Biblioteca Digital | FCEN-UBA

Biblioteca Digital ¿Por qué?
Objetivos
Impactos
Estadísticas
Documentos
Presentaciones
Notas
Autores y derechos
¿Por qué depositar?
¿Cómo depositar?
Autorización
Depositar y publicar
Editoriales
Publicar mi tesis Formulario Tesis Posgrado
Formulario Tesis Grado
Normativa
Res. CD 2053/05
Res. CD 2533/09
Res. CD 0272/13
Res. CD 2793/15

Colecciones Tesis Doctorales
Fotografías
Publicaciones
Archivo
Libros
Reportes Técnicos

Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Genética [ 94 tesis ]

Saidman, Beatriz Ofelia. "Estudio de la variación alozímica en el género prosopis" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Rossi, María Susana. "Organización, replicación y evolución de un ADN satélite del género Ctenomys (Octodontidae, Rodentia)" (1990) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Vazquez, Martín Pablo. "Organización y expresión genómica en Trypanosoma cruzi : Proteínas ribosomales P y secuencias repetidas" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Malirat, Viviana. "Variabilidad genética y antigénica del virus de la fiebre aftosa, serotipo O, entre aislamientos recuperados durante la replicación del virus en animales persistentemente infectados, y entre cepas de campo" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La variación genética y antigénica en el virus de la fiebre aftosa, O1 Campos Brasil 1/58 (O1 C/58) se ha analizado en aislamientos consecutivos, recuperados durante un periodo de uno o dos años, a partir de cuatro bovinos con infección persistente, establecida en forma experimental. La comparación de los mapas bidimensionales de fragmentos resistentes a Rnasa T1, y de la secuencia de nucleótidos de la región que codifica para la proteína inmunogénica VP1, revelaron un aumento irregular de las fijaciones de mutaciones a medida que la infección avanzaba. El grado de variación con respecto a la cepa O1 C/58, usada originalmente para establecer la infección persistente, alcanzó valores máximos de 2,4 por ciento para el genoma total y de 1,4 por ciento para la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP1. La mayoría de los cambios no eran conservados entre aislamientos consecutivos. Estos resultados, junto con los valores substanciales de velocidad de variación genómica observados entre algunos pares de aislamientos recuperados con intervalos de tiempo muy cortos, indicaron la coexistencia de poblaciones heterogéneas, que predominaban unas sobre las otras en periodos irregulares, y que evolucionaban independientemente entre sí. No se observaron padrones de variación relacionados entre los cuatro animales. También fue evaluada la diversificación genética de cepas representativas de brotes de campo, serotipo O, ocurridos en regiones endémicas del sudeste de Brasil y del centro-este de Argentina entre los años 1958 y 1983. En base a los análisis de mapas bidimensionales de fragmentos resistentes a RNasa T1, los aislamientos mostraron diferencias respecto de la cepa O1 C/58, con valores que fluctuaban entre 0,7 por ciento y 4,0 por ciento de variación, y los valores registrados en base a la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP1 fluctuaron desde 1,0 por ciento hasta 17,2 por ciento. La variación genómica registrada era independiente del tiempo transcurrido entre los aislamientos, y los cambios no eran acumulativos. Estos resultados sugieren que las variantes no emergen sucesivamente en el campo, y que probablemente representan padrones independientes de evolución, donde podrían intervenir las infecciones persistentes.

Abstract:
Genetic and antigenic variation in foot-and-mouth disease virus O1 Campos Brasil 1/58 (O1 C/58) has been analyzed in consecutive isolates recovered over a one- or two-year period from four cattle with experimental persistent infections. Comparisons of RNase T1 two-dimensional maps and nucleotide sequences of the VP1-coding region revealed an oscillatory increase in the fixation of mutations as the infection progressed. The degree of variation with respect to the strain O1 C/58 used originally to establish the persistent infection, reached values of up to 2,4 per centum for the overall genome, and 1,4 per centum for the nucleotide sequence of the VP1-coding region. Most changes were not conserved in consecutive isolates. These results, together with the substantial rates of genomic variation observed between some pairs of strains recovered at close time periods, suggested the coexistence of heterogeneous populations in which variants predominate at irregular time intervals and evolve independently from each other. Furthermore, non-related patterns of variation were observed in the four animals. Genetic diversification of representative strains from major serotipe O outbreaks in endemic disease regions of southeastern Brazil and central-eastern Argentina between 1958 and 1983, was evaluated. On the basis of oligonucleotide fingerprinting, isolates showed variations, with respect to the early strain O1 C/58, ranging between 0.7 per centum and 4.0 per centum, and values between 1.0 per centum and 17.2 per centum on the basis of nucleotide sequencing of part of the VP1-coding region. The extent of differences among the genomes was independent of the time elapsed between viral isolations. Moreover, changes did not accumulate in subsequent samples. These results suggested that variants did not emerge successively in the field, and probably represent independent patterns of evolution, where persistent infections might be involved.

Panebra Alvarado, Alfredo. "Respuesta humoral en Leishmaniasis del Perú : Proteínas HSP70 y ribosomales P" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En la presente tesis, se abordó el clonado de la hsp70 de L.(V.) peruviana y la caracterización de la respuesta humoral en pacientes con Leishmaniasis Tegumentaria Americana, la Enfermedad de Chagas y la enfermedad mixta Chagas/Leishmaniasis. Se determinó el tamaño del inserto de U4 en 1,6 Kpb. Se mostró que U4 presentaba un marco de lectura abierto de 525 pb. que codifican para los 174 aminoácidos C-terminales de la hsp70 de L.(V.) peruviana. U4 presenta una homología de 98% con Lbb1 (97% de identidad y 1% de cambios conservativos) y con RA1 un 87% (74% de identidad y 13% de cambios conservativos). Se determinó la organización genómica de los genes hsp70 por Southern-blot de ADN genómico de clones de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis. Se encontró 2 locus genómicos, uno de los cuales contenía un tandem de genes hsp70 para ambas especies de Leishmania sp. Los ADNc de U4 y Lbb1 se subclonaron pGEX1l T para caracterizar la respuesta humoral en Leishmaniasis Tegumentaria Americana, Enf. de Chagas y la Inf. mixta Chagas/Espundia por Ensayo de Placa de Lisis, Western-blot y ELISA. Los resultados obtenidos por las 3 técnicas indican que U4/Lbb1 se pueden usar en el diagnóstico de L. Mucocutánea (Espundia) y junto a JL7, permitiría un diagnóstico diferencial de la enfermedad mixta Chagas/Espundia. El clonado y la caracterización de la respuesta humoral de las proteínas ribosomales P2 de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis. El clonado de las proteínas ribosomales ácidas de tipo P2 de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis se realizó mediante rastreo de bibliotecas de expresión en l gt11 con sondas de las proteínas ribosomales P2a y P2b de L.(L.) infantum. En la biblioteca de expresión de L.(V.) peruviana se aisló un recombinante con cada sonda. El recombinante LbpP2a tenía un inserto de aprox. 900 pb., presentando un marco de lectura abierto de 327 pb. que codifican 108 aminoácidos, faltándole sólo los 3 primeros residuos N-terminales para estar completa. El recombinante LbpP2a presenta una homología de aminoácidos de 95% (89% de identidad y 6% de cambios conservativos) con la proteína homóloga de L.(L.) infantum, un 87% (74% de identidad y 13% de cambios conservativos) con la de T. cruzi y un 65% (44% de identidad y 21% de cambios conservativos) con la proteína P2 humana. El otro recombinante (LbpP2b ) aislado de la misma biblioteca continua un inserto de 271 pb., presentando un marco de lectura abierto de 144 pb. que codifican los 44 últimos aminoácidos C-terminales. Cuando se compara el recombinante LbpP2b con sus homólogas de otras especies de Trypanosomátidos, la más alta homología la presenta con la proteína ribosomal P2b de L.(L.) infantum con un 90% (81% de identidad y 9% de cambios conservativos), con la P2b de T. cruzi alcanza un 86% (78% de identidad y 8% de cambios conservativos), con la P2b de T. brucei un 78% (66% de identidad y 12% de cambios conservativos) y con la P2 humana un 73% (59% de identidad y 14% de cambios conservativos). En la biblioteca de expresión de L.(V.) braziliensis se aisló un recombinante (LbbP2b -like) con la sonda la P2a de L.(L.) infantum. Este recombinante contiene un inserto de aprox. 750 pb., presentando un marco de lectura abierto de 264 pb. que codifican los 87 aminoácidos C-terminales de una proteína ribosomal P2b atípica de L.(V.) braziliensis. La comparación de aminoácidos es mayor con el recombinante LbpP2b con un 72% (52% de identidad y 20% de cambios conservativos), un 69% con la de L.(L.) infantum (49% de identidad y 20% de cambios conservativos), con la P2 humana un 64% (35% de identidad y 29% de cambios conservativos), con la T. brucei 58% (38% de identidad y 20% de cambios conservativos) y finalmente con la de T. cruzi un 53% (31% de identidad y 22% de cambios conservativos). Al analizar la respuesta humoral de pacientes con L. Mucocutánea contra los recombinantes LbpP2a y LbbP2b -like, se vió que el epítope inmunodominante no se localiza en el extremo C-terminal, mientras que en las proteínas ribosomales P de T. cruzi, se había determinado el extremo C-terminal como el epítope inmunodominante (péptido R-13). De otro lado, pacientes con la Enfermedad de Chagas no reaccionaban con las proteínas ribosomales de tipo P2 de Leishmania sp., indicando que inducen anticuerpos Leishmania-específicos y que no cros-reaccionan con las de T. Cruzi.

Abstract:
I have performed the cloning of the hsp70 of Leishmania (Viannia) peruviana (recombinant U4) and characterization of the humoral inmune response in patients with American Tegumentary Leishmaniasis (ATL), Chagas’ disease (CH) and the mixed infection Chagas/Leishmaniasis (CH/L) against this protein. The recombinant U4 has an insert of 1,6 Kbp., presenting an open reading frame (ORF) of 525 bp, coding for the last 174 aminoacids. The recombinant U4 presents a high degree of homology with the recombinant Lbb1 (C-terminal domain of the hsp70 of L.(V.) braziliensis) of 98% (97% identity and 1% non conservative substitutions) and with the recombinant RA1 (C-terminal domain of the hsp70 of T. cruzi) of 87% (74% identity and 13% non conservative substitutions). I found two hsp70 genomic loci in the genome of the related species L.(V.) peruviana and L.(V.) braziliensis as determined by Southern blot. One locus comprised the tandem repeat of the hsp70 genes, which present a repetitive unit of 3,7 Kbp. I have cloned the U4, Lbb1 and RA1 cDNAs in the expression vector pGEX1l T to characterize the humoral inmune response in ATL, CH and CH/L as measured by ELISA, Phage dot array immunoassay and Western blot. I found a high reactivity of Mococutaneous Leishmaniasis sera with the U4/Lbb1 recombinant proteins, whereas most of the Cutaneous Leishmaniasis, Chagasic and non-related sera did not. I have also cloned the ribosomal P2-type proteins of L.(V.) peruviana (LbpP2a and LbpP2b ) and L.(V.) braziliensis (LbbP2b -like) by screening of the expression libraries with P2-type ribosomal proteins from L.(L.) infantum as probes. The recombinant LbpP2a has an insert of 900 bp. An ORF of 327 bp, codifying 108 aminoacids, lacking the three N-terminal residues to be a full length protein. This recombinant presents an homology of 95% (89% identity and 6% conservative substitution) with the homologous of L.(L.) infantum, 87% of homology (74% identity and 13% conservative substitutions) with the corresponding of T. cruzi and 65% of homology (44% identity and 25% conservative substitutions) with the human P2 protein. The recombinant LbpP2b has an insert of 271 bp, presenting on ORF of 144 bp, coding for the last 44 C-terminal aminoacids. It has an homology of 90% (81% identity and 9% conservative substitutions) with the corresponding of L.(L.) infantum, 86% of homology (78% identity and 8% conservative substitutions) with that of T. cruzi, 78% of homology (66% identity and 12% conservative substitutions) with the P2b protein of T. brucei and 73% of homology (59% identity and 14% conservative substitutions) with the human P2 protein. The LbbP2b -like protein has an insert of 750 bp, presenting an ORF of 264 bp. coding for the 87 C-terminal aminoacids. It has 72% of homology (52% identity and 20% conservative substitutions) with that of L.(V.) braziliensis, 69% (49% identity and 20% conservative substitutions) with that of L.(L.) infantum, 64% (35% identity and 29% conservative substitutions) with the human P2 protein, 58% (38% identity and 20% conservative substitutions) with the P2b of T. brucei and a 53% (31% identity and 22% conservative substitutions) with that of T. cruzi. In both Leishmania P2 proteins (LbpP2a and LbbP2b -like) evaluated, the most antigenic epitope was not located at the C-terminus, whereas in the T. cruzi P2 proteins the inmunodominant epitope was the last 13 C-terminal residues (R-13 peptide). Chagasic sera did not react with the ribosomal P2 proteins from Leishmania sp.

Porcel, Betina Mabel. "Caracterización molecular del gen que codifica para una proteína flagelar ligadora de calcio del Trypanosoma cruzi, altamente consevado en Tripanosomátidos" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La fracción flagelar de epimastigotes de Trypanosoma cruzi, enriquecida en flagelos y elementos de membrana, ha mostrado en modelos experimentales murinos las mejores propiedades inmunogénicas, protectivas y no agresivas contra el desafío con el T. cruzi Quizás sólo un pequeño número de los componentes de esta fracción están involucrados en esta inmunidad protectiva en el huésped, en tanto que el resto de ellos podrían actuar en otros procesos esenciales para el parásito. Las señales de calcio juegan un papel preponderante en diversos mecanismos de transducción de señales en parásitos, tanto en relación a la invasión a la célula hospedadora como en los cambios morfo-fisiológicos del mismo a lo largo de su ciclo de vida. Asimismo, la alta conservación de las proteínas moduladoras de calcio en distintos tripanosomátidos, ha sugerido su posible implicancia en dichos procesos de transducción. En este trabajo se describe la caracterización a nivel molecular del gen que codifica para una proteína flagelar ligadora de calcio en T. cruzi, y su versión homóloga en Trypanosoma rangeli. Varios clones de ADN recombinante fueron detectados en una genoteca de expresión construida a partir del ADN total de la forma epimastigote de T. cruzi (clon Miranda/76), en el vector de expresión λgt11 , utilizando suero de conejo anti-fracción flagelar. Dos de esos clones recombinantes fueron seleccionados para la caracterización de sus productos de expresión. La expresión de estos clones recombinantes en bacterias produjo proteínas fusionadas a la enzima g-galactosidasa, las que mostraron poseer epitopes reconocidos por anticuerpos dirigidos contra la fracción flagelar del parásito. La adsorción del suero anti-fracción flagelar por las proteínas expresadas, permitió obtener anticuerpos que identificaron por "inmunoblotting" moléculas de 29 kDa en ambos casos, en homogeneizado total de epimastigotes y fracción flagelar, mientras no reaccionaron con antígenos de Leishmania brasiliensis. Posteriormente, el análisis de la secuencia de bases de ambos fragrnentos confirmaron que los insertos provenientes de ambos clones codifican para una misma proteína de 29 kDa. en T. cruzi. La presencia de este antígeno F29 en la superficie del parásito fue comprobada por inmunofluorescencia. La expresión del gen completo que codifica para la proteína flagelar F29 en el vector pMAL-p2 permitió obtener una proteína recombinante fusionada a proteína de unión a maltosa, que mostró ser ligadora de calcio. Cuando se ensayó la inmunogenicidad del antígeno recombinante F29-MBP, utilizando Bordetella pertussiscomo adyuvante, se observó que esta proteína es capaz de generar una respuesta inmune humoral contra el T. cruzi, demostrada por anticuerpos dirigidos contra la proteína pura y el homogenato total del parásito. Los epitopes generadores de respuesta en F29-MBP fueron reconocidos en un gran número de otras proteínas en el parásito, a igual que se mostraron altamente representados en el T. rangeli. El gen que codifica para la proteína flagelar ligadora de Ca++ F29 mostró encontrarse organizado en al menos 20 copias, altamente conservadas entre cepas pertenecientes a distintos zimodemas, adyacentes una a la otra con una disposición cabeza-cola en el genoma del parásito. Dicho gen se expresa en epimastigotes de T. cruzi transcribiendose a un mensajero policistrónico, el cual podría sufrir un procesamiento post-transcripcional de clivaje y poliadenilación, también observado para otros genes del parásito. El perfil encontrado para diferentes clones y cepas de T. cruzi estudiados por hibridización a cromosomas enteros fraccionados por electroforesis en campo pulsado reveló que el gen que codifica para la proteina flagelar F29 se halla ampliamente representado en T cruzi, mostrando una conservación intraspecífica en las cepas y clones evaluados. Asimismo, estos patrones de hibridización mostraron una alta correlación con la clasificación isoenzimática de las distintas cepas y clones analizadas de acuerdo a su perfil isoenzimático basado en 2, 12, 13 y 19 loci. A su vez, la existencia de al menos dos arreglos de repeticiones de genes, ubicados en un par de cromosomas homólogos fue observada al enfrentar la misma sonda a productos de digestión provenientes de la digestión de cromosomas enteros de distintas cepas, con enzimas sin sitios de corte dentro del inserto. La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa sobre ADN genómico total de T. rangeli (aislado LDG) usando como iniciadores de la síntesis oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia completa del gen que codifica en T cruzi para la proteína flagelar ligadora de calcio F29, permitió la obtención de un fragmento de ADN que codifica para una proteína de 23 kDa con alta homología con proteínas flagelares responsables de la unión a Ca2+ en otros tripanosomátidos. La hibridación a ARN de T. rangeli reveló que esta proteína se expresa como un transcripto poliadenilado de 1.6 kb, a raiz, al igual que en T. cruzi, de un procesamiento post-transcripcional. El gen que codifica para TrCaBP en T. rangeli tambien se encontró organizado en al menos 20 copias por célula, en dos cromosomas de gran tamaño en ciertos aislados del T. rangeli, y a dos pequeños en otros aislados. Los resultados presentados demuestran que la información genética que codifica para la proteína flagelar ligadora de Ca2+ F29 del T. cruzi se encuentra altamente conservada en el genoma de otros tripanosomátidos, sin encontrarse presente en el género Leishmania.

Abstract:
The flagellar fraction of Trypanosoma cruzi epimastigotes contains flagellar membrane components such as glycoproteins and parasite surface enzymes. This fraction has the best immunoprotective properties in the murine model. Just a few of these components would be involved in this protective response, whereas others would play a key role in parasite's essential processes. Calcium signals would play an important regulatory role in signal transduction processes in parasites, being critically involved in the coordination of life cycle events and cell invasion. Likewise, the high conservation of calcium-modulated proteins among different trypanosomatides supports the notion that these cell-surface calflagins would play common roles in these caZ+-transduction processes. In the present study, we report the cloning and molecular characterisation of genes encoding EF-hand calcium-binding proteins in Trypanosoma rangeli and T. cruzi, showing that these genes are highly conserved in these related trypanosomes. A T. cruzi, Miranda/76 clone, genomic Agtl 1 expression library was screened with rabbit anti flagellar fraction polyclonal antibodies and several clones were obtained. Two of them, with inserts of 550 and 750 bp respectively, were selected for recombinant protein production. The IS-galactosidase fusion proteins produced in bacteria by IPTG induction possesed epitopes recognized by antibodies raised against T. cruzi flagellar fraction. Antibodies selected from the anti-flagellar fraction polyclonal sera using these fusion proteins, detected a 29 kDa. protein in T. cruzi epimastigote whole homogenate and flagellar fraction by immunoblotting, whereas no reactivity was observed against Leishmania brasiliensis . Subsequently sequence analysis showed that both inserts encoded for the same 29 kDa. protein in T. cruzi. The presence of F29 antigen on the parasite surface was confirmed by indirect immunofluoresence. Expression of the complete F29 encoded-gene into pMAL-p2 expression vector showed that F29 is a calcium-binding protein. Furthermore, this recombinant protein was inmunogenic in mice, using Bordeteila pertussis as adyuvant. Antibodies raised against F29recognized several proteins in T. cruzi by immunobloting as well as in T. rangeli. F29 is encoded by at least twenty tandemly arranged highly conserved genes, organized in a head-to-tail fashion in the parasite genome. F29-encoding gene is transcribed as a polyadenylated transcript in the parasite. PFGE hybridization experiments revealed the presence of the F29 genes in different T. cruzi isolates, cloned stocks and strains, with common features between T. cruzi isoenzimatic classification and chromosomal hybridization patterns. Similar pattern of one or two bands were seen after PFGE-Southern analysis with rare cutting restriction enzymes, which do not cut inside the tandem array, indicating a disomic chromosomal constitution for F29 genes. PCR amplification of T. rangeli genomic DNA, using primers derived from the T. cruzi F29-encoding sequence made it possible to isolate the homologous gene in T. rangeli, encoding a 23 kDa highly homologous to calcium-binding proteins from trypanosomatids. Northern blot analysis revealed that the Tr CaBP gene is also expressed in T. rangeli as a polyadenylated transcript. The TrCaBP-encoding genes are present in at least 20 copies per cell, organized in tandem arrays on large T. rangeli chromosomes in some isolates, and on two smaller in others. Hence, the calcium-modulated proteins encoding genes, as well as their genomic organization, are well conserved in trypanosomes. The gene, however, seems to be absent from Leishmania sp.

Rosato, Carmen Luisa Marcela. "Tamaño del genoma, heterocromatina, polimorfismo numérico y herencia de cromosomas B en razas nativas del maíz" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Se realizaron estudios citogenéticos en poblaciones nativas de maíz del norte argentino adaptadas a diferentes alturas de cultivo. Los mismos consistieron en: determinación del polimorfismo numérico para cromosomas B y del tamaño del genoma, caracterización de la heterocromatina mediante técnicas de bandeos cromosómicos y la relación de éstos con parámetros geográficos como la altitud. Además, se estudió la tasa de transmisión femenina de cromosomas B en una población de la raza Pisingallo. Se estudiaron 21 poblaciones (1120 individuos) cultivadas a diferentes altitudes (80-3620m). Se encontró polimorfismo numérico para cromosomas B en 19 poblaciones. Las frecuencias media de individuos portadores de cromosomas B varían entre 0 y 94%. El análisis de correlación entre el número medio de cromosomas B y la altitud indica que se correlacionan positivamente. El tamaño del genoma (contenido de ADN) fue determinado en 17 poblaciones (107 individuos). Con la finalidad de estudiar la variación del contenido de ADN en los cromosomas A (A-ADN) independientemente de la variación aportada por los Bs, ésta estimación fue llevada a cabo en plantas sin Bs. El rango de variación hallada entre las poblaciones estudiadas fue del 36% (5,00 - 6,8 pg). El contenido de ADN (A-ADN) se correlaciona negativamente con la altura de cultivo y el número medio de Bs. La variación clinal hallada del contenido de ADN y la consecuente correlación con la frecuencia de cromosomas B sobre un gradiente altitudinal tendría un significado adaptativo. En cuatro poblaciones se estudió el contenido de ADN en individuos con diferente dosis de cromosomas B. Se encontró que, dependiendo de la población analizada, la presencia de cromosomas B no siempre incrementa el contenido de ADN respecto a los individuos sin cromosomas B de la misma población. Con el fin de dilucidar sí esto se debe a un efecto de enmascaramiento producido por la variación en el contenido de heterocromatina, se analizaron individuos con distinta dosis de cromosomas B mediante la técnica de bandeo fluorescente utilizando DAPI como fluorocromo. Se encontró, en una población, que la distribución del número de bandas no es independiente de la presencia de cromosomas B. El resultado hallado indica que en individuos portadores de cromosomas B, la variación del número de bandas heterocromáticas estaría enmascarando la presencia de los cromosomas B, al medir el contenido de ADN. Debido a éste resultado existiría una estrecha relación entre el tamaño del genoma, el contenido de heterocromatina y los cromosomas B. En cada población, la frecuencia de Bs podría estar limitada por la variación del contenido de A-ADN o viceversa. Además la distribución de frecuencias en el número de bandas heterocromáticas está relacionada con la presencia de cromosomas B y por lo tanto, los individuos con Bs poseen en general menor número de bandas heterocromáticas en sus cromosomas A, que los individuos sin Bs. Por otro lado, se encontró una correlación altamente significativa entre el número de zonas heterocromáticas y la frecuencia de cromosomas B en 11 poblaciones. Estos resultados sugieren que, en cada población, el contenido de ADN total posee un limite máximo y el mismo sería alcanzado mediante un balance entre el contenido de heterocromatina (en los As) y la dosis de cromosomas B. Por otro lado, con la finalidad de conocer la tasa de transmisión de los cromosomas B por vía materna se realizaron cruzamientos entre plantas f.1B x m. 0B en una población de la raza Pisingallo. Se encontró una variación para la tasa de transmisión de los Bs en la G0. Un experimento de selección con cruzamientos controlados el cual consistió en seleccionar aquellas progenies que presentaron las menores y las mayores tasas de transmisión durante dos generaciones. Los resultados obtenidos en la G1 indican la presencia de dos diferentes grupos de plantas: alta y baja tasa de transmisión de cromosomas B por vía materna y demuestra la existencia de polimorfismo para genes que controlan la tasa de transmisión de los cromosomas B. En la G2 los grupos de alta y baja tasa de transmisión se mantuvieron separados, sin embargo, no fue posible obtener mayor progreso selectivo que el obtenido en la G1. Estos resultados indican que habría un componente genético en la variación obtenida para la tasa de transmisión de los cromosomas B en la generación parental (G0). El grupo seleccionado para alta tasa de transmisión de los cromosomas B por vía materna corresponde a genotipos que lo transmiten de manera mendeliana en cambio, el grupo seleccionado para baja tasa de transmisión lo transmiten a una tasa menor. Es decir que, sólo habría genes "anti-B" que podrían actuar promoviendo la pérdida meiótica del univalente B en la meiósis femenina o la migración del B hacia las megasporas no funcionales o ambos fenómenos. Los mecanismos de acumulación descriptos para maíz son suficiente para explicar el mantenimiento del polimorfismo de los Bs en las poblaciones, sin embargo, estos mecanismos no son suficiente para explicar las diferentes frecuencias de cromosomas B en las poblaciones. Diferentes frecuencias de los alelos que controlan la tasa de transmisión de cromosomas B podrían explicar las frecuencias de cromosomas B hallada en las diferentes poblaciones.

Abstract:
Maize native populations from northern Argentina adapted to different altitudes were cytogenetically studied. These studies consisted in: determination of B-chromosome numerical polymorphism, DNA content, characterisation of heterochromatin by techniques of chromosome banding and the study of the relationship with altitude of cultivation. Moreover, the transmission rate of B-chromosome was studied in a population of Pisingallo race. Twenty one native populations (1120 individuals) cultivated at different altitudes (80-3620m) were studied. A numerical polymorphism for B-chromosomes was found in 19 populations. The mean frequencies of individuals with Bs varied from 0 to 94%. A highly significant positive correlation between the mean number of Bs per plant and altitude of cultivation was demonstrated. The genome size (DNA content) was determined in 17 populations (107 individuals). With the aim to study the variation in DNA content of A-chromosomes (A-DNA) independently from the variation supplied by the Bs, this estimation was performed in plants without Bs. The range of variation was 36% (5,00 to 6,8 pg) among studied populations. A-DNA content was negatively correlationed with both altitude of cultivation and mean frequency of Bs. The clinal variation of A-DNA content found in individuals without Bs and the consequent inverse correlation of B frequencies over an altitudinal gradient could have an adaptive significance. The genome size in individuals with different doses of Bs in 4 populations was studied as well. It was found that the presence of Bs did not always increase the DNA content respect to individuals without Bs and it depended on each population. With the aim to know if this phenomenon was caused by a masking effect produced by the variation in heterochromatin amount, individuals with different B-chromosome doses were studied by means of fluorescent banding with DAPI. It was found that the distribution of number of bands is not independent of the presence of B-chromosomes. The found result indicates that in individuals carrying B chromosomes a variation in the number of heterochromatic bands would be masking the B chromosome presence in the DNA content. These results indicate that there is a close interrelationship between the DNA content, heterochromatin amount and B-chromosomes. In each population, the B-chromosome frequency would be limited by the variation of DNA content, or viceversa. Moreover, the distribution of frequency in number of heterochromatic bands is related with the presence of B-chromosomes and, therefore, individuals with Bs have fewer bands than individuals without Bs in the A-chromosomes. On the other hand, a highly significant negative correlation between the number of knobs and the mean number of Bs in eleven populations was found. These results suggest that, in each population, there would be a maximum range of mass of nuclear DNA and this could be reached balancing both heterochromatin amount and B-chromosomes. With the aim to know the transmission rate (TR) of the B chromosomes on the female side, crosses between f.1B X m. 0B plants were carried out in a population (VAV 6313) of the race Pisingallo. Variation of B-chromosome transmission rate in G0 was found. An experiment of selection with controlled crosses was carried out which consisted in selecting those progenies of f.1B X m. 0B crosses showing the highest and lowest TR along two generations. The results obtained in G1 indicate the presence of two different groups of plants, high and low B TR on the female side, and demonstrate the existence of polymorphism for genes controlling B TR. In G2 the high and low B-TR groups were kept up isolated, nevertheless it was not possible to obtain more selective progress than that obtained in G1. This indicates that there is a genetic component to the variation of B TR obtained in G0. The selected groups for high female B-TR corresponds to genotypes that transmit it in a mendelian inheritance, whereas the selected group for low B-TR transmit it at a lower rate tham that in the mendelian inheritance. In other words, there are "anti-B genes" which might act on the propensity for the meiotic loss of the B univalent, or on the nonrandom migration of the B toward the non-functional megaspore, or both. Drive mechanisms are sufficient to account for the maintenance of B polymorphism in maize populations. However, these mechanisms cannot account for the differences of B frequencies in different populations. Different frequencies of the alleles controlling B-TR may account for B frequency in different populations of maize.

Cucchi, Adriana. "Supervivencia y mejoramiento de los bacilos entomopatógenos : Bacillus thuringiensis var. israelensis y Bacillus sphaericus" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El uso de los bioinsecticidas representa una ventajosa alternativa desde el punto de vista ecológico y toxicológico en el control de enfermedades y plagas.% Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) y Bacillus sphaericus (Bf) son especies bacterianas empleadas como bioinsecticidas en la lucha contra los agentes de transmisión del paludismo, la fiebre amarilla y el dengue entre otras enfermedades. Sin embargo su uso se ve restringido debido a la alta especificidad y sedimentación de los preparados de bioinsecticidas así como debido a problemas de supervivencia de los bacilos entomopatógenos. El objetivo de esta tesis es comprender las causas de la baja supervivencia de Bti y Bf y mejorar esta variable para aumentar su eficiencia como bioinsecticidas. En este estudio se evalúan distintas propiedades vinculadas con la supervivencia, eligiéndose a la respuesta osmótica como tema central de estudio. Si bien se analiza el comportamiento en distintos estadios fisiológicos, las esporas constituyen el principal blanco de interés. Esto surge al considerar que los bioinsecticidas son preparados formados por esporas y cristales tóxicos y que son empleados mediante su diseminación en ambientes acuáticos. A partir de los resultados obtenidos en esta tesis se puede concluir que: 1- Distintos factores determinan la baja supervivencia de los bacilos entomo-patógenos Bti y Bf en el ambiente: la temperatura, la luz UV, las variaciones osmóticas y el bajo pH, si bien su reducida tolerancia osmótica es uno de los factores que contribuye en mayor medida. 2- La alta sensibilidad de las esporas de estos bacilos resulta de una deficiencia en un tipo de proteínas llamadas SASP, encontrándose afectados tanto su concentración como el contenido en aminoácidos osmóticamente relevantes. Por otro lado, posiblemente deficiencias relacionadas con las cubiertas y envolturas de las esporas sean también responsables de su gran sensibilidad ambiental. 3- La introducción de genes ssp (codificantes de las proteínas SASP) de B. subtilis permite un mejoramiento de la respuesta osmótica en esporas de Bti y Bf. La expresión de estas proteínas en las cepas transformadas no afecta la esporulación ni otras propiedades biológicas de importancia en el empleo de los bioinsecticidas.

Abstract:
Bioinsecticides constitute a convenient choice in plague and disease control, both considering toxicological and environmental perspectives. Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) and Bacillus sphaericus (Bf) are bacteria employed as bioinsecticides in paludism, yellow fever and dengue control. Nevertheless, poor strain survival, restricted host range and sediment problems of formulations in aquatic enviroments limit their application in nature. The objetive of this work is to understand Bti and Bf low survival and to improve it in order to obtain a greater efficacy in field application. The research is focus on the osmotic response, although other parameters are also evaluated. The study is based on spores, but vegetative cell behaviour is also analyzed. This results from bioinsecticides are spore plus crystal complexes which are disseminated in aquatic environments. From the results obtained we can conclude that: 1. Different environmental factors contribute with Bti and Bf poor survival: temperature, UV light, osmotic variations and low pH, although the reduced osmotic tolerance is one of the main factors to consider. 2. The great sensibility of Bti and Bf spores is due to a defficiency in some proteins called SASP, being affected both its concentration and the content of osmotically relevant aminoacids. Possibly, other defficiencies including the spore cortex and spore coats contribute with this great sensibility. 3. Introduction of ssp genes (which code for SASP proteins) from B. subtilis improve the osmotic response of Bti and Bf spores. SASP expression doesn’t interfere with sporulation nor crystal protein synthesis, essential in bioinsecticide application.

Chiavarino, Amílcar Mauricio. "Cromosomas B : Meiosis y herencia en razas nativas de maíz" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Marcucci Poltri, Susana N.. "Caracterización molecular y cariotípica de la variabilidad genética de germoplasma argentino de Solanum L." (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La papa cultivada se encuentra relacionada con un gran número de especies del género Solanum con las que frecuentemente se cruza. Por tal motivo, las aproximadamente 200 especies silvestres que producen tuberculo, constituyen un importante reservorio de genes para distintos propósitos de mejoramiento. Las mismas se encuentran distribuidas en un amplio rango de hábitats y nichos ecológicos, constituyendo el Noroeste argentino, una gran fuente de germoplasma. Es conocido que poseen gran variabilidad tanto dentro como entre especies. La información sobre el grado de relación genética que existe entre las distintas entradas, reviste gran interés para las aplicaciones al mejoramiento genético, organización de los bancos de germoplasma. identificación de cultivares, reducción del número de entradas necesarias para que alberguen en una pequeña muestra, la mayor variabilidad genetica posible, para el mejoramiento molecular, etc. La variabilidad genetica puede medirse utilizando distintas herramientas las que incluyen datos morfológicos, citológicos, bioquímicos y moleculares. El objetivo de este trabajo es evaluar la variabilidad genética de 67 entradas silvestres y cultivadas del género Solanum, coleccionadas en el Banco de Germoplasma de EEA INTA- Balcarce, aplicando metodologías citológicas y moleculares y contrastar los resultados obtenidos con la clasificación taxonómica y su hipótesis evolutiva. Se analiza la utilidad de estas herramientas y la información generada mediante los polimorfismos de restricción correspondientes a los ADNs ribosomales. Se evaluó mediante microdensitometría, el contenido de ADN de individuos pertenecientes a 14 especies silvestres del género Solanum con el fin de detectar diferencias en el valor C. A pesar de que la mayoria de las especies no mostró diferencias significativas entre ellas (dentro de los distintos grupos de ploidías), pequeñas diferencias fueron detectadas entre algunas de ellas. S. tarijense y S. kurzianum (2.3 pg) difirieron significativamente (0,1%) de S. Spegazzini, S. vernei, S. venturii y S. commersonii (1,9 pg); y S.. megistacrobolum (2,2 pg) difirió de S. spegazzinii (1,9 pg) dentro de los citotipos diploides. Entre los tetraploides el rango fue desde 3,6 pg (S. tuberosum ssp tuberosum cv. Baraka) hasta 4,7 pg (S. tuberosum ssp andigena y S. gourlayi) hallándose diferencias significativas al 0,1%. En cuanto a la variabilidad de los genes que codifican para el ARN ribosomal, se detectaron diferentes tamaños de las subunidades completas, tanto dentro como entre especies, y aún, dentro de una misma especie; sugiriendo una alta tasa de mutaciones localizada fundamentalmente el extremo 5' del espaciador externo. La pérdida del sitio EcoRI del extremo 3'de dicho espaciador en todas las entradas de S. venturii fue característica de dicha especie. El desarrollo de las nuevas metodologías ha expandido el rango de los ensayos para detectar polimorfismos de ADN con propósitos de "fingerprinting", distancias genéticas, etc. Se han desarrollado distintos marcadores moleculares (RFLP, AFLP, SSR etc) con el fin de estudiar las relaciones genéticas y se evaluó su utilidad en varios cultivos, incluidos la papa cultivada, S. tuberosum ssp tuberosumm. En este trabajo, se ensayaron 4 combinaciones de "primers" de AFLP, 15 sondas genómicas de RFLP y 7 pares de "primers" para SSR; para un grupo de 67 genotipos diploides y poliploides que pertenecen al mismo grupo de especies silvestres y cultivadas. Se compararon las asociaciones generadas mediante todas las técnicas y se las comparó con la clasificación taxonómica tradicional. Se calcularon los indices de contenido polimórfico promedios correspondiente a cada sistema (con valores aproximados de 0,25 para RFLP, 0,32 para AFLP y 0.58 para SSR), número de polimorfismos por ensayo y también se determinaron los alelos comunes entre las entradas diploides y poliploides, incluyendo al cultivar de papa. En términos generales, las relaciones entre las especies variaron según la metodología utilizada. Se observó una gran variabilidad dentro de especies, lo que dificultó el establecimiento de las relaciones entre especies. Como se esperaba, las entradas pertenecientes a una misma especie, en general se agruparon con mayor similitud que entre especies, independientemente de la técnica utilizada. También se detectaron asociaciones de individuos concordantes con la procedencia geográfica. Promediando todos los indices de similitud obtenidos con los tres métodos. la especie que tuvo menor variabilidad fue S. venturii (0,681) y la de mayor variabilidad S. gourlayii(0,411). Los mejores valores de correlaciones entre los distintos sistemas correspondieron a AFLP y SSR, en los dos grupos de ploidías, aunque los coeficientes de correlación entre las matrices de similitud obtenidas mediante las distintas herramientas no difirieron demasiado. Los valores de correlaciones en los citotipos diploides fueron desde 0,510 (RFLP vs SSR), 0,552 (RFLP vs AFLP), 0,640 (AFLP vs SSR). Considerando todos los citotipos independientemente de la ploidía, los valores oscilaron desde 0,441 (RFLP vs SSR), 0,505 (RFLP vs AFLP) a 0,629 (AFLP vs SSR). Debido a los altos valores obtenidos en los coeficientes de correlación cofenéticos (matrices de similitud vs. matrices cofenéticas, AFLP r=0.92; SSR r=0.85; RFLP r=0.78), las asociaciones entre los individuos pueden visualizarse directamente a partir del dendrograma. Los AFLP mostraron el mejor ajuste con la clasificación taxonómica, asociando dos especies que pertenecen a la misma serie Yungasensa (S. tarijense y S. chacoense), como así también agrupando más próximo al grupo de referencia externo tomate, a las entradas pertenecientes a S. commersonii, considerada como la especie más primitiva según la hipótesis propuesta por Hawkes, 1990. Esto quizás sea debido al gran número de bandas compartidas entre el germoplasma y a la alta cobertura genómica. En el caso de RFLP, se observaron algunos individuos dispersos, sugiriendo que sería necesario evaluar un mayor número de sondas. Los SSR en general se utilizan para obtener información dentro de especies. pero no entre especies. Pudo observarse que la mayoria de los loci evaluados produjeron amplificaciones, indicando la conservación de las regiones flanqueantes. Sin embargo, el número de repeticiones, no fue muy conservado entre las distintas especies, transformándolos en inapropiados para establecer relaciones entre especies, pero si muy útiles dentro de especies. El análisis reverso de los datos, permitió la detección de bandas caracteristicas de especies y también de individuos. Casi todas las especies pudieron discriminarse con estas bandas, y muchos de los individuos mostraron bandas únicas. Se evaluaron asimismo el número de bandas novedosas respecto del cultivar Huinkul MAG, en especies como en individuos particulares, pudiendo identificarse aquellas más distantes genéticamente, que serían potencialmente interesantes para aumentar las bases genéticas de los cultivares comerciales. También se determinó es grado de homocigosis de los distintos genotipos diploides, merced al uso de los marcadores de tipo codominantes (RFLP y SSR) mostrando un mínimo de homocigosis de 26% en S. goniocalyx megistacrolobum Oka 3787.

Abstract:
Cultivated potato is related to a large number of Solanum sp and can easily be hybridized. This makes that the two hundred wild and cultivated tuber-bearing species of the genus Solanum form a valuable gene reservoir for different breeding purposes. They are distributed in a wide variety of habitats and niches (North-West Argentina is a source of a great number of these species), there is high genetic variation within and between species. Information on genetic relationships among accessions has several important applications for crop improvement: organizing germplasm banks, identifying cultivars, reducing the number of accessions needed to ensure a representative sample of broad range of genetic variability, molecular breeding, etc. Genetic variability can be assessed in different ways including the comparison of morphological, cytological, biochemical and molecular data. The objective of this work is to evaluate genetic variability of 67 wild and cultivated Solanum accessions belonging to the germplasm bank of EEA INTA Balcarce applying cytologic and molecular tools. The usefulness of this tools are compared with traditional taxonomy and its evolutive hypothesis. Ribosomal DNAcoding sequences are explored trough different restriction polymorphisms. Different subunits sizes were detected within and between species, and also in one specie, showing a high mutation rate mainly in the 5' end of the external spacer. All accessions of S. venturi showed the lost of an EcoRI restriction site located in the 3' end of the external intergenic spacer. DNA content of individuals belonging to 14 wild Solanum species was measured by microdensitometry to determine differences in their C value. Although most species did not show significant differences between them, slight differences could be detected between some of the species. Both S. tarijense and S. kurzianum (2.3 pg) differ from S. spegazzinii, S. vernei, S. venturii and S. commersonii (1,9 pg); and S. megistacrolobum (2,2 pg) differ from S. spegazzini (1,9 pg) at diploid level. Tetraploids ranged from 3.6 pg (S. tuberosum ssp tuberosum cv. Baraka) were found at 0.1% level. New technological developments have expanded the range of DNA polymorphism assays for genome fingerprinting, genetic relatedness, etc. Different molecular markers (RFLP, AFLP, SSR, etc.) has been developed to study genetic relationships and their usefulness was compared in many crop species including cultivated potato Solanum tuberosum ssp tuberosum In this work, 67 genotypes (diploids as well as tetraploids) belonging to the same group of wild and cultivated species, were assayed with, 15 RFLP genomic probes, 4 AFLP primers combinations and 7 microsatellite primers pairs. Associations generated by each technique were compared as well as how they fit with traditional taxonomy classification. Estimates of diversity indexes for each system (RFLP=O,25, O,32=AFLP and O,58=SSR), number of polymorphisms per assay as well as identification of common alleles between diploid and tetraploid accessions including cultivated potato were calculated. In general terms, quantification of relatedness between species varied depending on the technique applied. It was observed a very high level of variation within species, making more difficult to establish relationships between species. As expected, accessions of the same species grouped at a higher level of similarity than with the rest of the germplasm, independently of the molecular tool used for evaluation. Genotypes belonging to the same geographic origin, were also grouped. S. gourlayí showed to be the most variable specie calculated on the bases of the three methodologies with the with the smallest average similarity index (0,411) and the less variable was S. venturii with the highest average similarity index (0,681). Similarity indexes calculated on the bases of all three different methodologies were correlationed and r values were 0.510 (RFLP vs SSR), 0,552 (RFLP vs AFLP), 0,640 (AFLP vs SSR) for diploid species. Taking into account all citotypes, r values ranged from 0.441 (RFLP vs SSR), 0,505 (RFLP vs AFLP) a 0,629 (AFLP vs SSR). As similarity matrixes are comparable with cophenetic matrixes (AFLP r=0.92; SSR r=0.85; RFLP r=0.78), this allows us to roughly visualize the associations between accessions directly on dendograms. AFLP showed the best fit to taxonomic classification grouping two species (S. tarijense and S. chacoense) which belong to the same taxonomical serie Jungasensa, althogeter; also S. commersonii which is considered to be the most primitive taxon of this group (Hawkes. 1990) was grouped near the outgroup tomato. This might be due to the higher proportion of shared bands respect to the other and the relative better coverage of genomes. In the case of RFLP, some accessions were dispersed, suggesting that more probes need to be analyzed. SSR are usually used to obtain information within species and not between species, it was observed that the loci were conserved since amplification was possible in many of the genotypes analyzed. However, microsatellite loci showed very little conservation of alleles in different species (as expected for this very mutable loci) making them not appropriate for relatedness quantification when comparing different species while they keep their usefulness within species. Reverse analysis of data allowed the detection of specie specific bands as well as individuals ones. Nearly all of the species were able to be discriminated and most of single individuals had unique bands. Novel bands not found in potato cultivar Huinkul MAG were also computed in all species and in individuals allowing the knowledge of the more distant ones, which might be interesting for increasing genetic basis of commercial cultivars. Homozygous status of diploids genotypes were also estimated using codominant markers (RFLP and SSR) being of 36% for S. spegazzinii Oka 6108 and 64% for S. goniocalyx y S. megistacrolobums Oka 3787.

Fernández Iriarte, Pedro José. "Bases genéticas de la adaptación de Drosophila buzzatii al uso de los recursos" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En este trabajo de Tesis se analizaron las bases genéticas de la adaptación de Drosophila buzzatii al uso de los recursos, asociadas con la variación en los caracteres de historias de vida, intentándose profundizar en el conocimiento de los procesos adaptativos que afectan la distribución de la variabilidad en las poblaciones naturales. Se ha demostrado que el polimorfismo de inversión del cromosoma 2 de D. buzzatii afecta a la viabilidad(VI), el tiempo de desarrollo (TD) y el largo del tórax (LT).Además,los efectos de las inversiones sobre el TD y la VT no son independientes del tipo de cactus usado como sustrato larval. Estos efectos de interacción genotipo x ambiente podrían proporcionar las bases para la especialización y partición del recurso. Por otra parte, los efectos entre el TD y el LT sugieren la existencia de compromisos (trade-off) en la aptitud. En poblaciones naturales se observó que la diferenciación microespacial de las frecuencias de inversión entre los sitios de cria individuales (rots), es mayor que la observada a una escala temporal. El nivel principal de diferenciación es el rot individual y una parte de la divergencia en las frecuencias cromosómicas podría deberse al efecto fundador producido por la colonización de un bajo número de individuos. Las inversiones cromosómicas no presentaron un patrón de atracción diferencial entre plantas hospedadoras diferentes (Opuntia quimilo y Trichocereus terschekii).La ordenación 2J mostró en ambos hospedadores efectos direccionales positivos en longevidad balanceados por efectos negativos en viabilidad pupal, mientras que la ordenación 2ST mostró efectos opuestos. Además, los cariotipos mostraron un leve efecto diferencial sobre la viabilidad pupal y un exceso de lieterocigotas significativo en la mayoria de los rots de ambos hospedadores. Este resultado podria ser explicado por aptitud diferencial entre cariotipos. Las comparaciones de las frecuencias de diferentes loci isoenzimáticos mostraron principalmente para el locus Est-2 efectos de atracción y viabilidad diferencial entre hospedadores lo que podría sugerir para su mantenimiento la existencia de selección de hábitat dependiente de la heterogeneidad de los recursos. Estos resultados mostraron, además, que la selección que opera sobre las ordenacione cromosómicas no puede explicar los patrones de variación en las frecuencias alélicas de los loci isoenzimáticos.

Abstract:
The genetic basis of adaptation of Drosophila buzzatti associated with life history variation is analized in this Thesis by study the adaptive processes in relation to the use of different resources affecting the distribution of variability in natural population. This work shows that D. buzzatii second chromosome polymorphic inversions affect viability(VI), developmental time (DT) and thorax lenght (TL). In addition, the effects of inversions on life history traits are not independent of the cactus rearing media. genotype x environment interactions for fitness components would provide the opportunity for resource specialization and resource partitioning. Moreover the effects on DT and TL suggest that a trade-offs between early and late fitness components may be invoked to explain the maintenance of the polymorphism. In natural populations temporal variation of inversion frequencies is lower than variation among individual breeding sites (rots), suggesting that the latter is more important in determining the distributions of inversion frequencies. The breeding structure of D. buzzatii populations is strongly affected by the discrete and ephemeral substrates that are colonized by a small number of mating pairs each generation. Chromosomal inversions do not affect attraction to O. quimilo and T. Terschekii rotting pads. Fitness component analysis showed that arrangement 2J increases longevity effects and decreases pupal viability while 2ST has opposite effects. However, there is a significant within-rot excess of inversion heterokaryotypes for the second chromosome and a slight effect of differential viability in both resources. These results can be explained by differential fitness among karyotype. Analysis of allozyme genotypes variation in a natural population showed differential effects of attraction and viability among alleles of locus list-2 in two types of resources, suggesting the existence of habitat selection. These results suggest that the selection operating on the inversion polymorphism cannot be account for the selective differences affecting allozyme loci.

Delprat, María Alejandra. "Estudio de reordenamientos polimórficos e inducidos en los cromosomas politénicos de la mosca del Mediterráneo: Ceratitis capitata" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La mosca del Mediterráneo, Ceratitis capitata, es una de las plagas más perjudiciales, pero como modelo experimental es aún poco conocido. Para erradicarla se aplica la Técnica del Insecto Estéril empleando líneas de sexado genético. Uno de los problemas de estas líneas es la pérdida del ligamiento entre el gen separador y el cromosoma Y, debido a eventos de recombinacíón. El siguiente trabajo se propuso aportar información a través de los cromosomas politénicos para implementar mejoras en la estabilidad de las líneas autosexantes Muestras de distintas poblaciones naturales de Argentina fueron estudiadas en busca de reordenamientos espontáneos que pudieran introducirse en las líneas autosexantes como supresores de la recombinacíón. Se localizó la posición del locus sw empleado como gen separador en las líneas obtenidas en nuestro laboratorio y se estudiaron además 17 nuevas líneas de sexado genético para caracterizar el tipo de reordenamiento producido por la radiación y seleccionar así aquellas con menores probabilidades de recombinacíón. Por último, se realizaron ensayos de Hibridación in situ, ajustando una técnica directa de sondas fluorescentes, tanto para cromosomas politénicos de glándulas salivares como para cromosomas mitóticos. Este trabajo en conjunto, aporta información novedosa que permitirá implementar mejoras en las líneas de sexado genético.

Abstract:
Although the Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata) is an important pest of many crops around the world, some aspects of its biology are still unknown. Currently, the Sterile Insect Technique is used to control or eradicate this pest. Genetic Sexing strains are being reared to release only males. One of the problems of such strains are recombination that end in the separation of the male—determining Y chromosome and the sexing gene. The aim of this study was to analyse aspects of the cytology of this species to implement improvements in the stability of these sexing strains. Samples from different localities of Argentina were analysed in order to detect spontaneous rearrangements that could suppress recombination. The sexing gene sw, isolated in this laboratory, was localised by means of polytenic chromosomes analyses. Moreover, 17 new strains were analysed to select those with lower recombination probabilities. Finally the In Situ Hybridisation direct technique was used to analyse both polytenic and mitotic chromosomes. To sum up this work provides novel information that will improve the genetic sexing strains and hence the eradication of such important pest.

