causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Al comienzo de una infección por micobacterias, la activación de las células de la inmunidad innata (linfocitos Natural Killer (NK), Tγδ y polimorfonucleares neutrófilos (PMN), asi como las citoquinas (CK) secretadas por ellas, influencian y modulan el curso de la reacción inflamatoria. Los PMN participan en la formación del granuloma, precediendo a los monocitos en las áreas de inflamación granulomatosa, liberando quimioquinas (QK) que atraen a los monocitos activándolos indirectamente. A pesar de que, durante el curso crónico de la TB humana, la respuesta inflamatoria se caracteriza por un infiltradode monocitos-macrófagos en el sitio de infección pulmonar, a medida que la enfermedad avanza se puede observar un elevado número de PMN en el lavado broncoalveolar (BAL)que se correlaciona con el contenido de interleuquina (IL)-8 en pulmón. Esta CK, cuya producción por el macrófago es inducida por interleuquina (IL)-1β y factor de necrosis tumoral (TNF)-α, podria inducir a su vez la secreción de otras CK por el PMN. Por otra parte, se ha demostrado que, dentro de las lesiones pulmonares, los PMN son capaces de matar a la micobacteria. Luego de arribar al foco inflamatorio, los PMN subyacen a la muerte. Esto puede ocurrir por dos mecanismos de muerte: 1) necrosis: donde la liberación del contenido citoplasmático al medio extracelular provoca una respuesta de tipo inflamatoria, 2) apoptosis: donde la membrana permanece intacta, de manera que los neutrófilos son removidos por los macrófagos sin liberar su contenido. Además, cuando los macrófagos ingieren células apoptóticas, no liberan mediadores pro-inflamatorios pero si en cambio moléculas de acción anti-inflamatorias. Por otra parte, los PMN apoptóticos pierden previamente la habilidad de degranulación, fagocitosis, estallido respiratorio y quimiotaxis. Por eso, si bien los PMN juegan un rol central en la defensa contra microorganismos infecciosos, la presencia de estas células en el pulmón puede contribuir a la injuria tisular local y en este contexto, la muerte del PMN por apoptosis, representa un mecanismo que permite su reconocimiento e ingestión por los macrófagos residentes, limitando asi el daño tisular que genera el marcado influjo de PMN durante el curso de una infección bacteriana. El objetivo de este trabajo fue estudiar el estado de activación de los PMN circulantes en pacientes con TB (TB-PMN) y su posible contribución a la fisiopatología de esta enfermedad. Por otra parte, sabiendo que muchas funciones que dependen de la activación del PMN generan en éste señales intracelulares, que estarían asociadas a la inducción del proceso apoptótico en los PMN, estudiamos la apoptosis en los PMN circulantes y el proceso apoptótico espontáneo e inducido por Mtb in vitro evaluando a su vez los mecanismos involucrados en este fenómeno y las señales intracelulares que participan. Por último, para corroborar los experimentos in vitro, evaluamos los mismos parámetros en líquidos pleurales de pacientes con TB y patologías no relacionadas. Los resultados demuestran que: ▪ Los polimorfonucleares neutrófilos circulantes de pacientes con TB (TB-PMN), tienen aumentada la expresión del receptor para la fracción constante de la inmunoglobulina G (FcγR)-IIIB(CD16) y el receptor para TNFα de 55 kD (TNF-R55). A su vez se observó la expresión del FCγRI (CDG4)que no se expresa constitutivamente en PMN. En concordancia con el aumento en la expresión de los receptores CD16 y CD64, las funciones que de ellos dependen tales como citotoxicidad mediada por complejos inmunes (Cx-CI) y citotoxicidad dependiente de anticuerpos (CCDA), también se hallaron aumentadas en los TB-PMN. ▪ Por otra parte, en los TB-PMN la liberación de anión superóxido fue inducida a concentraciones quimioatractantes del péptido formilado FMLP. Estos resultados sugieren que los PMN de los pacientes con TB se encuentran activados y liberando intermediarios reactivos del oxigeno, fuera del sitio de infección. Por lo tanto la activación de los PMN en sangre periférica observada en los pacientes, puede ser considerada como una inflamación sistémica, contribuyendo a la fisiopatología del proceso crónico inflamatorio en tuberculosis. ▪ En circulación los PMN de los pacientes con TB no presentan signos de apoptosis. Los TB-PMN tienen mayor expresión de los receptores CD16 y CD11b, ambos son parámetros indicativos de la activación del PMN. ▪ Los TB-PMN presentan una apoptosis espontánea aumentada que se correlaciona con la pérdida espontánea del receptor CD16 en cultivo (marcador de apoptosis en PMN). La marcada apoptosis espontánea podria explicarse por la mayor expresión en membrana de la proteína pro-apoptótica Fas y una menor expresión de la proteina anti-apoptótica bcl-2 en citoplasma. ▪ Mtb activa a los PMN in vitro incrementando la expresión de CD11b tanto en N- como en TB-PMN y dicha activación aceleraría el proceso apoptótico in vitro. Más aún, observamos que los PMN activados se ubican en una zona de mayor tamaño celular y mayor expresión de CD11b. Este hecho, nos permite postular que la mayor apoptosis espontánea observada en los TB-PMN, podría deberse al estado de activación que in vivo presentan los PMN de pacientes con TB. ▪ La apoptosis inducida por Mtb en los TB-PMN está inicialmente retrasada. Este hecho se correlacionó con la conservación del receptor CD16 y una mayor producción de IL-8. A períodos mas prolongados, Mtb aceleró significativamente la apoptosis en los pacientes. ▪ El componente del Mtb causante del efecto apoptótico, no seria manLAM ni estaría presente en el el lisado total bacteriano de la cepa virulenta Rv utilizada en este trabajo, ya que no indujeron apoptosis comparable con la bacteria entera. El efecto pro-apoptótico del Mtb ocurre aún a relaciones no fagocíticas (Mtb:PMN, 1:3). Por lo tanto, el Mtb entero dispararía el proceso apoptótico sin necesidad de ser fagocitado. ▪ La apoptosis no está mediada por el TNFα endógeno y no involucra al receptor CD11b. ▪ La apoptosis inducida por Mtb en TB-PMN es dosis dependiente. A pesar de que la fagocitosis de la bacteria induce el proceso apoptótico en PMN, nosotros mostramos que la apoptosis es inducida también a bajas relaciones Mtb:PMN(1:3). Por Io tanto, La apoptosis inducida por Mtb ocurriría mediante la interacción de la bacteria con un receptor diferente del CD11b sin mediar fagocitosis. ▪ Analizamos la activación de ciertas kinasas tales como mitogen-activated-protein-kinasa (MAPK)p38 que en los PMN estaría asociada tanto a la activación celular como al proceso apoptótico y extracelullar-signal-regulated kinase (ERK) ERK1/2 asociada a la sobrevida. Observamos que p38 MAPK participa en la apoptosis mediada por Mtb, pero no en la apoptosis espontánea. Por otro lado, la activación de ERK sería necesaria para prevenir el proceso apoptótico ya que al inhibirla se indujo un aumento en la apoptosis. Esto hecho, podría deberse a la anulación de alguna señal anti-apoptótica que actúa por esta vía, como por ejemplo la IL-8. ▪ La expresión de Ia MAPK p38 fosforilada (activada) se encontró elevada en los TB-PMN circulantes respecto de PMN de individuos sanos o de patologías inflamatorias no relacionadas. Además, Mtb es capaz de inducir la expresión de p-p38 MAPK. ▪ Finalmente, evaluamos los parámetros de activación y apoptosis de los PMN en líquidos plurales. Observamos que los PMN presentes en líquidos pleurales de pacientes con tuberculosis, presentan un aumento en la expresión de los marcadores de activación, CD64, CD11b, TNF-R55 y una disminución del CD16, respecto de sangre periférica del mismo paciente. Basados en los experimentos in vitro, evaluamos si los PMN, una vez extravasados al sitio de infección, presentaban una grado de apoptosis mayor. Efectivamente, los PMN de los derrames pleurales tuberculosos tienen elevados niveles de apoptosis, no observándose el mismo efecto en derrames pleurales de patologías no relacionadas, a la vez que tienen una elevada expresión de la proteína p38 activada, por lo que concluimos que el fenómeno es característico de la enfermedad tuberculosa. Se sabe que en el contexto de una reacción inflamatoria pulmonar, el reclutamiento masivo de los PMN al foco infeccioso genera un daño tisular importante. Para evitar tanto el daño tisular como para resolver el proceso inflamatorio, es necesario remover oportunamente a estas células del pulmón. Por lo tanto, si la respuesta inflamatoria mediada por los PMN es regulada por la activación del proceso apoptótico se estaría controlando su potencial destructivo en el sitio de infección. En este trabajo demostramos que los PMN están activados antes de arribar al foco infeccioso y una vez allí, el encuentro con el Mtb dispararía una serie de señales que, moduladas a su vez por las CK presentes, activarían aún mas al PMN, como lo hemos observado en los derrames pleurales de etiología tuberculosa. Sin embargo, en un primer momento la apoptosis de los PMN extravasados sería contrarrestada por ciertas citoquinas como la IL-8, de manera tal, que en presencia del Mtb conservarían ciertos receptores, como el CD16, permitiendo al PMN extravasado mantener su capacidad efectora en el sitio inflamatorio. Posteriormente, la apoptosis inducida por el Mtb en los PMN se acelerarla rápidamente, promoviendo así la remoción de los PMN por los macrófagos alveolares y el control del proceso inflamatorio en el sitio de infección, lo que evitaría un mayor daño tisular.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is a chronic inflammatory disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb). ln the early phase of infection, activation of cells of the innate immunity such as Natural Killer (NK) cells, Tγδ lymphocytes and neutrophils (PMN), as well as the cytokines (CK)secreted by them, modulate the course of the inflammatory reaction. PMN participate in the granuloma formation preceding monocytes in the areas of granulomatous inflammation and releasing chemokines that attract monocytes. Although tuberculosis lesions are characterized by a predominant migration of monocytes/macrophages to the site of infection, the earliest response to mycobacteria is primarily an influx of PMN. Nevertheless, as the disease evolves, an increased number of PMN is observed in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of affected lung that correlates with the interleukin (IL)-8 content. The production of this chemokine in macrophages is induced by interleukin (lL)-1β and tumor necrosis factor alpha (TNF)-α, that could induce in turn the secretion of other CK by PMN. It has been recently documented that PMN are able to kill Mtb in tuberculosis lesions. Once localized in the site of infection, the PMN underlie to death by two possible mechanisms: 1) necrosis: characterized by the release of the cytoplasmic content to the extracellular media generating an inflammatory response and 2) apoptosis: characterized by the preservation of the membrane integrity, so PMN might be removed by macrophages without releasing their cytotoxic content. More over, macrophages that phagocytes apoptotic cells do not release inflammatory mediators but anti-inflammatory molecules. On the other hand, apoptotic PMN loose some of their functions as degranulation, phagocytosis, respiratory burst and chemotaxis. Therefore, although PMN play a central role in the infectious process, the excessive recruitment of these cells generates tissue injury. In this context, apoptosis of PMN represents an effective mechanism that leads to the removal of undesirable cells by macrophages limiting tissue damage during the course of the inflammatory response. The aim of these studies was to investigate the activation state of circulating PMN of patients with active pulmonary tuberculosis (TB-PMN) and their possible contribution to the chronic inflammatory process. It is known that several functions that depend on the activation state leads to changes in second messengers that are associated with the induction of apoptotic process in PMN. Therefore, we evaluated apoptosis in circulating PMN and spontaneous and Mtb-induced apoptosis in vitro as well as the mechanisms involved in this process. Finally, in order to corroborate the findings observed in vitro, we evaluate the same parameters in pleural fluids of tuberculosis and non-tuberculosis diseases. Results demonstrated that: ▪ TB-PMN have an increased expression of (FcγR)-IIIB(CD16) and TNF-R55 compared to those of healthy subjects (N-PMN). Furthermore, FCγRI(C64) whose expression is almost exclusively restricted to mononuclear phagocytes, is observed in TB-PMN. Functions that depends on FCγR such as immune complex-mediated cytotoxicity (Cx-IC) and antibodydependent cellular cytotoxicity (CCDA), are also increased in circulating TB-PMN. ▪ On the other hand, in TB-PMN, superoxide anion generation are triggered even at chemottractant concentrations of the formylated peptide FMLP, suggesting that PMN of TB patients are activated and might release reactive oxygen intermediates (ROI) outside the site of infection so, we speculate that the chronic inflammatory response could no longer be considered solely as a local lung inflammation but it could contribute to a systemic inflammation in active TB patients. ▪ Although recently isolated TB-PMN show an elevated expression of CD16 and CD11b indicating that they are activated in circulation, they do not exhibit apoptotic features. ▪ Spontaneous apoptosis of TB-PMN is significantly increased and correlates with the loss of the CD16 receptor expression in culture (indicative of apoptosis in PMN). This spontaneous apoptosis could be due at least in part to the higher expression of Fas and/or the lower bcl-2 expression observed in TB-PMN compared to N-PMN. ▪ Mtb activates PMN in vitro enhancing the CD11b expression in N- and TB-PMN accelerating the apoptotic process in vitro. Moreover, activated TB-PMN are located in a new region characterized by a larger size and CD11b expression. This fact, lead us to speculate that accelerated spontaneous apoptosis of TB-PMN, could be due to the activation state that these cells have in circulation. ▪ Mtb-induced apoptosis of TB-PMN is initially delayed and correlates with the preservation of the CD16 receptor and with an increased secretion of IL-8. Later in the time of culture Mtb markedly accelerates the apoptotic process in TB-PMN. ▪ The pro-apoptotic effect of Mtb is not due to the major mycobacterial cell wall component, the glycolipid ManLAM. Furthermore, a whole cell lysate preparation has no effect on PMN apoptosis. Therefore, the whole Mtb triggers apoptotic process in PMN. ▪ Mtb-induced apoptosis in TB-PMN is not mediated by endogenous TNFα and does not involvs the CD11b receptor. ▪ Mtb-induced apoptosis in TB-PMN is dose dependent. Although phagocytosis induces high levels of apoptosis in PMN, we show that it is also induced at a low Mtb:PMN ratio (1:3). Therefore, Mtb-induced apoptosis might occur by the interaction with a receptor different from CD11b and does not depend on the phagocytosis of Mtb. ▪ mitogen-activated-protein-kinasa (MAPK)p38 and extracellular-signal-regulated kinase (ERK) ERK1/2 were analyzed because these proteins participate in cellular activation an survival. We demonstrated that p38 MAPK is involved in Mtb-induced apoptosis and not in spontaneous apoptosis. On the contrary, activation of ERK would be necessary to prevent the apoptotic process. In this context, some anti-apoptotic signal (i.e. IL-8) might have been annulated when ERK activation was blocked. ▪ Activated MAPK p38 (p-p38) expression in circulating TB-PMN is higher compared to N-PMN or to PMN of inflammatory non-related pathologies. ▪ TB-PMN in pleural fluid (PF) have an increased expression of activation markers as CD64, CD11b, TNF-R55 and a lower CD16 expression compared to peripheral blood PMN from the same patient. Furthermore, PMN that have migrated to the site of TB infection show high levels of apoptosis and a high p-p38 expression. On the contrary, we do not observe the same pattern in PMN of PF of inflammatory non-related pathologies suggesting that these features are characteristic of the tuberculosis disease. In the context of a pulmonary inflammatory reaction the massive recruitment of PMN to the infectious focus generates injury in the lung. Therefore, timer removal of PMN might avoid tissue damage and progression to chronic inflammation. Thus inflammatory response mediated by PMN in tuberculosis, is regulated by the activation of the apoptotic process limiting their detrimental potential in the lung. All these findings have a potential clinical relevance because PMN that have migrated to the site of inflammation are most likely to be either primed or activated before encountering mycobacteria. The delayed apoptosis at short culture times together with the preservation of CD16 suggest that PMN would be able to perform their effector functions at the site of infection. Likewise, later in time, Mtb-induced activation might lead to accelerated apoptosis of PMN, as can be observed in tuberculous pleuritis, thus avoiding tissue damage.

Ghio, Sergio Claudio. "Clonado y caracterización de un antígeno rico en aminoacidos ácidos de Trypanosoma cruzi y su posible rol en la inmunopatogenia de la cardiopatía chagásica crónica" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Se ha postulado la hipótesis de un origen autoinmune para explicar la etiología de la enfermedad de Chagas. Este proceso autoinmune podría ser el resultado de una respuesta inmune cruzada contra componentes específicos de células cardíacas que comparten epítopes con antígenos de Trypanosoma cruzí (mimetismo molecular). En trabajos anteriores demostramos que los anticuerpos de pacientes crónicos, inmunopurificados con el péptido correspondiente a los 13 aa C-terminales de la proteína ribosomal P28 de T. cruzi (TcP2β),alteraron la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ya que también podían reconocer el segundo bucle de los receptores cardiacos (M2 muscarínicos y β-adrenérgícos). Lo mismo ocurrió con los inmunopurificados contra un péptido correspondiente a la proteína ribosomal P0 (TcP0). Tanto los epítopes parasitarios como los del hospedador reconocidos por estos anticuerpos estaban formados por secuencias aminoacídicas ácidas. En la búsqueda de nuevos antígenos que pudieran producir este tipo de reacción cruzada, se propuso el rastreo de ESTs (Expressed Sequence Tags) producidos en el Proyecto Genoma T. cruzi que codificaran para proteínas ricas en secuencias ácidas. De este modo se aisló un EST de 718 pb. Se obtuvo la secuencia completa del gen que denominamos garp (glutamic acid rich protein) de 3500 pb, que es de copia única y origina un único ARNm de aproximadamente 4 kb. Según la comparación de secuencias se encontró una identidad de hasta 72% con secuencias de T. brucei. La proteína es de 130 KDa, y según ensayos de Western blot e inmunofluorescencia se localiza en el citoplasma del parásito. Aproximadamente el 20% de los sueros de pacientes con la enfermedad de Chagas crónica fueron capaces de reconocer la proteína recombinante GARP, y todos ellos lo hicieron con la región más C-terminal de la proteína, que contiene los aminoácidos ácidos. La inmunización con la proteína recombínante GARP provocó la aparición de anticuerpos dirigidos contra toda la proteína. Estos anticuerpos no modificaron la frecuencia de latidos de los cardiocítos en cultivo, y consecuentemente los ratones no sufrieron alteraciones electrocardiográficas. Como un método alternativo de inmunización, ensayamos la metodologia de inmunización con ADN. Con esta técnica de inmunización se pretendía reflejar mejor la situación de la infección crónica, ya que la presentación constantes de los antígenos parasitarios por las células musculares del hospedador podría ser mas adecuada para estudiar la patogenicidad de la enfermedad. Para poner a punto esta metodología, realizamos inmunizaciones con las proteínas ribosomales TcP2β y TcP0. Las inmunizaciones de ADN con TcP2β ,TcP0 y GARP generaron anticuerpos capaces de reconocer epítopes diferentes a los reconocidos en la infección natural. Los anticuerpos no provocaron alteraciones en la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ni se observaron alteraciones electrocardiográficas tales como las ocurridas cuando ratones fueron inmunizados con proteínas recombinantes TcP2β y TcP0. Por tanto concluimos que la inmunización con ADN es capaz de generar anticuerpos que reconocen epítopes diferentes a los inducidos por inmunizaciones con proteínas recombinantes o por la infección natural, lo cual es de utilidad al momento de generar una vacuna contra T. cruzi.

Abstract:
The hypothesis of an autoimmune origin has been postulated to explain the etiology of the Chagas' heart disease. This autoimmune process could be the result of an immune response capable of cross-reacting to specific components of heart (issues that share epitopes with antigens of Trypanosoma cruzi (molecular mimicry). As we have previously reported, antibodies of chronic patients, recognizing a peptide corresponding to the 13 aminoacid C-terminus (peptide R13) of the T. cruzi ribosomal P2 β protein (TcP2β) altered the frequency of cardiomyocyte beating culture. This antibodies were also able to recognize the second extracellular loop of the G-protein coupled receptors (M2 muscarinic and β-adrenergic receptors). Antibodies immunopurified against the C-terminus of the T. cruzi ribosomal P0 protein (TcP0) present a similar functional and physicochemical features. Both the parasitic and the host epitopes recognized by these antibodies are composed of acidic sequences. In the search of new antigens that could produce this type of cross-reaction, we looked for ESTs (Expressed Sequence Tags) in the Genome Project of T. cruzi coding for acidic residues rich proteins. So we identified a EST of 718 bp. The complete sequence of the gene (3500 bp) was obtained and we named it garp (glutamic acid rich protein). This gene exists in a single copy and gives origin to only transcript of approximately 4 kb. Its sequence was compared with database, finding a identity up to 72% with T. brucei sequences. The protein has 130 KDa, and both Western blot and immunofluorescence assays located it into cytoplasm. Approximately 20% of the sera of chronic chagasic patients were capable to recognize the recombinant protein GARP, and all of them recognized only the C-terminus of GARP, which contains the acidic sequences. When we immunized mice with the recombinant protein GARP, we achieved antibodies against the whole protein GARP. With anti-GARP serum we carried out assays on beating rat cardiomyocytes. With neither of the antisera beating frequency was altered and immunized mice with high anti-GARP titers showed no electrocardiografic alterations. As alternative method of immunization, we assayed immunizations with DNA plasmids. With this immunization technique we attempted to reflect better the situation of the chronic infection, since the constant presentation of the parasitic antigens from the host’s muscular cells could be more appropriate to study the pathogenicity of the disease. To set up this methodology we achieved immunizations with DNA coding genes of ribosomal TcP2β and TcP0 proteins. The DNA immunizations with TcP2β, TcP0 and GARP generated antibodies capable to recognize different epitopes to those obtained in the natural infection. No alterations in cardyocytes culture nor electrocardiografics recording in mice were observed. In contrast, immunization with TcP2β and TcP0 recombinant proteins generated functionally active antibodies. So we conclude that DNA immunization is useful to generate antibodies against epitopes that are different than the antibodies obtained in immunization with recombinant protein o in the natural infection. This could be useful to generate a vaccine against T. cruzi.

Todaro, Laura Beatriz. "Rol de la molécula de adhesión NCAM en patologías neurodegenerativas y neuroproliferativas humanas y experimentales" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La NCAM pertenece a la familia de las inmunoglobulinas siendo su función más conocida la promoción de la adhesión homofílica entre células vecinas, como neuronas, astrocitos y células musculares, y de la adhesión heterofilicas entre estas células y proteínas de las matrices extracelulares. Tiene tres isoformas principales: 120, 140 y 180 kDa. Sólo la NCAM de 120 kDa carece de los dominios citoplasmático y transmembrana y se encuentra unida por anclaje fosfatidilinositol. Una caracteristica de Ia NCAM es presentar cadenas homo poliméricas de ácido siálico (PSA) unidas covalentemente. La expresión de PSA NCAM es muy abundante en el sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario y las primeras etapas postnatales pero en el adulto su expresión disminuye. La presencia de PSA en la NCAM adulta impide la adhesión celular y estimula la remodelación y plasticidad tisular. Además la NCAM puede encontrarse en forma soluble, puesto que se ha descrito su presencia en diferentes fluidos biológicos, proponiéndola como marcador soluble para algunas patologías tumorales como el cáncer de pulmón a células pequeñas y en patologías neurodegenerativas como la esquizofrenia. Nuestro obietivo fue estudiar la relación de la molécula NCAM con procesos tumorales y neurodegenerativas humanos y experimentales. A) Para ello estudiamos la participación de NCAM en el comportamiento biológico de la línea celular LP07, derivada de un tumor de pulmón murino de origen epitelial glandular con componente neuroendocrino. La expresión se evaluó en homogenatos y cultivos primarios tumorales, detectándose distintas isoformas de NCAM,cuya expresión varia a lo largo del crecimiento tumoral. Por otro lado, la disminución de metástasis experimentales con anti NCAM sugiere que esta molécula favorecería la colonización del órgano blanco. El tratamiento de NCAM in vitro con anticuerpos específicos disminuyó la adhesividad, la migración y la proliferación celular al mismo tiempo que induce la reorganización del citoesqueleto de actina compatible con una reversión epitelio mesenquimática, característica de la célula tumoral. B) Hemos estudiado el rol de NCAM sérica como marcadora tumoral en pacientes con patología cerebral benigna y maligna. Para ello en un primera etapa estudiamos por western blot y densitometría los niveles de todas las isoformas de NCAM sérica en individuos sanos apareados por edad y sexo, observando que las isoformas de bajo PM difieren con la edad de los individuos. Determinamos los niveles de las distintas isoformas de NCAM presentes en el suero de pacientes con tumores primarios del SNC: gliomas (n=34), metástasis única (n=27), tumores benignos (n=22). Las muestras de suero de cada paciente se analizaron por western blot y densitometría. La concentración de NCAM se asoció a los parámetros clínico-patológicos indicadores de pronóstico, así como con la evolución clínica de cada paciente. Se detectaron bandas específicas de alto (≥130kDa) y bajo PM (<130kDa). Se encontró que el cociente ≥130kDa /<130kDa está aumentado en los pacientes con tumores cerebrales vs controles sanos (diferencias independientes de edad y sexo). No se encontró diferencia entre pacientes con tumores benignos o malignos NCAM sérico mostró una especificidad del 80% y una sensibilidad del 60%, con un VP+ del 60% y VP- del 80% para identificar pacientes con tumores cerebrales. En una segunda muestra post cirugía fue posible encontrar una disminución de los valores séricos de NCAM en 9 de 12 pacientes analizados. C) Hemos medido los niveles de NCAM sérico en pacientes con déficit cognitivo como la Demencia tipo Alzheimer (DTA). Las patologías neurodegenerativas presentan niveles séricos elevados de todas las isoformas de NCAM. Además se observó un aumento especifico de la NCAM <130kDa asociada al grado de deterioro cognitivo de los pacientes DTA por lo tanto podría ser útil como marcador de seguimiento del paciente, lo cual facilitaría el diagnostico y el tratamiento en etapas tempranas.

Abstract:
NCAM is an adhesion molecule which belongs to the immunoglobulin superfamily and mediates both homophilic binding between neighbour cells like neurons, astrocites and muscular cells; and heterophilic binding between these cells and proteins from the extracellular matrix. NCAM presents three major isoforms: 120, 140 and 180 kDa. Only NCAM 120 kDa is linked to the membrane via a glycosyl-phosphatidyl inositol (GPI) anchor and lacks citoplamic and transmembrane domains. NCAM has sialic acid (PSA) homo polymeric chains covalently bond. PSA NCAM expression is highly expressed in central nervous system during embrionary development and post natal early stages but the PSA expression is down regulated in adult tissues. The presence of PSA NCAM in adults prevents cellular adhesion and stimulates tissular remodelling and plasticity. In addition NCAM exist in a soluble form, since its presence has been described in several biological fluids. Some authors proposed soluble NCAM as a diagnostic marker for tumoral pathologies like small cells lung cancer (SCLC) and neurodegeneratives pathologies including squizofrenia. Our objective was to study the relationship between NCAM molecule and experimental and human tumoral and neurodegenerative processes. A) We study the roll of NCAM in biological behaviour of the cellular line LPO7, derived from a murine lung tumor with neuroendocrine component. The NCAM expression was evaluated in homogenates and tumoral primary cultures. Several NCAM isoforms were detected whose expression varies through tumoral growth. On the other hand, decrease of experimental metastasis with anti NCAM suggests that this molecule is implicated in target organ colonization. In vitro NCAM treatment with specific antibodies diminishes adhesion, migration and cellular proliferation while induces actine cytoskeleton reorganization, compatible with mesenchematic epithelial reversion. B) We have study the roll of serum NCAM as a tumoral marker in patients with benign and malign brain pathology. First, we determine the levels of serum NCAM isoforms in healthy individuals paired by sex and age by western blot and densitometry. Low Molecular Weigh NCAM bands (100-130kDa) decreased significantly with age independently of sex. Then, we determine NCAM isoforms levels in serum from primary brain tumor patients: gliomas (n=34), brain metastsis (n=37) and benign tumors (n=22). NCAM values were associated with clinico-pathological prognostic parameters, as well as clinical evolution of each patient. There were detected specific bands of high (≥130 kDa) and low molecular weigh (<130 kDa). It was observed that the ratio ≥130 /<13O kDa is increased in patients vs control. It was no differences between benign and maligns tumors. NCAM showed a sensitivity of 60% and a specificity of 80%. The PV+ was about 60% and the PV- was 80% for brain tumors patients’ identification. In a post surgery sample we detected decreased serum values of NCAM in 9 of 12 patients. C) We have measure serum NCAM levels in patients with cognitive deficit like Dementia of Alzheimer Type (DAT).DAT patients presented values of all isoforms significantly higher than healthy controls of similar age. Only low molecular weight NCAM isoforms were associated with GDS, which may be useful as follow up marker. This marker would allow the diagnostic and treatment in early stages.

Ramhorst, Rosanna Elizabeth. "Mecanismos inmunológicos involucrados en la prevención del rechazo semi-alogénico fetal" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Benedetti, Rubén Mariano. "Inducción, producción y mantenimiento de la respuesta inmune sistémica por inmunización oral" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Tradicionalmente se pensaba que las mucosas poseían un sistema inmune propio y común con pocos puntos de contacto con el resto del sistema inmune. Esto se fundamentaba en que las mucosas se caracterizan por (l) el predominio de la IgA, (2) la dificultad de obtener respuesta inmune en las mucosas con una inmunización sistémica y (3) que con una inmunización por una mucosa es posible dar protección en otras mucosas distantes. Con posterioridad, se encontraron varias interacciones entre los tejidos linfoides de las mucosas y los sistémicos que llevan a pensar que en realidad no hay una clara separación en dos sistemas inmunes, sino que constituyen una unidad. El fenómeno de la tolerancia oral, la posibilidad (en algunos casos) de inducir la respuesta inmune sistémica por inmunización por la vía de las mucosas y el transporte hepatobiliar de IgA polimérica desde el suero al intestino son ejemplos de esa comunicación. Otra conexión posible es que la médula ósea reciba células productoras de anticuerpos luego de una inmunización sistémica. Es bien conocido que en la médula ósea aparecen células plasmáticas luego de una inmunización sistémica. La médula ósea es el principal productor de anticuerpos en la respuesta secundaria. Pese a esto, no era claro si una inmunización por las mucosas podía llevar a que la médula ósea se convierta en productora de anticuerpos especificos. En este trabajo efectuarnos inmunizaciones orales (intragástricas e intra-placas de Peyer) utilizando toxina colérica, uno de los más potentes antígenos y adyuvante por las mucosas, para observar la cinética de aparición de las células plasmáticas antitoxina en el intestino, el bazo y la médula ósea. También observamos la respuesta de memoria. En estas condiciones encontramos que: - Tanto durante el primado como en la memoria, en la médula ósea aparecen células plasmáticas y este es el principal órgano productor de anticuerpos destinados a la circulación sanguínea. - La médula ósea es, además, el único órgano que mantiene células secretoras de anticuerpos muchos meses después de la inmunización oral, cuando consideramos que ya no queda antígeno en el organismo. - Existe una muy temprana presentación antigénica en el bazo, paralela a la que ocurre en el intestino. - La médula ósea posee linfocitos T y B de memoria, aunque el ganglio mesentérico y el bazo tienen mayor concentración de células de memoria. Todas estas observaciones contribuyen al mejor conocimiento de la amplia comunicación entre el llamado sistema inmune de las mucosas y el central y sostienen la idea de la unidad del sistema inmune.

Abstract:
Traditionally it was thought that the mucosae had a common immune system with few meeting points with the rest of the immune system. This was based on that the mucosae are characterized by (l) the predominance of the IgA, (2) the difficulty to obtain immune response in the mucosae with a systemic immunization and (3) that with a mucosal immunization is possible to give protection in other distant mucosae. Later, several interactions between the mucosal and systemic lymphoid tissues were found wich led to think that in fact there is no clear separation between the two immune systems, but that they constitute a unit. The phenomenon of oral tolerance, the possibility (in some cases) of inducing a systemic immune response by immunization by the route of the mucosae and hepatobiliar transport of polimeric IgA from serum to intestine are examples of that communication. Another possible connection is that the bone marrow receives antibody producing cells after a systemic immunization. It is well known that in the bone marrow plasma cells appear after a systemic immunization. The bone marrow is the main antibody producing site in the secondary response. In spite of this, it was not clear whether an immunization by the mucosae could make the bone marrow become a producer of specific antibodies. In this work we carried out oral immunizations (intragastric and intra-Peyer patches) using cholera toxin, one of the most powerful antigens and adjuvant by the mucosae, to observe the kinetics of appearance of the antitoxin plasma cells in the intestine, spleen and bone marrow. We also observed the memory response. In these conditions we found that: - During the priming as well as during the memory, plasma cells appear in the bone marrow and this is the main organ producing antibodies destined to blood circulation. - The bone marrow is, in addition, the only organ that maintains antibody secreting cells many months after oral immunization, when we consider there is no more antigen left in the organism. - A very early antigenic presentation in spleen exists, parallel but independent from what happens in the intestine. - The bone marrow does have memory T and B cells, although the mesenteric lymph node and spleen have greater concentrations of memory cells. All these observations contribute to the best knowledge of the extensive communication between the so called mucosal immune system and the central immune system and support the idea of the unit of the immune system.

Steinberg, Marcos Wenceslao. "El rol de las proteínas tirosina quinasas ZAP-70 y Syk en la activación de las células T: Estudios preclínicos de terapia génica para la deficiencia en ZAP-70" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas ZAP-70 y Syk componen la familia Syk de tirosina quinasas. Estas dos proteínas presentan secuencias de amino ácidos y estructuras similares, sin embargo ZAP-70 y Syk son reguladas diferentemente en términos de expresión y probablemente de función. En los linfocitos T, estas quinasas intervienen en la diferenciación y la activación celular mediada por el receptor de células T (TCR). En este trabajo hemos sido capaces de realizar un estudio comparativo del rol de ZAP-70 y de Syk en los eventos precoces de señalización via el TCR, utilizando células T primarias y líneas celulares T transformadas expresando separadamente niveles equivalentes de ZAP-70 y de Syk. En dicho estudio demostramos que ZAP-70 y Syk contribuyen de manera diferencial a la señalización vía e TCR, en particular a la fosforilación de la cadena C del receptor. Además, Syk es menos eficaz que ZAP-70 para asociarse al TCR. Nuestro estudio demuestra que Syk funciona de manera diferente a ZAP-70 en la señalización precoz via el TCR. La deficiencia humana en ZAP-70 constituye una forma rara de inmunodeficiencia combinada severa (SCID) caracterizada por la ausencia de células T CD8+ y la presencia de células T CD4+ anormales. Utilizando la terapia génica basada en la transferencia de genes mediada por un vector retroviral, en este trabajo hemos sido capaces introducir el gen wild-type de ZAP-70 dentro de células T CD4+ primarias aisladas de pacientes deficientes en ZAP-70. En las células T CD4+ de pacientes transducidas, la expresión ectópica de ZAP-70 fue suficiente para reconstituir las funciones defectuosas de las mismas. Además, la introduccón del gen wildtype de ZAP-70 dentro de células progenitoras de la médula ósea “lin”, aisladas de ratones ZAP-70 KO, y su posterior transplante en estos mismos ratones, resultó en la reconstitución del desarrollo y las funciones de los linfocitos T CD4+ y CD8+. Nuestros descubrimientos proporcionan una importante información para el establecimiento de protocolos de terapia génica, no solo para la inmunodeficiencia en ZAP-70 sino también para diferentes tipos de inmunodeficiencias primarias.

Abstract:
The ZAP-70 and Syk proteins are the two members of the Syk family of protein tyrosine kinase. These two proteins share important similarities of sequence and structure, however, ZAP70 and Syk differ in terms of expression and probably of function. In T lymphocytes, these kinases are involved in cellular differentiation and activation. In this work, we have been able to compare both tyrosine kinases participation in TCR signaling pathway in human primary T cells obtained from ZAP-70 deficient patients, which expressed important levels of Syk in absent of ZAP-70. In addition, we performed the same study in transformed-T cell lines expressing stable equivalent levels of ZAP-70 and/or Syk. These results demonstrate that upon TCR stimulation, ZAP-70 and Syk differ in their capacity to support C-chain phosphorylation. Moreover, we have shown that Syk is less efficient than ZAP-70 in the association to the TCR. Our results suggest a differential role for ZAP-70 and Syk in the early signaling events after TCR stimulation. The human ZAP-70 deficiency is a rare severe combined immunodeficiency (SCID), characterized by a selective inability to produce CD8+ single positive T cells and a signal transduction defect in peripheral CD4+ T cells. A gene therapy approach may prove to be an alternative treatment for ZAP-70-deficient patients. In the present study we have been able to successfully introduce the wild-type ZAP-70 gene into primary T cells from ZAP-70-deficient infants with a reconstitution of T cell function. Moreover, introduction of the wild-type ZAP-70 gene was into murine ZAP-70ˉ/ˉ hematopoietic stem cells and subsecuent ZAP-70-transduced bone marrow cells transplantation, restored the development and function of CD4 and CD8 T Lymphocytes. Altogether, our studies offer important information to the establishment of new gene therapy-based protocols as an alternative treatment for ZAP-70 and other immunodeficient patients.

Cerutti, María Laura. "Desarrollo y caracterización de anticuerpos contra un factor de transcripción viral unido a su ADN específico" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune de etiología desconocida. El rasgo principal de esta enfermedad es la presencia de anticuerpos dirigidos contra componentes nucleares, como histonas y ADN doble cadena. En los últimos años, se ha demostrado que varios complejos proteína: ADN pueden inducir una respuesta autoimmune contra ADN en ratones normales, no-predispuestos a desarrollar autoinmunidad. En este trabajo de tesis se describe el desarrollo de un modelo de inmunización con un complejo proteína: ADN molecularmente definido y la caracterización de la respuesta inmune generada contra él en animales normales. En particular, se utilizó el complejo formado por el dominio C-terminal del factor de transcripción E2 del papilomavirus humano y un olígonucleótido doble cadena de 18 pb comprendiendo uno de sus sitios de reconocimiento específico dentro del genoma viral. El análisis de la respuesta inmune humoral de ratones inmunizados con la proteína E2 libre o unida a ADN indica que ésta es una proteína altamente inmunogénica. La inmunización con E2 libre emulsionada en un adyuvante de composición aceite-en-agua resulta en una respuesta policlonal dirigida hacia el reconocimiento de epitopes discontinuos, sugiriendo que la naturaleza acuosa del adyuvante es el responsable de mantener a la proteína en su conformación nativa. El estudio de la respuesta policlonal contra ADN desarrollada en los ratones inmunizados con este complejo proteína: ADN señala que el olígonucleótido específico puede adquirir potencial inmunogénico sólo cuando el complejo es incubado a altas concentraciones por un largo período de tiempo. En estos casos, los ratones inmunizados desarrollaron altos títulos de IgG anti-oligonucleótido durante una respuesta T-dependiente clásica. Además, la inmunización con la proteína E2, ya sea libre o unida a su secuencia de reconocimiento, resultó en una respuesta autoinmune contra ADN nativo doble cadena. Estos resultados son congruentes con la hipótesis de que proteínas virales con capacidad de unir ADN tendrían el potencial necesario para iniciar el desarrollo de la enfermedad autoimmune lupus eritematoso sistémico. A partir de uno de los animales inmunizados con el complejo E2: ADN han sido obtenidos y caracterizados seis anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína viral y dos anticuerpos contra el olígonucleótido específico. En coincidencia con el patrón de reactividades observado en la respuesta políclonal, la mayoría de los hibridomas anti-E2 reconocen epitopes discontinuos en la proteína. Los estudios de mapeo epitópico-funcional realizados sobre estos anticuerpos monoclonales revelan que se han obtenido dos grandes poblaciones de anticuerpos: una formada por anticuerpos capaces de formar un complejo temario estable con E2 y el oligonucleótido, y otra población formada por anticuerpos que reconocen un epitope, parcial o totalmente, superpuesto con la superficie de unión a ADN en el factor de transcripción, interfiriendo en su interacción con ADN. Estudios detallados de la interacciones anti-ADN: ADN muestran que los dos anticuerpos monoclonales anti-ADN generados reaccionan contra el oligonucleótido utilizado como inmunógeno con afinidades comparables a las del factor de transcripción E2. Por el contrario, estos anticuerpos unen con muy baja afinidad moléculas de ADN no-relacionadas doble cadena del mismo largo. Más aún, ambos anticuerpos unen al oligonucleótido libre y acomplejado a E2 con afinidades muy similares, formando un complejo temario estable. La estructura de las regiones variables y el patrón de mutaciones de la secuencia de estos anticuerpos indica que éstas son muy similares a las encontradas en anticuerpos anti-ADN generados en modelos murinos de lupus. En conjunto, todos estos resultados sugieren fuertemente que estos anticuerpos monoclonales anti-ADN son el producto de una respuesta inmune dirigida por el antígeno, en el cual el complejo E2: ADN actuó como una nueva entidad inmunogénica.

Abstract:
Systemic lupus erythematosus is an autoimmune disorder with unknown etiology. The major hallmark of this disease is the presence of antibodies against nuclear components, including double-stranded DNA and histones. In the last years, several protein: DNA complexes have been shown to induce anti-DNA antibodies in normal, nonautoimmune-predisposed mice. This PhD thesis describes the development of an immunization model using a molecularly defined protein: DNA complex and the characterization of the immune response generated against it in non-autoimmune mice. In particular, a complex formed by the C-terminal domain of the human papillomavirus E2 transcription factor and a cognate 18 bp double stranded oligonucleotide corresponding to one of its recognition sites in the viral genome has been used. Analysis of the humoral immune response of mice challenged with free or bound E2 indicates that this is a very immunogenic protein. Immunization with free E2 emulsified in an oil-in-water adjuvant elicits a strong humoral response shifted to the recognition of discontinuous epitopes, suggesting that the aqueous nature of this adjuvant emulsion is responsible for keeping the protein in its native conformation. Analysis of the induced polyclonal anti-DNA response indicates that the specific oligonucleotide can acquire immunogenic potential only when the complex is incubated under high concentrations for a long-term period. In this case, the immunized mice develop high IgG anti-oligonucleotide sera titers during a typical T-dependent immune response. Besides, immunization with free or DNA complexed E2 protein also results in an autoimmune response to native double stranded DNA, supporting the hypotesis that viral DNA-binding proteins may have the potential to initiate the development of the autoimmune disease Systemic lupus erythematosus. From one of the E2: DNA complex immunized mice there has been obtained and characterized six monoclonal antibodies against the viral protein and two against the specific oligonucleotide. According with the pattern of reactivity observed in the polyclonal response, most anti-E2 hybridomas recognize discontinuous epitopes on the protein. Epitope mapping and functional analysis of these monoclonal antibodies reveals that two separate antibodies populations can be obtained: one formed by antibodies able to form a stable ternary complex with protein and the oligonucleotide, and other in which the antibodies recognize an epitope totally or partially overlapped with the DNA-binding surface of the transcription factor, interfering with its interaction with DNA. Detailed studies of the anti-DNA: DNA interactions showed that the two generated anti-DNA monoclonal antibodies react against the double stranded oligonucleotide used as immunogen with affinities comparable to that of the transcription factor. In contrast, they bind with low affinities with unrelated double stranded DNAs of the same length. Furthermore, they bind with almost the same affinity towards the free or E2 bound oligonucleotide, forming a stable ternary structure. The variable region structures and mutation pattern of the anti-DNA antibodies sequences indicate that they are similar to the anti-dsDNA antibodies described on murine models of systemic lupus erythematosus. Taken together these results strongly suggest that these anti-DNA monoclonal antibodies are the product of an antigen-driven immune response, in which the E2: DNA complex acted as an new immunogenic entity.

Goldszmid, Silvana Romina. "Células dendríticas en la inmunoterapia del cáncer : desarrollo de una vacuna anti-melanoma en un modelo experimental" (2003-12) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La incidencia del melanoma aumenta a mayor velocidad que la de otros cánceres y la sobrevida de pacientes con metástasis distantes es generalmente < l año. Con el avance en la comprensión de los requerimientos para inducir inmunidad las CD se han convertido en atractivos vectores para la inmunoterapia del cáncer. Consideradas las más potentes células presentadoras de Ag (APC), las células dendríticas (CD) actúan como centinelas del sistema inmune, patrullando a través de la sangre, tejidos periféricos, linfa y órganos linfoides secundarios alertando al sistema inmune y controlando sus decisiones más tempranas. En la periferia las CD inmaduras capturan antígenos (Ag) y migran hacia los órganos linfoides secundarios donde presentan dichos Ag a linfocitos T naïve induciendo la activación de la respuesta inmune. El objetivo del presente trabajo de Tesis fue estudiar desarrollar una vacuna anti-melanoma utilizando CD cargadas con células tumorales apoptóticas y estudiar los mecanismos involucrados en la respuesta inducida contra el tumor. Para ello, se utilizó el modelo de melanoma murino B16. El melanoma B16 es un tumor de origen espontáneo, débilmente inmunogénico y por lo tanto provee un marco adecuado para el estudio de la modulación de la respuesta inmune anti-tumoral. Las CD aisladas a partir de precursores de médula ósea fueron cultivadas en presencia de sobrenadante de cultivo de la línea productora de GM-CSF establecida mostraron un fenotipo inmaduro con baja expresión de moléculas MHC I y II y coestimulatorias y alta capacidad de captación antigénica tanto por fagocitosis de Ag particulados como endocitosis de macromoléculas. Luego de inducir la maduración con LPS se observó un marcado aumento en la expresión de moléculas MHC I y II y coestimulatorias y un aumento en la capacidad estimulatoria en cultivos mixtos alogeneicos. Ensayos de migración in vitro mostraron la alta capacidad migratoria de las CD inmaduras en respuesta a estímulos inflamatorios y de CD maduras en respuesta a quimioquinas constitutivamente secretadas en los ganglios linfáticos. Se comprobó también, mediante la realización de ensayos de migración in vivo, que las CD inyectadas subcutáneamente eran capaces de migrar hacia los ganglios linfáticos de drenaje. Estos resultados reflejaron el potencial de las CD obtenidas para su utilización en el diseño de una vacuna anti-tumoral. La apoptosis de las células B16 fue inducida por radiación y y evidenciada por tinción con Anexina V / IP. 48 hs después de la irradiación se observaron 70 —80 % de células apoptóticas caracterizadas por la tinción Anexina +/ IP - comparadas con lO—12 % en las células sin tratar. Las células Bl6 apoptóticas fueron eficientemente fagocitadas por CD inmaduras. Luego de 24 hs de cocultivo gran proporción (> 50 %) de CD había incorporado material apoptótico según se evidenció por FACS, microscopía confocal y microscopía electrónica. El cocultivo con células tumorales apoptóticas indujo la maduración de las CD, evidenciada por un aumento en la expresión de MHC II y CD86 respecto a CD inmaduras cultivadas en ausencia de células apoptóticas. Dicho aumento se observo principalmente en la población de CD que había incorporado material apoptótico. Otra evidencia de la maduración de las CD, fue la marcada disminución de la capacidad endocítica con respecto a CD inmaduras (intensidad de fluorescencia media 35,8 vs. 192,5). Luego de ser inyectadas subcutáneamente, CD cocultivadas con células apoptóticas o CD solas migraron hacia los ganglios linfáticos en forma comparable. Las CD encontradas en los ganglios correspondían a ~0.5% del inoculo original y en ambos casos se observo una expresión uniforme de MHC II y CD86 equivalente a la observada en CD maduras. La vacunación con CD cargadas con células tumorales apoptóticas (CD-Apo) indujo un alto nivel de protección contra el desarrollo del melanoma B16: 80 % de los animales permanecieron libres de tumor 12 semanas después del desafió. Dicha protección fue especifica para el melanoma B16, ya que todos los animales vacunados desarrollaron tumor cuando fueron desafiados con un tumor singeneico no relacionado. 80 % de los animales vacunados con CD-Apo y desafiados 10 semanas después de la inmunización permanecieron libres de tumor, consistente con la inducción de memoria inmunológica. Estudios de depleción in vivo de subpoblaciones linfocitarias demostraron que tanto linfocitos T CD4+ como CD8+ son son necesarios para la efectiva vacunación con CD-Apo. Se evidenció que ambas poblaciones linfocitarias son activadas para la producción de IFNy cuando son estimuladas con CD-Apo y CD-TRP-2. Además, los linfocitos CD8+ son capaces de reconocer células Bl6 intactas in vitro y de lisar células pulsadas con TRP-2 in vivo. El estudio de la inmunidad humoral demostró la presencia de anticuerpos específicos dirigidos contra las ce'lulas B16. Por último, en el análisis del sitio de inyección del tumor se observó un importante infiltrado de neutrófilos a tiempos muy tempranos, siendo máximo seis días después de la inyección del tumor. La presencia de linfocitos en el sitio de inyección se observó más tardíamente. Esto podría indicar que los neutrófilos también juegan un rol importante en el rechazo tumoral. En el presente trabajo de Tesis se ha demostrado por primera vez, que la vacunación con CD cargadas con células tumorales apoptóticas (CD-Apo) induce inmunidad a largo plazo dependiente de la acción combinada de linfocitos T CD4+ y CD8+ contra el melanoma B16 débilmente inmunogénico. Este modelo preclínico provee el marco necesario para la realización de estudios clínicos comparables utilizando CD-Apo como adyuvante para la inmunización activa contra el cáncer.

