Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Desarrollo y caracterización de anticuerpos contra un factor de transcripción viral unido a su ADN específico |
| Autor: | Cerutti, María Laura |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas (IIB)
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| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 2003 |
| Fecha en portada: | 2003 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Director: | Goldbaum, Fernando A. |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | INMUNIZACION; ADYUVANTE; COMPLEJO PROTEINA : ADN; AUTOINMUNIDAD; ANTICUERPOS ANTI-ADN; FACTOR DE TRANSCRIPCION; PAPILOMAVIRUSINMUNIZATION; ADJUVANT; PROTEIN : DNA COMPLEX; AUTOIMMUNITY; ANTI-DNA ANTIBODIES; TRANSCRIPTION FACTOR; PAPILLOMAVIRUS |
| Tema: | biología/inmunología
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3589_Cerutti |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3589_Cerutti.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3589_Cerutti |
| Ubicación: | Dep.QUI 003589 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Cerutti, María Laura. (2003). Desarrollo y caracterización de anticuerpos contra un factor de transcripción viral unido a su ADN específico. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3589_Cerutti |
Resumen:
El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune de etiologíadesconocida. El rasgo principal de esta enfermedad es la presencia de anticuerposdirigidos contra componentes nucleares, como histonas y ADN doble cadena. En losúltimos años, se ha demostrado que varios complejos proteína: ADN pueden inducir unarespuesta autoimmune contra ADN en ratones normales, no-predispuestos a desarrollarautoinmunidad. En este trabajo de tesis se describe el desarrollo de un modelo deinmunización con un complejo proteína: ADN molecularmente definido y lacaracterización de la respuesta inmune generada contra él en animales normales. Enparticular, se utilizó el complejo formado por el dominio C-terminal del factor detranscripción E2 del papilomavirus humano y un olígonucleótido doble cadena de 18 pbcomprendiendo uno de sus sitios de reconocimiento específico dentro del genoma viral. El análisis de la respuesta inmune humoral de ratones inmunizados con la proteína E2libre o unida a ADN indica que ésta es una proteína altamente inmunogénica. Lainmunización con E2 libre emulsionada en un adyuvante de composición aceite-en-aguaresulta en una respuesta policlonal dirigida hacia el reconocimiento de epitopesdiscontinuos, sugiriendo que la naturaleza acuosa del adyuvante es el responsable demantener a la proteína en su conformación nativa. El estudio de la respuesta policlonalcontra ADN desarrollada en los ratones inmunizados con este complejo proteína: ADNseñala que el olígonucleótido específico puede adquirir potencial inmunogénico sólocuando el complejo es incubado a altas concentraciones por un largo período de tiempo. En estos casos, los ratones inmunizados desarrollaron altos títulos de IgG anti-oligonucleótidodurante una respuesta T-dependiente clásica. Además, la inmunizacióncon la proteína E2, ya sea libre o unida a su secuencia de reconocimiento, resultó en unarespuesta autoinmune contra ADN nativo doble cadena. Estos resultados son congruentescon la hipótesis de que proteínas virales con capacidad de unir ADN tendrían el potencialnecesario para iniciar el desarrollo de la enfermedad autoimmune lupus eritematososistémico. A partir de uno de los animales inmunizados con el complejo E2: ADN han sidoobtenidos y caracterizados seis anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteínaviral y dos anticuerpos contra el olígonucleótido específico. En coincidencia con elpatrón de reactividades observado en la respuesta políclonal, la mayoría de los hibridomas anti-E2 reconocen epitopes discontinuos en la proteína. Los estudios de mapeo epitópico-funcionalrealizados sobre estos anticuerpos monoclonales revelan que se han obtenidodos grandes poblaciones de anticuerpos: una formada por anticuerpos capaces de formarun complejo temario estable con E2 y el oligonucleótido, y otra población formada poranticuerpos que reconocen un epitope, parcial o totalmente, superpuesto con la superficiede unión a ADN en el factor de transcripción, interfiriendo en su interacción con ADN. Estudios detallados de la interacciones anti-ADN: ADN muestran que los dosanticuerpos monoclonales anti-ADN generados reaccionan contra el oligonucleótidoutilizado como inmunógeno con afinidades comparables a las del factor de transcripción E2. Por el contrario, estos anticuerpos unen con muy baja afinidad moléculas de ADNno-relacionadas doble cadena del mismo largo. Más aún, ambos anticuerpos unen aloligonucleótido libre y acomplejado a E2 con afinidades muy similares, formando uncomplejo temario estable. La estructura de las regiones variables y el patrón demutaciones de la secuencia de estos anticuerpos indica que éstas son muy similares a lasencontradas en anticuerpos anti-ADN generados en modelos murinos de lupus. Enconjunto, todos estos resultados sugieren fuertemente que estos anticuerpos monoclonalesanti-ADN son el producto de una respuesta inmune dirigida por el antígeno, en el cual elcomplejo E2: ADN actuó como una nueva entidad inmunogénica.