Manifesto, María Marcela. "Caracterización de la variabilidad genética de germoplasma argentino de trigo (Triticum aestivum L) mediante marcadores moleculares" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
105 cultivares de trigo pan (Triticum aestivum L.), liberados comercialmente en Argentina entre 1932 y 1995, fueron caracterizados utilizando marcadores genéticos de tipo morfológico y molecular (microsatélites y AFLP) para obtener una estimación cuantitativa de la diversidad genética y su evolución a lo largo del tiempo, programas de mejoramiento. Un subgrupo de 10 diez SSR (microsatélites) altamente informativos fue seleccionado y utilizado para la construcción de la Matriz de Identificación, que permitió la discriminación de todos los cultivares estudiados aqui. Los datos moleculares fueron comparados con los datos morfológicos. Se observaron valores de correlación significativos,aunque bajos, para las distintas técnicas comparadas con los datos fenotípicos, presentando valores de correlación mayores los AFLP y SSR (r= 0.1334) siguiéndole el de coeficientes de parentesco (r = 0.12239). Los datos obtenidos mediante los marcadores SSR se complementaron con la información de datos de AFLP a fin de evaluar las relaciones genéticas entre cultivares. La correlación entre las matrices de similitud de datos combinados de SSR con AFLP y la matriz de coeficientes de parentesco fue estadísticamente significativa (test de Mantel, P<0 01), aunque baja (r = 0.34) Los datos moleculares fueron usados para cuantificar la diversidad genética a través de los criaderos y para evaluar la erosión genética. No se hallaron diferencias significativas en la diversidad genética entre los principales programas de mejoramiento privados y públicos. Sólo se hallaron diferencias significativas entre los principales criaderos y los menores, tanto con SSR como con AFLP. Un resultado interesante es que no se hallaron diferencias significativas en los valores de diversidad genética de los grupos de cultivares liberados antes de 1960 y aquellos liberados en las siguientes tres décadas. Los valores de diversidad promedio basados en marcadores SSR fueron casi idénticos para los cuatro periodos analizados La diversidad genetica estimada basada en datos de AFLP fue similar, pero diferencias levemente significativas fueron halladas entre cultivares liberados en los '70 (PIC= 0.28) y en los 80's (PIC = 0.34). Estos resultados contradicen la visión generalizada de la erosión genética de los cultivares modernos y muestran que el germoplasma Argentino de trigo pan ha mantenido relativamente constante el nivel de diversidad genética durante la última mitad del siglo. Se corroboró la factibilidad de la aplicación de microsatélites en dos aspectos: a) el estudio de caracteres cuantitativos de interes agronómico, como es la calidad panadera, en poblaciones segregantes y b) su aplicación en la caracterización de germoplasma. a) El microsatélite Xgwm3000 ubicado dentro del locus del gen de las γ-gliadinas (Xps2(Gli-1)) se halló completamente ligado al locus de RFLP XGli-B1 y estrechamente ligado (1 6 cM) a XGlu-B3 en la poblacion segregante Chinese Spring-Klein 32. La presencia del alelo 252 pb detectado en Klein32 se correlacionó con los aumentos detectados en los parámetros de calidad. Los microsatélites Xgwm2999 y Xgwm3000 ubicados dentro de los loci de γ-gliadinas y gluteninas de bajo peso molecular, respectivamente fueron útiles en la caracterización de la variación alelica de los loci de proteínas de reserva en 105 cultivares de Argentina y 90 de California.

Abstract:
In this study, 105 Argentine cultivars of bread wheat (Triticumaestivum L.) released between 1932 and 1995 were characterized using SSR, AFLP markers and morphological characters to obtain a quantitative genetic diversity estimation, its evolution along time and different breeding programs. A selected subset of ten highly informative microsatellites was used to construct an Identification Matrix that allowed the discrimination of all the cultivars included in this study. Molecular data was compared with morphological data. Significant correlation values, although low, were obtained for morphological data matrix and molecular data matrix. AFLP and SSR showing highest values of correlation (r = 0.1334), followed by kinship data (r = 0.1224) Data obtained from SSR markers was complemented by information derived from AFLPs, to evaluate genetic relationships among cultivars. The correlation between a combined SSR and AFLP similarity matrix and a kinship coefficients matrix was highly significant (Mantel test. P<0.01). but low (r= 0.34) Molecular data were used to quantify genetic diversity across the wheat breeding programs and to evaluate genetic erosion. No significant differences in genetic diversity were found between the largest private and public breeding programs. Significant differences were found only between the large and smallest breeding programs for both SSR and AFLP An interesting result from this study was that no significant differences in genetic diversity were found between the group of cultivars released before 1960 and those released in each of the following three decades. Average diversity values based on SSR markers were almost identical for the four analyzed periods Genetic diversity estimates based on AFLP data were also very similar but slightly significant differences were found between bread wheat cultivars released in the 70's (PIC = 0.28) and those released in the 80's (PIC= 0.34). These results contradict the general vision of significant genetic erosion in modern cultivars and showed the Argentine bread wheat germplasm has maintained a relativer constant level of genetic diversity during the last half century. Microsatellite application was corroborated in both aspects: a) studies of qualitative characters of agronomic interest, as bread making quality, in segregating populations and b) germplasm characterisation. a) SSR located within the γ-gliadin gene (Xps2(Gli-1))was completely linked to RFLP locus XGli-B1 and closer linked (1.6 CM)to XGlu-B3 in Chinese Spring-Klein 32 segregating population. Allele 252 pb at this loci detected in Klein 32 variety, was associated with significant increment in bread making quality parameters. b) SSR loci Xpsp 2999 and Xpsp 3000 located within a low molecular weight glutenin gene and gamma-gliadin gene, respectively are useful to characterize allelic variation at these two storage protein loci in 105 bread wheat cultivars from Argentina and 96 from California.

De Brasi, Carlos Daniel. "Marcadores genéticos ligados al gen del factor VIII de coagulación : Su utilidad diagnóstica en hemofilia y en el estudio del mecanismo molecular de la recombinación homóloga en meiosis humanas" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La hemofiliaA (HA)es una enfermedad hemorrágica hereditaria, ligada al sexo, causada por deficiencia del factor VIIIde coagulación (FVIII). La ruta preferida para la provisión de datos para diagnóstico molecular es la detección directa de mutaciones. Entre las mutaciones que afectan al gen del FVIII, la inversión del intrón 22 (inv22) constituye la causa de casi la mitad de las HA severas (SHA). Mediante análisis de Southern blot fueron estudiadas 47 familias Argentinas con SHA. En cercano acuerdo a lo reportado series internacionales, 19 de ellas (40%) resultaron informativas para la Inv22 y pudo proveerse diagnóstico molecular por el método directo. Dentro de éstas, 14 (79%) resultaron Inv22 tipo distal y las restantes 5 (21%), proximal. No fueron encontradas significativas asociaciones entre la presencia o no de la Inv22 en SHA, y el origen de la enfermedad (esporádica o familiar), ni tampoco con la propensión o no a desarrollar anticuerpo inhibidor neutralizante contra el FVIII terapéutico. El camino alternativo para el diagnóstico es por vía indirecta usando polimorfismos ligados a la enfermedad. Entre los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) ubicados dentro del gen del FVIII, el marcador Xbal A del intrón 22 a pesar de proveer una alta informatividad en los distintos ganos étnicos analizados, fue casi excluido de la rutina diagnóstica por la lentitud y laboriosidad de su detección. Aquí se describen dos métodos rápidos, no-radioactivos, basados en PCR de larga distancia (LDPCR), para genotipificación del RFLP Xbal A. Los amplimeros de 6,6 y 6,9 kb incluyen el sitio polimórfico y un sitio constante de Xbal que provee control de digestión. La especificidad del método fue desafiada en experimentos a ciegas de muestras previamente genotipificadas por Southern blot, obteniéndose una perfecta correlación entre ambos métodos. Mediante este método, 53 cromosomas X de la población Argentina general fueron genotipificados para Xbal A, lo que permitió proyectar una informatividad de aproximadamente el 47%. Los estudios de asociaciones alélicas entre Xbal A (X) y el polimorfismo Bc/l (B) del intrón 18 del gen del FVIII, determinaron un alto, pero no-completo desequilibrio de ligamiento entre los marcadores, proyectando una informatividad combinada (X+B) del 55%. A 737 bp rio abajo del RFLP Xbal, fue localizado y caracterizado un nuevo polimorfismo bialélico, de cambio de nucleótido que afecta el sitio de reconocimiento de la enzima Mspl (CCg/aG). La genotipificación especifica del RFLP Mspl A se realiza utilizando la LD PCR específica para Xbal A como primera vuelta. seguida por una PCR anidada de 176 bp que incluye al sitio polimórfico y uno constante de Mspl para proveer control de digestión. Su análisis en las poblaciones nomiales Argentina y Británica permitió estimar una heterocigocidad de 49 y 46%, respectivamente. A pesar de su proximidad física y su desequilibrio de ligamiento, X y M proyectan una informatividad conjunta del 62% para población Argentina y 59% para la Británica. Ambos RFLPs (X y M) están incluídos en una región de 9,5 kb dentro del intrón 22 del gen del FVIII(int22h-1), que se encuentra repetida por lo menos 2 veces fuera del gen del FVIII, también sobre Xq28 (int22h-2 y -3). Para investigar los sitios correspondientes de X y M sobre los homólogos extragénicos fueron diseñados abordajes específicos similares a aquellos usados para los sitios intragénicos. Los sitios Mspl extragénicos (B y C) resultaron polimórficos en población Argentina y Británica aunque con frecuencias del alelo mucho menores a las intragénicas. La Inv22 es originada por un evento de entrecruzamiento recíproco intracromosómico por recombinación homóloga entre las secuencias int22h descriptas resultando en la interrupción inactivante del gen del FVIII en su intrón 22. Debido a (1) que los marcadores X y M ubicados dentro de int22h permiten mediante sus frecuencias alélicas diferenciar las copias intra de las extragénicas y (2) que en el cromosoma X de varones de la población normal podemos estimar el estado de estos marcadores antes del evento y en los hemofílicos con la Inv22 podemos analizar el estado de estos marcadores después del evento; se diseño una estrategia para recabar datos del mecanismo molecular que origina la Inv22 como modelo de entrecruzamiento recíproco en meiosis humanas. La aplicación del método planteando nueve hipótesis de posibles intermediarios moleculares de la Inv22 asociadas a la predicción de resultados numéricos utilizando las estimaciones sobre población de varones normales y su comparación con los datos obtenidos en el grupo de afectados con la Inv22, permitió determinar que el evento molecular de recombinación meiótica está acoplado a la conversión génica del marcador Xbal, con la secuencia extragénica como dadora de la información. El mismo análisis sobre Mspl si bien proyecta resultados similares, no permite determinado con significación estadística. El aumento de la población hemofílica para la obtención de resultados más precisos además de los estudios de mapeo de puntos calientes para rupturas meióticas de doble cadena dentro de las secuencias int22h permitirá la elucidación específica del mecanismo de la Inv22 como modelo de recombinación homóloga en meiosis humanas.

Abstract:
Haemophilia A (HA) is a sex linked inherited haemorragic disorder characterised by deficiency in the coagulation factor VIII (FVIII). Direct mutation detection in the gene is the best choice to obtain data for molecular diagnosis. Intron 22 FVIII gene inversion (Inv22) is involved in almost half of severe HA (SHA). It has been studied by Southern blot 47 Argentinean families with SHA and found inversions in 19 (40%), 15 (32%) with distal and 4 (8%) with proximal pattern. In this group of Inv22 informative families definitive information for molecular diagnosis could be provided. No significant correlation between the inheritance of the disease (either familiar or sporadic haemophilia) and the presence of inversions was found. The development of therapeutic-FVIII inhibitor in inv22-positive SHA-affected families was found increased but not significantly. The alternative route to obtain molecular information for genetic counselling is gene tracking using DNA polymorphisms. Among the restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) in the FVIII gene, the Xbal A (intron 22) (X) despite its high informativity in almost all ethnic groups analysed, has not been frequently used in the routine because its reliable detection is tedious and labour-intensive. Two rapid, non-radioactive, long distance PCR-based methods (LD PCR) to genotype the X RFLP are described. The amplimers of 6.6 and 6.9 kb long include both the polymorphic and a constant Xbal site, which provides a digestion control. The specificity of the method was challenged by a blind experiment with genomic DNA samples previously genotyped using Southern blot analysis: a perfect correlation was obtained using both approaches. Fifty-three alleles from the Argentinean normal population were Xbal A genotyped. The results predict an informativity of 47%. Despite the high degree of allelic associations found between X and Bc/l (intron 18) (B), they predicts a combined heterozygocity (X+B) of 55%. A new polymorphism in the human FVIII gene has been localised and characterised. It is a bi-allelic single nucleotide polymorphism which affects an Mspl site (CCg/aG)located 737 bp downstream frorn the Xbal marker. The specific genotyping of the so termed Mspl A RFLP (M) requires a nested PCR approach using the X-specific LD PCR as first round and a 176 bp-long second round which includes both the polymorphic and a constant control digestion Mspl site. M genotyping from the Argentinean and the British normal population estimate an informativityof 49 and 46%, respectively. Despite their close proximity, the X and M polymorphisms are not in complete linkage disequilibnum: haplotype analysis from Argentinean and British population predict a combined informativity (X+M)of 62 and 59%, respectively. The markers X and Mare located in intron 22 of the FVIII gene within a 9.5 kb int22h-1segment. Int22h is duplicated at least twice extragenically at Xq28. Both extragenic copies (int22h-2 and —3) are also polymorphic with respect to X. There have been designed LDPCR-based methods to specifically genotype these extragenic X and M sites. The extragenic sites of both X and M resulted also polymorphic in Argentinean and British normal populations but with much lower frequencies of the allele than those obtained frorn int22h-1. Inv22 originates by an intrachromosomic crossing over due to homologous recombination between int22h-1 and int22h-2 or —3. The molecular inversion interrupts the normal sequence of the intron 22 of the FVIII gene causing SHA. Due to (1) X and M enable the discrimination of the intra from the extragenic copies of int22h by means of differences in their allelic frequencies, and (2) that there can be estimated these frequencies before the event in males from the normal population and the frequencies after the event in the Inv22-SHA population; it was possible to design an genetic testing strategy to address the molecular mechanism of the Inv22 as a model for homologous recombination in human meiosis. The inspection of the literature prompts the design of 9 possible hypothesis of the intermediaries of the mechanism involved. Each hypothesis was associated with numerical values calculated from the parameters estimated in the normal populations, to predict the results to be obtained from the Inv22-affected population. This analysis allowed us to conclude that the molecular inversion is coupled to the gene conversion from a DNA segment including the Xbal extragenic site to its intragenic homologue. The results obtained using Mspl, although similar than those using Xbal, are not statistically significant. The increase in the number of the haemophilic population in order to gain precision in the test and the investigation of meiotic double-strand-breaks hot spots within int22h would allow further insights in the molecular mechanism of the Inv22 as a model for homologous recombination in human meiosis.

Martinez, Eric Javier. "Herencia de la reproducción apomíctica e identificación de marcadores moleculares ligados al carácter en Paspalum notatum" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La manipulación de la apomixis, reproducción asexual por medio de semillas, puede tener un gran impacto en la agricultura. La apomixis es el modo principal de reproducción en Paspalum notatum, una gramínea forrajera nativa de América Central y del Sur. Los citotipos diploides son sexuales mientras los tetraploides son apomícticos. Los objetivos de este trabajo fueron estudiar el control genético de la apomixis e identificar marcadores moleculares ligados al carácter. Se generaron progenies F1, F2s y retrocruzas a partir de un cruzamiento original entre una planta tetraploide 100 % sexual con una apomíctica obligada. Las progenies fueron clasificadas en sexuales o apomícticas mediante la observación directa de sacos embrionarios en 60 óvulos por cada planta. Las plantas que poseían únicamente sacos meióticos fueron consideradas sexuales, mientras que se clasificó como apomíctica a aquella que tenia sacos apospóricos. En todos los cruzamientos sexuales X apomícticos la segregación fenotípica fue cercana a 3:1 (sexuales:apomícticas). La autopolinización de plantas F1 sexuales y los cruzamientos entre ellas, siempre dieron origen a descendientes sexuales. Estos resultados no se ajustan a un modelo Mendeliano clásico para una herencia de tipo tetrasómica y con control monogénico. Es probable que algún mecanismo de distorsión gamética o genotípica provoque la muerte de algunas gametas o genotipos que condicionan para apomixis. El análisis de segregantes en grupos (Bulked Segregant Analysis) fue usado para identificar marcadores de RAPD, AFLP y RFLP asociados con la apomixis. Diez plantas fueron incluidas en cada uno de los grupos (S y A). Se probaron cuatrocientos iniciadores de RAPD y se utilizaron 10 combinación de pares de oligonucleótidos de AFLP. Se ensayaron 77 sondas de RFLP de maíz y arroz. Dos marcadores RAPD,2 de AFLP y 2 RFLP mostraron diferencias entre los grupos. Todos fueron específicos del padre y del grupo apomíctico. El análisis de segregación en una población de 175 individuos F1 para RAPD, 100 para AFLP y 132 para RFLP, mostró un ligamiento completo entre el locus Apo y los seis marcadores moleculares descubiertos. El locus de la apomixis fue encontrado relacionado con el extremo distal del brazo largo del cromosoma 12 de arroz. Los marcadores moleculares confirmaron que el carácter posee un control monogéneico y es dominante sobre la sexualidad, pero la segregación también mostró distorsión de las proporciones Mendelianas esperadas.

Abstract:
Manipulation of apomixis, asexual reproduction by seeds. may have a great impact in agriculture. Apomixis is the main mode of reproduction of Paspalum notatum. a forage grass native to Central and South America. Diploid cytotypes are sexual while tetraploids are apomictic. The objectives of this work were to study the genetic control of apomixis and the identification of molecular markers linked to the trait. F1, F2s and backcrosses were generated by crossing a 100 % sexual tetraploid plant with an obligated apomictic one. The progeny was classified in sexual or apomictic individuals by direct observation of embryo sacs in 60 clarified ovaries for each plant. Sexual plant was considerate that only had meiotic embryo sacs, while apomictic plant that had aposporous embryo sacs. The segregation in all crosses of sexual x apomictic plants was close to 3:1 (sexual:apomictic). Self-pollination of sexual F1 plants and crosses between two F1plants gave always origin to 100 % sexual offsprings. Taking in account tetrasomic inheritance. these results do not adjust to a classic Mendelian model for monogenic inheritance. It is probable that some mechanisms of gametic or genotype distortion cause the death of some gametes or genotypes conditioning apomixis. Bulked segregant analysis was used to identify RAPD, AFLP and RFLP markers associated with the trait. Ten plants were included in each group (sex, apo). Four hundred RAPD primers and 10 pairs of oligonucleotides for AFLP were tested. 77 RFLP probes of maize and rice were evaluated as well. Two RAPD, 2 AFLP and 2 RFLP markers showed differences between the groups. All markers resulted specific to the apo group and were present in the apo parent. Linkage analysis performed using 175 individuals with RAPD, 100 with AFLP and 132 with RFLP showed complete association between the apo locus and the six molecular markers detected. The apo locus is related with the telomeric region of the long arm of rice chromosome. Molecular markers confirmed that apo locus have a monogenic control and is dominant over sexuality, but the segregation also showed distortion from the expected Mendelian proportions.

Lorenzi, Hernán Alejandro. "Estructura genómica y diseño de nuevos vectores de transfección para Trypanosoma cruzi" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Trypanosoma cruzi es un parásito protozoario causante de la enfermedad de Chagas. Dentro del marco del proyecto genoma de T. cruzi y como un activo aporte a su concreción, se ha caracterizado un nuevo tipo de marcador genético asociado a la secuencia repetida SIRE denominado SAS, que condujo a la identificación de cuatro nuevos genes y de las secuencias repetidas TCREL y VIPER. Para contribuir a la construcción del mapa fisico, se construyó y caracterizó una biblioteca de ADN genómico de T. cruzi en vectores YAC con un tamaño promedio de inserto de 365 kpb, que fue utilizada para construir el mapa fisico de una región de ~900 kpb del cromosoma XVI y comenzar la construcción del mapa fisico del cromosoma XX. También se construyeron cromosomas circulares en levaduras por el método de clonado RAT utilizando las secuencias repetidas como base del clonado, y se probó la utilidad de un vector de fragmentación que sirvió para ubicar el gen TcP2β cerca de una región telomérica de un cromosoma de ~1 Mpb. Para contribuir con los estudios genómicos funcionales se diseñó y construyó el vector necesario para obtener cromosomas artificiales de T. cruzi. Finalmente, estos estudios llevaron a utilizar comparaciones de secuencia para definir las características de sintenía de extensas regiones genómicas de T. cruzi, Trypanosoma brucei y Leishmania major.

Abstract:
Trypanosoma cruzi is a parasitic protozoan that causes Chagas disease. As part of the T. cruzi genome project and to contribute to its concretion we have characterized a new type of chromosomal marker associated to the repetitive element SIRE named SAS, that allowed the identification of four novel genes and two repetitive sequences, TcREL and VIPER. To accomplish the construction of the physical map of the T. cruzi genome, we constructed and characterized a genomic YAC library of T. cruzi with an average insert-size of 365 kbp that was used to get the physical map of a ~900 kbp region from chromosome XVI and to start the assembly of contigs from chromosome XX. In addition, we also constructed circular artificial chromosomes in yeast, based on a T. cruzi repetitive sequence by RAT cloning, and verified the utility of a fragmentation vector in the position of the TcP2β gene near a telomeric region of a chromosome of ~1 Mbp. To perform functional genomic studies we designed and constructed a vector that can be used as an artificial chromosome in T. cruzi. Finally, comparison and sequence analysis allowed us the identification of large genomic sintenic regions among T. cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania major.

Vicario, Ana Laura. "Estudio comparativo de la diversidad genética de germoplasma comercial de soja (Glycine max (L.) Merr.) y variedades tradicionales" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La soja (Glycine max (L) Merr.) es uno de los cultivos más importantes para los cuales la variabilidad genética es particularmente limitada debido a que es exótico en los principales países productores (USA, Brasil y Argentina). Los objetivos propuestos dentro del marco de esta tesis fueron la caracterización y cuantificación de la variabilidad genética del germoplasma de soja de uno de sus sitios de origen (China) para su comparación con el argentino y el boliviano mediante el uso de marcadores moleculares y, estudiar la posibilidad de utilizar a los SSR en el registro de variedades de soja en Argentina (y en general), específicamente mediante su adaptación al análisis DHE. Se utilizaron más de 120 genotipos que se analizaron con hasta 33 microsatélites. Como resultado se observó que la diversidad de las variedades comerciales de soja es menor que en el caso de variedades tradicionales. Las variedades chinas mostraron mayor número de alelos por locus, mayores valores de similitud e índices de diversidad genética. La mayoría de las variedades argentinas se agruparon separadas de las chinas, sin embargo algunas se relacionaron con estas últimas mostrando que hubo introgresiones de germoplasma chino en el argentino. Se analizaron 10 caracteres morfológicos para las variedades chinas a fin de compararlos con los datos de microsatélites, evidenciándose que cada tipo de marcador explica las relaciones entre las variedades de diferente manera. Ninguno de ellos mostró correlación con los requerimientos fotoperiódicos de las variedades chinas. Los análisis de homogeneidad y estabilidad muestran que es necesario establecer el número mínimo de marcadores a estudiar y cuáles serán éstos antes de aplicarlos en estudios de DHE, ya que las variaciones de los tipos alélicos de los SSR en el tiempo y el carácter selectivamente neutro de estos marcadores pueden modificar los umbrales de diferenciabilidad entre las variedades.

Abstract:
Soybean (Gycine max (L) Merr.) is one of the world most important crops for which the genetic variability is particularly limited, because it is exotic for the most important producing countries (USA, Brazil and Argentina). The principal aims of this work were to characterize and quantify the genetic variability of soybean germplasm form China (center of origin), Argentina and Bolivia using microsatellites markers and to test the possibility of using this kind of markers for DUS testing purposes. More than 120 genotypes were analyzed with up to 33 microsatellites. Commercial soybean varieties showed lower variability than traditional ones. Traditional soybean varieties showed larger allele number per locus, similarity index and diversity values. Most of Argentine varieties clustered separately form Chinese ones, but some mixes were found showing that there were Chinese introgressions into Argentine germplasm. Ten morphological traits were analyzed for Chinese germplasm to compare their genetic diversity description with that derived from micorsatellite profiles showing that different markers explain variety relationships in a different way. None of markers showed correlation with photoperiodic requirements among the Chinese varieties. The homogeneity and stability testing showed that it is needed to carefully establish a minimum number of very well characterized markers before their application to DUS testing, because variability in the allelic SSR profiles and its generally neutral selective nature could modify the distinguishing ability between varieties.

O’Rourke, Eyleen J.. "Identificación, caracterización e importancia biológica de las ADN glicosilasas del sistema de reparación del ADN por escisión de bases de Helicobacter pylori" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Tosto, Daniela S.. "Estudio de las relaciones genómicas y de similitud genética relativa entre especies del germoplasma del cultivo andino "oca" (Oxalis tuberosa) mediante análisis de AFLP y secuencias de ADN ribosomal" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Oxalis tuberosa, comúnmente conocida como oca, es una de las 8 especies andinas con raíces y tubérculos comestibles que juegan un rol importante en los sistemas agrícolas de las tierras altas de la región andina. Estos cultivos son de gran importancia económica y nutricional para la subsistencia de los agricultores de los Andes y un potencial alimento para el resto de la humanidad. La oca pertenece al género Oxalis, el cual está distribuido mundialmente e incluye alrededor de 800 especies. La mayor diversidad se encuentra en América del Sur y en Sud Africa; siendo las especies de América del Sur las que presentan el mayor rango de variación en cuanto a características morfológicas, ecológicas y citológicas. Los estudios citogenéticos revelaron una gran diversidad en el número básico de cromosomas variando desde X=5 a X=12, siendo X=7 el número más frecuente. Los niveles de poliplodía en el género también son variables (2n a 8n). De Azkue y Martínez (l990) encontraron que un grupo de once especies, que eran semejantes morfológicamente, compartían un número básico de cromosomas X=8. A este grupo pertenecen O. herrerae, O. medicaginea, O. mollissima, O. oblongiformis, O. peduncularis, O. subintegra, O. tabaconanensis. O.aff. víllosula (todas estas diploides), O. lotoides (2n=32), O. spiralis (2n=48) y la oca (O. tuberosa), un octoploide. A este grupo lo denominaron “la alianza de O. tuberosa”. Sin embargo este agrupamiento no coincide con la clasificación basada en criterios de taxonomía tradicional. El estudio de las especies silvestres relacionadas a los cultivos puede dar idea del proceso de domesticación y la evolución de los mismos, por otro lado pueden tener aplicaciones prácticas dado que las especies silvestres relacionadas a los cultivos son reservorios genéticos para el mejoramiento de los mismos. La caracterización de las distintas variedades y accesiones de O. tuberosa que existen es fundamental para saber con la diversidad que se cuenta y para el manejo de los bancos de germoplasma. Dentro de este marco los objetivos generales del presente estudio fueron por un lado poner a prueba, con herramientas de la taxonomía molecular, la hipótesis cromosómica que relaciona a O. tuberosa y con otras especies del género por compartir el mismo número básico de cromosomas X=8. Por otro lado evaluar distintas herramientas moleculares para cuantificar y comparar la diversidad genética de representantes del género y, más particularmente, de la especie cultivada, con el objeto de contribuir criterios objetivos para la conservación de estos recursos genéticos y su mejoramiento con fines agrícolas. Para lo cual se realizó el análisis de los genes ribosomales y se analizaron patrones de AFLP. El análisis de la región del espaciador interno de los genes ribosomales (ITS) corroboró la hipótesis cromosómica que relaciona a O. tuberosa y las especies que comparten el mismo número básico de cromosomas X=8. El análisis de AFLP también apoyó la hipótesis cromosómica ya que tanto en el análisis de agrupamientos como en el análisis mediante coordenadas principales las especies de la alianza se diferenciaron respecto de O. articulata generándose en el primer caso un dendrograma que sostenía este agrupamiento con un coeficiente de correlación cofenética de 0,99. El segundo análisis permitió identificar a las combinaciones de primers E41-M39 y E45- M43 como las que más aportaron a dicho agrupamiento. Los resultados no son del todo consistentes con los obtenidos a través de la taxonomía tradicional mediante descripciones puramente morfológicas, tanto en el caso de las clasificaciones que dividen a las distintas especies de la alianza en cuatro secciones (Knuth, 1939, 1936) como el caso en que las dividen en dos (Lourteig, 2000). De todos modos, la clasificación basada en datos moleculares de las especies de la alianza es más congruente con la propuesta taxonómica de Lourteig (2000) y puede ayudar a afinarla. El análisis de los genes ribosomales a nivel de la región codificante (la más conservada), muestra mayor similitud entre O. tuberosa y O. oblongiformis. Esta observación, sí sería congruente con la taxonomía tradicional, ya que ambas especies fueron las únicas de las especies estudiadas, agrupadas en la misma sección por Knuth (en Ortgiesae) y por Lourteig (en Lotoideae). Lo incongruente sería que, en su monografía, Lourteig (2000) sinonimizó a O. oblongiformis con O. tabaconasensis. El análisis del ADNr, pero a nivel de la región del IGS (la más variable) dio una idea de la compleja estructura de estas secuencias hipervariables en la alianza. Dado que es una región altamente variable no esclareció demasiado la relación de las especies diploides y poliploide cultivada, pero aportó información interesante de la relación entre las especies diploídes. Las tres especies diploides que comparten el mismo patrón de bandas fueron ubicadas por Knuth en tres secciones diferentes, mientras que por Lourteig en dos. Así mismo, esta parte del ADNr demostraría la inconsistencia de sinonimizar O. oblongiformis y O. tabaconasensis (Lourteig 2000). El análisis de los resultados obtenidos por los AFLP aparte de apoyar la hipótesis cromosómica de la alianza, permitieron visualizar el potencial de la técnica de AFLP para la caracterización de las distintas accesiones del cultivo y su utilización para el manejo de los bancos de germoplasma. Ya que se permitieron diferenciar accesiones que figuran con el mismo número, como así también identificar posibles duplicados, accesiones que figuran con distinto número, pero tienen perfiles de bandas idénticos. Siendo las combinaciones de primers E45-M43, E69-M69 y E41-M39 las que más incidieron para explicar la variación observada.

Abstract:
Oxalis tuberosa, commonly known as oca, is one of the 8 Andean species with edible underground roots and tubers that play a major role in the Andean highland farming systems. These crops are of great economic and nutritional importance to subsistence Andean farmers and a potential source of food for the whole mankind. Oca belongs to the genus Oxalis, that is worldwide distributed and represented by at least 800 species most of them in the southern hemisphere, mainly in America and South Africa, being South American species the most diverse in morphologigal, ecological and cytogenetic characteristics. Cytogenetic studies revealed a great deal of variability in the basic number of chromosomes (from X=5 to X=12), X=7 is the more frequent, as well as variation in the ploidy degree, that ranges from 2n to 8n (Marks, 1956; Cronquist, 1981; Naranjo et al., 1982; de Azkue, 1986; de Azkue & Martínez, 1983, 1984, 1989, 1990). Among them, a group of 12 species that share the same basic number of chromosomes (x=8) was defined by de Azkue & Martínez (1990). The group of species is named “the O. tuberosa alliance”. To this group belongs O. herrerae, O. medicaginea, O. mollissima, O. oblongiformis, O. peduncularis, O. subintegra, O. tabaconanensis, O. aff. villosula (all diploids species), O. Iotoides (2n=32), O. spiralis (2n=48) and the oca (O. tuberosa), an octoploid. However, this grouping is not consistent with the classification based on traditional taxonomy criteria. The study of the wild species related with the crop could help to clarify the processes of domestication and evolution of the oca. Furthermore, this study has practical applications since related wild species are natural genetic reservoirs for breeding. Characterization of different cultivars and accessions is very important in order to acknowledge the existing diversity and germplasm management. In this context, the general objectives of the present study were: first, to corroborate the chromosome hypothesis that relates O. tuberosa with the other species that share the same basic chromosome number, X=8. Second, to evaluate different molecular tools to quantitate and compare the genetic diversity of the different species of the genus, and particularly, within the crop species, so contributing objective criteria for genetic resources conservation and breeding. For these purposes, rDNA sequence analyses by RFLP complemented by nucleotide sequencing as well as AFLP were carried out. Comparative ribosomal intergenic transcribed sequences (ITS) analysis corroborated the hypothesis of relativeness of the species that share the same basic number of chromosome X=8. No differences were detected among the diploid species or within the O. tuberosa species. When diploid and polyploid species were compared, four differences were observed, two transitions in the ITS1 and two transversions in the ITS2. In contrast, when the species belonging to the alliance were compared to with an external reference species (O. articulata), several differences were found. The AFLP results also showed to be in good agreement with the cytogenetic hypothesis. Both cluster analysis and principal coordinates analysis discriminated the alliance species from O. articulata. In the first case, a dendrogram from UPGMA cluster analysis that show this grouping was obtained, and its very high cophenetic coefficient value (r = 0.99) indicates excellent fitness to the genetic similarity matrix. The co-ordinates analysis allowed to identify the primer combination E4l-M39 y E45-M43, as the most significant for this grouping. The results obtained from these analyses are not so consistent with those from the traditional taxonomy. Neither in the case of Knuth's classification (1930, 1936) by which the species of the alliance belong to four different sections, nor in the case of Lourteig (2000), which separates them in two different sections. In any case, the last classification is more congruent with the molecular data, which may help to refine it. O. tuberosa and O. oblongiformis showed identical restriction endonuclease patterns for the transcribed rDNA regions, which is consistent with conventional taxonomy, since both species were classified in the same section by Knuth (in Ortigiesae) and Lourteig (in Lotoideae). However, in the last case, the defined synonymy between O. oblongiformis and O. tabaconanensis is inconsistent with the molecular data shown here. Restriction endonuclease and sequence analyses of the IGS revealed a subrepeat organization which sequence and organization showed such degree of variation that did not allow relating polyploid to diploid species. However, the molecular organization of IGS rDNA contributed some important information on the relationship among diploids species. The three species that share the same pattern in this variable region, were classified by Knuth in three different sections, while they were classified in two by Lourteig. The IGS sequence also showed the inconsistency of the sinonimy between O. oblongiformis and O. tabaconanensis by Lourteig (2000). The AFLP analysis not only supported the chromosome hypothesis but also showed that AFLP is a powerful tool to characterize the different crop accessions and its usefulness for germplasm characterization and management (for example, for the identification of duplicate accessions), being the E45-M43, E69-M69 and E41-M39 primer combinations the most significant to explain the observed variability.

Ben-Dov, Claudia Paola. "Regulación post-transcripcional en Trypanosoma cruzi : regiones intergénicas y elementos repetidos" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Trypanosoma cruzí es un parásito protozoario causante de Ia enfermedad de Chagas, cuya regulación de la expresión génica se da casi exclusivamente a nivel post-transcripcional. Los objetivos de la presente tesis fueron estudiar las regiones intergénicas y la influencia del elemento repetido SIRE en las mismas. Se determinó la presencia del elemento SIRE en regiones no codificantes del genoma del parásito . Se estableció que SIRE se asocia a una amplia variedad de genes implicados en distintos procesos metabólicos. Másaún, se determinó la relevancia que esta asociación tiene en la regulación de la expresión génica del parásito, dado que SIRE pude disminuir la estabilidad y la traductibilidad del ARNm al estar en regiones 3’ UTR, o bien aumentar la traductibilidad del ARNm al incluirse los últimos nucleótidos de SIRE en regiones 5' UTR. A su vez se estudió en profundidad las secuencias requeridas en el transsplicing y se definió la existencia de elementos reguladores del mencionado proceso y al mismo tiempo de la traductibilidad del ARNm correspondiente. Por último los resultados determinan la falta de consensos estrictos para las señales reconocidas en los primeros pasos del trans-splicing.

Abstract:
Trypanosoma cruzi is a parasitic protozoan that causes Chagas disease. The regulation of gene expression occurs mainly at a post-transcriptional level. The aims of this thesis were to study the role of intergenic regions and the influence of the repetitive element SIRE. The results demonstrate that SIRE is present in non-coding regions of the genome. Moreover, the results reveal that SIRE is associated to a wide variety of genes involved in different metabolic processes. Also, the results determine the relevance of this association to the regulation of gene expression given that SIRE, when present in 3’ UTR regions, down regulates the stability of the mRNA as well as its translation. In addition, the last nucleotides of SIRE can stimulate translation when present in the 5' UTR region. Furthermore, we study which are the most important sequences for the trans-splicing reaction. We defined new elements that are able to up regulate not only trans-splicing but also the translation of the corresponding mRNA. Finally, the results determine that there is no need of consensus sequences to achieve the early steps of the trans-splicing process.

Edelstein, Alexis. "Epidemiología molecular y caracterización genética del hantvirus Andes causante de síndrome pulmonar en Argentina" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
A partir de una zoonosis emergente en el año 1995, se determinó la presencia de un hantavirus asociado al sindrome pulmonar en la Argentina, desconociéndose la magnitud del problema. Este trabajo tiene como objetivo aportar al conocimiento de la infección por hantavirus, su replicación, transmisibilidad ecoepidemiología y caracterización de virus circulantes. El estudio de la caracterización viral de las muestras humanas provenientes de distintas regiones geográficas determinó la existencia de 3 regiones endémicas asociadas a hantavirosis responsables del SPH en nuestro país: La región Norte (Salta y Jujuy) donde se estableció la existencia del linaje viral AND Nort., la región Sur (Rio Negro, Chubut y Neuquén) donde circula el linaje AND Sout,. y la región Central (Provincia de Buenos Aires) donde se detectaron los linajes AND Cent. Lec, AND Cent Plata y AND Cent Bs.As Los distintos análisis filogenéticos realizados sobre las secuencias nucleotídicas de los segmentos genómicos S y M mostraron claramente la evolución monofilética de los hantavirus. En esta evolución, el antecesor del virus Andes sería el virus Laguna Negra. Este análisis filogenético es apoyado por el aparente desplazamiento migratorio realizado por los Sigmodontinos desde América del Norte hasta el extremo sur del continente. Dentro del grupo Andes, la divergencia evolutiva no resultó tan clara, probablemente debido a que este grupo monofilético es de reciente radiación. Se obtuvo por primera vez la secuencia completa del virus Andes amplificándose y secuenciándose los segmentos S y M correspondientes al genoma viral y una porción del segmento L. Del análisis de dicho genoma se identificó al virus Andes como una nueva especie viral. Se determinó además para los 3 segmentos virales, la composición nucleotídica no putativa de sus extremos, responsables de la estabilidad del ARN viral y asociados además a su replicación /trascripción. A diferencia del segmento S, los segmentos M y L presentaron deleciones en ambos extremos posiblemente asociadas a la regulación de la persistencia viral. El análisis del brote ocurrido en El Bolsón en el año 1996, demostró por primera vez en el mundo, la existencia de un hantavirus capaz de transmitirse a través de contacto interhumano. Esta vía de contagio representó un evento único entre los hantavirus del grupo renal y pulmonar, solamente asociada hasta el momento al linaje Andes Sout. Con el objeto de determinar las posibles alteraciones genéticas asociadas a la vía de contagio interhumano hallada en Andes Sout, se amplificaron y secuenciaron en forma completa los segmentos S y M de un hantavirus perteneciente al linaje Andes Cent Plata, hasta el momento no asociado a contagio interhumano. La comparación de los segmentos S y M de las cepa transmisora y no transmisora no presentó diferencias estructurales significativas. La transmisión interhumana no parecería ser dependiente de la cepa viral requiriéndose la evaluación de factores alternativos como la carga viral o la respuesta inmune dependiente del huésped. Los hallazgos del presente trabajo de tesis aportaron las bases para el estudio de los mecanismos que influyen en la interrelación genética-viral y los aspectos biológicos tales como factores ambientales y ecológicos, cuyos efectos provocan alteraciones demográficas en huéspedes infectados y susceptibles, que conducen a la emergencia de enfermedades zoonóticas humanas.

Abstract:
From an emergent zoonosis in 1995, it was determined the presence of hantavirus associated to the pulmonary syndrome in Argentina, not knowing the magnitude of the problem. This work takes as target to reach to the knowledge of the infection with hantavirus, its replication, contagiousness, ecoepidemiology and characterization of circulating viruses. Viral characterization of human samples from different geographic regions determined the existence of 3 endemic regions associated to hantavirus illness responsible for the hantavirus pulmonary syndrome in our country: north region (Salta and Jujuy) where settled down the existence of viral lineage AND Nort., south region (Rio Negro, Chubut and Neuquén) where circulates lineage AND Sout. and central region (Province of Buenos Aires) where cocirculate lineages AND Cent. Lec, AND Cent Plata and AND Cent Bs.As. The different phylogenetic analyses realized on the sequences of the genomic segments S and M clearly showed a monophyletic evolution of the hantavirus. In this evolution, the predecessor of the virus Andes would be the virus Laguna Negra. This phylogenetic analysis is supported by the apparent migratory displacement realized by the sigmodontines from North America up to the south end of the continent. Inside the group Andes, the evolutionary difference did not turn out to be so clear, probably due to the fact that this monophyletic group is of recent radiation. The complete sequence of Andes virus was obtained for the first time through complete S and M segments amplification corresponding to the viral genome and a portion of segment L. The analysis of this genome identified Andes virus as a new viral species. It was determined in addition for the 3 viral segments, the non putative nucleotidic extremes sequences, which are responsible of RNA viral stability and associated in addition to its replication/trascription. Unlike S segment, segments M and L displayed deletions in both extremes possibly associated to the regulation of viral persistence. Analysis of the outbreak happened in El Bolsón in the year 1996, demonstrated for the first time in the world, the existence of a hantavirus capable of being transmitted across interhuman contact. This route of contagion represented a unique event between hantaviruses of renal and pulmonary group, only associated up to the moment with the lineage Andes Sout. In order to determine the possible genetic alterations associated with the route of interhuman infection found in Andes Sout, the complete S and M segments of a hantavirus belonging to the lineage Andes Cent Plata, not associated to interhuman infection until the moment, were amplified and sequenced. The comparison of segments S and M of the transmitting and nontransmitting lineages did not display significant structural differences. The interhuman transmission would not seem to be dependent of the viral lineage requiring the evaluation of alternative factors like viral load or immune response dependent of the guest. The findings of the present thesis work contributed the bases for the study of the mechanisms that influence in the genetic-viral interrelation and the biological aspects such as environmental and ecological factors, whose effects cause demographic alterations in infected and susceptible guests, who lead to the emergency of human zoonotic diseases.

Martinez Montaño, Romari Alejandra. "Biomarcadores de genotoxicidad en el estudio de la fragilidad genómica en el orden primates" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Existe cada vez más evidencia a favor de la hipótesis de que la inestabilidad genómica estaría directamente relacionada con la estructura de ciertos loci específicos involucrados en rearreglos cromosómicos recurrentes, conocidos como “puntos calientes". Con la finalidad de establecer si es posible detectar estos “puntos calientes” a nivel citogenético, la presente Tesis Doctoral emplea biomarcadores de genotoxicidad como manifestación de fragilidad cromosómica inducida por agentes químicos. Para ello, se trabajó con dos modelos: Cebus apella (CAP) y Homo sapiens (HSA), un sistema experimental como los linfocitos de sangre periférica (LSP) y un agente químico inductor como el metronidazol (MTZ). Cebus apella (CAP) es un Primate del Nuevo Mundo, ampliamente utilizado como modelo experimental en diferentes áreas de la biomedicina que, hasta el presente, poco había sido analizado en cuanto a su utilidad en estudios de genotoxicidad empleando agentes químicos. El Metronidazol (MTZ) es un derivado 5-nitroimidazólico considerado un agente genotóxico en sistemas in vivo e in vitro. En el presente trabajo de Tesis Doctoral, se utilizaron distintas concentraciones de MTZ en cultivos de linfocitos de sangre periférica (LSP) de Cebus apella y de humanos (HSA), con la finalidad de evaluar su potencial mutagénico sobre los genomas de ambas especies, por separado y a nivel intergenómico, realizando un análisis de las frecuencias de ICH y ACG a nivel de banda cromosómica, utilizando una técnica de Bandas G (Tinción Wright)-ICH secuencial puesta a punto en el marco de esta Tesis. Los resultados se analizaron en un nivel genómico general, para los cuatro biomarcadores empleados (Índice Mitótico —IM-, Índice de Replicacíón —IR-, Intercambio de Cromátides Hermanas —ICH- y Aberraciones Cromosómicas Incluyendo Gaps. —ACG-), empleando un diseño en bloques al azar (DBA) y un ANOVA de dos vías para CAP y para HSA. A nivel genómico sitio específico, se analizaron las frecuencias para dos biomarcadores (ICH y ACG) por cromosoma, brazo y banda cromosómica, utilizando una Chi cuadrado, considerando siempre como frecuencia esperada la correspondiente al control de diseño (sin el agregado de droga). A nivel intergenómico se utilizó la prueba U-Mann Whitney para el análisis de las frecuencias medias entre CAP y HSA. Se realizó una tabla de 41 puntos de homeología, según la literatura, que se completó con la información de las frecuencias de ICH y de ACG en dichos puntos para CAP y HSA realizando el análisis mediante el coeficiente de Spearman. El MTZ genera una disminución del IM y un aumento de los ICH por célula y las ACG por célula en cultivos de LSP de Cebus apella y de Homo sapiens, con respecto al control de diseño. Para ambas especies, el IR no se ve afectado por la presencia de MTZ en las concentraciones utilizadas en el presente estudio. Los promedios generales para los cuatro biomarcadores no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre CAP y HSA. Este hallazgo es coherente con una conservación genómica de más del 80%. La ausencia de relación entre los ICH y las ACG por cromosoma y el tamaño o la morfología cromosómicos, junto a una concentración de ambos biomarcadores en un conjunto de bandas, indicaría la no aleatoriedad en la distribución de la fragilidad genómica, junto a una conservación de la información en los segmentos homeólogos entre ambos genomas. Encontramos bandas con elevadas frecuencias de ICH y/o ACG en todos los casos, es decir, puntos con una elevada “inestabilidad genómica basal”, y bandas con bajas o nulas frecuencias (de ICH y/o ACG) para el control de diseño, con diferencias estadísticamente significativas al agregar MTZ al cultivo. La mayoría de estas bandas contienen secuencias que han sido calificadas como indicadoras de inestabilidad genómica, o son consideradas Sitios Frágiles. Los hallazgos del presente trabajo representarían evidencias citogenéticas de la no aleatoriedad en la distribución de la fragilidad genómica en Primates, y de su conservación a nivel evolutivo.

Abstract:
There is increasing evidence supporting the hypothesis that chromosomal instability might be related to the structure of certain loci, involved in recurrent chromosomal rearangements. These sites are currently known as “hot spots”. With the goal of detecting these “hot spots” at a cytogenetic level, two models have been used: Cebus apella (CAP) and Homo sapiens (HSA), with an experimental system such as Peripheral Blood Lymphocytes (PBL) and a chemical inducer, such as metronidazole (MTZ), using genotoxicity biomarkers as an expression of chemically induced chromosomal fragility. Cebus apella (CAP) is a New World Primate, extensively used as an animal model in biomedicine. Up to now, its usefulness in genotoxic studies with chemical agents has been scarcely evaluated. Metronidazole (MTZ) is a 5-nitroimidazole derivative considered potentially genotoxic in several systems, both in vivo and in vitro. In this PhD Thesis, different concentrations of MTZ were added to PBL cultures of Cebus apella and HSA, with the aim of assessing, through genotoxicity markers, the effect of a potentially mutagenic agent in vitro on both genomes, separately and combined in an intergenomic analysis, performing an evaluation of the frequency of Sister Chromatid Exchanges (SCE) and Chromosomal Aberrations including Gaps (CAG) per band, using a sequential G(Wright stain)/SCE technique, developed for this Thesis. Results are analyzed at two levels: a) general, considering the four biomarkers measured (Mitotic Index, MI, Replication Index, RI, SCE and CAG), using a randomized block desing (RBD) and a Two-way ANOVA, and b) site-specific, for SCE and CAG frequencies, measured at each chromosome, chromosomal arm and band, with a Chi Square test, using always as the expected frequency the desing control (no MTZ added). At an intergenomic level, a U-Mann Whitney Test was used to compare all average values for the four biomarkers; a Table of 41 homeology regions was constructed following published references, and completed with the information for SCE and CAG for each point in CAP and HSA. Each homeolog pair was analyzed with a Spearman Coefficient. MTZ generates a decrease in MI and an increase , in SCE and CAG frequencies per cell in PBL cultures of Cebus apella and HSA (compared to the desing control). RI is not affected by the presence of MTZ in both species. General averages for the four biomarkers cannot be differentiated statistically between CAP and HSA. This is coherent with a genomic conservation of more than 80%. The lack of relationship between chromosomal length, size or morphology, along with a concentration of relatively high frequencies of SCE and CAG in a few chromosomal bands, can be considered indicators of a non random distribution of chromosomal fragility, along with the evolutionary conservation of homeolog segments between both genomes. We find bands with a high basal frequency of SCE and/or CAG in all cases, which represent regions of “basal genomic instability”, and bands with zero or low frequency of SCE and/or CAG in control cultures, showing a statistically significant increase of their frequencies in cultures exposed to MTZ. Most of these bands contain sequences that have been pointed as indicators of genomic instability, or are Fragile Sites. The current findings represent cytogenetic evidence of a non random distribution of chromosomal fragility in Primates, related to evolutionary conservation.

Fabris, Victoria T.. "Contribución de los estudios cromosómicos a la comprensión de los mecanismos de la carcinogénesis hormonal: estudio citogenético de carcinomas mamarios murinos inducidos por progestágenos" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El tratamiento prolongado con acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones de la cepa BALB/c induce carcinomas mamarios de histología ductal, que expresan receptores de estrógenos y progesterona, y son metastásicos en pulmón y ganglio linfático. Estos tumores se mantienen in vivo por pasajes singeneicos, siendo hormono-dependientes (HD) ya que requieren del agregado exógeno del MPA para crecer, y no crecen en animales sin tratar con MPA. Se seleccionaron variantes hormono-independientes (HI) a partir de los tumores HD que comenzaron a crecer en los animales sin MPA. Estos tumores HI son capaces de crecer en animales sin tratar con MPA, pero mantienen los receptores hormonales. Los tumores HI presentan una respuesta diferencial a1 tratamiento con l7-ᵝ-estradiol (E2) y los antiprogestágenos mifepristona y onapristona. Se los clasifica en respondedores, aquellos tumores HI que inhiben su crecimiento in vivo por el tratamiento hormonal, y no respondedores a aquellos que no regresionan por el tratamiento. En la primera parte de este trabajo se estudió el cariotipo de los tumores HD (n=5) y sus variantes HI (n=ll) con técnicas de citogenética clásica (bandeo G) y molecular (hibridación in situ fluorescente, FISH), con el objetivo de relacionar el número de cromosomas y las alteraciones del cariotipo presentes con las características biológicas de los tumores. Tres de los 5 tumores HD (60%) presentaron un número de cromosomas en el rango diploide (ratón normal, 2n=40), mientras que los tumores HD que presentaron números modales en el rango triploide a tetraploide fueron estudiados en pasajes muy avanzados. Los tumores HI en pasajes tempranos presentaron números modales diploides. En pasajes tardíos la mayoría de los tumores HI (8 de los ll estudiados) presentaron cariotipos en el rango triploide a tetraploide. Todos los tumores presentaron alteraciones numéricas y estructurales de sus cromosomas. No se observó una alteración común a todos los tumores, o que estuviera asociada con la dependencia hormonal. Sin embargo, podemos inferir que los tumores con números modales diploides responderán al tratamiento con E2 y antiprogestágenos. Las alteraciones más frecuentes fueron ganancia de los cromosomas 3, 4 y 6 (entre el 50% y 60% de los tumores) y pérdida de los cromosomas 16 y X (en el 70% y 100% de los tumores, respectivamente). En un análisis global, la pérdida del cromosoma X resultó significativa. Se observaron numerosas translocaciones, que involucraron a los cromosomas 4 y 7 con mayor frecuencia (presentes en tres de las cuatro familias tumorales con alteraciones evaluables), observándose el mismo punto de ruptura para el cromosoma 7. Por otra parte, las alteraciones presentes en los tumores HD se conservan en los pasajes tempranos del crecimiento autónomo. En base a estos resultados podemos concluir que los tumores inducidos por el MPA serían diploides, y que con el continuo pasaje in vivo puede aumentar el número de cromosomas. La adquisición de la hormono-indepedencia no es causada por el aumento de la ploidía, y los tumores HI conservarían el cariotipo diploide de los tumores HD en los pasajes tempranos. El aumento del número de cromosomas y la adquisición de nuevas alteraciones sería posterior a la adquisición de la hormono-independencia y ocurriría como consecuencia del aumento de los pasajes. La ocurrencia en pasajes más tempranos de variaciones en el cariotipo observada en los tumores HI con p53 mutado, respecto de los tumores HI con p53 normal, podría estar asociada a las mutaciones en p53. Sin embargo, en el tumor HD la presencia de p53 mutado no está acompañada de inestabilidad cromosómica, sugiriendo que serían necesarios otros factores además de dichas mutaciones. En la segunda parte del trabajo se estudiaron los cambios del cariotipo durante el establecimiento de líneas celulares a partir de carcinomas mamarios murinos HD y HI. Se analizaron las variaciones en ploidía y de las alteraciones cromosómicas a lo largo de los repiques de las 8 líneas celulares obtenidas. Las líneas celulares conservaron el número de cromosomas diploide de los tumores parentales en los primeros repiques, este número de cromosomas aumentó con los posteriores pasajes in vitro, y se estabilizó en el rango triploide en 5 de las 8 líneas celulares, sugiriendo que éste les daría cierta ventaja para el crecimiento en cultivo. Sin embargo, una de las líneas celulares mantiene su cariotipo diploide hasta repiques avanzados. Todas las líneas celulares conservan los cromosomas marcadores de los tumores parentales a través de los repiques, pero 7 de las 8 líneas adquieren alteraciones nuevas desde repiques muy tempranos. Podemos concluir que el aumento de la ploidía se vería favorecido por el avance de los repiques. Por otra parte, los cromosomas marcadores del tumor no se pierden por el continuo cultivo in vitro, pero se favorece la formación de nuevas alteraciones. El conocimiento del cariotipo permitió, además de caracterizar las líneas celulares, discernir sobre el origen de una de las líneas establecidas. En resumen, en este trabajo de tesis se investigó la evolución cariotípica de diferentes tumores mamarios murinos en su evolución desde la hormono-dependencia hacia la independencia, y de las líneas celulares derivadas. En nuestro conocimiento, este es el primer informe del estudio citogenético en relación con la independencia hormonal en tumores mamarios murinos. Los genes ubicados en los sitios de ruptura de las translocaciones observadas, como por ejemplo Aurora C, merecen ser estudiados en investigaciones futuras.