Abstract:
Melanoma is the cancer with the fastest increasing incidence, and survival of patients with distant metastases is generally < l year. With increased understanding of the requirements for initiating immunity, dendritic cells (DCs) have become attractive vectors for immunotherapy of this and other cancers. Considered the most potent antigen presenting cells (APC), DC act as sentinels of the immune system, they patrol trough the blood, periphery, lymph and lymphoid organs, alerting the immune system and controlling its early decisions. At the periphery immature DC capture antigens (Ag) and migrate to the secondary lymphoid organs where they present those Ag to naïve T cells and therefore inducing the immune response. The aim of this Thesis work was to develop an anti-melanoma vaccine using DC loaded with apoptotic tumor cells and to study the mechanisms underlying the induced anti-tumor response. In order to do that, we used the B16 melanoma. The B16 melanoma is a poorly immunogenic tumor of spontaneous origin, thus providing the adequate background to explore maneuvers to increase host defenses against it. The DC obtained from bone marrow precursors were cultured in the presence of GM-CSF containing supematant from the previously established GM-CSF producing cell line, showed an immature phenotype with low expression of MHC II and I and co-stimulatory molecules and high Ag capture capacity. After LPS induced maturation DC showed an up-regulated expression of MHC I and II and co-stimulatory molecules and high T cell activation capacity in the mixed leukocyte reaction. DC also showed a high migratory activity as evidenced by in vitro migration assays. Furthermore, it has also been shown that after s.c. injection DC migrated to the draining lymph nodes. These observations pointed out the potential of DC for the design of anti- tumor vaccines. To induce apoptosis, B16 cells were irradiated (70 Gy) and cultured for 48 h. Apoptosis was documented by AnexinV / PI staining. After 48 h, cultured unirradiated cells contained 10-12% early apoptotic cells characterized by AnnexinV + / PI —staining. In contrast, 70-80% of irradiated cultured tumor cells had undergone early apoptotic death. 12-19% of the cells displayed AnnexinV + / PI + staining, indicating secondary necrosis in both unirradiated and irradiated cultures. Then DCs were cultured apoptotic tumor cells for 24h. At 37°C, over 50% of immature DCs phagocytosed apoptotic material, as confirmed by FACS, confocal fluorescence microscopy and electron microscopy. After coculture a large fraction of the tumor-exposed DCs upregulated CD86 as well as MHC II. Another evidence of the induced maturation was the down-regulated capacity to endocytose FITC-Dextran as compared with immature DC(mean fluorescence 35,8 vs 192, 5). Following injection, DCs migrated to the draining lymph nodes comparably to control DCs at a level corresponding to ~0.5% of the injected inoculum and uniformly expressed high levels of CD86 and MHC II molecules comparable to fully mature and immunogenic DC. Mice vaccinated with tumor-loaded DCs (DC-Apo) showed a strong protection against an intracutaneous challenge with B16: 80% of the mice remaining tumor-free 12 weeks after challenge. This protection was not observed when vaccinated mice were challenged with a nonrelated syngeneic tumor. 80 % of mice receiving a tumor challenge 10 weeks after vaccination were also protected, consistent with the induction of tumor-specific memory. When either CD4+ or CD8+ T cells were depleted in vivo at the time of challenge, the protection was completely abrogated, indicating that both CD4+ and CD8+ T cells are necessary for the effective anti-tumor response induced DC-Apo vaccination. CD4+ and CD8+ T cells were efficiently primed in vaccinated animals, as evidenced by interferon-y secretion after in vitro stimulation with DC-Apo or DCs pulsed with TRP-2. In addition, B16 melanoma cells were recognized by immune CD8+ T cells in vitro, and cytolytic activity against TRP-2(180-188) pulsed target cells was observed in vivo. The study of the humoral response showed the presence of anti-B16 specific antibodies. Finally, when the tumor injection site was analyzed a large amount of neutrophils were observed at very early time points and being maximum six days following tumor challenge. The presence of lymphocytes at the injection site was observed only at later time points. This could indicate tha neutrophils also play an important role in the tumor rejection. In the present Thesis work it has been shown for the first time, that DCs phagocytosing apoptotic tumor cells (DC-Apo) elicit long-lived combined CD4+ and CD8+ immunity against the poorly immunogenic B16 melanoma. This preclinical model sets the stage for comparable studies in humans with DC-Apo as adjuvants for active immunization against cancer.

Gabri, Mariano Rolando. "Ensayos pre-clínicos de dos vacunas inmunoterapéuticas con actividad antitumoral desarrolladas a partir de gangliósidos" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Para el año 1934 la toxina de Coley era el único tratamiento sistémico para el tratamiento de cáncer. Este preparado fue desarrollado unos años antes por el prestigioso cirujano del Memorial Hospital de New York, William B. Coley, utilizando toxinas bacterianas de los géneros Serratia y Streptococcus. Este producto se convirtió así en la primera vacuna oncológica y en uno de los primeros tratamientos sistémicos del cáncer. A pesar de los experimentos iniciales del siglo pasado, luego de los ensayos de Coley la inmunoterapia oncológica fue dejada de lado por el advenimiento de las drogas quimioterapéuticas y las mejoras en la radioterapia. En las últimas décadas se ha vuelto a observar a la inmunoterapia como una estrategia complementaria válida para el tratamiento de cáncer. Este nuevo interés sobre este tipo de tratamientos, tiene sus bases en el gran avance alcanzado en el entendimiento de los mecanismos inmunológicos y de los procesos que dominan la biología tumoral. En esta tesis se presentan resultados relativos a dos vacunas desarrolladas a partir de gangliósidos, moléculas de membrana anfipáticas que pertenecen a la familia de los glicoesfingolípidos con por lo menos, un residuo de ácido siálico lo cual es una característica distintiva de estos compuestos. Los resultados se centran en la evaluación de los efectos tóxicos, la respuesta antitumoral y la modulación inmunológica desencadenados por la aplicación de vacunas inmunoterapéuticas a base de gangliósidos, consistentes en un anticuerpo anti-idiotipo dirigido a gangliósidos glicolilados (anticuerpo 1E1O) y de una vacuna molecular del gangliósido NacGM3 conjugado a proteínas externas de membrana de N. Meningitidis proteoliposomas de muy pequeño tamaño (NacGM3/VSSP). Con este fin se evaluará también el perfil de los modelos murinos experimentales de cáncer mamario y melanoma a emplearse para cada vacuna, respectivamente. Los resultados demuestran que los modelos animales elegidos presentan características adecuadas para ser utilizados como herramientas de evaluación de los efectos y mecanismos desencadenados por la inmunización con las vacunas. La línea celular de cancer mamario murino F3II crece en el espacio subcutáneo desarrollando un fenotipo tumoral altamente maligno. Su portación produce un cuadro inmunoestimulatorio posiblemente ligado a la secreción de GM-CSF, citoquina ante la cual se modifica su respuesta proliferativa. Además estas células son reactivas al anticuerpo P3, precursor del 1E10, lo que la convierte en un modelo apropiado para la evaluación de la respuesta antitumoral de 1E10. La inmunización de ratones con el preparado 1E10-KLH no produce efectos tóxicos de magnitud en los animales, desarrollando una respuesta tumoral que es capaz de reconocer a las células F3II. Utilizando este proceso de inmunización se puede observar un retardo en el crecimiento tumoral y una disminución significativa en el recuento de metástasis espontáneas en los ratones tratados. Además se evaluó a la línea B16 crecida en animales singénicos como modelo de estudio de los efectos producidos por la vacunación con NacGM3/VSSP. Las células B16 presentan en su membrana al gangliósido NacGM3, reaccionando positivamente ante la presencia del mismo en el medio de cultivo. La vacunación de ratones C57 con NacGM3/VSSP desarrolla una respuesta inmunológica humoral que es capaz de reconocer a los componentes de la vacuna y a las células de melanoma B16. La aplicación de la vacuna no produce efectos tóxicos de importancia. La vacunación con NacGM3/VSSP genera una respuesta antitumoral que se manifiesta en el rechazo del desafío tumoral en el 100% de los animales vacunados. Esta respuesta se mantiene en el tiempo hasta tres meses luego de finalizada la misma. La respuesta antitumoral obtenida es dosis dependiente ya que se pudo observar una actividad antitumoral creciente en lotes de ratones inmunizados con una concentración vacunal de hasta 360 μg/dosis y específica hacia células que expresan el gangliósido NacGM3). La vacunación con NacGM3/VSSP desarrolla una respuesta de anticuerpos con preponderancia del isotipo IgG2b. Estos anticuerpos reconocen cortes de tumor B16 siendo su epítope reactivo el residuo de ácido sialico presente en las células. La investigación básica en vacunas provee un mejor entendimiento de los mecanismos inmunológicos involucrados en el rechazo tumoral inducidos por la vacunación. Los ensayos preclínicos con modelos animales de cáncer son de importancia capital en el estudio de los efectos inmuno modulatorios de estas vacunas y en la evaluación de sus capacidades terapéuticas a nivel clínico.

Abstract:
By 1934 Coley's toxin was the only systemic treatment for cancer. This compound was developed few years before for the famous surgeon from The Memorial Hospital of New York, William B. Coley, using bacterial toxins from Serratia and Streptococcus. This product become the first cancer vaccine and one of the first systemic treatments for cancer. Despite the initial experiments carried out in the last century, after Coley attempts cancer immunotherapy was abandoned due to the appearance of quimiotherapeutic drugs and improvements in radiotherapy. In the last decades, immunotherapy is seeing again as a valid adiuvant therapy for cancer treatment. This new interest in this kind of treatments, is based in the important advance reached in the understanding of immunology and the processes that govern tumor biology. In this thesis, results related with two vaccines based in gangliosides are presented. Gangliosides are amphipatic membrane molecules that belong to the glicoesfingolipid family, having at least one residue of sialic acid, which is a distinctive characteristic of this kind of compounds. The results focus in the evaluation of toxicity, antitumoral response and the immunological modulation due to the application of this two vaccines, one an antiidiotypic antibody against glycolilated gangliosides (1E1o antibody) and other a molecular vaccine composed by the ganglioside NacGM3 conjugated to proteins from the outer membrane of N. Meningitidis in proteoliposomes of very small size (NacGM3/VSSP). With this reasoning in mind, the profile of the experimental murine models of breast cancer and melanoma to be employed with each vaccine, was also evaluated. Results demonstrated that the animal models chosen have the characteristics needed to be used as evaluation tools of the effects and mechanisms developed by the immunization with the vaccines. F3II murine breast cancer cell line grows in the subcutis developing a highly malignant tumor phenotype. Its bearing produce an immunoestimulatory effect probably related to the secretion of GM-CSF, a cytoquine able to modify its proliferative response. Furthermore, this cells are reactive to P3 antibody, a precursor of 1E10, becoming a very adequate model for the evaluation of 1E10 antitumor response. Immunization of mice with the preparation 1E10-KLH did not produce relevant toxic effects in the animals, developing a humoral response able to recognize F3II cells. Using this immunization process it can be observed a delay in tumor growth an a significant decrease in the number of spontaneous metastasis in treated animals. Also, the B16 line, growing in singenic animals, as a study model of the effect produced by vaccination with NacGM3/VSSP, was evaluated. B16 cells have in its membrane NacGM3 ganglioside. Vaccination of C57 mice with NacGM3/VSSP developed a humoral immunologic response able to recognize both, components of the vaccine and B16 melanoma cells. Administration of the vaccine did not produce relevant toxic effects. Vaccination with NacGM3/VSSP generated an antitumoral response that translated in the rejection of the tumor challenge in 100% of the vaccinated animals. This response is sustained in the time up to three months after final inoculation. The antitumoral response obtained is dose-dependent since was observed an increasing antitumoral activity in mice immunized with a vaccine concentration of up to 360 μg/dose, being specific towards cells expressing NacGM3 ganglioside. Vaccination with NacGM3/VSSP developed an antibody response mostly based in the isotype IgG2b. This antibodies recognize B16 tumor slides being its reactive epitope the sialic acid residue which is present in the cells. Basic research in vaccines provide a better understanting of the immunologic mechanisms involved in tumor rejection induced by vaccination. Preclinical experiments with animal models of cancer are of utmost importance in the study of the immunomodulatory effects of this vaccines and the evaluation of its therapeutic capabilities at the clinical level.

Barrionuevo, Paula. "Efecto de los complejos inmunes sobre las moléculas de histocompatibilidad (MHC) y otras moléculas asociadas a fenómenos inflamatorios en monocitos humanos" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Un fenómeno inflamatorio se produce la migración unidireccional (quimiotaxis) de los polimorfonucleares neutrófilos (PMN) hacia el foco inflamatorio, seguidos luego por los monocitos sanguíneos. Esta migración es la respuesta al gradiente de concentración de un agente quimiotáctico determinado, como el leucotrieno B4 o las quimioquinas. También existen productos como los complejos inmunes (Cl), que son quimiotácticos para monocitos y neutrófilos. La formación de Cl circulantes es la consecuencia fisiológica de la respuesta de anticuerpos contra microorganismos u otros antígenos, o bien el resultado de enfermedades autoinmunes como artritis reumatoidea, o lupus eritematoso sistémico. Los Cl son los ligandos fisiológicos de los receptores para la porción Fc de las IgG (FcγRs) y la interacción entre éstos, dispara una variedad de funciones regulatorias y efectoras. Las moléculas de histocompatibilidad (MHC) son glicoproteínas presentes en la superficie celular que participan en la presentación de péptidos antigénicos para la activación de los linfocitos T. Existen dos tipos de moléculas presentadoras de antígenos: las MHC de clase I (MHC-I) y las de clase II (MHC-II). Estas moléculas se expresan constitutivamente en la superficie de los fagocitos mononucleares y su expresión es aumentada por citoquinas como el interferón -γ (IFN-γ). En este trabajo, se ha demostrado que la preincubación de los monocitos humanos con Cl formados por Ovoalbúmina (OA)- IgG anti-OA fue capaz de disminuir la expresión basal e inducida por IFN-γ de las MHC-I y las MHC-II. El efecto de los Cl sobre la expresión de las MHC es mediado a través de la interacción de los Cl con el FcγRI y el FcγRII. La disminución de la expresión de las MHC en los monocitos correlacionó directamente con la capacidad de presentación antigénica de dichas células. Similares resultados fueron obtenidos con sobrenadantes de monocitos tratados con Cl. La inhibición del efecto de los SN sobre las MHC-II por pepstatin y phosphoramidon sugiere que la secresión se proteasas aspárticas y metaloproteasas constituye un mecanismo posible en la regulación de las MHC-II por parte de los Cl. Por otra parte, la inhibición por phosphoramidón para las MHC-I sugiere la participación de metaloproteasas en la regulación de las MHC-I. Además, los sobrenadantes de PMN tratados con el Cl también fueron capaces de disminuir la expresión de las MHC. En el modelos murino de inflamación crónica, los Cl también disminuyeron la expresión basal e inducida por IFN-γ de las MHC-II en macrófagos murinos. Además, los Cl disminuyeron la expresión de otras moléculas de relevancia inmunológica tales como CD14, ICAM-1 y CD40. La disminución de la expresión de CD14 mediada por Cl va acompañada de la inhibición de la producción de factor de necrosis tumoral α (TNF-α) inducida por lipopolisacáridos (LPS). En cuanto al mecanismo, observamos que el efecto de los Cl sobre CD14 podía ser atribuido a la liberación de serinproteasa(s) con especificidad tipo tripsina por parte de los monocitos humanos. Por último, encontramos una forma soluble de CD14 en el sobrenadante de monocitos tratados con Cl, confirmando que la distribución de CD14 en superficie se debe al clivaje y la liberación de la molécula al medio extracelular. Este trabajo contribuye a la comprensión global de los mecanismos mediante los cuales agentes conocidos como pro-inflamatorios pueden tener funciones anti-inflamatorias en determinadas circunstancias. Este efecto anti-inflamatorio de los Cl podría funcionar como mecanismo de atenuación de una respuesta inflamatoria exacerbada por parte del huésped.

Abstract:
Inthe course of the inflammatory phenomenon, polymorphonuclear neutrophils (PMN) migrate unidirectionally (chemotaxis) towards the inflammatory focus, followed by monocytes. This migration occurs in response to the concentration gradient of a chemotactic agent, such as leukotriene B4 or chemokines. Molecules such as inmune complexes (IC) are chemotactic for neutrophils and monocytes. The information of circulating IC is the physiological consequence of antibody response to different antigens, including microorganisms, or lupus erythematosus. IC are the endogeneous agonists of the receptors for the Fc portion of IgG (FCγRs) and their interaction triggers a variety of regulatory and effectors functions. The histocompatibility molecules (MHC) are cell-surface glycoproteins involved in the presentation of peptides for the activation of T lymphocytes. There are two classes of molecules for antigen presentation: the MHC class I (MHC-I) and class II (MHC-II). This molecules are constitutively expressed on the surface of phagocytic mononuclear cells and their and their expression is induced by cytokines such as interferon-γ (IFN-γ). In this study, it has been demonstrated that pre-incubation of human monocytes with ovalbumin (OA)- rabbit IgG anti-OA immune complexes exerted an inhibition of basal and IFN-γ-induced expression of MHC-I and MHC-II. The effect of IC on MHC expression was mediated by the interaction of IC with FcγRI and FcγRII. The down-regulation of MHC expression on monocytes correlated directly with the antigen presentation capacity of this cells. Similar results were obtained with supernatants from IC-treated monocytes. The inhibition of the effects of supernatants on MHC-II by pepstatin and phosphoramidon suggests that the secretion of aspartic proteases and metalloproteases is a possible mechanism that regulates MHC-II. On the other hand, the inhibition of the effect on MHC-I by phosphoramidon supports the role of metalloproteases in this case. In addition, supernatants from IC-treated PMN were also able to reduce the expression of MHC. In a murine model of chronic inflammation, IC also down-regulated the basal and IFN-γ-indiced expression of MHC-II on murine macrophages. In addition, IC down-regulated the expression of other immunologically relevant molecules such as CD14, ICAM-1, and CD40. The down-regulation of CD14 expression mediated by IC correlated with the inhibition of lipopolisacarides (LPS)-induced tumor necrosis factor α (TNF-α) production. Regarding the mechanism, we demostrated that the effect of IC on CD14 could be ascribed to the secretion of serinproteases tripsina-like by human monocytes. Finally, we found a soluble form of CD14 in supernatants from IC-treated monovytes, confirming that the reduction of CD14 on the cell-surface is due to cleavage and release of the molecule into extracellular medium. This study contributes to the understanding of inflammatory phenomena. We have demonstrated that well-known pro-inflammatory molecules could behave, under certain circunstances, as anti-inflammatory agents. This anti-inflammatory effect of IC would attenuate an exacerbated host immune response.

Molinero, Luciana Lorena. "Inmunobiología de MICA en linfocitos T: estímulos fisiológicos, rutas de señalización y consecuencias funcionales de su expresión" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
INTRODUCCIÓN: La interacción de MICA con el receptor activador de citotoxicidad NKG2D (expresado en células NK y linfocitos T Ɣδ y αβ CD8+), desencadena una respuesta citotóxica contra células que expresan MICA. MICA se induce por estímulos de estrés, infecciones, neotransformación o linfocitos T activados con fitohemaglutinina. OBJETIVOS: a) estudiar la expresión de MICA en linfocitos T activados con estímulos fisiológicos; b) investigar los mecanismos moleculares involucrados y; c) investigar las consecuencias funcionales de dicha expresión. RESULTADOS: Por Western Blot, RT-PCR y citometría de flujo se observó que MICA se induce en linfocitos T presentes en células mononucleares de sangre periférica (CMSPs) por estimulación con células alogeneicas, por microagregación del complejo TCR/CD3 o por coestimulación con la molécula CD28 y PMA. Los niveles de expresión de MICA alcanzaron una meseta a los 4-7 días post-estímulo. Empleando inhibidores farmacológicos, observamos que la expresión de MICA inducida por la microagregación del complejo TCR/CD3, o la coestimulación a través de CD28 y PMA involucran a Lck/Fyn, ERK1/2, calcineurina, p38 MAPK, p70 56 y Jak. Asimismo, la inhibición farmacológica de NF-kB bloqueó la expresión de MICA en linfocitos T activados de la misma manera. Detectamos un sitio de unión KB localizado en el primer intrón del gen de MICA, y por ensayos de supershift observamos que esta secuencia une a los dímeros p65(RelA)/p50 y p50/p50 presentes en extractos nucleares de linfocitos T activados. Asimismo, la sobreexpresión de RelA en células HeLa por transfección transitoria incrementó los niveles de MICA, confirmando que la expresión de dicho gen es regulada por NF-kB. Además, por Western Blot observamos que CMSPs estimuladas con las citoquinas mitogénicas IL-2 e IL-4, lo mismo que linfocitos T polarizados hacia un perfil Th1 o Th2 inducen la expresión de MICA. Linfocitos T CD4+ purificados y activados con PMA e Ionomicina, pero no linfocitos T CD4+ presentes en CMSPs, expresan MICA en su superficie. Por ensayos de transwell, observamos que este fenómeno se debe a un factor soluble liberado por CMSPs activadas. Además, linfocitos T CD4+ activados con PMA e Ionomicina son blancos de citotoxicidad por células NK autólogas activadas con IL-2 (LAK). El bloqueo de la interacción MICA-NKG2D con AcMo anti-MICA mostró que MICA juega un rol menor en dicha respuesta. CONCLUSIONES: MICA se induce en linfocitos T activados por estímulos fisiológicos e involucra a la señalización de Lck/Fyn, ERK1/2, calcineurina, p38 MAPK, p70 56k, Jak y al factor de transcripción NF-kB. La expresión de MICA en superficie de linfocitos T tiene un rol menor en la lisis por células NK activadas. En esta tesis se describen por primera vez algunas de las vías de transducción de señales y un factor de transcripción involucrados en la expresión de MICA. Los resultados presentados sugieren además que la interacción MICA-NKG2D podría constituir un nuevo mecanismo de regulación de la respuesta inmune adaptativa.

Abstract:
INTRODUCTION: The interaction between MICA and the cytotoxicity activating receptor NKG2D (expressed in NK cells and CD8+ αβ and Ɣδ T cells) triggers a cytotoxic response against MICA expressing cells. MICA is induced by stress stimuli, infections, neotransformation or phytohemagglutinin in T cells. OBJECTIVES: a) to study MICA expression in T cells activated with physiological stimuli, b) to investigate the molecular mechanisms involved, and c) to explore the functional consequences of that expression. RESULTS: We activated T cells present in peripheral blood monononuclear cells (PBMCs)by allogeneic stimulation, microaggregation of TCR/ CD3 complex or the costimulatory molecule CD28 with anti-CD3 mAb or anti-CD28 mAb in the presence of PMA. All of these stimuli induced MICA expression, as assessed by Western blot, RT-PCR and flow cytometry, reaching a maximum at 4 to 7 days after stimulation, depending on the stimulus. Using pharmacological inhibitors we next investigated the signal transduction pathways involved in MICA induction triggered by TCR/CD3 crosslinking or costimulation through CD28 in the presence of PMA. We found that several signaling pathways like Lck/ Fyn, ERK1/2, p38 MAPK, calcineurin, Jak and p70 56 are involved in MICA induction: By pharmacological inhibition of NF-kB, we found that MICA expression was dependent on NF-kB, most probably through a kB binding sequence located in the first intron of the MICA gene. By EMSA and supershift assays we found that this sequence bound RelA/p50 and p50/p50 NF-kB dimers present in nuclear extracts of activated T cells. Pharmacological blockade of NF-kB also inhibited MICA expression in HeLa cells and overexpression of RelA in these cells increased MICA expression, suggesting that NF-kB regulates MICA expression. Mitogenic cytokines, like IL-2 and IL-4, were able to induce MICA expression in T cells. This molecule was also induced in Th1 or Th2 polarized cells. We observed that PMA/ lonomycin stimulation induced surface MICA expression on purified CD4+ T cells, but not on CD4+ T cells present in PBMCs, more likely due to a soluble factor secreted by activated PBMCs. PMA/lonomycin activated CD4+ T cells became targets of cytotoxicity by syngeneic IL-2 activated NK cells (LAK), but not of resting NK cells. Blocking MICA-NKG2D interaction with an anti-MICA mAb, developed in our laboratory, showed that MICA plays a marginal role in this cell death. CONCLUSIONS: MICA is induced in T cells by physiological stimuli through the activation of Lck/Fyn, ERK1/2, p38 MAPK, calcineurin, Jak and p70 56 signal transduction pathways, as well as the transcription factor NF-kB. MICA expression on the surface of CD4+ T cells play a marginal role as target of cytotoxicity by activated NK cells. In this Thesis some of the signal transduction pathways and a transcription factor involved in MICA expression are described for the first time. Also, the results suggest that MICA NKG2D interaction may be a novel mechanism of regulation of the adaptive immune response.

Rutitzky, Laura I.. "Mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis murina" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Abstract:
Schistosomiasis continues to be one of the most prevalent parasitie infections in the world. In schistosomiasis mansoni, helminth parasite eggs preeipitate an intrahepatic granulomatous and fibrosing inflammatory process, which is mediated by, and dependent on, MHC class lI-restricted CD4+T helper lymphoeytes specific for schistosome egg antigens (SEA). In the mouse model of the disease, CBA mice develop high pathology characterized by large granulomas and strong eggantigen- speeifie T cell responses whereas C57BL/6 (BL/6) mice develop low pathology with significantly smaller granulomas and a more attenuated T cell response to the SEA. While in the acute phase of the disease both strains develop a Thl type cytokine response, during the chronic phase CBA mice exhibit a Thl/Th2 type response whereas BL/6 mice bias their cytokine response to a Th2 phenotype. The following experiments were undertaken to further investigate how the prevailing cytokine environment, CD4+ T cell apoptosis and T cell costimulatory pathways influence the development of the egg-induced immunopathology in the experimental murine schistosome infection and the outcome of the disease: l. An artificial model of high pathology by immunization of BL/6 mice with SEA in complete Freund’s adjuvant (CFA) was used to study the role of Thl vs. Th2 cytokine responses in the development of egg-induced immunopathology. The results showed that the immunization with SEA/CFA induced a Thl shift in the cytokine production by a numerically stable population of SEA-specifie CD4+ T cells that correlated with a severe exacerbation of the immunopathology and death of these otherwise low pathology mice. 2. The role of CD4+T cell apoptosis in the egg-induced immunopathology, and the possible underlying mechanisms that account for this type of cell death, were studied by comparing several immune parameters related to CD4+ T cells between the two polar strains of mice, CBA and BL/6. The results demonstrated that CD4+ T cell apoptosis of granuloma and mesenteric lymph node cells was higher in the low pathology BL/6 strain than in the high pathology CBA strain as a result of IL-2 deprivation. The in vivo treatment of BL/6 mice with recombinant IL-2 resulted in increased hepatic pathology and decreased CD4+ T cell apoptosis. 3. Finally, the role of the ICOS-B7RP-l (inducible costimulatory molecule-B7-related protein-l) costimulatory pathway on the development of egg-induced immunopathology was examined by treating infected BL/6 mice with a blocking mAb against ICOS. The results showed that the ICOS-B7RP-l costimulatory pathway serves primarily to control IFN-γ production by SEA-specific T lymphocytes, thereby promoting a Th2 cytokine environment conducive to limited hepatic damage in the low pathology BL/6 strain. These findings contribute to our knowledge on the mechanisms that regulate the immune response in murine schistosomiasis. They provide new insights on how CD4+ T lymphoeytes regulate immunopathology; confirm that the establishment of a Th2 cytokine environment correlates with host protection in this helminth infection and demonstrate that apoptosis represents a significant means of controlling the CD4+ T cells that mediate the immunopathology. The results presented in this thesis may serve to devise and implement strategies for amelioration of the immunopathology in this disease.

Fuertes, Mercedes Beatriz. "Rol del sistema Mica-NKG2D en la inmunovigilancia y en el escape tumoral" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La mayoría de los tumores crece en huéspedes inmunocompetentes a pesar de que expresan ligandos de NKG2D (NKG2DLs) como MICA (MHC class I-chain related gene A) y MICB. Sin embargo, su participación en el escape tumoral no ha sido totalmente dilucidada. En esta Tesis demostramos que numerosos melanomas humanos (líneas celulares y metástasis aisladas de pacientes) no expresan MICA en la superficie pero poseen depósitos intracelulares de este NKG2DL. Observamos correlación entre la citotoxicidad mediada por células NK y la relación entre NKG2DLs y moléculas de clase I del HLA, pero no con los niveles de MICA en superficie celular. La sobre-expresión de MICA por transfección restauró la expresión en superficie y resultó en un aumento en la citotoxicidad y la secreción de IFN-? por células NK. Los melanomas que sobre-expresan MICA exhibieron un crecimiento retardado respecto de los controles en ratones atímicos (nude) debido a la inducción de apoptosis mediada por células NK in vivo. MICA fue retenida en el retículo endoplasmático (RE) aparentemente debido a la acumulación de formas inmaduras de MICA (sensibles a endoH), transporte retrógrado al citoplasma y degradación en el proteosoma. Por lo tanto la retención intracelular de MICA por acumulación de formas inmaduras del polipéptido en el RE constituye un novedoso mecanismo de escape tumoral que confiere privilegio inmunológico previniendo los mecanismos efectores anti-tumorales de las células NK. Sin embargo, este fenotipo puede ser revertido mediante estrategias de transfección que induzcan un aumento en la expresión de MICA. Estos resultados tienen importancia potencial para el desarrollo de estrategias de inmunoterapia en seres humanos empleando a MICA como blanco molecular.

Abstract:
Most tumors grow in immunocompetent hosts despite expressing NKG2D ligands (NKG2DLs) such as the MHC class I-chain related genes A and B (MICA and B). However, their participation in tumor cell evasion is still not completely understood. Here we demonstrate that several human melanomas (cell lines and freshly isolated metastases) do not express MICA on the cell surface but have intracellular deposits of this NKG2DL. Susceptibility to NK cell-mediated cytotoxicity correlated with the ratio of NKG2DLs to HLA class I molecules but not with the amounts of MICA on their cell surface. Transfection-mediated overexpression of MICA restored cell surface expression and resulted in an increased in vitro cytotoxicity and IFN-ã secretion by human NK cells. In xenografted nude mice, these melanomas exhibited a delayed growth and extensive in vivo apoptosis. Retardation of tumor growth was due to NK cell-mediated effector functions against MICA-transfected tumors because this effect was not observed in NK cell-depleted mice. Also, mouse NK cells killed MICA-overexpressing melanomas in vitro. MICA was retained in the endoplasmic reticulum which appeared to be due to an accumulation of endoH-sensitive (immature) forms of MICA, retrograde transport to the cytoplasm and degradation by the proteasome. Hence, our study identified a novel strategy developed by melanoma cells to evade NK-cell mediated immune surveillance based on the intracellular sequestration of immature forms of MICA in the endoplasmic reticulum and demonstrates that this tumor immune escape strategy can be overcome by gene therapy approaches aimed at over-expressing MICA on tumor cells

Zwerdling, Astrid. "Rol de las lipoproteínas de Brucella Abortus en el desarrollo de la respuesta inflamatoria en brucelosis" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La inflamación es un rasgo característico de la brucelosis humana, presente virtualmente en todos los órganos afectados por la misma. Esta particularidad, junto con la detección de bacterias en los tejidos inflamados, sugiere que Brucella estimula una robusta respuesta inflamatoria en los sitios en que se localiza. Sin embargo, los mecanismos por los cuales estas bacterias desencadenan esta respuesta son hasta el momento desconocidos. A pesar del poderoso potencial inmunomodulador de las lipoproteínas bacterianas, se les ha prestado hasta el momento poca atención en la brucelosis. En esta tesis investigamos la función de las lipoproteínas en el desarrollo de la respuesta inflamatoria asociada a esta enfermedad, poniendo énfasis en la interacción de Brucella con distintos tipos celulares fundamentales en el desarrollo de la respuesta innata. Nuestros resultados demuestran que B. abortus es capaz de inducir la respuesta inflamatoria por medio de la activación y producción de citoquinas en monocitos/macrófagos, células dendríticas y neutrófilos. En relación al componente de Brucella responsable de inducir esta respuesta, nuestras observaciones experimentales indican que las lipoproteínas de Brucella estarían implicadas en el desarrollo de la respuesta inflamatoria en brucelosis.

Abstract:
Regardless of the diversity of signs and symptoms of human brucellosis, inflammation is a hallmark of brucellosis, present in virtually all the organs affected by this disease. This trait, together with the detection of the bacterium in the inflamed tissues, suggests that Brucella stimulates a robust inflammatory response at sites of localization. Yet, the mechanisms by which these bacteria induce the inflammatory response are unknown. Despite the inherent immunomodulatory potential of bacterial lipoproteins, they have not received much consideration in brucellosis. In this thesis we investigated for the first time the role of lipoproteins in the development of the inflammatory response associated with this disease. Focusing on the interactions of Brucella with different cell types key in the development of the innate immune response, we have demonstrated that B. abortus is capable of inducing an inflammatory profile through the activation of, and cytokine production by monocytes/macrophages, dendritic cells and neutrophils. Regarding to the bacterial constituent responsible of inducing this response, our experimental observations suggest that through the induction of phonotypical and functional changes associated with the activation of the different cell types studied, lipoproteins might be implicated in the development of the inflammatory response in brucellosis.

Girart, María Victoria. "Regulación de la actividad biológica de las células NK por receptores de tipo toll y por células dendríticas. Implicancias en la inmunidad contra tumores." (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células NK son células linfoides importantes en la defensa del huésped contra patógenos intracelulares y en la inmunovigilancia contra tumores. Ejercen su actividad biológica a través de la elaboración de citoquinas y el desarrollo de actividad citotóxica, funciones reguladas por familias de receptores activadores e inhibidores. Las células NK humanas expresan receptores de tipo Toll (TLRs) tales como TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9, entre otros. Sin embargo poco se conoce acerca del impacto de los agonistas de los TLRs en la funcionalidad de las células NK, en particular sobre sus funciones antitumorales. En años recientes, se ha demostrado que durante las etapas tempranas de activación de la respuesta inmune, existe una importante interacción entre las células NK y las células dendríticas (CDs), lo que perfila el desarrollo de una respuesta inmune efectiva. CDs maduras (CDm) a diferencia de CDs inmaduras (CDi) promueven, ente otras cosas, la activación y secreción de IFN-γ por células NK. Sin embargo, desconocemos el efecto de las CDs tolerogénicas (como las que se generan en el ambiente tumoral) sobre las células NK. En este trabajo, utilizamos agonistas de TLR3, TL7 y TLR9 (poliI:C, loxorribina y ODNs, respectivamente) con el objeto de estimular células NK en ausencia o en presencia de dosis subóptimas de IL-12, IL-15 o IFN-α, e investigamos la secreción de IFN-γ, citotoxicidad y expresión del receptor activador NKG2D. PoliI:C y loxorribina, en combinación con IL-12 pero no con IL-15, promovieron una intensa secreción de IFN-γ, la cual requirió de la internalización de los agonistas de los TLRs y fue dependiente de las vías de señalización de MEK1/ERK, p38 MAPK, p70S6 quinasa y NF-κB pero no de calcineurina. El IFN-α indujo un efecto similar siendo menor los niveles de IFN-γ secretado por las células NK. Sin embargo, la citotoxicidad (ensayos estándares de liberación de 51Cr) contra células blanco tumorales MICA- y MICA+ no fue regulada por los agonistas así como tampoco se observaron variaciones en los niveles de expresión de NKG2D. Interesantemente, la secreción de IFN-γ aumento significativamente luego de la estimulación con poliI:C o loxorribina e IL-12, cuando se realizaron co-cultivos con células tumorales MICA+ pero no cuando los co-cultivos se realizaron con células tumorales MICA-, efecto que fue dependiente de PI3K. Por otra parte, CDt no promovieron la secreción de IFN-γ por células NK tal como lo hicieron las CDs maduras. Este hecho reviste especial importancia ya que podría ocurrir que las CDt ejercieran efectos inhibitorios sobre las capacidades anti-tumorales desarrolladas por las células NK en el microambiente durante el curso de la respuesta inmune anti-tumoral natural o en respuesta a diferentes estrategias de inmunoterapia tales como la administración de agonistas de TLRs.

Abstract:
NK cells are lymphoid cells that play a key role during the immune response against intracellular pathogens and in the immunesurveillance against tumors. These cells exert their biologic activity through the secretion of cytokines and the display of cytotoxic activity against susceptible target cells. These functions are regulated by families of activating and inhibitory receptors. Human NK cells also express different Toll-like receptors (TLRs) such as TLR3, TLR7, TLR8 and TLR9, among others. However, little is known about the impact of agonists of these TLRs on NK cell functionality, in particular on their antitumor activity. In recent years, it has been shown that there exist an important interaction between the NK cells and dendritic cells (DCs) during the early activation of the immune response, which gives rise to the development of an effective immune response. Mature DCs (mDCs), in opposition to immature DCs (iDCs) promote, among others, the activation and IFN-γ secretion by NK cells. However, the effect of tolerogenic DCs (tDCs) (such as the generated in a tumor environment) on NK cells remains unknown. In this work, we used specific agonists of TLR3, TLR7 and TLR9 (polyI:C, loxoribine and ODNs, respectively) to stimulate human NK cells in the absence or in the presence of suboptimal doses of IL-12, IL-15 or IFN-α, and investigated the secretion of IFN-γ, cytotoxicity and expression of the activating receptor NKG2D. PolyI:C and loxoribine, in conjunction with IL-12 but not IL-15, promoted a robust secretion of IFN-γ, which required internalization of the TLR agonists and was dependent on MEK1/ERK, p38 MAPK, p70S6 kinase and NF-κB but not on calcineurin. IFN-α induced a similar effect but promoted lesser IFN-γ secretion. However, cytotoxicity (51Cr release assays) against MICA- and MICA+ tumor targets remained unchanged as well as the expression of the NKG2D receptor. Excitingly, IFN-γ secretion was significantly increased when NK cells were stimulated with polyI:C or loxoribine and IL-12, and NKG2D engagement was induced by coculture with MICA+ tumor cells but not with MICA- tumor cells, an effect that was dependent on PI3K. We also observed that tDCs were unable to promote IFN-γ secretion by NK cells. Conversely, mDCs were strong stimulators of IFN-γ secretion by NK cells. This fact is of critical relevance as it is likely that tDCs may exert their inhibitory effect on the anti-tumoral capabilities developed by the NK cells in the tumor microenvironment during the course of the natural anti-tumor immune response or in response to different immunotherapy strategies such as the administration of agonists of different TLRs.

Poncini, Carolina Verónica. "Funcionalidad de las células dendríticas en la infección por Trypanosoma cruzi" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Una de las características más relevantes de la infección por Trypanosoma cruzi es la presencia de desordenes inmunológicos. Previamente, nuestro grupo demostró que la infección aguda con la cepa virulenta RA regula negativamente la expresión de moléculas del CMHII en células presentadoras de antígeno (CPA) y altera la capacidad de células dendríticas (CD) esplénicas de estimular células T. Dado que las CD poseen un rol central en el inicio y desarrollo de la respuesta inmune, en el siguiente trabajo de tesis analizamos la capacidad del estadio de tripomastigote (Tp) de modular el estado de diferenciación y funcionalidad de CD derivadas de médula ósea in vitro. En dicho modelo, observamos que específicamente el estadio de Tp de T. cruzi fracasa a la hora de inducir activación de CD. Estas preservan la expresión basal de moléculas del CMHII y coestimulatorias, así como su capacidad endocítica. Asimismo, los Tp inducen secreción de TGF- β e incrementan la producción de interleuquina (IL)-10, observándose un aumento de la relación IL-10/IL-12p70 durante el tratamiento conjunto con LPS. Además, los Tp modulan la activación de CD inducida por LPS, regulando negativamente la expresión del CMHII y su capacidad de estimular linfoproliferación. La neutralización de IL-10 durante la diferenciación de las CD in vitro en presencia de Tp+LPS, revierte parcialmente la incapacidad de las CD de inducir alorespuesta durante una reacción linfocitaria mixta (RLM). Contrariamente, la neutralización simultánea de IL-10 y TGF-β durante la RLM no modifica la falta de alorespuesta observada. Ambas citoquinas, TGF-β e IL-10 son inmunomoduladoras y se encuentran asociadas a la inducción de tolerancia. Por lo tanto, estos resultados demuestran por primera vez que los Tp modulan la diferenciación de CD en presencia de LPS in vitro. Dichas CD presentan propiedades tolerogénicas (CDreg). Asimismo, Tp muertos por calor (Tpmc), pero no fijados con paraformaldehído o productos de excreción secreción parasitaria inducen CDreg. Las CD son responsables de modular la respuesta de células T, inclusive mediante la diferenciación de células T regulatorias (Tregs). Aquí se describe que tanto los Tp vivos como Tpmc alteran la capacidad de CD activadas con LPS de estimular linfocitos. En el cultivo de células T con CDreg se detectó producción de IL-10 y bajos niveles de IFN-γ. Asimismo, las CDreg alteran la respuesta ag-específica in vitro (OVA), utilizando células T CD4+ purificadas de ratones OT-II. Las células T CD4+ diferenciadas en presencia de CDreg (inducidas por Tp o Tpmc), muestran una menor expresión del marcador de activación temprana CD69 en comparación con las estimuladas con CD activadas con LPS. Además, estos CD4+ suprimen la alorespuesta en el marco de una RLM secundaria. Pese a no detectar diferencias respecto al número de Tregs CD4+CD25+FoxP3+, los resultados descriptos sugieren que las CD con propiedades tolerogénicas inducidas por T. cruzi, in vitro diferencian células T CD4+ potencialmente supresoras. La activación de la respuesta inmune depende del reconocimiento de señales de daño. El reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) por CD, juega un importante papel en el desarrollo de inmunidad. Numerosas moléculas de T. cruzi, capaces de activar CPA, han sido descriptas como ligandos de TLR2. Sin embargo, el modelo en CD se encuentra pobremente caracterizado. Las CDreg son inducidas por Tpmc, independientemente de infección. El fenotipo regulatorio se caracteriza por un estado particular de activación de CD: aumento en la activación de ERK 1/2 inducida por LPS y fosforilación de STAT3. Asimismo, los Tp no alteran la activación de p38, degradación de IκB-α o translocación a núcleo de NF-κB inducida por LPS. La vía de ERK es central en la inducción del fenotipo tolerogénico ya que su bloqueo regula negativamente la producción de IL-10 y restaura la capacidad de estimulación de las CD. La activación de NF-kB pero no la fosforilación de STAT3 está involucrada en la modulación de IL-10 por Tp. Un trabajo reciente demuestra que la señalización conjunta vía TLR2 y TLR4 induce sinergismo en la liberación de citoquinas anti-inflamatorias en CD murinas. El estímulo de TLR2 y TLR4 utilizando Pam3Cys o LPS y Tpmc en CD de ratones TLR2KO o mutantes para el TLR4, demuestra que los altos niveles de IL-10 son independientes del reconocimiento del parásito por TLR2 pero asociados a la señalización vía TLR4. En conclusión, estos resultados sugieren la importancia de la vía de ERK, la señalización por TLR4 y activación de NF-kB en la modulación de IL-10 inducida por T. cruzi y sugiere la existencia de interacciones parásito-CD aún no descriptas. La modulación de la diferenciación de CD por T. cruzi, puede explicarse como una estrategia de evasión desplegada por el parásito sobre una célula con potencial de desarrollar inmunidad con subsecuente control y erradicación de la infección. Sin embargo, muchos de los mecanismos inmunomoduladores que explican la persistencia parasitaria, favorecen el control de una respuesta proinflamatoria exacerbada, contrarrestándose el daño tisular concomitante. Futuros estudios permitirán descifrar el papel e impacto de los mecanismos inmunomoduladores en el balance entre tolerancia e inmunidad durante la infección experimental.

Abstract:
A main feature of acute infection with Trypanosoma cruzi is the presence of immunological disorders. Previously, our group demonstrated that acute infection with the virulent RA strain downregulates the expression of MHCII on antigen presenting cells (APC) and impairs the T-cell stimulatory capacity of splenic dendritic cells (DC). Since DC have a main role in the initiation and subsequent development of immune responses, here we assess the ability of trypomastigotes (Tp) to modulate the differentiation stage and functionality of bone marrow-derived DC in vitro. In this model, we observe that specifically Tp stage of T. cruzi fails to activate DC, which preserved low expression of MHCII and costimulatory molecules as well as endocytic activity. We also describe that Tp induce TGF-β secretion by DC, and enhance the gap between interleukin (IL)-10 and IL-12 p70 production, showing a higher IL-10/IL-12p70 ratio upon LPS-treatment. In addition, we observe that Tp modulate full activation induced by LPS, thereby downregulating their MHCII surface expression and inhibiting DC capacity to stimulate lymphocyte proliferation. In vitro IL-10 neutralization during DC-differentiation process with Tp+LPS, partially reverts poor aloresponse during mixed lymphocyte reaction (MLR). In contrast, simultaneous neutralization of both IL-10 and/or TGF-β during MLR does not restore linfoproliferation. Since both TGF-β and IL-10 are immunosuppressive cytokines related to the immunoregulation and tolerance induction, our results suggest for the first time that Tp modulate LPS-treated DC differentiation in vitro. DC described, display tolerogenic properties (DCreg). In addition, Tp heat-killed (Tphk), but not fixed with paraformaldehyde or parasite excretion-secretion products induce the DC-differentiation profile described for live-Tp. DC modulate T cells responses also by inducing differentiation of regulatory T cells. In the present work we describe that live or heat-killed Tp affect T-cell stimulatory capacity of LPS-treated DC. T cells cultured with DCreg show impaired aloresponse, produce IL-10 and low levels of IFN-γ. DCreg are unable to induce ag-specific responses to OVA using CD4+ T cells from OT-II mice in vitro. Alogenic CD4+ T cells primed with DCreg (induced by live or Tphk) show reduce expression of the early-activation marker CD69 compared with the ones cultured with activated DC (LPS). In addition, CD4+ T cells primed with DCreg suppress aloresponse in the context of a secondary MLR. Eventhough, we fail to find CD4+CD25+FoxP3+ Tregs, these results suggest DC with tolerogenic properties induced by T. cruzi prime potentially regulatory CD4+ T cells. Activation of immune responses depends on recognition of danger signal. Recognition of pathogens associated molecular pattern (PAMPs) by DC plays a key role in the first steps related to development of immunity. Several T. cruzi molecules that stimulate APC were described as Toll-like receptor 2 (TLR2) ligands. However, DC models are poorly characterized. Here, we show that DCreg are induced by Tphk stimulation, ruling out infection as a key mechanism involved in Tp-DC modulation. Regulatory phenotype is characterized by a particular DC activation state, with increased LPS-induced activation of extracellular regulated kinase (ERK) 1/2 and phosphorylation of signal transducer and activator of transcription (STAT) 3. We also observe that Tp does not affect p38 activation, IκB-α degradation or NF-κB translocation to the nucleus induced by LPS. ERK has a central role in DC differentiation since its blockade down-regulates IL-10 production and restores DC stimulatory capacity. NF-kB activation but not STAT3 phosphorylation is associated to IL-10 modulation by Tp. A recent work shows that signaling via TLR4 and TLR2 induces a synergism in anti-inflammatory cytokine production in murine DC. Upon TLR2 and TLR4 stimulation using Pam3Cys or LPS and Tphk in DC from TLR2 knock out (KO) or TLR4-mutant mice, we show that high levels of IL-10 are independent of TLR2 but associated to TLR4 signallization. In conclusion, all these findings demonstrate a key role of ERK and TLR4 in association to NF-kB in IL-10 modulation induced by T. cruzi and suggest that this regulatory effect involves parasite-DC interactions not described yet. Modulation of DC differentiation program by T. cruzi might be an evasion mechanism displayed by the parasite with immunosuppressive effects and consequences in the eradication of the parasite. However, immunoregulatory mechanisms in general associated with parasite persistence, may also control pro- inflammatory responses and counteract host tissue damage. Future goals will undercover the role and impact of immunomodulation in the balance between tolerance and immunity during the experimental infection in vivo

Sander, Valeria Analía. "Rol de la hiperandrogenización en la presentación antigénica y su consecuencia en la funcionalidad lútea y activación de linfocitos T. Acción de la metformina como tratamiento. Mecanismos moleculares involucrados" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Síndrome del Ovario Poliquístico (SOP) es la endocrinopatía más frecuente en las mujeres en edad reproductiva y constituye la causa más común de esterilidad femenina. Su característica principal es el hiperandrogenismo, una condición que ha sido asociada a la insuficiencia lútea y a un incrementado riesgo de pérdida de la preñez temprana. A pesar de la relevancia del cuerpo lúteo (CL) en la reproducción, prácticamente no existen investigaciones abocadas al estudio de esta glándula en SOP. Por ello, en este trabajo evaluamos los mecanismos por los cuales el exceso de andrógenos modula la funcionalidad e involución del CL, en un modelo murino de androgenización con dehidroepiandrosterona (DHEA). También determinamos la capacidad de metformina de revertir dichas alteraciones. Durante la etapa funcional del CL, el hiperandrogenismo indujo la disminución de la progesterona sérica mediante la modulación de las enzimas esteroidogénicas. Por el contrario, la administración de DHEA durante la regresión funcional provocó el “rescate” del CL, incrementando los niveles de progesterona mediante la regulación de su biosíntesis y degradación, su acción anti-oxidante y la modulación de las prostaglandinas. El hiperandrogenismo durante la regresión estructural incrementó la apoptosis y reguló la expresión de moléculas involucradas en la presentación antigénica en las células del CL. La metformina previno muchos de los efectos del hiperandrogenismo en la luteólisis, pero no evitó la disfuncionalidad lútea en su etapa funcional. Concluimos que el hiperandrogenismo posee un efecto dual sobre el CL, dependiendo del estado de desarrollo lúteo en el cuál actúe, generando estados patológicos y disfuncionales, la mayoría de los cuales pueden ser evitados por la metformina.

