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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Biomedicina [ 204 tesis ]

Grinblat, Lea. "Diabetes y funciones mitocondriales en miocardio de rata" (1980) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Moreno, Silvia N. J.. "Mecanismo de acción de drogas tripanocidas" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Rosemblit, Nora. "Estudio sobre diferencias genómicas en neoplasias humanas" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Lanari, Claudia Lee Malvina. "Efecto de la progesterona y del acetato de medroxiprogesterona (MPA) sobre el crecimiento de fibrosarcomas murinos : Estudios in vivo e in vitro" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de este trabajo surgió de la observación de que la progesterona tiene efectos antifibromatogénicos en cobayos y en el hombre. Se evaluó el efecto de la progesterona y del acetato de medroxiprogesterona (MPA) sobre el crecimiento de un fibrosarcoma murino tanto in vivo como in vitro. También se estudió su efecto sobre la inducción de sarcomas originados por la implantación subcutánea de un cuerpo extraño. (cilindro de vidrio). In vivo, los resultados obtenidos demuestran que el MPA disminuyó la incidencia tumoral cuando se lo inoculó junto con el transplante de fibrosarcoma. Cuando el tratamiento hormonal se comenzó días después del inóculo tumoral no hubo efecto sobre su crecimiento. Se obtuvieron resultados similares con un transplante de una leucemia linfoblástica mientras que no se observó una disminución en la incidencia tumoral con un carcinoma epidermoide indiferenciado. In vitro, también se demostró que los fibroblastos tanto embrionarios como tumorales fueron más sensibles a concentraciones altas (10-5 - 10-4M) de progestágenos que las células epiteliales que constituyen las líneas celulares WISH y HELA. Sobre fibroblastos normales y tumorales la progesterona no sólo tuvo un efecto citostático sino que también por encima de 10-4M se observó un efecto citolítico. Con MPA sólo se pudo evaluar el efecto citostático ya que no se pudieron obtener concentraciones superiores a 7x10-5M. Este efecto fue específico para fibroblastos ya que las células WISH no se inhibieron aún con las altas concentraciones de hormona. En base a la alta concentración de la hormona se postula una acción directa, no mediada por receptores sobre las células tumorales tanto in vivo como in vitro. En cuanto al efecto del MPA sobre la tumorigénesis por cuerpo extraño, se observó una disminución en la incidencia de sarcomas inducidos por la implantación subcutánea de un cilindro de vidrio. Esta disminución fue más evidente cuando se inoculó la hormona en la vecindad del cuerpo extraño que en el flanco contralateral; en el primer caso no sólo disminuyó la incidencia tumoral sino que también fue menor el ritmo de aparición de los sarcomas. Se postula que el efecto inhibidor del MPA sobre la inducción de sarcomas se debería a una disminución en la fibrosis que rodea al cuerpo extraño. Un resultado inesperado, pero de gran relevancia debido al uso indiscriminado de esta hormona, fue la aparición de adenocarcinomas en hembras portadoras de cilindro de vidrio y tratadas con MPA ya sea in situ o en el flanco contralateral. Se puede concluir que si bien los progestágenos tienen un efecto antifibromatogénico, su administración prolongada pude llevar al desarrollo de adenocarcinomas.

Galassi, Nora Virginia. "Maduración de la competencia inmunológica en la rata" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Castillo, Marta Beatriz. "Acción de los glucocorticoides y la insulina en el sistema inmune" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Nepomnaschy, Irene. "Inmunoregulación en ratones F1 híbridos recíprocos" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Orti, Eduardo. "Mecanismo de acción molecular de los corticoides en la médula espinal" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Guerra, Liliana Noemí. "Estudios biológicos, bioquímicos y genéticos de la línea IIB-MEL-J como modelo para el melanoma humano" (1991) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Carrizo, Patricia H.. "Metabolismo hepático del nifurtimox, un nitrofurano antichagásico" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Mladovan, Alejandro G.. "Modulación de oncogenes en cancer mamario humano" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de mama es el tumor más frecuente en el sexo femenino afectando en la actualidad a una de cada diez mujeres. La complejidad de esta patología y el escaso conocimiento acerca de su etiología y desarrollo dificultan el entendimiento fisiopatológico de dicho desorden y, por consiguiente, la prevención y el tratamiento. Los estudios diferenciales sobre la proliferación y los mecanismos moleculares involucrados en los procesos de duplicación celular en células normales y neoplásicas aportan nuevas ideas para la comprensión del desarrollo de esta enfermedad. En tal sentido, los trabajos realizados en la presente Tesis tuvieron como principal objetivo estudiar diversos par metros involucrados en la proliferación de células mamarias humanas bajo la acción de hormonas peptídicas y de agentes que actúan como promotores tumorales. De la amplia gama de señales moleculares se analizaron especialmente aquellas relacionadas con la expresión de proto-oncogenes nucleares y la activación de ciertas kinasas que participan en la vía de señales que regulan la expresión de dichos genes. Estos estudios se realizaron utilizando como modelo de trabajo diversas líneas celulares, principalmente la línea no tumorigénica establecida a partir de tejido mamario humano normal, MCF-10A, su contraparte transformada con el oncogén H-ras, MCF-10T y líneas neoplásicas de mama humana ampliamente descriptas en la literatura como MCF-7, MDA-453 y SKBR3. La caracterización celular y molecular de MCF-10T evidenció la presencia de un gen H-ras mutado en el codón 12 y la sobre-expresión de dicho gen. Si bien se comprobó que MCF-10T es capaz de proliferar en forma independiente del anclaje, su duplicación es inhibida por la alta densidad celular siendo incapaz de proliferar en forma estratificada. Las células provenientes de tejido normal evidenciaron una tasa proliferativa mayor que las de origen neoplásico en condiciones de cultivo favorable, mientras que células no transformadas como las MCF-10A no sobreviven en ausencia de nutrientes. De los agentes que promueven la proliferación en células MCF-10, el EGF ejerció un potente efecto mitogénico seguido por el IGF-I y la insulina a altas dosis. Los estudios determinaron que en estas células el EGF y el PMA, pero no la insulina o el IGF-I, son capaces de aumentar los niveles de ARNm del gen c-fos. Los estudios demostraron que el EGF y el PMA inducen la expresión de los proto-oncogenes c-fos, c-jun, fosB y junB con cinéticas particulares para cada gen no mostrando diferencias significativas entre las células MCF-10A y MCF-10T, siendo válida esta observación para los dos agentes analizados. Otros genes como c-myc, junD o fra1, evidenciaron escasa variación en sus niveles de transcriptos ante dichos estímulos. Si bien ambas líneas exhibieron una dosis dependencia del EGF en cuanto a su proliferación, inducción de la síntesis de ADN y expresión de proto-oncogenes nucleares, la línea transformada MCF-10T manifestó un menor requerimiento de nutrientes y una mayor sensibilidad a otros mitógenos comparado con MCF-10A, posiblemente debido a una mayor proliferación autócrina. La combinación del EGF con otros agentes estudiados promueve un mayor efecto proliferativo que el ejercido por cada uno de ellos individualmente sin afectar los niveles de transcriptos de proto-oncogenes nucleares inducidos por el EGF. Se comprobó que el EGF ejerce su acción inductora sobre los proto-oncogenes nucleares a través de la autofosforilación de su receptor específico con la subsecuente activación de MAP kinasas involucradas en la cascada de señales mitogénicas. Se observó además, que las diversas líneas celulares analizadas difieren cuantitativamente en los tipos de MAP kinasas que expresan según su origen normal o neoplásico. Esto establece un hecho relevante por cuanto podría inferirse que tales especies constituyen marcadores específicos de desórdenes asociados al tipo de neoplasia analizado. Si bien la acción de agentes que inducen la formación del segundo mensajero AMPc resultan inhibitorios de la proliferación en ciertas líneas celulares de mama, en ningún caso estos agentes, o drogas que mimetizan la acción del AMPc, bloquearon la activación de MAP kinasas mediada por el EGF como se ha descripto en otros sistemas celulares. Por último, el gen c-myc, cuyos transcriptos se encuentran elevados en las células MCF-10A y MCF-10T durante su crecimiento exponencial o en estadio de aquiescencia, no solo es regulado por agentes mitogénicos como el EGF, sino también por las condiciones extracelulares (densidad celular y factores de crecimiento autócrinos) y por agentes inhibitorios de la proliferación como el TGFb1. Por lo tanto se ha demostrado que la transformación in vitro de células de mama normales por el oncogén H-ras, a diferencia de lo que ocurre en otros modelos celulares, altera en forma pleiotrópica diversas funciones celulares relacionadas con el proceso neoplásico, como el crecimiento en ausencia de sustrato de anclaje, requerimiento de nutrientes y diversos cambios morfológicos, sin afectar ciertos mecanismos involucrados en la respuesta primaria que conducen a la duplicación celular como la inducción de proto-oncogenes nucleares o la activación de la vía de MAP kinasas. Asimismo, se deduce que el proceso neoplásico difícilmente pueda ser atribuido a la alteración de un solo gen; resulta más adecuado sugerir que tales desórdenes son consecuencia de un número mayor de fenómenos que actúan en forma coordinada para desarrollar todo su potencial neoplásico. Es mi más firme deseo que los estudios detallados en esta Tesis puedan contribuir de alguna forma al entendimiento de la patogenia y el desarrollo de las enfermedades neoplásicas que afectan al ser humano.

Abstract:
Breast cancer is the most frequent female tumor affecting at present one out of ten women. The complexity of this pathology and our limited knowledge of its etiology and biology hinder the understanding, prevention and treatment of the disease. Studies on the proliferation and molecular mechanisms involved in cell division from both normal and neoplastic cell lines would contribute with new insights in the the development of this affliction. In this sense, the aim of this Thesis was to study several parameters involved in the proliferation of human mammary cells exposed in culture to peptide hormones and tumor promoters. Among the broad range of molecular signals, those involved with the expression of proto-oncogenes and related kinases that regulates this process, were analyzed. These studies were carried out on several cell lines, namely MCF-10A, established from normal human breast tissue; MCF-10T, the same line transformed with an H-ras oncogene and several well-known neoplastic human breast cell lines: MCF-7, MDA-453 and SKBR3. The cellular and molecular characterization of MCF-10T showed the presence of the H-ras gene mutated in codon 12 and its overexpression. Although MCF-10T is capable of anchorage-independent growth, its duplication is inhibited by high cell density and cannot proliferate in a stratified fashion. Cells from normal tissue displayed a higher growth rate than those from neoplastic sources in a suitable culture condition, but non-tumorigenic cells, as MCF-10A cannot survive in the absence of appropriate growth factors. From the proliferating agents studied on MCF-10A and MCF-10T cells, EGF exerted the most potent mitogenic effect, followed by IGF-I and insulin at high dose. Both EGF and PMA, but neither IGF-I nor insulin, were able to modify c-fos mRNA levels. Studies demonstrated that EGF and PMA induced the expression of c-fos, c-jun, fosB and junB with a particular kinetic for each gene without any significant differences between MCF-10A and MCF-10T nor among EGF and PMA. Other genes, such as c-myc, junD or fra-1 showed only a poor variation in its transcript levels with those stimuli. Although growth rate, DNA synthesis and proto-oncogene induction were dependent on the EGF concentration in both lines, the transformed MCF-10T cell line exhibited a lower requirement for nutrients and an increased sensitivity to other mitogens, probably due to an autocrine proliferation. The association of EGF with other agents increased the proliferative effect exerted by each agent alone, without affecting the proto-oncogene mRNA levels induced by EGF. EGF exerts its action on nuclear proto-oncogenes through autophosphorylation of its specific receptor with the subsequent activation of MAP kinases. Each cell line expressed different classes of MAP kinases, according to their normal or neoplastic origin. This constitutes a significant finding, as it could be inferred that such species make up specific markers associated to the type of neoplasia analyzed. Though cAMP inducing agents inhibit proliferation of certain mammary cell lines, this action is not mediated through the control of MAP kinase activity as it was widely described in other systems. c-myc gene, whose transcripts are elevated in both proliferating and quiescent MCF-10 cells, is regulated by mitogens such as EGF and also by extracellular conditions (cellular density and autocrine factors) and TGF(1, an inhibitor of cell growth. Thus, in vitro transformation of breast cells with an activated H-ras gene alters in a pleiotropic mode several cellular functions associated to the neoplastic process, such as independent-anchorage growth, nutrient requirement and morphological changes. However, it does not affect those mechanisms involved in the early responses which trigger cell duplication, such as the induction of nuclear proto-oncogenes or activation of MAP kinases. Therefore, these results suggest that the neoplastic process cannot be attributed to the alteration of only one gene; instead, it would be more adequate to consider this disease as a consequence several events acting in coordination to fulfill their neoplastic potential. I hope the studies analyzed in this Thesis could contribute in part to the understanding of the pathogenesis and development of the neoplastic disease affecting the human being.

Montalto, María. "Prevención de la necrosis hepática producida por tetracloruro de carbono con tetraacetato de ditiotreitol" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Costas, Mónica Alejandra. "Mecanismos moleculares de regulación de la sensibilidad a glucocorticoides por las citoquinas" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las citoquinas inducen la producción de glucocorticoides (GC), los cuales inhiben la producción de citoquinas y sus acciones biológicas, protegiendo al organismo de una respuesta inmune exacerbada. Se observó que el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) aumentó la actividad transcripcional inducida por GC vía elementos respondedores a GC (GRE) en fibroblastos de ratón L-929 transfectadas con un plásmido reporter inducible por GC. Además, TNF-a aumentó el número de receptores para GC (GR) y la actividad transcripcional en el promotor de GR (HGRP) en células L-929 transfectadas con un plásmido reporter HGRP. TNF-a no tuvo efecto en células que no expresan GR pero que sí expresan receptores para TNF-a, aunque, el efecto fue evidente cuando estas células fueron cotransfectadas con un vector de expresión para GR. Estas acciones ponen de manifiesto, que TNF-a puede aumentar la actividad transcripcional de GR en respuesta a GC independientemente del aumento en el número de GR. Más aún, TNF-a aumentó la unión de GR a GRE. Como correlato biológico de estos efectos, un priming (preincubación) de TNF-a (dosis baja, no citotóxica) aumentó significativamente la sensibilidad a la acción inhibitoria de los GC sobre la citotoxicidad/apoptosis inducida por TNF-a en las células L-929. TNF-a e IL-1b tuvieron el mismo efecto estimulatorio sobre la actividad transcripcional de GR en distintos tipos celulares (glioma, epiteliales, hipofisiarias). Concluimos que, las citoquinas, pueden modular la acción de los GC a nivel molecular aumentando la sensibilidad a sus efectos reguladores en la célula blanco.

Abstract:
Cytokine-induced glucocorticoid secretion and glucocorticoid inhibition of cytokine synthesis and pleiotropic actions act as important safeguards in preventing cytokine over-reaction. We found that tumor necrosis factor-a (TNF-a) increased glucocorticoid-induced transcriptional activity of the glucocorticoid receptor (GR) via the glucocorticoid response elements (GRE) in L-929 mouse fibroblasts transfected with a glucocorticoid-inducible reporter plasmid. In addition, TNF-a also enhanced GR number and transcriptional activity on GR promoter (HGRP) in L-929 cells transfected with a HGRP reporter plasmid. The TNF-a effect on transcriptional activity was absent in other cell lines that express TNF-a receptors but not GRs, and became manifest when a GR expression vector was cotransfected, indicating that TNF-a, independent of any effect it may have on GR number, has a stimulatory effect on the glucocorticoid-induced transcriptional activity of the GR. Moreover, TNF-a increased GR binding to GRE. As a functional biological correlate of this mechanism, priming of L-929 cells with a low (non-cytotoxic) dose of TNF-a significantly increased the sensitivity to glucocorticoid inhibition of TNF-a-induced cytotoxicity/apoptosis. TNF-a and IL-1b had the same stimulatory action on glucocorticoid-induced transcriptional activity of the GR via the GRE, in different types of cytokine/glucocorticoid target cells (glioma, pituitary, epithelioid). The phenomenon may therefore reflect a general molecular mechanism whereby cytokines modulate the transcriptional activity of the GR, thus potentiating the counter-regulation by glucocorticoids at the level of their target cells.

Trevani, Analía S.. "Factores capaces de condicionar la actividad biológica de los anticuerpos IgG : Acción de las enzimas proteolíticas e impacto de la carga eléctrica" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la presente Tesis, se estudió la capacidad de factores propios a los entornos inflamatorios e inherentes a los complejos inmunes (CI), de condicionar distintas respuestas biológicas inducidas a consecuencia de la interacción del fragmento Fc de los anticuerpos IgG con sus receptores celulares específicos (RFcg). Respecto a los primeros se evaluó el efecto de dos enzimas proteolíticas de distinta especificidad, pronasa y quimotripsina. Los resultados obtenidos indicaron que estas proteasas incrementan marcadamente la avidez y la funcionalidad del RFcgII expresado por neutrófilos, condicionando la magnitud de las respuestas biológicas que involucran la participación de este receptor. Este efecto, sin embargo, parece ser dependiente de las características del CI empleado como estímulo, puesto que las proteasas aumentaron notablemente las respuestas inducidas por eritrocitos sensibilizados con anticuerpos IgG y por CI solubles, pero no modificaron aquellas inducidas por CI precipitantes. La acción potenciadora de las proteasas parece ser selectiva del RFcgII, pues este efecto no fue observado en otros receptores operativos en neutrófilos. Considerando la existencia de altos niveles de proteasas en reas inflamatorias, es posible que este mecanismo sea relevante in vivo en la regulación de la actividad del RFcgII del neutrófilo humano. En cuanto a los factores inherentes a los CI, se analizó el impacto de la carga eléctrica de los antígenos y anticuerpos que los conforman, sobre su capacidad de inducir respuestas proinflamatorias y trombóticas mediadas por células fagocíticas y plaquetas, respectivamente. La cationización de la fracción IgG de los CI, procedimiento que incrementó sus pI desde 5,8-8,2 hasta 8,0-9,5, aumentó, al menos en un orden de magnitud, su capacidad de inducir funciones dependientes de los RFcg expresados por células fagocíticas tales como la citotoxicidad, la emisión de quimioluminiscencia y la liberación extracelular de elastasa. El efecto potenciador de la cationización fue a£n m s notable empleando plaquetas. Los CI que incluían anticuerpos IgG cationizados fueron capaces de inducir fuertes respuestas de activación de plaquetas lavadas, filtradas o plaquetas suspendidas en plasma, mientras que aquellos formados con componentes nativos fueron incapaces de inducir la activación plaquetaria bajo condiciones experimentales similares. La cationización del componente antigénico de los CI, también incrementó marcadamente su potencia biológica. En conjunto, estos hallazgos indican que la carga eléctrica de los CI constituye una propiedad critica que condiciona su capacidad de inducir la activación celular y sugieren que los anticuerpos y antígenos catiónicos podrían ser relevantes en eventos inflamatorios asociados a enfermedades que cursan con altos niveles de CI circulantes. Durante el transcurso de estos estudios se realizaron observaciones adicionales relacionadas con el desarrollo de procesos inflamatorios agudos. El paradigma corriente asume que las capacidad quimiot ctica de la IgG reside en su habilidad para formar CI e inducir la activación del sistema complemento y la subsecuente producción de péptidos quimiot cticos como el C5a. En la presente Tesis, se observó que los CI son capaces, per se, de estimular la quimiotaxis de neutrófilos a través de su interacción con el RFcgII. Esta actividad quimiot ctica intrínseca de los CI podría ser responsable, al menos en parte, delreclutamiento de neutrófilos observado en sitios inflamatorios de huéspedes deficientes de complemento.

Abstract:
In the current Thesis it was studied the ability of different factors to condition biological functions induced by the interaction of the Fc fragment of IgG antibodies with their cellular specific receptors (FcgR). Both factors belonging to inflammatory focus and IC-intrinsecal factors were evaluated. Among the formers, the effect of two proteolytic enzymes with distinct specificity, pronase and chymotrypsin, was analyzed. The results obtained showed that proteases markedly increase the avidity and functionallity of FcgRII, conditioning the magnitude of the biological responses that involve this receptor. However, this effect appears to be dependent on the characteristics of the IC employed as stimulus judging by the capacity of proteases to increase functions induced by erythrocytes coated with IgG antibodies and soluble IC but not those induced by precipitating IC. The enhancing action of proteases seems to be restricted to FcgRII-dependent functions since proteases did not up-regulate the activity of other receptors expressed by neutrophils. Taking into account the high levels of proteases in inflammatory areas, these findings suggest that a mechanism involving the action of proteolytic enzymes could be relevant for the in vivo regulation of human neutrophil FcgRII activity. Among IC-intrinsecal factors, the impact of electric charge of their antibodies and antigens on their ability to induce proinflammatory and thrombotic responses mediated by phagocytes and platelets was analyzed. Cationization of the IgG fraction of IC, procedure that increased its pI from 5.8-8.2 to 8.0-9.5, enhanced at least by tenfold their ability to induce RFcg-dependent functions by phagocytic cells such as cytotoxicity, chemiluminescence emission and the elastase extracellular release. Noteworthy, it was observed that IC prepared with cationized antibodies were able to trigger platelet activation either in washed platelets, gel-filtered platelets or plasma suspended platelets. By contrast, IC formed with native components did not induce platelet activation under similar experimental conditions. Additional experiments showed that antigen cationization also markedly increses IC biological activity. These findings suggest that the electric charge of IC constitutes a critical property that conditions their ability to induce cellular activation and support a role of cationic antibodies and antigens in the development of inflammatory events associated to certain IC-induced diseases. During the course of these studies, additional observations related to the development of acute inflammatory processes were made. The current paradigm for the mechanism by which IgG induce neutrophil chemotaxis assert that this ability lies on its capacity to form IC and induce complement activation with the subsequent generation of chemotactic peptides such as C5a. In the current Thesis, it was observed that IC are able, per se, to induce neutrophil chemotaxis through their interaction with FcgRII. This intrinsic chemotactic activity of IC may account, at least in part, for the neutrophil recruitment that is observed at inflammatory sites in complement-deficient hosts.

Di Gianni, Pedro D.. "Factores inductores del estado de tumor dormido" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Observaciones clínicas y experimentales han demostrado que en muchas ocasiones la extirpación de un tumor va seguida de un rápido desarrollo de metástasis que no eran aparentes al tiempo de la misma. Esto sugiere que la presencia de un tumor primario ejerceria un control inhibitorio sobre las metástasis. El modelo experimental para el estudio de este fenómeno es conocido como resistencia concomitante. En este trabajo hemos demostrado que ratones portadores de un tumor LB eran capaces de inhibir el crecimiento de metástasis experimentales del propio tumor LB y metástasis espontáneas de otro tumor no relacionado (el altamente metastásico C7HI). La presencia del tumor LB induce en estas metástasis un verdadero estado de tumor dormido en el que las células metastásicas permanecen vivas pero sin crecimiento aparente; reciprocamente cuando el tumor LB es extirpado, su acción desaparece y ello ocasiona un rápido desarrollo de las metástasis. Presumiblemente las metástasis son inhibidas por dos mecanismos diferentes pero complementarios, a saber: un mecanismo directo que afecta la proliferación de las propias células tumorales y un mecanismo indirecto que afecta la neovascularización tumoral. Ambos mecanismos estarian mediados por un factor de bajo peso molecular (800-1200 D) hallado en el suero de ratones portadores de LB. Este factor probó ser resistente al calor y a amplias variaciones de pH, con máximos de absorción a 215 y 266 nm. Esta molécula parece poseer en su estructura una tirosina libre seguida de otra/s tirosinas modificadas, posiblemente por azúcares. Su origen parece estar asociado más a la respuesta inflamatoria que monta el huésped en presencia del tumor LB que al tumor LB por sí mismo. La definitiva caracterización de este factor podría eventualmente ser de valor en el futuro para ensayar nuevas terapéuticas en la lucha contra el cáncer.

Abstract:
Observations from both clinical and experimental oncology have demonstrated that surgical removal of a primary tumor is usually followed by an explosive growth of metastases which were not apparent at the time of excision. These observations suggest that the primary tumor may prevent or retard the development of its own metastases. The experimental model for the study of this phenomenon is known as concomitant resistance. In this work we have shown that LB tumor-bearing mice were able to inhibit the growth of experimental and spontaneous metastases from both the proper LB and the unrelated highly metastatic C7HI tumor. The presence of the LB tumor induced a tumor dormant state in which metastatic cells remained a live but without apparent growth; reciprocally, when the LB tumor was removed the suppression exerted by the local LB tumor disappeared and metastatic growth was rapidly evident. Presumably, metastases were inhibited by two different but complementary mechanisms: a direct one, affecting the proliferation of the tumor cells themselves and an indirect one affecting tumor vascularization. Both mechanisms would be mediated by a low molecular weight factor (800-1200 D) found in the serum of LB tumor-bearing mice. This factor proved to be resistant to heat and to variations of pH, exhibiting two peaks of absorption at 215 and 266 nm. This molecule would have a free tyrosine followed by one or more glycosilated tyrosine. Origin of this factor is apparently associated with the inflammatory response mounted by the host against the tumor. The final characterization of this factor could be eventually of some value to assay in the future new therapeutic approaches against cancer.

Mirkin, Gerardo A.I.. "Mecanismos inmunopatogénicos en la neuromiopatía chagásica experimental" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los mecanismos patogénicos subyacentes a las alteraciones neuromusculares producidas durante la infección con Trypanosoma cruzi fueron estudiados en un modelo murino empleando una cepa miotrópica de escasa virulencia (CA-I) y una cepa letal pantrópica (RA), mediante técnicas electrofisiológicas, histológicas e inmunológicas. Ratones C3H/HeN infectados con la cepa CA-I manifestaron un patrón electromiográfico de compromiso muscular primario, en tanto los infectados con RA, revelaron un patrón neuropático primario. Los estudios histopatológicos evidenciaron alteraciones inflamatorias de severidad creciente en los tejidos afectados estudiados en este modelo: músculo isquiotibial, nervio ciático y médula espinal. Las lesiones musculares eran de mayor intensidad en la infección con CA-I y las de tejido nervioso predominaban con RA, lo cual está de acuerdo con el tropismo parasitario. El fenotipo celular predominante en los infiltrados inflamatorios dependió de la cepa de T.cruzi, del tejido y del tiempo post-infección. Los rasgos más destacados en la infiección con la cepa CA-I fueron: a) Predominio de linfocitos T CD4 en músculo esquelético durante la fase aguda y crónica temprana y, b) Presencia de linfocitos B con IgM de superficie en la fase crónica tardía en todos los tejidos. Las características más relevantes de la infección con RA fueron: a) predominio de linfocitos T CD8 en tejido nervioso durante todo el curso de la infección, b) presencia de células NK (asialo-GMl+) en tejido muscular durante la fase crónica y, c) presencia células CD4-, CD8- en tejido nervioso durante la fase crónica. Estudios de proliferación linfocitaria realizados durante la infección crónica con el clon K-98 de CA-I demostraron la existencia de linfocitos T CD4 y CD8 autorreactivos frente a Ag de tejido muscular esquelético y sistema nervioso. En estudios similares con la cepa RA ambassubpoblaciones de linfocitos T sólo proliferaron frente a Ag de SN. La transferencia pasiva de linfocitos T CD4 de ratones infectados con K-98, indujo miositis con predominio de células T CD4+ y macrófagos en ratones singeneicos normales, sugiriendo el desarrollo de hipersensibilidad retardada (HR), frente a Ag musculares. Los linfocitos T CD8 de los mismos ratones no desencadenaron patología neuromuscular en los receptores. La transferencia de linfocitos T CD4 y CD8 de ratones infectados con RA, indujo neuritis y leptomeningitis, sugiriendo el desarrollo de mecanismos de HR como de citotoxicidad dependiente de linfocitos T frente a Ag de sisterna nervioso.

Abstract:
The pathogenic mechanisms underlying the newomuscular alterations during manosoma d infedion were studied in a mnurh?e model by means of electrophysiological, histological and immunological techniques in inbred mice infected with a low virulence myotropic strain (CA-I) and a highly virulent pantropic strain by means of electrofisiological, histological and immunological techniques. C3H/HeN mice infected with CA-I showed an electromyographic pattern of primaxy muscle compromise while those infected with RA disclosed a primary neuropathic pattern. Histological studies revealed inflammation of increasing severity in the affected tissues studied in this model: hamsting muscle, sciatic nerve and spinal cord. The muscle lesions were more intense in mice infected with CA-I, and those in nervous tissue were more intense in mice infected with RA in agreement with the parasite tropism. The predominant phenotype in the inflammatory infiltrates depended on the T.cruzi strain, the tissue and post-infection time studied. The relevant features in the infection with CA-I were: a) Predominance of CD4 T lymphocytes in skeletal muscle during the acute and early chronic phases and, b) Presence of surface IgM positive B lymphocytes during the late chronic phase in all tissues. The relevant fatures in the infection with RA were: a) Predominance of CD8 T lymphocytes in nervous tissue during the course of infection, b) Presencia of NK cells (asialo-GMl+) in muscle tisuue during the chronic phase and, c) Presence of CD4-, CD8- cells in nervous tissue during the chronic phase. Lymphocyte proliferation studies performed during the chronic phase with the K-98 clone of CA-I showed the existence of nervow system Ag and muscle Ag autoreactive CD4 and CD8 T lymphocytes. In similar studies with the RA strain both T cell subsets proliferated against nervous tissue Ag only. Pasive cell transfer of CD4 T lymphocytes fiom K-98-infected mic, induced myositis with predominance of CD4 T cells and macrophages in normal syngeneic mice, suggesting the development of delayed-type hypemdtivity (DTH) against muscle Ag. CD8 T lymphocytes fiom the same donors did not develop neuromuscular pathology in recipients. The transfer of CD4 and CDS T lymphocytes fiom RA-infected mice induced neuritis and leptomeningitis in recipients, suggesting the development of both DTH and T lymphocyte-dependent cytotoxicity against nervous system Ag.

Monte, Martín. "Estudio sobre la activación de linfocitos para inducir angiogénesis durante la portación tumoral" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La angiognésis tumoral es el proceso que involucra la proliferación de vasos sanguíneos hacia el tumor en desarrollo. Los capilares que llegan al tumor aportan nutrientes y oxígeno y la vía de acceso de las células tumorales a circulación. Por lo tanto, este proceso es indispensable para el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica. Además de existir factores angiogénicos liberados por la células tumorales, se ha descripto que células del huésped pueden colaborar en este proceso. En este laboratorio se demostró que los linfocitos T provenientes de ratones portadores de tumor, tienen actividad angiogénica. El objetivo de este trabajo fue identificar factores que estuvieran alterados durante el crecimiento tumoral y que fueran capaces de estimular los linfocitos para desencadenar la respuesta angiogénica (SLIA). Particularmente se estudió la importancia de la síntesis de poliaminas (PA) y de la producción de radicales libres de oxígeno (ROS) en este proceso. Se encontró que si bien la síntesis activa de PA es indispensable para la actividad angiogénica de los linfocitos, estos metabolitos no son inductores de SLIA. Cuando se investigó la importancia de la producción de ROS en la SLIA, se observó: a) el bloqueo de la SLIA por la administración de secuestradores de ROS a ratones portadores de tumor; b) aumento de peroxidación lipídica en el bazo de ratones portadores de tumor; c) aumento en el cociente entre la actividad de las enzimas antioxidantes SOD y CAT en el bazo normal, que continuaba incrementándose durante el crecimiento tumoral. Luego se determinó in vitro que el peróxido de hidrógeno era el único ROS capaz de inducir esta respuesta angiogénica, coherentemente con los hallazgos realizados in vivo sobre la peroxidación lipídica y el desbalance SOD/CAT. Finalmente se observó que la administración in vivo de esta molécula estimula la respuesta SLIA en forma análoga a la inducida por las células tumorales.

Abstract:
Solid tumors induce an angiogenic response by the host blood vessels to form a new vascular network for the supply of fresh nutrients and oxygen. This neovascular response is responsible for tumor growth and metastatic spread. We have previously observed that, in addition to tumor cells, T-lymphocytes from tumor-bearing mice induced angiogenesis in syngeneic combination. This response was called SLIA (syngeneic lymphocyte-induced angiogenesis). The aim of this work was to identify factors related to tumor development capable to stimulate lymphocytes to induce angiogenesis. Since polyamine biosynthesis and reactive oxygen specis (ROS) production were increased during tumor growth, we focused the study on these processes. Using the irreversible inhibitor of the Ornithine Decarboxilase, a-DFMO we observed the in vivo and in vitro inhibition of the SLIA, but the treatment of lymphocytes with the polyamine putrescine failed to stimulate these cells induce angiogenesis. These results suggest that lymphocytes would require an active polyamine biosynthesis to induce angiogenesis but polyamines are not molecules capable to trigger this process. On the other hand, we blocked the SLIA by the administration of an antioxidant to tumor-bearing mice. Moreover, we stimulate normal lymphocytes to induce angiogenesis by the incubation of the cells in a ROS generator medium. Studies on lymphocytes stimulated in vitro by ROS to induce angiogenesis, showed that only the enzyme catalase could block the activation. The incubation of normal lymphocytes with H2O2 stimulated these cells to induce angiogenesis. The administration of hydrogen peroxide or an oxidative stress-producing drug (doxorubicin) to normal mice activated in vivo the SLIA response. On the other hand, we observed evidences of oxidative stress measuring high contents of lipid peroxidation products in the spleen. Moreover, when the ROS scavenger enzymes (superoxide dismutase-SOD and catalase-CAT) were determined, we observed low CAT activity in normal spleens, reflected on a high SOD/CAT ratio, when compared to liver or kidney values. We also showed an increasing value of the SOD/CAT ratio along with tumor growth. These results strongly suggest that hydrogen peroxide could be involved on the mechanisms of lymphocyte activation to induce angiogenesis during tumor growth.

Casas, Adriana Gabriela. "Metabolismo del hemo y neoplasias" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Terapia Fotodinámica del cáncer (TFD) es un tratamiento que se basa en la acumulación selectiva de un fotosensibilizante en las células tumorales. Este, luego de ser excitado por acción de la luz roja, desencadena una serie de reacciones mediadas por radicales libres, que finalmente destruyen el tejido. El empleo del ácido 5-aminolevúlico (ALA) como precursor de la síntesis de porfirinas, ha cobrado especial interés en los últimos años tanto en la TFD usando las porfirinas como fotosensibilizantes, como en la fotodetección de tumores, empleando la propiedad de estos pigmentos de fluorescer con la luz UV. Por otra parte, se ha observado que algunos tejidos neoplásicos acumulan porfirinas, por lo cual se ha postulado que el camino biosintético de los tetrapirroles se encuentra alterado en los pacientes con neoplasias. En el presente trabajo se caracterizaron las actividades de algunas de las enzimas del camino biosintético del hemo en un adenocarcinoma mamario de ratón y en el hígado de los animales portadores de dicha neoplasia. Se estudió la biosíntesis de porfirinas in vitro a partir de ALA en tumor y otros tejidos, empleando para ello la técnica de explantes tisulares, y se encontró que la acumulación de porfirinas se hace más selectiva para el tumor cuando el precursor se administra encapsulado en liposomas o cuando se agrega cinc en el medio de incubación. Se desarrolló un modelo in vitro-in vivo para estudiar la efectividad de la acción fotodinámica de las porfirinas sintetizadas endógenamente a partir de ALA, en el cual se monitorea el crecimiento de los tumores irradiados, luego de su reimplantación en animales receptores. Se encontró que los explantes incubados 2 hs con ALA, y que por lo tanto sintetizaron 4,6 (g de porfirinas/g tej., al ser irradiados sufrieron una reducción desde un 60% de la masa tumoral, hasta la falta completa de crecimiento del tumor en el ratón receptor. Además se observó una correlación entre el nivel de porfirinas acumuladas y el daño celular. El mismo modelo fue utilizado para investigar la efectividad del daño fotodinámico inducido por ALA en combinación con los antineoplásicos 5-Fluorouracilo, Ciclofosfamida y Doxorubicina.. Se encontró un aumento en la eficacia de la TFD, cuando se emplearon Ciclofosfamida y Doxorubicina; no así cuando se usó 5-Fluorouracilo. Con nuestro modelo in vitro-in vivo se ha demostrado que ocurre una importante y hasta una completa destrucción de las células tumorales mediante la combinación de la síntesis endógena de porfirinas a partir de ALA y un tratamiento lumínico de baja potencia. Los resultados presentados en este trabajo indican que el empleo del ALA en la detección temprana de las células alignas y en la TFD es sumamente prometedor. Nuestros hallazgos plantean también la posibilidad del uso combinado de antineoplásicos con la TFD inducida por ALA.

Abstract:
Photodynamic Therapy (PDT) shows considerable promise as a treatment modality for malignant tumors. This type of therapy is based on the accumulation of a photosensitiser after its administration. Subsequent illumination with light of an appropriate wavelength provokes a photochemical reaction that results in tissue destruction. 5-aminolevulinic acid (ALA) induced photosensitisation may be a promising approach. So does the use the fluorescence under UV light of ALA induced porphyrins on the early detection of malignancies. The overproduction of porphyrins in tumors, in the absence of known porphyria, has also been observed by several authors. It has been suggested that porphyrin metabolism may be altered in cancer patients. In this work we have reported some properties of ALA-D and PBG-ase, two enzymes of the porphyrin biosynthesis pathway, in a mouse mammary adenocarcinoma and liver of tumor bearing mice. Using the tissue explant cultures technique we have studied the endogenous porphyrin biosynthesis in tumor and other organs using the ALA precursor either free or encapsulated in liposomes. It was found that the latter improved tumor selective accumulation. Porphyrin retention was further enhanced when cinc was added to the incubation media. To assess the potential antineoplasic efficacy of ALA-based Photodynamic Therapy, we have designed a new in vitro - in vivo model. Tumor explants were incubated with ALA and, after irradiation, viability was tested by monitoring the growth of implanted tumors in receptor animals. It was found that tumor explants incubated 2 hours with ALA, reaching a concentration of 4.6 (g porphyrin/g tissue, lead from 60% reduction of the tumoral mass to complete lack of tumor growth. These results showed a correlation between cellular destruction and the level of porphyrin content. The same model was used to investigate the effectiveness of ALA as photosensitizer in combination with antineoplasic drugs such as 5-Fluorouracil, Cyclophosphamide and Doxorubicin. An increase in the efficacy of the photodynamic therapy was observed when Cyclophosphamide and Doxorubicin were used, but there was no improvement when 5-Fluorouracil was used. These findings, showing an important to complete tumor cell destruction by combination of porphyrins endogenously formed from ALA and low irradiance, support our proposal on the use of ALA for early diagnosis and photodynamic treatment of malignant cells. Furthermore, ALA-based PDT in combination with chemotherapy is a promising therapy.

Ballaré, Cecilia J.. "Heterogeneidad celular en carcinomas mamarios humanos" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Dos objetivos principales fueron planteados en este trabajo: 1) investigar la heterogeneidad celular en carcinomas mamarios humanos, caracterizando distintas subpoblaciones celulares respecto a proliferación y expresión de diversos marcadores tumorales; 2) obtener anticuerpos monoclonales (AMC) contra estos tumores, con propiedades citotóxicas, que reconozcan células indiferenciadas, de alto potencial proliferativo. Los estudios de heterogeneidad celular fueron realizados utilizando muestras tumorales humanas, la proliferación evaluada mediante incorporación de Timidina y marcadores por inmunohistoquímica. Los resultados permitieron establecer una secuencia de expresión de marcadores a medida que progresa la diferenciación celular y disminuye la capacidad proliferativa. Pudieron identificarse marcadores asociados a distintas etapas de la diferenciación (NCA90, receptor estroncio, receptor de progesterona, TAG72, CaMBr1, CEA) y otros que comienzan a expresarse en células indiferenciadas, altamente proliferativas, y continuarían durante todo el proceso de diferenciación (Ag2.15, PEM). Se investigaron también las propiedades del AMC FC-2.15 (anti-Ag2.15) desarrollado utilizando como inmunogeno un carcinoma mamario humano indiferenciado. FC-2.15 presento una potente citotoxicidad contra células Ag2.15+ mediando lisis por complemento humano, reconocio un antígeno presente en membrana plasmática en alta densidad (2,8x10 6 /célula) y fue lentamente internalizado. Los resultados presentados en este trabajo sugieren que FC-2.15 podría ser útil en inmunoterapia de pacientes con neoplasias Ag2.15+.

Abstract:
The main purposes of this study were: 1) to investigate the cell heterogeneity in human breast cancer and characterize the different cell subpopulations with regard to proliferation and expression of tumor markers; 2) to obtain monoclonal antibodies (MAb) against these tumors which recognize highly undifferentiated (stem) cells, and mediate specific cytotoxicity. Cell heterogeneity was studied in human tumor samples, proliferation was evaluated by thymidine incorporation and markers by immunohistochemistry. According to the results, it could be defined a regular sequence of marker expression as cell differentiation proceeds and proliferation decreases. Some markers were identified which are expressed in different stages of the differentiation pathway (NCA90, estrogen receptor, progesterone receptor, TAG72, CaMBr1, CEA). Conversely, the expression of other markers (Ag2.15, PEM) would start in undifferentiated-highly proliferative cells and remain throughout the whole differentiation process. It was also investigated the properties of MAb FC-2.15 (anti-Ag2.15) generated using an undifferentiated human breast carcinoma as immunogen. Results showed that FC-2.15 exhibits strong human complement-mediated cytotoxicity against Ag2.15+ cells. It recognizes a high-density antigen (2.8x10 6/cell) in the cell membrane and is slowly internalized. The results obtained in this study suggest that FC-2.15 could be a useful agent for passive immuntherapy.

Mazzadi, Alejandro Noel. "Evolución mecánico-energética del músculo cardíaco durante la isquemia y la reperfusión" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se estudió la producción de calor (Ht) y evolución mecánica en ventrículos de rata estimulados eléctricamente a 1.5 Hz, perfundidos según la Técnica de Langendorff y sometidos a 45 min de isquemia (Isq) y 45 min de reperfusión (Rep). La influencia de la temperatura se evaluó a 25, 30 y 35 ºC. Los 4 componentes diferenciables del calor activo (H1, H2, H3 y H4)(Ponce-Hornos y col, Pflugers Arch-Eur J Physiol 429; 1995) se analizaron en contracciones aisladas en los 10 primeros min de Isch. Los músculos se montaron en un calorímetro (Ponce-Hornos y col, Am. J. of Physiol. 243; 1982) que permitió medir Ht y simultáneamente la presión desarrollada en condiciones isovolúmicas (P) y la presión de reposo (PR). A partir de los estudios realizados fue posible descartar procesos que fueron postulados como responsables de la falla cardíaca isquémica e involucrar en medida apropiada a otros. Entre los primeros, fue posible descartar la caída del pH y los cambios en la energía libre del ATP como responsables en etapas muy tempranas. También pudo disociarse la caída de la P respecto de la desaparición de un componente mitocondrial Ca++ dependiente (H4). Entre los segundos, se identificó un evento energético durante la Isch de alto valor predictivo de la disfunción mecánica y/o daño durante la Rep. También, los experimentos dan apoyo a los cambios en la PR como responsables de la abrupta caída en la P al inicio de la Isch. Además, fue posible vincular a la interacción actomiosínica con la mayor fracción de liberación de energía en el período inicial de la Rep. También se asoció la baja recuperación mecánica durante la Rep con altos valores relativos de calor independiente de tensión.

Abstract:
Total heat production and mechanical evolution were studied in electrically stimulated (1.5 Hz) rat’s ventricles perfused by Langendorff technique and subjected to ischemia (isch) and reperfusion (Rep) (45 min both). Temperature effect was evaluated at 25, 30 and 35 °C. For identified active heat components from a single contraction (H1 to H4)(Ponce-Hornos et al, Pflugers Arch-Eur J Physiol 429; 1995) were analyzed during the first 10 min of ischemia. Resting (RP) and developed pressure (P) and total heat production (Ht) were simultaneously measure on isovolumetric hearts placed in a calorimeter (Ponce-Hornos et al, Am J of Physiol 243; 1982). From these results a fall in pH, as well a changes in ATP free energy, were discarded as possible causes of cardiac failure after early ischemia. Also, the fall in developed tension was dissociated from the Ca-dependent mitochondrial component (H4). An energetic event was identified during the ischemic phase which was highly related with the mechanical failure during reperfusion. And the other hand, these experiments suggest that changes in resting tension are responsible for the brisky fall in the developed pressure at the begining of the ischemia. Even more, the main fraction of released energy during the begining of reperfusion was associated to acto-myosin interaction. Finally, the small mechanical recovery during reperfusion was related with high relative values of tension independent heat.

Mallo, Gustavo V.. "Estudio de genes expresados diferencialmente en el cáncer de colon humano" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Novaro, Virginia. "Influencia de agentes vasoactivos en el proceso implantatorio embrionario : Alteraciones en la diabetes mellitus" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo abordamos la implantación embrionaria en ratas controles y diabéticas desde el punto de vista del fenómeno vasoactivo que conlleva. Las prostaglandinas son necesarias para permitir la implantación de los embriones en el lumen, ya sea incrementando el flujo sanguíneo y la vasodilatación del útero durante la decidualización endometrial, como regulando Ia actividad contráctil del tejido miometrial. El óxido nítrico ha sido reconocido como agente vasodilatador y miorrelajante, y parte de su efecto es mediado a través de la regulación de la síntesis de prostaglandinas en diversos procesos fisiológicos. Se ha determinado variaciones en la síntesis uterina de prostaglandinas y de óxido nítrico en la preñez temprana en la rata, y se ha establecido una relación causal entre ambos mecanismos fisiológicos durante la implantación embrionaria. En el útero dichos agentes vasoactivos aumentan durante los días peri-implantatorios de la preñez, como resultado de la combinación de la acción de los esteroides ováricos y de agentes locales derivados del embrión o de la madre. Las isoformas Cab-dependiente y Cap-independiente de la enzima sintetizadora de óxido nítrico son las responsables del incremento en la actividad enzimática en el día de la implantación. La inhibición de la síntesis intraluminal de óxido nítrico reduce el número de embriones implantados en un 50%, probablemente alterando la adecuada irrigación sanguínea al sitio de implantación. También se determinó que la producción uterina de prostaglandina E y qu depende tanto de la producción de óxido nítrico como de señales embrionarias tempranas. Nuestros resultados indican además, que la acción vasoactiva del óxido nítrico y de las prostaglandinas puede modularse de manera tal de compensar alteraciones metabólicas en la rata diabética de tipo no-insulino-dependiente, y permitir que el proceso implantatorio ocurra eficientemente en esta patología.

Abstract:
This thesis addresses the process of embryo implantation in control and diabetic rats focusing in the vasoactive changes it involves. We have established the role of prostaglandins and nitric oxide. The first group of molecules is required to allow embryo implantation in the uterine lumen, by increasing uterine blood flow and vasodilatation during endometrial decidualization and by regulating the contractile activity of the miometrial tissue. On the other hand, nitric oxide, a recognized vasodilating and muscular relaxing agent, exerts part of its effects in several physiological processes by modulating prostaglandin synthesis. In the present work we have determined the existence of significant changes in the uterine synthesis of prostaglandins and nitric oxide during the early pregnancy in the rat and we have established a causal relationship between both mechanisms during the embryonic implantation. The observed increase in the concentration of these vasoactive agents in the uterus takes places in the peri-implantation days, as a result of the combined action of ovarian steroids and local factors derived either from the embryo or the maternal tissue. Both the Cap-dependent and independent isoforms of the nitric oxide synthetase are responsible for the increase in enzymatic activity in the implantation day. The relevant role played by nitric oxide is revealed by the fact that inhibition of uterine nitric oxide synthesis reduces the number of implanted embryos by 50%, probably because it alters the appropriate blood supply to the implantation site. In addition, it was determined that the production of prostaglandin E and an depends both on the production of nitric oxide and on early embryonic signals. Our studies also indicate that the vasoactive effect of nitric oxide and prostaglandins is modified in the non-insulin dependent diabetic rat in such a way as to compensate the metabolic alterations that this pathology involves, thus allowing an efficient embryo implantation.

Franco, Marcela. "Resistencia concomitante antitumoral inducida por tumores murinos de distintos grados de inmunogenicidad" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La resistencia concomitante antitumoral (RC) es la capacidad de un individuo portador de un tumor de inhibir el crecimiento de un segundo implante tumoral realizado en un sitio distinto del primero. Se estudió este fenómeno en ratones eutímicos y atímicos, usando nueve tumores murinos con distintos grados de inmunogenicidad. Se describieron dos picos de RC durante el desarrollo del tumor primario. El primer pico fue generado sólo por tumores inmunogénicos pequeños, file específico e irreversible y estuvo asociado a mecanismos inmunológicos convencionales dependientes del timo. El segundo pico de RC fue compartido por tumores inmunogénicos y no inmunogénicos de gran volumen, fire inespecífico, timo-independiente y al menos en parte, reversible y estuvo asociado a la actividad de un factor/es inhibidor de aproximadamente 1000 D de peso molecular, presente en el suero de ratones portadores de tumor. Este factor ejercería un efecto inhibitorio directo e indirecto sobre el tumor secundario: el efecto directo se ejercería sobre las propias células tumorales; el efecto indirecto se ejercería a través de la inhibición de la neovascularización. El efecto inhibitorio se manifiesto como una inhibición de la proliferación —condisminución en el número de células en mitosis y de células positivas para el Antígeno Nuclear de Proliferación Celular (PCNA)- y como un aumento en el número de células en apoptosis. Asimismo, se observaron alteraciones en la cinética del ciclo celular, con un aumento de la fase S y disminución de las fases (G0-G1) y (G2-M).

Abstract:
Antitumor concomitant resistance is the phenomenon according to which a tumor-bearing host inhibits the development of secondary tumor implants carried out in a different site. This phenomenon was studied in euthymic and athymic mice, using nine murine tumors with widely different immunogenicity. Two temporally separate peaks of concomitant resistance were detected during primary tumor development. The first one was exhibited only by small immunogenic tumors; it was tumor-specific, irreversible and mediated by classical immunological T cell dependent mechanisms. The second peak was shared by both immunogenic and non-immunogenic large tumors; it was nonspecific, thymus-independent and partially reversible and correlated with the activity of an antitumor factor/s (molecular weight = 1000 D aprox.) present in the serum of tumor-bearing mice. This factor/s would exert direct and indirect inhibitory effects on secondary tumor growth, the former affecting tumor cells themselves and the latter limiting neovascularization. The inhibitory effect was associated with a decrease in the number of both cells in mitosis and cells expressing the Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), with an increase in the number of apoptotic cells and alterations in cell cycle kinetics, such as an increase in the proportion of cells in S phase and a decrease in (G0-G1) and (G2-M) phases.

Bigi, Fabiana. "Identificación y caracterización de antígenos de Mycobacterium bovis" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Chamson, Astrid de Reig. "Desarrollo y control de un tumor experimental de ovario" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de esta tesis fue el estudio de un modelo animal de tumor ovárico con ciertas similitudes con patologías ováricas hormono-dependientes y endocrinamente funcionales. El luteoma se desarrolla al autoinjertar un ovario en el bazo de una rata hembra adulta bilateralmente ovariectomizada, por la hipergonadotrofinemia resultante. En estudios de un año de duración determinamos que son tumores benignos y no modifican el estado general del animal. La mayoria de los animales portadores de tumor cursan con gonadotrofinas elevadas por un período de tiempo prolongado. Los luteomas secretan inhibina determinando un patrón particular de secreción de FSH. In vitro estos tumores presentan la esteroidogénesis basal alterada. La administración crónica de buserelina (análogo de GnRH)tuvo un claro efecto antitumoral: redujo la aparición de tumores e inhibió su crecimiento. A través de receptores específicos de afinidad similar al ovario control, la buserelina ejerce un efecto directo sobre las células de luteomas: inhibe la secreción de progesterona estimulada por LH. Las células tumorales son más sensibles a este efecto que las células lúteas control. Sin embargo, los receptores para GnRH en las células de los luteomas se encuentran desacoplados de su via clasica de segundos mensajeros: fosfolipasa C. En nuestros trabajos caracterizamos los luteomas en diversos aspectos que abarcan al animal entero hasta estudios subcelulares.

Abstract:
The aim of the present thesis was the study of an animal model of ovarian tumor. The interest of this tumor lies in its similarities with ovarian pathologies which are hormone-dependent and endocrinologically active. This luteoma develops when an ovary is grafted into the spleen of a bilaterally ovariectomized adult female rat, as a consequence of the resulting hipergonadotrophinemia. In a year-long study we determined that these tumors are benign and do not alter the general condition of the animals. The majority of the tumor-bearing animals display high gonadotrophin levels for long periods of time. Luteoma secrete inhibins, which determine the particular FSH secretion pattern. In vitro these tumors show basal steroidogenesis alterations. Chronic buserelin (a GnRH analog) administration had a clear antitumoral effect: it inhibited initial tumor development and induced a reduction in tumor volume. Buserelin, acting on specific receptors with affinity similar to that in control ovaries, has a direct effect on luteoma cells: it inhibits LH-stimulated progesterone secretion. Tumoral cells are more sensitive to this effect than control luteal cells. However, GnRH receptors in luteoma cells are uncoupled from their classic second messenger generating system: phospholipase C. In our work we have characterized these luteoma in a variety of aspects including the whole animal and subcellular studies.

Urtreger, Alejandro Jorge. "La fibronectina como moduladora del fenotipo metastásico en líneas tumorales murinas" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los procesos de invasión tumoral y diseminación metastásica involucran tanto moléculas de adhesión como proteasas tumorales. Entre las moléculas de adhesión la fibronectina (FN), una glicoproteína de alto peso molecular presente en la matriz extracelular (ME) y en varios fluidos corporales, juega un importante rol en muchos aspectos de la interacción célula-célula y célula-sustrato incluyendo adhesión, spreading y migración, cicatrización y transformación maligna. El activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPA) es una enzima proteolítica capaz de activar el sistema fibrinolítico por conversión del plasminógeno en plasmina e interviene en numerosos fenómenos de remodelación de matrices tisulares. Los tejidos cancerosos suelen contener un exceso de uPA, hecho que genera una intensa actividad degradativa en torno de la masa tumoral primaria. De esta manera, las células tumorales son capaces de degradar diferentes componentes de la matriz extracelular y migrar a través de estos defectos, constituyendo un paso crucial en el proceso de invasión y metástasis. En el presente trabajo se muestra el desarrollo de modelos de cáncer experimental útiles para estudiar el rol de las proteasas y los componentes de la ME en la biología de la progresión tumoral. En una primera instancia se establecieron y caracterizaron las líneas celulares LM3 y LMM3. obtenidas por subcultivos sucesivos in vitro a partir de cultivos primarios de los adenocarcinomas mamarios murinos M3 y MM3 respectivamente. Durante la evolución de la línea LM3 se observó un incremento en la capacidad de crecer en forma independiente del anclaje, un desplazamiento hacia un nivel triploide en la distribución del número cromosómico y la perdida gradual de la expresión de FN. La capacidad invasiva local y la capacidad metastásica espontánea de la línea LM3 se incrementaron con el aumento del número de repique, en asociación con la progresiva pérdida de expresión de FN y el incremento en los niveles de uPA unido a la membrana celular. Por otra parte, las células LMM3 mantuvieron la incapacidad para expresar FN y la alta capacidad metastásica espontánea ya observada en su tumor parental MMS, adquiriendo además una mayor invasividad local. Con el fin de analizar el rol de la FN en el proceso metastásico, células de la línea LMM3 se transfectaron en forma estable con distintas construcciones conteniendo variantes wt (salvaje) y RGD (-) del cDNA de FN humana y se obtuvieron, de esta manera, clones celulares capaces de re-expresar esta FN humana recombinante. Si bien ninguno de estos clones fue capaz de ensamblar una matriz extracelular in vitro, los mismos mostraron una reducción en su capacidad migratoria y un incremento en sus propiedades adhesivas. Todos los clones celulares analizados mostraron una reducción significativa en su potencial metastásico experimental cuando se los comparó con clones control y con la linea celular parental. Una tendencia similar se observó en la capacidad metastásica espontánea. Estos resultados indican que la re-expresión de FN, carente del sitio de unión a células RGD e incapaz de formar matriz extracelular. es suficiente para disminuir el potencial metastásico de las células tumorales. Además de tener un efecto directo en la adhesión y migración celular, la expresión de FN podría estar modulando otros eventos celulares asociados a la cascada metastásica. Con el fin de analizar esta hipótesis, se estudió el potencial angiogénico y la capacidad de producir uPA, una proteasa altamente correlacionada con el fenotipo invasivo, de los diferentes clones celulares. Independientemente de la integridad de la secuencia RGD, todos los clones transfectados con el gen de FN mostraron una reducción significativa en la capacidad angiogénica respecto del clon control, indicando que la FN podría prevenir el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos, ya sea capturando o impidiendo la liberación de factores angiogénicos. Por otra parte, la re-expresión de FN produjo un incremento en los niveles de uPA secretados al medio condicionado en todos los clones analizados, si bien aquellos que expresan la variante RGD (-) secretaron un 50% menos de uPA que aquellos que expresan la variante wt. Por otro lado, los clones FNwt fueron incapaces de unir uPA a la superficie celular, mientras que los clones RGD (-), al igual que el clon control, conservan esta capacidad. El tratamiento de células LMM3 o del clon control con FN exógena indujo un aumento en la secreción de uPA y una caída en la capacidad de unir uPA a la membrana plasmática, en forma similar a los efectos inducidos por la re-expresión de FN en los clones. La modulación por FN de la actividad uPA secretada y asociada a la membrana celular mostró ser dependiente de la secuencia RGD y de la integrina β1. Estos resultados sugieren que la capacidad de la FN de bloquear el desarrollo de las metástasis en los clones celulares analizados puede también estar parcialmente generada por la disminución en la capacidad de unir uPA a la superficie celular mediada por la FN, generando la reducción de la capacidad migratoria e invasiva de las células. En la presente tesis se describe por primera vez un mecanismo por el cual la FN interviene en la prevención de la diseminación metastásica de manera independiente de la formación de ME y del principal sitio de unión a células, la secuencia RGD. Además, demostramos que la FN es capaz de modular la expresión de uPA y de su receptor uPAR. Por otra parte se sugiere la existencia de otros mecanismos que influyen en el potencial metastásico. En la presente tesis se proveen además nuevas evidencias acerca de cómo moléculas de la ME pueden modular el fenotipo metastásico.

Abstract:
Tumor invasion and metastasis is a multistep process involving adhesion molecules as well as tumor proteases. In order to study the role of fibronectin (FN) in the metastatic process, we transfected a new cell line (LMM3), obtained in our laboratory by sequential subcultures in vitro, with two variants of a full length human FN cDNA. Besides affecting the adhesion and migration, we also analyzed if the reexpresion of FN may be somehow modulating the production of urokinase-type plasminogen activator (uPA), a protease highly correlated with the invasive phenotype. Our results showed that FN may prevent the metastatic dissemination independently of matrix formation and RGD sequence, the main cellular binding site. The results presented here strongly support a novel activity for the multifunctional glycoprotein FN regarding the regulation of uPA production as well as the capacity of tumor cells to bind uPA. We believe that the present report also provides a new insight on how ECM molecules like FN, may reduce the metastatic phenotype.

Ledda, María Fernanda. "Estudio del rol de la proteína en el desarrollo y progresión del melanoma humano" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
SPARC (Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine) es una proteína extracelular asociada a tejidos que presentan altas tasas de proliferación celular y remodelación de la matriz. En este trabajo se muestra que las lineas celulares de melanoma humano IIB-MEL-LES, IIB-MEL-IAN e IIB-MEL-J así como varios melanomas humanos metastásicos expresan altos niveles de la proteína y del ARNm de SPARC. Mediante análisis por Western Blot, detectamos una única banda de 42 kDa secretada in vitro por fibroblastos diploides humanos y un doblete de 40 a 45 kDa secretado por las tres líneas celulares de melanoma y en todos los melanomas metastásicos testeados. Algunas de las muestras de melanomas y de las líneas celulares mostraron un doblete adicional de 34-36 kDa. El ARNm de SPARC fue detectado por ensayos de northern blot en las tres líneas de melanoma estudiadas, en las l4 muestras de melanomas metastásicos y en los tumores inducidos en ratones atímicos. El patrón heterogéneo de SPARC secretado por las células de melanoma humano es resultado de la glicosilación post-traduccional y de un clivaje extracelular específico. A diferencia de lo que sucede con los fibroblastos humanos, las células de melanoma no sobreexpresaron SPARC luego del agregado de TGF-β. El análisis inmunohistoquímico demostró que SPARC se expresó fuertemente en el 100% de los melanomas primarios (7/7) y metastásicos (29/29), con moderación en la mayoría de los nevos displásicos positivos (13/14) y débilmente en los nevos benignos (4/25). No se detectó expresión de SPARC en melanocitos normales. Los datos sugieren que la expresión de de esta proteína está asociada a la progresión neoplásica del melanoma humano. En el presente trabajo también se describe la supresión parcial de la expresion de SPARC en 2 líneas de melanoma humano utilizando un vector de expresión con la secuencia antisentido para SPARC. La reducción de los niveles de expresión de esta proteína dio como resultado una reducción en la capacidad adhesiva e invasiva in vitro de las células tumorales sobre membranas basales reconstituídas, eliminando completamente su capacidad tumorigénica in vivo. Esta es la primera evidencia de que SPARC desempeña un papel clave la progresión del melanoma humano.

Abstract:
SPARC (Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine) is an extracellular protein associated with tissues exhibiting high rates of cell proliferation and matrix remodelling. The present work shows that the human melanoma cell lines IIB-MEL-LES, IIB-MEL-IAN and IIB-MEL-J and different human metastatic melanomas expressed high levels of SPARC mRNA and protein. By western blot analysis we detected a unique secreted 42 kDa band in human diploid fibroblast-conditioned medium and a 40 to 45 kDa doublet in the three melanoma cell lines and all the metastatic melanomas tested. Part of the melanoma samples and cell lines showed an additional doublet of 34-36 kDa. SPARC mRNA was expressed by the three established cell lines, 14 metastatic melanoma samples, and tumors raised in nude mice, and no spliced variants were found. The heterogeneous pattern of SPARC secreted by human melanoma cells is the result of post-translational glycosilation and specific extracellular cleavage. Unlike human fibroblasts, melanoma cells did not over express SPARC upon addition of TGF-β. Immunohistochemical analysis showed that SPARC was strongly expressed in 100 % of primary melanomas (7 of 7) and metastatic melanomas (29 of 29), moderately expressed in most of the positive dysplastic nevi (13 of 14), and only weakly expressed in nevocellular nevi (4 of 25). Normal melanocytes did not express SPARC. The data suggest that the expression of SPARC is associated with the neoplastic progression of human melanoma. The present study also reports that the suppression of SPARC expression by 2 human melanoma cell lines using a SPARC antisense expression vector, results in significant decrease in the in vitro adhesive and invasive capacity of tumor cells, completely abolishing their in vivo tumorigenicity. This is the first evidence that SPARC plays a key role in human melanoma development and progression.

Gerez, Esther Noemí. "Cáncer hepatocelular y porfirinas : Regulación del camino del Hemo durante el estadío de iniciación de la Carcinogénesis química" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El principal objetivo de esta tesis ha sido el estudio de los cambios bioquímicos, histológicos y moleculares, que ocurren en las etapas tempranas de la hepatocarcinogénesis inducida químicamente. Se trabajó con ratones CF1 machos que recibieron p-dimetilaminoazobenzeno (DAB 0,5% p/p) en la dieta durante un período total de 184 días. En estos animales se estudió el sistema metabolizante de drogas, la regulación metabólica del hemo, y el equilibrio entre la formación de radicales libres y los sistemas de defensa antioxidante. Se observó que a partir de los 35 días el higado sufre cambios significativos tanto a nivel molecular como morfológicos. La administración del carcinógeno produjo un gran aumento en el contenido del P450 con la consecuente inducción de la síntesis y disminución de la degradación del hemo. A su vez, se comprobó una desregulación en esta vía metabólica, por la falta de respuesta a agentes porfirinogénicos. La disminución de las actividades de las enzimas de defensa antioxidante aumentó el grado de estrés oxidativo provocado por la metabolización del carcinógeno. Los antioxidantes ensayados previnieron parcialmente las alteraciones bioquímicas detectadas. El modelo experimental mostró dos patrones de comportamiento bioquímico diferentes según el tiempo de intoxicación. Esto nos llevó a proponer un probable mecanismo para la gestación del proceso hepatocarcinogénico que considera la existencia de un estado primario activante del hígado en su totalidad, referido como estadio de preiniciación, caracterizado por un patrón de alteraciones bioquímicas necesarias para la instauración del estadio de iniciación de la hepatocarcinogénesis.

Abstract:
The aim of this thesis has been to study the biochemical, histological and molecular aspects of the changes occurring during the onset of the chemically induced hepatocarcinogenesis. Male CF1 mice were fed with a diet supplemented with p- dimethylaminoazobenzene (DAB, 0.5% w/w) during a whole period of 184 days. Then, the drugs metabolizing enzyme system, the regulation of heme metabolic pathway, and the balance between free radicals production and the antioxidant defense system were investigated. Significant hepatic changes at the molecular and the morphological level were detected from day 35 of intoxication onwards. The carcinogen administration greatly increased P450 content with the consequent enhancement of heme synthesis and diminution of heme degradation. The lack of response to some porphyrinogenic agents showed the deregulation of this metabolic pathway in the animals exposed to the carcinogen. The decrease in the activities of the antioxidant defense enzymes further increased the oxidative stress provoked by the carcinogen metabolization. The antioxidants assayed partially prevented the observed biochemical alteration. This experimental model showed two different biochemical patterns during the course of the intoxication. This led us to propose the hypothesis about a probable mechanism for the onset of hepatocarcinogenesis that considers a primary activating liver state involving the whole organ, the so-called pre-initiation stage, resulting in a biochemical aberration which then leads to the actual initiation stage.

Bais, Carlos E.. "El receptor acoplado a proteína G del herpes virus asociado al sarcoma de Kaposi (Kaposi’s Sarcoma associated herpevirus o KSHV) es una oncoproteína viral y un activador angiogénico" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Abstract:
The Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV-HHV-8)is a γ-2 herpesvirus that is implicated in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma and of primary effusion B-cell lymphomas (PELs), it encode putative oncogenes, and genes that may cause Kaposi's sarcoma lesions by stimulating angiogenesis. The G-protein-coupled receptor encoded by an open reading frame (ORF 74) of KSHV is expressed in Kaposi's Sarcoma lesions and in PELs, and stimulates signaling pathways linked to cell proliferation in a constitutive (agonist-independent) way. Here we show that signaling by this G-Protein Coupled Receptor leads to cell transformation an tumorigenicity, and induces a switch to an angiogenic phenotype mediated by vascular endothelial growth factor (VEGF), an angiogenesis and Kaposi's-spindle cell growth factor. We find that this receptor can activate ( in HEK293T) two protein kinases, JNK/SAPK and p38MAPK, by triggering signaling cascades like the ones induced by inflammatory cytokines that are angiogenic activators and mitogens for Kaposi's sarcoma-cells and B cells. Although this is a suggestive result, when we express KSHV-GPCR in different cell types it activate different signaling cascades, and induces different phenotypes. Using pathway specific dominant negatives and pharmacological inhibitors we show that, in the cell line NIH3T3, the activation of JNK and p38 play a major rol in the molecular mechanism of KSHV-GPCR induced cell transformation. Endothelial cells play a central rol in kaposi's sarcoma pathogenesis. KSHV infects endothelial cells and spindle-like cells, of suspected endothelial origin, wich are present in the kaposi's sarcoma lesions. Therefore, in the context of viral infection, KSHV-GPCR is expressed in endothelial cells. As the expression of KSHV-GPCR has different biological and biochemical effects in different cell types we decide to study the consecuences of KSHV-GPCR expression in human primary endothelial cells. KSHV-GPCR expression in endothelial cells induce strong morphologic changes, modifications in the citoskeleton structure, secretion of metaloproteases and resistence to serum starvation mediated by activation of the PI3K/AKT pathway's. All those changes are reminiscent of the transformed phenotype. Usually, the expression of transforming oncogenes in primary cells induces shortage of telomeres, premature senescence, and cell death. In sharp contrast the expression of KSHV-GPCR in primary endothelial human cells stabilize telomere length, by an alternative mechanism independent of telomerase activity (Alternative Lengthening of Telomeres or ALT ), and inmortalize endothelial cells. To our knowledge this is the first demostration that a protein encoded by KSHV is able to inmortailize primary human cells. Thus using a KSHV oncogenic protein we created a new inmortilized endothelial cell line that we call Ecs-KSGPCR. As predicted by the multistep carcinogenesis hypotesis, our preliminary experiments suggest that the mechanisms of Terminal Proliferation Arrest (TPA) are not completelly supressed by KSHV-GPCR and that additional oncogenic events are necessary in order to fully transform human primary endothelial cells. Further research will determine wether other KSHV's oncogenes can cooperate oncogenicaly with KSHV-GPCR. KDR/VEGFR-2 and Tie-2 are endothelial specific tyrosine kinase receptors that play key roles in vascular biology. These two receptors regulate cell survival and proliferation of endothelial cells during angiogenesis, as a consequence of this they appear to be minimally expressed in quiescent endothelium in vivo, and they are down regulated after a few passages, in vitro, of primary endothelial cells. Surprisingly KDR and Tie-2 are overexpressed in long term cultures of Ecs-KSGPCR. Altough in this work we show that the sustained expression of those receptors is functional, further experiments are required to determine if they play any rol in the inmortalization process. We conclude that KSHV-GPCR is a viral oncogene that can exploit cell signaling pathways to induce oncogenesis and angiogenesis in KSHV-mediated oncogenesis.

López Bergami, Pablo. "Estudio molecular y funcional de la patología cardíaca inducida por inmunización con proteínas ribosomales P de Trypanosoma cruzi" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estudio de la respuesta inmune contra las proteínas ribosomales P de Trypanosoma cruzi en el suero de pacientes chagásioos crónicos sugirió que esta respuesta inmune podria jugar un importante rolen el desarrollo de la cardiomiopatía chagásica. En función de esos resultados se encaró una tarea de clonado de las proteinas ribosomales P213 y P0 de T. cruzi en vectores procariontes con el objeto de expresar y purificar abundantes cantidades de proteínas recombinantes. Estas proteínas se utilizaron para desarrollar modelos de inmunización en ratones. En primer término se determinó la especificidad de la respuesta inducida mediante estos modelos. Luego se estudió la respuesta contra los principales epítopes de éstas proteínas localizados en el extremo C-terminal (péptido R13 en TcP2β y P015 en TcP0). Se determinó que la respuesta contra estos epitopes fue similar a la observada en sueros humanos. Paralelamente, se realizaron estudios tendientes a determinar alteraciones en la función cardíaca de los animales inmunizados. De esta forma, mediante la realización de electrocardiogramas, se estableció el desarrollo de alteraciones en la generación del impulso nervioso (arritmias), alteraciones en la conducción intraventricular y en la repolarización. La participación de los anticuerpos anti-P en la generación de alteraciones cardíacas también fue confirmada en ensayos realizados sobre corazones aislados de conejo.

Abstract:
The study of the immune response against ribosomal P proteins of Trypanosoma cruzi in chronic Chagas disease patient's sera suggested that this immune response might play an important role in the development of Chagasic Cardiomiopathy. The molecular cloning of the ribosomal P26 and P0 proteins allowed us to express and purify high amounts of recombinant proteins. These proteins were used to develop animal models of immunization. First, we assessed the specificity of the induced response and determining the induction of high levels of anti-P antibodies. Then, we determined that the response against the C-terminal epitopes of these proteins (peptide R13 in Tc2β Band peptide P015 in TcP0) was similar to those observed in human sera. Immunized animals showed a modified electrocardiographic pattern compared to that in control mice. The participation of anti-P antibodies in the induction of cardiac disturbances was also assessed in a whole rabbit heart isolated system.

De Lorenzo, Mariana S.. "Acción del antiestrógeno Nafoxidina y del inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1) en la angiogénesis tumoral" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La terapia antiangiogénica se basa en estrategias moleculares que intentan bloquear la neovascularización tumoral y así detener la progresión de la masa neoplásica. Las células endoteliales suelen responder al estímulo estrogénico. La angiogénesis implica la proliferación del endotelio junto a la remodelación de la matriz extracelular, donde participan, las metaloproteinasas (MMPs) y sus inhibidores (TIMPs). En el presente trabajo se investigaron los posibles mecanismos antiangiogénicos del potente antiestrógeno nafoxidina y el intrincado papel del TIMP-1 en la vascularización y progrésión tumoral. Se encontró que el tratamiento in vitro de células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) con dosis no citotóxicas de nafoxidina disminuye de manera dosis-dependiente la proliferación. Nafoxidina redujo también la adhesión, la capacidad de extensión sobre el sustrato y la migración de las células endoteliales, e indujo un aumento en la activación de la MMP-2 y en la secreción de TIMP-1. Además, inhibió significativamente la invasión y la formación de cordones endoteliales sobre Matrigel. La acción antiangiogénica de nafoxidina podría asociarse a acciones indirectas, mediadas a través del aumento del TIMP-1, como también a efectos directos del antiestrógeno sobre las células HUVEC. Los cotratamientos in vitro con nafoxidina y el éster de forbol PMA indicaron que la acción antiangiogénica podría estar relacionada con la inhibición de vías de señalización intracelular dependientes de la proteína quinasa C. El cotratamiento con el inhibidor de fosfodiesterasas IBMX y el derivado de CAMP dbcAMP sugirieron la participación de múltiples vías de señales en la acción antiangiogénica de nafoxidina. Otros ensayos in vitro con el inhibidor de fosfolipasa D n-butanol, el ionósforo A23187 y el bloqueante de canales de calcio verapamilo indicaron la importancia de estas vías de señales en la formación de capilares endoteliales. Finalmente, se exploraron in vivo los efectos de nafoxidina y TIMP-1, empleando un modelo singénico de carcinoma mamario en ratones BALB/c y un melanoma murino inoculado en hídridos C57BL/6j-CBA transgénicos que sobrexpresan TIMP-1 humano en hígado y lo vuelcan a la circulación. Los datos obtenidos en animales ratifican La complejidad de los mecanismos regulatorios que operan in vivo durante la vascularización tumoral y diseminación metastásica. Este trabajo aporta elementos útiles para el futuro diseño de ensayos clínicos con nuevos agentes antiangiogénicos para el tratamiento del cáncer.

Abstract:
Antiangiogenic therapies use molecular strategies to block tumor neovascularization and arrest neoplasic progression. Endothelial cells respond to estrogenic stimulation. Angiogenesis involves endothelial cell proliferatíon and extracellular matrix remodeling, in which take part metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMPs). In this present study it was investigated the potential antiangiogenic mechanisms of the antiestrogen nafoxidine and the intrincate role of TIMP-1 in vascularization and tumor progression. It was found that teatment in vitro with non citotoxic doses on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) decreased endothelial growth in a dose manner dependent. Nafoxidine reduced adhesion, spreading and migration of endothelial cells and induced an increment in MMP-2 activation and TIMP-1 secretion. Invasion and endothelial tube formation on Matrigel were inhibited. Antiangiogenic effect of nafoxidine could be associate with indirect actions, mediated by TIMP-1 increment, or also with direct effects of the antiestrogen on HUVEC. In vitro cotreatments with nafoxidine and phorbol ester PMA indicated that antiangiogenic action could be related with inhibition of PKC intracellular signalling pathways. Cotratments with phosphodiesterases inhibitor IBMX and cAMP derivative dbcAMP suggested the involvement of multiple signalling pathways. Other in vitro assays with phospholipase D inhibitor n-butanol, ionosphore A23l87 and L-type Ca2+ channels blocker veraparnil indicated that their pathways are important in endothelial tube formation. Finally, it was investigated the in vivo effects of nafoxidine and TIMP-1, using a murine mammary carcinoma in BALB/c mice and a murine melanoma inoculated in hybrid C57BL/6j-CBA transgenic mice that overexpress human TIMP-1 in liver and overturn it at circulation. The results in animals ratify the complexity of regulating mechanisms that act in vivo during tumor vascularization and metastatic dissemination. The present study supplies useful elements to future clinic trials designs with new antiangiogenic agents for cancer treatment.

De Brasi, Carlos Daniel. "Marcadores genéticos ligados al gen del factor VIII de coagulación : Su utilidad diagnóstica en hemofilia y en el estudio del mecanismo molecular de la recombinación homóloga en meiosis humanas" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La hemofiliaA (HA)es una enfermedad hemorrágica hereditaria, ligada al sexo, causada por deficiencia del factor VIIIde coagulación (FVIII). La ruta preferida para la provisión de datos para diagnóstico molecular es la detección directa de mutaciones. Entre las mutaciones que afectan al gen del FVIII, la inversión del intrón 22 (inv22) constituye la causa de casi la mitad de las HA severas (SHA). Mediante análisis de Southern blot fueron estudiadas 47 familias Argentinas con SHA. En cercano acuerdo a lo reportado series internacionales, 19 de ellas (40%) resultaron informativas para la Inv22 y pudo proveerse diagnóstico molecular por el método directo. Dentro de éstas, 14 (79%) resultaron Inv22 tipo distal y las restantes 5 (21%), proximal. No fueron encontradas significativas asociaciones entre la presencia o no de la Inv22 en SHA, y el origen de la enfermedad (esporádica o familiar), ni tampoco con la propensión o no a desarrollar anticuerpo inhibidor neutralizante contra el FVIII terapéutico. El camino alternativo para el diagnóstico es por vía indirecta usando polimorfismos ligados a la enfermedad. Entre los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) ubicados dentro del gen del FVIII, el marcador Xbal A del intrón 22 a pesar de proveer una alta informatividad en los distintos ganos étnicos analizados, fue casi excluido de la rutina diagnóstica por la lentitud y laboriosidad de su detección. Aquí se describen dos métodos rápidos, no-radioactivos, basados en PCR de larga distancia (LDPCR), para genotipificación del RFLP Xbal A. Los amplimeros de 6,6 y 6,9 kb incluyen el sitio polimórfico y un sitio constante de Xbal que provee control de digestión. La especificidad del método fue desafiada en experimentos a ciegas de muestras previamente genotipificadas por Southern blot, obteniéndose una perfecta correlación entre ambos métodos. Mediante este método, 53 cromosomas X de la población Argentina general fueron genotipificados para Xbal A, lo que permitió proyectar una informatividad de aproximadamente el 47%. Los estudios de asociaciones alélicas entre Xbal A (X) y el polimorfismo Bc/l (B) del intrón 18 del gen del FVIII, determinaron un alto, pero no-completo desequilibrio de ligamiento entre los marcadores, proyectando una informatividad combinada (X+B) del 55%. A 737 bp rio abajo del RFLP Xbal, fue localizado y caracterizado un nuevo polimorfismo bialélico, de cambio de nucleótido que afecta el sitio de reconocimiento de la enzima Mspl (CCg/aG). La genotipificación especifica del RFLP Mspl A se realiza utilizando la LD PCR específica para Xbal A como primera vuelta. seguida por una PCR anidada de 176 bp que incluye al sitio polimórfico y uno constante de Mspl para proveer control de digestión. Su análisis en las poblaciones nomiales Argentina y Británica permitió estimar una heterocigocidad de 49 y 46%, respectivamente. A pesar de su proximidad física y su desequilibrio de ligamiento, X y M proyectan una informatividad conjunta del 62% para población Argentina y 59% para la Británica. Ambos RFLPs (X y M) están incluídos en una región de 9,5 kb dentro del intrón 22 del gen del FVIII(int22h-1), que se encuentra repetida por lo menos 2 veces fuera del gen del FVIII, también sobre Xq28 (int22h-2 y -3). Para investigar los sitios correspondientes de X y M sobre los homólogos extragénicos fueron diseñados abordajes específicos similares a aquellos usados para los sitios intragénicos. Los sitios Mspl extragénicos (B y C) resultaron polimórficos en población Argentina y Británica aunque con frecuencias del alelo mucho menores a las intragénicas. La Inv22 es originada por un evento de entrecruzamiento recíproco intracromosómico por recombinación homóloga entre las secuencias int22h descriptas resultando en la interrupción inactivante del gen del FVIII en su intrón 22. Debido a (1) que los marcadores X y M ubicados dentro de int22h permiten mediante sus frecuencias alélicas diferenciar las copias intra de las extragénicas y (2) que en el cromosoma X de varones de la población normal podemos estimar el estado de estos marcadores antes del evento y en los hemofílicos con la Inv22 podemos analizar el estado de estos marcadores después del evento; se diseño una estrategia para recabar datos del mecanismo molecular que origina la Inv22 como modelo de entrecruzamiento recíproco en meiosis humanas. La aplicación del método planteando nueve hipótesis de posibles intermediarios moleculares de la Inv22 asociadas a la predicción de resultados numéricos utilizando las estimaciones sobre población de varones normales y su comparación con los datos obtenidos en el grupo de afectados con la Inv22, permitió determinar que el evento molecular de recombinación meiótica está acoplado a la conversión génica del marcador Xbal, con la secuencia extragénica como dadora de la información. El mismo análisis sobre Mspl si bien proyecta resultados similares, no permite determinado con significación estadística. El aumento de la población hemofílica para la obtención de resultados más precisos además de los estudios de mapeo de puntos calientes para rupturas meióticas de doble cadena dentro de las secuencias int22h permitirá la elucidación específica del mecanismo de la Inv22 como modelo de recombinación homóloga en meiosis humanas.

Abstract:
Haemophilia A (HA) is a sex linked inherited haemorragic disorder characterised by deficiency in the coagulation factor VIII (FVIII). Direct mutation detection in the gene is the best choice to obtain data for molecular diagnosis. Intron 22 FVIII gene inversion (Inv22) is involved in almost half of severe HA (SHA). It has been studied by Southern blot 47 Argentinean families with SHA and found inversions in 19 (40%), 15 (32%) with distal and 4 (8%) with proximal pattern. In this group of Inv22 informative families definitive information for molecular diagnosis could be provided. No significant correlation between the inheritance of the disease (either familiar or sporadic haemophilia) and the presence of inversions was found. The development of therapeutic-FVIII inhibitor in inv22-positive SHA-affected families was found increased but not significantly. The alternative route to obtain molecular information for genetic counselling is gene tracking using DNA polymorphisms. Among the restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) in the FVIII gene, the Xbal A (intron 22) (X) despite its high informativity in almost all ethnic groups analysed, has not been frequently used in the routine because its reliable detection is tedious and labour-intensive. Two rapid, non-radioactive, long distance PCR-based methods (LD PCR) to genotype the X RFLP are described. The amplimers of 6.6 and 6.9 kb long include both the polymorphic and a constant Xbal site, which provides a digestion control. The specificity of the method was challenged by a blind experiment with genomic DNA samples previously genotyped using Southern blot analysis: a perfect correlation was obtained using both approaches. Fifty-three alleles from the Argentinean normal population were Xbal A genotyped. The results predict an informativity of 47%. Despite the high degree of allelic associations found between X and Bc/l (intron 18) (B), they predicts a combined heterozygocity (X+B) of 55%. A new polymorphism in the human FVIII gene has been localised and characterised. It is a bi-allelic single nucleotide polymorphism which affects an Mspl site (CCg/aG)located 737 bp downstream frorn the Xbal marker. The specific genotyping of the so termed Mspl A RFLP (M) requires a nested PCR approach using the X-specific LD PCR as first round and a 176 bp-long second round which includes both the polymorphic and a constant control digestion Mspl site. M genotyping from the Argentinean and the British normal population estimate an informativityof 49 and 46%, respectively. Despite their close proximity, the X and M polymorphisms are not in complete linkage disequilibnum: haplotype analysis from Argentinean and British population predict a combined informativity (X+M)of 62 and 59%, respectively. The markers X and Mare located in intron 22 of the FVIII gene within a 9.5 kb int22h-1segment. Int22h is duplicated at least twice extragenically at Xq28. Both extragenic copies (int22h-2 and —3) are also polymorphic with respect to X. There have been designed LDPCR-based methods to specifically genotype these extragenic X and M sites. The extragenic sites of both X and M resulted also polymorphic in Argentinean and British normal populations but with much lower frequencies of the allele than those obtained frorn int22h-1. Inv22 originates by an intrachromosomic crossing over due to homologous recombination between int22h-1 and int22h-2 or —3. The molecular inversion interrupts the normal sequence of the intron 22 of the FVIII gene causing SHA. Due to (1) X and M enable the discrimination of the intra from the extragenic copies of int22h by means of differences in their allelic frequencies, and (2) that there can be estimated these frequencies before the event in males from the normal population and the frequencies after the event in the Inv22-SHA population; it was possible to design an genetic testing strategy to address the molecular mechanism of the Inv22 as a model for homologous recombination in human meiosis. The inspection of the literature prompts the design of 9 possible hypothesis of the intermediaries of the mechanism involved. Each hypothesis was associated with numerical values calculated from the parameters estimated in the normal populations, to predict the results to be obtained from the Inv22-affected population. This analysis allowed us to conclude that the molecular inversion is coupled to the gene conversion from a DNA segment including the Xbal extragenic site to its intragenic homologue. The results obtained using Mspl, although similar than those using Xbal, are not statistically significant. The increase in the number of the haemophilic population in order to gain precision in the test and the investigation of meiotic double-strand-breaks hot spots within int22h would allow further insights in the molecular mechanism of the Inv22 as a model for homologous recombination in human meiosis.

Berenstein, Mariana G.. "Diseño, caracterización, producción y utilización de vectores virales y plasmídicos para terapia génica del cáncer" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La transferencia in vivo del gen de la timidina kinasa del virus herpes-1 seguido por la administración de la prodroga ganciclovir (HSV-tk/GCV) y su posterior activación in situ, surgió como una estrategia de terapia génica eficaz para el tratamiento de tumores experimentales y humanos. Se había demostrado la existencia de un efecto “bystander” por el cuál las células no modificadas por el gen también eran eliminadas por GCV activado por el gen HSV-tk. Sin embargo, su validez fue cuestionada desde diferentes perpectivas, entre ellas el sistema de transferencia y el modelo tumoral utilizado. Dada la disparidad de resultados en diferentes modelos experimentales, construimos un vector retroviral conteniendo el gen de HSV-tk y obtuvimos células productoras de vectores retrovirales (VPC). Utilizando dichas células como fuente de tranferencia génica, estudiamos la eficiencia de transducción in vivo en células malignas sobre tres modelos tumorales distintos: melanoma murino B16, melanoma humano IIB-MEL-LES y glioblastoma de rata C6. En estudios in vitro pudimos observar un efecto bystander sólo en células C6. Los estudios in vivo mostraron una inhibición del crecimiento tumoral en los dos modelos de melanoma cuando las células eran co-inoculadas con VPC productoras de vectores retrovirales portando el gen HSV-tk (VPC-tk) y tratadas con GCV. Sin embargo, el 100% de los animales fue capaz de desarrollar tumores en ambos modelos . Bajo las mismas condiciones experimentales, 70% de las ratas fueron capaces de rechazar células de glioma C6 transferidas de modo intracraneal por técnicas estereótaxicas y el 50% de los animales mostró un aumento significativoen el tiempo de sobrevida. El tratamiento de tumores C6 establecidos con VPC-tk y GCV, llevó a la cura del 33% de los animales. Las ratas que rechazaron el tumor primario fueron capaces de desarrollar una respuesta inmune de memoria que lleva al rechazo de desafíos contralaterales con células parentales. A los efectos de aumentar el efecto terapéutico estudiamos el efecto antitumoral de la tranferencia del gen de interleuquina-12 solo o en combinación con el gen HSV-tk y tratamiento con GCV, sobre tumores de cerebro intracraneales y los mecanismos involucrados en el rechazo tumoral. Luego de la transferencia i.c.de células productoras VPC-IL12, se lograba suprimir el crecimiento de tumores C6, aún en tumores establecidos de 10 días. La combinación con células VPC-tk y GCV tuvo mejor efecto terapéutico que los dos tratamientos por separado sobre tumores incipientes. Los estudios de los mecanismos asociados a la respuesta antitumoral demostraron la participación de eventos inmunológicos y no inmunológicos. Secciones histológicas de cerebros con expresión local de IL-12 mostraron una activación inmediata de macrófagos/microglia y su reclutamiento a áreas intratumorales. La expresión de IL-12 también fue capaz de estimular un reclutamiento de PMN e inducir necrosis de vasos tumorales, mientras los vasos del parénquima normal no se vieron afectados. Por otro lado, el tratamiento con HSV-tk/GCV mostró un infiltrado mayoritario de células CD5+. Además, únicamente la combinación de IL-12 y HSV-tk/GCV fue capaz de reclutar células CD4+ y CD8+ cuando el tratamiento era aplicado a tumores de gran tamaño. Los animales sobrevivientes desarrollaron una inflamación crónica en el sitio de inyección primario compuesto de macrófagos y linfocitos en distintas proporciones según el tipo de terapia inicial aplicado. Este infiltrado crónico no fue perjudicial para el cerebro ya que no se observaron evidencias de desmielinización ni tampoco daños neurológicos asociados. Por lo tanto este estudio provee las bases para comprender los mecanismos involucrados en la respuesta antitumoral inducida por IL-12, sola o en combinación con el sistema del gen suicida y apoya el uso de la terapia combinada para el tratamiento de tumores de cerebro. Un clon de VPC terapéutico portando el gen de HSV-tk fue también seleccionado para su utilización en protocolos clínicos. Este clon mostró una mayor eficacia antitumoral que la preparación original. Finalmente, se construyeron y caracterizaron nuevos vectores para su uso en terapia génica, basados en sistemas regulables e inducibles por condiciones exógenas (tetraciclina) y endógenas del tumor (hipoxia tumoral).

Abstract:
In vivo transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene followed by ganciclovir administration (HSV-tk/GCV) and in situ activation of the prodrug, has evolved as an effective approach to the treatment of tumors of experimental and human origin. In vitro studies were able to demonstrate the development of a“bystander effect" that led to the death of cells that do not express the gene, in the presence of GCV activated by HSV-tk modified cells. However, several studies have questioned the validity of this approach, mainly in terms of the gene transfer system being used and the experimental model to which they applied. Considering the different results that were reported on different experimental tumor models, we made a retroviral vector containing the HSV-tk gene and retroviral vector producer cells (VPC) were obtained. By using these (VPC) as a source for in vivo gene transfer we evaluated the efficacy of in vivo transduction of malignant cells using three different tumor cell models: 816 murine and IIB-MEL-LES human melanomas, and C6 rat glioblastoma. In vitro studies have shown a bystander effect only in C6 cells. In vivo studies showed an inhibition of tumor growth in the two melanoma models when tumor cells were co-injected with VPC producing retroviral vectors carrying the HSV-tk gene (VPC-tk), followed by GCV treatment, but 100% of mice developed tumors in both models. Under similar experimental conditions, 70% of syngeneic rats completely rejected stereotactically transferred C6 tumor cells and 50% of them showed a prolonged_survival. Treatment of established C6 tumors with VPC-tk and GCV led to cure of 33% of the animals. Rats which rejected tumor growth developed an anti-tumor immune memory leading to rejection of a stereotactic contralateral challenge with parental cells. In order to increase the therapeutic efficacy of the system we studied the antitumoral response after interleukin-12 (IL-12) gene transfer alone or in combination with the herpes virus thymidine kinase gene/gancyclovir (HSVtk/GCV), on i.c. implanted brain tumors and the underlying mechanisms mediating tumor rejection. Following i.c. transplantation of retroviral vector producer cells (VPC) VPC-IL12 were able to suppress rat C6 glioma tumor growth even when rats carried 10 days-old tumors. Its combination with VPC-tk had better therapeutic effect than each single treatment on incipient tumors. The study of the mechanisms involved in the antitumoral response, clearly showed that it was mediated by immune and no immune mechanisms. IL-12 expression was characterized by the immediate activation of microglia/macrophage and their recruitment to the intratumoral area. IL-12 expression also stimulated PMN recruitment and induced tumor vessel necrosis, while normal brain vessels remained intact. Conversely, CD5+ lymphocytes were the main immune cell type recruited by HSV-tk/GCV. In addition, only the combination of IL-12 and HSV-tk/GCV was able to recruit CD4+ and CD8+ when large tumors were treated. Surviving rats developed a chronic inflammation at the site of injection composed of macrophages and lymphocytes which was not harmful to the brain since no demielynization or neurological signs were observed. The present study provides a basis to understand the mechanisms underlying the antitumor response induced by IL-12 alone and in combination with HSV-tk/GCV and supports their use in combination therapy of brain tumors We also selected a therapeutic clone of VPC carrying the HSV-tk gene for its clinical application. This clone showed a higher antitumor efficacy than the original cell preparation. Finally, new gene therapy vectors, based on systems regulated by exogenous (tetracycline) and endogenous (tumor hypoxia) conditions, were developed and further characterized

González Guerrico, Anatilde María. "Expresión de genes asociados a fibrosis quística" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Fibrosis Quística es la más frecuente de las enfermedades humanas severas, de origen genético, en la población caucásica (Welsh MJ, 1995). Se produce por mutaciones en un único gen, que codifica para el canal de Cl- CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). Aún no ha sido establecida una relación clara entre el defecto genético y los mecanismos que gobiernan esta enfermedad. Todas las citoquinas proinflamatorias que han sido estudiadas en el ambiente inflamatorio de los pulmones FQ están elevadas y la concentración de la citoquina antinflamatoria interleuquina-10 (IL-10) está considerablemente reducida (Khan et al., 1995). A su vez, la IL-1β regula la expresión del CFTR (Cafferata E G A, 2001; Cafferata et al., 2000). Por otro lado, las proteínas proinflamatorias TNF-α, IL-1β y IL-6 regulan positivamente los genes de las mucinas muc2 y muc5 (Dohrman et al., 1998) e incrementan la quimioatracción de neutrófilos (Ohishi, 2000) que liberan gran cantidad de proteínas, especies reactivas de oxígeno y NO, que pueden causar daño celular. Entonces, es posible que genes diferencialmente regulados por IL-1β tengan una participación en los mecanismos que llevan a la muerte celular, la exacerbación de los procesos inflamatorios o la acumulación de mucinas en el tracto respiratorio FQ. Con el fin de identificar nuevos intermediarios en la vía de señalización de IL-1β, o de identificar genes que tuviesen una regulación similar al CFTR, se realizó un "Differential Display" sobre las células T84 tratadas con distintas concentraciones de IL-1β. Se aisló un gen regulado por dicha citoquina, que poseía el mismo patrón de modulación que el CFTR. La banda aislada fue clonada y secuenciada. La misma mostró una homología del 99% con otras del banco de datos que codificaban para proteínas cuya actividad es desconocida. A este gen diferencial se lo denominó hsccl (Homo sapiens T84 colon carcinoma cell line IL-1beta regulated mRNA 1). Por el análisis de la secuencia completa del ARNm se determinó que hscc1 contiene dominios que se hallan conservados en la familia de las proteínas transportadoras. Mediante "Northern blots" se observó una doble banda correspondiente a 3,5 kb, que mostraba un máximo de activación cuando las células fueron tratadas con 0,5 ng/ ml de IL-1β. Por otro lado, la expresión de hscc1 se inhibió a concentraciones de IL-1β mayores a 1 ng/ml. La IL-1β induce al factor de transcripción NF-κB cuando se encuentra presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,5 ng/ml (Cafferata E G A, 2001), mientras que con 2,5 ng/ml de IL-1β se inducen los factores c-jun y c-fos, pero no NF-κB. Usando un virus que sobre-expresa a un dominante negativo de NF-κB, se determinó que la inducción de este factor es necesaria para que se produzca el aumento en la expresión de hscc1 por IL-1β, en forma similar a lo que ocurre con CFTR. Por otro lado, el inhibidor de proteína quinasa C, GF109203X (Battle et al., 1998) y los inhibidores de proteína quinasas de tirosina Genisteína (Rao et al., 1997) y Herbimicina A (Taylor et al., 1997), bloquearon la inducción mediada por IL-1β, sugiriendo que estas proteína quinasas estan también involucradas en el camino de transducción de la señal de IL-1β. Otro objetivo de este trabajo fue identificar genes cuya expresión fuese dependiente de la actividad del CFTR, con el fin de determinar cuales eran las funciones celulares dependientes del canal CFTR y de identificar factores que contribuyesen a la deficiencia pulmonar en fibrosis quística. Realizamos un "Differencial Display" usando células de epitelio de traquea fibroquística (CFDE) y las mismas células transfectadas con el CFTR normal (CFDE/6RepCFTR). Aislamos e identificamos un ARNm de expresión diferencial que codifica para la quinasa de tirosina c-Src. Este mensajero se encontró sobre-expresado en las células CFDE. Cuando las células CFDE/6RepCFTR fueron tratadas con el inhibidor del canal CFTR NPPB, los niveles del ARNm c-Src se elevaron. Es decir, la actividad del canal CFTR sería necesaria para la regulación de c-src. Asimismo, los análisis de la proteína c-Src por inmunohistoquímica mostraron que ésta se encuentra elevada en los pulmones FQ. La fibrosis quística se caracteriza por la acumulación de mucus que obstruye los conductos de distintos órganos (Hutchison and Govan, 1999). A su vez, este aumento en la producción de mucinas puede hacer a los enfermos más susceptibles de sufrir infecciones pulmonares por Pseudomonas aeruginosa (Parmley and Gendler, 1998). Se sabe que MUC1 se encuentra elevada en el colon de los ratones FQ, pero los ratones FQ que no producen MUC1 (ratones "knock out" para MUC1) tienen una obstrucción intestinal mucho menor. Además, a c-Src se la ha involucrado en la producción de mucinas en respuesta a diversas injurias (Bausbaum et al., 1999). Era posible entonces que el aumento de c-Src inducido por la falla en CFTR fuese responsable de la acumulación de mucus. Para corroborar esta hipótesis, se midió la expresión de la MUC1. Esta fue encontrada elevada en células CFDE respecto de las células CFDE/6RepCFTR. Además, cuando las células CFDE fueron tratadas con un dominante negativo o con un inhibidor de c-Src (PP2) los niveles de MUC1 disminuyeron. Estos resultados indican que c-Src estaría involucrada en el camino de señalización que lleva el aumento de MUC1. Estos datos sugieren, además, que la falla en el CFTR produciría un incremento en la expresión de MUC1 en el sistema respiratorio y que esto ocurre previamente a la infección pulmonar. En consecuencia, la quinasa c-Src podría ser el nexo entre la falla del CFTR y la acumulación de mucinas en fibrosis quística.

Abstract:
Cystic Fibrosis (CF) is the most important severe genetic in Caucasian population (Welsh MJ, 1995). It is caused by mutations in a single gene that codifies for the chloride channel named cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). A clear relationship between the genetic defect and the mechanisms governing the disease has not been fully established. In the inflammatory medium of CF lung every pro-inflammatory cytokines tested were elevated and the concentration of anti-inflammatory cytokine interleukin-10 (IL-10) was considerably decreased. In addition, IL-1β regulates CFTR expression. In this work, a differential display from T84 cells treated with different concentrations of IL-1β was performed, in order to identify new second messengers of IL-1β signaling pathway or other genes that have a regulation similar to cftr. The proinflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 up-regulate muc2 and muc5 gene expression (Dohrman et al., 1998) and increase neutrophils chemioattraction (Ohishi, 2000), which produce proteins, NO, and oxygen reactive molecules that can cause cellular injure; then, IL-1β differential expressed genes may be involved in processes that produce cell died, inflammation exacerbation or mucus accumulation in the CF airway. One of the differential display isolated fragments was cloned and sequenced. The sequence showed 99% homology with other sequences present in the data bank. They codify for proteins with unknown activity. This differential expressed gene was called hscc1 (Homo sapiens T84 colon carcinoma cell line IL-1beta regulated mRNA 1). The complete hscc1 mRNA sequence analysis predicted that HSCC1 sheared some conserved domains with transport proteins. Northern blots assays, using 32P labeled hscc1 as a probe, a double band of 3,7 kbp was observed. Maximum mRNA levels were obtained after treating the cells with 0.5 ng/ml of IL-1β. Hscc1 expression was inhibited with 1 ng/ml or higher concentrations of IL-1β. On the other hand, IL-1β at 0.5 ng/ml induced the transcription factor NF-ĸB (Cafferata E G A, 2001) but 2.5 ng/ml of this cytokine induced c-jun and c-fos but not NF-ĸB. In this work it was determinated that NF-ĸB is essential for the IL-1β induction of hscc1 by using a NF-ĸB dominant negative expressing virus. The pre-treatment with PKC inhibitor GF109203X (Batlle et al., 1997) blocked the IL-1β induction of hscc1, suggesting that these protein-kinases are involved in the IL-1 signal transduction pathway. In order to better understand which cellular functions depend on CFTR channel activity and which factors contribute to the pulmonary defects in cystic fibrosis, we search for possible genes having a CFTR-dependent expression. We performed a differential display assay using human CF tracheal epithelial cells (CFDE) and the same cells transfected with normal CFTR (CFDE/6RepCFTR). We have isolated and identified the tyrosine kinase c-Src as a differential gene, which was up-regulated in CFDE cells. When CFDE/6RepCFTR cells were treated with the CFTR channel inhibitor, NPPB, the levels of the c-Src mRNA raised, suggesting that the chloride channel activity should be involved in CFTR-dependent regulation of c-Src expression. In addition, immuno-histochemical analysis showed and increased c-Src in the CF lung. The most important problem in cystic fibrosis results from obstruction of ducts in several organs due to excessive mucus secretion (Hutchison and Govan, 1999). The overexpression of mucins in turn might lead to susceptibility to Pseudomonas aeruginosa infection in cases of CF (Basbaum et al., 1999). The expression of the mucin MUC1 is elevated in the colon of CF mouse, and CF mouse lacking MUC1 exhibits greatly diminished intestinal mucus obstruction (Parmley and Gendler, 1998). In addition, c-Src has been involved in mucin production in response to diverse insults (Basbaum et al., 1999). Therefore, we studied the possible role of c-Src in mucus accumulation due to the CFTR failure. We found taht MUC1 was elevated in the tracheal CFDE cells compared with CFDE/6RepCFTR cells. When CFDE cells were treated with a c-Src dominant negative plasmid or the c-Src inhibitor PP2, the MUC1 levels diminished, suggesting that c-Src might be involved in the signalling pathway that drives the elevation of MUC1 in CF. These data suggest that the CFTR failure produce an elevated MUC1 expression in the airway and this occurs previously to lung infection. Therefore, the tyrosine kinase c-Src seems to constitute a bridge between MUC1 over-expression and the CFTR channel failure.

Tekiel, Valeria. "Autoinmunidad en la infección experimental por Trypanosoma cruzi" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En Argentina, el 10% de la población crónicamente infectada con Trypanosoma cruzi presenta patología en sistema nervioso periférico (SNP). En la presente Tesis se estudió la participación de mecanismos inmunes en la inducción de patología a nivel de lo que denominamos genéricamente SNP, representado por el arco médula espinal-nervio ciático-músculo isquiotibial. Empleamos como modelo, ratones C3H/HeN infectados con las cepas RA o CA-I de T. cruzi que evidencian signos de daño principalmente en nervio ciático y médula espinal o en músculo esquelético, respectivamente. Además, linfocitos T (LT) de estos animales son capaces de injuriar de manera selectiva los órganos antes mencionados por transferencia pasiva en ausencia de parásitos. Hemos definido esos tejidos como blanco de daño para cada una de las cepas de T. cruzi. La respuesta inmune humoral, evaluada por IFI sobre cortes de tejido normal, no mostró diferencias cepa-dependientes; los patrones de marcación evidenciaron depósitos de IgG en intersticio de músculo y en vainas de mielina en nervio. Los sueros con reactividad positiva hacia antígenos conformacionales de nervio fueron definidos como Ne+. La inyección epineural de sueros Ne+ altera la conducción del nervio ciático de manera cepadependiente. Así, sueros de ratones infectados con la cepa RA/Ne+ inducen aumento del tiempo de latencia y disminución en la amplitud del potencial de acción nervioso (PAN) en los animales receptores, 4 días post- inyección (dpy). Por el contrario, sueros de animales infectados con la cepa CA-I no afectan ningún parámetro del PAN. La inyección de IgG purificada de sueros RA/Ne+ también disminuye la amplitud del PAN, indicando la presencia de un menor número de axones funcionantes. En coincidencia se observan depósitos de IgG marcando fibras axonales y/o vainas de mielina e infiltrados inflamatorios leves en los nervios inyectados con suero RA/Ne+ pero no en los inyectados con suero CA-I/ Ne+, a los 4 dpy. No se detecta presencia de parásitos en los nervios de animales receptores de sueros (PCR). Las alteraciones del PAN luego de la inyección de suero RA/Ne+ son similares a las detectadas en animales crónicamente infectados y en ratones inyectados con tripomastigotes en el epineuro l7 dpy. En conjunto, estos resultados indican la participación directa de autoanticuerpos en las alteraciones electrofisiológicas observadas en sistema nervioso periférico en la enfermedad de Chagas. En relación con la participación de LT en esta patología, se estudió el repertorio de las cadenas variables β del receptor de células T (TCRVβ) en distintos tejidos de animales crónicamente infectados con ambas cepas de T. cruzi. En bazo, se observa la sobreexpresión del segmento TCRVβ l3 y sub-expresión del segmento TCRVβ l4, lo cual podría ser marcador de infección. En SNP, se detecta un alto número de cadenas expresadas en los tejidos blanco de daño, que refleja la presencia de un importante infiltrado inflamatorio. Significativamente, se observa el uso relativo aumentado del segmento TCRVβ9 en los tejidos blanco de daño para cada cepa: nervio y médula en los animales infectados con RA y músculo en los infectados con CA-I. Esto demuestra la existencia de un patrón de expresión diferencial de segmentos en el sitio de lesión con respecto a la expresión periférica. El clonado, secuenciación y análisis del polimorfismo de secuencia de la región CDR3 de los segmentos TCRVβ9 sobre-expresados demostró una alta proporción de clones idénticos en animales infectados con RA (médula y nervio), que podría estar indicando la presencia de LT autorreactivos en el sitio de lesión. Además, la elevada producción de citoquinas pro-inflamatorias en los tejidos blanco de daño sugiere que la respuesta inmune local tiene un papel relevante en el proceso inflamatorio. Por otro lado, en los órganos que no son blanco principal de daño para cada una de las cepas de T. cruzi, donde no se encontraba sobre-expresión del segmento TCRVβ9, se observó dominancia clonal en la secuencias de la región CDR3. Este hecho, conjuntamente con la imposibilidad de reproducir daño por transferencia pasiva de células, el hallazgo de material parasitario y la baja producción de IL-6 y TNFα, sugiere que los clones mayoritarios detectados en los tejidos que no son blanco principal de daño están dirigidos hacia antígenos parasitarios contribuyendo al control local de la infección.

Abstract:
In Argentina, l0% of the chronically Trypanosoma cruzi-infected population develops peripheral nervous sytem (PNS) pathology. Herein we studied the participation of immune mechanisms in the pathology of the PNS (spinal cord-sciatic nerve- hamstring muscle axis). Using the C3H/HeN mouse strain and two T. cruzi subpopulations (RA and CA-I) it is possible to induce pathology mainly in skeletal muscle (CA-I) or in sciatic nerve and spinal cord (RA). T cells are able to injure the organs above mentioned in absence of parasites in a strain-dependent way. Therefore, we have defined these organs as target of pathology for each T. cruzi strain. The humoral immune response, evaluated by IFAT, against comformational muscle and nerve antigens was simmilar for RA and CA-I antisera; deposits of IgG were observed at the interstitial matrix in skeletal muscle and in the myelin sheats in sciatic nerve. Sera with positive reactivity against sciatic nerve were defined as Ne+. The epineural injection of sera from infected mice in syngeniec recipients altered the sciatic nerve conduction. This effect was parasite-strain dependent since just recipients of sera obtained from mice infected with the RA strain showed electrophysiological alterations. Moreover, among the sera from RA-infected mice, only those RA/Ne+ were able to induce prolonged latencies and diminished amplitudes of the sciatic nerve action potential (SNAP). On the contrary, sera fron CA-I-infected mice did not alter any SNAP parameter. The abnormalities observed in the amplitude of SNAP seemed to be mediated by IgG since purified antibodies from RA/Ne+ injected epineurally provoke the same effect than the whole sera, demonstrating the expression of a lower number of functional axons. In accordance with these results, IgG deposits labeling the axonal course and/or mielyn sheats as well as mild inflamatory infiltrates were found in the nerves injected with RA/Ne+ sera but not in those injected with CA-I/Ne+ sera 4 days post-injection (dpi). No parasite DNA was detected in the nerves. SNAP alterations in serum recipients are simmilar to those observed in chronically-infected animals or in mice injected in the epineurum with trypomastigotes, l7 dpi. Results presented here indicate the direct participation of autoantibodies in the pathology observed in PNS in chronic Chagas’ disease. To analyze the participation of TL in pathology in our model, we have studied the T cell receptor Vβ (TCRVβ) repertoire in different tissues of chronically-infected mice. Overexpression of TCRVβ 13 and underexpression of TCRVβ l4 segments were observed in spleen of infected mice, suggesting that these peripheral TCRVβ usages can be markers of infection. In PNS tissues, it was deteceted a high number of segments expressed in the target organ of damage, reflecting the strong inflammatory infiltrate. There was an over representation of TCRVβ 9 segment in sciatic nerve and spinal cord in RA- and in skeletal muscle in CA-I-infected mice, showing a differential expression pattern between the target organ of disease and the peripheral repertoire. The sequence polymorphism analysis of the CDR3 region of over-expressed TCRVβ9 segments showed a high proportion of identical clones in sciatic nerve and spinal cord in RA-infected mice, that could denote the presence of autoreactive TL. Moreover, the elevated production of pro-inflammatory cytokines in situ suggests that the local immune response is contributing to the severe pathology observed in those organs. On the other hand, clonal dominance was observed in TCRVβ9 segments not-over-expressed in the tissues that are not the main target of damage for each T. cruzi strain. This fact, together with the fail to induce damage by passive cell transfer in these tissues, the presence of parasite in situ and the low production of TNFα and IL-6, suggest that the the main clones are directed to parasite antigens and contribute locally to the control of the infection.

Kreimann, Erica Lorena. "Estudios de terapia por captura neutrónica en boro (BNCT) en un modelo experimental de cáncer oral" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Terapia por Captura Neutrónica en Boro (BNCT) es una modalidad terapéutica binaria que involucra la acumulación selectiva de portadores de ¹°Ben el tumor y la subsiguiente irradiación con un haz de neutrones. Las particulas de alta transferencia lineal de energia que se producen durante la reacción de captura de un neutrón térmico por el núcleo de boro tienen un rango de aproximadamente 5-9 μm y una alta eficacia biológica relativa. Así, el BNCT dañaría selectivamente las células tumorales. Esta terapia se encuentra en etapa de ensayo clínico en el mundo para tumores de cerebro y melanoma. Dentro del marco de la búsqueda de nuevas aplicaciones para BNCT, el estudio de la biologia y radiobiología del BNCT, la búsqueda de nuevos compuestos borados y la evaluación de la respuesta del tejido tumoral, precanceroso y normal hemos propuesto el modelo de cáncer oral en la bolsa de la mejilla del hamster para estudios de BNCT. Los estudios de biodistribución y farmacocinética en este modelo de un compuesto borado tradicional y uno de última generación demostraron la incorporación selectiva de boro al tumor en cantidades potencialmente terapéuticas. Un estudio de BNCT in vivo demostró por primera vez el éxito de esta terapia en el tratamiento del cáncer oral sin daño al tejido normal.

Abstract:
Boron Neutron Capture Therapy (BNCT) is a binary treatment modality that involves the selective accumulation of ¹°B carriers followed by irradiation with a neutron beam. The high linear energy transfer particles emitted during the capture of a thermal neutron by a ¹°B nucleus have a range of approximately 5-9 μm in tissue and are known to have a high relative biological effectiveness. Thus, BNCT would potentially target neoplastic tissue selectively. Clinical trials of BNCT for the treatment of brain tumors and melanoma are underway in the world. Within the context of the search for new applications of BNCT, the study of the biology and radiobiology of BNCT, the assessment of new boron compounds and the evaluation of the response of tumor, precancerous and dose-limiting normal tissues we have proposed the hamster cheek pouch oral cancer model for BNCT studies. The biodistribution and pharmacokinetic studies of a traditional and a new boron compound in this model evidenced potentially therapeutic, selective, incorporation of boron to tumor tissue. An in vivo study demonstrated, for the first time, the success of BNCT in the treatment of oral cancer with virtually no damage to normal tissue.