Abstract:
Medroxyprogesterone acetate treatment in BALB/c female mice leads to the development of ductal mammary carcinomas which express estrogen and progesterone receptors and are metastatic in axilar lymph nodes and lungs. They are maintained by syngeneic transplantation in progestin treated female mice disclosing a hormone dependent (HD) pattern of tumor growth. Occasionally hormone independent (HI) variants have been selected. These HI tumors are able to grow without exogenous hormone supply. Some of them are able to regress completely afier l7-ᵝ-estradiol or antiprogestin administration and are so called responsive HI tumors while others are unresponsive to both treatments. In the first part of this study we have investigated the karyotype of 5 HD tumors and of ll HI variants using classic cytogenetic techniques as G banding and molecular approaches as fluorescence in situ hybridization (FISH). The aim of this study was to evaluate possible relationships between ploidy, chromosome markers and acquisition of hormone independence. A near diploid karyotype (2n=40) was found in 3/5 HD while a triploid to tetraploid karyotype was observed in the other two HD tumors which were studied in late passages. In early passages from HI tumors we obtained diploid karyotypes while in advanced passages they were mainly poliploid (8/11 tumors). All tumors showed number and structural chromosomal rearrangements. The tumors studied did not share chromosomal abnormalities neither chromosome markers could be related to HD or HI tumors. However, it seems that in this experimental model it can be inferred that a diploid tumor will be responsive to hormones whereas a poliploid tumor may be HD, responsive HI or unresponsive to hormone treatments. The most frequent chromosomal rearrangements found in individual tumors were gains in chromosomes 3, 4 and 6 (in 50 and 60% of the tumors) and loses in chromosomes 16 and X (70% and 100% respectively). In a global analysis of frequencies only loses of chromosome X were statistically significant. Nearly all tumors disclosed several translocations (22 in 9 tumors studied). Chromosomes 4 and 7 were involved independently in 3 of the 4 tumor families which could be studied. Twice they were together, and in the case of chromosome 7, in the same breakpoint. Abnormalties present in HD tumors were maintained in early passages of HI tumors although later on new rearrangements were observed. It can be concluded that MPA dependent tumors are probably diploid and polyploidy arises by continuous in vivo transplantation. The acquisition of hormone independence is not caused by an increase in ploidy. Conversely, HI tumors may maintain the same diploid karyotype in early passages while progressively losing and acquiring new markets in later passages. SSCP revealed a point mutation in p53 in 4/5 tumors of the same family. The parental HD tumor showed a diploid stable karyotype while the HI variants were poliploid and did not share common markers suggesting that mutated p53 is not uniquely involved in chromosome instability. HI variants may have acquired other alterations that together with mutated p53 may confer this phenotype. In the second part of this study the karyotype of 8 cell lines derived from 2 of these diploid tumors was investigated. Cell lines maintained the diploid karyotype during the early passages and nearly all of them after passage 35 changed to a stable triploid karyotype. Only one cell line, the MC4-L5 remained diploid for more than 45 passages. All cell lines maintained the same chromosome markers than the parental tumors and 7/8 acquired new markers which were different for each cell line and were characterized in this study. It can be concluded that the onset of the cell lines are not defined by increases in ploidy but that in vitro culturing favors their evolution towards a triploid state. The fact that the onset of the cell lines were associated with new different rearrangements suggests that these may favor this event. Thus cytogenetic analysis is extremely important to identify cell lines. In addition, cytogenetic studies helped to determine if one of the cell lines could have been originated as a consequence of an epithelial mesenchymal transition from the same cells or if it could have been originated from a different cell. Summing up, in this thesis we have investigated the evolution of karyotypes of different mammary tumors from a hormone dependent to a hormone independent state and in their derived cell lines. To our knowledge this is the first report on the field studying cytogenetics in relation to hormone independence in mouse mammary tumors. Genes located in breakpoints, such as Aurora C in chromosome 7, deserve further investigations.

Palermo, Ana María. "Estudio del efecto genotóxico de alcoholes alifáticos de amplio uso aplicando el modelo de Drosophila melanogaster" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El estudio del efecto genotóxico de agentes xenobióticos se ha centrado tradicionalmente en la detección de daños que involucran al DNA y a los cromosomas entre los posibles blancos de ataque. En la actualidad la evaluación de un compuesto en cuanto a su acción deletérea sobre el genoma, debería incluir un análisis del efecto sobre la segregación cromosómica, ya que los blancos de acción pueden ser diferentes del ADN. El interes se debe al gran impacto de las aneuploidías en patología humana y a la creciente exposición a compuestos con capacidad potencial para actuar como aneugenos. La exposición a un agente que no afecta al ADN, no puede considerarse segura desde el punto de vista genético hasta tanto no sea evaluado su efecto aneugénico. En humanos, las aneuploidías en la línea germinal son frecuentes y tienen graves consecuencias, se considera que son causa del 5 al 7% de las muertes en niños y del 35% de los abortos espontáneos. Los individuos que sobreviven con números cromosómicos normales presentan severas discapacidades físicas y/o mentales. En las células somáticas las aneuploidías también juegan un papel importante, ya que existem evidencias crrecientes de que pueden ser determinantes en las etapas tempranas y/o tardías de los procesos de transformación celular y carcinogénesis, debido a la pérdida de heterocigosis. En esta misma línea están las pruebas de mutación y recombinación somatica (SMART, Somatic Mutation and Recombination Tests), un conjunto de ensayos capaces de identificar agentes mutagénicos o recombinagénicos potencialmente inductores de pérdida de heterocigosis. En este trabajo de Tesis se caracterisó el posible efecto mutagénico, recombinagénico y aneugénico en línea somática y germinal de Drosophila melanogaster producido por exposición a alcoholes alifáticos de cadena corta: etanol (EtOH), isopropanol (IPA) y metanol(MetOH). El conocimiento de los efectos genéticos de estos alcoholes es escaso o contradictorio y su metabolismo es muy semejante en humanos y en drosophila, siendo este organismo una excelente modelo de estudio para la evaluación de la toxicidad, genotoxicidad y teratogénicidad in vivo de alcoholes alifáticos de amplio uso. Con este objetivo se realizaron tratamientos agudos por vía inhalatoria, con los alcoholes (EtOH, IPA, MetOH) y sus primarios (acetaldehido=AAld, acetona=AcetO, formaldehído=FAld). Cuando se quiso evaluar el efecto de tratamientos crónicos las larvas fueron criadas en medio con el compuesto. Los resultados obtenidos indican que los tres alcoholes, EtOH, IPA y MetOH exhiben toxicidad y genotoxicidad diferencial en drosophila en las condiciones experimentales aplicadas. El grado de toxicidad demostrado en orden decreciente es: MetOH, EtOH e IPA. Los tres alcoholes presentan toxicidad reproductiva, disminuyendo la fertilidad de las hembras tratadas. El EtOH demostró afectar el desarrollo de larvas de Drosophila e inducir malformaciones congénitas. La genotoxicidad de los alcoholes alifáticos de cadena corta se manifiesta por su capacidad de inducción de no disyunción (ND) cromosómica. El grado de inducción de ND en orden decreciente es: IPA,EtOH y MetOH, guardando una relación inversa con la toxicidad. El MetOH actuaría como aneugeno indirecto, ya que su metabolismo, el FAld, es más genotóxico que el alcohol mismo. El EtOH y el IPA son aneugenos directos y sus respectivos metabolitos, el AAld y la AcetO, no afectan de manera significativa la disyunción cromosómica o muestran un efecto comparativamente menor que el de sus alcoholes de origen. En la línea germinal, los oocitos que están en las etapas más tardías de la diferenciación son los más afectados por los tratamientos con estos alcoholes. En la línea somática el efecto no es concluyente. Drosophila melanogaster es el modelo biológico de la elección para monitorear el daño inducido por alcoholes, permitiendo la extrapolación a otros organismos superiores en general y al hombre en particular.

Abstract:
The study of genotoxic effects of xenobiotics has been traditionally focused on DNA and chromosome damage. Nowadays, any evaluation of deleterious consequences exerted by any agent on the genome should necessary include the analysis of chromosome segregation, since the target of xenobiotics may be different from DNA itself. The study of aneuploidy is of interest due to its great impact on human health and the abundance of environmental agents with the capacity of acting as potential aneugenes. Exposition to a certain compound that has proved harmless regarding segregation has been discarded. In humans aneuploidy is quite common and has serious consequences. It may be the cause of around 5-7% infant deaths and it has been detected in 35% of all spontaneous abortions. Moreover, surviving individuals with abnormal chromosome sets are physically and/or mentally hadicape. The occurrence of aneuploidy in somatic cells is also of great interest since it may play a critical role in cell transformation and carcinogenesis, due to the loss of heterocigosity that may be induced. Somatic Mutation and Recombination Test (SMART) are also very useful to identify mutagenic and/or recombinagenic agents that result in the expression of recessive genes, wich may be involved in early and/or late steps in cancer development. The aim of the present Thesis was to characterize the potential mutagenic, recombinagenic and/or aneugenic effect of three short chain aliphatic alcohols, ethanol (EtOH), isopropanol (IPA) and methanol (MetOH), on somatic and germinal cells line in Drosophila melanogaster. The Knowledge about genetic consequences of the exposition to these alcohols in scarce or contradictory. Alcohol metabolism is similar in humans and Drosophila, thus this eukaryote has become a useful model in the in vivo evaluation of toxicicity, genotoxicicity and teratogenicity of the above mentioned aliphatic alcohols. Acute inhalation treatments with EtOH, IPA and MetOH, and with the corresponding primary metabolites, acetaldehyde (AAld), acetone (AcetO) and formaldehyde (FAld) were performed. To evaluate the consequence of chronic treatments, the compounds were added to the larva growth media. The results obtained show that all three alcohols, EtOH, IPA and MetOH exhibit differential toxicicity and genotoxicicity in Drosophila. The toxicicity of the alcohols in decrescent order is: MetOH, EtOH e IPA. All three alcohols show reproductive toxicicity, because fertitlity in treated females is lower than controls. Besides, EtOH exhibited developmental toxicicity in Drosophila larvae and induction of congenital malformations. Short chain aliphatic alcohols genotoxicity is expressed as a significant increase in chromosomal non-disjunction (ND) rates. The degree of induction of ND is inverse relative to the toxicity, thus IPA treated series show the highest level of ND in the progeny, being EtOH and MetOH less aneugemic. The MetOH is probably an indirect aneugenic agent, since the FAld is more active as genotoxic than the alcohol itself. The other two alcohols, EtOH and IPA act as direct mutagens in the induction of aneuploidy, and their metabolites, AAld and AcetO, do not effect chromosomal disjunction or show a comparatively lower effect than the alcohol from which they derive. In germ cells, mature oocytes are sensible to the drug treatments while less mature stages are not. The effects exerted by alcohols in somatic cells are inconclusive. Drosophila melanogaster has proven to be a useful biological model to monitor genetic damage induced by short chain aliphatic alcohols, because the results can be extrapolated to other organism including man.

Lia, Verónica V.. "Diversidad genética y estructura poblacional en razas nativas de maíz (Zea mays ssp. mays) del Noroeste Argentino: presente y pasado del germoplasma autóctono" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El maíz, Zea mays ssp. mays, es uno de los cultivos más importantes de América y ha estado vinculado con la actividad humana desde los inicios de la agricultura. Su distribución abarca todo el continente, encontrándose en una amplia gama de ambientes tanto en sus formas comerciales como nativas. En la República Argentina, las razas nativas exhiben una gran variedad ecológica y morfológica; sin embargo, la caracterización genética del germoplasma autóctono es casi inexistente. Estudios previos realizados en razas nativas del Noroeste Argentino (NOA) revelaron la existencia de una correlación positiva entre cromosomas B y altitud, sugiriendo un significado adaptativo para ests elementos supernumerarios. Con el Objeto de describir la diversidad genética de razas nativas y estudiar la dinámica poblacional sobre el gradiente altitudinal descripto, se examinaron los patrones de variación de 18 loci microsatélites. Tres de estos loci fueron analizados en ejemplares arqueológicos del NOA a fin de establecer su relación con las razas actuales. Los resultados del presente estudio permiten concluir que: 1) las razas nativas del NOA representan una fuente importante de diversidad para ampliar la base genética de los programas de mejoramiento; 2) los ejemplares arqueológicos son más afines a las razas pertenecientes al complejo Andino, que a otras razas actuales de la región; 3) procesos selectivos determinan el mantenimiento del gradiente altitudinal de cromosomas supernumerarios.

Abstract:
Maize, Zea mays ssp. mays, is the principal domesticated crop of the New World. Its many cultivars and landraces are currently adapted to a broad range of environments from Canada to Argentina. In spite of the morphological and ecological diversity of argentinian landraces, no attempts have been made to date to determine the extent of genetic variation within local germplasm. Previous studies have shown a positive correlation between altitude and B chromosome frequencies in several landraces from NW Argentina, wich suggests that supernumerary elements may be subject to selective pressures. The patterns of variation of 18 microsatellite loci were examined in order to assess the genetic diversity and population dynamics along the above mentioned cline. Three microsatellite loci were also used to determine the affiliations of archeological specimens to extant landraces. Three main conclusions can be drawn from the present study: 1) the landraces of NW Argentina are a valuable source of diversity to enlarge the genetic basis of breeding programs; 2) the archeological specimens are more closely related to the races og the Andean Complex, than to any of any of the other races examined; 3) selection plays a role in the maintenance of the altitudinal cline of B chromosomes.

Pérez, Martín Mariano. "Catecolamina - beta alanil ligasa (cbal), enzima clave en el metabolismo de neurotransmisores en los insectos" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En la presente Tesis se ha estudiado la enzima NBAD-sintetasa, responsable de la síntesis de NBAD, el principal precursor de esclerotización de las cutículas marrones de los insectos. Se la caracterizó en detalle y se estudió su expresión en el ciclo de vida de C. capitata. El aporte principal ha sido, justamente, el estudio en detalle de esta enzima. Anteriormente a esta Tesis, ésta era una enzima prácticamente desconocida. Si bien se había postulado que el NBAD era el principal precursor de esclerotización de las cutículas marrones de los insectos, excepto nuestro laboratorio, nadie había publicado nada sobre la enzima que lo sintetiza. Se determinó la expresión de la NBAD-sintetasa en la metamorfosis. Se la caracterizó y se demostró que la misma posee una amplia especificidad de sustratos. Se demostró por primera vez la actividad de esta enzima en sistema nervioso y respuesta inmune. Se clonó y secuenció por primera vez un mutante melánico de D. melanogaster, carente de esta actividad enzimática. Por su amplía especificidad de sustratos hemos denominado a esta enzima como Catecolamina-B-alanil ligasa (CBAL). Los principales resultados obtenidos son: -Se determinó el patrón de expresión de la enzima en el tejido epidérmico durante el ciclo de vida de C. capítata. La actividad de esta enzima se detectó en momentos muy acotados del ciclo de vida, coincidiendo con los momentos en que los individuos necesitan esclerotizar sus cutículas. Esta actividad es dependiente de la hormona de la muda 20-OH-ecdisona. La actividad está ausente en el tegumento de las larvas, pues las mismas son de cutícula blanda y no sufren el proceso de esclerotización. El primer momento durante el ciclo de vida en que se detectó la actividad fue en las prepupas cuando se forma el pupario. Luego de varias horas la actividad fue indetectable hasta el estadío de adulto farado donde se volvió a registrar la actividad extendiéndose ésta hasta la emergencia del adulto. -Se descubrió y se dosó por primera vez in vitro la actividad NBAD-sintetasa en tejido nervioso. Se estudió el patrón de expresión y se determinó que la actividad en este tejido es constante a lo largo del ciclo de vida. Incluso se detectó actividad en el “cerebro” de las larvas, hecho significativo puesto que en este estadío nunca se detectó esta actividad en la epidermis. En adultos se demostró que la actividad en el sistema nervioso permanece constante durante todo el estadío, mientras que en la epidermis, luego de las primeras 48 horas, cuando ya ha finalizado el proceso de la esclerotización, no se detecta más la actividad. - Por primera vez se observó que la NBAD-sintetasa participa en la respuesta inmune innata de los insectos. Esta actividad se manifiesta solamente cuando los individuos son invadidos por un patógeno o cuando se produce una injuria en la cutícula. También se determinó la función antibacteriana del NBAD. - Se caracterizaron las diferentes actividades enzimáticas y se concluyó que todas corresponderían a una misma enzima. La misma mostró una amplia especificidad de sustrato, siendo capaz de conjugar β-alanina con catecolaminas, indolaminas e imidoaminas. Por primera vez se logró sintetizar in vitro: NBANE, NBAOA; NBATA, NBASHT, NBAHA (carcinina) y NBATyr (sarcofagina). Debido a la amplia especificidad de sustrato que mostró, hemos denominado a esta enzima como “Catecolamina-β-alanil ligasa” (CBAL). - Se estudiaron los mutantes melánicos niger de C. capitata y ebony de D. melanogaster. Se determinó que ambos mutantes son homólogos; los dos carecen de la actividad NBAD-sintetasa en epidermis (esclerotización y respuesta inmune) y en sistema nervioso. Ambos mutantes muestran deficiencias en el comportamiento. El estudio de los mutantes demostró que las proteínas responsables de las actividades enzimáticas corresponden a un único gen. - Se clonó y secuenció el gen ebony de D. melanogaster en la cepa salvaje y el mutante e4. Se demostró, mediante Northern blots, que el ARNm del mutante es de menor tamaño que el de la cepa salvaje. Luego se secuenció y se comprobó que el gen del mutante posee una deleción de 447 pb en el primer exón. Además se observó que en el sitio de la deleción se insertaron 15 nucleótidos pertenecientes a una secuencia extraña, la cual fue analizada y arrojó homología con una secuencia perteneciente a un gen de baculovirus. Se analizó, además, la región promotora y se encontraron secuencias de reconocimiento para genes que responden a 20-OH-ecdisona, factores de transcripción que actúan en tejido epidérmico, tejido nervioso o en la respuesta inmune. - Se comenzó a estudiar preliminarmente la enzima NBAD-hidrolasa. La misma mostró un patrón de expresión diferente a la sintetasa. La expresión de esta enzima se registró durante todo el ciclo de vida. También se observó que se expresa en tejido nervioso. Esta enzima también mostró una amplia especificidad de sustrato, siendo capaz de hidrolizar los diferentes productos que sintetiza la NBAD-sintetasa. Los resultados obtenidos han permitido poner en evidencia la actividad de la enzima CBAL durante el ciclo de vida de C. capitata y los procesos fisiológicos en los que interviene, claves en la evolución de los insectos. También se abrió un nuevo panorama en el estudio del metabolismo de aminas biogénicas y se aportó información para conocer el metabolismo de β-alanina en insectos.

Abstract:
In the present Thesis it has been studied the enzyme NBAD-synthase, responsible for the syntesis of NBAD the main precursor for tanning and sclerotization the insect brown cuticles. This enzyme has been characterized and was studied its expression profile in the C. capitata life cycle. The principal contribution has been the detailed study of this enzyme. Before this Thesis, it was an almost unknown enzyme. It has been postulated that the NBAD is the main precursor for the sclerotization of insect brown cuticles, but except our laboratory, nobody has published anything about the synthesizing enzyme. It has been determined the expression profile of the enzyme during C. capitata metamorphosis. It has been observed that this enzyme showed a wide substrate specificity. For the fisrt time it has been demonstrated the activity of this enzyme in nervous tissue and in innate immune response. It has been cloned and sequenced for the first time a Drosophila melanogaster melanic mutant, lacking the NBAD-synthase activity. Due to its wide substrate specificity we proposed identify it as Catecholamine B-alanyl-ligase (CBAL). The main obtained result are: - It has been determined the expression profile of the enzyme in the epidermal tissue during the life cycle of C. capitata. The activity of this enzyme has been detected in narrow developmental windows in differents stages during the life cycle. All those developmental windows where the enzyme was expressed were in coincidence with the momment when the fly must sclerotize its cuticle. This activity is absent in the larval integument, this is because they are maggots with soft cuticle and it never suffer the sclerotization process. The first time when this activity has been observed was in the prepupa, during puparium formation. After several hours the activity disappeared until the pharate adult stage when it was evident again and remained until the imago emergence. - It has been discovered and determined for the first time the activity of this enzyme in the nervous system of insects and we showed that this activity is expressed constitutively during the whole life cycle. Indeed the activity was measured in the larval brain, this is striking because the activity is absent from the epidermal tissue. It has been shown that in the adult stage while the epidermal activity drops to undetectable levels, after the first 48 hours, when the sclerotization process had finished, in nervous tissue it kept on constant. - It was observed for the first time that NBAD-synthase is activated during the immune response in insects. The NBAD-synthase is activated only when the insect is infected by a microorganism. It has been also demonstrated the antibacterial activity of NBAD. - It has been characterized the different enzymatic activities and it was observed that all of them belong to the same enzyme. This enzyme showed a wide substrate specificity, being capable of synthesize different β-alanyl derivatives of catecholamines, phenolamines, indolamines and imidoamines. It has been synthesized, for the first time in vitro: NBANE, NBAOA, NBATA, NBASHT, NBAHA (carcinine) and NBATyr (sarcophagine). Due to its broad substrate specificity we proposed identify it as Catecholamine β-alanyl ligase (CBAL). - It has been studied the melanic mutants niger of C. capitata and ebony of D. melanogaster. It has been shown that both mutant are homologous, this two mutants lack the NBAD-synthase activity in the integument (sclerotization and immune response) and in the nervous tissue. These both mutants also have behavioural anomalies. The studies carried out on these mutants demonstrated that the responsible enzymatic activities are codified by an unique gene. - It has been cloning and sequenced the ebony gene from D. melanogaster wild type and ebony4 (e4) strains. By Northern blot assays has been observed that the mutant mRNA is smaller than the wild type one. Thereafter by sequencing it has been demonstrated that the mutant gene has a 447 bp deletion in its first exon. Moreover it has been observed in the deletion site 15 exogenous nucleotides inserted, and it sequence showed great similarity with a baculovirus gene. It has been studied the expression pattern in the D. melanogaster life cycle. Using a computational program it has been analized the promoter region of this gene and it has been observed the presence of sequences for different transcription factor recognition sites, such as those that respond to 20-OH ecdysone, transcription factor that are expressed in epidermal or nervous tissue and those that modulate the immune response. - Preliminary it has begun to be studied the enzyme NBAD-hydrolase. This enzyme showed an expression pattern different for that of NBAD-synthase. The expression of the former has been detected during the whole life cycle of C. capitata. As it occurs with the NBAD-synthase, the NBAD-hydrolase is also expressed in nervous system and is capable to hydrolisate the alternative products synthesized by the NBAD-synthase. All these results has allowed to show the activity of CBAL during the whole life cycle of C. capitata and the physiological process where it participates, very important during the evolution of insects. A new subjet in the study of metabolism of biogenic amines has been opened and it has been given a new information on the metabolism of β-alanine in insects.

González, Graciela E.. "Afinidades genómicas y mapeo cromosómico en maíz y especies relacionadas, a través de estudios de citogenética clásica y de hibridación in situ" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Este trabajo de tesis tiene por objeto realizar estudios que permitan comprender la organización y diversificación genómica de las especies y subespecies del género Zea, los cuales brindarán nuevos datos en relación al origen alopoliploide del complejo, a las relaciones evolutivas de sus taxones y al origen del maíz domesticado. Con este fin, se realizaron distintos estudios de citogenética clásica y de Hibridación In Situ Fluorescente (GISH y FISH) en especies, subespecies e híbridos intra-e interseccionales. El análisis meiótico de los híbridos con 2n=20 cromosomas: Zea luxurians x Zea dip/operennís; Zea luxurians x Zea mays ssp. mays; Zea luxurians x Zea mays ssp. parvíglumis y Zea luxurians x Zea mays ssp. mexicana reveló anormalidades meióticas que explican la elevada esterilidad polínica de los mismos. Estas irregularidades pueden ser las determinantes del aislamiento reproductivo postcigótico entre las especies parentales. Por otra parte, en estos mismos híbridos se observó asincronía meiótica de dos grupos de 5 II cada uno durante diplotene-diacinesis, lo que sugiere la existencia de dos genomas ancestrales en las especies con 20 cromosomas. El análisis meiótico de los híbridos con 2n=30: Zea luxurians x Zea perennís y Zea mays ssp. mays x Zea perennís mostró que la configuración más frecuente en metafase I es de 5 trivalentes + 5 bivalentes + 5 univalentes. Este resultado junto con la asincronía observada en los híbridos de 20 cromosomas dan sustento a la hipótesis que sostiene que las especies del género son alopoliploides críptioos. El análisis GISH (Hibridación ln Situ Fluorescente usando sondas de ADN Genómico total) en estos mismos híbridos permitió distinguir el origen genómico de las configuraciones, y reveló que los bivalentes están formados por apareamiento autosindétióo entre genomas homeólogos de Zea perennís (2n=40) mientras que los univalentes provienen del genoma de la especie con 2n=20. Por otro lado, el mapeo FISH de genes ribosomales reveló que los mismos se encuentran localizados en los genomas parentales que presentan mayor homología. El análisis de las afinidades genómicas mediante GISH entre especies de la sección Luxuriantes y maíz reveló que Zea perennis presenta una importante divergencia genómica con respecto a las otras especies. De acuerdo a los patrones de hibridación se puede postular que uno de los genomas de esta especie aloctoploide es muy divergente, ya sea porque uno de sus antecesores era diferente, o bien porque ocurrieron divergencias genómicas a posteriori del proceso de especiación híbrida poliploide. Se realizaron experimentos de GISH hibridando cromosomas de maiz con sondas de ADN genómico total de las subespecies Zea mays ssp. parviglumis, Zea mays ssp. mexicana y Zea mays ssp. huehuetenanguensis. Se observó que Zea mays ssp. mays posee mucha mayor homología con Zea mays ssp. mexicana y Zea mays ssp. parviglumis que con Zea mays ssp. huehuetenanguensis. Sin embargo. mediante el uso de bloqueos genómicos, pudo revelarse que Zea mays ssp. mays y Zea mays ssp. parviglumis presentan importantes divergencias genómicas. Una de las teorías más aceptadas actualmente en relación al origen del maíz domesticado sostiene que el teosinte anual Zea mays ssp. parviglumis sería el antecesor directo del maíz moderno, debido a que éste es el que presenta mayor afinidad genética en marcadores isoenzimáticos y moleculares. Se discute esta teoría en base a los resultados obtenidos en este trabajo, y se propone que el origen de las divergencias con su probable progenitor podría deberse a diferencias en retroelementos o a procesos de especiación híbrida que habrían ocurrido durante la domesticación del maíz.

Abstract:
This work intends to make studies that allow understand the organization and genomic diversification of species and subspecies of the Zea genus, which will probably offer new insights in relation to the allopolyploid origin of the complex, to the evolutionary relationships of these taxa and to the origin of domesticated maize. With this aim, different studies applying classical and molecular cytogenetic techniques (Fluoresence In Situ Hibridization or FISH) in species, subspecies and hybrids were performed. The meiotic analysis of hybrids with 2n=20 chromosomes: Zea luxuríans x Zea diploperennis; Zea luxurians x Zea mays ssp. mays; Zea luxurians x Zea mays ssp. parvíglumis and Zea luxurians x Zea mays ssp. mexicana revealed meiotic abnormalities that explain the high sterility of such hybrids. Postzygotic reproductive isolation between parental species may be promoted by these meiotic irregularities. On the other hand, in these same hybrids, meiotic asyncrony of two groups of 5 bivalents each was observed during diplotene-diacinesis which suggests the existence of two ancestral genomes in the species with 20 chromosomes. The meiotic analysis of the hybrids with 2n=30: Zea luxurians x Zea perennis and Zea mays ssp. mays x Zea perennis showed that the most frequent configuration in metaphase I is of 5 trivalents + 5 bivalents + 5 univalents. This result along with asyncrony observed in the hybrids of 20 chromosomes, gives support to the hypothesis that maintains that species of the genus Zea are cryptic allopolyploids. GISH analysis (Fluoresence In Situ Hybridization using total Genomic DNA as a probe) in these same hybrids allowed to distinguish the genomic origin of meiotic configurations, and revealed that bivalents are formed by autosyndetic pairing between homeologous genomes of Zea perennis (2n=40) whereas the univalents come from the genome of the species with 2n=20. On the other hand, FISH mapping of ribosomal genes revealed that they are located in the parental genomes that display greater homology. The analysis of the genomic affinities by means of GISH between species of the Luxuriantes section and maize revealed that Zea perennis shows an important genomic divergence with respect to the other species. According to the hybridization pattern observed, it was postulated that one of the genomes of this alloctoploid species is very divergent, either because one of its ancestors belonged to a different species, or because genomic divergences occurred after the process of speciation by hybridization. GISH experiments were made hybridizing maize chromosomes with total genomic DNA probe from the three subspecies Zea mays ssp. parviglumis, Zea mays ssp. mexicana and Zea mays ssp. huehuetenanguensis. It was observed that Zea mays ssp. mays has much greater homology with Zea mays ssp. mexicana and Zea mays ssp. parviglumis than with Zea mays ssp. huehuetenanguensis. Nevertheless, by means of the use of blocking procedures, it could be revealed that Zea mays ssp. mays and Zea mays ssp. parviglumis show important genomic divergences. One of the most accepted theories in relation to the origin of domesticated maize maintains that annual teosinte Zea mays ssp. parviglumis would be the direct progenitor of modern maize, because it displays greater genetic affinity. Taking into account the results here obtained we discuss this theory and propose that the divergences observed between maize and its putative ancestor could be either due to differences in retroelements or processes of hybrid speciation that would have happened during the domestication of modern maize.

Piccinali, Romina V.. "El papel de la selección natural y la demografía histórica sobre la variabilidad nucleotídica de los genes Xdh (Xantín deshidrogenasa) y alfaEst-5 (alfa esterasa 5) en Drosophila buzzatii y D. koepferae" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En esta tesis, estudiamos los patrones de variabilidad nucleotídica de los genes Xdh (Xantín deshidrogenasa) y α-Est-5 (Alfa esterasa 5) en Drosophila buzzatii y D. koepferae, e investigamos si los mismos son compatibles con modelos de evolución neutra o adaptativa. Para ello analizamos mediante diversas pruebas estadísticas un fragmento de cada gen en muestras poblacionales de D. buzzatii y D. koepferae de Argentina, pertenecientes al área de origen de estas especies, y en muestras de D. buzzatii de Australia, un área de colonización reciente. Nuestros resultados muestran que: l) las diferencias en los niveles de polimorfismo entre genes y entre especies serían el resultado de diferencias en el ambiente recombinacional, probablemente debido al ligamiento diferencial de ambos loci con los polimorfismos de inversión del cromosoma 2; 2) las inversiones de D. buzzatii exhiben ciena diferenciación a nivel de la secuencia de nucleótidos de αEst-5; 3) existen polimorfismos compartidos entre especies en el gen Xdh los cuales podrian ser el resultado de eventos de introgresión más o menos recientes; 4) los alelos electroforéticos de Xdh detectados en estudios previos son clases heterogéneas resultantes de fenómenos de convergencia de carga, mientras que en los alelos electroforéticos de αEs1-5 tendrían un origen histórico común; 5) en D. koepferae ambos genes muestran patrones de estructuración poblacional concordantes con las Regiones Fitogeográficas de Argentina, que contrastan con la ausencia de estructura en D. buzzatii. Estas diferencias podrían estar relacionadas con las características ecológicas y la distribución histórica de los cactus a los que cada especie se encuentra asociada en la naturaleza; 6) ha existido un efecto fundador moderado en D. buzzatii asociado a la colonización de Australia; 7) existen excesos de mutaciones únicas en D. buzzatii, respecto de lo esperado bajo neutralidad selectiva en ambos genes, que sugieren que esta especie habría experimentado una expansión reciente en su área de origen; 8) existe un exceso de polimorfismos no sinónimos en el gen α-EsI-5 de D. buzzatii tanto en las muestras de la Argentina como de Australia, el cual probablemente se deba a la acción de selección natural episódica; 9) por el contrario. D. koepferae es una especie cuyas poblaciones están en aparente equilibrio deriva-mutación.

Abstract:
In this thesis we analyze patterns of nucleotide variatíon in the Xdh (Xanthine dehydrogenase) and α-Est-5 (alpha esterase 5) genes of the cactophilic Drosophila buzzatii and D. koepferae, and investigate whether these patterns are in agreement with expectations of models of neutral or adaptative evolution. We applied several statistical tests to natural population samples of D. buzzalii y D. koepferae from the native area and to samples of Australian populations of D. buzzarii, a recently colonized area. Our results show that: l) the disparities in the levels of nucleotide polymorphism between genes and species could be explained by differences in the recombinational environment to which each gene is exposed, and this environment is probably influenced by the differential distribution of polymorphic inversions along the second chromosome of both species; 2) paracentric polymorphic inversions in D. buzzatii exhibit certain degree of differentiation for the αEst-5 gene region; 3) the presence of shared polymorphisms between species in the Xdh locus can be the result of introgression events; 4) the electrophoretic alleles of Xdh are heterogeneous classes that share a similar electrophoretic mobility due to charge convergence, whereas some alleles of αEst-5 alleles appear as monophyletic; 5) patterns of population in D. koepferae are coincident with Argentinían Phytogeographical Regions for both genes and contrast with the absence of population structure in its sibling D. buzzatii. DifTerences in population structure can be due to ecological and historical differences in the distribution of cactus hosts to which each species is mainly associated; 6) there are evidences of a moderate founder effect in D. buzzatii during the colonization of Australia; 7) there is an excess of singletons in D. buzzatii, that suggests a recent population expansion of this species in its original area; 8) there is an excess of non synonymous polymorphisms in the αEst-5 gene of D. buzzatii that can be accounted for by episodic selection; 9) D. koepferae populations seem to be in equilibrium genetic drift-mutation.

Alberghina, Josefina Silvia. "Estudios ultraestructurales en el género Oedogonium Link (Oedogoniales, Chlorophyta) y su posición filogenética dentro de las algas verdes." (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las Oedogoniales constituyen un orden de algas verdes con citocinesis particular, zooides estefanocontos, y forma especializada de reproducción sexual. Los tres géneros incluídos en el orden se diferencian por el tipo de hábito, siendo Oedogonium filamentoso simple. Se seleccionaron 11 especies de Oedogonium provenientes de distintos cuerpos de agua dulce argentinos, se analizó a nivel ultraestructural la citología de los oogonios con distintos tipos de apertura y se secuenció el gen 18S rDNA. Dado que uno de los caracteres diacríticos más importantes para dicho género es el tipo de apertura de los oogonios, se relacionó su estudio ultraestructural con el filogenético molecular y morfológico. Los estudios moleculares, que incluyeron 37 especies de Chlorophyta permitieron demostrar la monofilia del Orden Oedogoniales y que ningún carácter usado tradicionalmente en la determinación específica del género puede ser conciderado como sinapomórfico. Estos análisis también indicaron que el aparato flagelar estefanoconto de los zooides podría haber derivado tanto de una configuración CCW como una DO. Sin embargo, estudios ultraestructurales de la gameogenesis y zoosporogénesis en Oedogonium parecerían indicar que el origen correspondería al tipo DO. Se porpone además elevar el orden Oedogoniales al nicel de Clase Oedogoniophyceae.

Abstract:
Oedogoniales make up a green algae Order with an unusual form of cytokinesis, a ring of flagella on zooids, and complex sexual reproduction. The three genera included in this Order differ from each other in the type of habit. Oedogonium sp. is unbranched filamentous. Eleven Oedogonium species collected from argentinian freshwater bodies were selected. The cytology of their oogonia with different types of aperture was analyzed with ultrastructural techniques, and their 18S rDNA genes were sequenced. As one of the diacritic characters for this Genus is the type og oogonial aperture, the aim of this research is to integrate the ultrastructural study with the molecular analysis. The phylogenetic study including 37 species of Chlorophyta demonstrated the monophyly of Oedogoniales, and that traditional morphological characters used in the specific determination of the Genus can not be considered as synapomorphic. It is proposed that the stephanokont motile cells in this order could be originated either from CCW configuration or DO, although previous ultrastructural studies of gametogenesis and zoosporogenesis in Oedogonium seem to indicate that the origin correspond to the DO type. It is also proposed that the Oedogoniales group raised to the status of Class Oedogoniophyceae.

Caimi, Karina Cynthia. "Genómica comparativa en micobacterias responsables de enfermedades zoonóticas pertenecientes al Complejo Mycobacterium tuberculosis" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El Complejo M tuberculosis (CMT) está formado por distintas especies de micobacterias entre las que se encuentra el agente causal de la tuberculosis en humanos, Mycobacterium tuberculosis y micobacterias responsables de enfermedades zoonóticas como M. bovis, M. microti y M. pinnipedii. La genómica comparativa en micobacterias brinda una vasta información acerca de la relación entre los genomas de distintas micobacterias pertenecientes al CMT. En la primera parte de este trabajo se estudió la Región de Repeticiones Directas (DR). Esta región está compuesta por repeticiones directas conservadas de 36pb separadas por secuencias no repetitivas llamadas espaciadores (sps). El polimorfismo observado en esta región entre aislamientos de micobacterias pertenecientes al CMT dio origen a la técnica de tipificación, ampliamente aplicada en tuberculosis denominada Spoligotyping. La secuenciación y comparación de la región DR entre distintos aislamientos argentinos de M. bovis permitió encontrar 5 espaciadores nuevos. Estos espaciadores conjuntamente con una colección de otros descriptos previamente, fueron incluidos en una nueva membrana de spoligotyping obteniéndose un total de 104 espaciadores. La utilización del spoligotyping de lO4-sps. permitió la diferenciación de aislamientos del CMT en 174 spoligotipos, mientras que el uso de la membrana tradicional tipificó estos mismos aislamientos en 160 spoligotipos distintos. Particularmente para M. bovis se obtuvo un incremento de 17 a 26 spoligotipos respectivamente. El análisis comparativo in silico en micobacterias no pertenecientes al CMT como M. smegmatis, M. avium, M. marinum y M. leprae, permitió establecer que los marcos de lectura abiertos (MLAs) flanqueantes a la Región DR de M. tuberculosis, se encuentran adyacentes entre sí en estas otras micobacterias. En cambio en el genoma de M. tuberculosis esta región comprende 24kb. que incluyen 23 MLAs así como la región DR ausentes en las mencionadas micobacterias. Este resultado fue corroborado in vitro mediante amplificación por PCR. Debido a la ausencia del locus DR descripto y los MLAs adyacentes, en M. avium y M. smegmatis y debido a que estas micobacterias fueron descriptas como más antiguas que M. tuberculosis, se postula que esta región podría haber sido adquirida por las especies del CMT o por un ancestro común a ellas a lo largo del proceso evolutivo. La segunda parte de este trabajo implicó el estudio de la variabilidad genética entre distintos aislamientos de M. bovis, M. microti y M. pinnipedii, estas últimas responsables de tuberculosis en ratones de campo denominados “vole” y en mamíferos marinos respectivamente, mediante comparación de genomas completos. Se encontró una nueva deleción en M. microti denominada MiD4. Esta región remueve 5 genes que codifican para antígenos de la familia ESAT-6 y PE-PPE. En M. pinnipedii se encontraron dos nuevas deleciones, PiD1 que removió dos genes, uno de los cuales codifica para una oxidoreductasa (Rv3530c) involucrada en el metabolismo celular. La segunda deleción PiD2, fue denominada como RD2seal debido a estar superpuesta con la región de 10.7kb, RD2, ausente en algunas M. bovis BCG. Esta región abarca los genes Rv1977 y Rv1978. Los experimentos de Southern blot mostraron que MiD4 está también ausente en M pinnipedii, en cambio PiDl es una deleción específica para M. pinnipedii. Por otra parte mediante la comparación del genoma de M. bovis con el genoma de M. tuberculosis in silico, se pudieron identificar nuevos marcadores capaces de diferenciar entre estas dos especies y respecto de otras especies del CMT. Uno de estos nuevos marcadores denominado rpfA presentó polimorfismos en los aislamientos de M. bovis estudiados, lo que podría ser usado en la tipificación y diferenciación.

Abstract:
The Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) is composed by different mycobacteria species, the agent of human tuberculosis and mycobacteria responsible of zoonotic disease as M. bovis, M. microti and M. pinnipedii are among them. Comparative genomics gives broad information about the relationship between the different micobacterial genomes of the MTC. In the first part of this work the Direct Repeat (DR) region was studied. The DR region is composed of multiple well-conserved 36-bp DRs interspersed with non-repetitive DNA spacer sequences (sps). The polymorphism in the DR region has led to the development of a methodology highly applied in tuberculosis research called Spoligotyping. Upon analysis of this region in argentine bovine isolates of M. bovis, five new spacers were detected. These spacers and a collection of others previously described were included in a new spoligotyping membrane reaching a total of 104 different spacers. The application of the lO4-sps spoligotyping allows the differentiation of isolates from the MTC in 174 spoligotypes while with the application of the traditional membrane 160 spoligotypes were obtained. The discriminatory power of M. bovis isolates was increased from l7 to 26 different patterns respectively. The comparative analysis in silico performed in mycobacteria not-belonging to the MTC as M. smegmatis, M. avium, M. marinum and M. leprae allow to establish that the open reading frames (ORFs) flanking the DR region of M. tuberculosis are adjacent in these mycobacteria. In M. tuberculosis genome, this fragment includes 24kb. with 23 ORFs absent from the referred mycobacteria. This observation was experimentally confirmed by PCR. As the DR locus and the ORFs around it, are absent in M. smegmatis and M. avium and, as it is possible that these species are older than M. tuberculosis, we postulated that the DR locus was acquired by the MTC species or by an ancestor bacterium during evolutionary process. In the second part of this work the genetic variability of different isolates of M. bovis, M. microti and M pinnipedii, these last species agents of tuberculosis in wild voles and marine mammals respectively, was studied by whole genome sequence analysis. A novel M. microti deletion was found here called MiD4. This region removes 5 genes that code for ESAT-6 family antigens and PE-PPE. Two new deletions were found in the M. pinnipedii isolates: PiD1, which removes two genes where one of them code for an oxidoreductase (Rv3530c) involved in cellular metabolism. A second deletion found in M. pinnipedii isolates, PiD2, has been recently defined as RD2 seal since it overlaps the 10,7 kb RD2 region. This region encompasses Rv1977 and Rv1978 genes. Southern blot experiments showed that MID4 was also deleted from M. pinnipedii, but PID1 is a deletion specific to M. pinnipedii. By the other hand the analysis in silico between the M. bovis and M. tuberculosis genomes, allow the identification of new markers. These markers were used to differentiate between both species and from another species. One of these new markers called rpfA, present polymorphism between M. bovis isolates. This polymorphism could be used in typification and differentiation.

Sede, Silvana Mabel. "Estudios multidisciplinarios en el complejo galactia-camptosema-collaea (leguminosae)" (2005) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El género pantropical y subpantropical Galactia, y los géneros neotropicales Camptosema y Collaea se agrupan en un complejo basado en sus afinidades exomorfológicas. Algunos caracteres macromorfológicos diagnósticos están algunas veces presentes sin correlación en las especies de distintos géneros en la región austral de América del Sur, y es por esta razón que se han adoptado distintos criterios para delimitarlos, generando gran confusión taxonómica. El objetivo de este trabajo fue clarificar las relaciones entre las especies del complejo Galactia- Camptosema- Collaea. Con este propósito se analizaron las características morfológicas y citológicas de distintas especies. Se realizó además un análisis filogenético combinando caracteres moleculares y morfológicos y un análisis del patrón de bandas generado por AFLP. La mayoría de los caracteres tradicionalmente usados como diagnósticos en la taxonomía del grupo no permiten una delimitación clara de los rangos genéricos e infragenéricos. Se evaluaron las características cromosómicas del grupo y se realizaron nuevos recuentos para las especies conflictivas. De los datos citológicos analizados, los caracteres fundamentales y de mayor relevancia para la resolución de la taxonomía conflictiva del grupo, resultaron ser el número cromosómico y la fórmula cariotípica. Las hipótesis filogenéticas propuestas en este trabajo apoyan la monofilia de Collaea, y no corroboran la monofilia de Galactia y Camptosema. El análisis de agrupamiento obtenido a partir de los patrones de bandas de AFLP no es consistente con la actual circunscripción de Galactia y Camptosema, corroborando los resultados obtenidos en el análisis morfológico y filogenético. Los resultados obtenidos inducen a rever la circunscripción actual del complejo genérico.

Abstract:
The pantropical and subpantropical genus Galactia, and the neotropical genera Camptosema and Collaea are grouped in a complex based on exomorphological affinities. Some diagnostic macromorphological features are sometimes present without correlation between the species of different genera in the austral region of South America, and this is the reason why different criteria have been adopted to delimit them, thus generating great taxonomic confusion. The aim of this work was to clarify the relationships of the species within the complex Galactia- Camptosema- Collaea. To accomplish this objective, morphological and cytological characteristics of different species were evaluated. A phylogenetic analysis combining morphological and molecular characters and the analysis of the AFLP band patterns of the species were also undertaken. Most of the characters traditionally used as diagnostic in the taxonomy of the group, do not permit a clear delimitation of the generic and infrageneric ranges. The chromosome characteristics of the group were also evaluated and new records for the conflictive species were reported. From the cytological data analyzed, the most relevant characters were the chromosome number and the karyotype formula. The phylogenetic hypotheses proposed in this work strongly support the monophyly of Collaea, but do not corroborate the monophyly of Galactia and Camptosema. The clustering obtained from the analysis of the AFLP band patterns is not congruent with the current circumscription of Galactia and Camptosema, corroborating the results obtained from the morphological and phylogenetic analyses. The results obtained induce to revise the present circunscription of the genera in the complex.

Soto, Ignacio M.. "Evolución morfológica asociada al proceso de divergencia entre especies: el cluster Drosophila buzzatii (Diptera, Drosophilidae)" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
¿Porqué hay especies morfológicamente crípticas sólo diferenciables por su genitalia? ¿Qué procesos están involucrados en la diferenciación morfológica de las especies y cuál es la importancia relativa de cada uno de ellos? ¿Qué patrones determinan estos procesos cuando se analizan en escalas micro y macroevolutivas? Muchos de los mecanismos por los que se producen los cambios morfo-fisiológicos que acompañan a la especiación permanecen largamente desconocidos por la biología. Más aún, las bases genéticas de la divergencia morfológica que acompaña a la cladogénesis sigue siendo una cuestión controvertida, tanto en lo que concierne al número de genes implicados como a la magnitud de sus efectos. En los últimos años se ha profundizado en el conocimiento de la genética, la biogeografía, la sistemática y la ecología del cluster buzzatii. El simple hecho de que este cluster incluya especies en diferentes etapas de la divergencia interespecífica ofrece la oportunidad de investigar las bases genéticas de la evolución de la morfología en un grupo en activa cladogénesis. Esto se suma a la posibilidad de generar híbridos interespecíficos en el laboratorio y al conocimiento acumulado sobre su ecología, lo que convierte al cluster en un excelente modelo biológico-evolutivo. Además, la fertilidad de las hembras híbridas posibilita experimentos de introgresión de material genético de una especie en el genoma de otra y la oportunidad de buscar loci que afectan caracteres cuantitativos como la forma y el tamaño de las alas y los órganos sexuales. El objetivo primario de esta tesis es comprender los factores causales, tanto genéticos como ecológicos, de las diferencias fenotípicas entre las especies cactófilas del cluster Drosophila buzzatii mediante el análisis de la variabilidad genética y la plasticidad fenotípica de caracteres de distinta naturaleza. Por un lado analizamos la morfología del ala, el tiempo de desarrollo y la viabilidad, que son caracteres íntimamente relacionados con la eficacia biológica. Por otro lado estudiamos la morfología del órgano copulador masculino (aedeagus), un carácter diagnóstico posiblemente blanco de la selección sexual. Asimismo, nos interesa conocer las relaciones entre la morfología, caracteres de historia de vida y el aprovechamiento de la planta hospedadora para determinar si existen correlaciones que puedan limitar o dirigir los cambios en forma y tamaño de los distintos órganos. Finalmente, estimando el grado de divergencia entre especies buscamos estudiar el patrón de evolución morfológica y poder determinar qué aspectos pueden ser atribuidos a la inercia filogenética y cuáles a procesos selectivos actuando en taxa específicos. Los resultados principales fueron: -La base genética de las diferencias morfológicas interespecíficas del ala y la genitalia masculina no sigue un modelo aditivo según el aporte de ensayos de hibridación. Existen elementos segregantes con fuertes efectos epistáticos y de dominancia. -Los sustratos de cría, distintas especies de cactus hospedadores, afectaron dramáticamente todos los caracteres estudiados. Quedan consolidados como un factor biótico central a considerar en cualquier estudio evolutivo en este modelo. - Se detectó plasticidad fenotípica en la genitalia masculina en respuesta a la planta hospedadora por primera vez en el género Drosophila. - Se obtuvo evidencia de que las plantas hospedadoras pueden perturbar diferencialmente el normal desarrollo larvario y constituir un factor de stress, posiblemente relacionado con la química de los cactus. -Las especies difirieron en los patrones de variación, plasticidad fenotípica y en el porcentaje de las diferencias de conformación debidas a la alometría para los caracteres medidos en ambos órganos. -En D. buzzatii y D. serido las diferencias genitales entre poblaciones siguen un modelo de aislamiento por distancia y un patrón de evolución morfológica congruente con un modelo neutro. -La evolución morfológica del cluster buzzatii presenta evidencia de divergencia por procesos selectivos. Esto se aplica tanto al ala como a la genitalia masculina aunque en este último carácter sólo valdría cuando está incluida D. buzzatii ya que las especies del “set” D. serido se ajustaron a un patrón de evolución neutra.