Abstract:
Polycystic ovary syndrome (PCOS), the most frequent endocrine disease that affects women of childbearing age, constitutes the major cause of female infertility. The main characteristic of PCOS is hyperandrogenism, a condition that has been associated to luteal insuficience and high rates of early pregnancy loss. In spite of the relevance of corpus luteum (CL) in reproduction, research about the influence of PCOS on luteal function is scarce. Therefore, the aim of the present study was to assess the mechanisms by which hyperandrogenization affects the lifespan of CL in a dehydroepiandrosterone (DHEA)-androgenized murine model. We also investigate the action of metformin in preventing ovarian dysfunctions produced by DHEA. During the functional stage of CL, hyperandrogenism induced a decline in serum progesterone levels, mainly due to the modulation of steroidogenic enzymes. On the contrary, treatment with DHEA during functional regression “rescued” CL from luteolysis, increased progesterone levels by regulating its biosyntheses and degradation, modulating prostaglandins and acting as an anti-oxidant agent. Hyperandrogenization during structural regression increased apoptosis and regulated molecules envolved in antigen presentation. Metformin prevented most of the effects of hyperandrogenization at both stages of luteal regression, but did not prevent luteal dysfunction at functional stage. Therefore, we conclude that hyperandrogenism has a dual effect on CL, depending on the stage of its development, leading to pathological and dysfunctional conditions, most of which metformin is able to restore.

Laborde, Evangelina A.. "Caracterización de efectos mediados por complejos inmunes durante la diferenciación de células dedríticas" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La interacción entre los complejos inmunes (CI) y los receptores para el fragmento Fc de las inmunoglobulinas G, induce respuestas inmunes regulatorias y efectoras. En este trabajo, nos propusimos investigar el efecto de los CI precipitantes sobre la diferenciación y las funciones biológicas de las células dendríticas (CD) derivadas de monocitos. Demostramos que el agregado de CI al inicio del cultivo altera la normal diferenciación de las CD. Así, las CD-CI diferenciadas durante 6 días en presencia de CI presentaron una baja expresión de los marcadores CD1a, CD1b, y una alta expresión de los marcadores CD14, MHC II y CD68, en comparación con las CD diferenciadas convencionalmente, sin embargo, no observamos diferencias en la expresión del marcador de células dendríticas CD11c. Estas alteraciones en el fenotipo correlacionaron con alteraciones en la morfología de las CD. Asimismo, evaluamos el efecto de CI solubles y observamos que sólo los CI solubles preparados con ligero exceso de antígeno, ejercieron un efecto sobre la diferenciación de las CD similar al observado con CI precipitantes. Demostramos además, que el efecto de los CI es tiempo y dosis dependiente e irreversible. Mediante el uso de anticuerpos bloqueantes específicos para los distintos FcγRs, determinamos que el efecto de los CI, es ejercido principalmente a través del FcγRI y en menor medida a través del FcγRII. Las CD-CI inmaduras mostraron altos niveles de CD83, CD86 y CD40, y el tratamiento con LPS no indujo un aumento en la expresión de las mismas. Esta alteración en la maduración de las CD se encontró asociada con una menor producción de IL-12 en respuesta al LPS, mientras que la producción de IL-10 no se vio alterada. Las CD-CI mostraron un perfil de producción de quimioquinas alterado, con un incremento en la producción de CXCL8, CCL2 y CCL3. Asimismo, las CD-CI mostraron una capacidad reducida para inducir una respuesta T alogénica y una menor capacidad endocítica. Demostramos que el efecto ejercido por los CI es independiente de IL-10 y prostaglandinas, mientras que la inhibición de la p38 MAP quinasa, abolió dicho efecto. Nuestros resultados demuestran que los CI afectan severamente la diferenciación, maduración y las funciones biológicas de las CD. Por esta razón, creemos que este estudio puede contribuir a un mejor entendimiento de los eventos involucrados en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes y los desórdenes inflamatorios crónicos como el lupus eritematoso sistémico (LES), la granulomatosis de Wegener, la crioglobulinemia esencial y artritis reumatoidea (AR).

Abstract:
The interaction between immune complexes (IC) and the receptors for the Fc portion of IgG triggers regulatory and effector functions in the immune system. In this study, we investigated the effects of precipitating IC on differentiation and biological functions of human monocyte-derived dendritic cells. Herein, we demonstrated that IC added at the beginning of the culture altered the normal differentiation of DC. IC-DC obtained on day 6, had lower levels of CD1a, CD1b and increased expression of CD14, MHC class II, and the macrophage marker CD68, as compared with normally differentiated DC, however we did not observed any differences in the expression of CD11c, a dendritic cell marker. These alterations on DC phenotype were correlated with morphological alterations on IC-DC. In addition, we also evaluated the effects of soluble immune complexes, and we found that only soluble immune complexes prepared with antigen excess, had similar effects on DC differentiation. Additionally, these effects resulted time and dose dependent, and were irreversible. By using specific blocking FcγR antibodies we demonstrated that the effects of IC were exerted mainly through their interaction with FcγRI and to a lesser extend with FcγRII. Immature IC-DC also showed higher levels of CD83, CD86, and CD40 and the expression of these maturation markers was not further regulated by lipopolysacharide (LPS) treatment. The apparent lack of maturation following TLR stimulation was associated with a decreased production of IL-12, nevertheless, the production of IL-10 was normal. DC-CI showed an altered profile of chemokine production with an increased secretion of CXCL8, CCL2 and CCL3. Furthermore, IC-DC showed a reduced ability to induce allogeneic T cell proliferation, and a lower capacity to uptake dextran-FITC particles. We have found that neither IL-10 nor prostaglandins were involved in immune complexes-mediated inhibition of DC differentiation; however, these effects were abrogated by p38 MAPK inhibition. Take into account our findings reveal that IC strongly affects DC differentiation, maturation and biological functions of DC. Therefore, this study contributes to a better understanding of events involved in the pathogenesis of autoimmune diseases and chronic inflammatory disorders such as Systemic lupus erythematosus (SLE), Rheumatoid arthritis (RA) samples, Wegener's granulomatosis and essential cryoglobulinemia.

Landoni, Verónica Inés. "Relevancia de mecanismos inflamatorios en el daño celular inducido por toxina Shiga, agente causal del sindrome urémico hemolítico (SUH)" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El síndrome urémico hemolítico (SUH) se caracteriza por anemia hemolítica, trombocitopenia y disfunción renal. La forma típica de SUH se asocia a infecciones por bacterias Gram negativas enterohemorrágicas del género Shigella y Escherichia productoras de toxina shiga (Stx). La disfunción endotelial inducida por la Stx es central, pero lipopolisacáridos bacterianos (LPS) y neutrófilos (PMN) contribuyen con la patofisiología. La falla renal es característica del SUH, aunque en casos severos, ocurren complicaciones neurológicas usualmente asociadas a casos fatales. Es clara la alteración de la barrera hemato-encefálica (BHE) asociado al daño de las células endoteliales (CEs) que la componen. Los astrocitos (ASTs) son células inflamatorias del cerebro y determinan el funcionamiento de la BHE. Los ASTs están en contacto con CEs, por lo que el estudio de los efectos de Stx y LPS sobre los ASTs, así como la influencia de esta respuesta sobre las ECs es fundamental. Stx1 y LPS indujeron la activación de ASTs y la liberación de TNF-α, óxido nítrico y quimioquinas atractantes de PMN. Factores liberados por ASTs estimulados con LPS y Stx1 disminuyeron la permeabilidad endotelial e indujeron la activación de CEs favoreciendo la adhesión de plaquetas y PMN. Los efectos evaluados fueron dependientes del TNF-α astrocitario. La respuesta de ASTs frente a Stx1 y LPS podría contribuir con la disfunción de la BHE y el desarrollo de la neuropatología observada en SUH.

Abstract:
The hemolytic uremic syndrome (HUS) is characterized by hemolytic anemia, thrombocytopenia and renal dysfunction. The typical form of HUS is generally associated with infections by Gram-negative Shiga toxin (Stx)- producing Escherichia coli organisms. Endothelial dysfunction induced by Stx is central, but bacterial lipopolysaccharide (LPS) and neutrophils (PMN) contribute to the pathophysiology. The renal failure is characteristic, although in severe cases, neurological complications occur and is usually associated with death. Impaired blood-brain barrier (BBB) is associated with damage to cerebral endothelial cells (ECs) that comprise the BBB. Astrocytes (ASTs) are inflammatory cells in the brain and determine BBB function. ASTs are in contact with ECs, hence the study of the effects of Stx1 and LPS on ASTs, and the influence of this response on ECs is essential. Stx1 and LPS induced activation of ASTs and the release of TNF-a, nitric oxide and PMN attractant chemokines. Factors released by Stx1 and LPS stimulated-ASTs decreased endothelial permeability. Furthermore, these factors induced ECs activation promoting platelet and PMN adhesion. Evaluated effects were dependent on ASTs secreted-TNF-α. Stx1 and LPS induced ASTs response could contribute to BBB dysfunction and to the development of the neuropathology observed in HUS.

Guerrieri, Diego. "Efecto inmunomodulador del inhibidor secretorio de proteasas leucocitarias (SLPI)" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El SLPI es un inhibidor de serino proteasas de 11,7 kDa presente en mucosas y con actividad anti-inflamatoria. El objetivo de este trabajo fue esclarecer la función del SLPI en la respuesta inmune. Los resultados obtenidos in vitro muestran que SLPI disminuye la proliferación linfocitaria inducida por IL-2, anti-CD3 y cultivos mixtos linfocitarios en forma dosis dependiente. El SLPI inhibe la activación linfocitaria disminuyendo los niveles de CD25 e inhibiendo la traslocación al núcleo de NF-κB. La inhibición sobre la proliferación no se observa en ausencia células mononucleares de sangre periférica (CMSP) depletadas de monocitos, y fue restituida en presencia de medio condicionado de monocitos pre-tratados con SLPI. Los monocitos tratados con SLPI producen altos niveles de IL-4, IL-6 e IL-10. Además, el SLPI inhibe la producción de IFN-γ y T-bet inducidos por IL-2 y un lisado de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Por otro lado el SLPI disminuye la cantidad de células CD25+/Foxp3+ y la secreción de TGF-β inducida por la elastasa y aumenta los niveles de IL-17 e IL-6. Estos resultados sugieren que el SLPI modula la respuesta inmune adaptativa inhibiendo la diferenciación de las células hacia un patrón Th1, las Treg y favoreciendo el perfil Th2 y Th17. Sin embargo, en modelos murinos in vivo, la administración de SLPI parece tener un efecto anti-inflamatorio; dado que el SLPI fue capaz de limitar las lesiones en la orquitis autoinmune experimental. Este efecto modulador de la respuesta inmune también se pudo corroborar en pruebas de hipersensibilidad retardada y en trasplante de piel. Por otro lado, los niveles de SLPI plasmático y la capacidad linfoproliferativa fue examinada en donantes sanos, pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y pacientes con cáncer de pulmón. Se pudo probar la existencia de una correlación negativa entre la proliferación linfocitaria y los niveles plasmáticos de SLPI para pacientes con EPOC y cáncer de pulmón pero no así para los dadores sanos. Estos resultados muestran al SLPI como una molécula con capacidad inmunomoduladora y los niveles de SLPI plasmáticos podrían ser un índice indirecto de la capacidad linfoproliferativa en los pacientes con EPOC y cáncer de pulmón.

Abstract:
Human SLPI is an 11.7 kDa cationic non-glycosylated serine protease inhibitor constitutively produced in mucosal surfaces such as airway epithelium and human uterus, but can also be secreted by inflammatory cells. The aim of this work was to evaluate the function of SLPI in the immune response. Results obtained in vitro shows that SLPI decreased the lymphocyte proliferation induced by IL-2, anti-CD3 and mixed lymphocyte reaction (MLR) in a dose-dependent manner. SLPI inhibits lymphocyte activation by decreasing CD25 expression and avoiding IkB degradation. SLPI inhibition was not observed by depleting monocytes from PBMCs and it was restored by adding monocytes or culture supernatant. Monocytes treated with SLPI, produced IL-4, IL-6 and IL-10 and decreased the expression of IFN-γ. Furthermore SLPI decreased CD25+/Foxp3+ cells and TGF-β production but increased IL-17 expression on lymphocytes. To determine the relevance of this effect in vivo, we investigated the immunoregulatory role of SLPI in an experimental autoimmune orchitis (EAO), delayed-type hypersensitivity models and in a skin transplantation model. SLPI significant decreased the EAO incidence. Even more the delayed-type hypersensitivity was reduced by SLPI and the allograft rejection was decreased. Furthermore, we evaluated a putative correlation between SLPI plasma levels and proliferation in healthy donors (HD; n =15), chronic obstructive pulmonary disease (COPD, n =17) and lung cancer (n = 23) patients. Plasma SLPI concentration was correlated with PBMC proliferation in COPD and lung cancer patients but not in HD. Our results demonstrated that SLPI has an immunomodulator effect on lymphocytes and that plasma SLPI concentration might be used as a marker of lymphocyte proliferation to follow up the immune status.

Solano, María Emilia. "Mecanismos moleculares involucrados en la activación de linfocitos T y su relación con procesos de androgenización incrementada" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El síndrome del ovario poliquístico (SOP) es un desorden endocrino que afecta a mujeres en edad reproductiva, constituyendo una de las primeras causas de infertilidad por anovulación. Asimismo, los andrógenos promueven la acumulación abdominal de la adiposidad que se relaciona a insulino-resistencia e inflamación crónica sistémica. Tanto a nivel ovárico como sistémico existen evidencias de que el sistema inmune contribuiría a la patogénesis del SOP. Por ello en este trabajo se estudiaron alteraciones inmunes, metabólicas y endocrinas en un modelo murino de SOP por androgenización con dehidroepiandrosterona (DHEA). A nivel sistémico, se observó mayor peso corporal, insulino-resistencia y parámetros de inflamación crónica incrementados Los quistes ováricos mostraron una expresión alterada de moléculas de adhesión que coincidió con infiltración leucocitaria, daño tisular, incremento en el estrés oxidativo y disminución de la prostaglandina E2 ovárica. In vitro, DHEA incrementó la expresión de moléculas de adhesión y marcadores de activación en leucocitos pero falló en estimular su proliferación y secreción de citoquinas. Estos resultados muestran que el sistema inmune colabora en los desórdenes ováricos y sistémicos inducidos en este modelo de SOP. DHEA promueve la activación leucocitaria in vitro pero no puede inducir por si misma una respuesta inflamatoria completa, resaltando la importancia del ambiente endócrino y metabólico en las alteraciones inmunes asociadas a SOP in vivo.

Abstract:
Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) is an endocrine disease that affects women in their reproductive age. It is one of the main causes of anovulatory sterility and is associated to abdominal fat distribution, which often leads to insulin resistance and chronic inflammation. Increasing evidence points that immune system could contribute to PCOS symptoms both at systemic and ovarian levels. Therefore, the aim of this study was to study the alterations on immune, metabolic and endocrine features induced by dehydroepiandrosterone (DHEA) administration as a murine model of PCOS. The ovarian cysts showed an altered expression of adhesion molecules, that lead to increased leucocyte infiltration, tissue damage, oxidative stress and reduced levels of prostaglandin E2 in the ovary. Furthermore, the animals showed increased weight gain, insulin resistence and chronic inflammation markers. In vitro assays showed that DHEA per se stimulates the adhesion molecules and activation markers expression but fails to induce proliferation and cytokine production. Therefore, we conclude that immune system is involved both in the ovary and the systemic DHEA-induced alterations. DHEA itself promotes leucocytes activation but fails to elicit a complete inflammatory response, highlighting the role of the endocrine and metabolic environment in PCOS.

Fuxman Bass, Juan Ignacio. "Reconocimiento del ADN bacteriano extracelular por neutrófilos humanos: su impacto en la respuesta a biofilms" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Previamente demostramos que el ADN bacteriano extracelular activa a los neutrófilos a través de un mecanismo diferente al canónico CpG-dependiente. El ADN extracelular es un componente central en la formación y estructura de los biofilms bacterianos, comunidades responsables de más del 60% de las infecciones ocasionadas por estos microorganismos. La presente tesis tuvo como objetivos centrales determinar el impacto del ADN de la matriz de los biofilms en la activación de los neutrófilos humanos y la identificaron del receptor involucrado en el reconocimiento de ADN. Los estudios realizados indicaron que la degradación con DNAsa I del ADN de la matriz extracelular de los biofilms de P. aeruginosa redujo marcadamente su capacidad de inducir la activación de los neutrófilos, determinada en función de su habilidad para producir citoquinas proinflamatorias, incrementar marcadores de activación fisiológicamente relevantes, de mediar la fagocitosis y de liberar trampas extracelulares de los neutrófilos (NET). La aplicación de técnicas de MALDI-TOF nos permitió identificar, en el neutrófilo, 16 proteínas con capacidad de unir ADN bacteriano. A pesar de que ninguna de ellas resultó ser el receptor de la superficie celular para ADN, es posible que dos de las proteínas encontradas constituyan sensores intracelulares de ADN, cuya relevancia queda por ser explorada. Los hallazgos realizados en la presente Tesis confirman la existencia de una proteína de la superficie del neutrófilo capaz de mediar el reconocimiento de ADN y la activación celular por esta molécula. Además, indican que el ADN de la matriz extracelular representa un componente proinflamatorio relevante de los biofilms de P. aeruginosa. Los mismos permiten especular que el reconocimiento del ADN de la matriz de biofilms podría representar un mecanismo seleccionado evolutivamente para permitir al huésped incrementar su capacidad de responder a este tipo de infecciones bacterianas persistentes

Abstract:
We have previously demonstrated that extracellular bacterial DNA activates neutrophils through a non-canonical mechanism. Extracelular DNA is a key component in the formation and composition of bacterial biofilms, that are communities responsible for more than 60% of the infections caused by these microorganisms. The aims of this Thesis were to determine the impact of DNA present in the biofilm matrix in triggering human neutrophil activation and to identify the receptor involved in DNA recognition. We found that extracelluar DNA degradation of P. aeruginosa biofilm matrix with DNase I markedly reduced its ability to induce neutrophil activation, determined by evaluating proinflammatoy cytokines production, the increase of physiologically relevant activation markers, phagocytosis and neutrophil extracelullar traps (NET) release. By application of MALDI-TOF techniques we identified 16 neutrophil proteins that bind bacterial DNA. Although none of them proved to be the DNA surface receptor, it is possible that two of these proteins correspond to intracellular DNA sensors whose relevance remains to be explored. The findings presented in this Thesis confirm the existence of a neutrophil surface protein capable of mediating DNA recognition and cell activation. Additionaly, they indicate that extracellular matrix DNA represents a relevant proinflammatory component of P. aeruginosa biofilms. Thus, it is possible to speculate that recognition of extracellular DNA of the biofilm matrix represents an evolutionary selected mechanism that increases the ability of the host to respond to these types of persistent bacterial infections.

García Samartino, Clara. "Interacciones de Brucella abortus con la inmunidad innata del sistema nervioso central como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La invasión al sistema nervioso central (SNC) por bacterias del genero Brucella resulta en un desorden inflamatorio llamado neurobrucelosis. En este trabajo nosotros presentamos evidencia in vivo e in vitro mostrando que B. abortus y sus lipoproteínas activan la inmunidad innata del SNC, originando una respuesta inflamatoria que lleva a la astrogliosis, una característica típica de neurobrucelosis. Inyecciones intracraneales de B. abortus muerta por calor (HKBA) o de la proteína de la membrana externa 19 (Omp19), una lipoproteína de B. abortus utilizada como modelo, indujeron astrogliosis concomitantemente con un infiltrado neutrofilico en el cuerpo estriado de los ratones. La infección de astrocitos y microglia con B. abortus incitó la secreción de IL-6, IL-1beta, TNF-alfa, MCP-1 y KC (CXCL1). HKBA también estimuló la liberación de estos mediadores inflamatorios, sugiriendo la independencia de la viabilidad bacteriana en este fenómeno e implicando a un componente estructural de la bacteria. De acuerdo con esto, Omp19 indujo el mismo patrón de secreción de citoquinas y quimiocinas. La respuesta inflamatoria desencadenada por Omp19 estuvo mediada por TLR2, ya que cultivos de células gliales provenientes de ratones TLR2 KO no promovieron la secreción de mediadores proinflamatorios. Sin embargo este receptor no media la infección ni la replicación de la bacteria en astrocitos o en microglía. La infección con B. abortus promovio apoptosis de astrocitos pero no de microglia. HKBA y Omp19 indujeron, no solo la apoptosis de los astrocitos sino también su proliferación, dos de las caracteristicas que se observan durante la astrogliosis. La proliferación inducida por HKBA y Omp19 disminuyó en presencia de Ac anti-IL-6. Por otro lado, la apoptosis promovida por los 2 estímulos fue completamente suprimida en células provenientes de ratones deficientes del receptor p55 de TNF-alfa o cuando se agregó a los cultivos el inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK. Por lo tanto, IL-6 contribuye a la proliferación de astrocitos, y la senalización de TNF-alfa vía TNFR1 a través de caspasas determina la apoptosis, cuando son estimulados con B. abortus y sus lipopoproteínas. Los resultados de esta tesis son prueba de principio de que las lipoproteínas de Brucella podrían ser determinantes de patogenia claves en neurobrucelosis, y que la astrogliosis podria contribuir a la patogénesis de la misma.

Abstract:
Central nervous system (CNS) invasion by bacteria of the genus Brucella results in an inflammatory disorder called neurobrucellosis. In this study we present in vivo and in vitro evidence showing that B. abortus and its lipoproteins activate the innate immunity of the CNS, eliciting an inflammatory response that leads to astrogliosis, a characteristic feature of neurobrucellosis. Intracranial injection of heat killed B. abortus (HKBA) or outer membrane protein 19 (Omp19), a B. abortus lipoprotein used as a model, induced astrogliosis with concomitant neutrophil's infiltrate in mouse striatum. Infection of astrocyte and microglia with B. abortus induced the secretion of IL-6, IL-1beta, TNF-alpha, MCP-1 and KC (CXCL1). HKBA also induced these inflammatory mediators, suggesting independency of bacterial viability and involvement of a structural component of the bacterium. Accordingly, Omp19 induced the same cytokine and chemokine secretion pattern. TLR2 mediated the inflammatory response induced by Omp19 since cultures from TLR2 KO mice did not induced the secretion of proinflammatory mediators. However, this receptor is not envolved in the infection or replication of the bacteria inside astrocytes or microglia. B. abortus infection induced astrocyte, but not microglia, apoptosis. HKBA and Omp19 elicited not only astrocyte apoptosis but also proliferation, two features observed during astrogliosis. Proliferation induced by HKBA and Omp19 was diminished in the presence of anti-IL-6 antibody, and apoptosis induced by both stimuli was completely suppressed in cells of TNF-alpha receptor p55-/- mice or when the general caspase inhibitor Z-VAD-FMK was added to cultures. Hence, IL-6 contributes to astrocyte proliferation, and TNF-alpha signaling via TNFR1 through the coupling of caspases determines apoptosis, as elicited by B. abortus and its lipoproteins. Our results provide proof of the principle that Brucella lipoproteins could be key virulence factors in neurobrucellosis, and that astrogliosis might contribute to neurobrucellosis pathogenesis.

Dilernia, Darío A.. "Estudio de la evasión de la respuesta inmune citotóxica por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana Tipo-1 (HIV-1) y su relación con el tratamiento antirretroviral" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Introducción. El HIV es el agente causal del SIDA. Entender las formas en las que evade la respuesta inmune del hospedador es crítico para el desarrollo racional de una vacuna efectiva. Aunque la amplia extensión del tratamiento antirretroviral es capaz de impactar significativamente en los procesos naturales de selección y escape, pocos trabajos han estudiado esta temática. El objetivo de esta tesis fue identificar aquellas regiones virales sometidas a presión de selección inmune y evaluar el impacto del tratamiento antirretroviral en su selección y persistencia. Metodología y resultados. Mediante análisis estadístico se identificaron 12 mutaciones virales asociadas a escape inmune, 6 de ellas en regiones no caracterizadas previamente como epítopes. El análisis de secuencias obtenidas en los últimos 20 años de epidemia sugirió que varias de ellas han incrementado su frecuencia hasta estar presentes en la mayoría de las cepas virales actuales. La evaluación de la respuesta inmune péptido específica mostró reconocimiento principalmente de dos péptidos con restricción para el alelo HLA A02 (A02P65 y A02P84), uno para el alelo HLA A03 (A03P28) y uno para el alelo HLA B07 (B07P357). Para los dos últimos y para A02P65 se demostró que la variante de escape disminuía el reconocimiento por la respuesta inmune mientras que, para todos los casos, se evidenció la capacidad de inducir una respuesta polifuncional secretora tanto de IFN como de IL 2 y MIP 1 . Se evaluó también el nivel de agotamiento inmune y, aunque la técnica de tetrámeros presentó varios inconvenientes, se detectó una mayoría de respuesta no exhausta en los casos exitosos. La secuenciación del gen viral gag mostró la presencia de escape viral en la mayoría de los epítopes analizados y sugirió que la positividad de la respuesta inmunológica estaba asociada a una mayor afinidad del epítope por el alelo HLA que lo presenta. Al mismo tiempo, el análisis de secuencia de dicho gen viral en muestras repetidas de 50 pacientes separadas por un promedio de 3 años, demostró la presencia de recambio activo de variantes virales hacia el estado de escape durante el período de muestreo. Se encontró también que la selección activa resulta menos frecuente en los pacientes bajo tratamiento y el análisis del virus en dichos pacientes sugirió que esto sería debido a una reducción significativa de la capacidad evolutiva del virus en el contexto del tratamiento altamente efectivo. Finalmente, un análisis filogenético más profundo de las secuencias estudiadas permitió datar el inicio de la epidemia del HIV 1 en Argentina en la primera mitad de la década de 1970. Conclusiones. El presente trabajo de tesis permitió caracterizar regiones de la proteína viral Gag de frecuente reconocimiento inmune sobre las cepas del HIV 1 circulantes en nuestra región y caracterizar su dinámica a nivel poblacional a lo largo de veinte años de epidemia. El conjunto de datos obtenido de los ensayos inmunológicos confirma la aproximación estadística para identificar sitios de reconocimiento inmune demostrando respuestas citotóxicas polifuncionales mientras que el estudio de muestras seriadas en pacientes, la mayoría de ellos en estados clínicos avanzados, sugiere que la selección del escape viral se extiende más allá de los primeros momentos de la infección. En este sentido, el inicio del tratamiento puede tener un beneficio adicional al prevenir dicho escape por reducción significativa de la evolución viral.

Abstract:
Introduction. HIV is the etiological agent of AIDS. To understand the way the virus evade the immune response of the host is critical for the rational development of an effective vaccine. Although the expansion of treatment access is able to shape the natural process of selection and escape, few studies have analyzed this phenomenon. The objective of the present thesis was to identify viral genomic regions where the virus undergoes selective immune pressure and to evaluate the impact that the antiretroviral therapy may have in their selection and persistence. Methodology and results. A total of 12 viral mutations associated to immune escape were identified, six of them in regions not previously characterized as epítopes. The analysis of a set of viral sequences obtained from samples collected in the last twenty years suggested that many of them have increased their prevalence in time until become the most prevalent state of circulating viral strains. The evaluation of peptide specific immune response showed that the main targets of immune recognition were located in two HLA A02 restricted epítopes (A02P65 and A02P84), in a HLA A03 restricted one (A03P28) and in a HLA B07 restricted one (B07P357). For the last two and also for A02P65 we found that the escape mutations significantly impair recognition by the immune response. For all of them, the capacity of stimulating a polyfunctional response able to release IFN , IL 2 and MIP 1 was shown. Also, the evaluation of immune exhaustion through tetramer technique showed, in spite of many technical inconveniences, a low level of exhaustion in the majority of successfully analyzed samples. The sequencing of viral gene gag showed the presence of escape in the majority of the epítopes analyzed and suggested that detection of immune response was associated to a greater affinity of the epítope for the HLA allele. At the same time, the analysis of the same region in repeated samples collected from 50 patients within a time period of 3 years showed the presence of active replacement of viral sequences toward the escape state. That active replacement seems to be associated to the lack of antiretroviral therapy and the analysis of the virus quasispecies in under therapy patients suggested that the significant reduction of evolutive capacity of the virus in the context of the effective therapy is likely the reason for that observation. Finally, a deeper phylogenetic analysis of the sequences under study allowed us to locate the initiation of the HIV epidemic in Argentina at the first half of the 1970s decade. Conclusions. The present thesis allowed us to characterize the regions of the viral protein Gag under frequent immune recognition at the population level and to characterize their dynamics in the last twenty years of epidemic. The set of data obtained from the immunologic assays confirms the statistical approach of the identification of sites under immune recognition showing polyfunctional cytotoxic responses while the study of repeated samples from patients that were in their majority in advanced stages of infection show that selection of escape not only occurs in the first stages of infection. In this sense, the initiation of treatment could have an additional benefit in preventing the immune escape by significantly reducing the evolutive capacity of the virus.

Rodríguez, Ana María. "Relevancia de la inmunidad celular subtipo específica en el desarrollo de estrategias de vacunación frente a VIH-1" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Han pasado casi 30 años de la detección de los primeros casos de VIH-1 y aún no se ha conseguido desarrollar una vacuna efectiva y segura. La epidemia de VIH en Argentina está caracterizada por una alta prevalencia de infecciones causadas por virus pertenecientes al subtipo B y formas recombinantes circulantes BF (CRF12_BF). A pesar de la amplia gama de trabajos dedicados a la caracterización de la respuesta inmune y al desarrollo de vacunas frente a VIH, no queda claro cuál es el impacto de la variabilidad en la elección del antígeno. Nef es una de las proteínas virales elegida como antígeno en los ensayos clínicos y pre- clínicos para vacunas. En este trabajo de Tesis, Nef fue usada como una herramienta para evaluar la importancia de las variantes recombinantes BF de VIH en el diseño de futuras vacunas. Vectores de ADN, MVA y VV que expresan NefBF y NefB fueron generados y caracterizados. Luego de la inmunización en ratones Balb/c con una dosis simple de ADN seguida por otra de MVA, se encontró que NefBF generó una respuesta altamente específica sin detectarse reactividad cruzada frente a Nef del subtipo B. Sin embargo, luego de aplicar un esquema de inmunización más extenso (tres dosis de ADN más una dosis de MVA) se indujo una respuesta específica mayor, acompañada con el aumento de la reactividad cruzada frente a B, aunque de menor magnitud que frente al antígeno homólogo NefBF. Por otro lado, al aplicar el vector VVnefBF se obtuvo una respuesta específica cerca de tres veces mayor que con MVA, pero con el mismo grado de reactividad cruzada; mientras que la inmunización con VVnefB generó una respuesta de menor magnitud, pero con mayor grado de reactividad cruzada contra NefBF. La aplicación de IL-12 y GM-CSF desde vectores de ADN (como moléculas adyuvantes) aumentó la respuesta hasta seis veces, al aplicarse por separado, y 14 veces al aplicarse juntas. Este nivel de respuesta permitió caracterizar los epítopes de mayor inmunogenicidad. Estos resultados son de crucial importancia para el desarrollo de una futura vacuna para nuestra región, indicando que antígenos de estas variantes virales BF deberían ser considerados en el diseño de las mismas.

Abstract:
It has been almost 30 years since the detection of the first HIV-1 cases and yet an effective and safe vaccine has not been developed. The HIV epidemic in Argentina is characterized by the high prevalence of infections caused by subtype B and BF variants. Despite the wide range of publications on the immune response against HIV and the vaccine development effort, the impact of variability on vaccine antigen selection is still unclear. Nef is a viral protein that has been selected as antigen in clinical and pre-clinical vaccine trials. In this thesis, Nef protein was used as a tool to study the impact of HIV-1 BF variants on the design of future vaccines. DNA, MVA and VV vectors expressing Nef from the CRF12_BF recombinant form or from subtype B of HIV-1 were generated and characterized. After the administration of single DNAprime/MVAboost immunization schedules in Balb/c mice, it was found that NefBF delivered from these vectors generated a response of high specificity without cross-reactivity against subtype B. But, when a more potent response was induced after 3 priming DNA doses and a booster with MVA recombinant virus, cross-reactivity against NefB was detected, although of lower magnitude than the NefBF specific response. Furthermore, the application of VVnefBF vector generated a nearly three-fold enhanced immune response than the schedule using MVA, but with the same level of low cross-reactivity, whereas immunization with VVnefB generated a slightly lower response, but with a greater cross-reactivity against NefBF. The application of IL-12 or GM-CSF as molecular adjuvants increased the specific response by six-fold, and 14-fold when they were applied together. This level of response allowed the characterization of the most immunogenic epitopes. These results will be pivotal for HIV vaccine design in our region, indicating that antigens from these viral variants should be considered for a future vaccine.

Yokobori, Noemí. "Evaluación de la respuesta inmune frente a cepas locales de Mycobacterium tuberculosis multirresistentes a drogas" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La tuberculosis multirresistente a drogas (MDR-TB) representa un gran desafío sanitario. En el presente trabajo evaluamos en monocitos (Mo) y macrófagos (MΦ), las estrategias de evasión de la respuesta inmune de dos aislados clínicos MDR de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) relacionados genéticamente: la cepa M causante de un extenso brote y la cepa 410 de baja virulencia. Nuestros resultados muestran que: 1) la inducción de citoquinas (CK) y respuesta linfoproliferativa Mtb-específica dependen tanto del status inmunológico del huésped como del genotipo de Mtb, 2) estas diferencias podrían deberse en parte al aumento en el subset de Mo-CD16+ en sangre periférica, 3) la cepa M es pobre inductora de TNF-α tanto en Mo como en MΦ, 4) ambas cepas MDR indujeron una cinética retardada de expresión de IL-1β en Mo, 5) algunos mecanismos de evasión, como la down-regulación del receptor de IFN-γ serían comunes a las cepas estudiadas, 6) la replicación intracelular de la cepa M fue lenta, mientras que 410 se multiplicó rápidamente dentro del MΦ, 7) la infección del MΦ con la cepa 410 induce tempranamente una fuerte secreción de TNF-α e IL-10, 8) la cepa M es capaz de interferir con señales proapoptóticas de la vía intrínseca y probablemente de la vía extrínseca, 9) la cepa 410 indujo predominantemente muerte por necrosis. En base a estos resultados, y a diferencia de lo reportado para otros genotipos virulentos de Mtb, proponemos que el éxito de M se debería a su capacidad de mantenerse en un estado de quiescencia, preservando su nicho y minimizando la respuesta inflamatoria en las etapas tempranas de la infección.

Abstract:
Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is a major challenge to public health. We tested in monocytes (Mo) and macrophages (MΦ), the immune evasion strategies of two MDR clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) genetically related: strain M, responsible for a large outbreak and the low virulence strain 410. Our results show that: 1) induction of cytokines (CK) and Mtb-specific T-cell proliferation are dependent on both the host's immune status and the genotype of Mtb, 2) these differences could be, in part, due to the increase in CD16+Mo-subset in peripheral blood, 3) strain M is poor inducer of TNF-α in both Mo and MΦ, 4) both MDR strains induced a delayed kinetics of IL-1β expression in Mo, 5) some immune evasion mechanisms such as the down-regulation IFN-γ receptor would be common to the strains tested, 6) intracellular replication of strain M was slow, while 410 multiplied rapidly within the MΦ, 7) infection of MΦ with strain 410 induces an early and strong secretion of TNF-α and IL-10, 8) strain M is capable of interfering with proapoptotic signaling of the intrinsic and, probably, also the extrinsic pathways, 9) 410-induced cell death was predominantly by necrosis. Our results suggest that, in contrast with previous reports with other virulent genotypes Mtb, the success of M is due to its ability to stay in a state of quiescence, preserving its niche and minimizing the inflammatory response in the early stages of infection.

Ferrer, María Florencia. "Construcción y evaluación de virus MVA recombinantes que expresan la glicoproteína D del virus BoHV-1" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus vaccinia Ankara modificado (MVA) es un virus altamente atenuado que se utiliza eficientemente como vector viral no replicativo para el desarrollo de nuevas vacunas. En este trabajo de Tesis se desarrolló un nuevo inmunógeno basado en MVA que expresa como antígeno de interés la glicoproteína D (versión secretada, gDs) del virus herpes bovino tipo I (BoHV-1), un agente infeccioso ampliamente distribuido en Argentina. Primeramente, se diseñó y construyó el vector de transferencia para obtener MVA recombinantes utilizando como sitio blanco de inserción el gen no esencial MVA086R. Se obtuvieron virus MVA-gDs recombinantes y se demostró la correcta expresión, antigenicidad y N-glicosilación de la glicoproteína D expresada a partir de dichos virus. Posteriormente, se evaluó la capacidad inmunogénica de los virus MVA-gDs en animales de experimentación (ratones y conejos). En el modelo de ratón, se observó que los virus MVA-gDs desencadenaron una respuesta inmune específica, de tipo humoral, que se mantuvo en niveles similares durante un período de siete meses (luego de la aplicación de dos dosis del inmunógeno). Además, se demostró que la síntesis de novo de la glicoproteína D a partir del vector viral no replicativo MVA-gDs fue la responsable de la respuesta inmune específica. La inoculación de conejos con virus MVA-gDs (por vía intramuscular o subcutánea) desencadenó una respuesta inmune específica de tipo humoral, observándose la máxima respuesta a los 9 días post dosis de refuerzo. En un ensayo de desafío de conejos con el virus BoHV-1, se observó que la inmunización por vía intramuscular de los animales con virus MVA-gDs disminuyó la excreción del virus de desafío. Finalmente, se demostró que la inmunización de ratones por vía intranasal con virus MVA-gDs adicionados con toxina colérica indujo respuestas inmunes humorales específicas de tipo IgA en muestras de lavados nasales y broncopulmonares y de tipo IgG en muestras de suero. De esta forma, se obtuvo, caracterizó y evaluó un nuevo inmunógeno denominado MVA- gDs que, en el futuro, podría ser evaluado como candidato a vacuna contra el virus BoHV-1 en bovinos.

Abstract:
Modified vaccinia virus Ankara (MVA) is a highly attenuated virus. During the past years, non-replicative recombinant MVA vectors have gained major interest in the development of new veterinary vaccines. Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) infection is widely distributed in Argentina and there are no efficacious vaccines to prevent the diseases caused by this virus. In order to develop a candidate vaccine for BoHV-1, the secreted version of glycoprotein D (gDs) was selected as the antigen to be expressed in new recombinant MVA non-replicative based vectors. First, the design and construction of the transference vector necessary to obtain recombinant MVA viruses was achieved using the non-essential gene MVA086R. Recombinant MVA-gDs virus was obtained and molecularly characterized, confirming the correct expression, antigenicity and N-glycosilation of glycoprotein D. Then, immunogenicity of recombinant MVA-gDs viruses was assessed in experimental animals (mice and rabbits). Mice immunized with MVA-gDs viruses developed a specific humoral immune response that was maintained for seven months and was dependent on the booster dose. In addition, mice immunized with MVA-gDs virus demonstrated that MVA-gDs non-replicative viral vector was responsible for the de novo synthesis of glycoprotein D and, consequently, for the immune response induced in animals immunized with not inactivated MVA-gDs virus. Intramuscular and subcutaneous rabbit inoculation with MVA-gDs virus was immunogenic and induced a specific humoral immune response. In a rabbit BoHV-1 challenge assay, diminished viral excretion was observed in those animals intramuscularly immunized with recombinant MVA-gDs. Finally, in order to evaluate MVA-gDs virus as a mucosal vaccine, two doses of MVA-gDs supplemented with cholera toxin were delivered by intranasal immunization of mice. These immunizations induced anti-gD IgA humoral immune responses in nasal and bronchopulmonar lavages as well as anti-gD IgG antibodies in serum samples. In conclusion, the new immunogen designated MVA-gDs was developed, characterized and evaluated in experimental animals. In the future, it could be evaluated in cattle as a candidate bovine vaccine for BoHV-1.

Góngora, Adrián Daniel. "Supresión de la angiogénesis tumoral a través de anticuerpos monoclonales" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La angiogénesis es el mecanismo por el cual se generan nuevos vasos sanguíneos a partir de los pre-existentes. En adultos, la angiogénesis es un evento raro excepto durante la reparación de heridas o en procesos asociados con el ciclo menstrual. Sin embargo, existen desórdenes patológicos dependientes de angiogénesis, como el desarrollo de tumores, la retinopatía diabética, la artritis reumatoidea, entre otras. Este proceso, es modulado en condiciones normales y patológicas por el balance entre factores positivos (pro-angiogénicos) y negativos (anti-angiogénicos), y ha sido propuesto como un factor limitante en el desarrollo tumoral, jugando también un papel importante en la metástasis. Los melanomas son tumores muy agresivos y resistentes a las terapias antineoplásicas que se caracterizan por expresar diversos factores de crecimiento. Estos pueden actuar en forma autocrina e intracrina sobre la proliferación y sobrevida, y en forma paracrina en la angiogénesis. Entre estos factores se destacan el VEGF y el FGF-2. Este trabajo tiene como objetivo principal el desarrollo de anticuerpos monoclonales (AMs), capaces de neutralizar los efectos biológicos del VEGF y del FGF-2 sobre las células endoteliales y evaluarlos terapéuticamente sobre el crecimiento tumoral en ratones atímicos, inducidos por distintas líneas de melanoma humanos. También, se caracterizó la expresión de estos factores en las líneas de melanoma para evaluar si existe una relación entre el efecto terapéutico de dichos AMs y el patrón de expresión de dichos factores en las líneas de melanoma. Concluimos que sólo el bloqueo del VEGF con AMs conduce a una reducción del crecimiento tumoral, mientras que el bloqueo del FGF-2 con AMs no mostró efectos terapéuticos en los modelos ensayados, incluso en las líneas que sobre-expresaban FGF-2, ni la combinación de ambos AMs sinergizó el efecto terapéutico del AM anti-VEGF. Por otro lado, si bien el efecto del bloqueo del VEGF con AMs se observó en todas las líneas neoplásicas ensayadas, evidenciaron una gran diferencia en la respuesta, dependiendo de los niveles de expresión de FGF-2. Las líneas de melanoma que sobreexpresan FGF-2 (A375 y 1205Lu) mostraron una mayor resistencia a esta terapia antiangiogénica, con una reducción del tamaño tumoral del orden del 50% respecto a los controles. Sin embargo, en la línea de melanoma que expresa bajos niveles de FGF-2 (IIB-Mel-J) esta reducción fue cercana al 90%. En conclusión, demostramos que solo el bloqueo del VEGF con AMs es efectivo en el tratamiento de melanomas experimentales y encontramos que este efecto terapéutico es en parte dependiente de los niveles de expresión de FGF-2, que actuaría en forma intracrina, generando una resistencia al tratamiento mencionado. De esta manera, contribuimos a definir al FGF-2 como un posible marcador de resistencia a esta terapia en melanoma. Finalmente, a partir del AM anti-VEGF, desarrollamos un anticuerpo recombinante de cadena simple (scFv-Fc) neutralizante de la actividad biológica del VEGF. Resultados preliminares indican que con solo un bajo porcentaje de células transfectadas con un plásmido que expresa el scFv-Fc anti-VEGF, xenotransplantadas en ratones atímicos, alcanza para disminuir significativamente la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

Abstract:
Angiogenesis is the process by which new blood vessels sprout from pre-existing vasculature. In adults, angiogenesis is a rare event except during the wound healing or menstrual cycle. However there are pathological disorders like tumors, diabetic retinopathy, and rheumatoid arthritis, among others, that depends on angiogenesis. This process is controlled in normal and pathological conditions by a balance between positive (pro-angiogenic), and negative (anti-angiogenic) factors, and it has been proposed as a limiting process in tumor development, and metastasis. Melanoma is an aggressive tumor resistant to antineoplastic therapies and are known to express several growth factors that can act as an autocrine and intracrine way in proliferation and survival and as a paracrine way in angiogenesis. Among other factors, VEGF and FGF- 2, are the more important pro-angiogenic factors. The aim of this work was to develop two monoclonal antibodies (MAs) able to block the biological effects of VEGF and FGF-2 on endothelial cells growth, and to evaluate their therapeutic effect on human melanoma cells growing in athymic mice. Moreover, we have characterized the expression of these factors in three melanoma cell lines, to evaluate the possible relationship between the therapeutic effect of these MAs and the expression of these factors in those cells. We have concluded, that only the MA anti- VEGF induces a reduction on tumor growth, while MAs against FGF-2 showed no antitumor activity on the assayed models, even in cell lines that overexpress this factor, and the combination of both MAs did not show improvements in the MA anti-VEGF therapeutic effect. On the other hand, although the therapeutic effects of VEGF inhibition was observed in all cell lines studied, we have found a great response differences depending on FGF-2 expression levels. Cells that overexpressed FGF-2 (A375 y 1205Lu), showed a greater resistance to this anti-angiogenic therapy with only a 50% on tumor size reduction as compared with the untreated mice. Nevertheless, when the xenotransplanted mice carrying melanoma cell line (IIB-Mel-J), that express lower values of FGF-2, were treated with MA anti-VEGF, the tumor mass reduction was near 90%. In conclusion, we have demonstrated that only the use of MA anti-VEGF is responsible for the decrease of experimental melanoma progression and we found that this therapeutic effect is in part dependent on FGF-2 expression levels, acting as an intracrine factor given rise to anti- VEGF therapy resistance. In this way, we have defined FGF-2 as a possible melanoma resistance molecular marker to this therapy. Finally, from the MA anti-VEGF, we have developed a recombinant single chain version (scFv) that neutralizes VEGF activity. Preliminar results indicated that only few percentage of melanoma cells transfected with a plasmid codifing scFv-Fc anti-VEGF, and xenotransplanted in athymic mice, are enough to reduce both angiogenesis and tumor progression.