Fernández, Gabriela C.. "Participación de la respuesta inflamatoria en el desarrollo del Síndrome Urémico hemolítico" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La forma típica del síndrome urémico hemolítico (D+SUH) es una microangiopatía trombótica caracterizada por anemia hemolítica con fragmentación de eritrocitos, trombocitopenia con agotamiento de la función plaquetaria y daño renal agudo. Esta enfermedad es la principal causa de daño renal en la población pediátrica y nuestro país presenta la mayor incidencia del mundo. Si bien la mortalidad es baja debido a las terapias de soporte empleadas en el tratamiento de los síntomas, existe una alta proporción de niños (hasta un 50%) que puede presentar secuelas renales y neurológicas. El D+SUH se desarrolla luego de la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas con bacterias productoras de una exotoxina denominada toxina Shiga (Stx). La bacteria coloniza el intestino, y comienza a producir la toxina que pasa a la circulación y se une a un receptor (Gb3) en los tejidos blanco (principalmente el riñón), donde se internaliza e inhibe la síntesis de proteínas. Si bien la Stx es absolutamente necesaria para el desarrollo de la enfermedad, existen evidencias que demuestran que el sistema inflamatorio puede influenciar el curso del D+SUH. El objetivo de esta tesis fue determinar la importancia de distintos componentes centrales de la respuesta inflamatoria como los neutrófilos (PMNs), las plaquetas y el óxido nítrico (NO) en la fisiopatología del SUH en un modelo murino por inyección endovenosa de la variante tipo 2 de la Stx (Stx2) pura. Asimismo, se investigó el estado de activación y funcionalidad de los PMNs periféricos de pacientes cursando el período agudo del D+SUH y luego de la recuperación clínica. Los resultados mostraron una disminución en la muerte y daño renal de los animales inyectados con Stx2 en ausencia de PMNs. Sin embargo, la depleción de plaquetas no tuvo ninguna influencia en estos aspectos. En los animales inyectados con Stx2 se observó una marcada neutrofilia, la cual correlacionó con el daño renal. Estos PMNs periféricos poseían mayor capacidad citotóxica, adhesión a la vasculatura y expresión del marcador de activación CD1lb. Estos datos evidencian una activación de los PMNs luego de la inyección de la Stx2 y demuestran la importancia de este tipo celular en el desarrollo del SUH como un factor de exacerbación del daño. Por otra parte, también se demostró una activación plaquetaria termprana en respuesta a la Stx2, con una inhibición posterior por agotamiento, similar a la observada en los pacientes. La inhibición de la producción de NO provocó un aumento del daño renal y la mortalidad inducidos por la Stx2. Estos fenómenos fueron mediados, al menos en parte, por una mayor activación plaquetaria en ausencia de NO. Los estudios histológicos apoyaron estos hallazgos y evidenciaron, por primera vez, la formación de coágulos intraglomerulares en los animales tratados con Stx2. Estos resultados sugieren un papel protector del NO en la fisiopatologia del SUH, mediado por su acción antitrombótica e inhibitoria de la activación plaquetaria. El estudio de los PMNs de los pacientes con D+SUH reveló una disminución en los marcadores de activación FcyRIII (CD16) y CD1lb, y en el marcador de degranulación mieloperoxidasa (MPO) y una menor respuesta citotóxica dependiente de anticuerpos y de degranulación con respecto a una población de niños sanos. Los PMNs de los pacientes presentaron una disminución del FcyRIII, la MPO y las respuestas citotóxicas con respecto a una población de niños con neutrofilia no relacionada con el D+SUH, aunque la capacidad de respuesta de degranulación entre ambas poblaciones fue muy similar. El fenotipo y funcionalidad de los PMNs de los pacientes en el momento en que acuden al hospital indica que este tipo celular se encuentra parcialmente agotado, debido a un fenómeno de activación previo. Probablemente, los efectos de la toxina sobre los PMNs sean indirectos y mediados a través de la activación y daño endotelial, ya que en nuestras condiciones y por distintas metodologías, la Stx fue incapaz de unirse y/o de causar ningún efecto en PMNs provenientes de individuos adultos normales. En conclusión, en este trabajo pudimos demostrar el papel central y modulador de distintos componentes de la respuesta inflamatoria en la fisiopatología del SUH.

Helguero, Luisa Alejandra. "Expresión y funcionalidad del receptor de progesterona (RP) en la modulación del crecimiento hormono-dependiente y en la adquisición de resistencia al tratamiento hormonal de un modelo murino de carcinogénesis mamaria" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de mama es la segunda causa de muerte en las mujeres, luego del cáncer de pulmón. En el desarrollo de esta enfermedad se postulan distintas etapas biológicas que van progresando desde un crecimiento hormono-dependiente a uno hormono-independiente, lo que está asociado a un aumento de la agresividad. En la clínica, si el tumor expresa receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP), una parte importante de los enfoques terapéuticos de elección, es la hormonoterapia con el antiestrógeno tamoxifeno. Sin bien en un principio la gran mayoría de los pacientes responden, con frecuencia el tumor evoluciona hacia la resistencia al tratamiento hormonal, lo que se asocia a diseminación generalizada. Esta resistencia, cuyos mecanismos aun se desconocen, no implica en general una pérdida de expresión de receptores hormonales y todo parece indicar que, o bien existe un cambio intrínseco en éstos, o en los mecanismos que regulan su expresión y activación. En nuestro laboratorio desarrollamos un modelo de adenocarcinomas mamarios murinos por la administración prolongada de MPA en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Estos tumores son en su mayoría de origen ductal con capacidad invasora. En un principio poseen un comportamiento progestágeno-dependiente (PD), requiriendo de la hormona trófica para su crecimiento y expresan RE y RP, pero con el tiempo pueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, en el cual se conserva aún la expresión de receptores. Previamente hemos demostrado que el RP estaria involucrado en la adquisición de hormonodependencia. El objetivo de este trabajo fue estudiar el papel del RP en la transición de hormono-dependencia a independencia y en la adquisición de resistencia hormonal. Para este estudio utilizamos seis tumores PD y nueve progestágeno-independientes. Caracterizamos la respuesta in vivo de los tumores independientes al tratamiento con los antiprogestágenos onapristona y mifepristona y al 17-β-estradiol. Seis tumores respondieron regresionando, y los llamarnos progestágeno-independientes respondedores (PI-NR) y tres no respondieron; a éstos los denominamos progestágeno-independientes no respondedores (PI-NR). En nuestro laboratorio ya se había evaluado la respuesta in vivo de los tumores PD, y respondieron a estrógenos y antiprogestágenos con regresión. Cuando, en cultivos primarios de un tumor PD, estudiamos la respuesta proliferativa a MPA in vitro observamos que la misma fue bifásica, con dos pendientes estimulatorias, una a concentraciones muy bajas (EC50 = 1.5 ± 0.7 fM) y la otra a concentraciones más altas (EC50 = 0.33 ± 0.3 nM). Con estos resultados, evaluamos por unión del ligando la expresión de receptores en todos los tumores y en tejidos normales. En útero normal, y en tumores PD y PI-R, descubrimos dos sitios receptores de progesterona, uno de alta afinidad no descrito previamente en el RP (Kd = 43 ± 9 pM, Q = 9 ± 2 fmoles/mg de proteína) y el otro sitio clásico que habíamos hallado previamente (Kd= 9.2 ± 4 nM). En los tumores PI-NR no se pudieron determinar estos parámetros. El estudio de la distribución subcelular de RP mostró que en los tumores PD y PI-R se localizan principalmente en el citosol, y son regulados por MPA, mientras que en los tumores PI-NR están principalmente en el núcleo y no son regulados. Sin embargo, durante el ciclo estral, los sitios receptores son regulados en todos los tipos de tumor estudiados. Para caracterizar la expresión de las isoformas del RP utilizamos Western blot. En los tumores PD y PI-R se encontraron ambas isoformas, RPa y RPb, con patrón de expresión similar al de los controles normales, útero y mama de ratón. Encontramos además, una proteína de 78 kDa que se expresa exclusivamente en los tumores, pero no en los tejidos normales. Desconocemos su naturaleza, pero se ha descrito una proteína similar en un 25 % de tumores humanos. Su ausencia de tejidos normales sugiere una posible aplicación como marcador tumoral. Con MPA, ambas isoformas RPA y RPB se regulan negativamente en forma similar. En los tumores PI-R se regula preferencialmente RPb, esto sugeriría un papel del RP en este tipo de crecimiento en particular por RPb. En los tumores PI-NR se detectaron menores niveles de RP, principalmente de RPb. Por estudios de Western Blot se podría predecir la capacidad de los tumores de responder al tratamiento hormonal. Por inmunohistoquímica, no se observaron diferencias en el patrón de marcación entre los tres tipos de tumores. Todos fueron positivos, con un porcentaje de células marcadas del 50 % o más. Los resultados de SSCP indican que la reactividad diferencial de los anticuerpos con Western blot e inmunohistoquímica no se debe a mutaciones en el gen de RP. Hemos teorizado la posibilidad de cambios de expresión de epitopes secundarios al distinto procesado de los tejidos en las técnicas. La caracterización de ARN por protección a RNasa indica que los niveles de RP en tumores PI-R y PI-NR son similares. Es probable que, en los tumores PI-NR, las diferencias de expresión observadas con Western blot se deban a cambios post-traduccionales. Con oligonucleótídos antisentido del RP (asRP) en cultivos primarios de tumores PI-NR demostramos que los RP están involucrados en la proliferación celular aún cuando han perdido la capacidad de unir al antiprogestágeno. Estos resultados, de ser extrapolables al humano indicarían que, en el tratamiento del cáncer de mama resistente a la terapia hormonal aún se podrían utilizar estrategias diseñadas a bloquear la funcionalidad de los receptores hormonales.

Abstract:
Breast cancer is, after lung cancer, the second cause of death in women. The development of this disease occurs through different stages from a hormone-dependent to a hormone-independent growth, which is associated to increased aggressiveness. One of the treatments of choice for ER and PR positive breast cancer is hormone therapy with the antiestrogen tamoxifen. Most of the patients respond, although eventually the tumor becomes refractory and the disease progresses. The mechanisms of resistance remain unknown, but most tumors still express hormone receptors, indicating that there is either an intrinsic modification on these molecules, or in the regulation of their expression and activation. In our laboratory, we have developed a murine mammary adenocarcinoma model by prolonged administration of MPA on female virgin BALB/c mice. Most of these tumors are invasive ductal carcinomas, disclosing a progestin-dependent pattern of growth (PD) and they express ER and PR. Either spontaneously or by successive transplantations in animals not treated with hormones, progestin-independent tumors may arise that maintain the expression of hormone receptors. Our goal was to study the role of PR in the transition from hormone-dependence to independence and in the acquisition of resistance to hormonal therapy. We characterized the in vivo response of progestin-independent tumors to the antiprogestins onapristone and mifepristone and to 17-β-estradiol. Six tumors regressed, and we named them responsive progestin-independent (R-PI); three did not respond and were named unresponsive progestin-independent tumors (UR-PI). We studied the proliferative response to MPA in vitro on primary cultures of a PD tumor, and observed that it was biphasic, with two stimulatory slopes, one at very low concentrations (EC50 = 1.5 ± 0.7 fM), and the other at higher concentrations (EC50 = 0.33 ± 0.3 nM). Based on these results we evaluated the receptor expression by radioligand binding in all the tumors and normal tissues. In uterus, PD and R-PI tumors, we discovered two sites for the progesterone receptor, one of high affinity not previously reported (Kd = 43 ± 9 pM, Q = 9 ± 2 fmoles/mg de protein) and the other site which corresponds to the classical PR described by others (Kd = 9.2 ± 4 nM, Q = 376 ± 74 fmoles/mg de protein). PR, in PD and R-PI tumors, are mainly localized in the cytosol, and are regulated by MPA, while in UR-PI tumors they are mainly in the nucleus and are not regulated by this hormone. Nevertheless, the receptor sites were regulated through the estral cycle in all the tumor types studied. To characterize PR isoform expression we used Western blot. We found both PRa and PRb isoforms in PD and R-PI tumors, with a similar expression pattern compared to the control tissue uterus and normal mammary gland. We also found a 78 kDa protein which is exclusively expressed in tumors but not in normal tissue. Its nature remains unknown but a similar protein has been described in 25 % of human cancers. Its absence in normal tissues suggests a possible use as a tumor marker. With MPA treatment, both PRa and PRb are down regulated. PRb is preferentially down regulated in R-PI tumors and this may be indicating its role in this type of growth. Lower levels of PR were detected in UR-PI tumors, particularly PRb. Based on the Western blot studies the ability of the tumors to respond to hormonal treatment could be predicted. PR expression was also studied by immunohistochemistry. No differences were observed between the staining patterns of the three tumor types. The signal was positive in 50% or more nuclei. We conclude based on the SSCP studies that the differential reactivity between the antibodies used in Western blot and immunohistochemistry is not due to mutations in the PR gene. We theorize the possibility that these changes are product of modifications in the epitope expression due to the processing of the sample for each technique, or to post-translational changes. The studies at RNA level by RNase protection assay indicate that PR expression levels in R-PI and UR-PI tumors are similar. Probably, in UR-PI tumors the lower expression levels observed with Western blot are due to post-translational modifications. In primary cultures of UR-PI tumors, using antisense oligonucleotides to PR (asPR) we demonstrated that PR are involved in cell proliferation even when they have lost their ability to bind to the antiprogestagens. The importance of these observations relies in that, if these results to humans are possible to extrapolate to human, in the treatment of hormone resistant breast cancer strategies designed to block the functionality of these receptors could still be used.

Carnevale, Silvana. "Diagnóstico de paludismo por Plasmodium Vivax utilizando secuencias repetitivas de ADN parasitario" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La malaria es un problema de salud pública mundial en más de 100 paises habitados por un total de 2.400 millones de personas, representando el 40% de la población mundial. Las cuatro especies más comunes que infectan al hombre son: Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale, de las cuales, las dos primeras, representan el 95% de las infecciones. En Argentina se plantea la necesidad de trabajar sobre P. vivax, pues no se han registrado casos autóctonos de paludismo por P. falciparum. El propósito de este estudio fue disponer de herramientas moleculares para la detección de P. vivax, aplicables a muestras humanas y vectores, adaptables a las condiciones de recolección y procesamiento básico disponibles en las bases operativas del Programa Nacional de Paludismo. Para ello se obtuvieron y caracterizaron secuencias repetitivas de ADN de P. vivax. El fragmento clonado (instPv10) resultó en un tamaño de 6.899 pb y presentó varias repeticiones directas en tandem y un elemento repetitivo del tipo disperso. Este fragmento incluyó la secuencia específica de P. vivax, insPv10-ll, de 75 pb, que fue empleada como sonda en el desarrollo de la técnica de Dot blot, y la secuencia insPvE/C, dentro de la cual se diseñó el blanco de reacción de PCR. Desde el punto de vista del diagnóstico individual, las técnicas de PCR-sangre e insPv10-11-Dot blot demostraron ser valiosas para emplearse como métodos en el diagnóstico de pacientes sintomáticos y asintomáticos, incluyendo aquellos que retoman de una zona endémica de infecciones causadas por P. vivax, y para el seguimiento de pacientes. Desde la perspectiva epidemiológica la técnica de PCR-elutorios desarrollada en este trabajo permitió efectuar el diagnóstico específico de la especie P. vivax en pacientes sintomáticos y asintomáticos, lo que facilitaría su uso en acciones de detección por búsqueda pasiva y activa. Por otro lado, el método de PCR aplicado a vectores mostró ser una de las pocas alternativas disponibles de alta sensibilidad y especificidad para la detección de P. vivax en mosquitos experimental y naturalmente infectados, con condiciones prácticas de conservación de muestras. Las técnicas desarrolladas en este trabajo son de utilidad para el manejo de brotes y epidemias ya contribuyen a la detección del aumento de la tasa de infección en mosquitos, al estudio de las migraciones y la vigilancia de la quimiorresistencia. El trabajo realizado se enmarca como un desarrollo local de herramientas diagnósticas aplicables al control del paludismo en Argentina.

Abstract:
Malaria is a public health problem in more than one hundred countries, meaning that 40% (2,400 million) of the world’s total population is exposed to malaria risk. The four common species that infect humans are Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale, and the two first ones represent 95% of infections. In Argentina it is necessary to work on P. vivax, because there are not local cases of malaria due to P. falciparum. The purpose of this study was to have disposal of molecular tools for the detection of P. vivax, that could be applied to human and mosquito samples, and adapted to the basic conditions of collection and processing available at the operating settings of the National Malaria Programme. In this way we obtained and characterized repetitive sequences of P. vivax DNA. The cloned fragment (insPv10) resulted in a molecular size of 6,899 bp, with several tandem direct repeats and a repetitive interspersed element. This fragment included the insPv10-ll P. vivax-specific sequence (75 bp), employed as probe for the development of the Dot blot technique, and the insPvE/C sequence, inside which the PCR target was designed. At the individual level, the PCR-blood and insPv10-11-Dot blot demonstrated to be valuable methods for the diagnosis of symptomatic and asymptomatic patients, including those returning from P. vivax endemic areas, and for management of cases. At the epidemiological level, the technique of PCR-blood impregnated filter paper disks developed in this work allowed the specific diagnosis of P. vivax in symptomatic and asymptomatic patients. This fact could facilitate its use in active and passive surveillance. The PCR methodology applied to malaria vectors showed to be one of the few available alternatives of high sensitivity and specificity for the detection of P. vivax in experimentally and naturally infected mosquitoes, with practical conditions for sample storage. The techniques developed in this work are useful for management of outbreaks and epidemics, as they contribute to the detection of increased infection ratios in mosquitoes, to the study of migrations, and to the surveillance of drug resistance. This work can be described as a local development of diagnostic tools that can be applied to malaria control in Argentina.

Tejera, Agueda Mercedes. "Efectos del tratamiento prolongado con AZT sobre células tumorales : acortamiento telomérico, inducción de senescencia y apoptosis, y reducción de tumorigenicidad" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Sorianello, Eleonora Mariana. "Fisiopatología de un tumor ovárico experimental" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de esta tesis fue el estudio de distintos aspectos de la biología y fisiopatología de un tumor ovárico experimental altamente luteinizado (luteoma). Se analizaron parámetros relacionados a la proliferación celular, apoptosis, capacidad de síntesis esteroidogénica y de secreción del tumor. Se halló que el luteoma se desarrollaría preferentemente por hipertrofia y proliferación de células foliculares y una marcada ausencia de apoptosis. Además se detectó la síntesis de las distintas subunidades de inhibina a lo largo de 7 meses de desarrollo tumoral; se evidenciaron patrones fluctuantes a lo largo del tiempo para las subunidades β, que correlacionan estrechamente con los niveles séricos de FSH, demostrando así que tejido altamente luteinizado es capaz de producir inhibinas. Posteriormente, se estudió el camino de señalización de un análogo superactivo del GnRH, Buserelina, en células provenientes del luteoma, evidenciando que el camino clásico de transducción de señales acoplado al receptor de GnRH se encontraba alterado y hallándose los caminos altemativos activados por el decapéptido. Por otro lado, se puso de manifiesto la expresión del mRNA y del péptido de GnRH en células del luteoma, postulándose para el mismo un papel autocrino/paracrino en dicho tejido. Finalmente, evaluamos el efecto de drogas inmunosupresoras, Ciclosporina A y Dexametasona, sobre el desarrollo del tumor in vivo en comparación con animales con operación ficticia (Sham) a lo largo de 7 semanas. Los resultados indicaron que, a pesar de ser efectiva la inmunosupresión inducida por estas drogas sobre variables inmunológicas, las mismas no afectaron el desarrollo tumoral. A diferencia de los animales portadores del tumor, en animales Sham la Ciclosporina A indujo efectos sobre varios parámetros, sugiriendo la presencia de factor/es secretado/s por el tumor que impiden o compensan algunas de las acciones de la droga. Estos estudios aportaron nuevos conocimientos acerca de caracteristicas relacionadas al desarrollo y capacidad de síntesis y secreción del luteoma, como así también de caminos de señalización del receptor de GnRH y comportamiento del tumor bajo tratamiento con drogas inmunosupresoras.

Abstract:
The aim of this thesis was to study different aspects regarding the biology and physiopathology of a highly luteinized experimental ovarian tumor (luteoma). Parameters related to cellular proliferation, apoptosis, steroidogenic capacity and tumor secretion were analyzed. These demonstrated that tumors develop mainly due to proliferation of follicular cells, while a marked absence of apoptosis was also observed. In addition, synthesis of inhibin subunits was detected along 7 months of tumor growth, showing fluctuating expression of B subunits along development, tightly correlating with serum FSH levels. It was thus demonstrated that highly luteinized tissue is able to produce inhibins. The signaling pathways of a superactive analog of GnRH, Buserelin, were studied in luteoma cells, showing that the classical transduction system coupled to the GnRH receptor was markedly altered and describing the alternate pathways activated by the decapeptide in luteoma cells. Moreover, the expression of the GnRH mRNA and peptide was evidenced in luteoma cells, suggesting a possible role as an autocrine/paracrine modulator. Furthermore, the effects of immunosuppressive drugs such as Cyclosporine A and Dexamethasone were evaluated on in vivo tumor growth in comparison to Sham-operated animals along 7 weeks of treatment. Results showed that even though the drug-induced immunosuppression was evidenced on immunological variables, tumor growth was not altered. Marking a difference with tumor-bearing rats, in Sham animals Cyclosporin A affected various parameters, suggesting tumor secreted factor/s which would inhibit or compensate some of the drug’s actions. These studies have contributed new understanding concerning tumor characteristics related to tumor growth, synthesis and secretion capacity as well as different signaling pathways activated by GnRH and tumor behavior under immunosuppression.

Policastro, Lucía Laura. "Participación de las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno en la transformación celular y en la modulación de la radiosensibilidad" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las poblaciones celulares en un organismo están estrictamente controladas por el balance de señales complejas que estimulan o inhiben la proliferación, diferenciación y sobrevida de las células. Existen evidencias experimentales que sugieren que las especies reactivos del oxigeno estón involucradas en el desarrollo del cancer. El primer objetivo de este trabajo fue evaluar la participación de las especies reactivos del oxígeno en los mecanismos de proliferación y transformación celular y modular los niveles de estas especies a fin de inhibir la proliferación y de esta forma controlar el crecimiento tumoral. Los resultados demostraron que existe un aumento de la actividad de superóxido dismutasa y una disminución de los niveles de catalasa y glutatión peroxidasa, enzimas disipadoras de peróxido de hidrógeno, en función de la malignidad. Este desbalance enzimótico se correlacionó con aumento de la producción de peróxido de hidrógeno. La disipación de peróxido de hidrógeno de manera exógena mediante tratamientos con catalasa inhibió la proliferación en líneas celulares de diversos orígenes tisulares y de organismos diferentes, lo que sugiere que la participación del peróxido de hidrógeno en el control de la proliferación sería un fenómeno general. Por otro lado, tratamientos con catalasa inhibieron el desarrollo de tumores experimentales. En concordancia con estos resultados, se demostró que la transfección estable del cDNA de la catalasa en una línea celular tumoral humana, disminuyó la tasa de proliferación y revirtió características de fenotipo maligno. Con respecto a los mecanismos de la inhibiciónde proliferación por secuestro de peróxido de hidrógeno, se demostró aumento de los niveles de óxido nítrico en los tratamientos con catalasa, sugiriendoa esta especie como un posible mediador de esta vía. Por otro lado, dado que la radioterapia constituye junto a la quimioterapia una de las principales formas de tratamiento contra el crecimiento tumoral, el segundo objetivo de esta tesis fue la caracterización de la radiosensibilidad intrínseca de líneas celulares con diferente grado de malignidad, de la respuesta celular a diferentes tipos de radiaciones ionizantes y el estudio del efecto del óxido nítrico como posible radiosensibilizador selectivo de las células tumorales. Los estudios de radiosensibilidad intrínseca demostraron un aumento de la radiorresistencia en función de la malignidad en las células tumorales de ratón evaluadas, que no se manifestó en las células de origen humano. Con respecto a las irradiaciones con haces de protones y de litio en comparación con la radiación gamma, se demostró un aumento de la eficiencia biológica relativa (RBE) en función de la transferencia lineal de energía (LET) de la radiación, que resultó consistente con los datos bibliográficos. Por otro lado, los estudios de la acción del óxido nítrico mostraron un mayor efecto radiosensibilizador en las células con mayor capacidad tumorigénica. Este efecto podría ser explicado por el estado prooxidativo basal de las células mas malignas, que potenciaría la acción de la radiación. Se demostró también la acción del óxido nítrico como radiosensibílizadoren tumores experimentales. Estos resultados sugieren la posibilidad de explorar terapias antioxidantes específicas y radiosensibílizadores selectivos para el control del crecimiento tumoral.

Abstract:
Cell populations in a living organism are strictly controlled by the balance of complex signaling systems, which stimulate or inhibit cell proliferation, dífferentiation and survival. Substantial experimental evidence suggests a role of reactive oxygen species in the development of cancer. The first aim of the present study was to evaluate the involvement of reactive oxygen species in the mechanisms of cell proliferation and transformation and to modulate the levels of these species to inhibit proliferation and thus control tumor growth. The results showed an increase in superoxide dismutase activity and a fall in the activities of H2O2-detoxifying enzymes, catalase and glutathione peroxidase, as a function of malignancy. This imbalance in the antioxidant system was coupled to a rise in the levels of H2O2. The exogenous removal of H2O2 by treatment with catalase induced an inhibition of proliferation in all the tested cell lines of different tissues from several species, suggesting that the regulation of proliferation by H2O2 would be a general phenomenon. Moreover, in vivo treatments with catalase inhibited the growth of experimental tumors. Furthermore, the rate of proliferation was inhibited and some features of malignant phenotype were reversed by a stable transfection of the cDNA of catalase in a human tumor cell line. Regarding the mechanisms of the inhibition of cell proliferation by scavenging H2O2,an increase in the levels of nitric oxide by treatment with catalase was found, suggesting that nitricoxide could be a mediator of this signaling pathway. Taking into account that radiotherapy coupled to chemotherapy is one of the main forms of treatment for cancer, the second aim of this study was to characterize the intrinsic radiosensitivity of cell lines with different degrees of malignancy, the cellular response to different types of ionizing radiation and the effect of nitricoxide as a possible selective radiosensitizer of tumor cells. The studies of intrinsic radiosensitivity demonstrated an increase in radioresistance as a function of malignancy in the mouse tumor cells evaluated. However, this correlation was not found in the human cells tested. Regarding proton and Lithium beam irradiations as compared with gamma irradiations, an increase in relative biological effectiveness (RBE)as a function of the linear energy transfer (LET) was found, which was consistent with previous reports. Furthermore, the studies of the action of nitric oxide resulted in a greater radiosensitizing effect on the more tumorigenic cells. These differential effects could be due to the basal prooxidative state of the more malignant cells that could potentiate the effect of radiation. The radiosensitizing effect of nitric oxide on experimental tumors was also demonstrated. These results suggest the possibility of exploríng specific antioxidant therapies and selective radiosensitizers for the control of tumor growth.

Binda, María Mercedes. "Factores reguladores de la angiogénesis en el fenómeno de resistencia antitumoral concomitante" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La resistencia antitumoral concomitante (RC) describe el fenómeno mediante el cual individuos portadores de un tumor son capaces de inhibir implantes tumorales secundarios o metástasis. En esta tesis se analizaron cinco modelos tumorales, tres derivados a partir de tumores mamarios murinos en ratones singenéicos y dos líneas de carcinoma de pulmon humano en ratones nude, el objeto de saber que factores angiogénicos/angiostáticos regulaban el fenómeno. Una de las líneas humanas generó una fuerte RC frente a un inóculo tumoral secundario subcutáneo (s.c.) en ratones nude, así como lo hicieron dos de los modelos tumorales murinos frente a inóculos s.c. y endovenosos (i.v.) de sus respectivas celulas. Se analizaron dos inhibidores (angiostatina y endostatina) y dos inductores (factor de crecimiento fibroblástico basico o bFGP y factor de crecimiento endotelial vascular o VEGF) de la angiogenesis, en sueros de animales portadores y en los medios condicionados (MCs) provenientes de los distintos tumores cultivados in vitro. Aunque no se pudo detectar angiostatina in vivo en los sueros de ratones portadores, si se detecto la conversion de plasminogeno a angiostatina in vitro por MCs en aquellos casos que mostraban capacidad de generan RC. El estudio con diferentes tipos de inhibidores de proteasas demostro que la enzima involucrada en esta conversión era una serinoproteasa. El uso de inhibidores del activador del plasminogeno de tipo uroquinasa (uPA) inhibio la generacion de angiostatina, a excepcion de una de las líneas murinas (M3MC) que posiblemente utilice una serinoproteasa distinta de uPA. Ademas, en general, se observo una baja concentración de VEGF y una alta concentración de endostatina en los sueros de animales portadores inductores de RC, respecto de sus controles y de los restantes grupos experimentales incapaces de desarrollar RC. Los resultados hallados permiten comprender mas profundamente el mecanismo de RC, a la vez aportan información que podría ser de utilidad para un eventual futuro tratamiento del cáncer basado en el uso de reguladores de la angiogenesis tumoral.

Abstract:
The term "concomitant antitumoral resistance” (CR) describes the phenomenon by which tumor-bearing hosts are capable of inhibiting secondary tumor implants or metastases. In order to elucidate whether the phenomenon under study is dependent on the capacity of tumor cells to generate different angiogenic and/or antiangiogenic factors, we used in this thesis three murine mammary adenocarcinomas and two human lung cancer cell lines. One of the human lung cancer cell lines revealed a strong CR against secondary subcutaneous (s.c.) tumor implants in nude mice, as well as two of the murine mammary tumors against secondary s.c. and intravenous (i.v.) tumor inoculations in syngeneic hosts did. Two angiogenesis inhibitors. (angiostatin and endostatin) and two angiogenic inducers (basic fibroblast growth factor or bFGF and vascular endothelial growth factor or VEGF)were analyzed in tumor-bearing mice sera and in conditioned media (CM)derived from the different tumor cells grown in vitro. Angiostatin could not be detected in either of the tumor-bearing mice sera analyzed. However, the CMs derived from those tumor cells that were capable to induce CR, showed in vitro conversion of plasminogen into angiostatin. The use of different types of protease inhibitors revealed that the conversion could be due to a serine protease. The use of urokinase type plasminogen activator (uPA) inhibitors could abrogate the generation of angiostatin, except for one of the murine mammary cancer cells lines, namer M3MC, that might utilize a serine protease other than uPA for the cleavage of plasminogen into angiostatin. Furthermore, a low VEGF concentration and a high endostatin concentration were usually found in sera from tumor-bearing mice, with respect to their controls and other experimental groups that did not induce CR. The results found herein lead to a more profound understanding of the CR mechanism, providing new information that could be useful for a future treatment of cancer based on the use of angiogenesis regulators.

Gamberale, Romina. "Regulación de la sobrevida de los linfocitos B de Leucemia Linfática Crónica : papel de los receptores para el fragmento Fc de la IgG" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La leucemia linfática crónica de células B (LLC-B) se caracteriza por la progresiva acumulación de linfocitos B clonales, que presentan muy baja tasa proliferativa y resistencia a morir por apoptosis. El objetivo de este trabajo de Tesis fue investigar el papel que cumplen los leucocitos no-malignos como posibles reguladores de la apoptosis de las células leucémicas. Por otro lado, considerando que las células LLC-B expresan receptores para el fragmento Fc de la IgG (RFCγ)y que es frecuente la presencia de complejos inmunes (Cl) en el suero de los pacientes, se analizó el papel de los RFcγ en la modulación de la sobrevida de las células leucémicas. Los resultados obtenidos demuestran que los monocitos y las células NK son capaces de prolongar la sobrevida de las células leucémicas en cultivo a través de distintos factores, tanto solubles como de contacto celular. Para tratar de identificar la producción de alguno de ellos se realizaron cultivos en presencia de anticuerpos neutralizantes anti-IFNγ,anti-IL-4 y anti-IL-10, encontrándose una marcada heterogeneidad entre los distintos pacientes evaluados. La misma variabilidad de respuesta se obtuvo al bloquear la interacción de CD40 con su ligando mediante anticuerpos anti-CD40. En conjunto, estos resultados sugieren que la capacidad de los monocitos y las células NK de favorecer la sobrevida de las células leucémicas depende de una sumatoria de señales que parecen ser particulares de cada paciente. Cuando los cultivos de células LLC-B y leucocitos accesorios se llevaron a cabo en presencia de Cl fue posible no sólo inhibir la apoptosis espontánea sino también la inducida agentes quimioterápicos como la fludarabina, el clorambucilo y la dexametasona. Es decir, que la activación de monocitos y células NK por entrecruzamiento de sus RFCγ estaría favoreciendo la acumulación del clon leucémico. Teniendo en cuenta que las células LLC-B sobre expresan la proteína antiapoptótica Bcl-2 y que la expresión de la misma se inhibe a medida que progresa la apoptosis ¡n vitro, se examinaron los niveles de Bcl-2 en las células leucémicas cultivadas con o sin leucocitos accesorios. Los resultados indican que la presencia de monocitos y células NK retarda la down-regulación de Bol-2 en las células leucémicas. Por el contrario, cuando la inhibición de la apoptosis de las células LLC-B se da a consecuencia de la activación de los leucocitos accesorios por Cl , el bol-2 no parece estar involucrado. La última parte de esta Tesis comprende el estudio de la expresión y funcionalidad de los RFcγ expresados por las leucémicas. Los datos presentados demuestran que las células B-CLL expresan no sólo el RFcγIIb característico de las linfocitos B normales, sino también la isoforma RFcγIIa. Debido a que portan dominios ITAM en su porción citoplasmática. los RFCγIIa transducen señales de activación. Sin embargo, ni la utilización de distintos tipos de Cl, ni el entrecruzamiento selectivo de los RFCγIIa logró inducir la activación de las células LLC-B, medida como cambios en los flujos de calcio. Tampoco fue posible modular la apoptosis en las Leucémicas purificadas, Lo que sugiere que este receptor no seria funcional en LLC-B.

Abstract:
B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is characterized by the progressive accumulation of clonal B lymphocytes caused by defects in programmed cell death rather than increased proliferation. The aim of the current Thesis was to investigate the role of non-malignant leucocytes in the regulation of B-CLLcells apoptosis. On the other hand, considering that leukemic cells express receptors for the Fc fragment of IgG (FCγR) and the presence of immune complexes (IC) is frequently found in B-CLL patients, we analized whether IC could modulate leukemic cells survival. Our results show that monocytes and NK cells were able to prolong the survival of cultured leukemic cells through different factors, not only soluble factors, but also cell-cell interactions. In an attempt to determine which are the factors involved in the protective effect mediated by accessory leukocytes, we performed cultures in the presence of neutralizing antibodies (Ab) directed to IL-4, IFNγ or IL-10, as well as blocking Ab to CD40. We found a marked heterogeneity among different patients, suggesting that the mechanisms involved in the regulation of apotosis might differ among B-CLL samples. In addition, it is conceivable that an array of factors rather than a single factor may account for the protective effect exerted by monocytes and NK cells. The anti-apoptotic effect was also observed when B-CLL cells and non-malignant Ieukocytes were cultured in the presence of immune complexes (IC). In this case, IC were able to inhibit,not only spontaneous apoptosis, but also the one induced by different chemotherapeutic agents, like fludarabine, chIorambuciI or dexamethasone. Thus, the activation of monocytes and NK cells by their FcγR crosslinking, may favor the accumulation of the leukemic clone. Taking into account that B-CLL cells over express the anti-apoptotic protein Bcl-2 and its expression was inhibited in vitro during the culture, we analized the expression of Bcl-2 in leukemic cells cultured with or without accessory leukocytes. Our results showed that the presence of monocytes and NK cells delays Bcl-2 down-regulation. However, when the cultures were done with IC, Bcl-2 seems not to be involved in the protective effect exerted by accessory cells. The last part of the current Thesis involves the study of the expression and functionality of FCyRexpressed by leukemic cells. We here present that B-CLL cells express no only FcγRIIb,found on normal B cells, but also FcγRIIa. which have ITAM domains related to activating signals. Surprisingly, neither the IC interaction with FeyRs on B-CLL cells, nor the FCγRIIa crosslinking with specific Ab, could modulate leukemic cells apoptosis or activation, measured by calcium mobilization. Our results suggest that FcγRIIa expressed on B-CLL cells may not be functional.

Lutzky, Viviana Paula. "PECAM-1/CD31 en células tumorales : Un nuevo blanco para la terapia antiotumoral?" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Las moléculas de adhesión han sido implicadas en la metástasis y la progresión tumoral. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la expresión y el rol de las moléculas de adhesión, en particular PECAM-l/CD31 en las células tumorales humanas. PECAM-l/CD31 es una glicoproteína de 130kDa perteneciente a la superfamilia de Inmunoglobulinas. Se encuentra presente en células endoteliales, plaquetas y en la mayoría de los leucocitos. Sin embargo, en este trabajo se demostró, por inmunofluorescencia y Western blot, la presencia de la molécula en líneas de células de melanoma y de adenocarcinoma. La expresión cuantitativa y cualitativa de PECAM-l/CD31 sobre las células tumorales es diferente a la de los leucocitos y células endoteliales, ya que en las células tumorales la expresión es menor, y además, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los dominios-2 y —6 no reaccionan con la molécula. La expresión de PECAM-l/CD31 sobre la superficie de las células tumorales fue modulada por interacciones célula-célula, siendo mayor en las células provenientes de cultivos sub-confluentes y en las células desprendidas espontáneamente de monocapas de células tumorales confluentes. La fijación y la permeabilización de las células tumorales reveló la presencia de reservorios intracelulares de PECAM-l/CD31. Por otro lado, la expresión de PECAM-l/CD31 aumentó y disminuyó en presencia de citocalasina B y brefeldina A, respectivamente. Las células de melanoma se adhirieron a células endoteliales y a proteínas de matriz extracelular. En el primer caso, la adhesión fue parcialmente mediada por PECAM-l/CD31, ya que la transfección de las células de melanoma con un oligonucleótido antisentido para PECAM-l/CD31, disminuyó la expresión de esta molécula y su adhesión. Lo mismo sucedió al tratar las células tumorales con anticuerpos dirigidos contra los dominios-1, —3 y —4/—5. En cambio la adhesión a las distintas proteínas de matriz extracelular fue mediada por las integrinas α1 (para colágeno IV); α3 (para matrigel, laminina, colágeno IV y colágeno I); α4 y α5 (para fibronectina); α6 (para matrigel) y β1 (para matrigel, colágeno IV, colágeno I y fibronectina). Finalmente, la coligación de PECAM-l/CD31 con anticuerpos dirigidos contra el dominio 3 en las células de melanoma y adenocarcinoma, tiene un efecto inhibitorio sobre la proliferación celular. Los resultados obtenidos en el presente trabajo, indican que existe un reservorio intracelular de PECAM-l/CD31 en células tumorales que probablemente module la expresión de CD31 en la superficie celular. Además sugieren un rol de esta molécula en el crecimiento tumoral y en la metástasis.

Abstract:
Tumor progression and metastasis have been related to the adhesion molecules expression. The aim of the present study was to examine the expression and the role of adhesion molecules on tumor cells, in particular PECAM-l/CD31. PECAM-l/CD31 is a 130-kDa member of the Immunoglobulin gene superfamily that is highly expressed on endothelial cells, platelets and most leukocytes. However, herein it is demonstrated by Western Blot and immunofluorescence that some melanoma cells and adenocarcinoma cells express PECAM-l/CD31 on the cell surface. The expression of PECAM-l/CD31 on tumor cells seems to be different from normal cells, since the expression was low compared to endothelial cells and leukocytes, and based on the absence of reactivity of monoclonal antibodies directed to domains 2 and 6. Furthermore, the tumor cells surface expression of PECAM-l/CD31 can be regulated by cell-cell contact, being higher on sparse and spontaneously detached cells. Fixing and permeabilizing tumor cells revealed a cytoplasmic pool of the molecule. Indeed, cell surface CD31 was internalized following mAb binding and the expression was enhanced and decreased by cytochalasin B and brefeldin A, respectively. Melanoma cells were able to adhere to endothelial cells and to extracellular matrix proteins, using different adhesion molecules. The interaction of melanoma cells with endothelial cells was partially mediated by PECAM-l, since decreasing the expression of CD31 on tumor cells by CD31-specific antisense oligonucleotide or by treatment with mAbs to domains -1, -3, -4/—5 decreased the adhesion to endothelium. Melanoma cells adhesion to ECM proteins was mediated by α1 (for collagen type IV); α3 (for matrigel, laminin, collagen type IV and collagen type I); α4 and α5 (for fibronectin); α6 (for matrigel) and β1 (for matrigel, collagen type IV, collagen type I and fibronectin). Furthermore, ligation of CD31 via domain —3 but not β1 integrin inhibited proliferation of melanoma and adenocarcinoma cells. Overall, these results indicate that there is an intracellular pool of CD31 on tumor cells which might modulate CD31 surface expression and its role in cancer cell growth and metastasis.

Ceballos, Ana. "Evaluación de factores involucrados en la transmisión vertical del HIV-1" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El 95% de los niños infectados con HIV-1 en el mundo contraen la infección por transmisión vertical. En la Argentina han sido informados hasta septiembre del 2001 1260 niños con SIDA, que corresponde al 7% del total de casos, el más alto de América Latina. Se han descripto muchos factores, virológicos e inmunológicos, que inciden sobre la tasa de transmisión. Actualmente existen protocolos eficaces de tratamiento antiviral y de procedimientos obstétricos para la prevención de la transmisión vertical. Sin embargo, el costo de los tratamientos resulta muy oneroso para los países en vías de desarrollo, por lo cual se está muy lejos de la resolución del problema. Por otro lado, el diagnóstico de la infección del niño nacido de madre infectada es más complejo que el del adulto, dada la persistencia de IgG maternas durante los primeros 12 meses de vida. Esta tesis aborda la transmisión vertical del HIV-1 desde distintos enfoques. Inicialmente se realizó un estudio de población en Buenos Aires y alrededores, para evaluar el éxito de las estrategias implementadas para prevenir la transmisión vertical desde 1993 hasta 2001, con el estudio de 874 familias. Se demostró un aumento gradual en el número de madres y niños que siguieron el protocolo ACTG 076 (AZT para la prevención de la transmisión vertical) que alcanzó un 80% en el período 1999-2000. Se registró un aumento en el número de niños nacidos por cesárea que alcanzó un 54.8% durante 1999-2000 contra un 19.4 en 1993-1995. La efectividad de estas medidas se vio reflejada en la disminución de la tasa de transmisión madre a hijo de 37,3% en el período 1993-1995 a 6.5% en el año 2001. Sin embargo, un porcentaje constante de mujeres (12%) continuaron amamantando en el período estudiado, desde 1993 hasta el 2000. El porcentaje de mujeres que se enteraron de su infección luego del nacimiento del niño también fue del 12%. Estos resultados muestran la necesidad de implementar estrategias adicionales que generalicen la educación, la consulta y el diagnóstico en las mujeres jóvenes y sus parejas. Se estudió la eficiencia de la detección de la IgA específica en l4l niños, 46 tratados bajo protocolo ACTG 076 y 95 no tratados, demostrando que no se encontraron diferencias significativas respecto a los niños no tratados, a pesar de que la sensibilidad es menor en los niños tratados. Al cuantificar los sueros de estos niños se observan títulos menores en los niños tratados. Sin embargo, esto no altera la detección e indica el valor de la prueba en niños tratados, que hoy en día son la mayoría. Se estudió la reactividad frente a péptidos del V3 loop del gen env de variantes locales recombinantes y de los subtipos B y F de 22 madres transmisoras y 22 no transmisoras de la infección. Se demostró una mayor reactividad en las muestras de plasma de las madres no transmisoras frente a las transmisoras con el péptido SF2 y B/F, y además una diferencia significativa en la reactividad general frente al péptido recombínante B/F local. Esto indicaría la importancia de la inmunidad humoral en la protección frente a la transmisión vertical del HIV-1. Estos resultados apoyarían el uso de inmunosueros para evitar la transmisión madre a hijo. No se encontraron diferencias significativas entre madres tratadas y no tratadas con antirretrovirales. La transmisión vertical del HIV-1 ocurre predominantemente en el parto, presumiblemente a través del contacto con líquidos y sangre materna. La oxitocina y las prostaglandinas (PGs) son hormonas que inducen el trabajo de parto fisiológicamente, y que son aplicadas en forma terapéutica para activar el proceso del nacimiento. Por otro lado, la oxitocina interviene en la lactancia materna. Se estudió la acción de dichas hormonas in vitro sobre la replicación del HIV-1. Se demostró que la PGF2α disminuye transitoriamente la producción del antígeno p24 en células persistentemente infectadas con HIV-1 y no en células con infección aguda, mientras que la oxitocina y la PGE2 no produjeron ninguna variación en la cantidad de virus. Esto demuestra que tanto la oxitocina como la prostaglandina se pueden utilizar terapéuticamente sin temor a que potencien la replicación viral en el momento del parto. Finalmente se analizó la variabilidad viral en casos de transmisión a niños utilizando métodos moleculares, filogenéticos y de evolución simulada. Se demostraron dos casos de transmisión horizontal de padre a hijo. Aunque estos casos deben ser considerados excepcionales en la clínica, sin embargo, el conocimiento de estas excepciones ayuda a limitar las oportunidades de la transmisión del HIV-1 en lugares poco comunes tales como en el seno familiar y, dado que, la extensión de la epidemia es considerable, podrían presentarse más casos de este tipo en el futuro. Por otro lado, por demanda legal, se demostró un evento de transmisión ocunido 7 años antes de la obtención de las muestras entre un donante, una madre receptora de la transfusión y su hijo. Estos métodos podrían utilizarse en casos semejantes en los cuales no se cuenta con datos epidemiológicos y clínicos suficientes y se debe corroborar un hecho de transmisión. Por otro lado, se analizó la variabilidad viral en cuatro casos de seroconversión materna durante el embarazo y/o la lactancia y se observó que las madres presentaban poblaciones virales con baja variabilidad. A pesar de la similitud entre las variantes maternas, no se observó un fenómeno de selección en la transmisión, las madres pudieron transmitir múltiples variantes virales a sus hijos. Esto puede deberse a la falta de madurez de la respuesta inmune materna, que parecería jugar un papel importante en el origen de la variabilidad viral del gen env y en los mecanismos de selección viral durante la trasnmisión vertical del HIV-1. Estos casos de seroconversión durante el embarazo y transmisión de la infección al niño muestran la necesidad de realizar diagnósticos durante y después del embarazo. Además, en poblaciones donde la incidencia de HIV entre las mujeres jóvenes es alta, se deberia repetir el diagnóstico en los últimos meses del embarazo o en el parto, las cuales permitirían implementar intervenciones para prevenir la transmisión vertical.

Abstract:
Vertical transmission is responsible for 95% of the children infected with HIV-1 in the wordl. In Argentina until September 2001, 1260 children with AIDS were reported, 7% of total AIDS cases in the country, the highest level of Latin America. Many different factors, whether virological or immunological, have been described to have an effect on the transmission rate. There are now efficacious treatment protocols as well as obstetric procedures to avoid vertical transmission. However, the cost of these treatments is too high for developing countries, therefore the problem is far from being solved. Further, the diagnosis of pediatric HIV infection is more complicated than that of the adult, due to the persistence of maternal IgG during the first 12 months of life. This tesis faces the problem of vertical transmission from different sides. Initially a study was performed to evaluate the success of a National Program for the prevention of mother to child transmission (MTCT) in 874 mother-infant pairs from Buenos Aires and its surroundings. This population was referred to the National Reference Center for AIDS for diagnosis of neonatal infection during 1993-2000. The data revealed a substantial increase in the percentage in the use of antiretroviral therapy during pregnancy from 3.2% in 1993-1994 to 73.1% in 1999-2000. An increase in the use of Caesarean section (reaching 54.8% in 1999-2000) was observed. However, the proportion of HIV-infected women who continued to breast feed their children remained steady (around 12%). The general improvement of the conditions to decrease MTCT resulted in a significant decrease of infected infants from 37.3% before 1995 to 10.7% in 1999-2000, and even 6.5% during 2001. Data on the time of diagnosis indicates that only 42.7% of the women knew about their HIV status before pregnancy, 44.8 during pregnancy and 12.3% after the birth of their child. The main risk factor for HIV infection of the mothers was heterosexual contact (73%) and for fathers was injection drug use (67 %). These results point out the urgent need to develop additional strategies to generalize education, counseling, and testing of young women. The efficiency of IgA detection was studied in children treated under protocol O76, showing no significant differences with the untreated children, in spite of a lower sensitivity in treated children. Samples of this groups of children were quantified and the titers for IgA were lower in treated childre. However, this fact doesnt alterate the detection possibilities. These results show the usefulness of this test in ACTG 076 treated children, which today are the majority. The reactivity to V3 loop peptides from env gen of local recombinant forms as well as B & F subtypes was analysed in plasma samples of 22 HIV-transmitting and 22 non transmitting mothers. A higher reactivity was shown in the samples of non transmitting mothers compared to the transmitting ones. Further, there was a general significant reactivity to the B/F recombinant local peptide. These results would point out the importance of humoral immunity in the protection for vertical transmission of HIV-1 and would support the use of hiperimmune sera to avoid mother to child transmission. No significant differences were found between treated and non treated mothers. Mother to child transmision of HIV occurs mainly during birth, probably through the contact with maternal blood and liquids. Oxytocin and prostaglandins (PGs) are hormones involved in labor and are used clinically for its induction. The effect of oxytocin, PGF2α, and PGE2 on HIV-l replication in vitro was analysed. No significant effect on p24 antigen production in acutely or persistently infected cells was found within the range of concentrations of oxytocin or PGs assayed, except for a transient decrease in persistently infected cells treated with 1μM PGF2α. These results showed that oxytocin and PGs could be used clinically for labor induction without any direct enhancement in viral production. Finally, viral variability in cases of transmission of HIV to children was analysed by means of mollecular, filogenetic and simulated evolution methods. Two cases of father to child horizontal transmission were proven with filogenetic methods. Even if these cases should be considered as exceptional in the clinical experience, nevertheless their knowledge helps to limitate the opportunities of HIV transmission in such uncommon places as the nuclear family. Further, since the epidemics is in expansion, new cases like those could appear in the future. By legal demand on our laboartory, an event of transmission which happenned 7 years before was shown with simulated evolution. This event included a male blood donor, a woman receptor of the transfussion during puerperium and her son. These methods could be used in similar situations in which the epidemiological and clinical data are insufficient and a transmission event has to be ascertained. Also, viral variability was analysed by means of mollecular cloning in four cases of maternal seroconversion during pregnancy and/or lactancy. Maternal viral populations presented low variability. In spite of the maternal variant likeness, no apparent selection was observed in mother to child transmission, and the children showed multiple variants shown in ther respective mothers. This could be due to the lack of maturity in the immune response of the mothers, which would apparently play an important rol in the origin of the variability of the env gen and in the mechanisms of viral selection during mother to child transmission of HIV. The mentioned cases of seroconversion show the need to strenghten the counseling ans testing of HIV during pregnancy. Further, in populations where HIV incidence is high, diagnosis should be repeated in the last trimester, to be able to take interventions to avoid mother to child transmission.

Labriola, Leticia. "Interacción entre las vías de transducción de señales activadas por el receptor de progesterona y las activadas por receptores con actividad de tirosina quinasa tipo I y II en cáncer de mama" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Existe numerosa evidencia que indica que los progestágenos están involucrados en el control de la tumorigénesis mamaria. A pesar de ello, los mecanismos por los cuales las hormonas esteroideas estimulan el crecimiento de células de cáncer de mama no han sido todavía descifrados completamente. Uno de los mecanismos propuestos ha sido la regulación de la expresión de factores de crecimiento que actuarían como mitógenos de las células tumorales. En particular, se ha demostrado previamente en el laboratorio que Heregulina (HRG), ligando de receptores con actividad de tirosina quinasa (RTK) tipo I, estimula el crecimiento de células epiteliales provenientes de cultivos primarios del tumor mamario progestágeno-dependiente C4HD y potencia los efectos mitogénicos del acetato de medroxiprogesterona (MPA) (Balañá et al., 1999; 2001). La primera parte del presente trabajo se centró en el estudio de interacciones entre los caminos de señalización activados por progestágenos y por RTKS tipo I y II en el modelo de carcinogénesis mamaria inducida por acetato de medroxiprogesterona en ratones Balb/c (Molinolo et al., 1987; Lanari et al., 1989). El tratamiento de las células C4HD con MPA indujo tanto el aumento de los niveles proteicos de ErbB-2 como el aumento de su fosforilación. Habíamos demostrado anteriormente que el receptor tipo I del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR) y el ErbB-2 están involucrados en la proliferación de estas células mediada por MPA. Al estudiar el bloqueo simultáneo de ErbB-2 y IGF-IR sobre la proliferación inducida por MPA, no se observaron efectos aditivos ni sinérgicos. Efectos aditivos hubieran sido esperados si IGF-IR y ErbB-2 activaran vías de señalización independientes. Una interacción sinérgica hubiera existido si el camino de transducción de señales activado por uno de los receptores potenciara el del otro receptor. Por lo tanto tan sólo un mecanismo que involucrara una interacción jerárquica entre IGF-IR y ErbB-2, en el cual uno de ellos es esencial para la activación de del otro, podía explicar nuestros resultados. En efecto, al suprimir la expresión del IGF-IR, la fosforilación del ErbB-2 inducida por MPA se vio totalmente inhibida. Sin embargo, el bloqueo de la síntesis de ErbB-2 no afectó la fosforilación del IGF-IR. Estos resultados muestran la existencia de una interacción jerárquica entre IGF-IR y ErbB-2; por medio de la cual IGF—IR dirige la activación de ErbB-2. Se demostró, por primera vez, que esta interacción involucra la asociación física de ambos receptores en un complejo heteromérico. Es más, experimentos de microscopía confocal laser mostraron que el MPA fue capaz de inducir la co-localización de ErbB-2 y IGF-IR. El propósito de la segunda parte del trabajo fue el de investigar la capacidad de HRG de activar al receptor de progesterona (RP) utilizando el mismo modelo experimental que en la primera parte. Es así que pudimos observar que HRG fue capaz de regular las características bioquímicas del RP en forma similar a la efectuada por la activación del receptor luego de la unión a un progestágeno. Se encontró que HRG fue capaz de inducir una disminución de los niveles proteicos de ambas isoformas, A y B, del RP y de disminuir la cantidad de sitios específicos de unión a progestágenos. Además, el tratamiento con HRG produjo un aumento de la proporción de RP con localización nuclear. Estudios posteriores nos permitieron saber que el tratamiento con HRG podía también inducir la unión del RP a su elemento respondedor en el ADN(PRE) y aumentar la transcripción de un gen reportero que contenía dos PRE en su promotor. Un antiprogestágeno como el RU486 provocó la inhibición de la activación transcripcional del RP mediada por HRG. Al profundizar en los mecanismos moleculares que estaban involucrados en los efectos de la HRG sobre el RP, pudimos observar que era necesaria la presencia de ErbB-2 funcional así como de proteínas quinasas activadas por mítógenos (MAPK) en su estado activo. Es más, MAPKs activadas por HRG tuvieron la capacidad de fosforilar al RP en ensayos de fosforilación in vitro. Los mismos estudios se realizaron en la línea de carcinoma mamario humano T47D obteniéndose resultados similares. Nuestros resultados mostraron que, en ausencia de progestágenos, HRG activa al RP tanto murino como humano mediante un mecanismo que requiere la presencia de ErbB-2 funcional así como la activación de MAPKs.

Abstract:
Accumulated evidence has indicated that progestins are involved in controlling mammary tumorigenesis. Although the mechanisms by which steroid hormones stimulate growth of breast cancer cells have not been completely deciphered, regulation of the expression of growth factors which in turn act as mitogens for tumor cells, has already been proposed. Particularly, we have previously demonstrated that Heregulin (HRG) stimulates gowth of primary cultures of the progestin-dependent C4HD mammary tumor epithelial cells and potentiates medroxyprogesterone acetate (MPA) mitogenic effects (Balañá et al., 1999; 2001). The first part of the present study focused on interactions between signaling pathways activated by progestins and by type I and II receptor tyrosine kinases (RTKs) in mammary tumors. An experimental model in which the synthetic progestin medroxyprogesterone acetate (MPA) induced mammary adenocarcinomas in Balb/c mice was used (Molinolo et a|., 1987; Lanari et al., 1989). MPA-stimulated proliferation of epithelial cells from primary cultures of progestin-dependent tumors induced up-regulation of ErbB-2 protein levels and tyrosine phosphorylation of this receptor. Recent findings in our laboratory indicate that type I insulin-like growth factor receptor (IGF-IR) and ErbB-2 are involved in proliferative signaling pathways in C4HD cells. Thus, we investigated the potential antiproliferative effect of the simultaneous downregulation of ErbB-2 and IGF-IR. The simultaneous blockage of ErbB-2 and IGF-IR showed neither synergistic nor additive effects on the inhibition of MPA induced proliferation of C4HD cells. Additive effects could have been expected if IGF-IR and ErbB-2 targeted different independent signaling pathways. Synergistic interaction could have been existed if one receptor pathway potentiated the other receptor biochemical pathway. Thus, only a mechamism involving a hierarchical interaction between IGF-IR and ErbB-2, wherein one of the receptors is essential for the activation of signal transduction pathways elicited by the other, could fit our results. In fact, suppression of IGF-IR by antisense oligodeoxinucleotides (ASODN) resulted in complete abrogation of MPA-induced phosphorylation of ErbB-2 in C4HD cells, whereas blockage of ErbB-2 did not affect IGF-IR phosphorylation. These results show the existence of hierarchical interactions between IGF-IR and ErbB-2, by means of which IGF-IR directs ErbB-2 phosphorylation. We demonstrated, for the first time, that this hierarchical interaction involves physical association of both receptors, resulting in the formation of a heteromeric complex. Furthermore, confocal laser microscopy experiments demonstrated that MPA was able to induce colocalization of ErbB-2 and IGF-IR. The aim of the second part of this study was to investigate the capacity of HRG to activate progesterone receptor (PR) by using the same model of hormonal mammary carcinogenesis. We first found that HRG was able to induce a decrease on PR A and B isoforms at protein level and to promote a significant increase in the nuclear localization of PR. Further studies allowed us to know that HRG was also able to induce PR binding to a progesterone response element (PRE) and significantly increased the transcription of a reporter gene with two PREs in its promoter. When we investigated molecular mechanisms involved in HRG action, we found that both the presence of functional ErbB-2 and activation of mitogen-activated protein kinases (MAPK)were needed. Additionally, HRG activated-MAPKs were able to phosphorylate PR in vitro. This PR activation by HRG was also seen in T47D human breast cancer cells. Our findings demonstrated that in the absence of progestins, HRG activates PR in both human and mouse breast cancer cells by a mechanism that requires both a functional ErbB-2 and MAPK activation. In addition, herein we provide the first evidence that MAPK activated by HRG are able to phosphorylate human and mouse PR in vitro.

Ouviña, Susana María. "Disfunción endotelial en angiopatías : angiopatía diabética tipo 2" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Diabetes Mellitus es un transtomo sistémico con alteraciones del metabolismo de los hidratos de carbono, lípidos y proteínas. La forma clínica predominante es la diabetes tipo 2 o no-insulino dependiente, siendo la enfermedad cardiovascular, la principal causa de muerte en estos pacientes. El desarrolllo de la diabetes está precedido por un período de resistencia a la insulina y de hiperinsulinemia. La incidencia de hipertensión arterial y el stress oxidativo están aumentados en los pacientes diabéticos y asociados a alteraciones vasculares. Se evaluó la disfunción endotelial en la diabetes tipo 2 mediante diferentes estudios clínicos en pacientes y se realizaron estudios experimentales con células endoteliales humanas, ratones y macrófagos. Se propusieron como objetivos: - Determinar la presencia de activación plaquetaria y la expresión de proteínas adhesivas. - Evaluar el metabolismo del óxido nítrico y la expresión de NOS. - Estudiar la liberación de citoquinas y FvW. - Determinar los niveles plasmáticos de ET-l en los pacientes diabéticos y su interacción con el NO. - Relación entre los niveles plasmáticos de insulina, PAI-l y Péptído C. - Evaluación de la función endotelial a través de la medición de la respuesta vasodilatadora a la isquemia hiperémica. - Seguimiento secuencial de los parámetros metabólicos, vasoactivos y marcadores de disfunción endotelial en una población de individuos hipertensos bajo tratamiento con una droga antihipertensiva y en otra población sin tratamiento farmacológico. - Estudiar la acción de los AGEs en células endoteliales obtenidas a partir de cordón umbilical humano. Determinar la migración de las CE en presencia de AGEs. Realizar co-cultivos de células endoteliales con eritrocitos provenientes de pacientes diabéticos tipo 2. - Determinar la respuesta en un modelo experimental animal (ratones Balb/c) expuesto a distintas concentraciones de albúmina glicosilada. - Estudio comparativo entre macrófagos murinos y la línea celular U-937, monoblastos de origen humano, diferenciada a macrófagos. La acción de los AGEs observada en los experimentos in vitro e in vivo reprodujo, en parte, los resultados obtenidos en los pacientes estudiados. Los pacientes diabéticos expresaron marcadores de activación plaquetaria y presentaron alteraciones en el metabolismo del NO y su interrelación con la ET-l. Las proteínas reactantes de fase aguda tales como FvW, Fibrinógeno y PAI-1 estuvieron elevadas y asociadas a la condición de insulino-resistencia. Las drogas antihipertensivas tipo IECA mejoraron significativamente la función endotelial, disminuyendo el riesgo de eventos trombóticos.

Abstract:
Diabetes Mellitus is a sistemic disorder with alterated carbohydrates, lipids and proteins metabolisms. The most frecuent type is the non-insulin dependent diabetes or type 2 diabetes. The cardiovascular disease is the main cause of death in these patients. A period of insulin-resistance or hyperinsulinaemia may preced the onset of diabetes. Arterial hypertension incidence and oxidative stress are increased in diabetic type 2 patients and associated to vascular alterations. Endothelial dysfunction was evaluated through different kind of clinical studies in patients. Experiments were also performed in human endothelial cells. mice and macrophages. The objetives of this Thesis were: - To evaluate the platelet activation and the adhesive proteins expression. - To analyse the nitric oxide metabolism and nitric oxide synthases expression. - To study the cytokines and von Willebrand Factor release. - To analyse the relatioship among insulin, PAI-l and C Peptide plasmatic levels. - To evaluate the endothelial function by the measure of the vasodilator response to the hyperemic ischemia. - Time followed metabolic and vasoactive parameters and endothelial dysfunction markers in a hypertensive patients group under anti-hypertensive drug treatment and in another hypertensive patients group without pharrnacologic treatment. - To study AGES action on the endothelial cells obtained from human umbilical cord and on their migration. To evaluate the endothelial cells and red blood cells from diabetic type 2 patients co-culture. - To propose the response of an experimental animal model (Balb/c mice) at different concentration of glycated albumin. - To compare murin macrophages and human monoblastic cellular line U-937, diferentiated to macrophage. The results obtained from the clinical studies were reproduced at least in pan. for in vivo and in vitro experiments done under the action of AGEs. Platelet activation markers were expressed in diabetic and they also showed NO metabolism and an altered relationship with ET-l. Plasmatic levels of acute reactant phase proteins such as von Willebrand Factor, Fibrinogen and PAI-l were increased and associated with the insulin-resistance condition. Anti-hypertensive drugs such as angiotensin-converting enzyme inhibitor significantly improved the endothelial function and in consequence, may decrease the thrombotic events risk.

Quintana, Irene Luisa. "Acción de la homocisteína sobre el sistema hemostático" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Numerosos estudios epidemiológicos han postulado que concentraciones plasmáticas elevadas de homocisteína (Hcy) constituyen un factor de riesgo independiente para la enfermedad vascular oclusiva, a nivel arterial y venoso. Aún no están esclarecidos los mecanismos fisiopatológicos involucrados en esta asociación. Los objetivos principales de esta tesis fueron: - Evaluar los niveles plasmáticos de Hcy en diversos grupos poblacionales, con un método analítico accesible y confiable. - Analizar determinantes genéticos y adquiridos de la homocisteinemia. - Determinar los valores de corte para homocisteinemia. - Estudiar la asociación de la variante termolábil de la MTHFR con la trombosis. - Evaluar la relación entre hiperhomocisteinemia y componentes del sistema hemostático. - Postular mecanismos responsables de la acción trombogénica de la Hcy. Para la determinación de la homocisteinemia en los estudios epidemiológicos realizados, se utilizó una técnica de ELISA, cuya validación arrojó resultados precisos y equivalentes a los del método de referencia (HPLC). Las muestras más apropiadas para ser analizadas fueron los plasmas en EDTA o los sueros obtenidos con gel separador, comprobándose que los congelamientos y descongelamientos sucesivos no afectan los resultados. Los valores de homocisteinemia de la población de Buenos Aires resultaron comprendidos entre 5,0-19,2 μM (3 a 59 años de edad); 1,2-11,6 μM (neonatos) y 6,0-30 μM (>65 años). Estos resultados no deben considerarse como valores de referencia; por el contrario, en el análisis de valores de corte se determinó que el nivel plasmático óptimo de Hcy debe ser S«12 μM. Se observó una prevalencia elevada de hiperhomocisteinemia (HHcy), sugiriendo que aproximadamente el 50 % de nuestra población estaría expuesta a un mayor riesgo de enfermedad vascular. Los niveles de Hcy se incrementaron con la edad de los individuos y resultaron mayores en los hombres que en las mujeres. Se demostró que existe una estrecha relación entre la homocisteinemia y los niveles de ácido fólico, vitamina B12 y creatinina. En particular, se observó que la restricción dietaria de folatos aumenta significativamente los niveles de Hcy, mientras que una dieta que aporte 400 μg/día de ácido fólico disminuye notablemente la homocisteinemia. Entre los factores genéticos que podrían afectar la concentración de Hcy se estudió el polimorfismo C677T de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). Se observó que sólo la condición de homocigosis de la mutación se asociaría a niveles aumentados de Hcy. La HHcy resultó factor de riesgo independiente para la trombosis venosa, mientras que la presencia T677T/MTHFR no se asociaría a esta patología. En individuos hiperhomocisteinémicos mayores de 65 años se detectaron niveles significativamente aumentados de factor von Willebrand y de dermatán sulfato, probablemente asociados a una disfunción endotelial. Componentes del sistema hemostático tales como las plaquetas, los factores del sistema de coagulación y la fibrinolisis no mostraron alteraciones en presencia de altas concentraciones de Hcy, cuando fueron evaluados mediante pruebas del laboratorio de hemostasia. Sin embargo, en las experiencias de fibrinoformación se evidenciaron efectos importantes de la Hcy sobre la estructura de la red de fibrina. Se obtuvieron redes compactas, gruesas y muy ramificadas, que generarían coágulos más resistentes a la fibrinolisis. En estos resultados estaría involucrado el grupo tiol de la Hcy y uno de los componentes afectados en la fibrinoformación sería el factor XIII. Los hallazgos enunciados constituyen un nuevo aporte para el esclarecimiento de los mecanismos implicados en el efecto trombogénico de la hiperhomocisteinemia.

Abstract:
Several clinical and epidemiological studies have postulated that a high plasma homocysteine (Hcy) concentration is an independent risk factor for occlusive vascular diseases. The precise physiologic mechanisms of Hcy-associated atherothrombosis remain unclear. Main objectives in the present thesis were: - To evaluate plasma Hcy levels with a reliable method in various populations. - To analyze genetic and acquired determinants of homocysteinemia. - To propose homocysteinemia cut-off values. - To study the relation between the thermolabile MTHFR variant and thrombosis. - To evaluate hyperhomocysteinemia-haemostatic system interactions. - To postulate mechanisms involved in the thrombogenic effects associated to Hcy. Validation of an ELISA for the determination of plasma Hcy levels was performed. The method provided reliable data and showed agreement with HPLC. The most adequate samples were EDTA plasmas and serum obtained with gels. Frosting and defrosting procedures did not affect samples’ stability. The population of Buenos Aires showed a range of homocysteinemia between 5.0-19.2 μM (ages 3-59 years); 1.2-11.6 μM (newborns) and 6.0-30.0 μM(> 65 years old). These results must not be considered as reference values. On the contrary, homocysteinemia cut-off was 12 μM. Plasma Hcy concentration increased with age and was higher for male than for female. Homocysteinemia correlated inversely with folic acid and Vitamin B12 levels and positively with serum creatinine levels. Individuals with dietary restriction of folates showed hyperhomocysteinemia; meanwhile a diet providing 400 μg folic acid/day significantly diminished Hcy concentration. Polymorphism C677T of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) study showed an association of the homozygous mutant genotype with increased plasma Hcy. Hyperhomocysteinemia resulted in an independent risk factor for venous thrombosis, but MTHFR677TT would not show an enhancement of the thrombotic events. In elderly hyperhomocysteinemic subjects high factor von Willebrand and dermatan sulphate levels were measured. Probably, these results would be associated to an endothelial dysfunction in this population. Platelets, coagulation factors and fibrinolysis did not seem to be affected by high Hcy concentrations in laboratory tests. However, fibrinformation in vitro studies showed a significant Hcy-associated effect. Fibrin networks were different from control, with shorter, thicker and more branched fibers, resulting in a more compact structure. These changes would make clots more resistant to fibrinolysis. The thiol group would be involved in this effect and probably, factor XIII could be altered. These findings represent a new contribution to the knowledge about mechanisms involved in the thrombogenic effects associated with hyperhomocysteinemia.

Todaro, Laura Beatriz. "Rol de la molécula de adhesión NCAM en patologías neurodegenerativas y neuroproliferativas humanas y experimentales" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La NCAM pertenece a la familia de las inmunoglobulinas siendo su función más conocida la promoción de la adhesión homofílica entre células vecinas, como neuronas, astrocitos y células musculares, y de la adhesión heterofilicas entre estas células y proteínas de las matrices extracelulares. Tiene tres isoformas principales: 120, 140 y 180 kDa. Sólo la NCAM de 120 kDa carece de los dominios citoplasmático y transmembrana y se encuentra unida por anclaje fosfatidilinositol. Una caracteristica de Ia NCAM es presentar cadenas homo poliméricas de ácido siálico (PSA) unidas covalentemente. La expresión de PSA NCAM es muy abundante en el sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario y las primeras etapas postnatales pero en el adulto su expresión disminuye. La presencia de PSA en la NCAM adulta impide la adhesión celular y estimula la remodelación y plasticidad tisular. Además la NCAM puede encontrarse en forma soluble, puesto que se ha descrito su presencia en diferentes fluidos biológicos, proponiéndola como marcador soluble para algunas patologías tumorales como el cáncer de pulmón a células pequeñas y en patologías neurodegenerativas como la esquizofrenia. Nuestro obietivo fue estudiar la relación de la molécula NCAM con procesos tumorales y neurodegenerativas humanos y experimentales. A) Para ello estudiamos la participación de NCAM en el comportamiento biológico de la línea celular LP07, derivada de un tumor de pulmón murino de origen epitelial glandular con componente neuroendocrino. La expresión se evaluó en homogenatos y cultivos primarios tumorales, detectándose distintas isoformas de NCAM,cuya expresión varia a lo largo del crecimiento tumoral. Por otro lado, la disminución de metástasis experimentales con anti NCAM sugiere que esta molécula favorecería la colonización del órgano blanco. El tratamiento de NCAM in vitro con anticuerpos específicos disminuyó la adhesividad, la migración y la proliferación celular al mismo tiempo que induce la reorganización del citoesqueleto de actina compatible con una reversión epitelio mesenquimática, característica de la célula tumoral. B) Hemos estudiado el rol de NCAM sérica como marcadora tumoral en pacientes con patología cerebral benigna y maligna. Para ello en un primera etapa estudiamos por western blot y densitometría los niveles de todas las isoformas de NCAM sérica en individuos sanos apareados por edad y sexo, observando que las isoformas de bajo PM difieren con la edad de los individuos. Determinamos los niveles de las distintas isoformas de NCAM presentes en el suero de pacientes con tumores primarios del SNC: gliomas (n=34), metástasis única (n=27), tumores benignos (n=22). Las muestras de suero de cada paciente se analizaron por western blot y densitometría. La concentración de NCAM se asoció a los parámetros clínico-patológicos indicadores de pronóstico, así como con la evolución clínica de cada paciente. Se detectaron bandas específicas de alto (≥130kDa) y bajo PM (<130kDa). Se encontró que el cociente ≥130kDa /<130kDa está aumentado en los pacientes con tumores cerebrales vs controles sanos (diferencias independientes de edad y sexo). No se encontró diferencia entre pacientes con tumores benignos o malignos NCAM sérico mostró una especificidad del 80% y una sensibilidad del 60%, con un VP+ del 60% y VP- del 80% para identificar pacientes con tumores cerebrales. En una segunda muestra post cirugía fue posible encontrar una disminución de los valores séricos de NCAM en 9 de 12 pacientes analizados. C) Hemos medido los niveles de NCAM sérico en pacientes con déficit cognitivo como la Demencia tipo Alzheimer (DTA). Las patologías neurodegenerativas presentan niveles séricos elevados de todas las isoformas de NCAM. Además se observó un aumento especifico de la NCAM <130kDa asociada al grado de deterioro cognitivo de los pacientes DTA por lo tanto podría ser útil como marcador de seguimiento del paciente, lo cual facilitaría el diagnostico y el tratamiento en etapas tempranas.

Abstract:
NCAM is an adhesion molecule which belongs to the immunoglobulin superfamily and mediates both homophilic binding between neighbour cells like neurons, astrocites and muscular cells; and heterophilic binding between these cells and proteins from the extracellular matrix. NCAM presents three major isoforms: 120, 140 and 180 kDa. Only NCAM 120 kDa is linked to the membrane via a glycosyl-phosphatidyl inositol (GPI) anchor and lacks citoplamic and transmembrane domains. NCAM has sialic acid (PSA) homo polymeric chains covalently bond. PSA NCAM expression is highly expressed in central nervous system during embrionary development and post natal early stages but the PSA expression is down regulated in adult tissues. The presence of PSA NCAM in adults prevents cellular adhesion and stimulates tissular remodelling and plasticity. In addition NCAM exist in a soluble form, since its presence has been described in several biological fluids. Some authors proposed soluble NCAM as a diagnostic marker for tumoral pathologies like small cells lung cancer (SCLC) and neurodegeneratives pathologies including squizofrenia. Our objective was to study the relationship between NCAM molecule and experimental and human tumoral and neurodegenerative processes. A) We study the roll of NCAM in biological behaviour of the cellular line LPO7, derived from a murine lung tumor with neuroendocrine component. The NCAM expression was evaluated in homogenates and tumoral primary cultures. Several NCAM isoforms were detected whose expression varies through tumoral growth. On the other hand, decrease of experimental metastasis with anti NCAM suggests that this molecule is implicated in target organ colonization. In vitro NCAM treatment with specific antibodies diminishes adhesion, migration and cellular proliferation while induces actine cytoskeleton reorganization, compatible with mesenchematic epithelial reversion. B) We have study the roll of serum NCAM as a tumoral marker in patients with benign and malign brain pathology. First, we determine the levels of serum NCAM isoforms in healthy individuals paired by sex and age by western blot and densitometry. Low Molecular Weigh NCAM bands (100-130kDa) decreased significantly with age independently of sex. Then, we determine NCAM isoforms levels in serum from primary brain tumor patients: gliomas (n=34), brain metastsis (n=37) and benign tumors (n=22). NCAM values were associated with clinico-pathological prognostic parameters, as well as clinical evolution of each patient. There were detected specific bands of high (≥130 kDa) and low molecular weigh (<130 kDa). It was observed that the ratio ≥130 /<13O kDa is increased in patients vs control. It was no differences between benign and maligns tumors. NCAM showed a sensitivity of 60% and a specificity of 80%. The PV+ was about 60% and the PV- was 80% for brain tumors patients’ identification. In a post surgery sample we detected decreased serum values of NCAM in 9 of 12 patients. C) We have measure serum NCAM levels in patients with cognitive deficit like Dementia of Alzheimer Type (DAT).DAT patients presented values of all isoforms significantly higher than healthy controls of similar age. Only low molecular weight NCAM isoforms were associated with GDS, which may be useful as follow up marker. This marker would allow the diagnostic and treatment in early stages.

Steinberg, Marcos Wenceslao. "El rol de las proteínas tirosina quinasas ZAP-70 y Syk en la activación de las células T: Estudios preclínicos de terapia génica para la deficiencia en ZAP-70" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas ZAP-70 y Syk componen la familia Syk de tirosina quinasas. Estas dos proteínas presentan secuencias de amino ácidos y estructuras similares, sin embargo ZAP-70 y Syk son reguladas diferentemente en términos de expresión y probablemente de función. En los linfocitos T, estas quinasas intervienen en la diferenciación y la activación celular mediada por el receptor de células T (TCR). En este trabajo hemos sido capaces de realizar un estudio comparativo del rol de ZAP-70 y de Syk en los eventos precoces de señalización via el TCR, utilizando células T primarias y líneas celulares T transformadas expresando separadamente niveles equivalentes de ZAP-70 y de Syk. En dicho estudio demostramos que ZAP-70 y Syk contribuyen de manera diferencial a la señalización vía e TCR, en particular a la fosforilación de la cadena C del receptor. Además, Syk es menos eficaz que ZAP-70 para asociarse al TCR. Nuestro estudio demuestra que Syk funciona de manera diferente a ZAP-70 en la señalización precoz via el TCR. La deficiencia humana en ZAP-70 constituye una forma rara de inmunodeficiencia combinada severa (SCID) caracterizada por la ausencia de células T CD8+ y la presencia de células T CD4+ anormales. Utilizando la terapia génica basada en la transferencia de genes mediada por un vector retroviral, en este trabajo hemos sido capaces introducir el gen wild-type de ZAP-70 dentro de células T CD4+ primarias aisladas de pacientes deficientes en ZAP-70. En las células T CD4+ de pacientes transducidas, la expresión ectópica de ZAP-70 fue suficiente para reconstituir las funciones defectuosas de las mismas. Además, la introduccón del gen wildtype de ZAP-70 dentro de células progenitoras de la médula ósea “lin”, aisladas de ratones ZAP-70 KO, y su posterior transplante en estos mismos ratones, resultó en la reconstitución del desarrollo y las funciones de los linfocitos T CD4+ y CD8+. Nuestros descubrimientos proporcionan una importante información para el establecimiento de protocolos de terapia génica, no solo para la inmunodeficiencia en ZAP-70 sino también para diferentes tipos de inmunodeficiencias primarias.

Abstract:
The ZAP-70 and Syk proteins are the two members of the Syk family of protein tyrosine kinase. These two proteins share important similarities of sequence and structure, however, ZAP70 and Syk differ in terms of expression and probably of function. In T lymphocytes, these kinases are involved in cellular differentiation and activation. In this work, we have been able to compare both tyrosine kinases participation in TCR signaling pathway in human primary T cells obtained from ZAP-70 deficient patients, which expressed important levels of Syk in absent of ZAP-70. In addition, we performed the same study in transformed-T cell lines expressing stable equivalent levels of ZAP-70 and/or Syk. These results demonstrate that upon TCR stimulation, ZAP-70 and Syk differ in their capacity to support C-chain phosphorylation. Moreover, we have shown that Syk is less efficient than ZAP-70 in the association to the TCR. Our results suggest a differential role for ZAP-70 and Syk in the early signaling events after TCR stimulation. The human ZAP-70 deficiency is a rare severe combined immunodeficiency (SCID), characterized by a selective inability to produce CD8+ single positive T cells and a signal transduction defect in peripheral CD4+ T cells. A gene therapy approach may prove to be an alternative treatment for ZAP-70-deficient patients. In the present study we have been able to successfully introduce the wild-type ZAP-70 gene into primary T cells from ZAP-70-deficient infants with a reconstitution of T cell function. Moreover, introduction of the wild-type ZAP-70 gene was into murine ZAP-70ˉ/ˉ hematopoietic stem cells and subsecuent ZAP-70-transduced bone marrow cells transplantation, restored the development and function of CD4 and CD8 T Lymphocytes. Altogether, our studies offer important information to the establishment of new gene therapy-based protocols as an alternative treatment for ZAP-70 and other immunodeficient patients.

Lev, Paola Roxana. "Estudios moleculares de citoquinas relacionadas con fibrosis medular en la trombocitemia esencial" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis con metaplasia mieloide son enfermedades mieloproliferativas crónicas que se caracterizan por aumento de megacariocitos en médula ósea. Los pacientes con TE presentan además, aumento del recuento plaquetario en sangre periférica. Se estudió un grupo de pacientes con TE sin tratamiento y durante la normalización del recuento plaquetario por el tratamiento con anagrelide. En ellos se evaluó el nivel proteico en el plasma y en las plaquetas y el nivel de ARN mensajero intraplaquetario de tres citoquinas relacionadas con el desarrollo de fibrosis medular, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante β (TGFβ) y el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). Se observó un incremento significativo en el nivel plasmático del PDGF que se normalizó con la reducción del recuento plaquetario por el tratamiento. Los pacientes que tenían fibrosis reticulínica leve en la biopsia de médula ósea mostraron mayores niveles de PDGF plasmático con respecto a los pacientes que no tenían fibrosis. Esta citoquina se encontró disminuida en las plaquetas y nuevamente los valores se normalizaron con el tratamiento. A diferencia de los niveles plasmáticos, los intraplaquetarios no se relacionaron con la presencia o ausencia de fibrosis en la médula ósea. El ARN mensajero se encontró disminuido antes y durante el tratamiento. La normalización del nivel plasmático de PDGF durante el tratamiento puede indicar que su incremento en el plasma se debe a liberación plaquetaria. La disminución del contenido intraplaquetario también podría atribuirse a una disminución de su síntesis en el megacariocito dado que se encontró disminuido el ARN mensajero. Los niveles plasmáticos del TGFβ se encontraron aumentados y los intraplaquetarios normales antes y durante el tratamiento y no se encontró relación con la presencia o ausencia de fibrosis reticulínica leve. El ARN mensajero intraplaquetario se encontró aumentado y se normalizó durante el tratamiento. Dado que el nivel plasmático de esta citoquina permaneció elevado aún con recuento plaquetario normal, se buscó la participación de otra fuente celular en este incremento. Se vió por inmunofluorescencia, la presencia de la citoquina en linfocitos y megacariocitos, la intensidad de marcación fue similar a la de los controles normales. Por lo tanto, los megacariocitos y no los linfocitos podrían ser una posible fuente celular causante del incremento plasmático, dado que su número se encuentra elevado en los pacientes con esta enfermedad. Los niveles plasmáticos e intraplaquetarios del bFGF se encontraron aumentados en los pacientes sin tratamiento y si bien disminuyeron significativamente con la normalización del recuento plaquetario, permanecieron aumentados con respecto al control. No se encontró relación con la presencia o ausencia de fibrosis reticulínica leve en la médula ósea. El ARN mensajero de la citoquina se encontró normal. Dado que el nivel plasmático se reduce cuando se normaliza el recuento plaquetario la liberación de esta citoquina podría ser atribuida en parte a las plaquetas. Pero por otro lado, se buscó la participación de otra fuente celular. Se vió por inmunofluorescencia, la presencia de la citoquina en linfocitos y megacariocitos con intensidad de marcación similar a la de los controles normales. Por lo tanto, también en este caso, los megacariocitos y no los linfocitos podrían ser una posible fuente celular causante del incremento plasmático. El aumento de estas citoquinas en el plasma de los pacientes con TE puede sugerir que éstas juegan un rol en la patogenia de la enfermedad. Los niveles del TGFβ intraplaquetarios normales con el aumento de su ARN mensajero y el aumento intraplaquetario del bFGF con el nivel de su ARN mensajero normal puede indicar una desregulación en su síntesis. Por otro lado se estudió el efecto del TGFβ sobre plaquetas normales. Se encontró la presencia de un número bajo de receptores en la membrana plaquetaria y se estudió el efecto de la citoquina sobre la agregación plaquetaria. El efecto del TGFβ sobre la función plaquetaria fue variable dependiendo tanto del tiempo de incubación como de la concentración de ADP utilizada como agonista. Se observó que el TGFβ potencia la agregación plaquetaria tanto en incubaciones de las plaquetas con la citoquina por períodos cortos como por períodos largos utilizando ADP en bajas concentraciones y tiene el mismo efecto cuando se incuban las plaquetas por periodos largos pero se utilizan concentraciones altas de ADP para inducir la agregación. En cambio, produce un efecto inhibitorio cuando las plaquetas se incuban con la citoquina por períodos cortos y se las estimula con concentraciones de ADP altas. En todos los casos el efecto fue leve y se corresponde con el bajo número de receptores encontrado por plaqueta. Las incubaciones de plaquetas con TGFβ in vitro durante tiempos largos podrían semejar situaciones patológicas en donde hay niveles altos de la citoquina durante tiempos prolongados. De esta manera, las plaquetas circulantes están continuamente expuestas a esta citoquina y ante un estímulo plaquetario las mismas responderían en forma incrementada Este sería el caso de la TE. La respuesta inhibitoria observada en tiempos cortos podría indicar un posible mecanismo de regulación negativa de la activación plaquetaria ante un estímulo intenso, en el sitio de injuria. Al estudiar el mecanismo por el cual la citoquina modula la función plaquetaria, se vió que cuando la activación plaquetaria está inhibida, la presencia de la citoquina no induce en forma directa la fosforilación de proteínas en residuos tirosinas. Al evaluar la fosforilación de proteínas durante la agregación plaquetaria inducida por ADP, en presencia de la citoquina, se vió una disminución en la intensidad de dos bandas correspondientes a 100 y 105 kd que estan relacionadas con la agregación. Este efecto se observó sólo al incubar las plaquetas durante 5 minutos en precencia de la citoquina y concuerda con el efecto inhibitorio causado por el TGFβ en la agregación plaquetaria.

Martin, Valentina. "Regulación de la respuesta inmune contra el toxoplasma gondii en la mucosa intestinal y análisis del valor inmunoprofiláctico de antígenos del parásito en el modelo murino" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Toxoplasma gondii, es un parásito protozoario que infecta al hospedador mediante la ingestión oral de quistes tisulares u ooquistes induciendo una respuesta inmune en el intestino y sistémica del tipo Thl, produciendo inmunidad contra una re-infección. La infección experimental oral de diferentes cepas de ratones resulta en dos modelos interesantes de regulación de la respuesta inmune. Los ratones C57BL/6 (H-2b) desarrollan una ileitis inflamatoria aguda (IBD), caracterizada por la sobreproducción de IFN-γ y la síntesis de óxido nítrico en el intestino delgado dentro de los primeros siete días que, dependiendo de la dosis parasitaria inicial, puede producir la muerte debido al proceso inflamatorio. En cambio los ratones C3H/HeJ y CBA/J (H-2k) muestran solo pequeños procesos inflamatorios, cursando una infección aguda normal con establecimiento de la infección crónica. En el presente estudio, se demuestra que los linfocitos intraepiteliales (IELs) primados con antígeno de T. gondii previenen la ileitis aguda en ratones susceptibles (C57BL/6), e in virro reducen la producción de quemoquinas inflamatorias por enterocitos infectados, evento que estaría mediado por el TGF-β que secretan. Los IELs serían un componente esencial en la homeostasis del intestino luego de la infección oral con este parásito. Como un primer acercamiento en el conocimiento de la respuesta que este parásito genera en ratones que cursan una infección aguda normal, se caracterizó la respuesta de la línea celular enterocítica MODE-K (H-2k)frente a la infección para estudiar su valor como modelo in vitro. Estas células mostraron activarse frente a la infección con taquizoitos del T. gondii, secretando un patrón de citoquinas y quemoquinas cuya cinética resulta cepa específica. Los IELs derivados de los ratones CBA/J mostraron reducir la expresión de quemoquinas en los enterocitos infectados, y este efecto fue observado tanto en IELs no primados como primados. Estos IELs de ratones naïve, a diferencia de los provenientes de ratones susceptibles, producirían citoquinas anti-inflamatorias en forma endógena lo cual podría ser un componente importante en la resistencia al desarrollo de la ileitis aguda frente a la infección. La segunda parte de esta tesis estuvo enfocada al estudio de la habilidad de antígenos específicos del parásito de estimular in vitro una respuesta a nivel sistémico y de mucosas luego de una infección oral de ratones susceptibles (C57BL/6) y resistentes (BALB/c

Abstract:
Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that infects the host by oral ingestion of tissue cysts or oocysts, with the induction of a systemic and intestinal Thl immune response resulting in the production of immunity against re-infection. There are two interesting models of the immune response regulation in the experimental oral infection with cysts of different strains of mice. C57BL/6 mice (H-2^b) develop acute inflammatory ileitis (IBD) characterized by the overproduction of IFN-γ and nitric oxide synthesis in the gut after seven days of infection, and depending on the initial parasite-dose this inflammatory response can result lethal. In contrast, oral infection of C3H/HeJ and CBA/J (H-2^k) reveal only mild inflammation in the gut, resulting resistant to the acute phase of the infection with the establishment of the chronic infection. In the present study, we report that T. gondii antigen-primed intraepithelial lymphocytes (IELs) prevent the acute ileitis in C57BL/6 susceptible mice, and in vitro, reduce the production of inflammatory chemokines by infected enterocytes, event that would be mediated by TGF-β secretion. IELs could be an essential component in the gut homeostasis after oral infection with this parasite. As a first attempt to study the immune response induced by this parasite in mice resistant to the acute infection, we have characterized the response elicited by the infection of the enterocyte cell line MODE-K (H-2^k)to evaluate its value as an in vitro model. Infection with T. gondii tachyzoites induced the activation of these cells, with the secretion of a cytokine and chemokine pattem with a strain-specific kinetics. Both unprimed and antigen-primed IELs isolated from CBA/J mice reduce chemokine expression by infected enterocytes. These IELs from naïve resistant mice, in contrast to the IELs from naïve susceptible mice, would produce endogenous anti-inflammatory cytokines that could result in an important component in the resistance to acute ileitis after infection. The second part of this thesis, has been focused on the study of the ability of specific parasite antigens in stimulating in vitro a systemic and mucosal response in orally infected susceptible (C57BL/6) and resistant (BALB/c

Boggiano, César. "Uso de bibliotecas sintéticas combinatorias para el desarrollo de vacunas y antirretrovirales para el tratamiento y prevención del SIDA" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el año 2002, 3 millones de personas murieron como consecuencia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y se estima que 5 millones se infectaron con el virus de la inmunodeficiencia adquirida humana (HIV). Hasta la fecha no existe un tratamiento que pueda erradicar la infección en todos los pacientes HIV+ y tampoco una vacuna efectiva profiláctica o terapéutica. Las bibliotecas sintéticas combinatorias (BSCs) son colecciones de compuestos orgánicos, peptidomiméticos o peptídicos. Debido a su alta complejidad (miles a millones de compuestos diferentes) son excelentes herramientas para la identificación de compuestos capaces de alterar diferentes eventos biológicos. En primer lugar, se estudió la capacidad de las bibliotecas de inhibir el primer evento del ciclo replicativo de HIV-1, adsorción y entrada, en un sistema de fusión de membranas dependiente de HIV-1 Env y receptores celulares. Los compuestos individuales derivados de bibliotecas de piperazinas y triaminas, mostraron actividad inhibitoria de la fusión aunque con elevada toxicidad. También se identificaron D-decapéptidos capaces de inhibir en el rango micromolar, la replicación de cepas de laboratorio HIV-1 y un aislamiento clínico resistente a AZT. El mecanismo inhibitorio de la replicación involucra la entrada viral. Además, se descubrieron compuestos antagonistas de la quiomiotaxis inducida por SDF-1α en células CXCR4+, aunque este mecanismo no parece estar involucrado en la inhibición de la replicación. Por otra parte, una BSC de L-nonápeptidos fue utilizada para identificar inmunógenos naturales y sintéticos específicos para un clon de células T citotóxicas derivadas de un paciente HIV+. Se identificaron superagonistas capaces de estimular no sólo el clon original mejor que el péptido natural (Gag77-85), sino también clones con la misma especificidad aislados de otro paciente HIV+. También se identificaron por primera vez, secuencias derivadas de virus heterólogos que son capaces de estimular un clon específico para HIV-1 Gag77-85.

Schere Levy, Carolina P.. "Búsqueda de factores involucrados en el origen y la evolución de tumores mamarios murinos, su relevancia enla biología de la mama normal : participación del LIF en estos procesos" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus del tumor mamario murino (MMTV),es un retrovirus de tipo B que induce el desarrollo de tumores de mama, en ratones suceptibles a la infección, mediante mutagénesis insercional en genes de células somáticas. En este trabajo se utilizaron ratones de la cepa BALB/c infectados con la variante viral MMTV(LA),la cual fue encontrada previamente en nuestro laboratorio. Se ha descripto anteriormente que los ratones infectados con esta variante viral, poseen una incidencia de tumores de mama del 90%. Estos tumores presentan inicialmente un crecimiento preñez-dependiente (HD)que luego se independiza del control hormonal para mostrar un fenotipo hormono-independiente (HI). Para determinar si el compartimiento lobulo-alveolar es o no un factor relevante en la inducción de tumores por el MMTV(LA),se infectaron crías transgénicas WAP-TGFβ1 con esta variante viral mediante el amamantamiento utilizando madres infectadas con el virus. Estos ratones transgénicos expresan TGFBl bajo el control del promotor de la proteína WAP. Este promotor pertenece a una proteína de la leche abundante en murinos, es específica del epitelio mamario y se activa principalmente durante la preñez tardía y la lactancia. Ha sido demostrado previamente, que las hembras transgénicas para WAP-TGFβ1 son incapaces de amamantar a sus crías. Esto se debe a que la sobre-expresión de este factor durante la preñez, desencadena un incremento de la apoptosis en las células alveolares responsables de la producción y secreción de leche. Otra consecuencia de la expresión del transgen es la senescencia prematura de las células progenitoras (stem cells) mamarias, puesta en evidencia por la pérdida de la capacidad clonogénica de las mismas. Los resultados obtenidos en el presente trabajo indican que la actividad pro-apoptótica del TGFβ1 sobre las células lobulo-alveolares mamarias, no redujo la capacidad tumorigénica del MMTV(LA). Por otro lado, encontramos que la infección de las hembras WAPTGFβ1 con el MMTV(LA)revirtió la senescencia prematura de las células progenitores inducida por el transgen. El hecho que la infección con MMTV induzca el restablecimiento de la capacidad clonogénica de las “stem cells” mamarias transgénicas, sugiere que un evento temprano de la oncogénesis inducida por este vian podría ser la inmortalizaciónde las células progenitoras mamarias. Estos resultados (junto con los reportados por otros autores) sugieren que las "stem cells" mamarias podrían ser un blanco preferencial para la actividad oncogénica del MMTV. Esto implicaría un origen y crecimiento clonal para estos tumores. En relación con esta hipótesis se estudió, por análisis de Southern blot, el DNA de las inserciones virales exógenas en los pasajes de tumores mamarios inducidos por MMTV(LA). Estos experimentos se basan en el hecho que sólo puede encontrarse un patrón de bandas especifico y estable del DNA viral en todos los pasajes tumorales, si los tumores originales poseen un origen clonal u oligoclonal. El análisis de los resultados de 17 líneas tumorales in vivo generadas por pasajes singenéicos, muestran que los tumores HD se originan frecuentemente a partir de distintas células mamarias infectadas, mientras que los tumores HI surgen a partir de una sola célula. En todos los casos analizados, se encontraron nuevas inserciones de MMTV(LA) durante la progresión de tumores policlonales HD a tumores monoclonales HI. Por lo tanto, en este modelo, la progresión tumoral se produce asociada al surgimiento de clones que contienen inserciones ausentes o minoritarias en los tumores HD originales. Se ha reportado que la expresión del LIF tanto en el útero como en algunas líneas celulares de cáncer de mama puede ser regulada por estrógeno y progesterona. Sin embargo, no existían evidencias en la literatura sobre la expresión ni la actividad del LIF en la glándula mamaria normal. Por otro lado, se conoce bien que la presencia del LIF es necesaria para mantener a las “stem cells" embrionarias en estado pluripotente. Dado que la glándula mamaria está regulada por hormonas ováricas y que existen células progenitoras mamarias especificas involucradas en el desarrollo mamario normal y tumoral, nos propusimos investigar la participación del LIF en la biologia de la glándula mamaria. Nuestros resultados muestran que este factor se expresa durante el desarrollo de la glándula mamaria del ratón en mamas de hembras vírgenes y preñadas. Sin embargo, hallamos que su expresión máxima se induce durante la fase temprana de la involución mamaria postlactancia. En esta etapa, se habia demostrado que la acumulación de la leche causada por la falta de succión induce la liberación de factores locales que desencadenan la activación del factor de transcripción Stat3 y apoptosis del epitelio mamario. Aunque se sabía que dicho factor cumple un rol fundamental en desencadenar apoptosis durante esta fase, se desconocian los factores involucrados en su activación. Los resultados mostrados aquí indican que el LIF se libera como un factor local durante la fase temprana de la involución debido a la acumulación de la leche en la mama e induce apoptosis en el epitelio. Además detenninamos que el LIF es capaz de inducir la activación de Stat3 en el epitelio mamario in vivo. Por otro lado, nuestros resultados muestran que todos los tumores mamarios inducidos por MMTV(LA) poseen altos niveles de expresión de LIF y de activación de Stat3 y sugieren que el primero sería al menos parcialmente responsable de la activación del segundo. Si bien hemos encontrado el rol biológico de este camino de señalización (LIF-Stat3) en la glándula mamaria normal, queda todavía por dilucidar la significancia de este mecanismo en los tumores mamarios. En conclusión, los resultados presentados aquí refuerzan la idea que las células pluripotenciales y los factores asociados a prevenir su diferenciación, pueden cumplir un rol relevante en la biología de la glándula mamaria normal y tumoral.

Abstract:
Mouse mammary tumor virus (MMTV) is a type B retrovirus that causes mammary tumors in susceptible mice by insertional mutagenesis. In the present work it has been used the MMTV(LA),which has been first found in our laboratory. It has been previously showed that mice infected with this variant have a mammary tumor incidence of 90%. These tumors initiain show a hormone-dependent (HD) behavior, but evolve afterwards to a hormone-independent (HI)phenotype. In order to determine whether or not the mammary gland lobulo-alveolar compartiment is relevant for MMTV(LA)-induced tumorigenesis, WAP-TGFβ1 transgenic mice were nursed with MMTV(LA) infected mothers. This transgenic mice, express TGFβ1 under the control of the whey acidic protein (WAP) promoter. This promoter corresponds to a compicuos murine milkprotein, is mammary epithelium-specific and most active during late pregnancy and lactation. It has been demonstrated that TGFβ1 transgenic female mice are unable to lactate. This is because the ectopic expression of this factor in the lobular compartment of the mammary gland during pregnancy induces an increased rate of alveolar apoptosis. Another consequence of the WAP-TGFβ1 transgene expression is the premature senescence of the mammary specific epithelial stem cells manifested in a significant decreased capacity of WAP-TGFβ1 mammary transplant to grow and repopulate a cleared normal fat pad. The results showed herein indicate that WAP-TGFβ1 expression and the consequent lower number of lobulo-alveolar cells in the transgenic animals did not abrogate MMTV(LA) capacity to induce mammary tumors. On the other hand, we have found that MMTV(LA) infection reverted the proviously observed early senecence of WAP-TGFβ1 transgenic mammary epithelium. Since MMTV infection induces a recovery in the clonogenic capacity of the transgenic mammary stem cells, it raises the possibility that mammary stem cells inmortalization would be an early event in MMTV(LA)induced tumorigenesis. Our results show that mammary stem cells could be a preferencial target for MMTV-induced tumorigenesis. This implies a clonal origin for these tumors. Then, to test this hypothesis, Southern blot analysis of MMTV insertions in tumor cell DNA was performed. These studies were carried out based on the fact that a specific and reproducible pattem of bands can only be found in a mono or oligoclonal cell populations. Analysis from 17 tumor lines generated from pregnant MMTV(LA) infected females indicated that HD tumors frequently arise from different mammary infected cells while all HI tumor variants arise from a single cell. In all the cases analyzed herein, new MMTV(LA) insertions were found during progression from policlonal HD to monoclonal HI tumors. It has been reported that leukemia inhibitory factor (LIF) expression could be regulated by estrogen and progesterone in uterus and in some mammary tumor cell lines. However, there were no reports about LIF expression or activity in the normal mammary gland. On the other hand, it is very well known the importance of the LIF presence in order to maintain pluripotent embryonic stem cells. Since mammary gland is regulated by ovaric hormone and there are mammary specific stem cells involved in normal and neoplastic development. We decided to investigate LIF participation in the mammary gland biology. Our results show that LIF is expressed during mammary development in Virgin and pregnant females. However, LIF expression picks shortly after weaning during the early phase of mammary involution. It has been demonstrated that during this period, milk stasis caused by the lack of suckling results in the induction of local factors that lead to the activation of Stat3 transcription factor and mammary epithelium apoptosis. The results presented herein demonstrate that LIF is secreted as a mammary local factor in response to milk stasis and induces mammary ephitelium apoptosis. Moreover, we also demonstrate that LIF induces Stat3 phosphorylation in the mammary gland in vivo. On the other hand, we have found high LIF expression and Stat3 activation in all the MMW(LA) induced HD and HI mammary tumors and our results suggest that LIF would be at least partialliy responsible of that activation. While the biological role of this pathway in the nomal mammary gland has been very reciently uncover, its significance in mammary neoplastic glands remains to be elucidated. In conclusion, the results showed herein support the relevant role of mammary stem cells and factors possibly associated with the prevention of their differentiation, in the biology of normal and neoplastic mammary gland.

Sinner, Débora Inés. "Efecto de prostaglandinas, óxido nítrico y endotelina-1 sobre el metabolismo y desarrollo del embrión en oncogénesis durante la gesta diabética" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El entorno diabético durante la preñez provoca alteraciones en el desarrollo del embrión, sin embargo los mecanismos subyacentes no han sido totalmente clarificados. En este trabajo hemos analizado los efectos de algunos agentes vasoactivos, sobre el desarrollo y metabolismo del embrión de rata durante la organogénesis en dos modelos diferentes de diabetes inducida por estreptozotocina. Ambos modelos presentan anomalías morfológicas y retardo en el crecimiento embrionario, siendo más severo el cuadro en el modelo de diabetes tipo l. En el embrión de rata diabética tipo Il, se hallaron niveles incrementados de Endotelina 1 (ET-1) y de Oxido Nítrico (NO), compuestos que se regulan negativamente entre sí. En forma diferente el embrión de rata diabética tipo 1, presenta niveles disminuidos de ET-1 e incrementados de NO, y no existe modulación entre ambos compuestos. A su vez, estos embriones presentan anomalías en el contenido y la producción de prostaglandina E2 (PGE2) debido a alteraciones en el transporte de dicho prostanoide. La síntesis de lípidos embrionarios es un mecanismo activo, proceso que se encuentra alterado en el embrión de rata diabética, siendo dicha anomalía más severa en el modelo tipo 1, la cual es revertida por acción de PGE; y acentuada por 15 deoxi delta 12,14 prostaglandina J2 (agonista del receptor nuclear PPARγ), ambos moduladores del metabolismo lipídico. Los resultados permiten afirmar que, en respuesta al grado de severidad del entorno materno diabético, se afecta la síntesis, producción y regulación de agentes vasoactivos que alteran en forma directa el desarrollo del embrión.

Abstract:
During pregnancy, diabetic milieu induces anomalies on embryonic development, although underlying mechanisms still remain unclear. In this work we have analyzed the effects of vasoactives agents on embryonic development and metabolism during organogenesis in two different models of diabetes induced by streptozotocin. Both models show morphological anomalies and delayed embryonic growth, being this condition worse in diabetes type 1. Increased levels of Endothelin-1 (ET1) and Nitric Oxide (NO) were found in embryos from diabetic type II rats, where there is a negative modulation between both agents. Differently, embryos from diabetic type I rats show diminished levels of ET-1 and increased levels of NO and no modulation between both compounds. In addition, these embryos show anomalies in embryonic levels and production of Prostaglandin E2 (PGE2) because of the transport alterations of this prostanoid. Embryonic lipid synthesis is an active mechanism, that is impaired in diabetic embryo, being more severe in type 1 model. This alteration is reverted by PGE2 and accentuated by 15 deoxy delta 12,14 prostaglandin J2. (an agonist of nuclear receptor PPARγ), both modulators of lipid metabolism. This results let us to state that, according to severity of maternal diabetic milieu , synthesis, production and regulation of vasoactive agents are affected, altering directly the normal embryonic development.

Raimondi, Ana Rosa. "Relación epitelio-conectivo en la carcinogénesis experimental bucal: variaciones de ploidía epitelial en relación a la expresión del factor de crecimiento fibroblástico-básico y fibrosis" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El modelo de la bolsa de la mejilla del hámster muy aceptado y utilizado, reproduce la cancerización de la boca humana y una fibrosis subepitelial semejante a la fibrosis de la submucosa. En el se han analizado extensamente las características de los tumores que produce, pero se ha prestado menos atención al estudio de las etapas previas a la aparición de tumores. Las neoplasias que se observan en el modelo se dan en forma focal, precedidas por lesiones pre-malignas muitifocales, en una clara manifestación de la instalación de un campo cancerizado al igual que en la boca humana. Dado que el carcinoma de la mucosa bucal ha mantenido su incidencia y sus bajos índices de sobrevida durante los últimos 20 años parece importante disponer de un modelo experimental bien caracterizado para su estudio. Aproximadamente el 90% de los cánceres humanos son carcinomas, por lo cual resulta de interés que el abordaje del estudio de la biología de los carcinomas sea desde la perspectiva de la interacción epitelio-mesénquima. En base a estas observaciones, el objetivo de esta tesis doctoral fue el de estudiar los cambios que subyacen a la transformación maligna del epitelio, a través del análisis de ploidía y la desregulación de la interacción epitelio-conectivo, caracterizándola por medio del estudio de los cuadros fibrosos subyacentes al epitelio transformado. Tratando de aportar datos que pudieran ser trasladados a la biología de las lesiones pre-malignas humanas y a la búsqueda de marcadores de cancerización de campo. Para ello describimos las áreas NUMF(epitelios histológicamente normales pero cancerizados) que configuran los cuadros propios de la cancerización de campo. Como primer paso en el estudio de la interacción epitelio-conectivo evaluamos a través del análisis de ploidía las alteraciones epiteliales, cuantificamos las áreas NUMF, pre-neoplásicas y neoplásicas, encontrando que las zonas NUMF presentan un mayor contenido de ADN respecto de la mucosa normal a las 16 semanas de tratamiento. Para analizar las alteraciones en el tejido conectivo caracterizamos los cuadros desmoplásicos a través de la cuantificación de las áreas de fibrosis. Encontramos que la fibrohilalinosis aparece muy precozmente, antes que se evidencien cambios morfológicos en el epitelio transformado (a las 7 semanas de tratamiento, subyacente a las áreas NUMF) se presentan volúmenes de fibrosis aumentados significativamente respecto de la mucosa normal. Luego analizamos la expresión del FGF-2 durante el proceso, tratando de relacionado con los cuadros fibrosos. Encontramos que las variaciones en la expresión del FGF-2 en el tejido epitelial coinciden con la evolución de la fibrosis subepitelial en las etapas tempranas y que los carcinomas expresan en muy baja cantidad el factor o no lo expresan (se observó una regulación a través de la isoforma de 18 kd del factor). Encontramos expresión de los receptores 2 y 3 del FGF en el tejido epitelial y conectivo en las lesiones pre-malignas y expresión irregular de los mismos en los tumores. Finalmente analizamos si existía expresión de VEGF en el modelo. El VEGF presentó un cambio de su patrón de expresión en el epitelio en relación a los cuadros fibrosos durante las etapas pre-neoplásicas. También estudiamos si existia actividad proteolítica, encontrando un patrón de actividad correspondiente al de las MMP-2 y 9 en las etapas tempranas. El análisis conjunto de los resultados expuestos en esta tesis nos lleva a considerar que ni el b-FGF ni el VEGF tendrían un rol preponderante en el proceso angiogénico general de este modelo, ni en los tumores, pero el b-FGF tendrían un rol importante en la producción de fibrosis, de gran magnitud en las etapas tempranas. Tanto el factor como los cuadros desmoplásicos disminuyen desde las etapas intermedias en adelante, revelando su influencia en la disrupción temprana de la interacción epitelio-conectivo. Por lo tanto, la fibrosis junto a la ploidía de las áreas pre-neoplásicas son una manifestación temprana de la cancerización de campo.

Abstract:
The hamster cheek pouch carcinogenesis model is universally accepted and wider employed as a model of human oral cancer. It closely mimics human oral carcinogenesis and exhibits a subepithelial fibrosis that resembles the fibrosis of the submucosa. The tumors that develop as a result of the carcinogenesis protocols have been extensively studied. However, the earlier stages of malignant transformation have been less studied. Foci of neoplastic growth are preceded by multifocal premalignant lesions that evidence the presence of field cancerized tissue as occurs in the human oral cavity. Given that the incidence and low survival rate of oral carcinoma have remained unchanged over the last 20 years, a well characterized experimental model to study the different aspects of this pathology is of great value. Approximately 90% of all human cancers are carcinomas. Within this context it is interesting to address carcinoma biology from the viewpoint of epithelium-mesenchyma interactions. Based on these observations, the aim of the present PhD Thesis was to study the changes that underlie epithelial malignant transformation employing ploidy analysis and the evaluation of the deregulation of the interaction between epithelium and connective tissue. We characterized this interaction by evaluating the fibrosis that underlies the transformed epithelium. The particular aim was to contribute data that may be applied to the biology of human precancerous lesions and search for markers of field cancerization. Within this context we described NUMF areas (histologically normal but cancerized areas of epithelium), characteristic of field cancerization. As the first stage in our study of epithelium-connective tissue interactions we performed a ploidy analysis of the different areas of epithelium, i.e. NUMF, pre-neoplastic and neoplastic epithelia. We showed that the DNA content of NUMF epithelium at 16 weeks of treatment was larger than that of normal epithelium. We analyzed the changes in connective tissue in terms of desmoplastic features by quantitative evaluation of areas of fibrosis. We demonstrated that fibrohyalinosis appears very early on in the process of malignant transformation before the morphological changes become apparent in the transformed epithelium. At 7 weeks of treatment significantly larger volumes of fibrosis were detected underlying NUMF areas than those underlying normal tissue. We also analyzed the expression of FG-2 during the process and the association with fibrosis. We found that variations in the expression of FG-2 in epithelial tissue correlate with the evolution of subepithelial fibrosis in the early stages and that carcinomas express the factor very little or not at all (we observed regulation via the 18 kd isoform of the factor). We detected expression of receptors 2 and 3 of FG-2 in the epithelium and the connective tissue in precancerous lesions and irregular expression in tumors. We also examined the expression of VEGF in the model. VEGF evidenced a change in its expression pattern in the epithelium above areas of fibrosis that appear during the preneoplastic stages. The analysis of proteolytic activity revealed patterns of activity corresponding to MMP-2 and 9 in the early stages. A comprehensive analysis of the data presented in the present Thesis suggests that bFGF and VEGF do not play a central role in angiogenesis in this model or in tumors. bFGF would have an important role in the induction of fibrosis, a process which is particularly important in the early stages. Both the factor and the desmoplastic features decrease from the intermediate stages onwards, revealing their influence on the early disruption of the interaction between epithelium and connective tissue. In this way, fibrosis and ploidy in preneoplastic areas would be an early manifestation of field cancerization.

Agote Robertson, Marcos. "Modulación de la función tiroidea por radiación y factores de crecimiento" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El trabajo de investigación realizado en la presente tesis doctoral tuvo dos objetivos principales: l. la investigación de la posible aplicación de radiosensibilizadores en el tratamiento del cáncer de tiroides o el hipertiroidismo, con radioiodo. 2. Elucidar el rol de las diferentes isoformas del TGF-β en la regulación de la función y proliferación celular tiroidea en células normales y tumorales con distintos grados de diferenciación y la variación de su expresión durante la evolución y prevención del bocío. Los resultados pueden resumirse de la siguiente manera: l. Estudios in vivo en ratas normales y bociosas demostraron que la administración de nicotinamida incrementó la radiodestrucción de la tiroides causada por el 13l-I. Esta acción radiosensibilizadora no está relacionada con mecanismos de poli-ADP ribosilación de proteínas nucleares, proceso involucrado en la reparación del ADN dañado. La nicotinamida produjo un incremento del flujo sanguíneo tiroideo y por lo tanto, postulamos que esto a su vez incrementaría la oxigenación tisular, aumentando asi la producción de radicales libres, altamente dañinos para las células. Para confirmar esta última hipótesis, fueron analizadas las actividades de diversas enzimas y la concentración de algunos compuestos relacionados con el metabolismo de los radicales libres. Nuestros resultados demuestran que la administración de nicotinamida y radioiodo causa un aumento significativo en la producción de peróxidos orgánicos y en la expresión de la eNO sintasa. No ocurrió lo mismo con las actividades de SOD (superóxido dismutasa), catalasa y glutatíón peroxidasa. Estos resultados abren la posibilidad de la utilización de la nicotinamida como radiosensibilizador de la acción del radioiodo en las terapias antitiroideas. 2a. Estudios in Vitro Las 3 isofonnas del TGF-β causaron una inhibición de magnitud similar en la proliferación de células normales tiroidas de la línea FRTL5. Un incremento progresivo a la resistencia a esta acción inhibitoria encontramos en las líneas tumorales, de acuerdo con el grado creciente de pérdida de funciones diferenciadas tiroideas: cáncer tiroideo folicular humano (WRO) < cáncer papilar humano(NPA) < cáncer tiroideo indiferenciado humano (ARO). Notamos, asimismo que las isoformas 2 y 3 son más potentes, en líneas generales, que la l. 2b. Estudios in Vivo La expresión de la proteína TGF-β3 se incrementó a medida que evolucionaba el bocio. La administración simultánea de 6-iodo-delta lactona del ácido araquidónico inhibió la formación del bocio ydisminuyó la expresión del TGF-β3. La inyección de ioduro de potasio en conjunto con un inhibidor de la peroxidasa tiroidea, mostró que no redujo la formación del bocio ni la expresión de la isoforma 3. Per se, ni el ioduro ni la iodolactona alteraron los niveles de expresión del TGF-β3 Estos resultados confirman el rol de la iodolactona en la autorregulación tiroidea y nos permiten descartar un rol para el TGF-β3 en este mecanismo.