Abstract:
Why we do we have morphologically cryptic species that exclusively differ in the morphology of their genitalia? Which are the processes involved in morphological divergence between species? and which is the relevance of adaptive vs stochastic differentiation? What are the patterns established by these processes in both a micro and macroevolutionary scales? The mechanisms that drive morpho-physiological changes accompanying speciation remain largely unknown by biologists. Besides, there is still a controversy regarding the genetic basis of morphological divergence during cladogenesis and the number of genes involved and the magnitude of their effects In recent years it has been an increment in the knowledge about the genetics, biogeography, systematics and ecology of species that belong to the buzzatii cluster. The mere fact that this cluster comprises species in different stages of interspecific divergence offers the chance to study genetic basis of morphological evolution in a group in active cladogénesis. Additionally, the possibility of producing interspecific hybrids in the laboratory sets the cluster as an excellent biological model for the study the genetic basis of interspecific divergence during different stages of cladogenesis. Moreover, hybrid females are fertile allowing experiments of introgression of genetic material from one species to another and the chance to search for quantitative trait loci affecting wing and genital size and shape. The primary objective of this thesis is to comprehend the causal factors, both genetic and ecological, of phenotypic differences among cactophilic species of the Drosophila buzzatii cluster by means of the estimation of the relative contribution of genetic variation and phenotypic plasticity to phenotypic variation in morphological and life history traits. On one hand, we analyzed wing morphology, developmental time and viability, as representatives of fitness related traits, and, on the other hand, we studied the morphology of male copulatory organ (aedeagus), a diagnostic trait a possible target of sexual selection. As well, we are interested in knowing the relationship between morphological and life-history traits and the influence of host plant use to determine if correlations exists that might limit or drive the shape and size changes in different organs. Alternatively, we seek to understand morphological evolution and to establish which aspects of the evolution of the organ might be attributed to phylogenetic inertia and which to adaptive processes acting in specific taxa. Main results: - According to hybridization essays, the genetic basis of interspecific morphological differences in wing and genitalia did not respond to an additive model. Our results suggest the existence of segregating factors with dominant and epistatic effects. - The breeding substrates, different host cacti, affected dramatically all studied traits. Thus, our study emphasizes the position of host cacti as a central biotic factor to be taken into account in any evolutionary study with this model. - We report phenotypic plasticity in male genitalia associated to host plants for the first time in the genus Drosophila. - We obtained evidence that host plants may differentially affect normal development and represent a factor of stress which might be related to cactus chemistry. - Species differed in patterns of trait variation, phenotypic plasticity and the percentage of shape differences due to allometry for morphological traits in both organs. - Interpopulational genital differences in D. buzzatii and D. serido follow an “isolation by distance” model and a pattern of morphological evolution that is congruent with neutrality. - Morphological divergence in the buzzatii cluster appears to be largely due to adaptive processes for both wing and genitalia. This is true for the D. buzzatii cluster as a whole, while divergence of male genitalia in the D. serido sibling set appears to have evolved under random drift.

Colombo, Noemí. "Caracterización molecular de mutantes derivadas del genotipo mutador de cloroplastos de cebada" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La coordinación de la expresión génica entre los genomas nuclear, plastídico y mitocondrial es de importancia crucial para las células vegetales. Un caso particular de la interacción núcleo-plástido está dado por los genes nucleares mutadores de cloroplasto, que inducen un dramático aumento de la tasa de mutación espontánea del plastoma. En esta tesis se estudió molecularmente el plastoma de cuatro mutantes inducidas por el mutador de cloroplastos de cebada en las que no se observaron cambios mayores, ni en el tamaño, ni en el arreglo génico del plastoma. Sin embargo, no debe descartarse en las mismas la presencia de alteraciones menores, como pequeñas deleciones, duplicaciones o sustituciones. Por otro lado, se hicieron estudios de expresión génica en la lámina de la primera hoja de una de ellas, la línea citoplásmica 2 (LC2) caracterizada por presentar retraso en la traducción plastídica durante embriogénesis, afectando el desarrollo temprano de los cloroplastos. En la base y el ápice LC2 presentó: a) incremento en los transcriptos de las ARN polimerasas plastídica (NEP) y mitocondrial; b) incremento en la acumulación de ARN mensajeros para genes transcriptos por NEP; c) menor acumulación de ARN ribosomales plastídicos; d) menor acumulación de proteínas tilacoidales. La acumulación de la ARN polimerasa plastídica (PEP) fue similar al control, al igual que los patrones de sus transcriptos. Se observó expresión diferencial de Rubisco entre células del mesófilo y de la vaina parenquimática del haz vascular en el ápice de LC2. Mediante parámetros de fluorescencia de clorofila se comprobó la alteración temprana y posterior recuperación de la fotosíntesis en LC2. Los resultados aportan nuevas evidencias sobre la relación entre la traducción plastídica y el desarrollo de los cloroplastos y muestran a LC2 como un material experimental útil para el estudio de la traducción plastídica y del efecto de ésta y de los plástidos sobre la expresión concertada de los distintos genomas de la célula vegetal.

Abstract:
The coordination of gene expression between the nuclear, plastidic and mitochondrial genomes is crucial for plant cells. A particular case of the nuclear-plastid interaction is that of the chloroplast mutator nuclear genes, which dramatically increase the plastome spontaneous mutation rate. In this thesis, the plastome of four mutants induced by the barley chloroplast mutator was characterized at the molecular level. No major changes were observed, either in plastome size or in gene arrangement. However, minor changes like small deletions, duplications or substitutions should not be discarded. Additionally, studies on gene expression along the first leaf blade were carried out in one of the mutants, the cytoplasmic line 2 (CL2). CL2 presents a delay in plastid translation during embryogenesis, affecting early chloroplast development. In the basal and top sections CL2 showed: a) an increase in transcripts levels of plastid (NEP) and mitochondrial RNA polymerases; b) an increase in mRNA accumulation of NEP- transcribed genes; c) lower levels of plastid ribosomal RNAs; d) lower accumulation of thylakoid proteins. The accumulation of plastid RNA polymerase (PEP) in CL2 was similar to that of the control, as were its transcripts patterns. Differential expression of Rubisco was observed between mesophyll and parenchymatous bundle sheath cells in CL2 top. Early photosynthesis impairment and subsequent recovery was determined using chlorophyll fluorescence parameters. Results provide new evidences about the relationship between plastid translation and chloroplast development and show CL2 is a useful material for studying plastid translation and its effect on the concerted expression of different plant cell genomes

Landau, Alejandra Mabel. "Análisis molecular y funcional de líneas citoplásmicas con deficiencias clorofílicas originadas por un gen mutador de cloroplastos de cebada" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los cloroplastos son organelas exclusivas de la célula vegetal y en ellas se produce uno de los procesos más fundamentales de la vida terrestre que es la fotosíntesis. Las mismas poseen su propio ADN o plastoma que se hereda de manera citoplasmática. El plastoma está altamente conservado observándose poca variabilidad natural y la inducción artificial de mutaciones ha sido dificultosa. En el Instituto de Genética se caracterizó genéticamente un gen mutador de cloroplastos en cebada que induce un amplio espectro de mutaciones plastómicas. En este trabajo de tesis se analizaron y caracterizaron fisiológica, bioquímica y molecularmente tres mutantes aisladas a partir del genotipo mutador, las líneas citoplásmicas LC2, LC3 y LC9. Para la mutante LC9, de tipo virescente, no se hicieron postulaciones sobre posibles genes candidatos, sin embargo, de acuerdo a los resultados del análisis de RFLPs pudo concluirse que esta línea mutante no porta grandes rearreglos o deleciones en el plastoma. En el caso de la mutante LC2, de tipo albo-viridis, los resultados de determinación de pigmentos y proteínas codificadas por el plastoma en experimentos de imbibición de las semillas con antibióticos que inhiben la traducción plastídica, sugirieron que las plántulas LC2 tienen un retraso en la síntesis de proteínas plastídicas en la parte superior de la lámina de la primera hoja, proceso que en el caso de la cebada normal se produciría antes de la germinación. El único gen en el plastoma involucrado en la regulación de la traducción cloroplástica es el gen infA, que fue postulado como candidato del fenotipo LC2. Luego de su secuenciación se halló una mutación puntual que produce un cambio de aminoácido en la proteína IF1 ("initiation factor 1"). Se concluyó que se trata de una mutante del gen infA, siendo la primera vez que un fenotipo mutante es atribuido a este gen en plantas superiores. Además, el fenotipo LC2 se vió estrechamente asociado a mutaciones en el gen infA como claramente se demostró mediante el aislamiento de nuevas mutantes tipo LC2 (LC2-like). En el caso de la mutante LC3, de tipo viridis y sensible a alta temperatura, se analizó la composición de clorofilas y carotenoides demostrándose que LC3 tiene un menor contenido de clorofilas totales en comparación con el control, sobre todo a alta temperatura. Los resultados del contenido de pigmentos del ciclo de las xantofilas indicaron que la mutante sufre de estrés fotooxidativo. También se realizaron mediciones de los espectros de fluorescencia de la clorofila a temperatura ambiente y a 77 K, y éstos demostraron fotoinhibición y un fotosistema I (PSI) afectado en LC3. A nivel de proteínas de las tilacoides, se encontró que en LC3 estaban disminuidos o ausentes algunos polipéptidos componentes del PSI cuando la mutante creció en condiciones de luz y temperatura determinadas. A partir de estos resultados se postularon como responsables los loci ycf3 e ycf4, que codifican para dos chaperoninas involucradas en el ensamblaje del PSI. En el primero de ellos se encontraron dos mutaciones puntuales localizadas en el intrón 1 que afectaron la eficiencia de "splicing" de este gen que se vio disminuida en función de la temperatura. Los resultados indican que el genotipo mutador estudiado es una fuente promisoria para el análisis funcional del plastoma.

Abstract:
Chloroplasts are exclusive organelles of the plant cell. Photosynthesis, one of the major processes for life in Earth, is carried out within them. These organelles hold their own DNA or plastome which is cytoplasmically inherited and highly conserved. Natural variability of the plastome is hardly observed and the artificial induction of mutations has been very difficult to obtain. A barley chloroplast mutator gene was genetically characterized in the Institute of Genetics, which induces a wide spectrum of plastome mutations. In this thesis, three chloroplast mutants isolated from the mutator genotype, the cytoplasmic lines CL2, CL3 and CL9, were analyzed from physiological, biochemical and molecular approaches. In the case of CL2 mutant, an albo-viridis type, the results of pigment and chloroplast proteins determination in experiments of seed imbibitions with antibiotics that inhibit chloroplast translation, suggest that CL2 seedlings have a delay in chloroplast protein synthesis in the upper part of the first leaf blade. In the wild type barley, this process appears to take place before germination. The only plastome gene involved in the regulation of chloroplast translation is the infA gene, which was consequently postulated as a candidate gene for CL2 phenotype. After sequencing infA gene in CL2, a point mutation that changed an amino acid in IF1 (initiation factor 1) protein was found. It was concluded that CL2 is an infA gene mutant, being this the first time that a mutant phenotype is associated to this gene in higher plants. Furthermore, the CL2 phenotype was observed to be closely linked to mutations in infA gene, as was clearly demonstrated after isolation of new CL2-like mutants. In the case of CL3 mutant, a viridis and temperature-sensitive type, the chlorophyll and carotenoids composition was determined showing that CL3 has lower chlorophyll content than the wild type, especially at high temperature. The results of xanthophylls cycle pigment content pointed out that the mutant suffers from photo-oxidative stress. Furthermore, the chlorophyll fluorescence spectra at room temperature or at 77 K indicated photoinhibition and an affected photosystem I (PSI) in CL3. When the thylakoid proteins were analyzed, some PSI subunits were found to be decreased or absent in CL3 when the seedlings were grown under certain light and temperature conditions. Taking into account the above mentioned results, the loci ycf3 and ycf4, which encode two chaperones involved in PSI assembly, were postulated as candidate genes for CL3 phenotype. After sequencing both genes, two point mutations were found in intron 1 of ycf3, which showed to affect splicing depending on temperature. CL9 mutant, a virescent type, does not bear any conspicuous rearrangements or deletions in the plastome detectable by RFLP in the conditions assayed in this thesis. Postulations on possible candidate genes were not elaborated for this mutant and the molecular basis of the mutation remains to be established. The results indicate that the mutator genotype in study is a promising resource for the functional analysis of the plastome.

Mensch, Julián. "Identificación y caracterización de genes con variación natural para el tiempo de desarrollo a partir de mutantes heterocrónicos de Drosophila" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Comprender la arquitectura genética de caracteres ecológicamente relevantes requiere la contribución tanto de la biología evolutiva como de la biología del desarrollo. El tiempo requerido para alcanzar la edad reproductiva es un carácter adaptativo conocido como tiempo de desarrollo. El impacto del tiempo de desarrollo sobre el fitness particularmente en los insectos holometábolos que explotan habitats efímeros, como las moscas de la fruta, es aún más drástico. El presente trabajo es uno de los primeros estudios sistemáticos sobre la arquitectura genética del tiempo de desarrollo, en el cual además evaluamos el impacto de la variación ambiental en la expresión de este carácter. Analizamos 179 líneas mutantes artificiales generados por inserciones de elementos móviles P en Drosophila melanogaster, con el objetivo de identificar genes candidatos que afecten el tiempo de desarrollo en moscas criadas a 25ªC. El sesenta por ciento de las líneas mostró un fenotipo heterocrónico, lo que sugiere que una gran cantidad de genes afectan al carácter. Los mutantes Merlin y Karl mostraron los fenotipos más extremos del estudio, exhibiendo una reducción y un aumento de 2 y 4 días en relación al control, respectivamente. Además, a partir de una submuestra de 42 líneas seleccionadas al azar de las 179 iniciales, se cuantificó el tiempo de desarrollo a 17ºC. Interesantemente, la interacción gen-ambiente contribuyó con el 52% de la varianza fenotípica total. De esta manera, se encontraron un gran número de genes candidatos con normas de reacción plásticas. En la siguiente etapa del proyecto encontramos gran variación genética natural para el tiempo de desarrollo asociada al cromosoma II en respuesta a gradientes altitudinales. A partir de estos resultados realizamos ensayos de complementación genética para varios mutantes heterocrónicos plásticos para la temperatura, con el objetivo final de identificar genes con variación natural para el carácter. De esta manera, pudimos determinar que una importante fracción de la variación natural está asociada a la variación a nivel de las secuencias de invected, mastermind, criclket y CG14591. En conclusión, nuestros resultados enfatizan la necesidad de tomar en cuenta el efecto que las vías de señalización metabólicas ejercen sobre la arquitectura genética de este complejo carácter de historia de vida.

Abstract:
Understanding the genetic architecture of ecologically relevant adaptive traits requires the contribution of developmental and evolutionary biology. The time to reach the age of reproduction is a complex life history trait commonly known as developmental time. In particular, in holometabolous insects that occupy ephemeral habitats, like fruit flies, the impact of developmental time on fitness is further exaggerated. The present work is one of the first systematic studies of the genetic architecture of developmental time, in which we also evaluate the impact of environmental variation on the expression of the trait. We analyzed 179 co-isogenic single P-element insertion lines of Drosophila melanogaster to identify novel genes affecting developmental time in flies reared at 25ºC. Sixty percent of the lines showed a heterochronic phenotype, suggesting that a large number of genes affect this trait. Mutant lines for the genes Merlin and Karl showed the most extremes phenotypes exhibiting a developmental time reduction and increase, respectively, of over 2 days and 4 days relative to the control. In addition, a subset of 42 lines selected at random from the initial set of 179 lines was screened at 17ºC. Interestingly, the gene-byenvironment interaction accounted for 52% of total phenotypic variance. Plastic reaction norms were found for a large number of developmental time candidate genes. In the next part of the project we found an altitudinal clinal variation for second chromosome natural substitution lines. As a consequence, we performed genetic complementation tests for a number of heterochronic temperatureplastic mutants to identify genes with natural variation. We were able to establish that an important fraction of the genetic natural variation is attributed to invected, mastermind, criclket and CG14591. Taken together, our results stress the need to take into account the effect of metabolic signaling pathways on the genetic architecture of this complex life-history trait.

Taranda, Julián. "Generación y análisis de ratones geneticamente modificados en los genes Chrna9 y Chrna10" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El receptor colinérgico nicotínico (nAChR) compuesto por la subunidades α9 y α10 y acoplado al canal de potasio dependiente de Ca2+ SK2, media la transmisión sináptica inhibitoria entre la inervación eferente medial (MOC) y las células ciliadas de la cóclea. En este trabajo hemos generado dos animales geneticamente modificados con alteraciones en el funcionamiento del receptor α9α10. Con el objetivo de estudiar el papel del sistema eferente olivococlear en el funcionamiento del oído interno generamos un ratón knock in que alberga una sustitución de una leucina (L) por una treonina (T) en la posición 9’ de la región transmembrana 2 de la subunidad α9 del receptor colinérgico nicotínico. Esta mutación le confiere al receptor una menor tasa de desensibilización y una mayor afinidad aparente para la ACh, la cual se refleja en un marcado aumento de la actividad del sistema eferente olivococlear in vivo. Es así que los animales mutados presentaron un aumento en los umbrales de las respuestas eléctricas evocadas del tronco encefálico (BERA) y en los productos de distorsión de emisiones otoacústicas (PD- EOAs). Más aún, la estimulación eléctrica del sistema eferente en la base del IV ventrículo, produjo un dramático aumento de la supresión de los PD-EOAs. Todos estos efectos fueron bloqueados por estricnina, un bloqueante de receptores α9α10. Finalmente, los animales mutados presentaron una mayor resistencia al trauma producido por sonidos intensos. Estos resultados demuestran que el sistema olivococlear es un sistema inhibitorio que protege al oído del trauma acústico. En la segunda parte del presente trabajo generamos un ratón transgénico que expresa a la subunidad α10 de receptores nicotínicos en forma constitutiva. Las células ciliadas internas (CCIs) de la cóclea reciben una inervación eferente colinérgica antes del comienzo de la audición (P12 en roedores). Luego del comienzo de la audición, estas fibras se retraen, y esto se correlaciona con el cese de la transcripción del gen que codifica para la subunidad α10 (Chrna10) y la ausencia de receptores colinérgicos funcionales. Para evaluar si estos cambios durante el desarrollo se deben en parte al cese de la transcripción de Chrna10, generamos un ratón transgénico que expresa a la subunidad α10 en forma constitutiva. A tal fin, el ADNc que codifica para la subunidad α10 fue introducido rio abajo del promotor del Pou4f3, factor de transcripción que se expresa en las CCIs y CCEs desde estadios embrionarios. Este transgén se expresó correctamente en las CCIs y codificó para una subunidad α10 funcional. Sin embargo, a pesar de la presencia de la subunidad α10, no se detectaron corrientes colinérgicas luego del comienzo de la audición. Por lo tanto, la desaparición de las respuestas colínergicas que acompañan al desarrollo de las CCIs no es consecuencia del cese de la transcripción de Chrna10.

Abstract:
The nicotinic cholinergic receptor (nAChR) composed of the α9 and α10 subunits and functionally coupled to calcium-activated, small conductance (SK2) potassium channels, mediates the inhibitory synaptic transmission between the medial efferent fibers (MOC) and the hair cells of cochlea. In this work we have generated two genetically modified animals with alterations in the function and expression of the α9α10 receptor. To study the function of the olivocochlear efferent system in the inner ear, we generated a knock in mice, which harbors a threonine (T) for leucine (L) substitution at 9’ position (L9’T) of the second transmembrane domain of the α9 subunit. This mutation confers a decreased rate of desensitization and a higher apparent affinity for Ach. This was reflected in increase of the olivocochlear efferent activity in vivo. The knock in mice presented an increase in the thresholds of the auditory brainstem responses (ABR) and the distortion product otoacoustic emissions (DPOAEs). Moreover, the electrical stimulation of the efferent system at the base of the fourth ventricle produced a dramatic increase in the suppression of the DPOAEs. All these effects were blocked by strychnine, a potent antagonist of α9α10. Finally, the knock in mice presented a greater resistance to acoustic trauma produced by intense sounds. These results demonstrate that the olivocochlear system is an inhibitory system that protects the ear from acoustic injury. In the second part of this work we generated a transgenic mouse that constitutively expresses the α10 subunit. Inner hair cells (IHCs) of the cochlea receive cholinergic efferent innervation before the onset of hearing (P12 in rodents). After the onset of hearing, these fibers retract, and this is correlated with the cessation in the transcription of the gene that codes for the α10 subunit (Chrna10). In order to analyze these development changes around the onset of hearing, we generated a transgenic mouse that expresses the α10 subunit constitutively. For this purpose, the cDNA that codes for the α10 subunit was introduced downstream of the Pou4f3 promoter, a transcription factor that is expressed in IHCs and outer hair cells (OHCs) since embryonic stage. This transgene was correctly expressed in the IHCs and encoded a functional α10 subunit. Nevertheless, this manipulation was not sufficient for maintaining a functional cholinergic receptor after the onset hearing. Therefore, the disappearance of cholinergic responses that accompanies the development of IHCs is not a consequence of the cessation in the transcription of Chrna10.

Carreira, Valeria Paula. "Bases y arquitectura genética de caracteres morfológicos en Drosophila melanogaster" (2009-04-29) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Taminelli, Guillermo Luis. "Estudio de la expresión del gen CISD1 mediada por la actividad del CFTR" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva producida por mutaciones en el gen que codifica el canal de cloruro CFTR. Muy poco se sabe sobre los mecanismos moleculares involucrados en el daño celular producido por la falla del canal CFTR. Mediante la metodología de “Display Diferencial” o “Differential Display” (DD) observamos que la expresión del gen de origen nuclear CISD1 (CDGSH Iron Sulfur Domain 1) estaba disminuída en un modelo celular de FQ. Dado que el DD es una técnica que aporta evidencias pero es susceptible a falsos positivos y negativos, se decidió que el primer enfoque de esta Tesis fuera corroborar los resultados del DD. Para ello se utilizaron técnicas como RT-PCR semi cuantitativas y RT seguida de PCR en tiempo real para medir los niveles de expresión de CISD1 en distintos modelos celulares de FQ o con células que expresasen CFTR wt en presencia de inhibidores o activadores del CFTR. Ya que CISD1 es un gen que se encuentra en el genoma nuclear, el siguiente enfoque de esta Tesis fue determinar la localización subcelular de su producto. En este caso, se utilizó la expresión de una quimera unida a EGFP y mediante microscopía confocal pudimos demostrar que CISD1 codifica una proteína de localización mitocondrial. La localización mitocondrial fue confirmada por Wiley y col. Ellos además reportaron que CISD1 posee un grupo prostético del tipo 2Fe-2S en lugar de Zinc, como postulamos en un principio debido a su estructura primaria. La función de esta proteína es desconocida, pero estudios hechos en mitocondrias aisladas de células cardíacas de un ratón nulo (-/-) para mitoNEET (CISD1 en humanos) presentaban disminuída en un 30 % la capacidad máxima de la fosforilación oxidativa medida en estado 3. Además, en un trabajo anterior de Colca y colaboradores, se reportó que la proteína Minner-1 de ratón (producto de splicing alternativo de CISD1) co-inmuno precipitó con proteínas pertenecientes al complejo l de la cadena de transporte de electrones. Luego de que comprobamos su localización mitocondrial mediante la quimera GFP-CISD1, nuestro siguiente objetivo fue determinar si la actividad del complejo I mitocondrial se encontraba afectada por la expresión diferencial de CISD1 (un efecto observado en FQ por Grabriel Valdivieso en su Tesis, aún no publicado). Para tal fin medimos la actividad in gel del CIm mediante la técnica “Blue Native-PAGE” (BN-PAGE), en mitocondrias extraídas desde diferentes modelos experimentales de células FQ transfectadas con CISD1 salvaje y células Caco-2 (no FQ) transfectadas con un variante mutada de CISD1 obtenida por mutagénesis dirigida en las cisteínas 72 y 74 que fueron reemplazadas por serinas en un plásmido de expresión para eucariotas pcDNA 3.1(-). Así, observamos que la disminución significativa de la actividad del CIm reportada por Valdivieso y col. en distintos modelos FQ era restaurada por la expresión ectópica de CISD1, mientras que la variante mutada de CISD1 moduló negativamente la actividad normal del Clm en células Caco-2 (no FQ).

Abstract:
Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene encoding the CFTR chloride channel. Very little is known about the molecular mechanisms involved in the disease. Using the methodology of "Differential Display" (DD), we observed that the expression of the nuclear gene CISD1 (CDGSH Iron Sulfur Domain 1) was decreased in a cell model of CF. Since DD is a technique that might provide false positive or negative results, the results has to be validated by using other methods. Thus, the first objetive of this Thesis was to corroborate the DD results. For this purpose, we used semi-quantitative RT-PCR and RT followed by real-time PCR to measure the expression levels of CISD1 in different CF cell models. We also used non-CF cells in presence of CFTR inhibitors or activators. Since CISD1 is a gene found in the nuclear genome, the following focus of this thesis was to determine the subcellular location of the CISD1 product. We used the expression of a chimera containing CISD1 linked to EGFP and by using confocal microscopy we could show that CISD1 indeed encodes for a protein of mitochondrial localization, as the program PSORT previosuly predicted. The mitochondrial location was also confirmed by Wiley et al. They reported that CISD1 has a 2Fe-2S type prosthetic group instead of zinc as we originally thought. The function of this protein is unknown yet, but studies done in isolated mitochondria of cardiac cells from a null (-/-) mouse for mitoNEET (CISD1 in humans) had decreased by 30% the maximal capacity of oxidative phosphorylation measured in state 3. Furthermore, in a previous work, Colca et al. reported that the mouse protein Minner-1 co-immune precipitated with proteins belonging to the mCl of the electron transport chain (ETC). We also showed previously (Valdivieso et al), that the mitochondrial protein ND4, which belong to the mitocondrial complex I, was reducen in FQ. Therefore, our next goal was to determine whether mitochondrial complex I activity was affected by the differential expression of CISD1. To this end, we measured the in gel mCl activity using the "Blue Native-PAGE (BN-PAGE) technique, in mitochondria extracted from different experimental models of CF cells, transfected with CISD1 wt, and non- CF cells transfected with a mutated variant of CISD1. We observed that the significant decrease in the mCl activity reported by Valdivieso et al. in different CF models, can be partially restored by the CISD1 ectopic expression, while the mutated variant of CISD1 down modulated the normal mCl activity in non-CF Caco-2 cells.

Goenaga, Julieta. "Resistencia a la inanición en Drosophila melanogaster: variación genética natural y su relación con la longevidad y las reservas energéticas" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En la naturaleza los organismos están expuestos a un ambiente continuamente cambiante que los fuerza a desarrollar adaptaciones que alivian las consecuencias del estrés ambiental. La escasez de alimentos es un factor de estrés que afecta a todos los organismos en su hábitat natural, de modo que es esperable que desarrollen adaptaciones que maximicen la resistencia a la inanición (RI). El potencial evolutivo de cualquier carácter está determinado por su arquitectura genética. En el presente trabajo estudiamos la arquitectura genética de la RI en poblaciones naturales de Drosophila melanogaster. En primer lugar analizamos la variación genética a diferentes escalas geográficas en isolíneas derivadas de poblaciones naturales. A continuación, examinamos la contribución del cromosoma 2 (que representa cerca del 40% total del genoma) a la variación fenotípica de la RI, con el fin de establecer qué proporción de la variación está regulada por esta región del genoma. Posteriormente, mediante pruebas de complementación genética identificamos variación alélica natural en genes implicados en la RI. Además, estudiamos las asociaciones entre la RI y otros caracteres, la longevidad (L) y el contenido de lípidos (CL). Los principales resultados muestran que las poblaciones naturales de D. melanogaster cuentan con variación genética para la RI y que la variación interpoblacional es menor que la intrapoblacional. Asimismo, revelan que una fracción importante de la variación genética es dependiente del sexo. En general, la RI muestra un dimorfismo sexual (DS) a favor de las hembras, sin embargo la magnitud del DS varía entre los genotipos analizados. Además, demostramos que el cromosoma 2 explica una fracción importante de la variación fenotípica en la RI. Finalmente, los ensayos de complementación genética indicaron que 5 de los 6 genes implicados en la RI (Rya-44F, crol, l(2)rG270, l(2)k17002 y l(2)k00611) contribuyen a su variación natural. Los resultados de los estudios de asociación revelaron que la variación en el CL es un importante determinante de la RI. En conclusión, la RI mantiene un alto potencial evolutivo en poblaciones naturales y una fracción importante de su variación genética se atribuye a factores localizados en el cromosoma 2. Asimismo, genes que regulan el metabolismo, la reproducción y la asignación de los recursos energéticos son responsables de la variación natural en la RI.

Abstract:
In nature, organisms are often exposed to a wide range of fluctuating environmental conditions that force the evolution of specific adaptations to alleviate the consequences of environmental stress. Food shortage is a stress factor that affects all organisms in their natural habitat. Therefore, individuals need to develop adaptations to tolerate food shortage or starvation resistance (SR). The genetic architecture of a trait is essential because it describes and determines the variational properties of traits, and thus their potential to evolve. In this Thesis, we studied the genetic architecture of SR in natural populations of Drosophila melanogaster. First, we analyzed genetic variation at different geographic scales in sets of lines derived from natural populations. Then, we examined the contribution of chromosome 2 (which accounts for approximately 40% of the whole genome) to total phenotypic variation in SR. Finally, we performed genetic complementation tests to identify genes with natural variation for SR. In addition; we studied the relationship between SR and longevity (L) and lipid content (CL). Our results showed that natural populations of D. melanogaster harbor substantial amounts of genetic variation for SR and that the contribution of among population variation explains a smaller amount of total trait variation than within population variation. We also detected that an important fraction of genetic variation is sex-specific. Moreover, females tended to outlive males, though the SD magnitude varied among genotypes. An important fraction of genetic variation could be accounted by factors located in chromosome 2. Finally, complementation genetic tests indicated that 5 out of 6 genes that affect SR (Rya-44F, crol, l(2)rG270, l(2)k17002 y l(2)k00611) contribute to natural variation. In addition, a statistically significant relationship between SR and LC was found in both sexes. In conclusion, SR has evolutionary potential in nature, and some chromosome 2 loci can account for a relevant fraction of variation. The genes involved in natural variation of SR regulate essential pathways related to metabolism, reproduction and the mobilization of energy reserves.

Guzmán, Noelia Verónica. "Filogeografía comparada de dos especies de gorgojos plaga con distintos modos de reproducción" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En el presente trabajo de tesis se realizó un estudio comparativo de los procesos evolutivos que dieron origen a la distribución geográfica de la variabilidad genética actual de dos especies de gorgojos, Naupactus leucoloma y Naupactus xanthographus (Coleoptera: Curculionidae). Ambas especies originarias de Sudamérica, son consideradas importantes plagas agrícolas. N. xanthographus presenta reproducción bisexual y N. leucoloma se reproduciría por partenogénesis telitóquica y apomíctica. Se realizó un estudio filogeográfico comparado a través de dos tipos de marcadores, mitocondrial y nuclear, de manera de abarcar tanto los procesos evolutivos históricos como los actuales, con el objeto de dilucidar los efectos del modo de reproducción sobre la potencialidad colonizadora de cada especie. Los resultados del presente trabajo permiten concluir que: 1) Todas las poblaciones de N. leucoloma presentaron ausencia de machos y se reproducen asexualmente. Estas poblaciones habrían atravesado por un cuello de botella severo o un barrido selectivo a raíz de la infección por Wolbachia, bacteria inductora de la partenogénesis, de manera que tan solo unos pocos haplotipos exitosos habrían llegado a colonizar diversas regiones del mundo; 2) Del análisis filogeográfico se desprende que N. xanthographus, de reproducción sexual, posee una mayor variabilidad genética en comparación con N. leucoloma, y su principal centro de diversidad y dispersión estaría ubicado hacia el norte de la provincia de Buenos Aires y sur de Santa Fe; 3) Ambas especies han sido exitosas en la colonización de nuevos ambientes, aunque siguiendo diferentes estrategias: a) Un modo de reproducción bisexual que mantiene la alta variabilidad genética confiriéndole una mayor capacidad de adaptación a nuevos ambientes y b) Un modo de reproducción asexual, que si bien trae como consecuencia una escasa variabilidad genética, confiere la capacidad de colonizar ambientes marginales y a larga distancia, con la presencia de tan solo un individuo.

Abstract:
In the present thesis was carried out a comparative study of the evolutive process that have given origin to the actual geographic distribution of the genetic variability from two weevils, Naupactus leucoloma and Naupactus xanthographus (Coleoptera: Curculionidae). Both species originated in South America, are considered important agricultural pests. Naupactus xanthographus present bisexual reproduction and N. leucoloma would reproduce by infectious theltoky apomictic parthenogenesis. We realized a comparative phylogeographic study based in mitochondrial and nuclear makers, so we can cover both historical and actual evolutive process with the objective to elucidate the effects from the reproductive mode over the colonizing potential of the species. Results from the present work allow conclude: 1) All populations from N. leucoloma present absence of males and reproduce asexually. These populations would have passed a severe bottleneck or a selective sweep consequence of the bacterial infection which apparently induce the parthenogenesis, Wolbachia, which induce parthenogenesis, so only a few successful haplotypes have colonized diverse regions of the world; 2) From phylogeographic analysis we conclude that N. xanthographus, with sexual reproduction, have a greater genetic variability compare with N. leucoloma, and its principal center of diversity and dispersion is locate in the north of Buenos Aires and south of Santa Fe provinces; 3) Both species have been successful in colonization of new environments, but with different strategies: a) a bisexual reproduction which maintains high genetic variability conferring a mayor adaptative capacity to new environments y b) an asexual reproduction, which bring a low genetic variability as a consequence, confer the capacity to colonized marginal habitats and to long distances, with the presence of an only individual.

Gómez, Federico Hernán. "QTL para estrés de alta temperatura y evolución experimental de hormesis en el modelo Drosophila" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Drosophila melanogaster se encuentra distribuida en amplias zonas geográficas, desde regiones tropicales a templadas en la mayoría de los continentes. Diversos fenotipos adaptativos han evolucionado en este organismo modelo cosmopolita, dependiendo los individuos y las poblaciones de conjuntos de mecanismos de resistencia al estrés ambiental, tanto basales como inducibles para la adaptación a las condiciones climáticas variantes. La resistencia al estrés por calor, hambre y radiación representan fenotipos ecológicamente relevantes de adaptación a los ambientes en la etapa adulta del ciclo de vida de Drosophila. Se ha hallado que los tratamientos de estrés térmico con frecuencia inducen hormesis en la longevidad en varios organismos. Hormesis es un concepto fundamental en la biología evolutiva de la respuesta al estrés, siendo utilizado ampliamente para definir un fenómeno de respuesta de dosis sobre diversos caracteres, incluyendo la longevidad. El efecto de hormesis sobre la longevidad ocurre cuando la exposición a un factor de estrés moderado (ej., estrés por calor) extiende la longevidad de un organismo o bien reduce su tasa de senescencia o envejecimiento. La radiación ultravioleta (UV) es otra forma de estrés ambiental que, como ocurre con la temperatura, puede afectar la distribución, abundancia y evolución de los organismos. Los niveles de radiación UV incrementan a mayores latitudes y altitudes. El presente escenario de calentamiento global está caracterizado por un gradual deterioro de la capa de ozono y mayores niveles de radiación ultravioleta que alcanzan la superficie del planeta. Debido a que los caracteres de historia de vida han evolucionado en un ambiente donde la radiación está presente, es de interés investigar la base genética de la resistencia a la radiación ultravioleta. Otro carácter de importancia adaptativa en insectos es la resistencia a la inanición. Este carácter es importante para la supervivencia cuando los recursos alimenticios son escasos. En los insectos es común que las poblaciones tengan que soportar inanición en forma periódica, y la evolución de caracteres de historia de vida puede haber ocurrido bajo condiciones ambientales que incluyan la falta de alimento. El tamaño corporal puede estar relacionado a la tolerancia a la inanición además de ser otro carácter de gran importancia adaptativa para la dispersión y la capacidad para encontrar recursos de alimento y cría en D. melanogaster. Este carácter se encuentra muy influenciado por la temperatura durante el desarrollo embrionario. Utilizando el mapeo de QTL (Quantitative Trait Loci) como herramienta y Drosophila melanogaster como organismo modelo, se investigó e identificó la ubicación de loci que son importantes para la variación en la resistencia a las altas temperaturas, al hambre y a la radiación UV. En este trabajo de tesis también se realizó un mapeo de QTL para el tamaño del ala (un índice del tamaño corporal) y la asimetría fluctuante como un indicador de la inestabilidad del desarrollo, tanto en benigna como en alta temperatura experimentada durante el desarrollo embrionario. En las regiones de QTL descubiertas se encuentran genes que desempeñan un rol importante en la evolución adaptativa de estos caracteres. Por otro lado, se investigaron e identificaron patrones adaptativos de hormesis en la longevidad en líneas de Drosophila buzzatii seleccionadas artificialmente para alta y baja resistencia a diferentes formas de estrés térmico. La tolerancia al estrés por inanición fue consistentemente más alta en las hembras que en los machos. El mapeo del intervalo compuesto identificó un QTL entre las bandas 64D-66E2 del cromosoma 3 en los machos y ningún QTL en las hembras. Se identificaron muchos genes candidatos dentro de dicha región de QTL. Los QTL para el tamaño del ala tampoco co-localizaron con el QTL para la tolerancia a la inanición. Los resultados se discuten con respecto a los múltiples genes candidatos y la falta de co-localización con QTL de termotolerancia previamente detectados en estudios recientes en Drosophila melanogaster. En el análisis de hormesis se utilizaron líneas de selección bi-direccional para mayor (K+) y menor (K-) resistencia al estrés por calor, así como también se utilizaron líneas seleccionadas para mayor (CCR+) o menor (CCR-) resistencia al estrés por frío. La hormesis inducida por estrés de calor fue sustancial en las hembras K- y CCR-, mientras que no se detectó ningún efecto de hormesis en las líneas K+, CCR+ y de control. Las diferencias en la longevidad entre las diversas líneas desaparecieron luego de un tratamiento por estrés de calor. Los efectos de hormesis sobre la tasa de senescencia demográfica fueron específicos de sexo y consistentemente más altos en las líneas menos longevas que en las líneas más longevas. Los resultados indicaron que la hormesis es una respuesta adaptativa, dado que su magnitud puede aumentar evolutivamente con la sensitividad térmica. Respecto de los QTL de termotolerancia se detectó un QTL de gran efecto sobre la resistencia al coma por calor en la región central (pericentromérica) del cromosoma 2 de Drosophila melanogaster. Los efectos de este QTL fueron mucho mayores en moscas no aclimatadas (resistencia basal) que en moscas aclimatadas (termotolerancia inducida). Este QTL explicó un 18% de la variación en fenotipos de resistencia al coma por calor, y no co-localizó con QTL de tolerancia a la inanición. Este QTL de termotolerancia colocalizó con un QTL del tamaño del ala y con un QTL de la resistencia a la radiación UV en el presente estudio. Se detectaron otros QTL para el tamaño del ala en los tres cromosomas mayores de la especie, que fueron específicos de la temperatura de desarrollo y del sexo. Respecto de los QTL para la asimetría fluctuante (AF), el resultado más interesante fue que ningún QTL para AF fue significativo en temperatura benigna y todos los QTL para AF fueron significativos en condiciones de estrés y parecieron ser específicos de cada sexo. El alelo del QTL que aumenta la tolerancia al calor fue el mismo que el que aumenta la tolerancia a la radiación UV-C, Este resultado es interesante porque indica que la tolerancia al calor y la resistencia a la radiación UV pueden tener QTLs en común. En la naturaleza, ambos caracteres podrían responder a la selección natural a través del mismo QTL, en ambientes con alta temperatura y elevada radiación UV. Por lo tanto, el QTL identificado será de gran interés para futuros análisis sobre termo-tolerancia y radiación ultravioleta, y el estudio presente discute posibles genes candidatos implicados en este QTL.

Abstract:
Drosophila melanogaster is distributed over wide geographic areas, ranging from tropical to temperate regions in most continents. A great number of adaptive stress resistance mechanisms have evolved in this cosmopolitan model organism, and individuals as well as populations depend on sets of basal and inducible traits to adapt to the changing climatic conditions. Resistance to heat stress, starvation and radiation represent ecologically relevant phenotypes of adaptation to environments in the adult stage of the Drosophila life cycle. Thermal stress is known to induce hormesis on longevity in several organisms. Hormesis is a fundamental concept in the evolutionary biology of stress resistance and is widely used to define a dose-response phenomenon on several traits, including longevity. Hormesis on longevity takes place when exposure to a mild stress factor, a mild heat stress for example, either extends the lifespan of an organism, or reduces its senescence or ageing rate. Another form of environmental stress that can affect the distribution, abundance and evolution of organisms is UV radiation. UV radiation levels increase at higher altitudes and latitudes. The present global warming scenario is characterized by a gradual ozone layer deterioration and higher levels of ultraviolet radiation reaching the planet surface. Because life history traits have evolved in an environment where radiation is present, it is of interest to further investigate the genetic architecture of ultraviolet radiation resistance. Another trait of adaptive importance is starvation resistance. This trait is crucial to survival when food resources are scarce. In insect populations periodic starvation is fairly common, and evolution of life history traits may have occurred under environmental conditions that included food shortage. Body size may be related to starvation resistance and is another adaptive trait under the influence of several environmental factors, including temperature, and of great importance for dispersion and resource finding. This trait is greatly influenced by temperature during the embryonary stage of development in D. melanogaster. Using QTL (Quantitative Trait Loci) mapping as a tool and Drosophila melanogaster as model organism, I investigated and identified the arrangement of loci relevant to variation in resistance to high temperature, starvation and UV radiation. Also, in this thesis we used QTL mapping to search for loci relevant for wing size (an index of body size) and fluctuating asymmetry, an indicator of developmental instability, at both benign and high developmental temperatures. Discovered QTL regions contain genes that play a significant role in the adaptive evolution of these traits. In addition, we investigated and identified adaptive patterns for hormesis in longevity in Drosophila buzzatii lines artificially selected for high and low resistance to different forms of thermal stress. Starvation stress tolerance was consistently higher in females than in males. Composite interval mapping revealed a QTL between bands 64D- 66E2 in chromosome 3 in males and none in females. Several candidate genes were identified within said QTL region. QTL for wing size did not co- localize with starvation resistance QTL. Results are discussed regarding the multiple candidate genes and lack of co-localization with QTL previously identified for thermotolerance in recent studies in D. melanogaster. For hormesis analysis, bidirectional selection lines for high (K+) and low (K-) resistance to heat stress were utilized, as were lines selected for high (CCR+) and low (CCR-) resistance to cold stress. Heat stress induced hormesis was significant in K- and CCR- females, whereas no hormetic effect was detected in control, K+ and CCR+ lines. Differences in longevity among the several lines disappeared following a heat stress treatment. The effects of hormesis on the demographic senescence rate were sex-specific and consistently higher in shorter-lived lines than in longer-lived lines. Results indicate that hormesis is an adaptive response, as its magnitude may evolutionarily increase with thermal sensitivity. Regarding thermotolerance, a QTL of great effect for heat-shock resistance was detected in the pericentromeric region of chromosome 2 in Drosophila melanogaster. The effects of this QTL were much higher in non- hardened flies (basal resistance) than in hardened flies (induced thermotolerance). This QTL explained 18% of the variation in heat-shock resistance phenotypes, and did not colocalize with starvation resistance QTL. Additionally, this QTL did colocalize with a QTL for wing size and a QTL for UV radiation resistance in the present study. Other QTL were detected for wing size in the three major chromosomes of the species, these QTL were sex specific and also development-temperature specific. In regards to fluctuating asymmetry (FA), the most interesting result was that all FA QTL were significant under stressful temperature development and seemed to be sex-specific, whereas no significant benign temperature QTL were detected for AF. The QTL allele increasing heat tolerance was the same as the one increasing UV-C radiation tolerance. This is an interesting result because it hints that heat tolerance and UV radiation resistance could have QTL in common. In nature, both traits may respond to natural selection through the same QTL in high-temperature and high-UV radiation level environments. Therefore, the identified QTL is of great interest for future analyses on thermotolerance and ultraviolet radiation, and the present study discusses possible candidate genes implicated in this QTL.

Dellarole, Mariano. "E2, regulador de transcripción y replicación del papilomavirus humano: interacción con ADN, dinámica conformacional y divergencia evolutiva" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Más de 50 tipos de papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelio mucoso causando una variedad de lesiones benignas y malignas. El dominio C-terminal de la proteína E2 de HPV (E2C) discrimina entre cuatro sitios de ADN altamente similares regulando el ciclo de vida del virus vía la activación de la replicación y la activación y/o represión de la transcripción. Con el fin de tratar de entender la naturaleza de la interacción entre E2C y ADN, realizamos un análisis detallado del complejo utilizando herramientas bioinformáticas y el contenido de información en las secuencias proteicas y nucleotídicas y usando técnicas biofísicas, proteínas E2C recombinantes y sitios sintéticos de ADN específicos y no-específicos. Antes de estudiar el rol de la interacción E2C-ADN, nos focalizamos en el proceso de polimerización no-funcional de E2C dado que su desarrollo es reprimido por la presencia de ADN específico. Inducida por temperatura, la polimerización de E2C se desencadena mediante la formación de un núcleo estructurado y finaliza en un paisaje morfológico de oligómeros solubles con propiedades amiloideas. El estudio computacional de la interacción E2-ADN de todos los tipos de HPV mucosos indica que las proteínas E2 de distintos tipos poseen propiedades de discriminación de ADN similares. Las diferencias en la interacción E2-ADN se encuentran principalmente en la secuencia de ADN específico, en acuerdo con el análisis de la unión de E2C a diferentes sitios mediante titulaciones isotérmicas de calorimetría. Basado solamente en la secuencia de ADN, logramos predecir diferencias en la energía de unión las cuales se ordenaron en seis grupos de afinidades discretas. Ciertas jerarquías de afinidades como también distancias entre sitios y presencia de sitios de metilación se encontraron estadísticamente asociados con tipos de HPV propensos a ser malignos. Estudiamos la estabilidad y la propiedad de discriminación de secuencia de cinco proteínas E2C homólogas de identidad de secuencia proteica en el rango 44% al 77%. La desnaturalización al equilibrio y la cinética de desplegado en cloruro de guanidinio mostró que todos los dominios son homodímeros estables que se desnaturalizan vía un mecanismo de dos estados. Medimos la unión a distintos sitios de ADN y confirmamos que el mecanismo de unión para todos los complejos es el mismo en base a una genuina compensación entropico-entálpica. Nuestros resultados muestran que la inusual estructura de barril-beta de E2C puede acomodarse a numerosas mutaciones manteniendo las propiedades cruciales de conformación y función. Pero la unión cooperativa a sitios adyacentes de ADN mostró que los componentes entálpicos-entrópicos de la reacción como la deformación del ADN puede divergir entre distintas homólogas en acuerdo con un fuerte acoplamiento entre la dinámica global de la proteína y el reconocimiento del ADN.

Abstract:
More than 50 Human papillomavirus (HPV) types infect mucosal epithelia causing a variety of benign and malign lesions. The C-terminal domain of HPV E2 protein (E2C) discriminates between four highly similar cognate DNA sites in order to regulate the virus life cycle by activating replication and repressing and/or activating transcription. In order to try to understand the nature of the interaction between E2C and DNA, we performed a detailed analysis of the complex using bioinformatics tools and the information content on DNA sequences and using biophysical techniques and recombinant engineered and homologous E2C proteins and synthesized specific and nonspecific DNA sites. Before studying the role of the E2C-DNA interaction, we focused on the nonfunctional polymerization process of E2C as its development is repressed by the presence of DNA binding sites. Triggered by heat, the polymerization of E2C starts by formation of a stable and structured nucleus and ends in an organized morphology landscape of soluble amyloid-like oligomers. The computational study of the E2-DNA interaction of all mucosal HPV types, indicates that E2 proteins have similar DNA discrimination properties. Differences in E2-DNA interaction among HPV types lie mostly in the target DNA sequence, in agreement with the analysis of binding of E2C to different sites using isothermal titration calorimetry. Based on DNA sequences only, we could predict differences in binding energies which clustered into six discrete affinity hierarchies. Finally, certain distances between sites, affinity hierarchies and their eventual changes upon methylation, are statistically associated with high-risk types. We studied the stability and DNA discrimination properties of five homologous E2C proteins with sequence identities ranging from 45% to 77%. Equilibrium denaturation and unfolding kinetics in guanidinium chloride showed that all five domains are very stable homodimers that unfold via a two-state mechanism. We used isothermal titration calorimetry to follow binding of the five proteins to three different DNA sites. Genuine enthalpy-entropy compensation confirms that the binding mechanism is the same for all complexes. The five domains have nearly identical capacities for DNA sequence discrimination despite the high degree of sequence divergence. Our results show that the unusual E2C beta-barrel can accommodate many mutations while retaining its crucial conformational and functional properties. But cooperative binding to tandem DNA E2 site showed that the enthalpic-entropic components of the reaction and DNA deformation can diverge in agreement with a strong coupling between global dynamics and DNA recognition.

Linero, Florencia N.. "Estrategia de reprogramación traduccional del virus Junín en infecciones in vitro: estudio de las principales vías de regulación del inicio de la traducción" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Dentro de los factores que determinan el éxito de una infección viral la eficiencia en la traducción de las proteínas del virus constituye un factor clave a la hora de definir tanto la citopatogenicidad como la virulencia de estos agentes. Los virus son parásitos intracelulares obligados, por lo cual dependen completamente de la maquinaria traduccional de la célula hospedadora para sintetizar sus proteínas. Esta dependencia los ha llevado a desarrollar distintas estrategias de reprogramación traduccional a fin de asegurar la competencia efectiva de sus mARNs con los mARNs celulares por la maquinaria de traducción. En este trabajo de tesis doctoral se analizó la estrategia de reprogramación traduccional utilizada por el virus Junín (JUNV) para lograr la traducción de sus mARNs. El estudio se centró fundamentalmente en el proceso de inicio de la traducción, evaluándose la participación del complejo eIF (eIF4E, eIF4A y eIF4GI) y del factor eIF2 y la modulación de sus principales mecanismos de regulación. En este trabajo se demostró que JUNV es capaz de traducir las proteínas virales aún en ausencia del factor de unión al cap, eIF4E, a pesar de que sus mRNAs presentan dichas estructuras en sus extremos 5´. Esto fue comprobado mediante el empleo de inhibidores de la vía de PI3K/Akt/mTOR, principal vía regulatoria de la traducción dependiente del cap, observándose que la inhibición de PI3K posterior a la entrada del virus no tuvo efectos significativos en la replicación de JUNV. Estos resultados fueron corroborados mediante el tratamiento con la droga rapamicina, un inhibidor del complejo mTOR/raptor, la cual no afectó la síntesis de antígenos virales. La expresión de una proteína dominante negativa de 4E-BP, proteína reguladora de eIF4E, tampoco afectó la replicación de JUNV, reforzando la idea de que el factor eIF4E no sería necesario en la replicación de JUNV. Asimismo, la inhibición de la vía de PI3K/Akt en un cultivo persistentemente infectado con JUNV tampoco afectó la síntesis de los antígenos virales. Por otro lado, se demostró un bloqueo en la fosforilación de eIF2α ejercido por JUNV. La fosforilación de este factor constituye uno de los principales mecanismos de la respuesta celular antiviral, mediante el cual la célula induce el bloqueo global de la traducción con el fin de impedir la replicación viral. La consecuencia de esta fosforilación es el secuestro de los factores de inicio de la traducción en estructuras citoplasmáticas denominadas gránulos de estrés (SGs). Los resultados obtenidos demostraron que el bloqueo en la fosforilación de eIF2α inducido por JUNV inhibe la formación de SGs cuando las células infectadas son tratadas con un inductor de estrés oxidativo. Este impedimento sería mediado fundamentalmente por la expresión de los antígenos virales N y GPC y tendría por finalidad mantener activo al factor eIF2 como así también asegurar el acceso a los factores de inicio de la traducción, que de otra manera podrían quedar secuestrados en los SGs. Esta modulación de la respuesta a la estrés celular no fue observada en los cultivos persistentemente infectados con JUNV, indicando que la ausencia de expresión de G1 y probablemente los bajos niveles de la proteína N en su forma completa serían responsables de que estos cultivos persistentemente infectados no logren bloquear la respuesta celular al estrés. Por otro lado, se demostró el requerimiento de los factores de inicio de la traducción del complejo eIF: eIF4A y eIF4G, mediante ensayos de silenciamiento y el empleo de inhibidores específicos, indicando una estrategia de traducción alternativa en la cual la participación de eIF4E, integrante canónico de dicho complejo, no sería requerida. Probablemente la participación de una proteína viral en reemplazo del factor de unión al cap eIF4E, favorecería la traducción de los mARNs de JUNV, sin inducir un bloqueo en la síntesis de las proteínas celulares. La interacción de N con los factores eIF4A y eIF4GI, evaluada mediante ensayos de inmunoprecipitación y microscopía confocal, sugiere que esta proteína viral estaría formando parte de los complejos de traducción de los mARNs virales. En función de los resultados expuestos se plantea un modelo de reprogramación traduccional para JUNV en el cual el factor de unión al cap, eIF4E, no sería mayoritariamente requerido para la traducción de los antígenos virales. La actividad de este factor sería reemplazada por la proteína N que mediante su interacción con los factores eIF4A y eIF4GI constituiría los complejos de traducción del virus. Sin embargo, no puede descartarse la participación de eIF4E en la traducción inicial de los mARNs de N, hasta que los niveles de esta proteína puedan competir efectivamente con dicho factor.