Croci Russo, Diego Omar. "Interacción entre lectinas y glicanos en procesos de neovascularización tumoral: implicancias en estrategias de inmunoterapia en cáncer" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Uno de los desafíos de la biología tumoral consiste en la búsqueda de mecanismos que vinculen fenómenos de hipoxia y angiogénesis. En función del papel crítico de galectina- 1 (Gal1) en la progresión tumoral investigamos su relevancia en fenómenos de neovascularización. El análisis funcional del perfil de glicosilación de células endoteliales reveló una amplificación preferencial del repertorio de glicanos críticos para la unión de Gal1 en células endoteliales expuestas a estímulos tolerogénicos, proliferatívos e hipóxicos típicos de microambientes tumorales. De acuerdo a estos hallazgos, observamos que Gal1 interacciona con células endoteliales principalmente en N-glicanos promoviendo proliferación, migración/invasión y tubulogénesis a través de mecanismos dependientes de las vías de señalización de VEGFR2, PI3K-Akt y Erk1/2, mimetizando de este modo el efecto biológico del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Por otro lado, verificamos que Gal1 se encuentra asociada a Nglicanos presentes en VEGFR2 e induce su activación y segregación en estructuras tipo "lattices". En tal sentido, los fenómenos de migración y tubulogénesis inducidos por Gal1 fueron bloqueados al utilizar anticuerpos anti-VEGFR2 o al inhibir la disponibilidad de N-glicanos complejos en células endoteliales. A los fines de evaluar la regulación de la expresión de Gal1 en células tumorales se incubaron células de Sarcoma de Kaposi (KS) en condiciones de hipoxia (1% O2), observándose un incremento marcado en la expresión de esta lectina a través de mecanismos dependientes de la activación del factor de transcripción NF-κB y especies reactivas del oxígeno (ROS) e independientes del factor inducible por hipoxia (HIF)-1α. Dicha expresión fue crítica para el crecimiento y la neovascularización de tumores humanos KS y murinos B16 in vivo. La relevancia fisiopatológica de estos hallazgos fue determinada a través de la inhibición de la expresión de Gal1 utilizando estrategias de silenciamiento (shRNA). El bloqueo de la expresión génica de Gal1 logró inhibir la capacidad pro-angiogénica de tumores KS in vivo e in vitro. El análisis por inmunohistoquímica de diversas patologías vasculares humanas reveló que Gal1 se expresa selectivamente en patologías malignas, confirmando el impacto clínico de nuestros hallazgos. Finalmente, y con el objetivo de validar una estrategia terapéutica basada en el bloqueo de Gal1 en el microambiente tumoral, desarrollamos un panel de anticuerpos monoclonales anti-Gal1 bloqueantes los cuales lograron neutralizar los efectos pro-angiogénicos e inmunosupresores de esta lectina in vitro e in vivo. En forma notable, el bloqueo de Gal1 en tumores B16 logró remodelar la vasculatura tumoral e inducir un marcado incremento en el infiltrado inflamatorio, el cual fue capaz de montar respuestas antitumorales dependientes de células Th1 y Th17. Este efecto fue asociado no sólo al bloqueo de la capacidad inmunosupresora de Gal1 sino también a un efecto ‘normalizador’ sobre el endotelio permitiendo la maduración de pericitos y el influjo de células T al parénquima tumoral. En conjunto, los resultados del presente trabajo de tesis demuestran que Gal1 participaría activamente en la generación de un microambiente tumoral pro-angiogénico e inmunosupresor, en el cual la hipoxia, a través de la expresión de esta lectina y sus glicanos, modularía compartimientos inmunológicos y vasculares, favoreciendo fenómenos de angiogénesis y crecimiento tumoral. De este modo, el presente estudio permite vincular, a partir del reconocimiento de lectinas y sus ligandos específicos fenómenos de hipoxia con programas inmunológicos y de neovascularización. A su vez sugiere nuevos enfoques en el diagnóstico y tratamiento de tumores, dando luz a la primera herramienta terapéutica capaz de modular en forma específica la interacción entre Gal1 y sus glicanos interrumpiendo simultáneamente fenómenos de angiogénesis y escape tumoral.

Abstract:
Novel strategies are needed to circumvent resistance to anti-angiogenic therapies. Here we identify a glycosylation-regulated mechanism, based on arrangements of lectin-glycan lattices, which links tumor hypoxia to VEGFR2-mediated angiogenesis through HIF-1α- and VEGF-independent pathways. Concomitant with selective remodeling of endothelial cell surface glycans, hypoxia promoted ROS/NF-κBdependent up-regulation of tumor-derived galectin-1 (Gal1), which signaled angiogenesis through binding to complex N-glycans on VEGFR2. Targeted disruption of Gal1-glycan lattices, using shRNA strategies, mAb-mediated blockade or interruption of N-glycan elongation, attenuated hypoxia-driven angiogenesis, while promoting pericyte maturation and vascular remodeling, thereby favoring influx and expansion of immune cells and suppression of tumor growth. Thus, hypoxia-regulated interactions between endogenous lectins and complex N-glycans on cognate receptors can create functional signaling clusters that substitute for canonical ligands to modulate endothelial cell biology and preserve angiogenesis. These findings highlight the versatility of endogenous lectins and the dynamics of the ‘glycome’ during cancer progression and provide the first evidence of a multitargeted agent capable of promoting vascular remodeling and overcoming tumor immunosuppression through specific interruption of lectin-glycan lattice formation.

Gil Cardeza, María Lourdes. "Esferoides como modelo predictivo de respuesta tumoral a la terapia génica : Estudio de los efectos de la transferencia génica no viral del sistema gen suicida y del gen de interferón-beta en esferoides derivados de melanoma espontáneo canino" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los esferoides constituyen un modelo experimental que se asemeja más al comportamiento de los tumores in vivo que sus respectivas monocapas. Por lo tanto su estudio e implementación en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para combatir el cáncer es de suma importancia. En el presente estudio demostramos que la respuesta a la transferencia no viral del sistema gen suicida HSVtk/GCV de esferoides formados a partir de líneas celulares derivadas de tumores de melanoma espontáneo canino correlaciona mejor con la respuesta de los pacientes que sus respectivas monocapas. También observamos que la resistencia multicelular (MCR) al sistema HSVtk/GCV presente en los esferoides probablemente se deba a una rápida repoblación de las células resistentes al tratamiento en esta configuración espacial. La gran cantidad de líneas cuyos esferoides resultaron ser sensibles al sistema HSVtk/GCV y/o a la transferencia no viral del gen cIFN-β (80% sobre un total de 15 líneas) y el mantenimiento de la sensibilidad al ser co-transferidos demuestran la gran potencialidad terapéutica de la co-administración de ambos genes. Como alternativa a la electroporación, encontramos una forma menos agresiva de aumentar la penetración intracelular de bleomicina: la lipofección. Encontramos que el sistema lipoplexes/bleomicina es altamente efectivo pues la presencia de los lipoplexes sensibiliza a las células al efecto citotóxico de la bleomicina, posiblemente estimulando el ingreso de la droga a las células mediante un transporte activo.

Abstract:
Spheroids are an experimental model in vitro that resembles more accurately the tumor behavior observed in vivo than monolayers. So the study and implementation of spheroids in the development of new therapeutic strategies to fight cancer is very important. At the present study we demonstrated that the response to the non viral gene transfer of the suicide gene system HSVtk/GCV on spheroids derived from spontaneous canine melanoma tumors better correlates to the patient’s response than their monolayers counterparts. We also observed that the multicellular resistance (MCR) to the HSVtk/GCV system when cells are cultured as spheroids is probably due to a rapid re-population of the cells that were resistant to the therapy. The high amount of spheroids which were sensitive to the HSVtk/GCV system and/or to the non viral transfer of the cIFN-β gene (80% over a total of 15) together with the maintenance of the sensitivity when the genes were co-transferred, demonstrates the high therapeutic potentiality of the coadministration of both genes. We then studied the sensitivity to the lipoplexes/bleomycin system. We found that the new therapeutic strategy is highly effective since the lipoplexes sensitizes the cells to the citotoxic effect of bleomycin, presumably by stimulating an active incorporation of the drug inside the cells.

Sabio y García, Julia Verónica. "Uso de Brucella abortus como vector para la expresión de antígenos heterólogos" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Ainciart, Natalia. "Estudio de Lumazina Sintasa de Brucella como proteína transportadora de antígenos: relación entre estructura, estabilidad e inmunogenicidad" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La proteína lumazina sintasa de Brucella abortus (BLS) tiene características estructurales, de estabilidad y de inmunogenicidad que la convierten en un candidato interesante para su utilización como carrier o proteína transportadora de distinto tipo de moléculas (péptidos, dominios proteicos, azúcares, etc) BLS tiene una estructura de dímero de pentámero en solución y los estudios realizados en el laboratorio establecieron que tiene una temperatura de melting aparente de 89 °C y un ΔG de desnaturalización de 320 ± 22 kJ/mol. Además, genera una alta respuesta tanto celular como humoral cuando la proteína recombinante es administrada en ratones o conejos (inclusive sin adyuvante) o como vacuna a DNA en un vector de expresión eucariota. La fusión de distintos péptidos y dominios proteicos en su extremo amino terminal da lugar a quimeras de BLS y permite utilizarla como proteína transportadora y aumentar la inmunogenicidad contra las moléculas transportadas en distintos modelos animales. BLS se disocia en dos pentámeros plegados cuando es incubada con cloruro de guanidinio 2M o en buffer fosfato a pH 5. Si la concentración de desnaturalizante aumenta por encima de 2,3 M, se produce una disociación y desnaturalización concertadas que dan lugar a monómeros desplegados. Conocer en detalle estos equilibrios nos permitió diseñar dos estrategias para obtener proteínas mixtas de BLS que contuvieran una mezcla de péptidos provenientes de dos quimeras diferentes. Obtuvimos proteínas mixtas con diferente cantidad de péptido OMP31 y pudimos establecer una relación lineal entre la inmunogenicidad y la densidad de epitopes en la presentación antigénica. Al mismo tiempo, obtuvimos mutantes de estabilidad de BLS y estudiamos el efecto que tiene la estabilidad de la proteína transportadora en la inmunogenicidad contra el péptido transportado. Mediante el estudio de este modelo pudimos establecer que la densidad local de epitopes que se consigue con las quimeras de BLS y las elevadas estabilidad e inmunogenicidad intrínseca de BLS son las principales características que hacen que esta proteína funcione tan eficientemente como carrier de moléculas.

Abstract:
The enzyme lumazine synthase from Brucella spp. is highly immunogenic. This decameric protein is remarkably stable to thermal or chemical denaturation, suggesting a correlation between thermodynamic stability, polymeric arrangement and immunogenicity. The three-dimensional structure of this protein shows that is possible to insert foreign peptides or full-length proteins at the amino terminus without disrupting its general folding. These peptides are presented to the immune system in a polymeric way and in the context of a high specific immune response. BLS is a dimer of pentamers in solution, has a melting temperature of 89 °C and a ΔG of denaturation of 320 ± 22 kJ/mol. BLS induces a high humoral and cellular response when the recombinant protein is inoculated in mice and rabbits (even in the absence of adjuvants) or when is used as a DNA vaccine in an eukaryotic expression vectors. The decoration with peptides or protein domains (chimeras) show that of BLS acts as an efficient carrier and enhances the immunogenicity against the transported molecules. BLS dissociates into two folded pentamers when is incubated in 2 M guanidinium chloride in phosphate buffer at pH 5. Guanidinium chloride concentrations above 2.3 M produce a concerted dissociation and denaturation process resulting in unfolded monomers. The knowledge of these equilibria allowed us to design two different strategies to obtain mixed proteins of BLS with peptides from different chimeras. We obtained mixed chimeras decorated with different number of OMP31 peptides and established a linear relationship between the immunogenicity against the peptide and the epitope density. At the same time, we obtained mutants of BLS with decreased stability and studied the effect of the stability of the carrier protein in the immunogenicity of the peptide. This experimental model allowed us to demonstrate that the local density of epitopes and the high stability and intrinsic immunogenicity of BLS are the main features that make BLS an efficient carrier for vaccine design.

Geffner, Laura Judith. "Alteración del eje IFN-gamma/IL-4 e inhibición de la respuesta citotóxica T antígeno-específica como mecanismo de evasión de la respuesta inmune por la cepa de Mycobacterium tuberculosis multirresistente a drogas M" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La tuberculosis multirresistente a drogas (MDR-TB) plantea una amenaza real al control y la eliminación de la tuberculosis (TB) que, a pesar de ser una enfermedad prevenible y curable, continúa siendo uno de los principales problemas de la salud pública. En el presente trabajo caracterizamos la respuesta inmune adaptativa frente a dos cepas causantes de brotes de MDRTB en Argentina, M y Ra, en pacientes con MDR-TB, TB sensible a drogas (STB) e individuos sanos con infección latente (N). Además, determinamos cuáles son los factores involucrados en la evasión de la respuesta T citotóxica (CTL) por la cepa M, en comparación con 410, un aislado estrechamente relacionado con M pero de baja virulencia. Nuestros resultados muestran que: 1) la inducción de citoquinas y de la respuesta CTL Mtb-específicas dependen tanto del status inmunológico del huésped como del genotipo de Mtb; 2) los pacientes con MDR-TB presentan una alteración del eje IFN-γ/IL-4, una respuesta CTL disminuida y un aumento de linfocitos T reguladores; 3) M y Ra son pobres inductoras de IFN-γ en N y 4) M es una gran inductora de IL-4 en MDR-TB y S-TB, sugiriendo que M explota y aumenta la tendencia pre-existente de estos pacientes a generar respuestas Th2; y 5) M es una pobre inductora de CTL tanto en MDR-TB y S-TB como N a diferencia de 410, indicando que la carencia de CTL es una característica de M. La cepa M emplearía varios mecanismos para inhibir la respuesta CTL: a) alteración en la formación de conjugados CTL-CB; b) disminución en la expresión de moléculas líticas y RANTES; c) una activación disminuida, determinada por la baja expresión de CD69; y d) una escasa ayuda CD4+.

Abstract:
Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) poses a real threat to control and elimination of tuberculosis (TB) that, despite being a curable illness that can be prevented, is still one of the main problems of public health. In the present work we characterize the adaptive immune response against two strains that caused MDR-TB outbreaks in Argentina, M and Ra, in patients with MDR-TB, drugsensitive TB (S-TB) and healthy individuals with latent infection (N). Furthermore, we determine which are the factors involved in the cytotoxic T cell (CTL) response evasion by strain M, comparing with 410, a clinical isolate closely related with M but of low virulence. Our results show that: 1) cytokine induction and CTL response Mtb-specific depend on the immune status of the host but also on the Mtb genotype; 2) MDR-TB patients present an alteration of the IFN-γ/IL-4 axis, a diminished CTL response and a rise in regulatory T cells; 3) M and Ra are poor IFN-γ inducers in N; 4) M is the best IL-4 inducer in MDR-TB and S-TB, suggesting that M explits and enhances the pre-existing tendency of these patients to generate a Th2 type response; and 5) strain M is a poor CTL response inducer both in MDR-TB and S-TB as well as in N, and this difference with strain 410 points out that CTL impairment is specific from M. Strain M would employ several mechanisms to inhibit CTL response: a) alteration of conjugate formation between CTL and target cells; b) low lytic molecules and RANTES expression; c) diminished immune activation, as determined by CD69 expression; and d) a limited CD4+ T cell help.

Palumbo, María Laura. "Influencia del balance TH1/TH2 en las alteraciones neuroinmunes y conductuales inducidas por estrés crónico moderado. Reversión con copaxone" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de este trabajo fue interrelacionar las alteraciones conductuales, neuroquímicas e inmunológicas inducidas por estrés crónico en dos cepas endocriadas de ratones, BALB/c y C57BL/6. Se utilizó un modelo de estrés crónico moderado (CMS) que consiste en la aplicación de varios estresores de moderada intensidad, de manera crónica, alternada e impredecible durante varias semanas. Se observó que los ratones BALB/c expuestos a CMS presentaron una menor capacidad de aprendizaje y memoria compatible con alteraciones estructurales y neuroquímicas observadas en el hipocampo, como disminución de la neurogenésis, disminución de la actividad y del nivel proteico de nNOS, perfil proteico diferencial de isoformas de PKC, entre otras. Estas alteraciones no fueron encontradas en los ratones C57BL/6 expuestos a CMS. En lo que respecta a la respuesta inmune, los BALB/c CMS presentaron una disminución en la proliferación de linfocitos T y un aumento en la proliferación de linfocitos B estimulada por mitógenos. Así como un desbalance de citoquinas hacia Th2. Por el contrario, los animales C57BL/6 CMS mostraron un aumento en la reactividad en los linfocitos T sin presentar cambios en la correspondiente a los linfocitos B y un desbalance de citoquinas hacia Th1. Respecto a la participación de las hormonas clásicamente relacionadas al estrés (catecolaminas y corticosterona), los resultados indicaron que no existe una coincidencia temporal entre el aumento de dichas hormonas y la aparición de las alteraciones mencionadas. Además, los cambios observados en los ratones BALB/c CMS pudieron ser revertidos por la administración de Copaxone®, que estimula débilmente la respuesta autoinmune induciendo un aumento de las citoquinas Th1. Estos hallazgos señalan que las terapias basadas en la modulación del sistema inmune podrían ser útiles para el tratamiento de déficit cognitivos inducidos por estrés. Palabras claves: psiconeuroinmunología, ratones BALB/c y C57BL/6, estrés crónico, aprendizaje y memoria, neurogénesis, óxido nítrico sintasa, proteína quinasa C, balance Th1/Th2, Copaxone®.

Abstract:
The aim of this work was to investigate the relationship between the behavioral, neurochemical and immunological alterations induced by chronic stress in two inbred mouse strains, BALB/c y C57BL/6. A chronic mild stress (CMS) model, consisting of the chronic application of several stressors of moderate intensity applied in an unpredictable manner for several weeks, was utilized. CMS BALB/c mice showed an impaired learning and memory which are related to structural and neurochemical changes observed in the hippocampus, such us a decrease of neurogenesis, a decrease of NOS activity and protein levels, differential protein levels of PKC isoform, among others. These alterations were not found in C57BL/6 mice subjected to CMS. Respect to immune response, CMS BALB/c mice showed a decrease in the T- lymphocyte and an increase of B-lymphocyte mitogen- stimulated proliferation, and an imbalance towards Th2 cytokines. On the contrary, CMS C57BL/6 animals showed an increase in the reactivity of T-lymphocytes without changes in the B- lymphocytes reactivity, and an imbalance towards Th1 cytokines. Concerning to the participation of the classically stress-associated hormones (catecholamines and corticosterone) in the above mentioned findings, the results indicate that there was not a temporal coincidence between corticosterone and catecholamines increase and behavioral and immune alterations. The changes observed in CMS BALB/c mice were reverted by the administration of Copaxone®, which weakly stimulates the autoimmune response increasing Th1 cytokines. These findings indicate that immune-based therapies could be useful for the treatment of cognitive deficits induced by stress.

Pérez Mazliah, Damián Eduardo. "Efecto del tratamiento con benznidazol sobre la respuesta celular T específica para Trypanosoma cruzi en pacientes en la etapa indeterminada de la enfermedad de Chagas crónica" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enfermedad de Chagas, causada por el parasito protozoario intracelular Trypanosoma cruzi, afecta alrededor de 8 a 10 millones de personas desde el Sur de California hasta Sudamérica y Europa occidental. A pesar de ser la causa más frecuente de cardiomiopatía infecciosa del mundo, pocas personas infectadas reciben tratamiento. La mayor limitación para desarrollar nuevas drogas y evaluar su eficacia reside en la falta de ensayos que permitan determinar de manera confiable la carga parasitaria y la eliminación definitiva del parásito. Diversos estudios de nuestro laboratorio, incluyendo el presente trabajo, han demostrado que los linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi en pacientes con enfermedad de Chagas crónica muestran características funcionales y fenotípicas de células efectoras o de memoria efectora con baja capacidad de proliferación homeostática y requieren, por lo tanto, del estímulo antigénico para permanecer en circulación. De esta forma, es de esperar que los cambios en la carga parasitaria inducidos por el tratamiento etiológico se vean reflejados en alteraciones en la respuesta celular T. En el presente trabajo, se determinó en forma periódica la frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi, los títulos de anticuerpos específicos de T. cruzi y el estado clínico en 43 voluntarios adultos con infección crónica por T. cruzi bajo tratamiento con benznidazol durante un período de seguimiento de tres años. Estas mediciones fueron comparadas con valores previos al tratamiento y con valores obtenidos a partir de un grupo control no tratado. La frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi productores de IFN-γ disminuyó significativamente luego del transcurso de un año de inicio del tratamiento con benznidazol en la mayoría de los pacientes estudiados, alcanzando posteriormente valores por debajo del límite de detección en gran parte de los pacientes tratados. Llamativamente, esta disminución fue en muchos casos precedida por un incremento significativo en la frecuencia de linfocitos T específicos de T. cruzi productores de IFN-γ con fenotipo efector o de memoria efectora entre dos y seis meses luego del tratamiento. Por el contrario, la frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T cruzi permaneció relativamente estable en ausencia de tratamiento. A pesar de las alteraciones significativas en la respuesta celular T, solo 6 de 43 pacientes tratados con benznidazol mostraron seroconversiones a valores negativos de los títulos de anticuerpos específicos de T. cruzi y solo 3 pacientes mostraron progresión hacia estadios clínicos mas avanzados de la enfermedad. Sin embargo, estos últimos son resultados esperables, teniendo en cuenta que el período de seguimiento fue relativamente corto. Un seguimiento similar fue llevado a cabo en un grupo de 15 voluntarios adultos con infección crónica por T. cruzi sometidos a un esquema novedoso de tratamiento combinado secuencial con alopurinol seguido de benznidazol. La frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi productores de IFN-γ se vio también significativamente afectada por el tratamiento combinado; observándose una disminución inmediatamente después de la administración de alopurinol, así como luego de la finalización del tratamiento combinado con la administración de benznidazol. Más aún, el tratamiento con alopurinol promovió un aumento significativo en el porcentaje de linfocitos T vírgenes totales en periferia, acompañado de una disminución significativa en los niveles de activación de la población total de linfocitos T determinada por la expresión del marcador de activación HLA-DR. Este fenómeno se mantuvo luego del tratamiento con benznidazol. Si bien ninguno de los pacientes estudiados mostró seroconversión completa a valores negativos durante el período de seguimiento, un análisis más exhaustivo de los datos mostró que los títulos de anticuerpos específicos de T. cruzi disminuyeron significativamente luego de finalizado el tratamiento combinado. Estudios in vitro con una variedad de antígenos y el mitógeno PMA mostraron que el alopurinol ejerce un efecto directo en la activación de linfocitos T humanos. De esta forma, el aumento en el porcentaje de linfocitos T vírgenes totales en periferia y la disminución de la expresión del marcador de activación HLA-DR luego del tratamiento con alopurinol podría explicarse por un efecto inmunomodulador directo del alopurinol sobre el sistema inmune del huésped, una disminución en la carga parasitaria, o por una combinación de ambos efectos. El efecto antiinflamatorio del alopurinol podría ser beneficioso para prevenir el desarrollo de alteraciones cardiacas, previamente asociadas con el proceso de inflamación crónica en la enfermedad de Chagas. En conclusión, tanto el tratamiento clásico con benznidazol así como el esquema novedoso de tratamiento combinado secuencial con alopurinol seguido de benznidazol generaron un marcado impacto sobre el sistema inmune específico de T. cruzi en pacientes con enfermedad de Chagas crónica. Estos resultados son altamente indicativos de eficacia terapéutica y cura parasitológica en un conjunto sustancial de pacientes.

Abstract:
Chagas disease, caused by the intracellular protozoan parasite Trypanosoma cruzi, affects around 8 to 10 million people from Southern California to South America and Western Europe. In spite of being the most common cause of infectious cardiomyopathy in the world, few infected subjects receive any treatment. The major limiting factor in developing and evaluating potential new drugs for their efficacy is the lack of reliable tests to assess parasite burden and elimination. Several studies from our research group, including the present work, have demonstrated that T. cruzi-specific T cells in chronically T.cruzi-infected subjects display phenotypic features of effector/effector memory cells that lack homeostatic proliferation capability and rely on antigenic stimulation to remain in circulation. Therefore, it can be reasoned that changes in parasite-load induced by etiological treatment might be reflected in alterations of T cell responses. T. cruzi-specific T cells and antibodies, as well as the clinical status, were measured periodically over a 3-year follow-up period in 43 adult volunteers with chronic T. cruzi infection under treatment with benznidazole. These measurements were compared with pre-treatment conditions and with values in an untreated control group. The frequency of peripheral IFN-γ-producing T cells specific for T. cruzi declined as early as 12 months after the benznidazole treatment was administered and subsequently became undetectable in a substantial proportion of treated subjects. The shift to negative IFN-γ T cell responses was highly associated with an early increase in IFN-γ-producing T cells with phenotypic features of effector/effector memory cells in a subset of subjects. Conversely, the frequency of peripheral T. cruzi-specific T cells remained relatively stable in the absence of treatment. Not surprisingly, given the relatively short follow-up period, in only 6 out of 43 treated subjects the results of conventional serological tests became negative during the follow-up period. In addition, only 3 subjects exhibited progression in the assessment of disease severity during the follow-up period (2 in the benznidazole-treated group and 1 in the untreated group). A similar follow-up study was also conducted on a group of 15 adult volunteers with chronic T. cruzi infection who submitted to a novel combined sequential treatment with allopurinol followed by benznidazole. The frequency of peripheral IFN-γ-producing T. cruzi-specific T cells was highly affected by the combined treatment; the impact was registered early after allopurinol administration, as well as after the completion of the combined treatment. In addition, the treatment with alopurinol promoted an increase in the frequency of total peripheral naïve T cells and a decrease in the frequency of total T cells expressing the activation marker HLA-DR. These observations were sustained after the completion of the combined treatment with benznidazole administration. Although none of the subjects studied showed complete seronegative conversion during the follow-up period, the levels of T. cruzi- specific antibodies significantly decreased after completion of the combined treatment. In vitro studies using a variety of antigens as well as mitogen showed that allopurinol exerted a direct effect on T cell activation. Thus, the early improvement in total naïve T cells and the decrease in the expression of the activation marker HLA-DR after alopurinol treatment may be explained either as a direct effect of allopurinol on the host immune system or by a decrease in parasite load, or a combination of both effects. The anti-inflammatory effect of alopurinol could be beneficial in preventing the development of cardiac symptoms, previously associated with the process of chronic inflammation in Chagas disease. In summary, benznidazole treatment, as well as a novel combined sequential treatment with allopurinol followed by benznidazole, during chronic Chagas disease have a substantial impact on parasite-specific immune responses that is likely indicative of treatment efficacy and cure.

Rearte, María Bárbara. "Estrategias para revertir la inmunosupresión en el fenómeno de tolerancia a endotoxinas" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Los fenómenos de sepsis y shock séptico pueden ser causados por bacterias Gram- positivas y negativas como también por otros microorganismos. En el caso de las bacterias Gram-negativas, las endotoxinas, componentes normales de la pared bacteriana, también conocidas como lipopolisacáridos (LPS), han sido consideradas como uno de los principales agentes causales de los efectos indeseables de estas enfermedades. La respuesta a LPS implica, en principio, la generación de un estado inflamatorio, caracterizado por la rápida secreción de citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, interleuquina (IL) -1, IL-6, e interferón (IFN)-γ, seguido por un estado anti-inflamatorio en donde predominan mediadores como la IL-10, el factor de transformación del crecimiento-β (TGF)-β o glucocorticoides (GC), los cuales conducen al huésped a un estado de refractariedad temporal frente a una nueva exposición al LPS, un proceso conocido como tolerancia a LPS o tolerancia a endotoxina. Si bien se ha considerado como un mecanismo de protección frente al desarrollo de una sepsis o una inflamación sistémica, la tolerancia a endotoxina ha sido también señalada como una de las causas principales de la inmunosupresión inespecífica tanto humoral como celular descrita en dichos pacientes. En este trabajo demostramos, mediante un modelo murino, que si bien el mantenimiento de la tolerancia depende de los GC, el establecimiento del fenómeno puede ser inhibido por un GC sintético como la dexametasona (Dex). Por el contrario, demostramos que el mifepristone (RU486), un conocido antagonista de receptores para GC, fue capaz de inducir una desarticulación transitoria y reversible de la tolerancia a endotoxina, permitiendo también una restauración parcial de tanto la respuesta inmune adaptativa humoral como celular en ratones inmunosuprimidos inducido por LPS, sugiriendo el involucramiento de los GC endógenos en este fenómeno. Por otro lado, mediante el uso de ciclofosfamida y gemcitabina, demostramos que las células supresoras GR-1^+/CD11b^+ y las células T regulatorias CD4^+CD25^+FoxP3^+ no juegan un rol principal ni en el establecimiento ni en el mantenimiento de la tolerancia a endotoxina, un mecanismo central en la inducción de un estado de inmunosupresión. Estos resultados permiten considerar una nueva perspectiva para el manejo de la inmunosupresión en sepsis y en shock no infecciosos y merecen de mayores estudios e investigaciones en el futuro.

Abstract:
Sepsis and septic shock can be caused by Gram-positive and -negative bacteria and other microorganisms. In the case of Gram-negative bacteria, endotoxin, a normal constituent of the bacterial wall, also known as lipopolysaccharide (LPS), has been considered as one of the principal agents causing the undesirable effects in this critical illness. The response to LPS involves a rapid secretion of proinflammatory cytokines such as tumour necrosis factor (TNF)-a, interleukin (IL)-1, IL-6, interferon (IFN)-g and the concomitant induction of anti-inflammatory mediators such as IL-10, transforming growth factor (TGF)-b or glucocorticoids (GC), which render the host temporarily refractory to subsequent lethal doses of LPS challenge in a process known as LPS or endotoxin tolerance. Although protective from the development of sepsis or systemic inflammation, endotoxin tolerance has also been pointed out as the main cause of the non-specific humoral and cellular immunosuppression described in these patients. In this report we demonstrate, using a mouse model, that while the maintenance of tolerance is dependent upon GC, the establishment of tolerance by LPS could be inhibited by dexamethasone (Dex), a synthetic GC. Conversely, we demonstrated that mifepristone (RU486), a known GC receptor antagonist, was capable of inducing a transient and reversible disruption of endotoxin tolerance, also permitting partial restoration of both adaptive humoral and cellular immune response in LPS immunosuppressed mice, suggesting the involvement of endogenous GC in this phenomenon. On the other hand, using cyclophosphamide and gemcitabine, we demonstrated that regulatory/suppressor CD4^CD25^+FoxP3^+ and GR-1+CD11b^+ cells do not play a major role in the establishment or the maintenance of endotoxin tolerance, a central mechanism for inducing an immunosuppression state. These results are encouraging for the management of immunosuppression in sepsis and/or noninfectious shock, and deserve further investigation in the future.

Rubinstein Guichon, Mara Roxana. "Influencia del condicionamiento genético y del estrés en la desregulación de la respuesta inmune en el estado diabético. Participación del estrés oxidativo" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Aunque está clínicamente aceptado que la diabetes predispone a sufrir infecciones severas y los estudios sugieren una asociación entre esta patología y las infecciones, no se conocen los mecanismos que median entre la diabetes y la inmunosupresión. A su vez, el estrés tiene un significativo reconocimiento en el desarrollo y la evolución de la diabetes. Es así que el objetivo del presente trabajo fue estudiar la respuesta inmune en la diabetes mellitus tipo 1, ampliando el conocimiento acerca de los factores genéticos y no genéticos que participan en la evolución del estado diabético y en la alteración de la respuesta inmune. Para esto, se utilizó un modelo experimental murino de diabetes mellitus tipo 1 en dos cepas de ratones: BALB/cByJ y C57Bl/6J y se analizó la respuesta inmune encontrándose que, en los ratones diabéticos de la cepa BALB/cByJ, la repuesta inmune determinada in vivo e in vitro se encontraba afectada, mientras que en los ratones de la cepa C57Bl/6J no lo estaba. A continuación se investigó el efecto del estrés sobre la respuesta inmune en la diabetes. Para esto se utilizó el modelo de estrés crónico moderado (CMS) aplicado luego de la instauración de la diabetes. Los resultados mostraron que en los ratones diabéticos de la cepa BALB/cByJ el CMS provocó alteraciones más tempranas sobre la proliferación linfocitaria probablemente mediadas por el aumento en la glucemia. En estos ratones se observó una correlación positiva entre la glucemia y catecolaminas. En cuanto al efecto sobre la cepa C57Bl/6J, sólo se encontró un aumento en las glucemias sin estar presente la alteración inmune. Dado que la hiperglucemia es el principal factor involucrado en el desarrollo de las complicaciones de la diabetes, se evaluó su participación en los efectos observados. Para esto, se analizó el efecto de la alta glucosa sobre la actividad linfocitaria normal. Las altas concentraciones de glucosa sobre linfocitos provenientes de la cepa BALB/cByJ afectaron directamente la proliferación y condujeron a la muerte de las células, alteración que no se observó en los linfocitos provenientes de la cepa C57Bl/6J. Entre los mecanismos que estarían implicados en los efectos deletéreos de la alta glucosa se destacó el aumento en el estrés oxidativo. Estos resultados señalan la influencia del condicionamiento genético y del estrés en el deterioro de la respuesta inmune en el estado diabético. Si bien la extrapolación de estos resultados a pacientes con diabetes debe ser tomada con precaución, puntualizan la importancia de un temprano y adecuado control de la glucemia como así también de los factores ambientales que puedan alterarla.

Abstract:
Diabetes is widely believed to predispose to serious infections. Experimental clinical literature supports an association between diabetes and infection. However, the mechanisms linking diabetes and immunosuppression are not well defined. In particular, stress has a significant recognition in the development and progression of diabetes. Therefore, the aim of the present project was to study the immune response in type 1 diabetes and genetic and nongenetic factors involved in the evolution of the diabetic state and in immune response alteration. For this purpose, an experimental animal model of diabetes was used in two mice strains: BALB/cByJ and C57Bl/6J and the immune response was analyzed. The immune response in BALB/cByJ diabetic mice was affected while in C57Bl/6J it was not. Then, the effect of stress on immune response in the diabetic state was investigated. The animals were exposed to a chronic mild stress model after diabetes induction. Stress exposure in BALB/cByJ mice caused earlier alterations on immune response mediated by the glycaemia increase. Also, a positive correlation between glycaemia and catecholamines was found. In C57Bl/6J mice, stress exposure only caused glycaemia increase without the immune alteration. Hyperglyacemia is the main factor involved in the development of diabetes complication, thus its participation in the observed effects was evaluated. The effect of high glucose incubation on lymphocyte reactivity was studied. In BALB/cByJ lymphocytes, high glucose decreased the proliferation and increased the apoptosis whereas in C57Bl/6J lymphocytes these alterations were not observed. Among the mechanisms involved in the deleterious effects of high glucose, the increase in oxidative stress was the most important. These results show the influence of genetic background and stress in the immune alteration in the diabetic state. Although extrapolation of these results to patients with diabetes should be taken with caution, it is important to emphasize the early and adequate glycaemia control as well as environmental factors too.

Camicia, Gabriela Lorena. "Influencia de la catepsina L en la población de células T regulatorias CD4+: rol del estroma" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células T regulatorias CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) son esenciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunológica hacia lo propio y la homeostasis del sistema inmune. Utilizando ratones CTSLnkt/nkt, portadores de una mutación en el gen que codifica para la proteasa catepsina L (CTSL), demostramos que la falta de actividad de esta enzima está asociada con una severa disminución en el número de células Treg en el timo, aunque no altera la frecuencia de los timocitos CD25+Foxp3+ en la población CD4 simple positiva. Contrariamente, en los órganos linfoides periféricos la falta de actividad de CTSL correlaciona con un aumento en la proporción de células CD25+Foxp3+ dentro de la población CD4+ y con un incremento en el número de células Treg en los ganglios linfáticos (GL). Determinamos que en los GL de los ratones CTSLnkt/nkt las tasas de proliferación y apoptosis de las células CD4+ Treg y T convencionales (CD4+CD25-Foxp3-) están aumentadas. Estos aumentos afectarían el número de células Treg pero no determinarían el aumento en su frecuencia dentro de la población CD4+. La ausencia de actividad de CTSL en las células linfoides influencia la proliferación de las células T convencionales, mientras que la falta de actividad de CTSL en el entorno de los GL aumenta tanto la proliferación de las células T convencionales como la de las Treg. Ensayos in vitro sugieren que la inhibición de CTSL induce la expresión de Foxp3 en algunas células CD4+CD25-Foxp3-. Interesantemente, las células estromales derivadas de GL de ratones CTSLnkt/nkt producen más TGF-b1 que las de ratones normales. En conjunto estos resultados indican que la CTSL interviene en la regulación del número y la frecuencia de las células Treg en los órganos linfoides, y sugieren que dicha enzima jugaría un rol en la adquisición del fenotipo iTreg en la periferia. Demostramos además que las células estromales de los GL son capaces de aumentar la proliferación y la sobrevida in vitro de las células Treg. Estos resultados aportan nuevos conocimientos acerca de la biología de las células Treg y de los mecanismos que regulan el balance entre las células CD4+ Treg y T convencionales, pudiendo así contribuír al desarrollo de nuevas terapias inmunológicas.

Abstract:
CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Treg) are essential for the maintenance of immunological self-tolerance and immune homeostasis. Using CTSLnkt/nkt mice, carrying a mutation in the gene encoding the cathepsin L protease (CTSL), we demonstrated that the lack of CTSL activity is associated with a severe decrease in the number of Treg thymocytes, although it does not alter the frequency of CD25+Foxp3+ cells within the CD4 simple positive pool. On the other hand, the lack of CTSL activity in the secondary lymphoid organs correlates with an increase in the frequency of CD4+CD25+ cells within the CD4+ T cell subset, along with an increase in the lymph nodes (LN) Treg cell number. We determined that the apoptosis and proliferation rates of both Treg cells and T conventional cells (CD4+CD25-Foxp3-) are increased in the LN of CTSLnkt/nkt mice. These increases would affect the number of Treg cells but they would not determine a higher frequency of Treg cells within the CD4+ T cell subset. The absence of CTSL activity in lymphoid cells increases the proliferation levels of T conventional cells, whereas the lack of CTSL activity in the LN microenvironment influenced both, the T conventional and Treg cells proliferation rates. Our results suggest that CTSL inhibition would induce Foxp3 expression within few CD4+CD25-Foxp3- T cells in vitro. Interestingly, CTSL mutant mice LN derived stromal cells produce more TGF-b1 than LN stromal cells from wt mice. Taken together, these results indicate that CTSL influences the number and frequency of lymphoid organs Treg cells and they suggest that this protease would play a role in the peripheral conversion of T conventional cells to Treg phenotype. We also demonstrated that LN stromal cells are capable to increase both Treg proliferation and survival levels in vitro. Our results provide novel insights into biology of Treg cells and into the mechanisms that regulate the Treg and T conventional cells balance. These findings would contribute to the development of new immunological therapies.

Lentz, Ezequiel Matías. "Producción de antígenos y anticuerpos de interés veterinario en plantas transplastómicas de tabaco" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta Tesis Doctoral, se evaluó la factibilidad de utilizar plantas transplastómicas de tabaco (Nicotiana tabacum) para la producción de proteínas de interés en medicina veterinaria: dos antígenos virales y un anticuerpo de camélido de cadena simple (VHH). La primera proteína producida en este sistema consistió en una fusión entre un epítope inmunogénico de la proteina VP1 del virus de la fiebre aftosa y la enzima β-glucuronidasa (VP-βGUS). Se generaron plantas transplastómicas, las cuales fueron caracterizadas a nivel molecular. La proteína heteróloga se acumuló de un modo importante en los cloroplastos de las plantas transformadas: hasta el 51% de las proteínas solubles totales (PST) (8 mg/g de tejido fresco ), conservando su actividad enzimática e inmunogenicidad. Los niveles de expresión observados resultaron claramente mayores a los obtenidos previamente en plantas transgénicas nucleares utilizando la misma construcción. A pesar de estos altos niveles de expresión, el fenotipo de las plantas transplastómicas resultó ser indistinguible del de las plantas wild-type. Esta prueba de concepto con resultados alentadores nos permitió avanzar en la producción de otras moléculas mediante este sistema. El segundo antígeno expresado fue VP8*, una proteína no glicosilada de la cápside de rotavirus bovino (RVB). Se utilizó una versión del vector que permite la acumulación de VP8* en el estroma y se generaron dos construcciones adicionales, una para expresarla como una fusión a la β-glucuronidasa (GUS-E-VP8*), y otra para dirigirla al lúmen de los tilacoides (str- VP8*). VP8* se acumuló como agregados insolubles en el estroma de los cloroplastos y pudo ser solubilizada parcialmente por sonicación. Se obtuvieron extractos de VP8* utilizando la fracción soluble, donde VP8* representaba el 4% de las PST (250 μg/g TF). Al extraerse VP8* a partir de la fracción insoluble sin incluir el paso de sonicación, fue posible enriquecer la preparación en la proteína recombinante, eliminar la nicotina, y mejorar el rendimiento al obtenerse 500 μg/g TF. La proteína VP8* obtenida a partir de ambas fracciones resultó ser inmunogénica y protectiva contra el virus en el modelo del ratón lactante. Las estrategias alternativas para la expresión de VP8* no fueron exitosas. GUS-E-VP8* se acumuló como una proteína soluble en el estroma del cloroplasto, pero en niveles significativamente menores que VP8*. La construcción str-VP8* permitió la translocación de VP8* al lúmen de los tilacoides, pero se observó una proteólisis no esperada de la proteína, y la presencia de una forma truncada de la misma. Estos resultados sugieren que la acumulación de VP8* en el estroma del cloroplasto es favorecida por su insolubilidad, que la protegería del ataque proteolítico. La tercera molécula expresada fue el VHH clon 3B2 dirigido contra un epítope conformacional de la proteína VP6 de RVB. Para la expresión de este nanoanticuerpo también se evaluaron tres estrategias: expresión de VHH en el estroma, redirección al lúmen de los tilacoides (pep- VHH) y fusión a la enzima β-glucuronidasa (GUS-E-VHH). Todas las líneas de plantas transplastómicas expresando VHH mostraron un fenotipo heteroplástico. El análisis molecular confirmó la heteroplastía en líneas que habían sido regeneradas en medio selectivo al menos tres veces. La proteína VHH se acumuló en niveles bajos, los cuales se acercaban al límite de la detección por la técnica de western blot. La expresión se mejoró significativamente tanto en las plantas pep-VHH (2,5% de las PST; 60 μg/g TF) como en las GUS-E-VHH (3% de las PST; 70 μg/g TF), aunque en este último caso se observaron productos de degradación. Las plantas pep-VHH homoplásticas tenían un fenotipo clorótico que se intensificaba con la mayor iluminación. Los resultados obtenidos muestran la dificultad de expresar este VHH en cloroplastos y sugieren un efecto tóxico del transgén. La redirección al lúmen de los tilacoides favorecería la estabilidad de esta proteína heteróloga, lo cual es consistente con su expresión exitosa en E. coli cuando se expresa en el periplasma bacteriano. Los resultados presentados en este trabajo aportan evidencias que promueven el uso y optimización de plantas transplastómicas como biorreactores, para llegar a ser alternativas rentables y concretas de uso en la industria.

Abstract:
In this PhD Thesis, we evaluated the feasibility of using transplastomic plants (Nicotiana tabacum) for the production of proteins of interest in veterinary medicine: two viral antigens and a camelid single-chain antibody (VHH). The first protein produced in this system was a translational fusion of an immunogenic peptide from VP1 of foot-and-mouth disease virus and the enzime β-glucuronidase (VP-βGUS). Transplastomic plants engineered to express the aforementioned construction were characterized at the molecular level. The heterologous protein accumulated up to 51% of the total soluble leaf protein (TSP), or 8 mg/g of fresh tissue (FT), while retaining its enzymatic activity and immunogenicity. The observed expression levels were clearly higher than those obtained previously in nuclear transgenic plants, using the same construction. Despite these high levels of expression, the phenotype of the transplastomic plants was indistinguishable from that of wild-type plants. This proof of concept with encouraging results, allowed us to continue evaluating this system for the production of other recombinant proteins. The second antigen expressed was VP8*, a non-glycosilated capside protein from bovine rotavirus (BRV). Two additional constructions were used to express it in the chloroplast stroma as a β-glucuronidase fusion (GUS-E-VP8*), and to accumulate it in the thylakoid lumen (str- VP8*). VP8* formed insoluble aggregates in the stroma and was partially solubilized by sonication. In the soluble extracts obtained from VP8* transplastomic plants, the recombinant protein represented 4% of the TSP (250 μg/g FT). The insoluble fraction from these plants was highly enriched in VP8*, devoid of nicotine, and contained 500 μg/g FT. The protein from both fractions was immunogenic and conferred protection against the virus in the suckling mouse model. The alternative strategies for VP8* expression were unsuccessful. GUS-E-VP8* accumulated as a soluble protein at barely detectable levels. The construction str-VP8* allowed translocation of VP8* into the thylakoid lumen, but the protein was processed in an unexpected manner. These results suggest that VP8* accumulation in the chloroplast stroma is boosted by its insolubility, which would protect the recombinant protein from proteolytic attack and degradation. The third molecule expressed was the VHH clone 3B2 directed against a conformational epitope of the VP6, an inner capsid protein of BVR. This nanobody was expressed using three strategies: accumulation in the stroma by itself (VHH) or as a fusion to the β-glucuronidase (GUS-E-VHH), and translocation into the thylakoid lumen (pep-VHH). All the transplastomic lines expressing the single-chain antibody presented an heteroplastic phenotype. Southern blot analysis confirmed the heteroplasmy of these plants. In VHH transplastomic plants the protein accumulated at very low levels, almost undetectable by western blot. Expression levels were improved in both pep-VHH (2,5% of TSP; 60 μg/g TF) and GUS-E-VHH plants (3 % of TSP; 70 μg/g TF), but in the latter case degradation products were observed. Homoplastic pep-VHH plants had a chlorotic phenotype, which was more intense when the plants were grown with higher illumination. These results show the difficulty of expressing this VHH in chloroplasts and suggest a toxic effect of the transgen on the plant. The redirection to the lumen of thylakoids favors the stability of the heterologous protein, which is consistent with its successful expression in E. coli when it is directed to the bacterial periplasm. The results presented in this work support the use and optimization of transplastomic plants as biorreactors, in order to become concrete industrial alternatives.

Maglioco, Andrea Florencia. "Terapias combinadas contra tumores murinos: inmunoterapia y quimioterapia. Relación de la eficacia del tratamiento con el estado inmunológico del portador" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El ganglio linfático drenante del tumor (NLDT) es central en el primado de células T contra antígenos tumorales y en el inicio de la respuesta antitumoral. Sin embargo, también allí el tumor generaría inmunosupresión y tolerancia. La tolerancia no sólo favorece el crecimiento tumoral sino que constituye un obstáculo para el éxito de las inmunoterapias. Utilizamos un fibrosarcoma murino tempranamente inmunogénico que evoluciona hacia un estado tolerogénico, con el fin de estudiar los mecanismos celulares que llevan a la generación de la tolerancia a nivel del NLDT y de diseñar un tratamiento inmunológico apropiado. Determinamos que tras una activación inicial, se induce el aumento de células plasmacitoides, linfocitos B-IL10+ y T regulatorios, todos ellos asociados con inmunosupresión, los cuales coexisten con signos de inmunidad antitumoral locales y sistémicos. Por lo tanto evaluamos la utilidad de extirpar el NLDT como medio de eliminar un foco de inmunosupresión y favorecer el rechazo del tumor; por el contrario se indujo exacerbación del mismo. La restitución de las células efectoras del ganglio extraído conjuntamente con la depleción in vivo de células regulatorias por una dosis baja de ciclofosfamida resultó en menor crecimiento, mayor sobrevida y una alta tasa de regresión tumoral, sin recidivas. Parte de los mecanismos involucrados en la regresión comprenden la disminución del número y la actividad de las células regulatorias, la disminución de la producción de TGF-β, y el aumento de la citotoxicidad específica.