Abstract:
The research work performed in the present Doctoral Thesis deals with two main objectives: l. to investigate the possible applicaction of radiosensitizers in the treatment of thyroid cancer and hyperthyroidism with radioiodine. 2. To clarify the role of the isoforms of TGF-β in the regulation of thyroid cell proliferation and function in normal and tumoral cells with distinct degrees of undifferentiation, and the variations of their expression in the course of goiter induction and involution. The results obtained can be summarized as follows: l. In vivo studies in rats demonstrated that the administration of nicotiamide to normal rats increase the degree of thyroid ablation produced by different doses of 131-I. Similar results were obtained with rats bearing goiter induced by the previous administration of a goitrogen. The radiosensitizing action of nicotinamide is not related to the inhibition of poli-ADP ribosylation of nuclear proteins, a biochemical pathway involved in DNA repair. Nicotinamide produced a very significant increase in thyroid blood flow, and therefore we postulated that this would in turn increase tissue oxygenation, thereby causing a greater production of free radicals, responsible for the greater tissue damage. In order to explore this latter hypothesis the activities of varios enzymes and compounds related to feer radical metabolism were assayed. Our results demonstrated that simultaneous administration of nicotinamide and radioiodine caused a significant increase in the production of organic peroxides and the acitivty of the eNO synthase. No significant changes were observed in SOD (superoxide dismutase), catalase and glutathion peroxidase. These results open the possibility of applying the simultaneous use of radioiodine and nicotinamide to clinical trials. 2a. In Vitro Studies The three isoforms of TGF-β caused a similar degree of inhibition of normal thyroid cell proliferation (FRTL5). A progressive increase in the resistance to this effect was observed as the degree of undifferentiation increased: human thyroid follicular cancer (WRO) < human papillary cancer (NPA) < undifferentiated thyroid cancer (ARO). A tendency to show that isoforms 2 and 3 are more potent inhibitors than the isoform l was observed. 2b. In Vivo Studies The expression of the protein of TGF-β3 was increased during goiter induction. The simultaneous administration of 6-iodo-delta lactone of arachidonic acid inhibited goiter growth and decreased the expression of TGF-β3. The injection of iodide plus a blocker of iodide organification, showed no significant action on both goiter growth and TGF-β3 expression. Neither iodide nor iodolactone by themselves caused a significant increase in the expression of TGF-β3 These results confirm the role of iodolactone in thyroid autoregulation and allow us to discard the participation ofTGF-β3 in this mechanism.

Alemán, Mercedes. "Papel de los polimorfonucleares neutrófilos en el proceso inflamatorio crónico de la tuberculosis : efecto del Mycobacterium tuberculosis y mecanismos involucrados" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La tuberculosis (TB) es una enfermedad inflamatoria crónica causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Al comienzo de una infección por micobacterias, la activación de las células de la inmunidad innata (linfocitos Natural Killer (NK), Tγδ y polimorfonucleares neutrófilos (PMN), asi como las citoquinas (CK) secretadas por ellas, influencian y modulan el curso de la reacción inflamatoria. Los PMN participan en la formación del granuloma, precediendo a los monocitos en las áreas de inflamación granulomatosa, liberando quimioquinas (QK) que atraen a los monocitos activándolos indirectamente. A pesar de que, durante el curso crónico de la TB humana, la respuesta inflamatoria se caracteriza por un infiltradode monocitos-macrófagos en el sitio de infección pulmonar, a medida que la enfermedad avanza se puede observar un elevado número de PMN en el lavado broncoalveolar (BAL)que se correlaciona con el contenido de interleuquina (IL)-8 en pulmón. Esta CK, cuya producción por el macrófago es inducida por interleuquina (IL)-1β y factor de necrosis tumoral (TNF)-α, podria inducir a su vez la secreción de otras CK por el PMN. Por otra parte, se ha demostrado que, dentro de las lesiones pulmonares, los PMN son capaces de matar a la micobacteria. Luego de arribar al foco inflamatorio, los PMN subyacen a la muerte. Esto puede ocurrir por dos mecanismos de muerte: 1) necrosis: donde la liberación del contenido citoplasmático al medio extracelular provoca una respuesta de tipo inflamatoria, 2) apoptosis: donde la membrana permanece intacta, de manera que los neutrófilos son removidos por los macrófagos sin liberar su contenido. Además, cuando los macrófagos ingieren células apoptóticas, no liberan mediadores pro-inflamatorios pero si en cambio moléculas de acción anti-inflamatorias. Por otra parte, los PMN apoptóticos pierden previamente la habilidad de degranulación, fagocitosis, estallido respiratorio y quimiotaxis. Por eso, si bien los PMN juegan un rol central en la defensa contra microorganismos infecciosos, la presencia de estas células en el pulmón puede contribuir a la injuria tisular local y en este contexto, la muerte del PMN por apoptosis, representa un mecanismo que permite su reconocimiento e ingestión por los macrófagos residentes, limitando asi el daño tisular que genera el marcado influjo de PMN durante el curso de una infección bacteriana. El objetivo de este trabajo fue estudiar el estado de activación de los PMN circulantes en pacientes con TB (TB-PMN) y su posible contribución a la fisiopatología de esta enfermedad. Por otra parte, sabiendo que muchas funciones que dependen de la activación del PMN generan en éste señales intracelulares, que estarían asociadas a la inducción del proceso apoptótico en los PMN, estudiamos la apoptosis en los PMN circulantes y el proceso apoptótico espontáneo e inducido por Mtb in vitro evaluando a su vez los mecanismos involucrados en este fenómeno y las señales intracelulares que participan. Por último, para corroborar los experimentos in vitro, evaluamos los mismos parámetros en líquidos pleurales de pacientes con TB y patologías no relacionadas. Los resultados demuestran que: ▪ Los polimorfonucleares neutrófilos circulantes de pacientes con TB (TB-PMN), tienen aumentada la expresión del receptor para la fracción constante de la inmunoglobulina G (FcγR)-IIIB(CD16) y el receptor para TNFα de 55 kD (TNF-R55). A su vez se observó la expresión del FCγRI (CDG4)que no se expresa constitutivamente en PMN. En concordancia con el aumento en la expresión de los receptores CD16 y CD64, las funciones que de ellos dependen tales como citotoxicidad mediada por complejos inmunes (Cx-CI) y citotoxicidad dependiente de anticuerpos (CCDA), también se hallaron aumentadas en los TB-PMN. ▪ Por otra parte, en los TB-PMN la liberación de anión superóxido fue inducida a concentraciones quimioatractantes del péptido formilado FMLP. Estos resultados sugieren que los PMN de los pacientes con TB se encuentran activados y liberando intermediarios reactivos del oxigeno, fuera del sitio de infección. Por lo tanto la activación de los PMN en sangre periférica observada en los pacientes, puede ser considerada como una inflamación sistémica, contribuyendo a la fisiopatología del proceso crónico inflamatorio en tuberculosis. ▪ En circulación los PMN de los pacientes con TB no presentan signos de apoptosis. Los TB-PMN tienen mayor expresión de los receptores CD16 y CD11b, ambos son parámetros indicativos de la activación del PMN. ▪ Los TB-PMN presentan una apoptosis espontánea aumentada que se correlaciona con la pérdida espontánea del receptor CD16 en cultivo (marcador de apoptosis en PMN). La marcada apoptosis espontánea podria explicarse por la mayor expresión en membrana de la proteína pro-apoptótica Fas y una menor expresión de la proteina anti-apoptótica bcl-2 en citoplasma. ▪ Mtb activa a los PMN in vitro incrementando la expresión de CD11b tanto en N- como en TB-PMN y dicha activación aceleraría el proceso apoptótico in vitro. Más aún, observamos que los PMN activados se ubican en una zona de mayor tamaño celular y mayor expresión de CD11b. Este hecho, nos permite postular que la mayor apoptosis espontánea observada en los TB-PMN, podría deberse al estado de activación que in vivo presentan los PMN de pacientes con TB. ▪ La apoptosis inducida por Mtb en los TB-PMN está inicialmente retrasada. Este hecho se correlacionó con la conservación del receptor CD16 y una mayor producción de IL-8. A períodos mas prolongados, Mtb aceleró significativamente la apoptosis en los pacientes. ▪ El componente del Mtb causante del efecto apoptótico, no seria manLAM ni estaría presente en el el lisado total bacteriano de la cepa virulenta Rv utilizada en este trabajo, ya que no indujeron apoptosis comparable con la bacteria entera. El efecto pro-apoptótico del Mtb ocurre aún a relaciones no fagocíticas (Mtb:PMN, 1:3). Por lo tanto, el Mtb entero dispararía el proceso apoptótico sin necesidad de ser fagocitado. ▪ La apoptosis no está mediada por el TNFα endógeno y no involucra al receptor CD11b. ▪ La apoptosis inducida por Mtb en TB-PMN es dosis dependiente. A pesar de que la fagocitosis de la bacteria induce el proceso apoptótico en PMN, nosotros mostramos que la apoptosis es inducida también a bajas relaciones Mtb:PMN(1:3). Por Io tanto, La apoptosis inducida por Mtb ocurriría mediante la interacción de la bacteria con un receptor diferente del CD11b sin mediar fagocitosis. ▪ Analizamos la activación de ciertas kinasas tales como mitogen-activated-protein-kinasa (MAPK)p38 que en los PMN estaría asociada tanto a la activación celular como al proceso apoptótico y extracelullar-signal-regulated kinase (ERK) ERK1/2 asociada a la sobrevida. Observamos que p38 MAPK participa en la apoptosis mediada por Mtb, pero no en la apoptosis espontánea. Por otro lado, la activación de ERK sería necesaria para prevenir el proceso apoptótico ya que al inhibirla se indujo un aumento en la apoptosis. Esto hecho, podría deberse a la anulación de alguna señal anti-apoptótica que actúa por esta vía, como por ejemplo la IL-8. ▪ La expresión de Ia MAPK p38 fosforilada (activada) se encontró elevada en los TB-PMN circulantes respecto de PMN de individuos sanos o de patologías inflamatorias no relacionadas. Además, Mtb es capaz de inducir la expresión de p-p38 MAPK. ▪ Finalmente, evaluamos los parámetros de activación y apoptosis de los PMN en líquidos plurales. Observamos que los PMN presentes en líquidos pleurales de pacientes con tuberculosis, presentan un aumento en la expresión de los marcadores de activación, CD64, CD11b, TNF-R55 y una disminución del CD16, respecto de sangre periférica del mismo paciente. Basados en los experimentos in vitro, evaluamos si los PMN, una vez extravasados al sitio de infección, presentaban una grado de apoptosis mayor. Efectivamente, los PMN de los derrames pleurales tuberculosos tienen elevados niveles de apoptosis, no observándose el mismo efecto en derrames pleurales de patologías no relacionadas, a la vez que tienen una elevada expresión de la proteína p38 activada, por lo que concluimos que el fenómeno es característico de la enfermedad tuberculosa. Se sabe que en el contexto de una reacción inflamatoria pulmonar, el reclutamiento masivo de los PMN al foco infeccioso genera un daño tisular importante. Para evitar tanto el daño tisular como para resolver el proceso inflamatorio, es necesario remover oportunamente a estas células del pulmón. Por lo tanto, si la respuesta inflamatoria mediada por los PMN es regulada por la activación del proceso apoptótico se estaría controlando su potencial destructivo en el sitio de infección. En este trabajo demostramos que los PMN están activados antes de arribar al foco infeccioso y una vez allí, el encuentro con el Mtb dispararía una serie de señales que, moduladas a su vez por las CK presentes, activarían aún mas al PMN, como lo hemos observado en los derrames pleurales de etiología tuberculosa. Sin embargo, en un primer momento la apoptosis de los PMN extravasados sería contrarrestada por ciertas citoquinas como la IL-8, de manera tal, que en presencia del Mtb conservarían ciertos receptores, como el CD16, permitiendo al PMN extravasado mantener su capacidad efectora en el sitio inflamatorio. Posteriormente, la apoptosis inducida por el Mtb en los PMN se acelerarla rápidamente, promoviendo así la remoción de los PMN por los macrófagos alveolares y el control del proceso inflamatorio en el sitio de infección, lo que evitaría un mayor daño tisular.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is a chronic inflammatory disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb). ln the early phase of infection, activation of cells of the innate immunity such as Natural Killer (NK) cells, Tγδ lymphocytes and neutrophils (PMN), as well as the cytokines (CK)secreted by them, modulate the course of the inflammatory reaction. PMN participate in the granuloma formation preceding monocytes in the areas of granulomatous inflammation and releasing chemokines that attract monocytes. Although tuberculosis lesions are characterized by a predominant migration of monocytes/macrophages to the site of infection, the earliest response to mycobacteria is primarily an influx of PMN. Nevertheless, as the disease evolves, an increased number of PMN is observed in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of affected lung that correlates with the interleukin (IL)-8 content. The production of this chemokine in macrophages is induced by interleukin (lL)-1β and tumor necrosis factor alpha (TNF)-α, that could induce in turn the secretion of other CK by PMN. It has been recently documented that PMN are able to kill Mtb in tuberculosis lesions. Once localized in the site of infection, the PMN underlie to death by two possible mechanisms: 1) necrosis: characterized by the release of the cytoplasmic content to the extracellular media generating an inflammatory response and 2) apoptosis: characterized by the preservation of the membrane integrity, so PMN might be removed by macrophages without releasing their cytotoxic content. More over, macrophages that phagocytes apoptotic cells do not release inflammatory mediators but anti-inflammatory molecules. On the other hand, apoptotic PMN loose some of their functions as degranulation, phagocytosis, respiratory burst and chemotaxis. Therefore, although PMN play a central role in the infectious process, the excessive recruitment of these cells generates tissue injury. In this context, apoptosis of PMN represents an effective mechanism that leads to the removal of undesirable cells by macrophages limiting tissue damage during the course of the inflammatory response. The aim of these studies was to investigate the activation state of circulating PMN of patients with active pulmonary tuberculosis (TB-PMN) and their possible contribution to the chronic inflammatory process. It is known that several functions that depend on the activation state leads to changes in second messengers that are associated with the induction of apoptotic process in PMN. Therefore, we evaluated apoptosis in circulating PMN and spontaneous and Mtb-induced apoptosis in vitro as well as the mechanisms involved in this process. Finally, in order to corroborate the findings observed in vitro, we evaluate the same parameters in pleural fluids of tuberculosis and non-tuberculosis diseases. Results demonstrated that: ▪ TB-PMN have an increased expression of (FcγR)-IIIB(CD16) and TNF-R55 compared to those of healthy subjects (N-PMN). Furthermore, FCγRI(C64) whose expression is almost exclusively restricted to mononuclear phagocytes, is observed in TB-PMN. Functions that depends on FCγR such as immune complex-mediated cytotoxicity (Cx-IC) and antibodydependent cellular cytotoxicity (CCDA), are also increased in circulating TB-PMN. ▪ On the other hand, in TB-PMN, superoxide anion generation are triggered even at chemottractant concentrations of the formylated peptide FMLP, suggesting that PMN of TB patients are activated and might release reactive oxygen intermediates (ROI) outside the site of infection so, we speculate that the chronic inflammatory response could no longer be considered solely as a local lung inflammation but it could contribute to a systemic inflammation in active TB patients. ▪ Although recently isolated TB-PMN show an elevated expression of CD16 and CD11b indicating that they are activated in circulation, they do not exhibit apoptotic features. ▪ Spontaneous apoptosis of TB-PMN is significantly increased and correlates with the loss of the CD16 receptor expression in culture (indicative of apoptosis in PMN). This spontaneous apoptosis could be due at least in part to the higher expression of Fas and/or the lower bcl-2 expression observed in TB-PMN compared to N-PMN. ▪ Mtb activates PMN in vitro enhancing the CD11b expression in N- and TB-PMN accelerating the apoptotic process in vitro. Moreover, activated TB-PMN are located in a new region characterized by a larger size and CD11b expression. This fact, lead us to speculate that accelerated spontaneous apoptosis of TB-PMN, could be due to the activation state that these cells have in circulation. ▪ Mtb-induced apoptosis of TB-PMN is initially delayed and correlates with the preservation of the CD16 receptor and with an increased secretion of IL-8. Later in the time of culture Mtb markedly accelerates the apoptotic process in TB-PMN. ▪ The pro-apoptotic effect of Mtb is not due to the major mycobacterial cell wall component, the glycolipid ManLAM. Furthermore, a whole cell lysate preparation has no effect on PMN apoptosis. Therefore, the whole Mtb triggers apoptotic process in PMN. ▪ Mtb-induced apoptosis in TB-PMN is not mediated by endogenous TNFα and does not involvs the CD11b receptor. ▪ Mtb-induced apoptosis in TB-PMN is dose dependent. Although phagocytosis induces high levels of apoptosis in PMN, we show that it is also induced at a low Mtb:PMN ratio (1:3). Therefore, Mtb-induced apoptosis might occur by the interaction with a receptor different from CD11b and does not depend on the phagocytosis of Mtb. ▪ mitogen-activated-protein-kinasa (MAPK)p38 and extracellular-signal-regulated kinase (ERK) ERK1/2 were analyzed because these proteins participate in cellular activation an survival. We demonstrated that p38 MAPK is involved in Mtb-induced apoptosis and not in spontaneous apoptosis. On the contrary, activation of ERK would be necessary to prevent the apoptotic process. In this context, some anti-apoptotic signal (i.e. IL-8) might have been annulated when ERK activation was blocked. ▪ Activated MAPK p38 (p-p38) expression in circulating TB-PMN is higher compared to N-PMN or to PMN of inflammatory non-related pathologies. ▪ TB-PMN in pleural fluid (PF) have an increased expression of activation markers as CD64, CD11b, TNF-R55 and a lower CD16 expression compared to peripheral blood PMN from the same patient. Furthermore, PMN that have migrated to the site of TB infection show high levels of apoptosis and a high p-p38 expression. On the contrary, we do not observe the same pattern in PMN of PF of inflammatory non-related pathologies suggesting that these features are characteristic of the tuberculosis disease. In the context of a pulmonary inflammatory reaction the massive recruitment of PMN to the infectious focus generates injury in the lung. Therefore, timer removal of PMN might avoid tissue damage and progression to chronic inflammation. Thus inflammatory response mediated by PMN in tuberculosis, is regulated by the activation of the apoptotic process limiting their detrimental potential in the lung. All these findings have a potential clinical relevance because PMN that have migrated to the site of inflammation are most likely to be either primed or activated before encountering mycobacteria. The delayed apoptosis at short culture times together with the preservation of CD16 suggest that PMN would be able to perform their effector functions at the site of infection. Likewise, later in time, Mtb-induced activation might lead to accelerated apoptosis of PMN, as can be observed in tuberculous pleuritis, thus avoiding tissue damage.

Goldszmid, Silvana Romina. "Células dendríticas en la inmunoterapia del cáncer : desarrollo de una vacuna anti-melanoma en un modelo experimental" (2003-12) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La incidencia del melanoma aumenta a mayor velocidad que la de otros cánceres y la sobrevida de pacientes con metástasis distantes es generalmente < l año. Con el avance en la comprensión de los requerimientos para inducir inmunidad las CD se han convertido en atractivos vectores para la inmunoterapia del cáncer. Consideradas las más potentes células presentadoras de Ag (APC), las células dendríticas (CD) actúan como centinelas del sistema inmune, patrullando a través de la sangre, tejidos periféricos, linfa y órganos linfoides secundarios alertando al sistema inmune y controlando sus decisiones más tempranas. En la periferia las CD inmaduras capturan antígenos (Ag) y migran hacia los órganos linfoides secundarios donde presentan dichos Ag a linfocitos T naïve induciendo la activación de la respuesta inmune. El objetivo del presente trabajo de Tesis fue estudiar desarrollar una vacuna anti-melanoma utilizando CD cargadas con células tumorales apoptóticas y estudiar los mecanismos involucrados en la respuesta inducida contra el tumor. Para ello, se utilizó el modelo de melanoma murino B16. El melanoma B16 es un tumor de origen espontáneo, débilmente inmunogénico y por lo tanto provee un marco adecuado para el estudio de la modulación de la respuesta inmune anti-tumoral. Las CD aisladas a partir de precursores de médula ósea fueron cultivadas en presencia de sobrenadante de cultivo de la línea productora de GM-CSF establecida mostraron un fenotipo inmaduro con baja expresión de moléculas MHC I y II y coestimulatorias y alta capacidad de captación antigénica tanto por fagocitosis de Ag particulados como endocitosis de macromoléculas. Luego de inducir la maduración con LPS se observó un marcado aumento en la expresión de moléculas MHC I y II y coestimulatorias y un aumento en la capacidad estimulatoria en cultivos mixtos alogeneicos. Ensayos de migración in vitro mostraron la alta capacidad migratoria de las CD inmaduras en respuesta a estímulos inflamatorios y de CD maduras en respuesta a quimioquinas constitutivamente secretadas en los ganglios linfáticos. Se comprobó también, mediante la realización de ensayos de migración in vivo, que las CD inyectadas subcutáneamente eran capaces de migrar hacia los ganglios linfáticos de drenaje. Estos resultados reflejaron el potencial de las CD obtenidas para su utilización en el diseño de una vacuna anti-tumoral. La apoptosis de las células B16 fue inducida por radiación y y evidenciada por tinción con Anexina V / IP. 48 hs después de la irradiación se observaron 70 —80 % de células apoptóticas caracterizadas por la tinción Anexina +/ IP - comparadas con lO—12 % en las células sin tratar. Las células Bl6 apoptóticas fueron eficientemente fagocitadas por CD inmaduras. Luego de 24 hs de cocultivo gran proporción (> 50 %) de CD había incorporado material apoptótico según se evidenció por FACS, microscopía confocal y microscopía electrónica. El cocultivo con células tumorales apoptóticas indujo la maduración de las CD, evidenciada por un aumento en la expresión de MHC II y CD86 respecto a CD inmaduras cultivadas en ausencia de células apoptóticas. Dicho aumento se observo principalmente en la población de CD que había incorporado material apoptótico. Otra evidencia de la maduración de las CD, fue la marcada disminución de la capacidad endocítica con respecto a CD inmaduras (intensidad de fluorescencia media 35,8 vs. 192,5). Luego de ser inyectadas subcutáneamente, CD cocultivadas con células apoptóticas o CD solas migraron hacia los ganglios linfáticos en forma comparable. Las CD encontradas en los ganglios correspondían a ~0.5% del inoculo original y en ambos casos se observo una expresión uniforme de MHC II y CD86 equivalente a la observada en CD maduras. La vacunación con CD cargadas con células tumorales apoptóticas (CD-Apo) indujo un alto nivel de protección contra el desarrollo del melanoma B16: 80 % de los animales permanecieron libres de tumor 12 semanas después del desafió. Dicha protección fue especifica para el melanoma B16, ya que todos los animales vacunados desarrollaron tumor cuando fueron desafiados con un tumor singeneico no relacionado. 80 % de los animales vacunados con CD-Apo y desafiados 10 semanas después de la inmunización permanecieron libres de tumor, consistente con la inducción de memoria inmunológica. Estudios de depleción in vivo de subpoblaciones linfocitarias demostraron que tanto linfocitos T CD4+ como CD8+ son son necesarios para la efectiva vacunación con CD-Apo. Se evidenció que ambas poblaciones linfocitarias son activadas para la producción de IFNy cuando son estimuladas con CD-Apo y CD-TRP-2. Además, los linfocitos CD8+ son capaces de reconocer células Bl6 intactas in vitro y de lisar células pulsadas con TRP-2 in vivo. El estudio de la inmunidad humoral demostró la presencia de anticuerpos específicos dirigidos contra las ce'lulas B16. Por último, en el análisis del sitio de inyección del tumor se observó un importante infiltrado de neutrófilos a tiempos muy tempranos, siendo máximo seis días después de la inyección del tumor. La presencia de linfocitos en el sitio de inyección se observó más tardíamente. Esto podría indicar que los neutrófilos también juegan un rol importante en el rechazo tumoral. En el presente trabajo de Tesis se ha demostrado por primera vez, que la vacunación con CD cargadas con células tumorales apoptóticas (CD-Apo) induce inmunidad a largo plazo dependiente de la acción combinada de linfocitos T CD4+ y CD8+ contra el melanoma B16 débilmente inmunogénico. Este modelo preclínico provee el marco necesario para la realización de estudios clínicos comparables utilizando CD-Apo como adyuvante para la inmunización activa contra el cáncer.

Abstract:
Melanoma is the cancer with the fastest increasing incidence, and survival of patients with distant metastases is generally < l year. With increased understanding of the requirements for initiating immunity, dendritic cells (DCs) have become attractive vectors for immunotherapy of this and other cancers. Considered the most potent antigen presenting cells (APC), DC act as sentinels of the immune system, they patrol trough the blood, periphery, lymph and lymphoid organs, alerting the immune system and controlling its early decisions. At the periphery immature DC capture antigens (Ag) and migrate to the secondary lymphoid organs where they present those Ag to naïve T cells and therefore inducing the immune response. The aim of this Thesis work was to develop an anti-melanoma vaccine using DC loaded with apoptotic tumor cells and to study the mechanisms underlying the induced anti-tumor response. In order to do that, we used the B16 melanoma. The B16 melanoma is a poorly immunogenic tumor of spontaneous origin, thus providing the adequate background to explore maneuvers to increase host defenses against it. The DC obtained from bone marrow precursors were cultured in the presence of GM-CSF containing supematant from the previously established GM-CSF producing cell line, showed an immature phenotype with low expression of MHC II and I and co-stimulatory molecules and high Ag capture capacity. After LPS induced maturation DC showed an up-regulated expression of MHC I and II and co-stimulatory molecules and high T cell activation capacity in the mixed leukocyte reaction. DC also showed a high migratory activity as evidenced by in vitro migration assays. Furthermore, it has also been shown that after s.c. injection DC migrated to the draining lymph nodes. These observations pointed out the potential of DC for the design of anti- tumor vaccines. To induce apoptosis, B16 cells were irradiated (70 Gy) and cultured for 48 h. Apoptosis was documented by AnexinV / PI staining. After 48 h, cultured unirradiated cells contained 10-12% early apoptotic cells characterized by AnnexinV + / PI —staining. In contrast, 70-80% of irradiated cultured tumor cells had undergone early apoptotic death. 12-19% of the cells displayed AnnexinV + / PI + staining, indicating secondary necrosis in both unirradiated and irradiated cultures. Then DCs were cultured apoptotic tumor cells for 24h. At 37°C, over 50% of immature DCs phagocytosed apoptotic material, as confirmed by FACS, confocal fluorescence microscopy and electron microscopy. After coculture a large fraction of the tumor-exposed DCs upregulated CD86 as well as MHC II. Another evidence of the induced maturation was the down-regulated capacity to endocytose FITC-Dextran as compared with immature DC(mean fluorescence 35,8 vs 192, 5). Following injection, DCs migrated to the draining lymph nodes comparably to control DCs at a level corresponding to ~0.5% of the injected inoculum and uniformly expressed high levels of CD86 and MHC II molecules comparable to fully mature and immunogenic DC. Mice vaccinated with tumor-loaded DCs (DC-Apo) showed a strong protection against an intracutaneous challenge with B16: 80% of the mice remaining tumor-free 12 weeks after challenge. This protection was not observed when vaccinated mice were challenged with a nonrelated syngeneic tumor. 80 % of mice receiving a tumor challenge 10 weeks after vaccination were also protected, consistent with the induction of tumor-specific memory. When either CD4+ or CD8+ T cells were depleted in vivo at the time of challenge, the protection was completely abrogated, indicating that both CD4+ and CD8+ T cells are necessary for the effective anti-tumor response induced DC-Apo vaccination. CD4+ and CD8+ T cells were efficiently primed in vaccinated animals, as evidenced by interferon-y secretion after in vitro stimulation with DC-Apo or DCs pulsed with TRP-2. In addition, B16 melanoma cells were recognized by immune CD8+ T cells in vitro, and cytolytic activity against TRP-2(180-188) pulsed target cells was observed in vivo. The study of the humoral response showed the presence of anti-B16 specific antibodies. Finally, when the tumor injection site was analyzed a large amount of neutrophils were observed at very early time points and being maximum six days following tumor challenge. The presence of lymphocytes at the injection site was observed only at later time points. This could indicate tha neutrophils also play an important role in the tumor rejection. In the present Thesis work it has been shown for the first time, that DCs phagocytosing apoptotic tumor cells (DC-Apo) elicit long-lived combined CD4+ and CD8+ immunity against the poorly immunogenic B16 melanoma. This preclinical model sets the stage for comparable studies in humans with DC-Apo as adjuvants for active immunization against cancer.

Barrero, Paola Roxana. "Secuencia nucleotídica completa del Adenovirus 7h: análisis de los polimorfismos del gen del hexón de los Adenovirus circulantes en Buenos Aires entre los años 1990-2002" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los Adenovirus circularon en el período 1999-2002 durante todo el año, registrándose un mayor número de casos en el período invernal de baja temperatura y primaveral con cambios de temperatura frecuentes. El diagnóstico virológico se realizó tempranamente luego de la internación siendo la bronquiolitis el diagnóstico clínico al ingreso más frecuente. Se registró un mayor número de casos en menores de 12 meses y la evolución en general fue favorable registrándose 9 casos fatales en un total de 362 muestras analizadas. Se encontró una correlación negativa de grado medio con respecto a la temperatura, indicando un aumento en el número de casos cuando el registro térmico desciende. En cuanto a la humedad relativa y el índice UVB, la relación no es tan clara aunque es siempre de grado menor. Este parece ser un parámetro no necesariamente asociado a la aparición de casos de Adenovirus. El análisis filogenético del hexón completo permitió agrupar las muestras fatales y las separó de las graves y leves en el periodo 1990-1999. El análisis de las regiones hipervariables en el período 1990-2002 posicionó a las muestras analizadas en el cluster GTC2 junto al AV7h. La secuencia completa del AV7h se llevó a cabo por una estrategia de ensamblado de 8 contigs que permitieron elaborar una secuencia consenso de 35259 pb. con un porcentaje G+C del 51%. Se conservaron intactos los genes para las regiones tempranas, intermedias y tardías. El análisis filogenético ubicó al genoma AV7h junto con el AVB con el que tiene una homología del 84%. Se hallaron ORFs relacionados con proteínas pulmonares que podrían inducir autoanticuerpos o daño pulmonar crónico postviral.

Abstract:
In Argentina, Adenovirus 7h (AV7h) has been frequently associated with fatal cases and chronic lung disease. In to order to understand the characteristics of AV7h we accomplished the entire reference sequencing and analysed sample polymorphism in the hexon gene from a twelve-year period (1990-2002). Nasopharyngeal aspirates from children with acute lower respiratory infections were characterized by multiplex-PCR. Primers were designed and PCRs were performed to obtain the full genome for the reference 7h strain 87-922 and the entire hexon gene or hipervariable regions for samples. Amplicons were sequenced, contigs were aligned, a consensus full-length sequence was obtained for the reference strain 87-922 and phylogenetic relationships for hexon gene were inferred by maximum-likelihood criteria. Overall differences between AV7h hexon gene and prototype for serotype 7 (Gomen) sequence were <4% at nucleotide level and <3.5% at amino acid level. Phylogenetic analysis clustered together fatal cases apart from severe and mild cases. The entire genome was completed in 8 contigs with 44, 16, 7, 15, 14, 26, 18 and 15 primer reactions respectively. AV7h was 35263 bp in length and had a GC content of 51% and genes from the early, intermediate, and late regions were present in the expected human adenovirus locations. The genome differs from prototype strain for AVB (subspecie B2) in 16%, and 4% from vaccinal strain AV7(subspecie B1). This work constitutes the first attempt to elucidate intragenotypic variations within AV7h and to reveal particular features of this strain.

Daroqui, María Cecilia. "Caracterización del sistema TGF-ß/TßRs en carcinomas de mama y pulmón murinos. Rol en la progresión tumoral" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo analizamos el rol de TGF-β en la progresión tumoral, empleando dos modelos de adenocarcinoma murino, de mama y de pulmón. Nuestro modelo de tumor de mama está constituido por los tumores parentales M3 y MM3, poco y altamente metastásicos, respectivamente, y por las lineas celulares derivadas LM3 y LMM3, altamente invasivas y metastásicas. Todas las células de nuestro modelo expresan el sistema completo TGF-β y sus receptores específicos TβRs, y éste es funcional. Además, mediante estudios in vitro determinamos que TGF-β activa la vía de transducción de señales Smads y otras vias, como p38Mapk y MEK/ERK, en las células de carcinoma de mama de nuestro modelo. En cuanto a su acción biológica, TGF-β tiene un efecto antiproliferativo sobre los cultivos primarios de M3 y MM3, mientras que las líneas son resistentes a dicho efecto. Por otra parte, TGF-β induce la actividad de MMP-9 en todas las células de nuestro modelo. Determinamos por primera vez que las vías de señalización p38Mapk y MEK/ERK bloquean la inducción de MMP-9 por TGF-β y que los receptores de señalización TβRI y TβRII son esenciales en esta respuesta. Además, estudiamos el rol de TGF-β sobre la expresión y/o actividad de distintos componentes del sistema de activación del plasminógeno, incluyendo activadores como el uPA y el uPA unido a membrana, e inhibidores como PAI-1. Detectamos que TGF-β inhibe el balance neto de este sistema en las células poco metastásicas, mientras que lo estimula en las células de fenotipo más agresivo. Por otro lado, analizamos la función de TGF-β en la reorganización del citoesqueleto de acfina y determinamos que TGF-β no modula las tropomiosinas ni la proteina HSP27, moléculas relacionadas con actina. Sin embargo, demostramos por primera vez que la actividad del complejo Arp2/3, fundamental en la polimerización de actina, aumenta en respuesta a TGF-β,si bien su consecuencia biológica debe aún esclarecerse mediante otros estudios. Además, TGF-β induce una leve remodelación de la actina cortical en nuestro modelo, sin producir cambios fenotípicos como la formación de fibras de stress y la transición epitelio-mesenquimática como ocurre en sistemas epiteliales no-tumorigénicos. Asimismo, determinamos que la via de señaligación MEK/ERK bloquea la formación de fibras de stress en las células tumorales en estudio y que además está involucrada en la inducción de la migración celular por TGF-β, junto con la vía p38Mapk. Por otra parte, TGF-β estimula la capacidad invasiva in vitro de todas las células de nuestro modelo de tumor de mama. Observamos que la presencia de TβRI y TβRII funcionales, así como las vías de señalización p38Mapk y MEK/ERK, son esenciales en este proceso. Estos datos son muy novedosos, ya que no ha sido descripto previamente un mecanismo de acción de TGF-β en la invasión celular. Mediante estudios in vivo determinamos que TGF-β no modula la capacidad angiogénica en nuestro modelo. Por otro lado, empleando células LM3 transfectadas con formas dominantes negativas de los receptores de señalización de TGF-β, encontramos que la tasa de crecimiento tumoral y la capacidad metastásica de las células de adenocarcinoma mamario en estudio dependen de un sistema funcional TGF-β/TβRs. Por otro lado, estudiamos el sistema TGF-β/TβRs en la línea de adenocarcinoma de pulmón LP07, altamente metastásica. Encontramos que estas células han perdido la capacidad de expresar la proteina TGF-β, respecto del tumor P07 que le dio origen. Además, determinamos que las células LP07 expresan los receptores de señalización TβRI y TβRII. Por medio de estudios in vitro detectamos que si bien las células LP07 no producen TGF-β, la via de Smads y otras vías de transducción de señales pueden ser activadas por TGF-β, por lo que son capaces de responder a la citoquina. Así, TGF-β es un potente inhibidor del crecimiento de LP07. Además, TGF-β inhibe marcadamente la actividad de las proteasas uPA y MMP-2 en las células LPO7 y controla su motilidad in vitro. Y también es capaz de inhibir la angiogénesis in vivo de LP07. De este modo, nuestros resultados indican que TGF-β podría funcionar como un supresor tumoral en nuestro modelo de adenocarcinoma de pulmón, y que la pérdida de funcionalidad del sistema TGF-β/TβRs podria contribuir a la progresión tumoral en estas células.

Abstract:
In the present work we have studied the role of TGF-β in tumor progression, by using a mammary and a lung murine adenocarcinoma experimental models. The mammary tumor model is composed by two closer related tumors, the poorly metastatic M3 and the highly metastatic MM3 ones, as well as the derived highly invasive and metastatic cell lines, LM3 and LMM3. We determined that all these cell types express both TGF-β and its receptors (TβRs), so they present the complete TGF-β/TβRs system. By in vitro studies we found that TGF-β induces the activation of different signaling pathways in our model, including Smads, p38Mapk and MEK/ERK. Besides, TGF-β exerts an antiproliferative action on M3 and MM3 primary cultures while the derived cell lines are resistant to this effect. On the other hand, TGF-β estimulates MMP-9 activity in all the cell types of our tumor model. We show here for the first time that p38Mapk y MEK/ERK pathways block MMP-9 by TGF-β, as well as that the TGF-β signaling receptors, TβRI and TβRII, are key components of this response. We also studied the role of TGF-β on the expression and/or activity of distinct components of the plasminogen activation system, including activators like uPA and membrane-bound uPA and inhibitors like PAI-1. We found that TGF-β inhibits the net balance between activators and inhibitors in the poorly metastatic cells, enhancing it in those cells with the more aggressive phenotype. On the other hand, we studied TGF-β action on actin cytoskeleton reorganization and we determined that TGF-β is not able to modulate the actin-related molecules tropomyosins and HSP27. However, we show here for the first time that TGF-β enhances Arp2/3 complex activity, although its biological significance remains to be fully determined. Besides, we found that TGF-β induces only a slight remodelling on the cortical actin in our tumor model, without affecting the cellular phenotype like the formation of stress fibers and the epithelial-to-mesenchymal transition showed by some normal epithelial cells. We also demonstrate that the MEK/ERK pathway blocks stress fiber formation in the tumor cells studied here, and that this pathway is also implicated in TGF-β-mediated cell migration, together with the p38Mapk pathway. Besides, we found that TGF-β induces the in vitro invasive ability of all the cell types studied here, and that this effect requires TβRI and TβRII activity as well as p38Mapk and MEK/ERK pathways. This is the first time that a signaling pathway is implicated in TGF-β-induced cellular invasion. By in vivo studies we showed that TGF-β is not able to modulate the angiogenic ability of the mammary tumor cells studied here. Finally, by using LM3 cells stably transfected with dominant negative forms of TGF-β signaling receptors, we determined that the tumor growth rate as well as the ability to form metastases depend on a functional TGF-β/TβRs system. On the other hand, we studied the role of the TGF-β/TβRs system in the highly metastatic lung tumor LP07 cell line. We found that LP07 cells do express TβRs but they have lost the ability to express TGF-β at the protein level showed by P07 parental cells. Using in vitro studies we detected that despite LP07 cells do not produce TGF-β, Smads and other signaling pathways can be activated by TGF-β, so these cells are able to respond to the cytokine. Besides, TGF-β markedly inhibits the activity of proteases like uPA and MMP-2 in LP07 cells as well as it reduces the in vivo angiogenic ability of these cells. So, our data suggest that TGF-β could function as a tumor suppressor in our lung tumor model, and that a disruption in the TGF-β/TβRs system regulation may thus contribute to tumor progression.

D’Agostino, Agata Magdalena. "Estudio de los mecanismos moleculares de patogénesis del sarcoma de Kaposi mediados por el Herpesvirus Humano-8/KSHV y su oncogén, el receptor acoplado a proteína G (vGPCR), en modelos animales" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
KSHV es un oncovirus implicado en Sarcoma de Kaposi (KS) y otros cánceres asociados a SIDA. KS es un neoplasma caracterizado por la proliferación de células ahusadas y la intensa angiogénesis. Los mecanismos a través de los cuales KSHV causa la respuesta angioproliferativa de KS se desconocen y la reproducción de todos los aspectos de KS mediante infección experimental por KSHV aún no ha podido ser demostrada. El receptor acoplado a proteína-G (vGPCR) de KSHV puede estimular cascadas de señalización que inducen angiogénesis y transformación celular. Identificar estas cascadas puede tener significancia terapéutica. Ciclooxigenasa-2 (COX-2) es un medidor involucrado en angiogénesis tumoral que puede ser regulada por antinflamatorios (AINEs). En la primera parte de este trabajo demostramos que vGPCR regula la actividad y la expresión de COX-2 vía ERK-1/2. Encontramos que la inhibición de COX-2 impide la angiogénesis inducida por vGPCR y que la administración del AINE Celecoxib retarda el crecimiento tumoral con disminución en la vascularata y producción de VEGF. Así, COX-2 sería uno de los componentes moleculares del cambio angiogénico de vGPCR y un posible blanco terapéutico. En la segunda parte mostramos que la transfección con KSHV clonado en un Cromosoma Artificial Bacteriano (KSHVBac36) en preparaciones de médula ósea murinas enriquecida en precursores de células endoteliales (mEC) es suficiente para inducir tumorigénesis y llevar al cambio fenotípico angiogénico. Las células mEC transfectadas con KSHVBac36 (mECK36) estaban infectadas con KSHV, secretaban VEGF, eran angiogénicas in vivo e indujeron en ratones inmunodeficientes la formación de sarcomas de células ahusadas vascularizados que expresaban LANA y marcadores característicos de KS. La inhibición de la expresión de vGPCR en las mECK36 utilizando siRNA condujo a la inhibición de su angiogenicidad y tumorigenicidad. Estos resultados definen un modelo animal para estudiar la patogénesis de KS mediada por KSHV y señalan a vGPCR como uno de sus principales oncogenes angiogénicos.

Abstract:
KSHV ia a human oncovirus associated with Kaposi´s sarcoma (KS) an AIDS associated cancer. KS is a neoplasm characterized by proliferation of spindle-shaped cells and intense angiogenesis. The mechanisms whereby KSHV causes KS angioproliferative response are not well defined and the reproduction of KS by experimental KSHV infection has not yet been shown. vGPCR is a G protein-coupled receptor encoded by KSHV that subverts host´s signaling pathways to induced cell transformation and angiogenesis. Cyclooxygenase-2 (COX-2) is a mediator involved in tumor angiogenesis that can be inhibited by NSAIDS. We demonstrated that vGPCR upregulates COX-2 activity and expression, and we found that inhibition of COX-2 by the NSAID Celecoxib impairs vGPCR-driven angiogenesis and tumorigenesis. Taken together these results show that COX-2 is a molecular mediator of vGPCR angiogenicity and potential target for KS therapy. On the second part we show that transfection of KSHV cloned in a Bacterial artificial chromosome (Bac36) into mouse Bone marrow preparations enriched in endothelial cells and its progenitors (mEC) is sufficient to induce tumorigenesis and angiogenesis. mEC transfected with KSHVBac36 (mECK36) were infected with KSHV, displayed high levels of VEGF secretion, were angiogenic in vivo and induced spindle-cell sarcomas expressing KSHV LANA and KS phenotypic markers. The inhibition of vGPCR expression mediated by siRNA led to inhibition of mECK36 angiogenesis and of tumor growth. These results define an animal model of KSHV-mediated KS pathogenesis in vivo and point to vGPCR as one of its major angiogenic oncogenes.

Gabri, Mariano Rolando. "Ensayos pre-clínicos de dos vacunas inmunoterapéuticas con actividad antitumoral desarrolladas a partir de gangliósidos" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Para el año 1934 la toxina de Coley era el único tratamiento sistémico para el tratamiento de cáncer. Este preparado fue desarrollado unos años antes por el prestigioso cirujano del Memorial Hospital de New York, William B. Coley, utilizando toxinas bacterianas de los géneros Serratia y Streptococcus. Este producto se convirtió así en la primera vacuna oncológica y en uno de los primeros tratamientos sistémicos del cáncer. A pesar de los experimentos iniciales del siglo pasado, luego de los ensayos de Coley la inmunoterapia oncológica fue dejada de lado por el advenimiento de las drogas quimioterapéuticas y las mejoras en la radioterapia. En las últimas décadas se ha vuelto a observar a la inmunoterapia como una estrategia complementaria válida para el tratamiento de cáncer. Este nuevo interés sobre este tipo de tratamientos, tiene sus bases en el gran avance alcanzado en el entendimiento de los mecanismos inmunológicos y de los procesos que dominan la biología tumoral. En esta tesis se presentan resultados relativos a dos vacunas desarrolladas a partir de gangliósidos, moléculas de membrana anfipáticas que pertenecen a la familia de los glicoesfingolípidos con por lo menos, un residuo de ácido siálico lo cual es una característica distintiva de estos compuestos. Los resultados se centran en la evaluación de los efectos tóxicos, la respuesta antitumoral y la modulación inmunológica desencadenados por la aplicación de vacunas inmunoterapéuticas a base de gangliósidos, consistentes en un anticuerpo anti-idiotipo dirigido a gangliósidos glicolilados (anticuerpo 1E1O) y de una vacuna molecular del gangliósido NacGM3 conjugado a proteínas externas de membrana de N. Meningitidis proteoliposomas de muy pequeño tamaño (NacGM3/VSSP). Con este fin se evaluará también el perfil de los modelos murinos experimentales de cáncer mamario y melanoma a emplearse para cada vacuna, respectivamente. Los resultados demuestran que los modelos animales elegidos presentan características adecuadas para ser utilizados como herramientas de evaluación de los efectos y mecanismos desencadenados por la inmunización con las vacunas. La línea celular de cancer mamario murino F3II crece en el espacio subcutáneo desarrollando un fenotipo tumoral altamente maligno. Su portación produce un cuadro inmunoestimulatorio posiblemente ligado a la secreción de GM-CSF, citoquina ante la cual se modifica su respuesta proliferativa. Además estas células son reactivas al anticuerpo P3, precursor del 1E10, lo que la convierte en un modelo apropiado para la evaluación de la respuesta antitumoral de 1E10. La inmunización de ratones con el preparado 1E10-KLH no produce efectos tóxicos de magnitud en los animales, desarrollando una respuesta tumoral que es capaz de reconocer a las células F3II. Utilizando este proceso de inmunización se puede observar un retardo en el crecimiento tumoral y una disminución significativa en el recuento de metástasis espontáneas en los ratones tratados. Además se evaluó a la línea B16 crecida en animales singénicos como modelo de estudio de los efectos producidos por la vacunación con NacGM3/VSSP. Las células B16 presentan en su membrana al gangliósido NacGM3, reaccionando positivamente ante la presencia del mismo en el medio de cultivo. La vacunación de ratones C57 con NacGM3/VSSP desarrolla una respuesta inmunológica humoral que es capaz de reconocer a los componentes de la vacuna y a las células de melanoma B16. La aplicación de la vacuna no produce efectos tóxicos de importancia. La vacunación con NacGM3/VSSP genera una respuesta antitumoral que se manifiesta en el rechazo del desafío tumoral en el 100% de los animales vacunados. Esta respuesta se mantiene en el tiempo hasta tres meses luego de finalizada la misma. La respuesta antitumoral obtenida es dosis dependiente ya que se pudo observar una actividad antitumoral creciente en lotes de ratones inmunizados con una concentración vacunal de hasta 360 μg/dosis y específica hacia células que expresan el gangliósido NacGM3). La vacunación con NacGM3/VSSP desarrolla una respuesta de anticuerpos con preponderancia del isotipo IgG2b. Estos anticuerpos reconocen cortes de tumor B16 siendo su epítope reactivo el residuo de ácido sialico presente en las células. La investigación básica en vacunas provee un mejor entendimiento de los mecanismos inmunológicos involucrados en el rechazo tumoral inducidos por la vacunación. Los ensayos preclínicos con modelos animales de cáncer son de importancia capital en el estudio de los efectos inmuno modulatorios de estas vacunas y en la evaluación de sus capacidades terapéuticas a nivel clínico.

Abstract:
By 1934 Coley's toxin was the only systemic treatment for cancer. This compound was developed few years before for the famous surgeon from The Memorial Hospital of New York, William B. Coley, using bacterial toxins from Serratia and Streptococcus. This product become the first cancer vaccine and one of the first systemic treatments for cancer. Despite the initial experiments carried out in the last century, after Coley attempts cancer immunotherapy was abandoned due to the appearance of quimiotherapeutic drugs and improvements in radiotherapy. In the last decades, immunotherapy is seeing again as a valid adiuvant therapy for cancer treatment. This new interest in this kind of treatments, is based in the important advance reached in the understanding of immunology and the processes that govern tumor biology. In this thesis, results related with two vaccines based in gangliosides are presented. Gangliosides are amphipatic membrane molecules that belong to the glicoesfingolipid family, having at least one residue of sialic acid, which is a distinctive characteristic of this kind of compounds. The results focus in the evaluation of toxicity, antitumoral response and the immunological modulation due to the application of this two vaccines, one an antiidiotypic antibody against glycolilated gangliosides (1E1o antibody) and other a molecular vaccine composed by the ganglioside NacGM3 conjugated to proteins from the outer membrane of N. Meningitidis in proteoliposomes of very small size (NacGM3/VSSP). With this reasoning in mind, the profile of the experimental murine models of breast cancer and melanoma to be employed with each vaccine, was also evaluated. Results demonstrated that the animal models chosen have the characteristics needed to be used as evaluation tools of the effects and mechanisms developed by the immunization with the vaccines. F3II murine breast cancer cell line grows in the subcutis developing a highly malignant tumor phenotype. Its bearing produce an immunoestimulatory effect probably related to the secretion of GM-CSF, a cytoquine able to modify its proliferative response. Furthermore, this cells are reactive to P3 antibody, a precursor of 1E10, becoming a very adequate model for the evaluation of 1E10 antitumor response. Immunization of mice with the preparation 1E10-KLH did not produce relevant toxic effects in the animals, developing a humoral response able to recognize F3II cells. Using this immunization process it can be observed a delay in tumor growth an a significant decrease in the number of spontaneous metastasis in treated animals. Also, the B16 line, growing in singenic animals, as a study model of the effect produced by vaccination with NacGM3/VSSP, was evaluated. B16 cells have in its membrane NacGM3 ganglioside. Vaccination of C57 mice with NacGM3/VSSP developed a humoral immunologic response able to recognize both, components of the vaccine and B16 melanoma cells. Administration of the vaccine did not produce relevant toxic effects. Vaccination with NacGM3/VSSP generated an antitumoral response that translated in the rejection of the tumor challenge in 100% of the vaccinated animals. This response is sustained in the time up to three months after final inoculation. The antitumoral response obtained is dose-dependent since was observed an increasing antitumoral activity in mice immunized with a vaccine concentration of up to 360 μg/dose, being specific towards cells expressing NacGM3 ganglioside. Vaccination with NacGM3/VSSP developed an antibody response mostly based in the isotype IgG2b. This antibodies recognize B16 tumor slides being its reactive epitope the sialic acid residue which is present in the cells. Basic research in vaccines provide a better understanting of the immunologic mechanisms involved in tumor rejection induced by vaccination. Preclinical experiments with animal models of cancer are of utmost importance in the study of the immunomodulatory effects of this vaccines and the evaluation of its therapeutic capabilities at the clinical level.

Pazos, Adriana Alejandra. "Caracterización de un sustituto de piel humana a base de dermis porcina" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las lesiones cutáneas que abarcan una gran superficie de la piel, requieren el recubrimiento inmediato de la zona afectada para reducir riesgos se sepsis y facilitar la regenración tisular. Entre los múltiples procedimientos terapéuticos aplicados en el tratamiento de estas lesiones, los injertos de piel proveen un medio adecuado y seguro para la regeneración tisular. En esta tesis se estudió un sustituto de piel humana a base de dermis porcina utilizado para ese fin terapéutico, el cual essometidopara su comercialización a un tratamiento industrial que incluye liofilizacipon. El objetivo de la tesis, consistió en la caracterización de este producto comercial, su comparación con la dermis fresca original, y la descripción de ciertos aspectos de su actividad biológica. El análisis consistió en desarrollar la metodología adecuada para el aislamiento y cuantificación de los componentes de importancia biológica. Estos fueron los colágenos del tipo I y III, las proteínas fibronectina y laminina, y los proteoglicanos de ácido hialurónico, keratán sulfato, dermatán sulfato y condroitín sulfatos A y C. Los resultados se esta etapa sugieren que el tratamiento industrial aplicado para su comercialización, no los modificó de manera importante, ya que no hubo alteraciones cuali-cuantitativas relevantes. Además, el análisis de su actividad biológica en un " modelo de cultivo in vitro" de fibroblastos humanos, mostró que la dermis induce un aumento de la proliferación celular. Por lo tanto, este sustituto dérmico puede considerarse una excelente herramienta para el tratamiento de pacientes con heridas cutáneas extensas.

Abstract:
Extended skin damage requires immediate covering of the wounded area in order to avoid sepsis and to facilitate tissue regeneration. There are multiple approaches to treat these injuries, however skin graft is one of the most suitable and safe measures to accomplish this issue. In the present thesis, it was examined a human skin substitute based on porcine dermis used for this kind of treatments, which was previously submitted to an industrial treatment that includes dried-freeze. The objective of this was, characterization of the product, later comparison to the original fresh tissue, and description of certain aspects of this biological activity. The analysis was focused on the development of an appropriate methodology to isolate and quantify those components considered of biological interest. These compounds were collagen types I and III, fibronectin, laminin, and hyaluronic acid, keratan sulphate, dermatan sulphate, and chondroitin sulphates A and C-containing proteoglycans. The results of this step suggest that the industrial treatment applied to the dermis for marketing purposes did not modify greatly the product, since there were no relevant qualitative and quantitative alterations. Besides, the biological activity analysis performed in an "in vitro culture model" of human fibroblasts showed that the dermis induces an increment of cellular proliferation and DNA synthesis, and a consequent shorten of cell cycle. Therefore, the studied dermal substitute could be considered as an excellent tool for the treatment of patients with extended skin injuries.

Basile, Laura Ana. "Estructura y dinámica de comunidades bacterianas en sistemas de barros activados que degradan fenol" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La forma en la que las comunidades responden a las alteraciones suelen manifestarse a través de cambios en la composición o en la abundancia relativa de las especies. Frecuentemente estos cambios pueden ser atribuídos a caracteres funcionales o adaptativos. La búsqueda de modelos que expliquen los patrones de composición de especies y la coexistencia de especies similares dentro de comunidades ecológicas, pueden aportar datos sobre los mecanismos subyacentes que regulan la biodiversidad y su relación con el funcionamiento del ecosistema. En este trabajo se estudió la dinámica de las comunidades bacterianas, a nivel taxonómico y funcional, y el funcionamiento de sistemas de barros activados especializados en la degradación de fenol. Se evaluó en primer lugar la dinámica de las comunidades bacterianas en función del tiempo de aclimatación al fenol, operando bioreactores a escala de laboratorio bajo condiciones constantes a lo largo de 9 meses. En una segunda etapa se analizó el modo en que las comunidades bacterianas respondían a un aumento escalonado en la concentración de fenol. El funcionamiento de los reactores se analizó por mediciones de biomasa, niveles de turbidez y de fenol en el sobrenadante y velocidades de degradación de fenol. La estructura de la comunidad bacteriana se estudió por medio de geles de gradiente desnaturalizantes (DGGEs) del dominio variable V3 del ADN ribosomal 16S. La estructura a nivel funcional se determinó mediante la cuantificación por ensayos de PCR en tiempo real de las distintas variantes del gen de la subunidad mayor de la enzima fenol hidroxilasa multicomponente (LmPH), que cataliza la oxidación de fenol a catecol, paso limitante de la vía de degradación de fenol. Finalmente, buscando relacionar los patrones de abundancia de los grupos LmPH con sus propiedades cinéticas, se estudiaron representantes de los grupos LmPH obtenidos mediante técnicas de cultivo y aislamiento. Los resultados demuestran que la actividad de degradación de fenol en el sistema es debida a la acción combinada de un número de organismos funcionalmente redundantes. La comparación de los patrones de abundancia de las poblaciones que degradan fenol sugiere un grado de determinismo considerable, donde la abundancia relativa de cada especie parece determinada por la concentración de fenol en el alimento. Las características cinéticas de representantes de siete de los ocho genotipos LmPH, obtenidos utilizando un amplio rango de condiciones de cultivo, exhibieron un intervalo relativamente acotado de variabilidad fisiológica, indicando que la capacidad de una bacteria particular de volverse un miembro predominante de la comunidad bajo condiciones ambientales cambiantes no puede ser inferida únicamente de las propiedades de degradación de fenol.

Abstract:
Communities' responses to disturbance are commonly manifested as changes in species composition or relative species abundances. These changes are often attributed to functional or adaptive traits. The understanding of the patterns of species abundance, and the coexistence of similar species within ecological communities can provide important insights into the underlying mechanisms that regulate biodiversity and its relationship with ecosystem function. In this work we studied bacterial communities dynamics, using both taxonomic and functional approaches, and its relationship with the activity of phenol degrading acitvated sludge systems. Firstly, we evaluated bacterial communities dynamics as a function of phenol acclimation time, over 9 months of reactor operation under constant conditions. In a second stage, we analyzed the responses of bacterial communities to a step-increase in phenol concentration. Reactors performance was analyzed by biomass concentration, turbity and phenol concentration in supernants, and degradation rates. The structure of bacterial communities was studied using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of the variable domain V3 of PCR-amplified 16S ribosomal DNA. Functional structure was determined by real time quantitative PCR on different gene variants of the major subunit of the multicomponent phenol hydroxylase enzyme (LmPH), which catalyzes the oxidation of phenol to catechol, the rate limiting step in phenol biodegradation pathway. Finally, looking for a relationship between LmPH abundance patterns and kinetic properties, we studied representatives of LmPH groups, which were obtained through cultivation and isolation techniques. We concluded that phenol degradation activity in our systems depend on the combinated action of a number of functional redundant organisms. Comparison of the abundance patterns of phenol degrading populations suggests a considerable degree of determinism, where the relative abundance of each species seems to be determined by the concentration of phenol in the feed. The kinetics characteristics of representatives of seven from eight LmPH groups, obtained using a wide range of culture conditions, exhibited a rather narrow range of physiological variability, suggesting that the ability of a particular bacteria to became a predominant member of the community under changing ambiental conditions cannot be infered exclusively from the phenol-degrading properties.

Girart, María Victoria. "Regulación de la actividad biológica de las células NK por receptores de tipo toll y por células dendríticas. Implicancias en la inmunidad contra tumores." (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células NK son células linfoides importantes en la defensa del huésped contra patógenos intracelulares y en la inmunovigilancia contra tumores. Ejercen su actividad biológica a través de la elaboración de citoquinas y el desarrollo de actividad citotóxica, funciones reguladas por familias de receptores activadores e inhibidores. Las células NK humanas expresan receptores de tipo Toll (TLRs) tales como TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9, entre otros. Sin embargo poco se conoce acerca del impacto de los agonistas de los TLRs en la funcionalidad de las células NK, en particular sobre sus funciones antitumorales. En años recientes, se ha demostrado que durante las etapas tempranas de activación de la respuesta inmune, existe una importante interacción entre las células NK y las células dendríticas (CDs), lo que perfila el desarrollo de una respuesta inmune efectiva. CDs maduras (CDm) a diferencia de CDs inmaduras (CDi) promueven, ente otras cosas, la activación y secreción de IFN-γ por células NK. Sin embargo, desconocemos el efecto de las CDs tolerogénicas (como las que se generan en el ambiente tumoral) sobre las células NK. En este trabajo, utilizamos agonistas de TLR3, TL7 y TLR9 (poliI:C, loxorribina y ODNs, respectivamente) con el objeto de estimular células NK en ausencia o en presencia de dosis subóptimas de IL-12, IL-15 o IFN-α, e investigamos la secreción de IFN-γ, citotoxicidad y expresión del receptor activador NKG2D. PoliI:C y loxorribina, en combinación con IL-12 pero no con IL-15, promovieron una intensa secreción de IFN-γ, la cual requirió de la internalización de los agonistas de los TLRs y fue dependiente de las vías de señalización de MEK1/ERK, p38 MAPK, p70S6 quinasa y NF-κB pero no de calcineurina. El IFN-α indujo un efecto similar siendo menor los niveles de IFN-γ secretado por las células NK. Sin embargo, la citotoxicidad (ensayos estándares de liberación de 51Cr) contra células blanco tumorales MICA- y MICA+ no fue regulada por los agonistas así como tampoco se observaron variaciones en los niveles de expresión de NKG2D. Interesantemente, la secreción de IFN-γ aumento significativamente luego de la estimulación con poliI:C o loxorribina e IL-12, cuando se realizaron co-cultivos con células tumorales MICA+ pero no cuando los co-cultivos se realizaron con células tumorales MICA-, efecto que fue dependiente de PI3K. Por otra parte, CDt no promovieron la secreción de IFN-γ por células NK tal como lo hicieron las CDs maduras. Este hecho reviste especial importancia ya que podría ocurrir que las CDt ejercieran efectos inhibitorios sobre las capacidades anti-tumorales desarrolladas por las células NK en el microambiente durante el curso de la respuesta inmune anti-tumoral natural o en respuesta a diferentes estrategias de inmunoterapia tales como la administración de agonistas de TLRs.

Abstract:
NK cells are lymphoid cells that play a key role during the immune response against intracellular pathogens and in the immunesurveillance against tumors. These cells exert their biologic activity through the secretion of cytokines and the display of cytotoxic activity against susceptible target cells. These functions are regulated by families of activating and inhibitory receptors. Human NK cells also express different Toll-like receptors (TLRs) such as TLR3, TLR7, TLR8 and TLR9, among others. However, little is known about the impact of agonists of these TLRs on NK cell functionality, in particular on their antitumor activity. In recent years, it has been shown that there exist an important interaction between the NK cells and dendritic cells (DCs) during the early activation of the immune response, which gives rise to the development of an effective immune response. Mature DCs (mDCs), in opposition to immature DCs (iDCs) promote, among others, the activation and IFN-γ secretion by NK cells. However, the effect of tolerogenic DCs (tDCs) (such as the generated in a tumor environment) on NK cells remains unknown. In this work, we used specific agonists of TLR3, TLR7 and TLR9 (polyI:C, loxoribine and ODNs, respectively) to stimulate human NK cells in the absence or in the presence of suboptimal doses of IL-12, IL-15 or IFN-α, and investigated the secretion of IFN-γ, cytotoxicity and expression of the activating receptor NKG2D. PolyI:C and loxoribine, in conjunction with IL-12 but not IL-15, promoted a robust secretion of IFN-γ, which required internalization of the TLR agonists and was dependent on MEK1/ERK, p38 MAPK, p70S6 kinase and NF-κB but not on calcineurin. IFN-α induced a similar effect but promoted lesser IFN-γ secretion. However, cytotoxicity (51Cr release assays) against MICA- and MICA+ tumor targets remained unchanged as well as the expression of the NKG2D receptor. Excitingly, IFN-γ secretion was significantly increased when NK cells were stimulated with polyI:C or loxoribine and IL-12, and NKG2D engagement was induced by coculture with MICA+ tumor cells but not with MICA- tumor cells, an effect that was dependent on PI3K. We also observed that tDCs were unable to promote IFN-γ secretion by NK cells. Conversely, mDCs were strong stimulators of IFN-γ secretion by NK cells. This fact is of critical relevance as it is likely that tDCs may exert their inhibitory effect on the anti-tumoral capabilities developed by the NK cells in the tumor microenvironment during the course of the natural anti-tumor immune response or in response to different immunotherapy strategies such as the administration of agonists of different TLRs.

Duffy, Tomás. "Desarrollo y aplicación de estrategias de PCR para la genotipificación y cuantificación de Trypanosoma cruzi" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La infección por el parásito Trypanosoma cruzi (T. cruzi), causante de la enfermedad de Chagas, sigue siendo un importante problema de salud pública en los 21 países endémicos de América, con una prevalencia estimada de 8 millones de personas infectadas. Esta enfermedad muestra un curso clínico variable, desde asintomática hasta fases crónicas con parasitemias bajas, cuya forma más severa es la cardiopatía. En diferentes regiones endémicas los pacientes se encuentran infectados con distintas poblaciones parasitarias que a su vez podrían desempeñar un papel en la patogenia, las formas clínicas y la gravedad de la enfermedad. Para el tratamiento de la enfermedad actualmente se dispone de quimioterapias que son más eficaces en las infecciones recientes que en la población adulta crónica. A su vez, la evaluación de la eficacia de nuevas drogas se encuentra seriamente comprometida dado que el criterio de cura actualmente se basa en la conversión serológica a negativa, lo que puede ocurrir sólo años después del tratamiento, lo que requiere un largo plazo de seguimiento. En este contexto, nos propusimos desarrollar ensayos de PCR cuantitativa (QPCR) sensibles y precisos para la cuantificación de la carga parasitaria que permitan evaluar tempranamente la eficacia o el fracaso de nuevas drogas tripanocidas, así como monitorear la respuesta al tratamiento con las drogas actuales en casos clínicos. El otro objetivo de la tesis ha sido el desarrollo de estrategias de PCR sensibles y con distintos grados de resolución para la genotipificación de T. cruzi. Estas técnicas permiten tipificar las poblaciones parasitarias directamente a partir de muestras biológicas y por lo tanto establecer asociaciones entre el genotipo del parásito y las formas clínicas de la enfermedad, así como evaluar el rol eco-epidemiológico de las distintas poblaciones parasitarias.

Abstract:
Infection with the parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi), which causes Chagas disease, remains a major public health concern in 21 endemic countries of America, with an estimated prevalence of 8 million infected people. Chagas disease shows a variable clinical course, ranging from asymptomatic to chronic stages with low parasitaemias, whose severest form is heart disease. Individuals from different endemic regions are infected with distinct parasite populations that may play a role in pathogenesis, clinical forms and severity of the disease. Current chemotherapies are unsatisfactory since they are more effective in recent infections than in the chronic adult population, and the criterion of cure relies on serological conversion to negative, which may occur only years after treatment, requiring long-term follow-up, hampering novel drug trails. In this context, we aimed to develop sensitive and accurate quantitative PCR strategies (QPCR) for T. cruzi quantification that may allow an early assessment of efficacy or failure of novel drugs in future trials, as well as to follow-up patients under etiological treatment with the currently available chemotherapies. The second aim of this thesis has been the development of sensitive PCR strategies for genotyping T. cruzi populations. These assays allow us to establish relationships between parasite genotypes and clinical forms of the disease, as well as to evaluate the eco-epidemiological role of distinct parasite populations.

Rosa, Silvina Mariana. "Las thraustochytriales (labyrinthulomycetes, heterokonta): caracterización de su biodiversidad en humedales salinos de la Argentina mediante un enfoque multidisciplinario y diseño de un bioproceso para la producción de ácidos grasos omega 3" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se obtuvieron más de 140 cepas de traustoquitriales de muestras recolectadas en una amplia variedad de humedales salinos argentinos a partir del mejoramiento de la metodología de aislamiento, que incluyó la formulación de dos nuevos medios de cultivo. Se estudiaron los caracteres taxonómicos tradicionales (rasgos morfológicos observados en cultivos en agua y cebos) de las cepas así como la morfología de las colonias, los requerimientos para su cultivo, el perfil de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) y la secuencia del gen ARNr 18S. El reconocimiento de grupos monofiléticos que incluyeron a los aislamientos y a otras traustoquitriales previamente estudiadas permitió la identificación en el nivel genérico de la mayoría de las nuevas cepas en base a los criterios recientemente propuestos y dio elementos para proponer que algunas de ellas serían nuevas especies. Se observó también la morfología a nivel ultraestructural en cepas identificadas como representantes de los taxones más abundantes (Ulkenia visurgensis, Schizochytrium sp., Thraustochytrium striatum, T. kinnei y T. aureum); esto permitió obtener mayor detalle sobre la formación de estructuras reproductivas. Los estudios de producción de PUFAs omega 3 se realizaron con la cepa modelo Aurantochytrium limacinum SR21. Se diseño un bioproceso en dos etapas, optimizándose las condiciones para la obtención de biomasa (primera fase) mediante una combinación de métodos estadísticos (Diseños Experimentales Estadísticos y Redes Neuronales Artificiales, entre otros). La utilización de esta biomasa en una segunda fase de producción permitió alcanzar una productividad máxima de 3.7 g de ácido docosahexaenoico l-1 d-1 en un biorreactor de 3,5 l.

Abstract:
More than 140 thraustochytrid strains were obtained from samples collected in Argentinean saline wetlands, once isolation methodologies were improved, including the formulation of two new culture media. Traditional taxonomic characteristics (morphological features in pollen seawater cultures) of strains were studied as well as other alternative characters (colony morphology, culture requirements, polyunsaturated fatty acids composition and 18SrRNA gene sequence). The finding of monophyletic groups including local isolates and other previously studied thraustochytrids allowed to identify most of new strains at genus level (according to new taxonomical rearrangements) and supported the proposal that several of them would be new species. Morphology at ultrastructural level of isolates recognized as representatives of the most abundant taxons (Ulkenia visurgensis, Schizochytrium sp., Thraustochytrium striatum, T. kinnei and T. aureum) gave more details about reproductive structures development. Omega 3 fatty acids production studies were carried out with the model strain Aurantiochytrium limacinum SR21. A two-stage bioprocess was designed, and conditions for biomass propagation (first stage) were optimized by a combination of statistical methods (Statistical Experimental Designs and Artificial Neural Networks, among others). Obtained biomass was used in a second production stage, reaching a maximal productivity of 3.7 g docosahexaenoic acid l-1 d-1 in a 3.5 l biorreactor.

Rivas, Martín Alfredo. "Participación del factor de necrosis tumoral alfa en la proliferación de carcinomas mamarios" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) es una citoquina pro-inflamatoria implicada en promover el crecimiento de ciertos tipos de cánceres. En el presente trabajo de Tesis se exploraron los caminos de señalización intracelulares que llevan al crecimiento de las células de cáncer de mama inducido por TNFα y su interacción con el receptor tirosina quinasa tipo I, ErbB-2. Nuestros resultados indicaron que el TNFα, actuando a través del receptor de TNFα tipo 1 (TNFR1), indujo la activación de las quinasas activadas por mitógenos p42 y p44 (p42/p44 MAPK), la quinasa del amino terminal de c-jun (JNK) y la fosfatidilinositol 3-fosfato quinasa / Akt (PI3-K/Akt), la activación del factor de transcripción Factor Nuclear κB (NF-κB) y la proliferación celular. También comprobamos que la administración de TNFα in vivo indujo el crecimiento del tumor C4HD en ratones Balb/c y que el tratamiento con un inhibidor selectivo de NF-κB, Bay 11-7082, resultó en la regresión parcial de dicho tumor de mama. Asimismo, el Bay 11-7082 bloqueó la capacidad del TNFα de inducir el aumento de la proteína promotora del ciclo celular ciclina D1 y de la proteína antiapoptótica Bcl-XL. Un importante hallazgo fue demostrar que el TNFα indujo la transactivación de ErbB-2 en células de cáncer de mama que sobreexpresan ErbB-2. En estas células, el TNFα activa a la tirosina quinasa c-Src, promueve la fosforilación de ErbB-2 en el residuo Tyr877, y favorece la formación del heterodímero ErbB-2/ErbB-3. Este último proceso lleva a la fosforilación de Akt, a la activación del factor de transcripción NF-κB, y al aumento en la expresión de ciclina D1. La presencia del inhibidor de ErbB-2, AG825, o de ARN cortos de interferencia (siRNA) contra ErbB-2, pero no la del anticuerpo monoclonal humanizado trastuzumab (HerceptinMR) abolió la fosforilación de ErbB-2, la activación de NF-κB y la proliferación inducidas por TNFα. Nuestro trabajo revela que el TNFα es capaz de transactivar a ErbB-2 y utilizarlo como un intermediario en la generación de señales mitogénicas. Dado que el TNFα se encuentra presente en un alto porcentaje de cánceres de mama, nuestros hallazgos tendrían una gran importancia en la comprensión de la biología de tumores de mama que sobreexpresan ErbB-2 como así también en la elección del tratamiento al cual los pacientes son sometidos.

Abstract:
Tumor necrosis factor alpha (TNFα) is a pro-inflammatory cytokine that promotes the growth of certain cancer types. In the present Thesis we explored signaling pathways involved in TNFα-induced breast cancer growth and its interaction with the tyrosine kinase receptor I, ErbB-2. Our results indicate that TNFα, acting through TNFR1, induces activation of p42/p44 MAPK, JNK and PI3-K/Akt, NF-κB activation and cell proliferation. TNFα, when administered in vivo, induced C4HD tumor growth on Balb/c mice and treatment with a specific inhibitor of NF-κB, Bay 11-7082, induced a partial regression of said breast tumor. Bay 11-7082 blocked TNFα ability of inducing the cell cycle promoter protein cyclin D1 and the antiapoptotic protein Bcl-XL. In addition we showed that TNFα induces ErbB-2 transactivation on breast cancer cells with ErbB-2 overexpression. We found that TNFα activates the tyrosine kinase c-Src, promotes ErbB-2 phosphorylation on Tyr877, and favors heterodimer formation between ErbB-2 and ErbB-3. This last event leads to Akt phosphorylation, NF-kB activation and to the increase in cyclin D1 protein expression. The presence of AG825, an ErbB-2 inhibitor, or small interference RNA (siRNA) to ErbB-2, but not the humanized monoclonal antibody trastuzumab (HerceptinTM) abolished ErbB-2 phosphorylation, NF-κB activation and TNFα-induced proliferation. Our findings reveal that TNFα is able to transactivate ErbB-2 and using it as an obligatory downstream signaling molecule in the generation of mitogenic signals. Given the fact that TNFα is present in a high percentage of invasive breast cancers, our work would be of importance for the understanding of breast cancer which overexpresses ErbB-2 and also for choosing the most appropriate treatment for patients.

De Lella Ezcurra, Ana Laura. "La sobre-expresión crónica del factor de necrosis tumoral alfa en la substantia nigra induce neurodegeneración y síntomas motores" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La neuroinflamación es considerada una característica neuropatológica de la enfermedad de Parkinson. Se ha observado activación de microglía y niveles elevados de citoquinas pro-inflamatorias, entre las que se encuentra el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), en la substantia nigra, una de las principales regiones del cerebro afectadas en esta enfermedad. Sin embargo, el rol funcional de la activación microglial y la sobre-expresión de TNF-α no es claro en la enfermedad de Parkinson. El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos de la sobre-expresión crónica de TNF-α en la substantia nigra, e identificar moléculas candidatas a mediar ese efecto. Para ello, se inyectó en la substantia nigra de ratas adultas un adenovector que expresa TNF-α (AdTNFα), pudiendo detectarse la citoquina recombinante hasta 14 días p.i. La expresión crónica de TNF-α indujo una pérdida progresiva de neuronas en la substantia nigra, que comenzó el día 14 y se acentuó a los 21 y 28 días p.i., comparado con animales controles inyectados con un adenovector que expresa β- galactosidasa (Adβgal). La sobre-expresión de TNF-α produjo la aparición de síntomas motores a los 14 días p.i.; y la activación de la microglía y/o reclutamiento de macrófagos de la periferia desde el día 7 luego de la inoculación. No se pudo detectar inducción de IL-1β ni evidencias de apoptosis. En cambio, se observó un aumento en los niveles de ciclooxigenasa tipo 2 (COX-2) y en la actividad de la óxido nítrico sintasa (NOS) en los animales que sobre-expresan TNF-α, por lo que dichas moléculas podrían estar participando de la muerte neuronal inducida por la citoquina. Por otro lado, se llevó a cabo un estudio de los genes regulados por TNF-α utilizando la técnica de microarrays. Entre los genes que se encontraron diferencialmente expresados entre los animales tratados con AdTNFα y Adβgal, estaban significativamente representados procesos relacionados con la respuesta inmune y el metabolismo. Se validó por RT- PCR en tiempo real la expresión disminuida de la proteína quinasa C tipo delta (nPKC- delta) y el regulador de la señalización por proteína G 3 (RGS3) en los animales que sobre-expresan TNF-α con respecto a los controles. En conclusión, podemos decir que la expresión prolongada de niveles pro- inflamatorios de TNF-α es suficiente para producir un efecto tóxico en las neuronas de la substantia nigra, con la aparición de síntomas motores y una respuesta glial característica. Los niveles y la duración de la expresión de esta citoquina son variables importantes para que ejerza un efecto neurodegenerativo. Se generó un modelo animal que permite estudiar los mediadores del efecto tóxico de TNF-α como lo demuestran los resultados de genómica funcional, sentando las bases para estudios futuros que puedan identificar blancos para una posible terapia contra la enfermedad de Parkinson.

Abstract:
Neuroinflammation is regarded as a neuropathological characteristic of Parkinson’s disease. Microglia activation and high levels of pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor alpha (TNF-α), have been reported in the substantia nigra, one of the main brain regions affected in this disease. The aim of this study was to determine the effects of the chronic overexpression of TNF-α in the substantia nigra, and to identify candidates to mediate that effect. To achieve this, an adenovector expressing TNF-α (AdTNFα) was injected in the substantia nigra of adult rats. We have been able to detect the recombinant protein until 14 days p.i. The chronic expression of TNF-α induced a progressive loss of neurons in the substantia nigra, which started 14 days p.i. and was more evident at 21 and 28 days p.i., compared to control animals injected with an adenovector expressing β-galactosidase (Adβgal). Chronic overexpression of TNF-α caused motor symptoms, appearing at 14 days p.i.; and activation of microglia and/or recruitment of macrophages form the periphery from day 7 after adenoviral inoculation. We could not detect induction of IL-1β expression, or evidences of apoptosis. On the other hand, we could observe increased levels of cyclooxygenase type-2 (COX-2) and increased activity of nitric oxide synthase (NOS) in animals overexpressing TNF-α, which suggests that these molecules could participate in the neuronal death induced by the cytokine. On the other hand, we studied the genes regulated by TNF-α using microarrays technology. We found that processes related to immune response and metabolism were significantly represented among de genes differentially expressed in AdTNFα and Adβgal injected animals. Using real time RT-PCR, we validated the downregulation of protein kinase C delta type (nPKC-delta) and regulator of G-protein signaling 3 (RGS3) in animals over-expressing TNF-α, compared to controls. Thus, we conclude that long-lasting expression of pro-inflammatory levels of TNF-α is sufficient to produce a toxic effect on neurons in the substantia nigra, as well as motor symptoms and a characteristic glial response. Levels and duration of TNF-α expression are important variables to establish its neurodegenerative effect. This study provides an animal model to study the mediators of the toxic effect of TNF-α as shown by the results of functional genomics, laying the foundations for future studies with the final objective of identifying possible therapeutic targets for Parkinson’s disease.

Viale, Diego Luis. "Caracterización y desarrollo de promotores quimera que permitan la replicación viral específica en el entorno tumoral" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los tumores están compuestos de una masa heterogénea de células tumorales que incluyen células estromales asociadas que pueden convertirse en una barrera para la lograr una terapia exitosa contra la enfermedad. En los últimos años, los Adenovirus Replicativos Condicionales (CRAds) regulados por promotores recombinantes surgieron como una nueva modalidad de terapia para el cáncer. SPARC se encuentra expresada en forma muy elevada tanto en células tumorales como en endotelio y en los fibroblastos activados de tumores. A partir de estos datos, decidimos utilizar al promotor de SPARC para dirigir la replicación de los virus tanto en las células tumorales como en las células que forman parte del tumor. Logramos clonar un promotor que demostró mayor actividad en las células que expresan SPARC (F512) que se utilizó para dirigir la replicación de un CRAd (Ad-F512). Ad-F512 tiene efecto oncolítico en diferentes líneas celulares de melanoma y en ensayos in vivo se observó la eliminación de tumores SB2. Por el contrario, los tumores de melanoma A375N, Mel J y el tumor SB2/WI-38, que combina células de melanoma con fibroblastos, su efecto oncolítico es muy reducido. Para aumentar su eficacia adicionamos secuencias de ADN conteniendo elementos de respuesta a diferentes condiciones pato‐fisiológicas que caracterizan al tejido tumoral para aumentar la replicación. A partir de los resultados obtenidos, seleccionamos el promotor kBF512HRE conteniendo elementos de respuesta a hipoxia (HRE) y elementos de respuesta a NFkB (kB). Construimos el CRAd Ad-kBF512HRE que eliminó el tumor SB2/WI-38 en todos los ratones pero no se observa el mismo efecto sobre tumores Mel-Les y A375N. A partir de estos resultados se cambió la fibra adenoviral involucrada en el pegado al receptor celular y el virus resultante, Ad-5/3-kBF512HRE tiene efecto anti-tumoral sobre los tumores Mel-Les. Estos resultados indican que la adición de elementos de respuesta a condiciones que caracterizan al tejido tumoral y el cambio de la proteína involucrada en la unión al receptor celular aumentan el efecto terapéutico de un CRAd en las líneas celulares resistentes y, además, pueden sobrepasar la restricción en la replicación que implica la presencia de células estromales.

Abstract:
Human tumors are composed of a heterogeneous mass of malignant cells that also include tumor‐associated stromal cells that might become a barrier for successful therapies. In the last years, Conditionally Replicative Adenoviruses (CRAds) regulated by recombinant promoters appear as a new modality for cancer therapy. SPARC is over‐expressed in tumor cells and associated-endothelial and –fibroblast cells. Due to these results we utilized SPARC promoter for transcriptional regulation due to its overexpression on tumor melanoma cells and tumor associated stromal cells. We cloned a promoter that shows higher transcriptional activity in SPARC-expressing cells (F512) and we used to drive adenoviral replication (Ad-F512). This CRAd shows oncolytic activity in different melanoma cell lines and stromal cells and eliminated SB2 tumors in vivo, however, in A375N, Mel J and mixed tumor cell /fibroblast SB2/WI-38, its oncolytic effect was strongly reduced. In order to improve its efficacy we added DNA sequences containing responsive elements to different patho‐physiological conditions that characterize tumor tissue to increase its replication. Based on their activity/ specificity ratio we selected kBF512HRE, containing Hypoxia Response Elements (HRE) and NFkB response elements (kB). We constructed Ad-kBF512HRE and eliminated SB2/WI-38 tumor in all mice, on the other side, this effect was not observed on A375N and Mel-Les tumors. After this, we changed the adenoviral fiber, protein responsible of cellular receptor attachment. Ad-5/3-kBF512HRE eliminates 2/4 tumors of AdkBF512HRE-resistant Mel-Les tumors. These results indicate that addition of enhancer elements responsive to tumor-environmental conditions and fiber change improved the therapeutic effect of a CRAd over resistant cells and might overcome the restriction imposed by the presence of stromal cells.

Lodillinsky, Catalina. "Rol de los receptores activadores de la proliferación de peroxisomas del subtipo gamma el el cáncer de vejiga" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
PPARg es miembro de la superfamilia de receptores nucleares que son factores de transcripción activados por su ligando. BCG es el tratamiento de elección para el cáncer devejiga (CaV) que no invade músculo. Nos propusimos estudiar el rol de éste receptor bajo el tratamiento de BCG en ésta patología. Encontramos que BCG es capaz de inducir la expresión de PPARg en células de CaV murinas, MB49 y los ligandos de PPARg potencian este efecto. La actividad transcripcional de PPARg también es aumentada por BCG y potenciada por 15-d-PGJ2, ligando de PPARg. Al mismo tiempo BCG induce en las líneas de CaV la expresión de iNOS y la consecuente producción de óxido nítrico (NO). Los ligandos de PPARg inhibirían la producción de NO inducida por BCG, por un mecanismo PPARg independiente pero dependiente de la vía de NF-kB. In vivo, BCG inhibe el crecimiento de tumores, efecto bloqueado por BADGE, antagonista de PPARg indicando que parte del mecanismo de acción de BCG es a través de PPARg. BCG induce la expresión de colágeno, SMA-alfa y FGF-2, al mismo tiempo induce la proliferación de los fibroblastos in vitro. RO revierte el efecto inhibitorio ejercido por BCG, inhibiendo diferentes funciones de macrófagos y fibroblastos. BCG media su mecanismo de acción antitumoral, en parte, a través de PPARg pero su activación in vivo con agonistas exógenos puede ser contraproducente dado su funcionalidad en el sistema inmune. Obtuvimos una nueva línea celular, MB49-I y desarrollamos un modelo murino ortotópico con distinto grado de invasión. Al evaluar la expresión de PPARg en éste modelo, observamos que PPARg está aumentado en tumores superficiales comparado con la vejiga normal, mientras que se pierde en vejigas portadoras de tumor invasor. En tumores vesicales de pacientes observamos que un mayor número de pacientes con tumores invasores expresa bajos niveles de PPARg comparado con aquellos pacientes con tumores no invasores, sugiriendo que PPARg podría estar involucrado en la progresión de tumores de vejiga.

Abstract:
Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma (PPARg) is a member of the nuclear receptor superfamily of ligand-activated transcription factors that is involved in cell growth and differentiation as well as inflammatory processes. We found that BCG is able to induce PPARg expresión in bladder murine cell line MB49. Transcriptional activity of PPARg is also increased by BCG and it is enhanced by 15-d-PGJ2, a PPARg ligand. At the same time, PPARg ligands enhance BCG-induced cell death. BCG also induces iNOS expression and NO production. PPARg ligands inhibits NO production induced by BCG. In vivo, BCG inhibits tumor growth, but RO reverses that effect. RO inhibits different functions associated to activated macrophages induced by BCG. In vitro, BCG induces fibroblast proliferation and in vivo, induces collagen, FGF-2 and alpha-SMA expresión. RO decreases that induction. We have generated a new cell line, MB49-I and we developped a new murine ortothopic model with different levels of invasion. PPARg is increased in superficial tumors compared to normal bladder, meanwhile, this expression is reduced in invasive tumors. In patients, we observed that invasive tumors express low level of PPARg compared to those with non-invasive tumors. PPARg is involved in the mechanism of action of BCG, but his activation could be not recommended in vivo, since it has a relevant role in the inmune system. PPARg expression is decreased in invasive tumors, which suggests that this transcription factor plays a key role during progresion in bladder tumors.

Peluffo, Guillermo D.. "Rol de la ciclooxigenasa-2 en la progresión de tumores de pulmón y mama" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Diversos tipos de tumores poseen elevados niveles de expresión de la ciclooxigenasa-2 y de producción de prostaglandinas. El uso de los antiinflamatorios no esteroides resultó beneficioso en el tratamiento de distintos modelos tumorales, a veces independientemente de la expresión de las ciclooxigenasas, sus blancos primarios. Nuestro objetivo en este trabajo de tesis fue estudiar el papel de la COX-2 en la progresión de distintos modelos tumorales. Utilizamos el adenocarcinoma de pulmón murino LP07 y hallamos que la COX-2 es un componente importante del comportamiento maligno de estas células. En este modelo, la inhibición de la COX-2 redujo el crecimiento del tumor primario y el desarrollo metastásico así como también los síndromes paraneoplásicos provocados por el tumor. La COX-2 y la PGE2 tienen un papel clave en la modulación de la supervivencia de las células LP07, que ejerce modulando las actividades de las quinasas Akt y p38, así como también la actividad del factor de transcripción NF-κB. En los adenocarcinomas de mama murinos LM3 y LMM3 la importancia de la COX-2 es menos relevante, ya que si bien el uso de un inhibidor selectivo de esta enzima, el celecoxib, produjo esencialmente los mismos resultados que en las células LP07, un análogo carente de actividad inhibitoria se comportó de manera similar. La PGE2 exógena no revirtió ninguno de los efectos del celecoxib. En estas células, la modulación de la biología tumoral involucró también un aumento de la apoptosis y el arresto del ciclo celular posiblemente mediado por p21 y p27. Finalmente, utilizamos un modelo más complejo, con el cocultivo de células de un carcinoma ductal in situ de mama humano y fibroblastos inflamatorios de artritis reumática. Las células del CDIS MCF10DCIS.com no expresan COX-2, la cual es inducida cuando son cocultivadas con los fibroblastos de AR. Encontramos que los fibroblastos inducen la progresión hacia el carcinoma invasivo, en parte modulada por la COX-2, cuya inhibición disminuyó los niveles de la MMP-14 y la actividad de la MMP-9. La inhibición de la COX-2, el NF-κB y la MMP-9 redujo la capacidad invasiva de las células MCF10DCIS.com inducida por las interacciones con los fibroblastos inflamatorios. En conjunto, este trabajo sugiere la utilidad de los inhibidores de la COX-2 para el tratamiento de la progresión tumoral y la participación de esta enzima en la modulación del comportamiento de algunos tumores ya sea mediante su expresión constitutiva o inducida por un microambiente inflamatorio.

Abstract:
COX-2 expression is increased in a number of tumors along with elevated PG production. NSAID treatment was found to have antitumor properties in different types of cancers, although the dependency of COX-2 inhibition remains controversial, in spite of being their primary target. We aimed to study the role of COX-2 in tumor progression using different cancer models. We found that COX-2 is a key player for the malignant behavior of the LP07 murine lung adenocarcinoma. COX-2 inhibition delayed not only tumor growth but also the metastatic outcome and the development of paraneoplastic syndromes. COX-2 and PGE2 were found to have an important role for LP07 cell survival by modulating the Akt and p38 kinase activities and the transcription factor NF-κB. The relevance of COX-2 activity in the murine mammary adenocarcinomas LM3 and LMM3 was somewhat less important. The COX-2 specific inhibitor celecoxib renders nearly the same outcome in these cells than in LP07 cells. However the closely related analogue dimethyl-celecoxib, devoid of COX-2 inhibitory activity, was found to be equally effective. Moreover, exogenously added PGE2 did not revert the effect of celecoxib. The antitumor properties also involved an increased apoptosis and the cell cycle arrest possibly modulated by p21 and p27. Finally, we studied the role of COX-2 in mediating the interaction between breast cancer epithelial cells and inflammatory fibroblasts leading to the transition between DCIS and invasive carcinoma. The MCF10DCIS.com cells express COX-2 upon coculture with rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. We found that RASF-induced progression to invasive carcinoma involved in part the induction of COX-2 expression, and that MMP-14 levels and MMP-9 activity were reduced by COX-2 inhibition. The increased invasiveness of MCF10DCIS.com cells acquired though the interaction with the inflammatory fibroblasts were lowered by COX-2, MMP-9 or NF-κB inhibition. Taken together, these results suggest COX-2 inhibitors are useful antitumor drugs and the key role for COX-2 in modulating the behavior of some tumors by being either constitutively expressed or induced by an inflammatory stroma.

Solano, María Emilia. "Mecanismos moleculares involucrados en la activación de linfocitos T y su relación con procesos de androgenización incrementada" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El síndrome del ovario poliquístico (SOP) es un desorden endocrino que afecta a mujeres en edad reproductiva, constituyendo una de las primeras causas de infertilidad por anovulación. Asimismo, los andrógenos promueven la acumulación abdominal de la adiposidad que se relaciona a insulino-resistencia e inflamación crónica sistémica. Tanto a nivel ovárico como sistémico existen evidencias de que el sistema inmune contribuiría a la patogénesis del SOP. Por ello en este trabajo se estudiaron alteraciones inmunes, metabólicas y endocrinas en un modelo murino de SOP por androgenización con dehidroepiandrosterona (DHEA). A nivel sistémico, se observó mayor peso corporal, insulino-resistencia y parámetros de inflamación crónica incrementados Los quistes ováricos mostraron una expresión alterada de moléculas de adhesión que coincidió con infiltración leucocitaria, daño tisular, incremento en el estrés oxidativo y disminución de la prostaglandina E2 ovárica. In vitro, DHEA incrementó la expresión de moléculas de adhesión y marcadores de activación en leucocitos pero falló en estimular su proliferación y secreción de citoquinas. Estos resultados muestran que el sistema inmune colabora en los desórdenes ováricos y sistémicos inducidos en este modelo de SOP. DHEA promueve la activación leucocitaria in vitro pero no puede inducir por si misma una respuesta inflamatoria completa, resaltando la importancia del ambiente endócrino y metabólico en las alteraciones inmunes asociadas a SOP in vivo.

Abstract:
Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) is an endocrine disease that affects women in their reproductive age. It is one of the main causes of anovulatory sterility and is associated to abdominal fat distribution, which often leads to insulin resistance and chronic inflammation. Increasing evidence points that immune system could contribute to PCOS symptoms both at systemic and ovarian levels. Therefore, the aim of this study was to study the alterations on immune, metabolic and endocrine features induced by dehydroepiandrosterone (DHEA) administration as a murine model of PCOS. The ovarian cysts showed an altered expression of adhesion molecules, that lead to increased leucocyte infiltration, tissue damage, oxidative stress and reduced levels of prostaglandin E2 in the ovary. Furthermore, the animals showed increased weight gain, insulin resistence and chronic inflammation markers. In vitro assays showed that DHEA per se stimulates the adhesion molecules and activation markers expression but fails to induce proliferation and cytokine production. Therefore, we conclude that immune system is involved both in the ovary and the systemic DHEA-induced alterations. DHEA itself promotes leucocytes activation but fails to elicit a complete inflammatory response, highlighting the role of the endocrine and metabolic environment in PCOS.

Radic, Claudia Pamela. "Genética molecular de hemofilia: caracterización de mutaciones en hemofilia B, expresión de hemofilia en mujeres y desarrollo de nuevos métodos de análisis de inversiones" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las hemofilias A (HA) y B (HB) son coagulopatías hereditarias, ligadas al cromosoma X (X), sufridas por varones (1:5000) y raramente por mujeres, causada por defectos génicos del factor VIII (F8) y IX (F9), respectivamente. Para caracterizar el espectro de mutaciones causales de HB en Argentina se aplicó un esquema original de 12 amplímeros para el F9, incluyendo un screening por CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis), en 49 familias, y se identificaron 29 cambios missense (60%), 7 nonsense (14%), 4 defectos de splicing (8%), 2 pequeñas inserciones‐deleciones (4%), 6 grandes deleciones (12%) y un cambio en región promotora del F9. Dos cambios missense no reportados mostraron, uno la disrupción de un puente disulfuro y otro la destrucción de un sitio de γ‐carboxilación condicionando el fenotipo de HB severa. Para mejorar la estrategia de detección de grandes rearreglos que involucran int22h e int1h en el F8, causales del 50% de las HA severas, se desarrolló un abordaje nuevo, inverse‐shifting‐PCR (IS‐PCR). Mediante el uso de un test diagnóstico para la inversión del intron 22 (Inv22), los resultados de IS‐PCR fueron validados por perfecta concordancia en 32 y 43 casos previamente estudiados por Southern blot y PCR inversa, y en 34 casos nuevos. El uso conjunto del test diagnóstico y complementario sobre las series de nuestra población, no mostró las variantes estructurales, i.e., deleciones y duplicaciones hipotetizadas en la literatura. El test para la inversión del intrón 1 fue validado por perfecta concordancia en 21 casos estudiados por doble PCR y en 13 casos nuevos. Para investigar la utilidad de IS‐PCR en diagnóstico prenatal, muestras de vellosidades coriónicas de una madre portadora de la Inv22 y su feto nonato fueron diagnosticadas. Para estudiar la causa de la expresión de HA severa en mujeres portadoras heterocigotas se ajustó y validó el sistema del gen HUMARA para estimar el patrón de inactivación del X (XIP). Se estudiaron 6 mujeres con HA severa: una mostró la mutación c.3633delA en hemi‐homocigosis, 4, mostraron la mutación en heterocigosis y sesgo extremo en el XIP, y un caso, heterocigota para c.4388_4391delCTTT, mostró XIP no sesgado en leucocitos de sangre periférica (hipotetizando una inactivación hepática distinta). En una serie de 37 portadoras heterocigotas, y un grupo control de 20 no portadoras, se estudió la correlación XIP‐FVIII:C mediante análisis de contingencia y de errores respecto a un modelo teórico original (Obs.‐Esp.), obteniéndose modestas diferencias significativas (p menor a 0,05) asociadas a una gran dispersión de FVIII:C. Este trabajo presentó la primera serie molecular de mutaciones causales de HB en Argentina, el desarrollo de una nueva estrategia para el estudio de las grandes invers.

Abstract:
Hemophilia A (HA) and B (HB) are X‐chromosome (X) linked inherited coagulation disorders suffered by men (1:5000) and rarely by women, which are caused by gene defects of factor VIII (F8) and IX (F9), respectively. To characterize the spectrum of HB causative mutations in Argentina, an original scheme of 12 amplicons for F9 including a screening by CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis) was applied in 49 families identifying 29 missense mutations (60%), 7 nonsense (14%), 4 splicing defects (8%), 2 small insertions‐deletions (4%), 6 large deletions (12%) and one change in the F9 promoter region. Two previously unreported missense changes showed a disruption of a disulfide bridge, and the destruction of a site for γ‐ carboxylation by analysis in silico, both conditioning the severe HB phenotype. To improve the genotyping strategy for large rearrangements involving int22h and int1h in the F8 that cause 50% of severe HAs worldwide, we design and developed a new approach, inverse‐shifting‐PCR (IS‐PCR). Using a diagnostic test for analysis of the intron 22 inversion (Inv22), IS‐PCR results were validated by obtaining perfect agreement, in 32 and 43 cases previously studied by Southern blot and a former inverse PCR approach; and in 34 new cases. The combined use of a complementary and a diagnostic test over our population series showed no structural variants, i.e., deletions and duplications hypothesized in the literature. The test for genotyping F8 intron 1 inversion was validated by perfect result agreement in 21 cases previously studied by double PCR, and 13 new cases. To investigate the usefulness of IS‐PCR in prenatal diagnosis, chorionic villus samples from an Inv22 carrier mother and her fetus were diagnosed. To study the cause of severe HA expression in heterozygous female carriers a system of the gene HUMARA for estimating X‐inactivation patterns (XIP) was adjusted and validated. We studied 6 women with severe HA: one showed an hemi‐homozygous mutation, c.3633delA, 4 showed heterozygous mutations with extremely skewed XIP; and one case, heterozygous for c.4388_4391delCTTT, showed a non skewed XIP in peripheral blood leukocytes (hypothesizing a different hepatic inactivation). A series of 37 heterozygous carriers and a control group of 20 non‐carriers were studied for XIP‐FVIII: C correlation. We analyzed contingency tables and relative errors (Obs.‐ Esp.) applying an original theoretical model and found modest significant differences (p minor than 0.05) associated with a wide variation of FVIII:C. This work presented the first molecular series of HB causative mutations in Argentina, the development of a new strategy for characterization of large DNA inversions causing severe HA and investigate the causes of a full expression of severe HA phenotype in women.

Wargon, Victoria. "Resistencia constitutiva y adquirida al tratamiento hormonal de carcinomas mamarios murinos" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los mecanismos por los cuales los estrógenos y los progestágenos, a través de sus respectivos receptores (RE y RP), participan en el desarrollo y crecimiento del cáncer de mama es un tema de gran interés ya que su detección se utiliza como factor pronóstico y orienta la terapéutica hacia una de tipo hormonal. En nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo experimental de adenocarcinomas mamarios murinos inducidos por acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Se establecieron líneas tumorales hormono-dependientes (HD) y hormono-independientes (HI) que expresan RE, alfa (REα) y beta (REβ), y las dos isoformas del RP (RPA y RPB). Los tumores HI se clasifican en respondedores (sensibles) y resistentes a la terapia con antiprogestágenos. Hemos generado a su vez por presión selectiva variantes tumorales con resistencia adquirida a los mismos. Utilizando tres familias tumorales de este modelo, demostramos que los tumores sensibles expresan mayor nivel de RPA que de RPB, mientras que lo opuesto se observa en los resistentes. Esta diferencia sería un posible marcador para discriminar un tumor sensible de uno resistente. Pudimos determinar que la resistencia adquirida puede revertir ya sea por tratamiento hormonal, o por cultivo y en todos los casos esta reversión se ve acompañada de la reexpresión de RPA. Demostramos que el silenciamiento de RPA en los tumores con resistencia adquirida se debe a metilación del promotor de PRA y que el tratamiento con el agente desmetilante 5azadC desensibiliza los tumores al antiprogestágeno. No hemos podido hasta el momento dilucidar cuál es el mecanismo que silencia la expresión de RPA en los tumores con resistencia adquirida, sin embargo la plasticidad que observamos en la expresión de esta isoforma nos hace pensar que se trataría de algún otro mecanismo epigenético. La fuerte correlación que hemos observado a lo largo de este trabajo de investigación entre la expresión de RPA y la sensibilidad a los antiprogestágenos sugieren que la terapia con antiprogestágenos debería ser considerada como posible tratamiento para tumores de mama con alta expresión de RPA.

Abstract:
The mechanisms by which estrogens and progestins activate estrogen (ER) and progesterone receptors (PR) respectively are still a main and controversial area in breast cancer research. The detection of these receptors is used as a prognostic factor and patients with high levels of ER and PR will be treated with a hormone therapy aimed to block estrogen synthesis or to inhibit ER activation. There is however compelling evidence that points out that PR is also involved in the development and progression of breast carcinomas. In our Laboratory we have developed an experimental model of mammary carcinomas induced by the continuous administration of medroxyprogesterone acetate (MPA) into BALB/c female mice. MPA-dependent tumors (HD) are maintained by syngeneic transplantations in MPA-treated mice. Spontaneously, tumors which are able to grow without exogenous hormone supply may arise, and these are referred to as hormone independent tumors (HI). Both tumor types express ER alpha (ERα) and beta (ERβ), and both isoforms of PR (PRA and PRB). HI tumors are classified as antiprogestin responsive or antiprogestins resistant tumors. We have already demonstrated that PR play a key role mediating tumor growth in both tumor types since antisense oligonucleotides of PR and different antiprogestins inhibit their growth. In this study we analyzed 3 responsive, 3 acquired resistant and 2 constitutive resistant tumors from three different tumor families from the MPA breast cancer model. We demonstrated that the difference between these responsive and resistant tumors relies in the PRA/PRB ratio, being PRA higher than PRB in responsive tumors. Interestingly the acquired resistant phenotype was possible to be reverted and this reversion was significantly associated with an increase in PRA expression. We demonstrated that only in the constitutive-resistant tumors, PRA expression was silenced by DNA methylation. This prompted us to investigate whether the treatment of constitutive resistant tumors with a demethylating agent could restore PRA expression and antiprogestins responsiveness. We found that 5-aza- 2 ́-deoxycytidine treatment induced PRA expression and RU-486 responsiveness in vitro and in vivo experiments. Furthermore, high levels of DNA methyltransferase (Dnmts) were detected in these tumors. In conclusion, our results suggest that methyltransferase inhibitors in combination with antiprogestins may be effective in the treatment of constitutive-resistant carcinomas with a high DNA methyltransferase level. The correlation between PRA expression and antiprogestins responsiveness supports the hypothesis that antiprogestin should be used for the treatment of breast cancer patients showing high expression of PRA.

Taminelli, Guillermo Luis. "Estudio de la expresión del gen CISD1 mediada por la actividad del CFTR" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva producida por mutaciones en el gen que codifica el canal de cloruro CFTR. Muy poco se sabe sobre los mecanismos moleculares involucrados en el daño celular producido por la falla del canal CFTR. Mediante la metodología de “Display Diferencial” o “Differential Display” (DD) observamos que la expresión del gen de origen nuclear CISD1 (CDGSH Iron Sulfur Domain 1) estaba disminuída en un modelo celular de FQ. Dado que el DD es una técnica que aporta evidencias pero es susceptible a falsos positivos y negativos, se decidió que el primer enfoque de esta Tesis fuera corroborar los resultados del DD. Para ello se utilizaron técnicas como RT-PCR semi cuantitativas y RT seguida de PCR en tiempo real para medir los niveles de expresión de CISD1 en distintos modelos celulares de FQ o con células que expresasen CFTR wt en presencia de inhibidores o activadores del CFTR. Ya que CISD1 es un gen que se encuentra en el genoma nuclear, el siguiente enfoque de esta Tesis fue determinar la localización subcelular de su producto. En este caso, se utilizó la expresión de una quimera unida a EGFP y mediante microscopía confocal pudimos demostrar que CISD1 codifica una proteína de localización mitocondrial. La localización mitocondrial fue confirmada por Wiley y col. Ellos además reportaron que CISD1 posee un grupo prostético del tipo 2Fe-2S en lugar de Zinc, como postulamos en un principio debido a su estructura primaria. La función de esta proteína es desconocida, pero estudios hechos en mitocondrias aisladas de células cardíacas de un ratón nulo (-/-) para mitoNEET (CISD1 en humanos) presentaban disminuída en un 30 % la capacidad máxima de la fosforilación oxidativa medida en estado 3. Además, en un trabajo anterior de Colca y colaboradores, se reportó que la proteína Minner-1 de ratón (producto de splicing alternativo de CISD1) co-inmuno precipitó con proteínas pertenecientes al complejo l de la cadena de transporte de electrones. Luego de que comprobamos su localización mitocondrial mediante la quimera GFP-CISD1, nuestro siguiente objetivo fue determinar si la actividad del complejo I mitocondrial se encontraba afectada por la expresión diferencial de CISD1 (un efecto observado en FQ por Grabriel Valdivieso en su Tesis, aún no publicado). Para tal fin medimos la actividad in gel del CIm mediante la técnica “Blue Native-PAGE” (BN-PAGE), en mitocondrias extraídas desde diferentes modelos experimentales de células FQ transfectadas con CISD1 salvaje y células Caco-2 (no FQ) transfectadas con un variante mutada de CISD1 obtenida por mutagénesis dirigida en las cisteínas 72 y 74 que fueron reemplazadas por serinas en un plásmido de expresión para eucariotas pcDNA 3.1(-). Así, observamos que la disminución significativa de la actividad del CIm reportada por Valdivieso y col. en distintos modelos FQ era restaurada por la expresión ectópica de CISD1, mientras que la variante mutada de CISD1 moduló negativamente la actividad normal del Clm en células Caco-2 (no FQ).

Abstract:
Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene encoding the CFTR chloride channel. Very little is known about the molecular mechanisms involved in the disease. Using the methodology of "Differential Display" (DD), we observed that the expression of the nuclear gene CISD1 (CDGSH Iron Sulfur Domain 1) was decreased in a cell model of CF. Since DD is a technique that might provide false positive or negative results, the results has to be validated by using other methods. Thus, the first objetive of this Thesis was to corroborate the DD results. For this purpose, we used semi-quantitative RT-PCR and RT followed by real-time PCR to measure the expression levels of CISD1 in different CF cell models. We also used non-CF cells in presence of CFTR inhibitors or activators. Since CISD1 is a gene found in the nuclear genome, the following focus of this thesis was to determine the subcellular location of the CISD1 product. We used the expression of a chimera containing CISD1 linked to EGFP and by using confocal microscopy we could show that CISD1 indeed encodes for a protein of mitochondrial localization, as the program PSORT previosuly predicted. The mitochondrial location was also confirmed by Wiley et al. They reported that CISD1 has a 2Fe-2S type prosthetic group instead of zinc as we originally thought. The function of this protein is unknown yet, but studies done in isolated mitochondria of cardiac cells from a null (-/-) mouse for mitoNEET (CISD1 in humans) had decreased by 30% the maximal capacity of oxidative phosphorylation measured in state 3. Furthermore, in a previous work, Colca et al. reported that the mouse protein Minner-1 co-immune precipitated with proteins belonging to the mCl of the electron transport chain (ETC). We also showed previously (Valdivieso et al), that the mitochondrial protein ND4, which belong to the mitocondrial complex I, was reducen in FQ. Therefore, our next goal was to determine whether mitochondrial complex I activity was affected by the differential expression of CISD1. To this end, we measured the in gel mCl activity using the "Blue Native-PAGE (BN-PAGE) technique, in mitochondria extracted from different experimental models of CF cells, transfected with CISD1 wt, and non- CF cells transfected with a mutated variant of CISD1. We observed that the significant decrease in the mCl activity reported by Valdivieso et al. in different CF models, can be partially restored by the CISD1 ectopic expression, while the mutated variant of CISD1 down modulated the normal mCl activity in non-CF Caco-2 cells.

Larzábal, Mariano. "Identificación de péptidos bloqueantes del sistema de secreción de tipo III y de la adherencia a epitelios de Escherichia coli enterohemorrágico (EHEC) y Escherichia coli enteropatógeno (EPEC)" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Escherichia coli Enteropatógeno (EPEC) y Escherichia coli Enterohemorrágico (EHEC) se encuentran asociadas con diarrea en seres humanos. EPEC es una de las principales causas de diarrea infantil en países desarrollados, mientras que EHEC es responsable de enfermedades cuyo espectro clínico incluye diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH), que es la principal causa de insuficiencia renal aguda de niños menores de 5 años en la Argentina. La expresión de la toxina Shiga (Stx) codificada por bacteriófagos integrados al cromosoma de cepas EHEC, es considerada la responsable de la colitis hemorrágica y el SUH. El principal reservorio de EHEC es ganado bovino sano a pesar de que un número limitado de serotipos se han asociado con diarrea en terneros jóvenes, mientras que el reservorio de EPEC son los niños sintomáticos y asintomáticos. Ambos patotipos de E. coli, al igual que Citrobacter rodentium, poseen un isla de patogenicidad conocida como Locus of enterocyte effacement (LEE). El LEE codifica para el sistema de secreción de tipo III (SSTT), cuya función es traslocar proteínas efectoras a los enterocitos, provocando la subversión celular. Este resulta en la formación de lesiones características de attaching and effacement (A/E) en el epitelio intestinal, que consisten en la destrucción de las microvellosidades y la formación de pedestales de actina polimerizada por debajo del sitio de contacto entre la bacteria y la célula. El SSTT es una estructura compleja con más de 20 proteínas que forman un sistema de 'aguja y jeringa' que permite inyectar proteínas efectoras directamente en la célula hospedadora. El LEE contiene cinco grandes operones que han sido completamente secuenciados: LEE1, LEE2, LEE3, LEE4 y LEE5. EspA, EspB y EspD son algunas de las proteínas codificadas por el LEE4 que componen la parte del traslocon del SSTT. EspA, es la proteína mayoritaria, y sus polímeros forman filamentos huecos (estructura aguja), que están presentes de manera transitoria. EspB y EspD, se asocian al extremo del filamento y están involucrados en la formación de poros en las membranas de las células infectadas. El extremo proximal del filamento de EspA se apoya sobre el cuerpo basal formado por polímeros de la proteína EscF, que también se encuentra codificado en el LEE4. La proteína de membrana externa intimina, se encuentra codificada en el LEE5, y es responsable de la adherencia íntima de la bacteria al enterocito, así como también su propio receptor Tir, que es traslocado a través de la SSTT al citoplasma para luego anclarse en la membrana celular. Con el fin de utilizar a los factores de virulencia responsables de la lesión A/E como blancos de terapias de intervención, se determinó la inmunogenicidad y la antigenicidad de las proteínas del sistema de secreción de tipo III y la adhesina intimina empleando calostro de bovinos naturalmente infectados o colonizados. Los resultados demostraron que el calostro de bovinos no vacunados, proveniente de ganado lechero y cárnico de la región Pampeana de la Argentina, contiene una alta frecuencia de anticuerpos contra las proteínas intimina-γ C280, EspA y EspB. Por otro lado, también se obtuvieron sueros policlonales a partir de conejos inmunizados con proteína EspA, EspB y N-EspD recombinantes, demostrando la capacidad por parte de estas proteínas de inducir elevados títulos de respuesta inmune humoral en anticuerpos IgG. En este trabajo, se observó que tanto el calostro bovino como anticuerpos policlonales específicos contra proteínas del SSTT, inhibieron la acción mediada por SSTT de EPEC 2348/69 sobre los GRs de manera dependiente de la dosis, demostrando que compuestos dirigidos contra el SSTT pueden inhibir su funcionalidad. Estos efectos protectores han sido parcialmente atribuidos a la presencia de anticuerpos contra componentes del SSTT, ya que una reducción significativa en la actividad inhibitoria fue obtenida cuando el calostro o los sueros policlonales fueron depletados de IgG total. La inmunogenicidad, antigenicidad y exposición en superficie de varios de los componentes responsables de la lesión A/E, los convierte en potenciales candidatos para vacunas, y moléculas blanco para péptidos y otros compuestos. Por lo tanto, resulta atractiva la estrategia de utilizar a los factores de virulencia como blanco de terapias de intervención. Con el objetivo de impedir el desencadenamiento de la acción del SSTT por parte de EHEC y EPEC, se utilizó la técnica de phage display para disponer de péptidos de 12 aminoácidos seleccionados específicamente contra proteínas estructurales y efectoras del SSTT, como EspA y EspB, susceptibles de ser bloqueadas. Si bien, los péptidos obtenidos por phage display tuvieron una alta afinidad hacia las proteínas blanco, no consiguieron neutralizar la patogénesis de EPEC in vitro, indicando que no necesariamente la interacción entre péptidos y proteínas blanco afecta la funcionalidad del SSTT. Teniendo en cuenta estos resultados, se trató de reducir el rango de especificidad de péptidos hacia regiones altamente conservadas y funcionalmente importantes de proteínas estructurales del inyectosoma, como son las regiones coiled-coil que consisten en α-hélices hidrofóbicas con repeticiones de siete aminoácidos, que participan de las interacciones proteína-proteína especialmente en la formación de complejos de multímeros. En este estudio, se examinaron los péptidos sintéticos, diseñados para bloquear la formación del SSTT. Los péptidos CoilA y CoilB, representan la región coiled-coil del C-terminal de la proteína traslocadora EspA y el péptido CoilD, correspondiente a la región coiled–coil del extremo N-terminal de la proteína EscF, fueron efectivos en la inhibición de la hemólisis de glóbulos rojos dependiente del SSTT de EPEC E2348/69 y EHEC O157:H7. Los péptidos de CoilA y CoilB también redujeron la formación de pedestales de actina cuando fueron pre-incubados con las bacterias EPEC E2348/69 y afectaron la traslocación por medio del SSTT a las células epiteliales de la proteína efectora Tir. A su vez, CoilA y CoilB fueron capaces de bloquear el ensamble del filamento de EspA, evitando la polimerización in vitro de la proteína EspA recombinante y por microscopía electrónica se observó una reducción en la longitud de los filamentos de EspA. Esto sugiere que los péptidos coiled-coil pueden prevenir el montaje y por lo tanto la funcionalidad del TTSS. A su vez, ensayos de western blot demostraron que los péptidos también inhibieron la correcta secreción de las proteínas EspB y EspD en EPEC E2348/69 y EspD en C. rodentium. Estos resultados motivaron a desarrollar un ensayo de protección contra C. rodentium in vivo, como modelo de infección para bacterias que contienen LEE. El tratamiento vía oral de ratones con una combinación de péptidos CoilA y CoilB, previa y durante la infección con C. rodentium, previno de la lesión A/E colónica. Estos resultados demostraron que el tratamiento preventivo y post inoculación con los péptidos coiled-coil inhibe la formación del SSTT de C. rodentium in vivo, actuando con un efecto protector contra la formación de la lesión A/E en ratones. En conclusión, el diseño de moléculas que perjudiquen la asociación íntima de los patógenos a la mucosa intestinal probablemente tendrán un efecto importante en las estrategias disponibles contra microorganismos patógenos, y existe la posibilidad de que los inhibidores específicos contra un mecanismos de virulencia sean efectivos por un largo tiempo antes que la resistencia se convierte en un problema, ya que habría poca o ninguna presión selectiva al no afectar la viabilidad, reduciéndose así el desarrollo de resistencia a estos agentes antimicrobianos. La investigación orientada a la búsqueda de inhibidores contra distintos mecanismos de virulencia puede tener un alto potencial terapéutico y preventivo como en este caso, a la vez que puede servir como herramienta para dilucidar los sistemas regulatorios intrínsecos que modulan la virulencia EPEC y EHEC o de cualquier otra bacteria que posea un SSTT. Los péptidos coiled-coil son moléculas pequeñas, más fáciles de sintetizar que moléculas orgánicas complejas, y podrían ser parte de formulaciones nutracéuticas contra patógenos diarreagénicos. Por lo tanto, la interferencia en la formación y/o funcionalidad del SSTT podría evitar la manifestación de lesiones A/E, impedir la colonización del epitelio intestinal y en última instancia podrían prevenir la enfermedad. Incluso, reducir la carga bacteriana de animales próximos a ingresar a frigorífico o mantenidos en feed-lot, disminuyendo la posibilidad de contaminación de la carne.