Abstract:
Translation efficiency of viral proteins is a key factor in defining both cytopathogenicity and virulence of viruses, which are obligate intracellular parasites and entirely dependent on the cellular translational machinery to synthesize their proteins. This dependence has led them to develop different strategies of translational reprogramming to ensure effective competition of viral mRNAs with cellular mRNAs. In this doctoral thesis the translational reprogramming strategy used by Junin virus (JUNV) to achieve the translation of its mRNAs, was analyzed. The study was focused primarily on the process of translation initiation, to evaluate the involvement of eIF complex (eIF4E, eIF4A and eIF4GI) and the eIF2 factor and the modulation of main regulatory mechanisms. Results suggest that JUNV might be able to translate viral proteins even in the absence of the cap-binding factor, eIF4E, although its mRNAs have cap structures in their 5 'ends. This is supported by the fact that inhibitors of PI3K/Akt/mTOR pathway, the main regulatory pathway of capdependent translation were effective only during virus entry but not on JUNV protein translation. Treatment of infected cells with rapamycin, an mTOR complex/raptor inhibitor and the expression of a dominant negative protein 4E-BP, eIF4E regulatory protein, had no effect on JUNV replication, reinforcing the idea that the eIF4E factor would not be required for JUNV replication. Furthermore, inhibition of PI3K/Akt pathway in a JUNV persistently infected culture did not affect the synthesis of viral antigens. On the other hand, a blockage on the eIF2α phosphorylation exerted by JUNV was observed. Phosphorylation of this factor is one of the main mechanisms of the antiviral cellular response, by which cell induces a global translation blockade to prevent viral replication. The consequence of this phosphorylation is the sequestering of the initiation translation factors in cytoplasmic structures named stress granules (SGs). The results showed that blockage in the phosphorylation of eIF2α induced by JUNV inhibits the formation of SGs when infected cells are treated with an oxidative stress inductor. This blockage would be mediated primarily by the expression of viral antigens N and GPC and would aim to keep eIF2 factor active to ensure virus access to initiation translation factors which might otherwise be sequestered into SGs. This modulation on the cellular stress response was not observed in cultures persistently infected with JUNV, indicating that the absence of expression of G1 and probably low levels of the complete form of N protein would be responsible for these persistently infected cultures inability to block the cellular stress response. Requirement of initiation translation complex eIF: eIF4A and eIF4G has been assessed by ARN interfering assays and the use of specific inhibitors. Results indicate an alternative translation strategy in which the involvement of eIF4E, a canon member of this complex would not be required. Probably, the involvement of a viral protein to replace the cap binding factor eIF4E, would favor the translation of JUNV mRNAs without inducing a blockage in cellular proteins synthesis. N interaction with eIF4A and eIF4GI factors was assessed by immunoprecipitation assays and confocal microscopy suggesting that this viral protein would be part of the translation complex of viral mRNAs. Based on the above results a model for JUNV translational reprogramming is presented. In this model, the cap-binding factor, eIF4E, would be replaced by N protein through its interaction with eIF4A and eIF4GI factors constituting the translation complex for viral proteins. However, it cannot be ruled out the involvement of eIF4E at the initial translation step of N mRNA, until the level of this protein can be high enough to compete effectively with this factor.

Bertoli, Carlos Ignacio. "Exploración de la arquitectura genética para la respuesta al frío y al etanol en el modelo Drosophila: líneas de selección y mapeo de QTL" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las respuestas de los organismos a los distintos factores de estrés han sido objeto de estudio desde hace varias décadas. El interés que despertó esta área de conocimiento ha llevado a tomar diferentes enfoques para abordar un tema sumamente complejo como es la respuesta de un organismo a un factor de estrés. Tanto aspectos fisiológicos, como moleculares y genéticos entre otros aspectos, han sido considerados en estudios recientes para develar como es que los organismos responden a la presencia de un estresor. En esta tesis colaboramos, desde la genética cuantitativa, en la búsqueda de la base genética que permita entender más acabadamente que factores intervienen en la recuperación de un individuo cuando se lo expone al frío, así como cuales son los factores que permiten la recuperación y la tolerancia cuando son expuestos a altas concentraciones de etanol. También se buscan posibles correlaciones genéticas entre la recuperación al frío y otros caracteres de historia de vida así como de resistencia a distintas formas de estrés. Hemos hecho uso de un organismo experimental ampliamente utilizado en el área de la genética, Drosophila melanogaster. Asimismo, algunos experimentos también fueron desarrollados en otra especie del mismo género Drosophila, Drosophila buzzatii, que es una especie cactófila. En primer lugar, desarrollamos, mediante selección artificial, líneas para alta y baja velocidad de recuperación al coma por enfriamiento, ambas en Drosophila buzzatii. Una vez constatada la heredabilidad del caracter y la diferenciación significativa entre los fenotipos de ambas líneas evaluamos la posible correlación de este régimen selectivo con distintos caracteres adaptativos, como ser el tiempo de desarrollo, resistencia al golpe de calor, tamaño corporal, resistencia a la inanición, resistencia a los vapores de etanol. También desarrollamos un programa que permite mejorar la eficiencia y precisión de la medición. En segundo lugar, realizamos, mediante la utilización de líneas RIL (líneas recombinantes endocriadas) de Drosophila melanogaster pertenecientes al laboratorio GERES, un mapeo genético para localizar la posible existencia de QTL (loci de caracter cuantitativo) vinculados con las diferencias fenotípicas para la recuperación al frío presentes en las líneas RIL antes mencionadas. En tercer lugar, utilizando estas mismas líneas de Drosophila melanogaster se 4 mapearon tres caracteres vinculados a la respuesta a la exposición al etanol (recuperación y tolerancia en adultos y supervivencia en larvas). Por último, se comparan los resultados obtenidos en los mapeos para la recuperación al frío con los obtenidos en la respuesta al etanol. Si bien se pudo constatar que en Drosophila buzzatii la heredabilidad de la recuperación al coma por enfriamiento es significativa en un régimen selectivo de múltiples generaciones, no se pudo establecer correlaciones genéticas entre este régimen y otros caracteres medidos (tamaño corporal, tiempo de desarrollo, resistencia al calor o resistencia a la inanición). El único caracter que mostró una correlación con el régimen selectivo fue la tolerancia a la exposición al etanol. El mapeo de QTL para la recuperación al frío permitió identificar 3 QTL para los cuales fue posible detectar algunos genes candidatos. Algunos de estos QTL solapan con QTL identificados por otros autores para el mismo caracter de resistencia al frío así como también para otros caracteres de resistencia al calor. Para el caso del mapeo de QTL para la exposición al etanol se encontraron 13 QTL, muchos de estos específicos según el caracter analizado. La superposición de los QTL correspondientes a la respuesta al etanol con los QTL encontrados para la recuperación al frío fue casi nula, así como la superposición entre los mismos caracteres vinculados a la respuesta al etanol. En conjunto, los resultados indican que la arquitectura genética es diferente entre la resistencia al frío y los caracteres mapeados de tolerancia al etanol en el modelo Drosophila. Debido a esto es que podemos decir que la correlación detectada en Drosophila buzzatii parece ser dependiente de la población, lo que nos lleva a plantear que los vínculos entre la respuesta al frío y la respuesta al etanol son débiles y dependientes de la población en estudio.

Abstract:
The responses of organisms to diferent stress factors have been studied for several decades. The interest in this topic has been illustrated from different approaches to address a very complex issue, which is the response of an organism to a stressor. Both physiological and molecular mechanisms, as well as the genetic variation among other issues, have been considered in recent studies to reveal how the organisms respond to the presence of a stressor. In this thesis a quantitative genetic approach is followed to search for the genetic basis of stress resistance to test for factors that are potentially involved in the recovery of an individual when it is exposed to cold stress, and what is the genetic basis for recovery and stress tolerance when exposed to high concentrations of ethanol. This work also test for possible correlations between chill- coma recovery and other adaptive characters, including some life history traits as well as other traits of stress resistance. We made use of an experimental organism widely used in the area of genetics, Drosophila melanogaster. Likewise, another species of the same genus Drosophila is used in other experiments, the cactophilic species Drosophila buzzatii. Firstly, artificial selection was applied to select for both increased and reduced times of chill-coma recovery in Drosophila buzzatii. After constructing divergent lines for chill-coma recovery by artificial selection in D. buzzatii, the possible genetic correlations were tested between this trait and other adaptive traits such as development time, resistance to heat stroke, body size, starvation resistance, resistance to ethanol vapors. I also developed a program that improves the efficiency and precision of measurement. Second, recombinant inbred lines (RIL) of Drosophila melanogaster were used to identify QTL (quantitative trait loci) for chill-coma recovery. Third, the same RIL were used to also map traits of tolerance to ethanol in adults and larvae. Finally, the results are compared between traits of cold and ethanol tolerance. After applying artificial selection for chill-coma recovery in Drosophila buzzatii, replicated lines obtained were divergent for this trait indicating the the trait is heritable. These divergent lines were used to test for any possible genetic correlations between chill-coma recovery and other adaptive traits such as body size, development 6 time, heat-stress resistance and starvation resistance. In these experiments with D. buzzatii, the only character that showed a correlation with selective regime for chill- coma recovery was tolerance to ethanol. QTL mapping for the chill-coma recovery allowed to reveal the presence of 3 QTL where some candidate genes are allocated. Some QTL for chill-coma recover overlapped with QTL with QTL regions detected in previous studies with other mapping populations for both chill-coma recovery and heat-stress resistance. In the case of the QTL mapping for ethanol resistance traits, a total of 13 QTL were identified. There was no consistent overlapping between QTL for chill-coma recovery and QTL for ethanol tolerace. Overall, the results indicate that the genetic architecture of the mapped traits is different between chill-coma recovery and ethanol resistance in the Drosophila model. Because of this we can say is that the correlation detected in Drosophila buzzatii seems to be dependent on the population, which leads us to propose that the ties between the response to cold and response to ethanol are weak and dependent on the study population.

Larramendy, Celia. "Efectos y adaptaciones inducidos por el tratamiento prolongado con agonistas dopaminérgicos en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Levodopa y pramipexol son drogas de uso frecuente en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Levodopa es el fármaco más efectivo para aliviar las deficiencias motoras pero en la mayoría de los casos induce disquinesias (movimientos involuntarios anormales). Pramipexol ha sido relacionado con efectos neuroprotectores y con una menor inducción de disquinesias. Sin embargo, su eficacia disminuye a medida que progresa la enfermedad. Con el objetivo de analizar si estas diferencias se reflejan a nivel de la expresión de genes, inyectamos ratas con 6-hidroxidopamina en el estriado y caracterizamos un modelo de lesión moderada de la vía nigroestriatal. Luego de la cirugía los animales fueron tratados con levodopa o pramipexol, en dosis que produjeron un beneficio terapéutico similar, determinado como la disminución de la aquinesia, inducida por la lesión, de la pata delantera contralateral al hemisferio lesionado. Un grupo control recibió vehículo. Mediante la tecnología de microarreglos de ADN analizamos 3 tandas independientes de animales a fin de comparar los cambios en la expresión de genes inducidos por los tratamientos de los grupos: normal/vehículo, lesionado/vehículo, lesionado/levodopa, y lesionado/pramipexol. Encontramos que el tratamiento crónico con levodopa y pramipexol indujo cambios en la expresión de numerosos genes, demostrando que, además de las diferencias observadas en el perfil farmacológico y en los efectos clínicos (tanto anti-parkinsonianos como adversos), estas drogas también inducen importantes diferencias a nivel de la expresión génica. La exploración de los genes expresados diferencialmente permitió elaborar nuevas hipótesis, siendo éste el valor principal del análisis masivo de genes.

Abstract:
Levodopa and pramipexole are frequently used drugs in the treatment of Parkinson's disease. Levodopa is the most effective to alleviate motor disability but induces abnormal involuntary movements (dyskinesias). Pramipexole have been proposed to have neuroprotective effects and less induction of dyskinesias. In order to evaluate possible differences at the gene expression level, rats were injected with 6- hydroxydopamine in the striatum and a partial nigrostriatal lesion model was characterized. After surgery, animals were treated with levodopa or pramipexole at doses that produced similar therapeutic benefit, evaluated by the reversal of akinesia, induced by the lesion, of the forepaw contralateral to the lesioned hemisphere. A control group received vehicle alone. We analyzed 3 independent groups of normal and lesioned rats by DNA microarray technology in order to compare the genetic profile of the groups: normal/vehicle, lesioned/vehicle, lesioned/levodopa, and lesioned/pramipexole. We have found that cronic treatment with levodopa and pramipexole induced changes in gene expression. We have demostrated that besides the differences seen in the pharmacological profile and the clinic effects (antiparkinsonian and colateral effects) of levodopa and pramipexole, these drugs also have important differences at the gene expression level. The analysis of differentially expressed genes induced by these drugs allowed us to elaborate new hypothesis, being the most valuable result of massive gene analysis.

Lipovsek, María Marcela. "Consecuencias funcionales de la evolución adaptativa del receptor nicotínico alfa 9 alfa 10" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) α9α10 media la inhibición eferente de las células ciliadas del oído interno en vertebrados. La inhibición es el resultado de la entrada de Ca2+ a través del nAChR, que activa una corriente de K+ dependiente de Ca2+. El análisis de secuencias utilizando modelos de máxima probabilidad basados en codones mostró evidencias de selección positiva en el gen CHRNA10, codificante para la subunidad α10, en el linaje de mamíferos (Franchini y Elgoyhen, 2006). Proponemos que, como resultado de sustituciones no-sinónimas, los receptores α9α10 de mamíferos y no-mamíferos presentarían propiedades funcionales diferentes. Para poner a prueba esta hipótesis, estudiamos receptores recombinantes α9α10 de un mamífero (Rattus novergicus), un ave (Gallus gallus) y un anfibio (Xenopus tropicalis) expresados en oocitos de Xenopus laevis. Encontramos que los cambios ocurridos a lo largo de la evolución alteraron dramáticamente las propiedades de los receptores. A diferencia de la subunidad de rata, la subunidad α10 de pollo fue capaz de conformar receptores funcionales. Sorprendentemente, la permeabilidad al calcio del receptor α9α10 de pollo resultó significativamente menor que la del receptor de rata. Además, cambios en la subunidad α9 (y no la α10) resultaron responsables de las diferencias descriptas en la permeabilidad al Ca2+. El análisis de secuencias de los genes codificantes para todas las subunidades nicotínicas mostró que únicamente la subunidad α10 se encuentra bajo selección positiva en el linaje de mamíferos. Los resultados presentados demuestran una historia evolutiva diferente para los receptores α9α10 de mamíferos y no-mamíferos, con consecuencias funcionales de notable importancia para el funcionamiento del sistema eferente olivococlear.

Abstract:
The α9α10 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) mediates efferent inhibition of cochlear hair cells in vertebrates. This inhibition results from a Ca2+-dependent K+ current activated by Ca2+ entry through α9α10 nAChRs. Sequence analysis using codonbased maximum likelihood models showed evidence of positive selection in the CHRNA10 gene within the mammalian lineage (Franchini and Elgoyhen, 2006). We propose that, as a result of non-synonymous substitutions, mammalian and nonmammalian α9α10 nAChRs should present differential functional properties. To test this hypothesis, we studied recombinant mammalian (Rattus novergicus), avian (Gallus gallus) and amphibian (Xenopus tropicalis) α9α10 nAChRs expressed in Xenopus laevis oocytes. We found that these evolution-driven modifications dramatically changed the receptor’s properties. Unlike rat, chicken α10 subunits formed a functional receptor. Strikingly, the Ca2+ permeability of the avian α9α10 nAChR was substantially lower than that of its mammalian counterpart. Moreover, changes in the α9 subunit (and not α10) were responsible for the encountered differences in Ca2+ permeability. Sequence analysis of the genes coding for all the nAChR subunits showed that only the α10 subunit was under positive selection within the mammalian lineage. These results indicate a different evolutionary history of mammalian versus non-mammalian α9α10 nAChRs, with important functional implications for the operation of the efferent system in each species.

Carabajal Paladino, Leonela Z.. "Genética y citogenética de la determinación del sexo en Diachasmimorpha longicaudata (Hymenoptera, Braconidae)" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El parasitoide bracónido Diachasmimorpha longicaudata es ampliamente utilizado como controlador biológico de moscas de los frutos; sin embargo, es escaso el conocimiento disponible sobre su genética. A fin de aportar información y mejorar su cría masiva, se estudió su sistema de determinación del sexo mediante la realización de cruzamientos de alta y baja endogamia, utilizando herramientas de citogenética para determinar el nivel de ploidía de la descendencia. Asimismo, se analizó su espermatogénesis y su cariotipo en detalle, realizando aportes a la Teoría de Interacción Mínima, desarrollada para el estudio de la evolución del cariotipo en Hymenoptera. En este parasitoide el sexo se determina por haplodiploidía (machos haploides, hembras diploides), pero en condiciones de alta endogamia ocurre un sesgo significativo de la proporción de sexos hacia machos, debido a la generación de machos diploides. El sexo estaría determinado por el estado de un promedio de tres loci no ligados. Los individuos homocigotas para los loci sexuales se desarrollan en machos diploides. Esta información permitirá mejorar los protocolos de cría masiva de la especie, tratando de minimizar el nivel de endogamia a fin de evitar un incremento en la producción de machos. El estudio citogenético permitió corroborar el número cromosómico descripto previamente. Se analizó la cantidad, composición y distribución de la heterocromatina constitutiva, se mapearon los “clusters” de genes ribosomales y se determinó la cantidad de “clusters” activos. La información obtenida permitió aportar más evidencias a favor de la Teoría de Interacción Mínima.

Abstract:
Diachasmimorpha longicaudata is a braconid parasitoid widely used as biological control agent against fruit flies. In spite of its importance, little is known about its genetics. Different aspects were studied in order to provide more information and to optimize its massive production. Its sex determination system was analyzed using inbred and outbred crosses, and cytogenetic tools to analyze the ploidy level of the descendants. Also its spermatogenesis and karyotype were analyzed in detail, contributing to the Minimum Interaction Theory proposed for the study of karyotype evolution in Hymenoptera. Sex is determined by haplodiploidy (males are haploid, females are diploid), but under inbreeding a significant bias towards male progeny is observed due to the generation of diploid males. Sex is presumably determined by a mean of three independent loci. Homozigotes for the sex loci develop into diploid males. In order to avoid an increment in male production, this information would be useful to improve the protocols of massive production of this species, regarding to minimizing the inbreeding levels. The cytogenetic study allowed the corroboration of the chromosome number of the species. The amount, composition and distribution of constitutive heterochromatin were analyzed. The ribosomal gene clusters were located and the quantity of active sites was determined. The obtained information gave more evidence in favor of the Minimum Interaction Theory.

Santa María, Cristóbal Raúl. "Aplicaciones de data mining al estudio de la biodiversidad en relevamientos metagenómicos" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El trabajo aquí presentado trata acerca de las mediciones de biodiversidad en comunidades microbianas que suelen involucrar dos aspectos: la riqueza y la distribución de los taxones. Una metodología usual para estudiar esas comunidades comprende la utilización de genes marcadores, tal como el que codifica para el rRNA 16S. Se presenta un estado del arte referido a las técnicas de procesamiento computacional que son empleadas, en esos análisis, sobre las secuencias de ADN del gen marcador. También se reseñan las formas de estimación estadística de la diversidad más comúnmente usadas. Se evalúan y detallan las limitaciones que surgen de la aplicación de esos métodos, que comprenden procedimientos habituales en explotación de datos afectados, en este caso, por la presencia de taxones dominantes y de otros que resultan raros aunque no menos importantes desde el punto de vista del análisis del ecosistema. Se proponen alternativas de estimación por simulación para el descubrimiento del conocimiento sobre cantidad de taxones y distribución de los mismos. Los estimadores desarrollados procuran describir las características de la comunidad hallando un patrón distintivo a partir de los datos. En particular se utiliza una idea de Alan Turing acerca de la probabilidad de selección de una especie aun no contabilizada, para construir un Algoritmo de Recuento de Especies (ARE) que expande la muestra original poniendo en evidencia la distribución real y la riqueza. Se emplea también la idea de cobertura muestral para proponer distintas correcciones a este procedimiento y se construye un algoritmo de estimación que combina el uso de ambos estimadores con el de la entropía, que mide la cantidad de información muestral. Los resultados de las pruebas realizadas muestran el desempeño más eficiente de los algoritmos construidos respecto de las mediciones por estimación no paramétrica o por rarefacción, las que a menudo subestiman los valores de riqueza de la población microbiana.

Lavagnino, Nicolás José. "Evolución de la arquitectura genética del comportamiento olfativo en Drosophila" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Comprender la arquitectura genética de caracteres ecológicamente relevantes requiere de la contribución de diversas disciplinas dentro de la biología, ya que es necesario conocer numerosos factores involucrados en la expresión de la misma. Por otro lado, es también una oportunidad de poner a prueba hipótesis sobre la evolución de los organismos. Por la tanto, este tipo de análisis debe realizarse en un marco multidisciplinario y el organismo modelo Drosophila melanogaster es ideal para tal propósito. En el presente trabajo se han estudiado diferentes aspectos de la arquitectura genética del comportamiento olfativo en D. melanogaster. En particular, a) se identificaron genes candidatos a participar en el comportamiento olfativo larval, de los cuales algunos son exclusivos de larva y otros también participan en la arquitectura genética del olfato adulto; b) se describieron las propiedades de variación de la arquitectura genética del carácter en larvas y moscas adultas derivadas de poblaciones naturales de Argentina; c) basándose en resultados obtenidos en diferentes niveles de análisis se demostró que la interacción genotipo por ambiente es una parte importante de la arquitectura genética del comportamiento olfativo larval y adulto; d) se encontró que las diferencias en la arquitectura genética del olfato entre estadios del ciclo de vida repercute en que en que la canalización y la presencia de variabilidad genética críptica son más importantes en adulto que en larva y e) se analizaron las fuerzas evolutivas que actúan sobre los genes olfativos en 6 especies pertenecientes al grupo de especie D. melanogaster, lo que permitió determinar que la selección purificadora es el proceso que afecta a las tasas de sustituciones nucleotídicas en la mayoría de los genes olfativos y por el contrario la selección positiva tiene poca incidencia, también que las tasas de evolución de los genes olfativos dependen de la posición que ocupan en el sistema olfativo en la mayoría de las especies analizadas.

Abstract:
Understanding the genetic architecture of ecologically relevant phenotypic traits requires the contribution of several disciplines within biology, because numerous factors involved in its expression must be analysed. In addition, it is also an opportunity to test hypotheses regarding organisms’ evolution. Therefore, this kind of analysis must be done in a multidisciplinary fashion and using a model organism as Drosophila melanogaster is pertinent for this purpose. In the present thesis, we analyzed different aspects of the genetic architecture of olfactory behavior in D. melanogaster. Particularly, a) we identified candidates genes to participate in D. melanogaster larval olfactory behavior, some of which are larva exclusive and others participate also in adult olfaction; b) variational properties of olfactory behavior genetic architecture were described, both for larva and adult wild-derived flies from natural populations of Argentina; c) based on results from different levels of analysis it was demonstrated that genotype by environment interaction its an important aspect of olfactory behavior genetic architecture in larva and adult; d) it was found that differences in olfactory behavior genetic architecture between life cycle stages has an impact on canalization and cryptic genetic variability being more important in adult than in larva; and e) evolutionary forces acting on olfactory genes were analysed for 6 species belonging to the D. melanogaster species group, which allowed to determine that purifying selection is the process affecting most genes and instead positive selection has a limited incidence; also in most species analyzed a relationship between evolutionary rates and the position that the gene products occupy in the olfactory system was found. In conclusion, our results point out that the genetic architecture of olfactory behavior is complex, changes along ontogenetic stages and it’s influenced by the environment.

Bruno, Gabriela Alejandra. "Aportes al conocimiento del Aullador Negro y Dorado (Alouatta caraya): un análisis de historia de vida fuera de su distribución natural" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los monos aulladores son primates neotropicales ampliamente distribuidos en el continente americano, en territorios forestales desde los 18° N, en el estado mexicano de Veracruz y 20° N en la península de Yucatán, México, hasta los 21° S en la provincia de Corrientes, Argentina. De estas especies dos llegan en su distribución geográfica natural a la Argentina: Alouatta caraya y Alouatta fusca clamitans. Alouatta caraya con una amplia distribución en Sudamérica, es adaptable a distintos tipos de hábitat naturales. Si bien su aclimatación a las condiciones de cautiverio no es sencilla, paradójicamente responde satisfactoriamente, a las variables longevidad y reproducción, en condiciones ambientales fuera de su área de distribución natural. En este Trabajo de Tesis, se analizaron indicadores demográficos, genéticos y eto-ecológicos, (basados en patrón de actividad, alimentación y conducta social) que puedan tener efecto sobre el ajuste de los ejemplares a las condiciones de ambientes antropogénicos fuera del área geográfica de distribución del taxón. Los indicadores anteriormente mencionados se analizaron en grupos de Alouatta caraya que provienen del mascotismo y en un paraje cercano a La Cumbre, Córdoba. Los hallazgos obtenidos avalarían el desarrollo de un proceso de rehabilitación en los ejemplares analizados ya que los mismos han podido sobrevivir exitosamente, aclimatándose a los bosques exóticos y expresando un repertorio de conductas especie-específicas.

Abstract:
Howler monkeys are widely distributed neotropical primates in the Americas, ranging from forest lands 18 ° N in the Mexican state of Veracruz, and 20 ° N on the peninsula Yucatan, to 21 ° S in the province of Corrientes, Argentina. Two species reach Argentina in their natural geographic distribution: Alouatta caraya and A. guariba clamitans. Alouatta caraya has a wide distribution in South America, being adaptable to different types of habitats. While its acclimatization to captivity conditions is not easy, paradoxically the species responds satisfactorily, with respect to longevity and reproductive variables, to different environmental conditions outside their natural geographic distribution. In this dissertation we analyzed demographic, genetic and ecological variables (based on activity pattern, feeding and social behavior) that could have an effect on the adjustment of the individuals to the conditions found in anthropogenic forest environments outside the geographic distribution of the taxon. The above indicators were analyzed in groups of Alouatta caraya rescued from pet trade, living in a man-modified forest environment near La Cumbre, Cordoba. The evaluation of these indicators suggested an adaptive response corresponding to the one expected for the species in its natural habitat. These findings would support a process of rehabilitation of the studied individuals since they could successfully survive and, acclimated to exotic forests, expressing a repertoire of species-specific behaviors.

Gil Cardeza, María Lourdes. "Esferoides como modelo predictivo de respuesta tumoral a la terapia génica : Estudio de los efectos de la transferencia génica no viral del sistema gen suicida y del gen de interferón-beta en esferoides derivados de melanoma espontáneo canino" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los esferoides constituyen un modelo experimental que se asemeja más al comportamiento de los tumores in vivo que sus respectivas monocapas. Por lo tanto su estudio e implementación en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para combatir el cáncer es de suma importancia. En el presente estudio demostramos que la respuesta a la transferencia no viral del sistema gen suicida HSVtk/GCV de esferoides formados a partir de líneas celulares derivadas de tumores de melanoma espontáneo canino correlaciona mejor con la respuesta de los pacientes que sus respectivas monocapas. También observamos que la resistencia multicelular (MCR) al sistema HSVtk/GCV presente en los esferoides probablemente se deba a una rápida repoblación de las células resistentes al tratamiento en esta configuración espacial. La gran cantidad de líneas cuyos esferoides resultaron ser sensibles al sistema HSVtk/GCV y/o a la transferencia no viral del gen cIFN-β (80% sobre un total de 15 líneas) y el mantenimiento de la sensibilidad al ser co-transferidos demuestran la gran potencialidad terapéutica de la co-administración de ambos genes. Como alternativa a la electroporación, encontramos una forma menos agresiva de aumentar la penetración intracelular de bleomicina: la lipofección. Encontramos que el sistema lipoplexes/bleomicina es altamente efectivo pues la presencia de los lipoplexes sensibiliza a las células al efecto citotóxico de la bleomicina, posiblemente estimulando el ingreso de la droga a las células mediante un transporte activo.

Abstract:
Spheroids are an experimental model in vitro that resembles more accurately the tumor behavior observed in vivo than monolayers. So the study and implementation of spheroids in the development of new therapeutic strategies to fight cancer is very important. At the present study we demonstrated that the response to the non viral gene transfer of the suicide gene system HSVtk/GCV on spheroids derived from spontaneous canine melanoma tumors better correlates to the patient’s response than their monolayers counterparts. We also observed that the multicellular resistance (MCR) to the HSVtk/GCV system when cells are cultured as spheroids is probably due to a rapid re-population of the cells that were resistant to the therapy. The high amount of spheroids which were sensitive to the HSVtk/GCV system and/or to the non viral transfer of the cIFN-β gene (80% over a total of 15) together with the maintenance of the sensitivity when the genes were co-transferred, demonstrates the high therapeutic potentiality of the coadministration of both genes. We then studied the sensitivity to the lipoplexes/bleomycin system. We found that the new therapeutic strategy is highly effective since the lipoplexes sensitizes the cells to the citotoxic effect of bleomycin, presumably by stimulating an active incorporation of the drug inside the cells.

Di Santo, Mariana Carolina. "Caracterización de genes codificantes de glicosidasas de pared celular relacionadas al crecimiento y a la maduración de prunoideas" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La arabinosa es el prinicipal azúcar neutro no celulósico de la pared celular de durazno (Prunus persica (L.) Batsch) y de ciruela japonesa (Prunus salicina Lindl), observándose una pérdida neta de arabinosa tanto durante la maduración y el ablandamiento como en etapas previas a dicho proceso. Las α-L-arabinofuranosidasas y α-L-arabinofuranosidasas/β-D-xilosidasas son enzimas responsables de estas modificaciones en la pared celular de Prunus persica (L.) Batsch y de Prunus salicina Lindl. Se obtuvieron clones completos de ADNc desconocidos de durazno (PpARF1) y de ciruela japonesa (PsARF/XYL). Además, el gen PsARF/XYL fue clonado y secuenciado. PsARF/XYL presentó dos variantes de ARNm maduro, uno completamente spliceado y otro con un intrón terminal retenido, probablemente debido a splicing alternativo. La proteína deducida a partir de este último, resulta en un péptido truncado en su porción carboxi-terminal que podría alterar su funcionalidad pero que no implica la pérdida de los aminoácidos del sitio activo. También se obtuvieron secuencias parciales de un gen de ciruelo japonés denominado PsARF1 (por su homología con PpARF1) el cual fue incluido en los análisis de expresión génica. Reacciones de RT-PCR para el gen PsARF/XYL en distintas fases de la ontogenia y maduración del fruto reveló una expresión diferencial de los dos transcriptos alternativamente spliceados. Aunque PsARF1 se expresa durante el climaterio, se inhibe fuertemente ante tratamientos con etileno. En todos los casos analizados, los transcriptos se detectaron en otros tejidos de la planta, tanto vegetativos como reproductivos. Los resultados sugieren fuertemente que la expresión de estos genes de pared celular se encuentra regulada a nivel transcripcional y post-transcripcional en distintos tejidos y estados de desarrollo y que el etileno, hormona de la maduración en frutos climatéricos, podría participar en esa regulación.

Abstract:
Arabinose es the major non-cellulosic neutral sugar in the peach (Prunus persica (L.) Batsch) and japanese plum (Prunus salicina Lindl) cell wall and a net loss of arabinose residues accurs during ripening and softening and even in stages prior to this process. The α-L-arabinofuranosidases and α-L-arabinofuranosidase/β-D-xylosidases are enzymes responsible for these changes in the cell wall. In this work we characterized genes encoding cell wall glycosidases of Prunus persica (L.) Batsch and Prunus salicina Lindl. We obtained unknown full cDNA clones of peach (PpARF1) and Japanese plum (PsARF1/XYL). In addition, the gene PsARF/XYL was cloned and sequenced. PsARF/XYL presented two variants of the mRNA, a completely spliced and another terminal intron retained probably due to alternative splicing. The protein deduced from the latter, resulting in a truncated peptide at its carboxy-terminal portion tha could affect their functionality but that does not involve the loss of active site amino acids. Partial sequences of a gene called PsARF1 of Japanese plum (given its homology with PpARF1) were also obtained, which was included in the analysis of gene expression. PpARF1 expression was detected in mesocarp throughout development and ripening stages showed a differential expression of two alternatively spliced transcripts. Although PsARF1 is expressed during the climateric stage, it is strongly inhibited when ethylene treatment is applied. In all cases analyzed , transcripts were detected in other vegetative and reproductive tissues. The expression of both PsARF/XYL transcripts was detected in flower organs, roots and leaves. Results strongly suggest that the expression of these cell wall genes is regulated at the transcriptional and postranscriptional level in different tissues and developmental stages and that ethylene, the ripening hormone in climateric fruit, could be involved in the regulation of these enzymes.

Steinberg, Eliana Ruth. "Determinación sexual en primates neotropicales: el caso de los monos aulladores" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Cariosistemática permite comparar taxa relacionados, en particular especies. Una variable de análisis con valor diagnóstico es el tipo de sistema de determinación sexual. En este Trabajo de Tesis se analizaron monos aulladores del género Alouatta con sistemas de determinación sexual múltiple resultado de translocaciones Y-autosoma. Se los comparó con otros 3 Ceboidea (Cebus, Saimiri y Aotus) y con dos Hominoidea (Pan troglodytes y Homo sapiens) ante la diversidad de patrones de determinación sexual, en particular en machos. Se realizó la primera caracterización del cariotipo de Alouatta pigra que mostró 2N=58, X_1X_1X_2X_2 / X_1X_2Y_1Y_2. Se estudió conservación genómica por FISH con las sintenias 3/15 y 3/21 evidenciando que estas asociaciones no estarían conservadas en las especies mesoamericanas A. pigra y A. palliata. Este estudio junto al de homeologías cromosómicas, mostró que los autosomas involucrados en las translocaciones que darían origen a los multivalentes sexuales en las especies sudamericanas y mesoamericanas serían distintos. En el marco conceptual de “Evidencia Total”, el análisis combinado de variables moleculares y cromosómicas resolvió las relaciones de parentesco entre las especies de aulladores de ambos orígenes americanos, demostrando su utilidad en el esclarecimiento de controversias que relacionan la Taxonomía y la Evolución de los primates ceboideos.

Abstract:
Karyosystematics allows for comparison of related taxa, particularly species. The sex determination system constitutes a variable with diagnostic value. In this dissertation howler monkeys, genus Alouatta, with multiple sex determination systems product of Y-autosome translocations, were analized. In light of the diversity of sex determination patterns observed, particularly in males, they were compared with other 3 Ceboidea (Cebus, Saimiri and Aotus) and with 2 Hominoidea (Pan troglodytes and Homo sapiens). The first cytogenetic characterization of Alouatta pigra karyotype X_1X_1X_2X_2/X_1X_2Y_1Y_2. Genomic was performed, exhibiting a 2N=58, conservation was studied by FISH analizing the syntenies 3/15 and 3/21, showing that these asociations are not conserved in the mesoamerican howlers, A. pigra y A. palliata. This analysis, together with the chromosomal homologies, demonstrated that the autosomal pairs involved in the translocations that originate the sexual multivalents are different in the southamerican and mesoamerican species. Under the framework of the “Total Evidence” concept, the combined análisis of molecular and chromosomal variables resolved the phylogenetic relationships between the howler species of both american origins, demonstrating its utility to clarify the controversies related to the Taxonomy and Evolution of Ceboidea primates.

Veiga, María Florencia. "Estudios sobre la presencia y expresión de cadherina epitelial en gametas humanas y murinas. Evidencias sobre su participación en el proceso de la fecundación" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La fecundación involucra eventos de adhesión celular ovocitoespermatozoide dependientes de Ca2+. Cadherina epitelial (cadE) es una glicoproteína de membrana de 120 KDa, con 5 dominios extracelulares, 1 transmembrana y 1 citoplasmático. CadE se asocia al citoesqueleto de actina a través de moléculas adaptadoras como β-catenina y está involucrada en la adhesión celular dependiente de Ca2+. CadE participa en el desarrollo embrionario, la organogénesis y mantenimiento de tejidos y la tumorigénesis. El objetivo de este proyecto fue evaluar la expresión de cadE en tejidos reproductivos, su presencia y localización en ovocitos y espermatozoides y su participación en la fecundación. Se emplearon 2 modelos: humano y murino. Los estudios describen 1) la expresión del ARNm de cadE en testículo y epidídimo y 2) la presencia de la proteína en extractos de epidídimo y su localización en las células epiteliales 3) la presencia de cadE en estructuras membranosas del plasma seminal humano y del fluido epididimario murino 4) la presencia, formas proteicas y localización de cadE, β-catenina y actina en espermatozoides murinos epididimarios y humanos eyaculados 5) la localización de cadE en espermatozoides capacitados y reaccionados 6) la localización de cadE en ovocitos y formas proteicas en ovocitos murinos 7) la capacidad de anticuerpos bloqueantes de la función adhesiva de cadE de inhibir la interacción espermatozoide-ovocito 8) la evaluación de la presencia de cadE en pacientes en tratamiento por infertilidad e identificación de alteraciones en algunos casos. Este es el primer estudio que aborda de manera exhaustiva la detección de cadE en las gametas humanas y murinas y muestra evidencias de su rol en la fecundación.

Abstract:
Fertilization involves Ca2+ dependent adhesion events between the oocyte and the spermatozoon. Epithelial cadherin (Ecad) is a 120 KDa glycoprotein organized in five extracellular domains, one transmembrane and one cytoplasmic domain. Ecad is linked to the actin cytoskeleton by adaptor molecules, such as β- catenin, and is involved in Ca2+-dependent cell-cell adhesion. Among several functions, Ecad has been shown to participate in embryonic development, organogenesis and maintenance of tissues as well as in tumor progression and metastasis. The aims of this project were to evaluate Ecad expression in reproductive tissues, its presence and localization in oocytes and spermatozoa and its participation in fertilization. Human and murine tissues and gametes were used throughout the study. The studies have shown: 1) expression of Ecad mRNA in the testis and the epididymis 2) presence of the 120 KDa Ecad form in the epididymis mainly localized in the epithelial cells borders 3) immunodetection of Ecad in membranous vesicles isolated from human seminal plasma and murine epididymal fluid 4) presence and localization of Ecad, β-catenin and actin in murine epididymal spermatozoa and in ejaculated human sperm cells 5) a distinctive localization of Ecad in capacitated and acrosome-reacted spermatozoa 6) immunoreactivity towards Ecad in human oocytes and its protein forms in murine oocytes 7) the ability of specific antibodies towards Ecad to inhibit spermoocyte interaction 8) the assessment of Ecad in patients under infertility treatment and the identification of changes in some of them. This is the first report that thoroughly characterizes the expression of Ecad in tissues of the male reproductive tract, as well as in gametes from mice and humans, and shows evidence of its participation in fertilization.

Luaces, Juan Pablo. "Citogenética molecular y reproducción de la tribu Euphractini Winge, 1923 (Dasypodidae, Xenarthra, Mammalia) de Argentina" (2011-12-12) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los armadillos de la tribu Euphractini son un grupo de mamíferos xenartros, que se encuentran clasificados en 5 especies cuya distribución ocurre principalmente en la Argentina (salvo Euphractus sexcinctus). Por su condición filogenética basal en placentados, su biología requiere ser cuidadosamente revisada y estudiada. Se caracterizó citogeneticamente y desde el punto de vista reproductivo a Euphractini, para poder esclarecer posibles mecanismos de aislamiento reproductivo (MAR) acontecidos durante su historia evolutiva: 1). MAR post-cigóticos: mediante la caracterización citogenético-molecular de: 223 ejemplares (131 machos y 92 hembras) de Chaetophractus villosus, 2n=60 y NF=88; 103 ejemplares de Chaetophractus vellerosus, en sus dos distribuciones disyuntas, 2n=62 y NF 88-90 ; 14 ejemplares (4 machos y 10 hembras) de Zaedyus pichiy, 2n=62 y NF=98; y 7 ejemplares (4 machos y 3 hembras) de E. sexcinctus, 2n=58 y NF=106. 2). MAR precigóticos: con el estudio de la morfología del tracto genital masculino en machos de Ch. villosus, y de la fisiología reproductiva, con estudio del ciclo reproductivo en machos de Ch. villosus y en hembras de Ch. villosus y Ch. vellerosus.

Abstract:
The armadillos of the tribe Euphractini are a group of xenarthrous mammals, which divided in five species, are manly distributed in Argentina (except for Euphractus sexcinctus). Due to its basal phylogenetic position within placentals, its biology has to be carefully analysed. Cytogenetic and reproductive characterization of Euphractini were carried out in order to bound reproductive isolation mechanisms (RIM) that occurred during its evolutive history: 1). Post-mating RIM: throughout a molecular cytogenetic study of the group in: 223 individuals (131 males and 92 females) of Chaetophractus villosus, 2n = 60 and NF = 88; 103 individuals of Chaetophractus vellerosus in it two disjunct distributions, 2n = 62 and NF 88 -90 ; 14 individuals (4 males and 10 females) Zaedyus pichiy, 2n = 62; and NF = 98 and 7 specimens (4 males and 3 females) E. sexcinctus, 2n = 58 and NF = 106. 2). Pre-mating RIM: throughout the study of the reproductive morphology, of the male genital tract in Ch. villosus and physiology, with the study of the reproductive cycle in males of Ch. villosus and in females of Ch. villosus and Ch. vellerosus.

Fasanella, Mariana. "Variabilidad genética espacial y ecología molecular en dos especies de roedores del Archipiélago de Tierra del Fuego: Ctenomys magellanicus, especie nativa y Castor canadensis, especie invasora" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En esta tesis, se analizan a nivel molecular dos especies que habitan el Archipiélago de Tierra del Fuego (ATDF): una especie endémica (Ctenomys magellanicus) y una invasora (Castor canadensis). Ctenomys magellanicus se encuentra en estado Vulnerable según la UICN y es la única especie del género Ctenomys que se encuentra en Tierra del Fuego, mientras que el castor es la exótica más importante del ATDF y que genera mayores problemas a nivel ecológico y económico. Utilizando trampas de captura muerta, se capturaron 255 ejemplares de C. canadensis muestreados en todo el ATDF incluyendo Chile y Argentina, mientras que se capturaron 60 ejemplares de C. magellanicus de la zona norte de la Isla Grande de TDF (Argentina) utilizando trampas de captura viva. Utilizando marcadores moleculares (ADNmt y microsatélites), se estudió la variabilidad genética y la estructura genético poblacional de ambas especies. Para esto se subdividió a la población de castor en 5 subpoblaciones y a la de tucos en dos regiones (REGION NORTE y REGION SUR) según la forma cromosómica y dentro de cada una en 2 y 4 subpoblaciones respectivamente. Para C. magellanicus se detectaron 9 haplotipos de ADNmt, 3 exclusivos de la REGION NORTE y 6 exclusivos de la REGION SUR mientras que para castor se encontraron 7 haplotipos distribuidos en casi todas las subpoblaciones. Se encontró una significativa estructuración genética en la población de tucos (tanto con el marcador mitocondrial Φst=0,181 p=0,001 como con el nuclear Fst=0,108 p=0,001) a diferencia de la población de castores, que no presentó estructuración significativa en ambos marcadores moleculares (Φst=0,058 p=0,002; Fst=0,052 p < 0,001). Los resultados del ADNmt y los microsatélites mostraron una alta variabilidad para tucos mientras que para castor la variabilidad fue menor. Por último, en castor, se identificó a la Isla Dawson (subpob E) como una Unidad de Erradicación (UE) mientras que dentro de la Isla Grande, al haber muy baja estructuración poblacional no se pudieron identificar UE. Debido a que en la Isla Grande no existen barreras a la dispersión para los castores, se deberá realizar un control simultáneo en toda la isla para evitar posibles recolonizaciones. Si bien los datos para Ctenomys magellanicus aportan información parcial, se podrían sugerir 5 Unidades de Manejo (UM) basadas en la estructuración genética: 4 UM para la REGION SUR y 1 UM para la REGION NORTE.

Abstract:
In this thesis, we analyze at the molecular level two species that inhabit the Tierra del Fuego Archipelago (TDFA): an endemic (Ctenomys magellanicus) and an invasive species (Castor canadensis). Ctenomys magellanicus is in a Vulnerable state by the UICN and is the only species of the genus Ctenomys found in Tierra del Fuego, while the beaver is the most important exotic in the TDFA and generates the biggest problems at the ecological and economic levels. Using killing traps we capture 255 individuals of C. canadensis sampled throughout the TDFA including Chile and Argentina, while we capture 60 individuals of C. magellanicus from the north of the Isla Grande of TDF (Argentina) live trapping. Using molecular markers (mtDNA and microsatellites), we studied the genetic variability and population genetic structure of both species. For this, beaver population was further divided into 5 sub-populations and C. magellanicus was divided into two regions (NORTH REGION and SOUTH REGION) according to the chromosome form and within each into 2 and 4 sub- populations respectively. For C. magellanicus we detected 9 mitochondrial haplotypes, 3 exclusive from the NORTH REGION and 6 exclusive from SOUTH REGION while for beaver we found 7 haplotypes in almost all sub-populations. There was a significant population genetic structure in tucos (both with mitochondrial marker Φst=0,181 p=0,001 as with nuclear Fst=0,108 p=0,001) as opposed to the beaver population which did not present significant structure in both molecular markers (Φst=0,058 p=0,002; Fst=0,052 p < 0,001). Microsatellite and mtADN results showed a high variability in tucos while in beavers the variability was less. Finally, in beavers, we identified Isla Dawson (Subpop E) as an Eradication Unit (EU) while inside the Isla Grande, we could not identified EUs because of the very low population structure. Since on the Isla Grande there are no barriers to dispersal for beavers, it should be performed a simultaneously control on the island to avoid recolonization. While data on Ctenomys magellanicus provide partial information, we could suggest 5 Management Units (MU) based on the genetic structure: 4 MU for the SOUTH REGION and 1 MU for the NORTH REGION.

Nuñez, Pablo Alfredo. "Estudios genómicos y funcionales en Anaplasma marginale y en bacterias intracelulares de la clase alfa-proteobacteria y su relación con la reducción del genoma" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La subdivisión α- de la clase proteobacteria representa un grupo sumamente diverso y heterogéneo de bacterias con una gran variabilidad en sus características genómicas, biológicas y ecológicas. Dentro de esta subdivisión se encuentra el orden Rickettsiales que ha cobrado gran importancia durante los últimos años por agrupar a diversos patógenos emergentes que resultan relevantes para la salud pública y salud animal. Entre ellos, se destaca Anaplasma marginale, causante de la Anaplasmosis bovina enfermedad transmitida por garrapatas que tiene gran impacto sobre la actividad ganadera en nuestro país. Es importante concentrar esfuerzos en comprender mejor las preguntas: ¿Qué tienen en común y en qué difieren estos organismos en términos de información en el genoma y en su biología? ¿Podemos identificar y explicar las diferencias en sus capacidades de adaptación en términos del contenido génico y la conservación de la estructura y función de determinados mecanismos moleculares? Este trabajo se centra en aspectos inmunológicos, funcionales y evolutivos tomando como modelo a A. marginale y analizando comparativamente organismos relacionados del orden Rickettsiales en el contexto de la clase α-proteobacteria. La caracterización del conjunto de proteínas de membrana externa y de los sistemas de secreción representa un desafío importante por ser los principales blancos de interacción de las bacterias con las células hospedadoras y con las células del sistema inmune. Este estudio permitió la identificación de dos proteínas en A. marginale con capacidad antigénica que fueron capaces de estimular una respuesta inmune específica. Estudios futuros permitirán verificar experimentalmente la localización superficial, como también corroborar su potencialidad como antígenos protectivos en nuevas formulaciones de vacunas racionales. La caracterización del sistema de secreción de proteínas “Twin Arginine translocación pathway (Tat)” aporta nueva información acerca de la funcionalidad del sistema en dos patógenos de gran relevancia: A. marginale y B. abortus. A pesar de que sistema Tat en A. marginale presentan una organización genómica fragmentada, se pudo demostrar la conservación de su funcionalidad en este organismo. Esta organización se opone a la estructura clásica en operon bajo una única secuencia regulatoria característica de la mayoría de los sistemas proteicos multi-componentes. Asimismo, en A. marginale la diferencia de los niveles de abundancia de ARNm de cada uno de los genes correlaciona con los niveles de proteínas descriptos para complejos funcionales, sugiriendo la existencia de una adaptación a mecanismos de regulación alternativos gen-específicos. Las bacterias intracelulares estrictas tendrían un uso limitado del sistema Tat, mientras que organismos de vida libre y bacterias del suelo presentarían un uso moderado a alto. Sin embargo, tanto en A. marginale como en B. abortus el sistema Tat podría estar involucrado en procesos relevantes de adaptación y patogénesis. Los procariotas coordinan la transcripción de genes involucrados en complejos metabólicos o de proteínas mediante la organización de operones. En la actualidad,existen diferentes hipótesis acerca de las fuerzas que rigen estos procesos de organización, tanto para determinar su origen como los mecanismos de mantenimiento de este tipo de estructura. A partir de la fragmentación del operon tat y la adaptación a mecanismos de regulación gen-específicos, como así también de otros casos descriptos recientemente en la literatura, surgió la hipótesis de la existencia de un proceso generalizado de fragmentación de operones en organismos asociados a ambientes intracelulares con genomas reducidos en tamaño. En tal sentido, fue posible comprobar que en las α-proteobacterias de genomas pequeños tanto el número como el largo de los operones era menor en comparación con bacterias de genomas también pequeños pero pertenecientes a otros grupos. Este comportamiento observado en las α-proteobacterias sería compatible con un proceso generalizado de fragmentación. Estos resultados se explicarían teniendo en cuenta que los procesos de reducción genómica se describieron como procesos evolutivos independientes en los diferentes linajes. Del análisis de las diferentes propiedades de los genes presentes en operones en diversos grupos filogenéticos se pudo detectar tanto resultados que reflejan diversidad como patrones consistentes y conservados. La mayor frecuencia de fragmentación supone el incremento de regiones de regulación gen-específicas en genomas de tamaño reducido, y/o en genes bajo escasa presión de selección, como se observa para los genes menos persistentes, de baja expresión y no-esenciales. La aparición de mecanismos de control gen-específico versus un control concertado en operón estaría fuertemente influenciado por los procesos de mutación, selección y deriva. Dada la diversidad de la clase y la complejidad de procesos que afectan y determinan la organización de los cromosomas, el conocimiento acerca de los mismos ayudará a conocer los procesos celulares, moleculares que subyacen a la diversidad. Aspiramos a que los estudios realizados en la tesis aporten al conocimiento general de los organismos del orden Rickettsiales para avanzar en la caracterización de un grupo de bacterias que requiere más atención y estudio como patógenos emergentes de amplia distribución.