Abstract:
Tumor-draining lymph nodes (TDLN) are central sites where T cell priming to tumor antigens and onset of the antitumor immune response occur. However, tumor-induced immunosuppression has been demonstrated at TDLN, leading to downregulation of antitumor reaction and tolerance induction. Tolerance in turn is a main impairment for immunotherapy trials. We used a murine immunogenic fibrosarcoma that evolves to a tolerogenic state, to study the cellular mechanisms underlying tolerance induction at the level of TDLN and to design an appropriate immunotherapy. We determined that following a transient activation, the established tumor induces signs of immunosuppression at TDLN that coexist with local and systemic evidences of antitumor response. Therefore, we evaluated the feasibility of removing TDLN in order to eliminate a focus of immunosuppression and favor tumor rejection; but instead, a marked exacerbation of tumor growth was induced. Combining the restoring of the TDLN-derived cells into the donor mouse by adoptive transference with the in vivo depletion of regulatory cells by low-dose cyclophosphamide, resulted in lowered tumor growth, enhanced survival and a considerable degree of tumor regression. The mechanisms accounting for tumor remission are at least in part the inhibition of regulatory cells and TGF-β production and the enhancement of the specific cytotoxicity.

Palmieri, Mónica Alejandra. "Efecto del arsenito de sodio en un modelo de carcinogénesis experimental en piel de ratón" (2011-03-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La exposición ambiental al arsénico es un problema de salud pública debido a que afecta a un gran número de poblaciones en el mundo y a que es un agente carcinogénico para humanos. Por tal motivo surge la necesidad del desarrollo de estudios que permitan comprender el modo de acción para poder prevenir los efectos nocivos relacionados con la ingestión de arsenito a través del consumo de agua. El presente trabajo se desarrolló con la finalidad de detectar la influencia de los compuestos arsenicales en posibles procesos cancerosos pre-existentes o simultáneas al consumo del agua con arsenito. Por lo que se diseñaron los experimentos en ratones a los que se les suministró arsenito de sodio de manera crónica en el agua bebida. Se tomaron en cuenta distintas dosis (2, 20 ó 200 ppm) y distintos momentos de superposición con el proceso clásico de carcinogénesis (antes o después del esquema DMBA/TPA). El efecto del arsenito de sodio en el proceso de carcinogénesis experimental se evidenció en una menor cantidad de tumores en todas las condiciones que bebieron arsenito respecto del control. Pero esas formaciones tumorales evidenciaron una tendencia al aumento del índice de malignidad respecto a los ratones de las condiciones control. Por otro lado es de destacar que la condicón que recibió mayor dosis (200 ppm) bebió un 50% menos que las otras condiciones y que tuvo una tendencia a tener menos peso corporal. Para comprender los efectos sistémicos que puede causar el consumo crónico de arsenito, se estudió ex vivo la población de macrófagos provenientes ya sea de la cavidad peritoneal como del tronco bronqueo-alveolar de dichos ratones. En todas las condiciones la población de macrófagos mantiene la capacidad fisiológica de autorregular si reactividad. Esta característica es más evidente en los macrófagos peritoneales. Por otro lado se observó un aumento sustancial en el npumero de macrófagos respecto a los ratones que no recibieron ningún tipo de tratamiento. En los macrófagos alveolares tratados in vitro no se detectaron cambios significativos en la viabilidad celular y en la apoptosis con las concentraciones menores de a 2 microM para 24-96 hs., pero a concentraciones mayores se observó una marcada disminución en la viabilidad y un significativo aumento en la apoptosis. Para caracterizar el estatus metabólico se estudió la dinámica del proceso de generación de sales de formazona a partir del MTT la cual se modificó a concentraciones mayores a 2 microM y por otro lado, se evaluó la actividad metabólica, sin encontrar modificaciones. Pero la actividad específica del NBT como parámetro de generación de anión superóxido se incrementó significativamente. El arsenito modifica el metabolismo y el estatus oxidativo de los macrófagos alveolares in vitro cuando se encuentran en un medio enriquecido con arsenito. En la líneas celulares se estudiaron in vitro los mismos parámetros. En cuanto a la dinámica de generación de formazona así como en la respuesta apoptótica sólo se observaron cambios significativos con concentraciones mayores a 7,5 microM. Los resultados obtenidos muestran un resultado paradójico, menos tumaores pero mayor malignidad, acorde con las distintas facetas conocidas para éste compuesto, por lo que es necesario hacer hincapié en el tiempo de exposición al mismo, los posibles eventos pre-cancerígenos y la variabilidad interindividual.

Abstract:
Environmental exposure to arsenic is a public health problem because it affects a large number of populations worldwide and arsenic is carcinogenic in human beings. Within this context, the needs arises to perform studies aimed at elucidting the mode of action of arsenic and prevent harmful effects derived from the intake of arsenite in drinking water. The aim of the present study was to asses the influence os arsenic compounds on potential carcinogenic precesses, both pre-existing and concomitant with the intake of water containing arsenite. Experimental protocol werw designed to evaluate the effect of chronic administration of sodium arsenite to mice in the drinking water. Diferent doses of sodium arsenite (2,20 and 200 ppm) were administrated with a varying overlap with the classic carcerogenesis process (namely, before and after the DMBA/TPA carcerogenesis protocol). The effect of sodium arsenite on the process of experimental carcirogenesis involved a reduction in the number of tumors in all the groups exposed to arsenite compared to control. However, the malignancy index of tumors was higher in the experimental group then in the control group. Furthermore, the animals exposed to the highest dose of arsenite (200 ppm) drank 50% less water than the other groups and exhibiter a tendency to lose body weight. Seeking to understand the systemic effects of chronic intake of arsenite, we studied ex-vivo the population of macrophages derived from the peritoneal cavity or the broncheo-alveolar trunk in experimental mice. In all the conditions the macrophages preserved their phisiologic capacity to self-regulate their reactivity. This feature was more evident in peritoneal macrophages. In addition, a robust increase in the number of macrophages was observed in experimental animals compared to animals with no treatment (non-cancerized, not exposed to arsenite) Lastly, in citro studies were performed to characterize the effect of arsenite on cell metabolism of epithelial cell lines and alveolar macrophages. Alveolar macrophages traeted in vitro did not exhibit significant changes in cell viability and apoptosis with concentrations below 2 µM for the 24-96 hs time-point. However, higher concentrations induced a marked rduction in viability and a significant increase in apoptosis. Metabolic status was characterized in terms of the kinetics of the process of generation of formazan salts from MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltetrazolio). This process was modulated by concentrations above 2µM. In addition, we evaluated the specific activity of MTT as a parameter of metabolic activity, and found no changes. However, the specific activity on NBT (Nitro Blue Tetrazolium) as a parameter of generation of superoxide anions rose significantly. Arsenite modified the metabolism and axidative status of alveolar macrophages in vitro when the cells were cultured in an arsenite enriched medium. The same parameters were studied in vitro in the cell lines. The kinetics of production of formazan salts and the apoptotic response only exhibited changes at concentrations above 7,5 µM. the present results are paradoxical in the sence that they reveal a reduction in the number of tumors but an increase in malignancy in cancerized animals exposed to arsenite compared to cancerized controls. This response was with the different known aspects of the effect of arsenite described in the literature. Within this context, potencial pre-carcirogenic effects and inter-subject variability.

Badano, María Noel. "Regulación de la linfopoyesis B por la cisteín proteasa catepsina-L" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La catepsina-L (CTSL) es una proteasa lisosomal de expresión ubicua que presenta funciones diversas y específicas. Entre ellas, participa en la selección positiva de las células T CD4+ y en la homeostasis de las células T. Utilizando como modelo experimental ratones CTSLnkt/nkt, portadores de una deleción en el gen que codifica para la CTSL, estudiamos la influencia de la CTSL sobre la homeostasis de las células B. Observamos un incremento en el número de células B en los ganglios linfáticos (GL), el bazo y la sangre periférica (SP) de los ratones CTSLnkt/nkt. En el bazo, este incremento estuvo restringido a las células B transicionales T1 y T2 y a las células B de la zona marginal (ZM). No se detectaron alteraciones en los niveles de proliferación y apoptosis basales de las células B periféricas en los ratones CTSLnkt/nkt. La frecuencia y el número de células B en los distintos estadios de maduración de la médula ósea (MO) en los ratones CTSLnkt/nkt resultó normal. Sin embargo, experimentos in vitro e in vivo demostraron que la linfopoyesis B se encuentra incrementada en los ratones CTSLnkt/nkt. Tanto los precursores de las células B como el microambiente de la MO de los ratones CTSLnkt/nkt contribuyen a dicho incremento. Además la emigración de células B de la MO hacia el bazo se encuentra incrementada en los ratones CTSLnkt/nkt. El conjunto de estos resultados indica que la CTSL regula negativamente la producción y exportación de los linfocitos B por la MO y el número de células B periféricas.

Abstract:
Cathepsin-L (CTSL) is an ubiquitously expressed lysosomal cysteine protease with diverse and highly specific functions. The involvement of CTSL in thymic CD4+ T-cell positive selection and T-cell homeostasis has been previously documented. Using CTSLnkt/nkt mice that lack CTSL activity, we investigated the influence of CTSL activity on B-cell homeostasis. B-cell numbers were increased in lymph nodes (LN), spleen and blood from CTSLnkt/nkt mice. Increases in splenic B-cell numbers were restricted to transitional T1 and T2 cells and to the marginal zone (MZ) cell subpopulations. No alterations in the proliferative or apoptosis levels were detected in peripheral B-cell populations from CTSLnkt/nkt mice. In the bone marrow (BM), the percentage and the absolute number of B cells precursors and mature B cells were not altered. However, in vitro and in vivo experiments showed that BM B-lymphopoiesis was markedly increased in CTSLnkt/nkt mice. Both BM microenvironment and B-cells progenitors would contribute to the increased Blymphopoiesis in CTSLnkt/nkt mice. Besides, BM B-cell emigration to the spleen was increased in CTSLnkt/nkt mice. Overall, our data clearly demonstrate that CTSL negatively regulates BM B-cell production and output and the number of peripheral B cells.

Balboa, Luciana. "Alteraciones de las células presentadoras de antígenos en pacientes con tuberculosis pulmonar" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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La tuberculosis (TB) es considerada la segunda causa de muerte por infección, causando 1.7 millones de muertes al año. Se estima que un tercio de la población mundial está actualmente infectada con Mycobacterium tuberculosis (Mtb) y que sólo entre el 5‐10% de aquellos infectados desarrollarán la enfermedad, siendo desconocidos los mecanismos que conducen al establecimiento de la enfermedad tuberculosa latente o activa. El éxito de la infección depende principalmente de las estrategias de evasión de la respuesta inmune y de la capacidad de las células presentadoras de antígeno (CPA) de iniciar una eficiente respuesta. En este sentido, las células dendríticas (CD) son críticas para el desarrollo de la respuesta inmune antibacteriana y, por lo tanto, constituyen un blanco fundamental en la inmuno‐evasión inducida por Mtb. Nuestra hipótesis de trabajo es que durante la infección con Mtb se inducirían alteraciones en las CPA determinando la eficiencia de la respuesta inmune así como el curso de la infección; teniendo en cuenta esto, nuestro objetivo fue investigar las alteraciones en la generación de las CPA y su impacto en el desarrollo de la respuesta inmune en pacientes con TB. Para ello, caracterizamos el efecto de la bacteria sobre la diferenciación de monocitos (Mo) en controles sanos, observando que Mtb altera la diferenciación hacia CD a través de la secreción de IL‐10 y la activación de TLR‐2. Las células obtenidas presentaron baja expresión de receptores de entraba para la bacteria, baja capacidad de presentación de antígenos micobacterianos en el contexto de moléculas CD1 y mayor proliferación de clones T específicos de perfil TH2. Por otro lado, caracterizamos el fenotipo y la función de las CD obtenidas a partir de los Mo de pacientes con TB, las cuales presentaron alteraciones en la expresión de los marcadores típicos de CD así como una baja capacidad de presentación de antígenos micobacterianos. Finalmente, los Mo de los pacientes con TB mostraron un alto grado de activación y un enriquecimiento en la población de Mo CD16+, la cual fue previamente descripta como proinflamatoria. Esta población resultó ser menos eficiente para diferenciarse hacia CD y ha sido asociada a la severidad radiológica de la TB y a los niveles plasmáticos de TNF‐α, poniendo de manifiesto la relevancia clínica del hallazgo. En conclusión, en este trabajo de Tesis describimos un nuevo paso en la regulación de la respuesta inmune contra Mtb a través de la modulación de la capacidad de diferenciación de los Mo. Nuestros resultados amplian el conocimiento de los mecanismos involucrados en la evasión de la respuesta inmune ejercida por Mtb y, de ese modo, podrían contribuir al desarrollo de nuevos tratamientos y vacunas en esta enfermedad re‐emergente tanto a nivel local como mundial.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is the second most common cause of death from infectious diseases in the world and it causes an estimated 1.7 million deaths worldwide. Overall, one‐third of the world's population is currently infected with the TB bacillus (Mycobacterium tuberculosis) and 5‐10% of those infected individuals may develop TB disease. The exact mechanism leading to latent or acute TB disease is unknown, but it mainly depends on immune evasion strategies displayed by M. tuberculosis and the efficiency of the immune response initiated by antigen presenting cells (APC). As dendritic cells (DC) are critical for initiating a M. tuberculosis‐specific T‐cell response, they may represent a crucial target of M. tuberculosis immune evasion. Our hypothesis is that M. tuberculosis infection could induce alterations in APC, determining the outcome of the infection. Therefore, our aim was to evaluate the impact of M. tuberculosis infection on the generation of APC and on the host immune response. Thus, we characterized the effect of M. tuberculosis in the differentiation of monocytes (Mo) from healthy donors into DC. We determined that M. tuberculosis alters Mo differentiation through IL‐10 release and TLR‐2 activation, promoting the generation of cells with a low expression of M. tuberculosis pattern recognition receptors, a reduced specific CD1‐restricted lymphocytes proliferation, and a preferential polarization towards a TH2 pattern. In this line, the phenotype and function of DC from Mo in TB patients also showed alterations in DC loyal markers and a reduced antigenpresenting capacity. Finally, we found that circulating Mo from TB patients presented an activated phenotype with an enrichment of the proimmflamatory CD16+ subset, being this subset less prone to differentiate into DC. Moreover, the percentages of CD16+ Mo correlated with disease severity and with TNF‐α plasma levels, highlighting the clinical relevance of this finding. In conclusion, we have described a new step in the regulation of the immune response to M. tuberculosis through modulation of Mo differentiation. Our results may contribute to a better understanding of the immune evasion strategies of M. tuberculosis, therefore facilitating the development of effective therapeutic and prophylactic approaches for controlling M. tuberculosis infection.

Vota, Daiana Marina. "Eriptosis. Mecanismos involucrados y efecto protector de la eritropoyetina" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los procesos inflamatorios, frecuentemente asociados a anemia de enfermedades crónicas, podrían cumplir un rol en la inhibición de la eritropoyesis. La existencia de señales intracelulares comunes entre los procesos que regulan la eritropoyesis y la respuesta inflamatoria sugiere que la desregulación de un sistema podría explicar la disminución de la función del otro. Por otro lado, un daño directo sobre los eritrocitos maduros en circulación, causado por factores presentes en dichos procesos, podría contribuir también al desarrollo de anemia. Teniendo en cuenta que la identificación de factores que pueden afectar la sensibilidad de células eritroides a las diferentes señales recibidas permitiría conocer la interferencia de la inflamación en la eritropoyesis, se planteó como primer objetivo, dilucidar la interrelación entre diferenciación eritroide y apoptosis. Se observó una mayor sensibilidad de la línea eritroleucémica humana K562 a la acción proapoptótica de citoquinas proinflamatorias, como TNF-α e IL-1β, cuando las células se encontraban en etapa de diferenciación eritroide. El estudio de los mecanismos involucrados permitió sugerir, por primera vez, una posible explicación del efecto de TNF-α e IL-1β basada en la disminución de los niveles de la proteína antiapoptótica c-FLIP observada durante la diferenciación con hemina. Más aún, el tratamiento previo con el factor de crecimiento eritropoyetina (Epo) de las células inducidas a diferenciación eritroide las protegió de la acción proapoptótica a la vez que se detectó la modulación positiva de c-FLIP. La Epo contrarrestaría los cambios en las vías de señalización producidos durante el proceso de diferenciación eritroide permitiendo a las células mantener su resistencia a la apoptosis mediada por citoquinas proinflamatorias. Bajo ciertas circunstancias, eritrocitos maduros pueden sufrir autodestrucción prematura presentando alteraciones celulares similares a las de la apoptosis de una célula nucleada, razón por la que se denominó a este proceso eriptosis. Además de citoquinas, durante los procesos inflamatorios es frecuente encontrar incrementados los niveles de compuestos prooxidantes. Por ello, a continuación se enfocó el trabajo hacia la evaluación de un posible efecto directo de estos agentes sobre eritrocitos maduros. Se estudió el desarrollo de signos de eriptosis en los eritrocitos expuestos a citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β e IFN-γ) y a agentes prooxidantes (NaNO2 y H2O2). Se encontró que éstos pero no las citoquinas indujeron traslocación de fosfatidilserina (PS) en la membrana del eritrocito. Para investigar los posibles mecanismos involucrados en la autodestrucción prematura de los eritrocitos, se analizaron cambios morfológicos y bioquímicos en el glóbulo rojo expuesto a dos condiciones: aumento masivo de calcio intracelular y exposición celular a NaNO2 y H2O2. Además de la externalización de PS, los eritrocitos bajo ambos tratamientos mostraron un incremento del nivel intracelular de calcio, ambas características típicas del desarrollo de eriptosis. Sólo en el modelo de estrés oxidativo se observó, además, el incremento de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la disminución de glutation (GSH). La activación de la proteína PI3K parecería ser relevante en la eriptosis inducida por ambos modelos mientras que la activación de la fosfatasa PTP1B estaría favorecida en el modelo de sobrecarga de calcio. Las modificaciones de proteínas de membrana y los cambios en la morfología celular fueron también signos diferenciales entre ambos tratamientos. La Epo fue capaz de disminuir significativamente la inducción de la alteración en el estado redox celular por NaNO2 y H2O2. En cambio, no fue capaz de inhibir la traslocación de PS en el modelo de incremento de calcio. Las diferencias en los mecanismos involucrados en los dos modelos estudiados podrían explicar la acción diferencial de Epo sobre los eritrocitos inducidos a eriptosis por los diferentes agentes. En base a los resultados obtenidos y a otros trabajos realizados previamente en nuestro laboratorio, se decidió, en el siguiente paso, investigar si compuestos de aluminio pueden actuar como factores proeriptóticos. Experiencias in vivo e in vitro permitieron asociar la sobrecarga de aluminio con anemia. En este trabajo, se estudiaron mecanismos de acción del metal, utilizando un modelo de eritrocitos humanos sometidos a tratamiento prolongado in vitro con cloruro de aluminio. La aparición de eritrocitos con morfología anormal sugirió una interacción del metal con la superficie celular, sustentado por el hallazgo de elevada concentración de Al en la membrana celular. Se demostró que el Al induce signos de eriptosis, como externalización de PS, aumento de calcio intracelular y degradación de banda 3. El hallazgo de un incremento significativo de ROS en conjunto con una disminución de la concentración de GSH mostró un estado de estrés oxidativo. Un punto interesante es que la acción prooxidante del aluminio fue contrarrestada por la Epo. El hecho de que este resultado fuera similar a la prevención del desbalance óxido-reducción por la acción del antioxidante N-acetilcisteina (NAC), sugiere un rol antioxidante de la Epo. El efecto antieriptótico de la Epo podría contribuir a enriquecer el conocimiento acerca del rol fisiológico de esta hormona sobre células eritroides. Independientemente de cuál sea su mecanismo antioxidante, el efecto de Epo demostrado en este modelo de exposición a aluminio, así como en el modelo de estrés oxidativo, nos permite sugerir potenciales beneficios del tratamiento con la hormona en pacientes con anemia asociada a patologías con un ambiente redox alterado.

Abstract:
The first part of this study focused on the modulation of factors that would affect the sensitivity of erythroid differentiated cells to proinflammatory citokines, such as TNF-α and IL- 1β. The tumor necrosis factor alpha (TNF-α) affects a wide range of biological activities, such as cell proliferation and apoptosis. Cell life or death responses to this cytokine might depend on cell condition. Therefore, it was interesting to study whether erythroid differentiation may affect erythroid progenitors to apoptosis induced by proinflammatory cytokines. Hemin-differentiated K562 cells showed higher sensitivity to TNF-induced apoptosis than undifferentiated cells. At the same time, hemin-induced erythroid differentiation reduced c- FLIP expression. However, this negative effect was prevented by previous treatment with erythropoietin, which allowed the cell line to maintain c-FLIP levels. The results suggest that erythroid differentiation might deregulate the balance between growth promotion and death signals induced by TNF-α, depending on cell type and environmental conditions. The role of c-FLIP seemed to be critical in the protection of erythroid differentiated cells from apoptosis or in the determination of their sensitivity to TNF-mediated programmed cell death. Epo, which for the first time was found to be involved in the prevention of c-FLIP downregulation, proved to have an antiapoptotic effect against the proinflammatory factor. The identification of signals related to cell life/death switching would have significant implications in the control of proliferative diseases, and would contribute to the understanding of mechanisms underlying the anemia associated to inflammatory processes. Proinflammatory factors may not only affect the erythropoiesis process but also cause direct injury upon mature erythrocytes. Eryptosis is a process by which red blood cells can undergo self-destruction sharing several features with apoptosis. Since premature programmed erythrocyte death may be induced by different agents, in this work mechanisms involved in two eryptotic models (oxidative stress and cell calcium overload) were compared. Phosphatidylserine (PS) translocation and increased calcium content were common signs observed in erythrocytes exposed to sodium nitrite plus hydrogen peroxide or calcium ionophore A23187, while increased reactive oxygen species (ROS) and decreased reduced gluthation (GSH) levels were detected in the oxidative model. Protein kinase activation seemed to be an outstanding feature in eryptosis induced by oxidative stress whereas phosphatase activation was favored in the calcium overload model. Cell morphology and membrane protein alterations were also differential signs between both models. Erythropoietin was able to prevent cell oxidative unbalance, thus blunting PS translocation. However, the hormone favored intracellular calcium influx which could be the reason why it could not completely counteract the induction of eryptosis. Instead, erythropoietin was unable to inhibit PS externalization in the increased calcium model. The different mechanisms involved in the eryptotic models may explain the differential action of erythropoietin upon erythrocytes induced to eryptosis by different agents. Previous works developed in our laboratory suggested that aluminum compounds could be proeryptotic agents. The widespread use of aluminum provides easy exposure of humans to the metal and its accumulation remains a potential problem. In vivo and in vitro assays have associated Al overload with anemia and erythrocyte morphological and biochemical changes. To better understand the mechanisms by which aluminum affects human erythrocytes, these cells were exposed to long-term treatment with the metal using an in vitro model developed in our laboratory that mimic in vivo effects. The appearance of erythrocytes with abnormal shapes suggested metal interaction with cell surface, supported by the fact that high amounts of aluminum were found attached to cell membrane. Long-term incubation of human erythrocytes with Al induced signs of premature erythrocyte death (eryptosis), such as phosphatidylserine externalization, increased intracellular calcium, and band 3 degradation. Signs of oxidative stress, such as significant increase in ROS in parallel with decrease in the amount of GSH, were also observed. Interestingly, Epo protected erythrocytes from the prooxidative action of aluminum. Since this result was similar to that of the antioxidant N-acetylcysteine, it can be suggested an antioxidant ability of Epo. In conclusion, results provide evidence that chronic aluminum exposure may lead to biochemical and morphological alterations similar to those shown in eryptosis induced by oxidant compounds in human erythrocytes. The antieryptotic effect of Epo may contribute to enhance the knowledge of its physiological role on erythroid cells. Irrespective of the mechanism involved in its antioxidant action, this property of Epo shown in this model of aluminum exposure, let us suggest additional benefits of the Epo treatment in patients with anemia associated to altered redox environment.

Pérez Recalde, María Mercedes. "Polisacáridos del alga roja Nemalion helminthoides: caracterización, modificación química y actividad biológica" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La presente Tesis comprende cuatro temas principales: Estudio del sistema de polisacáridos del alga roja Nemalion helminthoides, familia Liagoraceae, orden Nemaliales. Se determinó que la matriz de la pared celular estaba compuesta: (i) mayoritariamente por α-D-(1→3)-mananos con unidades monosulfatadas en C-4 ó C-6, con un promedio de un grupo sulfato cada cuatro residuos, y un grado de polimerización de ~200; (ii) en menor proporción por α-D-(1→3)-mananos con ramificaciones simples de β-D-xilosa en C-2, de similar grado de sulfatación también en C-4 ó C-6, y peso molecular promedio de ~10 kDa; (iii) por xilanos neutros β-D- (1→3;1→4), de ~6 kDa. Por último, de pared fibrilar se aislaron (1→4)-β-D-xilanos neutros. Modificaciones químicas de las fracciones de mananos y xilomananos de Nemalion helminthoides. (i) A partir de los mananos nativos se generaron polisacáridos modificados con 43-50% de sulfatación, constituidos mayormente por unidades disulfatadas en C-2 y C-6 y de unidades trisulfatadas. (ii) A partir de las fracciones de xilomananos se obtuvieron, por degradación de Smith, derivados sin ramificaciones de xilosa. Estudio de actividad antiviral de fracciones nativas y modificadas de Nemalion helminthoides. Los xilomananos inhibieron in vitro al virus herpes simplex (HSV-1 y HSV-2) y al virus dengue (DENV-2) agregados durante la adsorción viral. Los mananos sobresulfatados inhibieron DENV-2 agregados durante la adsorción viral, y HSV-1 y HSV-2 colocados durante y/o después de la adsorción viral in vitro. Utilizando un modelo de infección intranasal de ratones BALB/c con HSV-2, los mananos sobresulfatados protegieron de la enfermedad en un 100% con una única dosis, por la misma vía. Evaluación de acción inmunomoduladora de polisacáridos de Nemalion helminthoides. Fracciones de xilomananos indujeron proliferación de linfocitos T humanos (línea H9) y macrófagos murinos (línea RAW). En macrófagos, además, estimularon la secreción de citoquinas proinflamatorias IL-6 y TNF-α y de óxido nítrico. La respuesta de citoquinas también se detectó en plasma de ratones BALB/c inyectados por vía intravenosa. Los animales tratados con xilomananos no desarrollaron la enfermedad al ser infectados, una hora después, con HSV-2.

Abstract:
This Thesis comprises four main topics: Study of the polysaccharide system from the red seaweed Nemalion helminthoides family Liagoraceae, order Nemaliales. It was determined that the cell wall matrix was composed: (i) mainly by α-D-(1→3)-mannans with monosulfated units at C-4 or C-6, one sulfate group every four residues, on average, and a polymerization degree of ~200; (ii) in minor amount by α-D-(1→3)-mannans with β-D-xylose at C-2, with similar sulfation degree at C-4 or C-6, and average molecular weigth of ~10 kDa; (iii) by neutral β-D-(1→3;1→4) mixed linkage xylans, of ~6 kDa. Finally, from the fibrillar wall, neutral (1→4)-β-D-xylans were isolated. Chemical modifications of mannan and xylomannan fractions from Nemalion helminthoides. (i) From the native mannans, oversulfated polysaccharides with a 43- 50% sulfation were prepared. These mainly constituted by disulfated units at C-2 and C- 6, and trisulfated units. (ii) From the xylomannan fractions, derivatives without xylose branches were obtained, by Smith degradation. Study of antiviral activity of native and modified fractions of Nemalion helminthoides. Xylomannans were inhibitors of herpes simplex virus (HSV-1 and HSV- 2) and dengue virus (DENV-2) in vitro when were added during viral adsorption. Oversulfated mannans were inhibitors of DENV-2 when were incorporated during viral adsorption, and HSV-1 and HSV-2 during and/or after viral adsorption in vitro. Oversulfated mannans were evaluated in BALB/c mice with intranasal infection with HSV-2, 100% of the mice receiving one dose were protected. Evaluation of immunomodulatory effect by Nemalion helminthoides polysaccharides. Xylomannans fractions were inductors of human T lymphocites (H9 line) and murine macrophages (RAW line) proliferation. Besides, this compounds were able to stimulate secretion of nitric oxide and cytokines (IL-6 and TNF-α) in macrophages. Cytokine response was also observed in BALB/c mice inoculated by intravenous route. Remarkably no illness was developed in mice treated with xylomannans fractions one hour before HSV-2 infection.

Morande, Pablo Elías. "Papel de la proteína eritrocitaria Banda 3 en la biología de las células de leucemia linfática crónica" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los pacientes con leucemia linfática crónica (LLC) suelen desarrollar anemia hemolítica autoinmune (AHA). Nuestro grupo demostró que la proteína Banda 3, la más abundante en la membrana del eritrocito y blanco frecuente de los autoanticuerpos en AHA, se une a la superficie de células LLC a través de su porción N-terminal. Esta tesis tuvo como objetivos centrales identificar el sitio de unión de Banda 3 y estudiar el impacto que dicha unión tiene para la célula leucémica. Los resultados demostraron que el principal sitio de unión de Banda 3 en la membrana de la célula leucémica es una proteína que se eluye a pH 2,5 y que se identificó como high mobility group N2 (HMGN2), proteína de nucleosomas que no había sido descripta en la membrana hasta el momento. La expresión de HMGN2 en la superficie de células LLC fue corroborada por citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. El cultivo con IFN-α incrementó la expresión de HMGN2 y la capacidad de unir Banda 3 de las células LLC. Asimismo, la unión de Banda 3 tuvo como consecuencia el aumento en la expresión de marcadores de activación de las células leucémicas. Proponemos que Banda 3 a través de HMGN2 podría favorecer la iniciación de la AHA en LLC.

Abstract:
Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) patients often develop autoimmune hemolytic anemia (AHA). Our group previously showed that Band 3, the most abundant protein in the outer membrane of red blood cells and a frequent target of autoantibodies in AHA, specifically binds the surface of CLL cells through its N-terminal domain. The main objectives of the present thesis work were to identify the binding site of Band 3 and to study the impact of such interaction in the leukemic cells. The results demonstrate that the major binding site of Band 3 on leukemic B cell membrane is a protein eluted at pH=2,5 that was identified as high mobility group N2 (HMGN2), a nucleosome-interacting protein which has not been previously reported as a membrane protein. Expression of HMGN2 at the surface of CLL cells was corroborated by flow cytometry and fluorescence microscopy. Cell cultures in the presence of IFN-α increased the expression of HMGN2 and the binding capacity of Band 3 to CLL cells. Additionally, binding of Band 3 resulted in an increased expression of activation markers on the leukemic cells. We propose that Band 3, through HMGN2, might favor the ignition of AHA in CLL.

Borge, Mercedes. "Leucemia linfocítica crónica de células B: el papel de las señales del microambiente en la patogénesis de la enfermedad" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células leucémicas de pacientes con Leucemia Linfocítica Crónica de células B (LLC) proliferan en los órganos linfoides, donde la quimiocina CXCL12 proveniente de células estromales y de células de tipo nodriza (NLC), y moléculas como CD40L e IFNγ producidas por linfocitos T CD4+ activados, favorecen su expansión y sobrevida. Existen numerosos estudios donde se evalúa el efecto del CXCL12 sobre el clon leucémico, pero no había sido estudiado hasta el momento el impacto de dicha quimiocina en la fisiología de los linfocitos T de pacientes con LLC. Los resultados presentados en este trabajo demuestran que el CXCL12 induce la migración de linfocitos T de pacientes LLC, aunque en menor medida que la de linfocitos T de dadores sanos, hecho que se correlaciona con una menor polimerización de actina en respuesta al CXCL12. Además, observamos que los linfocitos T de pacientes de buen pronóstico migran menos en respuesta al CXCL12 en comparación a linfocitos T de pacientes de mal pronóstico debido a señales provenientes del clon leucémico. También demostramos que el CXCL12 actúa como un factor coestimulante de linfocitos T CD4+ de pacientes LLC, incrementando su activación y proliferación, y que los linfocitos T activados en presencia de CXCL12 inducen una mayor proliferación del clon leucémico. Por último, demostramos que las NLC contactan con linfocitos T CD4+ y aumentan su activación y proliferación, en parte, a través del receptor para CXCL12, el CXCR4. Como conclusión, nuestros resultados demuestran que el CXCL12 tiene un rol dual sobre los linfocitos T de pacientes LLC, induciendo la migración y también aumentando su activación y proliferación, favoreciendo en última instancia la expansión del clon leucémico. Considerando que la presencia de los linfocitos T en los órganos linfoides favorece que las células leucémicas sobrevivan y proliferen, la menor migración al CXCL12 de los linfocitos T de pacientes de buen pronóstico podría estar involucrada en el curso clínico indolente característico de esos pacientes.

Abstract:
Leukemic cells from patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) proliferate in lymphoid organs in close contact with activated T cells and CXCL12`s producer stromal and nurse like cells (NLC). CD4+ T cells induce CLL cell proliferation and survival mainly trough CD40L and IFNγ production, and CXCL12 enhances CLL survival. While a number of reports have evaluated the impact of CXCL12 on the leukemic clone, there is no information about the role of this chemokine in T cell physiology. Our results here show CXCL12 induces the migration of T cells from CLL patients, although in a lesser extend than T cells from healthy donors. The low migratory response of T cells from CLL patients was correlated with an actin polymerization defect in response to CXCL12. Moreover, we found that T cells from CLL patients with good prognosis have a lower migratory response to CXCL12 than T cells from CLL patient with worst prognosis, due to signals delivered by leukemic cells. We also found that CXCL12 costimulates the activation and proliferation of activated CD4+ T cell from CLL patient, and that activated T cells in the presence of CXCL12 enhance the activation and proliferation of the leukemic clone. Finally we demonstrated that autologous NLC establish a close contact with CD4+ T cells and increase their activation and proliferation partially through a CXCR4-dependent mechanism. In conclusion, our results suggest that CXCL12 production by lymphoid tissue microenvironment in CLL patients might play a key dual role on T cell physiology, functioning not only as a chemoattractant but also as a costimulatory factor for activated T cells, which finally improves CLL cell proliferation. Since T cells in lymphoid organs may help CLL cells to survive and proliferate, the low migratory response to CXCL12 in T cells from CLL patients with good prognosis might favor the indolent clinical course of the disease in these patients.

Alvarez, Ivana Belén. "Estudio del rol de la vía de PD-1 sobre la respuesta inmune de células Nk y de los mecanismos inmunológicos inducidos por las células Th9 frente a la infección por M. tuberculosis" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Estudio del rol de la vía de PD-1 sobre la respuesta inmune de células NK y de los mecanismos inmunológicos inducidos por las células Th9 frente a la infección por M. tuberculosis La tuberculosis continúa siendo un grave problema de salud a nivel mundial a pesar de los tratamientos disponibles. Se estima que un tercio de la población mundial se encuentra infectada de manera asintomática con Mycobacterium tuberculosis, constituyendo un enorme reservorio de la bacteria. Ante eventos de inmuno-supresión, esos individuos pueden desarrollar enfermedad activa y transmitirla. La respuesta inmune frente a M. tuberculosis, requiere la inducción de un perfil de citoquinas de tipo Th1, donde el IFN-γ posee un rol fundamental. Sin embargo, actualmente se sabe que el IFN-γ no sería suficiente para controlar y erradicar completamente al patógeno del organismo hospedero. Por ello, resulta de crucial importancia para el desarrollo de nuevos tratamientos, vacunas y métodos de diagnóstico, conocer las bases moleculares y celulares que conllevan a la generación del correcto balance de poblaciones celulares efectoras durante la respuesta inmune contra el microorganismo. Así como dilucidar la interacción de proteínas específicas de la bacteria con las células del hospedero y, más aún, los mecanismos moleculares que involucran estas interacciones. Por lo mencionado, en este trabajo se investigó el rol de ciertas citoquinas, moléculas coestimulatorias e inmunomoduladores sobre las funciones efectoras de células NK y de linfocitos T durante la tuberculosis activa. Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron que la molécula coestimulatoria PD-1 inhibe la respuesta de citoquinas Th1 frente a M. tuberculosis. Sin embargo, el rol de este receptor en la respuesta inmune innata durante la tuberculosis se desconocía. Por ello, en este trabajo se evaluó la expresión y función de los miembros de la vía de PD-1 en las células NK de pacientes con tuberculosis activa. Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron por primera vez que las células NK humanas expresan constitutivamente los tres miembros de esta vía de señalización: el receptor PD-1 y sus dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. Más aún, demostramos que la estimulación con antígeno de M. tuberculosis incrementa la expresión de estas tres moléculas en células NK y que la señalización a través de las mismas inhibe la producción de IFN-γ y la citotoxicidad de estas células. A su vez, los datos obtenidos en este trabajo demostraron que M. tuberculosis induce la expansión de células T productoras de IL-9 con fenotipo característico de la subpoblación linfocitaria Th9. De acuerdo a nuestros resultados, la IL-9 producida colaboraría en la generación de un perfil Th1 durante la enfermedad activa, promoviendo así la producción de IFN-γ frente a M. tuberculosis. Finalmente, estudiamos la interacción de la proteína específica de M. tuberculosis, ESAT-6, con células T humanas y el efecto de ESAT-6 sobre la producción de IL-9 durante la tuberculosis humana. Caracterizamos la cinética de esta interacción y además identificamos tres proteínas linfocitarias que interactúan con ESAT-6. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el uso de anticuerpos bloqueantes y agonistas podría tener importantes implicancias en potenciales terapias para combatir infecciones bacterianas crónicas como la tuberculosis. Por otro lado, demostramos que ESAT-6 se une a linfocitos T humanos, ingresa a las células e interacciona con proteínas involucradas en el procesamiento y en la estabilidad de ARNm específicos. Este podría entonces tratarse de un mecanismo por el cual ESAT-6 modularía las funciones efectoras de linfocitos T, como lo es la producción de citoquinas, como factor de virulencia o mecanismo de evasión de la respuesta inmune por parte del patógeno.

Abstract:
Study of the role of the PD-1 pathway on the NK cell immune response and of the immunological mechanisms induced by Th9 cells against M. tuberculosis infection. Tuberculosis remains to be a serious health problem worldwide despite available treatments. One third of the world population is estimated to be infected with Mycobacterium tuberculosis in a latent but asymptomatic way; constituting a huge reservoir for the bacteria. In the event of immuno-suppression, those individuals can develop active disease and transmit it. The immune response against M. tuberculosis requires the induction of a Th1 cytokine profile, where IFN-γ plays a fundamental role. However, it is now known that IFN-γ is not sufficient to control and to completely eradicate the pathogen the host. Because of this it is of crucial importance for the development of new treatments, vaccines and diagnostic methods, knowing the molecular and cellular basis that leads to the generation of a correct balance among effector cell populations during the immune response against the microorganism, as well as elucidating the interaction of specific proteins from the bacteria with the host cells and even more, the mechanisms that this interactions involve. Based in the mentioned before, in this work we investigated the role of cytokines, costimulatory molecules and immunemodulators on the efector functions of NK cells and T lymphocytes during the human tuberculosis. Previous results from our laboratory showed that the co-stimulatory molecule PD-1 inhibits the Th1 response against M. tuberculosis. But the role of this receptor in the innate immune response against tuberculosis was so far unknown. Therefore, this study evaluated the expression and function of members of the PD-1 pathway on NK cells against M. tuberculosis. We show here for the first time, that human NK cells constitutively PD-1 receptor and its two ligands, PD-L1 and PD-L2. Moreover, we demonstrated that M.tuberculosis induces an increase in the expression of these molecules by NK cells and that signaling through this receptor inhibits the two main effector functions of NK cells, production of IFN-γ and cytotoxicity. In addition, the expression of PD-1 correlates directly with the production of IFN-γ. In this work, we also reported that M. tuberculosis significantly induces IL-9-producing cells which have all the characteristics of the Th9 cell subset. According to our results, IL-9 would collaborate in the generation of a Th1 profile during active disease, promoting the production of IFN-γ against M. tuberculosis. Finally, we studied the interaction of the M. tuberculosis specific protein, ESAT-6, with human T cells and ESAT-6 modulation of IL-9 production during human tuberculosis. We characterized the kinetics of the interaction and we were able of identify three lymphocytic proteins that interact with ESAT-6. Overall, the results of this study demonstrate that the use of blocking antibodies and agonists may have important implications for potential therapies for chronic bacterial infections such as tuberculosis. We also demonstrated that ESAT-6 binds to human T cells, enters the cells and interacts with proteins that are involved in the processing and stabilization of specific mRNA. This could comprise a mechanism by which ESAT-6 could modulate T cell effector functions, as cytokine production, acting as a virulence factor or as an immune evasion mechanism of the bacteria.

Romanutti, Carina. "Evaluación de la respuesta inmune inducida por distintos inmunógenos recombinantes dirigidos contra el Virus de la Fiebre Aftosa" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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El objetivo del presente trabajo de tesis fue, emplear distintos sistemas de expresión para el desarrollo de vacunas recombinantes y de estrategias de vacunación contra el virus de la fiebre aftosa (VFA). Se trabajó con vacunas derivadas de vectores virales no replicativos (Adenovirus y Herpesvirus) y vacunas génicas (pCI). El antígeno utilizado fue la poliproteína P1, cuyos subproductos son las proteínas capsidales virales, junto con la proteína 2A y la proteasa 3C, del serotipo O1/Campos del VFA. Con las vacunas recombinantes disponibles (HSV-P12A3C, Ad-P12A3C y pCI-P12A3C) y una vacuna convencional a virus inactivado (VFAi) en formulación oleosa, se procedió a estudiar la respuesta inmune generada, utilizando estrategias de tipo prime-and-boost homólogo y heterólogo en un modelo murino. En general, la vacunación heteróloga con vectores virales fue más efectiva que la homóloga, en inducir una respuesta inmune α-VFA, tanto humoral como celular. Los títulos más altos de anticuerpos (Acs) específicos correspondieron a los animales vacunados con 2 dosis de VFAi, pero los ratones primados con Ad-P12A3C que recibieron una dosis de refuerzo con HSV-P12A3C o VFAi, también indujeron títulos significativamente más altos que los otros grupos analizados. Los regímenes de inmunización con vectores virales generaron respuestas con predominio de Acs de isotipo IgG2a, sugiriendo un sesgo hacia una respuesta de tipo Th1, mientras que en la inoculación con 2 dosis de VFAi se generaron altos niveles de Acs con predominio de isotipo IgG1. Estos resultados fueron confirmados por la evaluación de las citoquinas inducidas (IL-2, IFNγ e IL-4). En los ensayos de desafío no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de protección, entre el esquema de dos dosis de vacuna convencional frente a una dosis de vacuna vectorial con un refuerzo de HSV-P12A3C o VFAi. Por otra parte, la re- exposición de los distintos grupos inmunizados al virus inactivado a los 5 meses, generó un rápido aumento de los anticuerpos específicos α-VFA en todos los grupos, demostrando la presencia de células B de memoria, funcionales in vivo. En este mismo tiempo post vacunación, los ratones inmunizados con la combinación Ad-P12A3C/HSV-P12A3C fueron capaces de reducir la viremia post desafío en un 100%. Es decir que esta combinación de inmunógenos resultó efectiva para desencadenar una respuesta inmune protectiva a mediano plazo contra el VFA en ratones adultos.

Abstract:
In the present work, different recombinant vaccine candidates and vaccination regimes against foot-and-mouth disease virus (FMDV) were tried. The antigen used was the P1 polyprotein, which includes the viral capsid proteins. Defective vectors derived from heterologous virus (adenovirus and herpesvirus) and a classic genetic DNA vector (pCI) carrying these sequences were constructed. To characterize the immune responses, a well known murine model was used. BALB/c mice were immunized following a prime-and-boost delivery system combining the different vaccine candidates (HSV-P12A3C, Ad-P12A3C, and pCI-P12A3C) and the inactivated adjuvanted virus (FMDVi), mimicking the conventional vaccine. The heterologous prime-and-boost regimes resulted in more effective humoral and cellular immune responses than the homologous viral vector boosting. The highest antibody titers corresponded to the groups vaccinated with 2 doses of inactivated virus, but significant high titers were also obtained when mice primed with Ad-P12A3C were boosted either with HSV-P12A3C or FMDVi. The predominat presence of antibodies of the IgG2a isotype and increased levels of mRNA of IL-2 e INFγ was detected in the groups immunized with the viral vectors, suggesting a Th1 response, while inoculation with conventional vaccine generated high antibodies titers of the IgG1 isotype. No difference was found in protection from challenge with live O1/Campos virus, between animals vaccinated with inactivated virus or primed Ad-P12A3C and boosted either with HSV-P12A3C or FMDVi. The rapid induction of specific antibodies and antibody secreting cells in animals re-exposed to FMDV 5 months later, suggest that B memory and plasmatic cells were functional in vivo. At the same time point after vaccination, mice vaccinated with the combination Ad-P12A3C/HSV-P12A3C were 100% protected from viral challenge, suggesting that this combination was effective to elicit a protective immune response in the medium term against FMDV in adult mice.

Argüello, Rafael José. "Mecanismos de regulación negativa de la respuesta inmune en pacientes con enfermedad de Chagas" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enfermedad de Chagas es causada por el parásito protozoario intracelular Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y afecta alrededor de 10 millones de personas. Aproximadamente un 20 a 30% de los sujetos crónicamente infectados muestran la progresión a miocardiopatía, después de padecer infección asintomática durante un período de años a décadas. La miocardiopatía de la enfermedad de Chagas es la causa más frecuente de miocardiopatía infecciosa en el mundo. Las respuestas inmunes mediadas por células CD8 y células T CD4 son cruciales para el control de esta infección crónica. En el pasado, debido a la escasez de los parásitos en el corazón, prevaleció la hipótesis de que la miocarditis chagásica crónica era atribuible exclusivamente a reacción cruzada autoanticuerpos al tejido cardiaco, y que la presencia del parásito era dispensable para la inflamación y fisiopatogénesis. Esta idea, en combinación con la elevada toxicidad y la falta de estudios controlados sobre la eficacia del tratamiento, exacerbó el escepticismo sobre la conveniencia de un tratamiento antiparasitario durante la infección crónica. Este escepticismo se mantuvo hasta finales de la década de los 90. Por otra parte, las pruebas serológicas convencionales pueden mantenerse positivas durante años o incluso décadas después de tratamiento antiparasitario exitoso y los resultados de un ensayo clínico doble ciego controlado con placebo para determinar la eficacia del tratamiento benznidazol no están disponibles actualmente. En el presente trabajo hemos estudiado los mecanismos inmunoregulatorios presentes en células T de sangre periférica, específicas o no contra T. cruzi y también en el corazón de pacientes humanos infectados con este parásito. Así mismo evaluamos el impacto del tratamiento tripanocida (benznidazol) sobre, la expresión de las moléculas de inmunoregulatorias y sobre los niveles de subpoblaciones de células T (ítems 1, 2 y 3). 1) Caracterización funcional de moléculas inmunoregulatorias y producción de citoquinas por parte de linfocitos T específicos contra T. cruzi. 2) Evaluación del impacto del tratamiento con benznidazol en subpoblaciones de linfocitos T en pacientes con infección crónica. 3) Composición celular, grado de diferenciación celular y perfil funcional de las células reclutadas hacia el corazón de pacientes con miocarditis crónica de Chagas. 1) Caracterización funcional de moléculas inmunoregulatorias y producción de citoquinas por parte de linfocitos T específicos contra T. cruzi. En los individuos infectados, más del 80% de los linfocitos T específicos contra el parásito productores de IFN-γ, presenta expresión del receptor inhibitorio CTLA-4, pero no de LIR-1. Por el contrario, en los mismos sujetos los linfocitos T específicos contra antígenos de la vacuna TetaDif productores de IFN-γ, no expresan ni CTLA-4 (3%), ni LIR-1 (5%). Además demostramos que la expresión de CTLA-4 en células T específicas contra T. cruzi tiene consecuencias funcionales, debido a la activación de CTLA-4 conduce a la disminución de la producción de IFN-γ en respuesta a antígenos de parásitos. Interesantemente, detectamos expresión de CTLA-4 en linfocitos T en el corazón de pacientes con miocarditis chagásica crónica. Luego de la activación policlonal, la expresión de CTLA-4 aumenta en mayor medida en pacientes sintomáticos en comparación con la inducción de la misma en sujetos asintomáticos y no infectados (P<0,001). La expresión de este receptor inhibitorio en células T específicas contra el parásito en repetidas ocasiones durante la exposición antigénica crónica, podría resultar en el agotamiento immunológico observado en el compartimento total de células T después de 10-20 años de la infección inicial. 2) Evaluación del impacto del benznidazol en subpoblaciones de linfocitos T que se encuentran aumentadas en pecientes crónicamente infectados. La administración del fármaco tripanocida en adultos con infección crónica por T. cruzi induce una disminución temprana, duradera y significativa (5 años de seguimiento) en los niveles de linfocitos T altamente diferenciados, los cuales vuelven a niveles normales. Este cambio se observa en la mitad (7 de 14) de los individuos infectados tratados, pero en ninguno de los individuos infectados no tratados seguidos en el tiempo (0 de 12). La serología convencional acompaña a la disminución de los CD4 + LIR-1 + obtenido en los primeros tiempos después del tratamiento y, por tanto constituiría un marcador precoz subrogante de la eficacia del tratamiento. 3) Composición celular, grado de diferenciación celular y perfil funcional de las células reclutadas hacia el corazón de pacientes con miocarditis crónica de Chagas. Con el fin de caracterizar los tipos celulares presentes y su posible rol durante la miocarditis de la enfermedad de Chagas, se analizaron la composición celular (i.e. CD3, CD4, CD8, CD20, CD21, CD68, CD57), la expresión de moléculas coestimuladoras (i.e. CD27), receptores inhibitorios (i.e. HLA-G, PD-1, CTLA-4), factores de transcripción de TH1 o células T reguladoras (i.e. Tbet, FOXP3), marcadores de senescencia (i.e. CD57, CD45RA) y un marcador de ciclo celular activo (i.e. Ki67). 3a. El porcentaje de células T (CD3 + , CD4 + y CD8 + células) se encuentra incrementado significativamente en las regiones con mayor grado de inflamación (hasta 70% del total infiltrado). Por el contrario, el porcentaje de macrófagos (% CD68 + ) fue similar en regiones de alto y bajo nivel de infiltración (20% del infiltrado). Por otro lado, las células B (i.e. células CD20 + ) se observaron sólo en algunas áreas con alto grado de inflamación y en bajo porcentaje (i.e. mediana, rango; 2%, 0-13%). 3b. La mayoría de los linfocitos infiltrantes mostraron expresión de CD45RO y CD27, marcadores de células con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación. Por el contrario, la expresión de PD-1, CD57 y CD45RA fue muy baja o ausente en el corazón de pacientes con enfermedad de Chagas independientemente del grado de miocarditis. 3c. La expresión del factor de transcripción maestro de TH1, Tbet, se observó en una importante proporción de células durante la miocarditis chagásica. En contraste, el nivel de células T reguladoras (i.e. FOXP3 + ) mostró ser escaso. Se observaron altos niveles del células expresando el marcador del ciclo celular activo, Ki67, las cuales a su vez resultaron coexpresar CD3, pero no CD8. 3d. Mediante un análisis de estadística de dos dimensiones pudimos demostrar la infección del miocardiocito humano durante el curso natural de la infección induce un reclutamiento eficiente de linfocitos T con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación (i.e. CD45RO + CD57 – ). En resumen, hemos encontrado que las células T reclutadas por el corazón infectado de pacientes con Chagas miocarditis poseen bajo grado de diferenciación y un fenotipo similar al de los linfocitos T específicos contra T. cruzi en presentes en sangre periférica. Además, se observó que las células T proliferarían in situ, y que los linfocitos T con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación son reclutadas por los miocitos infectados de manera eficiente.