Abstract:
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are associated with diarrhea in humans. EPEC is one of the leading causes of childhood diarrhea in developed countries, while EHEC is responsible for the clinical spectrum disease include diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS), which is the main cause of acute renal failure in children under 5 years in the Argentina. The expression of Shiga toxin (Stx) encoded by bacteriophages integrated in the chromosome strains EHEC is considered responsible for hemorrhagic colitis and HUS. The main reservoir of EHEC is healthy cattle while a limited number of serotypes have been associated with diarrhea in young calves while EPEC reservoir is symptomatic and asymptomatic children. Both diarrheagenic E. coli, as well as Citrobacter rodentium, possess a pathogenicity island known as the locus of enterocyte effacement (LEE). The LEE encodes type III secretion system (TTSS) whose function is to translocate effector proteins to the enterocytes, causing cellular subversion. This results in the formation of characteristic attaching and effacement lesions (A/E) in the intestinal epithelium, which consist of the microvilli destruction and formation of actin polymerized than contact between bacteria and the cell site pedestals. The TTSS is a complex structure with more than 20 proteins that forms a system of 'needle and syringe' which allows injecting effector proteins directly into the host cell. The LEE contains five major operons which have been fully sequenced: LEE1 LEE2, LEE3 LEE4 and LEE5. EspA, EspB and EspD are some of the proteins encoded by the LEE4 comprising part of the TTSS translocon. EspA, is the major protein and its polymers are hollow filaments (needle structure), which are present on a transitional basis. EspB and EspD, are associated with the end of the filament and are involved in the formation of pores in the membranes of the infected cells.The proximal end of the EspA filament relies on basal body formed by the EscF polymers, protein that is also encoded in the LEE4. The outer membrane protein, Intimin, is encoded in the LEE5 and is responsible for intimate adhesion to the enterocytes as well as its own receptor Tir, which is translocated through TTSS into the cytoplasm to then anchor into the cell membrane. In order to use the virulence factors responsible for the A/E lesion as targets of intervention therapies, the immunogenicity and antigenicity of TTSS proteins and intimin using naturally infected or colonized bovine colostrum. The results showed that bovine colostrum from unvaccinated dairy and meat cattle from Argentina contains a high frequency of antibodies against intimin-γ C280, EspA and EspB proteins. On the other hand polyclonal IgG antibodie from in rabbits immunized with EspA, EspB and N-EspD recombinant proteins, demonstrating the ability of these proteins to induce a strong humoral immune response. In this work, it was observed that both bovine colostrum and specific polyclonal antibodies against proteins of the TTSS inhibited the lysis on the red blood cells (RBCs) mediated by TTSS of EPEC 2348/69, demonstrating that directing substances against the TTSS can inhibit its functionality. These protective effects have been partially attributed to the presence of antibodies against the TTSS components because a significant reduction in inhibitory activity was obtained when colostrum or polyclonal sera were IgG totally depleted. Immunogenicity, antigenicity and exhibition surface of various proteins responsible for the A/E lesion, demonstrated that they can be potential candidates for vaccines, and target molecules for peptides and other molecules. The strategy used to intervention therapies target virulence factors is therefore attractive. In order to prevent the triggering action from EHEC and EPEC TTSS, the technique of phage display was used to obtain peptides of 12 aminoacids selected specifically against structural and effector TTSS protein such as EspA and EspB, likely to be blocked. Although peptides obtained by phage display had a high affinity towards target proteins, did not neutralize the pathogenesis of EPEC in vitro, indicating that not necessarily interaction between peptides and target proteins affects the functionality of the TTSS. Given these results, the range of specificity of peptides was reduce to functionally important and highly conserved regions of the inyectosome-structural proteins such as coiled-coil regions, consisting of hydrophobic α- helices with repetitions of seven amino acids involved in protein-protein interactions especially in the formation of multimers complexes. This study examined the synthetic peptides, designed to block the formation of the TTSS. Peptides CoilA and CoilB, represent the coiled-coil region at the C-terminus of the protein EspA and the peptide CoilD, corresponding to the coiled-coil region of N-terminal EscF protein, were effective in RBCs hemolysis mediated by TTSS of EPEC E2348/69 and EHEC O157:H7. Peptides CoilA and CoilB also reduced formation of actin pedestals when they were pre-incubated with EPEC E2348/69 bacteria and affected translocation by the TTSS epithelial cells of the Tir effector. In turn, CoilA and CoilB were able to block the ensemble the filament of EspA, avoiding the polymerization in vitro of EspA recombinant protein. By electron microscopy a reduction in the length of the filaments of EspA was observed. This suggests the coiled-coil peptides can prevent the ensemble and thus the TTSS functionality. In turn, western blot assays showed that peptides also inhibited the correct secretion of EspB and EspD proteins from EPEC E2348/69 and EspD protein from C. rodentium. These results led to develop a test for protection against C. rodentium in vivo, as model of infection by bacteria containing LEE. Treatment by oral route of mice with a combination of peptides CoilA and CoilB prior and during the infection with C. rodentium, prevented colonic A/E lesion. These results showed that preventive treatment and post inoculation with the coiled-coil peptides inhibits the formation in vivo of TTSS from C. rodentium, acting with a protective effect against the formation of A/E lesion in mice. In conclusion, design molecules which harm the intimate association of pathogens to the intestinal mucosa probably will be an important effect on strategies available against pathogenic microorganisms. The specific inhibitors against virulence mechanism are effective for a long time before resistance becomes a problem, since there would be little or no selective pressure to affect the viability, thus reducing the development of resistance to antimicrobial agents. Research aimed at finding inhibitors against different mechanisms of virulence can have a high therapeutic and preventive potential as in this case. Also, it can used as a tool for elucidating the regulatory mechanisms that modulate the EPEC and EHEC virulence, and also for any other bacteria possessing a TTSS. Coiled-coil peptides are small molecules, easierad to synthesize than complex organic molecules, and could be part of nutraceutic formulations against diarrheagenic E. coli. Therefore, training and/or functionality of the TTSS interference could avoid A/E lesion manifestation, the colonization of the gut epithelium and ultimately could prevent the disease. Even could reduce the bacterial load of animals going to slaugtherhouse or at the feed-lot, decreasing the possibility of contamination of meat.

Rodríguez, Ana María. "Relevancia de la inmunidad celular subtipo específica en el desarrollo de estrategias de vacunación frente a VIH-1" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Han pasado casi 30 años de la detección de los primeros casos de VIH-1 y aún no se ha conseguido desarrollar una vacuna efectiva y segura. La epidemia de VIH en Argentina está caracterizada por una alta prevalencia de infecciones causadas por virus pertenecientes al subtipo B y formas recombinantes circulantes BF (CRF12_BF). A pesar de la amplia gama de trabajos dedicados a la caracterización de la respuesta inmune y al desarrollo de vacunas frente a VIH, no queda claro cuál es el impacto de la variabilidad en la elección del antígeno. Nef es una de las proteínas virales elegida como antígeno en los ensayos clínicos y pre- clínicos para vacunas. En este trabajo de Tesis, Nef fue usada como una herramienta para evaluar la importancia de las variantes recombinantes BF de VIH en el diseño de futuras vacunas. Vectores de ADN, MVA y VV que expresan NefBF y NefB fueron generados y caracterizados. Luego de la inmunización en ratones Balb/c con una dosis simple de ADN seguida por otra de MVA, se encontró que NefBF generó una respuesta altamente específica sin detectarse reactividad cruzada frente a Nef del subtipo B. Sin embargo, luego de aplicar un esquema de inmunización más extenso (tres dosis de ADN más una dosis de MVA) se indujo una respuesta específica mayor, acompañada con el aumento de la reactividad cruzada frente a B, aunque de menor magnitud que frente al antígeno homólogo NefBF. Por otro lado, al aplicar el vector VVnefBF se obtuvo una respuesta específica cerca de tres veces mayor que con MVA, pero con el mismo grado de reactividad cruzada; mientras que la inmunización con VVnefB generó una respuesta de menor magnitud, pero con mayor grado de reactividad cruzada contra NefBF. La aplicación de IL-12 y GM-CSF desde vectores de ADN (como moléculas adyuvantes) aumentó la respuesta hasta seis veces, al aplicarse por separado, y 14 veces al aplicarse juntas. Este nivel de respuesta permitió caracterizar los epítopes de mayor inmunogenicidad. Estos resultados son de crucial importancia para el desarrollo de una futura vacuna para nuestra región, indicando que antígenos de estas variantes virales BF deberían ser considerados en el diseño de las mismas.

Abstract:
It has been almost 30 years since the detection of the first HIV-1 cases and yet an effective and safe vaccine has not been developed. The HIV epidemic in Argentina is characterized by the high prevalence of infections caused by subtype B and BF variants. Despite the wide range of publications on the immune response against HIV and the vaccine development effort, the impact of variability on vaccine antigen selection is still unclear. Nef is a viral protein that has been selected as antigen in clinical and pre-clinical vaccine trials. In this thesis, Nef protein was used as a tool to study the impact of HIV-1 BF variants on the design of future vaccines. DNA, MVA and VV vectors expressing Nef from the CRF12_BF recombinant form or from subtype B of HIV-1 were generated and characterized. After the administration of single DNAprime/MVAboost immunization schedules in Balb/c mice, it was found that NefBF delivered from these vectors generated a response of high specificity without cross-reactivity against subtype B. But, when a more potent response was induced after 3 priming DNA doses and a booster with MVA recombinant virus, cross-reactivity against NefB was detected, although of lower magnitude than the NefBF specific response. Furthermore, the application of VVnefBF vector generated a nearly three-fold enhanced immune response than the schedule using MVA, but with the same level of low cross-reactivity, whereas immunization with VVnefB generated a slightly lower response, but with a greater cross-reactivity against NefBF. The application of IL-12 or GM-CSF as molecular adjuvants increased the specific response by six-fold, and 14-fold when they were applied together. This level of response allowed the characterization of the most immunogenic epitopes. These results will be pivotal for HIV vaccine design in our region, indicating that antigens from these viral variants should be considered for a future vaccine.

Sarnacki, Sebastián Hernán. "Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente.

Abstract:
DNA adenine methyltransferase (Dam) enzyme is a global regulator of bacterial gene expression. In previous studies, Salmonella Typhimurium dam mutants have been proposed as excellent vaccines strains because of their characteristic of attenuation and protective capabilities. By extension, dam gene mutation has been proposed as a method for attenuating a variety of bacterial species. Given our interest in the study and prevention of infections with Salmonella Enteritidis, a serotype that most commonly causes enterocolitis in humans, we generate S. Enteritidis dam mutants by transposition and site-directed mutagenesis by replacement. Interestingly, studies in Balb/c mice showed that the S. Enteritidis dam mutants, are only moderate in their attenuation. Thirty percent (30%) of animals inoculated by the intragastric route with the mutant died within 3 weeks. Moreover, the protection of immunized animals challenge with the virulent strain of Salmonella Enteritidis # 5694, did not reach acceptable levels. Given the critical role that macrophages play in innate immunity against Salmonella, we analyzed the interaction between SEΔdam mutant and macrophage cell line RAW 264.7. By Western blot, we found that the expression of inflammatory molecules in macrophages infected with SEΔdam is attenuated. As activation of the inflammatory response of macrophages is generated in part by bacterial antigens, we wondered whether the lack of Dam might be affecting the structure or function of certain effector proteins or lipopolysaccharide (LPS) of Salmonella Enteritidis. Therefore, we studied the involvement of Dam on protein synthesis and secretion of two effector proteins both dependent on type 3 secretion systems. To this purpose, we constructed and characterized Salmonella dam mutants carrying sopA and sopB genes tagged with the FLAG epitope. The results showed that the dam mutant has a reduced expression and secretion of SopA and SopB invasion proteins, which are Salmonella pathogenicity island (SPI-1)-dependent. This finding indicates that Dam methylation is involved in the regulation of the synthesis and secretion of SopA and SopB proteins in Salmonella as an upregulator of these genes. We also investigated the involvement of the Dam enzyme in S. Enteritidis LPS synthesis. We found that compared to the parental strain, a SEΔdam mutant synthesized LPS with shorter O-antigen polysaccharide chain lengths. Since Wzz is responsible for the chain length distribution of O-antigen, we investigated whether Dam methylation is involved in regulating wzz gene expression. Densitometric analysis of Western blot with samples of protein extracts showed that the relative amount of Wzz protein produced by SEΔdam is three-fold lower than that of the parental strain. Concomitantly, wzz gene promoter activity in SEΔdam was reduced, as measured by chromosomal transcriptional fusion with a reporter gene, and this result was further confirmed by the amount of mRNA as measured by RT-PCR quantitative real-time analysis. Also, the expression of pmrA and rcsB genes (two wzz gene regulators) in the dam mutant was reduced. However, the defect in the chain length distribution of O-antigen of the SEΔdam, was associated only with RcsB. Our results show that Dam methylation regulates the LPS synthesis of Salmonella. Overall, these results indicate that Dam methylation in Salmonella regulates functions related intimately to the host-bacteria interaction. Therefore, the dam gene deletion as a method of attenuation of vaccine strains must be analyzed critically.

La Padula, Pablo Hugo. "Adaptación del miocardio de rata a la hipoxia hipobárica crónica. Actividad mecánica y mecanismos celulares" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La actividad mecánica y su respuesta a la hipoxia/reoxigenación fue estudiada en músculos papilares de ventrículo izquierdo de ratas sometidas a hipoxia hipobárica (53.8 kPa) durante varios períodos y en sus controles (101.3 kPa). Un retardo en la declinación de la contractilidad asociada a la edad y una mayor recuperación post-hipoxia se desarrollaron durante la aclimatización. Entre las enzimas mitocondriales analizadas en ventrículo izquierdo, se encontró una regulación específica de la mtNOS por la hipoxia. Para evaluar la regresión de estos efectos durante el retorno a la normoxia, se investigó la contractilidad en respuesta al calcio y a la hipoxia/reoxigenación y la actividad y expresión de mtNOS al cabo de tres períodos de desaclimatización. La actividad mecánica basal, la recuperación post-hipoxia, y la actividad de mtNOS declinaron linealmente, con un tiempo medio de 5.9, 5.3 y 5.0 meses, respectivamente. La expresión de mtNOS, la cual reaccionó con anticuerpos iNOS y nNOS, mostró un comportamiento similar. Se halló una correlación bifásica entre la actividad de mtNOS y la contractilidad, resultando ésta máxima a 0.70-0.74 nmol NO.min^-1.mg proteina^-1. Este modelo experimental proveería el efecto más persistente conocido actualmente sobre la preservación de la función miocárdica y la tolerancia a la hipoxia. Los resultados sugieren la participación de la mtNOS en el mecanismo involucrado.

Abstract:
Parameters of contractile function and their response to hypoxia/reoxygenation were measured in papillary muscles isolated from left ventricle of rats submitted to hypobaric hypoxia (53.8 kPa) for several periods and of their controls (101.3 kPa). Retardation of age-associated decline in mechanical activity and improved post-hypoxic recovery developed during acclimatization. Among left ventricle mitochondrial enzymes analyzed, specific upregulation of nitric oxide synthase (mtNOS) by hypoxia was found. To evaluate the time course of regression of these effects upon deacclimatization, a group of 5 mo- acclimatized rats were returned to normoxic conditions similar to controls. After three time-periods, contractile function in response to calcium and to hypoxia/reoxygenation and mtNOS activity and expression were determined. All measured parameters showed linear decline during deacclimatization, with mean half-time of 5.9, 5.3, and 5.0 mo, for basal mechanical activity, post- hypoxic recovery, and mtNOS activity, respectively. The expression of mtNOS, which reacted with iNOS and nNOS antibodies, showed similar behavior. The correlation of mtNOS activity with muscle contractility sustained a biphasic modulation, showing optimal performance at 0.70-0.74 nmol NO.min^-1.mg protein^-1. This experimental model would provide the most persistent effect known at present on preservation of myocardial function and improved tolerance to O2 deprivation. Results strongly support the putative role of mtNOS in the mechanism involved.

Salibe, Mariano César. "Modificación de perfiles de expresión en el sistema nervioso central, en respuesta a enfermedades en la periferia" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Una de las principales funciones del sistema nervioso es el mantenimiento de la homeostasis, detectando y reaccionado frente a señales que superan un determinado umbral. El cerebro es capaz de detectar eventos inmunes en la periferia ya sea a través de compuestos solubles o a través del nervio vago y de reaccionar mediante la activación del eje hipotálamo-pituitaria- adrenal, modulando la respuesta inmune. La progresión tumoral se caracteriza por una interacción con el sistema inmune y por poseer una alta tasa de mutaciones. El período comprendido entre el inicio y de un tumor, y la detección clínica, puede ser de entre 10 y 15 años. Durante este tiempo cada una de las mutaciones podría convertirse en una señal de alarma. En la actualidad ha sido demostrado que la presencia de un tumor en la periferia induce cambios en el metabolismo de neurotransmisores en el cerebro, sin embargo se desconoce si a su vez existen cambios a nivel transcripcional. En esta Tesis se demostró mediante la utilización de la tecnología de microarreglos en tres modelos tumorales, que la presencia de células tumorales en crecimiento en la periferia induce cambios en los niveles de expresión de determinados grupos de genes en el cerebro, pero no en un órgano periférico como el hígado. A su vez se demostró la existencia de cambios en niveles de expresión en el cerebro como consecuencia del desarrollo de artritis reumatoide. Estos cambios fueron específicos para cada tipo de tumor y para cada enfermedad. Estos resultados demuestran que señales periféricas derivadas del desarrollo de un tumor o de una enfermedad como artritis son capaces de inducir cambios en el perfil de expresión del cerebro.

Abstract:
The main function of the nervous system is to maintain homeostasis by sensing and reacting to signals that reach a certain threshold. For example, the brain can sense immune peripheral events through soluble compounds or the vagus nerve and can react through activation of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis, resulting in the modulation of an ongoing immune response. Cancer progression is characterized by interaction with the immune system and by high mutation rates, with each mutation potentially promoting alarm signals during the 10 to 15 years of cancer development before clinical detection. A peripheral tumor is able to alter the metabolism rate of certain neurotransmitters; however, it is not known whether this can also promote changes in the central nervous system transcriptome. Using genome-wide expression analysis in three mouse tumour models, we showed that a tumor growing at the periphery can indeed promote changes in the expression levels of defined sets of genes in the brain, but not in the liver. An other peripheral disease such as Arthritis also promoted transcriptional changes in the brain. These changes were cancer type and disease type specific, and involved specific signalling pathways. These findings prove that cancer and arthritis-derived signals are effective in eliciting specific changes in gene expression in discrete brain regions.

Landoni, Verónica Inés. "Relevancia de mecanismos inflamatorios en el daño celular inducido por toxina Shiga, agente causal del sindrome urémico hemolítico (SUH)" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El síndrome urémico hemolítico (SUH) se caracteriza por anemia hemolítica, trombocitopenia y disfunción renal. La forma típica de SUH se asocia a infecciones por bacterias Gram negativas enterohemorrágicas del género Shigella y Escherichia productoras de toxina shiga (Stx). La disfunción endotelial inducida por la Stx es central, pero lipopolisacáridos bacterianos (LPS) y neutrófilos (PMN) contribuyen con la patofisiología. La falla renal es característica del SUH, aunque en casos severos, ocurren complicaciones neurológicas usualmente asociadas a casos fatales. Es clara la alteración de la barrera hemato-encefálica (BHE) asociado al daño de las células endoteliales (CEs) que la componen. Los astrocitos (ASTs) son células inflamatorias del cerebro y determinan el funcionamiento de la BHE. Los ASTs están en contacto con CEs, por lo que el estudio de los efectos de Stx y LPS sobre los ASTs, así como la influencia de esta respuesta sobre las ECs es fundamental. Stx1 y LPS indujeron la activación de ASTs y la liberación de TNF-α, óxido nítrico y quimioquinas atractantes de PMN. Factores liberados por ASTs estimulados con LPS y Stx1 disminuyeron la permeabilidad endotelial e indujeron la activación de CEs favoreciendo la adhesión de plaquetas y PMN. Los efectos evaluados fueron dependientes del TNF-α astrocitario. La respuesta de ASTs frente a Stx1 y LPS podría contribuir con la disfunción de la BHE y el desarrollo de la neuropatología observada en SUH.

Abstract:
The hemolytic uremic syndrome (HUS) is characterized by hemolytic anemia, thrombocytopenia and renal dysfunction. The typical form of HUS is generally associated with infections by Gram-negative Shiga toxin (Stx)- producing Escherichia coli organisms. Endothelial dysfunction induced by Stx is central, but bacterial lipopolysaccharide (LPS) and neutrophils (PMN) contribute to the pathophysiology. The renal failure is characteristic, although in severe cases, neurological complications occur and is usually associated with death. Impaired blood-brain barrier (BBB) is associated with damage to cerebral endothelial cells (ECs) that comprise the BBB. Astrocytes (ASTs) are inflammatory cells in the brain and determine BBB function. ASTs are in contact with ECs, hence the study of the effects of Stx1 and LPS on ASTs, and the influence of this response on ECs is essential. Stx1 and LPS induced activation of ASTs and the release of TNF-a, nitric oxide and PMN attractant chemokines. Factors released by Stx1 and LPS stimulated-ASTs decreased endothelial permeability. Furthermore, these factors induced ECs activation promoting platelet and PMN adhesion. Evaluated effects were dependent on ASTs secreted-TNF-α. Stx1 and LPS induced ASTs response could contribute to BBB dysfunction and to the development of the neuropathology observed in HUS.

Pardo, Romina Paola. "Estudio del rol de la proteína VMP1 en los procesos de autofagia, muerte y sobrevida celular en la fisiopatología pancreática" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La autofagia es un proceso de degradación de componentes citoplasmáticos que en algunos casos puede jugar un rol citoprotectivo, mientras que en otros puede llevar a la muerte celular. En trabajos previos hemos descripto a la proteína transmembrana VMP1, la cual se encuentra inducida en la pancreatitis experimental. Con el objetivo de determinar su función, se estudió su participación en el proceso de autofagia. Los resultados obtenidos en esta tesis demostraron que la sobreexpresión de VMP1 induce autofagia en células cultivadas en un medio rico en nutrientes. Además, VMP1 está involucrada en la autofagia inducida por ayuno y rapamicina. Más aún, el silenciamiento de VMP1 inhibe la formación de autofagosomas por el tratamiento con ayuno o rapamicina sugiriendo que VMP1 es necesaria para la autofagia. Aún no ha sido esclarecido el rol de la autofagia en el cáncer de páncreas. Los estudios desarrollados en este trabajo sobre la autofagia y VMP1 en el cáncer de páncreas, indican que el tratamiento con gemcitabina induce autofagia en las líneas celulares de cáncer de páncreas PANC-1 y MIAPaCa-2, y que este proceso promueve la muerte celular por apoptosis. La inhibición de la autofagia con 3-metiladenina redujo significativamente el porcentaje de células apoptóticas en respuesta a la gemcitabina. También se observó que la gemcitabina induce la expresión temprana de VMP1, que el silenciamiento de VMP1 disminuye la apoptosis inducida por este agente quimioterapéutico y que la sobreexpresión de VMP1 aumenta significativamente el porcentaje de células apoptóticas. Estos resultados demuestran que la vía de autofagia mediada por VMP1 participa en la muerte celular por apoptosis inducida por gemcitabina. Con el objetivo de profundizar el estudio de los mecanismos moleculares mediante los cuales VMP1 interviene en la sobrevida o muerte celular, se buscaron interactores de esta proteína utilizando la estrategia de doble híbrido. Se demostró que VMP1 interacciona con S100A10, un miembro de la familia de proteinas S100 que se encontró sobreexpresado en adenocarcinomas pancreáticos. También se observó que la expresión basal del mRNA de S100A10 en las células MIAPaCa-2 es mayor que en las células HeLa. S100A10 se induce bajo estímulos autofágicos, como el tratamiento de ayuno y la gemcitabina, en células HeLa, pero no en las células tumorales MIAPaCa-2, sugiriendo que en estas su expresión se encuentra desregulada. El análisis del rol de la interacción VMP1-S100A10 en las células tumorales mostró que la sobreexpresión de VMP1 induce la expresión del mRNA de S100A10, sugiriendo que S100A10 forma parte de la respuesta celular mediada por VMP1. Cuando la proteína sobreexpresada es S100A10, se modifica la distribución intracelular de VMP1, disminuyendo su patrón punteado característico y aumentando la distribución en una estructura reticulada semejante al retículo endoplásmico. Finalmente se investigó la participación de S100A10 en el proceso de autofagia mediado por VMP1. Se observó que la sobreexpresión de S100A10 disminuye la formación de autofagosomas tanto en respuesta al tratamiento con gemcitabina como ante la inducción directa por la sobreexpresión de VMP1. Se determinó también que S100A10 reduce la apoptosis inducida por gemcitabina, ya que su silenciamiento aumentó la apoptosis causada por este agente quimioterapéutico. Por lo tanto, la expresión de S100A10 disminuye la autofagia y la apoptosis mediadas por VMP1, favoreciendo la resistencia a la muerte de las células de cáncer de páncreas. Los resultados de este trabajo contribuyen a elucidar el rol de la autofagia en el cáncer de páncreas, señalando a la autofagia mediada por VMP1 como un mecanismo molecular que conduce a la muerte por apoptosis de las células neoplásicas de origen pancreático, y a la proteína S100A10 como un mecanismo posible de supervivencia de las células de cáncer de páncreas, que actúa disminuyendo la capacidad de desarrollar autofagia y apoptosis. En base a los resultados obtenidos, proponemos a la vía de autofagia mediada por VMP1 como posible blanco para el estudio de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de páncreas.

Abstract:
Autophagy is a process of degradation of cytoplasmic components, in some cases can play a cytoprotective role, while in other cases can lead to cell death. In previous works we have described the transmembrane protein VMP1, which is induced in experimental pancreatitis. In order to determine its function, its participation in the process of autophagy was studied. The results obtained in this thesis showed that overexpression of VMP1 triggers autophagy in cells grown in a culture media rich in nutrients. VMP1 is also involved in starvation or rapamycin-induced autophagy. Moreover, the silencing of VMP1 gene inhibits the formation of autophagosomes by starvation or rapamycin treatments, suggesting that VMP1 is necessary for autophagy. The role of autophagy in pancreatic cancer has not been clarified yet. Studies developed in this work on autophagy and VMP1 in pancreatic cancer indicate that treatment with gemcitabine induces autophagy in PANC-1 and MIAPaCa-2 pancreatic cancer cell lines, and this process promotes cell death by apoptosis. Inhibition of autophagy with 3-methyladenine significantly reduced the percentage of apoptotic cells in response to gemcitabine. It was also observed that gemcitabine induces early expression of VMP1. Furthermore, the silencing of VMP1 reduces this chemotherapeutic agent-induced apoptosis and VMP1 overexpression significantly increases the percentage of apoptotic cells. These results demonstrate that the pathway of VMP1-mediated autophagy participates in apoptotic cell death induced by gemcitabine. With the aim of study the molecular mechanisms by which VMP1 participates in cell death or survival, interactors of this protein were searched using the two-hybrid strategy. It was shown that VMP1 interacts with S100A10, a member of the family of proteins S100 found to be overeexpressed in pancreatic adenocarcinoma. It was also noted that the basal expression of the S100A10 mRNA in MIAPaCa-2 cells is higher than in HeLa cells. S100A10 is induced under autophagic stimuli such as starvation or treatment with gemcitabine in HeLa cells, but not in MIAPaCa-2 tumor cells, suggesting that in these cells its expression is unregulated. The analysis of the role of VMP1-S100A10 interaction in tumor cells showed that the overexpression of VMP1 induces S100A10 mRNA expression, suggesting that S100A10 is part of the VMP1-mediated cell response. When S100A10 protein is overexpressed, VMP1 intracellular distribution is modified, lowering its characteristic dotted pattern and increasing distribution in a reticulated structure similar to the endoplasmic reticulum. Finally the involvement of S100A10 in the process of autophagy mediated by VMP1 was investigated. It was found that S100A10 overexpression reduces the formation of autophagosomes induced by gemcitabine treatment or by VMP1 overexpression. It was also determined that S100A10 reduces gemcitabine –induced apoptosis, since its silencing increased apoptosis caused by this chemotherapeutic agent. Therefore, the expression of S100A10 reduces the autophagy and apoptosis mediated by VMP1, increasing death resistance of pancreatic cancer cells. The results of this work contribute to elucidate the role of autophagy in pancreatic cancer, pointing out VMP1- mediated autophagy as a molecular mechanism leading to death by apoptosis of neoplastic pancreatic cells, and protein S100A10 as a possible survival mechanism of pancreatic cancer cells, which acts decreasing the ability to develop autophagy and apoptosis. Based on these results, we postulate the pathway of VMP1-mediated autophagy as a possible target for the study of new therapeutic strategies for pancreatic cancer.

Toloza, Ariel Ceferino. "Bioactividad y toxicidad de componentes de aceites esenciales vegetales, en Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) resistentes a insecticidas piretroides" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los piojos de la cabeza, Pediculus humanus capitis De Geer (Phthiraptera: Pediculidae) son ectoparásitos obligados de humanos. La infestación con piojos produce irritación de la piel, prurito y riesgo de infecciones secundarias como consecuencia del rascado. El control químico de esta plaga ha sido mediante el uso de insecticidas clorados (DDT y lindano), organofosforados (malatión), carbamatos (carbaril), piretrinas naturales y piretroides (deltametrina, permetrina, d-fenotrina). Actualmente el uso de estos insecticidas está limitado por el desarrollo de poblaciones de piojos resistentes. Una alternativa a los insecticidas convencionales son los compuestos botánicos tales como los aceites esenciales (AE) de plantas aromáticas y sus componentes, los cuales han despertado alto interés por su actividad adulticida, ovicida y repelente en varios insectos plaga. Los objetivos planteados en esta tesis fueron: a) establecer la actividad biológica de los vapores de aceites esenciales y de sus componentes provenientes de plantas autóctonas y exóticas que crecen en Argentina sobre poblaciones de huevos y adultos de piojos resistentes a piretroides; b) analizar el efecto repelente de los mencionados aceites; y c) estudiar los mecanismos involucrados en el modo de acción y el rol de las enzimas monooxigenasas en la toxicidad de los monoterpenoides sobre piojos de la cabeza. Los piojos utilizados se recolectaron mediante el uso de peine fino de cabezas de niños de entre 3 y 13 años provenientes de escuelas primarias de Buenos Aires. Los 49 aceites esenciales fueron colectados en diversas regiones de Argentina durante la primavera de los años 2003-2004 y 2006-2007. Los 26 monoterpenoides estudiados en esta tesis fueron de origen comercial. Previo al estudio del efecto insecticida de los AEs, se determinó el grado de pediculosis (presencia de al menos una forma viable de piojo) y los niveles de resistencia a permetrina de las poblaciones a estudiar. Para el estudio de la fase vapor de los AEs y de los monoterpenoides sobre las liendres y sobre los adultos, se empleó una cámara cerrada que permitió la liberación progresiva del aceite o componente puro. En el caso de las formas eclosionadas, se midió el volteo de los piojos cada 5 min durante 1 h, y luego se calculó el tiempo de volteo necesario para afectar el 50% de los piojos (TV50). Con respecto a las liendres, las mismas fueron expuestas durante 24 hs al vapor de las sustancias en estudio y se registró el porcentaje de mortalidad (%). La actividad repelente de los AEs y de los monoterpenoides fue medida sobre una arena experimental concéntrica diseñada para este estudio. Se midió el porcentaje de insectos que estaban en el área tratada y control, y se calculó el índice de repelencia (IR). Con respecto a la medición enzimática de la actividad de acetilcolinesterasa (AChE), la misma fue determinada por un método espectrofotométrico y cinético. En primer lugar se estudió el efecto de los monoterpenoides sobre la inhibición de la AChE de anguila eléctrica. Luego se calculó la concentración de inhibición al 50% (CI50) del compuesto más efectivo usando las enzimas de AChEs de anguila eléctrica y la extraída a partir de homogenatos de piojos. Posteriormente, se expusieron piojos a los vapores del compuesto más efectivo y a los de un compuesto organofosforado volátil (diclorvos-DDVP-) del que se conoce su gran poder inhibitotio sobre la actividad de acetilcolinestarasa. Para analizar el posible rol de las enzimas monooxigenasas en la degradación de monoterpenoides, se topicaron las formas post-embrionarias de piojos con diferentes concentraciones del butóxido de piperonilo (PBO)- un conocido inhibidor de oxidasas-, y luego los piojos fueron expuestos a los vapores del monoterpenoide más efectivo y del compuesto organofosforado diclorvos-DDVP-. Los resultados demostraron un promedio de 29,7% de los chicos analizados tenían piojos, siendo encontrados más frecuentemente en las nenas que en los varones. Los grados de resistencia (GRs) de las poblaciones estudiadas de P.h.capitis variaron desde un 28,57 hasta un 71,42 (en comparación con la cepa de referencia susceptible de P.h.humanus). No se encontraron diferencias significativas en los valores de TV50 de las poblaciones con grados de resistencia diferentes. Esto sugiere que los mecanismos de resistencia a piretroides no afectan de manera prioritaria o directa a la toxicidad a los vapores de AEs y a sus componentes. En relación a al efecto fumígeno de los AEs sobre formas eclosionadas hay que mencionar que 24 de los 49 aceites estudiados (49%) produjeron un efecto tóxico sobre los piojos resistentes a permetrina. De estos aceites los más efectivos fueron aquellos obtenidos de plantas aromáticas autóctonas tales como Cinnamomun porphyrium, Myrcianthes cisplatensis, Aloysia citriodora (quimiotipo 2), Myrcianthes pseudomato, con valores respectivos de TV50 de 1,12; 1,29; 3,02 y 4,09 m. Estos aceites fueron entre 9 y 20 veces más tóxicos que los aceites que los precedieron. En relación a los compuestos monoterpenoides con mayor actividad fumígena sobre piojos, tenemos que destacar que el 1,8-cineol y el anisol fueron los más efectivos, con TV50s de 11,1 y 12,7m. Luego estuvieron los compuestos limoneno, 1S-(-)-α- pineno, β-pineno, (+)-α-pineno, linalol, mentona, α-pineno, pulegona, β- mirceno y alcohol bencílico. El TV50 del control positivo DDVP (un conocido fumigante) fue de 40,15 m y fue menos efectivo significativamente que los compuestos más efectivos, tales como el 1,8-cineol, el anisol y el limoneno. Se halló una correlación significativa entre los valores de TV50 y la presión de vapor de estos monoterpenoides, indicando que las sustancias más efectivas son las que poseen mayor presión de vapor. Cuando se profundizó en el estudio de aceites esenciales modificados genéticamente (híbridos de Eucaliptos), se halló que los híbridos Eucalyptus grandis X Eucalyptus camaldulensis y Eucalyptus grandis X Eucalyptus tereticornis produjeron mayor volteo (TV50= 13,6 y 12,9m) que sus formas parentales con TV50s de 25,6; 31,3 y 35m. Además, se halló una correlación significativa entre el porcentaje de 1,8-cineol y el TV50 de los mismos. Con respecto a la toxicidad de los monoterpenoides sobre los embriones hay que destacar que los compuestos más efectivos y de manera similar fueron el 1,8- cineol, anisol, el α-pineno, el β-pineno, el (+)-α-pineno, el 1S-(-)- α-pineno, el anetol, la carvona, el limoneno y el linalol. Esto es similar a lo observado para formas eclosionadas. En relación con la repelencia, el aceite esencial que produjo mayor repelencia sobre piojos de la cabeza fue el obtenido de la planta exótica Mentha pulegium y no difirió significativamente del control positivo piperonal. El compuesto con mayor efectividad repelente fue el alcohol bencílico con un índice de repelencia promedio de 57,74%, seguido de (-)-mentol, mentona y (+)-mentol con valores de IR respectivos de 53,56; 39,23 y 36,45%. Las lactonas estudiadas tuvieron efecto repelente en valores similares al control positivo. Con respecto a la actividad enzimática de acetilcolinestarasa medida sobre anguila eléctrica, se encontró diferencias significativas entre los 20 monoterpenoides, siendo el 1,8-cineol el que mayor inhibición produjo con un valor de CI50=6x10־³M. EL 1,8-cineol produjo inhibición de AChE obtenida de piojos, con una CI50=7,7x10־²M. Cuando se estudio la actividad sintomatológica de intoxicación del 1,8-cineol y del organofosforado DDVP, y se procedió a medir la inhibición de la AChE de piojos, se encontró que el 13% de la AChE estaba inhibida por el 1,8-cineol, mientras que el 80% de la enzima fue inhibida por el DDVP. Estos resultados demostraron relación entre la toxicidad del monoterpeno 1,8-cineol y la inhibición de la actividad AChE de piojos, y sugieren que habría otros mecanismos asociados a la sintomatología de volteo de piojos. El análisis del rol de las oxidasas de función mixta mostró una relación creciente entre la dosis subletal topicada con butóxido de piperonilo (PBO) y el TV50 de los piojos expuestos a los vapores del 1,8-cineol y del DDVP. Esto indica la importancia de este complejo enzimático en la degradación del monoterpeno 1,8-cineol. Para finalizar, hay que resaltar que es la primera vez que se realiza un estudio de toxicidad y repelencia de aceites esenciales obtenidos de plantas aromáticas de Argentina (y de sus componentes), sobre piojos resistentes a permetrina. Adicionalmente estos resultados aportan información para avanzar en el conocimiento del efecto de los monoterpenoides sobre la actividad de la enzima acetilcolinesterasa, y del rol de las enzimas monooxigenasas en la degradación de dichos compuestos.

Abstract:
The human head louse, Pediculus humanus capitis De Geer (Phthiraptera: Pediculidae) is an obligate ectoparasite of humans. The infestation with head lice is unpleasant and may cause itching, prurito and secondary skin infections due to scratching of irritated scalp. Chemical control of head lice has been based on a variety of insecticides, such as organoclorides (DDT and lindane), organophosphates (malathion), carbamaes (carbaryl), natural pyrethrins and pyrethroids (deltamethrin, permethrin, d-phenothrin). The overuse of these insecticides is limited due to the development of resistant head lice populations. Alternatives to conventional insecticides might be found in aromatic plants such as essential oils (EOs) and their monoterpenoids. Some of these natural products are repellents, adulticides and ovicidal against a wide variety of pests. The aims of the present thesis were: a) to establish the biological activity of the vapour phase of the essential oils and their main compounds obtained from aromatic plants of Argentina against eggs and adults of permethrin-resistant head lice; b) to analyzed the repellent activity of the essential oils; and c) to study the mechanisms involved in the mode of action and the role of the monooxygenases in the toxicity of the monoterpenoids against head lice. Head lice were collected from from heads of infested children 3-13 yr old, using a fine toothed antilouse comb. Fourty nine essential oils were collected from in the spring season of 2003-2004 and 2006-2007 from different regions of Argentina. Twenty six monoterpenoids were purchased from Aldrich. Prior to the study of the insecticide effect of the essential oils, pediculosis percentage (evidence of at least one living head lice) was calculated, and the permethrin resistance levels of the studied populations. An enclosed chamber was employed to study the fumigant activity of EOs and their components against eggs and adults of head lice. This method allowed creating a saturated micro-atmosphere as a result of the evaporation of the essential or component. Adults and nymphs III were observed for evidence of knockdown every 5 min for 60 min. Then, time in minutes to knockdown of 50% of each unit’s subjects (KT50). With respect to the eggs, each set was exposed to the substances for 24 h and mortalitity data was recorded. Repellency of EOs and components was estimated in an experimental arena with two areas. The number of lice was recorded every 5 min and each experiment was completed within 1 h. Then, a repellency index (RI) was calculated. The inhibition of the acetylcholinesterase activity (AChE) was calculated by a spectrofotometric and kinetic method. First, the inhibition of the monoterpenoids against AChE from electric eel was measured. Then, the inhibition concentration at 50% (IC50) of the most effective monoterpenoid was recorded from either AChE from electric eel or homogenate of lice. Finally, head lice were exposed to the vapours of the most effective compound and to the organophosphate dichlorvos-DDVP-, a well known AChE inhibitor. To study the role of the monooxygenases in monoterpenoide degradation, adult insects were topicated at different piperonil butoxide (PBO) concentrations and then exposed to the vapours of the most effective monoterpenoide and DDVP. The results showed that, in average, 29.7% of the anayzed children had lice, and with the girls being more infected than boys. The resistant ratios (RRs) of the studied populations of P.h.capitis varied from 28.57% to 71.42% (in comparison with the laboratory susceptible strain of P.h.humanus). There were no significant differences among the KT50 values of the different permethrin-resistant populations. These indicate that pyrethroid-resistance mechanisms were no affected by the toxicity of the EOs and monoterpenoids. About the fumigant activity of the EOs against postembryonic insects, 24 of the 49 studied (49%) oils were effective against permetrhin-resistant head lice. Of these EOs, the most effective were from the native aromatic plants like Cinnamomun porphyrium, Myrcianthes cisplatensis, Aloysia citriodora (chemotype 2), Myrcianthes pseudomato, KT50 values of 1.12, 1.29, 3.02 and 4.09 min; respectively. The mentioned oils were 9- to 20-fold more toxic than the studied EOs. The most effective monoterpenoids were 1,8-cineole and anisole, with values of 11.1 and 12.7m; respectively. They were followed by limonene, 1S-(-)-α-pinene, β-pinene, (+)-α-pinene, linalool, mentone, α-pinene, pulegone, β-myrcene and benzyl alcohol. The KT50 value of the positive control DDVP was 40.15 min, and was less effective than the three more toxic compounds like 1,8-cineole, anisole and limonene. A positive relationship was found between the KT50 values of the effective compounds and corresponding vapour pressures, suggesting that the more volatile the compounds, the more effective it was as a fumigant. With respect to the study of the genetically modified oils (eucalypt hybrids), it is important to show that fumigant activity of the hybrids Eucalyptus grandis X Eucalyptus camaldulensis and Eucalyptus grandis X Eucalyptus tereticornis was higher (KT50= 13.6 and 12.9 min; respectively) than that for pure species (KT50= 25.6, 31.3 and 35 min). Moreover, a significant correlation was found between KT50 data and % of 1,8-cineole in the essential oils. The toxicity of the eggs revealed that the most effective monoterpenoids were anisole, α-pinene, β- pinene, (+)-α-pinene, 1S-(-)- α-pinene, anethole, carvone, limonene, linalool and 1,8-cineole. It was in accordance with the pattern found in adult head lice. The most repellent essential oil was from the exotic Mentha pulegium and it was not significantly more repellent than the positive control piperonal. The most repellent monoterpenoid was benzyl alcohol with a RI= 57.74%, followed by (-) menthol, mentone y (+)-menthol with RI values of 53.56, 39.23 and 36.45%; respectively. The studied lactones possessed similar repellent activity than the positive control. Concerning the enzymatic activity of acetylcholinesterase from electric eel, there were significant differences among the 20 studied monoterpenoids, with the 1,8-cineole as the most inhibitor with a IC50=6x10־³M. Moreover, 1,8-cineole was an inhibitor of the AChE obtained from homogenate of head lice with a IC=7.7x10־²M. The study of the sintomatology of intoxication of the 1,8-cineole and DDVP, followed by the analyses of the inhibitory activity of AChE of lice revealed that 1,8-cineole inhibited 13% of the AChE while DDVP inhibited 80%. The analysis of OFM showed a relationship between the sublethal dose of PBO and the KT50 of the exposed head lice to the vapours of 1,8-cineole and DDVP. Finally, it is important to note that it is the first study of toxicity and repellency of essential oils and their compounds obtained from aromatic plants of Argentina against permethrin-resistant head lice. Additionally, the results obtained in the present thesis bring new insight into the knowledge of the mode of action of the monoterpenoids over the acetylcholinesterase activity and the role of the monooxigenases in the degradation of the mentioned components.

Dellarole, Mariano. "E2, regulador de transcripción y replicación del papilomavirus humano: interacción con ADN, dinámica conformacional y divergencia evolutiva" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Más de 50 tipos de papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelio mucoso causando una variedad de lesiones benignas y malignas. El dominio C-terminal de la proteína E2 de HPV (E2C) discrimina entre cuatro sitios de ADN altamente similares regulando el ciclo de vida del virus vía la activación de la replicación y la activación y/o represión de la transcripción. Con el fin de tratar de entender la naturaleza de la interacción entre E2C y ADN, realizamos un análisis detallado del complejo utilizando herramientas bioinformáticas y el contenido de información en las secuencias proteicas y nucleotídicas y usando técnicas biofísicas, proteínas E2C recombinantes y sitios sintéticos de ADN específicos y no-específicos. Antes de estudiar el rol de la interacción E2C-ADN, nos focalizamos en el proceso de polimerización no-funcional de E2C dado que su desarrollo es reprimido por la presencia de ADN específico. Inducida por temperatura, la polimerización de E2C se desencadena mediante la formación de un núcleo estructurado y finaliza en un paisaje morfológico de oligómeros solubles con propiedades amiloideas. El estudio computacional de la interacción E2-ADN de todos los tipos de HPV mucosos indica que las proteínas E2 de distintos tipos poseen propiedades de discriminación de ADN similares. Las diferencias en la interacción E2-ADN se encuentran principalmente en la secuencia de ADN específico, en acuerdo con el análisis de la unión de E2C a diferentes sitios mediante titulaciones isotérmicas de calorimetría. Basado solamente en la secuencia de ADN, logramos predecir diferencias en la energía de unión las cuales se ordenaron en seis grupos de afinidades discretas. Ciertas jerarquías de afinidades como también distancias entre sitios y presencia de sitios de metilación se encontraron estadísticamente asociados con tipos de HPV propensos a ser malignos. Estudiamos la estabilidad y la propiedad de discriminación de secuencia de cinco proteínas E2C homólogas de identidad de secuencia proteica en el rango 44% al 77%. La desnaturalización al equilibrio y la cinética de desplegado en cloruro de guanidinio mostró que todos los dominios son homodímeros estables que se desnaturalizan vía un mecanismo de dos estados. Medimos la unión a distintos sitios de ADN y confirmamos que el mecanismo de unión para todos los complejos es el mismo en base a una genuina compensación entropico-entálpica. Nuestros resultados muestran que la inusual estructura de barril-beta de E2C puede acomodarse a numerosas mutaciones manteniendo las propiedades cruciales de conformación y función. Pero la unión cooperativa a sitios adyacentes de ADN mostró que los componentes entálpicos-entrópicos de la reacción como la deformación del ADN puede divergir entre distintas homólogas en acuerdo con un fuerte acoplamiento entre la dinámica global de la proteína y el reconocimiento del ADN.

Abstract:
More than 50 Human papillomavirus (HPV) types infect mucosal epithelia causing a variety of benign and malign lesions. The C-terminal domain of HPV E2 protein (E2C) discriminates between four highly similar cognate DNA sites in order to regulate the virus life cycle by activating replication and repressing and/or activating transcription. In order to try to understand the nature of the interaction between E2C and DNA, we performed a detailed analysis of the complex using bioinformatics tools and the information content on DNA sequences and using biophysical techniques and recombinant engineered and homologous E2C proteins and synthesized specific and nonspecific DNA sites. Before studying the role of the E2C-DNA interaction, we focused on the nonfunctional polymerization process of E2C as its development is repressed by the presence of DNA binding sites. Triggered by heat, the polymerization of E2C starts by formation of a stable and structured nucleus and ends in an organized morphology landscape of soluble amyloid-like oligomers. The computational study of the E2-DNA interaction of all mucosal HPV types, indicates that E2 proteins have similar DNA discrimination properties. Differences in E2-DNA interaction among HPV types lie mostly in the target DNA sequence, in agreement with the analysis of binding of E2C to different sites using isothermal titration calorimetry. Based on DNA sequences only, we could predict differences in binding energies which clustered into six discrete affinity hierarchies. Finally, certain distances between sites, affinity hierarchies and their eventual changes upon methylation, are statistically associated with high-risk types. We studied the stability and DNA discrimination properties of five homologous E2C proteins with sequence identities ranging from 45% to 77%. Equilibrium denaturation and unfolding kinetics in guanidinium chloride showed that all five domains are very stable homodimers that unfold via a two-state mechanism. We used isothermal titration calorimetry to follow binding of the five proteins to three different DNA sites. Genuine enthalpy-entropy compensation confirms that the binding mechanism is the same for all complexes. The five domains have nearly identical capacities for DNA sequence discrimination despite the high degree of sequence divergence. Our results show that the unusual E2C beta-barrel can accommodate many mutations while retaining its crucial conformational and functional properties. But cooperative binding to tandem DNA E2 site showed that the enthalpic-entropic components of the reaction and DNA deformation can diverge in agreement with a strong coupling between global dynamics and DNA recognition.

Béguelin, Wendy. "Definición de una nueva clase de complejo transcripcional: ErbB2 actúa de coactivador de Stat3 promoviendo la proliferación en tumores mamarios" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El receptor con actividad de tirosina quinasa ErbB2 y la proteína transductora de señales y activadora de la transcripción 3 (Stat3) juegan un rol importante en el desarrollo del cáncer de mama. Distintas evidencias sugieren la existencia de interacciones cruzadas entre ErbB2 y Stat3. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a esta interacción en tumores mamarios permanecen poco estudiados. En este trabajo identificamos un nuevo mecanismo de interacción entre ErbB2 y Stat3 que involucra la translocación nuclear de ErbB2 y la formación de un complejo en el que ErbB2 actúa como coactivador transcripcional de Stat3. Mostramos que la formación de este complejo es inducida tanto por el ligando de los receptores ErbBs, heregulina, como por los progestágenos a través del receptor de progesterona (PR). Demostramos también que la función de ErbB2 como coactivador de Stat3 promueve la activación del promotor de ciclina D1. Cuando la formación del complejo Stat3/ErbB2 es inducida por progestágenos, encontramos al PR co-reclutado en el promotor de ciclina D1, revelando un nuevo mecanismo de acción genómico no clásico del PR. Demostramos que la presencia de ErbB2 en el núcleo celular ejerce un rol fundamental en la proliferación in vitro e in vivo en tumores mamarios. Estos hallazgos revelan una posible intervención terapéutica nueva en tumores de mama que sobreexpresan ErbB2, mediante la inhibición de la translocación nuclear de ErbB2, dado que esta estrategia es efectiva en células tumorales resistentes a las terapias anti ErbB2 convencionales.

Abstract:
ErbB2 tyrosine kinase receptor and Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (Stat3) have been unraveled as two major players in breast cancer growth. In spite of all the accumulating evidence suggesting a crosstalk between ErbB2 and Stat3, the molecular mechanisms underlying ErbB2 and Stat3 interaction in breast tumor remain poorly explored. In this work, we identified a new mechanism of ErbB2 and Stat3 interaction, which involves ErbB2 nuclear translocation and the assembly of a complex in which ErbB2 acts as a transcriptional coactivator of Stat3. We showed that the assembly of this complex is induced by heregulin, a ligand of the ErbBs receptors, as well as by ligand bound progesterone receptor (PR). We also highlighted that ErbB2 function as Stat3 coactivator drives cyclin D1 promoter activation. When the assembly of Stat3/ErbB2 complex is induced by progestins, we found PR recruitment together with Stat3 and ErbB2 to the cyclin D1 promoter, unraveling a new nonclassical PR genomic mechanism. We found that the nuclear Stat3/ErbB-2 transcriptional complex plays a key role in in vitro and in vivo proliferation of breast tumors. Our findings reveal a novel therapeutic intervention in ErbB2-overexpressing breast tumors, by inhibition of ErbB2 nuclear translocation, since this strategy has proven effective in tumor cells which are resistant to conventional anti ErbB2 therapies.

Alvarez, Lucía Paula. "Efecto del ácido salicílico sobre la virulencia de Staphylococcus aureus y su interacción con el huésped" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
S. aureus es una bacteria oportunista capaz de generar infecciones severas en humanos. Entre los factores de virulencia más importantes de S. aureus se encuentran el polisacárido capsular (PC) y la adhesina Eap, cuya expresión está controlada por los reguladores globales sae y mgrA. La expresión de eap es activada por sae, mientras que el PC es activado por mgrA e inhibido por sae. El ácido salicílico (SAL) altera la expresión de diversas moléculas en células procariotas y eucariotas. Este trabajo se propuso estudiar el efecto del SAL sobre la expresión de los factores de virulencia de S. aureus y cómo esto afecta la interacción de la bacteria con el huésped. Al respecto, el SAL provocó un aumento en la capacidad de internalización de la cepa Newman en células epiteliales. Esto correlacionó con una expresión disminuida del PC5 y un aumento de Eap, debido al efecto positivo del SAL sobre sae y negativo sobre mgrA. Por otra parte, el tratamiento de las células endoteliales con SAL, así como también sobre los ratones generó una menor adherencia de S. aureus. Además, se determinó que Eap es esencial para la internalización y colonización de S. aureus tanto in vitro como in vivo. Estos hallazgos demuestran que el SAL altera la expresión de moléculas de S. aureus directamente involucradas en la interacción con el huésped y por lo tanto la progresión de la infección podría verse afectada.

Abstract:
S. aureus is an opportunistic bacterium capable of generating severe infection in humans. Among the most important virulence factors of S. aureus are the capsular polysaccharide (CP) and Eap adhesin, whose expression is modulated by sae and mgrA global regulators. Expression of eap is activated by sae, while CP is activated by mgrA and inhibited by sae. Salicylic acid (SAL) alters the expression of various molecules in prokaryotic and eukaryotic cells. This work proposed to characterize the effect of SAL on hostbacteria interaction. In this regard, SAL caused an increased internalization of strain Newman into epithelial cells. This observation correlated with a decreased expression of CP and an increased expression of Eap, which would be caused by a positive effect of SAL on sae and a negative effect on mgrA. Moreover, the action of SAL on endothelial cells and mice generated a lower adherence of S. aureus. Moreover, it was determined that Eap is essential for internalization and colonization of S. aureus both in vitro and in vivo. These findings demonstrate that SAL is able to alter the expression of molecules directly involved in of host - S. aureus interaction, and therefore the progression of infection would be affected.

dos Ramos Farias, María Sol. "Epidemiología molecular de HIV, HBV, HCV y HTLV-1/2 en población de trabajadores sexuales hombres y trans (travestis, transexuales o transgénero) de Argentina" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo general de esta tesis fue aportar conocimiento sobre las infecciones de transmisión sexual (ITS) en poblaciones de alta vulnerabilidad y en las que la información era casi inexistente como son los hombres trabajadores sexuales (HTS) y trans (travestis, transexuales o transgénero, hombre a mujer) trabajadoras sexuales (TTS). La incidencia de HIV fue mayor en TTS que en HTS (10,7 y 2,3 por 100 personas-año, respectivamente). Las TTS (N= 273) mostraron una prevalencia significativamente mayor que los HTS (N= 114) de HIV (34,1 vs. 11,4%), HBV (40,2 vs. 22,0%) y Treponema pallidum (50,4 vs. 20,4%). Las prevalencias de HCV y HTLV-1/2 no fueron significativamente diferentes entre TTS y HTS (HCV: 4,5 y 6,1%; HTLV-1/2: 1,8 y 1,0%, respectivamente). Las variantes de HIV más frecuentes fueron el subtipo B y la recombinante BF. En el caso de HBV, se detectó una muestra de genotipo F, dos muestras de genotipo A y una de genotipo C. Respecto al HCV, se detectaron cinco muestras con genotipo 1, tres con genotipo 3 y tres con genotipo 4. Además, en un grupo de TTS fue posible determinar la prevalencia de HPV y Chlamydia trachomatis y sus variantes. Las TTS resultaron positivas para HPV en 111/114 casos y para C. trachomatis en 5/113 casos. Los genotipos más frecuentes de HPV fueron el 16, 42, 81 y 58 (el primero y el último de alto riesgo oncogénico). En las muestras positivas para C. trachomatis se detectaron dos con genotipo D, una con genotipo E y una con genotipo L2 correspondiente a linfogranuloma venéreo. La alta prevalencia de ITS y la alta incidencia de HIV demuestran la gran vulnerabilidad de estas poblaciones e indican la urgente necesidad de implementar estrategias preventivas y de facilitar el acceso a programas de salud para las mismas

Abstract:
The general objective of this thesis was to generate knowledge on sexually transmitted infections among highly vulnerable groups which information is scarce, namely male sex workers (MSW) and male-to-female trans sex workers (TSW). HIV incidence among TSW was higher than MSW (10.7 and 2.3 per 100 person-years respectively). TSW (N= 273) showed a significantly higher prevalence of HIV (34.1 vs. 11.4%), HBV (40.2 vs. 22.0%) and Treponema pallidum (50.4 vs. 20.4%) than MSW (N= 114). HCV and HTLV-1/2 prevalence was not significantly different among TSW and MSW (HCV: 4.5 and 6.1%; HTLV-1/2: 1.8 and 1.0% respectively). The most frequently found HIV variants were subtype B and BF recombinant. Regarding HBV, one genotype F was detected as well as two genotype A samples and one genotype C. HCV detected types were one genotype 1, three genotype 3 and three genotype 4. Besides, it was possible to determine HPV and Chlamydia trachomatis prevalence and variants in one group of TSW. TSW tested positive for HPV in 111/114 cases and for C. trachomatis in 5/113 cases. The most frequent HPV genotypes were 16, 42, 81 y 58 (the first and the last corresponding to high risk or oncogenic types). Among C. trachomatis positive samples two genotypes D, one genotype E and one genotype L2 (Lymphogranuloma venereum type) were detected. The high prevalence of STIs and the high incidence of HIV demonstrate the great vulnerability of these high risk populations and indicate the urgent need for preventive strategies on intervention and facilitation of access to healthcare programs.

Larramendy, Celia. "Efectos y adaptaciones inducidos por el tratamiento prolongado con agonistas dopaminérgicos en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Levodopa y pramipexol son drogas de uso frecuente en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Levodopa es el fármaco más efectivo para aliviar las deficiencias motoras pero en la mayoría de los casos induce disquinesias (movimientos involuntarios anormales). Pramipexol ha sido relacionado con efectos neuroprotectores y con una menor inducción de disquinesias. Sin embargo, su eficacia disminuye a medida que progresa la enfermedad. Con el objetivo de analizar si estas diferencias se reflejan a nivel de la expresión de genes, inyectamos ratas con 6-hidroxidopamina en el estriado y caracterizamos un modelo de lesión moderada de la vía nigroestriatal. Luego de la cirugía los animales fueron tratados con levodopa o pramipexol, en dosis que produjeron un beneficio terapéutico similar, determinado como la disminución de la aquinesia, inducida por la lesión, de la pata delantera contralateral al hemisferio lesionado. Un grupo control recibió vehículo. Mediante la tecnología de microarreglos de ADN analizamos 3 tandas independientes de animales a fin de comparar los cambios en la expresión de genes inducidos por los tratamientos de los grupos: normal/vehículo, lesionado/vehículo, lesionado/levodopa, y lesionado/pramipexol. Encontramos que el tratamiento crónico con levodopa y pramipexol indujo cambios en la expresión de numerosos genes, demostrando que, además de las diferencias observadas en el perfil farmacológico y en los efectos clínicos (tanto anti-parkinsonianos como adversos), estas drogas también inducen importantes diferencias a nivel de la expresión génica. La exploración de los genes expresados diferencialmente permitió elaborar nuevas hipótesis, siendo éste el valor principal del análisis masivo de genes.

Abstract:
Levodopa and pramipexole are frequently used drugs in the treatment of Parkinson's disease. Levodopa is the most effective to alleviate motor disability but induces abnormal involuntary movements (dyskinesias). Pramipexole have been proposed to have neuroprotective effects and less induction of dyskinesias. In order to evaluate possible differences at the gene expression level, rats were injected with 6- hydroxydopamine in the striatum and a partial nigrostriatal lesion model was characterized. After surgery, animals were treated with levodopa or pramipexole at doses that produced similar therapeutic benefit, evaluated by the reversal of akinesia, induced by the lesion, of the forepaw contralateral to the lesioned hemisphere. A control group received vehicle alone. We analyzed 3 independent groups of normal and lesioned rats by DNA microarray technology in order to compare the genetic profile of the groups: normal/vehicle, lesioned/vehicle, lesioned/levodopa, and lesioned/pramipexole. We have found that cronic treatment with levodopa and pramipexole induced changes in gene expression. We have demostrated that besides the differences seen in the pharmacological profile and the clinic effects (antiparkinsonian and colateral effects) of levodopa and pramipexole, these drugs also have important differences at the gene expression level. The analysis of differentially expressed genes induced by these drugs allowed us to elaborate new hypothesis, being the most valuable result of massive gene analysis.

Acosta, Eliana Gisela. "La entrada del virus dengue a la célula huésped" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección con dengue, resultando la enfermedad viral transmitida por artrópodos de mayor importancia en todo el mundo. A pesar de la creciente incidencia de este virus, al momento no existen vacunas o quimioterapia antiviral disponibles. Dado que el conocimiento del ciclo de multiplicación viral es indispensable como punto de partida para el diseño de agentes quimioterapéuticos, el presente trabajo de tesis se propuso estudiar los pasos iniciales de la infección con DENV: el mecanismo de entrada a la célula huésped. Nuestro estudio se centralizó en el análisis in vitro de los factores celulares involucrados en la internalización, transporte intravesicular y desnudamiento del virus y la influencia del tipo de célula (mamífero o insecto), cepa y serotipo viral sobre dichos procesos. Mediante el uso combinado de inhibidores químicos y moleculares, medidas de infectividad y técnicas de microscopía electrónica y de fluorescencia demostramos que la entrada del serotipo DENV-1 en células Vero ocurre por endocitosis dependiente de clatrina, mientras que la entrada del serotipo DENV-2 tiene lugar por un mecanismo no clásico independiente de clatrina, caveolas y lipid-rafts, pero dependiente de dinamina. Al extender nuestro estudio a otros sistemas celulares (C6/36 HT y A549) encontramos que la endocitosis de DENV-1 y DENV-2 ocurre por un mecanismo clásico dependiente de clatrina. Por lo tanto, estos resultados demuestran por primera vez que un mismo serotipo viral puede utilizar diferentes vías de entrada en líneas celulares de distinto origen, y que a su vez, distintos serotipos virales pueden utilizar vías de entrada alternativas en un mismo tipo celular. Asimismo, observamos que en todos los sistemas celulares analizados, la entrada de DENV ocurre con dependencia de la exposición de los viriones a pH ácido. Esto implica un tránsito de las partículas virales en compartimentos endosomales hasta el momento en que se dispara la fusión entre la membrana viral y la membrana de la vesícula transportadora. Encontramos que los viriones son primeramente transportados hacia endosomas tempranos para luego continuar hasta endosomas tardíos o endosomas de reciclaje dependiendo de características propias de cada cepa viral. Por lo tanto, los hallazgos presentados en este trabajo no sólo aportan conocimientos básicos sobre los pasos iniciales del ciclo de replicación de este importante patógeno humano, sino que además proveen una nueva perspectiva para encarar el desarrollo racional de agentes antivirales para esta enfermedad de creciente reemergencia global.

Abstract:
At present, nearly half of the world population is at risk of dengue infection, resulting in the arthropod-borne viral disease of major importance worldwide. Despite the increasing incidence of this virus, there are no vaccines or antiviral chemotherapy available. Since knowledge of the viral multiplication cycle is essential as a starting point for the design of chemotherapeutic agents, this thesis aimed to examine the initial steps of DENV infection: the mechanism of virus entry into the host cell. Our study was centered in the in vitro analysis of the cellular factors involved in the internalization, intravesicular transport and penetration of the virus and the influence of the cell type (mammalian or insect), strain and serotype in these processes. Through the combined use of chemical and molecular inhibitors, infectivity assays and electron and fluorescence microscopy techniques we show that the entry of the serotype DENV-1 in Vero cells occurs by clathrin-mediated endocytosis, while entry of DENV-2 takes place by a nonclassical mechanism independent of clathrin, caveolae and lipid-rafts, but dependent on dynamin. By extending our study to other cell systems (C6/36 HT and A549) we found that endocytosis of DENV-1 and DENV-2 occurs by a classical clathrin-dependent mechanism. Therefore, these results demonstrate for the first time that the same serotype may use diverse pathways in cell lines of different origin, and in turn, different serotypes can use alternative entry pathways in the same cell line. We also observed that in all cell systems analyzed by us, the entry of DENV occurs with dependence of exposure of the virions to acidic pH. This implies a transport of viral particles in endosomal compartments until fusion between the viral membrane and the membrane of the carrying vesicle is triggered. We found that virions are first transported to early endosomes and then continue to late endosomes or recycling endosomes depending on characteristics of each viral strain. Therefore, the findings presented here not only provide basic knowledge about the initial steps of the replication cycle of this important human pathogen, but also provide a new perspective to address the rational development of antiviral agents against this re-emerging global disease.

Rubinstein Guichon, Mara Roxana. "Influencia del condicionamiento genético y del estrés en la desregulación de la respuesta inmune en el estado diabético. Participación del estrés oxidativo" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Aunque está clínicamente aceptado que la diabetes predispone a sufrir infecciones severas y los estudios sugieren una asociación entre esta patología y las infecciones, no se conocen los mecanismos que median entre la diabetes y la inmunosupresión. A su vez, el estrés tiene un significativo reconocimiento en el desarrollo y la evolución de la diabetes. Es así que el objetivo del presente trabajo fue estudiar la respuesta inmune en la diabetes mellitus tipo 1, ampliando el conocimiento acerca de los factores genéticos y no genéticos que participan en la evolución del estado diabético y en la alteración de la respuesta inmune. Para esto, se utilizó un modelo experimental murino de diabetes mellitus tipo 1 en dos cepas de ratones: BALB/cByJ y C57Bl/6J y se analizó la respuesta inmune encontrándose que, en los ratones diabéticos de la cepa BALB/cByJ, la repuesta inmune determinada in vivo e in vitro se encontraba afectada, mientras que en los ratones de la cepa C57Bl/6J no lo estaba. A continuación se investigó el efecto del estrés sobre la respuesta inmune en la diabetes. Para esto se utilizó el modelo de estrés crónico moderado (CMS) aplicado luego de la instauración de la diabetes. Los resultados mostraron que en los ratones diabéticos de la cepa BALB/cByJ el CMS provocó alteraciones más tempranas sobre la proliferación linfocitaria probablemente mediadas por el aumento en la glucemia. En estos ratones se observó una correlación positiva entre la glucemia y catecolaminas. En cuanto al efecto sobre la cepa C57Bl/6J, sólo se encontró un aumento en las glucemias sin estar presente la alteración inmune. Dado que la hiperglucemia es el principal factor involucrado en el desarrollo de las complicaciones de la diabetes, se evaluó su participación en los efectos observados. Para esto, se analizó el efecto de la alta glucosa sobre la actividad linfocitaria normal. Las altas concentraciones de glucosa sobre linfocitos provenientes de la cepa BALB/cByJ afectaron directamente la proliferación y condujeron a la muerte de las células, alteración que no se observó en los linfocitos provenientes de la cepa C57Bl/6J. Entre los mecanismos que estarían implicados en los efectos deletéreos de la alta glucosa se destacó el aumento en el estrés oxidativo. Estos resultados señalan la influencia del condicionamiento genético y del estrés en el deterioro de la respuesta inmune en el estado diabético. Si bien la extrapolación de estos resultados a pacientes con diabetes debe ser tomada con precaución, puntualizan la importancia de un temprano y adecuado control de la glucemia como así también de los factores ambientales que puedan alterarla.

Abstract:
Diabetes is widely believed to predispose to serious infections. Experimental clinical literature supports an association between diabetes and infection. However, the mechanisms linking diabetes and immunosuppression are not well defined. In particular, stress has a significant recognition in the development and progression of diabetes. Therefore, the aim of the present project was to study the immune response in type 1 diabetes and genetic and nongenetic factors involved in the evolution of the diabetic state and in immune response alteration. For this purpose, an experimental animal model of diabetes was used in two mice strains: BALB/cByJ and C57Bl/6J and the immune response was analyzed. The immune response in BALB/cByJ diabetic mice was affected while in C57Bl/6J it was not. Then, the effect of stress on immune response in the diabetic state was investigated. The animals were exposed to a chronic mild stress model after diabetes induction. Stress exposure in BALB/cByJ mice caused earlier alterations on immune response mediated by the glycaemia increase. Also, a positive correlation between glycaemia and catecholamines was found. In C57Bl/6J mice, stress exposure only caused glycaemia increase without the immune alteration. Hyperglyacemia is the main factor involved in the development of diabetes complication, thus its participation in the observed effects was evaluated. The effect of high glucose incubation on lymphocyte reactivity was studied. In BALB/cByJ lymphocytes, high glucose decreased the proliferation and increased the apoptosis whereas in C57Bl/6J lymphocytes these alterations were not observed. Among the mechanisms involved in the deleterious effects of high glucose, the increase in oxidative stress was the most important. These results show the influence of genetic background and stress in the immune alteration in the diabetic state. Although extrapolation of these results to patients with diabetes should be taken with caution, it is important to emphasize the early and adequate glycaemia control as well as environmental factors too.

Rodríguez, Lorena Gabriela. "Selectividad de la terapia fotodinámica empleando ALA y otros fotosensibilizantes. Rol de la vasculatura en el daño fotodinámico" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Terapia Fotodinámica (TFD), es un tratamiento para el cáncer y otras patologías, basado en la activación de un fotosensibilizante (FS) ante la exposición a la luz. Uno de los mayores desafíos de la TFD es aumentar su selectividad por las células neoplásicas. En este trabajo hemos estudiado la selectividad de FSs (Foscan, Merocianina 540, naranja de Acridina, Clorina, Verteporfin y Photofrin) y pro-FSs (ALA) por las células tumorales en un modelo de línea celular normal/tumoral, HB4a y HB4a-Ras transfectada establemente con el oncogén Ras. Para ello hemos comparado la acumulación y localización subcelular de diversos FSs y la respuesta a la TFD y encontramos que las células transfectadas con Ras son resistentes respecto a su parental. Por lo que nuestro objetivo de trabajo se focalizó en estudiar las causas de dicha resistencia en las células HB4a-Ras. Hemos hipotetizado que dicha resistencia se puede deber a una menor adhesión al sustrato y adhesión célula- célula debido a una desorganización de la E-cadherina y a alteraciones en el citoesqueleto en F-actina y vinculina. Otro aspecto importante de la fotosensibilización es el rol de la vasculatura. En esta Tesis estudiamos cual es el blanco preferencial (vascular o tumoral) de la TFD. Los estudios in vivo indican que tanto el daño tumoral directo como el vascular son fundamentales, mientras que in vitro, las células endoteliales HMEC-1 son más resistentes a la TFD con FSs tetrapirrólicos que algunas líneas mamarias tumorales y que los queratinocitos humanos, aunque no ocurre lo mismo con FSs de otras estructuras tales como la Merocianina 540 y naranja de Acridina. Las diferencias de selectividad por las células endoteliales para los distintos FSs podrían ser explotadas para su uso en el tratamiento de patologías específicas. Hemos concluido que la selectividad de la TFD varía fuertemente con la estirpe celular, y que la estructura del FS es esencial en dicho proceso. Asimismo, la expresión de oncogenes en los tumores, sería un factor determinante en la efectividad del tratamiento.

Abstract:
Photodynamic Therapy (PDT) involves the administration of a photosensitiser (FS) which is activated by light of an appropriate wavelength to treat cancer and other diseases. Tumour selectivity is one of the major challenges in the PDT field. In the present work we have studied FSs (Foscan, Merocyanin 540, Acridine orange, Clorine,Vertephorfin and Photofrin) and pro-FS (ALA) selectivity for tumour cells employing the normal/tumour cell line pair model HB4a and HB4a-Ras. We have compared accumulation and intracellular distribution of a panel of FSs, and we have found that HB4a-Ras cells are resistant to PDT treatment. Taking into account this finding, we then focused on the study of the mechanism of PDT resistance. We hypothesised that a decreased cell-substratum and cell-cell adhesion due to E- cadherin, F-actin and vinculin disorganization, were involved in the development of resistance. The role vasculature in PDT photodamage has largely been discussed. We decided to study vascular and tumour targets in the in vivo and in vitro photodynamic processes. Our results suggest that whereas in vivo both targets are equally damaged by PDT, in vitro, human endothelial HMEC-1 cells are more resistant to PDT employing tetrapyrrolic PSs than some mammary tumour lines and human keratinocytes, but not employing FSs dyes such as Merocyanin 540 and Acridine orange. These differences in selectivity between different FSs could be exploited for the treatment of specific pathologies. The main conclusion of this work was that PDT selectivity strongly depends on cell type, and that FS structure is crucial on the process. Moreover, oncogene expression may be a key point in the prediction of the tumours that can profit from PDT.

De Maio, Federico Andrés. "Relevancia de la variabilidad genética del HIV-1 y del hospedador en el SIDA pediátrico: sistema Vif-APOBEC3" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas APOBEC3 son citidina deaminasas que pueden determinar cambios G→A en la secuencia codificante de HIV-1, propiedad que les confiere una capacidad antiviral. Esta actividad puede ser contrarrestada por el virus al expresar la proteína Vif, la cual recluta un complejo ubiquitina ligasa basado en Culina5 que desestabiliza a las moléculas APOBEC3. La variabilidad genética tanto del virus como del hospedador puede afectar la eficiencia con la que se desarrollan estos procesos. Una elevada edición G→A puede resultar en la restricción de HIV-1 (fenómeno de mutagénesis letal denominado hipermutación), aunque cambios en niveles subletales podrían favorecer a la diversificación viral. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la variabilidad del sistema Vif-APOBEC3 en niños perinatalmente infectados por HIV-1, determinando su relevancia para el desarrollo de SIDA infantil. Los polimorfismos APOBEC3G H186R, APOBEC3G C40693T y CUL5 SNP6 no parecieron modificar el curso clínicos de la infección. En cambio, mutaciones en Vif (inserción de un aminoácido en posición 61 y las sustituciones V13I, V55T, A62D/N/S, L81M y Q136P) sí se relacionaron con diferencias en los tiempos de progresión a SIDA. Se hallaron además evidencias de que ciertos alelos de APOBEC3G/CUL5 seleccionarían variantes particulares de Vif. Se determinó una baja frecuencia de casos con una población proviral constituida mayoritariamente por formas de HIV-1 hipermutadas. El grado de edición en niveles subletales exhibió diferencias entre variantes de CUL5 y Vif. En conclusión, la variabilidad del sistema Vif-APOBEC3 afectaría los tiempos de desarrollo de SIDA pediátrico y también los niveles de edición sufridos por HIV-1.

Abstract:
The APOBEC3 proteins are cytidine deaminases able to determine G→A changes in the HIV-1 coding sequence, a property that confers them antiviral capacity. This activity can be counteracted by the virus through the expression of the Vif protein, which recruits a Cullin5- based ubiquitin ligase complex that destabilizes APOBEC3 molecules. The genetic variability of both virus and host may affect the efficiency of these processes. A high G→A editing can result in the restriction of HIV-1 (phenomenon of lethal mutagenesis called hypermutation), although changes at sublethal levels could favor viral diversification. The aim of the present work was to study the variability of the Vif-APOBEC3 system in perinatally HIV-1 infected children and to asses its relevance to the pediatric AIDS development. The APOBEC3G H186R, APOBEC3G C40693T and CUL5 SNP6 polymorphisms did not seem to modify the clinical course of infection. In contrast, Vif mutations (a one-amino-acid insertion at position 61 and substitutions V13I, V55T, A62D/N/S, L81M and Q136P) were related to different times of progression to AIDS. Evidences suggesting that certain APOBEC3G/CUL5 alleles could select for particular Vif variants were also found. Cases showing a proviral population mainly composed by hypermutants were observed in a low frequency. The grade of editing at sublethal levels exhibited differences linked to CUL5 and Vif variants. In conclusion, the variability of the Vif-APOBEC3 system could affect the time of progression to pediatric AIDS and also the level of editing carried by HIV-1.

Matzkin, María Eugenia. "Prostaglandinas y su participación en la regulación de la función testicular" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las prostaglandinas son biomoléculas derivadas del ácido araquidónico por acción de la enzima ciclooxigenasa, que participan en el control de procesos fisio-patológicos en reproducción. No obstante, se desconoce aún el papel que desempeñarían en el testículo. En este Trabajo de Tesis Doctoral se investigaron los mecanismos regulatorios de la síntesis de prostaglandinas en el testículo, enfatizando en el análisis de aquellos factores locales involucrados en la modulación de la expresión de ciclooxigenasa 2 en células de Leydig y Sertoli. Los estudios realizados han permitido establecer: a) la participación de hormonas hipofisarias (LH, FSH y PRL) y andrógenos (testosterona, DHT) en la regulación de la expresión de ciclooxigenasa 2 y la síntesis de prostaglandinas en cultivos primarios de células de Leydig y Sertoli de hámsteres Dorados, b) la existencia de análogos moleculares de carga de la PRL hipofisaria que presentan bioactividades diferenciales sobre la expresión de ciclooxigenasa 2 en testículos de hámsteres, y c) el rol estimulatorio ejercido por IL-1β sobre la producción de prostaglandinas en el testículo de pacientes que padecen infertilidad idiopática. Así, las prostaglandinas desempeñarían un rol clave en la regulación de la actividad testicular en situaciones fisiológicas en el hámster, así como también durante el desarrollo y/o mantenimiento de ciertas disfunciones gonadales que conducen a una espermatogénesis alterada en el testículo humano.

Abstract:
Prostaglandins are bioactive molecules derived form arachidonic acid by the action of cyclooxygenase. Although prostaglandins exert their control over both physiological and pathological events in reproduction, very little is known about their role in the testis. In this Doctoral Thesis, the regulatory mechanisms for prostaglandins synthesis in the testis were studied, paying particular interest to local factors that, acting as modulators of cyclooxygenase 2 expression may regulate the functioning of Leydig and Sertoli cells. Studies performed in this Thesis have allowed us to establish: a) the participation of pituitary hormones (LH, FSH, PRL) as well as androgens (testosterone, DHT) as modulators of cyclooxygenase 2 expression and prostaglandins synthesis in Syrian hamster Leydig and/or Sertoli cells primary cultures, b) the existence of differentially bioactive pituitary PRL molecular charge analogues, and c) the stimulatory role exerted by IL-β on cyclooxygenase 2 expression in testes from men suffering from idiopathic infertility. Thus, prostaglandins would play a key role in the regulation of testicular activity under physiological situations in the golden hamster, as well as in the development and/or maintenance of certain testicular malfunctions that could lead to an altered spermatogenesis in the human testis.

Geffner, Laura Judith. "Alteración del eje IFN-gamma/IL-4 e inhibición de la respuesta citotóxica T antígeno-específica como mecanismo de evasión de la respuesta inmune por la cepa de Mycobacterium tuberculosis multirresistente a drogas M" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La tuberculosis multirresistente a drogas (MDR-TB) plantea una amenaza real al control y la eliminación de la tuberculosis (TB) que, a pesar de ser una enfermedad prevenible y curable, continúa siendo uno de los principales problemas de la salud pública. En el presente trabajo caracterizamos la respuesta inmune adaptativa frente a dos cepas causantes de brotes de MDRTB en Argentina, M y Ra, en pacientes con MDR-TB, TB sensible a drogas (STB) e individuos sanos con infección latente (N). Además, determinamos cuáles son los factores involucrados en la evasión de la respuesta T citotóxica (CTL) por la cepa M, en comparación con 410, un aislado estrechamente relacionado con M pero de baja virulencia. Nuestros resultados muestran que: 1) la inducción de citoquinas y de la respuesta CTL Mtb-específicas dependen tanto del status inmunológico del huésped como del genotipo de Mtb; 2) los pacientes con MDR-TB presentan una alteración del eje IFN-γ/IL-4, una respuesta CTL disminuida y un aumento de linfocitos T reguladores; 3) M y Ra son pobres inductoras de IFN-γ en N y 4) M es una gran inductora de IL-4 en MDR-TB y S-TB, sugiriendo que M explota y aumenta la tendencia pre-existente de estos pacientes a generar respuestas Th2; y 5) M es una pobre inductora de CTL tanto en MDR-TB y S-TB como N a diferencia de 410, indicando que la carencia de CTL es una característica de M. La cepa M emplearía varios mecanismos para inhibir la respuesta CTL: a) alteración en la formación de conjugados CTL-CB; b) disminución en la expresión de moléculas líticas y RANTES; c) una activación disminuida, determinada por la baja expresión de CD69; y d) una escasa ayuda CD4+.

Abstract:
Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) poses a real threat to control and elimination of tuberculosis (TB) that, despite being a curable illness that can be prevented, is still one of the main problems of public health. In the present work we characterize the adaptive immune response against two strains that caused MDR-TB outbreaks in Argentina, M and Ra, in patients with MDR-TB, drugsensitive TB (S-TB) and healthy individuals with latent infection (N). Furthermore, we determine which are the factors involved in the cytotoxic T cell (CTL) response evasion by strain M, comparing with 410, a clinical isolate closely related with M but of low virulence. Our results show that: 1) cytokine induction and CTL response Mtb-specific depend on the immune status of the host but also on the Mtb genotype; 2) MDR-TB patients present an alteration of the IFN-γ/IL-4 axis, a diminished CTL response and a rise in regulatory T cells; 3) M and Ra are poor IFN-γ inducers in N; 4) M is the best IL-4 inducer in MDR-TB and S-TB, suggesting that M explits and enhances the pre-existing tendency of these patients to generate a Th2 type response; and 5) strain M is a poor CTL response inducer both in MDR-TB and S-TB as well as in N, and this difference with strain 410 points out that CTL impairment is specific from M. Strain M would employ several mechanisms to inhibit CTL response: a) alteration of conjugate formation between CTL and target cells; b) low lytic molecules and RANTES expression; c) diminished immune activation, as determined by CD69 expression; and d) a limited CD4+ T cell help.

Cassino, Lucila. "Coinfección HIV-HBV en regiones genómicas reguladoras" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La coinfección con HIV y HBV es común en virtud de que ambos virus comparten similares vías de transmisión. La coexistencia de HIV puede modificar la historia natural de la infección por HBV favoreciendo la progresión a cronicidad y aumentando la tasa de replicación de éste. Estos eventos encuentran sustento en la potencial capacidad de modificar el accionar de elementos que regulan la expresión génica. Desde allí surge como objetivo principal de la presente tesis estudiar el impacto de HIV sobre la variabilidad y la evolución molecular de HBV desde las regiones genómicas S, pol, preC/C y X a partir de pacientes crónicamente monoinfectados con HBV y HIV-coinfectados, estudiados longitudinalmente. El genotipo A2 de HBV resultó el más prevalerte ante la coinfección. Sin embargo, comparativamente los aislamientos de tal genotipo caracterizados en pacientes monoinfectados mostraron mayor propensión a cambios en regiones regulatorias. En línea con ello, la evolución molecular de HBV exhibió diferentes tasas de evolución así como menor heterogeneidad y diversidad de cuasiespecies cuando HIV está presente. Este estudio muestra por vez primera el impacto que le imprime la concomitante infección por HIV sobre diferentes parámetros relacionados a la evolución molecular del HBV.

Abstract:
Coinfection with HIV and HBV is a common event since both viruses share blood-borne transmission routes. The natural history of HBV infection is modified by HIV infection leading to an increased risk of hepatitis B evolution to chronicity and a higher replication rate. These events are related with a potential capacity of HIV to modify the activity of regulatory elements of genomic expression. Taking this into account, this thesis is aimed to study HIV impact on HBV variability and molecular evolution in S, pol, preC/C and X HBV genomic regions from HBV monoinfected and HIV coinfected patients, longitudinally studied. Hepatitis B genotype A2 was the most prevalent in coinfected individuals. However, genotype A2 isolates from monoinfected patients showed more changes in regulatory regions. In line with these results, HBV molecular evolution exhibited different evolutionary rates and less heterogeneity and quasispecies diversity when HIV coexists. This study demonstrates HIV influence in different parameters related with HBV molecular evolution.

Pérez Piñero, Cecilia. "Efecto de compuestos alfa2 y beta-adrenérgicos en modelos experimentales de cáncer de mama humano" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La expresión de receptores β-adrenérgicos (RA-β) es conocida tanto en células tumorales mamarias humanas como en modelos experimentales. Sin embargo, el efecto descripto para agonistas y antagonistas sobre la proliferación celular y crecimiento tumoral es paradójico, impidiendo su utilización como terapia adyuvante, especialmente en tumores refractarios. La expresión de RA-β2 fue confirmada en las células humanas por inmunofluorescencia y RT-PCR. La incorporación de -timidina se encontró aumentada por epinefrina (por acción RA-α2) y disminuida por los agonistas β, isoproterenol o β2 salbutamol. Estos agonistas redujeron el crecimiento de los tumores estudiados (IBH-4 e IBH-6). Este efecto fue revertido por el antagonista β-adrenérgico propanolol. El antagonista α2- adrenérgico rauwolscina y los agonistas β-adrenérgicos isoproterenol y salbutamol fueron igualmente eficaces disminuyendo el crecimiento tumoral y la activación de Erk1/2 (fosforilación analizada por western blot). La señalización de estos RA en cuanto a la disminución de la fosforilación de Erk1/2 demostró ser dependiente de AMPc y de la activacion de la PKA. Cuando se realizaron experimentos de migración, se reveló un efecto modulador de este fenómeno por parte de los compuestos adrenérgicos, tanto por parte de las catecolaminas endógenas epinefrina y norepinefrina como de los agonistas β- adrenérgicos. En los modelos experimentales de cáncer de mama estudiados, los agonistas β- adrenérgicos inhiben la proliferación celular y el crecimiento tumoral. Este efecto está probablemente mediado por la inhibición de la fosforilación de Erk1/2. Estos compuestos fueron tan eficaces como el antagonista α2-adrenérgico rauwolscina, brindando la posibilidad de evaluar nuevas terapias adyuvantes para el tratamiento del cáncer de mama.

Abstract:
β-adrenoceptor (β-AR) expression is known in both human breast cancer cells and experimental animal models. However, the reported effect of the agonists and antagonists on cell proliferation and tumour growth is paradoxical, precluding their utilization as possible adjuvant therapy, mainly in the cases of refractory tumours. β2-AR expression was confirmed in the human cells tested by immunofluorescence and RT-PCR. -thymidine incorporation was increased by epinephrine (by α2-AR action) and decreased in every tested cell line by the β-agonist isoproterenol and/or the β2- agonist salbutamol. Isoproterenol and/or salbutamol reduced tumour growth in both tumours tested (IBH-4, IBH-6). This effect was reversed by the β-adrenergic antagonist propranolol. The α2-adrenergic antagonist rauwolscine and the β-adrenergic agonists isoproterenol or salbutamol performed equally well in lowering tumour growth. Erk1/2 phosphorylation inhibition was mainly mediated by the PKA pathway. When the migration potential was assessed, the endogenous catecholamines and also β- adrenergic compounds were able to modulate the migration of the cells. In the experimental models studied, the β-adrenergic agonists inhibit breast cancer cell proliferation and tumour growth. This effect is probably mediated by Erk1/2 phosphorylation inhibition. The β-adrenergic agonists perform equally well as the α2-adrenergic antagonist rauwolscine, providing possible novel therapeutic adjuvant treatments for breast cancer.

Fabrizio, María del Carmen. "Modelización y estudio de la propagación de la infección por Trypanosoma cruzi en escenarios rural y urbano" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se formularon dos modelos matemáticos uno determinístico y el otro, estocástico para obtener una mejor comprensión de la dinámica de la infección por T. cruzi y los mecanismos asociados a la dispersión de la misma. Se recalca la importancia de la diferenciación de las tres etapas de la infección en humanos: aguda, crónica indeterminada y crónica con patología determinada. El modelo determinístico en el escenario rural también involucró a la población de triatominos y a la de los perros (principales reservorios domésticos de T. cruzi en la presencia del triatomino). Las vías de transmisión consideradas para los humanos fueron la vectorial, la congénita y la transfusional. Debido a que el flujo migratorio ha originado la expansión de la enfermedad desde zonas rurales hacia zonas urbanas en ciudades latinoamericanas, generando un problema sanitario en dichos lugares, incluso en países como Canadá, Estados Unidos, Australia, Japón y en países de Europa, se analiza el modelo correspondiente al denominado “Chagas urbano”, en el que se involucra sólo al humano. Se obtienen las fórmulas de la matriz de la próxima generación (interpretando el significado de cada uno de sus componentes) y a partir de ella, de diversos números reproductivos básicos. Se realizan sus correspondientes estimaciones en dos escenarios diferentes. (i) zona rural endémica del Gran Chaco Argentino y (ii) ciudad de Buenos Aires. Se resuelven numéricamente los sistemas de ecuaciones diferenciales de los modelos para (i) vivienda rural en la zona endémica mencionada y (ii) en la ciudad de Buenos Aires. Se deducen las expresiones analíticas de la cantidad de individuos en la dispersión inicial de la infección. Se planteó el modelo urbano en su versión estocástica, obteniéndose la resolución numérica del número esperado de individuos en cada una de las cuatro etapas consideradas.

Abstract:
Deterministic and stochastic mathematical models were formulated in order to get a better understanting of the development and mechanisms associated with the dispersion of the disease. The significance of the classification in three stages of infected individuals (acute stage, indeterminate chronic stage, and chronic stage with apparent symptoms), is stressed. Besides the human population, the deterministic model in the rural scenario involved both, the insect and the dog populations (which are the basic domestic reservoirs of T. cruzi when the insect is present). Three transmission mechanisms were considered: vectorial, congenital and through blood transfussions. Given the expansion of the disease from rural endemic zones toward the Latinoamerican cities caused by migratory streams, thus generating a public health issue in Canada, USA, European countries, Australia and Japan, the model of the so called “urban Chagas” is analyzed as well, in which only human beings are considered as the T. cruzi carriers. Expressions were obtained (and interpreted) from the next generation matrix and the basic reproductive numbers are calculated from it. Two estimations were obtained corresponding to two different scenarios: (i) endemic zone (Argentine Chaco) and, (ii) city of Buenos Aires. The systems of differential equations corresponding to (i) a farm household in the endemic area and, (ii) Buenos Aires city, are numerically solved. Analytical expressions for the number of individuals in the initial phase of the disease dispersion are obtained. A stochastic urban model of differential equations was constructed and numerically solved for the expected number on individuals in each of the four stages considered for the disease.

Maglioco, Andrea Florencia. "Terapias combinadas contra tumores murinos: inmunoterapia y quimioterapia. Relación de la eficacia del tratamiento con el estado inmunológico del portador" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El ganglio linfático drenante del tumor (NLDT) es central en el primado de células T contra antígenos tumorales y en el inicio de la respuesta antitumoral. Sin embargo, también allí el tumor generaría inmunosupresión y tolerancia. La tolerancia no sólo favorece el crecimiento tumoral sino que constituye un obstáculo para el éxito de las inmunoterapias. Utilizamos un fibrosarcoma murino tempranamente inmunogénico que evoluciona hacia un estado tolerogénico, con el fin de estudiar los mecanismos celulares que llevan a la generación de la tolerancia a nivel del NLDT y de diseñar un tratamiento inmunológico apropiado. Determinamos que tras una activación inicial, se induce el aumento de células plasmacitoides, linfocitos B-IL10+ y T regulatorios, todos ellos asociados con inmunosupresión, los cuales coexisten con signos de inmunidad antitumoral locales y sistémicos. Por lo tanto evaluamos la utilidad de extirpar el NLDT como medio de eliminar un foco de inmunosupresión y favorecer el rechazo del tumor; por el contrario se indujo exacerbación del mismo. La restitución de las células efectoras del ganglio extraído conjuntamente con la depleción in vivo de células regulatorias por una dosis baja de ciclofosfamida resultó en menor crecimiento, mayor sobrevida y una alta tasa de regresión tumoral, sin recidivas. Parte de los mecanismos involucrados en la regresión comprenden la disminución del número y la actividad de las células regulatorias, la disminución de la producción de TGF-β, y el aumento de la citotoxicidad específica.

Abstract:
Tumor-draining lymph nodes (TDLN) are central sites where T cell priming to tumor antigens and onset of the antitumor immune response occur. However, tumor-induced immunosuppression has been demonstrated at TDLN, leading to downregulation of antitumor reaction and tolerance induction. Tolerance in turn is a main impairment for immunotherapy trials. We used a murine immunogenic fibrosarcoma that evolves to a tolerogenic state, to study the cellular mechanisms underlying tolerance induction at the level of TDLN and to design an appropriate immunotherapy. We determined that following a transient activation, the established tumor induces signs of immunosuppression at TDLN that coexist with local and systemic evidences of antitumor response. Therefore, we evaluated the feasibility of removing TDLN in order to eliminate a focus of immunosuppression and favor tumor rejection; but instead, a marked exacerbation of tumor growth was induced. Combining the restoring of the TDLN-derived cells into the donor mouse by adoptive transference with the in vivo depletion of regulatory cells by low-dose cyclophosphamide, resulted in lowered tumor growth, enhanced survival and a considerable degree of tumor regression. The mechanisms accounting for tumor remission are at least in part the inhibition of regulatory cells and TGF-β production and the enhancement of the specific cytotoxicity.

De Luca, Paola. "Rol de BRCA1 en la regulación de la transcripción en cáncer de próstata" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El gen de susceptibilidad al cáncer de mama (BRCA1) es un supresor tumoral. Las mutaciones germinales en este gen confieren predisposición al cáncer de mama, ovario y están asociadas con una mayor agresividad del cáncer de próstata (PCa). Varias evidencias demuestran que BRCA1 tiene numerosas funciones, sin embargo, no se conoce aún cuál es el rol de este supresor tumoral en el PCa. En esta tesis determinamos por primera vez que BRCA1 regula directamente su propia transcripción y la de otros genes que intervienen en la respuesta al daño en el ADN, el ciclo celular y la apoptosis en el PCa. Establecimos un mecanismo por el cual la regulación de la transcripción de BRCA1 es una característica fundamental en la modulación de la sensibilidad a los agentes genotóxicos. Comprobamos que BRCA1 forma un complejo multriproteico integrado por E2F1 y Rb, que se asocia a su promotor autorreprimiéndolo. Luego del estrés genotóxico generado por doxorrubicina, BRCA1 se libera activando su transcripción y asociándose a los promotores de otros genes, entre ellos GADD153. Así, BRCA1 induce la transcripción de GADD153 aumentando la apoptosis y el arresto del ciclo celular. Además, generamos un modelo in vivo de xenotransplantes de PCa que poseen disminuída la expresión de BRCA1. Con este modelo demostramos que la disminución de la expresión de BRCA1 aumenta el desarrollo tumoral de próstata. Considerando que los agentes quimioterapéuticos utilizados comúnmente en el tratamiento del cáncer causan daño en el ADN, en este trabajo proponemos que el PCa asociado a mutaciones en BRCA1 presentaría una respuesta alterada a la quimioterapia, representando un nuevo subgrupo de pacientes que podrían requerir terapias alternativas. Los tumores de próstata avanzados se tornan rápidamente resistentes a todos los agentes quimioterapéuticos actualmente utilizados. Así, el entendimiento de los mecanismos de resistencia en tumores con mutaciones en BRCA1 ayudará a desarrollar mejores opciones de tratamiento, como por ejemplo, terapias personalizadas para el PCa.

Abstract:
Breast Cancer susceptibility gene (BRCA1) is a tumor suppressor. Germline mutations in BRCA1 gene increase breast and ovarian cancer risks, and are associated to high grade prostate tumors. Evidence demonstrates that BRCA1 has several functions mainly through interaction with key proteins in several cellular processes; however, BRCA1 role in prostate cancer (PCa) is poorly understood. In this doctoral thesis we determined for the first time that BRCA1 directly regulates its own and other genes transcription in PCa. These genes are involved in DNA damage response, cell cycle and apoptosis. We established one mechanism in which the co- regulator BRCA1 function is a key feature in the modulation of genotoxic sensitivity. We showed that BRCA1 form a multiprotein complex with E2F1 and Rb that associates to its own promoter auto-repressing its expression. After genotoxic stress induced by doxorubicin, BRCA1 is released activating its transcription and associating to other promoters, as GADD153. Thus, BRCA1 induces GADD153 transcription increasing apoptosis and arresting cell cycle. Furthermore, we developed a BRCA1 depleted in vivo xenograft model of PCa. Using this model we could demonstrate for the first time that BRCA1 depletion increases prostate tumor growth in mice. Due to chemotherapeutic agents frequently used in cancer therapy cause DNA damage, in this work we propose that BRCA1 mutations associated to PCa will show different chemotherapy response. This will create a new subset of patients that requires alternative therapies. Advanced PCa rapidly acquire resistance to chemotherapy. Based on this, our model gains high significance. Knowing the mechanisms for BRCA1 associated tumor resistance will help to develop better therapy options, as personalized therapies for PCa.

Bellusci, Carolina Paula. "Implicancias de la farmacogenética en la infección pediátrica por HIV-1" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El gen de resistencia a múltiples drogas (MDR1) codifica para la Glicoproteína P (P-gp), que bombea diversos sustratos hacia el exterior de la célula, entre ellos los antirretrovirales: inhibidores de proteasa (PI). Además, el nivel de expresión de MDR1 está regulado por el receptor nuclear PXR. En el presente trabajo de Tesis Doctoral evaluamos la influencia de los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) de MDR1 (T-129C, C1236T y C3435T) y PXR (C63396T) en la infección pediátrica por HIV-1, la respuesta al tratamiento antirretroviral y la expresión de P-gp. Los SNPs C1236T y C3435T cumplirían un rol protector retrasando la progresión a SIDA pediátrico, pero no afectarían la transmisión vertical por HIV-1. Además, evaluamos el efecto de los SNPs en la respuesta antirretroviral al PI lopinavir, demostrando que el SNP C1236T se asocia con una menor concentración plasmática de la droga y una mayor carga viral. Por otra parte, analizamos si los niveles de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ se asocian con los SNPs de MDR1 o PXR, sin hallar diferencias entre los distintos genotipos. Sin embargo, observamos que el nivel de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ aumenta con la edad y la infección pediátrica por HIV-1. En conjunto, nuestros resultados sugieren que P-gp es un factor clave tanto en la modulación de la infección por HIV-1, independientemente de su función en el transporte de drogas, como en la respuesta a la terapia antirretroviral.

Abstract:
The multidrug resistant gene (MDR1) encodes for P-glycoprotein (P-gp), which pumps several substrates out of the cell, such as the antiretroviral protease inhibitors (PI). In addition, the MDR1 expression level is regulated by the nuclear receptor PXR. In the present PhD Thesis we evaluated the influence of the single nucleotide polymorphisms (SNP) T-129C, C1236T y C3435T of MDR1 and C63396T of PXR in HIV-1 pediatric infection, response to antiretroviral therapy and P-gp expression. The SNPs C1236T and C3435T may play a protective role delaying progression to pediatric AIDS, but we did not observe an effect HIV-1 vertical transmission. In addition, we evaluated the effect of SNPs on antiretroviral response to the PI lopinavir, demonstrating that the SNP C1236T is associated with a lower drug plasma concentration and a higher viral load. We analyzed whether P-gp expression levels in CD4+ lymphocytes are associated with the SNPs of MDR1 or PXR, but no differences between the genotypes were found. However, we observed that P-gp expression levels in CD4+ lymphocytes increase with the age and the HIV-1 pediatric infection. Our results suggest that P-gp is a key factor either in the modulation of the HIV-1 infection, independently of its function in drug transport, or in the response to antiretroviral therapy.

Mondotte, Juan Alberto. "Estudio de las interacciones del virus del dengue con la célula hospedadora" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus del dengue produce en humanos la enfermedad viral más frecuentemente transmitida por artrópodos y no existe hasta el momento terapia antiviral ni vacuna alguna. En este trabajo se desarrollaron diferentes herramientas genéticas con el fin de estudiar las distintas etapas de la replicación viral y la interacción del virus con la célula huésped. Así, se obtuvo el primer clon infeccioso del virus del dengue de un aislamiento argentino y distintas generaciones de virus con proteínas reporteras. Empleando estos sistemas genéticos se pudieron disecar las distintas etapas de la replicación viral. La manipulación del genoma viral permitió caracterizar mutantes de N-glicosilación de las proteínas de envoltura y pre-membrana, y estudiar su importancia en las distintas etapas del ciclo viral. El ensayo del virus reportero, el cual permite evaluar la actividad de luciferasa como un marcador de replicación viral, fue miniaturizado para realizar una búsqueda de quinasas de la célula huésped involucradas en la replicación. Para esto se utilizó la tecnología del RNA de interferencia a gran escala. Mediante este ensayo se identificaron distintas quinasas claves en la replicación del virus y se estudió su importancia en la replicación viral. Por último, se aportó nueva infomación sobre el mecanismo celular por el cual la proteína de cápside se dirige a las organelas celulares lipid droplets, y su relación con la proteína celular ADRP. Este trabajo provee nuevas herramientas genéticas y nueva información sobre los requerimientos del virus del dengue para replicar en la célula infectada. Además, realiza un aporte que podría llevar al desarrollo de nuevas estrategias antivirales.

Abstract:
Dengue is the most prevalent viral disease transmitted by arthropods. At present, neither antiviral therapies or licensed vaccine exist. In this work, we developed new genetic tools to study different steps of viral replication and host-viral interactions. We obtained the first infectious clone from an Argentinean clinical isolate, and several dengue virus reporter systems. Using these tools, we dissected each step of the viral replication process through a luciferase activity assay. Genetically manipulating the viral genome, we characterized N-glycosylation mutants of envelope and pre-membrane proteins, and their role during the viral life cycle. The reporter virus assay was miniaturized to perform an RNA interference screen to search for host kinases involved in viral replication. We identified several kinases important for different steps of viral replication. Finally, we provided new information about the cellular mechanism by which the capsid protein is targeted to cellular organelles known as lipid droplets, and investigated the relationship of capsid with the cellular protein ADRP. This thesis provides new genetic tools and new information on the cellular requirements for dengue virus replication, which could lead to the development of new antiviral strategies.

Croci Russo, Diego Omar. "Interacción entre lectinas y glicanos en procesos de neovascularización tumoral: implicancias en estrategias de inmunoterapia en cáncer" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Uno de los desafíos de la biología tumoral consiste en la búsqueda de mecanismos que vinculen fenómenos de hipoxia y angiogénesis. En función del papel crítico de galectina- 1 (Gal1) en la progresión tumoral investigamos su relevancia en fenómenos de neovascularización. El análisis funcional del perfil de glicosilación de células endoteliales reveló una amplificación preferencial del repertorio de glicanos críticos para la unión de Gal1 en células endoteliales expuestas a estímulos tolerogénicos, proliferatívos e hipóxicos típicos de microambientes tumorales. De acuerdo a estos hallazgos, observamos que Gal1 interacciona con células endoteliales principalmente en N-glicanos promoviendo proliferación, migración/invasión y tubulogénesis a través de mecanismos dependientes de las vías de señalización de VEGFR2, PI3K-Akt y Erk1/2, mimetizando de este modo el efecto biológico del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Por otro lado, verificamos que Gal1 se encuentra asociada a Nglicanos presentes en VEGFR2 e induce su activación y segregación en estructuras tipo "lattices". En tal sentido, los fenómenos de migración y tubulogénesis inducidos por Gal1 fueron bloqueados al utilizar anticuerpos anti-VEGFR2 o al inhibir la disponibilidad de N-glicanos complejos en células endoteliales. A los fines de evaluar la regulación de la expresión de Gal1 en células tumorales se incubaron células de Sarcoma de Kaposi (KS) en condiciones de hipoxia (1% O2), observándose un incremento marcado en la expresión de esta lectina a través de mecanismos dependientes de la activación del factor de transcripción NF-κB y especies reactivas del oxígeno (ROS) e independientes del factor inducible por hipoxia (HIF)-1α. Dicha expresión fue crítica para el crecimiento y la neovascularización de tumores humanos KS y murinos B16 in vivo. La relevancia fisiopatológica de estos hallazgos fue determinada a través de la inhibición de la expresión de Gal1 utilizando estrategias de silenciamiento (shRNA). El bloqueo de la expresión génica de Gal1 logró inhibir la capacidad pro-angiogénica de tumores KS in vivo e in vitro. El análisis por inmunohistoquímica de diversas patologías vasculares humanas reveló que Gal1 se expresa selectivamente en patologías malignas, confirmando el impacto clínico de nuestros hallazgos. Finalmente, y con el objetivo de validar una estrategia terapéutica basada en el bloqueo de Gal1 en el microambiente tumoral, desarrollamos un panel de anticuerpos monoclonales anti-Gal1 bloqueantes los cuales lograron neutralizar los efectos pro-angiogénicos e inmunosupresores de esta lectina in vitro e in vivo. En forma notable, el bloqueo de Gal1 en tumores B16 logró remodelar la vasculatura tumoral e inducir un marcado incremento en el infiltrado inflamatorio, el cual fue capaz de montar respuestas antitumorales dependientes de células Th1 y Th17. Este efecto fue asociado no sólo al bloqueo de la capacidad inmunosupresora de Gal1 sino también a un efecto ‘normalizador’ sobre el endotelio permitiendo la maduración de pericitos y el influjo de células T al parénquima tumoral. En conjunto, los resultados del presente trabajo de tesis demuestran que Gal1 participaría activamente en la generación de un microambiente tumoral pro-angiogénico e inmunosupresor, en el cual la hipoxia, a través de la expresión de esta lectina y sus glicanos, modularía compartimientos inmunológicos y vasculares, favoreciendo fenómenos de angiogénesis y crecimiento tumoral. De este modo, el presente estudio permite vincular, a partir del reconocimiento de lectinas y sus ligandos específicos fenómenos de hipoxia con programas inmunológicos y de neovascularización. A su vez sugiere nuevos enfoques en el diagnóstico y tratamiento de tumores, dando luz a la primera herramienta terapéutica capaz de modular en forma específica la interacción entre Gal1 y sus glicanos interrumpiendo simultáneamente fenómenos de angiogénesis y escape tumoral.

Abstract:
Novel strategies are needed to circumvent resistance to anti-angiogenic therapies. Here we identify a glycosylation-regulated mechanism, based on arrangements of lectin-glycan lattices, which links tumor hypoxia to VEGFR2-mediated angiogenesis through HIF-1α- and VEGF-independent pathways. Concomitant with selective remodeling of endothelial cell surface glycans, hypoxia promoted ROS/NF-κBdependent up-regulation of tumor-derived galectin-1 (Gal1), which signaled angiogenesis through binding to complex N-glycans on VEGFR2. Targeted disruption of Gal1-glycan lattices, using shRNA strategies, mAb-mediated blockade or interruption of N-glycan elongation, attenuated hypoxia-driven angiogenesis, while promoting pericyte maturation and vascular remodeling, thereby favoring influx and expansion of immune cells and suppression of tumor growth. Thus, hypoxia-regulated interactions between endogenous lectins and complex N-glycans on cognate receptors can create functional signaling clusters that substitute for canonical ligands to modulate endothelial cell biology and preserve angiogenesis. These findings highlight the versatility of endogenous lectins and the dynamics of the ‘glycome’ during cancer progression and provide the first evidence of a multitargeted agent capable of promoting vascular remodeling and overcoming tumor immunosuppression through specific interruption of lectin-glycan lattice formation.

Gil Cardeza, María Lourdes. "Esferoides como modelo predictivo de respuesta tumoral a la terapia génica : Estudio de los efectos de la transferencia génica no viral del sistema gen suicida y del gen de interferón-beta en esferoides derivados de melanoma espontáneo canino" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los esferoides constituyen un modelo experimental que se asemeja más al comportamiento de los tumores in vivo que sus respectivas monocapas. Por lo tanto su estudio e implementación en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para combatir el cáncer es de suma importancia. En el presente estudio demostramos que la respuesta a la transferencia no viral del sistema gen suicida HSVtk/GCV de esferoides formados a partir de líneas celulares derivadas de tumores de melanoma espontáneo canino correlaciona mejor con la respuesta de los pacientes que sus respectivas monocapas. También observamos que la resistencia multicelular (MCR) al sistema HSVtk/GCV presente en los esferoides probablemente se deba a una rápida repoblación de las células resistentes al tratamiento en esta configuración espacial. La gran cantidad de líneas cuyos esferoides resultaron ser sensibles al sistema HSVtk/GCV y/o a la transferencia no viral del gen cIFN-β (80% sobre un total de 15 líneas) y el mantenimiento de la sensibilidad al ser co-transferidos demuestran la gran potencialidad terapéutica de la co-administración de ambos genes. Como alternativa a la electroporación, encontramos una forma menos agresiva de aumentar la penetración intracelular de bleomicina: la lipofección. Encontramos que el sistema lipoplexes/bleomicina es altamente efectivo pues la presencia de los lipoplexes sensibiliza a las células al efecto citotóxico de la bleomicina, posiblemente estimulando el ingreso de la droga a las células mediante un transporte activo.

Abstract:
Spheroids are an experimental model in vitro that resembles more accurately the tumor behavior observed in vivo than monolayers. So the study and implementation of spheroids in the development of new therapeutic strategies to fight cancer is very important. At the present study we demonstrated that the response to the non viral gene transfer of the suicide gene system HSVtk/GCV on spheroids derived from spontaneous canine melanoma tumors better correlates to the patient’s response than their monolayers counterparts. We also observed that the multicellular resistance (MCR) to the HSVtk/GCV system when cells are cultured as spheroids is probably due to a rapid re-population of the cells that were resistant to the therapy. The high amount of spheroids which were sensitive to the HSVtk/GCV system and/or to the non viral transfer of the cIFN-β gene (80% over a total of 15) together with the maintenance of the sensitivity when the genes were co-transferred, demonstrates the high therapeutic potentiality of the coadministration of both genes. We then studied the sensitivity to the lipoplexes/bleomycin system. We found that the new therapeutic strategy is highly effective since the lipoplexes sensitizes the cells to the citotoxic effect of bleomycin, presumably by stimulating an active incorporation of the drug inside the cells.