Abstract:
The α-proteobacteria class represents an extremely diverse and heterogeneous group of bacteria with a high variability in their genomic, biological and ecological features. The order Rickettsiales has become more important over the last years, since it groups together emerging pathogens that are relevant to human and animal health. Among them, Anaplasma marginale is the etiological agent of bovine Anaplasmosis, an infectious tick-borne disease that highly impacts on livestock farming activity in our country. It is important to focus efforts to better understand the following questions: what do these organisms have in common and in what do they differ, taking into account their genome and biology? Can we identify and explain the differences in their adaptive capacities in terms of genetic content, structure and functionality conservation of molecular mechanisms? This work focus on immunological, functional and evolutionary topics based on A. marginale in comparison with related organisms from the order Rickettsiales in the context of the α-proteobacteria class. The characterization of the set of outer membrane proteins and secretion systems represents a significant challenge, since they are the main targets of interaction of bacteria with host cells and the immune system, and also can be responsible of the export of virulence factors. This study allowed the identification of two novel proteins with antigenic capacities in A. marginale which were able to stimulate a specific immune response. Future studies will allow to verify their surface location, as well as their potential as protective antigens in new vaccine formulations. The characterization of protein secretion system "Twin Arginine translocation pathway (Tat)" provides new information on the functionality of the system in two relevant pathogens: A. marginale and B. abortus. The functionality of the Tat system was demonstrated in A. marginale, irrespective of the genomic and regulatory divergence relative to the classical operon organization under unique regulatory sequence. Difference in the abundance of mRNA levels which correlated with the protein levels described for functional complexes suggests the existence of alternative adaptive mechanisms by gene-specific regulation. Pathogenic intracellular bacteria would have a limited usage of the Tat system, while free-living organisms and soil bacteria could have a moderate to high usage. However, in both pathogens analyzed in this study, the Tat system could be involved in several adaptive or pathogenic mechanisms. Prokaryotes usually coordinate transcription of genes involved in metabolism or protein complexes through the organization of operons. Nowadays, different hypotheses are under discussion about the forces that govern these organizations, both regarding the origin and maintenance of this type of structure. Considering the tat operon fragmentation as well as other cases recently described in the literature, we hypothesized the existence of a more generalized operon fragmentation event in small genome organisms associated with intracellular lifestyles. In this regard, the α- proteobacteria showed less usage and length of operons supporting a generalized fragmentation process, while the opposite pattern was observed in small genomes from other groups. These results could be explained considering that genome reduction events were described as independent evolutionary processes in different lineages.The analysis of the different genes features and phylogenetic groups let us detect abundant diversity as well as consistent and conserved patterns among groups. The highest operon fragmentation frequency involves the increase of gene-regulatory regions in small genomes and/or in operons of genes with lower adaptive value as it is observed for non-persistent, lowly-expressed and non-essential genes. This suggests that gene-specific mechanisms versus operon organization are strongly shaped by mutation, selection and genetic drift. Considering the diversity and complexity of the events that affect the organization of bacterial chromosomes, a better understanding of chromosome organization will help to understand the cellular and molecular mechanisms underlying diversity. We believe this thesis contribute to the overall knowledge of organisms of the Rickettsiales order, making it possible to improve the characterization of a bacterial group that requires more attention and study as emerging pathogens widely distributed.

González, Rodrigo Matías. "Regulación epigenética de la familia de genes Asr en tomate (Solanum lycopersicum)" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En el presente trabajo, se estudió la epigenética asociada al estrés por falta de agua en dos genes de tomate (Asr1 y Asr2), que pertenecen a una familia génica involucrada en la tolerancia a distintos estreses abióticos. Se analizó la región codificante del gen Asr1 en hojas y se detectó la presencia de metilación en todos los contextos: CG, CNG y CNN. Al someter las plantas a estrés hídrico, se observó un ligero aumento de la metilación en contexto CG y una marcada disminución en la metilación asimétrica (CNN). También se detectó, en histonas, una marca represiva de la expresión: H3K27me3, la cual disminuyó como consecuencia del estrés impuesto. Concomitantemente, se registró un marcado aumento en el nivel de transcripto de Asr1. También se analizaron las regiones regulatoria y codificante de Asr2 en raíces. En este sistema, se hallaron elevados niveles de metilación en citosinas en todos los contextos sobre la región regulatoria, registrándose una ligera disminución en la metilación asimétrica como consecuencia del estrés impuesto. En cambio, sobre la región codificante sólo se halló metilación CG, la cual no varió como consecuencia del estrés. Sólo se detectó la marca represiva H3K27me3 sobre una región ubicada 800 pb río arriba del gen, permaneciendo la misma invariable al aplicar el estrés. Estos hallazgos fueron concomitantes con una disminución generalizada de la transcripción, manteniéndose casi constantes los niveles de transcripto de Asr2.

Abstract:
In this work, we studied the epigenetics associated with water stress in two tomato genes (Asr1 and Asr2), belonging to a gene family involved in tolerance to various types of abiotic stress. The Asr1 gene coding region in leaves was analyzed. The presence of methylation in all contexts (CG, CNG and CNN) was detected. When subjecting plants to water stress, a slight increase in methylation in CG context and a marked decrease in asymmetric methylation (CNN) were observed. An expressionrepressive histone mark was also detected: H3K27me3, which decreased as a result of the stress imposed. Concomitantly, a marked increase in the level of Asr1 transcript was registered. The regulatory and coding regions of Asr2 in roots were analyzed as well. In this system, high levels of cytosine methylation in all contexts were found on the regulatory region and a slight decrease in asymmetric methylation due to the stress imposed was recorded. By contrast, on the coding region, only stress-independent CG methylation was found. Only the repressive H3K27me3 mark on a region located 800 bp upstream of the gene was registered, remaining unchanged when the same stress was applied. These findings were concomitant with a general decrease in transcription, remaining the Asr2 transcript levels almost constant.

Astort, Francisco. "Mecanismos involucrados en la inducción del gen de HO-1 en células adrenales. Efecto de ACTH, NO y LPS" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La actividad de HO-1 ha sido asociada a una plétora de efectos biológicos. En particular estudios previos de nuestro grupo de trabajo han demostrado su rol como modulador autócrino/parácrino de la esteroidogénesis en la corteza adrenal de ratas estimuladas con ACTH y LPS , así como su acción citoprotectora como parte del sistema antioxidante adrenal. En el presente trabajo de tesis estudiamos mecanismos de inducción de HO-1 en células adrenales. Los resultados obtenidos confirman que el tratamiento de células Y1 con ACTH induce la transcripción de HO-1. Se localizó una zona del promotor murino de HO-1 de 400 pb aledaña al inicio de la transcripción, donde se encontraron secuencias consenso para la unión de los factores de transcripción CREB y AP-1. Se demostró también la participación de la vía de transducción de señales de AMPc/PKA/CREB y de Akt/PKB en el mecanismo de inducción de HO-1 por ACTH. El LPS incrementó la transcripción de HO-1 por un mecanismo que involucra una zona del promotor de aprox. 516 pb (entre -3216 y -2700). Tras el estímulo con LPS constatamos, además, la activación del factor de transcripción NFκB y la regulación de la expresión de HO-1 por la vía de la PKA. Finalmente, encontramos evidencias que nos permiten afirmar que el NO también induce a la HO-1 incrementando su transcripción, por un mecanismo que involucra la activación del factor de Nrf2, la actividad de PKC, la activación de la GCs y la generación de GMPc. En suma, demostramos que diferentes estímulos son capaces de activar la transcripción de HO-1, en células adrenales Y1, utilizando diferentes mediadores y factores de transcripción. Dado su rol modulatorio en la síntesis de glucocorticoides adrenales además de sus efectos citoprotectores, este conocimiento podría utilizarse para diseñar estrategias dirigidas a inducir HO-1 como un blanco novel alternativo en el tratamiento de patologías que cursan con disfunción adrenal.

Abstract:
HO-1 activity has been involved in a plethora of biological effects. In particular, previous studies from our group have demonstrated an autocrine/paracrine modulatory role in steroidogenesis in the adrenal cortex of the rat under the stimulation of ACTH or LPS . In addition, HO-1 induction was shown to exert a citoprotective effect in these cells . Present studies were designed to analyze different mechanisms of HO-1 induction in adrenal cells. Our results confirm that ACTH treatment of Y1 adrenal cells results in an increase in the transcription of the HO-1 gene. Results showed a 400 bp zone of the murine HO-1 promoter near the initiation of the transcription site housing consensus sequences for the binding of CREB and AP-1. The involvement of the cAMP/PKA/CREB and Akt/PKB transduction pathways in ACTH-induced regulation of the HO-1 gene was also demonstrated. HO-1 transcription was also increased by LPS, and this effect was dependent on the presence of a ~516 bp zone in the murine promoter (between -3216 y -2700 bp). LPS-dependent HO-1 gene induction was mediated by the activation of the NFκB transcription factor. The modulation of this pathway by PKA was also demonstrated. Finally, we also showed that NO also increased HO-1 mRNA expression levels through the activation of Nrf2, PKC, and sGC with the resulting production of cGMP. In summary we demonstrated that different stimuli are able to induce HO-1 in the murine adrenocortical cell line Y1, using several signaling pathways that ultimately activate this enzyme’s gene by means of different transcription factors. Considering its role as a modulator of adrenal glucocorticoid synthesis, in addition to its cytoprotective effects, this knowledge could be used to design strategies aimed at inducing HO-1 as a novel alternative target in the treatment of diseases that presents with adrenal dysfunctions.

Poggio, María Georgina. "Aportes al conocimiento de los cromosomas holocíneticos de Hemiptera: estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El presente trabajo de Tesis Doctoral se basa en el estudio citogenético clásico, molecular y evolutivo de especies de insectos hematófagos y predadores pertenecientes a las familias Cimicidae y Reduviidae del infraorden Cimicomorpha (Hemiptera: Heteroptera), que se caracterizan por presentar cromosomas holocinéticos. Se analizó el complemento cromosómico, el desarrollo meiótico masculino, el contenido, distribución y composición de la heterocromatina y el número y la localización de los genes de ADN ribosomal en las siguientes especies: Acanthocrios furnarii 2n=10A+XY/XX (macho/hembra) y Psitticimex uritui 2n=28A+X1X2Y (macho) (Cimicidae: Haematosiphoninae); Brontostoma colossus 2n=28A+XY (macho) y B. discus 2n=34A+X1X2Y (macho) (Reduviidae: Ectrichodiinae); Microtomus lunifer 2n=26A+2m+X1X2Y (macho) (Reduviidae: Hammacerinae); Apiomerus lanipes 2n=22A+XY (macho), Atrachelus (Atrachelus) cinereus 2n=26A+XY/XX (macho/hembra), Cosmoclopius annulosus 2n=24A+X1X2X3Y/X1X1X2X2X3X3 (macho/hembra), Graptocleptes bicolor 2n=22A+XY/XX (macho/hembra) y Zelus obscuridorsis 2n=16A+XY/XX (macho/hembra) (Reduviidae: Harpactorinae); Zelurus femoralis longispinis 2n=20A+XY/X1X2Y (macho) (Reduviidae: Reduviinae); Rhodnius prolixus 2n=20A+XY/XX (macho/hembra) y Triatoma infestans 2n=20A+XY (macho) (Reduviidae: Triatominae). El análisis citogenético clásico realizado en ejemplares de A. furnarii y P. uritui demuestra que la meiosis masculina en ambas especies es aquiasmática y de tipo collochores , la cual podría ser considerada como una característica citogenética que comparten los miembros de la familia Cimicidae. Sin embargo, A. furnarii y P. uritui poseen un patrón propio de meiosis aquiasmática, en el cual se pueden diferenciar tres regiones en los bivalentes autosómicos: i) regiones terminales que se encuentran en repulsión, ii) región media donde los cromosomas se ubican paralelos pero sin contacto y iii) pequeñas regiones dentro de la región media donde se localizan puntos de unión no quiasmáticos o collochores . La población de A. furnarii analizada previamente por otros autores (2n=32A+XY, macho) difiere de la aquí descripta (2n=10A+XY, macho). Esta notable diferencia en el número diploide de autosomas no puede ser explicada como politipismo; por consiguiente, se concluye que estos dos cariotipos pertenecerían a dos entidades taxonómicas diferentes. Sobre la base de los resultados descriptos en la presente Tesis Doctoral y los antecedentes citogenéticos disponibles se sugieren las siguientes tendencias evolutivas para la subfamilia Haematosiphoninae: i) fusiones autosómicas que provocaron una reducción en el número de autosomas; ii) fragmentación del cromosoma X ancestral originando sistemas sexuales múltiples y iii) fragmentaciones autosómicas que trajeron aparejado un incremento en el número de autosomas. Acanthocrios furnarii y P. uritui poseen un alto contenido de heterocromatina, ubicada en ambas regiones terminales de cada uno de los autosomas del complemento, por lo cual las regiones cromosómicas que se repelen son heterocromáticas. En A. furnarii, los clusters de ADNr se localizan en una de las regiones terminales de un par autosómico, mientras que en P. uritui se ubican en una de las regiones terminales de un par autosómico y de uno de los cromosomas sexuales. En ambas especies la composición nucleotídica de los genes ribosomales es rica en pares de bases GC. Además del amplio rango en el número cromosómico en la familia, la localización de los genes de ADNr es muy variable, lo que permite sugerir que el genoma de los cimícidos presenta una gran dinámica, que podría deberse a diferentes mecanismos tales como la recombinación ectópica y/o la presencia de elementos transponibles. Las especies de Reduviidae estudiadas comparten características que son típicas de la familia e incluso de Heteroptera: los bivalentes autosómicos son quiasmáticos y se dividen reduccionalmente en anafase I; los cromosomas sexuales son heteropicnóticos positivos durante la profase I temprana, asinápticos, aquiasmáticos y se dividen ecuacionalmente en anafase I. Sin embargo, también se han observado diferencias y/o particularidades citogenéticas: i) las especies analizadas presentan una disposición cromosómica desordenada en metafase I, independientemente del número cromosómico y del sistema de cromosomas sexuales que posean, aunque en metafase II la arquitectura de la placa es la típica para los heterópteros; ii) la presencia de por lo menos un bivalente mayor con dos quiasmas es una característica frecuente en Reduviidae; además, estos bivalentes se comportarían como telocinéticos al liberarse primero uno de los dos quiasmas; iii) de acuerdo al comportamiento y las características meióticas del par menor hallado en M. lunifer , se propone que sea considerado como un par de cromosomas m. Hasta el presente Microtomus es el único género de Reduviidae que presenta este tipo de cromosomas. En cuanto a la evolución del cariotipo, se sugieren las siguientes tendencias evolutivas: i) la presencia de cromosomas m en Hammacerinae podría ser considerado como un carácter plesiomórfico; ii) las fusiones son más frecuentes que las fragmentaciones autosómicas; iii) las fragmentaciones en el cromosoma X y aún la pérdida del cromosoma Y aparecen en distintos grupos y de forma independiente. El análisis del contenido, localización y composición de heterocromatina sugieren que esta familia se caracterizaría por presentar un bajo contenido de heterocromatina constitutiva, preferentemente localizada en regiones terminales de los autosomas. En aquellas especies con bloques heterocromáticos terminales en algún bivalente autosómico, los quiasmas se ubicaron en zonas adyacentes, por lo que si bien muy probablemente no habría recombinación a nivel de heterocromatina, el efecto supresor de la recombinación no se extendería más allá de la región heterocromática en sí misma. La localización de los clusters de ADNr en Reduviidae fue también muy variable: en autosomas, en cromosomas sexuales o en ambos a la vez. En el par mayor de M. lunifer , G. bicolor y Z. obscuridorsis, la localización de ADNr fue utilizada como marcador cromosómico para analizar los sitios de actividad cinética, permitiendo sugerir que en las tres especies la elección de los extremos cinéticamente activos es un proceso azaroso en ambas divisiones meióticas y que aquellas regiones que fueron activas en la primera división meiótica son inactivas en la segunda y viceversa. Con el fin de analizar el grado de diferenciación molecular de los cromosomas sexuales utilizando técnicas citogenético-moleculares, se utilizó como modelo de estudio a R. prolixus y se implementó por primera vez en Cimicomorpha las técnicas de pintado cromosómico (CP), hibridación in situ de genoma (GISH) e hibridación comparativa de genoma (CGH). La técnica de CP sugiere que la estructura del genoma de R. prolixus posee un alto contenido de secuencias repetidas dispersas en el genoma. Por su parte, las técnicas de GISH y CGH fueron informativas al revelar que el cromosoma Y posee secuencias específicas de macho y que el cromosoma X no estaría enriquecido preferentemente en ADN de uno u otro sexo. Además, se pudo detectar un alto grado de diferenciación molecular entre los cromosomas sexuales X e Y en el sistema simple de R. prolixus. En este trabajo se describe una población polimórfica de Zelurus femoralis longispinis para el número de cromosomas, observándose dos citotipos (2n=22/23). El comportamiento del cromosoma extra altamente regular y similar al de los cromosomas sexuales y el hecho de encontrar que el largo promedio de los cromosomas sexuales en los individuos no portadores del cromosoma extra es significativamente mayor respecto a los que sí lo poseen, permiten concluir que: i) esta variante cariotípica es neutral o, al menos, no perjudicial, ii) su surgimiento no habría acontecido tan recientemente y iii) el cromosoma extra se habría originado por fragmentación del cromosoma X original, dando como resultado un sistema múltiple X1X2Y. El análisis de esta población sustenta la hipótesis del origen de los sistemas múltiples en Heteroptera. Por otra parte, se describió la presencia de un individuo de Triatoma infestans mutante espontáneo heterocigota para una fusión entre cromosomas no homólogos (2n=19A+cromosoma extra+XY, macho). A partir del análisis del comportamiento meiótico del mutante y del patrón de bandas C se propone que: i) el trivalente autosómico se divide ecuacionalmente en la primera división meiótica; ii) dos de los tres pares de autosomas mayores habrían estado involucrados en el evento de fusión; iii) el cromosoma extra se habría originado como producto de la fusión autosómica. La presencia de un mutante espontáneo en una población natural y el comportamiento masculino meiótico altamente regular constituyen evidencias a favor de la hipótesis que propone a las fusiones como uno de los mecanismos de evolución del cariotipo en Heteroptera.

Abstract:
This PhD Thesis is based on the classical cytogenetic, molecular and evolutionary study of hematophagous and predatory insects of Cimicidae and Reduviidae families from Cimicomorpha (Hemiptera: Heteroptera), which are characterized by the presence of holokinetic chromosomes. Chromosome complement and meiotic development were analysed as well as the heterochromatin content, composition and distribution. Moreover, the number and location of ribosomal DNA genes were also analysed in the following species: Acanthocrios furnarii 2n=10A+XY/XX (male/female) and Psitticimex uritui 2n=28A+X1X2Y (male) (Cimicidae: Haematosiphoninae); Brontostoma colossus 2n=28A+XY (male) and B. discus 2n=34A+X1X2Y (male) (Reduviidae: Ectrichodiinae); Microtomus lunifer 2n=26A+2m+X1X2Y (male) (Reduviidae: Hammacerinae); Apiomerus lanipes 2n=22A+XY (male), Atrachelus (Atrachelus) cinereus 2n=26A+XY/XX (male/female), Cosmoclopius annulosus 2n=24A+X1X2X3Y/X1X1X2X2X3X3 (male/female), Graptocleptes bicolor 2n=22A+XY/XX (male/female) and Zelus obscuridorsis 2n=16A+XY/XX (male/female) (Reduviidae: Harpactorinae); Zelurus femoralis longispinis 2n=20A+XY/X1X2Y (male) (Reduviidae: Reduviinae); Rhodnius prolixus 2n=20A+XY/XX (male/female) and Triatoma infestans 2n=20A+XY (male) (Reduviidae: Triatominae). The classical cytogenetic analysis performed on A. furnarii and P. uritui shows that male meiosis in both species is achiasmatic and of collochores type, which could be considered a cytogenetic characteristic shared by members of Cimicidae family. However, A. furnarii and P. uritui have an own pattern of achiasmatic meiosis, in which three regions can be differentiated in autosomal bivalent: i) terminal regions found in repulsion, ii) half region where the chromosomes are located parallel but without contact and iii) small areas within the middle region where not chiasmatic attachment points or collochores are located. The analysed population of A. furnarii by other authors (2n=32A+XY, male) differs from the present description (2n=10A+XY, male). This remarkable difference in the diploid number of autosomes cannot be explained as polytypism, therefore we concluded that these two karyotypes belong to two different taxa. Based on the results described in this PhD Thesis and on the cytogenetic background available, it suggests the following evolutionary trends for the subfamily Haematosiphoninae: i) autosomal fusions that caused a reduction in the number of autosomes, ii) X ancestral chromosome fragmentation originating the derived system of multiple sex chromosomes and iii) autosomal fragmentations associated with an increase in the number of autosomes. Acanthocrios furnarii and P. uritui both possess high heterochromatin content, located in both end regions of each autosome wherefore chromosomal regions that repel are heterochromatic. In A. furnarii rDNA clusters are located on one of the terminal regions of an autosomal pair, whereas in P. uritui are located in one of the end regions of an autosomal pair and in one of the sex chromosomes. In both species, the nucleotide composition of the ribosomal genes is rich in GC base pairs. In addition to the wide range in the chromosome number in the family, the location of rDNA genes is very variable, which allows to suggest that the cimicid genome has a high dynamic. This could be due to diverse mechanisms such as ectopic recombination and/or to the presence of transposable elements. The Reduviidae species studied herein share characteristics that are typical of the family and also from Heteroptera: autosomal bivalents are chiasmatic and divide at anaphase I, the sex chromosomes are positively heteropycnotic during early prophase I, asynaptic, achiasmatic and divided equationally at anaphase I. However, it has also observed different cytogenetic features: i) the analysed species have a disordered arrangement in metaphase I, regardless of the chromosome number and the sex chromosome system they have, although in metaphase II the plate architecture is typical for the group of Heteroptera; ii) the presence of at least one large bivalent with two chiasmata is a frequent feature in Reduviidae. Furthermore, those bivalents should behave as telokinetic by releasing first one of the two chiasmata; iii) according to the behaviour and meiotic characteristics of the minute pair found in M. lunifer, it proposes that it should be considered as one pair of m chromosomes. Microtomus is at present the only reduvid genus which presents a pair of m chromosomes. Regarding karyotype evolution, it suggests the following evolutionary trends: i) the presence of m chromosomes in Hammacerinae could be considered as a plesiomorphic character, ii) fusions are more common than autosomal fragmentations, iii) fragmentations on the X chromosome and even the loss of the Y chromosome appear in different groups and in an independent way. Analyses of content, location and composition of heterochromatin suggest that this family is characterized by a low content of constitutive heterochromatin, mainly located in terminal regions of the autosomes. In those species with terminal heterochromatic blocks in any autosomal bivalent, chiasmata were located in adjacent areas. Therefore, although there would not probably be recombination at heterochromatin level, the suppressive effect of recombination would not extend beyond the heterochromatic region itself. The rDNA clusters location was also highly variable in Reduviidae: on autosomes, on sex chromosomes, or in both simultaneously. In the largest autosomal pair of M. lunifer , G. bicolor and Z. obscuridorsis, the location of rDNA was used as a chromosomal marker to analyse sites of kinetic activity, suggesting that, in the three analysed species, the kinetic activity of both ends is not a random process and there is an inversion of this activity. In order to analyse of molecular differentiation in sex chromosomes by molecular cytogenetic techniques, R. prolixus was used as a model of study. Chromosome painting (CP), genome in situ hybridization (GISH) and comparative genome hybridization (CGH) were used for the first time in Cimicomorpha. CP technique suggests that the genome structure of R. prolixus has a high content of dispersed repeated sequences. On the other hand, GISH and CGH techniques were informative and revealed that the Y chromosome has male-specific sequences, whereas the X chromosome would not be enriched preferably in either sex DNA. In addition, it could also detect a high degree of molecular differentiation between X and Y sex chromosomes in the simple system of R. prolixus . In the present PhD Thesis, a polymorphic population of Zelurus femoralis longispinis for the chromosomal number has been described, being observed two cytotypes (2n=22/23). The behaviour of the extra chromosome highly regular and similar to sex chromosomes and finally, the finding that the average length of the sex chromosomes in individuals not carrying the extra chromosome is significantly greater than in those who do have, allow to conclude: i) this new chromosome complement is neutral or at least not harmful, ii) its origin would not have occurred so recently and iii) the extra chromosome should be originated by fragmentation of the original X chromosome, resulting in a multiple system X1X2Y. The analysis of this population supports the hypothesis of the multiple sex systems origin in Heteroptera. Moreover, the presence of a spontaneous mutant heterozygous of Triatoma infestans carrying a fusion between non-homologous chromosomes has been described (2n=19A+extra chromosome+XY, male). Taking into account its meiotic behaviour together with the results of the C-banding pattern, allow to propose that: (i) the autosomal trivalent divides equationally during the first meiotic division, ii) two of the largest pairs of autosomes might have been involved in the fusion event and (iii) the extra chromosome was originated as a product of the autosomal fusion. The presence of a spontaneous mutant in a natural population and the highly regular meiotic male behaviour are evidences that favour the hypothesis that fusion as one of the mechanisms of karyotype evolution in Heteroptera.

Gómez, Maximiliano. "Desarrollo de caña de azúcar transgénica resistente al Sugarcane mosaic virus (SCMV) y al Sorghum mosaic virus (SrMV) por silenciamiento génico" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El desarrollo de plantas transgénicas que explotan el mecanismo de silenciamiento génico contra los virus causales del mosaico (SCMV y SrMV) representa una interesante estrategia alternativa a los métodos de mejoramiento genético clásico. Sin embargo hasta el momento dichas estrategias han sido implementadas en base al conocimiento de unas pocas secuencias virales, lo que incrementa la posibilidad de que la resistencia sea quebrada por variantes poco frecuentes del virus. Se desarrolló un protocolo simple, rápido y económico diseñado para obtener secuencias virales a partir de un gran número de hojas de caña sintomáticas. Utilizando dicho protocolo se analizó la estructura poblacional de los virus causales del mosaico de la caña de azúcar en la Argentina y las áreas cañeras limítrofes de Bolivia, Uruguay y Paraguay, incluyendo 103 sitios de muestreo. Se analizaron 567 muestras sintomáticas por RT-PCR (pertenecientes a 104 genotipos de caña de azúcar) amplificando un fragmento del gen de la proteína de cápside del SCMV y del SrMV con iniciadores reportados en la literatura. Los productos de amplificación fueron secuenciados directamente. El análisis de las secuencias virales determinó que el principal agente causal de mosaico en la región es el SCMV, presente en 94% de las muestras. El SrMV estaba presente en solo 2,8% de las muestras, con bajos porcentajes de coinfección de los dos virus (0,5%). Las secuencias fueron analizadas filogenéticamente y clasificadas en cuatro grupos virales utilizando un valor de corte de 0,91 de identidad de secuencia, con un nuevo grupo viral (W) propuesto dentro de la clasificación del SCMV reportada en la literatura. Se diseñó un transgén de resistencia para desencadenar el silenciamiento génico contra todas las variantes virales encontradas en el muestreo realizado. Se seleccionaron tres fragmentos del genoma viral evolutivamente conservados: parte del gen P3 (función probables de anclaje a membrana del complejo de replicación) y dos fragmentos no homólogos del gen de la proteína de cápside, para ser clonados en direcciones opuestas a ambos lados de un intrón (construcción tipo horquilla), bajo la dirección del promotor del gen de la ubiquitina de maíz. Se obtuvieron plantas transgénicas de cinco variedades de caña de azúcar de interés comercial y fueron desafiadas con el SCMV en un ensayo de inoculación artificial en invernáculo y en un ensayo a campo bajo condiciones naturales de infección en la Chacra Experimental (provincia de Salta). Resultados preliminares indican la ocurrencia de eventos resistentes a la infección con mosaico de cuatro variedades de caña. El análisis molecular de un grupo de eventos es consistente con una resistencia mediada por silenciamiento génico. Se planea la realización de ensayos a campo para confirmar el fenotipo de resistencia a mosaico e identificar eventos que conserven las características agronómicas del genotipo transformado.

Abstract:
Attractive alternatives to traditional resistance breeding in sugarcane against sugarcane and sorghum mosaic virus (SCMV and SrMV, respectively), both causal agents of mosaic disease, have derived from transgenic approaches exploiting gene silencing. Such approaches, however, have been implemented based upon relatively few available virus sequences, therefore it is possible that infrequent variants escape gene silencing and break resistance. We developed a simple, fast and economic protocol designed to obtain viral sequences from a large set of symptomatic sugarcane leaf samples. Using this protocol, we estimated the population structure of potyviruses causing sugarcane mosaic disease throughout the sugarcane growing area of Argentina and neighboring regions in Bolivia, Uruguay and Paraguay by analyzing sugarcane leaf samples showing mosaic symptoms from 103 locations, including commercial and experimental fields. A set of 567 samples from 104 sugarcane genotypes were extracted and analyzed for the presence of a genomic fragment including most of the SCMV and SrMV coat protein coding regions by RT-PCR using reported sets of primers. PCR products were directly sequenced using the same amplification primers. Sequence analysis demonstrated that SCMV is the predominant mosaic virus infecting sugarcane in the region, and is present in 94% of the samples. SrMV was present only in 2.8% of samples, with low (0.5%) coinfection rates. Sequences were subject to phylogenetic analysis and classified into four viral groups using a 0.91 nucleotide identity cutoff, and a new group (W) was proposed to be included in the SCMV classification previously reported. A resistance transgene was designed to trigger silencing mediated resistance against all virus variants found in the large scale survey. Three viral fragments: a P3 gene fragment and two nonoverlapping fragments from the coat protein gene, were cloned in opposite directions separated by an intron in a hairpin construct, and placed under the maize UBI promoter. Transgenic sugarcane plants belonging to 5 varieties were obtained and putative events were tested in the greenhouse with artificial inoculation and in a field trial at Chacra Experimental (Salta province) under natural infection conditions. Preliminary results indicate the occurrence of events from four sugarcane varieties that are resistant to mosaic infection. Preliminary molecular analysis are consistent with a resistance mechanism mediated by gene silencing. Further analysis are needed to identify resistant events that have a good agronomic performance as well.

Caro, Florence. "Estudio de la traducción a escala genómica y métodos de manipulación genética en el parásito de la Malaria, Plasmodium falciparum" (2012-08-01) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Plasmodium falciparum es el parásito que causa la malaria más severa en humanos, enfermedad que afecta mundialmente a 200–300 millones de individuos al año. La descripción del genoma, del transcriptoma y del proteoma son un recurso importante para poder entender la función y la regulación de la expresión génica. En el caso del parásito P. falciparum, el 60% de los genes anotados siguen siendo hipotéticos, debido a la gran distancia evolutiva del parásito respecto de organismos modelo. Por otro lado, la presencia y abundancia de un ARNm no necesariamente se correlaciona con la abundancia de la proteína correspondiente y la cuantificación de estos parámetros son por lo tanto representaciones imperfectas de la regulación génica y proteómica subyacente. En esta tesis se establece la conexión entre ARNm y proteína midiendo directamente la traducción a nivel genómico usando la técnica de perfilamiento ribosomal, revelando por primera vez la dinámica de este proceso durante los estadíos intraeritrocíticos del parásito. Los resultados obtenidos demuestran que los procesos de transcripción y traducción están estrechamente acoplados, que el 11% del transcriptoma está regulado traducciónalmente y que este tipo de regulación juega un rol importante en genes con funciones de egreso e invasión del merozoito. Además, se presenta un conjunto de métodos mejorados para la manipulación genética a escala genómica de P. falciparum. Este conjunto de protocolos puede ser aplicado para la investigación y descubrimiento de la función de los genes del parásito.

Abstract:
Plasmodium falciparum is the causative agent of the most burdensome form of human malaria, affecting 200–300 million individuals per year worldwide. For the study of P. falciparum, the description of the genome, the transcriptome and the proteome are a tremendous resource for understanding gene function and gene expression regulation. However, 60% of the annotated genes in the genome remain hypothetical due to the evolutionary distance of this parasite to model organisms, and mRNA and protein abundance measurements remain imperfect representations of the underlying genetic and proteomic regulation, since the presence and abundance of an mRNA species does not necessarily correlate with the abundance of the corresponding protein. The work presented in this thesis bridges this disconnect by measuring whole genome translation, using the ribosome profiling technique, revealing for the first time translation dynamics throughout the asexual intraerythrocytic developmental cycle. The findings show that transcription and translation are tightly coupled in this parasite, that 11% of the transcriptome is translationally regulated and that this type of regulation plays a major role on genes related to merozoite egress and invasion. Additionally, presented here is an improved set of methods for 96-well plate-based transfection and culture that facilitate genome-scale genetic manipulation of P. falciparum. This set of protocols can be applied to investigation and discovery gene functions in this parasite.

Calderazzo Pereyra, Julio César. "Consecuencias de mutaciones y polimorfismos sobre la actividad de ADAMTS13" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los objetivos de esta tesis fueron: 1- Optimizar la amplificación de los 29 exones correspondientes al gen de ADAMTS13 y realizar la secuenciación completa del gen en pacientes con PTT congénita y 2- Realizar la expresión “in vitro" de la primera nueva mutación descripta en Argentina A4085T (sustitución de un ácido aspártico (D) por una valina (V) en la posición 1362). Evaluar la actividad proteolítica intra y extracelular de la ADAMTS13 resultante para analizar cómo impacta sobre los mecanismos de biosíntesis y secreción de la ADAMTS13. Los experimentos se realizaron en cultivos de células HEK 293 transfectadas con las construcciones plasmídicas de la secuencia WT y del mutante A4085T sintetizado a partir del plásmido WT por mutagénesis sitio-dirigida para evaluar cuál es el dominio afectado y cómo impacta sobre los mecanismos de biosíntesis y secreción de la ADAMTS13. Estos estudios ayudaron a una mejor evaluación del exón 29 del dominio CUB-2. Para medir el antígeno y la actividad de ADAMTS13 en células, sobrenadantes y células transfectadas con vector de expresión de ADAMTS13 WT y de A4085T, se utilizaron técnicas de ELISA con sustratos cromogénicos, técnicas de SDS-PAGE, inmuno-transferencia y microscopia de inmunofluorescencia. Se observó que la mutación produce acumulación intracelular de ADAMTS13. La nueva mutación D1362V identificada en el dominio CUB-2 codificada por el exón 29, donde aún no se han reportado mutaciones de sentido erróneo, produce una deficiencia plasmática de ADAMTS13 que estaría inducida por una secreción reducida de la proteasa a la circulación.

Abstract:
The aims of this thesis were: 1- To optimize the amplification of the ADAMTS13 gene 29 exons, and to perform the complete sequencing of this gene in patients with hereditary TTP, and 2- To perform the in vitro expression of the first new mutation described in Argentina, A4085T (substitution of an aspartic acid for valine at position 1362). The resulting ADAMTS13 intra and extracellular proteolytic activity will be evaluated to analyze its impact on ADAMTS13 biosynthesis and secretion mechanisms. The experiments were performed in cultures of HEK 293 cells transfected with plasmid constructions of the WT sequence, and of the A4085T mutant synthesized from the WT plasmid through site-directed mutagenesis, in order to evaluate which the affected domain is and how it impacts on ADAMTS13 biosynthesis and secretion mechanisms. These studies have helped to improve the evaluation of exon 29 at CUB-2 domain. ADAMTS13 antigen and activity on cells, supernatants and cells transfected with expression vector of ADAMTS13 WT and of A4085T, were measured by ELISA with chromogenic substrates, SDS-PAGE, immune transference technics applied and immunofluorescence microscopy. It was observed that the mutation produces intracellular accumulation of ADAMTS13. The new D1362V mutation identified in CUB-2 domain and encoded by exon 29, where no missense mutations have been reported yet, produces a plasmatic deficiency of ADAMTS13 that could be induced by a reduced secretion of circulating protease.

Quadrana, Leandro Daniel. "Análisis funcional de los determinantes genéticos del metabolismo de vitamina E en tomate" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El conocimiento acerca de los mecanismos fisiológicos y moleculares que determinan la calidad nutricional de los vegetales es de fundamental importancia tanto para el diseño de estrategias de mejoramiento vegetal como para ganar conocimiento en los mecanismos regulatorios del metabolismo secundario. La presente Tesis se focaliza en el estudio de los mecanismos que determinan los contenidos de Vitamina E de los frutos de tomate. Para ello caracterizamos estructuralmente y localizamos en el mapa genético todos los genes involucrados en la biosíntesis de vitamina E e identificamos QTLs para los contenidos de esta vitamina en los frutos de tomate. Así mismo identificamos los principales componentes de la red de regulación a nivel de la expresión génica que opera en la síntesis de vitamina E en tomate a partir del desarrollo de una plataforma de RT-qPCR capaz de evaluar la acumulación de RNA mensajeros para todos los genes de esta ruta biosintética. Adicionalmente y con el objetivo de estudiar funcionalmente genes involucrados en el metabolismo de vitamina E, desarrollamos un sistema de silenciamiento transiente mediado por virus basado en la expresión constitutiva de la proteína verde fluorescente para su silenciamiento como reportero. Por último, nos centramos en la identificación los determinantes genéticos del mayor QTL de vitamina E de tomate localizado durante la primera parte de esta Tesis.

Abstract:
Understanding the molecular and physiological mechanisms that determine the quality of vegetables-derived foods is of fundamental importance to design programs centered in plant breeding as well as to gain further insight on regulatory mechanisms of secondary metabolism.In this work we studied the regulatory mechanisms of Vitamin E content of the tomato fruits. We first structurally characterized and mapped all the genes involved in the vitamin E biosynthesis. Furthermore, we developed and take advantage of a RT-qPCR array which allow us to study the major players gene network determining the vitamin E synthesis. Additionally we developed a VIGS (Viral Induced Gene Silencing) system capable of silencing a target gene, coupled to a fluorescent reporter gene. Moreover we used this approach to study the function of several genes presumably involved or related to the vitamin E metabolism. Finally, we identified the molecular factors determining a major QTL of vitamin E in tomato fruit, identified during the first part of this thesis, and localized in the chromosome 9.

Delfino, Cecilia María. "Virus de hepatitis B (HBV) y virus de hepatitis D (HDV) en Argentina: epidemiología molecular y variabilidad viral" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El objetivo principal de esta tesis fue estudiar la epidemiología molecular de la infección por HBV y HDV, determinar los genotipos y analizar la variabilidad genética de los aislamientos detectados en distintas poblaciones y regiones de Argentina. Se estudiaron donantes de sangre de Buenos Aires y Misiones, y Amerindios de cuatro comunidades originarias: Mbyá-guaraníes (Misiones), Kollas (Jujuy), Sagua-Huarpes (San Juan) y Wichis (Formosa). Las cifras de prevalencia para el HBsAg variaron de 0,2 a 0,73% para donantes y de 1,4 a 1,7% para originarios. El análisis filogenético de las secuencias de HBV determinó la circulación en ambas poblaciones de los subgenotipos A2, B2, C2, D3, D3/D6, F1b y F4. En las secuencias de HBV se detectaron mutaciones en regiones regulatorias asociadas a mayor severidad de la enfermedad hepática y en las proteínas del pre-Core (productoras de fenotipo e minus), del Core (dentro de los epítopes para linfocitos T), preS1-S2 (posiblemente asociadas a infección oculta por HBV), S (mutantes de escape a la respuesta inmune humoral), P (asociadas a resistencia antiviral) y X (implicadas en el desarrollo del hepatocarcinoma celular). Se describe por primera vez la circulación del genotipo 1 de HDV en donantes de sangre de Buenos Aires y en originarios de Misiones; con el interesante hallazgo de la detección de este virus en casos de infección oculta por HBV. Además, se identificaron mutaciones en el antígeno Delta que podrían justificar la no detección de anticuerpos anti-HDV (infección “oculta”) en estos casos.

Abstract:
The main objective of this thesis was to study the molecular epidemiology of HBV and HDV infection, to determine the genotypes and to analyze the genetic variability of the isolations detected in different populations and regions of Argentina. Blood donors from Buenos Aires and Misiones, and Amerindians from four original communities were studied: Mbyá-guaraníes (Misiones), Kollas (Jujuy), Sagua-Huarpes (San Juan) and Wichis (Formosa). The prevalence of HBsAg ranged from 0.2 to 0.73% in blood donors and from 1.4 to 1.7% for aborigines. The phylogenetic analysis of the HBV sequences revealed the circulation of A2, B2, C2, D3, D3/D6, F1b and F4 genotypes in both populations. In HBV sequences, mutations in the regulatory regions associated to more severe hepatic desease and in the pre-Core proteins (e minus producers), the Core (among the epitopes for T cells), preS1-S2 (possibly associated to occult HBV infection), S (escape mutants to the humoral immune response), P (associated to antiviral resistance) and X (implicated in the development of hepatocellular carcinoma). We describe for the first time the circulation of HDV genotype 1 among blood donors of Buenos Aires and aborigines of Misiones; only among those with occult HBV infection. Moreover, we identified mutations in the Delta antigen which could explain the non-detection anti-HDV antibodies (“occult” infection) in these cases.

Catone, Mariela Verónica. "Identificación y análisis de los genes asociados al metabolismo de polihidroxialcanoatos en Pseudomonas extremaustralis" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los polihidroxialcanoatos (PHA) son polímeros de reserva bacterianos que poseen propiedades termoplásticas y son biodegradables. P. extremaustralis acumula polihidroxibutirato (PHB), formado por monómeros de longitud de cadena corta. Esta es una característica poco común en bacterias del género Pseudomonas, que normalmente acumulan PHA de longitud de cadena media (PHAmcl). Trabajos previos demostraron que los genes PHB se encuentran en una isla genómica. El objetivo de este trabajo consistió en la búsqueda y análisis de genes relacionados con la producción de distintos tipos de PHA en P. extremaustralis. También se realizaron análisis bioinformáticos del genoma de esta bacteria para identificar los genes involucrados en vías metabólicas centrales y los relacionados con la producción de alginato, de interés para comprender el metabolismo de compuestos carbonados que podrían estar relacionados con la producción de PHA. Se identificaron los genes de producción de PHAmcl, phaC1ZC2D y phaFI, además de los genes, phbFPX, asociados a la síntesis de PHB. Los análisis filogenéticos realizados permitieron inferir que estos genes poseen diverso origen. En base a estudios de complementación, de expresión génica y de proteómica de los gránulos del polímero se determinó la funcionalidad de las polimerasas de PHAmcl (PhaC1 y PhaC2) y se comprobó que la diferencia en la expresión de las 3 polimerasas, encontradas en el genoma de esta bacteria, podía explicar la alta producción de PHB en comparación con otros PHA. Los resultados en conjunto ponen de manifiesto la importante capacidad de adaptación al metabolismo de esta bacteria de genes probablemente adquiridos por transferencia horizontal, como los genes PHB. La capacidad de producción de PHA con distintas propiedades en P. extremaustralis resulta de interés biotecnológico dado que a través de manipulaciones genéticas sería posible lograr la producción de diferentes bioplásticos, utilizando la misma bacteria.

Abstract:
Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are reserve bacterial polymers that possess thermoplastic properties and are biodegradable. P. extremaustralis accumulates polyhydroxybutyrate (PHB), a PHA composed by short chain length monomers. This is an unusual feature in bacteria of the genus Pseudomonas, which normally accumulate medium chain length PHAs (PHAmcl). Previous works demostrated that PHB genes are located in a genomic island. The aim of this work was the identification and analysis of genes involved in the production of different types of PHAs in P. extremaustralis. Bioinformatic analysis of the genome of P. extremaustralis were performed in order to identify genes involved in the central metabolic pathways and other associated with alginate production, interesting to understand the metabolism of carbon compounds that could be associated with PHA production. Genes coding PHAmcl production (phaC1ZC2D and phaFI) were identified, and other group of genes (phbFPX) associated with the synthesis of PHB. Phylogenetic analysis allowed to infer that these genes have different origins. Complementation studies, gene expression analysis and proteomics assays of polymer granules showed the functionality of PHAmcl polymerases (PhaC1 and PhaC2), the key enzymes for the PHAmcl production, and allowed to determine that the difference in the expression of the 3 polymerases found in the genome of this bacterium could explain the high production of PHB in comparison with other PHAs. The overall results show the high adaptability of genes probably acquired by horizontal transfer to the metabolism of this bacterium, as PHB genes. The capability of PHA production with different properties in P. extremaustralis has biotechnological interest due to genetic manipulation could allow the production of different bioplastics such as PHB and other PHAmcl, using the same bacterium.

Buzzi, Lucila Inés. "Caracterización bioquímica y funcional de las dos UDP-Glc: glicoproteína glucosiltransferasas codificadas en el genoma de C. elegans" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT) es el sensor de la conformación de las glicoproteínas en el “Control de Calidad de Plegamiento de Glicoproteínas” ya que sólo presenta actividad sobre glicoproteínas que no se encuentran en su conformación nativa. Las glicoproteínas que presentan oligosacáridos monoglucosilados interaccionan con lectinas-chaperonas presentes en el Retículo endoplásmico (RE) como Calnexina y Calreticulina lo cual previene que los intermediarios de plegamiento inmaduros continúen su camino hacia el Aparato de Golgi. En C. elegans existen dos genes, uggt-1 y uggt-2, homólogos a los que codifican para las UGGT en diferentes organismos. La expresión de las proteínas UGGT-1 y UGGT-2 en S. pombe alg6 gpt1-, que carece de actividad de UGGT, permitió demostrar que uggt-1 codifica para una UGGT activa (CeUGGT-1), mientras que la proteína codificada por uggt-2 carece de actividad de UGGT (CeUGGT-2). Mediante la construcción de proteínas quiméricas, se determinó que el dominio C-terminal de CeUGGT-2 es incapaz de transferir glucosa a proteínas mal plegadas. El estudio del gusano mutante de uggt-2 (VC1961) reveló que CeUGGT-2 es esencial para la viablidad del nematodo ya que los gusanos uggt-2 -/- se arrestan en estadíos embrionarios y en L1 mostrando un tamaño menor y posibles defectos en la cutícula. Mediante Real Time PCR observamos que ambos genes se expresan durante todo el ciclo de vida de C. elegans. Mediante la construcción de gusanos transgénicos pudimos detectar expresión de CeUGGT-1 en todas las células y tejidos del nematodo. uggt-1 se induce en condiciones de estrés de RE a través de la vía de señalización de ire-1 en la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), mientras que uggt-2 no lo hace. El silenciamiento de la expresión de la proteína UGGT-1 y UGGT-2 por ensayos de RNAi produjeron un retraso en el desarrollo en gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) y resultaron en una disminución de la sobrevida de gusanos uggt-1(RNAi). CeUGGT-1 y CeUGGT-2 juegan un rol protector ante condiciones de estrés de RE ya que con 10 μg/ml de Tunicamicina (TN) se arrestó el crecimiento de gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) en L2/L3 pero no el de gusanos control. Además ensayos de RNAi a bajas concentraciones de TN en ausencia de ire-1, sugirieron que CeUGGT-2 es importante para aliviar los bajos niveles de estrés de RE en ausencia de esta vía de la UPR. Estos resultados indicarían que ambos homólogos de UGGT de C. elegans poseerían distintas funciones biológicas.

Abstract:
The UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (UGGT) is the sensor of glycoprotein conformations in the glycoprotein folding quality control as it exclusively glucosylates glycoproteins not displaying their native conformations. Monoglucosylated glycoproteins thus formed may interact with the lectin-chaperones calnexin and calreticulin. This interaction prevents premature exit of folding intermediates to the Golgi. Bioinformatic analysis showed that in C. elegans there are two genes, uggt-1 and uggt-2, coding for UGGT homologues. Expression of both genes in S. pombe mutants devoid of UGGT activity showed that uggt-1 codes for an active UGGT protein (CeUGGT-1). On the other hand, uggt-2 coded for a protein (CeUGGT-2) apparently not displaying a canonical UGGT activity and conversely to what happens in humans, the C-terminal domain of CeUGGT-2 is inactive. However, uggt-2 is not a pseudogene as we can detect its expression along the entire development. The study of the mutant worm VC1961 revealed that CeUGGT-2 is essential for viability. Worms uggt-2 -/- were arrested in embryonic and L1 stages and they showed smaller size and possible defects in the cuticle. Furthermore, Real-time PCR analysis showed that both uggt-1 and uggt-2 genes are expressed during the entire C. elegans life cycle. Moreover, transgenic worms constructed by fosmid recombineering technique carrying the gfp under the control of uggt-1 promoter indicated that that CeUGGT-1 is expressed in all cells and tissues of the nematode. uggt-1, but not uggt-2, is upregulated under ER stress through the ire-1 arm of the unfolded protein response (UPR). RNAi-mediated depletion of CeUGGT-1 but not of CeUGGT-2 resulted in a reduced lifespan and that of CeUGGT-1 and CeUGGT-2 in a developmental delay. We found that both CeUGGT1 and CeUGGT2 play a protective role under ER stress conditions, since 10 μg/ml tunicamycin (TN) arrested development at the L2/L3 stage of both uggt-1(RNAi) and uggt-2(RNAi) but not of control worms. Furthermore, we found that the role of CeUGGT-2 but not CeUGGT-1 is significant in relieving low ER stress levels simulated with TN in the absence of the ire-1 unfolding protein response signaling pathway. Our results indicate that both C. elegans UGGT homologues may have distinct biological functions.

Henrión, Guillermo Gabriel. "Descubrimiento de sitios regulatorios potenciales en las regiones intergénicas de Mycobacterium tuberculosis utilizando técnicas de minería de datos" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Naipauer, Julián. "Mecanismos moleculares involucrados en la regulación del ARN mensajero de Integrina Beta 1 en glándula mamaria" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las integrinas son receptores heterodiméricos de la superficie celular que juegan un papel crítico en el desarrollo normal y tumoral de los tejidos. Nuestros resultados muestran que el ARNm que codifica para la subunidad β1 de integrina (Itgb1) posee una señal (PAS1) y sitio de corte y poliadenilación alternativa que produce una isoforma del ARNm, 578 pares de bases más corta (Itgb1-C) que la isoforma reportada en las bases de datos. Esta isoforma no presenta en su 3’UTR, a diferencia de la isoforma larga (Itgb1-L) antes reportada, ni motivos ricos en AU ni secuencias blanco para miRNA que podrían estar implicados en la regulación de la estabilidad, localización y/o traducibilidad del ARNm. Hemos encontrado, además, que estas dos isoformas de Itgb1 se expresan de manera diferencial en los distintos tejidos de ratón analizados. Determinamos que la secuencia 3’UTR de la isoforma larga (Itgb1-L) es capaz de ser reconocida por proteínas de unión a secuencias ricas en AU (AUBP) que pueden modular su estabilidad. Encontramos también que las isoformas Itgb1-C e Itgb1-L se expresan de manera diferencial a lo largo de los distintos estadios del desarrollo de la glándula mamaria de ratón, la isoforma larga se encuentra estable durante la lactancia y en la diferenciación in vitro de células HC11. Por otro lado, la involución post-lactancia y el estiramiento de células HC11 disminuyó la expresión de esta isoforma y aumento la expresión de la isoforma corta. Por lo tanto, nuestros datos identifican una nueva instancia de regulación para el control de la expresión de Itgb1 durante del desarrollo de la glándula mamaria.

Abstract:
Integrins are heterodimeric cell surface adhesion receptors that play a critical role in tissue development. Characterization of the full length mRNA encoding the β1 subunit (Itgb1) revealed an alternative functional cleavage and polyadenylation site that yields a new Itgb1 mRNA isoform, 578bp shorter than that previously reported. Using a variety of experimental and bioinformatic approaches, we found that the two Itgb1 isoforms are expressed at different levels in a variety of mouse tissues, including the mammary gland, where they are differentially regulated at successive developmental stages. The longer mRNA species is privileged during lactation, while the shorter is induced after weaning. In 3D cultures, where expression of Itgb1 protein is required for normal formation of acini, experimental blockade of the longer isoform induced enhanced expression of the shorter species that allowed normal morphological mammary differentiation. The short isoform lacks AU-rich motifs and miRNA target sequences that are potentially implicated in the regulation of mRNA stability and translation efficiency. We further determined that the AU binding protein HuR appears to selectively stabilize the longer isoform in the mammary gland. In summary, our data identify a new regulatory instance involved in the fine‐tuning of Itgb1 expression during mammary gland development and function.