Abstract:
Chagas disease, caused by the intracellular protozoan parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi), affects around 10 million people. An estimated 20 to 30% of the chronically infected subjects show progression to cardiomyopathy, after being asymptomatic for a period of years to decades. Chagas heart disease is the most frequent cause of infectious cardiomyopathy in the world. Immune responses mediated by CD8 and CD4 T cells are crucial for the control of this chronic infection. In the past, due to the scarcity of parasites in the heart, it was hypothesized that chronic chagasic myocarditis was exclusively attributable to cross-reacting autoantibodies to cardiac tissue and that the presence of the parasite was unnecessary for pathogenesis. This belief, in combination with the high toxicity of treatment and lack of treatment efficacy tests led to skepticism about the convenience of antiparasitic treatment for chronic T. cruzi infection, which persisted until late 1990s. Moreover, conventional serologic assays remain positive after years or even decades after successful treatment and results of a double-blind placebo controlled clinical trial to determine benznidazole treatment efficacy are not available. During my thesis I studied immunoregulatory mechanisms in total peripheral T cells, T. cruzi- specific T cells, and also in heart infiltrating cells from infected human patients. I was able to evaluate the impact of trypanocidal treatment (benznidazole) on the expression of immunoregulatory molecules and T cell subsets in the blood and heart of these patients (item 1, 2, and 3). In order to contribute to the progress towards drug discovery in this neglected and poverty related disease, I developed an automatized method for highthroughput screenings of drugs against trypanosome parasites. 1) Evaluation of the impact of benznidazole treatment in T cell subsets that are increased in chronically infected subjects. 2) Functional characterization of immunoregulatory molecules and cytokine production by T. cruzi-specific T cells from peripheral blood of infected subjects. 3) Cellular composition, grade of differentiation and functional profile of cells recruited by the heart of patients with chronic Chagas myocarditis. 1) Evaluation of the impact of benznidazole on T cell subsets that are increased in chronically infected subjects. Trypanocidal drug administration in chronically infected adults induces a significant, early and long lasting (5 years of follow-up) decrease on highly differentiated effector T cells that return to normal levels. This change is observed in half (7 out of 14) of the infected individuals but in none of their untreated counterparts (0 out of 12). Conventional serology accompanies the decrease in CD4 + LIR-1 + obtained at earlier times after treatment and thus would constitute an early surrogant marker of treatment efficacy. 2) Functional characterization of immunoregulatory molecules and cytokine production by T. cruzi-specific T cells from peripheral blood of infected subjects. More than 80% of the IFN-γ producing T. cruzi-specific T cells from chronically infected patients show high expression of the inhibitory receptor CTLA-4, but not LIR-1. In contrast, IFN-γ-producing vaccine antigen-specific T cells from the same infected subjects do not express neither CTLA-4 (3%), nor LIR-1 (5%). We demonstrated that CTLA-4 expression in T.cruzi-specific T cells has functional consequences, because activating CTLA-4 leads to decreased IFN-γ production in response to parasite antigens. Moreover, the expression of CTLA-4 was observed in T cells in the heart of patients with chronic Chagasic myocarditis. Interestingly, we found that after policlonal activation, CTLA-4 expression was more significantly increased (P<0.001) in symptomatic subjects in comparison with asymptomatic and uninfected subjects. The expression of this inhibitory receptor in parasite specific T cells in conjunction with the chronic antigenic exposure could result in the observed exhaustion of the total T cell compartment after 20-40 years of the initial infection. 3) Cellular composition, grade of differentiation and functional profile of the cells recruited by the heart of patients with chronic Chagas myocarditis. In order to determine their role in the pathogenesis of chronic Chagas heart disease, we analyzed the cellular composition (CD3, CD4, CD8, CD20, CD21, CD68, CD57), the expression of co-stimulatory molecules (CD27), inhibitory receptors (HLA-G, PD-1, CTLA-4), transcription factors of TH1 or regulatory T cells (Tbet, FOXP3), senescence (CD57, CD45RA) and active cell cycle markers (Ki67). 3a. The percentage of T cells (CD3 + , CD4 + and CD8 + cells) are highly increased in regions with the highest degree of inflammation (up to 70% of the total infiltrate). Conversely, the percentage of macrophages (%CD68 + cells) was similar in regions with high and low level of infiltration (20% of the infiltrate). On the other hand, B cells (CD20 + cells) were only observed in some areas bearing high degree of inflammation (Median, range; 2%, 0-13%). 3b. Most heart infiltrating T cells showed CD45RO and CD27 expression, markers of antigen experienced T cells with low grade of differentiation. In contrast, PD-1, CD57 and CD45RA expression were absent, being this in agreement with the absence of terminally differentiated effector T cells and NKs in the heart of Chagas disease patients. 3c. TH1 (Tbet) were highly abundant during Chagas myocarditis. In contrast, regulatory T cells were scarce (FOXP3 + ). Cells expressing high levels of the active cell cycle marker, Ki67, showed CD3 expression but lacked CD8. 3d. Using two dimensional statistics I demonstrated that in-vivo infected human cardiac myocytes efficiently recruit antigen experienced (CD45RO + CD57 – ) T cells with low grade of differentiation. In summary, we found that T cells recruited by the infected heart of patients with Chagas myocarditis bear low grade of differentiation and a strikingly similar phenotype to T. cruzi- specific T cells present in peripheral blood. Moreover, we determined that T cells proliferate in situ, and that antigen experienced T cells are more efficiently recruited than other mononuclear cells by the infected myocytes (2-Dimensional statistics and Monte-Carlo simulations).

Bolcic, Federico Martín. "Coinfección HIV-Hepatitis C: análisis molecular de factores genéticos del HCV que influyen sobre la respuesta al interferón" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de la hepatitis C y el HIV comparten las mismas vías de transmisión, lo que conlleva a una elevada tasa de coinfección. En este escenario, la tasa de respuesta al peg-IFN+RBV es más baja que en pacientes monoinfectados con HCV. El objetivo central de este trabajo fue estudiar si diferentes proteínas del HCV, estructurales (E2) y no estructurales del HCV (NS5A), son capaces de interrumpir las acciones antivirales desencadenadas por el IFN, contribuyendo hacia una respuesta disminuida a la terapia. El genotipo de HCV implicado en la infección denotó una prevalencia elevada del 1a así como un crecimiento del 4. Ambos son conocidos por su baja tasa de respuesta al IFN. Se encontró una relación temporal en la introducción en Argentina del genotipo 1a del HCV y el subtipo BF de HIV. La glicoproteína E2 no dio evidencia de rol alguno en la respuesta al tratamiento. Dominios definidos de la proteína NS5A arrojaron resultados encontrados dependiendo de la población bajo estudio. La co-presencia de HIV no parece impactar en la génesis de variantes de escape de HCV, ni modificar la composición de cuasiespecies. No obstante el HCV tendría capacidad replicativa en sitios extrahepáticos aunque las variantes virales halladas en células mononucleares de sangre periférica no exhibieron diferencias con las presentes en plasma. La menor respuesta al tratamiento con peg-IFN+RBV en la coinfección guardaría relación con la mayor presencia de genotipos 1a y 4. La proteína NS5A podría contribuir en tal sentido. Es necesario analizar el rol que desempeñan factores inherentes al hospedador.

Abstract:
The HIV and HCV share the same transmission routs which lead to a high prevalence of coinfection. In this scenario, the rate of response to peg-IFN + RBV is lower than in HCV monoinfected patients. The aim of this work was to analyze whether different HCV proteins, structural (E2) and nonstructural HCV (NS5A), are able to disrupt viral actions triggered by IFN, contributing to a decreased response to therapy. The HCV genotype infection epidemiology denoted that the most prevalent was 1a and growth of 4. Both are known for their low response rate to IFN. We found a temporal relationship in the introduction in Argentina of HCV genotype 1a and BF subtype of HIV. The E2 glycoprotein gave no evidence of any role in the response to treatment. Defined domains of the NS5A protein yielded results depending on the population under study. The co-presence of HIV does not appear to impact the selection of HCV resistant variants, or modify the composition of quasispecies. However, the HCV may have replicative capacity in extrahepatic compartments but viral variants found in peripheral blood mononuclear cells did not differ with those present in plasma. The lower response to treatment with peg-IFN + RBV in HIV coinfected patients would be related to the increased presence of genotypes 1a and 4. NS5A protein could contribute to this effect. It is necessary to analyze the role that factors inherent to the host.

Chiarella, Paula. "Estrategias de inmunoterapias contra tumores murinos durante el estado de inmunosupresión inducido por el tumor" (2012-02-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Aunque los animales pueden ser inmunizados contra el crecimiento de algunos tumores, la mayoría de los intentos por aplicar estas inmunoterapias para causar la regresión en tumores humanos y de animales una vez que estos se encuentran establecidos no has sido exitosos, aun cuando los tumores son fuertemente inmunogénicos. En esta tesis, nosotros demostramos que el inicio de la refractariedad a los tratamientos inmunológicos coincidió con el comienzo de un estado de inmunosupresión conocido como “eclipse inmunológico” caracterizado por una pérdida o bloqueo de la respuesta inmune antitumoral después que el tumor ha superado cierto volumen crítico (500 mm3). A su vez el inicio del eclipse se correspondió con el comienzo de un proceso de inflamación sistémica progresiva caracterizado por un aumento en el número de neutrófilos circulantes y en bazo, un alto número células mieloides inmaduras (GR1/CD11b) y una elevada concentración sérica de citoquínas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β e IL-6, proteína C reactiva y proteína A Amieloide. En ratones portadores de tumor, la aplicación de una sola dosis (0.75 mg/Kg) de un corticoide sintético como la dexametasona (DX) redujo significativamente los parámetros de inflamación sistémica y revirtió simultáneamente el eclipse inmunológico, lo cual fue demostrado por la recuperación de ciertos indicadores de respuesta inmune antitumoral. Otros dos tratamientos anti-inflamatorios (inodmetacina o receptor para TNF-α) revirtieron parcialmente el eclipse inmunológico, aunque el efecto no fue tan efectivo que el observado con DX. La reversión del eclipse inmunológico no fue suficiente por si solo para inhibir el crecimiento de un tumor primario. Sin embargo, cuando usamos la estrategia de dos pasos inoculando DX para revertir el eclipse inmunológico y células dendríticas (CDs) estimuladas con antígeno tumoral, como un Booster de inmunización, se observó una inhibición significativa tanto en el crecimiento de tumores establecidos como en células remanentes luego de una operación de un tumor grande establecido, a pesar de que la vacunación con CDs solamente no tuvo efecto o incluso, a veces, produjo un aumento del crecimiento tumoral. Asimismo, cuando a la estrategia de dos pasos le adicionamos un tratamiento adicional (transferencia pasiva de linfocitos näive o administración de ATRA), si bien se observó una mayor inhibición del crecimiento de los tumores, la sobrevida de los animales no fue significativa. Por lo tanto, los datos presentes en esta tesis demuestran que es necesario eliminar o mejorar el eclipse inmunológico como condición previa para permitir que una terapia inmunológica anti-tumoral pueda ser efectiva.

Abstract:
Although animals can be immunized against the growth of some tumor implants, most of the attempts to use immunotherapy to cause the regression of animal and human tumors once they have become established have been disappointing even when strongly immunogenic tumors were used as target. In this paper, we demonstrate that the failure to achieve an efficient immunological treatment against an established strongly immunogenic murine fibrosarcoma was paralleled with the emergence of a state of immunological unresponsiveness (immunological eclipse) against tumor antigens observed when the tumor surpassed the critical size of 500 mm3. In turn, the onset of the immunological eclipse was coincidental with the onset of a systemic inflammatory condition characterized by a high number of circulating and splenic polymorphonucleated neutrophils displaying activation and myeloid suppressor cell (Gr1/CD11b) and an increasing serum concentration of the proinflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 cytokines and C-reactive protein and serum A amyloid phase acute proteins. Treatment of tumor-bearing mice with a single low dose (0.75 mg/kg) of the synthetic corticoid dexamethasone (DX) significantly reduced all the systemic inflammatory parameters and simultaneously reversed the immunological eclipse. Two other antiinflammatory treatments by using indomethacin or dimeric TNF-α receptor, also partially reversed the immunological eclipse although the effect was not as striking as that observed with DX. The reversion of the immunological eclipse was not enough on its own to inhibit the primary growing tumor. However, when we used the two-step strategy of inoculating DX to reverse the eclipse and then dendritic cells loaded with tumor antigens (CDs) as an immunization booster, a significant inhibition of the growth of both established tumors and remnant tumor cells after excision of large established tumors was observed, despite the fact that the vaccination alone (CDs) had no effect or even enhanced tumor growth in certain circumstances. Also, when we add an additional treatment (passive transfer of naive lymphocytes or administration of ATRA), although there was a greater inhibition of tumor growth, but survival was not significant. Therefore, these data that we present is based on the rationale that it is necessary to eliminate or ameliorate the immunological eclipse as a precondition to allow an otherwise ineffective anti-tumor immunological therapy to have a chance to be successful.

Gabelloni, María Laura. "Mecanismos moleculares involucrados en la secreción de IL-1ß por los neutrófilos humanos" (2012-03-09) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La interleuquina-1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos, sintetizada como un precursor (proIL-1β) que debe ser procesado proteolíticamente para la generación de su forma activa. En esta Tesis determinamos que los neutrófilos humanos altamente purificados liberan IL-1β en respuesta a estímulos infecciosos como el lipopolisacárido (LPS) y estériles, como los cristales de urato monosódico (MSU), así como también frente al primado con LPS y posterior estimulación con ATP. Los efectos de inhibidores específicos y la capacidad de los agonistas de inducir la activación de la caspasa-1 sugirieron que la secreción de IL-1β es dependiente de caspasa-1 y de las serinproteasas elastasa y/o proteinasa 3. Nuestros hallazgos realizados con neutrófilos de pacientes incapaces de activar a la enzima generadora de intermediarios reactivos del oxígeno (IRO) NADPH oxidasa, con una línea celular neutrofílica carente de actividad de esta enzima, y con un inhibidor específico de la misma, sugirieron que el evento de secreción de IL-1β madura de la célula requiere de la actividad de la NADPH oxidasa. Sin embargo, el procesamiento de la proIL-1β es regulado negativamente por los IRO, los cuales ejercen un efecto inhibitorio sobre la caspasa-1. Esta compleja regulación de la secreción de IL-1β que depende del estado rédox celular podría constituir un mecanismo fisiológico de control de procesos inflamatorios dependientes de IL-1β donde el neutrófilo cumple un papel destacado.

Abstract:
Interleukin-1β (IL-1β) is a major pro-inflammatory cytokine involved in pathophysiological processes. It is synthesized as a precursor (pro-IL-1β) which must be cleaved to become biologically active. In this work we determined that highly purified human neutrophils release IL-1β in response to infectious and sterile stimuli, like LPS or monosodium urate crystals, respectively, and also to LPS-priming plus ATP stimulation. By using specific inhibitors and monitoring caspase-1 activation induced by the above-mentioned agonists, we determined that IL-1β secretion is dependent on caspase-1 and the serine-proteases elastase and/or proteinase-3. Our findings with neutrophils from patients lacking NADPH oxidase activity, as well as with both, a NADPH oxidase-deficient neutrophilic cell line and a specific inhibitor of this enzyme, showed that the event of mature IL-1β release requires the activity of the NADPH oxidase. However, pro-IL-1β processing is negatively regulated by reactive oxygen species, which inhibit caspase-1 activity. These findings show a complex redox regulation of IL-1β secretion that could constitute a physiological mechanism to control IL-1β-dependent inflammatory processes where neutrophils play a pivotal role.

González, Laura Elisabeth. "Interacción de la inmunoglobulinas G de pacientes con Esclerosis Lateral Amiotrófica con la placa neuromuscular y su relación con los canales de calcio de tipo P/Q" (2012-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa de motoneuronas. Se encuentra mayormente asociada a una forma esporádica de etiología desconocida. Numerosas evidencias favorecen a la auto-inmunidad como uno de los potenciales contribuyentes a esta patología. Para estudiar los posibles antígenos que interactúan con las IgGs de pacientes con ELA esporádica (IgGs-ELA), evaluamos su inmuno-reactividad hacia la placa neuromuscular (PNM), comparando animales normales con aquellos carentes de la subunidad formadora del poro del canal de calcio (Ca2+) de tipo P/Q (CaV2.1). Las IgGs-ELA mostraron una importante reactividad hacia la PNM de ratones CaV2.1+/+ e incrementaron la frecuencia de potenciales de placa miniatura (MEPPs). Ambos parámetros disminuyeron significativamente al evaluar tejido de animales CaV2.1-/-. Ensayos de inmuno-precipitación y western blot indican que el blanco de los anticuerpos no sería el canal mismo sino una proteína asociada. Estudios de proteómica sugieren a la proteína BASP-1 (proteína ácida soluble de cerebro-1) como un candidato a evaluar en forma más detallada en fututos ensayos. Nuestros resultados adicionan evidencias a favor de la auto-inmunidad como uno de los posibles mecanismos contribuyentes a la patología de ELA. También sugieren que los auto-anticuerpos en el suero de una serie de pacientes interactúan con proteínas cuya presencia en la PNM disminuye cuando los canales de Ca2+ de tipo P/Q se encuentran ausentes.

Abstract:
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a motoneuron neurodegenerative disease. It is primarily associated with a sporadic form of unknown etiology. Several pieces of evidence favor auto-immunity as a potential contributor to this pathology. To gain understanding concerning possible antigens interacting with IgGs from sporadic ALS patients (ALS-IgGs), we studied immuno-reactivity against the neuromuscular junction (NMJ) of mice with and without the pore-forming subunit of the P/Q-type calcium (Ca2+) channel (CaV2.1). ALS-IgGs showed a strong reactivity against NMJs of WT diaphragms and increased the miniature end-plate potential (MEPP) frequency. Both parameters were significantly diminished when evaluating tissue from CaV2.1-/- animals. Immuno-precipitation and western blot assays indicate that antibody target would not be the channel itself but an associated protein. Proteomic studies suggest BASP-1 (brain acid soluble protein-1) as a candidate to evaluate in more detail in future assays. Our findings add further evidence supporting auto-immunity as one of the possible mechanisms contributing to ALS pathology. They also suggest that serum auto-antibodies in a subset of ALS patients would interact with NMJ proteins downregulated when P/Q-type Ca2+ channels are absent.

Almejún, María Belén. "Evaluación de defectos intrínsecos de linfocito B en imunodeficiencia común variable pediátrica (IDCV)" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La inmunodeficiencia común variable (IDCV) es un síndrome heterogéneo que se caracteriza por producción defectuosa de inmunoglobulinas. Un defecto molecular en los estadios de diferenciación tardía de los linfocitos B, hasta el momento poco explorados en pacientes con IDCV, podría ser causal del desarrollo de la enfermedad dado que estas células pueden producirse normalmente en estos pacientes. Además, al ser la inmunodeficiencia primaria más frecuente, resulta un buen modelo experimental para el estudio de la biología del desarrollo terminal del linfocito B humano. Los resultados obtenidos en los ensayos funcionales que permiten evaluar los procesos fundamentales en la diferenciación tardía del linfocito B, SHM y CSR, así como el estudio de subpoblaciones B en sangre periférica de pacientes argentinos con IDCV de presentación pediátrica, nos permitieron definir subgrupos acotando los probables defectos genéticos a determinadas etapas de la regulación terminal del linfocito B. Por otro lado, el análisis en nuestros pacientes de la secuencia de TNFRSF13B, el gen que codifica para TACI, permitió la identificación de dos nuevas mutaciones. Entre ellas, S231R, la primera mutación descripta en el dominio citoplasmático altamente conservado del receptor (THC) específicamente en el sitio de unión a MyD88. Los experimentos llevados a cabo para evaluar funcionalmente la variante TACI-S231R demostraron que las células portadoras no logran desencadenar los eventos moleculares del CSR cuando se las estimula vía TACI y/o TLR9, incluyendo la secreción de inmunoglobulinas. Además, se observó que la cooperación entre TACI y el receptor CD40 estimulado en condiciones subóptimas se encuentra deteriorada. Por último, tras la estimulación con su ligando, el receptor TACI-S231R no logra colocalizar con MyD88 ni con TRAF2, proteínas esenciales para activar la cascada del CSR. Colectivamente estos resultados ponen de relieve la necesidad de un sitio de unión a MyD88 intacto para desencadenar el CSR mediado por TACI. En suma, este trabajo realiza un aporte al conocimiento de los eventos moleculares que suceden en el desarrollo y activación de los linfocitos B humanos y abre las puertas para la búsqueda de nuevos blancos genéticos implicados en el desarrollo de la enfermedad.

Abstract:
Common variable immunodeficiency (CVID) is a heterogeneous syndrome characterized by an impaired immunoglobulin production with usually normal B cell numbers in peripheral blood. The latter suggests that the molecular defect may be found in the late stages of B cell differentiation (SHM, CSR), so far unexplored in patients with CVID. Moreover, being the most prevalent primary immunodeficiency, it could be a good experimental model to study the terminal steps of the human B cell development. Actually, the results obtained in functional assays of SHM and CSR, and the study of B cell subpopulations in peripheral blood of pediatric Argentinean patients with CVID, allowed to discriminate different subgroups and approached possible genetic defects in their B lymphocytes. Furthermore, the sequence analysis of TNFRSF13B, the gene encoding TACI, led the identification of two novel mutations. Among them, S231R, the first mutation described in the highly conserved cytoplasmic domain of the receptor (THC) at the MyD88-specific binding site. The results obtained in the evaluation of the functional relevance of TACI-S231R variant, showed that the B cells failed to trigger the CSR related events (including the immunoglobulin secretion) when stimulated via TACI and/or TLR9. It was also noted an impaired APRIL-mediated enhancement of CD40 activation in suboptimal conditions. Finally, after stimulation with its ligand, the receptor TACI-S231R failed to colocalize with MyD88 nor with TRAF2, essential proteins to activate the CSR cascade. Collectively, these results highlight the requirement of an intact MyD88-binding site in TACI to trigger CSR. In summary, this work makes a contribution to the knowledge of the molecular events that occur in the differentiation and activation of human B lymphocytes and it provides a glimpse of possible pathways that lead to the discovery of new genetic factors involved in the onset of the disease.

Fernández Do Porto, Darío Augusto. "La vía de CD137 regula de manera diferencial las respuestas innatas y adaptativas en el contexto de la tuberculosis humana" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La protección frente a M. tuberculosis requiere del establecimiento una respuesta de citoquinas Th-1, dominada por la secreción de interferón (IFN)-γ. Varias proteínas de señalización participan en la regulación de la activación de los linfocitos T, modulando los niveles y el patrón de citoquinas producidos por dichas células durante la estimulación antigénica. Así, resultados de nuestro laboratorio han demostrado que el Coestimulador Inducible (ICOS) y la Molécula Linfocitaria Activadora de Señales (SLAM) estimulan la secreción de IFN-γ mientras que la proteína asociada a SLAM (SAP), CD31 y el receptor de muerte programada (PD)-1 inhiben la respuesta Th-1 durante la respuesta inmune del hospedador frente a M. tuberculosis (M.tb). El receptor CD137 (4-1BB), un miembro de la superfamilia de receptores del Factor de Necrosis Tumoral (TNFR), es otra de las moléculas de señalización que participan en la regulación de las funciones efectoras de las células T CD137, una molécula que puede expresarse de manera constitutiva o en forma inducida en varios tipos de células inmunes, puede desempeñar un rol coestimulatorio sobre las células T, uniéndose a su ligando CD137L, el cual a su vez se expresa sobre Células Presentadoras de Antígenos (CPA). Dado que CD137 y CD137L puede expresarse sostenidamente durante infecciones crónicas e inflamaciones prolongadas, nuestra hipótesis de trabajo fue que ambas moléculas podrían desempeñar un rol clave durante las respuestas inmunes innata y adaptativa en la infección persistente por M. tuberculosis. A través de cultivos in vitro, demostramos que la estimulación con M.tb de células mononucleares de sangre periférica (CMSP), tanto de pacientes con tuberculosis como de individuos sanos, incrementa la expresión de CD137 y CD137L en monocitos y células NK, y de CD137 en linfocitos T. Por otro lado, observamos que la señalización a través de la vía de CD137 disminuye los porcentajes de monocitos y células NK productoras de IFN-γ y TNF-α estimulados con M.tb, mientras que, en contraste, aumenta las funciones efectoras y la sobrevida de las células T. De esta manera, durante la respuesta temprana, el receptor CD137 inhibiría la producción de IFN-γ y TNF-α por células NK y macrófagos respectivamente. Por el contrario, durante la respuesta inmune más tardía, CD137 estimularía la producción de IFN-γ por las células T, pero continuaría inhibiendo los niveles de TNF-α secretados por los macrófagos. Dado que la señalización a través de CD137 modula de manera opuesta los niveles tardíos de IFN-γ y TNF-α, se estudió la existencia de una posible regulación cruzada entre ambas citoquinas. Así, se demostró que la presencia de IFN-γ aumenta la secreción de TNF-α por CMSP estimuladas con M.tb, mientras que esta citoquina dispara mecanismos pro- y anti-inflamatorios que regulan finamente los niveles de IFN- γ producidos por las células T en el contexto de la tuberculosis. A fin de comprender los mecanismos que regulan la señalización del receptor CD137 se desarrolló un Modelo Bayesiano Computacional (MBC). La construcción de este modelo implicó traducir en ecuaciones diferenciales los diferentes procesos inmunológicos que ocurren en el sistema experimental con el objetivo de utilizar herramientas bayesianas para extraer una mayor información de los resultados experimentales de la que se podría obtener a través de un análisis estadístico tradicional. Los resultados del MBC predicen un efecto directo del receptor CD137 sobre las células T y sugieren que la regulación de los niveles de IFN-γ producidos por estos linfocitos, se basa en un aumento de la sobrevida de los mismos, más que en la inducción de la producción de dicha citoquina. Por otro lado, el MBC muestra que el mecanismo que da cuenta del efecto de CD137 sobre el TNF-α estaría basado en una disminución de la tasa de producción de dicha citoquina por las CPA y posiblemente, en un incremento de la apoptosis de estas células. Así, el MBC demostró ser una herramienta poderosa para comprender en profundidad los mecanismos de señalización del receptor CD137 durante la respuesta inmune humana frente a M. tuberculosis. El estudio de las vías de señalización a través de receptores linfocitarios durante la tuberculosis activa podría constituir un blanco potencial para la manipulación terapéutica, lo cual impactaría en el desarrollo de potenciales tratamientos contra la enfermedad. En particular, en este trabajo se presenta evidencia que propone al receptor CD137 como un posible candidato en la terapia contra la tuberculosis humana. Sin embargo, se deben tener en cuenta algunas precauciones a la hora de manipular este receptor con fines terapéuticos, dado que los anticuerpos agonistas anti-CD137 pueden causar severas anomalías en el sistema inmune del hospedador, tomando en consideración el hecho de que la vía CD137:CD137L opera de manera diferencial en las distintas células durante la respuesta inmune y adaptativa.

Abstract:
Protective immunity against Mycobacterium tuberculosis requires a Th-1 response dominated by IFN-γ secretion. Several signaling proteins contribute to the active up- or down-regulation during the priming of a T cell, modulating the level and pattern of cytokines produced by those cells upon antigen-stimulation. For example, during the immune response of the host against M. tuberculosis, we have demonstrated that SLAM and ICOS enhanced IFN-γ secretion whereas the SLAM associated protein (SAP), CD31 and PD-1 interfered with Th-1 responses. Another signaling molecule that participates in the regulation of T cell effector functions is the receptor CD137 (4-1BB), a member of the TNFR superfamily that can play a costimulatory role for T cell immunity upon binding with its ligand CD137L. In particular, it was reported that CD137:CD137L interactions boost CD8 T cell responses, although the expression profile of CD137 is now known to be quite broad, being present or induced on various types of immune cells, and not solely restricted within T lineage cells. Since the expression of CD137 has been reported to be sustained under conditions of persistent infection in chronically infected individuals, we hypothesized that CD137 and CD137L would have a role during innate and adaptive human responses against M. tuberculosis. By using in vitro cultures, we demonstrated that M. tuberculosis antigenstimulation of Peripheral Blood Mononuclear Cells increased both CD137 and CD137L expression on monocytes and NK cells from tuberculosis patients and healthy donors, but only up-regulated CD137 on T lymphocytes. CD137 pathway inhibits the levels of IFN-γ and TNF-α produced by monocytes and NK against M. tuberculosis. In contrast, CD137 significantly enhanced T cells effector functions and survival. In this way, CD137 inhibits early IFN-γ and TNF-α, produced mainly by NK cells and macrophages respectively, but, during late responses, stimulates IFN-γ produced by T cells, since continue inhibiting the major source of f TNF-α, the macrophages. Since CD137 regulates in opposite ways late IFN-γ and TNF-α, we studied a possible cross regulation between this two cytokines. We have demonstrated that IFN-γ increase TNF-α secretion by M.tb stimulated-PBCM. On the other hand, TNF-α triggered pro- and anti- inflammatory mechanisms that fine tune IFN-γ levels in the tuberculosis context. To make an insight in the possible mechanisms that account for the experimental data experimental data, we build a Bayesian Computational Model (BCM). The construction of this model implied to translate into differential equations those immunological processes occurring in the experimental system in order to use Bayesian tools to extract more information of the experimental results than the obtained through traditional statistical analysis. MBC results predict a direct effect of CD137 on T cells and suggest that the regulation of the levels of IFN-γ is based more on an increased survival of these cells, rather than the induction of the production of this cytokine. On the other hand, BCM shows that the mechanism that accounts the effect of CD137 on TNF-α is based on a decrease in the rate of TNF-α production by Antigen-Presenting Cells (APC), and possibly an increase in apoptosis of these cells. The MBC was shown to be a powerful tool for understanding the signaling mechanisms of CD137 in the human response to Mycobacterium tuberculosis. The understanding of the signaling pathways through lymphocytes receptors during active tuberculosis may have important implications for potential human therapies. In particular, in this work we show evidence to support CD137 receptor as a possible candidate for human therapy against tuberculosis. Nonetheless, caution must be used when designing ways to manipulate CD137 in human therapy, given that the agonistic anti-CD137 antibodies can cause severe immune system abnormalities and taking into consideration the fact that the CD137:CD137L pathway may operate differently in distinct cells during the innate and adaptive immune response.

Otero, Constanza. "Respuesta inmune al Streptococcus pneumoniae en pacientes con Asma y pacientes con deficiencia específica de respuesta a antígenos polisacáridos" (2013-04-08) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Durante años se ha considerado que la defensa inmune frente al Streptococcus (S.) pneumoniae (Spn) depende de anticuerpos anticapsulares, que protegen frente a la infección invasiva y a la colonización por este microorganismo. Sin embargo, la inmunidad adaptativa puede ser importante para generar memoria celular frente a la bacteria. Algunas patologías de la infancia como el asma atópico y la deficiencia específica de anticuerpos frente a antígenos polisacáridos (SPAD), parecen predisponer a un riesgo mayor de infección por Spn. Estudiamos la respuesta inmune al Spn en estos pacientes y en individuos sanos (S) en edades pediátricas. En los pacientes asmáticos (A) se observó una tendencia a una menor expresión de CD69 en linfocitos T (LT) convencionales y LTγδ frente al estímulo con Spn. Los LT CD8+ mostraron un aumento en la expresión de CD25 solo frente al estímulo con Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en las células de los A y no en los S. Para evaluar la respuesta Th1 se midieron los niveles de IFN‐γ frente a Spn y a Mtb, encontrándose muy elevados en los A. Al estudiar los pacientes SPAD (P), encontramos varias diferencias en las subpoblaciones de monocitos (Mo) y LT con respecto a los S. Observamos que los Mo CD14++CD16+, se encuentran en proporciones alteradas con respecto a los S a distintas edades, lo que podría relacionarse con una menor capacidad de respuesta T, dado que frente al neumococo los Mo modulan la diferenciación de LT hacia los perfiles Th1 y Th17. La expresión temprana de CD69 en los LT previene la diferenciación hacia el perfil Th17. En los P, los LT CD69+ y LTCD8+CD25+ se vieron disminuidos con respecto a los S, aún con Mtb, evidenciando alteraciones en su capacidad de respuesta celular. Creemos que nuestro reporte de alteraciones en los P puede ser útil en la búsqueda de otros métodos diagnósticos. Consideramos que deben evaluarse en los Mo las vías de señalización necesarias para activar a las células presentadoras de antígeno frente al neumococo, encargadas de modular la respuesta T en condiciones normales. Esto podría contribuir a identificar la base molecular de la inmunodeficiencia SPAD, aún desconocida.

Abstract:
The immune defense against Streptococcus (S.) pneumoniae (Spn) was considered dependent on capsular antibodies that provide protection against invasive infection and colonization by this microorganism. However, adaptive immunity may be important in the generation of cellular memory against this pathogen. Some childhood diseases like atopic asthma and specific polysaccharide antibody deficiency (SPAD) seem to be associated to a higher risk of infection with Spn. We studied the immune response to Spn in these patients and in healthy children (H). In asthmatic patients (A) we observed a reduced expression of CD69 in conventional T lymphocytes (T cells) and γδ T cells with Spn. The CD8 + T cells from A showed an increased expression of CD25 only with Mycobacterium tuberculosis (Mtb), when compared to healthy individuals. As a measure of Th1 response, we evaluated the IFN‐γ production after stimulating cells from A and H with the bacterial antigens. We found high levels of this cytokine in both groups. When we studied SPAD patients (S), we found several differences in monocyte (Mo) subpopulations and in T cells, which had never before been described. We observed that in S the proportion of CD16+CD14++ Mo at different ages was altered when compared to healthy individuals. This could be correlated to a decreased T cell responsiveness, since it was described that Mo modulate T cell response towards a Th1 or a Th17 profile, in the defense against Spn. Early up regulation of CD69 in T cells prevents them from generating a Th17 response. In S we observed that the expression of both CD69 and CD25 was reduced when compared to H. We also found lower percentages of CD8+ activated T cells, even with Mtb, suggesting alterations in the T cell response capacity of S. We believe that the alterations in leukocyte populations we report here can be useful to find new diagnostic methods for S. The necessary signaling pathways activate after Spn recognition in Mo ‐ that will result in a correct antigen presentation to T cells ‐ must be studied in normal conditions. This could also contribute to identify the molecular basis of the SPAD immunodeficiency, still unknown.

Weigel Muñoz, Mariana. "Las proteínas CRISP: desde la fertilización al sistema inmune" (2013-04-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas CRISP (Proteínas Secretorias Ricas en Cisteínas) de mamíferos se encuentran presentes en el tracto reproductor masculino y han sido propuestas como mediadores del proceso de fertilización. En base a ello, y a su alta homología con las proteínas PR1 y Ag5 involucradas en el sistema de defensa, el objetivo de esta Tesis ha sido investigar la relevancia de las CRISP tanto para la fertilidad como para el sistema inmune. Previos resultados de nuestro grupo indican que los ratones knockout para la proteína epididimaria CRISP1 (Crisp1-/-) son fértiles pese a presentar espermatozoides con una menor capacidad fertilizante. Dado que una mutación puede producir fenotipos diferentes según su fondo genético, evaluamos el fenotipo de los animales Crisp1-/- generados en un fondo genético homogéneo. Los resultados revelaron que los machos presentaron no sólo una desventaja en la fertilidad sino también nuevos defectos en parámetros funcionales de los espermatozoides, confirmando la importancia de realizar estudios en animales con diversos fondos genéticos. La proteína testicular CRISP2 participa en el proceso de fertilización y ha sido propuesta como un auto-antígeno capaz de generar orquitis. Con el fin de investigar su relevancia para la fertilidad, ratas macho y hembra fueron inmunizadas con CRISP2, observando que esta proteína es capaz de generar una respuesta inmune específica en animales de ambos sexos, que no genera orquitis ni compromete la fertilidad. Estos resultados sugieren que, a diferencia de CRISP1, CRISP2 no seria un blanco anticonceptivo ni un antigeno responsable de la inmunoifertilidad. En cuanto a CRISP3, observamos que si bien existen dos isoformas en el espermatozoide humano, una de las cuales se libera durante la capacitación y otra que permanece en el espermatozoide capacitado, esta proteína no actuaría como factor decapacitante ni sería relevante para la fertilización. Finalmente, en lo que respecta al posible rol de las CRISP en el sistema inmune, observamos que tanto CRISP3 como su homólogo CRISP1 se expresan en células dendríticas inmaduras y maduras. Más aún, el empleo de animales knockout para CRISP1 reveló que esta proteína modularía el perfil secretorio de citoquinas de las células dendrítricas. En conjunto, los resultados obtenidos indican la relevancia de las CRISP para la regulación tanto de la fertilidad como del sistema inmune.

Abstract:
The CRISP proteins (Cysteine Rich Secretory Proteins), in mammals, are primarily expressed in the male reproductive tract and have been proposed to participate in the fertilization process. Based on this, and considering the high homology between the CRISP proteins and the PR1 y Ag5 proteins involved in the immune system, the objective of the present thesis was to investigate the relevance of CRISP in fertility and in the immune system. Previous results from our group indicated that in spite of been fertile, the CRISP1 knockout mice contain sperm that exhibit a reduced ability to fertilized eggs. Considering that it has been reported that different phenotypes can arise from the same mutation depending on the genetic background, we investigated the phenotype of Crisp1−/− animals of a homogenous background. Results showed that males exhibited not only a disadvantage in fertility but also new defects on sperm parameters, confirming the importance of performing studies in animals with different genetic background. Testicular protein CRISP2 is involved in the fertilization process and has been proposed as an auto-antigen capable of generate autoimmune orchitis. With the aim of investigate its relevance for fertility, male and female rats were immunized with CRISP2. Results showed that this protein is capable of generating a specific immune response in male and female rats that neither generates autoimmune orchitis nor compromises fertility. These results suggest that, differently from CRISP1, CRISP2 would not be a target for immunocontraception or a molecule responsible for immunoinfertility. About CRISP3, we observed that even though two forms of the protein exist in human sperm, one of which is released from the sperm during capacitation and the other one that remains associated with the sperm after the acrosome reaction, this protein would not behave as a decapacitating factor and would not be relevant for fertility. Finally, regarding the role of CRISP in the immune system, we observed that CRISP3 and CRISP1 are expressed in immature and mature dendritic cells. Moreover, the use of CRISP1 knockout animals revealed that this protein would modulate cytokine secretion by dendritic cells. Altogether, the results obtained in the present thesis indicate not only the relevance of the CRISP protein in the regulation of fertility but also of the immune system.

Sterle, Helena Andrea. "Modulación in vivo del desarrollo y evolución de linfomas T por el estado tiroideo" (2013-10-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las hormonas tiroideas (HTs) son importantes reguladoras de la respuesta inmune, pero su participación en el desarrollo tumoral es controversial. El objetivo de este trabajo fue estudiar la modulación de las HTs sobre el comportamiento biológico y evolución del linfoma T EL-4 creciendo in vivo en ratones singeneicos eu- (controles), hiper- (hiper) o hipotiroideos (hipo). El tratamiento de las células EL-4 in vitro con HTs indujo un aumento en la proliferación y cambios en los niveles de expresión de reguladores del ciclo celular a tiempos cortos, pero llevó a la apoptosis a tiempos más largos de cultivo. La inoculación de las células EL-4 en animales hiper desarrolló tumores sólidos de mayor volumen que el de los Controles, pero los hipo presentaron un mayor número de metástasis. Adicionalmente, los tumores hiper mostraron un aumento en los niveles de expresión de ciclinas, mientras que en los hipo encontramos niveles incrementados de p16, p27 y p53. Los tumores hiper también exhibieron mayor angiogénesis por inmunohistoquímica y una expresión aumentada de metaloproteasas, por qRT-PCR, junto con incrementada apoptosis. Por otra parte, los ratones hiper mostraron un menor infiltrado linfocitario tumoral, compuesto por un menor porcentaje de linfocitos CD8+ que los ratones control. Por otra parte, los bazos de estos animales presentaron una aumentada proporción y actividad de células NK, junto con un menor porcentaje de células supresoras de origen mieloide. Los ratones hipo, sin embargo, mostraron una reducción en la actividad citotóxica específica contra células tumorales. Nuestros resultados sugieren que el estado tiroideo es capaz de modular el crecimiento tumoral a través de mecanismos que involucran la regulación de proteínas relacionadas con la progresión y/o arresto del ciclo celular y de la angiogénesis, y a través del control de la respuesta inmune antitumoral que puede limitar su diseminación.

Abstract:
Thyroid hormones (THs) are important regulators of immune response, but their role in tumor development is still controversial. The aim of this work was to evaluate THs involvement in the biological behavior and evolution of the EL-4 T lymphoma, growing in vivo in singeneic eu- (controls), hyper- (hyper) or hypothyroid (hypo) mice. The in vitro treatment of EL-4 cells for short periods of time with THs increased cell proliferation and led to changes in the expression of cell cycle regulators. However, longer treatment with THs induced apoptosis in these cells. Hyperthyroid mice that were inoculated with EL-4 cells showed an increased solid tumor volume compared to controls, while hypo exhibited a higher number of metastases. These results were associated with an increment in the expression of cyclins in hyper tumors, and higher levels of p16, p27 and p53 in tumors from hypo mice. An immunohistochemical analysis of tumor sections demonstrated an increased angiogenesis in hyper tumors, which was accompanied with an augmented expression of metalloproteases, measured by qRT-PCR, and an increased apoptosis. Furthermore, a lower number of tumor infiltrating lymphocytes was found in hyper mice, which was comprised of a decreased percentage of CD8+ lymphocytes compared to controls. However, the spleens obtained from these animals showed an increased proportion and activity of NK cells, together with a diminished percentage of tumor derived suppressor cells. Hypo mice, on the other hand, displayed a reduced tumor-specific cytotoxic activity. Our results suggest that thyroid status can directly modulate tumor development through the regulation of proteins that are involved with the cell cycle progression and/or arrest and through the regulation of angiogenesis. Together with this, thyroid status can also regulate tumor dissemination as a result of the modulation of the anti-tumor immune response.

Nannini, Paula Romina. "Efecto de la fludarabina en la sobrevida y funcionalidad de los linfocitos T de pacientes con leucemia linfática crónica: posibles implicancias en la falla terapéutica de la enfermedad" (2013-12-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La leucemia linfática crónica (LLC) se caracteriza por la acumulación de linfocitos B (LB) clonales en sangre periférica y órganos linfáticos. La fludarabina es uno de los principales agentes quimioterápicos empleados para su tratamiento y posee claros efectos inmunomoduladores más allá de su tradicional capacidad citotóxica sobre los linfocitos. En la actualidad, la LLC continúa siendo una enfermedad incurable ya que las células leucémicas logran sobrevivir a los efectos pro-apoptóticos de la quimioterapia en los tejidos linfoides. Allí, proliferan en estructuras anatómicas denominadas centros proliferantes (CP) en contacto con linfocitos T (LT) activados, células estromales y células de tipo nodriza (NLC) que les brindan señales indispensables para su acumulación. El objetivo de este trabajo de Tesis fue estudiar los mecanismos que podrían estar involucrados en la falla terapéutica de los pacientes con LLC, centrándonos en el efecto de la fludarabina y el microambiente tumoral en la sobrevida y funcionalidad de los LT de los pacientes. Encontramos que las NLC autólogas protegen a los LT de la apoptosis espontánea e inducida por fludarabina, y que ésta droga es capaz de incrementar la activación y proliferación de los mismos. Estos hallazgos sugieren que luego del tratamiento con fludarabina, algunos LT podrán sobrevivir a sus efectos pro-apoptóticos en los CP en parte gracias a la presencia de las NLC. Dado que los LT brindan señales claves para la acumulación del clon leucémico, la mayor proliferación y activación que poseen luego del tratamiento con la droga podría contribuir a la expansión de las células LLC que han sobrevivido, con la consecuente recaída del paciente. Palabras claves: LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA; FLUDARABINA; LINFOCITOS T; CÉLULAS DE TIPO NODRIZA; MICROAMBIENTE TUMORAL.

Abstract:
Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is characterized by the accumulation of clonal B lymphocytes in peripheral blood and lymphoid organs. Fludarabine is one of the main chemotherapeutic agents employed in the treatment of CLL and it exerts clear immunomodulatory actions besides its traditional cytotoxic effects on lymphocytes. There is still no cure for CLL patients as leukemic cells can overcome the pro-apoptotic actions of chemotherapy in lymphoid tissues within proliferation centers (PC). In these sites, CLL cells are in close contact with activated T lymphocytes (TL), stromal cells and nurse like cells (NLC) which support leukemic cells accumulation through survival and proliferation signals. The aim of this Thesis was to study the mechanisms that could be involved in the therapeutic failure of CLL patients, focusing on the effect of fludarabine and the tumor microenvironment in the survival and functionality of TL. We found that autologus NLC protect TL from spontaneous and fludarabine-induced apoptosis, and that this drug enhances activation and proliferation of TL from CLL patients. These findings suggest that after fludarabine treatment TL could survive in PC, at least in part, due to the presence of NLC. Considering that TL provide key survival signals that support CLL cells accumulation, fludarabine enhancement of TL proliferation and activation would contribute to the expansion of surviving leukemic cells, favoring the relapse of disease. Key words: CHRONIC LYMPHOCYTYC LEUKEMIA, FLUDARABINE, T LYMPHOCYTES, NURSE LIKE CELLS, TUMOR MICROENVIRONMENT.