Pérez Mazliah, Damián Eduardo. "Efecto del tratamiento con benznidazol sobre la respuesta celular T específica para Trypanosoma cruzi en pacientes en la etapa indeterminada de la enfermedad de Chagas crónica" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enfermedad de Chagas, causada por el parasito protozoario intracelular Trypanosoma cruzi, afecta alrededor de 8 a 10 millones de personas desde el Sur de California hasta Sudamérica y Europa occidental. A pesar de ser la causa más frecuente de cardiomiopatía infecciosa del mundo, pocas personas infectadas reciben tratamiento. La mayor limitación para desarrollar nuevas drogas y evaluar su eficacia reside en la falta de ensayos que permitan determinar de manera confiable la carga parasitaria y la eliminación definitiva del parásito. Diversos estudios de nuestro laboratorio, incluyendo el presente trabajo, han demostrado que los linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi en pacientes con enfermedad de Chagas crónica muestran características funcionales y fenotípicas de células efectoras o de memoria efectora con baja capacidad de proliferación homeostática y requieren, por lo tanto, del estímulo antigénico para permanecer en circulación. De esta forma, es de esperar que los cambios en la carga parasitaria inducidos por el tratamiento etiológico se vean reflejados en alteraciones en la respuesta celular T. En el presente trabajo, se determinó en forma periódica la frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi, los títulos de anticuerpos específicos de T. cruzi y el estado clínico en 43 voluntarios adultos con infección crónica por T. cruzi bajo tratamiento con benznidazol durante un período de seguimiento de tres años. Estas mediciones fueron comparadas con valores previos al tratamiento y con valores obtenidos a partir de un grupo control no tratado. La frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi productores de IFN-γ disminuyó significativamente luego del transcurso de un año de inicio del tratamiento con benznidazol en la mayoría de los pacientes estudiados, alcanzando posteriormente valores por debajo del límite de detección en gran parte de los pacientes tratados. Llamativamente, esta disminución fue en muchos casos precedida por un incremento significativo en la frecuencia de linfocitos T específicos de T. cruzi productores de IFN-γ con fenotipo efector o de memoria efectora entre dos y seis meses luego del tratamiento. Por el contrario, la frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T cruzi permaneció relativamente estable en ausencia de tratamiento. A pesar de las alteraciones significativas en la respuesta celular T, solo 6 de 43 pacientes tratados con benznidazol mostraron seroconversiones a valores negativos de los títulos de anticuerpos específicos de T. cruzi y solo 3 pacientes mostraron progresión hacia estadios clínicos mas avanzados de la enfermedad. Sin embargo, estos últimos son resultados esperables, teniendo en cuenta que el período de seguimiento fue relativamente corto. Un seguimiento similar fue llevado a cabo en un grupo de 15 voluntarios adultos con infección crónica por T. cruzi sometidos a un esquema novedoso de tratamiento combinado secuencial con alopurinol seguido de benznidazol. La frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi productores de IFN-γ se vio también significativamente afectada por el tratamiento combinado; observándose una disminución inmediatamente después de la administración de alopurinol, así como luego de la finalización del tratamiento combinado con la administración de benznidazol. Más aún, el tratamiento con alopurinol promovió un aumento significativo en el porcentaje de linfocitos T vírgenes totales en periferia, acompañado de una disminución significativa en los niveles de activación de la población total de linfocitos T determinada por la expresión del marcador de activación HLA-DR. Este fenómeno se mantuvo luego del tratamiento con benznidazol. Si bien ninguno de los pacientes estudiados mostró seroconversión completa a valores negativos durante el período de seguimiento, un análisis más exhaustivo de los datos mostró que los títulos de anticuerpos específicos de T. cruzi disminuyeron significativamente luego de finalizado el tratamiento combinado. Estudios in vitro con una variedad de antígenos y el mitógeno PMA mostraron que el alopurinol ejerce un efecto directo en la activación de linfocitos T humanos. De esta forma, el aumento en el porcentaje de linfocitos T vírgenes totales en periferia y la disminución de la expresión del marcador de activación HLA-DR luego del tratamiento con alopurinol podría explicarse por un efecto inmunomodulador directo del alopurinol sobre el sistema inmune del huésped, una disminución en la carga parasitaria, o por una combinación de ambos efectos. El efecto antiinflamatorio del alopurinol podría ser beneficioso para prevenir el desarrollo de alteraciones cardiacas, previamente asociadas con el proceso de inflamación crónica en la enfermedad de Chagas. En conclusión, tanto el tratamiento clásico con benznidazol así como el esquema novedoso de tratamiento combinado secuencial con alopurinol seguido de benznidazol generaron un marcado impacto sobre el sistema inmune específico de T. cruzi en pacientes con enfermedad de Chagas crónica. Estos resultados son altamente indicativos de eficacia terapéutica y cura parasitológica en un conjunto sustancial de pacientes.

Abstract:
Chagas disease, caused by the intracellular protozoan parasite Trypanosoma cruzi, affects around 8 to 10 million people from Southern California to South America and Western Europe. In spite of being the most common cause of infectious cardiomyopathy in the world, few infected subjects receive any treatment. The major limiting factor in developing and evaluating potential new drugs for their efficacy is the lack of reliable tests to assess parasite burden and elimination. Several studies from our research group, including the present work, have demonstrated that T. cruzi-specific T cells in chronically T.cruzi-infected subjects display phenotypic features of effector/effector memory cells that lack homeostatic proliferation capability and rely on antigenic stimulation to remain in circulation. Therefore, it can be reasoned that changes in parasite-load induced by etiological treatment might be reflected in alterations of T cell responses. T. cruzi-specific T cells and antibodies, as well as the clinical status, were measured periodically over a 3-year follow-up period in 43 adult volunteers with chronic T. cruzi infection under treatment with benznidazole. These measurements were compared with pre-treatment conditions and with values in an untreated control group. The frequency of peripheral IFN-γ-producing T cells specific for T. cruzi declined as early as 12 months after the benznidazole treatment was administered and subsequently became undetectable in a substantial proportion of treated subjects. The shift to negative IFN-γ T cell responses was highly associated with an early increase in IFN-γ-producing T cells with phenotypic features of effector/effector memory cells in a subset of subjects. Conversely, the frequency of peripheral T. cruzi-specific T cells remained relatively stable in the absence of treatment. Not surprisingly, given the relatively short follow-up period, in only 6 out of 43 treated subjects the results of conventional serological tests became negative during the follow-up period. In addition, only 3 subjects exhibited progression in the assessment of disease severity during the follow-up period (2 in the benznidazole-treated group and 1 in the untreated group). A similar follow-up study was also conducted on a group of 15 adult volunteers with chronic T. cruzi infection who submitted to a novel combined sequential treatment with allopurinol followed by benznidazole. The frequency of peripheral IFN-γ-producing T. cruzi-specific T cells was highly affected by the combined treatment; the impact was registered early after allopurinol administration, as well as after the completion of the combined treatment. In addition, the treatment with alopurinol promoted an increase in the frequency of total peripheral naïve T cells and a decrease in the frequency of total T cells expressing the activation marker HLA-DR. These observations were sustained after the completion of the combined treatment with benznidazole administration. Although none of the subjects studied showed complete seronegative conversion during the follow-up period, the levels of T. cruzi- specific antibodies significantly decreased after completion of the combined treatment. In vitro studies using a variety of antigens as well as mitogen showed that allopurinol exerted a direct effect on T cell activation. Thus, the early improvement in total naïve T cells and the decrease in the expression of the activation marker HLA-DR after alopurinol treatment may be explained either as a direct effect of allopurinol on the host immune system or by a decrease in parasite load, or a combination of both effects. The anti-inflammatory effect of alopurinol could be beneficial in preventing the development of cardiac symptoms, previously associated with the process of chronic inflammation in Chagas disease. In summary, benznidazole treatment, as well as a novel combined sequential treatment with allopurinol followed by benznidazole, during chronic Chagas disease have a substantial impact on parasite-specific immune responses that is likely indicative of treatment efficacy and cure.

Belforte, Nicolás Adalberto. "Desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento del glaucoma" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este Trabajo de Tesis se demostró que la hipertensión ocular inducida por inyecciones semanales intracamerales de ácido hialurónico provocó un aumento significativo en la actividad del sistema nitrérgico retiniano. La melatonina moduló los sistemas glutamatérgico, GABAérgico, nitrérgico y antioxidante endógeno retinianos en forma opuesta a la inducida por la hipertensión ocular crónica. Un tratamiento crónico con melatonina disminuyó las alteraciones funcionales e histológicas provocadas por el glaucoma experimental. Hemos desarrollado un modelo de glaucoma experimental a través de la administración semanal de condroitín sulfato (CS) en la cámara anterior del ojo de rata que reproduce características centrales del glaucoma humano. La inducción de tolerancia isquémica provocó una preservación significativa en la función retiniana y en la estructura de la retina y del nervio óptico en ojos con hipertensión ocular inducida por la administración de CS. Asimismo, hemos demostrado que la neurotomía óptica radial, que no provocó daño per se, previno y redujo los cambios inducidos por el glaucoma experimental, tanto a nivel funcional como histológico.

Abstract:
In this Thesis, we have demonstrated that ocular hypertension induced by weekly intracameral injections of hyaluronic acid provoked a significant increase in the retinal nitridergic pathway activity. Melatonin modulated the retinal glutamatergic, GABAergic, nitridergic and endogenous antioxidant systems in an opposite way to that induced by chronic ocular hypertension. Moreover, a chronic treatment with melatonin decreased functional and histological alterations provoked by experimental glaucoma. We have developed an experimental model of glaucoma in rats induced by weekly injections of chondroitin sulfate (CS) in the eye anterior chamber, which reproduces central features of human glaucoma. The induction of ischemic tolerance provoked a significant preservation of retinal function and retinal and optic nerve structure in eyes with ocular hypertension induced by CS. In addition, we have demonstrated that radial optic neurotomy, which did not cause damage per se, prevented and reduced functional and histological alterations in the retina induced by experimental glaucoma.

Eirin, María Emilia. "Epidemiología molecular del virus linfotrópico T-humano tipo 1 (HTLV-1) en Argentina: análisis étnico-geográfico y variabilidad viral" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo principal de esta tesis fue profundizar los conocimientos sobre la infección por HTLV-1 en Argentina. Con tal fin, se estimó la prevalencia de infección en comunidades originarias de las provincias de Jujuy, San Juan, Misiones, Formosa y Chaco, detectándose una prevalencia en Kollas de 9.8% que confirmó un área naturalmente endémica en Jujuy con una restricción étnico-geográfica ya descripta. El análisis filogenético determinó que las secuencias HTLV-1, tanto de Jujuy como de Buenos Aires, eran subtipo Cosmopolita subgrupo Transcontinental (aA) a excepción de dos, cuyas muestras provenían de individuos residentes de Buenos Aires nacidos en Perú (Neu2 y Neu6) que fueron clasificados en un nuevo subgrupo denominado F. Por otro lado, se detectaron 4 secuencias evolutivamente relacionadas con referencias de Sudáfrica, demostrando la circulación de cepas virales de origen africano en Buenos Aires. Al estudiar el origen étnico de los individuos HTLV-1 positivos, se evidenció la presencia de un componente autóctono predominante, detectándose los cuatro haplogrupos panamericanos (A2, B2, C1, D1) en los Kollas y en el 73% de los residentes de Buenos Aires. En el resto se identificaron haplogrupos alóctonos con un 17,9% de origen Euroasiático Occidental (H, J, T, U, N1b), un 4,5% de origen Africano (L0 y L1) y un 1,5% de origen Asiático Oriental (M7a). Las cepas clasificadas filogenéticamente como de origen africano pertenecieron a individuos con haplogrupo B2 amerindio, mientras que una secuencia de Buenos Aires que agrupó junto a las de Jujuy provenía de un donante con haplogrupo de origen africano. Estos datos sugieren el contacto entre estas poblaciones y sustenta la hipótesis de introducción de la infección con la llegada de esclavos africanos en la época pos-colombina. El análisis in sílico de las secuencias LTR reveló una menor variabilidad en individuos asintomáticos en comparación con pacientes con HAM/TSP y ATL(p menor 0,05), mientras que la variabilidad de la proteína viral Tax fue significativamente menor en secuencias de portadores de Jujuy que en individuos asintomáticos o con enfermedad de Buenos Aires. De todos modos, no se detectó un polimorfismo determinado asociado con la presencia de patología.

Abstract:
The aim of this thesis was to gain an in-depth knowledge of HTLV-1 infection in Argentina. In order to achieve this, HTLV-1 prevalence was estimated in aboriginal populations of Jujuy, San Juan, Misiones, Formosa and Chaco provinces, yielding a 9.8% among Kollas and confirming a naturally endemic area in Jujuy, associated to an ethnic-geographic restriction as previously described. The phylogenetic analysis determined that HTLV-1 sequences, both from Jujuy and Buenos Aires, were Cosmopolitan subtype Transcontinental (aA) subgroup with the exception of two sequences belonging to residents of Buenos Aires city but born in Peru (Neu2 y Neu6) who were classified in a new subgroup named F. On the other hand, 4 sequences evolutionally related to South Africa were detected, demonstrating the presence of viral strains with African origin in Buenos Aires city. Regarding the ethnic origin of all HTLV-1 positive individuals, the presence of a predominant autochthonous component (Pan-American haplogroups A2, B2, C1, D1) was detected, being all four present in Kollas and in 73% of Buenos Aires inhabitants. In the other populations alloctonous haplogroups were identified with a 17,9% Occidental Eurasian origin (H, J, T, U, N1b), a 4,5% African origin (L0 y L1) and a 1,5% de Oriental Asian origin (M7a). The strains phylogenetically classified as African belonged to individuals with Amerindian B2 haplogroup, while a sequence from Buenos Aires which grouped together with sequences from Jujuy belonged to a blood donor with an African origin haplogroup. This data suggests contact between these populations and sustains the hypothesis of the introduction of HTLV-1 infection with the arrival of African slaves in the post-Columbian era. The analysis in sílico of LTR sequences revealed a lower variability in asymptomatic individuals compared to HAM/TSP and ATL patients (p < 0,05), while the variability of Tax viral protein was significantly lower in asymptomatic individuals from Jujuy compared to asymptomatic or HAM/TSP and ATL patients from Buenos Aires. Regardless this situation, not a specific polymorphism was detected in association to the presence of pathologies.

Higa, Romina Daniela. "Mecanismos de inducción y de prevención de malformaciones congénitas en la patología diabética: rol de agonistas de PPARs y ácido fólico" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo se estudiaron las anomalías inducidas por la diabetes materna en el embrión y en la decidua de rata en el período de organogénesis temprana, así como también el efecto de la administración de agonistas de receptores activados por proliferadores peroxisomales (PPARs) administrados en la dieta y/o de ácido fólico sobre dichas anomalías. Se encontró una disminución en el crecimiento embrionario y un incremento en las tasas de reabsorción y malformación embrionaria en las ratas diabéticas y se observaron disminuciones en los niveles de PPARδ tanto en los embriones como en las deciduas provenientes de ratas diabéticas. Además, se observaron en estos tejidos alteraciones en el metabolismo del ácido araquidónico, en la producción de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno y en la actividad y expresión de enzimas responsables de la remodelación tisular inducidas por la diabetes. Las dietas suplementadas con aceites ricos en agonistas de PPARs administradas a las ratas diabéticas gestantes revierten parcialmente las anomalías en el crecimiento embrionario y la tasa de malformación embrionaria. El mecanismo de acción involucra la regulación de la producción de prostaglandinas, la reducción del estrés oxidativo y nitrativo y la regulación de la actividad de las MMPs y TIMPs en el embrión y en la decidua diabética. El tratamiento consistente en la administración de ácido fólico junto a la dieta enriquecida en aceite de cártamo administrado a las ratas diabéticas logra una reversión total de las malformaciones embrionarias regulando el entorno pro-inflamatorio inducido por la diabetes y previniendo anomalías de enzimas involucradas en la remodelación de la matriz extracelular tanto en el embrión como en la decidua de rata diabética. Estos hallazgos nos permiten destacar a los tratamientos enriquecidos en aceites de oliva y cártamo (capaces de activar PPARs) y con folatos como eficaces reguladores del daño inducido por la diabetes materna, resultados de interés en la búsqueda de tratamientos plausibles de ser aplicados a la gestación humana.

Abstract:
In this study we evaluated maternal diabetes-induced anomalies in the rat embryo and decidua at early organogenesis as well as the effect of peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) agonists administered in the diet and/or folic acid on these anomalies. We found a decrease in embryo growth and an increase in resorption and malformation rates in diabetic rats. Also, PPARδ was found diminished in embryos and decidua from diabetic rats. These intrauterine tissues showed diabetes-induced alterations in arachidonic acid metabolism, in reactive oxygen and nitrogen species and in the expression and activities of enzymes involved in tissue remodeling. Diets supplemented with PPAR agonists administered to diabetic pregnant rats partially reversed the abnormalities in embryonic growth and embryonic malformation rate. The mechanism of action involves the regulation of prostaglandin production, of nitrative and oxidative stress and of MMPs and TIMPs activities in the embryo and decidua from diabetic rats. Folic acid administered together with the safflower oil-supplemented diet achieved a complete reversal of embryonic malformations, possibly by regulating the pro-inflammatory environment induced by diabetes and by preventing alterations in extracellular matrix remodeling enzymes both in the embryo and decidua from diabetic rats. These findings allow us to highlight olive and safflower oil dietary treatments (capable of PPAR activation) and folates as effective regulators of the intrauterine damage induced by maternal diabetes during early organogenesis, results of interest in the search for treatments to be applied to human diabetic pregnancies.

Palmieri, Mónica Alejandra. "Efecto del arsenito de sodio en un modelo de carcinogénesis experimental en piel de ratón" (2011-03-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La exposición ambiental al arsénico es un problema de salud pública debido a que afecta a un gran número de poblaciones en el mundo y a que es un agente carcinogénico para humanos. Por tal motivo surge la necesidad del desarrollo de estudios que permitan comprender el modo de acción para poder prevenir los efectos nocivos relacionados con la ingestión de arsenito a través del consumo de agua. El presente trabajo se desarrolló con la finalidad de detectar la influencia de los compuestos arsenicales en posibles procesos cancerosos pre-existentes o simultáneas al consumo del agua con arsenito. Por lo que se diseñaron los experimentos en ratones a los que se les suministró arsenito de sodio de manera crónica en el agua bebida. Se tomaron en cuenta distintas dosis (2, 20 ó 200 ppm) y distintos momentos de superposición con el proceso clásico de carcinogénesis (antes o después del esquema DMBA/TPA). El efecto del arsenito de sodio en el proceso de carcinogénesis experimental se evidenció en una menor cantidad de tumores en todas las condiciones que bebieron arsenito respecto del control. Pero esas formaciones tumorales evidenciaron una tendencia al aumento del índice de malignidad respecto a los ratones de las condiciones control. Por otro lado es de destacar que la condicón que recibió mayor dosis (200 ppm) bebió un 50% menos que las otras condiciones y que tuvo una tendencia a tener menos peso corporal. Para comprender los efectos sistémicos que puede causar el consumo crónico de arsenito, se estudió ex vivo la población de macrófagos provenientes ya sea de la cavidad peritoneal como del tronco bronqueo-alveolar de dichos ratones. En todas las condiciones la población de macrófagos mantiene la capacidad fisiológica de autorregular si reactividad. Esta característica es más evidente en los macrófagos peritoneales. Por otro lado se observó un aumento sustancial en el npumero de macrófagos respecto a los ratones que no recibieron ningún tipo de tratamiento. En los macrófagos alveolares tratados in vitro no se detectaron cambios significativos en la viabilidad celular y en la apoptosis con las concentraciones menores de a 2 microM para 24-96 hs., pero a concentraciones mayores se observó una marcada disminución en la viabilidad y un significativo aumento en la apoptosis. Para caracterizar el estatus metabólico se estudió la dinámica del proceso de generación de sales de formazona a partir del MTT la cual se modificó a concentraciones mayores a 2 microM y por otro lado, se evaluó la actividad metabólica, sin encontrar modificaciones. Pero la actividad específica del NBT como parámetro de generación de anión superóxido se incrementó significativamente. El arsenito modifica el metabolismo y el estatus oxidativo de los macrófagos alveolares in vitro cuando se encuentran en un medio enriquecido con arsenito. En la líneas celulares se estudiaron in vitro los mismos parámetros. En cuanto a la dinámica de generación de formazona así como en la respuesta apoptótica sólo se observaron cambios significativos con concentraciones mayores a 7,5 microM. Los resultados obtenidos muestran un resultado paradójico, menos tumaores pero mayor malignidad, acorde con las distintas facetas conocidas para éste compuesto, por lo que es necesario hacer hincapié en el tiempo de exposición al mismo, los posibles eventos pre-cancerígenos y la variabilidad interindividual.

Abstract:
Environmental exposure to arsenic is a public health problem because it affects a large number of populations worldwide and arsenic is carcinogenic in human beings. Within this context, the needs arises to perform studies aimed at elucidting the mode of action of arsenic and prevent harmful effects derived from the intake of arsenite in drinking water. The aim of the present study was to asses the influence os arsenic compounds on potential carcinogenic precesses, both pre-existing and concomitant with the intake of water containing arsenite. Experimental protocol werw designed to evaluate the effect of chronic administration of sodium arsenite to mice in the drinking water. Diferent doses of sodium arsenite (2,20 and 200 ppm) were administrated with a varying overlap with the classic carcerogenesis process (namely, before and after the DMBA/TPA carcerogenesis protocol). The effect of sodium arsenite on the process of experimental carcirogenesis involved a reduction in the number of tumors in all the groups exposed to arsenite compared to control. However, the malignancy index of tumors was higher in the experimental group then in the control group. Furthermore, the animals exposed to the highest dose of arsenite (200 ppm) drank 50% less water than the other groups and exhibiter a tendency to lose body weight. Seeking to understand the systemic effects of chronic intake of arsenite, we studied ex-vivo the population of macrophages derived from the peritoneal cavity or the broncheo-alveolar trunk in experimental mice. In all the conditions the macrophages preserved their phisiologic capacity to self-regulate their reactivity. This feature was more evident in peritoneal macrophages. In addition, a robust increase in the number of macrophages was observed in experimental animals compared to animals with no treatment (non-cancerized, not exposed to arsenite) Lastly, in citro studies were performed to characterize the effect of arsenite on cell metabolism of epithelial cell lines and alveolar macrophages. Alveolar macrophages traeted in vitro did not exhibit significant changes in cell viability and apoptosis with concentrations below 2 µM for the 24-96 hs time-point. However, higher concentrations induced a marked rduction in viability and a significant increase in apoptosis. Metabolic status was characterized in terms of the kinetics of the process of generation of formazan salts from MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltetrazolio). This process was modulated by concentrations above 2µM. In addition, we evaluated the specific activity of MTT as a parameter of metabolic activity, and found no changes. However, the specific activity on NBT (Nitro Blue Tetrazolium) as a parameter of generation of superoxide anions rose significantly. Arsenite modified the metabolism and axidative status of alveolar macrophages in vitro when the cells were cultured in an arsenite enriched medium. The same parameters were studied in vitro in the cell lines. The kinetics of production of formazan salts and the apoptotic response only exhibited changes at concentrations above 7,5 µM. the present results are paradoxical in the sence that they reveal a reduction in the number of tumors but an increase in malignancy in cancerized animals exposed to arsenite compared to cancerized controls. This response was with the different known aspects of the effect of arsenite described in the literature. Within this context, potencial pre-carcirogenic effects and inter-subject variability.

Benedetti, Lorena Gabriela. "Rol de la proteína de matriz extracelular SPARC en el crecimiento y diseminación metastásica del cáncer de mama" (2011-12-21) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El crecimiento tumoral resulta de la interacción de la célula neoplásica y su entorno. SPARC “Secreted Protein Acid and Rich in Cystein” es una proteína de matriz extracelular cuya expresión normal se asocia al desarrollo y a tejidos en remodelación. En la mayoría de las neoplasias el aumento de la expresión de SPARC se asocia con un mal pronóstico. Sin embargo, en cáncer de mama la función que cumple la expresión de esta proteína en relación al crecimiento del tumor primario y la diseminación metastásica es controvertida. En este trabajo nos propusimos profundizar las funciones de SPARC, proveniente tanto del estroma como de las células epiteliales en la biología del cáncer de mama. A partir de los estudios realizados con animales transgénicos (SP-/-) que no expresan SPARC en ninguna de sus células, diferentesmodelos de cáncer de mama humanos con distintos niveles de expresión de SPARC, y la cuantificación de la expresión de la proteína en muestras de pacientes con cáncer de mama, determinamos que la expresión de SPARC en ambos componentes tumorales, epitelio y estroma, favorece el fenotipo maligno. Mientras que la elevada expresión en el epitelio tumoral resultó ser más relevante, encontramos que la expresión de SPARC en el estroma tumoral favorece el crecimiento del tumor sólo si el epitelio es negativo. Por otro lado, mediante la utilización del modelo murino 4T1, representativo de un tumor humano estadio IV, pudimos establecer una relación positiva entre la expresión de SPARC y la etapa metastásica de la enfermedad. A partir de la tecnología de microarreglos de ADN, encontramos que SPARC es un importante modulador transcripcional del espacio extracelular y de la proliferación celular, así como también de la respuesta inmune. Finalmente identificamosalgunos genes como posibles efectores de SPARC, favorecedores del crecimiento tumoral y la diseminación metastásica.

Abstract:
Tumor growth is the result of the crosstalkbetween neoplastic cells and theirmicroenvironment.SPARC “Secreted Protein Acid and Rich in Cystein” is a matricellular protein whose normal expression is associated with remodeling tissues. Despite some authors describe this protein as a marker of bad prognosis, its role during development and breast cancer progression remains controversial.Our goal was to understand the role of SPARC expressed either by the epithelial cells or by the surrounding stroma in tumor growth and metastatic dissemination of breast cancer. Using SPARC KO mice (SP-/-), human breast cancer lines with different SPARC expression levels, and the quantification of SPARC expression in human breast cancer samples, we were able to determine that both, epithelial and stromal SPARC contributes to tumor progression. While high epithelial SPARC expressionis more relevant, stromal SPARC only facilitates tumor growth in the presence of a SPARC negative epithelium. Moreover, using 4T1 murine model that very closely models a stage IV human breast carcinoma, we established a positive relation between SPARC expression and the metastatic stage of the disease. DNA microarray data revealed SPARC as an important transcriptional regulator of the extracellular region part, cellular proliferation and an immune response modulator. We identified some new genes as possible effectors of SPARC that regulate tumor growth and metastatic dissemination.

Julianelli, Vanina Laura. "El Heparán Sulfato y la descondensación del núcleo espermático humano: estudio de su rol específico en dicho proceso y caracterización molecular de la interacción Heparán Sulfato-ADN-Protaminas" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
A diferencia de las células somáticas, el espermatozoide posee su cromatina empaquetada principalmente por protaminas en lugar de histonas. Las protaminas son proteínas pequeñas y básicas, debido a su alto contenido de residuos lisina, arginina y cisteína. Las cisteínas forman puentes disulfuro intra e intercatenarios, lo que le proporciona al núcleo espermático gran estabilidad y resistencia para poder atravesar el tracto masculino, el femenino y llegar con su ADN intacto hasta el sitio de fecundación. Una vez que el espermatozoide penetra en el ovocito, es imprescindible que se produzca la descondensación de su cromatina, es decir el desempaquetamiento del ADN para poder reemplazar las protaminas por histonas ovocitarias. La descondensación de la cromatina consiste en dos eventos, deben reducirse los puentes disulfuro (tiorreducción) y removerse las protaminas. Las moléculas involucradas en estos procesos son el glutatión reducido (GSH) y el heparán sulfato (HS) ovocitarios. Hasta el momento se consideraban eventos independientes y sucesivos: primero el GSH tiorreduce las protaminas, y luego el HS las remueve. Sin embargo, nuestros resultados indican que estos procesos podrían ser simultáneos y cooperativos. El objetivo de esta tesis fue avanzar en el estudio del mecanismo de la descondensación de la cromatina del espermatozoide humano in vitro en presencia de heparina (análogo estructural del HS) y GSH y su extrapolación al mecanismo in vivo durante la fertilización. Al coincubar espermatozoides humanos o núcleos espermáticos aislados con heparina y GSH, se produce un mayor porcentaje de descondensación de la cromatina, con respecto a la incubación en forma secuencial con los mismos agentes, independientemente del orden de los mismos. Utilizando naranja de acridina como técnica para evaluar en forma indirecta el estado de tiorreducción de los núcleos espermáticos, se observa que la heparina colabora con el GSH en la tiorreducción, durante la descondensación. Estos resultados fueron confirmados utilizando monobromobimane como método directo para evaluar tiorreducción. Los resultados aportados por esta tesis indican que la tiorreducción producida por el GSH, y la remoción de las protaminas producida por la heparina, durante la descondensación de la cromatina de espermatozoides humanos in vitro, ocurriría en forma simultánea, y no secuencial, ya que ambos factores cooperarían entre sí.

Abstract:
Unlike somatic cells, sperm have a highly packed chromatin due to the presence of protamines instead of histones. Protamines are small basic proteins, very rich in cysteine, lysine and arginine. Cysteine residues form disulfide bonds, both intra and interchain, rendering the sperm nucleus high stability and resistance during transit along the male and female reproductive tracts, thus enabling the spermatozoon to arrive at the fertilization site intact. Once the sperm penetrates the oocyte, chromatin decondensation must occur, implying the unpacking of DNA through the replacement of protamines by oocyte histones. Decondensation comprises two steps: disulfide bonds must be reduced (thioreduction) and protamines must be removed. The molecules involved in these steps are reduced glutathione (GSH) and heparan sulfate (HS) from the oocyte. Until now, these events were considered independent and consecutive: first GSH thioreduced protamines and, then HS removed them. Our results indicate otherwise, suggesting that both processes could be simultaneous and cooperative. The aim of this thesis was to advance in the study of the mechanism of nuclear decondensation of human sperm in vitro, using heparin (HS structural analog) and GSH and the extrapolation to the in vivo mechanism during fertilization. A higher degree of decondensation was observed upon coincubating of human sperm or isolated nuclei with heparin and GSH, compared to sequential incubation with the same agents, regardless of the order in which they were added. Use of an acridine orange staining technique as a means to indirectly evaluate the thioreduced status of sperm chromatin, revealed that heparin enhanced GSH thiol reducing activity, suggesting the existence of a cooperative effect between both reagents during decondensation. These results were confirmed by direct thiol reduced status evaluation uthrough labeling of free thiols in sperm chromatin with monobromobimane. The results presented herein indicate that protamine thiol reduction by GSH and removal of protamines by heparin during chromatin decondensation of human sperm in vitro, occur simultaneously rather than sequentially, since a cooperative effect could be observed between both decondensing agents.

Argüello, Rafael José. "Mecanismos de regulación negativa de la respuesta inmune en pacientes con enfermedad de Chagas" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enfermedad de Chagas es causada por el parásito protozoario intracelular Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y afecta alrededor de 10 millones de personas. Aproximadamente un 20 a 30% de los sujetos crónicamente infectados muestran la progresión a miocardiopatía, después de padecer infección asintomática durante un período de años a décadas. La miocardiopatía de la enfermedad de Chagas es la causa más frecuente de miocardiopatía infecciosa en el mundo. Las respuestas inmunes mediadas por células CD8 y células T CD4 son cruciales para el control de esta infección crónica. En el pasado, debido a la escasez de los parásitos en el corazón, prevaleció la hipótesis de que la miocarditis chagásica crónica era atribuible exclusivamente a reacción cruzada autoanticuerpos al tejido cardiaco, y que la presencia del parásito era dispensable para la inflamación y fisiopatogénesis. Esta idea, en combinación con la elevada toxicidad y la falta de estudios controlados sobre la eficacia del tratamiento, exacerbó el escepticismo sobre la conveniencia de un tratamiento antiparasitario durante la infección crónica. Este escepticismo se mantuvo hasta finales de la década de los 90. Por otra parte, las pruebas serológicas convencionales pueden mantenerse positivas durante años o incluso décadas después de tratamiento antiparasitario exitoso y los resultados de un ensayo clínico doble ciego controlado con placebo para determinar la eficacia del tratamiento benznidazol no están disponibles actualmente. En el presente trabajo hemos estudiado los mecanismos inmunoregulatorios presentes en células T de sangre periférica, específicas o no contra T. cruzi y también en el corazón de pacientes humanos infectados con este parásito. Así mismo evaluamos el impacto del tratamiento tripanocida (benznidazol) sobre, la expresión de las moléculas de inmunoregulatorias y sobre los niveles de subpoblaciones de células T (ítems 1, 2 y 3). 1) Caracterización funcional de moléculas inmunoregulatorias y producción de citoquinas por parte de linfocitos T específicos contra T. cruzi. 2) Evaluación del impacto del tratamiento con benznidazol en subpoblaciones de linfocitos T en pacientes con infección crónica. 3) Composición celular, grado de diferenciación celular y perfil funcional de las células reclutadas hacia el corazón de pacientes con miocarditis crónica de Chagas. 1) Caracterización funcional de moléculas inmunoregulatorias y producción de citoquinas por parte de linfocitos T específicos contra T. cruzi. En los individuos infectados, más del 80% de los linfocitos T específicos contra el parásito productores de IFN-γ, presenta expresión del receptor inhibitorio CTLA-4, pero no de LIR-1. Por el contrario, en los mismos sujetos los linfocitos T específicos contra antígenos de la vacuna TetaDif productores de IFN-γ, no expresan ni CTLA-4 (3%), ni LIR-1 (5%). Además demostramos que la expresión de CTLA-4 en células T específicas contra T. cruzi tiene consecuencias funcionales, debido a la activación de CTLA-4 conduce a la disminución de la producción de IFN-γ en respuesta a antígenos de parásitos. Interesantemente, detectamos expresión de CTLA-4 en linfocitos T en el corazón de pacientes con miocarditis chagásica crónica. Luego de la activación policlonal, la expresión de CTLA-4 aumenta en mayor medida en pacientes sintomáticos en comparación con la inducción de la misma en sujetos asintomáticos y no infectados (P<0,001). La expresión de este receptor inhibitorio en células T específicas contra el parásito en repetidas ocasiones durante la exposición antigénica crónica, podría resultar en el agotamiento immunológico observado en el compartimento total de células T después de 10-20 años de la infección inicial. 2) Evaluación del impacto del benznidazol en subpoblaciones de linfocitos T que se encuentran aumentadas en pecientes crónicamente infectados. La administración del fármaco tripanocida en adultos con infección crónica por T. cruzi induce una disminución temprana, duradera y significativa (5 años de seguimiento) en los niveles de linfocitos T altamente diferenciados, los cuales vuelven a niveles normales. Este cambio se observa en la mitad (7 de 14) de los individuos infectados tratados, pero en ninguno de los individuos infectados no tratados seguidos en el tiempo (0 de 12). La serología convencional acompaña a la disminución de los CD4 + LIR-1 + obtenido en los primeros tiempos después del tratamiento y, por tanto constituiría un marcador precoz subrogante de la eficacia del tratamiento. 3) Composición celular, grado de diferenciación celular y perfil funcional de las células reclutadas hacia el corazón de pacientes con miocarditis crónica de Chagas. Con el fin de caracterizar los tipos celulares presentes y su posible rol durante la miocarditis de la enfermedad de Chagas, se analizaron la composición celular (i.e. CD3, CD4, CD8, CD20, CD21, CD68, CD57), la expresión de moléculas coestimuladoras (i.e. CD27), receptores inhibitorios (i.e. HLA-G, PD-1, CTLA-4), factores de transcripción de TH1 o células T reguladoras (i.e. Tbet, FOXP3), marcadores de senescencia (i.e. CD57, CD45RA) y un marcador de ciclo celular activo (i.e. Ki67). 3a. El porcentaje de células T (CD3 + , CD4 + y CD8 + células) se encuentra incrementado significativamente en las regiones con mayor grado de inflamación (hasta 70% del total infiltrado). Por el contrario, el porcentaje de macrófagos (% CD68 + ) fue similar en regiones de alto y bajo nivel de infiltración (20% del infiltrado). Por otro lado, las células B (i.e. células CD20 + ) se observaron sólo en algunas áreas con alto grado de inflamación y en bajo porcentaje (i.e. mediana, rango; 2%, 0-13%). 3b. La mayoría de los linfocitos infiltrantes mostraron expresión de CD45RO y CD27, marcadores de células con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación. Por el contrario, la expresión de PD-1, CD57 y CD45RA fue muy baja o ausente en el corazón de pacientes con enfermedad de Chagas independientemente del grado de miocarditis. 3c. La expresión del factor de transcripción maestro de TH1, Tbet, se observó en una importante proporción de células durante la miocarditis chagásica. En contraste, el nivel de células T reguladoras (i.e. FOXP3 + ) mostró ser escaso. Se observaron altos niveles del células expresando el marcador del ciclo celular activo, Ki67, las cuales a su vez resultaron coexpresar CD3, pero no CD8. 3d. Mediante un análisis de estadística de dos dimensiones pudimos demostrar la infección del miocardiocito humano durante el curso natural de la infección induce un reclutamiento eficiente de linfocitos T con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación (i.e. CD45RO + CD57 – ). En resumen, hemos encontrado que las células T reclutadas por el corazón infectado de pacientes con Chagas miocarditis poseen bajo grado de diferenciación y un fenotipo similar al de los linfocitos T específicos contra T. cruzi en presentes en sangre periférica. Además, se observó que las células T proliferarían in situ, y que los linfocitos T con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación son reclutadas por los miocitos infectados de manera eficiente.

Abstract:
Chagas disease, caused by the intracellular protozoan parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi), affects around 10 million people. An estimated 20 to 30% of the chronically infected subjects show progression to cardiomyopathy, after being asymptomatic for a period of years to decades. Chagas heart disease is the most frequent cause of infectious cardiomyopathy in the world. Immune responses mediated by CD8 and CD4 T cells are crucial for the control of this chronic infection. In the past, due to the scarcity of parasites in the heart, it was hypothesized that chronic chagasic myocarditis was exclusively attributable to cross-reacting autoantibodies to cardiac tissue and that the presence of the parasite was unnecessary for pathogenesis. This belief, in combination with the high toxicity of treatment and lack of treatment efficacy tests led to skepticism about the convenience of antiparasitic treatment for chronic T. cruzi infection, which persisted until late 1990s. Moreover, conventional serologic assays remain positive after years or even decades after successful treatment and results of a double-blind placebo controlled clinical trial to determine benznidazole treatment efficacy are not available. During my thesis I studied immunoregulatory mechanisms in total peripheral T cells, T. cruzi- specific T cells, and also in heart infiltrating cells from infected human patients. I was able to evaluate the impact of trypanocidal treatment (benznidazole) on the expression of immunoregulatory molecules and T cell subsets in the blood and heart of these patients (item 1, 2, and 3). In order to contribute to the progress towards drug discovery in this neglected and poverty related disease, I developed an automatized method for highthroughput screenings of drugs against trypanosome parasites. 1) Evaluation of the impact of benznidazole treatment in T cell subsets that are increased in chronically infected subjects. 2) Functional characterization of immunoregulatory molecules and cytokine production by T. cruzi-specific T cells from peripheral blood of infected subjects. 3) Cellular composition, grade of differentiation and functional profile of cells recruited by the heart of patients with chronic Chagas myocarditis. 1) Evaluation of the impact of benznidazole on T cell subsets that are increased in chronically infected subjects. Trypanocidal drug administration in chronically infected adults induces a significant, early and long lasting (5 years of follow-up) decrease on highly differentiated effector T cells that return to normal levels. This change is observed in half (7 out of 14) of the infected individuals but in none of their untreated counterparts (0 out of 12). Conventional serology accompanies the decrease in CD4 + LIR-1 + obtained at earlier times after treatment and thus would constitute an early surrogant marker of treatment efficacy. 2) Functional characterization of immunoregulatory molecules and cytokine production by T. cruzi-specific T cells from peripheral blood of infected subjects. More than 80% of the IFN-γ producing T. cruzi-specific T cells from chronically infected patients show high expression of the inhibitory receptor CTLA-4, but not LIR-1. In contrast, IFN-γ-producing vaccine antigen-specific T cells from the same infected subjects do not express neither CTLA-4 (3%), nor LIR-1 (5%). We demonstrated that CTLA-4 expression in T.cruzi-specific T cells has functional consequences, because activating CTLA-4 leads to decreased IFN-γ production in response to parasite antigens. Moreover, the expression of CTLA-4 was observed in T cells in the heart of patients with chronic Chagasic myocarditis. Interestingly, we found that after policlonal activation, CTLA-4 expression was more significantly increased (P<0.001) in symptomatic subjects in comparison with asymptomatic and uninfected subjects. The expression of this inhibitory receptor in parasite specific T cells in conjunction with the chronic antigenic exposure could result in the observed exhaustion of the total T cell compartment after 20-40 years of the initial infection. 3) Cellular composition, grade of differentiation and functional profile of the cells recruited by the heart of patients with chronic Chagas myocarditis. In order to determine their role in the pathogenesis of chronic Chagas heart disease, we analyzed the cellular composition (CD3, CD4, CD8, CD20, CD21, CD68, CD57), the expression of co-stimulatory molecules (CD27), inhibitory receptors (HLA-G, PD-1, CTLA-4), transcription factors of TH1 or regulatory T cells (Tbet, FOXP3), senescence (CD57, CD45RA) and active cell cycle markers (Ki67). 3a. The percentage of T cells (CD3 + , CD4 + and CD8 + cells) are highly increased in regions with the highest degree of inflammation (up to 70% of the total infiltrate). Conversely, the percentage of macrophages (%CD68 + cells) was similar in regions with high and low level of infiltration (20% of the infiltrate). On the other hand, B cells (CD20 + cells) were only observed in some areas bearing high degree of inflammation (Median, range; 2%, 0-13%). 3b. Most heart infiltrating T cells showed CD45RO and CD27 expression, markers of antigen experienced T cells with low grade of differentiation. In contrast, PD-1, CD57 and CD45RA expression were absent, being this in agreement with the absence of terminally differentiated effector T cells and NKs in the heart of Chagas disease patients. 3c. TH1 (Tbet) were highly abundant during Chagas myocarditis. In contrast, regulatory T cells were scarce (FOXP3 + ). Cells expressing high levels of the active cell cycle marker, Ki67, showed CD3 expression but lacked CD8. 3d. Using two dimensional statistics I demonstrated that in-vivo infected human cardiac myocytes efficiently recruit antigen experienced (CD45RO + CD57 – ) T cells with low grade of differentiation. In summary, we found that T cells recruited by the infected heart of patients with Chagas myocarditis bear low grade of differentiation and a strikingly similar phenotype to T. cruzi- specific T cells present in peripheral blood. Moreover, we determined that T cells proliferate in situ, and that antigen experienced T cells are more efficiently recruited than other mononuclear cells by the infected myocytes (2-Dimensional statistics and Monte-Carlo simulations).

Teijo, María Julieta. "Mecanismos de muerte y supervivencia celular por terapia fotodinámica basada en ácido 5-aminolevúlico" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Terapia Fotodinámica (TFD) es utilizada para el tratamiento del cáncer y otras patologías no malignas. Se basa en la administración un compuesto fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido maligno y al recibir luz de longitud de onda adecuada, éste interactúa con el O2 produciendo especies reactivas del oxígeno (ROS), que son altamente tóxicas y desencadenan la muerte celular. La administración exógena del ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de los tetrapirroles, induce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), el único FS endógeno. En la erradicación de tumores mediante TFD intervienen diferentes procesos de muerte celular, los que incluyen apoptosis, necrosis, y autofagia. En el presente trabajo se estudiaron los mecanismos que llevan a la muerte celular por TFD basada en ALA en células de adenocarcinoma de pulmón humanas (A549) cultivadas de modo convencional -en monocapa- o en esferoides multicelulares (EMCs, agregados celulares compactos que desarrollan gradientes de nutrientes y oxígeno), y en una variante resistente derivada mediante sucesivos ciclos de tratamiento fotodinámico y recuperación. La acumulación de PpIX a partir de ALA aumentó con el tiempo de incubación y la concentración de ALA hasta alcanzar un plateau con 1 mM tanto en monocapas como en EMCs. Estudios de microscopía confocal indicaron que las mitocondrias son el principal sitio de localización de PpIX endógena pero no de PpIX administrada exógenamente, la cual se localiza en la membrana plasmática. Los EMCs presentaron una capacidad de síntesis de PpIX similar a las células en monocapa, mientras que en células resistentes se observaron niveles menores de acumulación. La TFD-ALA reduce significativamente la supervivencia celular de manera dosis lumínica dependiente aunque en menor medida tanto en células resistentes como en EMCs. La TFD-ALA induce en las células la generación de ROS tales como ¹O2, O2ֿ y peróxidos, en células en monocapa pero no en EMCs; y esa producción puede ser modulada por agentes antioxidantes de alto grado de protección como el ascorbato y el trolox, con un consecuente aumento en la viabilidad celular. Se observaron eventos asociados a apoptosis 1 h luego de la TFD: reducción del tamaño celular, irregularidades en la membrana plasmática, condensación de la cromatina, despolarización de la membrana mitocondrial, liberación de citocromo c al citoplasma, externalización de fosfatidilserina y activación de caspasa-3. En cambio, tanto en EMCs como en células resistentes se observó una reducción notable en la producción de ROS y en los parámetros de apoptosis. Por otro lado, en todos los casos se hallaron indicios de un proceso autofágico, caracterizado por la formación de vacuolas de doble membrana y la detección de LC3-II, así como la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2. La activación del factor nuclear NFκB únicamente se halló en células tratadas con dosis bajas de TFD, mientras que las células resistentes mostraron presencia de este factor en el núcleo en todos los tiempos de irradiación, de manera creciente. Los resultados obtenidos en este trabajo permiten determinar que los mecanismos de muerte celular post-TFD ocurren principalmente por la vía apoptótica intrínseca, pueden ser modulados por agentes antioxidantes, y coexisten con procesos autofágicos. Por otro lado, el modelo de EMCs es más adecuado para el estudio de los efectos de la TFD-ALA respecto de la monocapa, ya que simula la estructura de microtumores avasculares y refleja características histológicas como la secreción de mucopolisacáridos y la expresión del factor inducido por hipoxia (HIF1-α). La autofagia es el mecanismo principal de respuesta a TFD en células resistentes, las cuales a su vez incrementan mecanismos de sobrevida como la activación de NFκB. Estos son factores condicionantes de la eficacia del tratamiento a considerar al aplicar TFD repetidamente en el tratamiento de tumores y al emplear agentes antioxidantes para minimizar el fotodaño a tejidos no tumorales.

Abstract:
Photodynamic therapy (PDT) is a treatment for malignant and non malignant pathologies. It consists on the administration of a photosensitizing drug (PS) which selectively accumulates in tumor cells and upon irradiation with appropriate wavelength light reacts with O2 and produces reactive oxygen species (ROS) leading to cell death. Exogenous administration of 5-aminolevulinic acid (ALA) induces the accumulation of the endogenous PS, protoporphyrin IX (PpIX). Different cell death pathways develop after PDT, such as apoptosis, necrosis, and autophagy. Mechanisms of cell death after ALA-PDT were evaluated in a human adenocarcinoma cell line (A549) cultured in conventional monolayers, or as multicellular spheroids (MCSs, compact cell aggregates which generate nutrient and oxygen gradients) and in a derived PDT-resistant cell culture obtained after repetitive PDT-recovery cycles. PpIX accumulation from exogenous ALA increased with incubation time and ALA concentration reaching a plateau at 1 mM, both in monolayers and MCSs. Confocal microscopy images showed that endogenously generated PpIX localized in mitochondria, and exogenous PpIX in the plasma membrane. Similar PpIX accumulation rates were found in MCSs with respect to monolayers, whereas derived resistant cells showed lower levels. ALA-PDT significantly reduced cell survival in a light-dose dependent manner, but to a lesser extent in resistant cells and MCSs. Cells subjected to ALA-PDT in monolayers produce ROS like ¹O2, O2ֿ and peroxides, but not in MCSs. They can be modulated by high protection grade antioxidants such as ascorbate or trolox, with the consequent increase in cell viability. Several apoptosis related features were observed after PDT: cell shrinking, membrane blebbing, chromatin condensation, mitochondrial membrane despolarization, cytocrome c release to the cytoplasm, phosphatidylserine externalization and caspase-3 activation. MCSs and resistant cells showed a marked reduction in ROS production and apoptotic features; as well as autophagic signs including doble membrane vacuoles and LC3-II detection, in addition to antiapoptotic protein Bcl-2 expression. Nuclear factor NFκB was detected only after low dose PDT, but in resistant cells all irradiation times showed presence of NFκB in the nucleus, increasing with irradiation time. Results presented in this work indicate that cell death mechanisms induced by ALA-PDT occur mainly by the apoptotic intrinsic pathway, which can be modulated by antioxidant agents, and coexist with autophagic processes. In addition, MCSs are an appropriate model for the study of ALA-PDT because they mimic avascular microtumors and present hystological features like mucopolysacharides secretion and hipoxia-inducible factor expression (HIF1-α). Autophagy is the principal cell death pathway occurring in resistant cells in which increased survival mechanisms, like NFκB activation, were found. Factors conditioning PDT efficacy should be considered when applying repetitive PDT for tumor treatment together with the use of antioxidants to minimize photodamage to non malignant tissue.

Wenker, Shirley Denise. "Investigación de la acción neuroprotectora de la eritropoyetina en modelos in vitro" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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La supervivencia de las células neuronales depende de un estricto balance entre diversos factores pro y antiapoptóticos. La pérdida de este delicado equilibrio puede conducir a la muerte celular por apoptosis como se manifiesta en accidentes cerebro-vasculares y en enfermedades neurodegenerativas. La muerte neuronal puede ocurrir en forma directa, donde el daño per sé induce la disminución del número de células viables o bien indirectamente, involucrando la activación de células de la glía, las cuales liberan citoquinas proinflamatorias, nitritos y especies reactivas del oxigeno, agentes causantes de la degeneración neuronal. La deficiencia de oxígeno (hipoxia) en el sistema nervioso central es un factor de estrés que induce múltiples respuestas. A nivel celular, la exposición a hipoxia puede inducir una desregulación metabólica con pérdida de la homeostasis y muerte celular. Además, durante dicho proceso se desarrolla un microambiente proinflamatorio generado por la activación de la glía, lo cual afecta indirectamente a las células neuronales. Dado el impacto de las secuelas que pueden originarse, se desarrollaron diferentes líneas de investigación con el fin de prevenir el daño neuronal y sus consecuencias. La eritropoyetina (Epo) es una citoquina pleiotrópica, originalmente definida por su rol en la eritropoyesis. Sin embargo, el hallazgo de receptores específicos en tejidos no hematopoyéticos, expandió su acción biológica y farmacológica. La utilización potencial de los efectos no hematopoyéticos de la eritropoyetina recombinante es uno de los aspectos más promisorios en la investigación de la acción farmacológica de esta hormona. De hecho, la Epo ha sido asociada a la prevención de apoptosis de células neuronales sometidas a agresiones tales como privación de nutrientes o factores de crecimiento. Si bien se propone a la Epo como factor de protección celular frente a estímulos apoptóticos, poco se sabe acerca de la modulación de su acción en diferentes estadios de diferenciación neuronal. Por otro lado, resultados de investigaciones utilizando diversos modelos experimentales le han adjudicado a la Epo una acción antiinflamatoria, aunque aún se desconoce el rol que puede presentar este factor sobre la microglía ante un daño tisular. En este trabajo se planteó, como objetivo general, el estudio del efecto modulador y/o neuroprotector de la Epo frente a daños inducidos por hipoxia y por otros estímulos. Para el estudio de la acción antiapoptótica de Epo frente al daño por hipoxia se utilizó un modelo in vitro de cultivos de la línea de origen neuronal SH-SY5Y. Además de disminución de la viabilidad celular y aumento significativo de la apoptosis, la exposición a hipoxia indujo alteraciones morfológicas tales como disminución del área celular y pérdida de la adhesión celular en cultivos indiferenciados. Como resultado del pretratamiento de estos cultivos con Epo, fueron prevenidos los efectos de la posterior exposición a hipoxia. En esta acción antiapoptótica de la Epo se encontraron involucrados la vía mediada por PI3K y el incremento de los niveles de los factores antiapoptóticos Bcl- 2 y Bcl-xL. Actualmente, se reconoce que los mecanismos de muerte celular son marcadamente diferentes en el cerebro inmaduro y en desarrollo por lo que, en el siguiente paso de este trabajo se realizó una comparación de la acción de Epo entre estadios inmaduro y maduro de células de origen neuronal. Los resultados obtenidos sugieren que la diferenciación celular, mediada por el agente diferenciador ácido retinoico (atRA), aumenta el umbral de resistencia celular ante diferentes agentes proapoptóticos, como staurosporina (STP), TNF-α o hipoxia. Este hallazgo se encontró asociado a la activación de la vía de supervivencia celular PI3K y a una regulación positiva del factor antiapoptótico Bcl-2, lo que explicaría, al menos parcialmente, la disminución de la susceptibilidad celular. En los cultivos de células neuronales diferenciadas con atRA no se pudo detectar un efecto protector de la Epo frente a la exposición a STP. Esta observación coincidió, a su vez, con la ausencia de modulación de los factores Bcl-2 y Bcl-xL por Epo. Además, la acción de Epo fue afectada por la modulación negativa de la expresión de su receptor observada en los cultivos diferenciados por atRA. Como se mencionó anteriormente, la inflamación se encuentra involucrada de manera crónica en enfermedades neurodegenerativas como también en procesos de isquemia cerebral y es una de las principales causas de muerte neuronal. En base a trabajos previos en los que se reportó un efecto antiinflamatorio de la Epo en distintos tejidos, se investigó si la Epo podía presentar un efecto modulador en cultivos de células de microglía murina EOC-2 activados por hipoxia química y se estudió el comportamiento de la hormona frente a estímulos proinflamatorios. No se observó un efecto antiinflamatorio clásico de Epo frente al estímulo de hipoxia química. Sin embargo, los resultados mostraron una acción directa de la Epo sobre la microglía incrementando los niveles de iNOS, enzima responsable de la síntesis de óxido nítrico. Además, la Epo mostró acción antioxidante previniendo la formación de especies reactivas de oxígeno e impidió la proliferación de las células de microglía inducida por hipoxia química en ausencia de Epo. Estos hallazgos sugieren que si bien la Epo no impide la activación de la microglía, podría reducir el daño potencial implicado, contrarrestando la inflamación a largo plazo mediante una acción antioxidante y antiproliferativa. En base a los resultados obtenidos, resultó interesante investigar la acción de la Epo en modelos de interacción microglía-neurona. Se observó el efecto neuroprotector de Epo ante la exposición de cultivos de células neuronales SH-SY5Y a medios condicionados obtenidos en cultivos de microglia estimulados por hipoxia. Esta acción citoprotectora de Epo también fue observada en cultivos de las células neuronales expuestas a medios condicionados de cultivos de macrófagos (células RAW) estimulados con LPS-IFNγ. Los resultados obtenidos en este trabajo aportan nuevos conocimientos sobre la acción de la Epo sobre células neuronales y de microglia. Por un lado, la Epo presenta acción neuroprotectora ante el daño directo inducido en células indiferenciadas por diversos agentes proapoptóticos como también ante un ambiente proinflamatorio inducido por la activación, tanto de células de microglía como de macrófagos. Si bien la Epo no presentó una acción antiinflamatoria clásica sobre la microglia, sí mostró un efecto antioxidante y antiproliferativo. De esta manera, se podría sugerir que la acción de la Epo atenuaría la activación de la microglía y, de esta forma, contribuiría a prevenir el desarrollo de un cuadro proinflamatorio mayor, disminuyendo el riesgo de la aparición de efectos perjudiciales para el sistema nervioso. Dada la búsqueda constante de nuevos fármacos para el tratamiento de enfermedades neurodegerativas y la existencia de la eritropoyetina recombinante humana, el conocimiento de la acción antiapoptótica y moduladora de dicha hormona sobre células del sistema nervioso puede constituir un aporte importante a sus características terapéuticas ya conocidas.

Abstract:
Among the factors that support cell survival, erythropoietin (Epo) is well known as a growth factor that maintains the number of circulating erythrocytes primarily by preventing apoptosis of erythroid progenitors. However, its biological role has been expanded by the finding of specific receptors in non-hematopoietic tissues, such as endothelial and neuronal tissues. Evidence has shown that Epo exhibits neuroprotective effects in vitro against proapoptotic agents. In addition, in vivo studies in adult and neonatal animal models have revealed a neuroprotective action of exogenous Epo administration. In this work, we compared the protective action of Epo between immature and mature cultures of neuroblastoma cells. We found a neuroprotective action of Epo upon undifferentiated neuronal SH-SY5Y cells against cytotoxicity induced by staurosporine (STP), TNF-alpha or hypoxia. Our results suggest that Epo might repress neuronal apoptosis by activation of PI3K and JAK-2 signaling pathways upregulating the expression of the antiapoptotic factors Bcl-2 and Bcl-xL. On the other hand, SH-SY5Y cell differentiation by retinoic acid (atRA) caused cell resistance to the Epo action. Together, the results describing modulation of the signaling pathways activated by Epo and those observed in cultures with atRA suggest that differentiated cell resistance to Epo protection can be coupled to an altered response at the EpoR level. During cerebral ischemia, hypoxia may not only cause neuronal cell injury in a direct way, since neuron-microglia interactions are important for neuronal viability. In vitro and in vivo studies have shown that hypoxia can activate microglia cells, leading to proinflammatory reactions that contribute to create a stressing environment upon neighboring neurons. Because of the role of hypoxia in proinflammatory mechanisms in the nervous system, and the protective effect of Epo against a proinflammatory condition resembled by TNF-α, we investigated the role of the hormone in the dialogue between neuron and microglial cells. As the first line of defense, microglia play a critical role in the innate immune response of the central nervous system (CNS) but an excessive response to CNS injury induces microglial activation. Thus, it is likely that toxic inflammatory mediators produced by activated microglial cells under hypoxic conditions may exacerbate neuronal injury following cerebral ischemia. The next step in the current research was the characterization of microglia activation. The murine EOC-2 cell line activated by chemical hypoxia induced by CoCl2 showed increased proinflammatory mediators (nitrites and TNF-α), reactive oxygen species (ROS), iNOS and Cox-2 modulation while cell proliferation data and PCNA stain demonstrated the mitogenic effect of chemical hypoxia. Pretreatment with Epo prevented the CoCl2 effect on cell proliferation and oxidative stress without changing nitrite production, iNOS protein expression or TNF-α secretion. Finally and taking into consideration the results obtained, it was interesting to investigate the effect of hypoxia upon the dialogue microglia-neuron. Conditioned media from activated microglial cells induced apoptosis of SH-SY5Y neuronal cells, effect that was abolished by Epo. Neuroprotection by this cytokine was also demonstrated against the cytotoxic effect of conditioned media obtained from activated macrophages (RAW 264.7 cell line). These results show that even though Epo did not exert a direct antiinflammatory effect upon microglial activation it did increase the resistance of neurons to subsequent damage derived from a proinflammatory environment. In conclusion, our results suggest that Epo protects neuronal cells from direct injuries as well as from the indirect damage caused by cytotoxic agents produced from microglia activation. The demonstrated antioxidant and antiapoptotic ability of Epo could contribute to consider this agent as a neuroprotective factor.

Blidner, Ada G.. "Efecto del antiinflamatorio no esteroideo indometacina sobre las células mieloides supresoras en microambientes inflamatorios normales y tumorales" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células mieloides supresoras (CMS) constituyen una población de células con actividad regulatoria que controla las respuestas inflamatorias crónicas y promueve el escape tumoral. En este proyecto de tesis mostramos que el efecto del antiinflamatorio no esteroide indometacina (Indo) sobre las CMS es dependiente del contexto en el que se diferencie esta población celular. Ratones BALB/c inoculados con el adenocarcinoma de pulmón singeneico LP07 (3x105 células) se trataron in vivo con una dosis de 10 μM de Indo en el agua de beber. El tratamiento inhibió la acumulación de CMS en el tumor y en órganos linfáticos secundarios producida durante la progresión tumoral, inhibió la actividad supresora de las CMS esplénicas sobre la respuesta linfocitaria a un aloantígeno e inhibió el crecimiento tumoral en un ensayo de transferencia adoptiva, p<0.001. En línea con estos resultados, observamos la misma actividad en las CMS cuando se trataron in vitro con Indo (10 μM) en presencia de medio condicionado de células LP07, simulando el microambiente tumoral. Sin embargo, en ausencia del microambiente tumoral, la administración de Indo generó un aumento en la capacidad supresora (MLR; p< 0.05) y pro-tumoral (transferencia adoptiva, p<0.01) de las CMS. Además, las CMS de ratones normales tratadas con Indo en ausencia del microambiente tumoral suprimieron el desarrollo de la encefalomielitis aguda experimental (EAE), un modelo de esclerosis múltiple en ratones C57BL/6, mientras que las CMS tumorales tratadas con Indo aumentaron la severidad de los síntomas e impidieron su resolución (p<0.05). Analizando los mecanismos de inmunosupresión, Indo redujo la actividad arginasa (4,794 vs 2,077 μg urea/ mg total proteína, p<0.001) y la producción de óxido nítrico (9.2 vs 4.4 μM; P<0,05) y de especies reactivas de oxígeno (124 vs 87 MFI P<0.05) en CMS tumorales pero no en CMS normales. Este estudio revela el rol dual de un agente antiinflamatorio en el control de una población celular regulatoria con implicancias críticas en cáncer y en desórdenes autoinmunes.

Abstract:
Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) have emerged as a regulatory cell population that controls chronic inflammatory responses and promotes tumor-immune escape. To date no specific immunomodulatory drug has proven efficacy in targeting the expansion and/or function of these cells. Here we show a context-dependent effect of the non-steroidal antiinflammatory drug indomethacin (Indo) on MDSCs. BALB/c mice were injected with 3x105 LP07 lung adenocarcinoma cells and treated with a non-cytotoxic dose of Indo (10 μM; IC50 LP07: 60 μM). Indo treatment inhibited the suppressive activity of splenic MDSCs in mixed lymphocyte reactions (MLR) (p<0.05), and restrained tumor growth in adoptive transfer experiments (p<0.001). Accordingly, the same effect was observed when MDSCs were treated with Indo in vitro (10 μM; IC50 MDSCs: 125 μM) in the presence of conditioned media from LP07 cells. However, in the absence of a tumoral context, Indo administration increased the suppressive activity of these cells (MLR; p< 0.05) and their pro-tumoral effect (p<0.01). In keeping with these observations, Indo-treated normal MDSCs suppressed the development of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), a model of multiple sclerosis in C57BL/6 mice, while Indo-treated tumoral MDSCs enhanced the severity of EAE and delayed its resolution (p<0.05). Mechanistically, Indo reduced arginase activity (4,794 vs 2,077 μg urea/ mg total protein,p<0.001) and production of nitric oxide (9.2 vs 4.4 μM; p<0,05) and reactive oxygen species (ROS) (124 vs 87 MFI P<0.05) in tumoral MDSCs, but not in normal MDSCs. Our study unveils the dual role of a widely used anti-inflammatory agent in the control of regulatory cell compartments with critical therapeutic implications in cancer and autoimmune disorders.

Fernandez, Diego Carlos. "Estudio de mecanismos de pre y post-condicionamiento como estrategia de inducción de tolerancia isquémica retiniana" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La isquemia es un componente central de diversas enfermedades retinianas que pueden provocar ceguera irreversible. Al presente, no existen tratamientos efectivos frente al daño isquémico retiniano. En este trabajo de Tesis se demostró por primera vez, que el post-condicionamiento isquémico (PostC) inducido por la aplicación de pulsos breves de isquemia en forma posterior a una isquemia prolongada, revierte significativamente las alteraciones funcionales e histológicas provocadas por una isquemia retiniana deletérea. En cuanto a los mecanismos involucrados en este fenómeno, los resultados obtenidos sugieren la participación de la síntesis de novo de proteínas y la actividad de la isoforma inducible de la óxido nítrico sintasa. Además, se demostró que el daño isquémico, al menos en parte, es causado por un aumento en las concentraciones sinápticas de glutamato y que el PostC podría proteger a la retina al disminuir este parámetro. A continuación, se realizó una caracterización del daño de la retina y la vía visual en un modelo de retinopatía diabética experimental inducido por la inyección de estreptozotocina (STZ). A nivel retiniano, se observaron alteraciones funcionales, vasculares y morfológicas significativas. En estadíos tempranos luego de la inyección de STZ se observaron alteraciones axo-gliales en la porción distal del nervio óptico, que podrían constituir el primer cambio estructural en la vía visual diabética. El condicionamiento isquémico (aplicación de pulsos semanales de isquemia) revirtió significativamente todas estas alteraciones, tanto a nivel de la retina como de la vía visual. Asimismo, los resultados obtenidos sugieren que la disminución en los niveles de VEGF y la restauración de la actividad de glutamina sintetasa podrían participar activamente en la protección inducida por el condicionamiento isquémico frente a las alteraciones provocadas por la retinopatía diabética. Finalmente, se demostró que las células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles en particular, y el sistema visual no formador de imagen en general, se preservan en etapas avanzadas de diabetes. En suma, los resultados obtenidos en este trabajo constituyen avances originales en la comprensión de los mecanismos involucrados en la lesión retiniana inducida por isquemia aguda y por diabetes, así como en la posibilidad de prevenir ambos procesos a través de la inducción de tolerancia isquémica. La demostración de que el sistema visual no formador de imagen es menos susceptible al daño diabético representa una valiosa pieza de información respecto a este sistema no canónico de transducción de la información luminosa.

Abstract:
Ischemia is a central component of several retinal diseases that can result in irreversible blindness. At present, there are no effective treatments to protect the retina from ischemic damage. For the first time, in this Thesis work, we have demonstrated that ischemic post-conditioning (PostC) induced by brief episodes of ischemia/reperfusion applied at the onset of reperfusion, significantly protected the retina against functional and histological alterations induced by ischemia. As for the involved mechanisms, the results suggest the participation of de novo synthesis of proteins and the inducible isoform of nitric oxide synthase activity in the protective mechanism triggered by PostC. We have also demonstrated that ischemic damage is, at least in part, caused by an increase in glutamate synaptic concentrations and that PostC protected the retina by decreasing this parameter. Moreover, we have analyzed the alterations at retinal and visual pathway level provoked by experimental diabetes induced by streptozotocin (STZ). Al retinal level, diabetes caused significant functional, vascular, and morphological alterations. In addition, significant axo-glial alterations were observed at the distal portion of the optic nerve at early stages of diabetes that could be the first structural change in the diabetic visual pathway. Ischemic conditioning (weekly application of brief pulses of ischemia) significantly reversed all these alterations. Furthermore, the results suggest that a decrease in VEGF levels and the restoration of glutamine synthetase activity could be key aspects in the protective mechanism triggered by ischemic conditioning against diabetic retinopathy. Finally, we showed that intrinsically photosensitive retinal ganglion cells and the non-forming image visual system are preserved at advanced stages of diabetes. In summary, the results presented in this Thesis provide original insights for unraveling the mechanisms involved in the retinal damage induced by acute ischemia and diabetes, as well as in the possibility of preventing these processes through the induction of ischemic tolerance. The demonstration that the non-forming image visual system is less susceptible to diabetic damage is a valuable piece of information about this non canonical system of light transduction.

Monti Hughes, Andrea. "Eficacia terapéutica y toxicidad de la terapia por captura neutrónica en boro (BNCT) en tejido con cancerización de campo: Estudio radiobiológico en un modelo experimental de cáncer bucal" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
BNCT se basa en la reacción de captura entre el boro depositado preferencialmente en tumor y los neutrones térmicos, generando partículas letales de corto alcance que dañan al tumor, preservando el tejido normal. Previamente, demostramos el éxito terapéutico del BNCT en tumores de la bolsa de la mejilla del hámster. El desafío pendiente era inhibir el desarrollo de segundos tumores primarios (STP) a partir de tejido con cancerización de campo, minimizando la mucositis limitante de dosis. Los STP son frecuentemente la causa del fracaso terapéutico clínico en tumores de cabeza y cuello. El objetivo general de la presente tesis doctoral fue evaluar, por primera vez, la radiotoxicidad y potencial inhibitorio a largo plazo de BNCT sobre el desarrollo tumoral en un modelo de mucosa bucal con cancerización de campo desarrollado en la bolsa de la mejilla del hámster para seguimiento a largo plazo (8 meses). Estudiamos la radiotoxicidad y capacidad inhibitoria de diferentes protocolos de BNCT, variando las dosis y los protocolos de fraccionamiento. Por primera vez, evidenciamos el efecto inhibitorio de BNCT en un tejido con cancerización de campo a largo plazo. Para optimizar BNCT, determinamos la influencia de las condiciones de tratamiento sobre la ventaja terapéutica y radiotoxicidad.

Abstract:
BNCT combines selective accumulation of 10B carriers in tumor tissue with subsequent neutron irradiation, giving rise to lethal, short-range particles. Damage is limited largely to cells containing 10B. Previously, we demostrated the therapeutic efficacy of BNCT to treat tumors in the hamster cheek pouch. However, the inhibition of tumor development from field-cancerized tissue was still an unresolved challenge. In a clinical scenario, tumor development from field-cancerized tissue is frequently the cause of therapeutic faliure. The aim of the present PhD thesis was evaluate, for the first time, BNCT-induced potential radiotoxicity and long-term inhibition of tumor development in a model of oral field-cancerized tissue. We developed an oral precancer model in the hamster cheek pouch for long-term studies (8 months). We studied radiotoxicity and the potential inhibitory effect of different BNCT protocols, evaluating different dose levels, dose fractionation and interval between applications. For the first time, we evidenced the long-term inhibitory effect on tumor development of BNCT in field-cancerized tissue and showed that treatment conditions are pivotal to therapeutic advantage and radiotoxicity. The knowledge of BNCT radiobiology for experimental oral precancer contributes to the optimization of the technique.

Moiola, Cristian Pablo. "Nuevos blancos moleculares en el cáncer de próstata" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de próstata (PCa) es el segundo tipo de cáncer más frecuente en el mundo. En la Argentina, es el de mayor incidencia y el segundo en mortalidad. La edad, el origen étnico, la historia familiar, el estilo de vida y la obesidad son importantes factores de riesgo asociados al desarrollo de esta patología. En este trabajo de tesis nos centralizamos en el rol de BRCA1 en diferentes vías que contribuyen al desarrollo del PCa. Estudiamos la regulación transcripcional mediada por BRCA1 del gen ATM, clave en el mantenimiento de la estabilidad genómica celular. Determinamos que el complejo formado por las proteínas BRCA1, E2F1 y CtIP, se asocian al promotor de ATM y activan su transcripción. Asimismo, cuando se induce estrés genotóxico, BRCA1 y CtIP se liberan reprimiendo su transcripción. Además, estudiamos la regulación transcripcional de BRCA1. Encontramos que los andrógenos, la principal hormona masculina, regula la expresión de BRCA1 en líneas celulares de PCa. Esta hormona reprime la transcripción de BRCA1 en las células LNCaP, sensibles a andrógenos. Mientras que en las células PC3, insensibles a andrógenos, la testosterona aumenta los niveles de expresión de BRCA1. Esta diferencia en la respuesta a la testosterona en las células tumorales de próstata parece responder a un efecto en la síntesis de estrógenos a partir de andrógenos. En este trabajo de tesis también determinamos que las proteínas CtBP1 y BRCA1 se encuentran asociadas a la región proximal del promotor de BRCA1 reprimiendo su transcripción. En la línea tumoral PC3, la testosterona provoca que estos factores se liberen del promotor de BRCA1 activando su transcripción. Utilizando líneas celulares que sobre-expresan o tienen disminuida en forma estable la expresión de CtBP1, encontramos que la sobreexpresión de CtBP1 aumenta la transformación y la viabilidad celular. En un modelo de xenotransplantes generado por inoculación de estas células estables en ratones nude, determinamos que la disminución de la expresión de CtBP1disminuyó drásticamente el crecimiento tumoral solo cuando los animales habían sido alimentados con una dieta hipercalórica. Asimismo, la incubación de las líneas estables de PC3 con el suero proveniente de animales alimentados con una dieta hipercalórica aumento la proliferación celular de las células que sobre-expresan CtBP1 al igual que se ven favorecidos la activación de procesos de EMT que podrían conducir al establecimiento de metástasis. En resumen, en este trabajo de tesis describimos por primera vez un mecanismo de regulación transcripcional de ATM por BRCA1 en respuesta al estrés genotóxico. Además determinamos que los andrógenos y la dieta hipercalórica pueden influenciar el desarrollo tumoral prostático alterando la vía de CtBP1/BRCA1. Por lo tanto, estos resultados aportan nuevas evidencias en cuanto a la regulación transcripcional de BRCA1 y su función co-reguladora de otros blancos moleculares fortaleciendo así su rol supresor tumoral en el PCa.

Abstract:
Prostate cancer (PCa) is the second most frequently diagnosed cancer in the world. In Argentina, has the highest incidence rate and is the second leading cause of deaths in males. Several factors, such as ethnicity, age, family history, lifestyle and obesity, have been associated with and increase risk of developing this pathology. In this thesis we focus on BRCA1’s role in different molecular pathways that contribute to the development of PCa. We studied ATM transcriptional regulation mediated by BRCA1 and its importance in the maintenance of cellular genomic stability. We determined that the molecular complex formed by BRCA1, CtIP and E2F1 proteins are associated with ATM promoter and activate its transcription. In addition, CtIP and BRCA1 are release and repressed ATM promoter under genotoxic stress conditions. On the other hand, we studied BRCA1 transcriptional regulation. We found that androgens regulate BRCA1 expression in PCa cell lines. Particularly, testosterone represses BRCA1 transcription in androgens sensitive LNCaP cells. However, testosterone increases BRCA1 expression levels in PC3 insensitive to androgens cell lines. This contradictory behavior in PCa cell lines may be due to an effect on the synthesis of estrogens from androgens. Moreover, we found that CtBP1 and BRCA1 proteins are associated to BRCA1 proximal promoter to repress its transcription. However, in PC3 cell lines, testosterone induces BRCA1 transcription causing the release of these factors. Furthermore, we generated PC3 cell lines with stable overexpression or knockdown CtBP1 expression. We found that CtBP1 overexpression enhanced cellular transformation and increased cell viability. We also determined, in a xenograft nude mice model generated by PC3 stable cell lines inoculation, that the decreased expression of CtBP1 drastically diminished the tumor growth only when the animals had been high-calorie diet fed. In addition, incubation of stable lines PC3 with serum from animals fed with a hypercaloric diet, increased cell proliferation of cells that overexpress CtBP1. Finally CtBP1 overexpressing cells have enhanced EMT activation toward CtBP1 silencing cell lines leading to the establishment of metastasis. In summary, we describe for the first time a transcriptional regulation mechanism of ATM by BRCA1 in response to genotoxic stress. We also determined that androgens and high caloric diet modulate CtBP1/BRCA1 pathway affecting prostate tumor development. Therefore, these results provide further evidence of BRCA1 transcriptional regulation and BRCA1 transcriptional co-regulatory function, strengthening its tumor suppressor role in PCa.

Travella, Ana Carolina. "Análisis de nuevos marcadores moleculares en Leucemia Linfocítica Crónica" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La leucemia linfocítica crónica (LLC) constituye la leucemia más frecuente en occidente, caracterizada por presentar un curso clínico variable, siendo de interés la búsqueda de nuevos marcadores. En este trabajo se estudiaron 223 pacientes con LLC mediante análisis citogenético, citomolecular y molecular. Los estudios citogenéticos y citomoleculares permitieron identificar 35 alteraciones estructurales no descriptas previamente en la literatura, siendo el cromosoma 8 el más frecuentemente implicado. El análisis del estado mutacional y los rearreglos del gen IGVH (immunoglobulin heavy chain variable gene), permitió caracterizar a nuestra población de pacientes con LLC, mostrando una distribución similar a la de los países Occidentales (IGVH3>IGVH1>IGVH4) con diferencias respecto de Asia y Brasil, sustentando variaciones en el background genético y/o en factores ambientales entre poblaciones. La evaluación de los niveles de expresión de los genes SEPT- 10, MCL-1, LPL, ADAM-29 y CLLU-1, mostró gran heterogeneidad que refleja la variabilidad característica de la LLC, y permitió establecer la asociación de la expresión LPL y ADAM-29 con las características citogenéticas de los pacientes, aspecto no explorado previamente. Estos estudios resaltan la importancia de profundizar la caracterización biológica y la comprensión de los mecanismos patogénicos de esta enfermedad tendiente a definir nuevos grupos de riesgo específicos.

Abstract:
Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent form of leukemia in Western world, characterized by a highly variable clinical course, being necessary the search for new prognostic markers. In this study, we described cytogenetic, citomolecular and molecular analysis of 223 CLL patients. Cytogenetic and citomolecular results showed 35 new structural abnormalities not previously described in the literature, being chromosome 8 the most frequently involved. The mutational status of the IGVH (immunoglobulin heavy chain variable genes) gene in our cohort showed a family distribution similar to that observed in Western countries (IGVH3>IGVH1>IGVH4) and different to CLL patients from Asia and Brazil, that may reflect variations in the genetic background and/or environmental factors of their populations. Expression profiles of SEPT-10, MCL- 1, LPL, ADAM-29 and CLLU-1 genes showed great heterogeneity that may reflect characteristic variability of CLL patients, and showed association between LPL and ADAM-29 with cytogenetic features in our cohort, data not previously described in the literature. This results remarks the importance of biological characterization and understanding of pathogenic mechanisms of this disease in order to define specific risk groups.

Vota, Daiana Marina. "Eriptosis. Mecanismos involucrados y efecto protector de la eritropoyetina" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los procesos inflamatorios, frecuentemente asociados a anemia de enfermedades crónicas, podrían cumplir un rol en la inhibición de la eritropoyesis. La existencia de señales intracelulares comunes entre los procesos que regulan la eritropoyesis y la respuesta inflamatoria sugiere que la desregulación de un sistema podría explicar la disminución de la función del otro. Por otro lado, un daño directo sobre los eritrocitos maduros en circulación, causado por factores presentes en dichos procesos, podría contribuir también al desarrollo de anemia. Teniendo en cuenta que la identificación de factores que pueden afectar la sensibilidad de células eritroides a las diferentes señales recibidas permitiría conocer la interferencia de la inflamación en la eritropoyesis, se planteó como primer objetivo, dilucidar la interrelación entre diferenciación eritroide y apoptosis. Se observó una mayor sensibilidad de la línea eritroleucémica humana K562 a la acción proapoptótica de citoquinas proinflamatorias, como TNF-α e IL-1β, cuando las células se encontraban en etapa de diferenciación eritroide. El estudio de los mecanismos involucrados permitió sugerir, por primera vez, una posible explicación del efecto de TNF-α e IL-1β basada en la disminución de los niveles de la proteína antiapoptótica c-FLIP observada durante la diferenciación con hemina. Más aún, el tratamiento previo con el factor de crecimiento eritropoyetina (Epo) de las células inducidas a diferenciación eritroide las protegió de la acción proapoptótica a la vez que se detectó la modulación positiva de c-FLIP. La Epo contrarrestaría los cambios en las vías de señalización producidos durante el proceso de diferenciación eritroide permitiendo a las células mantener su resistencia a la apoptosis mediada por citoquinas proinflamatorias. Bajo ciertas circunstancias, eritrocitos maduros pueden sufrir autodestrucción prematura presentando alteraciones celulares similares a las de la apoptosis de una célula nucleada, razón por la que se denominó a este proceso eriptosis. Además de citoquinas, durante los procesos inflamatorios es frecuente encontrar incrementados los niveles de compuestos prooxidantes. Por ello, a continuación se enfocó el trabajo hacia la evaluación de un posible efecto directo de estos agentes sobre eritrocitos maduros. Se estudió el desarrollo de signos de eriptosis en los eritrocitos expuestos a citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β e IFN-γ) y a agentes prooxidantes (NaNO2 y H2O2). Se encontró que éstos pero no las citoquinas indujeron traslocación de fosfatidilserina (PS) en la membrana del eritrocito. Para investigar los posibles mecanismos involucrados en la autodestrucción prematura de los eritrocitos, se analizaron cambios morfológicos y bioquímicos en el glóbulo rojo expuesto a dos condiciones: aumento masivo de calcio intracelular y exposición celular a NaNO2 y H2O2. Además de la externalización de PS, los eritrocitos bajo ambos tratamientos mostraron un incremento del nivel intracelular de calcio, ambas características típicas del desarrollo de eriptosis. Sólo en el modelo de estrés oxidativo se observó, además, el incremento de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la disminución de glutation (GSH). La activación de la proteína PI3K parecería ser relevante en la eriptosis inducida por ambos modelos mientras que la activación de la fosfatasa PTP1B estaría favorecida en el modelo de sobrecarga de calcio. Las modificaciones de proteínas de membrana y los cambios en la morfología celular fueron también signos diferenciales entre ambos tratamientos. La Epo fue capaz de disminuir significativamente la inducción de la alteración en el estado redox celular por NaNO2 y H2O2. En cambio, no fue capaz de inhibir la traslocación de PS en el modelo de incremento de calcio. Las diferencias en los mecanismos involucrados en los dos modelos estudiados podrían explicar la acción diferencial de Epo sobre los eritrocitos inducidos a eriptosis por los diferentes agentes. En base a los resultados obtenidos y a otros trabajos realizados previamente en nuestro laboratorio, se decidió, en el siguiente paso, investigar si compuestos de aluminio pueden actuar como factores proeriptóticos. Experiencias in vivo e in vitro permitieron asociar la sobrecarga de aluminio con anemia. En este trabajo, se estudiaron mecanismos de acción del metal, utilizando un modelo de eritrocitos humanos sometidos a tratamiento prolongado in vitro con cloruro de aluminio. La aparición de eritrocitos con morfología anormal sugirió una interacción del metal con la superficie celular, sustentado por el hallazgo de elevada concentración de Al en la membrana celular. Se demostró que el Al induce signos de eriptosis, como externalización de PS, aumento de calcio intracelular y degradación de banda 3. El hallazgo de un incremento significativo de ROS en conjunto con una disminución de la concentración de GSH mostró un estado de estrés oxidativo. Un punto interesante es que la acción prooxidante del aluminio fue contrarrestada por la Epo. El hecho de que este resultado fuera similar a la prevención del desbalance óxido-reducción por la acción del antioxidante N-acetilcisteina (NAC), sugiere un rol antioxidante de la Epo. El efecto antieriptótico de la Epo podría contribuir a enriquecer el conocimiento acerca del rol fisiológico de esta hormona sobre células eritroides. Independientemente de cuál sea su mecanismo antioxidante, el efecto de Epo demostrado en este modelo de exposición a aluminio, así como en el modelo de estrés oxidativo, nos permite sugerir potenciales beneficios del tratamiento con la hormona en pacientes con anemia asociada a patologías con un ambiente redox alterado.

Abstract:
The first part of this study focused on the modulation of factors that would affect the sensitivity of erythroid differentiated cells to proinflammatory citokines, such as TNF-α and IL- 1β. The tumor necrosis factor alpha (TNF-α) affects a wide range of biological activities, such as cell proliferation and apoptosis. Cell life or death responses to this cytokine might depend on cell condition. Therefore, it was interesting to study whether erythroid differentiation may affect erythroid progenitors to apoptosis induced by proinflammatory cytokines. Hemin-differentiated K562 cells showed higher sensitivity to TNF-induced apoptosis than undifferentiated cells. At the same time, hemin-induced erythroid differentiation reduced c- FLIP expression. However, this negative effect was prevented by previous treatment with erythropoietin, which allowed the cell line to maintain c-FLIP levels. The results suggest that erythroid differentiation might deregulate the balance between growth promotion and death signals induced by TNF-α, depending on cell type and environmental conditions. The role of c-FLIP seemed to be critical in the protection of erythroid differentiated cells from apoptosis or in the determination of their sensitivity to TNF-mediated programmed cell death. Epo, which for the first time was found to be involved in the prevention of c-FLIP downregulation, proved to have an antiapoptotic effect against the proinflammatory factor. The identification of signals related to cell life/death switching would have significant implications in the control of proliferative diseases, and would contribute to the understanding of mechanisms underlying the anemia associated to inflammatory processes. Proinflammatory factors may not only affect the erythropoiesis process but also cause direct injury upon mature erythrocytes. Eryptosis is a process by which red blood cells can undergo self-destruction sharing several features with apoptosis. Since premature programmed erythrocyte death may be induced by different agents, in this work mechanisms involved in two eryptotic models (oxidative stress and cell calcium overload) were compared. Phosphatidylserine (PS) translocation and increased calcium content were common signs observed in erythrocytes exposed to sodium nitrite plus hydrogen peroxide or calcium ionophore A23187, while increased reactive oxygen species (ROS) and decreased reduced gluthation (GSH) levels were detected in the oxidative model. Protein kinase activation seemed to be an outstanding feature in eryptosis induced by oxidative stress whereas phosphatase activation was favored in the calcium overload model. Cell morphology and membrane protein alterations were also differential signs between both models. Erythropoietin was able to prevent cell oxidative unbalance, thus blunting PS translocation. However, the hormone favored intracellular calcium influx which could be the reason why it could not completely counteract the induction of eryptosis. Instead, erythropoietin was unable to inhibit PS externalization in the increased calcium model. The different mechanisms involved in the eryptotic models may explain the differential action of erythropoietin upon erythrocytes induced to eryptosis by different agents. Previous works developed in our laboratory suggested that aluminum compounds could be proeryptotic agents. The widespread use of aluminum provides easy exposure of humans to the metal and its accumulation remains a potential problem. In vivo and in vitro assays have associated Al overload with anemia and erythrocyte morphological and biochemical changes. To better understand the mechanisms by which aluminum affects human erythrocytes, these cells were exposed to long-term treatment with the metal using an in vitro model developed in our laboratory that mimic in vivo effects. The appearance of erythrocytes with abnormal shapes suggested metal interaction with cell surface, supported by the fact that high amounts of aluminum were found attached to cell membrane. Long-term incubation of human erythrocytes with Al induced signs of premature erythrocyte death (eryptosis), such as phosphatidylserine externalization, increased intracellular calcium, and band 3 degradation. Signs of oxidative stress, such as significant increase in ROS in parallel with decrease in the amount of GSH, were also observed. Interestingly, Epo protected erythrocytes from the prooxidative action of aluminum. Since this result was similar to that of the antioxidant N-acetylcysteine, it can be suggested an antioxidant ability of Epo. In conclusion, results provide evidence that chronic aluminum exposure may lead to biochemical and morphological alterations similar to those shown in eryptosis induced by oxidant compounds in human erythrocytes. The antieryptotic effect of Epo may contribute to enhance the knowledge of its physiological role on erythroid cells. Irrespective of the mechanism involved in its antioxidant action, this property of Epo shown in this model of aluminum exposure, let us suggest additional benefits of the Epo treatment in patients with anemia associated to altered redox environment.

Balboa, Luciana. "Alteraciones de las células presentadoras de antígenos en pacientes con tuberculosis pulmonar" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La tuberculosis (TB) es considerada la segunda causa de muerte por infección, causando 1.7 millones de muertes al año. Se estima que un tercio de la población mundial está actualmente infectada con Mycobacterium tuberculosis (Mtb) y que sólo entre el 5‐10% de aquellos infectados desarrollarán la enfermedad, siendo desconocidos los mecanismos que conducen al establecimiento de la enfermedad tuberculosa latente o activa. El éxito de la infección depende principalmente de las estrategias de evasión de la respuesta inmune y de la capacidad de las células presentadoras de antígeno (CPA) de iniciar una eficiente respuesta. En este sentido, las células dendríticas (CD) son críticas para el desarrollo de la respuesta inmune antibacteriana y, por lo tanto, constituyen un blanco fundamental en la inmuno‐evasión inducida por Mtb. Nuestra hipótesis de trabajo es que durante la infección con Mtb se inducirían alteraciones en las CPA determinando la eficiencia de la respuesta inmune así como el curso de la infección; teniendo en cuenta esto, nuestro objetivo fue investigar las alteraciones en la generación de las CPA y su impacto en el desarrollo de la respuesta inmune en pacientes con TB. Para ello, caracterizamos el efecto de la bacteria sobre la diferenciación de monocitos (Mo) en controles sanos, observando que Mtb altera la diferenciación hacia CD a través de la secreción de IL‐10 y la activación de TLR‐2. Las células obtenidas presentaron baja expresión de receptores de entraba para la bacteria, baja capacidad de presentación de antígenos micobacterianos en el contexto de moléculas CD1 y mayor proliferación de clones T específicos de perfil TH2. Por otro lado, caracterizamos el fenotipo y la función de las CD obtenidas a partir de los Mo de pacientes con TB, las cuales presentaron alteraciones en la expresión de los marcadores típicos de CD así como una baja capacidad de presentación de antígenos micobacterianos. Finalmente, los Mo de los pacientes con TB mostraron un alto grado de activación y un enriquecimiento en la población de Mo CD16+, la cual fue previamente descripta como proinflamatoria. Esta población resultó ser menos eficiente para diferenciarse hacia CD y ha sido asociada a la severidad radiológica de la TB y a los niveles plasmáticos de TNF‐α, poniendo de manifiesto la relevancia clínica del hallazgo. En conclusión, en este trabajo de Tesis describimos un nuevo paso en la regulación de la respuesta inmune contra Mtb a través de la modulación de la capacidad de diferenciación de los Mo. Nuestros resultados amplian el conocimiento de los mecanismos involucrados en la evasión de la respuesta inmune ejercida por Mtb y, de ese modo, podrían contribuir al desarrollo de nuevos tratamientos y vacunas en esta enfermedad re‐emergente tanto a nivel local como mundial.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is the second most common cause of death from infectious diseases in the world and it causes an estimated 1.7 million deaths worldwide. Overall, one‐third of the world's population is currently infected with the TB bacillus (Mycobacterium tuberculosis) and 5‐10% of those infected individuals may develop TB disease. The exact mechanism leading to latent or acute TB disease is unknown, but it mainly depends on immune evasion strategies displayed by M. tuberculosis and the efficiency of the immune response initiated by antigen presenting cells (APC). As dendritic cells (DC) are critical for initiating a M. tuberculosis‐specific T‐cell response, they may represent a crucial target of M. tuberculosis immune evasion. Our hypothesis is that M. tuberculosis infection could induce alterations in APC, determining the outcome of the infection. Therefore, our aim was to evaluate the impact of M. tuberculosis infection on the generation of APC and on the host immune response. Thus, we characterized the effect of M. tuberculosis in the differentiation of monocytes (Mo) from healthy donors into DC. We determined that M. tuberculosis alters Mo differentiation through IL‐10 release and TLR‐2 activation, promoting the generation of cells with a low expression of M. tuberculosis pattern recognition receptors, a reduced specific CD1‐restricted lymphocytes proliferation, and a preferential polarization towards a TH2 pattern. In this line, the phenotype and function of DC from Mo in TB patients also showed alterations in DC loyal markers and a reduced antigenpresenting capacity. Finally, we found that circulating Mo from TB patients presented an activated phenotype with an enrichment of the proimmflamatory CD16+ subset, being this subset less prone to differentiate into DC. Moreover, the percentages of CD16+ Mo correlated with disease severity and with TNF‐α plasma levels, highlighting the clinical relevance of this finding. In conclusion, we have described a new step in the regulation of the immune response to M. tuberculosis through modulation of Mo differentiation. Our results may contribute to a better understanding of the immune evasion strategies of M. tuberculosis, therefore facilitating the development of effective therapeutic and prophylactic approaches for controlling M. tuberculosis infection.

Diez, Berenice Andrea. "Estudios sobre la terapia fotodinámica a partir de ALA en células leucémicas sensibles y resistentes a drogas de quimioterapia" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Terapia Fotodinámica (TFD) es utilizada para el tratamiento del cáncer y otras patologías no malignas. Se basa en la administración un compuesto fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido maligno y al recibir fotones interactúa con el O2 produciendo especies reactivas del oxígeno (ROS), que son altamente tóxicas y desencadenan la muerte celular. La administración exógena del ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de los tetrapirroles, induce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), un FS muy eficiente. La quimioterapia administrada en altas dosis, seguida del transplante autólogo de médula ósea es una de las modalidades terapéuticas más utilizadas para el tratamiento de la leucemia. Sin embargo, una pequeña proporción de células leucémicas indiferenciadas que se encuentran en un estado quiescente, pueden resultar resistentes a la quimioterapia y ser reinsertadas en el paciente luego del transplante. Por este motivo actualmente se estudian métodos de purgado potencialmente efectivos para eliminar a las células malignas remanentes. Además, el uso de quimioterapia presenta otras limitaciones como el desarrollo de fenotipos celulares resistentes a drogas y efectos secundarios no deseados. En esta tesis hemos estudiado los efectos de la TFD basada en ALA (TFD-ALA) en tres líneas celulares leucémicas murinas, LBR-, sensible a drogas de quimioterapia, LBR-D160 y LBR-V160, resistentes a doxorubicina (DOX) y vincristina (DOX), respectivamente. Para ello evaluamos la síntesis y acumulación de PpIX sintetizada a partir de ALA, y observamos que en las tres líneas estudiadas esta síntesis aumentó en función de la concentración y del tiempo de incubación con ALA. Estudios de microscopía confocal indicaron que las mitocondrias son el principal sitio de localización de PpIX. Mediante estudios de viabilidad celular demostramos la eficacia de la TFD-ALA en las tres líneas celulares, indicando la falta de resistencia cruzada en el caso de las líneas resistentes a drogas de quimioterapia. Por otra parte estudiamos los mecanismos involucrados en la muerte celular producida por la TFD, donde observamos un aumento en los parámetros de estrés oxidativo como la despolarización de la membrana mitocondrial, la producción de oxígeno singulete y de anión superóxido, indicando la importancia de las mitocondrias en los efectos de la TFD. El análisis de parámetros tanto morfológicos como bioquímicos demostró la predominancia de apoptosis como principal mecanismo de muerte, en particular a través de la vía intrínseca, lo que concuerda con el rol activo de las mitocondrias previamente mencionado. Evaluamos además los efectos al combinar la TFD-ALA con los agentes antineoplásicos DOX y VCR, en un modelo in vitro in vivo, utilizando la línea LBR-. En ambos casos observamos un beneficio significativo al utilizar las terapias combinadas, evidenciando la ventaja de esta modalidad frente a las terapias utilizadas en forma independiente. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran el beneficio potencial de utilizar la TFD-ALA como método de purgado de la médula ósea de pacientes con leucemia, especialmente para eliminar fenotipos resistentes a drogas. Además, los estudios utilizando las terapias combinadas indican la posibilidad de disminuir las dosis de drogas de quimioterapia, minimizando así las limitaciones ocasionadas por este tratamiento.

Abstract:
Photodynamic therapy (PDT) is a cancer treatment modality which involves the administration of a given photosensitizing agent (PS), its preferential accumulation in malignant tissue and the subsequent activation by light of appropriate wavelength. Interaction between the excited PS and molecular oxygen produces singlet oxygen as well as other reactive oxygen species (ROS) selectively destroying the target cells. Exogenous administration of 5-aminolevulinic acid (ALA) induces the accumulation of protoporphyrin IX (PpIX), a highly photosensitive compound. Autologous bone marrow transplantation (ABMT) after high dose chemotherapy is a widely accepted therapeutic modality for the management of hematologic malignancies. The major disadvantage of this approach is the possible contamination of the autograft with remaining leukemic cells which leads to recurrence of the disease. Besides, the use of chemotherapy agents promotes the development of drug resistant phenotypes and produces serious side adverse effects in many patients. In this work we studied the effects of ALA-based PDT (ALA-PDT) in three leukemic murine cell lines: LBR-, drug sensitive, LBR-D160 resistant to doxorubicin (DOX) and LBR-V160, resistant to vincristine (VCR). The synthesis and accumulation of PpIX after ALA administration was evaluated, which increased with the concentration and incubation time with ALA. Confocal microscopy studies revealed that PpIX was mainly localized in mitochondria. Cell viability studies demonstrated that ALA-PDT was effective in the three cell lines, indicating the lack of cross-resistance in LBR-D160 and LBR-V160 cells. The mechanisms involved in the death caused by ALA-PDT were also studied. It was observed an increase in oxidative stress parameters, such as mitochondrial membrane depolarization, singlet oxygen and superoxide anion production. Morphological and biochemical studies showed that apoptosis, especially involving intrinsic pathway, was the main death mechanism induced by ALA-PDT. We also evaluated on the LBR- cell line the effects of ALA-PDT combined with DOX or VCR using an in vitro-in vivo model, and a significant benefit for combination therapies, with respect to each one independently, was found. The results obtained in this work show that ALA-PDT could be useful as a purging method during ABMT in leukemia patients, especially to eliminate drug resistant cells. Besides, the use of combined therapies allows the possibility of reducing the doses of chemotherapeutic agents, thus minimizing the limitations of this therapy.

Heer, Angeles. "Análisis estructural y conformacional de E6*I, un producto de procesamiento alternativo derivado de la oncoproteína E6 de HPV16" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas E6 de papilomavirus humano de alto riesgo participan en la progresión tumoral, mayoritariamente por su habilidad de promover la degradación de p53. Los transcriptos de HPV muestran un patrón de procesamiento complejo, donde E6*I es el transcripto más abundante en HPV de alto riesgo, correspondiendo en secuencia de aminoácidos a los primeros 50 aminoácidos de E6. Actualmente, no hay información estructural o bioquímica de este polipéptido que contiene la mitad del primer motivo de unión a Zn de E6, debido a la dificultad de obtener una estructura compacta y monomérica en tan pequeño polipéptido. En este trabajo se muestra que E6*I de HPV16 puede plegarse en oligómeros con alto contenido de hélice-α o láminas-β a pH 7.5 y 5.0 respectivamente, en ausencia de Zn. Los oligómeros-β son altamente estables y no se ven afectados por la presencia de Zn, mientras que los oligómeros-α tienden rápidamente a agregar, evitando esto la presencia de Zn. Dos moléculas de E6*I unen una molécula de Zn, sugiriendo una coordinación tetraédrica de alta afinidad (KD < 10⁻¹² M), que resulta en un dímero de E6*I mediado por Zn con significativa estructura secundaria. Previamente se encontraron en el citosol de líneas celulares transformadas por HPV oligómeros endógenos de E6, y nosotros proponemos que las características determinantes de esta agregación se encuentran dentro de E6*I. Los efectos reportados de E6*I están asociados a la regulación negativa de la proteína E6, y la relación entre ambas especies modula la degradación de p53 y otras cascadas de señalización de apoptosis. En este trabajo, demostramos la interacción directa y específica entre las proteínas E6 y E6*I de HPV16. La abundancia en la célula de E6*I con una naturaleza “camaleón” correlaciona con la plasticidad para unir blancos celulares, y su destino está asociado a un balance entre los niveles de proteína, la disponibilidad de Zn, el potencial redox y la oligomerización. Este pequeño pero complejo polipéptido está asociado a un efecto más que a una función de un producto viral que, cuando se encuentra en altas concentraciones, puede directa o indirectamente afectar varios procesos celulares.

Abstract:
High-risk human papillomavirus E6 participates in tumorigenic progression, mainly by its ability to promote p53 degradation. HPV transcripts show a complex splicing pattern, where E6*I is the most abundant transcript in high-risk HPV types, comprising the first 50 amino acids of E6. No structural or biochemical information of this polypeptide, which contains half of the first zinc binding motif of E6, is available, due to the difficulty to acquire a compact monomeric fold in such a small polypeptide. We show that HPV16-E6*I can fold into either a-helix or ß-sheet large oligomers at pH 7.5 and 5.0, respectively, in the absence of zinc. The ß-sheet oligomers are highly stable and unaffected by the presence of zinc, while the a-helix oligomers tend to rapidly form aggregates, prevented by the presence of the metal. Two E6*I molecules bind per atom of zinc, suggesting a tetrahedral, high affinity arrangement (KD< 10⁻¹² M), which results in a zinc mediated E6* dimer with significant secondary structure. Endogenous E6 oligomers were previously found in the cytosol of high-risk HPV transformed cell lines, and we propose that the oligomerization determinant resides within E6*I. E6*I effects were reported to counteract those of E6 in cells, and the ratio between these two species modulates p53 degradation and other apoptosis dependent signaling cascades. In the present work, we show a direct and specific interaction between HPV16 E6 and E6*I. A residue of an evolved splicing event related to regulation of oncogene expression in HPV or a splicing event resulting from the selection of a small deleterious viral polypeptide, the abundant existence of E6*I with a “chameleon” nature correlates with target plasticity, and its fate is linked to a balance between protein levels, zinc availability, redox potential, and oligomerization. In addition, the results presented here have strong implications for zinc binding sites in nascent polypeptides. This evolved promiscuous folder speaks of effect rather than function of a viral product that, when highly increased, can directly or indirectly affect various cellular processes leading to cell deregulation and tumorigenesis.

Hovsepian, Eugenia. "Estudio de los efectos antiinflamatorios de 15-deoxi-delta 12,14-prostaglandina J2 e IL-10 en miocardiocitos infectados con Trypanosoma cruzi. Mecanismos moleculares involucrados" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la fase aguda de la enfermedad de Chagas, la infección por T. cruzi produce una intensa respuesta inflamatoria en diversos tejidos del organismo incluso en el corazón, donde los miocardiocitos constituyen un importante blanco. Si bien la reacción inflamatoria es importante para el control inicial de la infección, un desequilibrio o una mala resolución de la misma puede generar daños y alteraciones en la funcionalidad cardíaca. Las células cardíacas responden a la infección mediante la expresión de enzimas inflamatorias como óxido nítrico sintasa 2 (NOS2) y metaloproteasas (MMPs) y citoquinas como TNF-α e IL-6. Esta respuesta está mediada por la activación de vías de señalización que incluyen al factor de transcripción nuclear-ĸB (NF-ĸB) y a las quinasas reguladas por señales extracelulares-proteínas quinasas activadas por mitógenos (ERK1/2-MAPK), cuya participación es fundamental en procesos inflamatorios. Los receptores activados por factores de proliferación peroxisomal γ (PPARγ) son factores de transcripción dependientes de ligando que han sido implicados en la regulación del metabolismo lipídico y de procesos inflamatorios. En este trabajo evaluamos el aporte de 15-deoxi-Δ12,14-prostaglandina J2 (15dPGJ2), ligando natural de PPARγ y de la citoquina antiinflamatoria IL-10 en la resolución de la respuesta inflamatoria en cultivos primarios de miocardiocitos neonatales de ratón infectados con la cepa letal pantrópica/reticulotrópica (RA) de T. cruzi. Los resultados de esta evaluación evidencian que 15dPGJ2 es capaz de inhibir la expresión y actividad de diferentes enzimas inflamatorias como NOS2, MMP-9 y MMP-2, así como la expresión de las citoquinas proinflamatorias TNF-α e IL-6 inducidas por la infección. Los efectos inhibitorios ejercidos por 15dPGJ2 involucran participación de mecanismos dependientes e independientes de PPARγ. La contribución de su receptor en los efectos ejercidos por 15dPGJ2 fue confirmada al silenciar la expresión mediante ARN de interferencia (siARN-PPARγ). Por otro lado, a partir de la utilización de inhibidores específicos de ERK1/2 y de NF-ĸB, demostramos que 15dPGJ2 también ejerce sus efectos de manera independiente a PPARγ, a través de estas vías. IL-10 es una de las principales citoquinas antiinflamatorias y fue identificada originalmente como un factor inhibidor de la síntesis de citoquinas proinflamatorias y modulador de ciertas funciones asociadas a la activación de macrófagos y/o monocitos. En este trabajo se describe que la adición de IL-10 exógena inhibe la activación de las vías de señalización de ERK1/2 y de NF-ĸB y reduce los niveles de expresión y actividad de NOS2, MMP-9 y MMP-2, así como la expresión de TNF-α e IL-6 inducidas por la infección. La señalización por IL-10 a través de su receptor promueve fosforilación de STAT3, el cual actúa como factor de transcripción induciendo la expresión de proteínas supresoras de la señalización por citoquinas-3 (SOCS-3). Tanto la infección con T. cruzi como IL-10 inducen fosforilación de STAT3 y la expresión del ARNm de SOCS-3. El silenciamiento de la expresión de esta proteína mediante ARN de interferencia (siARNSOCS- 3) pone en evidencia la participación de la vía STAT3/SOCS-3 en los efectos ejercidos por IL-10. El conocimiento más profundo sobre el papel de ligandos de PPARγ y de IL-10 podría ser de gran utilidad para formular estrategias alternativas o coadyuvantes de la terapéutica clásica en la infección por T. cruzi.

Abstract:
In the acute phase of Chagas disease, T. cruzi infection produces an intense inflammatory response in different tissues including the heart where cardiomyocytes are an important target. Although the inflammatory reaction is important for the initial control of the infection, an imbalance or poor resolution can generate damage and impaired cardiac function. Cardiac cells respond to infection by the expression of inflammatory enzymes like nitric oxide synthase 2 (NOS2) and metalloproteases (MMPs) and cytokines such as TNF- α and IL-6. This response is mediated by the activation of nuclear factor-кB (NF-кB) and extracellular signal-regulated kinases-mitogen-activated protein kinase (ERK1/2-MAPK) pathways, whose participation is essential in inflammatory processes. Peroxisome proliferator-activated receptors γ (PPARγ) are ligand-dependent transcription factors that have been implicated in the regulation of lipid metabolism and inflammatory processes. In this study we evaluated the contribution of 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2 (15dPGJ2), natural PPARγ ligand, and the antiinflamatory cytokine IL-10 in primary cultures of neonatal mouse cardiomyocytes infected with the lethal pantropic/reticulotropic T. cruzi strain (RA). The obtained results show that 15dPGJ2 is able to inhibit the expression and activity of different inflammatory enzymes such as NOS2, MMP-9 and MMP-2 as well as the proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 induced by T. cruzi infection. 15dPGJ2 antiinflammatory effects involve participation of PPARγ-dependent and - independent mechanisms. PPARγ contribution in 15dPGJ2 effects was confirmed by silencing PPARγ expression with small interfering RNA (PPARγ-siRNA). On the other hand, the use of specific ERK1/2 and NF-кB pharmacological inhibitors demonstrated that 15dPGJ2 can also exert its effects through these pathways. IL-10 is one of the most important antiinflammatory cytokines and has been originally identified as a cytokine synthesis inhibitor factor and modulator of certain functions associated with macrophages and/or monocytes activation. This work describes that exogenous addition of IL-10 inhibits ERK1/2 and NF-кB activation and reduces NOS2, MMP-9 and MMP-2 expression and activities as well as TNF-α and IL-6 expression after T. cruzi infection. IL-10 signaling through its receptor promotes STAT3 phosphorylation, which acts as a transcription factor inducing the expression of suppressor of cytokine signaling-3 (SOCS- 3). Both T. cruzi infection and IL-10 treatment promote STAT3 phosphorylation and SOCS- 3 mRNA expression. SOCS-3 silencing with small interfering RNA (SOCS-3-siRNA) reveals STAT3/SOCS-3 signaling participation in IL-10 effects. A better understanding of the role exerted by PPARγ ligands and IL-10 could be useful in finding new or alternative strategies which could replace the classic parasiticidal therapeutic in T. cruzi infection.

Pontillo, Carolina Andrea. "Acción del hexaclorobenceno en la migración, invasión y metástasis en modelos experimentales de cáncer de mama" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Hexaclorobenceno (HCB) es un pesticida organoclorado considerado como probable carcinógeno humano. A nivel regional, este contaminante fue encontrado en leche materna de puérperas y en muestras de leche vacuna para consumo humano. Es un tóxico tipo dioxina, y como tal se une al receptor de hidrocarburos aromáticos (RHA), un factor de transcripción que modula procesos tales como apoptosis, proliferación y migración celular. El RHA está presente en el citosol e interacciona con el complejo que contiene a la quinasa de tirosina c-Src. Cuando estos tóxicos se unen al RHA, se pueden desencadenar dos mecanismos: 1) que el complejo tóxico-RHA se transloque al núcleo y module la expresión de genes con elementos de respuesta a dioxinas (DREs) en sus promotores y 2) que se libere la c-Src del complejo citosólico y active receptores de factores de crecimiento, como el Receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (HER1). Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron que el HCB aumenta el desarrollo y malignidad de tumores mamarios inducidos por N-Nitroso-N-metilurea en rata. En este mismo modelo se observó que el HCB activa la vía de señalización de c-Src/HER1 y disminuye la actividad del receptor de estrógenos (REα) en los tumores mamarios. Por otro lado, en estudios in vitro se demostró que el tóxico incrementa la proliferación y la actividad de c-Src en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 (+REα). La tumorigénesis ocurre frecuentemente como resultado de la sobreexpresión de proteínas como el HER1 y la c-Src, que están involucradas en procesos celulares normales. Estas proteínas están usualmente sobreexpresadas en cáncer de mama en estadíos tardíos, y cooperan en la formación y progresión tumoral al favorecer procesos como la proliferación, migración e invasión celular, actividad de metaloproteasas y metástasis. Los objetivos de este trabajo fueron investigar en ensayos in vitro, utilizando una línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (-REα) los efectos del tóxico en: a) la migración e invasión celular, b) la actividad y expresión de c-Src y HER1, c) la estimulación de las vías de señalización de ERK1/2, Akt2 y STAT5b, d) la actividad y expresión de metaloproteasas 2 y 9 (MMP2 y 9), y e) si los efectos observados dependen de las vías de señalización en estudio y de la unión del pesticida al RHA. Por otro lado, nos propusimos estudiar en ensayos in vivo, la acción del HCB sobre el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos espontáneos y experimentales. Nuestros resultados muestran que el HCB estimula las vías de transducción de señales de c- Src/HER1/STAT5b y HER1/ERK1/2, la migración e invasión celular, la expresión de MMP2 y 9, así como la secreción y actividad de MMP9 en la línea celular MDA-MB-231, in vitro. Observamos que la migración e invasión celular inducida por el tóxico están mediadas por c-Src, HER1 y el RHA. A su vez, la secreción y actividad de la MMP9 estimulada por el HCB depende de HER1 y del RHA, mientras que el aumento en la expresión de MMP2 depende tanto de c-Src, HER1 como del RHA. Asimismo, en un modelo de xenotrasplante con la línea celular MDA-MB-231 en ratones atímicos, demostramos que el pesticida estimula el crecimiento tumoral (0.3 y 3 mg/kg p.c.), mientras que induce la activación de c-Src, HER1, ERK1/2 y STAT5b e incrementa los niveles proteicos de MMP2 y 9 en los tumores mamarios en todas las dosis ensayadas. Por otro lado, en estudios de metástasis espontánea con tumores C4-HI en ratones BALB-c, encontramos que el HCB (0.3 y 3 mg/kg p.c.) aumenta el crecimiento de los tumores mamarios y el número de micrometástasis en hígado y pulmón. En los estudios de metástasis experimental con la línea celular LM3 en ratones BALB-c, el pesticida (3 mg/kg p.c.) incrementa el tamaño de las metástasis en pulmón. En conclusión, en el presente trabajo demostramos por primera vez, que el HCB promueve la migración e invasión celular por las vías de c-Src/HER1/STAT5b y HER1/ERK1/2, así como la expresión de MMP2 y MMP9 de manera dependiente del RHA. A su vez, observamos que el tóxico estimula el crecimiento tumoral y metástasis en pulmón e hígado en modelos experimentales de cáncer de mama.