Abstract:
Systemic lupus erythematosus is an autoimmune disorder with unknown etiology. The major hallmark of this disease is the presence of antibodies against nuclearcomponents, including double-stranded DNA and histones. In the last years, severalprotein: DNA complexes have been shown to induce anti-DNA antibodies in normal,nonautoimmune-predisposed mice. This PhD thesis describes the development of animmunization model using a molecularly defined protein: DNA complex and thecharacterization of the immune response generated against it in non-autoimmune mice. Inparticular, a complex formed by the C-terminal domain of the human papillomavirus E2transcription factor and a cognate 18 bp double stranded oligonucleotide corresponding toone of its recognition sites in the viral genome has been used. Analysis of the humoralimmune response of mice challenged with free or bound E2 indicates that this is a veryimmunogenic protein. Immunization with free E2 emulsified in an oil-in-water adjuvantelicits a strong humoral response shifted to the recognition of discontinuous epitopes,suggesting that the aqueous nature of this adjuvant emulsion is responsible for keepingthe protein in its native conformation. Analysis of the induced polyclonal anti-DNAresponse indicates that the specific oligonucleotide can acquire immunogenic potentialonly when the complex is incubated under high concentrations for a long-term period. Inthis case, the immunized mice develop high IgG anti-oligonucleotide sera titers during atypical T-dependent immune response. Besides, immunization with free or DNAcomplexed E2 protein also results in an autoimmune response to native double stranded DNA, supporting the hypotesis that viral DNA-binding proteins may have the potential toinitiate the development of the autoimmune disease Systemic lupus erythematosus. From one of the E2: DNA complex immunized mice there has been obtained andcharacterized six monoclonal antibodies against the viral protein and two against thespecific oligonucleotide. According with the pattern of reactivity observed in thepolyclonal response, most anti-E2 hybridomas recognize discontinuous epitopes on theprotein. Epitope mapping and functional analysis of these monoclonal antibodies revealsthat two separate antibodies populations can be obtained: one formed by antibodies ableto form a stable ternary complex with protein and the oligonucleotide, and other in whichthe antibodies recognize an epitope totally or partially overlapped with the DNA-bindingsurface of the transcription factor, interfering with its interaction with DNA. Detailed studies of the anti-DNA: DNA interactions showed that the twogenerated anti-DNA monoclonal antibodies react against the double strandedoligonucleotide used as immunogen with affinities comparable to that of the transcriptionfactor. In contrast, they bind with low affinities with unrelated double stranded DNAs ofthe same length. Furthermore, they bind with almost the same affinity towards the free or E2 bound oligonucleotide, forming a stable ternary structure. The variable regionstructures and mutation pattern of the anti-DNA antibodies sequences indicate that theyare similar to the anti-dsDNA antibodies described on murine models of systemic lupuserythematosus. Taken together these results strongly suggest that these anti-DNAmonoclonal antibodies are the product of an antigen-driven immune response, in whichthe E2: DNA complex acted as an new immunogenic entity.
Citación:
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Cerutti, María Laura. (2003). Desarrollo y caracterización de anticuerpos contra un factor de transcripción viral unido a su ADN específico. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3589_Cerutti
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Cerutti, María Laura. "Desarrollo y caracterización de anticuerpos contra un factor de transcripción viral unido a su ADN específico". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2003.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3589_Cerutti
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