Coria, Mirta Lorena. "Estudio de la capacidad adyuvante de la proteína Omp19 de Brucella spp. sobre la respuesta inmune adaptativa" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En nuestro laboratorio nos encontramos investigando la utilidad de la porción proteica de la lipoproteína de membrana externa de 19 kiloDalton de Brucella abortus (U-Omp19) como adyuvante vacunal. Resultados previos proponían a U-Omp19 como un inhibidor de serin proteasas de estómago e intestino. En esta tesis hemos comprobado que U-Omp19 posee actividad de inhibidor de cisteín proteasas lisosomales y que la co-administración de U-Omp19 inhibe parcialmente la degradación del antígeno (Ag) dentro de las células presentadoras de Ag incrementando su vida media y promoviendo su presentación cruzada a las células T CD8+. UOmp19 también es capaz de activar células dendríticas (DCs) induciendo un aumento en la expresión de moléculas co-estimulatorias y secreción de citoquinas pro-inflamatorias. Por último, estudiamos la respuesta inmune inducida en ratones luego de la co-administración de OVA y U-Omp19 por vía subcutánea. Observamos que U-Omp19 como adyuvante de OVA induce una eficiente respuesta inmune celular de tipo T CD8+ y citotóxica con producción de IFN-γ. Los resultados obtenidos indican que la actividad adyuvante de U-Omp19 está dada, por un lado, por su capacidad de activar DCs y por otro lado, por promover la estabilidad y la presentación de Ags a través de su acción como inhibidor de proteasas, éste último representa un novedoso mecanismo aún no descripto para un adyuvante vacunal.

Abstract:
In our laboratory we are investigating the usefulness of the protein moeity of the outer membrane lipoprotein of 19 kiloDalton from Brucella abortus (U-Omp19) as a vaccine adjuvant. Previous results proposed U-Omp19 as a serine protease inhibitor. In this thesis we found that U-Omp19 possesses inhibitory activity of lysosomal cysteine proteases, and that the coadministration of U-Omp19 partially inhibits the antigen (Ag) degradation in Ag presenting cells increasing its half life and promoting its cross presentation to CD8+ T cells. U-Omp19 is also capable of activating dendritic cells (DCs) inducing the upregulation of co-stimulatory molecules and secretion of pro-inflammatory cytokines. Finally, we studied the immune response induced in mice after subcutaneously co-administration of U-Omp19 and OVA. We observed that UOmp19 as adjuvant of OVA induces an effective T CD8+ and cytotoxic cellular immune response with IFN-γ production. These results indicate that the adjuvant activity of U-Omp19 is given, in one hand, by its ability to activate DCs and in the other hand, by promoting Ag stability and presentation through its action as a protease inhibitor, the latter represents a novel mechanism not yet described for a vaccine adjuvant.

Rossi, Soledad Paola. "Interacciones neuro-inmuno-endócrinas en el testículo: rol de la melatonina" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La melatonina, hormona secretada por la glándula pineal, modula los ritmos biológicos diarios y los ciclos de sueño/vigilia. A través de su acción regulatoria sobre la producción y secreción de hormonas hipotalámicas e hipofisarias, participa también en la modulación de la actividad sexual en especies con ciclos reproductivos anuales controlados por el fotoperíodo. En este Trabajo de Tesis Doctoral se investigaron dos mecanismos de acción diferenciales de la melatonina en el testículo: su rol como hormona y su rol como agente anti/pro oxidante. Los estudios realizados permitieron establecer: a) las señales intracelulares asociadas al rol inhibitorio ejercido por el sistema melatonina/CRH sobre la regulación de la esteroidogénesis en células de Leydig del hámster Dorado, b) la concentración testicular de melatonina y la expresión de los principales componentes de la cascada de señalización del sistema melatonina/CRH en el testículo de pacientes que padecen infertilidad idiopática, y c) la acción regulatoria ejercida por melatonina sobre la proliferación, estado oxidativo y capacidad secretoria en macrófagos y mastocitos testiculares. La melatonina desempeñaría un rol clave en la modulación de la esteroidogénesis testicular en el hámster. En el testículo humano patológico, ejercería además acciones regulatorias sobre la población local de macrófagos y mastocitos.

Abstract:
Melatonin is a hormone secreted by the pineal gland that mediates the physiological regulation of both daily rhythms and sleeping/waking cycles. In seasonal breeders, this hormone also participates in the modulation of annual reproductive activity through its action on the hypothalamic-pituitary axis. In this Doctoral Thesis two differential mechanisms of action of melatonin in the testis were studied: its role as a hormone and its role as an anti/pro-oxidant agent. Studies performed in this Thesis allowed us to establish: a) the intracellular events triggered by melatonin/CRH that lead to a down-regulation of the steroidogenic process in Syrian hamster Leydig cells, b) the testicular melatonin concentration and the expression of the main components of the signaling cascade linked to the melatonin/CRH system in testicular biopsies of men suffering from idiopathic infertility, c) the effects of melatonin on proliferation, oxidative state and secretory capability in testicular macrophages and mast cells. Thus, melatonin would play a key role in the regulation of testicular steroidogenesis in the hamster. In the pathological human testis, melatonin would also participate in the modulation of the local macrophage and mast cell populations.

Legisa, Danilo Mario. "Estudio de aislamientos nacionales y desarrollo de una vacuna a subunidad, direccionada a células presentadoras de antígenos, para el Virus de la Lengua Azul" (2014-04-03) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Lengua Azul es una enfermedad que afecta principalmente rumiantes salvajes y doméstico, y representa una importante barrera para el comercio internacional de animales y sus subproductos. El Virus de la Lengua Azul es el causante etiológico de la enfermedad y es transmitido por insectos hematófagos del género Culicoides. El Virus de la Lengua Azul , es el miembro prototipo del género Orbivirus dentro de la familia Reoviridae. El virión está compuesto por una doble capa proteica desnuda que envuelve un genoma de 10 segmentos lineales de ARNdc, los cuales codifican para al menos diez proteínas, 7 proteínas estructurales y al menos 4 no estructurales. La distribución del Virus de la Lengua Azul es global aunque en ciertas zonas la información es escasa. En Sudamérica, evidencia serológica de la presencia del virus fue encontrada todos los países menos Uruguay y Bolivia. Argentina y Brasil son los únicos países donde ha sido aislado el virus. En Argentina han sido obtenidos 5 aislamientos de Virus de la Lengua Azul serotipo4 en ganado bovino. Tres de estos aislamientos fueron logrados entre los años 1999-2001, mientras los dos restantes fueron obtenidos en los años 2009 y 2010 como parte del presente trabajo de tesis. La medida de control más práctica y eficaz es la inmunización profiláctica de los animales susceptibles. Desde principios del siglo XX se han desarrollado vacunas atenuadas e inactivadas eficientes para la Lengua Azul. Sin embargo, las desventajas en cuanto a bioseguridad y efectos adversos impulsan el desarrollo de vacunas a subunidad, no infecciosas como alternativa a las vacunas convencionales. En este trabajo de tesis se abordó un análisis epidemiológico molecular de los aislamientos argentinos del VLA y el desarrollo de una vacuna a subunidad direccionada a células presentadoras de antígeno. El análisis epidemiológico molecular se basó en la obtención y análisis de las secuencias de 5 de los 10 segmentos virales (Segmentos 2, 3, 6, 7 y 10). El análisis de los segmentos 2 y 6 resultó en un cluster de secuencias argentinas dentro del clado del serotipo 4 y también dentro del grupo del nucleotipo A (definido para cada segmento). El análisis de los segmentos 3, 7 y 10 mostró que los aislamientos argentinos agrupan dentro del cluster de aislamientos de topotipo occidental o western, indicando que su origen se remontaría a África/Europa. El análisis filogenético reveló que, además de este origen, las secuencias argentinas representaron un fuerte linaje Sudamericano de evolución independiente. El desarrollo de la vacuna a subunidad se basó en la expresión de la proteína VP2, mayoritaria de la cápside externa e inmunodominante, sola o fusionada a la molécula APCH (Antigen Presenting Cell Homing) capaz de dirigir moléculas a células presentadoras de antígeno, utilizando el sistema de expresión de baculovirus. Los ensayos de inmunogenicidad en cobayos y bovinos utilizando estos dos antígenos, resultaron en altos títulos de anticuerpos neutralizantes similares a los evocados por la vacuna formulada con virus inactivado. Más aún, se obtuvieron títulos comparables para VP2 y dosis 4 veces menores de APCH-VP2 demostrando la capacidad APCH de potenciar la generación de anticuerpos. Como caracterización de la respuesta inmune asociada se analizó el perfil de inmunoglobulinas G y la presencia de células T de memoria. El perfil de IgG en los bovinos inmunizados con APCH-VP2 mostró una mayor proporción de IgG1 en comparación con los grupos vacunados con VP2 sola o con el virus inactivado. Por otro lado, la inmunización con las vacunas experimentales, mostró generación de células T de memoria para VP2 sola. Además, se comprobó la capacidad de las vacunas recombinantes de diferencias animales vacunados de infectados. Esta sección constituye un aporte en el desarrollo de vacunas a subunidad, capaces de generar una respuesta inmune comparable a vacunas inactivadas pero con características emergentes.

Abstract:
Bluetongue disease affects principally wild and domestic ruminants and represents a major barrier to animal trade and their sub products. The etiological agent is the Bluetongue Virus, it is transmitted by hematophagous arthropods from the genus Culicoides. Bluetongue Virus is the prototype member of genus Orbivirus and it belongs to Reoviridae family. The non enveloped virión is composed by two concentric protein layer which contents the viral genome, composed by ten dsRNA segments. This genome codifies for 7 structural proteins and at least, 4 non structural proteins. Bluetongue Virus is worldwide distributed, although there is a lack of information in certain regions. In Southamerica, serologic evidences of Bluetongue Virus were recorded in all countries except Uruguay and Bolivia. Argentina and Brazil are the only two countries where the virus was isolated. In Argentina, five Bluetongue Virus serotype 4 isolates have been obtained from asymptomatic cattle. Three isolates were obtained in years 1999-2001, and two in years 2009 and 2010 as result of this thesis work. Prophylactic immunization of susceptible animals is the most practical and effective measure to prevent Bluetongue disease. From beginning of XX century, attenuated and inactivated vaccines against Bluetongue Virus have been developed, however, biosafety issues and the well known adverse effects lead to the development of subunit vaccines as an alternative to classic ones. In this work, we performed a molecular epidemiology study of Argentinean Bluetongue Virus isolates and we also developed a subunit vaccine delivered to antigen presenting cells. The molecular epidemiology approach was based on the sequence analysis from 5 out of 10 genome segments (Segments 2, 3, 6, 7, and 10). Segments 2 and 6 analysis showed that Argentinean sequences grouped into the serotype 4 cluster and nucleotype A group, and even more, they grouped in a unique Argentinean cluster whit high bootstrap value. Segments 3, 7 and 10 analysis, showed that Argentinean isolates grouped into a western topotype cluster, along with sequences already classified as originated in Africa and/or Europe. Phylogenetic analysis revealed that all Argentinean sequences formed a well supported Southamerican lineage with independent evolutionary history. The subunit vaccine development was based on the baculoviral expression of VP2 protein, the major and immunodominant component of the outer capsid, alone or fussed to a molecule named APCH (antigen presenting cell homing), capable to deliver peptides or molecules to antigen presenting cells. Immunogenicity assays conducted in guinea pigs and cattle showed that both antigens were able to induce high neutralizing antibodies titers similar to those evoked by the inactivated vaccine. Moreover, VP2 antibody titers were comparable to APCH-VP2 titers which were generated using a 4 times lower dose of antigen, demonstrating the ability of APCH molecule to enhance the generation of antibodies. As part of the immune response characterization, immunoglobulin G profile and the presence of memory T cells were analyzed. IgG profile in animals vaccinated whit APCH-VP2 showed a higher proportion of IgG1 in comparison with VP2 and inactivated BTV groups. On the other hand, immunization with both candidate vaccines showed the generation of memory T cells specific to VP2. In addition, the capacity of the recombinant vaccine to differentiate vaccinated animal from infected ones was confirmed. This section represents a contribution in the development of Bluetongue Virus subunit vaccines capable of generating an immune response comparable to inactivated vaccines but with new and advance features.

Fassolari, Marisol. "Mecanismo de reconocimiento de un epítope intrínsecamente desordenado por un anticuerpo monoclonal: integración mecanística y estructural" (2014-11-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El reconocimiento de antígenos por medio de anticuerpos es un evento fundamental en la respuesta inmune adaptativa. A su vez la formación de los complejos Antígeno:Anticuerpo es extensivamente utilizada como modelo de estudio de interacción proteína-proteína. En la presente tesis estudiamos el mecanismo de reconocimiento de un anticuerpo monoclonal específico, M1, por la proteína E7 del papilomavirus humano (HPV). E7 es la oncoproteína que constituye la principal actividad transformante del virus y además es paradigma de proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). E7 se expresa constitutivamente en tejidos de carcinoma y la aparición de anticuerpos específicos ocurre con alta frecuencia en pacientes con cáncer cervical. Llevando a cabo un mapeo epitópico determinamos que el anticuerpo M1 reconoce específicamente una región inmunodominante de la proteína de HPV- 16 denominada “bisagra”, por conectar el dominio IDP N-terminal con el dominio globular Cterminal de la misma. Experimentos cinéticos mostraron que la región reconocida por M1, la cual posee dos residuos de prolina, comprende al menos dos poblaciones separadas por una alta barrera energética (~ 22 Kcal/mol). Los estudios de Resonancia Magnética Nuclear identificaron el origen de esta barrera como un evento de isomerización cis-trans de las prolinas presentes en el epítope de reconocimiento. Se determinó que el anticuerpo M1 reconoce específicamente al epítope en su conformación minoritaria (10%), que posee sus prolinas en cis, mediante el mecanismo de selección conformacional. Por lo tanto, se requiere que el 90% de las moléculas que se encuentran en configuración trans isomericen previo a la unión con el anticuerpo. La velocidad de asociación del conformero cis por M1 ( kon = 6 x 107 M-1 s-1) se encuentra entre las más rápidas para las interacciones Antígeno:Anticuerpo, a pesar de que la reacción global es extremadamente lenta (t1/2 ~ 4 min). Esto indica que la reacción de asociación se encuentra limitada por un evento de isomerización de prolina. Utilizando mutantes puntuales demostramos que la P41 en su conformación cis es la requerida para la unión con el anticuerpo. Luego del evento lento de pre-equilibrio y de la unión con M1, ocurre un evento de rearreglo unimolecular, formándose finalmente un complejo consolidado de alta afinidad (KD 120 nM). Nuestros resultados sugieren que la presentación de este epítope viral por las células presentadoras de antígeno tiene que haber estado en su configuración minoritaria cis, al generar el clon que produce el anticuerpo específico. Finalmente, mostramos la importancia de los determinantes estructurales presentes en regiones desordenadas en el reconocimiento entre macromoléculas. Dado que numerosas proteínas virales son multifuncionales debido a su naturaleza IDP, los resultados presentados en esta tesis sientan la bases para el análisis del mecanismo de reconocimiento por medio de anticuerpos de epítopes virales intrínsecamente desordenados.

Abstract:
Recognition of antigens by antibodies is a critical event in the adaptive immune response. Furthermore, the Antigen:Antibody complex is extensively used as a model of protein-protein interactions. In the present thesis, we present a detailed mechanistic study of the interaction between a specific monoclonal antibody, M1, with the E7 oncoprotein of human papillomavirus. E7 is the main transforming factor of this virus and also emerges as a paradigmatic example of an intrinsically disordered protein or IDP. E7 is constitutively expressed at high levels in carcinoma tissues and antibodies are frequently raised in patients with cervical cancer. Epitope mapping studies reveal that the M1 antibody specifically recognizes an immunodominant region of the HPV-16 E7 protein called "hinge", located between the IDP N-terminal and the globular C-terminal domains of the protein. Kinetic experiments show that this hinge, which has two proline residues, has at least two populations separated by a high energy barrier (~ 22 kcal / mol). Nuclear magnetic resonance traced the origin of this barrier to a very slow trans/cis prolyl isomerization event present in E7 epitope. The less populated (10%) cis isomer is the binding-competent species. Thus, the 90% of the molecules in the trans configuration require isomerization before binding. The association rate for the cis isomer approaches 6x107 M-1s-1, a ceiling for antigen-antibody interactions, although the overall reaction is extremely slow (t1/2 ~ 4 min). Therefore, the E7 epitope:M1 antibody complex formation is limited by a proline isomerization event. Mutagenesis experiments showed that Pro 41 in the epitope was required for both binding and isomerization. After the slow pre-equilibrium event and M1 binding, a post-binding unimolecular event occurs and a consolidated complex with a KD = 1.2!10-7 M is reached. Our results suggest that presentation of this viral epitope by the antigen presenting cells would have to be “locked” in the cis conformation in opposition to the most populated trans isomer in order to select the specific antibody clone. Finally, we show the importance of the structural determinants within disordered regions in the recognition mechanism between macromolecules. Many viral proteins are multifunctional due to its IDP nature. Therefore, the results presented in this thesis establish the basis for the analysis of the recognition mechanism by antibodies of intrinsically disordered viral epitopes.

Martire Greco, Daiana. "Efecto inmunomodulador del ácido All-Trans Retinoico (ATRA) como estrategia para la reversión de la inmunosupresión asociada a procesos infecciosos en un modelo murino" (2015-03-06) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las infecciones secundarias asociadas a estados de inmunosupresión en pacientes sépticos son la principal causa de muerte en las Unidades de Cuidados Intensivos. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias enfocadas a utilizar drogas que reviertan este estado resulta prometedor. En este trabajo utilizamos el Ácido All-trans Retinoico (ATRA) para estudiar la modulación del estado inmunológico en un modelo murino de inmunosupresión (IS) por administración crónica de lipopolisacáridos. Demostramos un rol primordial de las células mieloides supresoras (Gr-1+ CD11b+ supresoras) en la inhibición de la proliferación T en los animales IS. Esta población adquiere sus propiedades inhibitorias en la médula ósea, y en el contexto de inmunosupresión, es direccionada a los ganglios linfáticos para ejercer su función. Asimismo, el ATRA evidenció claros efectos en el restablecimiento de la proliferación de linfocitos T, asociado a una disminución del número de Gr-1+ CD11b+ supresoras vivas en ganglios linfáticos, acompañado también de un aumento en los linfocitos T CD4+. Asimismo, demostramos que la administración del ATRA a los animales IS mejoró tanto la respuesta inmune innata, en términos de eliminación de un foco bacteriano, como la respuesta inmune humoral primaria. Nuestros resultados demuestran que el ATRA modula la respuesta inmune alterada en el estado de inmunosupresión actuando sobre distintos procesos y representa una estrategia posible para el tratamiento de pacientes sépticos que presenten un estado de inmunosupresión.

Abstract:
Secondary infections associated with immunosuppressive states in septic patients are the leading cause of death in Intensive Care Units. Therefore, the development of strategies aimed at using drugs to reverse this state is promising. In this study we used All-Trans Retinoic Acid (ATRA) to study the modulation of the immune response in a murine model of immunosuppression (IS) by chronic administration of lipopolysaccharide. We demonstrated a key role of Myeloid Suppressor Cells (Gr-1+ CD11b+ suppressors) in the inhibition of T cell proliferation in IS animals. This population acquires its inhibitory properties in the bone marrow, and in the context of immunosuppression, migrates to the lymph nodes to exert its function. Furthermore, ATRA showed clear effects in restoring T cell proliferation associated with a decrease in the number of live Gr-1+ CD11b+ suppressor cells in lymph nodes, also accompanied by an increase in CD4 + lymphocytes. In addition, we showed that administration of ATRA to IS animals improved both the innate and immune response, in terms of bacterial clearance and the primary humoral immune response. Our results demonstrate that ATRA modulates the impaired immune response in LPS-induced immunosuppression acting on different processes, and represents a potential strategy for the treatment of septic patients with an immunosuppressive state.

Sabio y García, Carmen Alejandra. "Impacto de la anafilotoxina C5a en la respuesta inmune inducida por cepas locales de Mycobacterium tuberculosis multirresistentes a drogas" (2015-03-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La tuberculosis es un problema de salud prioritario en Argentina, así como lo es a nivel mundial al punto que la Organización Mundial de la Salud ha declarado la emergencia pública sanitaria global. Este problema se ve agravado por el surgimiento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) multirresistentes a las drogas de primera línea utilizadas para combatirla. En la presente tesis, evaluamos el rol de la anafilotoxina C5a y sus receptores, C5aR y C5L2, sobre la respuesta inmune inducida por las cepas locales de brote multirresistentes a drogas, M y Ra, tomando como referencia la cepa de laboratorio H37Rv. Nuestros resultados muestran que: 1) Mtb induce la producción de C5/C5a en los monocitos y modula la expresión de C5aR y C5L2, receptores del fragmento activado C5a, durante la diferenciación de los monocitos a macrófagos; 2) el receptor C5aR expresado en monocitos participa de la inhibición de la polarización Th1 en la respuesta inducida por la cepa M, impidiendo el aumento de la población CD4+IFNγ+ en respuesta a la estimulación con esta cepa; 3) la interacción C5a-C5aR modula la expresión de las moléculas de superficie CD11b y HLA-DR en monocitos en diferenciación a macrófagos estimulados con las cepas H37Rv, M y Ra; 4) C5a aumenta la producción de intermediarios reactivos del oxígenos inducido por H37Rv y Ra, y puede compensar la disminución en esta respuesta debida la ausencia de señalización por otros receptores involucrados en la misma; 5) H37Rv, M y Ra presentan diferencias en la inducción de las respuestas estudiadas. La cepa M en particular, induce menor respuesta en: inducción de la producción de C5/C5a en monocitos, regulación de la expresión de los receptores C5aR y C5L2, inducción de intermediarios reactivos y ausencia de regulación de su producción por C5a. Aun así, el perfil de activación inducido por esta cepa es susceptible a ser modulado por C5aR. Estos resultados sugieren que C5a es producido como consecuencia de la presencia de Mtb y que esta anafilotoxina actúa, a través de sus receptores, modulando distintos niveles de la respuesta inmune contra este patógeno los cuales son determinantes para el éxito o fracaso de dicha respuesta. Más aún, demostramos que tanto los parámetros estudiados como su modulación por C5a dependen del genotipo bacteriano. Palabras claves: Mycobaterium tuberculosis - cepas multirresistentes a drogas – anafilotoxina C5a – receptores C5aR y C5L2 –monocitos – respuesta T CD4+ – intermediarios reactivos del oxígeno

Abstract:
Tuberculosis is a major health problem in Argentina as well as at a global level, and because of its relevance it was declared as a global public health emergency by the World Health Organization. This problem has been aggravated by the appearance of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) strains resistant to the two first line anti-tuberculosis drugs. In the present thesis, we evaluate the role of C5a anaphylatoxin and its receptors, C5aR and C5L2, in the immune response induced by the local outbreak multidrug-resistant strains, M and Ra, by taking H37Rv as a laboratory reference strain. Our results show that: 1) Mtb induces C5/C5a production by monocytes and modulates C5aR and C5L2, which are receptors of the activated fragment C5a, during monocyte-to-macrophage differentiation; 2) the C5aR receptor expressed in monocytes is involved in the inhibition of M strain-induced Th1 polarization, which prevents the increase of CD4+IFNγ+ T cells in response to this strain stimulation; 3) the C5a-C5aR interaction modulates the surface expression of CD11b and HLA-DR of monocytes in differentiation to macrophage stimulated with H37Rv, M or Ra strains; 4) C5a increases reactive oxygen species (ROS) production induced by H37Rv and Ra, and is able to compensate the decrease of ROS production due to the absence of signaling from other receptors involved in this response; 5) H37Rv, M and Ra display different immune responses. Particularly, M strain induces a weaker response in: monocyte C5/C5a production, the regulation of C5aR and C5L2 expression, the induction of ROS production and lack of C5a regulation of this last response; yet, the activation profile induced by this strain is susceptible to C5aR modulation. These results suggest that C5a is produced in response to Mtb and acts, through it receptors, modulating the immune response against this pathogen at different levels which are determinants for the success or failure of this response. Moreover, we demonstrated that the bacterial genotype influences both the analyzed parameters and their modulation through C5a. Keywords: Mycobaterium tuberculosis – multidrug resistant strains – monocytes – C5a anaphylatoxin – C5aR and C5L2 receptors– CD4+ T cells response – reactive oxygen species

Ghiglione, Yanina Alexandra. "Análisis de potenciales correlatos inmunes de control en la infección por HIV-1 durante la serconversión y el primer año de infección" (2015-03-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En los últimos años, se ha puesto especial énfasis en el estudio de la respuesta T CD8+ dado el rol central que esta juega en el control de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV, human immunodeficiency virus). Sin embargo sigue siendo clave la identificación y compresión de nuevos correlatos inmune de protección. Más aún, la etapa de infección aguda representa un escenario propicio para el estudio de las funciones que mejor se correlacionan con control viral. El objetivo de esta tesis fue analizar la especificidad, funcionalidad y el fenotipo de la respuesta T CD8+ HIV-específica en una cohorte de individuos recientemente infectados y su asociación con el control de la replicación viral y de la progresión a la enfermedad (evaluado mediante la carga viral, recuento de células T CD4+ y activación inmune), durante la seroconversión y el primer año de infección. Se obtuvieron muestras de sangre de 51 individuos reclutados dentro de los primeros 6 meses desde la fecha probable de infección (PHI, Primary HIV infection); 22 sujetos crónicamente infectados (Crónicos) y 14 sujetos controladores elite (EC, Elite Controllers). Se observó que, a pesar que Nef dominó la respuesta anti-HIV durante la infección aguda/temprana, la aparición temprana de una alta proporción de células T anti- Gag se correlacionó con un retraso en la progresión. Las células T CD8+ HIV-específicas polifuncionales fueron detectadas en tiempos tempranos post-infección pero no se asociaron con control viral. Por el contrario, se observó que los sujetos PHI que presentaban células T CD8+ con una mayor capacidad de mediar actividad antiviral (VIA, viral inhibitory activity), en la muestra basal, presentaron set points inmunes más elevados. Además, los niveles de VIA se correlacionaron con la magnitud de la respuesta T CD8+ anti-Gag. A su vez, las células T CD8+ Gag-específicas mostraron una mayor capacidad de mediar la lisis de células infectadas (lo cual se evidenció por una mayor capacidad de degranulación) y de producir, de manera simultánea, INF-γ lo cual les conferiría una ventaja para ejercer su actividad antiviral. Por otro lado, se observó que la distribución de las subpoblaciones de memoria de las células T CD8+, tanto totales como de las HIV-específicas, se encuentra sesgada en los individuos PHI, pero no alcanza los niveles dramáticos observados en los sujetos Crónicos. El análisis de la expresión de PD-1 en los individuos PHI, tanto en las células T CD8+ totales como HIV-específicas, reveló no sólo una asociación con progresión a la enfermedad si no también con el perfil de memoria de la población celular T CD8+. Notablemente, se obtuvieron correlaciones directas entre los niveles de VIA y la proporción de células T CD8+ con fenotipo terminal, tanto en la muestra basal como a los 12 meses post-infección. En consecuencia, se estableció una relación entre la preservación de la ruta de diferenciación de las células T CD8+ y la funcionalidad de las mismas. Esta tesis representa el primer trabajo donde se realizó una caracterización completa de la respuesta T CD8+ en una cohorte Argentina de individuos cursando la infección aguda/temprana por HIV. El poder descifrar la relación que existe entre la características que definen a las células T CD8+ con los niveles de activación inmune, el control viral y la progresión a la enfermedad en los distintos estadíos de la infección (como son la infección primaria, crónica o en EC), como ha sido llevado a cabo en esta tesis, es primordial para profundizar en el conocimiento que se tiene de la inmunopatogénesis del virus. Además, esta información es de suma importancia para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas frente al HIV así como en el diseño y posterior testeo de vacunas que promuevan una respuesta beneficiosa.

Abstract:
Given the central role that HIV-specific CD8+ T-cells play in the control of the human immunodeficiency virus (HIV) replication, special emphasis has been focused on this cell population. However, correlates of immune protection remain elusive. Moreover, the acute phase of infection represents a proper scenario to delineate the antiviral cellular functions that best correlate with virus control. The aim of the present study was to analyze specificity, functionality and phenotype of the HIV-specific immune response in a cohort of acute/early HIV-infected individuals and their associations with viral control and disease progression, during the seroconvertion and the first year post-infection. Blood samples from 51 subjects recruited within 6 months from infection (primary HIV infection ); 22 chronically infected subjects (Chronics) and 14 Elite Controllers (EC) were obtained. Results indicated that, although Nef dominated the anti-HIV response during acute/early infection, a higher proportion of early anti-Gag T cells correlated with delayed progression. Polyfunctional HIV-specific CD8+ T cells were detected at early time points but did not associate with virus control. Conversely, higher CD4+ T-cell set points were observed in PHI subjects with higher capacity of the CD8+ T-cells to mediate ex vivo viral inhibitory activity (VIA), at baseline. Importantly, VIA levels correlated with the magnitude of the anti-Gag cellular response. The advantage of Gag-specific cells relied on their enhanced ability to mediate lysis of infected cells (evidenced by a higher capacity to degranulate) and to simultaneously produce IFN-γ. Moreover, it was found that normal maturation of total and HIV-specific CD8+ T-cells into memory subsets is skewed in PHI, but not at the dramatic level observed in Chronics. Analysis of PD-1 expression, on bulk and HIV-specific CD8+ Tcells, from PHI subjects revealed not only an association with disease progression but also with skewed memory CD8+ T-cell differentiation. Most notably, significant direct correlations were obtained between the VIA levels and the higher proportions of fully-differentiated HIVspecific CD8+ T cells, both at baseline and at 12 months post-infection. Thus, a relationship between preservation of CD8+ T-cell differentiation pathway and cell functionality was established. This thesis represents the first work were a fully characterization of the CD8+ T-cell response have been performed in a cohort of acute/early HIV-infected individuals from Argentina. Unscrambling relationships among the CD8+ T-cell characteristics, immune activation, viral control, and disease progression in multiple settings (primary infection, viremic Chronics and ECs), such as those observed in this work, are increasingly important to advance our understanding of HIV pathogenesis. As well, this information will be instrumental for therapeutic and sterilizing vaccine design in order to boost our ability to elicit beneficial responses.

Carballeda, Juan Manuel. "Estudio de la relación del virus de la Bursitis Infecciosa con su hospedador. Análisis de la respuesta inmune y de la función y localización de la proteína viral VP5" (2015-03-25) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las aves representan un eslabón fundamental en la economía internacional. A nivel mundial, alrededor del 40% de la carne consumida es de origen aviar. La industria avícola ha experimentado en los últimos años un crecimiento muy importante tanto dentro del mercado local como del internacional, permitiendo ubicar a la Argentina en el octavo lugar como exportador mundial de carne de pollo junto con otros productos. El tipo de crianza intensiva utilizada dentro de la producción avícola facilita la aparición de factores que perjudican la estabilidad de los planteles, afectando si status sanitario. Por otra parte, tanto las enfermedades respiratorias como las inmunosupresoras suelen estar íntimamente asociadas con este tipo de crianza. El virus de la Bursitis Infecciosa Aviar (IBDV) es un patógeno de alta relevancia en la producción avícola debido a que causa, entre otros efectos, inmunosupresión, dejando así a los animales propensos a nuevas infecciones. El blanco principal del IBDV es la bursa de Fabricio, órgano exclusivo de las aves, donde se desarrollan y maduran los linfocitos B. En el presente trabajo de tesis doctoral se abordó el estudio de la respuesta inmune inducida por cepas de virulencia intermedia, habitualmente utilizadas como vacunas, en el hospedador natural. Se analizaron distintas facetas como la inducción de la expresión de citoquinas en distintos órganos, la capacidad de proliferación de linfocitos y las poblaciones celulares involucradas. Se estudiaron las vías de inoculación oral e intramuscular, habitualmente utilizadas en la vacunación comercial siendo la oral la vía de entrada natural del virus. Los resultados mostraron que altas dosis de virus de cepas intermedias son capaces de imitar efectos reportados con cepas de mayor virulencia como son: una fuerte infiltración de linfocitos T en la bursa de Fabricio (analizada por citpmetría de flujo), junto con una sobreexpresión de interleuquina 6 e inter ferón gama en este órgano (analizado por RT-PCR en tiempo real) e inmunosupresión (corroborada en ensayos de coinfección con otro agente viral aviar). La segunda parte del presente trabajo de tesis se abocó al estudio de la proteína no estructural VP5 de IBDV. Su función ha sido ampliamente discutida en la bibliografía respecto a su actividad apoptótica, ya que parece tener efectos opuestos en distintos estadíos del ciclo de replicación viral. Por otra parte, también existen reportes ambiguos respecto a su localización subcelular. En el presente trabajo, mediante ensayos in vitro y utilizando técnicas de Imaging, se determinó la localización de la proteína en la membrana plasmática no exponiendo ningún dominio al espacio extracelular, contradiciendo reportes que indicaban que se trataba de una proteína de transmembrana de clase dos. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis permitieron desarrollar un método de desafío sin utilizar cepas virulentas de IBDV. Asimismo se caracterizó una amplia variedad de efectos de cepas de virulencia intermedia del virus que, aunque son habitualmente utilizadas como vacuna, no habían sido descriptos hasta el presente trabajo de tesis. En la segunda parte, se determinó la localización de la proteína viral VP5. Estos resultados brindan un abanico de posibles mecanismos de acción de la misma, que luego de ser abordados posibilitarán el desarrollo de herramientas y estrategias sanitarias para combatir este importante patógeno aviar.

Abstract:
Birds play an important role in the international economy. Globally, about 40% of the meat consumed is of avian origin. In recent years, the poultry industry has exhibited a significant growth both in the local and international market, being Argentina the eighth largest exporter of chickens along with other avian products. The intensive breeding in poultry production facilitates the emergence of factors that affect the stability of the farms diminishing their health status. Moreover, both respiratory and immunosuppressive diseases are other closely associated with this type of production. Infectious bursal disease virus (IBDV) is a highly relevant avian pathogen in poultry production because it causes, among other effects, immunosuppression, leaving the animal susceptible to new infections. The main target of IBDV is the bursa of Fabricius, which is the organ where B-lymphocytes develop and mature. In the present work, we studied the immune response elicited by IBDV strains of intermediate virulence, commonly used as vaccines, in the natural host. Several parameters, such as the induction of cytokine expression in different organs, the ability of lymphocyte proliferation and the involved cell populations in inoculated chickens were analyzed. The oral and intramuscular routes, usually employed in conventional immunization procedures (the oral route being natural virus entry) were analyzed. The results showed that high doses of intermediate IBDV strains are able to mimic the effects caused by virulent strains, such as a strong infiltration of T lymphocytes in the bursa os Fabricius (assessed by flow cytometry), together with an overexpression of interleukin 6 and interferon gamma in this organ (analyzed by real time RT-PCR) and immunosuppression (demonstrated) by coinfection assays with another avian viral pathogen). The second part of this thesis focuses on the study of VP5, a non-structural protein of IBDV. Its role has been widely discussed in the literature regarding its apoptotic or anti-apoptotic function because it could have opposite effects at different stages of the viral replication cycle. Additionally, there are ambiguous reports concerning VP5 subcellular localization. By in vitro assays using Imaging techniques, we determined the localization of the protein in the plasma membrane of avian cells. Results showed that VP5 did not expose any domain to the extracellular space even though previous reports had indicated that it was a class two transmembrane protein. The results obtained in this thesis allowed the development of a method for viral challenge without using virulent strains of IBDV. Also, the characterization of a wide variety of effects induced by intermediated IBDV strains, which had not been described so far, although these strains are commonly used as a vaccine, were described. In the second part, the localization of VP5 viral protein was determined. Taken together, the results obtained in the present work provide a broad range of possible mechanisms of action for this protein that will contribute to the development of new sanitary tools and strategies to fight against this important avoan pathogen.

Mon, María Laura. "Nuevas estrategias para el diagnóstico de la tuberculosis y paratuberculosis bovina" (2015-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Tuberculosis (TBB) y Paratuberculosis bovina (PTB) son las principales enfermedades que limitan el desarrollo de la industria lechera y de la carne en Argentina, siendo importantes en el contexto de la Sanidad animal debido a las grandes pérdidas económicas que producen en el ganado bovino. La TBB es producida por M. bovis. El hospedador primario es el bovino, pero otras especies de interés económico, así como también especies salvajes se infectan con esta micobacteria. La TBB es considerada una de las zoonosis más importantes en Argentina, siendo más expuestos los trabajadores rurales y de frigorífico, así como, los que consumen leche cruda sin pasteurizar. No existen vacunas comerciales contra la TBB, por lo tanto disponer de métodos de diagnóstico confiables para la identificación de los animales enfermos es esencial. La prueba oficial de diagnóstico más empleada, aprobada por el SENASA, es la intradermoreacción (IDR) con PPD-B, la cual consiste en la inoculación intradérmica de un derivado proteico purificado de la cepa de M. bovis AN5 (PPD-B), y la posterior medición de la reacción de hipersensibilidad retardada producida. La PPD-B es una mezcla de componentes, principalmente proteínas y lípidos de M. bovis. El principal inconveniente de la IDR radica en que algunas proteínas presentes en la PPD-B se encuentran en otras micobacterias, lo cual disminuye la especificidad, ya que animales sensibilizados por exposición previa a otras micobacterias también responden a este reactivo. En la última década se desarrollaron nuevas pruebas para el diagnóstico de tuberculosis, la más difundida consiste en la medición de IFN- luego de la estimulación de linfocitos con PPD-B o antígenos específicos de M. bovis. Otro método utilizado para el diagnóstico de TBB es la prueba de ELISA, sin embargo esta sólo permite detectar animales en estados severos de la enfermedad o en estado de anergia. Por otro lado, la PTB es una enfermedad infecciosa, producida por M. avium subsp. paratuberculosis (MAP), la cual se caracteriza por una enteritis crónica que resulta en un deterioro progresivo del animal enfermo. Afecta principalmente al ganado bovino, ovino y caprino. El diagnóstico de certeza de PTB es el aislamiento de MAP, pero este es un microorganismo de crecimiento muy lento. Por estas razones, los métodos inmunológicos para el diagnóstico de PTB resultan más efectivos para aplicar en una campaña de erradicación de la enfermedad que el cultivo. El diagnóstico inmunológico de PTB es principalmente serológico debido a que en estadios tempranos de la enfermedad se detectan anticuerpos. Contrariamente a lo que sucede con TBB, el diagnóstico serológico en PTB permite detectar con mayor especificidad los animales infectados que las pruebas que miden respuesta celular. Actualmente hay varios kits comerciales serológicos disponibles con diferentes antígenos, pero estos han demostrado discrepancia en la capacidad de ser detectados por todos los animales infectados. También hay vacunas comerciales disponibles para PTB, pero estas no son utilizadas en nuestro país debido a que interfieren con el diagnóstico de TBB. Por lo mencionado, en este trabajo se identificaron y evaluaron antígenos específicos de M. bovis y MAP para mejorar el diagnóstico de ambas enfermedades y poder contar en el futuro con herramientas que permitan la utilización de vacunas en desarrollo para la erradicación de la TBB y PTB. Para este fin, se identificaron por técnicas de proteómica, antígenos en aquellas fracciones proteicas más inmunogénicas de la PPD-B. A partir de las proteínas identificadas, se evaluaron 2 mezclas de antígenos altamente inmunogénicos identificados ya en trabajos previos en nuestro laboratorio, ESAT- 6, CFP-10, MPB-83, MPB-70, HSPX y TB10.3. Además de ser altamente inmunogénicos ESAT-6 y CFP-10 tienen la ventaja de que no se encuentran en la vacuna BCG, con lo cual son útiles para un diagnóstico DIVA (diferenciando vacunados de infectados). Estas mezclas resultaron ser más específicas que la PPD-B al no ser detectadas por animales vacunados con BCG, ni animales con PTB o sanos. Para mejorar la sensibilidad de estas mezclas se incluyeron otras proteínas identificadas en este estudio, no estudiadas hasta el momento: FixB y CFP2. Las nuevas mezclas incluyendo a estas proteínas, fueron evaluadas por las técnicas de IFN- e IDR, en animales naturalmente infectados con M. bovis, animales con PTB y animales sanos. En base a estos resultados, se observó que FixB aumentó la sensibilidad de las mezclas sin comprometer la especificidad. Luego estas mezclas fueron evaluadas en una prueba serológica, siendo detectadas también específicamente por los sueros de animales infectados con M. bovis. Nuestros resultados demuestran que una nueva mezcla compuesta por las proteínas recombinantes CFP-10, ESAT-6, MPB83 y FixB, es un promisorio nuevo reactivo para aplicar al diagnóstico específico de TBB tanto celular como serológico, sin interferencias con animales sensibilizados con otras micobacterias o vacunados con BCG. En cuanto la evaluación de antígenos de MAP para utilizar en el diagnóstico de PTB, se evaluó un panel de 51 antígenos por la técnica de MAPIA. Esto permitió seleccionar 7 antígenos específicos: Map2513, Map1693c, Map2020, Map0038, Map1272, CSP, Map0210c, los cuales fueron detectados específicamente por los sueros de animales con PTB. En base a esto, se realizó una mezcla con los 7 antígenos (M1-PTB), la cual se evaluó también por MAPIA. Por otra parte se identificaron proteínas antigénicas a partir de PPD-A (Derivado proteico purificado a partir de M. avium por técnicas de proteómica identificándose 3 proteínas las cuales también se evaluaron por la técnica de MAPIA, conformando una segunda mezcla (M2-PTB). esta mezcla resultó sensible, pero no específica. Luego M1-PTB y M2-PTB fueron evaluadas con mayor cantidad de sueros de animales con PTB y con un grupo de animales con TBB por la técnica de ELISA, comparando con el ELISA convencional PPA-3 que utiliza un antígeno protoplasmático de MAP. M1- PTB tuvo sensibilidad del 33% y no exhibió reacción cruzada con sueros de animales sanos y la reactividad con el suero de animales con TBB fue muy baja mostrando una mayor especificidad que el ELISA-PPA-3. El panel de 51 antígenos también fue evaluado por la técnica de IFN-ningún antígeno de MAP demostró capacidad de liberar esta citoquina en valores que permitan su utilización en un test que mida respuesta celular. Los resultados presentados en este trabajo sugieren que varios antígenos específicos tanto de M. bovis como de MAP pueden mejorar la detección de la infección pudiendo permitir además el uso de vacunas tanto contra PTB como TBB, sin que estas interfieran en el diagnóstico.

Abstract:
Tuberculosis (TBB) and bovine paratuberculosis (PTB) are the main diseases that limit the development of dairying and beef in Argentina, being important in the context of animal health, due to the large economic losses that occur in cattle. TBB is produced by M. bovis. The primary host is cattle but other species of economic interest as well as wild species are infected with this mycobacterium. TBB is considered one of the most important zoonoses in Argentina where rural workers and those who consume raw unpasteurized milk are primarily exposed. There are no commercial vaccines against TBB therefore having reliable diagnostic methods its essential. The official diagnostic test, approved by SENASA is the tuberculin test (IDR), which involves intradermal inoculation of a purified protein derivative of M. bovis strain AN5 (PPD-B), and subsequent measuring of the delayed hypersensitivity reaction. PPD-B is a mixture of components, proteins and lipids from M. bovis. The main disadvantage of the IDR is that some proteins present in the PPD-B are in others mycobacteria, which decreases the specificity, since animals sensitized by previous exposure to other mycobacteria also respond to this reagent. In the last decade, new tests for the diagnosis of tuberculosis were developed; the most widespread is the measurement of IFN- after lymphocyte stimulation with PPD- B or specific M. bovis antigens. Another method used for TBB- diagnosis is the ELISA, but this only allows detecting anergic animals in severe disease states. Furthermore, PTB is an infectious disease caused by M. avium subsp. paratuberculosis (MAP), which is characterized by chronic enteritis resulting in a progressive deterioration of the animal. Primarily affects cattle, sheep and goats. Definitive diagnosis of PTB is the isolation of MAP, but this is a very slow growing organism. For these reasons, immunological methods for PTB diagnosis are more effective to implement in a campaign to eradicate the disease than culture. Immunological PTB diagnosis is primarily serologic because in the early stages of the disease antibodies are detected. Contrary to what happens with TBB, serological PTB diagnosis has a greater specificity to detect infected animals than cellular response test. Currently, several serological commercial kits are available with different antigens, but these have shown discrepancy in the ability to detect all infected animals. There are also commercial PTB-vaccines available, but these are not used in our country because they interfere with TBB diagnosis. In this study M. bovis and MAP specific antigens were identified and evaluated to improve the diagnosis of both diseases and to have tools in the future that allow the use of vaccines in development for the eradication of TBB and PTB. For this purpose, antigens were identified by proteomic techniques in those immunogenic PPD-B protein fractions. From this, 2 mixtures composed by highly immunogenic antigens identified in previous studies in our laboratory, ESAT-6, CFP-10, MPB-83, MPB-70, HSPX and TB10.3, were evaluated. Besides, being highly immunogenic ESAT-6 and CFP- 10 have the advantage of not to found in BCG, thereby serve as a diagnostic DIVA (differentiating vaccinated from infected). These mixtures were more specific than PPD-B not reacting with BCG-vaccinated animals, or PTB-infected or healthy animals. To improve the sensitivity of these cocktails, two unknown proteins, CFP2 and FixB were included. These new cocktails were evaluated by IFN- release assay and IDR. Based on these results, it was observed that FixB increased the sensitivity without compromising the specificity. Our results demonstrate that a novel mixture comprising the recombinant proteins CFP-10, ESAT-6, MPB83 and FixB, is a promising new reagent for specific diagnosis applied to both cellular and serological TBB without interference with other mycobacteria sensitized animals. Thus, the mixture can be used for diagnosis of TBB, and also applied in BCG vaccinated animals without interfering. As the evaluation of MAP antigens for PTB-diagnosis, a panel of 51 antigens was evaluated by MAPIA (multi-print antigen immunoassay). This allowed selecting 7 specific antigens: Map2513, Map1693c, Map2020, Map0038, Map1272, CSP, and Map0210c. Based on this, a mixture with the seven antigens (M1-PTB) was performed, which was also evaluated by MAPIA. Moreover, PPD-A antigenic proteins were identified by proteomic techniques. Three proteins from these were also evaluated by the technique of MAPIA, forming a second mixture (M2 -PTB). After this, both cocktails were evaluated with greater amount of sera from MAP and M. bovis infected animals by ELISA, comparing with conventional ELISA-PPA-3 using a M. avium protoplasmic antigen. M1-PTB had a sensitivity of 33% and exhibited no crossreaction with healthy animals and the reactivity of TBB animals was very low, being more specific than ELISA-PPA-3. The panel of 51 antigens was also evaluated by the technique of IFN-any antigen was very inmunogenic to allow their use in a test to measure cellular response. The results presented in this thesis suggest that several specific M. bovis and MAP antigens can improve the detection of infection and also allow the use of vaccines for both PTB as TBB, without interfering with the diagnosis.

Pascuan, Cecilia Gabriela. "Alteraciones neuroinmunes inducidas por exposición a estrés prenatal. Participación de citoquinas y neurotrofinas. Influencia del sexo de la cría" (2015-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo estudiamos el efecto del estrés prenatal (EP) en la respuesta neuroinmune en animales adultos. Observamos que machos y hembras respondieron diferente ante el EP, tanto a nivel inmunológico como comportamental. Los machos presentan una mayor respuesta inmune innata en relación a una mayor secreción de IFN-γ. Las hembras presentan algunos trastornos conductuales asociados posiblemente a una disminución de BDNF así como también a un aumento central y periférico de IL-4 y a una disminución periférica de IFN-γ. Ante nuevas situaciones de estrés en la adultez observamos que, las hembras EP tienen una respuesta inmune desmejorada ante situaciones de estrés agudo y un peor desempeño en aquellas pruebas que evalúan la memoria espacial al ser expuestas a estrés crónico. Las alteraciones inmunológicas podrían estar relacionadas con una disminución del balance Th1/Th2 y un mayor efecto inhibitorio de los glucocorticoides. Los trastornos conductuales podrían estar asociados a una disminución del BNDF y a un aumento de los receptores a GC en hipocampo inducidos por EP. Los machos EP expuestos a estrés en la adultez presentan un aumento en la respuesta inmune innata que estaría relacionado con un aumento en los niveles de IFN-γ. Sin embargo, tienen una disminución en la inmunidad adaptativa, que al igual que las hembras, tendría relación con el mayor efecto inhibitorio ejercido por la corticosterona. Por otro lado, en los machos tanto controles como EP, la exposición a estrés agudo o crónico no indujo alteraciones importantes en las pruebas comportamentales realizadas. Los resultados encontrados nos permiten concluir que el estrés materno induce cambios neuroinmunes en las crías que se pondrían especialmente en evidencia cuando estos individuos deben enfrentarse a nuevas situaciones de estrés en la adultez, siendo las hembras más sensibles que los machos. Además, hallamos que los cambios inducidos por exposición a EP se dan paralelamente en el hipocampo y en las células del sistema inmune. Podría entonces sugerirse que estas células pueden ser indicadores periféricos de una mayor susceptibilidad a padecer trastornos al ser expuestos a nuevas situaciones de estrés en la adultez.