Abstract:
Hexachlorobenzene (HCB) is an organochlorine pesticide considered as a probable human carcinogen. This pollutant was found in puerperal mother milk and in samples of bovine milk for human consumption, at regional level. It is a dioxin-like compound and a weak ligand of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) protein, which is a transcription factor that modulates processes as apoptosis, proliferation and cell migration. AhR interacts with cytosolic complex containing c-Src kinase. Upon dioxin binding, two mechanisms can be triggered: 1) the AhR-toxic complex translocates to the nucleus and modulates gene expression with dioxin-responsive elements (DREs) and 2) c-Src kinase frees from its complex and activates growth factors receptors like Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR/HER1). In previous studies of our laboratory, we found that HCB has a co-carcinogenic effect in N-Nitroso N-methyl urea–induced mammary tumors in rats, enhancing their development and malignancy. We have also demonstrated that HCB activates c-Src/HER1 signaling pathway and decreases estrogen receptor α (ERα) activity of mammary tumors, in the same model. In previous in vitro studies, we observed that HCB induces cell proliferation and c-Src activity in ERα (+) MCF-7 breast cancer cell line. Tumorigenesis frequently occurs as a result of the overexpression of proteins that are otherwise involved in normal cell processes, as HER1 family and c-Src tyrosine kinase. These proteins are overexpressed in a high percentage of certain late-stage human breast cancers, and they cooperate in tumor formation and progression, promoting processes like cell proliferation, migration and invasion, metalloprotease activities and metastasis. The aim of our study was to investigate the effects of HCB on: a) cell migration and invasion, b) c-Src and HER1 expression and activities, c) ERK1/2, Akt2 and STAT5b signaling pathways activation, d) MMP2 and MMP9 expression and activities, and e) AhR and c-Src/HER1 signaling pathways roles in ERα (-) MDA-MB-231 breast cancer cell line, in vitro. On the other hand, we studied the action of HCB on tumour growth and metastasis in spontaneous and experimental models, in vivo. Our results demonstrate that HCB stimulates c-Src/HER1/STAT5b and HER1/ERK1/2 signaling pathways, cell migration and invasion, MMP2 and 9 expression, as well as MMP9 secretion and activity in MDA-MB-231, in vitro. We observed that c-Src, HER1, and AhR are involved in cell migration and invasion increased by HCB. Moreover, HCB-induced MMP2 expression depends on c-Src, HER1 and AhR; whereas only HER1 and AhR are involved in HCB-induced MMP9 secretion and activity. When MDA-MB-231 were xenotrasplanted in athymic mice, we observed that HCB estimulates tumoral growth (0.3 and 3 mg/kg b.w.), whereas the pesticide also increases c-Src, HER1, ERK1/2 and STAT5b activities, as well as MMP2 and 9 protein levels in mammary tumors at all assayed doses. On the other hand, we found that HCB (0.3 and 3 mg/kg b.w.) enhaces mammary tumor growth, as well as lung and liver micrometastasis levels in spontaneous metastasis models with C4-HI tumors in BALB-c mice. Furthermore, we observed that the pesticide (3 mg/kg b.w.) enhances the lung metastasis size, in experimental metastasis assay with LM3 cell line in BALB-c mice. In conclusion, in the present study we demonstrate for the first time, that HCB promotes cell migration and invasion through c-Src/HER1/STAT5b and HER1/ERK1/2 signaling pathways activation, as well as MMP2 and MMP9 expression in an AhR dependent manner. Moreover, we observe that the pesticide estimulates tumor growth and lung and liver metastasis in breast cancer experimental models.

Lorenzetti, Mario Alejandro. "Caracterización de variantes del virus de Epstein Barr en la infección aguda en pacientes pediátricos y su comparación con linfomas pediátricos EBV +" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de Epstein Barr (EBV) posee dos ciclos de infección, lítica y latente, en linfocitos B, el segundo está asociado a procesos neoplásicos. Se han descripto polimorfismos en los genes BZLF1, BKRF1 (EBNA1) y BNLF1 (LMP1), algunos asociados a linfomas EBV+, a los compartimentos del hospedador o al origen geográfico del virus. Con el objetivo de identificar polimorfismos en estas regiones génicas y su dinámica de distribución en el tiempo y entre los compartimentos del hospedador, se estudió una serie de 35 pacientes pediátricos, 15 con mononucleosis infecciosa (MNI) y 20 con linfoma EBV+, todos de nuestra región geográfica. Mediante amplificación por PCR y posterior secuenciación, se caracterizaron las variantes virales de dichos genes en distintos compartimentos de pacientes i) con MNI al momento del diagnóstico (D0), al mes (D30) y a los tres meses (D90) durante la convalecencia y ii) en muestras de biopsias ganglionares de linfomas EBV+. Se identificaron variantes de BZLF1 estadísticamente asociadas a tumores EBV+, variantes de EBNA1 de circulación exclusiva en nuestra región geográfica y variantes de LMP1 preferentemente asociadas a patologías EBV+, tanto malignas como benignas.

Abstract:
Epstein Barr virus (EBV) displays two infective cycles, lytic cycle and latency within B cells, and it is the latter which is associated with neoplasic processes. Polymorphisms within BZLF1, BKRF1 (EBNA1) and BNLF1 (LMP1) genes were described, and some seemed to associate with malignancy, distribution between compartments or the geographical origin of the virus. With the aim to characterize polymorphisms within these genetic regions and their distribution over time and/or anatomical compartments, we studied a series of 35 pediatric patients from our geographic region: 15 with infectious mononucleosis (IM) and 20 with EBV-related lymphomas. Viral variants from these genes were characterized after direct sequencing of PCR products obtained from different anatomical compartments from patients with IM at diagnosis (D0), at a month time (D30) and after three months (D90), during the convalescence and also from EBV+ tumor biopsies. We identified BZLF1 variants statistically associated with EBV-related lymphomas, EBNA1 variants exclusively circulating in our region and LMP1 variants preferentially occurring in EBV-related pathologies, both malignant and benign.

Musikant, Alejandro Daniel. "La trans-sialidasa como factor de virulencia en la infección experimental con Trypanosoma cruzi" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo nos propusimos comprender los mecanismos asociados a la patología inducida por Trypanosoma cruzi en el modelo murino empleando cepas de baja y de alta virulencia. Estas últimas generan altos porcentajes de mortalidad en pocos días y expresan grandes cantidades de un factor de virulencia, la trans-sialidasa (TS) que induce, en la etapa temprana de la infección, apoptosis y desorganización de la histoarquitectura de órganos como el bazo, ganglio y timo. En esta Tesis Doctoral nos propusimos analizar las poblaciones celulares involucradas en las alteraciones producidas por la actividad de TS utilizando dos estrategias: - mediante la neutralización de la actividad circulante de TS durante la infección aguda observamos que el tratamiento no fue capaz de prevenir los desórdenes en las poblaciones linfocitarias maduras e inmaduras. El análisis de marcadores de migración linfocitaria permitió describir por primera vez que el parásito altera el tráfico de los linfocitos B en el bazo. - mediante un modelo de estimulación de la respuesta inmune con un antígeno definido observamos que el tratamiento con TS recombinante activa no fue suficiente para alterar el armado de los centros germinales. En la segunda etapa de este trabajo, analizamos la capacidad de T. cruzi de modular la expresión de las metaloproteasas (MMPs) del huésped. Observamos en la fase aguda de la infección, que las cepas/clones de alta virulencia inducen aumento de la actividad de MMP-2 y disminución de la actividad de MMP-9 plasmática, mientras que las de baja virulencia solo inducen disminución de MMP-9. El timo, ganglio e hígado de animales infectados con cepas/clones de alta virulencia poseen alterada la actividad de estas dos MMPs y observamos el mismo fenómeno en una línea celular de fibroblastos humanos. Utilizando ensayos in vivo e in vitro demostramos que la actividad de TS está relacionada con el aumento de la actividad de MMP-2. En este último sistema determinamos que el efecto es por hidrólisis de ácido siálico y pudimos reproducirlo utilizando neuraminidasas de origen bacteriano. Por último describimos vías de transducción de señal asociadas al aumento de la actividad de MMP-2 por la acción de TS y las neuraminidasas ensayadas. Nuestros hallazgos constituyen un aporte novedoso acerca del comportamiento de las MMPs en la infección murina por T. cruzi y su modulación diferencial dependiente de la virulencia. Es destacable que la modulación de MMP-2 está asociada a la actividad de TS que es altamente expresada en las mismas cepas que son inductoras de MMP-2 en la infección experimental.

Abstract:
In this work we have studied mechanisms associated with Trypanosoma cruzi pathology in a murine model employing different virulences strains. High-virulence parasites induce an increase mortality rate in a few days and also express high amount of trans-sialidasa (TS), a virulence factor that induces apoptosis and histological disorganization of organs such as spleen, thymus and lymph. In this thesis we analyze the cell populations involved in the alterations produced by the activity of TS using two strategies: - by neutralizing the activity of circulating TS during the acute phase of infection we observed that this treatment was not able to prevent disturbances in the mature and immature lymphocyte populations. The analysis of lymphocyte migration markers allow us to describe for the first time that the parasite alters B lymphocytes traffic in the spleen. - by using a immune response stimulation model with a specific antigen we showed that active recombinant TS treatment was not able to alter the assembly of the germinal centers. In the second stage of this work, we analyze if T.cruzi was able to modulate host matrix metalloproteinases (MMPs) expression. We showed that during the acute phase of infection high-virulence parasites (with detectable TS activity) induce an increase MMP-2 and diminished MMP-9 plasmatic activity and low-virulence parasites only induce reduction of MMP-9 plasmatic activity. Organs such as thymus, lymph and liver of infected animals with high-virulence parasites have an altered activity of both MMPs and the same results were observed in a human trofobroblast cell line. Using both in vivo and in vitro experiments we showed that TS activity is related with the increase of MMP-2 activity. We determined in vitro that the mechanism of the increase of MMP-2 is the hydrolysis of sialic acid and this was confirmed by using bacteria neuraminidases. Finally, we described signaling transduction pathways related to the increase of MMP-2 activity induced by TS and neuraminidases. Our findings constitute a novel contribution regarding MMPs behavior in murine infection by T. cruzi and differential modulation by different strains. Besides, modulation of MMP-2 activity is associated with TS, a virulence factor that is highly expressed in those strains that induce MMP-2 in the experimental infection.

Campodónico, Paola Bernadette. "Regulación de la diseminación de los tumores sólidos murinos por el sistema del ácido retinoico y sus receptores" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el rol del sistema retinoide en la progresión del tumor mamario murino LM38-LP, haciendo énfasis en las interacciones celulares entre su componente luminal (LEP) y mioepitelial (MEP). Determinamos que la línea LM38-LP expresa receptores retinoides y que los mismos son funcionales. El tratamiento con retinoides induce en la línea un arresto del ciclo celular. El mismo tratamiento induce apoptosis sólo en el compartimiento LEP y senescencia en las células MEP, mientras que una pequeña población celular que mediaría la interacción entre ambos componentes continúa ciclando. Asimismo se ha podido determinar la existencia de una población con características de células stem/progenitoras parcialmente resistentes al tratamiento con retinoides. Hemos estudiado además mecanismos implicados en la diseminación metastásica de la línea LM38-LP. En este sentido hemos observado que los retinoides inhiben tanto la actividad de proteasas secretadas como la capacidad migratoria, mientras que aumentan la capacidad adhesiva a componentes de la matriz extracelular. Los retinoides inhiben la invasión sólo en la población MEP de la línea LM38-LP. Se analizó la transcripción de un panel de genes implicados en el proceso de transición epitelio-mesenquimática. Se pudo determinar que el ácido retinoico modula estos genes diferencialmente entre los compartimientos LEP y MEP conduciendo a la línea hacia un fenotipo menos agresivo. Se generaron sublíneas que presentan silenciados o sobreexpresados los distintos receptores retinoideos, lo que permitió evaluar la participación de cada uno de ellos en la progresión tumoral maligna de la línea en estudio. Este trabajo sugiere que los retinoides ejercen efectos pro-apoptóticos y citostáticos diferenciales en los diferentes compartimentos celulares de la línea LM38-LP. Asimismo los resultados sugieren la existencia de una tercera población con capacidad clonogénica y resistente a los retinoides.

Abstract:
The objective of the present work is to study the role of retinoid system in the murine mammary tumor LM38-LP progression, emphasizing luminal and myoepithelial cellular interactions. We determined that LM38-LP cell line expresses retinoic acid receptors and that these are functional. Retinoid treatment induces cell cycle arrest in the cell line. Same treatment induces apoptosis only in LEP compartment, senescence in MEP cells, while a small cellular population that mediates interaction between LEP and MEP compartment remains cycling. We determined the presence of a small cell population with characteristics of stem/progenitor cells, partially resistant to retinoid treatment. Besides, we studied some mechanism involved in metastatic dissemination in LM38-LP cell line. In this way, we observed that retinoids inhibit both secreted protease activity and migratory capacity, while increase adhesion capacity to some components of extracellular matrix. Retinoids inhibit invasion only in LM38-LP cell line MEP population. A set of genes implicated in epithelial-mesechymal transition were analyzed employing a qPCR array. We could determine that retinoic acid modulated these genes in a differential way in LEP and MEP compartments, leading to a less aggressive phenotype. By using sub lines generated either silencing or over expressing different retinoic acid receptors, we analyzed the role of the different receptors in the metastatic progression of LM38-LP cells. This work suggests that retinoids exert differential pro apoptotic and citostatic functions on the different cell components of the mammary tumor cell line LM38-LP. Likewise, these results suggest the existence of a third cell population with clonogenic capacity and resistant to retinoids.

Recouvreux, María Victoria. "Caracterización del sistema TGF-ß1 hipofisario: en búsqueda de un blanco terapéutico para prolactinomas resistentes a agonistas dopaminérgicos" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los prolactinomas son tumores benignos que en general responden bien al tratamiento con agentes dopaminérgicos. Sin embargo alrededor del 15% de estos tumores son resistentes y aún no existen terapias médicas alternativas. TGF-β1 es un inhibidor de las funciones del lactotropo, y un intermediario de la inhibición que ejerce la dopamina, por lo tanto, resulta un candidato atractivo como blanco terapéutico para prolactinomas resistentes. El objetivo de la presente tesis fue caracterizar el sistema TGF-β1 hipofisario y la regulación de sus componentes, incluyendo los niveles de citoquina total y activa, sus proteínas de latencia (LTBPs) y activadores locales, para evaluar su posible utilidad para el desarrollo de nuevas terapias. Utilizamos dos modelos experimentales de prolactinomas: 1) ratones hembra con mutación nula del receptor dopaminérgico D2 (Drd2-/-); y 2) ratas tratadas crónicamente con estrógenos. Nuestros resultados demuestran que el sistema TGF-β1 se encuentra inhibido en las hipófisis tumorales de ambos modelos. Describimos por primera vez en la literatura una regulación diferencial de los niveles de TGF-β1 activo hipofisario por dopamina y estrógenos que podría explicar en parte las diferencias sexuales en la formación de prolactinomas. Determinamos la expresión de las tres isoformas de LTBPs capaces de unir TGF-β1, y su regulación frente a estímulos con estrógenos y agentes dopaminérgicos. Por último, identificamos a trombospondina 1 (TSP1) y calicreína 1 (KLK1) como posibles activadores de TGF-β1 a nivel local. Asimismo, ensayamos la eficacia de un tratamiento con péptidos análogos de TSP1 (ABT-510 y ABT-898) en el modelo de ratas estrogenizadas. Este tratamiento logró disminuir los niveles de prolactina sérica y el tamaño hipofisario incrementados por los estrógenos. Nuestro estudio contribuye al conocimiento del sistema TGF-β1 hipofisario y su regulación local. Siendo TGF-β1 un inhibidor de la función del lactotropo, proponemos que la restauración de su actividad local podría ser efectiva para frenar el crecimiento de prolactinomas resistentes a los tratamientos clásicos.

Abstract:
Prolactinomas are common benign adenomas that are generally treated with dopaminergic agonists. However, around 15% of these tumors become resistant, and there are still not alternative therapeutical approaches. TGF-β1 is a potent cytokine that inhibits lactotrope function and, that mediates dopamine inhibitory action. Therefore, we postulate TGF-β1 as a candidate for developing new therapies against dopamine - resistant prolactinomas. The aim of this thesis was to characterize the pituitary TGF-β1 system (active and total cytokine levels, latent TGF-β1 binding proteins (LTBPs) and local activators) and its regulation, in order to identify potential therapeutical targets. We used two different experimental models of prolactinoma development: 1) the female dopamine D2 receptor knock-out mice (Drd2-/-) and 2) the estrogen-treated rat. We demonstrated that TGF-β1 system is down-regulated in both prolactinoma models. We described for the first time in the literature a differential regulation of pituitary active TGF-β1 levels by dopamine and estradiol in vivo. These differences may contribute to sexual dimorphism found in prolactinoma development. We found that LTBPs isoforms were differentially expressed in normal vs. tumoral pituitaries in both prolactinoma models, and each isoform was also differentially regulated by dopamine and estradiol. We identified thrombospondin 1 (TSP1) and kallikrein 1 as candidates to mediate pituitary TGF-β1 activation. Finally we explored the efficacy of an in vivo treatment with TSP1 mimetic peptides (ABT-510 and ABT-898) in the rat prolactinoma model. TSP1 analogs treatment caused a significant reduction in prolactin serum levels and pituitary weight induced by estrogen after 2-weeks treatment. Our findings provide novel evidence of TGF-β1 system function and regulation in pituitary tumorogenesis. Since TGF-β1 exerts a negative control on lactotrope cells, we postulate that recovering its local activity could be effective in inhibiting tumor growth of dopamine agonist resistant prolactinomas.

Saez, Trinidad María de los Milagros. "Efectos de la exposición prenatal al agonista cannabinoide WIN55,212-2 sobre la proliferación, la migración y el citoesqueleto neuronal de la rata" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El sistema endocannabinoide (eCB), compuesto por los receptores cannabinoides (rCB1 y rCB2), ligandos endógenos (endocannabinoides), y enzimas de síntesis y degradación, está presente en el cerebro desde etapas muy tempranas de su desarrollo. En este periodo, el sistema eCB está involucrado en la regulación de la proliferación de progenitores neuronales, en la especificación, la migración y la diferenciación de neuronas piramidales e interneuronas y también en la sinaptogénesis. El consumo de marihuana durante la gestación representa un gran riesgo para el desarrollo del sistema nervioso central de los fetos, dado que el Δ9‐ tetrahidrocannabinol, el principal compuesto activo del cannabis, atraviesa la placenta y la barrera hemato‐encefálica. Estudios realizados en niños y adolescentes cuyas madres consumieron marihuana durante el embarazo, documentaron anormalidades cognitivas y comportamentales. En este trabajo se demostró la expresión del rCB1 durante la corticogénesis en neuronas postmitóticas en migración, así como en diversas poblaciones neuronales. Además, el presente trabajo aporta evidencias sobre los efectos que produce la exposición materna a un agonista cannabinoide sobre las neuronas postmitóticas en migración y la diferenciación de neuronas del linaje glutamatérgico. Estos resultados contribuyen al conocimiento sobre los sustratos neurobiológicos que determinarían los cambios neuro‐comportamentales que persistentes en las funciones cerebrales durante la vida postnatal. Asimismo, se demostró que ratones CB1 knockout mostraron una disminución en el número de progenitores intermedios y un aumento en el número de neuronas postmitóticas glutamatérgicas. Durante la vida postnatal, la deleción del rCB1 indujo una distribución de interneuronas anormal. En suma, los resultados obtenidos en este trabajo constituyen avances originales sobre el papel del sistema endocannabinoide en el desarrollo de la corteza cerebral.

Abstract:
The endocannabinoid system (eCB), formed by the cannabinoid receptors (rCB1 and rCB2), endogenous ligands (endocannabinoids) and synthesis and degradation enzymes, is present since early stages of brain development. During this period, the eCB is involved in the regulation of proliferation of neural progenitors and in specification, migration and differentiation of pyramidal neurons and interneurons as well as in synaptogenesis. Marihuana consumption during pregnancy represents a serious risk for the proper development of the fetus´s brain since Δ9‐ tetrahidrocannabinol, main active compound of cannabis, can reach the fetus through placenta and hemato‐encephalic barrier. Cohort studies performed on children and adolescents of mothers who consumed marihuana during pregnancy, reported cognitive and comportamental abnormalities in these subjects. In the present study, we demonstrated the expression of the rCB1 during corticigenesis in migrating postmitotic neurons as well as in other neuronal populations. Moreover, this Thesis work provides evidence on the effects accounted by prenatal exposure to a cannabinois agonist on migrating post‐mitotic neurons and the differentiation of glutamatergic neurons. The present results contribute to the knowledge on neurobiologic substrates that determine neuro‐comportamental changes that will persist through post‐natal life. Finally, it was also proved that CB1 knockout mice showed a diminished number of intermediate progenitors and a higher number of glutamatergic post‐mitotic neurons. During post‐natal life, the deletion of rCB1 induced an abnormal distribution of interneurons. In summary, the results presented in this Thesis work represent an original advance in the understanding of the role played by the eCB system in the development of the cerebral cortex.

Siless, Gastón Ezequiel. "Búsqueda de nuevas sustancias bioactivas a partir de productos naturales abundantes" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo se obtuvieron sustancias estructuralmente novedosas y biológicamente activas mediante modificaciones sintéticas de productos naturales abundantes. En particular, se trabajó con el pachydictyol A, un diterpeno con el core de perhidroazuleno, aislado a partir del alga parda Dictyota dichotoma, y con el ácido secochiliolídico, otro diterpeno pero con un core de espiro-furanolactona, aislado de la planta Nardophyllum bryoides. A partir del pachydictyol A se obtuvieron derivados modificados por oxidaciones selectivas; hidroxilación alílica, dihidroxilación de doble enlace y epoxidación. También se obtuvo un producto de iodociclación mediante tratamiento con el reactivo de Barluenga. Por último se obtuvieron productos híbridos de acoplamiento pachydictyol-p-benzoquinona mediante la cicloadición de Paterno-Buchi. Se ensayó la actividad antifouling de los dictyoles naturales y de algunos dictyoles modificados frente al molusco invasor Limnoperna fortunei. A partir del ácido secochiliolídico se sintetizaron; aza-derivados, híbridos secochiliolídico-quinona e hidroquinona, derivados de ácido, epóxidos y lactonas entre otros. Se ensayó la actividad tripanosomicida. Se sintetizaron híbridos terpeno-quinona y esteroide-quinona a partir de ácidos terpénicos naturales, ácidos biliares y p-benzoquinona, utilizándo la química que los ésteres tiohidroxámicos de Barton. Mediante una descarboxilación radicalaria fotoinducida y posterior adición a p-benzoquinona se logró sintetizar 12 quinonas e hidroquinonas esteroidales, una de ellas presentó una interesante actividad citotóxica frente a líneas celulares tumorales. Se estudió el alcance de la metodología para sustratos terpénicos mas complejos.

Abstract:
In the present work, novel bioactive compounds were obtained through synthetic modification of abundant natural products. Pachydictyol A, a perhydroazulenoid diterpene isolated from the brown alga Dictyota dichotoma was used as a starting material. The diterpene secochiliolidic acid, containing an interesting core of spiro-furanolactone, was isolated from the plant Nardophyllum bryoides and transformed into new componds. From pachydictyol A, several componds were synthetisized, for example: selectively oxydized derivatives; allylic hidroxylation products, dihydroxylation of a double bond and epoxidation products. An interesting iodocyclized diterpene was obtained using Barluenga´s reagent. Finally, hybrids of natural products were synthetisized by coupling pachydictyol A and p-benzoquinone using Paterno-Buchi cycloaddition. Natural and modified dictyols were tested for antifouling activity against the invassive molusk Limnoperna fortunei. By synthetic modification of secochiliolidic acid several derivatives were obtined: aza-diterpenes, hybrids of secochiliolidic-quinone and hydroquinone, acid derivatives, epoxides and lactones. The tripanosomycidal activity against Tripanosoma cruzii was tested. Many terpene-quinone hybrids were synthetisized by coupling terpene and bile acids with p-benzoquinone, using the Barton thiohydroxamic ester´s chemistry. Twelve steroidal hydroquinones and quinones were obtained by fotoinduced radical decarboxylation and addition to p-benzoquinone. One of these hybrids showed an interesting citotoxicity against tumor cell lines PANC1(human) and LM3(murine). The versatility of this methodology was studied for complex terpenic substrates.

Olivares, Carla Noemí. "Regulación del crecimiento del tejido endometrial en respuesta a nuevas alternativas terapéuticas propuestas para tratar la endometriosis" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La endometriosis se caracteriza por la presencia de focos de tejido endometrial por fuera de la cavidad uterina confiriéndole, a las mujeres que la padecen, fuertes dolores pélvicos e infertilidad. Basándonos en trabajos previos realizados en cáncer, evaluamos la aplicación de los inhibidores de aromatasa, los inhibidores de ciclooxigenasa (COX)-2 y los agonistas de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR)γ como posibles alternativas terapéuticas para la endometriosis. Específicamente evaluamos los efectos del inhibidor de aromatasa, anastrozole, del inhibidor selectivo de COX-2, celecoxib y del ligando de PPARγ, rosiglitazona sobre el crecimiento de células endometriales in vitro y sobre la implantación y crecimiento de lesiones endometriósicas en un modelo murino de endometriosis. Los resultados obtenidos son promisorios ya que todos los tratamientos provocaron efectos inhibitorios del desarrollo de la endometriosis así como efectos antiproliferativos, proapoptóticos y antiangiogénicos tanto in vivo como in vitro. Por otro lado, luego de administrar anastrozole y celecoxib en forma conjunta, no pudimos demostrar una mejora del tratamiento combinado por sobre la aplicación de cada una de las terapéuticas de manera individual. Nuestros resultados avalan al inhibidor de COX-2 como una alternativa terapéutica concreta para la endometriosis y, sugieren que la combinación de celecoxib con una glitazona podría mejorar la involución de la endometriosis, aunque aún se requiere profundizar los estudios para confirmar estos últimos datos.

Abstract:
Endometriosis is characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity. Women suffering from endometriosis experience pelvic pain and infertility. On the basis of previous cancer research, we evaluated aromatase inhibitors, cyclooxygenase (COX)- 2 inhibitors and peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)γ agonists as possible alternatives for endometriosis treatment. Specifically, we evaluated the effects of anastrozole, an aromatase inhibitor, celecoxib, a selective COX-2 inhibitor, and rosiglitazone, a PPARγ agonist on endometrial cell growth in vitro and on the implantation and growth of endometriotic lesions in a murine model of endometriosis. The results obtained are promising given that all treatments inhibited endometriosis development and had antiproliferative, proapoptotic and antiangiogenic effects both in vitro and in vivo. On the other hand, after anastrozole and celecoxib combined administration we could not demonstrate an improvement over the drugs administered individually. Our results support the COX-2 inhibitor as a real option as an alternative for endometriosis treatment and suggest that celecoxib combined with a glitazone might improve endometriosis involution, although this must be further confirmed.

Morande, Pablo Elías. "Papel de la proteína eritrocitaria Banda 3 en la biología de las células de leucemia linfática crónica" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los pacientes con leucemia linfática crónica (LLC) suelen desarrollar anemia hemolítica autoinmune (AHA). Nuestro grupo demostró que la proteína Banda 3, la más abundante en la membrana del eritrocito y blanco frecuente de los autoanticuerpos en AHA, se une a la superficie de células LLC a través de su porción N-terminal. Esta tesis tuvo como objetivos centrales identificar el sitio de unión de Banda 3 y estudiar el impacto que dicha unión tiene para la célula leucémica. Los resultados demostraron que el principal sitio de unión de Banda 3 en la membrana de la célula leucémica es una proteína que se eluye a pH 2,5 y que se identificó como high mobility group N2 (HMGN2), proteína de nucleosomas que no había sido descripta en la membrana hasta el momento. La expresión de HMGN2 en la superficie de células LLC fue corroborada por citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. El cultivo con IFN-α incrementó la expresión de HMGN2 y la capacidad de unir Banda 3 de las células LLC. Asimismo, la unión de Banda 3 tuvo como consecuencia el aumento en la expresión de marcadores de activación de las células leucémicas. Proponemos que Banda 3 a través de HMGN2 podría favorecer la iniciación de la AHA en LLC.

Abstract:
Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) patients often develop autoimmune hemolytic anemia (AHA). Our group previously showed that Band 3, the most abundant protein in the outer membrane of red blood cells and a frequent target of autoantibodies in AHA, specifically binds the surface of CLL cells through its N-terminal domain. The main objectives of the present thesis work were to identify the binding site of Band 3 and to study the impact of such interaction in the leukemic cells. The results demonstrate that the major binding site of Band 3 on leukemic B cell membrane is a protein eluted at pH=2,5 that was identified as high mobility group N2 (HMGN2), a nucleosome-interacting protein which has not been previously reported as a membrane protein. Expression of HMGN2 at the surface of CLL cells was corroborated by flow cytometry and fluorescence microscopy. Cell cultures in the presence of IFN-α increased the expression of HMGN2 and the binding capacity of Band 3 to CLL cells. Additionally, binding of Band 3 resulted in an increased expression of activation markers on the leukemic cells. We propose that Band 3, through HMGN2, might favor the ignition of AHA in CLL.

Chiarella, Paula. "Estrategias de inmunoterapias contra tumores murinos durante el estado de inmunosupresión inducido por el tumor" (2012-02-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Aunque los animales pueden ser inmunizados contra el crecimiento de algunos tumores, la mayoría de los intentos por aplicar estas inmunoterapias para causar la regresión en tumores humanos y de animales una vez que estos se encuentran establecidos no has sido exitosos, aun cuando los tumores son fuertemente inmunogénicos. En esta tesis, nosotros demostramos que el inicio de la refractariedad a los tratamientos inmunológicos coincidió con el comienzo de un estado de inmunosupresión conocido como “eclipse inmunológico” caracterizado por una pérdida o bloqueo de la respuesta inmune antitumoral después que el tumor ha superado cierto volumen crítico (500 mm3). A su vez el inicio del eclipse se correspondió con el comienzo de un proceso de inflamación sistémica progresiva caracterizado por un aumento en el número de neutrófilos circulantes y en bazo, un alto número células mieloides inmaduras (GR1/CD11b) y una elevada concentración sérica de citoquínas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β e IL-6, proteína C reactiva y proteína A Amieloide. En ratones portadores de tumor, la aplicación de una sola dosis (0.75 mg/Kg) de un corticoide sintético como la dexametasona (DX) redujo significativamente los parámetros de inflamación sistémica y revirtió simultáneamente el eclipse inmunológico, lo cual fue demostrado por la recuperación de ciertos indicadores de respuesta inmune antitumoral. Otros dos tratamientos anti-inflamatorios (inodmetacina o receptor para TNF-α) revirtieron parcialmente el eclipse inmunológico, aunque el efecto no fue tan efectivo que el observado con DX. La reversión del eclipse inmunológico no fue suficiente por si solo para inhibir el crecimiento de un tumor primario. Sin embargo, cuando usamos la estrategia de dos pasos inoculando DX para revertir el eclipse inmunológico y células dendríticas (CDs) estimuladas con antígeno tumoral, como un Booster de inmunización, se observó una inhibición significativa tanto en el crecimiento de tumores establecidos como en células remanentes luego de una operación de un tumor grande establecido, a pesar de que la vacunación con CDs solamente no tuvo efecto o incluso, a veces, produjo un aumento del crecimiento tumoral. Asimismo, cuando a la estrategia de dos pasos le adicionamos un tratamiento adicional (transferencia pasiva de linfocitos näive o administración de ATRA), si bien se observó una mayor inhibición del crecimiento de los tumores, la sobrevida de los animales no fue significativa. Por lo tanto, los datos presentes en esta tesis demuestran que es necesario eliminar o mejorar el eclipse inmunológico como condición previa para permitir que una terapia inmunológica anti-tumoral pueda ser efectiva.

Abstract:
Although animals can be immunized against the growth of some tumor implants, most of the attempts to use immunotherapy to cause the regression of animal and human tumors once they have become established have been disappointing even when strongly immunogenic tumors were used as target. In this paper, we demonstrate that the failure to achieve an efficient immunological treatment against an established strongly immunogenic murine fibrosarcoma was paralleled with the emergence of a state of immunological unresponsiveness (immunological eclipse) against tumor antigens observed when the tumor surpassed the critical size of 500 mm3. In turn, the onset of the immunological eclipse was coincidental with the onset of a systemic inflammatory condition characterized by a high number of circulating and splenic polymorphonucleated neutrophils displaying activation and myeloid suppressor cell (Gr1/CD11b) and an increasing serum concentration of the proinflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 cytokines and C-reactive protein and serum A amyloid phase acute proteins. Treatment of tumor-bearing mice with a single low dose (0.75 mg/kg) of the synthetic corticoid dexamethasone (DX) significantly reduced all the systemic inflammatory parameters and simultaneously reversed the immunological eclipse. Two other antiinflammatory treatments by using indomethacin or dimeric TNF-α receptor, also partially reversed the immunological eclipse although the effect was not as striking as that observed with DX. The reversion of the immunological eclipse was not enough on its own to inhibit the primary growing tumor. However, when we used the two-step strategy of inoculating DX to reverse the eclipse and then dendritic cells loaded with tumor antigens (CDs) as an immunization booster, a significant inhibition of the growth of both established tumors and remnant tumor cells after excision of large established tumors was observed, despite the fact that the vaccination alone (CDs) had no effect or even enhanced tumor growth in certain circumstances. Also, when we add an additional treatment (passive transfer of naive lymphocytes or administration of ATRA), although there was a greater inhibition of tumor growth, but survival was not significant. Therefore, these data that we present is based on the rationale that it is necessary to eliminate or ameliorate the immunological eclipse as a precondition to allow an otherwise ineffective anti-tumor immunological therapy to have a chance to be successful.

Ricci, Analía Gabriela. "Estudio de nuevas terapias naturales y antiangiogénicas para el tratamiento de la endometriosis" (2012-03-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La endometriosis se define como la presencia de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina y sus principales síntomas asociados son el dolor y la infertilidad. Las terapias médicas disponibles actualmente resultan insuficientes debido a las altas recidivas de la enfermedad y los efectos adversos que generan. Asimismo, en los últimos años, se ha propuesto a los inhibidores de la angiogénesis como posible alternativa terapéutica, así como también el uso de compuestos naturales presentes en alimentos que formen parte de nuestra dieta. El objetivo general de esta tesis consistió en evaluar el efecto de un agente antiangiogénico, el bevacizumab, y de dos polifenoles naturales, el resveratrol y el galato de epigalocatequina (EGCG); sobre el crecimiento de lesiones endometriósicas en un modelo murino de endometriosis. Asimismo, se estudió el efecto in vitro de los polifenoles sobre la supervivencia de células epiteliales de endometrio eutópico provenientes de pacientes con endometriosis y mujeres controles. Nuestros resultados sugieren que el resveratrol y el EGCG tendrían un efecto inhibidor del crecimiento del endometrio ectópico, regulando los niveles de apoptosis y proliferación celular, así como la vascularización de la lesión endometriósica. El bevacizumab también mostró ser efectivo en la inhibición de la endometriosis en el modelo murino. No obstante, es importante considerar sus posibles efectos secundarios y su costo como tratamiento. Siendo así, sugerimos que el resveratrol y el EGCG serían una opción terapéutica promisoria. Los resultados obtenidos en esta tesis avalan continuar investigando estos compuestos naturales para poder definir los mecanismos de acción que participan en el efecto inhibitorio observado, y determinar también las concentraciones plasmáticas efectivas en pacientes para poder esclarecer su potencial utilidad como agentes preventivos en el tratamiento de la endometriosis.

Abstract:
Endometriosis is defined as the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity being its main associated symptoms, pain and infertility. Medical therapies available up to date are unsatisfactory due to their adverse effects and the frequent pathology recurrences. In the last few years, antiangiogenic agents and several natural compounds present in different dietary sources have been proposed as a potent alternative therapy. Given this scenario, the general objective of the present thesis was to evaluate the effect of bevacizumab, known for its antiangiogenic properties, as well as the effect of two natural polyphenols, resveratrol and epigallocatechin-3-gallate (EGCG), on the growth of endometriotic lesions in a mouse model of endometriosis surgically induced. Moreover, the effect of both polyphenols on the survival of epithelial endometrial cells from endometriosis patients and control subjects was evaluated in vitro. Our results suggest that resveratrol and EGCG would have a repressive effect on endometriotic growth, by increasing apoptosis and reducing cell proliferation and vascularization within the epithelial fraction of the endometriotic lesion. Bevacizumab was also effective in the inhibition of endometriosis development in the mouse model. Nevertheless, it is important to take into account its adverse effects as well as its cost. Based on these data, we propose that resveratrol and EGCG become a promising therapeutic option. Our results support to keep ongoing with the research in order to elucidate the mechanisms of action involved in the observed inhibitory effects, and determine the effective doses for patients to clarify the usefulness of these agents in endometriosis treatment.

Loreti, Rosana Nazareth. "Implicancia del grado de sialilación y complejidad de los oligosacáridos de FSH en la regulación de la función ovárica: estudios clínicos y experimentales" (2012-12-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La FSH se sintetiza y secreta como una familia de variantes glicosiladas, las cuales difieren en el grado de sialilación y complejidad de sus oligosacáridos y en la inducción de respuestas biológicas en células blanco, in vivo e in vitro. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue establecer la relación existente entre las características de los carbohidratos presentes en la molécula de FSH y la inducción de respuestas biológicas en las células de la granulosa. La acción de variantes glicosiladas, aisladas de FSH recombinante humana (FSHrh), fue evaluada in vitro utilizando dos modelos experimentales. Se estudió la producción de inhibinas diméricas en células de la granulosa de rata; de esteroides e inhibinas en la línea celular de granulosa humana, KGN, como así también el patrón de expresión génica global y la expresión de enzimas esteroidogénicas y subunidades de inhibinas. Estudios in vitro demostraron que el grado de sialilación y la complejidad de los oligosacáridos presentes en la FSHrh reguló en forma diferencial la producción de esteroides y péptidos. Asimismo, el análisis de ontología génica reveló la capacidad que poseen las variantes glicosiladas de FSHrh de modular en forma diferencial la expresión de genes involucrados en funciones o procesos esenciales para el mantenimiento de la función celular. Las características de las variantes glicosiladas de la FSH circulante fueron determinadas en condiciones fisiológicas y en pacientes infértiles con ciclos regulares. Se observaron alteraciones en el grado de sialilación de la FSH circulante en las pacientes con trastornos reproductivos y en mujeres jóvenes ovodonantes. Los resultados obtenidos demuestran que los oligosacáridos de la molécula de FSH regulan distintas funciones de la célula de la granulosa. Alteraciones precoces en el grado de sialilación de la gonadotrofina podrían comprometer la capacidad reproductiva en la mujer.

Abstract:
FSH is produced and secreted as a family of glycosylation variants which differ from each other in the oligosaccharide sialylation and complexity and in the induction of different biological responses in vitro and in vivo. The aim of this Doctoral Thesis was to establish the relationship between the FSH carbohydrate characteristics and the induction of biological responses in granulosa cells. The effect of recombinant human FSH glycosylation variants were evaluated in two experimental models in vitro. Dimeric inhibin production was assessed in rat granulosa cells, steroids and inhibin production in human granulosa cell line KGN, as well as global gene expression profile and the expression of steroidogenic enzymes and inhibin subunits. In vitro studies demonstrated that sialylation and complexity of rhFSH oligosaccharides induced a differential regulation of steroid and inhibin production. Gene ontology analysis revealed the ability of rhFSH glycosylation variants to differentially modulate the expression of genes involved in essential cell biological processes and molecular functions. Circulating FSH oligosaccharides characteristics were determined under physiological conditions and in infertile patients. Alterations in FSH sialylation were observed in infertile patients and in ovodonors. The results obtained in this study show that FSH oligosaccharides regulate different functions in granulosa cells. Early alterations in FSH sialylation may jeopardize the reproductive capacity in women.

Molinari, Ana Julia. "Captura neutrónica en boro (BNCT) para el tratamiento del cáncer bucal: desarrollo de nuevas modalidades de BNCT, evaluación de su radiobiología, eficacia terapéutica y potencial radiotoxicidad en un modelo de hámster" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Captura Neutrónica en Boro (BNCT) es una terapia binaria que se basa en la acumulación selectiva de compuestos borados dentro del tumor y la subsiguiente irradiación con neutrones térmicos. La reacción de captura que se produce entre el 10B y los neutrones genera partículas letales de corto alcance que dañan el tumor sin causar daño significativo al tejido normal. Previamente en nuestro laboratorio se reportó el éxito terapéutico de una única aplicación de BNCT mediada por los compuestos borados borofenilalanina (BPA), decahidrodecaborato de sodio (GB-10) o la administración combinada de ambos, para el tratamiento del cáncer bucal en un modelo de hámster. Si bien los resultados en términos de eficacia terapéutica fueron muy buenos, pueden ser mejorados. En este trabajo de tesis, buscamos optimizar la terapia de BNCT potenciando el control tumoral y minimizando su radiotoxicidad. Para ello desarrollamos una nueva modalidad terapéutica denominada BNCT secuencial (BPA-BNCT seguido de GB-10-BNCT luego de 24 ó 48 horas), establecimos un método para inducir la normalización de los vasos sanguíneos tumorales (con talidomida) y evaluamos el efecto de esta normalización en la eficacia terapéutica del BNCT mediado por BPA. Complementariamente estudiamos la combinación de ambas modalidades (normalización con talidomida y BNCT secuencial). Asimismo, realizamos un análisis exhaustivo de los posibles cambios en la microdistribución de los compuestos borados por autorradiografía neutrónica. En el presente estudio demostramos que el BNCT secuencial mejora el control del cáncer bucal, que el tratamiento previo con talidomida aumenta la eficacia terapéutica del BNCT mediado por BPA a través de la normalización de los vasos sanguíneos aberrantes del tumor, y que con el tratamiento con talidomida previo al BNCT secuencial se alcanza una respuesta tumoral total (respuesta completa + parcial) del 100% de los tumores. Además, en todos los casos se redujo la radiotoxicidad en el tejido precanceroso circundante al tumor.

Abstract:
Boron Neutron Capture Therapy (BNCT) is based on targeting of tumor cells with boron compounds followed by irradiation with thermal neutrons. The capture reaction that occurs between the 10B and the neutrons generates short-range lethal particles that destroy the tumor cells but spare normal tissue. We previously reported the therapeutic success of a single application of BNCT mediated by boronophenylalanine (BPA), decahydrodecaborate (GB-10) or by the combined administration of BPA and GB-10, for the treatment of oral cancer in the hamster cheek pouch experimental model. These previous BNCT studies showed marked therapeutic efficacy but left room for improvement. In this thesis, we explored the way to improve the therapeutic effect without causing unacceptable toxicity in normal or dose-limiting precancerous tissue. Here we developed a novel approach to BNCT termed Sequential BNCT based on the sequential application of BPA-BNCT followed by GB-10-BNCT with an interval of 24 or 48 h between the two treatments. We developed a technique to normalize aberrant blood vessels with thalidomide and assessed its effect prior to the administration of BPA on the therapeutic efficacy of BNCT. As a third new protocol we studied the combination of both modalities, thalidomide treatment prior to Sequential BNCT. Additionally, we performed an autoradiography analysis to explore potential changes in boron microdistribution and content that are not detectable by gross boron measurements. We can conclude based on the observations reported in this thesis that Sequential BNCT enhanced tumor response, that the pretreatment with thalidomide prior to BNCT mediated by BPA was therapeutically beneficial, and that tumor blood vessel normalization before Sequential BNCT controlled the entire population of tumors. For all the new protocols, no extra cost in terms of mucositis in the dose-limiting precancerous tissue was observed.

Fauerbach, Jonathan Arturo. "Caracterización de las etapas tempranas de la agregación de alfa-sinucleína in vitro mediante sondas fluorescentes ESIPT y microscopia de fuerza atómica" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Enfermedad de Parkinson (EP) es el desorden neurodegenerativo motor más frecuente, caracterizado por la presencia de agregados proteicos amiloideos intra y extraneuronales conocidos como Cuerpos de Lewy (CL). El principal componente de estas estructuras es alfa-sinucleína (AS), una proteína presináptica de 140 aminoácidos abundante en células dopaminérgicas del cerebro aunque su función fisiológica permanece aún desconocida. En su forma libre nativa AS carece de una estructura secundaria definida pudiendo adoptar múltiples conformaciones en solución y en asociación con otras proteínas y membranas. Se cree que los CL y las fibras amiloides maduras (mafs) son el resultado de un proceso de mal plegamiento, auto-ensamblado y asociación de AS y que posiblemente sirven como mecanismos de protección para la célula, a través de la redistribución en la población de las especies tóxicas intermediarias solubles asociadas a etapas tempranas. Estudio in vitro de las especies y procesos involucrados en la agregación de AS brindan la posibilidad de entender los mecanismos subyacentes en EP. El diseño de nuevas formas de detección de las especies intervinientes en el proceso de agregación y el estudio de los mecanismos de formación de dichos intermediarios tempranos poseen una alta importancia. En esta tesis, se sintetizaron sondas fluorescentes sensibles a cambios en la polaridad de su microentorno que permiten monitorear el proceso de auto-ensamblado y asociación de AS marcada covalentemente con estos compuestos. Dichas sondas demuestran una muy alta sensibilidad al proceso en estudio, proveyendo una novedosa metodología de monitoreo en continuo con la mínima perturbación del sistema. Diversas sondas fueron sintetizadas basándose en la familia de las 3-hidroxicromonas (3HC), compuestos altamente sensibles a los cambios de polaridad de su entorno. Su particular estructura química posibilita el fenómeno conocido como ESIPT (‘Excited State Intramolecular Proton Transfer o Transferencia Protónica Intramolecular en el Estado Excitado’). En ESIPT se produce una transferencia protónica intramolecular en el estado excitado obteniendo dos formas excitadas cada una con un nivel de energía distinto. Con lo cual estos compuestos fluorescentes ESIPT presentan dos bandas de emisión en lugar de una sola. La posición, intensidad y relación entre las bandas de emisión se modifican de acuerdo a los cambios en la polaridad, formación de enlaces por puentes de hidrógeno, y acidez/basicidad del microentorno de la sonda. Las nuevas sondas 3HC sintetizadas resultaron reporteros muy versátiles para el proceso de agregación de AS, particularmente sensibles a las etapas tempranas a cuyos agregados de AS se les adjudica la mayor citotoxicidad. La combinación de distintas sondas de polaridad han permitido obtener datos experimentales acerca de la formación y desaparición de intermediarios pre-amiloideos transientes. Las curvas de agregación obtenidas y sus cambios espectroscópicos fueron complementadas con un análisis por Microscopia de Fuerza Atómica (AFM). Mediante un estudio sistemático por AFM se lograron identificar las diferentes especies provenientes del proceso de autoensamblado de AS, donde cada una de las especies fue caracterizada y catalogada. Estudios a diferentes temperaturas permitieron evaluar su influencia en la cinética y termodinámica del proceso de agregación. Incubaciones a baja temperatura (4°C) permitieron definir un mínimo local de energía en la coordenada de la agregación, revelando una novedosa especie supramolecular (la "acuna") que muestra indicios de estar directamente involucrada en el paso clave de la formación de estructuras fibrilares. Estudios preliminares sobre células SH-SY5Y en cultivo dan indicios de que las acunas son citotóxicas. A través de la Crio-Microscopía de Transmisión Electrónica (Cryo-ET) se obtuvo información estructural con resolución sub-nm de esta novedosa especie supramolecular. Los estudios dieron lugar a la formulación de un nuevo esquema secuencial de agregación (SAS) para AS, basándose en conceptos de química coloidal, de polímeros y supramolecular. SAS distingue 3 etapas de la agregación: molecular, coloidal y fibrilar, en función de las estructuras halladas, su orden secuencial lineal y orquestado de interconversión, su presencia transiente (aparición y desaparición) y morfología característica. Además, SAS distingue etapas exergónicas y endotérmicas del proceso global, señalando un mínimo local de energía correspondiente con la formación de la acuna. Se prevé que este modelo pudiera ser útil no sólo para AS sino para otras proteínas amiloideas “intrínsicamente desordenadas” asociadas a enfermedades neurodegenerativas similares, abriendo la posibilidad de la existencia de un mecanismo común y unificado. Esta tesis doctoral involucra un estudio desde lo sintético orgánico y la biofísica estructural, utilizando microscopias de alta resolución y herramientas fluorescentes avocadas al estudio y la descripción del proceso integro de agregación de AS, obteniendo nuevos datos relevantes al área que son interesantes de continuar y ser explorados por el aporte que puedan rendir en el contexto biomédico.

Abstract:
Parkinson's disease (PD) is the most common neurodegenerative motor disorder, characterized by the presence of intra and extraneuronal amyloid protein aggregates known as Lewy bodies (LB). The main component of these structures is alpha-synuclein (AS), a presynaptic protein of 140 aminoacids abundant in dopaminergic brain cells, although its function is not fully understood. In its native form AS has no defined secondary structure and can adopt multiple conformations in solution and in association with other proteins and membranes. It is believed that LB and mature amyloid fibers (mafs) are the result of a process of AS misfolding, self-assembly and association (where the trigger remains unknown), which are believed to play a neuroprotective role through the redistribution of the population of intermediate toxic soluble species associated with early stages. In vitro studies of the process provide the means for controlling the conditions under which aggregation occurs and offer the possibility to study their dynamics so as to understand the underlying mechanisms. The design of new means for detecting the involved species in AS aggregation has high priority in order to elucidate the mechanisms of formation of these early intermediates and certain their potential role in the context of PD. This thesis describes the synthesis of fluorescent probes sensitive to changes in the polarity of their microenvironment’s which have served to monitor the process of self-assembly and association of AS. Such probes show a high sensitive for the early stages of the process under study, providing a novel continuous monitoring methodology with minimal perturbation of the system. Different probes based on the family of 3-hydroxychromones (3HC) were synthesized, being organic compounds highly sensitive to changes in the polarity of their environment. Their unique chemical structure leads to the phenomenon known as ESIPT (‘Excited State Intramolecular Proton Transfer’), a process by which an intramolecular proton is transfered in the excited state leading two the formation of two states with different energy levels. As a consequence, these compounds exhibit two emission bands instead of one. The position, intensity and ratio of the bands are modified according to changes in the polarity, hydrogen-bonding potential, and acidity/basicity of the microenvironment of the probe. The new probes are versatile reporters of AS aggregation, particularly sensitive to the early stages and species to which the highest cytotoxicity is attributed. The combination of different polarity probes have provided experimental data on the formation and disappearance of pre-amyloid transient intermediates. Spectroscopic data for the progress curves of aggregation were complemented by analysis by Atomic Force Microscopy (AFM). Through a systematic study by AFM it was possible to identify the different species in the self-assembly process of AS, where each species was characterized and cataloged. Studies at different temperatures allowed the evaluation of their influence on the kinetics and thermodynamics of the aggregation. Incubations at low temperature (4°C) helped to define a local energy minimum of the aggregation coordinate, revealing a novel supramolecular species (the "acuna") with evidence that it is directly involved in key steps leading to the formation of fibrillar structures. Preliminary studies on SH-SY5Y cells provided evidence that these species are cytotoxic. Through cryotransmission electron microscopy (Cryo-ET) structural information was obtained with subnm resolution of the so-called "latent" acunas. These studies have led to the formulation of a new sequential aggregation scheme (SAS) for AS, based on concepts of colloidal, polymers and supramolecular chemistry. SAS distinguishes 3 stages of aggregation: molecular, colloidal and fibrillar according to the found structures, their sequential orchestrated interconversion, their transient presence (or absence) and their particular morphology. In addition, SAS distinguishes exergonic and endothermic stages of the overall process, pointing to a specific local energy minimum. It is anticipated that this model could be useful not only for AS and PD but for other "intrinsically disordered" amyloid proteins associated with neurodegenerative diseases, opening the possibility that a common and unified mechanism may exist. This thesis features a study encompassing synthetic organic chemistry and structural biophysics, using high-resolution microscopy and fluorescent tools to study and describe the entire process of the in vitro aggregation of AS, obtaining new relevant data to the field and with implications in the biomedical context, which required and justify further exploration.

Gómez, Natalia Valeria. "MAP quinasa fosfatasa-2 (MKP-2): regulación hormonal y rol funcional en células de Leydig" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La hormona luteinizante (LH) regula las funciones de las células de Leydig, principalmente la esteroidogénesis, a través de un mecanismo que incluye la activación de PKA y ERK1/2. Las MAPK fosfatasas (MKPs, MAP Kinase Phosphatase) desfosforilan específicamente a las MAPKs (MAP Kinase) y, consecuentemente, regulan procesos fisiológicos dependientes de MAPK. En este trabajo se demostró que, en células de Leydig MA-10, la activación del receptor de LH con gonadotrofina coriónica humana (hCG) o el aumento de AMPc intracelular provocan la acumulación de MKP-2 y su translocación al núcleo. La acumulación es consecuencia de la activación transcripcional y de la estabilización de la proteína por modificaciones posttraduccionales. El bloqueo de la expresión de MKP-2 mediante un shARN – desarrollado en el marco de este trabajo– aumentó la fosforilación de ERK1/2 inducida por AMPc, particularmente a tiempos prolongados de estimulación. El bloqueo de la expresión de MKP-2 también aumentó la actividad del promotor y los niveles del ARNm correspondiente al gen CYP11A1, que codifica para una enzima esteroidogénica y se induce por LH/hCG vía ERK1/2. Se concluye que LH/hCG regula estrictamente la expresión de MKP-2 para controlar la fase terminal de actividad de ERK1/2 y “apagar” la expresión de genes inducidos por LH vía ERK1/2.

Abstract:
The Luteinizing hormone (LH) regulates Leydig cell functions, mainly steroid synthesis, through a mechanism including PKA and ERK1/2 activation. MKPs (MAP Kinase Phosphatases) specifically dephosphorylate MAPKs (MAP Kinases) and, consequently, regulate MAPK-dependent physiological processes. The aim of this work was to analyze the regulation and function of MKP-2 in MA-10 Leydig cells. Results show that the increase in intracellular cAMP and the activation of the LH receptor with human Chorionic Gonadotropin promote MKP-2 accumulation and protein translocation to the nucleus. This accumulation results from gene transcription activation and posttranslational modifications that increase protein stabilization. The specific downregulation of MKP-2 by a shRNA –developed as part of this work– increased cAMPinduced ERK1/2 phosphorylation, particularly after prolongued stimulation. MKP-2 down-regulation by shRNA also increased both the promoter activity and mRNA levels of CYP11A1, which codifies for a steroidogenic enzyme induced by LH/hCG through an ERK-dependent mechanism. These findings demonstrate that LH/hCG tightly regulates MKP-2 expression to control the terminal phase of ERK1/2 activity and “turn off” the expression of LH/ERK-dependent genes.

Carlini, María José. "Rol del factor de crecimiento transformante beta en la progresión del cáncer de pulmón" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de pulmón es la causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo y se clasifica en dos tipos principales: de células pequeñas y de células no pequeñas (NSCLC). El factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) regula un amplio espectro de funciones celulares y juega un rol importante en las enfermedades del pulmón, incluyendo el NSCLC. El objetivo de este trabajo de tesis fue estudiar el papel del TGFβ en la progresión tumoral de la línea de adenocarcinoma de pulmón murino LP07. Más aún, se realizó un estudio retrospectivo con muestras de tumores de pacientes con NSCLC estadios I-III para evaluar el rol clínico-patológico y la significancia pronóstico de moléculas moduladas por TGFβ; incluyendo la galectina-1 (gal-1), el receptor de TGFβ tipo I (TβRI) y los factores de transcripción FoxM1 y DEC2. En el modelo experimental LP07, el TGFβ moduló múltiples aspectos vinculados con la progresión tumoral, incluyendo la proliferación, la apoptosis, la migración, la actividad de enzimas proteolíticas, la secreción de citoquinas, la angiogénesis, el acondicionamiento del órgano blanco de la metástasis y la retención de las células tumorales en el pulmón. Se demostró que si bien el tratamiento con TGFβ retrasó el crecimiento en el sitio primario, no indujo un programa de quiescencia sostenido, y se observó un cambio hacia la progresión maligna en el sitio metastásico. En los pacientes con NSCLC, se definió el valor como biomarcadores de pronóstico de la expresión alta de gal-1 conjuntamente en las células tumorales y el estroma, así como la expresión alta de TβRI en la membrana de las células tumorales, que se asociaron con menor supervivencia global y mayor riesgo de caída, respectivamente, luego del ajuste por otros pronosticadores. Por otro lado, la expresión del supresor tumoral candidato DEC2 en las células tumorales se asoció con una mejor supervivencia global, en particular para los pacientes con tamaño tumoral T2. La evaluación de la expresión del marcador de proliferación FoxM1 en las células tumorales o el infiltrado no arrojó datos de importancia clínica, aunque el análisis conjunto de la expresión contrapuesta de FoxM1 y DEC2 en los tumores podría aportar información de pronóstico en una cohorte de pacientes mayor. En conjunto, este trabajo demuestra la modulación por TGFβ del comportamiento de los tumores de pulmón y proporciona potenciales herramientas de pronóstico y posibles blancos moleculares para el tratamiento.

Abstract:
Lung cancer is the most frequent and one of the most deadly cancer types and is classified into small cell lung carcinoma and non–small cell lung carcinoma (NSCLC). Transforming growth factor beta (TGFβ) regulates a wide array of cell functions and plays a major role in lung diseases, including NSCLC. We analyzed the role of TGFβ1 on the progression of the murine lung adenocarcinoma cell line LP07. Furthermore, we undertook a retrospective study with tissue samples from stage I-III NSCLC patients to assess the clinical pathologic role and prognostic significance of several targets of the TGFβ pathway; including galectin-1 (gal-1), type I TGFβ receptor (TβRI), and the transcription factors FoxM1 and DEC2. In our model, TGFβ1 affected various aspects of tumor progression, including proliferation, apoptosis, migration, proteolytic enzyme activity, cytokine secretion, angiogenesis, conditioning of the metastatic target organ and tumor cell retention in the lungs. We demonstrated that although TGFβ delayed tumor growth at primary site, a sustained dormancy program was not induced, and a switch towards malignant progression upon TGFβ treatment was observed at the metastatic site. In NSCLC patients, we defined the prognostic value of gal-1 expression at both tumor cells and stroma, and TβRI membrane expression in tumor cells. Respectively, high expression of these biomarkers was associated with decreased overall survival and greater risk of relapse, after adjustment for other predictors of outcome. On the other hand, the expression of the candidate tumor suppressor DEC2 was associated with better overall survival, especially for patients with T2 size tumors. Assessment of the expression of the proliferation marker FoxM1 did not reveal significant outcomes. However, the combined evaluation of opposite expression of FoxM1 and DEC2 in a larger cohort of patients may reveal prognostic information. Altogether, these studies suggest the involvement of TGFβ in the behavior of lung tumors and provide potential prognostic tools and may help identify novel molecular targets for lung cancer treatment.

Elguero, María Belén. "Rol de HO-1 en la regulación de la inflamación asociada al cáncer de próstata. Compartimentalización subcelular y función" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por esta enfermedad entre los hombres occidentales. Los andrógenos y el receptor de andrógenos (AR) son críticos para el desarrollo del PCa. El AR recluta varios co-activadores/co-represores y factores de transcripción modificando la expresión de genes blanco. Se han identificado varios mecanismos que activan al AR entre ellos la vía de señalización de STAT3. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron la expresión nuclear de HO-1 en carcinomas primarios de próstata. In vitro la inducción de HO-1 disminuyó la proliferación, la invasión y la migración celular y retardó el crecimiento tumoral y la angiogénesis in vivo. Nuestra hipótesis es que HO-1 podría actuar como un co-regulador de receptores nucleares o bien modificar el microambiente tumoral modulando la expresión de factores que actuarían como coreguladores. En este trabajo de tesis nos propusimos investigar si HO-1 afecta la actividad transcripcional del AR a través del eje STAT3. Demostramos que la inducción de HO-1 en las células de PCa reprime la activación del AR, disminuyendo la actividad del promotor y los niveles del ARNm del antígeno prostático específico (PSA). Comprobamos que la sobreexpresión de HO-1 induce arresto del ciclo celular en G2/M. Mediante inmunoprecipitación de la cromatina determinamos que HO-1 se asocia a promotores génicos, revelando una nueva función nuclear para esta proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación mostramos que HO-1 y STAT3 interaccionan directamente. Por medio de microscopía confocal demostramos que HO-1 provoca la retención citoplasmática de STAT3. El tratamiento con hemina (inductor específico de HO-1) impidió la inducción de la expresión de los genes targets de STAT3, coincidente con la disminución de los niveles de pSTAT3 en el núcleo. Estudios in vivo confirmaron la reducción de la localización nuclear de STAT3 en los xenotransplantes de células PC3 que sobre-expresan HO-1. Adicionalmente, NFκB, un factor relevante en la inflamación y que forma complejos con STAT3, también queda inactivo retenido en el citoplasma cuando se induce HO-1. Estos resultados proveen una función nueva para HO-1 reprimiendo la actividad transcripcional del AR en PCa e interfiriendo con la señalización de STAT3. Estos hallazgos sustentan nuestra proposición acerca del nuevo rol que posee HO-1, más allá de su actividad catalítica.

Abstract:
Activation of the androgen receptor (AR) is a key step in the development of prostate cancer (PCa). Several mechanisms have been identified in AR activation, among them signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling. Recent studies suggest that heme oxygenase 1 (HO-1) may play a key role in PCa, independent of its catalytic function. We sought to explore whether HO-1 operates on AR transcriptional activity through the STAT3 axis. Our results display that HO-1 induction in PCa cells represses AR activation by decreasing the prostate-specific antigen (PSA) promoter activity and mRNA levels. We also show that HO-1 over expression in PC3 cells induces the arrest of the cell cycle in G2/M. Strikingly, this is the first report to show by chromatin immunoprecipitation analysis that HO- 1 associates to gene promoters, revealing a novel function for HO-1 in the nucleus. Furthermore, HO-1 and STAT3 directly interact as determined by co-immunoprecipitation studies. Forced expression of HO-1 increases in vitro and in vivo STAT3 cytoplasmic retention. When PCa cells were transfected with a constitutively active STAT3 mutant, PSA and STAT3 downstream target genes were abrogated under hemin treatment. Additionally, a significant decrease in pSTAT3 protein levels was detected in the nuclear fraction of these cells. Confocal microscopy images exhibit a decreased rate of AR/STAT3 nuclear colocalization under hemin treatment. The inflammatory key factor NFκB was shown to interact with both STAT3 and AR and its nuclear translocation was impaired by hemin treatment. These results provide a novel function for HO-1 down-modulating AR transcriptional activity in PCa cells, interfering with STAT3 signaling, evidencing HO-1 role beyond heme degradation.

Angelo, María Florencia. "Papel del receptor RAGE en la determinación de la sobrevida neuronal en un modelo experimental de apnea del sueño por hipoxia intermitente" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Apnea del Sueño (AS) es un grave problema para la Salud Pública que afecta a una notable proporción de la población. En animales de laboratorio la AS se modela a través de la exposición a hipoxia intermitente (HI) que induce alteraciones neuronales, gliosis reactiva, expresión del receptor RAGE y de su ligando S100B en el SNC. En esta tesis, desarrollamos un modelo de exposición a HI en cultivos primarios de hipocampo de roedores y ello nos ha permitido disecar algunas de las rutas de señalización que serían responsables de la neurodegeneración y la gliosis reactiva que se observa en modelos experimentales de AS. Así, demostramos que la exposición a HI induce stress oxidativo, activación de HIF-1 y NF-κB, un fenotipo reactivo en la astroglía y el acortamiento de las neuritas. Estas alteraciones, que correlacionan con los cambios observados en los animales expuestos al modelo de AS por HI, fueron prevenidos por la aplicación en el medio de cultivo de anticuerpos neutralizantes de RAGE así como por la sobreexpresión de un dominante negativo de RAGE entregado por un vector viral o el bloqueo farmacológico de NF-κB y Akt. La manipulación experimental de los niveles de S100B no fue tan efectiva para reducir estas alteraciones. Basándonos en estos resultados utilizamos el mismo enfoque para intentar disminuir las alteraciones neuro-gliales en el modelo experimental de AS por HI en roedores. Así, el bloqueo de RAGE con anticuerpos neutralizantes administrados intrahipocampalmente o la expresión del dominante negativo de RAGE entregado por un vector viral, tanto como el bloqueo farmacológico de NF-κB fueron efectivos para disminuir la gliosis reactiva y la neurodegeneración. Estos resultados indican que RAGE y NF-κB estarían involucrados en las alteraciones neuronales y la gliosis reactiva inducidas por la AS. Estas rutas de señalización serian así interesantes blancos moleculares para el desarrollo de estrategias de neuroprotección útiles en la AS.

Abstract:
Sleep Apnea (SA) is a serious problem for Public Health that affects a prominent proportion of the population. In laboratory animals SA is mimicked by the exposition to Intermittent Hypoxia (IH) that induces neuronal alterations, reactive gliosis, RAGE receptor expression and its ligand S100B in the central nervous system (CNS). In this Thesis, we developed a model of IH exposition in primary cultures from rodent hippocampus and this has allowed us to dissect some of the signaling pathways that would be responsible of the neurodegeneration and reactive gliosis that is observed in SA models. Thus, we showed IH exposition induces oxidative stress, HIF-1 and NF-κB activation, astroglial reactive phenotype and neurite reduction. These alterations, that correlate with the observed changes in animals exposed to the AS model by IH, were prevented by culture medium application of RAGE neutralizing antibodies as well as RAGE dominant negative overexpression delivered by a viral vector or the NF-κB and Akt pharmacological blockade. The manipulation of S100B levels was not so effective to reduce these alterations. Attending these results, we used the same approach to diminish neuro-glial alterations in the SA experimental model by IH in rodents. Thus, RAGE blockade with hipocampal administered neutralizing antibodies or the RAGE dominant negative delivered by a viral vector, as well as the pharmacological blockade of NF-κB were effective to diminish reactive gliosis and neuronal degeneration. These results suggest that RAGE and NF-κB would be involved in the neuronal alterations and reactive gliosis induced by SA. These signaling pathways would be interesting molecular targets for the development of neuroprotection strategies useful for SA treatment.

Caceres, Lucila Guadalupe. "Efectos de la radiación X neonatal sobre el hipocampo de rata. Estrategias de neuroprotección" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La radioterapia es un tratamiento utilizado en humanos como herramienta para eliminar células tumorales mediante el uso de radiaciones ionizantes; sin embargo, éstas también puede dañar tejidos sanos debido a la inducción de estrés oxidativo. Dada la alta radiosensibilidad del Sistema Nervioso Central en desarrollo, el objetivo del presente trabajo fue profundizar en el estudio de sus efectos sobre el hipocampo de animales jóvenes expuestos en el período neonatal. Más aún, el esclarecimiento del mecanismo de acción de la radiación ionizante podría permitir proponer intervenciones terapéuticas que prevengan sus efectos, siendo el 17β-estradiol una herramienta ideal por poseer múltiples mecanismos de acción neuroprotectora. Los resultados encontrados sugieren que los cambios observados en la memoria asociativa a P30 se deberían a modificaciones en el hipocampo a nivel molecular e histológico, siendo el sistema GABAérgico uno de los componentes afectados. Asimismo, la expresión de estas alteraciones en el animal joven ocurriría debido a cambios en la PKCβ1 a P15. Por otro lado, el tratamiento con estradiol fue capaz de prevenir la mayoría de los cambios inducidos por la radiación, permitiendo postular que ejercería su acción neuroprotectora tanto a través de un mecanismo antioxidante como de uno mediado por receptor. Por consiguiente, la vulnerabilidad del hipocampo frente a las radiaciones ionizantes podría prevenirse mediante el uso de fármacos que actúen mediante mecanismos semejantes al estradiol.

Abstract:
Radiation therapy is a widely used tool to kill tumor cells in humans through the use of ionizing radiations. Unfortunately, they can also damage healthy tissue by the induction of oxidative stress. Due to the high radiosensitivity of developing Central Nervous System, the aim of the present work was to search more comprehensively about its effects on the hippocampus of young animals exposed to radiation in the neonatal period. Indeed, the elucidation of the action mechanism of radiation would allow proposing therapeutic interventions to prevent its effects, being 17β -estradiol an ideal tool due to its multiple mechanisms of neuroprotection. Results obtained in the present work suggest that the changes observed in the associative memory at P30 could be related to hippocampal changes at the molecular and histological level, being the GABAergic system one of the components affected by the radiation. Furthermore, the expression of these alterations in the youth would occur due to changes in the PKCβ1 at P15. On the other hand, the treatment with estradiol was able to prevent most of the radiation-induced changes, allowing us to postulate that both an antioxidant and a receptor-mediated mechanism might underlie its neuroprotective action. Accordingly, the vulnerability of the hippocampus to ionizing radiation could be prevented by the use of drugs that exert similar neuroprotection mechanisms than 17β-estradiol.

Tkach, Mercedes. "Desarrollo de una inmunoterapia contra el cáncer de mama mediante el bloqueo de stat3 (proteína transductora de la señal y activadora de la transcripción 3)" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La proteína transductora y activadora de la transcripción 3 (STAT3) es un nodo de señalización para múltiples vías oncogénicas y se encuentra frecuentemente activada en diversos tipos de cánceres, incluyendo el de mama. Las evidencias experimentales y clínicas vinculan a los progestágenos con la carcinogénesis mamaria. Por ello, estudiamos la participación de los progestágenos en la activación de STAT3. En esta Tesis demostramos que los progestágenos inducen la fosforilación de STAT3 en el residuo serina 727 por medio de la activación de la vía c-Src/p42/p44 MAPK y que ésta fosforilación es necesaria para su completa activación transcripcional y para promover la proliferación tumoral mediada por progestágenos. Por otro lado, considerando que la inhibición de STAT3 en células tumorales induce la expresión de citoquinas y quimioquinas pro-inflamatorias, desarrollamos una inmunoterapia basada en la utilización de células de cáncer de mama que tienen inhibida la activación de STAT3 como inmunógeno. La administración de estas células en ratones indujo una respuesta anti-tumoral mediada por células T CD4+ y células NK citotóxicas que inhibió el crecimiento del tumor primario y la de sus metástasis. Además, la inhibición de la activación de STAT3 indujo un programa de senescencia celular, contribuyendo probablemente con su fenotipo inmunogénico. Los resultados expuestos demuestran el papel crítico de STAT3 en la tumorigénesis mamaria inducida por progestágenos y proporcionan las primeras evidencias preclínicas que la inhibición de STAT3 en células de cáncer de mama resulta en inmunoterapia eficaz contra el crecimiento tumoral.

Abstract:
Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is a signaling node of multiple oncogenic pathways and is therefore frequently activated in breast cancer. As experimental and clinical evidence reveals that progestins are key players in controlling mammary gland tumorigenesis, we studied STAT3 participation in this event. In this Thesis we demonstrate that progestins induce STAT3 phosphorylation at Ser727 residue which occurs via activation of c-Src/p42/p44 mitogen-activated protein kinase pathways and that this phosphorylation is required for full transcriptional activation and for progestin-dependent tumor growth. Moreover, considering that STAT3 inhibition in tumor cells induces the expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines, we proposed to apply Stat3-inhibited breast cancer cells as a source of immunogens to induce an antitumor immune response. Immunization with these cells inhibited wild-type tumor growth and metastasis in vivo in BALB/c mice through the activation of cellular immune responses involving CD4+ T cells and cytotoxic NK cells. Furthermore, inhibition of STAT3 activation induced a cellular senescence program, which probably contributes to the inmunogenic phenotype. The results presented here demonstrate the critical role of STAT3 in progestin-dependent mammary tumorigenesis and provide preclinical proof of concept that ablating STAT3 signaling in breast cancer cells results in an effective immunotherapy against breast cancer growth and metastasis.

Rinflerch, Adriana Raquel. "Investigación del rol de los ácidos disiálicos en el sistema nervioso central" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La neuroglicobiología es la disciplina que se ocupa de elucidar el rol de los glicanos en el sistema nervioso central (SNC). El ácido siálico o ácido Nacetilneuramínico es un monosacárido cargado negativamente con funciones importantes en el SNC. Fundamentalmente han sido estudiados los ácidos polisiálicos, a los que se ha atribuido un rol importante en la señalización y migración celular durante el desarrollo del SNC. Poco se ha investigado acerca de la ubicación y rol de los ácidos disiálicos (DiSia) en el SNC. Por este motivo, elegimos como objetivo de esta Tesis por un lado identificar la localización de los DiSia en el SNC en diferentes etapas del desarrollo postnatal de ratones y, por otra parte, elucidar la potencial función de estas moléculas en relación a la conducta. Inicialmente se determinaron la intensidad de expresión del epitope DiSia y la expresión de los genes de las sialiltrasferasas en distintas estructuras cerebrales de ratones C57BL/6, durante los estadios del desarrollo (neonato, adulto y senil). Si bien, los niveles del epitope DiSia y de ARNm de ST8SiaIII se mantienen constantes en el hipocampo, bulbo olfatorio y corteza, es interesante destacar que disminuyen en cerebelo gradualmente desde los estadios neonatales hasta los seniles. En una segunda etapa, con el fin de elucidar preliminarmente el potencial rol de la enzima ST8SiaIII en el cerebelo (donde se comporta diferencialmente), se inhibieron sus niveles postranscripcionalmente, mediante inyección estereotáxica de ARN de interferencia (ARNi). Se evaluó la conducta en la prueba de laberinto en T, relacionada con la correcta actividad cerebelosa. Los ratones en los que efectivamente se inhibió la transcripción de ST8Sia III durante los primeros días después del tratamiento mostraron bajo rendimiento en el laberinto en T (disminución de la alternancia entre brazos), sobre todo en edades más avanzadas. Estos resultados se corresponden con los cambios morfológicos observados histológicamente (degeneración del neuropilo), en el cerebelo de los animales transfectados. En esta tesis se presentan varios resultados originales: Si bien los DiSia se hallan distribuidos en forma equivalente en las diferentes estructuras estudiadas y en diferentes etapas de la vida, el cerebelo presenta una expresión diferencial tanto de ST8SiaIII como del epitope disialilado, siendo dicha expresión menor en los animales seniles. En el cerebelo la inhibición transitoria de ST8SiaIII y del epitope DiSia, en etapas tempranas del desarrollo, parecen corresponder con alteraciones morfológicas y conductuales. Estos resultados abren el camino a futuras líneas de investigación tanto de interés en ciencias básicas como en neurología clínica.

Abstract:
Neuroglycobiology is the field that aims to elucidate the role of the glycans in the central nervous system (CNS). The sialic acid or N-acetylneuraminic acid is a negatively charged monosaccharide with important functions in the CNS. Mainly, polysialic acids have been studied and an important role in cellular signaling and migration during the development of the CNS has been found. But, little is known about the location and function of disialic acids (DiSia) in the CNS. Taking this in consideration, the goals of this dissertation are, in one hand, to identify the location of the DiSia in the CNS during different stages of the postnatal development in mice, and on the other hand, elucidate the potential function of these molecules in relation to behavior. In the first place, the intensity of DiSia epitope expression and sialiltransferases gene expression in different brain regions of C57BL/6 mice, during different developmental stages (newborn, adult and senile) were determined. Even though, DiSia epitope and ST8SiaIII levels remain constant in the hippocampus, olfactory bulb and cortex, it is interesting to note that these levels gradually decrease in the cerebellum, from newborn to senile mice. In the second place, the aim was to elucidate the potential role of the ST8SiaIII enzyme in the cerebellum (where a differential expression was found). In this direction, ST8SiaIII levels were post-transcriptionally inhibited through a stereotaxic injection of interference RNA (RNAi). Behavior related to the cerebellum activity was evaluated in the T-maze. Mice, in which the transcription of ST8SiaIII was effectively inhibited, showed a reduced performance in the T-maze (decreased arms alternation) during the first days after treatment, but especially in advanced age. These results correlate with the morphological changes (neurophil degeneration) observed by histological techniques, in the cerebellum of transfected animals. The present dissertation has several new results: Even though DiSia have a constant distribution in the different brain regions and developmental stages, a differential expression of ST8SiaIII and of the disialidated epitope is present in the cerebellum, being that expression lower in senile animals. Temporal inhibition of ST8SiaIII and DiSia epitope in the cerebellum, in early developmental stages, seems to correlate with morphological and behavioral alterations. These results open the way to future lines of research in basic science as well as in clinical neurobiology.

Delfino, Cecilia María. "Virus de hepatitis B (HBV) y virus de hepatitis D (HDV) en Argentina: epidemiología molecular y variabilidad viral" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo principal de esta tesis fue estudiar la epidemiología molecular de la infección por HBV y HDV, determinar los genotipos y analizar la variabilidad genética de los aislamientos detectados en distintas poblaciones y regiones de Argentina. Se estudiaron donantes de sangre de Buenos Aires y Misiones, y Amerindios de cuatro comunidades originarias: Mbyá-guaraníes (Misiones), Kollas (Jujuy), Sagua-Huarpes (San Juan) y Wichis (Formosa). Las cifras de prevalencia para el HBsAg variaron de 0,2 a 0,73% para donantes y de 1,4 a 1,7% para originarios. El análisis filogenético de las secuencias de HBV determinó la circulación en ambas poblaciones de los subgenotipos A2, B2, C2, D3, D3/D6, F1b y F4. En las secuencias de HBV se detectaron mutaciones en regiones regulatorias asociadas a mayor severidad de la enfermedad hepática y en las proteínas del pre-Core (productoras de fenotipo e minus), del Core (dentro de los epítopes para linfocitos T), preS1-S2 (posiblemente asociadas a infección oculta por HBV), S (mutantes de escape a la respuesta inmune humoral), P (asociadas a resistencia antiviral) y X (implicadas en el desarrollo del hepatocarcinoma celular). Se describe por primera vez la circulación del genotipo 1 de HDV en donantes de sangre de Buenos Aires y en originarios de Misiones; con el interesante hallazgo de la detección de este virus en casos de infección oculta por HBV. Además, se identificaron mutaciones en el antígeno Delta que podrían justificar la no detección de anticuerpos anti-HDV (infección “oculta”) en estos casos.

Abstract:
The main objective of this thesis was to study the molecular epidemiology of HBV and HDV infection, to determine the genotypes and to analyze the genetic variability of the isolations detected in different populations and regions of Argentina. Blood donors from Buenos Aires and Misiones, and Amerindians from four original communities were studied: Mbyá-guaraníes (Misiones), Kollas (Jujuy), Sagua-Huarpes (San Juan) and Wichis (Formosa). The prevalence of HBsAg ranged from 0.2 to 0.73% in blood donors and from 1.4 to 1.7% for aborigines. The phylogenetic analysis of the HBV sequences revealed the circulation of A2, B2, C2, D3, D3/D6, F1b and F4 genotypes in both populations. In HBV sequences, mutations in the regulatory regions associated to more severe hepatic desease and in the pre-Core proteins (e minus producers), the Core (among the epitopes for T cells), preS1-S2 (possibly associated to occult HBV infection), S (escape mutants to the humoral immune response), P (associated to antiviral resistance) and X (implicated in the development of hepatocellular carcinoma). We describe for the first time the circulation of HDV genotype 1 among blood donors of Buenos Aires and aborigines of Misiones; only among those with occult HBV infection. Moreover, we identified mutations in the Delta antigen which could explain the non-detection anti-HDV antibodies (“occult” infection) in these cases.

Medina Pinzón, Luis Carlos. "Comparación de control de calidad de tratamientos de IMRT paciente específico mediante films radiocrómicos, films radiográficos y arreglo bidimensional de cámaras de ionización" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En los últimos años la utilización de técnicas de tratamientos radiante por modulación de intensidad (IMRT) ha ido creciendo hasta convertirse casi en un estándar en la Radioterapia moderna. La razón fundamental se basa en la posibilidad de obtener distribuciones de dosis más conformadas comparadas a técnicas conformadas 3D (CRT3D), aun en geometrías desfavorables, permitiendo una mayor protección de los tejidos sanos que circundan al tumor. El resultado de cada planificación produce como resultado un conjunto de complejos haces de intensidad modulada, que incluyen pequeños haces, irregulares y fuera de eje, donde es dificultoso predecir la dosis de cada uno. Estas características especiales de los haces obliga a que la fluencia de los mismos deban ser verificadas para garantizar que la dosis planificada a un paciente sea la que se desea entregar. En este trabajo se realizó una comparación del control de calidad de tratamientos de IMRT con MLC para distribuciones de dosis individuales y totales mediante film radiocrómicos, film radiográficos y arreglo bidimensional de cámaras de ionización en el Instituto de Radioterapia – Fundación Marie Curie, para tal fin se han implementado protocolos que abarcan la caracterización de los sistemas dosimétricos y evaluación de controles de calidad usando el criterio de análisis gamma para comparación de dosis medida y calculada registrando el número de píxeles con Y>1. Se analizaron 50 distribuciones de dosis del plan total con un criterio de análisis de 3% y un DTA 3mm (3%/3mm) y 50 campos individuales (5%/3mm) con los tres sistemas independiente y absoluta para cada plan empleando una cámara de ionización.

Abstract:
In the last years the use of Intensity Modulation Radiation Therapy (IMRT) techniques had grow until becoming almost in a standard on the modern Radiotherapy. The reason of this success is the possibility to obtain better conformation of dose distribution compared to 3D Conformal Radiation Therapy (3DCRT), even with unfavorable geometries, allowing better normal tissue sparing. The result of each planning produced as a result a set of complex beams intensity modulated beams, including small beams, irregular and off-axis, where it is difficult to predict the dose. These special features of the beams require that the fluence the same should be verified to ensure that the planned dose to a patient is the one you want to deliver. In this work, a comparison of quality control with MLC IMRT treatments for individual dose distributions and total dose distributions using film radiochromic, film radiography and 2D cell array at the Instituto de Radioterapia – Fundación Marie Curie, for this purpose protocols have been implemented that cover dosimetry systems characterization and quality control evaluation using the criteria the gamma index to doses compared to measured and calculated recording the number of pixels with Y>1. 50 plans analyzed dose distributions of total plan with criteria ranging from 3% of dose difference or 3mm of distance to agreement (3%/3mm), and single distribution (3%/5mm) with the three independent systems y the absolute dosimetry for each composite plan is performed using an ionization chamber.

Almejún, María Belén. "Evaluación de defectos intrínsecos de linfocito B en imunodeficiencia común variable pediátrica (IDCV)" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La inmunodeficiencia común variable (IDCV) es un síndrome heterogéneo que se caracteriza por producción defectuosa de inmunoglobulinas. Un defecto molecular en los estadios de diferenciación tardía de los linfocitos B, hasta el momento poco explorados en pacientes con IDCV, podría ser causal del desarrollo de la enfermedad dado que estas células pueden producirse normalmente en estos pacientes. Además, al ser la inmunodeficiencia primaria más frecuente, resulta un buen modelo experimental para el estudio de la biología del desarrollo terminal del linfocito B humano. Los resultados obtenidos en los ensayos funcionales que permiten evaluar los procesos fundamentales en la diferenciación tardía del linfocito B, SHM y CSR, así como el estudio de subpoblaciones B en sangre periférica de pacientes argentinos con IDCV de presentación pediátrica, nos permitieron definir subgrupos acotando los probables defectos genéticos a determinadas etapas de la regulación terminal del linfocito B. Por otro lado, el análisis en nuestros pacientes de la secuencia de TNFRSF13B, el gen que codifica para TACI, permitió la identificación de dos nuevas mutaciones. Entre ellas, S231R, la primera mutación descripta en el dominio citoplasmático altamente conservado del receptor (THC) específicamente en el sitio de unión a MyD88. Los experimentos llevados a cabo para evaluar funcionalmente la variante TACI-S231R demostraron que las células portadoras no logran desencadenar los eventos moleculares del CSR cuando se las estimula vía TACI y/o TLR9, incluyendo la secreción de inmunoglobulinas. Además, se observó que la cooperación entre TACI y el receptor CD40 estimulado en condiciones subóptimas se encuentra deteriorada. Por último, tras la estimulación con su ligando, el receptor TACI-S231R no logra colocalizar con MyD88 ni con TRAF2, proteínas esenciales para activar la cascada del CSR. Colectivamente estos resultados ponen de relieve la necesidad de un sitio de unión a MyD88 intacto para desencadenar el CSR mediado por TACI. En suma, este trabajo realiza un aporte al conocimiento de los eventos moleculares que suceden en el desarrollo y activación de los linfocitos B humanos y abre las puertas para la búsqueda de nuevos blancos genéticos implicados en el desarrollo de la enfermedad.

Abstract:
Common variable immunodeficiency (CVID) is a heterogeneous syndrome characterized by an impaired immunoglobulin production with usually normal B cell numbers in peripheral blood. The latter suggests that the molecular defect may be found in the late stages of B cell differentiation (SHM, CSR), so far unexplored in patients with CVID. Moreover, being the most prevalent primary immunodeficiency, it could be a good experimental model to study the terminal steps of the human B cell development. Actually, the results obtained in functional assays of SHM and CSR, and the study of B cell subpopulations in peripheral blood of pediatric Argentinean patients with CVID, allowed to discriminate different subgroups and approached possible genetic defects in their B lymphocytes. Furthermore, the sequence analysis of TNFRSF13B, the gene encoding TACI, led the identification of two novel mutations. Among them, S231R, the first mutation described in the highly conserved cytoplasmic domain of the receptor (THC) at the MyD88-specific binding site. The results obtained in the evaluation of the functional relevance of TACI-S231R variant, showed that the B cells failed to trigger the CSR related events (including the immunoglobulin secretion) when stimulated via TACI and/or TLR9. It was also noted an impaired APRIL-mediated enhancement of CD40 activation in suboptimal conditions. Finally, after stimulation with its ligand, the receptor TACI-S231R failed to colocalize with MyD88 nor with TRAF2, essential proteins to activate the CSR cascade. Collectively, these results highlight the requirement of an intact MyD88-binding site in TACI to trigger CSR. In summary, this work makes a contribution to the knowledge of the molecular events that occur in the differentiation and activation of human B lymphocytes and it provides a glimpse of possible pathways that lead to the discovery of new genetic factors involved in the onset of the disease.

Ferrando, María Mercedes Catalina. "HO-1 en la progresión ósea del cáncer de próstata" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por cáncer entre los hombres en Argentina. La angiogénesis es crucial para el crecimiento y progresión del PCa. El perfil de diseminación de estos tumores muestra tendencia a desarrollarse en el hueso como único sitio de progresión, donde las células tumorales interactúan con el microambiente interrumpiendo el equilibrio formación/degradación del hueso. Sin embargo, la naturaleza molecular de dicha interacción aún no se conoce completamente. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos que el aumento de expresión de hemo oxigenasa-1 (HO-1) en líneas de PCa disminuye su proliferación, invasión y migración in vitro y el crecimiento tumoral in vivo. En este trabajo de tesis nos propusimos estudiar el efecto de HO-1 sobre la angiogénesis y progresión del PCa. Comprobamos que la sobre-expresión de HO-1 en PC3 disminuye la expresión de genes pro-angiogénicos in vitro. Un ensayo de angiogénesis in vivo mostró que la inoculación intradérmica de las células con expresión estable de HO-1 (PC3HO-1), generaba tumores menos vascularizados, con reducida densidad de la microvasculatura e inmunomarcación disminuida de marcadores angiogénicos. Mediante un sistema de co-cultivo de células PC3 con cultivos primarios de osteoblastos de ratón (PMOs), comprobamos que la disminución de la proliferación de los PMOs inducida por las células tumorales, se restauraba cuando éstas fueron pre-tratadas con el inductor farmacológico de HO-1 (hemina). No se observaron alteraciones en la expresión de genes involucrados en la diferenciación y resorción ósea. Sin embargo, el tratamiento con hemina indujo DKK-1 en las células PC3 co-cultivadas y el estrés oxidativo y la vía de FoxO en los osteoblastos. Estos resultados se confirmaron utilizando explantes de calvarias. La inyección intra-ósea de PC3HO-1 produjo una robusta remodelación ósea. Mediante un microarray de tejidos derivados de metástasis de pacientes resistentes a la castración creciendo como xenotransplantes en ratones SCID se determinó que HO-1 presentaba inmunomarcación heterogénea. En conjunto, estos resultados demuestran que HO-1 es un factor clave para el control de la angiogénesis y altera el microambiente tumoral impactando sobre la progresión ósea del PCa.

Abstract:
Prostate cancer (PCa) is a leading cause of death among males. The switch to an angiogenic phenotype is known to be critical for its progression. PCa is dominated by complications arising from metastasis to the bone where the tumoral cells interact with the bone microenviroment impairing the balance between bone formation and degradation. However, the molecular nature of this interaction is not completely understood. Previous studies from our laboratory showed that heme oxygenase 1 (HO-1) expression decreased PCa cells proliferation, invasion and migration in vitro and decreased tumor growth in vivo. The goal of this thesis is to study the role of HO- 1 in PCa angiogenesis and progression. We demonstrated that pro-angiogenic genes were down-modulated in response to HO-1 over-expression in PC3 cells (PC3HO-1). An in vivo angiogenic assay showed that intradermic inoculation of PC3HO-1 cells generated tumors less vascularized, with decreased microvessel density and reduced expression of angiogenic markers. Using a co-culture system of PC3 cells with primary mouse osteoblasts (PMOs), we demonstrated that HO-1 pharmacological induction (hemin treatment) abrogated the diminution of PMOs proliferation induced by PCa cells. No changes were detected in the expression of genes involved in differentiation and bone resorption. However, co-culture of hemin pre-treated PC3 cells with PMOs induced DKK-1 expression in tumor cells and oxidative stress and FoxO signaling in osteoblasts. These findings were confirmed using a co-culture system of PCa cells with calvaria explants. In vivo bone injection of PC3HO-1 cells in the femur of SCID mice produced strong bone remodeling. Heterogeneous HO-1 immunoreactivity was detected in a tissue microarray of human prostate cancer metastasis from castrated resistant patients growing as xenografts in SCID mice. These results suggest that HO-1 is a key regulator of the angiogenic switch in PCa and has the potentiality to modify the bone micro-environment modulating PCa bone metastasis.

Tarelli, Rodolfo. "Estudio de efectos de estímulos inflamatorios periféricos sobre un modelo de enfermedad de Parkinson" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Enfermedad de Parkinson (EP) es una de las enfermedades neurodegenerativas de mayor incidencia en personas mayores de 65 años. Es de progresión lenta y su rasgo distintivo es la degeneración neuronal en la región de la sustancia nigra pars compacta (SN). Un hallazgo pato-fisiológico uniformemente observado tanto en modelos animales como en pacientes con EP es que la muerte de las neuronas de la SN se encuentra acompañada por activación de la microglía. Numerosa evidencia apunta a un efecto neurodegenerativo de la microglía activada, sin embargo, también se ha observado que la microglía podría tener efectos neuroprotectores, por ejemplo a través de la secreción de factores neurotróficos. Por lo tanto, el rol funcional de esta activación es aún un tema de amplio debate. En publicaciones previas de nuestro laboratorio hemos descripto una activación microglial atípica en la que la misma se encuentra parcialmente activada o “cebada” como consecuencia de la degeneración neuronal (Depino, Earl et al. 2003). En este estadío de activación atípica, las células son capaces de transcribir citoquinas proinflamatorias pero no de sintetizar la proteína en sí. Este concepto sugiere que una célula en estado cebado requeriría de un segundo estímulo menor al que requeriría una célula en reposo hasta quedar clásicamente activada. En esta tesis, hemos evaluado la hipótesis de que la inflamación pueda exacerbar la neurodegeneración en un modelo animal de EP (inyección de 6OHDA en el cuerpo estriado) con la consiguiente progresión de la enfermedad. Para ello, se procedió a la inyección endovenosa de un estímulo pro-inflamatorio periférico (Adenovector productor de interleuquina 1) a animales previamente denervados con la neurotoxina 6OHDA. El estímulo pro-inflamatorio fue capaz de exacerbar la neurodegeneración en progreso en la SN. Los efectos exacerbantes del estímulo inflamatorio fueron asociados con un aumento en la activación morfológica microglial y expresión de MHC clase II en superficie. Debido a que la patología se presenta en pacientes añosos y a que los cerebros de personas ancianas presentan microglía cebada (Cunningham, Konsman et al. 2002) realizamos el mismo diseño experimental en ratas ancianas. En este modelo, también, el estímulo pro-inflamatorio fue capaz de exacerbar la neurodegeneración presentando la microglía activación morfológica aumentada. Por otro lado, se estudiaron los mecanismos moleculares de la exacerbación de la neurodegeneración sobre un modelo de aumento de la inflamación con un estímulo pro inflamatorio en SN. Mediante la técnica de microarrays buscamos los genes candidatos a ser los responsables de estar participando en la exacerbación de muerte neuronal. Se encontraron genes diferencialmente expresados, cuatro de los cuales fueron validados técnicamente por RT-PCR en tiempo real. Esta tesis provee evidencia de los efectos perjudiciales de la inflamación en la progresión de la EP. Además, propone que las infecciones o inflamaciones podrían ser consideradas como un factor de riesgo en la exacerbación de la neurodegeneración en la EP. Así también, sugiere una asociación entre la activación de la microglía y los efectos neurotóxicos observados en la SN. Finalmente, propone candidatos a mediar estos efectos.

Abstract:
Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease in people over 65. It´s progression is slow and one of its distinctive features is the degeneration of neurons in the substantia nigra pars compacta (SN). A pathophysiological finding uniformly observed in both animal models and in patients with PD is that the death of SN neurons is accompanied by activation of microglia. Numerous evidence suggests a neurodegenerative role for activated microglia; however, microglia has also been shown to have neuroprotective effects. This may be through the secretion of neurotrophic factors. Therefore, the functional role of this activation is still a matter of intense debate. Previous publications from our laboratory have described an atypical microglial activation in which it is partially activated or "primed" as a result of neuronal degeneration (Depino, Earl et al. 2003). At this stage of atypical activation atypical cells are capable of pro-inflammatory cytokine transcription but not synthesis of the protein itself. This concept suggests that a primed microglial cell would require a smaller second stimulus to become classically activated when compared to the stimulus required for a resting microglial cell to achieve this same state. In this thesis, we evaluated the hypothesis that inflammation might exacerbate neurodegeneration in an animal model of PD (6OHDA injection into the striatum) with subsequent disease progression. To achieve this, we proceeded to the intravenous injection of a peripheral pro-inflammatory stimulus (interleukin 1 producing adenoviral vector) to previously denervated animals (with 6OHDA neurotoxin). The proinflammatory stimulus was able to exacerbate ongoing neurodegeneration in the SN. The inflammatory stimulus exacerbating effects were associated with an increased morphological microglial activation and surface expression of MHC class II. As PD is a disease in aging patients, and primed microglia is known to be an present in the elderly brain (Cunningham, Konsman et al. 2002), the same experimental design was carried out in aged rats. In this model, the pro-inflammatory stimulus was able to exacerbate neurodegeneration and morphological microglia activation also increased. In addition, we studied the molecular mechanisms of exacerbation of neurodegeneration on a model of augmented inflammation with a pro-inflammatory stimuli in the SN. Using microarray technology we looked for genes that might be candidates for being involved in the exacerbation of neuronal death. Differentially expressed genes were found, four of which were validated technically by RT-PCR in real time. This thesis provides evidence of the harmful effects of inflammation in the progression of PD. It also proposes that infections or inflammations could be considered as a risk factor in the exacerbation of neurodegeneration in PD. It also, suggests an association between the activation of microglia and the neurotoxic effects observed in the SN. Finally, it proposes candidates to mediate these effects.

Lelli, Sandra Marcela. "Cómo se altera el metabolismo y transporte de glucosa en porfiria experimental crónica y aguda. Una aproximación mecanística" (2013-02-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Este trabajo de Tesis fue realizado utilizando ratas Wistar como animales de experimentación y drogas tales como el hexaclorobenceno para inducir una porfiria crónica, y la 2-alil-2-isopropilacetamida junto con el 3´,5´-dietoxicarbonil-1,4- dihidrocolidina, para modelar una porfiria aguda. Se logró así relacionar ambas patologías modeladas con importantes alteraciones en diversos aspectos del metabolismo de los hidratos de carbono (rutas anabólicas y catabólicas del glucógeno, de la glucosa y su transporte), del metabolismo oxidativo (que lleva a la producción de especies reactivas de oxígeno, ROS), del triptófano (TRP) y de los glucocorticoides (GC) (niveles, síntesis y receptores), todos ellos campos que han sido muy poco estudiados en las porfirias. Se establecen además inter-relaciones e inter-regulaciones metabólicas y hormonales entre el metabolismo del hemo (que es donde las fallas generan la porfiria), los metabolismos recién mencionados, el de los GC y la insulina, con particular atención en la actividad de la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (PEPCK), enzima regulatoria clave de la gluconeogénesis. Así los disturbios hormonales y metabólicos encontrados en los modelos tanto de porfiria crónica como aguda, confluyen y dan cuenta de un descenso en la disponibilidad de glucosa en el hepatocito que modularía la porfiria, exacerbando la enzima regulatoria del camino del hemo, ALA-sintetasa. Por otro lado sustentarían el porqué del efecto benéfico de la administración de glucosa en la terapia de las porfirias, especialmente de la porfiria aguda, que es la más crítica y provoca un riesgo de vida. Asimismo, es de destacar el efecto benéfico de la melatonina, reportado en el presente trabajo, en los tres metabolismos investigados para la porfiria aguda. Así como la importante disrupción hormonal que se reporta a nivel de los GC tanto a nivel plasmático como en su síntesis adrenal y receptores hepáticos en el modelo crónico de porfiria cutanea tarda. También es mencionable la contribución de las ROS, TRP y GC al descenso de la PEPCK. Los resultados de esta Tesis tienen implicancias en el campo de la toxicología, medicina y de la química biológica.

Abstract:
This Thesis work was performed using Wistar rats as experimental animals and drugs such as hexachlorobenzene to induce chronic porphyria, and 2-allyl-2- isopropylacetamide combined with 3',5'-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine to model acute porphyria. Thus, both modeled pathologies were related with significant alterations in several aspects of carbohydrates metabolism (catabolic and anabolic pathways of glycogen, glucose and its transport), of oxidative metabolism (which leads to production of reactive oxygen species, ROS), of tryptophan (TRP) and glucocorticoids (GC) (levels, synthesis and receptor), all fields that have been very poorly studied in porphyrias. In addition, metabolic and hormonal inter-relations and inter-regulations were established between heme metabolism (where defects generate porphyria), the metabolisms above mentioned, that of GC and insulin, with particular attention on phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) activity, key regulatory enzyme of gluconeogenesis. Thus, hormonal and metabolic disturbances found in experimental models of both chronic and acute porphyria, converge and account for a decrease in the availability of glucose in the hepatocyte that would modulate the porphyria, exacerbating the regulatory enzyme of heme pathway, ALA-synthase. Furthermore they could explain why the beneficial effect of the glucose administration in the therapy of porphyrias, especially of acute porphyria, which is the most dangerous since it is a life-threatening disease. It is also noteworthy the beneficial effect of melatonin, observed in three metabolisms investigated in acute porphyria, here reported. Just as the important hormonal disruption found at the level of GC, both in plasma as well as in the adrenal synthesis and hepatic receptors in chronic model of porphyria cutanea tarda. Also worth of mentioning is the contribution of ROS, TRP and GC to the PEPCK decrease. The results of this Thesis have implications in fields of toxicology, medicine and biological chemistry.

Martinez Calejman, Camila. "Cambios morfológicos y funcionales en la corteza adrenal en un modelo animal de resistencia a la insulina inducida por la administración de una dieta rica en sacarosa" (2013-03-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La activación del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal ha sido ampliamente descripta tanto en pacientes como en modelos animales de insulinorresistencia (IR). Sin embargo, el efecto del desarrollo de este estado de IR sobre la función adrenal no ha sido dilucidado por completo. En este sentido, el objetivo del presente trabajo de tesis fue estudiar los cambios morfológicos y funcionales que ocurren en la glándula adrenal en animales con insulinorresistencia inducida por una dieta rica en sacarosa (DRS). Los animales del grupo DRS mostraron un mayor peso corporal y de sus depósitos lipídicos junto con una alteración en el perfil metabólico característica de la IR en la séptima semana de tratamiento. En cuanto a la función adrenal, estos animales presentaron mayores niveles basales de corticosterona circulantes y una respuesta disminuida al ACTH exógeno. En forma paralela observamos un aumento en los niveles de expresión de proteínas claves de la esteroidogénesis (StAR y CYP11A1) y una disminución en la expresión del receptor de ACTH (MC2R). Las glándulas adrenales del grupo DRS fueron más pequeñas y livianas que las de los correspondientes controles y mostraron un aumento en la infiltración lipídica con predominio de triglicéridos. Demostramos también que los animales alimentados con DRS desarrollan en forma local un estado inflamatorio evidenciado por el aumento en la expresión de citoquinas y marcadores proinflamatorios, en la actividad de NOS y en la expresión de COX-2. También observamos un incremento del sistema de HO-1, posiblemente como respuesta a la generación de estrés oxidativo en la corteza adrenal. La desregulación en la actividad de estos sistemas posiblemente también afecte la esteroidogénesis adrenal. Finalmente estudiamos el efecto de dos tratamientos insulinosensibilizadores. Tanto el tratamiento farmacológico como la implementación del protocolo de ejercicio lograron prevenir las alteraciones funcionales y morfológicas observadas en la corteza adrenal de los animales alimentados con DRS.

Abstract:
Studies performed both in humans and in animal models of insulin resistance (IR) show hyperactivation of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis. However, a possible direct effect of the IR state on the adrenal function has not been fully investigated. The aim of the present studies was to analyze morphological and functional changes arising in the adrenal cortex of adult Wistar male rats rendered insulin resistant by means of a sucrose rich diet (SRD). The SRD group showed an increase in body weight and lipid depots, as well as a characteristically altered metabolic profile at the seventh week of dietary treatment. At this time point, SRD animals showed elevated basal serum corticosterone concentrations, and a diminished response to ACTH injection. In parallel, higher expression levels of key proteins involved in steroidogenesis (StAR and CYP11A1), and a lower expression of the ACTH receptor (MC2R) were detected. Adrenal glands from the SRD group were smaller and lighter than those from the matching control group and showed an increased lipid infiltration. Animals fed a SRD also developed a local inflammatory state evidenced in the adrenal cortex by an increased cytokine and proinflammatory markers expression as well as an increase in NOS activity and in the expression of COX-2. We also detected an induction of the HO-1 system, possibly as a response to the oxidative stress generated within the adrenal cortex. Dysregulation of these systems may also affect adrenal steroidogenesis. Finally we studied the effect of two proven insulin-sensitizing treatments. Both therapies were able to prevent the morphological and functional changes observed in the adrenal cortex of the animals that received the SRD.

Losino, Noelia Ivana. "Las células madre pluripotentes son propagadas en un medio de cultivo novedoso que preserva sus propiedades fundamentales y aumenta su proliferación, asociada a la presencia de una isoforma de fibronectina que incluye el exón EDA" (2013-03-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células madre (CM) pluripotentes, entre ellas, las CM embrionarias (CME) y CM pluripotentes inducidas (CMPI) son capaces de propagarse indefinidamente en cultivo y de diferenciarse a todos los tipos celulares del organismo. Encontramos un medio de cultivo que permite su propagación, preservando sus propiedades básicas, evaluadas por análisis de expresión de marcadores y diferenciación in vitro e in vivo; y aumentando paralelamente su proliferación. Este medio es condicionado por una línea celular de granulosa bovina, mitogénico sobre otros tipos celulares, adjudicándose dicho efecto a la fibronectina (FN) que incluye el exón EDA (FN+EDA). En este contexto, decidimos analizar si esta isoforma de FN aumenta la proliferación de las CME. Estudiamos los niveles de proliferación de las CME en presencia de EDA exógeno, mediante dos estrategias. Utilizamos medios condicionados por líneas de fibroblastos embrionarios de ratón genéticamente modificadas, que secretan sólo FN+EDA, FN sin EDA o ambas isoformas. Por otra parte, evaluamos el efecto de un péptido correspondiente a una porción de FN que incluye o no dicho exón. En todos los casos, observamos que la presencia de este dominio produjo un aumento en la proliferación en CME de ratón y humanas, evaluada por MTT, cristal violeta y ensayos de sanado de herida. Esperamos que nuestros hallazgos contribuyan al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la proliferación de CM y a la optimización de sus condiciones de cultivo.

Abstract:
Pluripotent stem cells, which include Embryonic Stem Cells (ESC) and induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) can be propagated indefinitely in culture and are able to differentiate into all cell types of the organism. We found a culture medium that allows their propagation, preserving their basic properties, evaluated by analysis of marker gene expression and in vitro and in vivo differentiation protocols. This medium also increased pluripotent stem cell's proliferation. This is a medium conditioned by a bovine granulosa cell line, previously reported to be mitogenic for other cell types, ascribing this effect to fibronectin (FN) containing EDA exon (FN+EDA). In this context, we decided to study if this FN isoform increases the proliferative rate of ESC. We studied the mitogenic effect on ESCs in the presence of exogenous EDA, by two strategies. We used conditioned media from genetically modified lines of mouse embryonic fibroblasts that secrete only FN+EDA, FN without EDA or both isoforms. Furthermore, we evaluated the effect of a peptide corresponding to a portion of FN comprising or not EDA exon. In all cases, we observed that the presence of this domain resulted in an increase in the proliferation rate of both mouse and human ESC, assessed by MTT, crystal violet, and wound healing assays. We hope that our findings contribute to the understanding of the molecular mechanisms involved in the proliferation of pluripotent stem cells and optimization of culture conditions.

Otero, Constanza. "Respuesta inmune al Streptococcus pneumoniae en pacientes con Asma y pacientes con deficiencia específica de respuesta a antígenos polisacáridos" (2013-04-08) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Durante años se ha considerado que la defensa inmune frente al Streptococcus (S.) pneumoniae (Spn) depende de anticuerpos anticapsulares, que protegen frente a la infección invasiva y a la colonización por este microorganismo. Sin embargo, la inmunidad adaptativa puede ser importante para generar memoria celular frente a la bacteria. Algunas patologías de la infancia como el asma atópico y la deficiencia específica de anticuerpos frente a antígenos polisacáridos (SPAD), parecen predisponer a un riesgo mayor de infección por Spn. Estudiamos la respuesta inmune al Spn en estos pacientes y en individuos sanos (S) en edades pediátricas. En los pacientes asmáticos (A) se observó una tendencia a una menor expresión de CD69 en linfocitos T (LT) convencionales y LTγδ frente al estímulo con Spn. Los LT CD8+ mostraron un aumento en la expresión de CD25 solo frente al estímulo con Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en las células de los A y no en los S. Para evaluar la respuesta Th1 se midieron los niveles de IFN‐γ frente a Spn y a Mtb, encontrándose muy elevados en los A. Al estudiar los pacientes SPAD (P), encontramos varias diferencias en las subpoblaciones de monocitos (Mo) y LT con respecto a los S. Observamos que los Mo CD14++CD16+, se encuentran en proporciones alteradas con respecto a los S a distintas edades, lo que podría relacionarse con una menor capacidad de respuesta T, dado que frente al neumococo los Mo modulan la diferenciación de LT hacia los perfiles Th1 y Th17. La expresión temprana de CD69 en los LT previene la diferenciación hacia el perfil Th17. En los P, los LT CD69+ y LTCD8+CD25+ se vieron disminuidos con respecto a los S, aún con Mtb, evidenciando alteraciones en su capacidad de respuesta celular. Creemos que nuestro reporte de alteraciones en los P puede ser útil en la búsqueda de otros métodos diagnósticos. Consideramos que deben evaluarse en los Mo las vías de señalización necesarias para activar a las células presentadoras de antígeno frente al neumococo, encargadas de modular la respuesta T en condiciones normales. Esto podría contribuir a identificar la base molecular de la inmunodeficiencia SPAD, aún desconocida.

Abstract:
The immune defense against Streptococcus (S.) pneumoniae (Spn) was considered dependent on capsular antibodies that provide protection against invasive infection and colonization by this microorganism. However, adaptive immunity may be important in the generation of cellular memory against this pathogen. Some childhood diseases like atopic asthma and specific polysaccharide antibody deficiency (SPAD) seem to be associated to a higher risk of infection with Spn. We studied the immune response to Spn in these patients and in healthy children (H). In asthmatic patients (A) we observed a reduced expression of CD69 in conventional T lymphocytes (T cells) and γδ T cells with Spn. The CD8 + T cells from A showed an increased expression of CD25 only with Mycobacterium tuberculosis (Mtb), when compared to healthy individuals. As a measure of Th1 response, we evaluated the IFN‐γ production after stimulating cells from A and H with the bacterial antigens. We found high levels of this cytokine in both groups. When we studied SPAD patients (S), we found several differences in monocyte (Mo) subpopulations and in T cells, which had never before been described. We observed that in S the proportion of CD16+CD14++ Mo at different ages was altered when compared to healthy individuals. This could be correlated to a decreased T cell responsiveness, since it was described that Mo modulate T cell response towards a Th1 or a Th17 profile, in the defense against Spn. Early up regulation of CD69 in T cells prevents them from generating a Th17 response. In S we observed that the expression of both CD69 and CD25 was reduced when compared to H. We also found lower percentages of CD8+ activated T cells, even with Mtb, suggesting alterations in the T cell response capacity of S. We believe that the alterations in leukocyte populations we report here can be useful to find new diagnostic methods for S. The necessary signaling pathways activate after Spn recognition in Mo ‐ that will result in a correct antigen presentation to T cells ‐ must be studied in normal conditions. This could also contribute to identify the molecular basis of the SPAD immunodeficiency, still unknown.

Murta, Veronica. "Estudio de estímulos pro-inflamatorios secundarios sobre una lesión desmielinizante en un modelo de inflamación crónica asociado a esclerosis múltiple" (2013-08-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La esclerosis múltiple (EM) es un desorden inflamatorio autoinmune del sistema nervioso central, caracterizado por desmielinización, inflamación y pérdida axonal. La etiología de la enfermedad es aún desconocida, pero muchos trabajos en modelos animales han puesto en evidencia un rol importante de la neuroinflamación en su patogénesis y progresión. La mayoría de los pacientes presentan episodios de recaídas y remisiones. A medida que la enfermedad evoluciona el proceso de remielinización comienza a fallar, lo cual resulta en la eventual pérdida de funciones en los pacientes. El rol de la inflamación en la regeneración de la mielina es aún incierto. Considerando la heterogeneidad y complejidad que presenta la EM es importante generar modelos apropiados que recapitulen la enfermedad, pero también otros modelos de estudios más sencillos que faciliten la comprensión de los mecanismos involucrados. En la presente tesis nos propusimos estudiar el efecto de estímulos inflamatorios repetidos mediante la reinyección de un estímulo pro-inflamatorio crónico, en eventos similares a episodios de recaída. También nos propusimos estudiar la influencia de inflamaciones periféricas sobre las lesiones desmielinizantes en el SNC. Para ello utilizamos un adenovector que expresa interleuquina 1β en forma crónica. Hemos demostrado que la respuesta a un estímulo central secundario varia dependiendo de si la lesión primaria está activa o no. Así, la presencia de una lesión inflamatoria central aún activa disminuye la respuesta a un estímulo pro-inflamatorio secundario dentro del SNC. Sin embargo, esta repuesta secundaria disminuida no se observa cuando el segundo estímulo se aplica con la lesión primaria completamente recuperada. Por otro lado, un estímulo pro-inflamatorio proveniente de la periferia recrudece la respuesta inflamatoria central previa, incluso cuando la BHE se encuentra intacta. Los estímulos inflamatorios, tanto centrales como periféricos, deberían ser considerados como factores de riesgo al momento de estudiar la etiología y progresión de la EM. Una mejor comprensión de los mecanismos que intervienen en la recaída/remisión, y de la influencia de infecciones periféricas sobre la misma colaboraría con la identificación y el desarrollo de nuevas terapias para un mejor tratamiento de la EM.

Abstract:
Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune inflammatory disorder of the central nervous system characterized by demyelination, inflammation and axonal damage. The etiology of the disease is still unknown, but many studies have shown a role of neuroinflammation in the pathogenesis and progression of MS. Throughout the development of the disease most patients present relapsing and remitting episodes, while others progress to a chronic stage. The role of inflammation in myelin regeneration is still uncertain. As the disease progresses remyelination fails, resulting in the eventual loss of function in patients. It is as important to generate appropriate models that recapitulate the disease, as well as other more simplistic ones that facilitate the understanding of the mechanisms involved. There are few suitable models for the study of demyelination as a result of chronic inflammation. In this thesis we studied the effect or repeated inflammatory demyelinating events by re-injecting a chronic pro-inflammatory stimulus, thus mimicking the relapsing-remitting episodes of MS. We also studied the influence of peripheral inflammation on these phenomena in the CNS. For the generation of the chronic inflammatory event we used an adenovector expressing interleukin-1β. We have shown that the response to a secondary central stimulus varies depending on whether the primary lesion is still active or not: The presence of a previous active injury decreases the response to the second pro-inflammatory stimuli within the CNS. However, this secondary response does not change when the primary lesion is completely recovered. Furthermore, pro-inflammatory stimuli from the periphery exacerbate the central lesion. Inflammatory stimuli, both central and peripheral, should be considered as risk factors when studying the etiology and progression of MS.