Caraballo, Diego Alfredo. "Evolución de un complejo de especies de Ctenomys (Octodontidae, Rodentia) del noreste argentino: filogenia, variabilidad cromosómica y dinámica del ADN satélite" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los tuco-tucos, roedores subterráneos del género Ctenomys, de la provincia de Corrientes habitan en gran parte de su área de distribución en ambientes inestables tanto desde el punto de vista espacial como temporal. Constituyen un excelente modelo para estudiar la especiación y la hibridación, y el rol de la evolución cromosómica en estos procesos, un rasgo conspicuo en este grupo. Unas 39 poblaciones fueron descriptas en este grupo, la mayoría de status taxonómico indefinido. La variabilidad en el número diploide (2n) y número fundamental (NF) es inusualmente elevada en este grupo (2n=41-70, NF=76-84). En este trabajo se obtuvo una filogenia molecular que incluye representantes de 23 poblaciones correntinas, utilizando los marcadores mitocondriales citocromo b, citocromo oxidasa I y región control (D-loop). El grupo Corrientes resultó monofilético. Las especies previamente descriptas C. perrensi y C. dorbignyi no resultaron monofiléticas. Se propone el subgrupo iberá como linaje evolutivo diferenciado e independiente. Por otro lado, se obtuvieron cariomorfos de 33 individuos. El cariomorfo 2n=70 NF=84 ocurre en dos linajes basales en el grupo Corrientes, y en la especie hermana C. pearsoni, sería ancestral y habría sufrido reducciones en 2n y NF vía fusiones céntricas y en tándem, principalmente. Se exploró la relación entre la dinámica del principal ADN satélite de los tucos (SRPC) y la variabilidad cromosómica en Corrientes. Se analizó también la variación intra/inter poblacional del número de copias y de la secuencia del satélite SRPC. El satélite SRPC siguió un patrón conservativo en algunos linajes pero altamente dinámico en otros. La evolución de la secuencia y el número de copias de SRPC es compatible con la hipótesis de una biblioteca ancestral, cuyas variantes están presentes en todos los linajes, aunque en proporciones diferentes.

Abstract:
Tuco-tucos, subterranean rodents of the genus Ctenomys, from Corrientes province inhabit unstable environments both from a spatial and a temporal point of view, in most of its distribution. Tucotucos represent an excellent model for studying speciation and hybridization, and the role of chromosomal evolution in these processes, being a conspicuous attribute of this group. Most of the 39 populations described in this group have an undefined taxonomic status, and show an extraordinarily high diploid (2n) and fundamental number (FN) variability, in the ranges 2n=41-70 FN=76-84. In this work a molecular phylogeny was obtained, including representatives from 23 Correntinean populations, based on mitochondrial markers: cytochrome b, cytochrome oxidase I and the control region (D-loop). The Corrientes group resulted monophyletic. However, previously described species C. perrensi and C. dorbignyi did not result monophyletic. The iberá subgroup is proposed as an independent and differentiated evolutionary lineage. Besides, 33 individual karyomorphs were obtained with uniform staining. Karyomorph 2n=70 FN=84 occurs in two basal lineages in the Corrientes group, as well as in its sister species C. pearsoni, would be ancestral and may have suffered reductions in both 2n and FN mainly via centric and tandem fusions. The relationship between the major satellite DNA of tuco-tucos (RPCS) and chromosomal variability in Corrientes was studied. Intra and interpopulation variability in copy number and at RPCS’ nucleotide profile were also analyzed. The satellite RPCS followed a conservative pattern in some lineages but it has been highly dynamic in others. Nucleotide sequence and copy number evolution in RPCS are compatible with the hypothesis of an ancestral library, in which variants are present in all lineages, but in different proportions.

Rossi, Luis Francisco. "Citogenética y biología de la reproducción en Myrmecophagidae (Xenarthra) de Argentina" (2013-02-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La familia Mymercophagidae, constituida por cuatro especies, son mamíferos xenartros con distribución endémica del Neotrópico. Al pertenecer esta familia a un grupo basal en placentados, es de particular interés para el establecimiento de las relaciones filogenéticas en mamíferos. Como constituyente de nuestra fauna autóctona su biología requiere ser cuidadosamente analizada. Se caracterizó citogenética-molecularmente a 39 ejemplares (20 machos y 19 hembras) de Mymercophaga tridactyla (2n=60 y NF=110-12) y 29 ejemplares (17 machos y 12 hembras) de Tamandua tetradactyla (2n=54 y NF 108). Se establecieron dos poblaciones cariológicas para M. tridactyla y una para T. Tetradactyla en su distribución Argentina. El par 1 al igual que otros pares cromosómicos, como los sexuales, resultaron estar compartidos en la familia. Se describió también la morfología de los tractos reproductivos en machos y hembras. El tracto reproductor femenino, reveló características arcaicas (seno-urogenital) presentes en otras especies de Xenarthra. Los machos de Tamandua tetradactyla presentaron inhibición testicular, en relacion con una variación en el tamaño del tracto reproductor y se caracterizó morfométricamente el espermatozoide. Tambien se determinó el ciclo hormonal en hembras de ambas especies resultando poliéstricas anuales.

Abstract:
The four species of the Mymercophagidae family are Xenarthra mammals with endemic distribution in the Neotropics. The basal status of this family, in the placental mammals, makes them important for establishing phylogenetic relationships in mammals. Being part of our native fauna makes it necessary for us to carefully analyze and reformulate again their biology. 39 specimens (20 males and 19 females) of Mymercophaga tridactyla (2n = 60 and NF = 110-12) and 29 individuals (17 males and 12 females) of Tamandua tetradactyla (2n = 54 and NF 108) were characterized cytogenetic and molecularly. Two karyological populations of M. tridactyla and one of T. Tetradactyla were established for their Argentine distribution. The pair 1, as other pairs like the sex chromosomes, was found to be shared in the family. The morphology of the reproductive tracts and hormone cycle in females of both species, which were determined as annual polyestrous, were described. The female reproductive tract showed archaic features (urogenital sinus) present in other species of Xenarthra. The males of Tamandua Tetradactyla showed testicular inhibition, correlated to a size variation of the reproductive tract and the spermatozoon was morphometrically characterized.

Gambino, Yésica Paola. "Regulación de la expresión génica de leptina por estradiol en células placentarias" (2013-03-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La placenta produce un amplio número de moléculas esenciales para el establecimiento y el mantenimiento del embarazo. En este contexto, la leptina presenta un papel importante en la reproducción. La leptina es una proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, y fue descripta originalmente como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo a nivel central. Sin embargo, se ha sugerido que esta proteína presenta otras funciones durante la gestación, particularmente en la placenta, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. La síntesis de leptina en células trofoblásticas está modulada por diferentes agentes endógenos, pero aún no se comprende totalmente cómo se regula su expresión génica. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β-estradiol (E2) sobre la expresión de leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales: la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas humanas a término. Se ha observado la estimulación de la expresión de leptina endógena en respuesta a E2, a través de ensayos de Western blot y qRT-PCR. Este efecto fue dosis y tiempo dependiente e involucraría a los receptores de estrógenos, ya que el antagonista ICI 182,780 inhibió la acción del E2. Además, experimentos de transfección transitoria mostraron que el tratamiento con E2 aumentó la actividad transcripcional del promotor de leptina, y la región promotora comprendida entre -1951 pb y -1847 pb sería necesaria y suficiente para observar los efectos del E2. La acción de E2 también involucraría receptores de membrana, ya que la incubación con este esteroide promovió la fosforilación de MEK, ERK 1/2 y AKT en explantos placentarios. Apoyando esta hipótesis, el análogo E-BSA, que no atraviesa la membrana plasmática, indujo la expresión de leptina en ambos modelos experimentales, y activó rápidamente las vías de señalización de las MAPKs y PI3K. Los efectos del E2 y del E-BSA fueron bloqueados por inhibidores farmacológicos de las vías MAPKs y PI3K así como también a través de la expresión de mutantes dominantes negativas de MEK, ERK 1/2 y AKT, sugiriendo que estas cascadas de señalización estarían involucradas en la regulación de la expresión de leptina. Por otro lado, se ha demostrado la presencia del receptor de estrógenos alfa (ERα) en el núcleo y en la membrana plasmática de las células BeWo. Esta proteína podría mediar los efectos genómicos y no genómicos del E2. Apoyando esta idea, la sobreexpresión de ER potenció los efectos del E2, mientras que la disminución de los niveles de ERα a través de un ARN de interferencia específico disminuyó los efectos del E2 y del E-BSA sobre la expresión de leptina. El análisis in silico del promotor de leptina mostró posibles sitios ERE y half ERE para la unión de receptores ER, además de distintas secuencias que podrían interactuar con los factores de transcripción AP-1, CREB, NFκB y Sp1. La expresión de isoformas wild type o mutantes dominantes negativas de estas proteínas mostraron una posible interacción entre ellas y los ERs, la cual podría estar implicada en la regulación de la expresión de leptina placentaria. En conclusión, este trabajo demuestra que el E2 induce la expresión de leptina en células trofoblásticas a través de acciones genómicas y no genómicas, donde participan receptores de estrógenos de membrana y nucleares, distintos factores de transcripción y diferentes vías de transducción de señales. Estos mecanismos pueden estar desregulados en distintas patologías del embarazo.

Abstract:
The placenta produces a wide number of molecules that play essential roles in the establishment and maintenance of pregnancy. In this context, leptin has emerged as an important player in reproduction. Leptin, the 16,000 MW protein product of the LEP gene, was originally described as an adipocyte-derived signaling molecule for the central control of metabolism. However, it has been suggested that leptin is involved in other functions during pregnancy, particularly in the placenta, where it was found to be expressed. The synthesis of leptin in trophoblastic cells is regulated by different endogenous biochemical agents, but the regulation of placental leptin expression is still poorly understood. In the present work, we analyzed the effect of 17β-estradiol (E2) on leptin expression in human placenta using two experimental models: BeWo choriocarcinoma cells and human placental explants. We have found a stimulatory effect of E2 on endogenous leptin expression, which was analyzed by Western blot and qRT-PCR. This effect was time and dose dependent and involved estrogen receptors, as the antagonist ICI 182 780 inhibited E2-induced leptin expression. Moreover, transient transfection experiments showed that E2 treatment enhances leptin promoter activity, and a minimal promoter region between -1951 and -1847 bp is both necessary and sufficient to achieve E2 effects. E2 action probably involves membrane receptors too, since treatment with E2 promoted MEK, ERK 1/2 and AKT phosphorylation in placental explants. Supporting this hypothesis, the membrane-constrained E2 conjugate, E-BSA, induced leptin expression in both experimental models, and rapidly activated different MAPKs and PI3K pathways. The effects of E2 and E-BSA could be blocked by pharmacologic inhibition of these signaling pathways or through the expression of dominant negative mutants of MEK, ERK 1/2 or AKT, suggesting that those signaling pathways are involved in the regulation of leptin expression. On the other hand, we demonstrated the presence of estrogen receptor alpha (ERα) in the nucleus and its association to the plasma membrane of BeWo cells. We showed that E2 genomic and nongenomic actions could be mediated by ERα Supporting this idea, the over-expression of ERα potentiated the effects of E2, while the downregulation of ERα level through a specific siRNA, decreased E2 and E-BSA effects on leptin expression. In silico analysis of a region of the leptin promoter revealed potential consensus ERE and half ERE sites for ER and also elements for different transcription factors such as AP-1, CREB, NFκB and Sp1. The expression of wild type or dominant negative mutant isoforms of these proteins demonstrated a possible interaction between them and ERs, which could be implicated in the regulation of placental leptin expression. In conclusion, we provide evidence demonstrating that E2 induces leptin expression in trophoblastic cells through genomic and nongenomic actions, involving crosstalk between membrane and nuclear estrogen receptors, transcription factors and different signal transduction pathways. These mechanisms could be dysregulated in pathological pregnancies.

Risso, Guillermo Javier. "Regulación de la proteína quinasa Akt por conjugación a SUMO" (2013-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La proteína quinasa Akt está involucrada en una gran variedad de procesos celulares tales como supervivencia, crecimiento, proliferación, migración, angiogénesis, metabolismo, resistencia a estrés, entre otros. Durante el desarrollo de esta tesis doctoral descubrimos una nueva modificación post-traduccional para esta quinasa, la conjugación a SUMO. Realizando mutaciones puntuales pudimos mapear los sitios blanco de SUMOilation en esta proteína, los aminoácidos lisina 276 y 301. Una proteína doble mutante en K276R y K301R (2KR) mostró niveles disminuídos de SUMOilación. De modo interesante, la sobre-expresión de Akt1 2KR no aumenta, y hasta inhibe, los niveles de fosforilación de un patrón global de sustratos de Akt. En este sentido demostramos que la conjugación de SUMO a Akt es necesaria para la mayoría de los procesos estudiados en los que esta quinasa participa, tales como activación del factor de transcripción NFkB, regulación del splicing alternativo, progresión del ciclo celular y supervivencia celular. Sin embargo, la función inhibitoria de Akt sobre el factor de transcripción FOXO1 no depende de su SUMOilación. Por otro lado, alteraciones en los niveles de fosforilación de Akt1 no afectan los niveles de SUMOilación de esta quinasa, y viceversa. Por último observamos altos niveles de SUMOilación en una variante hiperactiva de esta quinasa (Akt E17K) encontrada en diferentes tumores humanos. Esta hiperactividad de Akt E17K se ve afectada por la disminución en sus niveles de SUMOilación. Estos resultados son muy alentadores y permitirán en el futuro intentar determinar la relación de la conjugación de SUMO a Akt con la participación de esta proteína en el desarrollo y progresión tumoral.

Abstract:
The protein kinase Akt is involved in a large variety of cellular processes such as survival, growth, proliferation, migration, angiogenesis, metabolism, stress resistance, among others. During the course of this thesis we discovered a new post-translational modification for this kinase, SUMO conjugation or SUMOylation. Performing point mutations we mapped the SUMO conjugation sites within this protein, the lysine residues 276 and 301. A double mutant protein K276R and K301R (“2KR”) showed lower levels of SUMOylation. Interestingly, over-expression of Akt1 2KR does not increase, and even inhibits phosphorylation levels of a global pattern of Akt substrates. In this regard, we demonstrated that SUMO conjugation to Akt is necessary for most of the studied processes in which this kinase participates, such as activation of the transcription factor NFkB, alternative splicing regulation, cell cycle progression and cell survival. However, the inhibitory role of Akt on FOXO1 transcription factor does not depend on its SUMOylation. Furthermore, alteration of Akt1 phosphorylation levels does not affect its SUMOylation levels and vice versa. Finally, we observed increased levels of SUMOylation in a hyperactive variant of this kinase (Akt E17K) found in various human tumors. This hyperactivity of Akt E17K is affected by the decrease on its SUMOylation levels. These results are very encouraging and will allow determining the connection between the conjugation of SUMO to Akt with the participation of this protein in tumor development and progression.

Depetris Chauvin, Ana. "Análisis de la transmisión de la información circadiana en Drosophila" (2013-07-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El control rítmico del comportamiento depende de la actividad de la red circadiana en el cerebro. En Drosophila existen dos modelos que dan cuenta del origen de las oscilaciones circadianas, uno basado en las oscilaciones moleculares de proteínas específicas y otro basado en la actividad de membrana. Por otra parte, desde el marcapasos central (las neuronas s-LNvs) la información circadiana es transmitida hacia el organismo a través de vías de salida entre las que se destaca el neuropéptido PDF. A su vez, las terminales dorsales de las s-LNvs presentan remodelamiento estructural diario pudiendo esto implicar cambios circadianos en los contactos sinápticos. En esta tesis probamos la validez del modelo basado en las oscilaciones moleculares como generador de las oscilaciones circadianas, mientras que determinamos a la actividad eléctrica de membrana como una importante vía de salida desde el marcapasos central. Demostramos que la actividad eléctrica de las neuronas PDF es crucial para determinar los niveles del neuropéptido en las terminales axonales, la plasticidad estructural y de las zonas sinápticas, con el consiguiente efecto sobre el comportamiento locomotor rítmico. Por otra parte, la realización de un screen de circuitos postsinápticos a las neuronas PDF utilizando la técnica de GRASP arrojó resultados que apoyan fuertemente nuestra hipótesis de cambios circadianos en la conectividad. En paralelo, determinamos a las metaloproteasas de matriz (MMPs) como reguladores claves de la plasticidad estructural de las neuronas PDF, así como a moléculas implicadas en fasciculación axonal y podado de neuritas. Como resultado de este análisis identificamos a MMP1 como un modulador del neuropéptido PDF, demostrando la importancia de MMP1 en el control de los ritmos circadianos.

Abstract:
Circadian control of behavior depends on the activity of clock neurons in the brain. Two models have been proposed for the generation of circadian oscillations in Drosophila, one based on the molecular oscillation of clock genes and the other one on cyclic membrane activity. Although most of the evidence supports a transcriptional/translational negative feedback loop as the most important one, its relevance has recently been questioned. From the master clock, localized in the s-LNv neurons in the fly brain, circadian information is transmitted through output signals such as the neuropeptide pigment dispersing factor (PDF). In addition, axonal terminals of the s-LNvs display daily structural plasticity and such remodeling could imply circadian changes on synaptic contacts of PDF neurons. In this thesis we demonstrated that molecular oscillations of clock genes are the basis of the circadian oscillator, and that the electrical activity coordinates output signals from the master clock. We also showed that electrical activity of PDF neurons affects the levels of the neuropeptide, abrogates the remodeling of the terminals and even reduces the number of synaptic active zones, ultimately controlling circadian locomotor activity. On the other hand, through a screen of postsynaptic targets using the GRASP technique we obtained data that strongly supports our hypothesis of circadian changes in connectivity. In parallel we investigated the relevance of matrix metalloproteinases (MMPs) in the control of the structural plasticity of the PDF neurons, as well as the importance of molecules involved in axonal fasciculation and pruning. As a result, we identified MMP1 as a new modulator of the neuropeptide PDF highlighting the relevance of MMP1 in the control of circadian locomotor behavior.

Carbonetto, María Belén. "Diversidad de las comunidades microbianas de los suelos pampeanos. Enfoques ecológicos y metagenómicos" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El suelo es uno de los ambientes más biodiversos y heterogéneos del planeta y los ciclos biogeoquímicos que en él suceden son de suma importancia para la vida. Estos procesos son llevados a cabo por microorganismos, mayoritariamente del grupo Bacteria y Arquea. A su vez, el suelo es un recurso esencial para los seres humanos ya que es su fuente principal de alimentos, pero como cualquier recurso natural, es finito. Por lo tanto el estudio del impacto de las modificaciones agrícolas en las características físicas, químicas y biológicas del suelo y por ende en los procesos del ecosistema, es imprescindible. El 50% de la superficie de Región Pampeana está dedicada a la agricultura. El impacto de las prácticas agrícolas sobre las características físicas y químicas del suelo, ha sido ampliamente estudiado en la región. Sin embargo, y más allá del gran esfuerzo realizado, todavía hay una deuda por comprender las consecuencias del uso agrícola sobre la biodiversidad y procesos biológicos. El trabajo aquí presentado pretende saldar parte de esta deuda estudiando el impacto que ejerce la agricultura sobre las comunidades bacterianas de suelos de la Región Pampeana. Se utilizaron técnicas de metagenómica y un enfoque ecológico. El primer capítulo se centró en estudiar el impacto de más de 100 años de agricultura sobre la estructura de las comunidades microbianas y sus perfiles metabólicos (metagenómicos). Se encontraron diferencias significativas entre comunidades de suelos con y sin historia de manejo agrícola. El segundo capítulo se dedicó a la comparación de dos sistemas de labranza. Se estudió la estructura de diversidad y el perfil metagenómico de comunidades de suelos bajo labranza convencional y bajo siembra directa. Vimos que las comunidades difirieron en su composición taxonómica y metabólica según el tipo de labranza a la cual fueran sometidas. El objetivo del tercer capítulo fue determinar el patrón regional de distribución bacteriano. Este análisis se realizó dentro del marco de la Teoría de Metacomunidades y utilizando datos de suelos con y sin historia de manejo de una transecta Este-Oeste que abarcó el gradiente edáfico y climático completo de la Región Pampena. Los resultados mostraron que los efectos de la dispersión fueron más importantes que los efectos contemporáneos a nivel regional, enmascarando así los impactos locales generados por el uso agrícola.

Abstract:
Soil is one of the most biodiverse and heterogeneous environments of Earth. Soil bio-chemical processes are essential for life and are carried out by microorganisms, mainly Bacteria and Archaea. Moreover soil is very important for humans, since it is the main source of food; but as any other natural resource it is not limitless. Though studying the impact of agriculture on soil physical, chemical and biological characteristics, and hence on ecosystem processes is imperative. The 50% of Pampas surface is devoted to agriculture. The impact of agricultural practices on soil physical and chemical properties has been extensively studied in the region. However, beyond the great effort made, there is a debt yet to understand the consequences of agriculture on biodiversity and biological processes. The work presented here aims to repay part of this debt by studying the impact of agriculture on soil bacterial communities of the Pampas. We used an ecological approach and 50% of the surface of Pampas is devoted to agriculture. The impact of agricultural practices on soil physical and chemical characteristics has been extensively studied in the region. However, beyond the great effort made, there is a debt yet to understand the consequences of agricultural biodiversity and biological processes. The work presented here aims to repay this debt of studying the impact that agriculture on soil bacterial communities of the Pampas. We used an ecological approach and metagenomics. The first chapter was focused on the study of the impact of over 100 years of farming on the structure of microbial communities and their metabolic (metagenomic) profiles. Significant differences between communities of soils with and without a history of agricultural management were found. The second chapter is devoted to the comparison of two tillage systems. We studied the structure and metagenomic profiles of soil communities under conventional tillage and no-tillage. We found that communities differ in their taxonomical composition and metabolisms. The aim of the third chapter was to determine the regional pattern of bacterial distribution. This analysis was performed within the framework of the theory of metacommunities. We sampled soils with and without soil management history, in an East-West transect that spanned the entire climatic and edaphic gradient of the Pampas. The results showed that dispersion was more important than environmental contemporaneous effects at the regional level, thus masking local impacts generated by agricultural use.

Moschen, Sebastián. "Identificación y caracterización funcional de genes candidatos asociados a la senescencia foliar en girasol basado en perfiles transcripcionales y metabólicos" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El proceso de senescencia en plantas es un mecanismo complejo controlado por múltiples variables genéticas y ambientales que condicionan el rendimiento de los cultivos. En el caso del girasol, el segundo cultivo oleaginoso en importancia económica para nuestro país, se trata de un proceso con impacto económico que interviene en la brecha existente entre el rendimiento potencial y el rendimiento real observado, por la mayor o menor oportunidad de las plantas para mantener el sistema fotosintético activo durante periodos prolongados. Los parámetros visuales resultan tardíos para evaluar el desencadenamiento y posterior tasa de evolución de la senescencia foliar. La clorosis, la variación en el contenido de clorofila así como también la necrosis de las hojas, son detectables mucho tiempo después que la señal iniciadora de la senescencia ha sido activada. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del proceso de senescencia en girasol a través de distintos niveles de organización: ecofisiológico, metabolómico, transcriptómico, culminando con la integración de los diversos enfoques ómicos mediante una aproximación de biología de sistemas, con el objetivo final de identificar potenciales biomarcadores asociados al proceso de senescencia en girasol. Se condujeron distintos ensayos que fueron realizados tanto a campo, en la Estación Experimental INTA-Balcarce como en invernáculo, en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar, para evaluar el progreso del proceso de senescencia tanto en condiciones naturales como controladas. Asimismo se evaluó la respuesta frente a condiciones de restricción hídrica impuesta en distintas etapas del desarrollo de las plantas. Se realizaron evaluaciones ecofisiológicas relacionadas con el avance de la senescencia, a través de la medición de variables como contenido de clorofila, azúcares solubles y nitrógeno total de hojas, mediciones a campo de área foliar verde, SPAD, intercepción de la radiación y materia seca por órganos, mediante las cuales fue posible evaluar la evolución del proceso en las diferentes hojas, en condiciones naturales de cultivo. Adicionalmente, se llevó adelante un análisis de los perfiles metabólicos utilizando técnicas de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) que permitió la optimización del protocolo de la extracción de metabolitos de hojas de girasol, y la detección de aproximadamente 60 metabolitos primarios incluyendo distintos aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y azucares alcohol. Asimismo se optimizó la tecnología de cromatografía iónica, mediante la cual se cuantificaron diferentes nutrientes iónicos relevantes durante el proceso de senescencia tales como nitratos, sulfatos, fosfatos entre otros. En forma paralela se llevó a cabo un estudio a nivel transcriptómico considerando tanto estrategias de genes candidato, mediante la búsqueda de secuencias putativamente ortólogas a girasol asociadas a senescencia en especies modelo, como el análisis concertado de expresión génica utilizando una micromatriz de oligonucleótidos desarrollada para esta especie. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos con la micromatriz, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre el total de los unigenes que mostraron un comportamiento diferencial y significativo para las distintas condiciones evaluadas, utilizando la metodología de Gene Set Analysis basado en modelos de regresión logística. De este modo se identificaron las diferentes categorías funcionales asociadas a bloques de genes con un patrón de expresión similar. La búsqueda de genes candidato se profundizó con la consulta de bases de datos de genes asociados a senescencia (SAGs del inglés: Senescence Associated Genes), así como también sobre aquellos genes con dominios de factores de transcripción como posibles desencadenantes de las cascadas de señalización de este proceso. Por último, se realizó la integración de los datos obtenidos a partir de distintas estrategias (fisiológicas, metabolómicas y transcriptómicas) utilizando una aproximación basada en biología de sistemas con el objetivo de identificar biomarcadores asociados a la senescencia en girasol. Para este fin se usaron los programas Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (García-Alcalde y col 2011) y Mapman (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm y col 2004) que fueron adaptados para su uso con datos provenientes de esta especie. Los resultados obtenidos a partir de la integración de datos mostraron una correspondencia entre los cambios detectados a través de los diferentes niveles analizados. A partir de una visión general del metabolismo celular se pudo observar una disminución de la actividad fotosintética y el crecimiento celular, y un incremento en el metabolismo de sacarosa, ácidos grasos, nucleótidos y aminoácidos así como también en aquellos procesos relacionados al reciclado de nutrientes. En particular, los factores de transcripción con dominios NAC, AP2- EREBP y MYB mostraron altos niveles de expresión y mayores niveles de correlación y co-expresión, puntualizándolos como importantes biomarcadores candidatos para la ejecución del programa de senescencia en girasol. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso de senescencia en girasol, así como a la selección robusta de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo del proceso, especialmente factores de transcripción. Estos últimos fundamentalmente, podrán ser validados a futuro sobre materiales de mejora para ser incorporados a los programas de mejoramiento asistido de este cultivo de gran importancia agronómica para nuestro país. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de la genómica y la post-genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol.

Abstract:
Leaf senescence is a complex mechanism controlled by multiple variables, either from genetical and environmental origin that has strong impact on crop yield. In sunflower, the second economically important oil crop in Argentina, the senescence process has an economic impact involved in the gap between potential and real yield observed due to the incapacity of the plants in keeping their green leaf area for longer periods. Visual parameters are belated to assess the onset and the evolution of leaf senescence. Chlorosis, variation in chlorophyll content as well as leaf necrosis is detected long after the triggering signal has been activated. The main objective of this work was the study of the senescence process in sunflower through different organization levels: ecophysiological, metabolomic, transcriptomic, and finally an integration of the different omics strategies using a systems biology approach, in order to identify potential biomarkers associated to leaf senescence in sunflower. Different experiments were conducted in both, field and greenhouse condition at INTA-Balcarce Experimental Station and at the Biotechnology Institute, INTA Castelar respectively, assessing the senescence process under natural and controlled conditions. Response to water restrictions imposed at different plant development stages was also evaluated. Ecophysiological assessments related to the senescence progress were performed through different measurements such as chlorophyll, soluble sugars and total leaf nitrogen content, field measurements of green leaf area, SPAD, interception of radiation and dry material by organ, allowing the evaluation of the senescence process progression in different leaves growing under natural field conditions. Additionally, metabolic profiles analysis was performed by using Gas Chromatography - Mass Spectrometry technique (GC-MS), allowing the metabolite extraction protocol optimization in sunflower leaves and the detection of approximately 60 primary metabolites, including different amino acids, organic acids, sugars and sugar alcohol. Likewise, it was possible to optimize the ion chromatography technology, leading to the quantification of relevant ionic nutrients content such as nitrates, sulphates, phosphates and others, along the senescence process. In parallel, transcriptomic studies were performed considering both, candidate gene strategies by searching of sunflower orthologous gene sequences reported as senescence associated in model species, as well as through a concerted expression analysis using a customized oligonucleotide microarray developed for this species. Statistical functional enrichment analysis was conducted over the complete significant unigenes set derived from the microarray assay, for each evaluated conditions, using Gene Set Analysis methodology based on logistic regression models. In this way, different functional categories were identified for gene clusters with similar expression patterns. Moreover, the exploration for candidate genes was deepened by searching into the senescence associated gene databases for model species, as well as by identification of putative triggers of the signalling pathways leading to senescence in sunflower among the transcription factor domains gene database. Finally, a systems biology approach was achieved in order to integrate the information from the different physiological, metabolomic and transcriptomic strategies with the aim to identify biomarkers associated with leaf senescence in sunflower. These analyses were performed using Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (Garcia-Mayor et al 2011) and Mapman software (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm et al 2004) that were adapted for sunflower data. These results showed a correspondence between the changes detected by the different strategies. Through a metabolism overview, a decrease of photosynthetic activity and cell growth was detected. Moreover, sucrose, fatty acids, nucleotides and amino acids metabolism as well as those pathways related to nutrient recycling processes showed an up-regulation during leaf development. In particular, NAC, AP2-EREBP and MYB transcription factors showed high expression levels and higher levels of correlation and co-expression making them important candidates biomarker in the execution of the senescence program in sunflower. The results of this work contributed to the knowledge of the molecular mechanisms involved at the onset and evolution of the senescence process in sunflower as well as to the identification of robust candidate genes involved in the different developmental stages of this process, especially transcription factors. These genes could be further validated on breeding materials to be incorporated into assisted breeding programs for this agronomic important crop for our country. Furthermore, the strategies, methodologies, tools and knowledge developed in this thesis, contribute to the crop development and promote the adoption of genomics and post-genomics in the different stages of sunflower breeding.

Ferder, Ianina C.. "Implicancias del gen FMR1 en la función ovárica" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El gen FMR1, responsable del Síndrome de Fragilidad del X (SFX), se localiza en el sitio FRAXA en el brazo largo del cromosoma X (Xq27.3), está compuesto por 17 exones, abarca aproximadamente 38 kilobases (kb) y su producto transcripcional es un ARN mensajero de 3,9 kb que puede sufrir splicing alternativo. En su región 5’ no codificante presenta una zona de tripletes CGG que puede variar en longitud. Según el tamaño de la expansión, los alelos se clasifican en normales (5- 44 repeticiones), intermedios (45-54 repeticiones), premutados (55- 200 repeticiones) o con mutación completa (>200 repeticiones). Mientras que la mutación completa es la causante del SFX, el estado de premutación se asocia a otros 2 desórdenes clínicos: Síndrome de temblor/ ataxia asociado a la Fragilidad del X (FXTAS), un desorden neurodegenerativo de inicio tardío y a la Insuficiencia Ovárica Primaria (IOP) asociada a la Fragilidad del X (FXPOI). La IOP se define como la presencia de amenorrea (de al menos 4 meses) antes de los 40 años, que se acompaña de un aumento en los niveles séricos de FSH (a niveles menopáusicos) y de bajos niveles de estradiol (hipoestrogenismo). Es un síndrome muy heterogéneo de patogénesis multicausal tales como alteraciones cromosómicas, enzimáticas, autoinmunidad, causas iatrogénicas e infecciosas. Tiene una incidencia del 1% en mujeres menores de 40 años y del 0,1% en menores de 30. FXPOI es la causa genética conocida más común de la IOP 46, XX y la premutación en FMR1 es responsable del 4- 6% de todos los casos de IOP 46, XX. Aproximadamente el 2% de las mujeres 46, XX con IOP aislada y el 14% de la mujeres 46, XX con IOP familiar son portadoras de la premutación en el gen FMR1. Asimismo, se ha descripto que alrededor del 20% de las mujeres portadoras de la premutación desarrollan IOP. A su vez, las mujeres portadoras se vuelven menopáusicas aproximadamente 5 años antes que las no portadoras. Si bien no todas las mujeres portadoras de la premutación experimentan una temprana pérdida de la fertilidad, todas ellas enfrentan el potencial adelantamiento en la aparición de condiciones asociadas con la deficiencia estrogénica (aumento en el riesgo de osteoporosis y de enfermedades cardiovasculares). Estudios genéticos epidemiológicos sugieren que el comienzo y la gravedad de la disfunción ovárica asociada a FXPOI son variables y podrían estar moduladas, potencialmente, por el largo de las repeticiones CGG y otros factores ambientales. El status de premutación per se pareciera estar influyendo en la expresión de la enfermedad. De hecho, no se ha descripto que mujeres que poseen expansión completa de tripletes (>200 repeticiones y con signos clínicos de Síndrome de Fragilidad del X) desarrollen IOP. Si bien no se conoce el mecanismo por el cual la premutación del gen FMR1 puede causar la disfunción ovárica y la insuficiencia ovárica primaria, se ha postulado que puede ocurrir una disminución inicial del número de folículos o una velocidad acelerada de la atresia. Es sabido que la proteína que codifica este gen, FMRP, se expresa en altas cantidades en células germinales del ovario fetal. Asimismo, se ha descripto que esta proteína actúa como inhibidor de la traducción de algunos ARN mensajeros formando parte de los procesos de silenciamiento génicos mediados por miRNAs. Teniendo en cuenta su función, se ha postulado como posible hipótesis de la patogenia, que un aumento de FMRP en estadios tempranos del desarrollo de los ovocitos podría conducir a una haploinsuficiencia de proteínas involucradas en este proceso, provocando una disminución del pool inicial de folículos. Sin embargo, y dado que en FXTAS se ha observado un aumento del ARN mensajero del gen como consecuencia de la premutación, se postula como mecanismos alternativo la existencia de un aumento del ARN mensajero en el ovario que ejerza un efecto tóxico en el tiempo, con el consecuente incremento de la atresia folicular. Ninguno de estos mecanismos han sido aún comprobados en el ovario, más aún la función fisiológica de la proteína en el mismo no está establecida. No se conoce además, si existe expresión diferencial a lo largo del desarrollo folicular. Considerando la escasa información que existe acerca de FMR1 y su expresión en ovario, nuestro trabajo consistió, en una primera fase, en el estudio de la expresión de la proteína FMRP y su mensajero a lo largo de la foliculogénesis, en un modelo de rata. Se utilizaron 3 grupos de ratas: ratas prepuberales de 18 días, ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con dietilestilbestrol (DES) para enriquecer a los ovarios en folículos antrales tempranos y ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con gonadotrofina coriónica equina (PMSG) para enriquecer los ovarios en folículos preovulatorios. En la primera parte del trabajo analizamos, por inmunohistoquímica, la expresión de FMRP en los distintos tipos celulares del folículo. Hallamos que la proteína se expresa en células de la granulosa, de la teca y en células estromales, con excepción de un grupo de células que rodea al folículo. La expresión se detectó en los folículos en los tres estadios del desarrollo estudiados: preantrales, antrales tempranos y preovulatorios. La expresión de la proteína FMRP fue estudiada también por Western blot en los tres tipos foliculares. Observamos una menor expresión en folículos preantrales y una mayor expresión en estadios más avanzados de la foliculogénesis. Por otra parte, se detectaron al menos 4 isoformas de la proteína cuyos patrones de expresión resultaron diferentes a los observados en testículo y cerebro. Teniendo en cuenta la función de la proteína como parte del complejo de silenciamiento post-transcripcional, estos resultados nos permitirían estimar que las diferencias observadas en los niveles de expresión de la proteína tendrían un rol en el correcto desarrollo del folículo. Asimismo, la presencia de isoformas distintivas en el ovario sugeriría una función específica para algunas de ellas en la gónada. La segunda parte del trabajo consistió en el estudio de la expresión del ARN mensajero de Fmr1 en los 3 estadios foliculares. Por PCR en tiempo real observamos que el patrón de expresión era opuesto al que se obtuvo para la proteína. En los folículos preovulatorios, el nivel del ARN fue menor respecto al de los estadios anteriores. Estos resultados sugerirían que la expresión del mensajero y su proteína en el ovario están regulados de manera diferente y posiblemente independiente. Por otro lado, identificamos por RT-PCR y posterior secuenciación, la existencia de varias isoformas del ARNm del gen, resultantes del splicing alternativo del mismo. Entre ellas, detectamos la isoforma que contiene al exón 12, la cual no ha sido previamente descripta en rata. El último aspecto que quisimos abordar en nuestro estudio fue el efecto biológico de la introducción de tripletes en el rango de la premutación sobre una línea celular de células de granulosa humana (KGN). Par tal fin se transfectaron las células con un plásmido conteniendo tripletes en el rango normal o de la premutación, río arriba de un gen reportero (GFP). Luego de 18 horas de transfección, los niveles de ARNm del gen reportero resultaron más elevados en las células que poseían los tripletes en el rango de la premutación, en concordancia con lo observado en diferentes experimentos y pacientes con FXTAS. Asimismo, detectamos una menor cantidad de células que expresan la proteína GFP, en presencia del plásmido con la premutación, en todos los tiempos de transfección estudiados. A nivel neuronal se ha relacionado al estado de premutación con posibles efectos apoptóticos en la célula. Si bien nuestros estudios aún no demuestran que el efecto de la introducción de tripletes en el rango de la premutación resulte en un aumento en la apoptosis de las células KGN, los resultados obtenidos en esta tesis abren la posibilidad de que este mecanismo sea analizado en un futuro. En conclusión, en esta tesis se describe por primera vez la expresión de la proteína FMRP y de su mensajero a lo largo del desarrollo folicular, y la presencia de algunas isoformas distintivas, producto del splicing alternativo del gen. Asimismo, se iniciaron los estudios tendientes a demostrar el efecto patogénico que posee la expresión de tripletes expandidos en células del ovario.

Abstract:
The FMR1 gene, responsible for the Fragile X Syndrome (FXS), is located in the FRAXA site of chromosome X. The gene is composed of 17 exons, spans about 38 kb and encodes an messenger RNA (mRNA) of 3.9 kilobases (kb) that can be alternatively spliced into a number of different isoforms. The 5’ UTR of the FMR1 gene presents a CGG repeat that is unstable and therefore variable. Based on the size of the expansion, alleles are classified as normal (5–44 trinucleotide repeats), intermediate (45- 54 repeats), premutated (55–200 repeats), or fully mutated (>200 repeats). While full mutation is the responsible for FXS, the premutation condition has been associated to other 2 clinical disorders: Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS), a neurodegenerative disorder of late onset and to the Fragile X- associated primary ovarian insufficiency (FXPOI). Primary ovarian insufficiency (POI) is defined as amenorrhea (for at least 4 months) before age of 40, an increase in serum levels of FSH (to menopausal levels) and low levels of estradiol (hypoestrogenism). This syndrome is very heterogeneous with a multicausal pathogenesis, and any of the following: chromosomal, enzymatic, iatrogenic, autoimmune or infectious aberration may be the cause of the disease. It has an incidence of 1% in women under age of 40 and of 0.1% below 30 years of age. FXPOI is the most common known genetic cause for IOP and the premutation condition is responsible for 4-6% of all cases of 46, XX IOP. About 2% of women 46, XX with IOP and 14% of women 46, XX with familial IOP, carry the premutation in the FMR1 gene. Moreover, it has also been described that around 20% of women carrying the premutation, become menopausal around 5 years earlier than not carriers. The premutation status seems to influence the expression of the disease. In fact, no full mutated women with IOP have been described. While not all women carries of the permutation experience an early loss of fertility, all carriers face the potential advance in the onset of the conditions associated with estrogenic deficiency (higher risk for osteoporosis and hearth diseases). Epidemiologic genetic studies also suggest that the onset and severity of ovarian dysfunction associated to FXPOI is variable, and could be potentially modulated by the CGG repeat length and environmental factors. Even though the underlying mechanism by which the FMR1 premutation is responsible for the ovarian dysfunction and POI is not known, it has been suggested that an initial decrease of the number of follicles or an accelerated rate of atresia may take place. The protein encoded by the FMR1 gene, FMRP, is highly expressed in germ cells in the fetal ovary. The protein acts as a translation inhibitor of some target mRNA, most likely via the microRNA silencing complex. Given that in FXTAS an increase in FMR1 mRNA has been observed, another possible mechanism for FXPOI is that high levels of mRNA exert a toxic effect causing an increase in follicular atresia. None of the postulated pathogenic mechanisms has been demonstrated in the ovary. Moreover, the physiological role of FMRP in the gonad has not been established, and the expression pattern of the protein during follicular growth remains unknown. Considering that there is limited information related to FMR1 expression and function in the ovary, the goal of our work was, initially, to study the expression of FMRP protein and its messenger during folliculogenesis in a rat model. For this propose, three groups of rats were used: 1- prepubertal rats of 18 days, 2- prepubertal rats of 21-23 days treated with Diethylstilbestrol (DES) to enrich ovaries with early antral follicles and 3- prepubertal rats of 21-23 days treated with equine chorionic gonadotropin (PMSG) to enrich ovaries with preovulatory follicles. The expression of FMRP in the rat ovarian follicular cells was analyzed by immunohistochemistry (IHQ) and Western blot (WB). By IHQ we found that the protein is expressed in granulosa, theca and stromal cells, except in a group of cells surrounding the follicle, mainly in the cytoplasm. Expression was detected in follicles at all stages of folliculogenesis: preantral, early antral and preovulatory. After WB assays, lower expression in preantral follicle was detected, whereas higher levels of FMRP were observed in later stages of folliculogenesis. Moreover, at least 4 isoforms of the protein were detected whose expression pattern differed from that observed in testis and brain. Considering FMRP’s function as part of the post -transcriptional silencing complex, these results may suggest that the differences observed at FMRP expression levels, could exert a role in the proper development of the follicle. Furthermore, the presence of distinctive isoforms in the ovary could imply a specific function for some of them in de gonad. In the second part of the work we studied the messenger RNA (mRNA) expression of Fmr1 in the three follicular development stages. Using quantitative RT-PCR (qRT-PCR) we found that the mRNA expression pattern was opposite to that observed for the protein: in preovulatory follicles, mRNA level was lower compared to earlier stages. These results suggest that mRNA and protein expression in the ovary may be regulated at different and perhaps independent levels. In addition, by RT-PCR and subsequent sequencing, we identified several messenger isoforms resulting from alternative splicing. Among them, we detected the variant including exon 12, which has not been previously described in other rat tissues so far analyzed. The last aspect we addressed in our work was the biological effect that the CGG repeats in the permutation range could exert on a human ovarian granulosa cell line (KGN). Cells were transfected with a plasmid containing repeats in the normal or in the premutation range cloned upstream of the GFP reporter gene. After different times of transfection, mRNA of the reporter gene was measured by qRT- PCR. We found that after 18 hours, the levels of mRNA was higher in cells transfected with the repeats in the premutation range comparing to the levels found for those with the normal one. These results are in agreement with the observations reported for FXTAS patients and for animal models of the syndrome. Moreover, when cells were transfected with the permutated plasmid, we detected fewer cells expressing the GFP protein in all the transfection times assayed. In neurons, the permutation state has been associated with possible apoptotic effects in the cell. Even though our preliminary studies do not yet show that transfection of KGN cells with the premutation plasmid results in increased apoptosis, the results obtained in the present work open the possibility for this mechanism to be analyzed in a future. In conclusion, this work describes, for the first time, the expression of the FMRP protein and its messenger during folliculogenesis in a rat model. Moreover, the presence of some distinctive isoforms resulting from the alternative splicing of the gene in the ovary is also described. Although we found an increase in mRNA levels and reduced protein expression of the reporter gene containing permutated repeats, further studies are needed to elucidate the pathogenic mechanism of the expanded triplets in the ovary.

Mansilla, Sabrina Florencia. "La degradación de p21 inducida por luz UV facilita la replicación de ADN lesionado y preserva la estabilidad genómica" (2014-03-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Mientras que el incremento en los niveles del inhibidor de quinasas dependiente de ciclinas p21 ha sido reportado extensamente en respuesta a variados tratamientos genotóxicos, lo opuesto ocurre en respuesta a la irradiación UVC en donde p21 disminuye sus niveles de expresión como consecuencia de una proteólisis. Esta degradación sugiere que p21 podría estar reprimiendo algún proceso relevante para la respuesta celular a la irradiación UVC. En este trabajo demostramos que la estabilización forzada de p21 luego de luz UV bloquea la replicación sobre ADN lesionado. Este impedimento está relacionado con un defecto en el reclutamiento de polimerasas especializadas necesarias para replicar sobre ADN dañado, que forman parte de un proceso conocido como Síntesis de ADN por Translesión, TLS, (del inglés Translesion DNA Synthesis). Los defectos observados en la replicación de ADN lesionado correlacionan con un aumento en los marcadores de estrés replicativo, inestabilidad genómica y aumento de la muerte celular. Interesantemente estos efectos deletéreos desaparecen si se remueve el sitio de unión a PCNA, (PIP box) de p21, sugiriendo que la perdida de interacción entre p21 y PCNA es suficiente como para permitir el reclutamiento de proteínas de unión a PCNA (como las polimerasas especializadas) relevantes para la respuesta a irradiación UV. Por otro lado la expresión de una construcción degradable de p21 tuvo un efecto transiente sobre los eventos de replicación temprana y sobre el reclutamiento de las polimerasa de TLS en respuesta a irradiación UV. Estos defectos temporarios desaparecen en correlación con la degradación de p21, sin observarse consecuencias sobre eventos de replicación tardía o sobre la estabilidad genómica. En conjunto, nuestros datos sugieren que la función biológica asociada a la degradación de p21 en respuesta a irradiación UV es la de promover la replicación sobre ADN lesionado a través de una correcta y efectiva activación de los eventos de TLS.

Abstract:
While many genotoxic treatments upregulate the ciclin kinase inhibitor p21, agents such as UV irradiation trigger p21 degradation. This suggests that p21 blocks a process relevant for the cellular response to UV. Here we show that forced p21 stabilization after UV strongly impairs damaged-DNA replication, which is associated with permanent deficiencies in the recruitment of DNA polymerases from the Y family (involved in translesion DNA synthesis -TLS), with the accumulation of DNA damage markers and increased genomic instability. Remarkably, such noxious effects disappear when disrupting the PCNA interacting motif (PIP) of stable p21, thus suggesting that the release of PCNA from p21 interaction is sufficient to allow the recruitment to PCNA of partners (such as Y polymerases) relevant for the UV response. Expression of degradable p21 only transiently delays early replication events and Y polymerase recruitment after UV irradiation. These temporary defects disappear in a manner that correlates with p21 degradation with no detectable consequences on later replication events or genomic stability. Together, our findings suggest that the biological role of UV- triggered p21 degradation is to prevent replication defects by facilitating the tolerance of UV-induced DNA lesions.

Kamm, Gretel Betiana. "Bases genéticas de la evolución del cerebro humano: estudio evolutivo y funcional del gen NPAS3" (2014-04-24) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Comprender el origen y la evolución del cerebro humano es uno de los desafíos más sobresalientes que enfrenta la ciencia. Los cambios genéticos que llevaron a la adquisición de las capacidades distintivas del cerebro humano están codificados en nuestro genoma. La disponibilidad de más de cincuenta genomas de vertebrados permite hoy reconstruir nuestra historia evolutiva. Nuestra hipótesis es que la adquisición de nuevos patrones de expresión de genes relacionados con el desarrollo y la función cerebral en el linaje humano, habría sido crítica para la evolución de las capacidades cognitivas excepcionales de nuestro cerebro. Haciendo uso de bases de datos públicas de secuencias no codificantes conservadas con evidencia de evolución acelerada en el linaje humano (denominados HAEs por human accelerated elements), se encontró que el factor de transcripción neuronal PAS domain-containing protein 3 (NPAS3) contiene 14 HAEs, el mayor número de HAEs para un solo gen en todo el genoma humano. Usando un ensayo de expresión en peces cebra transgénicos se demostró que 11 de los 14 HAEs son capaces de activar la expresión de la proteína reportera EGFP durante el desarrollo embrionario, particularmente en el sistema nervioso. Además, utilizando ratones transgénicos, se realizó un análisis comparativo estudiando los patrones de expresión de uno de los HAEs de NPAS3 y secuencias ortólogas de chimpancé y ratón. El enhancer humano muestra una extensión del patrón de expresión en el telencéfalo. Este cambio humano específico pudo haber contribuido con la evolución de alguna de las características de nuestro cerebro.

Abstract:
Understanding the origin and evolution of the human brain is one of the greatest challenges that today science faces. The genetic changes that led to the acquisition of the distinctive capacities of the human brain are encoded in our genome. The availability of more than fifty vertebrate genomes allows unraveling our evolutionary history. Our hypothesis is that the acquisition of new expression patterns in the human lineage of genes involved with the development and functioning of the brain would have been critical for the evolution of our unique cognitive capacities. Using public databases of human accelerated conserved non coding sequences (HAEs or human accelerated elements), we found that the transcription factor neuronal PAS domain-containing protein 3 (NPAS3) contains 14 HAEs, the largest number detected for a human gene. Using an enhancer transcription assay in transgenic zebrafish we show that 11 out of the 14 HAEs activated the expression of the reporter gen EGFP during zebrafish development in the central nervous system. In addition, using transgenic mice we performed an expression pattern comparative analysis of human, chimpanzee and mouse ortholog sequences of a selected HAE. We found that the human enhancer shows an extended expression pattern in the forebrain. This human-specific change could have contributed to the evolution of some of the distinctive capacities of our brain.

Rodríguez Batiller, María José. "Regulación de la expresión de genes en plantas por fotorreceptores" (2014-06-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La luz es uno de los factores más importantes en el desarrollo de las plantas. Las mismas poseen sistemas que les permiten percibir la calidad, intensidad, dirección y duración de la luz. Existen fotorreceptores específicos que registran la señal lumínica, la cual es traducida produciendo cambios en la expresión de los genes. Los fitocromos pertenecen al grupo de fotorreceptores que absorben predominantemente longitudes de onda del rojo (R) y rojo lejano (RL). El promotor del gen Lhcb es regulado por la luz a través del sistema de los fitocromos, ya que responde a muy bajas fluencias (VLFR) y altas irradiancias (HIR) de luz mediante el fitocromo A, y a bajas fluencias (LFR) de luz mediante el fitocromo B. El análisis del promotor Lhcb reveló un motivo necesario para la respuesta HIR pero no para la respuesta VLFR. Este motivo es a su vez necesario para la unión de la proteína BEL-LIKE HOMEODOMAIN 1 (BLH1) al promotor, lo cual se pudo observar tanto en experimentos in vitro como en experimentos de simple híbrido en levaduras. Sustituciones de promotor que aumentaron la unión de BLH1 también aumentaron la respuesta HIR. En contraparte, plantas mutantes blh1 mostraron una disminución en la respuesta al RL continuo pero mantuvieron valores normales a los pulsos de RL. Esto indica que el factor de transcripción BLH1 regula específicamente el HIR y no la VLFR del fitocromo A. De este modo se pone de manifiesto un mecanismo central de control de la sensibilidad a la luz por las plantas. Entre las diversas proteínas de la familia BLH se encuentran las proteínas BLH6 y BLH5, las cual es se caracterizan por presentar una alta homología estructural con la proteína BLH1. Se estudió la expresión de BLH1 y BLH6 en plantas deficientes en blh1 y blh6 y dobles mutantes blh1 blh6. Por la medida de expresión del gen β-glucuronidasa se pudo determinar que existe una regulación mutua entre las proteínas BLH1 y BLH6. Estudios fisiológicos sobre múltiples mutantes blh1, blh5 y blh6, indicaron una función aditiva de miembros de la familia BLH.