Abstract:
In the present work we studied the effect of prenatal stress (PS) in the neuroimmune response in adult animals. We observed a different response to PS between male and female, regarding immune and behaviour parameters. Male mice showed higher innate immune response evidenced by the increase in NK activity, possibly because of a higher release of IFN-γ. Female mice presented some behavioural disorders associated to a decrease in BDNF, as well as to an increase in central and peripheric IL-4 and to a peripherical decrease of IFN-γ. In a new stressful situation in adult life, female PS present a reduced immune response caused by acute stress and a worse performance in spatial memory test caused by chronic stress. Immunologic alterations could be related to a decrease in the Th1/Th2 balance and to a higher inhibitory effect of glucocorticoids. Behavioural disorders could be associated to a decrease in BDNF and to a increase of hippocampal GC receptors induced by PS. PS male mice exposed to adult stress showed an increase in innate immune response which could be related to an increase in IFN-γ levels. However, they have a reduction in adaptative immune response, which as in the female, could be related to the higher corticosterone inhibitory effect. Also, in control and PS males no changes in behaviour tasks were caused by acute or chronic stress. In conclusion, prenatal stress induce neuroimmune changes in the offspring that could be evidenced specially when the individuals are exposed to a new stressful situation in the adult life, being female more vulnerable than male mice. Furthermore, we found that changes induced by PS exposure occur simoultaneusly in hippocampus and in immune cells. We could suggest that these cells could be peripheral markers of susceptibility to deletereous effects of stress exposure in the adult life.

Ziblat, Andrea. "Regulación del fenotipo y funcionalidad de las células Natural Killer humanas por IL-23 e IL-27, nuevas citoquinas de la familia de IL-12" (2015-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células NK son células del sistema inmune, críticas en la defensa contra células tumorales y células infectadas, que se activan luego de sensar señales a través de receptores activadores y por acción de citoquinas secretadas por macrófagos y células dendríticas (CD), entre las cuales IL-12 es considerada una de las más relevantes. Recientemente se han descripto nuevos miembros de la familia de IL-12, entre ellos IL-23 e IL-27. IL-23 posee efectos pro-inflamatorios, pero existen datos contradictorios en cuanto a su rol en el contexto tumoral. En cambio, IL-27 induce una potente respuesta anti-tumoral, pero posee efectos tanto pro- como anti-inflamatorios. Debido a que el efecto de estas citoquinas sobre las células NK humanas aún no ha sido investigado, el objetivo de esta tesis doctoral fue estudiar el efecto de IL-23 e IL-27 sobre estas células. En primer lugar, demostramos que IL-23 e IL-27 secretadas por CD contribuyen a estimular la producción de IFN-γ por células NK. Mediante el empleo de inhibidores farmacológicos, demostramos que la estimulación de células NK con las citoquinas recombinantes indujo la producción de IFN-γ a través de la activación de las vías de JNK, PI3K, MEK1/2, NF-κB y mTOR, y que IL-27 activó además a STAT-1. Observamos también que tanto IL-23 como IL-27 generaron un efecto de priming para IL-18, exhibiendo estas citoquinas un efecto sinérgico con IL-18 para la secreción de IFN-γ. En el caso de IL-27, dicho efecto involucró un aumento en la expresión de T-bet y del receptor de IL-18. A su vez, ambas citoquinas indujeron un aumento en la expresión de los marcadores de activación celular CD25 y CD69, y potenciaron la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. IL-27, pero no IL-23, estimuló la respuesta citotóxica de las células NK de manera dependiente de NKp46 y de las vías de NF-κB y mTOR, a través de la vía secretoria y de TRAIL, pero no la de FasL. Detectamos además que IL-18 potenció la actividad citotóxica inducida por IL-27 a través de la inducción de un aumento en la expresión de ICAM-1 en las células blanco mediado por IFN-γ. En conjunto estos resultados indican que IL-23 e IL-27 estimulan las funciones efectoras de las células NK, lo que puede ser relevante durante situaciones tanto fisiológicas como patológicas.

Abstract:
NK cells are immune cells, critical during immunity against intracellular infections and tumors, that became activated after recognition through activating receptors and macrophage and dendritic cell (DC)-derived cytokines, among which IL-12 is considered to be one of the most relevant. New members of the IL-12 family have been recently described, including IL-23 and IL-27. IL-23 display pro-inflammatory properties, however its role during the anti-tumor immune response is controversial. On the other hand, IL-27 induces a potent anti-tumor immune response, but shows pro- and anti-inflammatory effects. The effect of these cytokines on human NK cells has not been yet studied, thus the objective of this doctoral thesis was to study the effects of IL-23 and IL-27 on human NK cells. We first demonstrated that DC-derived IL-23 and IL-27 induced an enhanced production of NK cell-derived IFN-γ through the activation of JNK, PI3K, MEK1/2, NF-κB and mTOR pathways. In addition, IL-27 also activated the STAT-1 pathway. We also observed that IL-23 as well as IL-27-primed NK cells for IL-18-induced IFN-γ secretion, showing a synergistic effect, which in the case of IL-27 was associated with upregulation of T-bet and IL-18 receptor expression. Moreover, both cytokines induced upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and enhanced the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. IL-27, but not IL-23, stimulated NKp46-dependent NK cell-mediated cytotoxicity through NF-κB and mTOR pathways. In addition, the TRAIL and secretory pathways, but not Fas-FasL interaction, are involved in this effect. We have also observed that IL-18 enhanced the IL-27-induced cytotoxic activity through the upregulation of ICAM-1 on target cells, mediated by IFN-γ. Together our results show that IL-23 and IL-27 stimulate NK cell effector functions, which may be relevant during different physiological as well as pathological situations.

Maeto, Cynthia Alejandra. "Optimización de un esquema de inmunización de mucosas frente al HIV basado en la combinación de los vectores ADN y del virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) (ADN/MVA): ADN-IL-12 junto con la subunidad B de la toxina colérica (CTB) cooperan en el incremento de la respuesta celular a nivel sistémico y de la mucosa del tracto genital" (2015-04-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Un desafío importante para el desarrollo de vacunas frente a infecciones adquiridas por vía de mucosas es poder inducir una respuesta inmune local, con el fin de evitar la diseminación del patógeno al resto del organismo. Actualmente, el esquema de inmunización utilizado ampliamente en ensayos clínicos para HIV, y otros patógenos para los cuales se requiere inducir una respuesta inmune celular específica, es el denominado “prime-boost” que consiste en la utilización de distintos vectores vacunales durante la inmunización tales como los vectores de ADN recombinantes y aquellos basados en el virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA). En este trabajo de tesis doctoral se utilizó un esquema ADN-prime/MVA-boost por ruta de mucosas, donde ambos vectores expresan la glicoproteína de envoltura de HIV y se analizó el efecto adyuvante de ADN-IL-12 con la subunidad B de la toxina colérica (CTB) en ratones BALB/c con el fin de potenciar la respuesta inmune específica frente al HIV a nivel sistémico y de la mucosa del tracto genital. Los resultados obtenidos demostraron que esta combinación de adyuvantes mejoró la respuesta inmune celular no sólo a nivel sistémico, sino también en ganglios drenantes de la mucosa genito-rectal, y más importante aún, en el tracto genital, observándose un incremento en la magnitud, amplitud y calidad de la respuesta. En conclusión, la combinación de los adyuvantes ADN-IL-12 + CTB podría ser potencialmente utilizada como adyuvantes de mucosas en vacunas ADN/MVA, no sólo para antígenos de HIV sino también para otras enfermedades infecciosas con impacto en mucosas.

Abstract:
An important challenge to develop a vaccine against mucosal infections is inducing a local immune response to prevent the pathogen dissemination to the rest of the organism. Nowadays, the immunization scheme used currently in clinical trials for HIV and other pathogens for which the induction of a specific cellular immune response is needed, is the so called “prime-boost”. It consists in the application of different vaccine vectors during the immunization, such as DNA vectors and Modified Vaccinia Ankara (MVA) virus vectors. In this thesis, we applied a DNA-prime/MVA-boost scheme by mucosal route which both vectors express the HIV envelope glycoprotein. We analyzed the adjuvant effect from DNA-IL-12 with the cholera toxin B (CTB) in BALB/c mice to enhance the systemic and mucosal genital tract specific immune response against HIV. The results showed that this adjuvant combination improved the cellular immune response not only at systemic level, but also in the genito-rectal draining lymph nodes and more important, in the genital tract, enhancing the magnitude, amplitude and quality of HIV-specific response. In conclusion, the combination of DNA-IL-12 + CTB could be potentially used as mucosal adjuvants in a DNA/MVA vaccine not only for HIV antigen but also for other infectious diseases that impact mucosal tissues.

Sabbione, Florencia. "Propiedades inmunomodulatorias de las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs)" (2016-03-04) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La injuria pulmonar produce la liberación de ácido úrico que, a concentraciones locales elevadas, precipita formando cristales de urato monosódico (MSU). Estos cristales producen una considerable inflamación asociada a infiltración neutrofílica. Luego de la estimulación con MSU, los neutrófilos liberan trampas extracelulares (NETs), compuestas por cromatina y proteínas granulares, nucleares y citoplasmáticas asociadas. En este trabajo se estudió si las NETs inducidas por MSU (NETs-MSU), poseen propiedades inmunoregulatorias tanto sobre células epiteliales pulmonares como sobre otras células del sistema inmune innato como células dendríticas y macrófagos. Se observó que las NETs-MSU incrementaron significativamente la secreción de interleuquina (IL) 8 e IL-6 por células epiteliales pulmonares y bronquiales. Estos efectos no fueron reproducidos por sobrenadantes de neutrófilos estimulados con MSU en presencia de inhibidores de la netosis, como un inhibidor de elastasa o el inhibidor de la NADPH oxidasa DPI. Las NETs-MSU no afectaron la viabilidad de las células epiteliales, ni su morfología, como tampoco la integridad de la barrera epitelial formada por células epiteliales polarizadas. La capacidad estimulatoria de citoquinas de las NETs no fue afectada por la degradación del ADN con nucleasa micrococal, ni tampoco por el tratamiento de las mismas con heparina o cuando la actividad de la elastasa asociada a las NETs fue bloqueada con un inhibidor. Sin embargo, el efecto observado fue revertido al tratar a las NETs con un anticuerpo bloqueante de la proteína del grupo de alta movilidad (HMGB1). El efecto proinflamatorio de las NETs se observó también en macrófagos humanos derivados de monocitos pero no en células dendríticas derivadas de monocitos, indicando que las propiedades proinflamatorias de las NETs-MSU son específicas de ciertos tipos celulares. En conjunto, los resultados de esta tesis indican que las NETs inducidas por MSU inducen efectos proinflamatorios en células de las vías respiratorias, que podrían contribuir al reclutamiento de neutrófilos in vivo y a la perpetuación de la inflamación y al daño del tejido pulmonar. Nuestros hallazgos podrían ser relevantes para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una inflamación marcada del tracto respiratorio, como la fibrosis quística y el daño pulmonar agudo (ALI). En estas patologías, a pesar de haberse corroborado la presencia de grandes cantidades de NETs en el tracto respiratorio, el tratamiento con DNasas no logra resolver el cuadro inflamatorio. Los resultados de este trabajo de tesis, indicando que el tratamiento de las NETs con MNasa no reduce su capacidad proinflamatoria permiten especular que tratamientos tendientes a limitar la producción de las NETs o a bloquear a la molécula HMGB1, podrían representar opciones terapéuticas más apropiadas a fin de mitigar la inflamación que acompaña a estas patologías.

Abstract:
Lung tissue injury leads to the release of uric acid which at high local concentrations forms monosodium urate crystals (MSU). These crystals trigger robust neutrophilic inflammation. Upon MSU stimulation, neutrophils release extracellular traps (NET) composed by chromatin and antimicrobial proteins associated. Here we investigated whether MSU-induced NET could be involved in the development of inflammation by stimulating cytokine release by airway epithelial cells and other relevant innate immune cells such as dendritic cells and macrophages. We found that MSU-induced NET significantly increased the secretion of IL-8 and IL-6 by lung and bronchial epithelial cells. These effects were not observed when NETosis was impaired by Diphenyleneiodonium or elastase inhibitor. Furthermore, NET did not affect the viability of airway epithelial cells, neither did they modify their morphology nor the barrier integrity of polarized cells. The epithelial stimulatory capacity of NET was not affected by degradation of DNA with micrococcal nuclease (MNase), treatment of NET with heparin or inhibition of the elastase immobilized to DNA, but was significantly reduced by pretreatment of NET with an anti-high mobility group box-1 blocking antibody (HMGB1). Additionally this proinflammatory effect was also observed in human monocyte- derived macrophages and not in human monocyte-derived dendritic cells. This indicates that the proinflammatory response is restricted to certain cell types. Altogether, our findings indicate that MSU-induced NET exert direct proinflammatory effects on airway epithelial cells that might contribute in vivo to further recruitment of neutrophils and perpetuation of inflammation upon lung tissue damage. These results could be relevant for treatment of pulmonary inflammatory pathologies, like cystic fibrosis and acute lung injury (ALI). Despite the fact that it has been proved the presence of large amounts of NET in these diseases, the current treatment with DNases does not resolve the associated inflammation. Our findings indicating that MNase treatment does not reduce the inflammatory capacity of NET suggest that treatments with NETosis inhibitors or HMGB1 blocking antibodies could be relevant therapeutics options to mitigate the inflammation in these pathologies.

Falivene, Juliana. "Estudio del impacto del balance Th17/Treg en periferia y en mucosas sobre la funcionalidad de la respuesta celular antiviral y la inmunopatogénesis de la infección HIV/SIDA" (2016-03-08) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las subpoblaciones de linfocitos Th17 y T regulatorios (Treg) han sido relacionados con la progresión a enfermedad en el contexto de la infección por HIV-1. Sin embargo, su relación con la respuesta adaptativa T CD8+ antiviral durante la infección aguda/temprana por HIV (PHI, primary HIV infection) no ha sido aún estudiada. En este contexto, el primer objetivo general de este trabajo de tesis consistió en analizar las subpoblaciones Th17 y Treg y su relación con la respuesta celular T CD8+ específica frente a HIV y parámetros de seguimiento de la infección durante la infección aguda/temprana y hasta un año postinfección (p.i). Para ello se utilizaron muestras de sangre de 14 dadores sanos (DSs), 40 PHI, 17 Crónicos y 13 controladores elite (ECs, Elite Controllers). Los porcentajes de células Th17 y Treg se encontraban severamente alterados en individuos Crónicos, mientras que todos los pacientes infectados con HIV evidenciaron un desbalance Th17/Treg comparados con DSs (incluso ECs), en concordancia con sus mayores proporciones de células T CD8+ activadas (HLA-DR+/CD38+). Un mejor estatus clínico (evidenciado por mayores recuentos de células T CD4+ y menores cargas virales y activación inmune) se asoció con mayores niveles de Th17 y menores niveles de Treg. Notablemente, se encontraron correlaciones positivas entre los niveles basales de Th17 y la funcionalidad de la respuesta T CD8+ específica frente a HIV: la capacidad de suprimir la replicación viral (VIA, viral inhibitory activity) y la proporción de células polifuncionales (IFN-γ+/CD107A/B +) tanto a tiempos tempranos como tardíos p.i, resaltando el valor pronóstico de la subpoblación Th17 en la preservación de una inmunidad celular antiviral más eficiente. La relación Th17/Treg y la intensidad media de fluorescencia relativa (IMFr) de IL-17 también se correlacionaron positivamente con VIA. Debido a la importancia del tratamiento antirretroviral (TARV) en la reconstitución inmune de individuos infectados, a continuación se decidió caracterizar las subpoblaciones Th17, Treg y su balance en sangre periférica y mucosa cervical y su implicancia en la inmunopatogénesis de HIV-1 en ausencia o presencia de TARV. Para ello se utilizaron muestras de 19 individuos TARV+ (más de 2 años con supresión efectiva de la CV), 22 pacientes crónicamente infectados naïve de tratamiento (TARV-) y 20 DSs. Tras el tratamiento, tanto la frecuencia de Th17 como la relación Th17/Treg en periferia alcanzaron valores similares a los observados en DSs, en contraste a lo observado en células Treg cuyos niveles se mantuvieron altos. Asimismo, en individuos TARV+ se observó una disminución de los niveles de activación inmune a pesar de lo cual no se alcanzaron valores normales, hallándose correlaciones negativas entre los niveles de activación celular y el balance Th17/Treg. Por otro lado, mayores niveles de la citoquina proinflamatoria IL-1β en exocervix se correlacionaron positivamente con los niveles de activación celular periféricos, sugiriendo que existiría una relación entre los niveles de inflamación sistémicos y lo observado en sitios de mucosas. Es importante destacar que el tratamiento no indujo un incremento de los recuentos de células T CD4+ CD161+ (subpoblación de células precursoras de Th17 que migran a intestino) los cuales resultaron significativamente menores a los observados en DSs. Asimismo, al estudiar el patrón de secreción de citoquinas por parte de células mononucleares de cérvix (CMCs) estimuladas, se observó que las CMCs provenientes de individuos TARV+ secretan menores niveles de IL-17A e IL-10 en relación a las de DSs. En conjunto, los resultados de la presente tesis sugieren, por un lado, la existencia de una potencial relación entre la subpoblación Th17 y el balance Th17/Treg con respuestas T CD8+ HIV-específicas que juegan un rol clave en la contención de la infección. Por otro lado, aunque el tratamiento antirretroviral parece tener un impacto positivo sobre la restauración de las funciones inmunes a nivel sistémico, tanto los niveles de precursores de células Th17 que migran a intestino como la secreción de IL-17A e IL-10 por CMCs no alcanzaron valores normales, sugiriendo que en sitios de mucosas la restauración inmune es incompleta.

Abstract:
Th17 and Treg subsets have been related to disease progression during HIV-1 infection. However, the potential relation of these T cell subsets with antiviral T-cell responses during primary HIV infection (PHI) has not been studied yet. In this context, the first aim of this study was to analyze Th17 and Treg subsets and their relation with anti-HIV T-cell responses and clinical parameters during PHI and up to one year post-infection (p.i). Samples from 14 healthy donors (HDs), 40 PHI patients, 17 Chronics, and 13 Elite controllers (ECs) were studied. The percentages of Th17 and Treg subsets were severely altered in Chronics, whereas all HIV-infected individuals (including ECs) showed Th17/Treg imbalance compared to HDs, in concordance with higher frequencies of activated CD8+ Tcells (HLA-DR+/CD38+). Better clinical status (higher CD4+ T-cell counts, lower viral loads and immune activation) was associated with higher Th17 and lower Treg levels. Positive correlations were found between Th17 at baseline and anti-HIV CD8+ T-cell functionality: viral inhibitory activity (VIA) and key polyfunctions (IFN-γ+/CD107A/B +) at both early and later times p.i, highlighting the prognostic value of Th17 cells to preserve an effective antiviral T-cell immunity. Th17/Treg ratio and the IL-17 relative mean fluorescence intensity were also positively correlated with VIA. Due to the importance that antiretroviral treatment (ART) has in the immune reconstitution of HIV+ patients, the second aim of this study was to characterize Th17 and Treg subsets and their balance in peripheral blood and female genital tract and their implications in the immunopathogenesis of HIV-1 infection comparing ART+ with ARTpatients. Samples from 19 HIV+ ART+ patients (more than 2 years under treatment), 22 HIV+ ART naïve patients (ART-) and 20 HDs were used. After treatment, both the frequency of Th17 cells as well as Th17/Treg ratio in peripheral blood reached similar levels compared to HDs, in contrast to that observed for Treg cells that remained at high levels despite ART. Also, ART was accompanied by a reduction in the immune activation levels, yet not to normal values, finding negative correlations between cellular immune activation and Th17/Treg ratio. On the other hand, high levels of the proinflammatory cytokine IL-1β in exocervix samples were positively correlated with higher levels of cellular immune activation in the blood, suggesting a relationship exists between systemic and mucosal activation/inflammation. Importantly, ART did not induce a proper restoration of CD4+ CD161+ T-cell counts (a subset of Th17 precursor cells with GALT homing properties) which were significantly lower compared to HDs. Interestingly, it was observed that cervix mononuclear cells (CMCs) from ART+ subjects secreted lower amounts of IL-17A and IL-10 upon stimulation than those obtained from HDs. Taken together, these results suggested, first, a potential link between Th17 and Th17/Treg ratio with key HIV-specific CD8+ T-cell responses against the infection. On the other hand, although ART has a positive impact on immune restoration in blood, both the levels of Th17 precursor subset with GALT homing properties and the ability of CMCs to secrete IL-17A and IL-10 did not reach normal values, suggesting that immune restoration at mucosal sites is impaired or incomplete.

Jaramillo Ortiz, José Manuel. "Desarrollo de candidatos vacunales contra Babesia bovis basados en vectores virales y proteínas recombinantes" (2016-03-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La babesiosis bovina es una enfermedad parasitaria trasmitida por garrapatas y causada por los protozooarios intraeritrocíticos Babesia bovis y B. bigemina. Esta infección provoca importantes pérdidas económicas en varias regiones tropicales y subtropicales del mundo donde el vector está presente. En nuestro país, la zona ganadera afectada incluye el noreste y noroeste por encima del paralelo 33°S en donde la garrapata vector Rhipicephalus microplus encuentra las condiciones ecológicas adecuadas para su desarrollo. La vacunación contra la babesiosis bovina es una de las medidas de control existente para esta parasitosis y se realiza en terneros menores a los nueve meses de edad utilizando principalmente hemovacunas refrigeradas a base de cepas vivas atenuadas de estos parásitos. Si bien esta vacuna es efectiva en una única dosis, confiriendo protección durante toda la vida útil del bovino, presenta algunas desventajas en su producción, vida media y logística de distribución. Por este motivo, el desarrollo de alternativas vacunales que superen estas dificultades resulta de interés para mejorar las condiciones sanitarias de la región y aumentar la competitividad del sector. En este presente trabajo de tesis, se han desarrollado tres candidatos vacunales basados en las regiones inmunodominantes de tres antígenos de B. bovis altamente conservados e inmunodominantes para el bovino; estos son las proteínas MSA-2c (del inglés, Merozoite Surface protein – 2c), RAP-1 (Rhoptry Associated Protein – 1) y HSP20 (Heat Shock Protein 20). Estos 3 antígenos se han obtenido en dos plataformas de expresión diferentes: como vectores virales no replicativos y como proteínas recombinantes. El primer candidato es un virus vaccinia Ankara modificado (rMVA), un poxvirus no replicativo que codifica en un único marco de lectura estas tres regiones antigénicas como un multiantígeno al que denominamos rMABbo. Asimismo se ha desarrollado un Adenovirus recombinante (rAd) que codifica el mismo multiantígeno. También, se han obtenido en un sistema procariota las tres proteínas por separado y el multiantígeno recombinante como única poliproteína. Con los tres inmunógenos desarrollados, se estudió la respuesta inmune celular y humoral inducida por los mismos en el modelo murino en esquemas de vacunación “prime – boost” homólogos y heterólogos. Los resultados mostraron que la vacunación heteróloga que combinó el prime con rAd o con el rMABbo y el boost con el virus rMVA resultaron ser más efectivas que sus esquemas homólogos, pudiendo detectarse en ambos tipos de esquemas heterólogos altos títulos de anticuerpos específicos de tipo IgG con una mayor proporción del isotipo IgG2a, niveles significativos de IFN secretado y un alto porcentaje de células CD4+ y CD8+ productoras de una y ambas citoquinas de perfil Th1: IFNγ y TNFα Los aportes de este trabajo de tesis permitieron desarrollar nuevos inmunógenos recombinantes basados en un diseño racional de antígenos y plataformas de expresión para optimizar la respuesta inmune protectiva hacia Babesia bovis. Además se ha caracterizado la respuesta inmune inducida en el modelo murino, permitiendo dilucidar los aspectos claves a tener en cuenta para seleccionar la mejor estrategia vacunal a ser evaluada frente al desafío con Babesia bovis en bovinos, único modelo biológico para este parásito.

Abstract:
Bovine babesiosis is a tick – borne disease caused by the intraerythrocytic protozoan parasites Babesia bovis and B. bigemina. This infection causes economic losses in tropical and subtropical areas where the tick is present. In Argentina, the livestock area affected includes the northeast and northwest of the parallel 33° S, where the natural vector Rhipicephalus (Boophilus) microplus finds the ecological conditions for its development. To prevent babesiosis outbreaks in endemic areas, 4-9-month-old calves are vaccinated with live attenuated strains of both parasites. Even though these vaccines are effective in a single dose, conferring protection throughout the life of the bovine, they have some disadvantages in their production, half-life and distribution logistics. Hence, the development of alternative vaccines to overcome these difficulties is of great interest to improve sanitary conditions in order to increase the competitiveness of the livestock production. In this present work, three vaccine candidates have been developed. These immunogens are based on the immunodominant regions of three highly conserved B. bovis antigens that are also immunodominant for cattle: MSA-2c (Merozoite Surface protein - 2c), RAP-1 (Rhoptry Associated Protein - 1) and HSP20 (Heat Shock Protein 20). These three antigens were obtained on two different expression platforms: as non-replicative viral vectors and as recombinant proteins. The first candidate is a recombinant modified vaccinia Ankara vector (rMVA), a nonreplicative poxvirus which encodes an open reading frame of a multi-antigen (rMABbo) . This multi-antigen includes B and T cells epitopes of the three antigens mentioned above. In addition, a recombinant adenovirus (rAd) expressing the same rMABbo was developed. Besides, the complete rMABbo and each of the three antigens were expressed separately in E.coli and purified by affinity chromatography for delivery as subunit vaccines. The humoral and cellular immune responses induced by the three vaccine candidate were evaluated in both homologous and heterologous prime – boost immunizations. The results show that heterologous immunization combining the rAd or the rMABbo as a prime, with rMVA as a boost elicit the most effective immune response in terms of high specific IgG antibody titters with a major IgG2a subclass proportion (indicating a Th1 immune response), a significant level of secreted IFNγ and high percentages of both CD4+ and CD8+ T cells producing both IFNγ and TNFα cytokines. The present work contributes to the development of a new generation vaccine candidates based on a rational design and antigen expression platforms to optimize the protective immune response to Babesia bovis. The characterization of the immune response in the murine model is also an accessible approach to optimize the best vaccination strategy to be evaluated in cattle which is the only biological model against Babesia bovis infection.

Abrey Recalde, María Jimena. "Interacción entre la respuesta trombótica y la respuesta inflamatoria en el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH)" (2016-03-29) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Síndrome Urémico Hemolítico (SUH), enfermedad caracterizada por anemia hemolítica, trombocitopenia y falla renal aguda, está asociado a infecciones enterohemorrágicas con Escherichia coli productores de toxina Shiga (Stx) (STEC). Si bien el daño endotelial, generado por Stx, ha sido reconocido como el principal evento que conduce al estado protrombótico en el SUH, existen otros mecanismos que todavía no han sido completamente identificados. La interacción entre la respuesta trombótica e inflamatoria ha sido recientemente reportada en diversas patologías y dada la importancia de ambas en el SUH, hipotetizamos que podría tener un rol destacable en su desarrollo. En efecto, nuestro objetivo fue evaluar los mecanismos de activación de la respuesta trombótica y su interacción con la respuesta inflamatoria en el SUH. Utilizando un modelo murino de SUH, detectamos que Stx2 indujo directa o indirectamente una marcada activación plaquetaria que contribuyó con la respuesta inflamatoria a través de la activación del sistema de complemento y la formación de complejos entre Plaquetas y leucocitos polimorfonucleares (PMN). Por otro lado, en un sistema in vitro, se vió que Stx2 indujo un daño endotelial que derivó en la activación y adhesión plaquetaria. Por último, en ambos modelos, se observó la capacidad del antioxidante N-acetil-L-Cisteína (NAC) de prevenir los efectos protrombóticos de Stx2. En conclusión, en esta tesis hemos descripto como Stx2, mediante el daño endotelial, activa la respuesta trombótica y como el estrés oxidativo contribuye a este proceso. Asimismo hemos probado la participación de las plaquetas en la activación de la respuesta inflamatoria. Finalmente, dados los efectos preventivos de la NAC proponemos su uso en la etapa prodrómica de la diarrea.

Abstract:
Hemolytic uremic syndrome (HUS) is a disease caracterized by hemolytic anemia, thrombocytopenia and acute kidney failure. HUS is associated with Shiga toxin (Stx) producing Escherichia coli (STEC) infections. While endothelial damage induced by Stx , has been recognized as the main event leading to the prothrombotic state in HUS, there are other mechanisms that have not yet been fully identified. The interaction between thrombotic and inflammatory response has been recently reported in various diseases, since both are important in HUS, we hypothesize that could have a prominent role in its development. In fact, our objective was to evaluate the activation mechanisms of thrombotic response and its interaction with the inflammatory response in HUS. Using a mouse model of HUS, we found that Stx2 directly or indirectly induced a marked platelet activation wich contribute to the inflammatory response through activation of the complement system and the formation of complexes between platelets and polymorphonuclear leukocytes (PMN). Moreover, in an in vitro system, it was found that Stx2 induced endothelial damage that led to the activation and platelet adhesion. Finally, we observed in both models, the ability of antioxidant drug N-acetyl-L-Cysteine (NAC) to prevent Stx2 prothrombotic effects. In conclusion, in this thesis we have described that Stx2 through endothelial damage, enhances the thrombotic response and the oxidative stress contributes to this process. We have also tested the involvement of platelets in activation of inflammatory response. Finally, given the preventive effects of NAC we propose its use in the prodromal stage of diarrhea.

Angerami, Matías Tomás. "Distribución y análisis funcional de Linfocitos T CD4+ regulatorios y T CD4+ convencionales en el contexto de la coinfección por HIV-1 y M. tuberculosis y su modulación por la hormona adrenal Dehidroepiandrosterona" (2016-04-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Tuberculosis representa el principal agente de mortalidad a nivel mundial en pacientes infectados con el HIV-1. Ambas infecciones conllevan a una desregulación de los ejes inmune y adrenal que influirán en el desarrollo de las correctas respuestas frente a los patógenos. Así, investigamos la subpoblacion de LT CD4+CD25-FoxP3+ (uTreg, LTreg “no convencionales”) en pacientes co infectados con tuberculosis activa (HIV-TB), en individuos HIV+ con TB latente (HIV-TBL), en individuos HIV+ sin TB y en dadores sanos (DS). En primer lugar se comparó la expresión de CD39, PD1, GITR y el estado de maduración (CD27/CD45RA) de las células uTreg entre los distintos grupos de estudio. Los pacientes HIV-TB mostraron menores niveles de expresión de CD39 y mayores de PD1 que los DS, así como un estado de maduración alterado con respecto a los demás grupos. Más aun, se observaron menores niveles de CD39 y mayores de PD1 en células uTreg de pacientes HIV-TB y DS, al compararse con la expresión en LT CD4+CD25+FoxP3+ (cTreg). Además la población uTreg mostro mayores frecuencias de la subpoblacionTreg EM, así como una capacidad de producción de IFN-γ incrementada respecto de cTreg, en ambos grupos e pacientes. Luego, evaluamos una cohorte de pacientes HIV-TB durante el transcurso del tratamiento anti tuberculoso (TaT), analizando parámetros endocrinos e inmunológicos. De esta forma se observaron valores disminuidos de DHEA-s al incio del TaT con respecto a las concentraciones presentadas por DS, que se normalizaron a través del tiempo. Además, esto se vio acompañado por un aumento en la frecuencia de células productoras de IFN-γ Mtb específicas, y por una disminución del número de células uTreg hasta alcanzar los valores presentes en DS. Finalmente, al analizar citoquinas asociadas a inflamación, se observaron niveles incrementados al inicio del TaT, que luego de seis meses retornaron a valores normales. Por último, se investigó la respuesta Mtb especifica de linfocitos T CD4+ de pacientes HIV-TB y DS, caracterizando la producción de IFN-γ y TNF-α, su distribución memoria/efectora, y la modulación por parte de DHEA sobre la respuesta y la maduración de LT. En principio se observó que el agregado de DHEA no logro modular la respuesta antígeno especifica ni en HIV-TB ni en DS. Por otro lado, se encontró una disminución de células Naive y un aumento de LT EM en el grupo HIV-TB. Además, al evaluar la producción de citoquinas de cada subpoblacion de memoria, los DS presentaron mayores niveles de IFN-γ/TNF-α en las LT EM, mientras en HIV-TB todas las poblaciones presentaron niveles similares de producción de dichas citoquinas. La adición de DHEA moduló la producción de citoquinas en los LT CM de DS y logró disminuir las diferencias existentes en la distribución memoria/efectora observadas en los LT CD4 Mtbespecíficos entre los HIV-TB y DS. El conjunto de resultados demuestran que la población uTreg a pesar de presentar diferencias en el fenotipo, el grado de maduración y en su capacidad de producir IFN-γ, posee una acción supresora similar a la de las células cTreg. Además, el trabajo permite evidenciar que el TaT logro normalizar parámetros endocrinos e inmunes a lo largo de 6 meses de terapia. Por último, se consiguió discriminar la producción de citoquinas Th1 para distintas subpoblaciones de Memoria en el contexto de la coinfeccion, y sugerir un rol modulador de DHEA sobre la diferenciación de las células antígeno específicas.

Abstract:
Tuberculosis is the most common opportunistic infection and represents the main cause of death worldwide in HIV-1 infected patients. Both infections lead to a deregulation of the immune and adrenal axes that influence the development of normal responses to pathogens, resulting in alterations of lymphocyte frequencies and in their functional capabilities. In this context, we aimed to investigate the previously described expanded subpopulation of LT CD4+CD25-FoxP3 + (uTreg) in co-infected patients with active tuberculosis (HIV-TB) and compared them with those uTregs analyzed in HIV+ individuals with latent TB (HIV- TBL), HIV+ individuals without TB (HIV) and a group of healthy donors (HD). So, first we evaluated the expression of CD39, PD1, GITR and the maturation status through CD27/CD45RA in the uTreg population along the different study groups. HIV-TB patients showed higher expression levels of CD39 and PD1 compared with HD. Moreover, we found significant differences in the maturation status of uTregs from HIV-TB when compared with the other study groups. We also compared uTreg vs. cTreg (CD4+CD25+FoxP3+) in HIV-TB patients and in HD. Besides this, the production of IFN-γ, TGF-β, IL-10 and suppressor capacity between both cell populations was assessed. Thus, we observed lower levels of CD39 and increased expression of PD1 in uTreg cells of both groups. Similar differences were found in these groups of individuals when maturation profile and cytokine production was analyzed, showing that uTreg cells had higher frequencies of Treg EM, as well as an increased capacity to produce IFN-γ than cTreg cells both in HIV-TB and HD groups. Secondly, we evaluated a cohort of HIV-TB patients during the course of the antituberculosis therapy (ATT), evaluating both endocrine and immunological markers. Thus, diminished plasma levels of DHEA-s were observed at the initiation of therapy, reaching normal levels after 6 months. Moreover, this was accompanied by an increase in the frequency of IFN-γMtb specific-producing cells, and a decrease in uTreg frequencies, which reached HD values at six months of therapy. Furthermore, when several cytokines associated with inflammation were analyzed during ATT, we observed a modulation of IL -6, IL-8, IL-7 and IL-12 levels, whose values decreased along anti TB therapy. Finally, we compared the responsiveness of Mtb specific LT CD4+ of HIV-TB and HD, analyzing the IFN-γ and TNF-α production, memory/effector distribution, and the modulation by DHEA of functionality and maturation status of CD4+ T cells.We observed that the DHEA did not modulate Mtb specific responses of CD4+ T cells in either group. On the other hand, when the memory/ effector distribution was compared between HIV-TB and HD, decreased proportions of naïve T cells and increased percentages of LTEM cells in HIV-TB group were found. In addition, cytokine production of memory subsets was assessed, therefore while the T CM subset produced a greater amount of IFN-γ/TNF-α compared with the other subsets of HD individuals, HIV-TB memory/effector subsets showed a similar production capacity. Addition of DHEA modified cytokine production only in TCM cells from HD. Interestingly, DHEA reduced the existing differences in CD4 T cells memory/effector distributions between Mtb-specific CD4+ cells from HIV-TB and HD. Together, these results uncover alterations of the immune-endocrine axes during HIVTB co infection. Our work also demonstrates that uTreg population, despite having an altered phenotype, maturation status and ability to produce IFN-γ, has a conserved suppressive capacity. Furthermore, this work demonstrates that ATT normalizes immune-endocrine parameters over 6 months of therapy. Finally, it was possible to discriminate Th1 cytokine production from different memory/effector subpopulations in the context of this coinfection, and to suggest a modulatory role for DHEA on the differentiation of Mtb-specific cells.

Najenson, Ana Clara. "El Factor Natriurético Atrial en el páncreas exocrino: papel en eventos tempranos que conducen al desarrollo de pancreatitis aguda" (2016-05-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La pancreatitis aguda constituye una entidad nosológica prevalente caracterizada por la autodigestión del páncreas exocrino provocada por la activación in situ de las mismas enzimas que el páncreas produce. Se expresa como una forma leve autolimitada, o bien como una forma severa con elevada mortalidad principalmente como resultado de falla multiorgánica. Las causas y/o mecanismos que llevan a una u otra expresión son desconocidos, por lo que debido a su curso incierto constituye una preocupación clínica. Los eventos tempranos que conducen a su desarrollo no se hayan aún esclarecidos, si bien la activación del tripsinógeno y de la respuesta inflamatoria constituyen dos mecanismos disparadores independientes. En este trabajo de tesis abordamos el estudio del posible papel protector del factor natriurético atrial (ANF) en los eventos temprano que disparan la patología, particularmente la respuesta inflamatoria que lleva a la muerte de las células acinares eventualmente por necrosis y apoptosis mediante la utilización de un modelo animal (rata) validado de pancreatitis aguda. Asimismo, evaluamos la posibilidad de que el páncreas exocrino constituya una fuente extracardíaca de ANF. El presente estudio se sustenta en trabajos previos en los que observamos que el ANF regula fisiológicamente la funcionalidad del páncreas exocrino y atenúa la pancreatitis aguda experimental al estimular la exclusión de AMPc a través de proteína asociada a resistencia a multidrogas tipo 4 (MRP4). No obstante, este mecanismo no explicaría en su totalidad el papel protector del ANF. Los resultados mostraron que el ANF disminuye la respuesta inflamatoria desencadenada durante la pancreatitis aguda al reducir la expresión de los principales mediadores inflamatorios. El ANF redujo la activación del factor de transcripción NF-κB, íntimamente relacionado con la activación de genes que codifican para citoquinas pro-inflamatorias. En este sentido, disminuyó asimismo los niveles intrapancreáticos del factor de necrosis tumoral α (TNF-α), citoquina que juega un papel clave en la propagación de la respuesta inflamatoria. Por otra parte, disminuyó la expresión de enzimas inducibles durante la inflamación como la enzima óxido nítrico sintasa (iNOS) y ciclo oxigenasa 2 (COX-2) así como también su principal producto, la prostaglandina E2 (PGE2). La atenuación de la respuesta inflamatoria se correlacionó con modificaciones de la ultraestructura de las células acinares observada mediante microscopía electrónica de transmisión. El ANF atenuó el daño generado en la ultraestructura celular ya que disminuyó el swelling del retículo endoplásmico, el edema intra e intercelular y la presencia de autofagolisosomas. El ANF asimismo estimula la muerte celular por apoptosis y disminuye la necrosis, lo que constituye un efecto beneficioso, ya que en la pancreatitis aguda la apoptosis se correlaciona inversamente con la necrosis y así con la severidad de la patología. El ANF incrementa las células TUNEL positivas y la activación de las caspasas, lo que se relaciona la morfología de los núcleos observados por microscopia electrónica. Se observó asimismo que el ANF se expresa en el páncreas exocrino tanto a nivel de su ARN mensajero como a nivel de proteína, lo que implica que el páncreas sintetiza y expresa ANF maduro. Mediante la técnica de inmuno-oro se observó que el ANF se localiza en el retículo endoplásmico, mitocondrias y gránulos de zimógeno. En resumen, en este trabajo de tesis demostramos que el ANF atenúa la respuesta inflamatoria y estimula la apoptosis en la pancreatitis aguda experimental lo sustenta su papel protector en el desarrollo de la patología. Asimismo, observamos que el páncreas exocrino sintetiza y expresa ANF maduro, sugiriendo que tendría funciones paracrinas y/o autocrinas a nivel de las células acinares pancreáticas, en las que hemos demostrado la presencia de sus receptores.

Abstract:
Acute pancreatitis is a prevalent disease characterized by the pathologic autodigestion of the gland promoted by the digestive enzymes synthesized and secreted by the pancreas as a result of premature intra-pancreatic activation. The condition is usually mild and selflimiting, but in 10–15% of cases, it can be severe with associated multiorgan dysfunction and high mortality. The causes leading to one or other form of pancreatitis are presently unknown and due to its uncertain course, the disease still remains a clinical concern. The early events in the development of pancreatitis are not fully understood yet, although trypsinogen activation and the inflammatory response are two independent triggering mechanisms associated with the onset of the disease. In the present thesis we investigated the possible protective role of atrial natriuretic factor (ANF) in the early events triggering acute pancreatitis, particularly the inflammatory response that leads to acinar cell death either by necrosis, apoptosis or both. We also evaluated the exocrine pancreas as a possible extra cardiac source of ANF production. The present study is based on previous works from our laboratory showing that ANF regulates pancreatic functionality and attenuates acute pancreatitis by stimulating cAMP extrusion through multidrug resistance associated protein type 4 (MRP4). However, this mechanism would partially explain ANF beneficial role in the disease. Results showed that ANF attenuated the inflammatory response triggered in acute pancreatitis by reducing the expression and/or level of the major inflammatory mediators. ANF reduced the activation of the transcription factor NF-κB, intimately involved in the stimulation of genes encoding pro-inflammatory cytokines. In this sense, ANF also diminished tumor necrosis factor α (TNF-α) intrapancreatic levels, a key cytokine involved in the propagation of the inflammatory response. The atrial factor also reduced the expression of inducible enzymes like nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase 2 (COX-2) and its main metabolite, prostaglandin E2 (PGE2). The attenuation of the inflammatory mediators correlated well with the ultrastructural changes observed in pancreatic acinar cells by transmission electron microscopy. ANF reduced acinar cell damage, it diminished endoplasmic reticulum swelling, intra and intercellular edema, and the presence of autophagosomes. ANF also stimulated programmed cell death (apoptosis) and diminished necrosis, which is a beneficial effect, given that in acute pancreatitis apoptosis inversely correlates with necrosis and with the severity of the disesase. ANF increased the number of positive TUNEL cells and caspases activation. These findings correlate well with the morphology of the nuclei observed by transmission electron microscopy. In the present study it was also observed that ANF mRNA and protein are expressed in the exocrine pancreas, supporting that the gland synthetizes and expresses mature ANF. Immunogold labeling electron microscopy studies showed that ANF localizes to endoplasmic reticulum, mitochondria and zymogen granules. In summary, this thesis shows that in experimental acute pancreatitis ANF attenuates the inflammatory response and stimulates apoptosis, supporting the protective role of this peptide in the development of the disease. Furthermore, the exocrine pancreas synthetizes and expresses mature ANF, suggesting that the atrial peptide may act in a paracrine and/or autocrine fashion on the acinar cells where we have previously reported the presence of natriuretic factor receptors expression.

Holgado, María Pía. "Estudio de la deleción de tres genes inmunomoduladores del genoma de MVA: efecto sobre su inmunogenicidad" (2017-02-10) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus Vaccinia Ankara modificado (MVA, del inglés Modified Vaccinia Ankara) es un vector viral atenuado que aún conserva numerosos genes inmunomoduladores en su genoma. Nuestro grupo reportó anteriormente la optimización de este vector luego de eliminar el gen viral C12L, el cual codifica para la proteína de unión a IL-18. En este trabajo se analizó la inmunogenicidad del vector MVA al cual se le delecionaron de manera simultánea los genes A44L, relacionado con la síntesis de esteroides, y A46R, un inhibidor de la señalización mediada por receptores Toll (MVAΔA44L-A46R); o también incluyendo la deleción del gen C12L, previamente descripto (MVAΔC12L/ΔA44L-A46R). Para ello, se evaluó la respuesta celular T contra epítopes de Vaccinia tanto en bazo como en ganglios inguinales, drenantes al sitio de inoculación, en ratones de la cepa C57BL/6. Se observó que la magnitud de la respuesta adaptativa, tanto en la etapa aguda como de memoria, fue mayor en los animales inmunizados con los vectores delecionados en relación a aquellos que recibieron el vector de la cepa salvaje (MVAwt). Asimismo, el vector MVAΔC12L/ΔA44L-A46R indujo una respuesta celular T específica de memoria de mayor calidad, caracterizada tanto por la bifuncionalidad de las células T-CD8+ (expresión simultánea de CD107a/b e IFN-γ) como por la capacidad de proliferación específica de las células T-CD4+ y CD8+. Al estudiar la respuesta innata generada por el MVAΔC12L/ΔA44L-A46R, se observó que este vector indujo una mayor producción de citoquinas relacionadas con la generación de una respuesta celular T, tales como IL-12 e IFN-γ, así como mediadores pro inflamatorios y antivirales como IL-1β e IFN-β. En conclusión, este estudio describe por primera vez que la deleción simultánea de los genes inmunomoduladores del genoma de MVA, cuyas funciones se encuentran inter-relacionadas, tales como A44L, A46R y C12L constituye una metodología adecuada para incrementar la inmunogenicidad del vector generando de esta manera una mayor respuesta inmune tanto innata como adaptativa. Esto convierte al vector MVA en una herramienta útil y versátil para ser utilizada en el campo del desarrollo de vacunas.

Abstract:
Modified Vaccinia Ankara virus (MVA) is an attenuated vector that still retains many immunomodulatory genes in its genome. Our group previously reported the optimization of this viral vector after removing the C12L gene, coding for the IL-18 binding protein. In this work, we analyzed the immunogenicity of MVA vectors harboring the simultaneous deletion of A44L gene, related to steroid synthesis, and A46R, a TLR-signaling inhibitor (MVAΔA44L-A46R); or also including a deletion of C12L (MVAΔC12L/ΔA44L-A46R), previously described. For this, T-cell responses against Vaccinia virus epitopes were evaluated in C57BL/6 mice in spleen and inguinal lymph-nodes, draining to the site of inoculation. The results showed that the magnitude of the adaptive response, in both the acute and memory phases, was higher in mice immunized with the deleted vectors in relation to those that received the MVAwt. Furthermore, MVAΔC12L/ΔA44L-A46R induced specific memory T cell responses of higher quality, characterized by the CD8 T-cell bifunctionality (simultaneous expression of CD107a/b and IFN-γ) and the specific proliferation capacity of CD4+ and CD8+ T-cells. The study of innate immune responses generated by the MVAΔC12L/ΔA44L-A46R indicated that this vector induced an increased production of cytokines associated with the generation of a specific Tcell response, such as IL-12 and IFN-γ and also, pro inflammatory and antiviral mediators like IL-1β and IFN-β. In summary, this study describes for the first time that the simultaneous deletion of immunomodulatory genes from MVA genome, whose functions are inter-related, such as A44L, A46R and C12L is an appropriate methodology to enhance the immunogenicity of the vector, enhancing both innate and adaptive immune responses. This type of strategies converts MVA vector in a useful and versatile tool to be used in the vaccine development field.

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