Tironi Farinati, Alicia Carla Flavia. "Acción de la toxina Shiga 2 producida por Escherichia coli enterohemorrágica en el Sistema Nervioso" (2013-08-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La toxina Shiga 2 (Stx2) producida por Escherichia coli enterohemorrágica es la principal causa de diarrea asociada a síndrome urémico hemolítico e insuficiencia renal. El 30 % de la población infantil que sufre SUH padece alteraciones en el sistema nervioso central (SNC). Nos propusimos determinar la expresión del receptor Gb3, el cual produce la entrada de la toxina en las células que lo poseen, en condiciones normales y luego de la administración intracerebroventricular de Stx2 en cerebros de roedores. Observamos que el receptor Gb3 se expresa en neuronas y aumenta con la administración local de Stx2. La interacción Gb3-Stx2 en neuronas podría contribuir al daño producido por las encefalopatías derivadas del SUH en niños intoxicados por ingestión de productos contaminados por E. coli enterohemorrágica. También caracterizamos el efecto de dosis subletales de Stx2 (dsStx2) administrada vía intravenosa por ultraestructura que se correlacionó con tests de comportamiento por primera vez. Este modelo translacional nos fue útil para determinar que dosis subletales de la toxina son capaces de generar un daño cronológico significativo de eventos en cerebros de ratones, que podría explicar las lesiones neurológicas que remiten o resultan ser permanentes en pacientes intoxicados. Un significativo edema perivascular se observó luego de 2 días de la administración sistémica de Stx2, daño en astrocitos a los 4 días, y en neuronas y oligodendrocitos luego de 8 días. También fue importante encontrar extravasación de mastocitos y sinapsis interrumpidas. Finalmente el tratamiento de la Dexametasona, un antiinflamatorio, el Lactobacillus Plantarum, y/o anticuerpos anti-Stx2 logran neutralizar la acción de Stx2. Estos estudios servirán como antecedentes para desentrañar a futuro los mecanismos celulares y moleculares involucrados en los procesos neuropatológicos durante la fase aguda de la intoxicación. En base a este conocimiento, agentes terapéuticos pueden ser utilizados para neutralizar la Stx2 a nivel central.

Abstract:
Shiga toxin (Stx2) produced by Escherichia coli enterohemorragic is the main cause of diarrhea associated to the hemolytic uremic syndrome. 30% of the child population that suffers from HUS shows alterations in the central neurosystem (CNS). We observed that Stx2’s receptor Gb3 is expressed in neurons and it’s expression is upregulated after the administration of Stx2. The Gb3-Stx2 interaction in neurons could contribute to the damage produced by HUS derived encephalopaties in children. We also studied the effect of the sub lethal doses of Stx2 administrated endovenously and for first time we found comportamental changes in mice. This translational model was useful to determine that sublethal doses of Stx2 are able to produce a significative chronologic damage in the mice brain, that might explain the neuropatological lesions that occurs in intoxicated patients. Two days after the administration of Stx2 we observed perivascular edema, astrocitary damage at the 4th day and damage in neurons and oligodendrocites at the 8th day. Another important discovery was to found tripartite synapses and mastocyte extravasation. Finally a treatment with Dexamethasone, an antiinflamatory, the Lactobacillus Plantarum, and/or antibodies anti-Stx2 neutralize the action of Stx2. These studies will serve as antecedents to unveil the cell and molecular mechanisms involved in the neuropathologic processes during the acute phase of the intoxication. Based on this knowledge, therapeutic agents can be used to neutralize Stx2 at central level.

Sterle, Helena Andrea. "Modulación in vivo del desarrollo y evolución de linfomas T por el estado tiroideo" (2013-10-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las hormonas tiroideas (HTs) son importantes reguladoras de la respuesta inmune, pero su participación en el desarrollo tumoral es controversial. El objetivo de este trabajo fue estudiar la modulación de las HTs sobre el comportamiento biológico y evolución del linfoma T EL-4 creciendo in vivo en ratones singeneicos eu- (controles), hiper- (hiper) o hipotiroideos (hipo). El tratamiento de las células EL-4 in vitro con HTs indujo un aumento en la proliferación y cambios en los niveles de expresión de reguladores del ciclo celular a tiempos cortos, pero llevó a la apoptosis a tiempos más largos de cultivo. La inoculación de las células EL-4 en animales hiper desarrolló tumores sólidos de mayor volumen que el de los Controles, pero los hipo presentaron un mayor número de metástasis. Adicionalmente, los tumores hiper mostraron un aumento en los niveles de expresión de ciclinas, mientras que en los hipo encontramos niveles incrementados de p16, p27 y p53. Los tumores hiper también exhibieron mayor angiogénesis por inmunohistoquímica y una expresión aumentada de metaloproteasas, por qRT-PCR, junto con incrementada apoptosis. Por otra parte, los ratones hiper mostraron un menor infiltrado linfocitario tumoral, compuesto por un menor porcentaje de linfocitos CD8+ que los ratones control. Por otra parte, los bazos de estos animales presentaron una aumentada proporción y actividad de células NK, junto con un menor porcentaje de células supresoras de origen mieloide. Los ratones hipo, sin embargo, mostraron una reducción en la actividad citotóxica específica contra células tumorales. Nuestros resultados sugieren que el estado tiroideo es capaz de modular el crecimiento tumoral a través de mecanismos que involucran la regulación de proteínas relacionadas con la progresión y/o arresto del ciclo celular y de la angiogénesis, y a través del control de la respuesta inmune antitumoral que puede limitar su diseminación.

Abstract:
Thyroid hormones (THs) are important regulators of immune response, but their role in tumor development is still controversial. The aim of this work was to evaluate THs involvement in the biological behavior and evolution of the EL-4 T lymphoma, growing in vivo in singeneic eu- (controls), hyper- (hyper) or hypothyroid (hypo) mice. The in vitro treatment of EL-4 cells for short periods of time with THs increased cell proliferation and led to changes in the expression of cell cycle regulators. However, longer treatment with THs induced apoptosis in these cells. Hyperthyroid mice that were inoculated with EL-4 cells showed an increased solid tumor volume compared to controls, while hypo exhibited a higher number of metastases. These results were associated with an increment in the expression of cyclins in hyper tumors, and higher levels of p16, p27 and p53 in tumors from hypo mice. An immunohistochemical analysis of tumor sections demonstrated an increased angiogenesis in hyper tumors, which was accompanied with an augmented expression of metalloproteases, measured by qRT-PCR, and an increased apoptosis. Furthermore, a lower number of tumor infiltrating lymphocytes was found in hyper mice, which was comprised of a decreased percentage of CD8+ lymphocytes compared to controls. However, the spleens obtained from these animals showed an increased proportion and activity of NK cells, together with a diminished percentage of tumor derived suppressor cells. Hypo mice, on the other hand, displayed a reduced tumor-specific cytotoxic activity. Our results suggest that thyroid status can directly modulate tumor development through the regulation of proteins that are involved with the cell cycle progression and/or arrest and through the regulation of angiogenesis. Together with this, thyroid status can also regulate tumor dissemination as a result of the modulation of the anti-tumor immune response.

Granata, Bárbara Xoana. "Porfirias hepáticas agudas : Relación con el estrés oxidativo y patologías asociadas" (2013-12-09) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las porfirias son desórdenes metabólicos causados por la deficiencia parcial primaria de alguna de las enzimas involucradas en el camino de biosíntesis del grupo hemo. En particular, las Porfirias Hepáticas Agudas, comprenden la Nueva Porfiria Aguda (NPA), Porfiria Aguda Intermitente (PAI), la Coproporfiria Hereditaria (CPH), y la Porfiria Variegata (PV). Individuos con estas patologías padecen ataques neuroviscerales. Por otra parte, en PV y CPH pueden aparecer además síntomas cutáneos. En cuanto a la naturaleza del ataque porfirico, si bien no se conoce exactamente el mecanismo por el cual se generan los disturbios neurológicos, se sabe que el precursor neurotóxico ALA puede autooxidarse generando ROS. Siendo estas enfermedades genéticas, se describieron diversas mutaciones en los genes que codifican las enzimas deficientes. En este trabajo nos focalizamos en el estudio molecular de la PV y diagnosticamos, mediante PCR y secuenciación automática, 10 nuevas familias Argentinas a nivel molecular. Encontramos 5 mutaciones nuevas en la literatura mundial y otras 5 previamente descriptas. Estas familias, sumadas a las anteriormente diagnosticadas en el CIPYP, elevan el total de familias Argentinas PV a 36. Comparamos los tipos de mutaciones con el tipo de sintomatología en todas las familias, con el objeto de hallar alguna correlación entre dichos parámetros. Sin embargo, como ocurre en la mayoría de las poblaciones, no pudimos establecer una relación genotipofenotipo en nuestros pacientes. Con el objetivo de comprobar que la alteración genética presente en cada paciente es efectivamente la causante de la patología, procedimos con la caracterización funcional de las mutaciones nuevas. Empleando un sistema de expresión procariotico en el caso de las mutaciones missense y un sistema de minigenes en el caso de mutaciones de splicing, pudimos corroborar que las primeras reducen la actividad enzimática de la PPOX y que las segundas provocan la exclusión del exón afectado durante el procesamiento del ARNm de este gen. Las porfirias son patologías genéticamente heterogéneas y cada mutación es privativa de una o a lo sumo dos familias. En nuestro país se destaca la mutación c.1.042_1.043insT, dado que no sólo fue descripta únicamente en Argentina, sino que también está presente en el 40% de las familias diagnosticadas genéticamente. De esta forma, hipotetizamos la posible existencia de un ancestro común para la mutación en nuestra población y en función de ésta realizamos un análisis de haplotipos basado en microsatélites o STRs. Encontramos un haplotipo común a todos los pacientes portadores de la mutación en cuestión, el cual es significativamente diferente al de los controles y de otros pacientes PV. Así concluimos que existe un efecto fundador en nuestra población para esta mutación en particular. Por último, teniendo en cuenta la relación existente entre el ataque porfirico y el estrés oxidativo, nos propusimos estudiar parámetros de estrés oxidativo en pacientes y controles, con el fin de identificar algún marcador de la disfunción neurológica. Los resultados obtenidos no son concluyentes dado que el número de individuos analizados es aún bajo y además porque se trata de pacientes controlados y/o en tratamiento, cuyo sistema de defensa antioxidante ya logró, probablemente, adaptarse al cuadro porfirico.

Abstract:
The porphyrias are a group of metabolic disorders caused by the partial deficiency of one of the enzymes involved in the heme biosynthetic pathway. Particularly, acute hepatic porphyrias comprise ALA-D Deficiency Porphyria (ADP), Acute Intermittent Porphyria (AIP), Hereditary Coproporphyria (HCP), and Variegate Porphyria (VP). Individuals with these conditions suffer neurovisceral attacks. Moreover, in VP and HCP cutaneous symptoms may also appear. Regarding the nature of the porphyric attack, although the mechanism by which neurological disturbances are produced is not well characterized, it is known that the neurotoxic precursor ALA may oxidize itself resulting in the formation of ROS. As these diseases are genetic, various mutations in the genes that are responsible of each porphyria have been described. We focused on the genetic study of VP and we diagnosed, by means of PCR and automated sequencing, 10 new Argentinean families at the molecular level. We found five novel mutations in the literature and another 5 previously described. These families, together with those previously diagnosed at the CIPYP, bring the total up to 36 Argentinean VP families. We compared the types of mutations with the type of symptom in all of these families, in order to find a correlation between these parameters. However, as in most populations, we could not establish a genotype-phenotype relationship in our patients. Aiming to ensure that the genetic alteration present in each patient is indeed the cause of the pathology we performed the functional characterization of the novel mutations. Using a prokaryotic expression system in the case of missense mutations and a minigene system in the case of splicing mutations, we describe the first ones reduce PPOX enzymatic activity and the second ones lead to the exclusion of the affected exon during the mRNA processing of this gene. The porphyrias are genetically heterogeneous diseases and each mutation is exclusive to one or two families. Among the mutations responsible for VP, in our country c.1.042_1.043insT stands out, since it was described only in Argentina and is present in 40% of genetically diagnosed families. Thus, we hypothesized the possible existence of a common ancestor for the mutation in our population and thus we conducted a study based on microsatellite haplotypes or STRs haplotypes. We found a common haplotype in all of the patients carrying the mutation, which is significantly different from controls and other PV patients. Therefore we conclude that there is a founder effect in our population for this particular mutation. Finally, taking into account the relationship between the porphyric attack and oxidative stress, we decided to study oxidative stress parameters in patients and controls, in order to identify a marker of neurological dysfunction. Results obtained in this work were not conclusive since the number of individuals analyzed is still low and because the patients are either controlled or treated so their antioxidant defense system is probably adapted to the pathology.

Raffo, Diego Alejandro. "Terapia endócrina y enriquecimiento en células con propiedades "stem" de cáncer de mama: implicancias para la respuesta a la terapia" (2013-12-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El 75% de los tumores de mama son positivos para receptores de estrógeno y progesterona y el tamoxifeno es la terapia más utilizada. Se propone que las células stem podrían ser iniciadoras de tumores y que tendrían una menor susceptibilidad a la quimio y radioterapia. El objetivo fue estudiar el efecto del tamoxifeno y de los elementos del microambiente tumoral sobre las poblaciones con propiedades stem y los mecanismos involucrados utilizando las líneas LMO5-E murina y MCF-7 humana in vitro y el tumor M05 in vivo. Se realizaron ensayos de mamoesferas, de actividad de la enzima ALDH1 y clonogénicos para estudiar a las células con propiedades stem y también se evaluó el crecimiento de los tumores in vivo y de las líneas in vitro y su expresión génica y proteica. Se observó que el tamoxifeno llevó a un enriquecimiento de células con propiedades stem in vivo e in vitro y que estos cambios perduraron luego de finalizado el tratamiento. Los elementos del microambiente tumoral redujeron la proporción de células con estas propiedades probablemente induciendo su diferenciación. De los resultados podemos concluir que el tamoxifeno podría llevar a un enriquecimiento de células con propiedades stem el cual podría ser responsable de las recurrencias observadas luego de la finalización del tratamiento apoyando los estudios que indican que prolongar el tratamiento a 10 años es más efectivo.

Abstract:
Seventy-five percent of breast tumors are positive for estrogen and progesterone receptors and tamoxifen is the therapy of choice. It has been proposed that stem cells could be tumor initiating cells and are more resistant to radio and chemotherapy. The aim of this work was to study the effect of tamoxifen and tumor microenvironmental factors on the proportion of cells with stem cells properties, and the mechanisms involved. To do so we used the LM05-E murine cell line and MCF-7 human cell line in vitro and the M05 tumor in vivo. Mammospheres, ALDH1 and clonogenic assays were performed in order to study cells with stem cell properties. In addition, tumor growth, cell line proliferation and genes and protein expression were studied. Tamoxifen led to an enrichment in cells with stem cell properties both in vivo and in vitro and this enrichment was maintained even after treatment was removed. Microenvironmental elements led to a reduction of cells with stem cells properties, probably due to an induction of differentiation of these cells. From these results we can conclude that endocrine therapy could lead to an enrichment of cells with stem cells properties that would be responsible for late recurrences observed after treatment interruption, supporting studies that indicate that ten-year treatment with tamoxifen is a better clinical alternative.

Nannini, Paula Romina. "Efecto de la fludarabina en la sobrevida y funcionalidad de los linfocitos T de pacientes con leucemia linfática crónica: posibles implicancias en la falla terapéutica de la enfermedad" (2013-12-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La leucemia linfática crónica (LLC) se caracteriza por la acumulación de linfocitos B (LB) clonales en sangre periférica y órganos linfáticos. La fludarabina es uno de los principales agentes quimioterápicos empleados para su tratamiento y posee claros efectos inmunomoduladores más allá de su tradicional capacidad citotóxica sobre los linfocitos. En la actualidad, la LLC continúa siendo una enfermedad incurable ya que las células leucémicas logran sobrevivir a los efectos pro-apoptóticos de la quimioterapia en los tejidos linfoides. Allí, proliferan en estructuras anatómicas denominadas centros proliferantes (CP) en contacto con linfocitos T (LT) activados, células estromales y células de tipo nodriza (NLC) que les brindan señales indispensables para su acumulación. El objetivo de este trabajo de Tesis fue estudiar los mecanismos que podrían estar involucrados en la falla terapéutica de los pacientes con LLC, centrándonos en el efecto de la fludarabina y el microambiente tumoral en la sobrevida y funcionalidad de los LT de los pacientes. Encontramos que las NLC autólogas protegen a los LT de la apoptosis espontánea e inducida por fludarabina, y que ésta droga es capaz de incrementar la activación y proliferación de los mismos. Estos hallazgos sugieren que luego del tratamiento con fludarabina, algunos LT podrán sobrevivir a sus efectos pro-apoptóticos en los CP en parte gracias a la presencia de las NLC. Dado que los LT brindan señales claves para la acumulación del clon leucémico, la mayor proliferación y activación que poseen luego del tratamiento con la droga podría contribuir a la expansión de las células LLC que han sobrevivido, con la consecuente recaída del paciente. Palabras claves: LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA; FLUDARABINA; LINFOCITOS T; CÉLULAS DE TIPO NODRIZA; MICROAMBIENTE TUMORAL.

Abstract:
Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is characterized by the accumulation of clonal B lymphocytes in peripheral blood and lymphoid organs. Fludarabine is one of the main chemotherapeutic agents employed in the treatment of CLL and it exerts clear immunomodulatory actions besides its traditional cytotoxic effects on lymphocytes. There is still no cure for CLL patients as leukemic cells can overcome the pro-apoptotic actions of chemotherapy in lymphoid tissues within proliferation centers (PC). In these sites, CLL cells are in close contact with activated T lymphocytes (TL), stromal cells and nurse like cells (NLC) which support leukemic cells accumulation through survival and proliferation signals. The aim of this Thesis was to study the mechanisms that could be involved in the therapeutic failure of CLL patients, focusing on the effect of fludarabine and the tumor microenvironment in the survival and functionality of TL. We found that autologus NLC protect TL from spontaneous and fludarabine-induced apoptosis, and that this drug enhances activation and proliferation of TL from CLL patients. These findings suggest that after fludarabine treatment TL could survive in PC, at least in part, due to the presence of NLC. Considering that TL provide key survival signals that support CLL cells accumulation, fludarabine enhancement of TL proliferation and activation would contribute to the expansion of surviving leukemic cells, favoring the relapse of disease. Key words: CHRONIC LYMPHOCYTYC LEUKEMIA, FLUDARABINE, T LYMPHOCYTES, NURSE LIKE CELLS, TUMOR MICROENVIRONMENT.

Polo, María Laura. "Caracterización de los mecanismos celulares involucrados en la regresión tumoral según la dependencia hormonal de los tumores mamarios" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las similitudes morfológicas y fenotípicas entre los carcinomas mamarios más frecuentes en mujeres (carcinomas ductales, positivos para los receptores de estrógenos (ER) y progesterona (PR)), y el modelo de carcinomas mamarios murinos inducidos con acetato de medroxiprogesterona (MPA), hacen de este modelo una herramienta útil para estudiar los mecanismos celulares asociados al tratamiento antitumoral con agentes endocrinos (antagonistas del ER y PR), e inhibidores de quinasas, entre otros. En este trabajo de Tesis hemos evaluado en el modelo de carcinomas mamarios inducidos con MPA, mecanismos tempranos de regresión tumoral asociados al tratamiento endocrino con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) y el inhibidor de PI3K wortmanin (WORT). En vista de la evidencia clínica actual, que demuestra que la combinación de agentes endocrinos e inhibidores de la vía PI3K/Akt resulta beneficiosa para el tratamiento adyuvante de pacientes con tumores ER y PR positivos, y de los estudios que señalan a los antiprogestágenos como una terapia válida para el tratamiento del cáncer de mama, creemos que este trabajo resulta valioso ya que constituye el primer estudio realizado en un modelo experimental de cáncer de mama en donde se evalúan los efectos de la terapia combinada de antiprogestágenos e inhibidores de PI3K. Analizando variantes tumorales que representan distintos estadios dentro de la progresión del cáncer de mama (desde la hormono-dependencia a la resistencia endocrina), comprobamos que los agentes MFP y WORT poseen mecanismos diferenciales de acción, tanto en el parénquima como en el estroma tumoral. Dichos mecanismos posibilitan en ciertas variantes que la combinación de ambos sea más efectiva que el tratamiento con cada droga por separado, y que en otras variantes, en cambio, la combinación no sea beneficiosa. De acuerdo a la creciente importancia que ha adquirido el microambiente tumoral tanto en la regulación del crecimiento de los tumores como en la respuesta a las terapias, demostramos que en algunas de las variantes analizadas el estroma tumoral juega un papel activo durante la regresión inducida por el tratamiento endocrino y por la inhibición de PI3K. Los resultados obtenidos en el modelo experimental plantean la posibilidad de que la expansión del compartimiento estromal que se asocia tempranamente con la regresión de los tumores (fenómeno definido como reacción estromal), actúe como un indicador de la eficacia de la terapia antitumoral utilizada. Hemos demostrado también que el modelo de cultivo tridimensional en Matrigel es una herramienta eficaz para evaluar in vitro la sensibilidad diferencial de las células epiteliales derivadas de las variantes tumorales a los distintos agentes ensayados, lo que apoya el uso de este sistema para predecir el comportamiento de las células neoplásicas frente a distintos compuestos antitumorales. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuyen al estudio de la terapia endocrina del cáncer de mama, presentando evidencia que se suma a los trabajos que plantean el uso de los antiprogestágenos en el tratamiento de esta patología, y demostrando por primera vez el beneficio potencial, para determinado grupo de tumores, de una terapia combinada de antiprogestágenos con inhibidores de vías de señalización como la vía PI3K/Akt.

Abstract:
The morphological and phenotypic similarities among the most frequent mammary carcinomas in women (ductal carcinomas, positive for estrogen (ER) and progesterone receptors (PR)) and the medroxyprogesterone acetate (MPA)- induced mammary tumor model in mice, make this model suitable for the evaluation of mechanisms associated with endocrine treatment (ER and PR antagonists), and protein kinase inhibitors, among others. In this Thesis we evaluated for the first time cellular mechanisms of early tumor regression after antiprogestin therapy in combination with PI3K inhibitors. In light of the current clinical evidence, showing that combination therapies with endocrine agents and PI3K/Akt inhibitors are beneficial for ER and PR positive patients, and based on recent studies pointing to PR as a valid target for breast cancer treatment, we believe that these results may shed light to choose which patients may be selected for this kind of adjuvant therapies. Evaluating tumor variants from the MPA–induced breast cancer model that represent different stages of breast cancer progression (from hormone dependency to endocrine resistance), we found that the antiprogestin mifepristone (MFP) and the PI3K inhibitor, wortmannin (WORT) inhibit tumor growth affecting both the parenchyma and the tumor stroma. However, different type of tumors showed a differential sensitivity to both agents and their combination resulted to be effective in certain tumor variants and not in others. In agreement with the increasing evidence supporting that the tumor microenvironment exerts a pivotal role regulating tumor growth and influencing their response to therapies, we have demonstrated that tumor stroma plays an active role during the early stages of endocrine and PI3K inhibition-induced regression. According to our results, stromal reaction (defined as the increase in the stromal compartment that occurs during tumor regression), may act as a biological marker for antitumor therapy’s effectiveness. Furthermore, we have also confirmed that three-dimensional culture on Matrigel is an effective tool to evaluate in vitro, tumor cell differential responses to several agents, and thus supports the use of this system to predict neoplastic cell behavior after anti-tumor treatment. In conclusion, this Thesis contributes to the study of endocrine therapy, by presenting evidence that supports the use of antiprogestins in breast cancer treatment, and by showing for the first time the potential benefit in certain type of tumors of combined therapies of antiprogestins together with signaling pathway inhibitors such as those of the PI3K/Akt pathway.

Faut, Mónica. "Rol de los receptores nucleares activados por proliferadores peroxisomales gamma frente al exceso de andrógenos durante la foliculogénesis temprana" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La reproducción es uno de los procesos fisiológicos con mayor costo energético, tal es así que los mecanismos fisiológicos que controlan el balance energético se hallan ligados a la fertilidad. Existen múltiples endocrinopatías asociadas a desbalances metabólicos, entre ellas el Síndrome de Ovario Poliquístico (SOP). Esta es una de las patologías más frecuentes en mujeres en edad reproductiva y cuya alteración principal es el hiperandrogenismo. Estas pacientes presentan alteraciones en la foliculogénesis temprana dado que, por mecanismos aun no conocidos, no ocurre la selección de folículos dominantes. Con el propósito de dilucidar estos mecanismos, en el laboratorio se ha generado un modelo murino de hiperandrogenización con dehidroepiandrosterona (DHEA) para el estudio del desarrollo folicular temprano. El objetivo principal de este trabajo es evaluar si “es el exceso de andrógenos durante la vida peripuberal el que genera alteraciones en la funcionalidad ovárica” y “cuál es el rol de los receptores nucleares activados por proliferadores peroxisomales de tipo γ (PPARγ) en esta alteración”. En el presente trabajo encontramos que el estímulo con eCG indujo un aumento en el número de folículos, disminuyendo la atresia folicular de manera controlada, sin alterar los procesos apoptóticos. Por otro lado, el aumento en los niveles de progesterona sérica (P4), indica la capacidad esteroidogénica de estos ovarios, permitiéndonos estudiar los efectos del hiperandrogenismo sobre las primeras etapas de la foliculogénesis y la regulación de la esteroidogénesis. En ovarios provenientes de animales hiperandrogenizados, encontramos un aumento en la expresión de proteínas fundamentales, como StAR, mientras que otras enzimas reguladoras, como P450scc, se encuentran disminuídas. Esta alteración provocó una disminución en la producción de P4, generando un efecto deletéreo en estos folículos. Los PPARγ actuarían como factores de transcripción, regulando la expresión de estas enzimas y estimulando la producción de P4 en las primeras etapas de la foliculogénesis, pero no siendo capaz de hacerlo en un ambiente hiperandrogénico. En estas condiciones, se produce un desbalance oxidativo en donde el GSHt es consumido rápidamente generándose daño a lípidos, lo cual alteraría la estructura de las membranas, provocando que las células no respondan correctamente al ambiente que las rodea, y entrando en un estado proapoptótico. De esta manera, el folículo entra en atresia.

Abstract:
Reproduction is one of the physiological processes with higher energy costs, that is so the physiological mechanisms that control energy balance are linked to fertility. There are multiple metabolic imbalances associated endocrinopathies, including Polycystic Ovary Syndrome (PCOS). This is one of the most frecuent pathology in women of childbearing age and whose main alteration is hyperandrogenism. Women with PCOS have many troubles during early folliculogenesis given that, by unknown mechanisms, the dominant follicles can´t be selected. To try to elucidate this phenomenon, in the laboratory we have generated a rat model of early follicular development with dehydroepiandrosterone (DHEA). The main objective of this work is to evaluate if "it´s the excess of androgens during peripubertal life that generates alterations in ovarian function" and "Which is the role of peroxisome proliferator-activeted receptors γ (PPARγ) in this condition". In this work, we found that ECG stimulation induces an increase in the number of follicles, decreasing the follicular atresia in a controlled manner, without exacerbating apoptotic processes. In the other hand, an increase in the serum progesterone (P4) indicates the steroidogenic capacity of these follicles, allowing us to study the effects of hyperandrogenism on the early stages of folliculogenesis and the regulation of the steroidogenic pathway. Ovaries from animals treated with DHEA, we found an increase in the expression of key proteins such as StAR, while others regulatory enzymes are diminished, such as P450scc. This alteration causes a decrease of P4, producing a deleterious effect on these follicles. PPARγ act as transcription factor of these enzymes by stimulating the production of P4 in the early stages of folliculogenesis, but not being able to do so in a hyperandrogenic environment. In these conditions, GSHt is rapidly consumed which increases the damage to lipids, altering the membrane structure and causing the cells do not respond to the surrounding environment, and entering into a proapoptotic state. In this manner, the follicle is leading to atresia.

Lucchina, Luciana. "Alteraciones periféricas y centrales en la respuesta inflamatoria en un modelo de autismo en ratón" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El autismo es un desorden severo del desarrollo neural que se encuentra principalmente caracterizado por un impedimento sostenido en la interacción social, habilidades comunicativas reducidas y por patrones de comportamiento estereotipados o restrictivos. Existen cada vez más evidencias clínicas y experimentales que relacionan alteraciones en el sistema inmune con la patogénesis del desorden de espectro autista (DEA). Los individuos autistas muestran en diversas etapas de su desarrollo signos de neuroinflamación, respuestas inflamatorias alteradas y anormalidades inmunes. El objetivo general de esta tesis fue el de estudiar el rol que juega la respuesta inflamatoria/glial del sistema nervioso central en la manifestación de comportamientos relacionados con el autismo. A tal fin utilizamos ratones expuestos en la preñez a 600 mg/kg de ácido valproico (VPA600), los cuales muestran deficiencias en la interacción social y han sido propuestos como un posible modelo de autismo. En este trabajo no sólo confirmamos el fenotipo en una filial 1 (F1) de dos cepas endocriadas de ratón, sino que extendimos el análisis conductual describiendo que los animales expuestos a VPA muestran niveles aumentados de comportamientos relacionados con la ansiedad. Evaluamos en estos animales la respuesta periférica y central a un estímulo inflamatorio, así como el estado basal de activación glial. Evidenciamos signos de activación glial crónica tanto en el hipocampo como en el cerebelo de los animales VPA600, así como una respuesta exacerbada al ser expuestos a un estímulo inflamatorio periférico (lipopolisacárido intraperitoneal, LPS): los animales VPA600 muestran niveles más altos de corticosterona en sangre y un aumento en los niveles de expresión de citoquinas pro-inflamatorias en el bazo respecto de animales control. Sumado a esto, luego del estímulo con LPS los VPA600 muestran signos de neuroinflamación: tienen mayor número de células de la microglia en el hipocampo y exhiben mayores niveles de citoquinas pro-inflamatorias en el cerebelo. A fin de evaluar la posible relación causal entre la neuroinflamación observada en el cerebro adulto de los animales expuestos a VPA y la disminución en la interacción social, inyectamos LPS directamente en el lobulillo VI-VII del cerebelo. Al evaluar el comportamiento a las 24 horas, observamos una disminución en la interacción social, acompañada de una marcada neuroinflamación. Los resultados que se presentan demuestran, por un lado, una neuroinflamación basal y una respuesta inflamatoria alterada en el modelo VPA de autismo y, por otro, sugieren que la inflamación en una región específica del cerebelo puede modular los niveles de interacción social. Teniendo ambas cosas en cuenta, proponemos a este modelo como una herramienta útil para evaluar la contribución de la inflamación al desarrollo de los comportamientos relacionados con el autismo. Consideramos que estos estudios contribuirán a dilucidar el rol de las desregulaciones inflamatorias observadas en individuos con ASD.

Abstract:
Autism is a severe neurodevelopmental disorder, characterized by impairment in social interactions, communication deficits and restricted repetitive and stereotyped interests and behaviors. There are clinical and experimental evidences linking alterations in the immune system and the pathogenesis of autism spectrum disorder (ASD). Autistic individuals show signs of neuroinflammation, altered inflammatory responses and immune abnormalities. The main aim of this thesis was to study the role of the inflammatory/glial response of the central nervous system on the manifestation of autism-related behaviors. To this aim, we used mice prenatally exposed to 600 mg/kg valproic acid (VPA600), which show reduced social interaction in adulthood and have been proposed as a mouse model of autism. In this work, we not only confirmed the phenotype in a F1 obtained from two inbred mouse strains, but we also extended the behavioral analysis describing that animals prenatally exposed to VPA also show increased anxiety-related behaviors. In these animals we evaluated the peripheral and central response to an inflammatory stimulus, along with the basal activation state of the glia. We found evidence of chronic glial activation in the hippocampus and the cerebellum of VPA600 animals, accompanied by an exacerbated response when they were challenged with a peripheral inflammatory stimulus (intraperitoneal lipopolysaccharides, LPS): VPA600 animals secrete more corticosterone to the blood and show increased levels of expression of proinflammatory cytokines in the spleen than control mice. Moreover, after a LPS challenge, VPA600 mice also show signs of increased neuroinflammation compared with control mice: they have more microglial cells in the hippocampus, and they show higher levels of proinflammatory cytokines in the cerebellum. To assess the possible causal relationship between the neuroinflammation observed in the adult brain of VPA-exposed animals and the deficit in social interaction, we injected LPS directly into the lobule VIVII of the cerebellum. 24 hours after injection, we analyzed the behavior and we observed a decrease in social interaction, accompanied by an evident neuroinflammation These results demonstrate, on the one hand, a basal neuroinflammation and altered inflammatory response in the VPA model of autism and, on the other hand, they suggest that inflammation in a specific region of the cerebellum can modulate the levels of social interaction. Taking both into account, we propose this model as a useful tool to evaluate the contribution of inflammation to the development of autism-related behaviors. We believe that these studies will help elucidate the role of the inflammatory alterations observed in individuals with ASD.

Ferder, Ianina C.. "Implicancias del gen FMR1 en la función ovárica" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El gen FMR1, responsable del Síndrome de Fragilidad del X (SFX), se localiza en el sitio FRAXA en el brazo largo del cromosoma X (Xq27.3), está compuesto por 17 exones, abarca aproximadamente 38 kilobases (kb) y su producto transcripcional es un ARN mensajero de 3,9 kb que puede sufrir splicing alternativo. En su región 5’ no codificante presenta una zona de tripletes CGG que puede variar en longitud. Según el tamaño de la expansión, los alelos se clasifican en normales (5- 44 repeticiones), intermedios (45-54 repeticiones), premutados (55- 200 repeticiones) o con mutación completa (>200 repeticiones). Mientras que la mutación completa es la causante del SFX, el estado de premutación se asocia a otros 2 desórdenes clínicos: Síndrome de temblor/ ataxia asociado a la Fragilidad del X (FXTAS), un desorden neurodegenerativo de inicio tardío y a la Insuficiencia Ovárica Primaria (IOP) asociada a la Fragilidad del X (FXPOI). La IOP se define como la presencia de amenorrea (de al menos 4 meses) antes de los 40 años, que se acompaña de un aumento en los niveles séricos de FSH (a niveles menopáusicos) y de bajos niveles de estradiol (hipoestrogenismo). Es un síndrome muy heterogéneo de patogénesis multicausal tales como alteraciones cromosómicas, enzimáticas, autoinmunidad, causas iatrogénicas e infecciosas. Tiene una incidencia del 1% en mujeres menores de 40 años y del 0,1% en menores de 30. FXPOI es la causa genética conocida más común de la IOP 46, XX y la premutación en FMR1 es responsable del 4- 6% de todos los casos de IOP 46, XX. Aproximadamente el 2% de las mujeres 46, XX con IOP aislada y el 14% de la mujeres 46, XX con IOP familiar son portadoras de la premutación en el gen FMR1. Asimismo, se ha descripto que alrededor del 20% de las mujeres portadoras de la premutación desarrollan IOP. A su vez, las mujeres portadoras se vuelven menopáusicas aproximadamente 5 años antes que las no portadoras. Si bien no todas las mujeres portadoras de la premutación experimentan una temprana pérdida de la fertilidad, todas ellas enfrentan el potencial adelantamiento en la aparición de condiciones asociadas con la deficiencia estrogénica (aumento en el riesgo de osteoporosis y de enfermedades cardiovasculares). Estudios genéticos epidemiológicos sugieren que el comienzo y la gravedad de la disfunción ovárica asociada a FXPOI son variables y podrían estar moduladas, potencialmente, por el largo de las repeticiones CGG y otros factores ambientales. El status de premutación per se pareciera estar influyendo en la expresión de la enfermedad. De hecho, no se ha descripto que mujeres que poseen expansión completa de tripletes (>200 repeticiones y con signos clínicos de Síndrome de Fragilidad del X) desarrollen IOP. Si bien no se conoce el mecanismo por el cual la premutación del gen FMR1 puede causar la disfunción ovárica y la insuficiencia ovárica primaria, se ha postulado que puede ocurrir una disminución inicial del número de folículos o una velocidad acelerada de la atresia. Es sabido que la proteína que codifica este gen, FMRP, se expresa en altas cantidades en células germinales del ovario fetal. Asimismo, se ha descripto que esta proteína actúa como inhibidor de la traducción de algunos ARN mensajeros formando parte de los procesos de silenciamiento génicos mediados por miRNAs. Teniendo en cuenta su función, se ha postulado como posible hipótesis de la patogenia, que un aumento de FMRP en estadios tempranos del desarrollo de los ovocitos podría conducir a una haploinsuficiencia de proteínas involucradas en este proceso, provocando una disminución del pool inicial de folículos. Sin embargo, y dado que en FXTAS se ha observado un aumento del ARN mensajero del gen como consecuencia de la premutación, se postula como mecanismos alternativo la existencia de un aumento del ARN mensajero en el ovario que ejerza un efecto tóxico en el tiempo, con el consecuente incremento de la atresia folicular. Ninguno de estos mecanismos han sido aún comprobados en el ovario, más aún la función fisiológica de la proteína en el mismo no está establecida. No se conoce además, si existe expresión diferencial a lo largo del desarrollo folicular. Considerando la escasa información que existe acerca de FMR1 y su expresión en ovario, nuestro trabajo consistió, en una primera fase, en el estudio de la expresión de la proteína FMRP y su mensajero a lo largo de la foliculogénesis, en un modelo de rata. Se utilizaron 3 grupos de ratas: ratas prepuberales de 18 días, ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con dietilestilbestrol (DES) para enriquecer a los ovarios en folículos antrales tempranos y ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con gonadotrofina coriónica equina (PMSG) para enriquecer los ovarios en folículos preovulatorios. En la primera parte del trabajo analizamos, por inmunohistoquímica, la expresión de FMRP en los distintos tipos celulares del folículo. Hallamos que la proteína se expresa en células de la granulosa, de la teca y en células estromales, con excepción de un grupo de células que rodea al folículo. La expresión se detectó en los folículos en los tres estadios del desarrollo estudiados: preantrales, antrales tempranos y preovulatorios. La expresión de la proteína FMRP fue estudiada también por Western blot en los tres tipos foliculares. Observamos una menor expresión en folículos preantrales y una mayor expresión en estadios más avanzados de la foliculogénesis. Por otra parte, se detectaron al menos 4 isoformas de la proteína cuyos patrones de expresión resultaron diferentes a los observados en testículo y cerebro. Teniendo en cuenta la función de la proteína como parte del complejo de silenciamiento post-transcripcional, estos resultados nos permitirían estimar que las diferencias observadas en los niveles de expresión de la proteína tendrían un rol en el correcto desarrollo del folículo. Asimismo, la presencia de isoformas distintivas en el ovario sugeriría una función específica para algunas de ellas en la gónada. La segunda parte del trabajo consistió en el estudio de la expresión del ARN mensajero de Fmr1 en los 3 estadios foliculares. Por PCR en tiempo real observamos que el patrón de expresión era opuesto al que se obtuvo para la proteína. En los folículos preovulatorios, el nivel del ARN fue menor respecto al de los estadios anteriores. Estos resultados sugerirían que la expresión del mensajero y su proteína en el ovario están regulados de manera diferente y posiblemente independiente. Por otro lado, identificamos por RT-PCR y posterior secuenciación, la existencia de varias isoformas del ARNm del gen, resultantes del splicing alternativo del mismo. Entre ellas, detectamos la isoforma que contiene al exón 12, la cual no ha sido previamente descripta en rata. El último aspecto que quisimos abordar en nuestro estudio fue el efecto biológico de la introducción de tripletes en el rango de la premutación sobre una línea celular de células de granulosa humana (KGN). Par tal fin se transfectaron las células con un plásmido conteniendo tripletes en el rango normal o de la premutación, río arriba de un gen reportero (GFP). Luego de 18 horas de transfección, los niveles de ARNm del gen reportero resultaron más elevados en las células que poseían los tripletes en el rango de la premutación, en concordancia con lo observado en diferentes experimentos y pacientes con FXTAS. Asimismo, detectamos una menor cantidad de células que expresan la proteína GFP, en presencia del plásmido con la premutación, en todos los tiempos de transfección estudiados. A nivel neuronal se ha relacionado al estado de premutación con posibles efectos apoptóticos en la célula. Si bien nuestros estudios aún no demuestran que el efecto de la introducción de tripletes en el rango de la premutación resulte en un aumento en la apoptosis de las células KGN, los resultados obtenidos en esta tesis abren la posibilidad de que este mecanismo sea analizado en un futuro. En conclusión, en esta tesis se describe por primera vez la expresión de la proteína FMRP y de su mensajero a lo largo del desarrollo folicular, y la presencia de algunas isoformas distintivas, producto del splicing alternativo del gen. Asimismo, se iniciaron los estudios tendientes a demostrar el efecto patogénico que posee la expresión de tripletes expandidos en células del ovario.

Abstract:
The FMR1 gene, responsible for the Fragile X Syndrome (FXS), is located in the FRAXA site of chromosome X. The gene is composed of 17 exons, spans about 38 kb and encodes an messenger RNA (mRNA) of 3.9 kilobases (kb) that can be alternatively spliced into a number of different isoforms. The 5’ UTR of the FMR1 gene presents a CGG repeat that is unstable and therefore variable. Based on the size of the expansion, alleles are classified as normal (5–44 trinucleotide repeats), intermediate (45- 54 repeats), premutated (55–200 repeats), or fully mutated (>200 repeats). While full mutation is the responsible for FXS, the premutation condition has been associated to other 2 clinical disorders: Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS), a neurodegenerative disorder of late onset and to the Fragile X- associated primary ovarian insufficiency (FXPOI). Primary ovarian insufficiency (POI) is defined as amenorrhea (for at least 4 months) before age of 40, an increase in serum levels of FSH (to menopausal levels) and low levels of estradiol (hypoestrogenism). This syndrome is very heterogeneous with a multicausal pathogenesis, and any of the following: chromosomal, enzymatic, iatrogenic, autoimmune or infectious aberration may be the cause of the disease. It has an incidence of 1% in women under age of 40 and of 0.1% below 30 years of age. FXPOI is the most common known genetic cause for IOP and the premutation condition is responsible for 4-6% of all cases of 46, XX IOP. About 2% of women 46, XX with IOP and 14% of women 46, XX with familial IOP, carry the premutation in the FMR1 gene. Moreover, it has also been described that around 20% of women carrying the premutation, become menopausal around 5 years earlier than not carriers. The premutation status seems to influence the expression of the disease. In fact, no full mutated women with IOP have been described. While not all women carries of the permutation experience an early loss of fertility, all carriers face the potential advance in the onset of the conditions associated with estrogenic deficiency (higher risk for osteoporosis and hearth diseases). Epidemiologic genetic studies also suggest that the onset and severity of ovarian dysfunction associated to FXPOI is variable, and could be potentially modulated by the CGG repeat length and environmental factors. Even though the underlying mechanism by which the FMR1 premutation is responsible for the ovarian dysfunction and POI is not known, it has been suggested that an initial decrease of the number of follicles or an accelerated rate of atresia may take place. The protein encoded by the FMR1 gene, FMRP, is highly expressed in germ cells in the fetal ovary. The protein acts as a translation inhibitor of some target mRNA, most likely via the microRNA silencing complex. Given that in FXTAS an increase in FMR1 mRNA has been observed, another possible mechanism for FXPOI is that high levels of mRNA exert a toxic effect causing an increase in follicular atresia. None of the postulated pathogenic mechanisms has been demonstrated in the ovary. Moreover, the physiological role of FMRP in the gonad has not been established, and the expression pattern of the protein during follicular growth remains unknown. Considering that there is limited information related to FMR1 expression and function in the ovary, the goal of our work was, initially, to study the expression of FMRP protein and its messenger during folliculogenesis in a rat model. For this propose, three groups of rats were used: 1- prepubertal rats of 18 days, 2- prepubertal rats of 21-23 days treated with Diethylstilbestrol (DES) to enrich ovaries with early antral follicles and 3- prepubertal rats of 21-23 days treated with equine chorionic gonadotropin (PMSG) to enrich ovaries with preovulatory follicles. The expression of FMRP in the rat ovarian follicular cells was analyzed by immunohistochemistry (IHQ) and Western blot (WB). By IHQ we found that the protein is expressed in granulosa, theca and stromal cells, except in a group of cells surrounding the follicle, mainly in the cytoplasm. Expression was detected in follicles at all stages of folliculogenesis: preantral, early antral and preovulatory. After WB assays, lower expression in preantral follicle was detected, whereas higher levels of FMRP were observed in later stages of folliculogenesis. Moreover, at least 4 isoforms of the protein were detected whose expression pattern differed from that observed in testis and brain. Considering FMRP’s function as part of the post -transcriptional silencing complex, these results may suggest that the differences observed at FMRP expression levels, could exert a role in the proper development of the follicle. Furthermore, the presence of distinctive isoforms in the ovary could imply a specific function for some of them in de gonad. In the second part of the work we studied the messenger RNA (mRNA) expression of Fmr1 in the three follicular development stages. Using quantitative RT-PCR (qRT-PCR) we found that the mRNA expression pattern was opposite to that observed for the protein: in preovulatory follicles, mRNA level was lower compared to earlier stages. These results suggest that mRNA and protein expression in the ovary may be regulated at different and perhaps independent levels. In addition, by RT-PCR and subsequent sequencing, we identified several messenger isoforms resulting from alternative splicing. Among them, we detected the variant including exon 12, which has not been previously described in other rat tissues so far analyzed. The last aspect we addressed in our work was the biological effect that the CGG repeats in the permutation range could exert on a human ovarian granulosa cell line (KGN). Cells were transfected with a plasmid containing repeats in the normal or in the premutation range cloned upstream of the GFP reporter gene. After different times of transfection, mRNA of the reporter gene was measured by qRT- PCR. We found that after 18 hours, the levels of mRNA was higher in cells transfected with the repeats in the premutation range comparing to the levels found for those with the normal one. These results are in agreement with the observations reported for FXTAS patients and for animal models of the syndrome. Moreover, when cells were transfected with the permutated plasmid, we detected fewer cells expressing the GFP protein in all the transfection times assayed. In neurons, the permutation state has been associated with possible apoptotic effects in the cell. Even though our preliminary studies do not yet show that transfection of KGN cells with the premutation plasmid results in increased apoptosis, the results obtained in the present work open the possibility for this mechanism to be analyzed in a future. In conclusion, this work describes, for the first time, the expression of the FMRP protein and its messenger during folliculogenesis in a rat model. Moreover, the presence of some distinctive isoforms resulting from the alternative splicing of the gene in the ovary is also described. Although we found an increase in mRNA levels and reduced protein expression of the reporter gene containing permutated repeats, further studies are needed to elucidate the pathogenic mechanism of the expanded triplets in the ovary.

Mamone, Leandro Ariel. "Búsqueda de nuevos fotosensibilizantes para el tratamiento del cáncer, inactivación bacteriana y de principios activos antineoplásicos a partir de especies vegetales de Argentina" (2014-03-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Terapia Fotodinámica (TFD) es un tratamiento contra el cáncer que implica la administración de un Fotosensibilizante (FS) y su activación mediante luz visible, produciendo así, fotodaños mediados por oxígeno singlete en el tumor. Además de su uso en cáncer, los principales usos de la TFD incluyen el tratamiento de desórdenes inflamatorios e infecciones. El objetivo de este trabajo fue investigar una colección de plantas de la Argentina como fuente de nuevos FS naturales para ser usados en cáncer y Terapia Fotodinámica Antimicrobiana (TFDA), así como también de compuestos antitumorales y antibacterianos. Se realizó una colección de 113 extractos de plantas de Argentina, y se testeó la presencia de actividad fototóxica sobre la línea celular LM2 de adenocarcinoma mamario, y sobre la especie bacteriana Gram-positiva Staphylococcus epidermidis. En la línea celular LM2 se observó que la exposición a los extractos metanólicos de hoja de Combretum fruticosum y Scutia buxifolia indujo la muerte celular al aplicar TFD. Estos extractos se probaron en diferentes líneas celulares y el efecto fue selectivo contra las líneas tumorales. Se determinó además, que el extracto metanólico de hoja de Collaea argentina es fotoprotector contra la TFD. En bacterias S. epidermidis, tres extractos resultaron ser altamente fotoactivos: Solanum verbascifolium flor, Tecoma stans flor y Cissus verticillata raíz. Estos indujeron reducciones de 4, 2 y 3 órdenes de magnitud en la supervivencia de la bacteria, respectivamente al aplicar la TFDA. Es destacable que la TFDA empleando S. verbascifolium como FS, fue más eficiente con luz solar que empleando una fuente de luz artificial (erradicación total vs. 4 órdenes de reducción). El balance entre compuestos oxidantes y antioxidantes debe estar probablemente enmascarando potenciales FS de los extractos vegetales, pero empleando el extracto crudo, el nivel de fotoactividad de S. verbascifolium es similar al de algunos de los FS comerciales bajo la exposición a luz solar, demostrando que compuestos naturales vegetales son efectivos para ser usados en TFDA. Se llevó a cabo la caracterización fotoquímica de la TFDA empleando el extracto de S. verbascifolium. Las reacciones fueron mediadas principalmente por oxígeno singlete y en menor medida, por el radical hidroxilo. Se estableció un modelo de internalización bacteriana en queratinocitos PAM212 empleando las especies S. epidermidis y S. aureus. Sobre las células infectadas se aplicó TFDA con S. verbascifolium, resultando en la reducción de las bacterias intracelulares sin afectar la viabilidad de las células eucariotas. Desarrollamos, además, un método para el “screening” de potenciales FS de plantas basado en la generación de reacciones redox y producción de oxígeno singlete ante la aplicación de luz. En cuanto a la búsqueda de potenciales compuestos antitumorales, investigamos la citotoxicidad de los extractos en oscuridad. Empleamos 4 líneas tumorales y 3 no tumorales. Trece extractos resultaron ser altamente citotóxicos. Sin embargo, la inhibición del crecimiento celular fue dependiente de la línea celular y no se encontró selectividad por las líneas tumorales, excepto por el extracto de Ipomoea cairica. En general, las concentraciones inhibitorias 50 estuvieron en el rango de 10-150 μg/ml. Los extractos más citotóxicos correspondieron a las especies Solanum chacoense, Iochroma australe y Jacaranda mimosifolia. Se aislaron parcialmente los principios activos de estos tres extractos, y se encontró que estos indujeron un alto porcentaje de muerte celular mediante el arresto del ciclo celular e inhibición de la migración celular. En líneas generales, este es uno de los primeros estudios enfocado al análisis de las propiedades de las plantas nativas de Argentina como antitumorales y antibacterianos en presencia o ausencia de luz y sus efectos biológicos. Palabras clave: Terapia fotodinámica, extractos vegetales, nuevos fotosensibilizantes, compuestos antitumorales, líneas celulares, inactivación bacteriana.

Abstract:
Photodynamic therapy (PDT) is an anticancer treatment that involves administration of a photosensitizer (PS) and its subsequent activation by visible light to result primarily in singlet oxygen–induced photodamage to the tumor. In addition to cancer, mainstream uses for PDT include inflammatory disorders and infections. The aim of this work was to investigate a collection of plants from Argentina as a source of new natural PS to be used in cancer and antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT), as well as antitumor and antibacterial compounds. A collection of 113 Argentinean plant extracts was prepared and screened for phototoxicity on LM2 mammary adenocarcinoma cells and the Gram-positive species Staphylococcus epidermidis. In the mentioned cell line, it was found that exposure to the methanolic extracts of Combretum fruticosum and Scutia buxifolia leaves induced cell death after PDT. This extracts were tested in different cell lines. The effect was selective for tumor lines. It was also found that Collaea argentina leaf extract was photoprotective against PDT. In bacteria, three extracts turned out to be highly photoactive: Solanum verbascifolium flower, Tecoma stans flower and Cissus verticillata root. They induced 4, 2 and 3 logs decrease in bacterial survival, respectively. It was noticeable that S. verbascifolium– aPDT was more efficient under sunlight as compared to artificial light (total eradication vs. 4 logs). The balance between oxidant and antioxidant compounds is very likely to be masking or unmasking potential PS of plant extracts, but employing the crude extract, the level of photoactivity of S. verbascifolium is similar to some artificial PS upon exposure to sunlight, demonstrating that natural resources can be employed in aPDT. Photochemical characterization of S. verbascifolium flower extract upon exposure to light was carried out. aPDT reaction was dependent mainly on singlet oxygen and to a lesser extent, on hydroxyl radicals. We established a model of bacteria internalization into human keratinocytes employing S. aureus and E. epidermidis species. Afterwards, we applied aPDT on infected cells, and the response was a reduction in the number of intracellular bacteria without affecting viability of eukaryotic cells. We developed an easy method for the screening of potential PS from plants based on redox reactions and singlet oxygen production. Regarding to the search for potential new anti-cancer agents, we investigated the effect of plant extracts on cell growth (in dark conditions). Four tumor cell lines and 3 non tumor cell lines were assayed. Thirteen extracts were found to be highly cytotoxic. However, inhibition on cell growth was dependent on cell type and selectivity was not found except for Ipomoea cairica extract. In general, the inhibitory concentrations 50% were in the range of 10-150 μg/ml. The most cytotoxic extracts were Solanum chacoense, Iochroma australe and Jacaranda mimosifolia. Active compounds from these three extracts were partially isolated, finding that they induced a high percentage of cell death through cell cycle arrest and inhibition of cell migration. Overall, this is one of the first studies focusing on Argentinean native plants and their compounds biological effects on PDT, as antitumor and antibacterial. Keywords: Photodynamic therapy, plant extracts, new photosensitizers, anti-tumoral compounds, cell lines, bacterial inactivation.

Sganga, Leonardo. "Identificación de ejes quimiotácticos que guían células madre mesenquimales al estroma tumoral en adenocarcinomas mamarios" (2014-03-31) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El crecimiento tumoral depende en gran medida en la interacción de las células tumorales con el microambiente que las circunda. Entre otras células que componen el estroma tumoral se encuentran precursores locales y precursores estromales o células madre mesenquimales (MSCs) que se alojan en el tumor tras ser reclutadas desde la médula ósea. En base a esto surge la pregunta: ¿cuáles de los factores del microambiente tumoral son los responsables de la migración de MSCs provenientes de médula ósea? Utilizando un modelo in vitro del microambiente tumoral representado por medios condicionados (MC) por muestras humanas de adenocarcinomas mamarios realizamos un estudio proteómico de citoquinas y quimioquinas sobre 8 muestras tumorales, destacándose IL-6, GRO, IL-8 y MCP-1 como los factores más representados de los medios condicionados por tumores, siendo el perfil muy similar entre todas las muestras tumorales. En busca de un modelo que remede el aporte de factores quimiotácticos por parte de los tumores humanos, se crecieron tumores ortotópicos en ratones nude combinando una línea tumoral mamaria humana con fibroblastos humanos adultos. Utilizando este modelo, se logró cuantificar las MSCs llegadas tras migración local luego de ser inyectadas de modo peritumoral. En una validación técnica y funcional in vitro, IL-6 resultó ser quimiotáctico para MSCs pero en concentraciones mucho mayores a las encontradas en los tumores; sin embargo no se descarta un rol de IL-6 directo o indirecto. Por otra parte los ejes quimiotácticos de GRO, IL-8 y MCP-1 no revelaron un aporte significativo sobre la migración de MSCs. Por otro lado, de un análisis estadístico y funcional comparando los MC provenientes de tumores y tejidos adyacentes libres de patología, resultó una lista de factores diferencialmente representados de los cuales MIP-3α o proteína inflamatoria de macrófagos 3 alfa surge como el factor más relevante como posible mediador del reclutamiento de las MSCs hacia el tumor. La validación funcional del eje quimiotáctico MIP-3α / CCR6 sugiere que este eje estaría involucrado, al menos en parte, en la migración de MSCs hacia tumores. En suma, hemos logrado identificar un factor relevante para la modulación de la migración de las MSCs hacia el tumor, factible de ser utilizado en estudios posteriores para el diseño de terapias celulares contra el cáncer.

Abstract:
Tumor growth depends greatly on the interaction of tumor cells with the surrounding microenvironment. Among other cells comprising the tumor stroma, there are local precursors and stromal precursors or mesenchymal stem cells (MSCs) that home into the tumor after being recruited from the bone marrow. Based on this, the question arises: which of the factors from the tumor microenvironment are responsible for the migration of bone marrow-derived MSCs? Using an in vitro model for the tumor microenvironment represented by conditioned media (CM) from human samples of breast adenocarcinomas, we performed a proteomic study of cytokines and chemokines in 8 tumor samples, highlighting IL-6, GRO, IL-8 and MCP-1 as the most represented factors in tumor -conditioned media, with a very similar profile among all tumor samples. Looking for a model that represents the contribution of chemotactic factors from human tumors, orthotopic tumors were grown in nude mice by combining a human mammary tumor cell line with human adult fibroblasts. Using this model, we were able to quantify MSCs arriving after local migration after being injected in a peritumoral way. In a technical and functional in vitro validation, IL-6 was found to be chemotactic for MSCs but at much higher concentrations than those found in tumors; however, we cannot disregard a direct or indirect role for IL-6. Moreover, chemotactic axis involving GRO, IL-8 and MCP-1 did not reveal a significant contribution on MSCs migration. Furthermore, a statistical and functional analysis comparing MC from tumors and adjacent tissues free of pathology, resulted in a list of factors differentially represented where MIP-3α or macrophage inflammatory protein- 3 alpha emerges as the most relevant factor as possible mediator for the recruitment of MSCs to the tumor. Functional validation of the chemotactic axis MIP-3α / CCR6 suggested that this axis would be involved, at least in part, on MSCs migration to tumors. In summary, we could identify a factor relevant for the modulation of MSCs migration into the tumor, likely to be used in subsequent studies to design cell therapies against cancer.

Aprile García, Fernando. "Estudio de las vías de señalización e inflamatorias del canal P2X7 y su variante polimórfica Gln460Arg en células del sistema nervioso central" (2014-04-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los receptores P2X7 son canales de calcio activados por ATP conformados por subunidades de dos pasos de membrana que se asocian como homotrímeros. Sus efectos son mediados por activación de la vía de las MAPK que incluye a BRaf y ERK 1/2. En el sistema nervioso central, regulan la liberación de neurotransmisores y citoquinas, y la activación glial frente a situaciones inflamatorias. Mediante distintos estudios genéticos se encontró que pacientes con trastornos depresivos poseen, con una incidencia significativa, una variante polimórfica del gen P2X7, que consiste en un cambio de un único nucleótido que produce la sustitución de Glutamina por Arginina en la posición 460 (Gln460Arg). El objetivo principal de esta tesis consiste en investigar la relación funcional entre esta variante polimórfica del receptor y la aparición de trastornos psiquiátricos. En particular, se estudiaron las cascadas de señalización activadas por el receptor P2X7, poniendo énfasis en el ingreso de calcio extracelular tras dicha activación, el rol de la cascada de las MAPK y los efectos funcionales y transcripcionales que derivan de dicha activación. Primeramente, se observó que en homocigosis la variante mutada de P2X7 tiene la misma funcionalidad que el receptor wild-type (WT). En cambio, cuando ambas subunidades fueron coexpresadas se produjo una marcada disminución en la entrada de calcio y en la activación de la MAPK ERK 1/2. Se demostró además que ambas subunidades interactúan físicamente en la membrana celular de células coexpresoras, asociándose para formar trímeros funcionales de P2X7 compuestos por subunidades WT y Gln460Arg. A su vez, nuestro grupo colaborador en el Max-Planck en Munich, Alemania, demostró que solamente los ratones knock-in que expresan ambas variantes del receptor P2X7 humano, y no aquellos que expresan una única variante, muestran alteraciones del comportamiento similares a aquellas que presentan pacientes con depresión. A continuación, se buscaron proteínas involucradas en la transducción de señales de P2X7 de interés en el marco de mecanismos inflamatorios o con un posible rol en depresión. Se detectó asociada a BRaf a la proteína Poli ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP1), enzima clave en la respuesta celular a procesos inflamatorios. Se demostró que P2X7 activa a PARP1, aumentando los niveles totales de poli ADP-ribosilación. Estos resultados identifican a PARP1 como un modulador clave de la transducción de señales de P2X7, y describen por primera vez a P2X7 como activador de PARP1. Además se realizó un microarray de expresión génica con el fin de caracterizar las consecuencias de la coexpresión de ambas variantes a nivel transcripcional. Con estos datos se realizó un análisis bioinformático global de los perfiles de expresión génica, con el cual se hallaron alteradas distintas vías de señalización relacionadas con inflamación y depresión. También identificamos genes candidatos con expresión alterada que resultan de máximo interés en el mismo contexto: CHUK (o IKKα, quinasa del inhibidor de NFκB α) y RCAN1 (regulador de calcineurina 1). Esta expresión diferencial detectada en el microarray fue posteriormente confirmada en distintos modelos, validando y profundizando dichos hallazgos. En conclusión, mediante la caracterización de las vías de transducción de señales asociadas a la activación de las distintas variantes de P2X7, el análisis de su impacto transcripcional y su asociación con nuevas moléculas se describen por primera vez los mecanismos moleculares y celulares que podrían proveer una explicación a la asociación entre la presencia de la variante mutada de P2X7 y la aparición de trastornos psiquiátricos como la depresión.

Abstract:
P2X7 receptors are ATP-gated calcium channels conformed by subunits with two transmembrane domains that assemble as homotrimers. Its effects are mediated by activation of the MAPK pathway that involves BRaf and ERK 1/2. In the central nervous system, they regulate neurotransmitter and cytokine release, as well as glial activation after inflammatory injury. Different genetic approaches have demonstrated that a significant amount of psychiatric patients suffering from major depression possess a polymorphic variant of the P2X7 gene, consisting in a single nucleotide change leading to a Glutamine for Arginine subtitution at the position 460 (Gln460Arg). The main aim of this thesis is to investigate the functional interplay between this polymorphic variant and the onset of psychiatric symptoms. More specifically, signaling pathways elicited by P2X7 receptor were studied, with special emphasis in calcium uptake, MAPK role and the functional and transcriptional effects derived from their activation. First of all, we report that the P2X7 polymorphic variant show the same functionality than its wild-type (WT) counterpart when expressed in homocygosis. In contrast, calcium uptake and MAPK ERK 1/2 activation were severely diminished when both subunits were coexpressed. We also show that both subunits physically interact in coexpressing cells, therefore assembling P2X7 receptors that bear WT and Gln460Arg subunits. At the same time, our partner research group at the Max-Planck Institute in Munich, Germany, showed that only knock-in mice for both variants of the human P2X7 receptor show behavior alterations reminiscent of those observed in psychiatric patients, while homozygous knock-in mice do not. Afterwards, we looked for novel proteins involved in P2X7 signaling pathways that would be of interest in the context of inflammation and depression. We detected Poly ADPribose polymerase (PARP1), a key enzime for cellular response to inflammatory processes. P2X7 activates PARP1, enhancing cellular levels of ADP-ribose. These results identify PARP1 as a key modulator of P2X7 signaling mechanisms, and describe P2X7 as a novel activator of PARP1. Also, we performed an expression microarray with the aim of depicting the transcriptional consequences of coexpressing both variants. This data was used to carry out a global bioinformatic analysis of gene expression profile. We found that different signaling pathways related to inflammation and depression were altered. We also found candidate genes with altered gene expression that are of interest in this context: CHUK and RCAN1. Their differential expression detected on the microarray was confirmed employing different models, therefore validating and gaining insight into these findings. Summing up, by means of characterizing the signaling pathways associated to the activation of the different P2X7 variants, the analysis of their transcriptional impact and the association with novel molecules we describe for the first time the molecular and cellular mechanisms that could provide an explanation for the association between the P2X7 polymorphic variant and the appearance of psychiatric illnesses such as depression.

Videla Richardson, Guillermo Agustín. "Establecimiento y estudio in vitro de células madre/progenitoras tumorales derivadas de gliomas de alto grado como fuente renovable para desarrollos terapéuticos" (2014-04-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los gliomas de alto grado son los tumores cerebrales primarios más frecuentes y son altamente agresivos e invasivos. Éstos parecen exhibir una organización jerárquica y se ha postulado que su generación ocurre a partir de células madre tumorales (CMT), las cuales corresponderían a una subpoblación minoritaria capaz de generar y propagar tumores al ser inyectadas en ratones inmunodeficientes. De esta forma, el aislamiento y la caracterización de células tumorales derivadas de pacientes con fenotipo de células madre o progenitoras permite contar con un valioso modelo de estudio para comprender en mayor profundidad la biología de los gliomas. En el presente trabajo logramos establecer con éxito nueve líneas de células madre/progenitoras tumorales (CMPT) a partir de biopsias de gliomas de alto grado. Éstas fueron capaces de generar tumores luego de ser inyectadas en el sistema nervioso central en ratones inmunodeficientes y presentaron las mismas alteraciones genéticas que se encontraron en los tumores parentales. Además, todas ellas fueron positivas para los marcadores de CMT: Nestina, Vimentina, CD44 y Sox2. Sin embargo, el grado de expresión de CD133 resultó ser variable en todas las líneas analizadas. A pesar de las similitudes entre las CMPT y las células madre neurales, es concebible pensar que pueden existir diferencias en sus respectivos potenciales de diferenciación. Para responder este interrogante hemos sometido a estas líneas celulares a diversos protocolos de diferenciación basados principalmente en el agregado de BMP4 recombinante humano y en la deprivación de factores de crecimiento. Luego de analizar la expresión de distintos marcadores de diferenciación y de evaluar cambios en la morfología celular, determinamos que estas líneas de CMPT poseen un grado variable de multipotencia, en donde cada una de ellas presenta un grado de compromiso particular hacia los linajes astroglial y neuronal. Además, pudimos observar que la adición de BMP4 recombinante redujo marcadamente la tasa de proliferación de todas las líneas celulares estudiadas. Por último, hemos determinado los niveles de expresión del ARNm de distintos ligandos y receptores involucrados en la señalización dependiente de BMPs en seis líneas de CMPT, encontrando en ellas ciertos patrones de expresión característicos. Dado que las CMT probablemente dependan de determinadas señales del microambiente tumoral para mantener su identidad, un tratamiento efectivo podría basarse en el bloqueo de mediadores generados en el nicho perivascular. Por este motivo y dado el gran potencial de este modelo experimental para el testeo de drogas, decidimos estudiar los niveles de expresión de los ARNm de los componentes del eje endotelinérgico en diferentes líneas de CMPT. Pudimos observar que todas las líneas celulares analizadas mostraron una expresión elevada de los transcriptos del receptor ETRB, mientras que el grado de expresión de los componentes restantes del sistema fue dependiente de cada línea celular. Más aún, en dos de cuatro líneas analizadas, el agregado de endotelinas recombinantes produjo una disminución significativa de los niveles de apoptosis generados en condiciones de deprivación de factores de crecimiento y nutrientes. Dada la variabilidad observada en las respuestas celulares a diferentes tratamientos en las distintas líneas de CMPT, este trabajo pone de menifiesto la relevancia de contar con un modelo in vitro basado en cultivos derivados de gliomas que permita contribuir al desarrollo de terapias personalizadas.

Abstract:
High grade gliomas are the most frequent and malignant primary brain tumors in adults and appear to have a hierarchical organization suggestive of a stem cell foundation. Glioma stem cells (GSC) have been recently isolated from tumors of patients and were characterized as a small subset of stem-like tumor cells capable of initiating and sustaining tumor growth when grafted into mice. Thus, isolation and expansion of these putative cancer stem/progenitor cells, harboring tumor-specific phenotypes, constitutes a powerful model to study glioma biology. Significantly, GSC lines from different tumors exhibit divergent gene expression signatures and distinct differentiation behavior. In the present study, we successfully established nine glioma stem/progenitor cell (GSPC) lines obtained from malignant gliomas which display stem cell properties and initiate high-grade gliomas following xenotransplantation. Importantly, all the established cell lines presented the same genomic alterations as parental tumors. Additionally, they were all positive for the stem cell markers: Nestin, Vimentin, CD44 and Sox2. In contrast, CD133 expression levels widely varied among GSPC lines. Despite similarities between GSPC and normal neural stem cells, we hypothesized that there may be differences in their differentiation potentials. To address this issue, first, we exposed these cell lines to several differentiation conditions that principally include BMP4 treatment and growth factors withdrawal. After analyzing the expression of various markers of differentiation and assessing changes in cell morphology, we determined that these GSPC lines possess a varying degree of multipotency. Moreover, we observed that the addition of recombinant BMP4 markedly reduced the rate of proliferation of all the studied cell lines. Finally, we determined the expression levels of different ligands and receptors involved in BMP-signaling, and found that the GSPC lines show characteristic patterns of expression. As many cancer stem cells might depend on a niche to maintain their identity, targeting molecules triggered by the perivascular niche could be a strategy to deplete or differentiate them. For this reason and given the potential of the present experimental model for drug screening, we studied the expression profile of the endothelin (EDN) axis members in different GSPC lines grown in vitro. Our findings revealed that all tested cell lines robustly express ETRB receptor. Nevertheless, the expression levels of the other components of this axis resulted cell line specific. Furthermore, in two from four GSPC lines, the addition of recombinant EDNs (1, 2 and 3) reduced apoptotic rates upon qrowth factors and nutrients withdrawal. Given the diversity of the responses displayed by patient-derived CSC lines, the present study highlights the relevance of the in vitro model presented herein for the development of tailor-made therapies.

Bruzzo Iraola, Juan. "Rol de la inflamación sistémica en la patología generada por tumores murinos" (2014-04-24) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La asociación entre cáncer e inflamación en un órgano o tejido se encuentra sólidamente establecida. En efecto, se sabe que ciertos tumores, tienen una mayor probabilidad de originarse en sitios de inflamación crónica y que procesos inflamatorios locales pueden acelerar el crecimiento de tumores preexistentes en animales y seres humanos. Por otro lado, la relación entre cáncer e inflamación sistémica no ha sido particularmente estudiada. En esta tesis, demostramos que durante el crecimiento de 4 tumores murinos, de diferente origen, estirpe histológico e inmunogenicidad y de un tumor humano creciendo en ratones nude, se generaron 2 picos temporalmente separados de inflamación sistémica. El primer pico fue relativamente pequeño y transitorio ya que fue detectado durante la primera semana luego de la inoculación del tumor. Tal vez represente, en parte, una respuesta del organismo al trauma mecánico de la inoculación de elementos extraños, ya que la inoculación de fibroblastos murinos normales también produjo una manifestación de inflamación sistémica, aunque menor, que la observada después de la inoculación de células tumorales. Por otro lado, el inicio del segundo pico de inflamación sistémica fue observado cuando el volumen tumoral fue mayor que 500 mm3 y coincidente con el inicio del crecimiento exponencial de cada tumor. Este segundo pico de inflamación sistémica fue significativamente más prominente que el primero y su intensidad aumentó en relación directa con el incremento de la masa tumoral. Estos resultados sugieren que la inflamación sistémica podría ser un fenómeno general de la patología neoplásica y su importancia se puso de manifiesto en el hecho de que, en nuestra colección de tumores, se observó, sorpresivamente, una correlación directa entre la magnitud de la inflamación sistémica generada por cada tumor y su agresividad, correlación que no se observó con la capacidad de generar metástasis. Esto indica, al menos en los tumores analizados por nosotros, que la capacidad de generar una potente respuesta inflamatoria sistémica, produce más efectos deletéreos sobre el organismo que la propia capacidad metastásica, disminuyendo de este modo la sobrevida. En este sentido, se encontró gran infiltración de neutrófilos y alteraciones estructurales en diferentes órganos, que son compatibles con disminución y aún pérdida de función, independiente de la capacidad metastásica de cada tumor. La inflamación sistémica generada por el tumor exacerba el propio crecimiento tumoral estableciendo un circuito de retroalimentación positivo entre ambos, al menos en parte por la activación del receptor TLR-4. Además, la disminución de las manifestaciones de inflamación sistémica mejoró los efectos anti-tumorales obtenidos con quimioterapia y radioterapia, aunque estos resultados fueron relativamente modestos. Esto se debe a que el tumor cuando supera los 1500 mm3, comienza un crecimiento exponencial, generando un fenómeno de inflamación sistémica progresivo, a pesar de que se continúan administrando las drogas antiinflamatorias, que hasta ese momento habían sido bastante efectivas para limitar la naciente inflamación sistémica y para retardar el crecimiento tumoral. En cambio, un excelente resultado terapéutico fue alcanzado cuando se realizó el tratamiento antiinflamatorio junto con la escisión quirúrgica de tumores > 2000 mm3. En este caso, la eliminación quirúrgica de la fuente principal de inflamación sistémica y de posible refractariedad, permitió al tratamiento antiinflamatorio tener muchas más chances de actuar, contra la inflamación sistémica residual, pero aún deletérea, que perdura al menos 2 semanas después de la extirpación del tumor. Si esta condición inflamatoria sistémica fuera una característica distintiva de muchos canceres avanzados, un conocimiento más preciso de los mecanismos por los cuales esta inflamación sistémica promueve el crecimiento tumoral y produce múltiples daños en el organismo y la búsqueda de sustancias antiinflamatorias más efectivas y con menores efectos adversos, serían muy importantes para complementar y mejorar las terapias actuales contra el cáncer.

Abstract:
The link between cancer and inflammation in an organ or tissue has firmly been established on the basis that cancer tends to occur at sites of chronic inflammation and that local inflammatory processes can accelerate the growth of preexisting tumors in both animals and human beings. In contrast, the relationship between cancer and systemic inflammation has been less studied. In this work, we demonstrated that during the growth of 4 murine tumors of different origin, histological type and immunogenicity and 1 human tumor in nude mice, two temporally separate peaks of systemic inflammation were detected. The first peak was relatively small and transient detected during the first week after tumor inoculation. It probably represented, at least in part, the response of the organism to the mechanical trauma of inoculation of foreign bodies, because the inoculation of normal fibroblasts produced a rather similar manifestation of systemic inflammation than that observed after the inoculation of tumor cells. On the other hand, the onset of the second peak was observed when the tumor was 500 mm3, coincidental with the beginning of the exponential tumor growth. This second peak of systemic inflammation was significantly more prominent than the first one and its magnitude increased progressively in parallel with the increase of tumor mass. These results suggest that systemic inflammation could be a general phenomenon of neoplastic pathology and its importance became manifest in the fact, that in our tumor collection, was observed, surprisely, a direct correlation between the magnitude of systemic inflammation generated by each tumor and its aggressiveness. On the other hand, in our tumor models, tumor aggressiveness did not correlate to the tumor´s ability to disseminate or metastasize, suggesting that the magnitude of systemic inflammation rather than the metastatic ability produce more deleterious effects in the organism, diminishing survival. In fact, was observed a large number of PMN and damage in tissues and organs, that are compatible with impair function, indepently of tumor´s metastatic ability. The systemic inflammation generated by tumor enhance tumor growth, establishing a positive feedback between both, at least in part, by activation of TLR-4 receptor. In addition, the attenuation of the manifestations of systemic inflammation improves the anti-tumor effects obtained with radiotherapy and chemotherapy. However, this results were relatively modest. This is probably due to the fact that when tumor surpass 1500 mm3, begins an exponential growth, generating a systemic inflammation which magnitude increase progressively, even though the continue inoculation of the anti-inflammatory drugs. Instead, an excellent therapeutic result was obtained when the anti-inflammatory treatment schedule was combined with surgery. In this case, the surgery eliminated the main source of systemic inflammation and in consequence an anti-inflammatory treatment had a better chance to act against the residual, but still deleterious, systemic inflammation. If a systemic inflammatory condition were a hallmark of many advanced cancers, a more accurate knowledge of the underlying mechanisms by which systemic inflammation promotes tumor growth and produces multiple deleterious effects on the organism and the search for new more effectives and with lesser side effects anti-inflammatory factors will help to design new strategies to complement and to improve the current therapies against cancer.

Villarreal, Alejandro. "El papel de la interacción entre neuronas y glía mediada por S100B/RAGE en la propagación del daño luego de la isquemia cerebral" (2014-06-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La isquemia cerebral es un grave problema para la Salud Pública en países emergentes como la Argentina. Aún no se conocen completamente los mecanismos celulares y moleculares que participan de la propagación del daño desde la zona del infarto isquémico (core) hacia las zonas cercanas del cerebro que se definen como área de la penumbra isquémica. Esta expansión del daño hacia zonas distales a la lesión isquémica original es lo que define el mal pronóstico de los pacientes. Las moléculas asociadas al daño o DAMP (del inglés Damage Associatted Molecular Pattern) como la proteína astroglial S100B aumentan en el espacio extracelular luego de la isquemia y son capaces de activar la respuesta inmune innata mediada por los receptores de patrones moleculares (PRR, del inglés Pattern Recognition Receptor). Considerando que S100B ha demostrado tener acciones sobre astrocitos y neuronas en cultivo, nuestra hipótesis de trabajo propuso que la liberación local de S100B desde el core isquémico activaría el PRR RAGE, facilitando la respuesta inflamatoria, y extendería así el daño hacia el tejido cerebral circundante. Utilizando un modelo de isquemia cerebral en animales de experimentación, administraciones intra-corticales de S100B purificada, cultivos puros neuronales y cultivos enriquecidos en astrocitos pudimos establecer que: i) S100B induce la sobrevida o muerte neuronal en neuronas expuestas a excitotoxicidad por glutamato en una forma dependiente de la dosis, de la expresión de RAGE y de la activación del factor de transcripción NF-κB; ii) S100B facilita la conversión de los astrocitos hacia el fenotipo reactivo proinflamatorio en forma RAGE/NF-κB dependiente; iii) S100B liberada desde un foco en el parénquima cerebral induce cambios en astrocitos similares a los observados días después de la lesión isquémica. En función de nuestros resultados proponemos que en las zonas vecinas al core isquemico S100B tendría efectos neurodegenerativos directos o en forma secundaria promoviendo la conversión astroglial hacia un fenotipo proinflamatorio activando la ruta RAGE/NF-κB. Esta cascada intracelular emerge como un tentador blanco molecular para futuras estrategias terapéuticas.

Abstract:
Brain ischemia represents a serious problem for Public Health in developing countries such as Argentina. The molecular and cellular mechanisms that participate in damage propagation from the ischemic infarct region (core) towards neighbor regions of the brain (defined as ischemic penumbra) are not fully understood. The penumbra damage determines the bad prognosis for patient outcome. Damage associated molecular patterns (DAMPs) like astroglial protein S100B are increased in the extracellular space after ischemia and are capable of activating innate immune response by engaging pattern recognition receptors (PPR). Considering that S100B has shown to have effects on astrocytes and neurons in vitro, our work hypothesis proposed that local release of S100B from the ischemic core could activate the PRR receptor named RAGE, facilitating inflammatory response and expanding damage to the limiting regions of brain tissue. Using an experimental model of brain ischemia in laboratory animals, intra-cortical infusions of purified S100B and neuronal or astroglial cultures we have been able to establish that: i) S100B promotes death or survival in neurons exposed to glutamate induced excitotoxicity in a dose dependent manner and requiring, RAGE expression and activation of transcription factor NF-κB ii) S100B facilitates astrocyte conversion towards a reactive and proinflamatory phenotype in a RAGE/NF-κB dependent manner; iii) S100B released from a focal spot in brain parenchyma induces changes on astrocytes that are similar to those observed in ischemic injury in vivo. Based on our results we propose that S100B might have neurodegenerative effects directly on neurons or indirectly by promoting the astroglial conversion towards a pro-immflamatory phenotype after engaging the RAGE/NF-κB pathway. This intracellular pathway emerges as a tempting molecular target for future therapeutic strategies.

Langle, Yanina Verónica. "Participación del estroma en la regresión del cáncer de vejiga inducida por Bacilo Calmette-Guérin (BCG)" (2014-07-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Bacilo Calmette-Guérin (BCG) es el tratamiento estándar para prevenir recidivas y progresión del cáncer vejiga (CaV) no invasor de alto grado histológico. Utilizando un modelo de CaV murino (MB49) demostramos que BCG reduce el crecimiento tumoral a través de a) la inhibición del crecimiento de las células tumorales y b) la generación de un estroma anti-tumoral. El crecimiento de células tumorales es inhibido por la activación del receptor activador de la proliferación de peroxisomas (PPARɣ) y la regulación negativa del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR3). BCG también induce la remodelación del estroma, incrementando la proliferación y diferenciación de los fibroblastos en forma directa o a través de factores producidos por los macrófagos. Este proceso es regulado negativamente por el óxido nítrico. Uno de los factores liberados por los macrófagos es el FGF-2, el cual induce esta activación de los fibroblastos. En tumores, se observa que BCG induce la disminución de la expresión del FGFR3 en las células tumorales y el incremento en la expresión de FGFR1 y FGFR2 en el estroma. En el 50% de los tumores de vejiga de pacientes, la expresión del FGFR3 disminuye por tratamiento ex vivo con BCG. El presente trabajo describe un nuevo mecanismo de acción de BCG, plantea nuevos blancos terapéuticos y posibles marcadores pronósticos para pacientes con CaV.

Abstract:
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the standard treatment to prevent recurrences and progression of non-muscle invasive high histological grade bladder cancer (BCa). Using a murine BCa model (MB49) we have demonstrated that BCG reduces tumor growth by a) inhibiting the growth of tumor cells b) generating an anti-tumor stroma. Tumor cell growth is inhibited by activating peroxisome proliferation activated receptor gamma (PPARɣ) and the fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) down-regulation. BCG also induces stromal remodeling, increasing fibroblast proliferation and differentiation, directly or indirectly through soluble factors produced by macrophages. This process is negatively regulated by nitric oxide. FGF-2 is one of the factors released by macrophages, which induces activation and proliferation of fibroblasts. BCG induces a decrease of FGFR3 expression in tumoral cells, while inducing an increase of FGFR1 and FGFR2 expression in stromal cells. Ex vivo treatment of bladder tumors patients with BCG produced a down-regulation of FGFR3 expression in the 50% of the cases. This paper describes a novel mechanism of action of BCG that could be useful to find new therapeutic targets and prognostic markers for patients with BCa.

Saborido, Mariano Diego. "Bases farmacológicas y moleculares de las disquinesias inducidas por L-dopa en un modelo experimental de la enfermedad de Parkinson" (2014-07-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enfermedad de Parkinson se caracteriza por una deficiencia de dopamina estriatal debida a la pérdida progresiva de neuronas de la substantia nigra pars compacta. La L-dopa es el antiparkinsoniano más eficaz, aun cuando luego de algunos años de tratamiento la mayoría de los pacientes presentan complicaciones motoras como las disquinesias. Éstas reducen la calidad de vida del paciente e interfieren con el beneficio terapéutico de la Ldopa. Se sabe que la exposición repetida a agonistas dopaminérgicos, la estimulación pulsátil de receptores dopaminérgicos estriatales y una severa degeneración nigroestriatal favorecen la aparición de disquinesias. Existe consenso respecto a que la aparición de disquinesias involucra profundos y persistentes cambios moleculares en el estriado. El objetivo general del presente trabajo fue examinar los mecanismos farmacológicos y moleculares que dan origen a las complicaciones motoras que se presentan durante la terapéutica sustitutiva con L-dopa en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Nuestros resultados avalan la participación de los receptores dopaminérgicos D1 y sugieren la participación de la proteína Fyn en el desarrollo de disquinesias. Aunque no hemos sido capaces de reducir la severidad de las disquinesias mediante la inhibición de la vía mediada por mTOR, no podemos descartar su participación en el desarrollo y consolidación del fenómeno disquinético.

Abstract:
Parkinson's disease is characterized by a deficiency of striatal dopamine due to the progressive loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. L-dopa is the most effective anti-Parkinsonian drug, even though after a few years of treatment, the majority of patients present motor complications such as dyskinesias. They reduce the quality of life of the patients and interfere with the L-dopa therapeutic benefit. It is known that repeated exposure to dopamine agonists, pulsatile stimulation of striatal dopaminergic receptors and a severe striatonigral degeneration favor the emergence of dyskinesias. There is consensus that the occurrence of dyskinesias involves deep and persistent molecular changes in the striatum. The general objective of this work was to examine the pharmacological and molecular mechanisms that give rise to complications that arise during substitutive therapy with L-dopa in an animal model of Parkinson´s disease. Our results support the participation of D1 dopamine receptors and suggest the involvement of the protein Fyn in the development of dyskinesias. Although we have not been able to reduce the severity of dyskinesias by inhibiting the mTOR-mediated pathway, we cannot dismiss its participation in the development and maintenance of the dyskinetic phenomenon.

Mac Keon, Soledad. "Vacunación con células dendríticas y regulación de la respuesta inmune en melanoma experimental" (2014-07-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo del presente trabajo de Tesis fue explorar el mecanismo mediante el cual la vacuna CD-Apo/Nec, constituida por células dendríticas cocultivadas con células apoptóticas y necróticas del melanoma murino B16-F1, genera protección antitumoral, y establecer condiciones que potencien la capacidad inmunoestimuladora de la misma. En el trabajo de Tesis que se presenta se demuestra que la protección generada por la vacuna es sistémica, evitando el desarrollo s.c. de melanoma B16-F1 y controlando micrometástasis latentes. Se detectó en el sitio de vacunación la novedosa formación de una estructura linfoide terciaria, la cual no se evidenció con otras vacunas que no desarrollan protección antitumoral. En esta estructura se observaron vénulas con expresión de Adresina de Nódulo Linfático Periférico y el reclutamiento de linfocitos T CD4+ y CD8+ en estrecho contacto con células dendríticas. Para la formación de la estructura linfoide terciaria fue necesario el cocultivo ex vivo durante 24 horas de las células dendríticas con células Apo/Nec. En los ganglios linfáticos drenantes, la vacunación no indujo la acumulación de linfocitos T regulatorios, pero sí fue posible detectar allí el reclutamiento y proliferación de linfocitos T CD8+ vírgenes B16-F1-específicos. Se determinó al finalizar el esquema de vacunación la producción anticuerpos IgM/IgG anti-B16-F1, que podrían actuar opsonizando células B16-F1. Se ensayaron diferentes estrategias de maduración in vitro de las células CD-Apo/Nec. Sin embargo, no fue posible generar un aumento significativo en su capacidad inmunoestimuladora. Se dedujo que las células apoptóticas y necróticas de melanoma inducen una pérdida en la capacidad funcional de las células dendríticas. Se comprobó la acumulación de lípidos neutros en las células dendríticas, que podría estar afectando el procesamiento y presentación de antígenos tumorales. En este trabajo de Tesis se logró determinar diferentes aspectos de la respuesta inmune anti-tumoral gatillados en los animales vacunados con CD-Apo/Nec. Creemos que las células de melanoma irradiadas son una fuente completa de antígenos de melanoma, y que este trabajo contribuye a planear nuevas aproximaciones y estrategias de combinación que logren mejorar las terapias anti-melanoma existentes.

Abstract:
The aim of this Ph.D. Thesis was to explore the mechanisms of antitumor protection elicited by DC-Apo/Nec vaccine, constituted by dendritic cells charged with apoptotic and necrotic murine B16-F1 melanoma cells, and to establish new conditions to enhance it´s immunostimulatory capacity. In this PhD Thesis it is demonstrated that the DC-Apo/Nec vaccine generates systemic protection against s.c. B16-F1 melanoma and dormant micrometastasis. The neoformation of a tertiary lymphoid structure was described at the vaccination site, which was not evidenced with other vaccines lacking antitumor capacity. Within this structure the expression of Peripheral Lymph Node Addressin and the recruitment of CD4+ and CD8+ T lymphocytes, in close contact with dendritic cells, were observed. For the tertiary lymphoid structure to be formed, a 24 hour coculture of dendritic cells with apoptotic and necrotic melanoma cells was required. In draining lymph nodes, B16-F1 specific T CD8+ lymphocyte recruitment and proliferation was detected, and regulatory T lymphocytes were not induced. Anti- B16-F1 antibodies were detected, which could be assisting by opsonization in the immune detection of B16-F1 melanoma cells. New maturation approaches for DC-Apo/Nec cells were assayed, but it was not possible to enhance significantly their immunostimulatory capacity. It was deduced that during the coculture period the apoptotic and necrotic melanoma cells induce a loss in the functional properties of dendritic cells. Lipid accumulation was shown in these dendritic cells, which could be affecting the processing and presentation of tumoral antigens. Different aspects of the antitumor response elicited by DC-Apo/Nec vaccination were determined in this Ph.D. Thesis. We believe that apoptotic and necrotic melanoma cells are an complete melanoma antigen source, and that this work contributes on the search for new approximations and combination strategies to improve actual anti-melanoma therapies.

Díaz Carrasco, Juan María. "Compartimentación de variantes virales entre plasma y células mononucleares de sangre periférica en pacientes con infección crónica por virus de hepatitis C" (2014-08-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de hepatitis C (VHC) afecta al 3% de la población mundial, representando una de las principales causas de hepatitis crónica y trasplante hepático. En el paciente infectado, el virus existe como un espectro de mutantes que difieren en su potencial de replicación, denominado cuasiespecie. La extensa variabilidad del VHC proporciona a la cuasiespecie una alta plasticidad fenotípica y capacidad de adaptación, que favorece el mantenimiento de la infección crónica. Si bien el principal sitio de replicación del VHC es el hígado, numerosos estudios han descripto la replicación del virus en tejidos extrahepáticos, en particular en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y esto se ha asociado con el desarrollo de distintas manifestaciones extrahepáticas. Se ha relacionado a distintos genes del VHC con la compartimentación en CMSP, pero aún no está claro cuáles son los factores celulares y virales requeridos para la infección de las células linfoides, por lo que la búsqueda de patrones moleculares asociados con el linfotropismo podría aportar datos valiosos para la comprensión de este fenómeno. Además, la gran mayoría de los estudios de compartimentación se han realizado en pacientes adultos y se basan únicamente en la región HVR1 de E2. El objetivo del trabajo fue evaluar la compartimentación del VHC en CMSP y su dinámica durante la infección crónica por VHC en pacientes pediátricos mediante el análisis de genes virales involucrados en distintas etapas del ciclo de replicación viral. Se evaluó la compartimentación y la existencia de patrones moleculares asociados con el linfotropismo mediante el análisis filogenético de las secuencias de tres regiones del genoma viral: IRES, E1E2 y NS5B, obtenidas a partir de muestras seriadas de plasma y CMSP de 6 niños. Se demostró estadísticamente que existe compartimentación viral en niños, principalmente en regiones discretas dentro de E1E2 que incluyen sitios de unión a receptores, lo que sugiere que el linfotropismo del VHC podría estar determinado por restricciones en la interacción de las glucoproteínas con factores celulares involucrados en el proceso de adsorción y entrada. Si bien no se evidenció un patrón molecular asociado con el linfotropismo común a todos los casos estudiados, se observó que las regiones identificadas están sujetas a presiones selectivas diferentes en plasma y CMSP y se describieron variaciones aminoacídicas asociadas con las variantes linfotrópicas. Además de contribuir al conocimiento general acerca de la compartimentación del VHC, nuestro trabajo pone de manifiesto el importante papel que juegan las CMSP como reservorios de variabilidad genética y como compartimentos de replicación extrahepática, favoreciendo la persistencia y contribuyendo al mantenimiento de la cronicidad durante la infección por VHC en niños.

Abstract:
Worldwide prevalence of chronic hepatitis C virus (HCV) infection is estimated at 3%, representing the major cause of chronic hepatitis and liver transplantation. Within the infected patient, the virus exists as a spectrum of mutants which differ in their replication potential, termed quasispecies. The large variability of HCV quasispecies provides high phenotypic plasticity and adaptability, which favors the maintenance of chronic infection. Although the primary site of HCV replication is the liver, numerous studies have described replication in extrahepatic tissues, particularly in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and this has been associated with the development of different extrahepatic manifestations. Several viral genes have been linked to HCV PBMCs compartmentalization, but the factors required for the infection of lymphoid cells still remain unclear, and therefore the search for molecular patterns associated with lymphotropism could provide valuable data for the understanding of this phenomenon. In addition, most studies examining compartmentalization have been conducted in adult patients and are based solely on the HVR1 region of E2. The aim of this study was to assess the compartmentalization of HCV in PBMCs and its evolution dynamics during chronic HCV infection in pediatric patients by means of the analysis of certain genes involved in different stages of the viral replication cycle. Compartmentalization and the existence of molecular patterns associated with lymphotropism were evaluated by phylogenetic analysis of the sequences of three viral genes, namely IRES, E1E2 and NS5B, which were obtained from serial samples of plasma and PBMCs of 6 children. We showed that there is statistically significant compartmentalization in children, mainly in discrete regions within E1E2 that includes receptor binding sites, suggesting that HCV lymphotropism could be influenced by restrictions in the interaction of the glycoproteins with cellular factors involved in viral attachment and entry. While a common molecular pattern associated with lymphotropism was not evident in all the studied cases, it was found that the identified regions were influenced by different selective pressures both in plasma and PBMCs. Moreover, amino acid variations associated with lymphotropic variants were described. Besides contributing to general knowledge about the compartmentalization of HCV, our work highlights the important role played by PBMCs as reservoirs of genetic variability and as compartments for extrahepatic replication, favoring persistence and contributing to the maintenance of chronicity during HCV infection in children.

Taboas, Melisa. "Estudio de mutaciones noveles como causa de la deficiencia de 21-hidroxilasa" (2014-09-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Con el nombre de Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) se conoce a un conjunto de enfermedades autosómicas recesivas en las que se encuentra afectada la esteroidogénesis adrenal. En el 95% de los casos, la HSC se produce por deficiencia de la enzima 21- hidroxilasa. Esta deficiencia puede manifestarse en forma severa o clásica (FC), o leve o no clásica (FNC). La enzima está codificada por el gen CYP21A2, que se encuentra duplicado y repetido en tándem junto a un pseudogen CYP21A1P con el que comparte 98% de identidad de secuencia. La elevada identidad de secuencia produce que la región sea propensa al alineamiento incorrecto y a la recombinación desigual, como así también a la transferencia de secuencias del pseudogen al gen mediante el mecanismo de conversión génica. La mayor parte de los afectados son compuesto heterocigotas ya que poseen diferentes mutaciones en cada uno de sus alelos. En estos casos, la manifestación clínica de la enfermedad será aquella que se relaciona con el alelo con mayor actividad enzimática. Si bien la mayor parte de los pacientes presentan mutaciones derivadas del pseudogen, hasta la fecha se identificaron más de 240 mutaciones diferentes como causales de la patología. En un trabajo previo de nuestro laboratorio se analizó la presencia de las 10 mutaciones más frecuentes derivadas del pseudogén en pacientes con deficiencia de 21-hidoxilasa de nuestra población. En esta tesis se estudió por secuenciación todo el gen CYP21A2 y su región promotora en muestras de ADN de 87 pacientes (15 FC y 72 FNC) en los cuales restaba determinar el defecto causante de la patología en uno o en ambos alelos del gen. Nuestro análisis reveló la presencia de 12 mutaciones poco frecuentes ya descriptas previamente y 7 mutaciones noveles, 6 en la región codificante y 1 en un sitio aceptor de splicing en el intrón 5. Para todas las mutaciones noveles halladas se analizaron 50 individuos de la población general mediante amplificación de la región de interés y cortes con enzimas de restricción y en ningún caso se halló la presencia de las mismas. Se hallaron asimismo, variantes de secuencias no descriptas previamente en regiones promotoras e intrónicas que se clasificaron como polimorfismos ya sea porque las mismas se observaron también en individuos de la población general, o bien porque no se encuentran en sitios que a priori pudieran afectar el splicing, respectivamente.A los efectos de analizar la implicancia biológica de las mutaciones noveles halladas, se realizaron aproximaciones bioinformáticas y ensayos funcionales. Dado que la proteína CYP21A2 humana no está cristalizada, la misma se modeló mediante herramientas in silico a partir de 18 cristalografías de otras proteínas de la familia CYP. Una vez obtenido el modelo, se analizó la estabilidad de las mutantes aminoacídicas halladas que no generaban corrimiento del marco de lectura. Las predicciones indicaron cambios en la estabilidad y/o carga de la superficie de la proteína que sugerirían un posible efecto deletéreo de las mismas. Para los ensayos funcionales, se realizaron mutagénesis dirigidas sobre un vector que contiene al ADNc de CYP21A2, transfección en células COS-7 y estimación de la expresión de la proteína y de su actividad mediante Western Blot y cromatografía en placa delgada (TLC), respectivamente. En todos los casos, las mutantes presentaron una actividad enzimática residual (AER) entre el 15 y el 50%, que se corresponderían con alelos relacionados a la FNC de la patología. En uno de los pacientes, una de las mutaciones noveles se encontraba en el mismo alelo con otra descripta previamente. Los ensayos funcionales demostraron que si bien las mismas en forma aislada son leves, la presencia de ambas en cis predice un alelo severo con una AER cercana al 2%. Para algunas de las mutaciones puntuales y para la doble mutante se observó una disminución en la cantidad de proteína resultante. Para la mutación en el sitio aceptor de splicing en el intrón 5, los análisis bioinformáticos predijeron la anulación del sitio canónico y la presencia de 2 sitios crípticos de splicing, uno en la mitad del intrón 5 y otro en el exón 6. Para evaluar la eficiencia de splicing in vitro, los estudios funcionales consistieron en la construcción de un minigén mediante amplificación de un fragmento entre el exón 4 y el exón 7 del gen, posterior clonado en un vector de expresión, transfección en células HeLa, HEK-293 e Y-1 y valoración del ARNm obtenido por RTPCR. Los ensayos revelaron que la mutante presentaba un ARNm más corto que la salvaje producto de una deleción de 16 nucleótidos debido a la utilización del sitio críptico de splicing dentro del exón 6. Esta deleción generaría un codón de terminación prematuro que predice un alelo severo relacionado con la FC de la patología. Mediante este estudio, el genotipo se completó en 27 de los 87 pacientes (100% de los pacientes FC y 16,6% FNC). Estos resultados señalarían que es probable que el valor de 17- hidroxiprogesterona (17-OHP) post estímulo con ACTH (test que se realiza para incluir a los pacientes de la FNC), esté sobreestimando la prevalencia de la patología. A los efectos de disciminar si los valores hormonales difieren entre los pacientes FNC totalmente genotipificados y aquellos que no, se compararon los valores hormonales de 17-OHP basal y post estimulación con ACTH, así como los de Dehidroepiandrosterona-sulfato (DHEA-S), Testosterona (T) y Androstenediona (A) de 271 pacientes diagnosticados como FNC. Los mismos fueron agrupados de acuerdo a si poseen los 2 alelos mutados, uno o ninguno. Los resultados obtenidos indican que no hay diferencias significativas entre los grupos estudiados cuando se analizaron los valores de A, T y DHEA-S. Sin embargo, en el caso de 17-OHP basal y post ACTH, se observan diferencias significativas entre aquellos que poseen ambos alelos con mutación y los demás grupos de estudio. Asimismo, se observó que si los pacientes presentaban valores de 17-OHP post ACTH entre 10 (valor hormonal de corte para la inclusión de pacientes) y 20 ng/ml, sólo en el 23% se hallaban los 2 alelos mutados Si el valor hormonal era mayor a 20 ng/ml, el 85% posee ambos alelos con mutación. Por último, analizando los genotipos encontrados en todos los pacientes de nuestra cohorte, ya sea mediante secuenciación o mediante el estudio de las 10 mutaciónes más frecuentes, observamos que en un 97,7% de los pacientes el fenotipo se correspondía con el genotipo hallado. Las principales discordancias se hallaron en pacientes con la mutación p.I172N, ya que la misma se asoció tanto a la forma virilizante simple (VS) como a la forma perdedora de sal. Por otro lado, si bien la mutación p.R356W está altamente relacionada a la forma PS de la enfermedad, un paciente VS presentaba esta mutación en heterocigosis compuesta con otra mutación que predice una enzima sin actividad en el alelo homólogo. Asimismo, en la literatura se describe a la mutación poco frecuente p.H62L como una mutación leve y asociada a la FNC de la patología. En esta tesis, sin embargo, se refiere que la misma se relacionaría también con la forma VS de la enfermedad. Por último, la mutación poco frecuente p.R341P se asocia a la forma VS, si bien en este trabajo se describe un paciente PS que poseía esta mutación en heterocigosis compuesta con la mutación c.283-13A/C>G en el otro alelo.

Abstract:
Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) is an autosomal recessive disease caused, in 95 % of cases, by the deficiency of the 21–hydroxylase enzyme. This disorder, which is the most frequent inborn error of metabolism, has a broad spectrum of clinical forms, ranging from severe or classical, which includes the salt-wasting (SW) and simple virilising (SV) forms, to the mild late onset or non-classical form of CAH (NCCAH). The enzyme is encoded by the CYP21A2 gene, which is duplicated and repeated in tandem along with the CYP21A1P pseudogene with which it shares 98 % of sequence identity. The high degree of sequence identity makes this region prone to misalignment and unequal recombination, as well as the transference of sequences from the pseudogene to the gene by gene conversion. Although most of the patients presented pseudogene derived mutations, approximately 240 mutations haven been described up to date. In this work, DNA from 87 patients (15 CCAH and 72 NCCAH) was analyzed by complete gene sequencing. In these patients the determination of the defect causing the disease remained inconclusive after the study of the 10 most frequent pseudogen-derived mutations. We found 12 less frequent mutations previously described, and 7 novel ones, 6 of them in the coding region and one in an acceptor splice site in intron 5. For all the novel mutations, DNA from 50 randomly selected individuals from the general population were analyzed by PCR amplification followed by restriction enzyme assays, but none of these mutations were found. We also found novel sequence variants in in the promoter region of the gene and in introns that were classified as polymorphisms, either because they were found in individuals from the general population, or because they are placed in regions that might not affect splicing outcome, respectively. In order to study the biological consequences of the novel mutations, bioinformatic approaches and functional assays were performed. Since human CYP21A2 was not crystallized yet, the protein was modeled by means of in silico tools using 18 other CYP proteins as templates followed by the estimation of the mutant protein stability. Molecular modeling studies revealed changes in the stability and/or surface charge of the protein that could be related to the clinical manifestations found in the patients. For functional assays, site-directed mutagenesis of a vector containing the CYP21A2 cDNA were performed, followed by transfection into COS-7 cells and estimation of the protein expression by Western blotting (WB) and its activity by TLC. In all cases, the mutants showed a residual enzymatic activity (REA) lesser than 50% of the wild type protein. Accordingly, all the variants predict alleles compatible to the mild NCCAH form of the disease. In one patient, one of the novel mutations was found in the same allele with another previously described. Functional assays showed that while the mutations in isolation are mild, the presence of both mutations in cis predict a severe allele with a REA close to 2%. In the WB assays, some of the isolated mutants and the double one showed less amount of the protein in comparison with the wild type. For the novel mutation in the acceptor splcing site of intron 5, in silico analyses predicted the disruption of the canonical site. Besides, two strong putative cryptic splicing sites, one located in the intron 5 and one in exon 6 were predicted. For functional assays, splicing reporter minigenes were constructed comprising the genomic region from exon 4 to exon 7 of the CYP21A2 gene. The vector was transiently transfected into HEK-293, HeLa, Y-1 cells and splicing was assessed by RT-PCR. We demonstrate that the allele with the intron 5 mutation completely abolishes the use of the canonical splicing site. Instead, the use of the cryptic splicing acceptor site within exon 6 created an mRNA with a 16 nt deletion leading to the appearance of a premature stop codon. A severe allele related to the classical form of the disease is strongly suggested by this mutation. After our work, the genotype was completed in 27 out of 87 patients (100 % of the CCAH and 16,6% of the NCCAH). This results may indicate that the currently cut-off hormonal levels used for the diagnosis of NCCAH is overestimating the prevalence of the disease. To evaluate if hormone values differ between the NCCAH patients fully genotyped and those with at least one non-determined allele, basal and post ACTH stimulation 17-hydroxyprogesterone (17-OHP), dehydroepiandrosterone-sulfate (DHEA-S), testosterone (T) and androstenedione (A) values were compared in 271 patients diagnosed as NCCAH. Patients were grouped according to whether they had 2 mutated alleles, one or no one. Our analysis revealed no significant differences between groups when the values of A, T and DHEA-S were compared. However, basal and post ACTH 17-OHP levels were statistically different between those patients having both mutated alleles and those with one or no one. Among patients with 17-OHP post ACTH values between 10 (currently cut-off value) and 20 ng/ml, only a 23 % had 2 mutated alleles, whereas if the values were greater than 20 ng/ml, 85 % of patients had mutations in both alleles. Finally, analyzing the genotypes found in all our patients, either after sequencing or by studying the 10 most frequent mutations, we observed a 97,7% phenotype-genotype correlation, while discrepancies were found mostly associated to the p.I172N mutation. Patients having this mutation presented either with the SV form or with the SW one. In addition, while p.R356W mutation is strongly associated with the SW form of the disease, we found the mutation in one patient SV with another severe mutation in the homologous allele. On the other hand, the less frequent p.H62L is described in literature related to the mild NCCAH form. In this work, however, it is reported associated to the SV form of the disease. Finally, the less frequent SV p.R341P mutation, is herein described in a SW patient having the c.283-13A / C> G mutation in the homologous allele.

Ronchetti, Sonia Alejandra. "Efectos del arsénico sobre la adenohipófisis. Mecanismos de acción" (2014-12-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Introducción: El arsénico es un metaloide ampliamente distribuido en el ambiente el cual presenta potentes efectos tóxicos. La contaminación provocada por arsénico inorgánico (iAs) es uno de los mayores problemas sanitarios a nivel mundial. Si bien se han reportado efectos adversos del iAs sobre la función reproductiva, poco se conoce de sus acciones sobre la liberación hormonal y la fisiología adenohipofisaria. Objetivos: 1) Estudiar el efecto citotóxico del iAs sobre la fisiología adenohipofisaria y caracterizar los mecanismos de acción. 2) Investigar el papel del iAs como agente xenoestrogénico en la adenohipófisis y el útero. Resultados: 1) La exposición al iAs, a través del agua de bebida en diferentes concentraciones (5, 25 o 100 ppm) durante 30 días en ratas machos, disminuyó los niveles plasmáticos de prolactina (PRL) en forma dosis dependiente, mientas que la hormona luteinizante (LH) se vio afectada sólo con la máxima concentración utilizada. La administración del metaloide in vivo alteró la expresión del ARNm de genes de respuesta al estrés oxidativo en la adenohipófisis sugiriendo que, en estas condiciones, el iAs induce estrés oxidativo en la glándula. Confirmando los resultados in vivo, el iAs, en concentraciones micromolares, disminuyó la liberación de PRL en forma tiempo-dependiente sin afectar la de LH en cultivos primarios de células adenohipofisarias. Además, el iAs redujo la viabilidad celular adenohipofisaria, efecto debido principalmente a la inducción de apoptosis. Este proceso se caracterizó por un incremento de las especies reactivas del oxígeno, la despolarización del potencial de la membrana mitocondrial y un aumento en la expresión del ARNm de MT-1 y HO-1. El tratamiento con el antioxidante Nacetilcisteína previno el efecto citotóxico y la inhibición de la liberación de PRL inducida por iAs. 2) La administración del iAs a dosis bajas (0,1 ppm) durante 30 días a ratas hembras ovariectomizadas (OVX) indujo la aparición de proestros y estros respecto al control OVX. En la adenohipófisis, se observó un estímulo en la proliferación celular, especialmente de los lactotropos y un incremento en la secreción de PRL. Este metaloide también reguló la expresión proteica del REa y de su variante truncada. En el útero, la exposición al metaloide causó modificaciones citoestructurales mostrando un incremento del área glandular y de la altura del epitelio. Además, el iAs alteró la expresión del REa en las células epiteliales y en el estroma. Conclusiones: El iAs es un disruptor endocrino cuyos efectos varían con la dosis y el tiempo de exposición. A concentraciones micromolares, el iAs induce apoptosis e inhibe la secreción de prolactina. La generación de estrés oxidativo parece ser el principal mediador de los efectos tóxicos del metaloide. Por otro lado, a concentraciones más bajas, el iAs reproduce las acciones del estrógeno, estimulando la proliferación celular en tejidos hormona-dependientes.

Abstract:
Introduction: Arsenic is a metalloid ubiquitously present in the environment with potent toxic effects. Inorganic arsenic (iAs) contamination is considered one of the top environmental health threats worldwide. Many reports have shown that iAs affects reproductive system, however, little is known about the effect of iAs on hormone release and anterior pituitary physiology. Objectives: 1) To study the cytotoxic effect of iAs on anterior pituitary physiology and describe its mechanisms. 2) To investigate iAs xenoestrogenic role on anterior pituitary and uterus. Results: 1) iAs exposure (5, 25 or 100 ppm) to male rats through drinking water for 30 days decreased prolactin (PRL) serum levels in a dose-dependent manner whereas luteinizing hormone (LH) levels were affected only at the highest concentration used. In vivo iAs administration increased mRNA expression of several oxidative stress-responsive genes in anterior pituitary gland, suggesting that this metalloid induces oxidative stress in pituitary gland. iAs, at micromolar concentrations, significantly decreased PRL release in a timedependent fashion whereas LH levels remained unaltered in anterior pituitary cells in culture. Besides, iAs reduced cell viability mainly by apoptosis. This process is characterized by increased levels of reactive oxygen species, early depolarization of mitochondrial membrane potential and augmented expression of some key oxidative stress-responsive genes such as HO-1 and MT-1. The antioxidant N-acetylcysteine prevented iAs-induced cytotoxic effects and prolactin release inhibition. 2) iAs administration at lower doses (0,1 ppm) to female ovariectomized rats (OVX) for 30 days induced the apparition of proestrus and estrus. In the pituitary gland iAs stimulated cell proliferation, especially of lactotroph and increased PRL secretion. This metalloid also regulated protein expression of ERa and its truncated variant. In uterus, iAs exposure caused cytoarchitectural changes by increasing both glandular area and uterine epithelium height. Besides, iAs altered ERa expression in epithelial cells and stroma. Conclusions: iAs is an endocrine disruptor whose effects vary with dose and exposure time. At micromolar concentrations iAs induces apoptosis and inhibits PRL secretion. Oxidative stress generation seems to be the main mediator of the metalloid’s toxic effects. On the other hand, at lower concentrations, iAs mimics estrogen actions by stimulating cell proliferation on hormone-dependent tissues.

Crisp, Renée Leonor. "Esferocitosis hereditaria: avance en la metodología diagnóstica, estudios demográficos e investigación de mecanismos involucrados" (2014-12-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Esferocitosis Hereditaria (ESH) es una anemia hemolítica de observación frecuente, caracterizada por alteraciones cuali y/o cuantitativas –genéticamente determinadas– de las proteínas de la membrana eritrocitaria. Consecuentemente, se debilita la unión entre la membrana eritrocitaria y el citoesqueleto subyacente, produciéndose la pérdida progresiva de la membrana con formación de hematíes de forma esférica, osmóticamente frágiles, que son selectivamente atrapados y destruidos en el bazo. Muchas alteraciones en diferentes genes pueden generar la misma enfermedad. Clínicamente se caracteriza por anemia, ictericia y esplenomegalia. La ESH es la anemia hemolítica hereditaria más frecuente en Argentina. A pesar de ello, es muy escasa la información sobre su comportamiento en nuestro país. Los objetivos de esta tesis son: a) Investigar avances en la metodología de diagnóstico a partir del análisis e implementación de nuevas pruebas que han sido desarrolladas durante la última década; b) Establecer aspectos demográficos de la ESH en la población atendida por nuestro grupo de trabajo; c) Dilucidar algunos mecanismos involucrados en la enfermedad. En este trabajo se utilizaron las pruebas tradicionales (fragilidad osmótica eritrocitaria y prueba de autohemólisis) y se desarrollaron por primera vez en nuestro país las nuevas pruebas diagnósticas (citometría de flujo con 5’eosina maleimida, criohemólisis hipertónica y fragilidad osmótica por citometría de flujo) estableciendo sus puntos de corte, sensibilidad, especificidad y valores predictivos. El análisis de los resultados de los ensayos electroforéticos de las membranas eritrocitarias permitió establecer que las deficiencias de espectrina y ankirina son las prevalentes en nuestra población. En los casos en que fue posible, el estudio se extendió al grupo familiar primario pudiendo detectar portadores sanos y establecer el patrón de herencia. Para poder realizar el diagnóstico en forma precoz, se desarrollaron las nuevas pruebas utilizando sangre capilar, estableciendo la presencia de la patología en neonatos de hasta 2 días de vida. El seguimiento clínico permitió observar la alta frecuencia de crisis hemolíticas asociadas a episodios febriles por lo que se decidió evaluar la posibilidad de que el agravamiento de la anemia fuera debido, en parte, a un efecto directo de la temperatura sobre los esferocitos. Se pudo observar que la hipertermia induce eriptosis mediada por la entrada de calcio a la célula, lo que podría contribuir al empeoramiento de la anemia o al desarrollo de la misma en individuos asintomáticos. La heterogeneidad clínica no pudo relacionarse al tipo de alteración proteica ni a los resultados de las pruebas diagnósticas. En la búsqueda de una alteración en común que pudiera correlacionar con la severidad de la anemia encontramos una expresión disminuida de acuaporina 1 (AQP-1), canal responsable del flujo de agua en el eritrocito, independientemente de la proteína de membrana afectada. El trabajo de tesis presentado implica un avance metodológico por haber desarrollado las nuevas técnicas diagnósticas en nuestro país y haber establecido la equivalencia para realizar los estudios con sangre capilar, conduciendo a un diagnóstico certero y precoz en los neonatos. Los antecedentes y el seguimiento clínico permitieron describir el comportamiento de la enfermedad en los pacientes pertenecientes a nuestra población. Por otra parte, los estudios in vitro, que mostraron sensibilidad de los eritrocitos de los pacientes a la temperatura y asociación de la disminución de AQP-1 en eritrocitos con la severidad de la enfermedad, abren un nuevo camino en la investigación de la esferocitosis hereditaria con una potencial aplicación terapéutica a futuro.

