Inmunobiología de MICA en linfocitos T : estímulos fisiológicos, rutas de señalización y consecuencias funcionales de su expresión

Molinero, Luciana Lorena

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	biologia
Título:	Inmunobiología de MICA en linfocitos T : estímulos fisiológicos, rutas de señalización y consecuencias funcionales de su expresión
Autor:	Molinero, Luciana Lorena
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Hospital de Clínicas "José de San Martín". Laboratorio de Inmunogenética
Publicación en la Web:	2019-03-29
Fecha de defensa:	2004
Fecha en portada:	2004-03
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Biológicas
Director:	Zwirner, Norberto Walter
Idioma:	Español
Tema:	biología/inmunología
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3711_Molinero
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3711_Molinero.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3711_Molinero
Ubicación:	Dep.BIO 003711
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Molinero, Luciana Lorena. (2004). Inmunobiología de MICA en linfocitos T : estímulos fisiológicos, rutas de señalización y consecuencias funcionales de su expresión. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3711_Molinero

Resumen:

INTRODUCCIÓN: La interacción de MICA con el receptor activador de citotoxicidad NKG2D (expresado en células NK y linfocitos T Ɣδ y αβ CD8+), desencadena una respuestacitotóxica contra células que expresan MICA. MICA se induce por estímulos de estrés,infecciones, neotransformación o linfocitos T activados con fitohemaglutinina. OBJETIVOS: a) estudiar la expresión de MICA en linfocitos T activados con estímulos fisiológicos; b)investigar los mecanismos moleculares involucrados y; c) investigar las consecuenciasfuncionales de dicha expresión. RESULTADOS: Por Western Blot, RT-PCR y citometría deflujo se observó que MICA se induce en linfocitos T presentes en células mononucleares desangre periférica (CMSPs) por estimulación con células alogeneicas, por microagregación delcomplejo TCR/CD3 o por coestimulación con la molécula CD28 y PMA. Los niveles deexpresión de MICA alcanzaron una meseta a los 4-7 días post-estímulo. Empleandoinhibidores farmacológicos, observamos que la expresión de MICA inducida por lamicroagregación del complejo TCR/CD3, o la coestimulación a través de CD28 y PMAinvolucran a Lck/Fyn, ERK1/2, calcineurina, p38 MAPK, p70 56 y Jak. Asimismo, lainhibición farmacológica de NF-kB bloqueó la expresión de MICA en linfocitos T activadosde la misma manera. Detectamos un sitio de unión KB localizado en el primer intrón del gende MICA, y por ensayos de supershift observamos que esta secuencia une a los dímerosp65(RelA)/p50 y p50/p50 presentes en extractos nucleares de linfocitos T activados. Asimismo, la sobreexpresión de RelA en células HeLa por transfección transitoriaincrementó los niveles de MICA, confirmando que la expresión de dicho gen es regulada por NF-kB. Además, por Western Blot observamos que CMSPs estimuladas con las citoquinasmitogénicas IL-2 e IL-4, lo mismo que linfocitos T polarizados hacia un perfil Th1 o Th2inducen la expresión de MICA. Linfocitos T CD4+ purificados y activados con PMA e Ionomicina, pero no linfocitos T CD4+ presentes en CMSPs, expresan MICA en su superficie. Por ensayos de transwell, observamos que este fenómeno se debe a un factor soluble liberadopor CMSPs activadas. Además, linfocitos T CD4+ activados con PMA e Ionomicina sonblancos de citotoxicidad por células NK autólogas activadas con IL-2 (LAK). El bloqueo de lainteracción MICA-NKG2D con AcMo anti-MICA mostró que MICA juega un rol menor endicha respuesta. CONCLUSIONES: MICA se induce en linfocitos T activados por estímulosfisiológicos e involucra a la señalización de Lck/Fyn, ERK1/2, calcineurina, p38 MAPK,p70 56k, Jak y al factor de transcripción NF-kB. La expresión de MICA en superficie delinfocitos T tiene un rol menor en la lisis por células NK activadas. En esta tesis se describenpor primera vez algunas de las vías de transducción de señales y un factor de transcripcióninvolucrados en la expresión de MICA. Los resultados presentados sugieren además que lainteracción MICA-NKG2D podría constituir un nuevo mecanismo de regulación de larespuesta inmune adaptativa.