Abstract:
Hereditary spherocytosis (HS) is a common hemolytic anemia, characterized by genetically determined quantitative and/or qualitative abnormalities of the red cell membrane proteins. As a consequence, the connection of skeleton and bilayer gets weakened, loss of membrane surface occurs and changes in red cell lead to the formation of spherical, osmotically fragile erythrocytes, which are selectively trapped and destroyed in the spleen. Diverse mutations in different genes can generate the same disease. HS is characterized by anemia, jaundice, and splenomegaly. Although HS is the most common hereditary hemolytic anemia in Argentina, information concerning its behavior in our country is very scarce. Aims of this thesis are: a) To evaluate advances on diagnostic methodology since the development of new diagnostic tests described throughout the last decade; b) To establish demographics characteristics of HS in the population attended by our working group; c) To elucidate some mechanisms involved in the disease. In this study, standard screening tests –osmotic fragility and autohemolysis– and novel diagnostic tests –eosin-5’maleimide flow cytometry, hypertonic cryohemolysis, and flow cytometric osmotic fragility– were carried out. As these new diagnostic techniques were developed for the first time in our country, their cut-off points, sensitivity and specificity were established. Electrophoresis of membrane proteins established that spectrin and ankyrin are the most frequently found deficiencies in our population. As far as possible, direct relatives were also studied, allowing to detect silent carriers and to establish the inheritance pattern. Novel tests were also developed using capillary blood, to accomplish an earlier diagnosis. So, HS could be diagnosed in neonates aged only 2 days. Patients’ follow-up showed a high frequency of hemolytic crisis associated to febrile diseases. Therefore, we decided to evaluate whether the temperature increment on spherocytes may be one factor responsible for the worsening of hemolysis. Results showed that hyperthermia induced eriptosis mediated by calcium influx to the erythrocyte, which could play a role either for anemia worsening or for anemia development in previously asymptomatic individuals. No correlation between severity of the disease and either deficient protein or results of diagnostic tests could be demonstrated. Searching for an unique factor associated with severity of anemia, a decreased expression of aquaporin-1 (AQP-1), the channel responsible of water influx in the erythrocyte, was found irrespectively of the type of protein deficiency. This thesis implies a methodological advance due to the development for the first time in Argentina of the novel diagnostic tests, as well as the demonstration that they can also be performed with capillary blood, allowing an early and accurate diagnosis in neonates and small infants. Antecedents and clinical follow-up enabled to establish the behavior of the disease in the population of our country. Furthermore, results of in vitro studies showing a harmful effect of hyperthermia on erythrocytes of patients, and association of AQP-1 decrease with severity of the disease, open a new way on HS research with potential future applications.

Bourguignon, Nadia Soledad. "El arsenito de sodio, un disruptor endócrino que afecta el eje reproductivo y la homeostasis de la glucosa" (2014-12-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La contaminación con As (As) en el agua de bebida se considera una amenaza para la salud en todo el mundo, ya que está asociado a un mayor riesgo de contraer enfermedades como cáncer de piel y pulmón, provocar efectos indeseables sobre el desarrollo, la reproducción las secreciones internas y alteraciones cardiovasculares. Debido a que el As puede actuar como un disruptor endócrino aquí investigamos el efecto de la exposición a As, durante períodos críticos del desarrollo neuroendócrino como es la gestación y las semanas postparto, sobre el eje reproductivo y el metabolismo de la glucosa, en las madres y sus crías. Se administraron 5 (A5) o 50 ppm (A50) de arsenito de sodio en el agua de bebida a ratas Sprague Dawley preñadas, desde el día 1 de gestación hasta el sacrificio (2 meses postparto). Al destete, se dividieron las crías en dos grupos: uno continuó recibiendo el mismo tratamiento que la madre y el otro recibió agua destilada hasta el día del sacrificio (4 meses). En las madres, la exposición a As produjo alteraciones en la homeostasis de la glucosa durante la preñez, probablemente alterando la funcionalidad de las células β, incrementando el riesgo de desarrollar diabetes gestacional. Además, alteró la fisiología reproductiva, sugiriendo el desarrollo de una falla ovárica prematura. Las crías expuestas a As durante el desarrollo presentaron alteraciones en la fisiología reproductiva, principalmente las hembras, mientras que el metabolismo de la glucosa no se vio afectado.

Abstract:
Arsenic contamination in drinking water is considered a worldwide threat to health, that is associated with an increased risk of diseases such as skin and lung cancer, cause undesirable effects on development, internal reproduction secretions and cardiovascular disorders. Because As can act as an endocrine disruptor, here we investigated the effect of As exposure, during critical periods of neuroendocrine development as gestation and postnatal weeks, on the reproductive axis and metabolism of glucose in dams and their offspring. We administered 5 (A5) or 50 ppm (A50) of sodium arsenite in drinking water to Sprague Dawley rats from gestational day 1 until sacrifice (two months postpartum). At weaning the offspring were divided in two groups: one of each continued to receive the same treatment and the other one received distilled water until sacrifice (4 months of age). In dams, As exposure induces glucose homeostasis alterations during pregnancy, probably by altering β-cell function, increasing the risk of developing gestational diabetes. In addition, profoundly impaired reproductive physiology, suggesting premature ovarian failure due to arsenic exposure, may have developed. Offspring rats exposed to arsenic during development present altered reproductive physiology, mainly females, while metabolism is not affected.

Martire Greco, Daiana. "Efecto inmunomodulador del ácido All-Trans Retinoico (ATRA) como estrategia para la reversión de la inmunosupresión asociada a procesos infecciosos en un modelo murino" (2015-03-06) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las infecciones secundarias asociadas a estados de inmunosupresión en pacientes sépticos son la principal causa de muerte en las Unidades de Cuidados Intensivos. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias enfocadas a utilizar drogas que reviertan este estado resulta prometedor. En este trabajo utilizamos el Ácido All-trans Retinoico (ATRA) para estudiar la modulación del estado inmunológico en un modelo murino de inmunosupresión (IS) por administración crónica de lipopolisacáridos. Demostramos un rol primordial de las células mieloides supresoras (Gr-1+ CD11b+ supresoras) en la inhibición de la proliferación T en los animales IS. Esta población adquiere sus propiedades inhibitorias en la médula ósea, y en el contexto de inmunosupresión, es direccionada a los ganglios linfáticos para ejercer su función. Asimismo, el ATRA evidenció claros efectos en el restablecimiento de la proliferación de linfocitos T, asociado a una disminución del número de Gr-1+ CD11b+ supresoras vivas en ganglios linfáticos, acompañado también de un aumento en los linfocitos T CD4+. Asimismo, demostramos que la administración del ATRA a los animales IS mejoró tanto la respuesta inmune innata, en términos de eliminación de un foco bacteriano, como la respuesta inmune humoral primaria. Nuestros resultados demuestran que el ATRA modula la respuesta inmune alterada en el estado de inmunosupresión actuando sobre distintos procesos y representa una estrategia posible para el tratamiento de pacientes sépticos que presenten un estado de inmunosupresión.

Abstract:
Secondary infections associated with immunosuppressive states in septic patients are the leading cause of death in Intensive Care Units. Therefore, the development of strategies aimed at using drugs to reverse this state is promising. In this study we used All-Trans Retinoic Acid (ATRA) to study the modulation of the immune response in a murine model of immunosuppression (IS) by chronic administration of lipopolysaccharide. We demonstrated a key role of Myeloid Suppressor Cells (Gr-1+ CD11b+ suppressors) in the inhibition of T cell proliferation in IS animals. This population acquires its inhibitory properties in the bone marrow, and in the context of immunosuppression, migrates to the lymph nodes to exert its function. Furthermore, ATRA showed clear effects in restoring T cell proliferation associated with a decrease in the number of live Gr-1+ CD11b+ suppressor cells in lymph nodes, also accompanied by an increase in CD4 + lymphocytes. In addition, we showed that administration of ATRA to IS animals improved both the innate and immune response, in terms of bacterial clearance and the primary humoral immune response. Our results demonstrate that ATRA modulates the impaired immune response in LPS-induced immunosuppression acting on different processes, and represents a potential strategy for the treatment of septic patients with an immunosuppressive state.

Ghiglione, Yanina Alexandra. "Análisis de potenciales correlatos inmunes de control en la infección por HIV-1 durante la serconversión y el primer año de infección" (2015-03-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En los últimos años, se ha puesto especial énfasis en el estudio de la respuesta T CD8+ dado el rol central que esta juega en el control de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV, human immunodeficiency virus). Sin embargo sigue siendo clave la identificación y compresión de nuevos correlatos inmune de protección. Más aún, la etapa de infección aguda representa un escenario propicio para el estudio de las funciones que mejor se correlacionan con control viral. El objetivo de esta tesis fue analizar la especificidad, funcionalidad y el fenotipo de la respuesta T CD8+ HIV-específica en una cohorte de individuos recientemente infectados y su asociación con el control de la replicación viral y de la progresión a la enfermedad (evaluado mediante la carga viral, recuento de células T CD4+ y activación inmune), durante la seroconversión y el primer año de infección. Se obtuvieron muestras de sangre de 51 individuos reclutados dentro de los primeros 6 meses desde la fecha probable de infección (PHI, Primary HIV infection); 22 sujetos crónicamente infectados (Crónicos) y 14 sujetos controladores elite (EC, Elite Controllers). Se observó que, a pesar que Nef dominó la respuesta anti-HIV durante la infección aguda/temprana, la aparición temprana de una alta proporción de células T anti- Gag se correlacionó con un retraso en la progresión. Las células T CD8+ HIV-específicas polifuncionales fueron detectadas en tiempos tempranos post-infección pero no se asociaron con control viral. Por el contrario, se observó que los sujetos PHI que presentaban células T CD8+ con una mayor capacidad de mediar actividad antiviral (VIA, viral inhibitory activity), en la muestra basal, presentaron set points inmunes más elevados. Además, los niveles de VIA se correlacionaron con la magnitud de la respuesta T CD8+ anti-Gag. A su vez, las células T CD8+ Gag-específicas mostraron una mayor capacidad de mediar la lisis de células infectadas (lo cual se evidenció por una mayor capacidad de degranulación) y de producir, de manera simultánea, INF-γ lo cual les conferiría una ventaja para ejercer su actividad antiviral. Por otro lado, se observó que la distribución de las subpoblaciones de memoria de las células T CD8+, tanto totales como de las HIV-específicas, se encuentra sesgada en los individuos PHI, pero no alcanza los niveles dramáticos observados en los sujetos Crónicos. El análisis de la expresión de PD-1 en los individuos PHI, tanto en las células T CD8+ totales como HIV-específicas, reveló no sólo una asociación con progresión a la enfermedad si no también con el perfil de memoria de la población celular T CD8+. Notablemente, se obtuvieron correlaciones directas entre los niveles de VIA y la proporción de células T CD8+ con fenotipo terminal, tanto en la muestra basal como a los 12 meses post-infección. En consecuencia, se estableció una relación entre la preservación de la ruta de diferenciación de las células T CD8+ y la funcionalidad de las mismas. Esta tesis representa el primer trabajo donde se realizó una caracterización completa de la respuesta T CD8+ en una cohorte Argentina de individuos cursando la infección aguda/temprana por HIV. El poder descifrar la relación que existe entre la características que definen a las células T CD8+ con los niveles de activación inmune, el control viral y la progresión a la enfermedad en los distintos estadíos de la infección (como son la infección primaria, crónica o en EC), como ha sido llevado a cabo en esta tesis, es primordial para profundizar en el conocimiento que se tiene de la inmunopatogénesis del virus. Además, esta información es de suma importancia para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas frente al HIV así como en el diseño y posterior testeo de vacunas que promuevan una respuesta beneficiosa.

Abstract:
Given the central role that HIV-specific CD8+ T-cells play in the control of the human immunodeficiency virus (HIV) replication, special emphasis has been focused on this cell population. However, correlates of immune protection remain elusive. Moreover, the acute phase of infection represents a proper scenario to delineate the antiviral cellular functions that best correlate with virus control. The aim of the present study was to analyze specificity, functionality and phenotype of the HIV-specific immune response in a cohort of acute/early HIV-infected individuals and their associations with viral control and disease progression, during the seroconvertion and the first year post-infection. Blood samples from 51 subjects recruited within 6 months from infection (primary HIV infection ); 22 chronically infected subjects (Chronics) and 14 Elite Controllers (EC) were obtained. Results indicated that, although Nef dominated the anti-HIV response during acute/early infection, a higher proportion of early anti-Gag T cells correlated with delayed progression. Polyfunctional HIV-specific CD8+ T cells were detected at early time points but did not associate with virus control. Conversely, higher CD4+ T-cell set points were observed in PHI subjects with higher capacity of the CD8+ T-cells to mediate ex vivo viral inhibitory activity (VIA), at baseline. Importantly, VIA levels correlated with the magnitude of the anti-Gag cellular response. The advantage of Gag-specific cells relied on their enhanced ability to mediate lysis of infected cells (evidenced by a higher capacity to degranulate) and to simultaneously produce IFN-γ. Moreover, it was found that normal maturation of total and HIV-specific CD8+ T-cells into memory subsets is skewed in PHI, but not at the dramatic level observed in Chronics. Analysis of PD-1 expression, on bulk and HIV-specific CD8+ Tcells, from PHI subjects revealed not only an association with disease progression but also with skewed memory CD8+ T-cell differentiation. Most notably, significant direct correlations were obtained between the VIA levels and the higher proportions of fully-differentiated HIVspecific CD8+ T cells, both at baseline and at 12 months post-infection. Thus, a relationship between preservation of CD8+ T-cell differentiation pathway and cell functionality was established. This thesis represents the first work were a fully characterization of the CD8+ T-cell response have been performed in a cohort of acute/early HIV-infected individuals from Argentina. Unscrambling relationships among the CD8+ T-cell characteristics, immune activation, viral control, and disease progression in multiple settings (primary infection, viremic Chronics and ECs), such as those observed in this work, are increasingly important to advance our understanding of HIV pathogenesis. As well, this information will be instrumental for therapeutic and sterilizing vaccine design in order to boost our ability to elicit beneficial responses.

Sabio y García, Carmen Alejandra. "Impacto de la anafilotoxina C5a en la respuesta inmune inducida por cepas locales de Mycobacterium tuberculosis multirresistentes a drogas" (2015-03-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La tuberculosis es un problema de salud prioritario en Argentina, así como lo es a nivel mundial al punto que la Organización Mundial de la Salud ha declarado la emergencia pública sanitaria global. Este problema se ve agravado por el surgimiento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) multirresistentes a las drogas de primera línea utilizadas para combatirla. En la presente tesis, evaluamos el rol de la anafilotoxina C5a y sus receptores, C5aR y C5L2, sobre la respuesta inmune inducida por las cepas locales de brote multirresistentes a drogas, M y Ra, tomando como referencia la cepa de laboratorio H37Rv. Nuestros resultados muestran que: 1) Mtb induce la producción de C5/C5a en los monocitos y modula la expresión de C5aR y C5L2, receptores del fragmento activado C5a, durante la diferenciación de los monocitos a macrófagos; 2) el receptor C5aR expresado en monocitos participa de la inhibición de la polarización Th1 en la respuesta inducida por la cepa M, impidiendo el aumento de la población CD4+IFNγ+ en respuesta a la estimulación con esta cepa; 3) la interacción C5a-C5aR modula la expresión de las moléculas de superficie CD11b y HLA-DR en monocitos en diferenciación a macrófagos estimulados con las cepas H37Rv, M y Ra; 4) C5a aumenta la producción de intermediarios reactivos del oxígenos inducido por H37Rv y Ra, y puede compensar la disminución en esta respuesta debida la ausencia de señalización por otros receptores involucrados en la misma; 5) H37Rv, M y Ra presentan diferencias en la inducción de las respuestas estudiadas. La cepa M en particular, induce menor respuesta en: inducción de la producción de C5/C5a en monocitos, regulación de la expresión de los receptores C5aR y C5L2, inducción de intermediarios reactivos y ausencia de regulación de su producción por C5a. Aun así, el perfil de activación inducido por esta cepa es susceptible a ser modulado por C5aR. Estos resultados sugieren que C5a es producido como consecuencia de la presencia de Mtb y que esta anafilotoxina actúa, a través de sus receptores, modulando distintos niveles de la respuesta inmune contra este patógeno los cuales son determinantes para el éxito o fracaso de dicha respuesta. Más aún, demostramos que tanto los parámetros estudiados como su modulación por C5a dependen del genotipo bacteriano. Palabras claves: Mycobaterium tuberculosis - cepas multirresistentes a drogas – anafilotoxina C5a – receptores C5aR y C5L2 –monocitos – respuesta T CD4+ – intermediarios reactivos del oxígeno

Abstract:
Tuberculosis is a major health problem in Argentina as well as at a global level, and because of its relevance it was declared as a global public health emergency by the World Health Organization. This problem has been aggravated by the appearance of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) strains resistant to the two first line anti-tuberculosis drugs. In the present thesis, we evaluate the role of C5a anaphylatoxin and its receptors, C5aR and C5L2, in the immune response induced by the local outbreak multidrug-resistant strains, M and Ra, by taking H37Rv as a laboratory reference strain. Our results show that: 1) Mtb induces C5/C5a production by monocytes and modulates C5aR and C5L2, which are receptors of the activated fragment C5a, during monocyte-to-macrophage differentiation; 2) the C5aR receptor expressed in monocytes is involved in the inhibition of M strain-induced Th1 polarization, which prevents the increase of CD4+IFNγ+ T cells in response to this strain stimulation; 3) the C5a-C5aR interaction modulates the surface expression of CD11b and HLA-DR of monocytes in differentiation to macrophage stimulated with H37Rv, M or Ra strains; 4) C5a increases reactive oxygen species (ROS) production induced by H37Rv and Ra, and is able to compensate the decrease of ROS production due to the absence of signaling from other receptors involved in this response; 5) H37Rv, M and Ra display different immune responses. Particularly, M strain induces a weaker response in: monocyte C5/C5a production, the regulation of C5aR and C5L2 expression, the induction of ROS production and lack of C5a regulation of this last response; yet, the activation profile induced by this strain is susceptible to C5aR modulation. These results suggest that C5a is produced in response to Mtb and acts, through it receptors, modulating the immune response against this pathogen at different levels which are determinants for the success or failure of this response. Moreover, we demonstrated that the bacterial genotype influences both the analyzed parameters and their modulation through C5a. Keywords: Mycobaterium tuberculosis – multidrug resistant strains – monocytes – C5a anaphylatoxin – C5aR and C5L2 receptors– CD4+ T cells response – reactive oxygen species

Bordone, Melina Paula. "Estudio de las vías visuales superiores en el glaucoma experimental" (2015-03-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El glaucoma, una de las principales causas de ceguera irreversible, se caracteriza por una pérdida progresiva de las funciones visuales, que se asocia a la muerte de células ganglionares retinianas (CGRs) y atrofia de la cabeza del nervio óptico (NO). El principal factor de riesgo es el aumento de la presión intraocular (PIO). Aunque el glaucoma fue concebido como una enfermedad limitada al ojo, los axones de las CGRs son extraoculares, con componentes intraorbitales e intracraneales. En este trabajo de Tesis se examinaron los efectos del glaucoma experimental agudo y crónico sobre el sistema visual consciente (SV-C) y el sistema visual no formador de imagen (SV-NFI). El SV-C en la rata, se compone de las CGRs clásicas y sus axones que proyectan al colículo superior (CS) y al núcleo geniculado lateral (NGL). El SV-NFI se compone por las CGRs intrínsecamente fotosensibles que expresan melanopsina (CGRsm) y proyectan a los núcleos supraquiasmáticos (NSQ), al núcleo pretectal olivar (NPO) y al intergeniculado (IG), que participan en la sincronización del reloj circadiano y el reflejo pupilar, entre otros. El modelo de glaucoma agudo consistió en un aumento de la PIO a 70 mm de Hg durante 90 min (hipertensión ocular aguda, HOA), en tanto que el glaucoma crónico se indujo a través de inyecciones intracamerales de condroitín sulfato (CSU), una vez por semana, durante 15 semanas. A los 7 días post-HOA se observó una alteración significativa de la función y estructura retinianas, con una pérdida significativa de CGRs, así como cambios astro- y microgliales en el CS y una disminución en el transporte anterógrado desde la retina al CS y NGL, pero no a los NSQ y al NPO. El número de CGRsm, los niveles de melanopsina y el reflejo pupilar consensual permanecieron inalterados aún a las 4 semanas post-HOA. La administración de CSU por 6 semanas indujo alteraciones en la función retiniana y en la vía visual, una disminución en el transporte anterógrado a todas las áreas de proyección y cambios gliales a nivel del NO, el CS y la retina. En el CS, estas alteraciones incluyeron una marcada respuesta micro- y oligodendroglial y una moderada respuesta astrocitaria, que se acompañaron de una disminución del contenido lipídico. A las 15 semanas de glaucoma crónico, estas alteraciones fueron más marcadas e incluyeron alteraciones en los axones, sin afectar el número de neuronas coliculares. La minociclina previno algunas de las alteraciones inducidas por la hipertensión ocular crónica, como el déficit en el transporte anterógrado desde la retina al CS. En cuanto al SV-NFI, el glaucoma crónico indujo una caída significativa en el número de CGRsm y los niveles de melanopsina, así como en el transporte desde la retina a los NSQ y el NPO, con una disminución en el reflejo pupilar consensual. En suma, los resultados obtenidos en esta Tesis aportan datos de relevancia respecto a la participación de las áreas visuales post-retinianas en el daño glaucomatoso. Palabras clave: células ganglionares, glaucoma, glía, hipertensión ocular, minociclina, sistema visual consciente, sistema visual no formador de imagen, transporte axonal.

Abstract:
Glaucoma, one of the main causes of irreversible blindness, is characterized by a progressive loss of visual functions, which is associated to retinal ganglion cell (RGCs) death and optic nerve (NO) atrophy. The increase in intraocular pressure (IOP) is one of the main risk factors. Classically, glaucoma has been conceived as a disease limited to the eye, but axons of RGCs have extraorbital and intracranial components. In this Thesis work, the effects of acute and chronic experimental glaucoma on the conscious visual system (C-VS) and the non-image forming visual system (NIF-VS) were examined. The C-VS in rats includes classical RGCs and their axons that project to the superior colliculus (SC) and the lateral geniculate nucleus (LGN). The NIF-VS is composed by intrinsically photosensitive RGCs expressing melanopsin (mRGCs) that project to the suprachiasmatic nuclei (SCN), pretectal olivary nucleus (OPN) and intergeniculate leaflet (IG), which drive circadian rhythms and pupillary light reflex (PLR), among others. The acute glaucoma model was induced by increasing IOP to 70 mm Hg for 90 min (acute ocular hypertension, AOH), whereas chronic glaucoma was induced by intracameral injections of chondroitin sulfate (CSU), once a week, for 15 weeks. At seven days post-AOH, a significant impairment of retinal function and structure, with a significant RGCs loss, and astro- and microglial changes were observed in the CS. At the same time, a marked reduction in anterograde transport to the SC and LGN, but not to the SCN and the OPN, was observed. At 4 weeks post-AOH, mRGCs cell number, melanopsin levels, and consensual PLR remained unchanged. CSU administration for 6 weeks induced alterations in retinal and visual pathway function, a decrease in anterograde transport to all of the RGCs projecting areas, and glial changes at the level of the retina, ON, and SC. In the SC, these alterations included a marked microand oligodendroglial response and a moderate astrocytic response, which were accompanied by a decrease in lipid content. At 15 weeks of chronic glaucoma, these changes were more intense and included axonal changes, without affecting collicular neuron number. Minocycline prevented some of the alterations induced by chronic ocular hypertension, and the anterograde transport deficit to the CS. As for the NIF-VS, chronic glaucoma induced a significant reduction of mRGCs number, melanopsin levels, and anterograde transport to the SCN and OPN, as well as a decrease in consensual PLR. In summary, the results obtained in this Thesis work provide relevant information regarding the participation of post-retinal visual areas in glaucomatous damage. Keywords: retinal ganglion cells, glaucoma, glia, ocular hypertension, minocycline, conscious visual system, non-image forming visual system, axonal transport.

Bestach, Yesica Soledad. "Estudios genéticos y citogenéticos en Aplasia Medular" (2015-03-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Aplasia Medular o Anemia Aplásica adquirida (AA) es una insuficiencia medular global cuantitativa, caracterizada por una médula ósea hipo-celular, pancitopenia y riesgo de progresión a Síndromes Mielodisplásicos (SMD). El 80% de los casos de AA son de etiología idiopática, vinculados a un desorden autoinmune subyacente. Los principales mecanismos relacionados a la supresión hematopoyética en AA involucran un incremento de las citoquinas TNF-α e IFN-γ producidas por linfocitos T citotóxicos y T helper (Th) 1, y el consecuente aumento de la apoptosis. También se observa un desbalance entre los diferentes subsets de linfocitos T y la desregulación de otras citoquinas como IL-6 y TGF-β1. El objetivo fue estudiar polimorfismos asociados con la expresión diferencial de los genes TNF, IFNG, IL6 y TGFB1, y establecer su relación con susceptibilidad y/o características clínico-patológicas en pacientes con AA y SMD. Además, determinar los niveles de expresión de estas citoquinas y de los factores de transcripción Foxp3, T-bet, GATA-3 y RORγt en AA, a fin de caracterizar el desbalance entre los linfocitos T regulatorios (Treg), Th1, Th2 y Th17, respectivamente. Los resultados sugieren que los polimorfismos estudiados no estarían asociados con susceptibilidad a AA; mientras que, existiría una relación entre los polimorfismos de los genes TNF e IL6 y riesgo a SMD, en nuestra población. Las variantes polimórficas estudiadas estarían relacionadas con la severidad de las citopenias tanto en AA como en SMD, pudiendo actuar como modificadores genéticos de la enfermedad. Los hallazgos del análisis de expresión en AA muestran un incremento de TNF e IL6, y una disminución de TGBF1. La relación entre los factores de transcripción reflejaría una disminución en la diferenciación y/o función de células Treg favoreciendo un estado pro-inflamatorio, principalmente Th1 y Th2, lo cual podría contribuir con los mecanismos patogénicos relacionados a la falla medular en los pacientes con AA.

Abstract:
Acquired aplastic anemia (AA) is a marrow failure characterized by a hypocellular bone marrow, pancytopenia and risk of progression to Myelodysplastic Syndromes (MDS). Around 80% of AA cases are idiopathic, linked to an underlying autoimmune disorder. The main mechanisms related to the hematopoietic suppression in AA involve an increase of the cytokines TNF-α and IFN-γ produced by cytotoxic T and T helper (Th) 1 cells and, therefore, an apoptosis rise. Furthermore, perturbations of the T cell balance and abnormal regulation of other cytokines such as IL-6 and TGF-β1 play important roles to the development of immune disorders in AA. The aim of this work was to study the polymorphisms associated with differential expression of TNF, IFNG, IL6 and TGFB1 genes and to establish its relationship with susceptibility and/or clinic-pathologic features in patients with AA and MDS. In addition, to determine the expression levels of these cytokines and of the transcription factors Foxp3, T-bet, GATA-3 and RORγt in AA, in order to characterize the imbalance among regulatory T cells (Treg), Th1, Th2 and Th17, respectively. The obtained results suggest that, in our population, the studied polymorphisms would not be associated with susceptibility to AA; while polymorphisms in TNF and IL6 genes may increase propensity to MDS. Furthermore, these polymorphic variants could be related to severity of the cytopenias in AA and MDS, and may act as genetic modifiers of the diseases. Moreover, the analysis of cytokine expression in AA shows an increase of TNF and IL6, and a decreased of TGBF1. Finally, the ratio among transcription factors might reflect a Treg deficiency impairment, supporting a proinflammatory state, mainly Th1 and Th2, which may contribute to the pathogenic mechanisms related to the bone marrow failure observed in patients with AA.

Izzo, Franco. "Regulación del factor de transcripción GATA3 por progestágenos y su participación en la proliferación de células de cáncer de mama" (2015-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El factor de transcripción maestro GATA3 se encuentra involucrado en el desarrollo de la glandula mamaria y es requerido para el mantenimiento del estado diferenciado de las células epiteliales luminales. El rol de GATA3 en cáncer de mama como supresor tumoral ha sido establecido, a pesar de que el mecanismo de la pérdida de expresión de GATA3 es no ha sido descrito hasta el momento. En el presente trabajo, demostramos que la activación del Receptor de Progesterona (RP) promueve el co-reclutamiento de la metiltransferasa de histonas Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) río arriba del locus de GATA3, incrementando los niveles de trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3) e induciendo la compactación de la cromatina, lo cual resulta en la disminución de los niveles del ARNm de GATA3. Esta regulación se encuentra acoplada a una disminución de la estabilidad de la proteína GATA3, mediante la fosforilación inducida por progestágenos en el residuo serina 308 (pSer308-GATA3), seguida por degradación vía proteasoma 26S. Ambos mecanismos moleculares convergen para lograr reducir la expresión de GATA3 en células de cáncer de mama tras la activación del RP. Además, demostramos que la reducción en los niveles de GATA3 es requerida para lograr el incremento inducido por progestágenos de la ciclina A2, la cual media la transición de la fase G1 a S del ciclo celular, y se encuentra asociada a un peor pronóstico en pacientes de cáncer de mama. Finalmente, demostramos que la disminución de los niveles de GATA3 son necesarios para la proliferación celular in vitro y el crecimiento tumoral in vivo inducidos por progestágenos.

Abstract:
The master transcription factor GATA3 is involved in the development of the mammary gland and is required for the maintainance of the differentiated status of luminar epithelial cells. The role of GATA3 as a tumor suppressor has been established, although the mechanism of GATA3 expression loss has not been described so far. In the present work, we demonstrated that Progesterone Receptor (PR) activation promotes the co- recruitment of the histone methyltransferase Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) upstream of the GATA3 locus, increasing the tri-methyl lysine 27 histone H3 (H3K27me·) levels and inducing chromatin compaction, which results in GATA3 mRNA dowregulation. This regulation is coupled with a decrease of GATA3 protein stability, through progestin- induced GATA3 phosphorylation at serine 308 (pSer308-GATA3), followed by 26S- proteasome mediated degradation. Both molecular mechanisms converge to accomplish the reduction of GATA3 expression levels in breast cancer cells upon PR activation. In addition, we demonstrate that GATA3 downregulation is required to accomplish progestin-induced cyclin A2 upregulation, which mediates the G1 to S cell phase transition of the cell cycle, and is associated with a worst prognosis in breast cancer patients. Finally, we demonstrate that GATA3 downregulation is required for in vitro progestin-driven breast cancer cell proliferation and for in vivo tumor growth.

Maeto, Cynthia Alejandra. "Optimización de un esquema de inmunización de mucosas frente al HIV basado en la combinación de los vectores ADN y del virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) (ADN/MVA): ADN-IL-12 junto con la subunidad B de la toxina colérica (CTB) cooperan en el incremento de la respuesta celular a nivel sistémico y de la mucosa del tracto genital" (2015-04-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Un desafío importante para el desarrollo de vacunas frente a infecciones adquiridas por vía de mucosas es poder inducir una respuesta inmune local, con el fin de evitar la diseminación del patógeno al resto del organismo. Actualmente, el esquema de inmunización utilizado ampliamente en ensayos clínicos para HIV, y otros patógenos para los cuales se requiere inducir una respuesta inmune celular específica, es el denominado “prime-boost” que consiste en la utilización de distintos vectores vacunales durante la inmunización tales como los vectores de ADN recombinantes y aquellos basados en el virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA). En este trabajo de tesis doctoral se utilizó un esquema ADN-prime/MVA-boost por ruta de mucosas, donde ambos vectores expresan la glicoproteína de envoltura de HIV y se analizó el efecto adyuvante de ADN-IL-12 con la subunidad B de la toxina colérica (CTB) en ratones BALB/c con el fin de potenciar la respuesta inmune específica frente al HIV a nivel sistémico y de la mucosa del tracto genital. Los resultados obtenidos demostraron que esta combinación de adyuvantes mejoró la respuesta inmune celular no sólo a nivel sistémico, sino también en ganglios drenantes de la mucosa genito-rectal, y más importante aún, en el tracto genital, observándose un incremento en la magnitud, amplitud y calidad de la respuesta. En conclusión, la combinación de los adyuvantes ADN-IL-12 + CTB podría ser potencialmente utilizada como adyuvantes de mucosas en vacunas ADN/MVA, no sólo para antígenos de HIV sino también para otras enfermedades infecciosas con impacto en mucosas.

Abstract:
An important challenge to develop a vaccine against mucosal infections is inducing a local immune response to prevent the pathogen dissemination to the rest of the organism. Nowadays, the immunization scheme used currently in clinical trials for HIV and other pathogens for which the induction of a specific cellular immune response is needed, is the so called “prime-boost”. It consists in the application of different vaccine vectors during the immunization, such as DNA vectors and Modified Vaccinia Ankara (MVA) virus vectors. In this thesis, we applied a DNA-prime/MVA-boost scheme by mucosal route which both vectors express the HIV envelope glycoprotein. We analyzed the adjuvant effect from DNA-IL-12 with the cholera toxin B (CTB) in BALB/c mice to enhance the systemic and mucosal genital tract specific immune response against HIV. The results showed that this adjuvant combination improved the cellular immune response not only at systemic level, but also in the genito-rectal draining lymph nodes and more important, in the genital tract, enhancing the magnitude, amplitude and quality of HIV-specific response. In conclusion, the combination of DNA-IL-12 + CTB could be potentially used as mucosal adjuvants in a DNA/MVA vaccine not only for HIV antigen but also for other infectious diseases that impact mucosal tissues.

Zalazar, Florencia. "Nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de próstata" (2015-05-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres en la población argentina. El instituto Nacional del Cáncer (USA) describe diferentes tratamientos para los pacientes con PCa: cirugía, radiación y hormono-terapia. Para los pacientes con PCa avanzado, el tratamiento más común es el docetaxel, sin embargo esta terapia no extiende significativamente la sobrevida de los pacientes. Por lo tanto, es crítico el desarrollo de nuevos agentes y combinaciones para el tratamiento de esta etapa de la enfermedad. Previamente en estudios in vitro se determinó que el compuesto antiangiogénico análogo de la talidomida CPS49, selectivamente elimina a las células de leucemia aumentando las especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de la modulación de diversas vías transcripcionales, cuando se lo combina con flavopiridol, un potente inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas (CDKs). En el presente trabajo se investigaron los efectos de nuevos análogos de la talidomida en el PCa. En base a los resultados in vitro obtenidos elegimos el CPS49 para combinar con otros agentes y estudiar su capacidad antitumoral. Cuando combinamos CPS49 con flavopiridol observamos que este inhibidor de CDKs aumentó la citotoxicidad del CPS49 en todas las líneas celulares de PCa analizadas. En PC3 observamos que la combinación arrestó el ciclo celular, indujo la apoptosis e inhibió la formación de colonias. Estudios in vivo utilizando xenotransplantes generados a partir de la inoculación de células PC3 en ratones nude demostraron que el CPS49 y el flavopiridol disminuyeron el crecimiento tumoral en una concentración efectiva de las drogas cercanas a la mitad de las previamente publicadas. Análisis histológicos de los tumores extraídos mostraron extensas áreas de necrosis inducidas por el tratamiento. Además evaluamos la expresión de 23 genes mediante un arreglo de RT-qPCR en células PC3 expuestas a las drogas y a su combinación y en los tumores de los ratones xenotransplantados, y observamos que el CPS49 junto con el flavopiridol disminuyó la expresión de genes involucrados en adhesión, migración e invasión celular. Teniendo en cuenta que el paclitaxel es el quimioterapéutico más utilizado actualmente para el tratamiento del PCa avanzado, se analizó el efecto de la combinación del CPS49 con este compuesto. Demostramos que la combinación de bajas dosis de CPS49 aumentó la citotoxicidad producida por paclitaxel en líneas celulares de PCa, aunque esta combinación no redujo el volumen tumoral en los ratones xenotransplantados. Debido a que las mutaciones en BRCA1 o la disminución de su expresión alteran la sensibilidad a diferentes drogas antitumorales, en este trabajo estudiamos la respuesta al flavopiridol y CPS49 luego de variar los niveles de expresión de BRCA1 en las distintas líneas celulares de PCa. La baja expresión de BRCA1 aumentó la sensibilidad a dicha combinación. Además utilizamos olaparib, un inhibidor de PARP que se usa para el tratamiento del cáncer de mama en pacientes que poseen BRCA1 mutado. Este agente resultó ser selectivo para las líneas celulares de PCa con baja expresión de BRCA1, y aumentó la sensibilidad a flavopiridol y CPS49 en la línea celular PC3. En resumen, en este trabajo de tesis doctoral se estudiaron distintas estrategias terapéuticas en ensayos pre-clínicos para el PCa. Aunque las terapias propuestas requieren una profundización del estudio, podemos concluir que la propuesta más completa y prometedora para el tratamiento del PCa es la combinación de CPS49 con flavopiridol.

Abstract:
Prostate cancer (PCa) still ranks as the second most frequently cause of men cancer death in Argentina. National Cancer Institute (USA) describes different treatments for PCa: surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and approved experimental clinical trials. For patients with metastatic castration-resistant prostate cancer (CRPC) the most common treatment is docetaxel chemotherapy. This therapy is only palliative and does not significantly extend the overall survival rate in patients. Thus, there is a need for the discovery of new agents and regimens for this disease. CPS49, an analog of thalidomide, was reported to selectively kill leukemic cells by increasing intracellular reactive oxygen species (ROS) and further targeting multiple transcriptional pathways, when is co-administrated with flavopiridol, a semisynthetic flavonoid that inhibits cyclin dependent kinases (CDKs). In this work, the effects of new thalidomide analogues in PCa were investigated. Based on the in vitro results, CPS49 was chosen to combine with other agents and study its antitumor capacity in PCa. The combination of flavopiridol and CPS49 enhanced CPS49 cytotoxicity in all PCa cell lines analyzed. In PC3 cell line we observed that this combination induced cell cycle arrest, apoptosis and inhibited colony formation. In vivo studies using xenograft generated from PC3 cell inoculation in nude mice demonstrated that flavopiridol and CPS49 combination decreased tumor growth using a half effective concentration of drug that was previously published. Histological analysis of xenograft PC3 tumor samples from CPS49/flavo combination showed extensive areas of necrosis induced by the treatment. RT-qPCR array containing 23 genes from PC3 cells or PC3 xenografts exposed to CPS49/flavo combination showed that this treatment shut down the expression of several genes involved in adhesion, migration or invasion. Given that paclitaxel is the chemotherapeutic treatment most currently used for advanced PCa, the effect of combining paclitaxel with CPS49 was analyzed. We find that the combination of low doses of CPS49 increased cytotoxicity produced by paclitaxel in PCa cell lines, but this combination did not significantly reduce tumor growth in PC3 xenografts. BRCA1 mutations or its decreased expression modulates sensitivity to various antitumor drugs. In this thesis, we studied the effects of flavopiridol and CPS49 in PCa cell lines with different BRCA1 expression levels. BRCA1 depletion increased cell sensitivity to this combination. Furthermore we investigated the effects of olaparib in BRCA1 depleted PCa cell lines. Olaparib is a PARP inhibitor used for the treatment of breast cancer in BRCA1 mutations carrier patients. This agent was found to be selective for BRCA1 depleted PCa cell lines, and increased sensitivity to CPS49/ flavopiridol combination in PC3 cell line. In summary, in this doctoral thesis, different therapeutic strategies were tested in PCa pre-clinical studies. Although all the proposed therapies require a more detailed study, we can conclude that the most complete and promising therapy assayed for PCa is the combination of CPS49 with flavopiridol.

Castronuovo, Cynthia Celeste. "Análisis de las bases moleculares de la resistencia a la quimioterapia y estrategias para su optimización: rol de las proteínas ABC, la apoptosis y la transformación celular" (2015-05-21) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo principal de esta tesis doctoral fue contribuir a la búsqueda de soluciones más eficaces para el tratamiento de diferentes enfermedades hepáticas como la hepatitis crónica causada por el HBV y el HCC. Los resultados más relevantes son: A) diferentes co-polímeros de PEO-PPO produjeron una reducción en la expresión de BCRP –bomba transportadora de drogas, entre otros compuestos- y un aumento en la acumulación intracelular del antitumoral doxorrubicina, en líneas celulares derivadas de HCC. La sensibilidad a la doxorrubicina se incrementó hasta 41 veces, lo cual muestra una posible capacidad de los mismos de quimiosensibilizar células MDR. B) estos copolímeros indujeron apoptosis y un aumento en los niveles de ARNm de bax y h-tert. C) uno de los análogos nucleosídicos estudiados presentó actividad anti-HBV. D) uno de los co-polímeros analizados redujo la replicación del HBV. E) la proteína X del HBV (HBx) -salvaje o mutante (I127T/K130M/V131I)- presentó efectos pro y antiapoptóticos. F) HBx y la replicación de HBV en su conjunto aumentaron la expresión de diversas proteínas -MRP1, MDR1 y BCRP- involucrados en el transporte de drogas antivirales y anticancerosas. Estos resultados en conjunto tendrían potenciales nuevas implicancias en la oncogénesis hepática y en la terapéutica antiviral y anticancerosa.

Abstract:
The main objective of this thesis was to contribute to the discovery of more effective treatments of various liver diseases such as chronic hepatitis caused by HBV and HCC. The most important results are the following: A) Different PEO-PPO co-polymers produced a reduction in the expression of BCRP -drug pump transporter, among other compounds-, and an increased intracellular accumulation of the antitumor doxorubicin, in cell lines derived from HCC. Doxorubicin sensitivity increased to 41 times, which shows a possible ability of co-polymers to chemosensitisation MDR cells. B) These copolymers induced apoptosis and increased mRNA levels of bax and h-tert. C) One of the nucleoside analogues studied herein had anti-HBV activity. D) One of the copolymers analyzed decreased HBV replication. E) The HBV X protein (HBx) -wild type or mutant (I127T/K130M/V131I)- had pro and anti-apoptotic effects. F) HBx and HBV replication as a whole increased expression of various proteins -MDR1, MRP1 and BCRP- involved in the transport of antiviral and anticancer drugs. These results together would have potential new implications in hepatic oncogenesis and in antiviral and anticancer therapeutics.

Adrover, Ezequiela. "Alteraciones del sistema glutamatérgico en un modelo de estrés prenatal" (2015-06-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estrés experimentado durante la gestación tiene un gran impacto sobre el desarrollo del sistema nervioso fetal. Esta situación altera la capacidad del organismo para enfrentar estímulos estresantes y lo hace más vulnerable a expresar trastornos comportamentales y neuropsiquiátricos como el desorden de ansiedad, la depresión y la auto-administración de drogas. La mayoría de estas alteraciones han sido atribuidas a desbalances en los sistemas de neurotransmisión del cerebro. En los mamíferos, el glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio del sistema nervioso central y participa en el desarrollo neuronal, en la integración de las funciones, promueve la plasticidad de las conexiones sinápticas y participa en los procesos de memoria y aprendizaje. En el sistema glutamatérgico la síntesis de glutamato, la regulación de los niveles de los receptores, la función de los transportadores y el control de la función sináptica en su conjunto dependen de la interacción entre las neuronas y las células gliales. Las alteraciones en el funcionamiento de los distintos componentes de la sinapsis glutamatérgica han sido asociadas con el desarrollo de desórdenes neurológicos como los déficits cognitivos, las psicosis, desordenes de aprendizaje y memoria, así como también con la esquizofrenia. Los estudios retrospectivos y prospectivos con humanos, al igual que las investigaciones con animales de experimentación han señalado que la exposición temprana a eventos adversos puede alterar la bioquímica del sistema glutamatérgico, así como también el comportamiento de los individuos en la edad adulta. Para evaluar el efecto del estrés prenatal sobre el metabolismo, la liberación y la captación del glutamato, se sometieron a estrés por inmovilización a ratas preñadas en su última semana de gestación. Se extrajo el cerebro de la cría adulta y se utilizaron la corteza frontal y el hipocampo para medir la síntesis de glutamato, los niveles de los receptores y de los transportadores del sistema y su función. Los resultados de los ensayos, que se exponen en este trabajo, indicaron que el estrés gestacional afecta los niveles de expresión de los trasportadores de glutamato en el cerebro de las crías macho, aumentando la cantidad de vGluT-1 en la corteza frontal y elevando el ARN mensajero y la proteína de GLT1 en el hipocampo. Paralelamente se registró en estos individuos un aumento de la recaptación de glutamato en la corteza frontal efecto que no se observó en el hipocampo. Estos cambios demuestran que la influencia del estrés gestacional es específica para cada área del cerebro y que produce cambios a largo plazo que alteran el sistema de neurotransmisión glutamatérgica. Palabras claves: estrés prenatal, sistema glutamatérgico, transportadores de glutamato, ratas Wistar.

Abstract:
Prenatal stress exerts a strong impact on fetal brain development in rats impairing adaptation to stressful conditions, subsequent vulnerability to anxiety, altered sexual function, and enhanced propensity to self-administer drugs. Most of these alterations have been attributed to changes in the brain neurotransmitter systems. Glutamate is the principal excitatory neurotransmitter in the mammalian central nervous system, participating in the integration of brain function and in synaptic plasticity, memory and learning processes. The glutamatergic normal function depends on the interactions between neurons and surrounding astroglia. This relationship is necessary for the synthesis of the amino acid, the regulation of the receptors and transporters levels and for the control of synaptic transmission. Due to this particular characteristic this brain system is considered a tri-partite synapse. Dysfunction of different components of the glutamatergic system, such as receptors, transporters and glutamate levels have been associated with development of several neurological disorders, e.g. cognitive deficits, psychosis, memory and learning problems, and schizophrenia. Evidences provided by animal research, as well as retrospective and prospective studies in humans, pointed out that exposure to adverse events in early life can alter adult behaviors and neurochemical indicators of glutamate activity, suggesting that the development of the glutamatergic system is sensitive to disruption by exposure to early stressors. To study the effect of prenatal stress on the glutamate metabolism, release and uptake pregnant rats were subjected to restrain stress during the last week of gestation. Brains of the adult offspring were used to assess glutamate synthesis and levels, as well as expression and function of glutamate receptors and transporters. While glutamate metabolism was not affected it was found that prenatal stress changed the expression of the transporters, thus, producing a higher level of vesicular vGluT-1 in the frontal cortex and elevated levels of GLT1 protein and messenger RNA in the hippocampus of adult male prenatally stressed offspring. In these animals, we also observed increased uptake capacity for glutamate in the frontal cortex. On the other hand, no such changes were observed in the hippocampus brain area. The results show that changes mediated by gestational stress on the adult glutamatergic system are brain region specific. Overall, prenatal stress produces longterm changes in this system that altered the synaptic transmission of the adult brain. Key words: prenatal stress, glutamatergic system, glutamate transporters, Wistar rat.

Questa, María. "Efectos del cultivo hipóxico sobre la reprogramación de fibroblastos humanos a células madre pluripotentes inducidas" (2015-10-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células somáticas pueden ser reprogramadas a células pluripotentes denominadas Células Madre Pluripotentes Inducidas (CMPi) y éstas, a su vez, pueden diferenciarse a cualquier tipo celular adulto. Esto es de gran importancia en los campos de la medicina regenerativa, las pruebas farmacológicas in vitro y la investigación de trastornos genéticos, dado que pueden obtenerse células pluripotentes sin enfrentar la barrera ética de la manipulación de embriones y con el valor agregado de ser genéticamente idénticas al donante de células somáticas. Por lo tanto, el estudio del proceso de reprogramación se ha vuelto cada vez más importante para mejorar los métodos en eficiencia, rapidez y seguridad. Teniendo en cuenta su interacción con factores de transcripción implicados en el estado pluripotente de la célula, los factores inducibles por hipoxia, HIF por su sigla en inglés, podrían ser de interés en el proceso de reprogramación. En el presente trabajo hemos aislado distintos tipos de células somáticas humanas, como fibroblastos, queratinocitos y células mononucleares de sangre periférica, los hemos cultivado, y hemos intentado reprogramarlos. Además estudiamos distintas condiciones de generación de CMPi, utilizando distintos vectores necesarios para la reprogramación, moléculas que modifican la estructura de la cromatina como Ácido Valproico y Butirato de Sodio, y diferentes protocolos, hasta llegar a un método confiable y reproducible. A partir de ello, hemos generado CMPi en condiciones de normoxia e hipoxia, y posteriormente las hemos cultivado a largo plazo también en ambas condiciones. Hemos validado la legitimidad bona fide de las líneas celulares generadas, evaluando la expresión de genes marcadores de estado indiferenciado y por otra parte, la pluripotencia, mediante protocolos de diferenciación in vitro, e in vivo, por formación de teratomas. Asimismo, encontramos que ambas líneas exhiben características morfológicas y proliferativas, y patrones de metilación del ADN propios de células madre pluripotentes. Estudiamos además el comportamiento de las líneas celulares en cultivo en cuanto a eficiencia de reprogramación, expresión de factores del estado pluripotente, proliferación y apoptosis. Encontramos que la hipoxia aumentó la cantidad de colonias generadas pero éstas resultaron más pequeñas en tamaño, en comparación con las colonias generadas en normoxia. Además, fue menor la expresión de marcadores del estado pluripotente en colonias de CMPi evaluadas en estadios tempranos luego de ser establecidas en hipoxia, que en las colonias generadas en normoxia. Esta expresión no aumentó cuando las colonias fueron establecidas y cultivadas a largo plazo, y luego expuestas a hipoxia aguda, pero se indujo después de una hipoxia crónica. Por otro lado, encontramos una mayor tasa de proliferación celular en CMPi cultivadas en hipoxia sin diferencias en los niveles de apoptosis. Finalmente, a fin de sentar las bases para la continuación del proyecto, generamos vectores retrovirales para poder introducir los genes de los factores HIF-1α y HIF-2α en células a reprogramar, junto con los vectores de reprogramación. Los factores HIF clonados en los plásmidos retrovirales fueron wild type y también formas mutadas que le confieren a las proteínas HIF una mayor estabilidad, y en algunos casos también una mayor capacidad de activación de la transcripción. En último lugar, investigamos el efecto de los vectores generados, en células somáticas plausibles de ser reprogramadas, y encontramos un posible efecto tóxico, probablemente debido a la acumulación de altas cantidades de proteína HIF en la célula, o de una actividad transcripcional de los genes blanco tan alta que conlleva muerte celular. Dado que la expresión del gen introducido por el vector retroviral se puede controlar debido a que utilizamos un sistema modulable Tet-Off, encontramos que un tratamiento con el agente represor disminuye la muerte celular, y podría ser necesario a la hora de co-transducir con estos vectores y los vectores de reprogramación. Esperamos que los resultados y las herramientas generadas en este trabajo contribuyan a la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la reprogramación y al desarrollo de protocolos para la generación de CMPi de alta calidad y con alta eficiencia. PALABRAS CLAVE células madre, células madre embrionarias humanas, células madre pluripotentes inducidas, hipoxia celular, reprogramación nuclear, pluripotencia, estado pluripotente, diferenciación

Abstract:
Somatic cells can be reprogrammed into pluripotent cells called Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) and these, in turn, can be differentiated into adult cell type. This is of great importance in the fields of regenerative medicine, pharmacological in vitro testing and genetic disorder research, as pluripotent stem cells can now be obtained without facing the ethical barrier of embryo manipulation, and with the added value that these are genetically identical to the somatic cell donor. Hence, through the study of the reprogramming process itself, it has become increasingly important to improve reprogramming methods in terms of efficiency, speed and safety. Given their interaction with transcription factors involved in stemness, Hypoxia Inducible Factor, HIF, may be of interest in the reprogramming process. In the present work we isolated different types of human somatic cells, like fibroblasts, keratinocytes and peripheral blood mononuclear cells, we have cultured them and tried to reprogram them. Moreover, we have studied different conditions for the generation of iPSC, using different vector necessary for reprogramming, molecules that modify the structure of chromatin like Valproic Acid and Sodium Butyrate, and different protocols, until we obtained a reliable and reproducible method. Based on this, we have generated iPSC in normoxia and in hypoxia, and subsequently cultured them long-term in both conditions as well. We validated the bona fide legitimacy of the cell lines generated, by evaluating the expression of stemness marker genes and, on the other hand, by evaluating pluripotency, through in vitro differentiation protocols, and in vivo, by teratoma formation. Also, we have found that both lines exhibited morphological and proliferative characteristics and DNA methylation patterns typical of pluripotent stem cells. Furthermore, we studied the cell lines’ behavior in culture regarding reprogramming efficiency, expression of stemness factors, proliferation and apoptosis. We found that hypoxia increased the amount of colonies generated but these turned out to be smaller in size, when compared to colonies generated in normoxia. Moreover, stemness marker expression was lower in iPSC colonies evaluated in early stages after being established in hypoxia, than in colonies established in normoxia. This expression did not increase when colonies were established and cultured in the long-term, and then exposed to acute hypoxia. Nevertheless, these markers’ expression was up-regulated after chronic hypoxic culture. In addition, we also found a higher proliferation rate for stem cells in hypoxia and no differences in apoptosis levels. Finally, in order to provide a continuation to the project, we generated retroviral vectors to be able to introduce HIF-1α and HIF-2α genes in cells to be reprogrammed, together with the reprogramming vectors. The HIF cloned in the retroviral plasmids were wild type and also mutated forms, which provide the HIF proteins with more stability and in some cases, also increased transcriptional activation ability. Lastly, we investigated the effect of these vectors, on somatic cells capable of being reprogrammed, and we found a possible toxic effect, probably due to the accumulation of high amounts of HIF proteins in the cell, or such a an elevated target gene transcriptional activity, that it generated cell death. Given the fact that the gene introduced by the retroviral vector can be controlled, since we used a modulable Tet-Off system, we found that a treatment with the repressor agent decreases cell death, and might be necessary for the co-transduction with these vectors and the reprogramming vectors. We hope that the results obtained and the tools generated in this work will contribute to the understanding of the molecular mechanisms involved in reprogramming, and to the development of high quality and highly efficient iPSC generation protocols. KEYWORDS stem cells, human embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, cell hypoxia, nuclear reprogramming, pluripotency, stemness, differentiation

Sabbione, Florencia. "Propiedades inmunomodulatorias de las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs)" (2016-03-04) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La injuria pulmonar produce la liberación de ácido úrico que, a concentraciones locales elevadas, precipita formando cristales de urato monosódico (MSU). Estos cristales producen una considerable inflamación asociada a infiltración neutrofílica. Luego de la estimulación con MSU, los neutrófilos liberan trampas extracelulares (NETs), compuestas por cromatina y proteínas granulares, nucleares y citoplasmáticas asociadas. En este trabajo se estudió si las NETs inducidas por MSU (NETs-MSU), poseen propiedades inmunoregulatorias tanto sobre células epiteliales pulmonares como sobre otras células del sistema inmune innato como células dendríticas y macrófagos. Se observó que las NETs-MSU incrementaron significativamente la secreción de interleuquina (IL) 8 e IL-6 por células epiteliales pulmonares y bronquiales. Estos efectos no fueron reproducidos por sobrenadantes de neutrófilos estimulados con MSU en presencia de inhibidores de la netosis, como un inhibidor de elastasa o el inhibidor de la NADPH oxidasa DPI. Las NETs-MSU no afectaron la viabilidad de las células epiteliales, ni su morfología, como tampoco la integridad de la barrera epitelial formada por células epiteliales polarizadas. La capacidad estimulatoria de citoquinas de las NETs no fue afectada por la degradación del ADN con nucleasa micrococal, ni tampoco por el tratamiento de las mismas con heparina o cuando la actividad de la elastasa asociada a las NETs fue bloqueada con un inhibidor. Sin embargo, el efecto observado fue revertido al tratar a las NETs con un anticuerpo bloqueante de la proteína del grupo de alta movilidad (HMGB1). El efecto proinflamatorio de las NETs se observó también en macrófagos humanos derivados de monocitos pero no en células dendríticas derivadas de monocitos, indicando que las propiedades proinflamatorias de las NETs-MSU son específicas de ciertos tipos celulares. En conjunto, los resultados de esta tesis indican que las NETs inducidas por MSU inducen efectos proinflamatorios en células de las vías respiratorias, que podrían contribuir al reclutamiento de neutrófilos in vivo y a la perpetuación de la inflamación y al daño del tejido pulmonar. Nuestros hallazgos podrían ser relevantes para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una inflamación marcada del tracto respiratorio, como la fibrosis quística y el daño pulmonar agudo (ALI). En estas patologías, a pesar de haberse corroborado la presencia de grandes cantidades de NETs en el tracto respiratorio, el tratamiento con DNasas no logra resolver el cuadro inflamatorio. Los resultados de este trabajo de tesis, indicando que el tratamiento de las NETs con MNasa no reduce su capacidad proinflamatoria permiten especular que tratamientos tendientes a limitar la producción de las NETs o a bloquear a la molécula HMGB1, podrían representar opciones terapéuticas más apropiadas a fin de mitigar la inflamación que acompaña a estas patologías.

Abstract:
Lung tissue injury leads to the release of uric acid which at high local concentrations forms monosodium urate crystals (MSU). These crystals trigger robust neutrophilic inflammation. Upon MSU stimulation, neutrophils release extracellular traps (NET) composed by chromatin and antimicrobial proteins associated. Here we investigated whether MSU-induced NET could be involved in the development of inflammation by stimulating cytokine release by airway epithelial cells and other relevant innate immune cells such as dendritic cells and macrophages. We found that MSU-induced NET significantly increased the secretion of IL-8 and IL-6 by lung and bronchial epithelial cells. These effects were not observed when NETosis was impaired by Diphenyleneiodonium or elastase inhibitor. Furthermore, NET did not affect the viability of airway epithelial cells, neither did they modify their morphology nor the barrier integrity of polarized cells. The epithelial stimulatory capacity of NET was not affected by degradation of DNA with micrococcal nuclease (MNase), treatment of NET with heparin or inhibition of the elastase immobilized to DNA, but was significantly reduced by pretreatment of NET with an anti-high mobility group box-1 blocking antibody (HMGB1). Additionally this proinflammatory effect was also observed in human monocyte- derived macrophages and not in human monocyte-derived dendritic cells. This indicates that the proinflammatory response is restricted to certain cell types. Altogether, our findings indicate that MSU-induced NET exert direct proinflammatory effects on airway epithelial cells that might contribute in vivo to further recruitment of neutrophils and perpetuation of inflammation upon lung tissue damage. These results could be relevant for treatment of pulmonary inflammatory pathologies, like cystic fibrosis and acute lung injury (ALI). Despite the fact that it has been proved the presence of large amounts of NET in these diseases, the current treatment with DNases does not resolve the associated inflammation. Our findings indicating that MNase treatment does not reduce the inflammatory capacity of NET suggest that treatments with NETosis inhibitors or HMGB1 blocking antibodies could be relevant therapeutics options to mitigate the inflammation in these pathologies.

Kurtz, Melisa Lidia Amelia. "Agonistas de los PPAR como reguladores de anomalías fetales inducidas por la diabetes materna" (2016-03-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo se estudiaron anomalías en el corazón y el pulmón fetal en un modelo de diabetes moderada en rata y se evaluaron los efectos de la administración de agonistas de los receptores activados por proliferadores peroxisomales α y γ (PPARα, PPARγ) sobre dichas alteraciones. En el corazón y el pulmón fetal de rata diabética se evidenció en forma sexodependiente, sobreacumulación de lípidos, disminución en la expresión de enzimas de oxidación lipídica, aumento en la producción de óxido nítrico (NO) y lipoperoxidos y disminución de la expresión de PPARα y PPARγ. La administración intrafetal de agonistas de PPARα (LTB4) y PPARγ (15dPGJ2) hacia finales de la gestación o tratamientos maternos con dietas enriquecidas en ácidos grasos agonistas de los PPAR durante toda la preñez, mostraron regular varios parámetros alterados por la diabetes materna en corazón y pulmón fetal, entre ellos la anómala expresión de los PPAR y de enzimas y transportadores involucrados en el metabolismo lipídico, la sobreproducción de NO y el daño oxidativo a lípidos. Varios de los efectos de los agonistas de PPAR variaron de acuerdo al órgano y el sexo fetal. Además, los tratamientos dietarios mostraron efectos particulares de acuerdo al tipo de ácido graso suplementado en la dieta materna. De esta forma se identificaron anomalías en el metabolismo de lípidos y marcadores de un estado pro-inflamatorio y pro-oxidante en corazones y pulmones fetales durante la gestación de rata diabética a término, que se vinculan con alteraciones en la expresión y función de los receptores nucleares PPAR. Estas anomalías podrían condicionar el desarrollo y función de dichos órganos teniendo consecuencias en la vida posnatal. A su vez, se describieron efectos benéficos de los agonistas de PPAR como moduladores de las alteraciones fetales provocadas por la diabetes materna.

Abstract:
In this study, anomalies in the fetal heart and lungs were evaluated using a mild diabetes rat model. Moreover, the effects of administrating peroxisome proliferator activated receptor α and γ (PPARα, PPARγ) agonists on these alterations were evaluated. Regarding the anomalies produced as a consequence of the maternal diabetes, in this study, fetal hearts and lungs from diabetic rats showed over-accumulation of lipids, reduced lipid oxidation enzymes expression, increased nitric oxide (NO) and lipoperoxides production and decreased expression of PPARα and PPARγ. For studying the effects of PPAR agonists administration on these anomalies, two protocols were used, finding that the effect of the intrafetal administration of PPARα and PPARγ agonists (LTB4 and 15dPGJ2 respectively) at the end of pregnancy were similar to those observed when mothers received troughout pregnancy diets enriched in fatty acids capable of activating PPARs. Both protocols regulated those alterations induced by maternal diabetes in the fetal hearts and lungs; such as impaired expression of PPARs and enzymes/transporters involved in lipid metabolism, NO overproduction and lipid oxidative damage. The effects of PPAR agonists varied depending on the fetal sex or organ analyzed. Moreover, the effect of the maternal diet was related to the type of fatty acid enriched that it has. Therefore, anomalies in the metabolism of lipids, pro-inflammatory and prooxidant state markers were here identified in fetal hearts and lungs as consequence of maternal diabetes in rats at term gestation. These anomalies were linked to alterations in the expression and function of PPAR; that may influence the development and functions of those organs, impacting on postnatal life. On the other hand, the beneficial effects of PPAR agonists on these alterations were also here described.

Falivene, Juliana. "Estudio del impacto del balance Th17/Treg en periferia y en mucosas sobre la funcionalidad de la respuesta celular antiviral y la inmunopatogénesis de la infección HIV/SIDA" (2016-03-08) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las subpoblaciones de linfocitos Th17 y T regulatorios (Treg) han sido relacionados con la progresión a enfermedad en el contexto de la infección por HIV-1. Sin embargo, su relación con la respuesta adaptativa T CD8+ antiviral durante la infección aguda/temprana por HIV (PHI, primary HIV infection) no ha sido aún estudiada. En este contexto, el primer objetivo general de este trabajo de tesis consistió en analizar las subpoblaciones Th17 y Treg y su relación con la respuesta celular T CD8+ específica frente a HIV y parámetros de seguimiento de la infección durante la infección aguda/temprana y hasta un año postinfección (p.i). Para ello se utilizaron muestras de sangre de 14 dadores sanos (DSs), 40 PHI, 17 Crónicos y 13 controladores elite (ECs, Elite Controllers). Los porcentajes de células Th17 y Treg se encontraban severamente alterados en individuos Crónicos, mientras que todos los pacientes infectados con HIV evidenciaron un desbalance Th17/Treg comparados con DSs (incluso ECs), en concordancia con sus mayores proporciones de células T CD8+ activadas (HLA-DR+/CD38+). Un mejor estatus clínico (evidenciado por mayores recuentos de células T CD4+ y menores cargas virales y activación inmune) se asoció con mayores niveles de Th17 y menores niveles de Treg. Notablemente, se encontraron correlaciones positivas entre los niveles basales de Th17 y la funcionalidad de la respuesta T CD8+ específica frente a HIV: la capacidad de suprimir la replicación viral (VIA, viral inhibitory activity) y la proporción de células polifuncionales (IFN-γ+/CD107A/B +) tanto a tiempos tempranos como tardíos p.i, resaltando el valor pronóstico de la subpoblación Th17 en la preservación de una inmunidad celular antiviral más eficiente. La relación Th17/Treg y la intensidad media de fluorescencia relativa (IMFr) de IL-17 también se correlacionaron positivamente con VIA. Debido a la importancia del tratamiento antirretroviral (TARV) en la reconstitución inmune de individuos infectados, a continuación se decidió caracterizar las subpoblaciones Th17, Treg y su balance en sangre periférica y mucosa cervical y su implicancia en la inmunopatogénesis de HIV-1 en ausencia o presencia de TARV. Para ello se utilizaron muestras de 19 individuos TARV+ (más de 2 años con supresión efectiva de la CV), 22 pacientes crónicamente infectados naïve de tratamiento (TARV-) y 20 DSs. Tras el tratamiento, tanto la frecuencia de Th17 como la relación Th17/Treg en periferia alcanzaron valores similares a los observados en DSs, en contraste a lo observado en células Treg cuyos niveles se mantuvieron altos. Asimismo, en individuos TARV+ se observó una disminución de los niveles de activación inmune a pesar de lo cual no se alcanzaron valores normales, hallándose correlaciones negativas entre los niveles de activación celular y el balance Th17/Treg. Por otro lado, mayores niveles de la citoquina proinflamatoria IL-1β en exocervix se correlacionaron positivamente con los niveles de activación celular periféricos, sugiriendo que existiría una relación entre los niveles de inflamación sistémicos y lo observado en sitios de mucosas. Es importante destacar que el tratamiento no indujo un incremento de los recuentos de células T CD4+ CD161+ (subpoblación de células precursoras de Th17 que migran a intestino) los cuales resultaron significativamente menores a los observados en DSs. Asimismo, al estudiar el patrón de secreción de citoquinas por parte de células mononucleares de cérvix (CMCs) estimuladas, se observó que las CMCs provenientes de individuos TARV+ secretan menores niveles de IL-17A e IL-10 en relación a las de DSs. En conjunto, los resultados de la presente tesis sugieren, por un lado, la existencia de una potencial relación entre la subpoblación Th17 y el balance Th17/Treg con respuestas T CD8+ HIV-específicas que juegan un rol clave en la contención de la infección. Por otro lado, aunque el tratamiento antirretroviral parece tener un impacto positivo sobre la restauración de las funciones inmunes a nivel sistémico, tanto los niveles de precursores de células Th17 que migran a intestino como la secreción de IL-17A e IL-10 por CMCs no alcanzaron valores normales, sugiriendo que en sitios de mucosas la restauración inmune es incompleta.

Abstract:
Th17 and Treg subsets have been related to disease progression during HIV-1 infection. However, the potential relation of these T cell subsets with antiviral T-cell responses during primary HIV infection (PHI) has not been studied yet. In this context, the first aim of this study was to analyze Th17 and Treg subsets and their relation with anti-HIV T-cell responses and clinical parameters during PHI and up to one year post-infection (p.i). Samples from 14 healthy donors (HDs), 40 PHI patients, 17 Chronics, and 13 Elite controllers (ECs) were studied. The percentages of Th17 and Treg subsets were severely altered in Chronics, whereas all HIV-infected individuals (including ECs) showed Th17/Treg imbalance compared to HDs, in concordance with higher frequencies of activated CD8+ Tcells (HLA-DR+/CD38+). Better clinical status (higher CD4+ T-cell counts, lower viral loads and immune activation) was associated with higher Th17 and lower Treg levels. Positive correlations were found between Th17 at baseline and anti-HIV CD8+ T-cell functionality: viral inhibitory activity (VIA) and key polyfunctions (IFN-γ+/CD107A/B +) at both early and later times p.i, highlighting the prognostic value of Th17 cells to preserve an effective antiviral T-cell immunity. Th17/Treg ratio and the IL-17 relative mean fluorescence intensity were also positively correlated with VIA. Due to the importance that antiretroviral treatment (ART) has in the immune reconstitution of HIV+ patients, the second aim of this study was to characterize Th17 and Treg subsets and their balance in peripheral blood and female genital tract and their implications in the immunopathogenesis of HIV-1 infection comparing ART+ with ARTpatients. Samples from 19 HIV+ ART+ patients (more than 2 years under treatment), 22 HIV+ ART naïve patients (ART-) and 20 HDs were used. After treatment, both the frequency of Th17 cells as well as Th17/Treg ratio in peripheral blood reached similar levels compared to HDs, in contrast to that observed for Treg cells that remained at high levels despite ART. Also, ART was accompanied by a reduction in the immune activation levels, yet not to normal values, finding negative correlations between cellular immune activation and Th17/Treg ratio. On the other hand, high levels of the proinflammatory cytokine IL-1β in exocervix samples were positively correlated with higher levels of cellular immune activation in the blood, suggesting a relationship exists between systemic and mucosal activation/inflammation. Importantly, ART did not induce a proper restoration of CD4+ CD161+ T-cell counts (a subset of Th17 precursor cells with GALT homing properties) which were significantly lower compared to HDs. Interestingly, it was observed that cervix mononuclear cells (CMCs) from ART+ subjects secreted lower amounts of IL-17A and IL-10 upon stimulation than those obtained from HDs. Taken together, these results suggested, first, a potential link between Th17 and Th17/Treg ratio with key HIV-specific CD8+ T-cell responses against the infection. On the other hand, although ART has a positive impact on immune restoration in blood, both the levels of Th17 precursor subset with GALT homing properties and the ability of CMCs to secrete IL-17A and IL-10 did not reach normal values, suggesting that immune restoration at mucosal sites is impaired or incomplete.

Belgorosky, Denise. "Rol del óxido nítrico en la progresión del cáncer de vejiga" (2016-03-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El óxido nítrico (NO) es un radical libre altamente reactivo, que puede actuar como mensajero intracelular e influir en el desarrollo tumoral. Resultados de nuestro grupo de investigación indican que la expresión de la enzima óxido nítrico (NO) sintasa inducible (iNOS) en tumores vesicales humanos es un factor de mal pronóstico que se asocia con recurrencias más tempranas y con un mayor grado histológico. Teniendo en cuenta que iNOS no se expresa en el urotelio vesical de individuos sanos, y que es una entidad clave del proceso inflamatorio, característico del cáncer de vejiga (CaV), surgió la hipótesis de que la inhibición de esta enzima puede ser un blanco terapéutico para pacientes cuyos tumores expresen iNOS. Para analizar esta hipótesis comenzamos estudiando el rol del NO como consecuencia de la expresión de iNOS, en la progresión del CaV. Para ello utilizamos un modelo murino de CaV que imita muy bien la patología en humanos. Cuando las líneas celulares MB49 y MB49-I son inoculadas en la vejiga de ratones singeneicos generan tumores no invasores del musculo (NMI) y tumores invasores del músculo detrusor (MI), respectivamente. La línea invasora MB49-I, expresa altos niveles de iNOS, y en consecuencia mayores niveles de NO, comparado con la línea MB49. Asimismo, posee incrementados varios pasos del proceso de invasión y metástasis como es su capacidad de migración e invasión, la actividad de enzimas proteolíticas, y la capacidad de generar metástasis pulmonares. Detectamos que el NO es un factor de sobrevida para células de CaV, que expresan iNOS y que al inhibirlo, se reduce la activación de vías de proliferación como la vía de las MAPK, y parámetros de progresión tumoral como la producción de enzimas proteolíticas, migración, angiogénesis y el crecimiento metástatico en pulmón. Analizamos, por otra parte las consecuencias de la inhibición de iNOS en el crecimiento tumoral empleando tres estrategias. La primera fue evaluar la actividad de L-NAME (inhibidor farmacológico pan NOS) de manera sistémica en ratones portadores de tumores de vejiga creciendo en el subcutáneo o en la vejiga de ratones singeneicos. La segunda, fue también una inhibición farmacológica, utilizando el inhibidor específico de iNOS 1400w, en forma local, y la tercera aproximación involucró el silenciamiento genético de la enzima iNOS en la línea invasora. Las tres estrategias mostraron resultados similares demostrando que tanto L-NAME sistémico, como 1400w local y la ablación genética reducen significativamente el crecimiento tumoral de células que expresan iNOS. Asimismo, hemos demostrado que los niveles urinarios de NO, determinados como nitrito, son un marcador de seguimiento en tumores de vejiga, y que la disminución de dichos niveles está asociado a una respuesta a tratamiento. Es así que proponemos que la inhibición de la actividad iNOS sería una terapia promisoria para pacientes cuyos tumores expresen la enzima.

Abstract:
Nitric oxide (NO) is a highly reactive free radical, which may act as an intracellular messenger and influence tumor development. Results of our research group indicate that the nitric oxide (NO) production through inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression is a poor prognostic factor associated to earlier recurrences and progression in patients with bladder cancer (Bca). Since iNOS it is not express in bladder urothelium of healthy individuals, and it is a key on inflammatory processes, -characteristic of Bca-, we hypothesize that the inhibition of this enzyme may be a therapeutic target for Bca patients whose tumors express iNOS. To test this hypothesis we began studying the role of NO produced by iNOS, in Bca progression. We used a murine Bca model that mimics well the pathology in humans. When Bca cell lines MB49 and MB49-I were inoculated in bladders of syngeneic mice, non-muscle invasive tumors (NMI) and invasive muscle tumors (MI), respectively, were generated. Invasive MB49-I cell line expressed high levels of iNOS and therefore higher levels of NO, compared with MB49. Several properties involved in metastases and invasion such as the activity of proteolytic enzymes, migration ability and angiogénesis were higher in the invasive line. We detected that NO is a survival factor for Bca cells that express iNOS, and that inhibition of NO, reduced proliferation pathways, such as MAPK and parameters involved in tumor progression, like the activity of metalloproteinase, migration, angiogénesis and metastases development. We also analyze the consequences of iNOS inhibition in tumor growth, using three different strategies. The first one was administered systemically, L-NAME (pan NOS pharmacological inhibitor). The second one consisted on using 1400w (specific pharmacological iNOS inhibitor) directly on the bladder, and the third approach involved iNOS gene silencing in the invasive line. The three strategies showed similar results, demonstrating that systemically L-NAME, intravesical 1400w and iNOS genetic ablation, significantly reduced tumor growth of Bca cells. Several substances have been described as markers to monitor or predict patients with Bca, but none of them has proved to be useful enough. We have shown urinary levels of NO determined as nitrite, are a marker for monitoring bladder tumors and their reduction is associated with response to treatment. In conclusion, we propose iNOS inhibition as a promising therapy for Bca patients whose tumors express the enzyme.

Díaz Bessone, María Inés. "Efecto de la sobreexpresión de distintas isoformas de la Proteína Quinasa C (PKC) en la modulación del fenotipo maligno de células mamarias epiteliales. Alteración en la sensibilidad al tratamiento con retinoides" (2016-03-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de mama representa actualmente el tipo de cáncer más frecuente en mujeres y se calcula que más de un millón de nuevos casos son diagnosticados por año en todo el mundo. Se trata de una enfermedad compleja, que presenta una variedad de subgrupos con características histopatológicas y genéticas diferentes y por lo tanto con diversas respuestas a los tratamientos. De las múltiples vías de señalización comprometidas en la progresión maligna, algunas constituyen prometedores blancos de intervención terapéutica, entre ellas la vía de la proteína quinasa C (PKC), implicada en eventos celulares como proliferación, diferenciación y apoptosis y el sistema retinoideo ampliamente involucrado en diferenciación celular. Dado que los distintos carcinomas mamarios presentan una expresión diferencial de las isoformas de PKC, desarrollamos modelos celulares mamarios (humanos y murinos) que sobreexpresan las isoformas α o δ de PKC. Utilizando estos modelos estudiamos de qué manera la sobreexpresión de PKCα o PKCδ afecta parámetros celulares implicados en la progresión tumoral y diseminación metastásica evaluando al mismo tiempo la respuesta al tratamiento con retinoides (ATRA). Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de PKCα torna a las células más sensibles a la acción del ácido retinoico, en líneas respondedoras, mediante un arresto en la fase G0/G1 del ciclo celular. La sobreexpresión de PKCδ, en las células MDA-MB231, confirió un fenotipo menos agresivo, disminuyendo significativamente su capacidad invasiva. Por último la falta de respuesta de esta línea celular al ATRA, se debería a la incapacidad de trans-reprimir los sitios AP-1.

Abstract:
Breast cancer represents the most common kind of cancer in women and it is estimated that more than one million new cases are diagnosed each year worldwide. It is a complex disease, which presents a variety of subgroups with different genetic and histopathologic features and therefore with different responses to treatments. Multiple signaling pathways are involved in malignant progression. Some of them are promising targets for therapeutic intervention, including protein kinase C (PKC), involved in cellular events such as proliferation, differentiation and apoptosis and the retinoid system, widely implicated in cell differentiation. Since different mammary malignancies exhibit differential expression of PKC isoforms, we have developed (human and murine) mammary cell models overexpressing α or δ PKC isoforms. Using these models we studied how PKCα or PKCδ alters cell parameters associated with tumor progression and metastatic dissemination while we assessed the response to treatment with retinoids (ATRA). Our results suggest that PKCα overexpression confers to the cells a retinoic acid-sensitive phenotype, through an arrest in the G0 / G1 phase of the cell cycle. Overexpression of PKCδ, in MDA-MB231 cells, induced a less aggressive phenotype, significantly reducing its invasive capability. Finally the lack of response of this cell line to ATRA treatment could be due to the inability to trans-repress AP-1 sites.

Abrey Recalde, María Jimena. "Interacción entre la respuesta trombótica y la respuesta inflamatoria en el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH)" (2016-03-29) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Síndrome Urémico Hemolítico (SUH), enfermedad caracterizada por anemia hemolítica, trombocitopenia y falla renal aguda, está asociado a infecciones enterohemorrágicas con Escherichia coli productores de toxina Shiga (Stx) (STEC). Si bien el daño endotelial, generado por Stx, ha sido reconocido como el principal evento que conduce al estado protrombótico en el SUH, existen otros mecanismos que todavía no han sido completamente identificados. La interacción entre la respuesta trombótica e inflamatoria ha sido recientemente reportada en diversas patologías y dada la importancia de ambas en el SUH, hipotetizamos que podría tener un rol destacable en su desarrollo. En efecto, nuestro objetivo fue evaluar los mecanismos de activación de la respuesta trombótica y su interacción con la respuesta inflamatoria en el SUH. Utilizando un modelo murino de SUH, detectamos que Stx2 indujo directa o indirectamente una marcada activación plaquetaria que contribuyó con la respuesta inflamatoria a través de la activación del sistema de complemento y la formación de complejos entre Plaquetas y leucocitos polimorfonucleares (PMN). Por otro lado, en un sistema in vitro, se vió que Stx2 indujo un daño endotelial que derivó en la activación y adhesión plaquetaria. Por último, en ambos modelos, se observó la capacidad del antioxidante N-acetil-L-Cisteína (NAC) de prevenir los efectos protrombóticos de Stx2. En conclusión, en esta tesis hemos descripto como Stx2, mediante el daño endotelial, activa la respuesta trombótica y como el estrés oxidativo contribuye a este proceso. Asimismo hemos probado la participación de las plaquetas en la activación de la respuesta inflamatoria. Finalmente, dados los efectos preventivos de la NAC proponemos su uso en la etapa prodrómica de la diarrea.

Abstract:
Hemolytic uremic syndrome (HUS) is a disease caracterized by hemolytic anemia, thrombocytopenia and acute kidney failure. HUS is associated with Shiga toxin (Stx) producing Escherichia coli (STEC) infections. While endothelial damage induced by Stx , has been recognized as the main event leading to the prothrombotic state in HUS, there are other mechanisms that have not yet been fully identified. The interaction between thrombotic and inflammatory response has been recently reported in various diseases, since both are important in HUS, we hypothesize that could have a prominent role in its development. In fact, our objective was to evaluate the activation mechanisms of thrombotic response and its interaction with the inflammatory response in HUS. Using a mouse model of HUS, we found that Stx2 directly or indirectly induced a marked platelet activation wich contribute to the inflammatory response through activation of the complement system and the formation of complexes between platelets and polymorphonuclear leukocytes (PMN). Moreover, in an in vitro system, it was found that Stx2 induced endothelial damage that led to the activation and platelet adhesion. Finally, we observed in both models, the ability of antioxidant drug N-acetyl-L-Cysteine (NAC) to prevent Stx2 prothrombotic effects. In conclusion, in this thesis we have described that Stx2 through endothelial damage, enhances the thrombotic response and the oxidative stress contributes to this process. We have also tested the involvement of platelets in activation of inflammatory response. Finally, given the preventive effects of NAC we propose its use in the prodromal stage of diarrhea.

Mengoni, Eleonora Soledad. "Búsqueda y aislamiento de metabolitos secundarios en plantas y su caracterización como antiinflamatorio y antimicrobiano. Potencial uso de estos en pacientes con fibrosis quística" (2016-04-06) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva producida por mutaciones en el gen que codifica un canal para iones cloruro, el CFTR. La principal complicación a la que se enfrentan las personas que padecen FQ es el daño pulmonar crónico y progresivo causado principalmente por el patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa. En esta tesis, se estudiaron compuestos provenientes de fuentes naturales con el objetivo de establecer si alguno de ellos poseía actividad antimicrobiana sobre P. aeruginosa PAO1 y/o anti-inflamatoria en modelos in vitro e in vivo. En una etapa preliminar, se empleó un extracto acuoso (RACU) y otro etanólico (RETOH) obtenidos a partir de hojas frescas de romero, y posteriormente se evaluaron sus compuestos mayoritarios: el ácido rosmarínico (RA), el ácido carnósico (CA) y el carnosol (CS). De todos, el CA, disminuyó el crecimiento de P. aeruginosa de manera dosis dependiente, potenció la actividad del antibiótico tobramicina, redujo la adhesión bacteriana a placas de poliestireno, e interfirió con la motilidad a concentraciones subinhibitorias. Mediante el uso de la cepa sensora de acil homoserina lactonas (AHLs), C. violaceum CV026,se observó que el CA afectó la producción de las AHLs C4-AHL, C6-AHL, C8-AHL y C12-AHL, responsables de la activación de genes reguladores del sistema quorum sensing (QS). En los ensayos de inflamación, tanto CA como el CS presentaron una importante actividad anti-inflamatoria tópica en modelos de ratón, corroborándose este efecto por estudios histopatológicos, y demostrándose por primera vez que el CA y el CS decrecen significantemente la expresión de IL-1β y TNF-α, e inhiben completamente la expresión de COX-2. Otro compuesto estudiado fue el xilitol debido a que es empleado en la prevención de patologías relacionadas con la colonización bacteriana en las fauces y vías aéreas superiores, se hipotetizó sobre la posibilidad de que se pueda emplear para inhibir el crecimiento de P. aeruginosa. Los resultados revelaron efectos pleiotrópicos del xilitol sobre los genes controlados por QS tanto en la producción de elastasa, piocianina, los movimientos de swarming, twitching y la formación de biofilm, sugiriendo que la producción de AHLs se encontraba afectada. El empleo de los plásmidos pME3853 (lasl::LacZ) y pME3846 (rhll::LacZ) en PAO1, permitieron demostrar la disminución de la producción de AHLs en presencia del xilitol. Por otra parte el cultivo de PAO1 crecido durante toda la noche en presencia de xilitol, se adhirió menos a las células epiteliales bronquiales Calu-3 crecidas en monocapa, disminuyendo el daño oxidativo producido por el proceso inflamatorio y la liberación de IL-8 por parte del epitelio bronquial comparado con el control (crecido sin xilitol). En conclusión, esta tesis presenta evidencias sobre el potencial uso de compuestos bioactivos provenientes de plantas en la inhibición del crecimiento de microorganismos de difícil erradicación y los posibles mecanismos involucrados.

Abstract:
Cystic Fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene encoding the CFTR chloride channel. The main complication for people with CF is chronic and progressive lung damage caused mainly by the opportunistic pathogen, P. aeruginosa. In this thesis, natural compounds were studied in order to determine if these, had antimicrobial activity on P. aeruginosa PAO1 and/or anti-inflammatory activity in vitro and in vivo models. In the first stage, an aqueous (RACU) and ethanolic (RETOH) extracts, from fresh leaves of rosemary, and its main constituents such as rosmarinic acid (RA), carnosic acid (CA) and carnosol (CS) were studied. From these compounds, CA, not only reduced the growth of P. aeruginosa in a dose-dependent manner, but also enhanced the activity of tobramycin antibiotic. Also decreased adhesion on polystyrene plates, and interfered with bacterial motility at subinhibitory concentrations. However, the production of AHLs (C4-AHLs, C6-AHL, C8-C12-AHLs) molecules responsible for the activation of genes regulating system quorum sensing (QS), were increased by CA, when C. violaceum CV026 was employed. In inflammatory test, both CA and CS had higher topical anti-inflammatory activity in mouse models, being corroborated by histopathological studies and demonstrating for the first time that CA and CS decreased significantly, the expression of IL-1β and TNF-α, and a complete inhibition of COX-2 expression. Subsequently, xylitol other natural component employed in the prevention of pathologies related to bacterial colonization of fauces and upper airways was studied. This compound showed pleiotropics effects on genes controlled by QS, such as elastase, pyocyanin, swarming, twitching and biofilm, suggesting that the production of AHLs were affected. To confirm this point, pME3853 (lasl::LacZ) and pME3846 (rhll::lacZ) plasmids were employed in PAO1, confirming that AHLs expression were decreased. In vitro, the growing of PAO1 with xylitol, reduced the adhesion of the bacteria on bronchial epithelial Calu-3 cells, also reduced the oxidative damage and decreased significantly the IL-8 release by bronchial epithelium. In conclusion, the plant kingdom offers a large number of components and bioactive compounds with its potential use against microorganisms where their eradication is difficult to control.

Angerami, Matías Tomás. "Distribución y análisis funcional de Linfocitos T CD4+ regulatorios y T CD4+ convencionales en el contexto de la coinfección por HIV-1 y M. tuberculosis y su modulación por la hormona adrenal Dehidroepiandrosterona" (2016-04-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Tuberculosis representa el principal agente de mortalidad a nivel mundial en pacientes infectados con el HIV-1. Ambas infecciones conllevan a una desregulación de los ejes inmune y adrenal que influirán en el desarrollo de las correctas respuestas frente a los patógenos. Así, investigamos la subpoblacion de LT CD4+CD25-FoxP3+ (uTreg, LTreg “no convencionales”) en pacientes co infectados con tuberculosis activa (HIV-TB), en individuos HIV+ con TB latente (HIV-TBL), en individuos HIV+ sin TB y en dadores sanos (DS). En primer lugar se comparó la expresión de CD39, PD1, GITR y el estado de maduración (CD27/CD45RA) de las células uTreg entre los distintos grupos de estudio. Los pacientes HIV-TB mostraron menores niveles de expresión de CD39 y mayores de PD1 que los DS, así como un estado de maduración alterado con respecto a los demás grupos. Más aun, se observaron menores niveles de CD39 y mayores de PD1 en células uTreg de pacientes HIV-TB y DS, al compararse con la expresión en LT CD4+CD25+FoxP3+ (cTreg). Además la población uTreg mostro mayores frecuencias de la subpoblacionTreg EM, así como una capacidad de producción de IFN-γ incrementada respecto de cTreg, en ambos grupos e pacientes. Luego, evaluamos una cohorte de pacientes HIV-TB durante el transcurso del tratamiento anti tuberculoso (TaT), analizando parámetros endocrinos e inmunológicos. De esta forma se observaron valores disminuidos de DHEA-s al incio del TaT con respecto a las concentraciones presentadas por DS, que se normalizaron a través del tiempo. Además, esto se vio acompañado por un aumento en la frecuencia de células productoras de IFN-γ Mtb específicas, y por una disminución del número de células uTreg hasta alcanzar los valores presentes en DS. Finalmente, al analizar citoquinas asociadas a inflamación, se observaron niveles incrementados al inicio del TaT, que luego de seis meses retornaron a valores normales. Por último, se investigó la respuesta Mtb especifica de linfocitos T CD4+ de pacientes HIV-TB y DS, caracterizando la producción de IFN-γ y TNF-α, su distribución memoria/efectora, y la modulación por parte de DHEA sobre la respuesta y la maduración de LT. En principio se observó que el agregado de DHEA no logro modular la respuesta antígeno especifica ni en HIV-TB ni en DS. Por otro lado, se encontró una disminución de células Naive y un aumento de LT EM en el grupo HIV-TB. Además, al evaluar la producción de citoquinas de cada subpoblacion de memoria, los DS presentaron mayores niveles de IFN-γ/TNF-α en las LT EM, mientras en HIV-TB todas las poblaciones presentaron niveles similares de producción de dichas citoquinas. La adición de DHEA moduló la producción de citoquinas en los LT CM de DS y logró disminuir las diferencias existentes en la distribución memoria/efectora observadas en los LT CD4 Mtbespecíficos entre los HIV-TB y DS. El conjunto de resultados demuestran que la población uTreg a pesar de presentar diferencias en el fenotipo, el grado de maduración y en su capacidad de producir IFN-γ, posee una acción supresora similar a la de las células cTreg. Además, el trabajo permite evidenciar que el TaT logro normalizar parámetros endocrinos e inmunes a lo largo de 6 meses de terapia. Por último, se consiguió discriminar la producción de citoquinas Th1 para distintas subpoblaciones de Memoria en el contexto de la coinfeccion, y sugerir un rol modulador de DHEA sobre la diferenciación de las células antígeno específicas.

Abstract:
Tuberculosis is the most common opportunistic infection and represents the main cause of death worldwide in HIV-1 infected patients. Both infections lead to a deregulation of the immune and adrenal axes that influence the development of normal responses to pathogens, resulting in alterations of lymphocyte frequencies and in their functional capabilities. In this context, we aimed to investigate the previously described expanded subpopulation of LT CD4+CD25-FoxP3 + (uTreg) in co-infected patients with active tuberculosis (HIV-TB) and compared them with those uTregs analyzed in HIV+ individuals with latent TB (HIV- TBL), HIV+ individuals without TB (HIV) and a group of healthy donors (HD). So, first we evaluated the expression of CD39, PD1, GITR and the maturation status through CD27/CD45RA in the uTreg population along the different study groups. HIV-TB patients showed higher expression levels of CD39 and PD1 compared with HD. Moreover, we found significant differences in the maturation status of uTregs from HIV-TB when compared with the other study groups. We also compared uTreg vs. cTreg (CD4+CD25+FoxP3+) in HIV-TB patients and in HD. Besides this, the production of IFN-γ, TGF-β, IL-10 and suppressor capacity between both cell populations was assessed. Thus, we observed lower levels of CD39 and increased expression of PD1 in uTreg cells of both groups. Similar differences were found in these groups of individuals when maturation profile and cytokine production was analyzed, showing that uTreg cells had higher frequencies of Treg EM, as well as an increased capacity to produce IFN-γ than cTreg cells both in HIV-TB and HD groups. Secondly, we evaluated a cohort of HIV-TB patients during the course of the antituberculosis therapy (ATT), evaluating both endocrine and immunological markers. Thus, diminished plasma levels of DHEA-s were observed at the initiation of therapy, reaching normal levels after 6 months. Moreover, this was accompanied by an increase in the frequency of IFN-γMtb specific-producing cells, and a decrease in uTreg frequencies, which reached HD values at six months of therapy. Furthermore, when several cytokines associated with inflammation were analyzed during ATT, we observed a modulation of IL -6, IL-8, IL-7 and IL-12 levels, whose values decreased along anti TB therapy. Finally, we compared the responsiveness of Mtb specific LT CD4+ of HIV-TB and HD, analyzing the IFN-γ and TNF-α production, memory/effector distribution, and the modulation by DHEA of functionality and maturation status of CD4+ T cells.We observed that the DHEA did not modulate Mtb specific responses of CD4+ T cells in either group. On the other hand, when the memory/ effector distribution was compared between HIV-TB and HD, decreased proportions of naïve T cells and increased percentages of LTEM cells in HIV-TB group were found. In addition, cytokine production of memory subsets was assessed, therefore while the T CM subset produced a greater amount of IFN-γ/TNF-α compared with the other subsets of HD individuals, HIV-TB memory/effector subsets showed a similar production capacity. Addition of DHEA modified cytokine production only in TCM cells from HD. Interestingly, DHEA reduced the existing differences in CD4 T cells memory/effector distributions between Mtb-specific CD4+ cells from HIV-TB and HD. Together, these results uncover alterations of the immune-endocrine axes during HIVTB co infection. Our work also demonstrates that uTreg population, despite having an altered phenotype, maturation status and ability to produce IFN-γ, has a conserved suppressive capacity. Furthermore, this work demonstrates that ATT normalizes immune-endocrine parameters over 6 months of therapy. Finally, it was possible to discriminate Th1 cytokine production from different memory/effector subpopulations in the context of this coinfection, and to suggest a modulatory role for DHEA on the differentiation of Mtb-specific cells.

Venturutti, Leandro. "Rol de los micro-ARN 21 y 16 en la diseminación metastásica y resistencia a terapias dirigidas en el cáncer de mama ErbB-2 positivo" (2016-05-04) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La sobreexpresión/amplificación del receptor con actividad tirosina-quinasa ErbB-2 define un subtipo agresivo de cáncer de mama (CM) con incidencia elevada de metástasis, denominado ErbB-2 positivo. En esta Tesis revelamos un nuevo sentido de la interacción entre el ErbB-2 y Stat3, otro actor clave en CM, la cual subyace la diseminación metastásica. Encontramos que Stat3 no solo induce la expresión del ErbB-2, sino que también lo recluta como coactivador en el promotor del microARN-21, un microARN promotor de metástasis. El ErbB-2 induce además la expresión del microARN-21 actuando como factor de transcripción. El microARN-21, a su vez, inhibe la expresión de PDCD4, un supresor de metástasis. En la clínica, encontramos en tumores ErbB-2 positivos una correlación inversa entre la coexpresión nuclear Stat3/ErbB-2 y la expresión de PDCD4, la expresión del microARN-21 y de PDCD4, y la expresión de PDCD4 y la presencia de metástasis ganglionares. A pesar de que terapias dirigidas al ErbB-2, como el trastuzumab y el lapatinib, han probado ser beneficiosas, las respuestas tienden a ser limitadas en magnitud y duración. Aquí, describimos un mecanismo de acción novedoso para estos agentes. Encontramos que el trastuzumab y el lapatinib, a través del bloqueo de las vías de PI3K/AKT y MAPK, inhiben al oncogén c-Myc, lo cual aumenta los niveles del microARN-16, un potente supresor tumoral. La incapacidad de inducir la expresión del microARN-16 subyace fenómenos de resistencia. Identificamos a CCNJ y FUBP1 como blancos novedosos del microARN-16, responsables de sus efectos antiprolfierativos, y demostramos que los niveles del microARN-16 y FUBP1 predicen la respuesta al trastuzumab en adyuvancia, en pacientes con CM ErbB-2 positivo. Postulamos al microARN-16 como un agente terapéutico innovador para tumores resistentes al trastuzumab y/o lapatinib.

Abstract:
Overexpression/amplification of the receptor tyrosine kinase ErbB-2 accounts for an aggressive breast cancer (BC) subtype (ErbB-2 positive) with increased incidence of metastases. In the present Thesis, we revealed a novel direction of the interaction between ErbB-2 and Stat3 (another key player in BC), underlying BC metastasis. We found that Stat3 not only induces ErbB-2 expression, but it also recruits ErbB-2 as its co-activator at the promoter of microRNA-21, a metastasis-promoting microRNA. ErbB-2 also up-regulates microRNA-21 through its direct role as transcription factor. MicroRNA-21, in turn, downregulates the expression of the metastasis-suppressor protein PDCD4. In the clinic, we found an inverse correlation between ErbB-2/Stat3 nuclear coexpression and PDCD4 expression, microRNA-21 and PDCD4 expression, and PDCD4 expression and nodal metastasis in ErbB-2 positive tumors. Although the ErbB-2-targeted therapies trastuzumab and lapatinib have proven beneficial, responses are usually limited in length and magnitude. Here, we revealed a novel mechanism of action of these agents. We found that that blockade of PI3K/AKT and MAPK by trastuzumab or lapatinib inhibits the oncogene c-Myc, resulting in upregulation of microRNA-16, a potent tumor suppressor. Accordingly, we found that failure to upregulate microRNA-16 underlies resistance. We identified two novel microRNA-16 targets, CCNJ and FUBP1, which mediate microRNA-16 antiproliferative effects, and identified microRNA-16 and FUBP1 as predictive biomarkers of adjuvant trastuzumab response in patients with ErbB-2 positive BC. We propose microRNA-16 as an innovative therapeutic agent for trastuzumab- and lapatinib-resistant tumors.

Najenson, Ana Clara. "El Factor Natriurético Atrial en el páncreas exocrino: papel en eventos tempranos que conducen al desarrollo de pancreatitis aguda" (2016-05-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La pancreatitis aguda constituye una entidad nosológica prevalente caracterizada por la autodigestión del páncreas exocrino provocada por la activación in situ de las mismas enzimas que el páncreas produce. Se expresa como una forma leve autolimitada, o bien como una forma severa con elevada mortalidad principalmente como resultado de falla multiorgánica. Las causas y/o mecanismos que llevan a una u otra expresión son desconocidos, por lo que debido a su curso incierto constituye una preocupación clínica. Los eventos tempranos que conducen a su desarrollo no se hayan aún esclarecidos, si bien la activación del tripsinógeno y de la respuesta inflamatoria constituyen dos mecanismos disparadores independientes. En este trabajo de tesis abordamos el estudio del posible papel protector del factor natriurético atrial (ANF) en los eventos temprano que disparan la patología, particularmente la respuesta inflamatoria que lleva a la muerte de las células acinares eventualmente por necrosis y apoptosis mediante la utilización de un modelo animal (rata) validado de pancreatitis aguda. Asimismo, evaluamos la posibilidad de que el páncreas exocrino constituya una fuente extracardíaca de ANF. El presente estudio se sustenta en trabajos previos en los que observamos que el ANF regula fisiológicamente la funcionalidad del páncreas exocrino y atenúa la pancreatitis aguda experimental al estimular la exclusión de AMPc a través de proteína asociada a resistencia a multidrogas tipo 4 (MRP4). No obstante, este mecanismo no explicaría en su totalidad el papel protector del ANF. Los resultados mostraron que el ANF disminuye la respuesta inflamatoria desencadenada durante la pancreatitis aguda al reducir la expresión de los principales mediadores inflamatorios. El ANF redujo la activación del factor de transcripción NF-κB, íntimamente relacionado con la activación de genes que codifican para citoquinas pro-inflamatorias. En este sentido, disminuyó asimismo los niveles intrapancreáticos del factor de necrosis tumoral α (TNF-α), citoquina que juega un papel clave en la propagación de la respuesta inflamatoria. Por otra parte, disminuyó la expresión de enzimas inducibles durante la inflamación como la enzima óxido nítrico sintasa (iNOS) y ciclo oxigenasa 2 (COX-2) así como también su principal producto, la prostaglandina E2 (PGE2). La atenuación de la respuesta inflamatoria se correlacionó con modificaciones de la ultraestructura de las células acinares observada mediante microscopía electrónica de transmisión. El ANF atenuó el daño generado en la ultraestructura celular ya que disminuyó el swelling del retículo endoplásmico, el edema intra e intercelular y la presencia de autofagolisosomas. El ANF asimismo estimula la muerte celular por apoptosis y disminuye la necrosis, lo que constituye un efecto beneficioso, ya que en la pancreatitis aguda la apoptosis se correlaciona inversamente con la necrosis y así con la severidad de la patología. El ANF incrementa las células TUNEL positivas y la activación de las caspasas, lo que se relaciona la morfología de los núcleos observados por microscopia electrónica. Se observó asimismo que el ANF se expresa en el páncreas exocrino tanto a nivel de su ARN mensajero como a nivel de proteína, lo que implica que el páncreas sintetiza y expresa ANF maduro. Mediante la técnica de inmuno-oro se observó que el ANF se localiza en el retículo endoplásmico, mitocondrias y gránulos de zimógeno. En resumen, en este trabajo de tesis demostramos que el ANF atenúa la respuesta inflamatoria y estimula la apoptosis en la pancreatitis aguda experimental lo sustenta su papel protector en el desarrollo de la patología. Asimismo, observamos que el páncreas exocrino sintetiza y expresa ANF maduro, sugiriendo que tendría funciones paracrinas y/o autocrinas a nivel de las células acinares pancreáticas, en las que hemos demostrado la presencia de sus receptores.

Abstract:
Acute pancreatitis is a prevalent disease characterized by the pathologic autodigestion of the gland promoted by the digestive enzymes synthesized and secreted by the pancreas as a result of premature intra-pancreatic activation. The condition is usually mild and selflimiting, but in 10–15% of cases, it can be severe with associated multiorgan dysfunction and high mortality. The causes leading to one or other form of pancreatitis are presently unknown and due to its uncertain course, the disease still remains a clinical concern. The early events in the development of pancreatitis are not fully understood yet, although trypsinogen activation and the inflammatory response are two independent triggering mechanisms associated with the onset of the disease. In the present thesis we investigated the possible protective role of atrial natriuretic factor (ANF) in the early events triggering acute pancreatitis, particularly the inflammatory response that leads to acinar cell death either by necrosis, apoptosis or both. We also evaluated the exocrine pancreas as a possible extra cardiac source of ANF production. The present study is based on previous works from our laboratory showing that ANF regulates pancreatic functionality and attenuates acute pancreatitis by stimulating cAMP extrusion through multidrug resistance associated protein type 4 (MRP4). However, this mechanism would partially explain ANF beneficial role in the disease. Results showed that ANF attenuated the inflammatory response triggered in acute pancreatitis by reducing the expression and/or level of the major inflammatory mediators. ANF reduced the activation of the transcription factor NF-κB, intimately involved in the stimulation of genes encoding pro-inflammatory cytokines. In this sense, ANF also diminished tumor necrosis factor α (TNF-α) intrapancreatic levels, a key cytokine involved in the propagation of the inflammatory response. The atrial factor also reduced the expression of inducible enzymes like nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase 2 (COX-2) and its main metabolite, prostaglandin E2 (PGE2). The attenuation of the inflammatory mediators correlated well with the ultrastructural changes observed in pancreatic acinar cells by transmission electron microscopy. ANF reduced acinar cell damage, it diminished endoplasmic reticulum swelling, intra and intercellular edema, and the presence of autophagosomes. ANF also stimulated programmed cell death (apoptosis) and diminished necrosis, which is a beneficial effect, given that in acute pancreatitis apoptosis inversely correlates with necrosis and with the severity of the disesase. ANF increased the number of positive TUNEL cells and caspases activation. These findings correlate well with the morphology of the nuclei observed by transmission electron microscopy. In the present study it was also observed that ANF mRNA and protein are expressed in the exocrine pancreas, supporting that the gland synthetizes and expresses mature ANF. Immunogold labeling electron microscopy studies showed that ANF localizes to endoplasmic reticulum, mitochondria and zymogen granules. In summary, this thesis shows that in experimental acute pancreatitis ANF attenuates the inflammatory response and stimulates apoptosis, supporting the protective role of this peptide in the development of the disease. Furthermore, the exocrine pancreas synthetizes and expresses mature ANF, suggesting that the atrial peptide may act in a paracrine and/or autocrine fashion on the acinar cells where we have previously reported the presence of natriuretic factor receptors expression.

Gantuz, Magdalena. "Identificación y caracterización molecular y funcional de variantes de la Proteína Latente de Membrana 1 del virus de Epstein Barr" (2016-08-24) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Virus de Epstein Barr (EBV), agente etiológico de la mononucleosis infecciosa (MNI), se asocia también a neoplasias. Si bien las causas por las cuales contribuye a la linfomagénesis están aún en estudio, la identificación de variantes virales asociadas a tumores podrían responder en parte este interrogante. Dado que LMP1 es la principal proteína oncogénica de EBV, el objetivo fue identificar y caracterizar las variantes moleculares en sus regiones promotora y codificante, y determinar su participación en la patogenia de las enfermedades asociadas. Se incluyeron 29 pacientes pediátricos con linfomas asociados a EBV, 30 con MNI y 14 controles con hiperplasia reactiva. Se amplificaron mediante PCR las regiones promotora ED-L1 y codificante, se secuenciaron y se realizó análisis filogenético. Se analizó además in vitro la actividad del promotor. Región ED-L1: se definieron 4 clados denominados según las líneas celulares B95.8, Cao, Raji and P3HR1. B95.8 fue el más frecuente (47%), pero no se asoció a a ninguna patología en particular. Se observaron mutaciones en sitios de unión a factores de transcripción, la pérdida del C/EBP disminuye 3 veces la actividad de ED-L1. Región codificante: se identificaron 6 clados (China1, China2, Med-, Alaskan, B95.8 and Argentina ) de los cuales prevaleció la variante de circulación local, Arg, (46%) potencialmente originada por recombinación Raji/China1 y que podría tener un origen africano. No se observó una asociación entre variantes específicas y linfomagénesis, aunque algunos polimorfismos tuvieron mayor frecuencia en linfomas. Se estimó una tasa de evolución acelerada en comparación a lo esperado para un herpesvirus, quizás influenciado por la presión de selección positiva sobre codones específicos. Este análisis muestra una evolución compleja de este gen y revela la importancia de su potencial utilización como marcador de variantes virales geográficas.

Abstract:
Epstein Barr virus (EBV), the etiological agent of infectious mononucleosis, is also associated with neoplasia. Little is known about variants prevalence and their influence in EBV diseases. Our aim was to study viral LMP1 variant distribution among children with EBV+ malignant and benign conditions as well as healthy carriers. Oral secretions (OS) and blood cells (PBMC) from 30 children with IM, and biopsies from 14 EBV+ reactive hyperplasia (RH) and 29 EBV+ lymphomas (L) were included. LMP1 sequences were amplified by nested PCR. Sequencing and phylogenetic analysis was performed. Promoter activity was assayed in EDL1 variants. ED-L1: Phylogenetic reconstruction defined 4 clades termed after B95.8, Cao, Raji and P3HR1. B95.8 clade was the most frequent (47%), but it was not associated with any particular condition. Mutations were found in transcription factor binding sites; the abolition of C/EBP caused a 3-fold diminish in EDL1 activity. Coding region: 6 clades were defined (China1, China2, Med-, Alaskan, B95.8 and Argentine (Arg)). Arg clade, the most prevalent (46%), proved to be a Raji and China1 recombinant. No pathology or compartment associations were observed for LMP1 variants, however some polymorphisms presented a higher prevalence in lymphoma patients. Viral evolutionary rate estimated from LMP1 was faster than the expected for a herpesvirus, perhaps due to positive selection influence. These results contribute to the knowledge of EBV genetic diversity and evolution. LMP1 appears to have a complex evolution pattern and reveals the importance of its potential use as a marker of geographical viral variants.

Fernández, Natalia Brenda. "Caracterización de los mecanismos moleculares y celulares activados por ROR1 durante la progresión de melanoma" (2016-08-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El receptor huérfano de tipo tirosina quinasa, ROR1, se expresa y cumple diversas funciones durante el desarrollo embrionario, mientras que en la adultez, su expresión en los tejidos normales es baja o nula. Sin embargo, se ha descripto que ROR1 se expresa abundantemente en diversos tipos de tumores y leucemias. A su vez, ROR1 actúa como un receptor celular de Wnt5a, un ligando extracelular que ha sido implicado en la tumorigénesis. Es por esto que decidimos determinar la expresión y participación de ROR1 en los procesos celulares y moleculares implicados en la progresión de melanoma. Nuestros resultados indican que ROR1 se expresa en líneas celulares y muestras tumorales de melanoma humano, y que su expresión se asocia con una menor sobrevida postrecurrencia de los pacientes. Empleando estrategias de pérdida y ganancia de función determinamos que ROR1 favorece el crecimiento celular, tanto de manera dependiente como independiente de un sustrato sólido. A su vez, ROR1 disminuye la adhesión y aumenta la motilidad y migración de las células de melanoma. Estos procesos son mediados, en parte, a través de la regulación positiva de la vía de Akt y del aumento de la expresión de los marcadores mesenquimales N-cadherina y vimentina. La regulación de N-cadherina depende tanto de la presencia de ROR1 como de la activación de la vía de Akt. En conclusión, demostramos que ROR1 contribuye a la progresión de melanoma y constituye un posible nuevo marcador pronóstico y blanco terapéutico.

Abstract:
The Receptor tyrosine kinase-like Orphan Receptor 1, ROR1, is primarily expressed during different stages of embryogenesis, while in the adult its expression in the normal tissues is downregulated. However, it has been shown that ROR1 re-express in various types of cancers and leukaemias. Interestingly, ROR1 acts as a Wnt5a receptor, an extracellular ligand that has been implicated in tumorigenesis. For these reasons, we decided to study ROR1 expression in melanoma and its role in the cellular and molecular processes implicated in melanoma progression. Here we show that ROR1 is aberrantly expressed in melanoma cell lines and tumours, and that its expression associates with poor post-recurrence survival of patients with melanoma. Using gain- and loss-of-function approaches we found that ROR1 enhances both anchoragedependent and -independent growth of melanoma cells. In addition, ROR1 decreases cell adhesion and increases cell motility and migration. These processes are mediated, in part, by an upregulation of the Akt pathway and an increased expression of the mesenquimal markers N-cadherin and vimentin. The regulation of N-cadherin relies on the presence of ROR1 and the activation of Akt. In summary, we show that ROR1 contributes to melanoma progression and is a candidate biomarker and a prospective therapy target.

Tubert, Cecilia. "Canales Kv1.3 median la hiperexcitabilidad de las interneuronas colinérgicas estriatales en un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson" (2016-09-01) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La acetilcolina moduladores de la función córticoestriatal. Desbalances en su disponibilidad pueden resultar en desórdenes neuropsiquiátricos como la enfermedad de Parkinson. La acetilcolina es liberada por las interneuronas colinérgicas estriatales (ICE), que presentan actividad tónica dependiente de mecanismos intrínsecos, y respuestas fásicas a entradas excitatorias talámicas que codifican eventos ambientales relevantes como recompensas. Un trabajo reciente demostró que las ICE se encuentran hiperactivas en un modelo de rata de la enfermedad de Parkinson. Nuestro primer objetivo fue identificar las corrientes que regulan la excitabilidad de las ICE en rodajas de cerebro de ratón, utilizando la acomodación (disminución de la descarga de potenciales de acción durante una despolarización sostenida) como indicador. Encontramos que la margatoxina, así como otros bloqueantes selectivos y el knock out de la subunidad Kv1.3, reducen fuertemente la acomodación de las ICE y la corriente de K+ subyacente. También encontramos que este canal regula la actividad tónica de estas neuronas, como así también la integración sináptica de inputs glutamatérgicos. Sorprendentemente, también encontramos que este canal participa de la corriente IsAHP de las ICE, descripta clásicamente como una corriente de K+ sensible a Ca2+, pero de la cual hasta el momento no se habían identificado sus componentes. Luego nos propusimos evaluar si cambios en los canales que contienen la subunidad Kv1.3 contribuyen generar las alteraciones de excitabilidad que se observan en ICE de ratones modelo de la enfermedad de Parkinson. Observamos que, al igual que en ratas, las ICE tienen una excitabilidad aumentada en ratones modelos de la enfermedad de Parkinson, la cual es insensible a la margatoxina. También encontramos que las ICE de los ratones parkinsonianos poseen una integración sináptica aumentada y que las corrientes sensibles a margatoxina son de menor amplitud. En conjunto, nuestros resultados revelan un rol importante de los canales que contienen la subunidad Kv1.3 en la excitabilidad de las ICE, en la regulación de su actividad tónica y en la integración de señales externas. En animales modelo de la enfermedad de Parkinson la función de estos canales estaría alterada, contribuyendo a su fenotipo hiperexcitable. Estos resultados nos permiten pensar en los canales Kv1.3 como un potencial nuevo blanco terapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Abstract:
Acetylcholine (ACh) and dopamine are the main modulators of corticostriatal function. Disbalances in their availability may result in neuropsychiatric disorders like Parkinson´s disease (PD). ACh is released by striatal cholinergic interneurons (SCINs), which present tonic activity that depends on intrinsic mechanisms, and phasic responses to excitatory thalamic inputs that codify salient stimuli like rewards. Recent work showed hyperactive SCINs in a rat model of PD. Here our first aim was to identify currents that regulate SCINs excitability in mouse brain slices, using accommodation (reduction of firing during a sustained depolarization) as an index of excitability. Our results show that margatoxin, as well as other selective blockers and the knock-out of Kv1.3 subunit, reduce accommodation and the underlying K+ current in SCINs. We also found that this channel regulates tonic activity and integration of glutamateric inputs in SCINs. Surprisingly, we also found that in SCINs this channel contributes to the IsAHP current, which so far is described as a Ca2+ dependent K+ current whose molecular correlates have not been identified. We then decided to evaluate if changes in the kv1.3 current contribute to alterations observed in SCINs excitability in a mouse model of PD. As it is the case in rats, SCINs become hyperactive after chronic nigrostrital degeneration in the mouse. Importantly, hiperexcitable SCINs are insensitive to margatoxin in the mouse PD model. Moreover, SCINs of parkinsonian mice have an increased synaptic integration and smaller margatoxin sensitive currents compared to sham mice SCINs. Altogether, our results reveal an important role of channels containing Kv1.3 subunit in SCINs excitability, in the regulation of their tonic activity and in their synaptic integration of external signals. In PD the function of these channels might be altered, contributing to their hyperexcitable phenotype. These results let as nominate Kv1.3 channels as potential new target of antiparkinsonian therapy.

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