Abstract:

INTRODUCTION: The interaction between MICA and the cytotoxicity activating receptor NKG2D (expressed in NK cells and CD8+ αβ and Ɣδ T cells) triggers a cytotoxic responseagainst MICA expressing cells. MICA is induced by stress stimuli, infections,neotransformation or phytohemagglutinin in T cells. OBJECTIVES: a) to study MICAexpression in T cells activated with physiological stimuli, b) to investigate the molecularmechanisms involved, and c) to explore the functional consequences of that expression. RESULTS: We activated T cells present in peripheral blood monononuclear cells (PBMCs)byallogeneic stimulation, microaggregation of TCR/ CD3 complex or the costimulatorymolecule CD28 with anti-CD3 mAb or anti-CD28 mAb in the presence of PMA. All of thesestimuli induced MICA expression, as assessed by Western blot, RT-PCR and flow cytometry,reaching a maximum at 4 to 7 days after stimulation, depending on the stimulus. Usingpharmacological inhibitors we next investigated the signal transduction pathways involvedin MICA induction triggered by TCR/CD3 crosslinking or costimulation through CD28 inthe presence of PMA. We found that several signaling pathways like Lck/ Fyn, ERK1/2, p38 MAPK, calcineurin, Jak and p70 56 are involved in MICA induction: By pharmacologicalinhibition of NF-kB, we found that MICA expression was dependent on NF-kB, mostprobably through a kB binding sequence located in the first intron of the MICA gene. By EMSA and supershift assays we found that this sequence bound RelA/p50 and p50/p50 NF-kB dimers present in nuclear extracts of activated T cells. Pharmacological blockade of NF-kB also inhibited MICA expression in HeLa cells and overexpression of RelA in thesecells increased MICA expression, suggesting that NF-kB regulates MICA expression. Mitogenic cytokines, like IL-2 and IL-4, were able to induce MICA expression in T cells. Thismolecule was also induced in Th1 or Th2 polarized cells. We observed that PMA/ lonomycinstimulation induced surface MICA expression on purified CD4+ T cells, but not on CD4+ Tcells present in PBMCs, more likely due to a soluble factor secreted by activated PBMCs. PMA/lonomycin activated CD4+ T cells became targets of cytotoxicity by syngeneic IL-2activated NK cells (LAK), but not of resting NK cells. Blocking MICA-NKG2D interactionwith an anti-MICA mAb, developed in our laboratory, showed that MICA plays a marginalrole in this cell death. CONCLUSIONS: MICA is induced in T cells by physiological stimulithrough the activation of Lck/Fyn, ERK1/2, p38 MAPK, calcineurin, Jak and p70 56 signaltransduction pathways, as well as the transcription factor NF-kB. MICA expression on thesurface of CD4+ T cells play a marginal role as target of cytotoxicity by activated NK cells. Inthis Thesis some of the signal transduction pathways and a transcription factor involved in MICA expression are described for the first time. Also, the results suggest that MICA NKG2Dinteraction may be a novel mechanism of regulation of the adaptive immuneresponse.

Citación:

---------- APA ----------

Molinero, Luciana Lorena. (2004). Inmunobiología de MICA en linfocitos T : estímulos fisiológicos, rutas de señalización y consecuencias funcionales de su expresión. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3711_Molinero

---------- CHICAGO ----------

Molinero, Luciana Lorena. "Inmunobiología de MICA en linfocitos T : estímulos fisiológicos, rutas de señalización y consecuencias funcionales de su expresión". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2004.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3711_Molinero

Estadísticas:

Descargas totales desde :

Navegar

Colección

Tesis Doctoral