Abstract:
Light is one of the most important in plant growth factors. Plants possess sensory systems that allow them to perceive quality, intensity, direction and duration of light. Specific photoreceptors perceive selected light signals, which are transmitted to produce changes in the expression of genes. Phytochromes absorb predominantly red light (R) and far-red light (FR). The promoter of the Lhcb1*2 gene is regulated by light through the system of phytochromes, as phytochrome A mediates the very-lowfluence responses (VLFR) and the high-irradiance responses (HIR), and phytochrome B mediates the low-fluence responses. Lhcb1*2 promoter analysis revealed a motif necessary for HIR but not for VLFR. This motif is necessary for binding of the protein BEL-LIKE HOMEODOMAIN 1 (BLH1) to the promoter, as revealed by both in experiments in vitro and experiments using the one hybrid system in yeast. Substitutions that increased promoter binding BLH1 also increased HIR. The blh1 mutant showed a decrease in the response to continuous FR but retained normal to pulses of RL values. This indicates that the transcription factor BLH1 specifically regulates the HIR but not the VLFR of the phytochrome A. This reveals a mechanism of control of sensitivity to light in plants. Among the various members of the BLH family, the BLH5 and BLH6 proteins are characterized by high structural similarity to BLH1. There is mutual regulation of expression between BLH1 and BLH6 proteins. Physiological studies involving double and triple mutants among blh1, blh5 and blh6 indicate an additive function of BLH family members.

Taboas, Melisa. "Estudio de mutaciones noveles como causa de la deficiencia de 21-hidroxilasa" (2014-09-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Con el nombre de Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) se conoce a un conjunto de enfermedades autosómicas recesivas en las que se encuentra afectada la esteroidogénesis adrenal. En el 95% de los casos, la HSC se produce por deficiencia de la enzima 21- hidroxilasa. Esta deficiencia puede manifestarse en forma severa o clásica (FC), o leve o no clásica (FNC). La enzima está codificada por el gen CYP21A2, que se encuentra duplicado y repetido en tándem junto a un pseudogen CYP21A1P con el que comparte 98% de identidad de secuencia. La elevada identidad de secuencia produce que la región sea propensa al alineamiento incorrecto y a la recombinación desigual, como así también a la transferencia de secuencias del pseudogen al gen mediante el mecanismo de conversión génica. La mayor parte de los afectados son compuesto heterocigotas ya que poseen diferentes mutaciones en cada uno de sus alelos. En estos casos, la manifestación clínica de la enfermedad será aquella que se relaciona con el alelo con mayor actividad enzimática. Si bien la mayor parte de los pacientes presentan mutaciones derivadas del pseudogen, hasta la fecha se identificaron más de 240 mutaciones diferentes como causales de la patología. En un trabajo previo de nuestro laboratorio se analizó la presencia de las 10 mutaciones más frecuentes derivadas del pseudogén en pacientes con deficiencia de 21-hidoxilasa de nuestra población. En esta tesis se estudió por secuenciación todo el gen CYP21A2 y su región promotora en muestras de ADN de 87 pacientes (15 FC y 72 FNC) en los cuales restaba determinar el defecto causante de la patología en uno o en ambos alelos del gen. Nuestro análisis reveló la presencia de 12 mutaciones poco frecuentes ya descriptas previamente y 7 mutaciones noveles, 6 en la región codificante y 1 en un sitio aceptor de splicing en el intrón 5. Para todas las mutaciones noveles halladas se analizaron 50 individuos de la población general mediante amplificación de la región de interés y cortes con enzimas de restricción y en ningún caso se halló la presencia de las mismas. Se hallaron asimismo, variantes de secuencias no descriptas previamente en regiones promotoras e intrónicas que se clasificaron como polimorfismos ya sea porque las mismas se observaron también en individuos de la población general, o bien porque no se encuentran en sitios que a priori pudieran afectar el splicing, respectivamente.A los efectos de analizar la implicancia biológica de las mutaciones noveles halladas, se realizaron aproximaciones bioinformáticas y ensayos funcionales. Dado que la proteína CYP21A2 humana no está cristalizada, la misma se modeló mediante herramientas in silico a partir de 18 cristalografías de otras proteínas de la familia CYP. Una vez obtenido el modelo, se analizó la estabilidad de las mutantes aminoacídicas halladas que no generaban corrimiento del marco de lectura. Las predicciones indicaron cambios en la estabilidad y/o carga de la superficie de la proteína que sugerirían un posible efecto deletéreo de las mismas. Para los ensayos funcionales, se realizaron mutagénesis dirigidas sobre un vector que contiene al ADNc de CYP21A2, transfección en células COS-7 y estimación de la expresión de la proteína y de su actividad mediante Western Blot y cromatografía en placa delgada (TLC), respectivamente. En todos los casos, las mutantes presentaron una actividad enzimática residual (AER) entre el 15 y el 50%, que se corresponderían con alelos relacionados a la FNC de la patología. En uno de los pacientes, una de las mutaciones noveles se encontraba en el mismo alelo con otra descripta previamente. Los ensayos funcionales demostraron que si bien las mismas en forma aislada son leves, la presencia de ambas en cis predice un alelo severo con una AER cercana al 2%. Para algunas de las mutaciones puntuales y para la doble mutante se observó una disminución en la cantidad de proteína resultante. Para la mutación en el sitio aceptor de splicing en el intrón 5, los análisis bioinformáticos predijeron la anulación del sitio canónico y la presencia de 2 sitios crípticos de splicing, uno en la mitad del intrón 5 y otro en el exón 6. Para evaluar la eficiencia de splicing in vitro, los estudios funcionales consistieron en la construcción de un minigén mediante amplificación de un fragmento entre el exón 4 y el exón 7 del gen, posterior clonado en un vector de expresión, transfección en células HeLa, HEK-293 e Y-1 y valoración del ARNm obtenido por RTPCR. Los ensayos revelaron que la mutante presentaba un ARNm más corto que la salvaje producto de una deleción de 16 nucleótidos debido a la utilización del sitio críptico de splicing dentro del exón 6. Esta deleción generaría un codón de terminación prematuro que predice un alelo severo relacionado con la FC de la patología. Mediante este estudio, el genotipo se completó en 27 de los 87 pacientes (100% de los pacientes FC y 16,6% FNC). Estos resultados señalarían que es probable que el valor de 17- hidroxiprogesterona (17-OHP) post estímulo con ACTH (test que se realiza para incluir a los pacientes de la FNC), esté sobreestimando la prevalencia de la patología. A los efectos de disciminar si los valores hormonales difieren entre los pacientes FNC totalmente genotipificados y aquellos que no, se compararon los valores hormonales de 17-OHP basal y post estimulación con ACTH, así como los de Dehidroepiandrosterona-sulfato (DHEA-S), Testosterona (T) y Androstenediona (A) de 271 pacientes diagnosticados como FNC. Los mismos fueron agrupados de acuerdo a si poseen los 2 alelos mutados, uno o ninguno. Los resultados obtenidos indican que no hay diferencias significativas entre los grupos estudiados cuando se analizaron los valores de A, T y DHEA-S. Sin embargo, en el caso de 17-OHP basal y post ACTH, se observan diferencias significativas entre aquellos que poseen ambos alelos con mutación y los demás grupos de estudio. Asimismo, se observó que si los pacientes presentaban valores de 17-OHP post ACTH entre 10 (valor hormonal de corte para la inclusión de pacientes) y 20 ng/ml, sólo en el 23% se hallaban los 2 alelos mutados Si el valor hormonal era mayor a 20 ng/ml, el 85% posee ambos alelos con mutación. Por último, analizando los genotipos encontrados en todos los pacientes de nuestra cohorte, ya sea mediante secuenciación o mediante el estudio de las 10 mutaciónes más frecuentes, observamos que en un 97,7% de los pacientes el fenotipo se correspondía con el genotipo hallado. Las principales discordancias se hallaron en pacientes con la mutación p.I172N, ya que la misma se asoció tanto a la forma virilizante simple (VS) como a la forma perdedora de sal. Por otro lado, si bien la mutación p.R356W está altamente relacionada a la forma PS de la enfermedad, un paciente VS presentaba esta mutación en heterocigosis compuesta con otra mutación que predice una enzima sin actividad en el alelo homólogo. Asimismo, en la literatura se describe a la mutación poco frecuente p.H62L como una mutación leve y asociada a la FNC de la patología. En esta tesis, sin embargo, se refiere que la misma se relacionaría también con la forma VS de la enfermedad. Por último, la mutación poco frecuente p.R341P se asocia a la forma VS, si bien en este trabajo se describe un paciente PS que poseía esta mutación en heterocigosis compuesta con la mutación c.283-13A/C>G en el otro alelo.

Abstract:
Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) is an autosomal recessive disease caused, in 95 % of cases, by the deficiency of the 21–hydroxylase enzyme. This disorder, which is the most frequent inborn error of metabolism, has a broad spectrum of clinical forms, ranging from severe or classical, which includes the salt-wasting (SW) and simple virilising (SV) forms, to the mild late onset or non-classical form of CAH (NCCAH). The enzyme is encoded by the CYP21A2 gene, which is duplicated and repeated in tandem along with the CYP21A1P pseudogene with which it shares 98 % of sequence identity. The high degree of sequence identity makes this region prone to misalignment and unequal recombination, as well as the transference of sequences from the pseudogene to the gene by gene conversion. Although most of the patients presented pseudogene derived mutations, approximately 240 mutations haven been described up to date. In this work, DNA from 87 patients (15 CCAH and 72 NCCAH) was analyzed by complete gene sequencing. In these patients the determination of the defect causing the disease remained inconclusive after the study of the 10 most frequent pseudogen-derived mutations. We found 12 less frequent mutations previously described, and 7 novel ones, 6 of them in the coding region and one in an acceptor splice site in intron 5. For all the novel mutations, DNA from 50 randomly selected individuals from the general population were analyzed by PCR amplification followed by restriction enzyme assays, but none of these mutations were found. We also found novel sequence variants in in the promoter region of the gene and in introns that were classified as polymorphisms, either because they were found in individuals from the general population, or because they are placed in regions that might not affect splicing outcome, respectively. In order to study the biological consequences of the novel mutations, bioinformatic approaches and functional assays were performed. Since human CYP21A2 was not crystallized yet, the protein was modeled by means of in silico tools using 18 other CYP proteins as templates followed by the estimation of the mutant protein stability. Molecular modeling studies revealed changes in the stability and/or surface charge of the protein that could be related to the clinical manifestations found in the patients. For functional assays, site-directed mutagenesis of a vector containing the CYP21A2 cDNA were performed, followed by transfection into COS-7 cells and estimation of the protein expression by Western blotting (WB) and its activity by TLC. In all cases, the mutants showed a residual enzymatic activity (REA) lesser than 50% of the wild type protein. Accordingly, all the variants predict alleles compatible to the mild NCCAH form of the disease. In one patient, one of the novel mutations was found in the same allele with another previously described. Functional assays showed that while the mutations in isolation are mild, the presence of both mutations in cis predict a severe allele with a REA close to 2%. In the WB assays, some of the isolated mutants and the double one showed less amount of the protein in comparison with the wild type. For the novel mutation in the acceptor splcing site of intron 5, in silico analyses predicted the disruption of the canonical site. Besides, two strong putative cryptic splicing sites, one located in the intron 5 and one in exon 6 were predicted. For functional assays, splicing reporter minigenes were constructed comprising the genomic region from exon 4 to exon 7 of the CYP21A2 gene. The vector was transiently transfected into HEK-293, HeLa, Y-1 cells and splicing was assessed by RT-PCR. We demonstrate that the allele with the intron 5 mutation completely abolishes the use of the canonical splicing site. Instead, the use of the cryptic splicing acceptor site within exon 6 created an mRNA with a 16 nt deletion leading to the appearance of a premature stop codon. A severe allele related to the classical form of the disease is strongly suggested by this mutation. After our work, the genotype was completed in 27 out of 87 patients (100 % of the CCAH and 16,6% of the NCCAH). This results may indicate that the currently cut-off hormonal levels used for the diagnosis of NCCAH is overestimating the prevalence of the disease. To evaluate if hormone values differ between the NCCAH patients fully genotyped and those with at least one non-determined allele, basal and post ACTH stimulation 17-hydroxyprogesterone (17-OHP), dehydroepiandrosterone-sulfate (DHEA-S), testosterone (T) and androstenedione (A) values were compared in 271 patients diagnosed as NCCAH. Patients were grouped according to whether they had 2 mutated alleles, one or no one. Our analysis revealed no significant differences between groups when the values of A, T and DHEA-S were compared. However, basal and post ACTH 17-OHP levels were statistically different between those patients having both mutated alleles and those with one or no one. Among patients with 17-OHP post ACTH values between 10 (currently cut-off value) and 20 ng/ml, only a 23 % had 2 mutated alleles, whereas if the values were greater than 20 ng/ml, 85 % of patients had mutations in both alleles. Finally, analyzing the genotypes found in all our patients, either after sequencing or by studying the 10 most frequent mutations, we observed a 97,7% phenotype-genotype correlation, while discrepancies were found mostly associated to the p.I172N mutation. Patients having this mutation presented either with the SV form or with the SW one. In addition, while p.R356W mutation is strongly associated with the SW form of the disease, we found the mutation in one patient SV with another severe mutation in the homologous allele. On the other hand, the less frequent p.H62L is described in literature related to the mild NCCAH form. In this work, however, it is reported associated to the SV form of the disease. Finally, the less frequent SV p.R341P mutation, is herein described in a SW patient having the c.283-13A / C> G mutation in the homologous allele.

Velásquez, Silvia Melina. "Las modificaciones post-traduccionales en extensinas son esenciales en la expansión polarizada de pelos radiculares en Arabidopsis thaliana" (2014-12-02) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los pelos radiculares son células individuales especializadas en la absorción de agua y nutrientes que crecen mediante expansión polarizada, proceso compartido con los tubos polínicos, axones, e hifas de hongos. No obstante, las paredes celulares imponen límites al crecimiento por lo cual, en plantas, se debe estar constantemente incorporando nuevas moléculas para lograr el crecimiento. Sus paredes celulares están compuestas por polisacáridos y proteínas ricas en hidroxiprolina (hydroxyproline-rich glycoproteins; HRPGs) que incluyen a las extensinas (EXTs). La hidroxilación de Prolinas (Hyp), una modificación post-traduccional (MPT) temprana de las HRGPs, catalizada por las Prolil-4-hidroxilasas (P4Hs), define los subsecuentes sitios de Oglicosilación en las EXTs, que son principalmente arabinosiladas. En este trabajo se exploró la función biológica de las P4Hs, las arabinosiltransferasas y las EXTs asociadas al desarrollo del pelo radicular. Inhibición bioquímica o disrupción genética de las P4Hs resultó en una interrupción del crecimiento polarizado en los pelos radiculares y en una reducción de la arabinosilación de las EXTs. En segundo lugar, se demostró que la prolil-4-hidroxilasa 5 (P4H5) y en menor medida P4H2 y P4H13, son centrales para el desarrollo del pelo mediado por EXTs. Mediante experimentos de intercambio de promotores y regiones catalíticas, se pudo mostrar que P4H2 y P4H13 tienen funcionalidades intercambiables pero son incapaces de reemplazar a P4H5. Estas tres P4Hs son direccionadas a la vía secretoria, más específicamente al Retículo y Aparato de Golgi, donde P4H5 forma dímeros con P4H2 y P4H13, sugiriendo la existencia de complejos de proteínas P4Hs. En tercer lugar, se exploró la localización sub-celular y la especificidad de sustrato de P4H5, como también la arquitectura de la pared celular resultante en el mutante p4h5. También se analizó la significancia fisiológica de las MPTs en las EXTs. Específicamente, mutantes deficientes en Hyp-O-arabinosilación o en Ser-O-galactosialción mostraron pelos más cortos, debido al efecto conjunto de una tasa de crecimiento más lenta y una interrupción temprana del crecimiento. A su vez, nuestros hallazgos resaltan que ambos tipos de O-glicosilación (Hyp-O-arabinosilación y Ser-O-galactosilación) son necesarios y tienen efectos aditivos en el correcto funcionamiento de las EXTs durante la expansión del pelo radicular. Finalmente, a través de simulaciones de dinámicas moleculares se pudo explorar la influencia de los O-glicanos en una putativa, auto-ensamblada, conformación de triple hélice de EXTs. Nuestros resultados demostrarían que una correcta O-glicosilación de las EXTs sería esencial para el auto-ensamblado de la pared celular y por lo tanto en la elongación del pelo radicular en Arabidopsis thaliana.

Abstract:
Root hairs are single cells that develop by tip growth and are specialized in the absorption of nutrients, a process shared with pollen tubes, axons, and fungal hyphae. However, structural cell walls imposed constraints prompt utilization of new molecules to accomplish tip growth in plants. Their cell walls are composed of polysaccharides and hydroxyproline-rich glycoproteins (HRGPs) that include extensins (EXTs). Proline hydroxylation, an early post-translational modification (MPT) of HRGPs that is catalyzed by prolyl 4-hydroxylases (P4Hs), defines the subsequent O-glycosylation sites in EXTs, which are mainly arabinosylated. Here, we explored the biological function of P4Hs, arabinosyltransferases and EXTs in root hair cell growth. Biochemical inhibition or genetic disruption of P4Hs resulted in the blockage of polarized growth in root hairs and reduced arabinosylation of EXTs. Secondly, we demonstrate that prolyl-4- hydroxylase 5 (P4H5), and to a lower extent P4H2 and P4H13, are pivotal for EXT-mediated root hair tip-growth. By P4H promoter and protein swaps approaches, it was shown that P4H2 and P4H13 have interchangeable functionalities but they cannot replace P4H5. These three P4Hs are targeted to the secretory pathway, most specifically to the ER and Golgi compartments, where P4H5 forms dimers with P4H2 and P4H13 suggesting the existence of P4Hs protein complexes. Thirdly, we explored the subcellular localization and substrate specificity of the P4H5, as well as the resulting cell wall architecture in the p4h5 mutant. We also addressed the physiological significance of the MPTs of EXTs. In particular, mutants who were deficient in Hyp-Oarabinosylation or in Ser-O-galactosylation showed shorter root hairs, due to both slower kinetics and premature growth termination. In addition, our findings highlights that both Oglycosylation types (Hyp-O-arabinosylation and serine-O galactosylation) are required and have additive effects for correct EXT function in root hair cell expansion. Finally, molecular dynamics simulations addressed the influence of O-glycans on a putative EXT self-assembled triple helix conformation. Our results demonstrate that correct O-glycosylation on EXTs is essential for cell wall self-assembly and hence root hair elongation in Arabidopsis thaliana.

Bernabó, Guillermo. "Caracterización de genes nuevos involucrados en neurodegeneración en Drosophila melanogaster" (2014-12-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El objetivo de esta tesis es identificar nuevos genes involucrados en neurodegeneración en Drosophila melanogaster y comprender su función y el mecanismo por el cual provoca dicha patología. En particular, se hizo foco en orsai. Encontramos que adultos envejecidos con la expresión de orsai reducida en las neuronas que controlan el comportamiento rítmico locomotor presentaban una caída en la ritmicidad y un alargamiento del período. La reducción de ORSAI en el cerebro adulto envejecido provoca que estos presenten signos de neurodegeneración más severos que sus controles. También se encontró que la reducción de los niveles de este gen en larvas provoca arresto en el segundo estadio y la consiguiente letalidad temprana. Estas larvas tienen un comportamiento anómalo frente a la comida, alejándose de la misma y reptando en un modo de clásico forrajeo, a pesar de tener alimento disponible, hasta su muerte. Encontramos que acotando la reducción de ORSAI a las tráqueas fenocopia al mutante. También determinamos que la respiración mitocondrial está severamente reducida en el mutante. La alteración de los niveles de ORSAI en distintos tejidos, tanto larvales como adultos, provoca diversos fenotipos, lo que demuestra la importancia de este gen para la homeostasis celular. El fenotipo en las tráqueas podría, a través de procesos hipóxicos, explicar el comportamiento de forrajeo en larvas y, sumando a esto la disfunción mitocondrial, los fenotipos observados en adultos.

Abstract:
The goal of this thesis was to identify new genes involved in neurodegeneration in Drosophila melanogaster and to understand their function and the mechanisms triggered upon their deregulation. In particular, we focused on orsai. We found that aged adult flies with reduced orsai expression in neurons that control rhythmic locomotor behavior showed declined rhythmicity and a lengthened period. Reduced ORSAI levels in aged adult brains correlate with signs of neurodegeneration more severe than controls. We also found that reduced orsai levels cause second instar developmental arrest and the ensuing early mortality. These larvae display an anomalous feeding behavior; they crawl away from the food source as if were foraging, and, despite food availability, they do so until their death. We found that limiting ORSAI depletion to the tracheal system phenocopies the mutant behavior. We also determined that mitochondrial respiration is severely reduced in the mutant. Importantly, reducing ORSAI levels in different tissues, both larval as well as adult, triggers diverse phenotypes, highlighting its relevance in cellular homeostasis. The tracheal phenotype could, through hypoxic processes, account for the abnormal larval foraging behavior and, taking into account the mitochondrial dysfunction, the observed adult phenotypes.

Solari, Claudia María. "Generación de células madre pluripotentes inducidas y estudio de la regulación de la expresión del gen Sod2 en células madre pluripotentes" (2015-03-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las células madre embrionarias (CME) son células derivadas del macizo celular interno del blastocisto de mamíferos. Poseen la capacidad de auto-renovarse indefinidamente en cultivo en condiciones apropiadas mientras que, ante los estímulos adecuados, pueden dar origen a células de las tres capas germinales, propiedad conocida como pluripotencia. En la última década ha sido posible reprogramar células terminalmente diferenciadas obteniendo así las denominadas células madre pluripotentes (CMP) inducidas (CMPI), que presentan características similares a las CME, como el perfil de expresión génica, las modificaciones epigenéticas, y sus propiedades fundamentales, auto-renovación y pluripotencia. Por esta razón y dado que además presentan ciertas ventajas, las CMPI son consideradas posibles sustitutos de las CME para diferentes aplicaciones. En el área de la medicina regenerativa, la posibilidad de generar células específicas para grupos de pacientes disminuye el riesgo de rechazo en terapias de trasplante. Por otra parte, a partir de estas células pueden desarrollarse modelos de enfermedades y evaluar fármacos en diferentes contextos genómicos. A pesar del gran avance desde el establecimiento de las CMPI, su obtención y propagación aún es un área de gran interés. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue desarrollar CMPI, como modelo complementario a las CME para estudiar diversos mecanismos moleculares relevantes para el mantenimiento de las propiedades fundamentales de estas células. Para tal fin, hemos generado CMPI mediante reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón y comprobado que las líneas obtenidas son capaces de auto-renovarse y son pluripotentes, evaluado tanto in vitro como in vivo. Una vez validadas, las utilizamos como sistema de estudio en distintos proyectos. En primer lugar, en base a resultados obtenidos previamente en el laboratorio y a la semejanza de las CMPI con las CME, estudiamos si el medio condicionado por una línea celular de granulosa bovina que permite el cultivo de CME, también proporcionaba un contexto favorable para las CMPI. Mediante la detección de la expresión de marcadores específicos y de protocolos de diferenciación in vitro e in vivo, determinamos que las CMPI pueden ser propagadas en este medio condicionado, conservando sus propiedades fundamentales. En una segunda parte de este trabajo nos centramos en el estudio de la regulación de genes relacionados con uno de los mecanismos que aseguran la estabilidad genómica de las CMP, el sistema de defensa frente al estrés oxidativo. A pesar de que ha sido reportado que la actividad antioxidante disminuye a lo largo de la diferenciación, poco se sabe acerca de la regulación transcripcional de los genes involucrados. Dada la importancia de este sistema, nos propusimos estudiar su regulación a partir de la hipótesis de que algunos de estos genes podrían ser modulados por los factores de transcripción (FT) esenciales para la auto-renovación y la pluripotencia de las CMP. Estudiamos el perfil de expresión de genes seleccionados, tanto en líneas comerciales de CME como en las CMPI obtenidas. Si bien hallamos perfiles de expresión muy variados para la mayoría de los genes analizados, observamos que el gen de la superóxido dismutasa 2 (Sod2) fue reprimido durante el proceso de diferenciación, en todos los modelos estudiados. A continuación estudiamos su regulación mediante la modulación de la expresión de los FT. Además generamos construcciones reporteras y evaluamos la actividad del promotor de Sod2 en ensayos de trans-activación. En conjunto, los resultados obtenidos a partir de las diferentes estrategias experimentales empleadas nos permitieron confirmar nuestra hipótesis, concluyendo que el gen de Sod2 es regulado por los factores fundamentales en CMP. Esperamos que las herramientas generadas y los resultados obtenidos en este trabajo contribuyan a la comprensión de los mecanismos moleculares relevantes en el mantenimiento de las propiedades fundamentales de las CMP, crítico para sus aplicaciones futuras.

Abstract:
Embryonic stem cells (ESC) are derived from the inner cell mass of the blastocyst in mammals. They have the ability to self-renew indefinitely in culture under appropriate conditions whereas, with the appropriate stimuli, they can give rise to cells of all three germ layers, property known as pluripotency. In the last decade, it has been possible to reprogram terminally differentiated cells obtaining the so-called induced pluripotent stem cells (iPSC), which have similar characteristics to the ESC, like the profile of gene expression, epigenetic modifications, and their essential properties, self-renewal and pluripotency. For this reason and since iPSC have some advantages, they are considered as possible substitutes for ESC for several uses. In the area of regenerative medicine, the possibility to generate specific cells for groups of patients decreases the risk of rejection in transplantation therapies. Moreover, disease models can be developed from these cells and drugs can be evaluated in different genomic backgrounds. Despite great progress since the establishment of iPSC, their production and propagation is still an area of great interest. One aim of this thesis was to develop iPSC as a complementary model to ESC for the study of relevant molecular mechanisms for the maintenance of the fundamental properties of these cells. To this end, we generated iPSC by reprogramming mouse embryonic fibroblasts and found that the obtained lines are capable of self-renew and are pluripotent, and this was tested in vitro and in vivo. Once validated, we used them in different projects. First, based on results previously obtained in our laboratory and the similarity of iPSC and ESC, we examined whether the conditioned medium by a bovine granulosa cell line that allows the maintenance of ESC, also provided a favorable context for iPSC culture. We detected the expression of specific markers and performed in vitro and in vivo differentiation protocols, and we determined that iPSC can be propagated in this conditioned medium, while retaining their basic properties. In the second part of this thesis, we focused on the study of gene regulation related to one of the mechanisms that ensure genomic stability of pluripotent stem cells (PSC), the defense system against oxidative stress. Although it has been reported that the antioxidant activity decreases along differentiation, little is known about the transcriptional regulation of the genes involved. Because of the relevance of this system, we decided to study its regulation based on the hypothesis that some of these genes could be modulated by transcription factors (TF) essential for PSC’ self-renewal and pluripotency. We studied the expression profile of selected genes in commercial ESC lines and in the obtained iPSC. Though we found very different expression profiles for most of the analyzed genes, we observed that superoxide dismutase 2 gene (Sod2) was repressed during the differentiation process in all studied systems. Next, we studied its regulation by modulating the expression of the mentioned TF. We also generated reporter constructions and evaluated Sod2 promoter activity in transactivation assays. Overall, the results obtained from the different experimental strategies allowed us to confirm our hypothesis, concluding that Sod2 gene is regulated by the fundamental factors in PSC. We hope that the tools generated and the results obtained in this study contribute to the understanding of the molecular mechanisms relevant for PSC’s fundamental properties, critical for future applications.

Pérez, Juliana Andrea. "Caracterización genómica y funcional de los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 que codifican para proteínas de tipo acuaporinas en Arabidopsis thaliana" (2015-03-25) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En las Angiospermas, la reproducción incluye procesos en los cuales el transporte de agua está espacial y temporalmente regulado. Durante la microgametogénesis del polen, el contenido de agua del grano de polen comienza a aumentar de manera significativa desde el estadio temprano de la microespora y continúa haciéndolo hasta la deshidratación parcial. El volumen de polen, al igual que el contenido de agua, disminuye durante la deshidratación de las anteras y el polen, se adapta a las condiciones ambientales durante la dispersión y aumenta durante la rehidratación en el estigma. En plantas con estigmas secos, la regulación de la rehidratación del polen proporciona una barrera temprana y eficaz para las polinizaciones incompatibles. El agua, los nutrientes y otras moléculas pequeñas son transportados rápidamente desde las papilas estigmáticas al grano de polen para promover su germinación por mecanismos que aún no se conocen completamente. Luego durante la elongación del tubo polínico, la entrada adicional de agua a través de la membrana plasmática permite el ajuste citosólico de iones (Ca2+, K+, H+ y Cl–) y de la presión de turgencia. Se ha propuesto que las acuaporinas estarían involucradas en el transporte de agua y/o solutos durante la germinación del polen y el crecimiento del tubo polínico. En Arabidopsis thaliana sólo 4 genes (de un total de 35 loci) se expresan específicamente en los granos de polen maduros y/o tubos polínicos: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 y AtNIP4;2. En este trabajo de tesis se demuestra la participación de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 en los procesos asociados a la reproducción. Los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 presentan alta identidad de secuencia nucleotídica, estructura génica similar (5 exones, 4 intrones) y están dispuestos en tándem. A nivel de proteínas, tienen un 84% de identidad aminoacídica, y comparten los mismos dos motivos NPA y el filtro de constricción ar/R (W, V, A, R), involucrados en la selectividad del transporte. Sin embargo, AtNIP4;1 y AtNIP4;2 muestran diferentes patrones de expresión. Ensayos de PCR en tiempo real demostraron que AtNIP4;1 tiene niveles relativos de expresión bajos en polen maduro y que AtNIP4;2 presenta un pico de expresión durante la elongación del tubo polínico. Además, flores transgénicas promotorNIP4;1::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS en los granos de polen maduros y persistente en los tubos polínicos, mientras que las flores promotorNIP4;2::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS solamente en el tubo polínico. Por lo tanto, nuestra hipótesis es que AtNIP4;1 y AtNIP4;2 podrían tener redundancia funcional durante la reproducción, pero desempeñar roles diferentes y específicos en el desarrollo del polen, la polinización y/o fertilización. Con el objetivo de llevar a cabo experimentos fisiológicos in vitro e in planta, se obtuvieron plantas mutantes simples de inserción de ADN-T y se generaron líneas amiARN doble knockdown. Las plantas simple mutante y doble knockdown mostraron parámetros de fertilidad afectados: reducción del número de semillas por silicua y segregación distorsionada asociada solamente al gametofito masculino. Además, las plantas doble knockdown mostraron reducción de la viabilidad y del diámetro de los granos de polen maduros, aumento del número de granos de polen inmaduros (granos de polen uni y bi-celulares), defectos en la rehidratación de polen, reducción de la tasa de germinación y de la longitud del tubo polínico (especialmente en condiciones limitantes de ácido bórico), y aumento del porcentaje de las flores no polinizadas. También se generaron líneas de complementación que expresan las proteínas de fusión eGFPAtNIP4; 1 y eGFP-AtNIP4;2 bajo sus promotores endógenos en el background de sus respectivas líneas simple mutantes. Los análisis de segregación demostraron que estas líneas de complementación rescatan el fenotipo mutante. Además, mediante microscopía confocal se observó que la proteínas de fusión eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 están localizadas en la membrana plasmática y en vesículas intracelulares de los granos (AtNIP4;1) y tubos polínicos (AtNIP4;1 y AtNIP4;2). Ensayos de expresión heteróloga de eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 en ovocitos de Xenopus laevis confirmaron que ambas acuaporinas presentan una baja permeabilidad al agua y un significativo transporte de glicerol. Ensayos de actividad quinasa in vitro demostraron que los dominios C-terminales de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 son fosforilados específicamente en Ser267 por AtCPK34, una proteína quinasa dependiente de calcio expresada en polen, sugiriendo que la fosforilación puede regular su actividad de transporte in planta. En resumen las evidencias obtenidas en esta tesis doctoral permiten sugerir que AtNIP4;1 estaría involucrada principalmente en las etapas del desarrollo del polen, polinización y germinación, y AtNIP4;2 tendría un rol preponderante en la elongación del tubo polínico. Palabras claves: acuaporinas de polen, transporte de agua, reproducción

Abstract:
In Angiosperms, reproduction involves processes where water and solutes transport is temporally and spatially regulated. During pollen development, pollen water content starts increasing significantly at the early microspore stage and continues to increase until partial dehydration. Then, pollen volume decreases during anther and pollen dehydration and, similar to water content, adapts to environmental conditions during dispersal, increasing later during rehydration. In plants with dry stigmas, regulated pollen hydration provides an effective early barrier to incompatible pollinations. Water, nutrients, and other non-polar small molecules are transported rapidly into pollen from the stigma papillae to promote its germination by mechanisms that are still unknown. Then, additional entry of water through the plasma membrane allows cytosolic adjustment of ions (Ca2+, K+, H+, and Cl–) and maintenance of turgor pressure during tip elongation. It has been proposed that aquaporins may mediate water and solute transport during pollen germination and pollen tube growth. In Arabidopsis thaliana only 4 genes (out of 35 loci) are specifically expressed in mature pollen grains and/or pollen tubes: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 and AtNIP4;2. Here, we show the involvement of AtNIP4;1 and AtNIP4;2 in reproduction processes. Interestingly, AtNIP4;1 and AtNIP4;2 are genes with high nucleotide sequence identity, similar gene structure (5 exons, 4 introns), and disposed in tandem. At protein level, they have 84% amino acidic identity, and share the same two NPA motifs and the ar/R constriction (W,V,A,R), involved in transport selectivity. However, they displayed different expression patterns. Real time PCR assays showed that AtNIP4;1 has low relative expression levels in mature pollen while AtNIP4;2 peaks during pollen tube elongation. Additionally, NIP4;1promoter::GUS flowers showed strong GUS activity in mature pollen grains, remaining in the pollen tubes, whereas NIP4;2promoter::GUS flowers, showed strong GUS activity upon pollen tube germination. Therefore, we hypothesized that they could have a functional redundancy during reproduction, even though they may play different roles in pollen development, pollination and/or fertilization. In order to perform in vitro and in planta physiological experiments, we obtained simple mutant T-DNA insertion lines and developed double knockdown amiRNA lines. Simple mutant and double knockdown plants showed affected fertility parameters: reduced number of seeds per silique, and distorted segregation ratios. Furthermore, double knockdowns displayed reduced mature pollen grain viability and diameter, increased number of immature pollen grains (increased number of pollen grains arrested at uni- and bi-cellular stages), defects in pollen rehydration, reduced germination rate and pollen tube length (specially under low boric acid conditions), and increased percentage of non-pollinated flowers. Complementation lines expressing eGFP-tagged AtNIP4;1 and AtNIP4;2 under their own promoters, in each mutant line background, rescued the mutant phenotype in segregation analysis. Additionally, confocal microscopy showed that eGFP-AtNIP4;1 and -AtNIP4;2 are localized in the plasma membrane and intracellular vesicles of pollen grains (AtNIP4;1) and tubes (AtNIP4;1 and AtNIP4;2). Functional expression of eGFP-AtNIP4;1 and eGFP-AtNIP4;2 in Xenopus laevis oocytes confirmed that both aquaporins have relatively low water permeability and significant glycerol transport. In vitro kinase assays showed that the C-terminal domains of AtNIP4;1 and AtNIP4;2 are specifically phosphorylated at Ser267 by AtCPK34, a pollen Calcium-dependent protein kinase, suggesting that phosphorylation might regulate their transport activity in planta. In summary, the obtained results suggest that AtNIP4;1 might be involved mainly in pollen development, pollination, and germination, and AtNIP4;2 could play a major role in pollen tube elongation. Keywords: aquaporins, pollen, water transport, reproduction

Bestach, Yesica Soledad. "Estudios genéticos y citogenéticos en Aplasia Medular" (2015-03-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Aplasia Medular o Anemia Aplásica adquirida (AA) es una insuficiencia medular global cuantitativa, caracterizada por una médula ósea hipo-celular, pancitopenia y riesgo de progresión a Síndromes Mielodisplásicos (SMD). El 80% de los casos de AA son de etiología idiopática, vinculados a un desorden autoinmune subyacente. Los principales mecanismos relacionados a la supresión hematopoyética en AA involucran un incremento de las citoquinas TNF-α e IFN-γ producidas por linfocitos T citotóxicos y T helper (Th) 1, y el consecuente aumento de la apoptosis. También se observa un desbalance entre los diferentes subsets de linfocitos T y la desregulación de otras citoquinas como IL-6 y TGF-β1. El objetivo fue estudiar polimorfismos asociados con la expresión diferencial de los genes TNF, IFNG, IL6 y TGFB1, y establecer su relación con susceptibilidad y/o características clínico-patológicas en pacientes con AA y SMD. Además, determinar los niveles de expresión de estas citoquinas y de los factores de transcripción Foxp3, T-bet, GATA-3 y RORγt en AA, a fin de caracterizar el desbalance entre los linfocitos T regulatorios (Treg), Th1, Th2 y Th17, respectivamente. Los resultados sugieren que los polimorfismos estudiados no estarían asociados con susceptibilidad a AA; mientras que, existiría una relación entre los polimorfismos de los genes TNF e IL6 y riesgo a SMD, en nuestra población. Las variantes polimórficas estudiadas estarían relacionadas con la severidad de las citopenias tanto en AA como en SMD, pudiendo actuar como modificadores genéticos de la enfermedad. Los hallazgos del análisis de expresión en AA muestran un incremento de TNF e IL6, y una disminución de TGBF1. La relación entre los factores de transcripción reflejaría una disminución en la diferenciación y/o función de células Treg favoreciendo un estado pro-inflamatorio, principalmente Th1 y Th2, lo cual podría contribuir con los mecanismos patogénicos relacionados a la falla medular en los pacientes con AA.

Abstract:
Acquired aplastic anemia (AA) is a marrow failure characterized by a hypocellular bone marrow, pancytopenia and risk of progression to Myelodysplastic Syndromes (MDS). Around 80% of AA cases are idiopathic, linked to an underlying autoimmune disorder. The main mechanisms related to the hematopoietic suppression in AA involve an increase of the cytokines TNF-α and IFN-γ produced by cytotoxic T and T helper (Th) 1 cells and, therefore, an apoptosis rise. Furthermore, perturbations of the T cell balance and abnormal regulation of other cytokines such as IL-6 and TGF-β1 play important roles to the development of immune disorders in AA. The aim of this work was to study the polymorphisms associated with differential expression of TNF, IFNG, IL6 and TGFB1 genes and to establish its relationship with susceptibility and/or clinic-pathologic features in patients with AA and MDS. In addition, to determine the expression levels of these cytokines and of the transcription factors Foxp3, T-bet, GATA-3 and RORγt in AA, in order to characterize the imbalance among regulatory T cells (Treg), Th1, Th2 and Th17, respectively. The obtained results suggest that, in our population, the studied polymorphisms would not be associated with susceptibility to AA; while polymorphisms in TNF and IL6 genes may increase propensity to MDS. Furthermore, these polymorphic variants could be related to severity of the cytopenias in AA and MDS, and may act as genetic modifiers of the diseases. Moreover, the analysis of cytokine expression in AA shows an increase of TNF and IL6, and a decreased of TGBF1. Finally, the ratio among transcription factors might reflect a Treg deficiency impairment, supporting a proinflammatory state, mainly Th1 and Th2, which may contribute to the pathogenic mechanisms related to the bone marrow failure observed in patients with AA.

Castillo, Daniela Susana. "La inducción de E2F1 y E2F2 en respuesta al daño al ADN preserva la estabilidad genómica en células neuronales" (2015-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Agentes genotóxicos endógenos y exógenos amenazan continuamente la integridad de la estructura molecular del ADN. Dentro del sistema nervioso, respuestas apropiadas al daño al ADN son requeridas para mantener la homeostasis celular y prevenir enfermedades. Dado que las neuronas maduras son células post-mitóticas altamente diferenciadas que no pueden ser reemplazadas –en su gran mayoría– en caso de trauma o enfermedad, las mismas han seleccionado mecanismos para defender la integridad de su genoma, por ende asegurando su longevidad y funcionalidad de cara a dichas amenazas. Defectos en la respuesta al daño al ADN en células neuronales están comúnmente asociados a neurodegeneración. La identificación de factores neuroprotectores y de supervivencia neuronal es clave para la comprensión de la progresión de desórdenes neurodegenerativos y para el establecimiento de terapias para menguar las consecuencias neurológicas de tales enfermedades. La familia de factores de transcripción E2F fue originalmente involucrada en el desempeño de un rol crítico en el control del ciclo celular. Evidencias han dejado en claro que –dado a su plasticidad funcional– estos factores participan en la regulación de una plétora de procesos biológicos, que incluyen la respuesta celular al daño al ADN. El principal objetivo de este trabajo consistió en estudiar la participación de los miembros de la familia de factores de transcripción E2F en el mantenimiento de la integridad genómica en células neuronales, y evaluar su potencial papel como factores neuroprotectores. En esta tesis se demostró que E2F1 y E2F2, el último específicamente en células neuronales, son inducidos transcripcionalmente en respuesta al daño al ADN. Este mecanismo novedoso, el cual es común a la respuesta a diversos agentes genotóxicos y el cual se encuentra conservado en distintas especies, contribuye al incremento de los niveles proteicos de E2F1 y E2F2 como consecuencia de síntesis proteica de novo. Asimismo, se observó que E2F2 es estabilizado tempranamente por un mecanismo post-traduccional luego de injuria genotóxica al igual que fue reportado previamente para E2F1. Por lo tanto, existen dos mecanismos consecutivos en el tiempo que conducen al aumento de E2F1 y E2F2 luego de daño al ADN: la estabilización proteica por modificaciones post-traduccionales de la proteína E2F ya sintetizada, seguida de la inducción transcripcional del gen E2F y la consecuente síntesis proteica de novo. De esta manera, los factores E2F1 y E2F2 inducidos por daño al ADN contribuyen al mantenimiento de la integridad genómica y a la resistencia a la injuria genotóxica al promover la reparación del ADN, conllevando a una reducida respuesta apoptótica y a una incrementada supervivencia celular. Dichas respuestas las llevan a cabo al ejercer dos papeles diferentes. Primero, mediante un rol transcripcional que implica la expresión de genes que favorecen la supervivencia en respuesta al daño al ADN. Segundo, a través de un rol no-transcripcional, localizándose en sitios de lesión al ADN y promoviendo el reclutamiento de factores de reparación y proteínas remodeladoras de la cromatina. En resumen, las evidencias presentadas en este trabajo establecen a E2F1 y E2F2 como factores neuroprotectores implicados en el mantenimiento de la estabilidad genómica en células neuronales en respuesta a injuria genotóxica. Es importante enfatizar que se demostró por primera vez que E2F2 es inducido por estrés genotóxico y que cumple un rol crítico en la respuesta al daño al ADN. Palabras clave: células neuronales; estabilidad genómica; factor de transcripción E2F; reparación del ADN; respuesta al daño al ADN.

Abstract:
Endogenous and exogenous genotoxic agents continuously threat the integrity of the molecular structure of DNA. Within the nervous system, appropriate responses to DNA damage are required to maintain cellular homeostasis and prevent disease. Since mature neurons are highly differentiated post-mitotic cells that cannot entirely be replaced after disease or trauma, they have evolved mechanisms to defend their genome integrity, hence ensuring their longevity and functionality in the face of these threats. Defects in the DNA damage response in neurons are commonly associated to neurodegeneration. The identification of neuroprotective and prosurvival factors is key to the understanding of neurodegenerative disorders progression and the establishment of therapies to ameliorate the neurological consequences of these diseases. The E2F family of transcription factors was originally described to play a pivotal role in cell cycle control. It has become clear that –due to their functional plasticity– they participate in the regulation of a plethora of biological processes, including the cellular response to DNA damage. The main aim of the present study consisted in studying the participation of the members of the E2F family of transcripction factors in the maintenance of genomic integrity in neuronal cells, and to evaluate their potential role as neuroprotective factors. In this thesis it was shown that E2F1 and E2F2, the latter specifically in neuronal cells, are transcriptionally induced in response to DNA damage. This novel mechanism, which is general to the response to different genotoxic agents and is conserved amongst diverse species, leads to increased E2F1 and E2F2 protein levels as a consequence of de novo protein synthesis. Besides, it was demonstrated that E2F2 is early stabilized by a posttranslational mechanism upon genotoxic injury as it was previously reported for E2F1. Therefore, there are two consecutive mechanisms that lead to the upregulation of E2F1 and E2F2 following DNA damage: the posttranslational modifications of the already synthesized E2F and consequent protein stabilization, followed by E2F transcriptional gene induction and de novo protein synthesis. The resulting E2F1 and E2F2 act to promote DNA repair, leading to a reduced apoptotic response and an increased cell survival capability, thereby conferring resistance to genotoxic insult and cooperating in the maintenance of the genome integrity. These responses are performed by E2F1 and E2F2 through two different roles. First, a transcriptional function involving the expression of prosurvival genes in response to DNA damage. Second, a nontranscriptional role in which these E2Fs localize to sites of DNA lesion upon genotoxic stress, and promote the recruitment of DNA repair factors and chromatin modifying enzymes. In summary, the evidence presented in this work establishes E2F1 and E2F2 as neuroprotective factors implicated in the maintenance of genomic stability in neuronal cells in response to genotoxic injury. It should be emphasized that it was shown for the first time that E2F2 is upregulated following genotoxic stress and plays a critical role in the DNA damage response. Keywords: neuronal cells; genomic stability; E2F transcription factor; DNA repair; DNA damage response.

Viñas, Ezequiel Santiago. "Análisis de plantas transgénicas ATEMYB32::IPT de pasto miel (Paspalum dilatatum Poir.) una gramínea C4" (2015-04-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En plantas forrajeras como Paspalum dilatatum Poir, la senescencia foliar es un proceso que afecta su producción y especialmente su calidad. Una estrategia molecular para retrasar la senescencia mediante la ingeniería genética se basa en la expresión de la secuencia codificante de la isopentenil transferasa (IPT), enzima clave en la biosíntesis de citoquininas. Para lograrlo se utilizan promotores con expresión no constitutiva que permitan la producción autorregulada de citoquininas. Se analizó el efecto de la incorporación vía transgénesis de las construcción quimérica ATEMYB32::IPT en clones de Paspalum dilatatum cv “Relincho”. Se estudiaron 8 eventos obtenidos mediante transformación biolística con controles isogénicos, dos provenientes de cultivo de tejido que no incorporaron al transgén después de la transformación biolística y uno de campo. Los individuos fueron propagados vegetativamente para generar réplicas que permitieron estimar la respuesta de los eventos a diferentes condiciones de estrés abiótico (deficiencias hídricas y temperaturas bajas extremas). Se realizaron análisis moleculares, PCR para amplificar el transgén ipt, complementándose esta información con la medición del nivel de citocininas y auxinas por HPLC. Se caracterizaron a las líneas transgénicas desde su comportamiento germinativo, su anatomía foliar y la ultraestructura de los cloroplastos. En todas las plantas ensayadas se estimó el contenido de clorofila, azúcares, proteínas totales y actividad de la enzima SOD. Se halló un mayor nivel de citocininas y de la relación citocininas/auxinas en plantas transgénicas respecto a las controles y variabilidad entre los eventos analizados. A niveles anatómico y ultraestructural se encontraron características distintivas de las líneas transgénicas. Además algunos de los eventos obtenidos mostraron una mayor resistencia a ambas condiciones de estrés y un mejor comportamiento germinativo. Se generaron conocimientos para comprender el efecto de la incorporación del transgén ATEMYB32::IPT en especies C4.

Abstract:
Leaf senescence is a process that affects the production and quality of fodder plant such as Paspalum dilatatum Poir. In order to delay the senescence, there is a molecular strategy which consists on using genetic engineering. It uses the sequence encoding isopentenyl transferase (IPT), a key enzyme in the biosynthesis of cytokinins. Promoter with expression non constitutive are used to allow the self –regulated production of cytokinin. The effect of incorporation of transgenesis via ATMYB32::IPT chimeric construct was analyzed in clones of Paspalum dilatatum cv " Relincho ". Eight events obtained by biolistic transformation and isogenic controls were studied. Two of them came from tissue culture with transformation biolistic which they did not incorporate to the transgenic after the biolistic conversion and also a third coming form field. The individuals were spread in a vegetative way to obtain replicates for estimating the response of different events under abiotic stress conditions (water deficits and frost). In addition, molecular analyzes were performed PCR to amplify the ipt transgene. This information was complemented with measures of cytokinins and auxins by HPLC. Transgenic Lines were characterized considering the germination behaviour, leaf anatomy and chloroplast ultrastructure. Content of chlorophyll, sugars, total protein and SOD enzyme activity was estimated in all plants under analysis. Higher levels of cytokinins were found in transgenic plants compared to the controls and variation in the analyzed events. Distinctive features of the transgenic lines were found in the anatomic and ultrastructural level. Furthermore some of the obtained events showed a higher resistance to stress conditions and a better germination behavior. Knowledge was developed in order to understand the effect produced by the incorporation of the transgene ATMYB32::IPT in C4 specie.

Toledo, María Fernanda. "Estudio sobre funciones específicas de proteínas MAGE-I y su relevancia en oncología" (2015-06-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las proteínas MAGE-I (Melanoma Antigen Gene) constituyen una de las familias multigénicas más grandes con expresión tumoral, la cual agrupa a los Mage-A, Mage-B, Mage-C. Estos genes se caracterizan por su expresión específica en tumores, por su alta conservación de secuencia (todos contienen un dominio común llamado MHD, Mage Homology Domain) y por su localización en el cromosoma X. Las primeras observaciones funcionales mostraron una correlación entre los altos niveles de expresión algunos Mage-A y la resistencia a drogas antitumorales. Así es que en los últimos años se ha investigado la potencial función de estos genes en distintos modelos. Nuestro grupo de trabajo ha aportado al estudio de los genes mage-I el mecanismo por el cual MageA2 causa la resistencia a ciertos agentes quimioterapéuticos e impide el gatillado de la senescencia inducida por PML mediante la activación de oncogenes como Ha-Ras. Estos mecanismos involucran, por un lado, la interacción de MageA2 con el oncosupresor p53 y la inhibición de su actividad transcripcional por la unión MageA2/HDAC3 (deacetilasa de histonas 3) formando el complejo inhibitorio p53/MageA2/HDAC3; y, por otro lado, une en forma directa a PML-IV (proteína de la leucemia promielocítica–3) interfiriendo en el eje PML-IV/p53. Las observaciones sobre la función y/o localización de otros MAGE-I nos llevaron a elaborar nuestra primera hipótesis: la conservación de secuencia dentro de esta familia de proteínas no implicaría necesariamente una redundancia funcional. Por otro lado, dada la relevancia de la función de p53, nos llevó a formular nuestra segunda hipótesis de trabajo: podrían existir vías intracelulares capaces de proteger a p53 de la actividad de MageA2. En la primera parte de este trabajo de Tesis caracterizamos otro miembro de la familia MAGE-I, del subgrupo B: la proteína MageB2 logrando evidenciar que la expresión de MageB2 induce proliferación en distintas líneas celulares en forma independiente de la inhibición de p53. Vinculamos la actividad de MageB2 a la regulación de factores de transcripción pro-oncogénicos como de la familia E2Fs y c-Myc. Además MageB2 se acumula en el nucléolo, aunque su distribución comprende tanto en citoplasma como en el núcleo también, dato que nos llevó a evaluar y evidenciar su asociación a los ribosomas. En la segunda parte de este trabajo de Tesis determinamos que la expresión de p14ARF (p14, Alternative Reading Frame) revierte la inhibición que MageA2 ejerce sobre p53 causando la relocalización de MageA2 del núcleo a los nucléolos en forma similar a lo que hace con Mdm2, un inhibidor de la función de p53. En conjunto, estos resultados demuestran que las proteínas MAGE-I podrían participar en el balance que existe en las células tumorales entre factores prooncogénicos y proteínas supresoras de tumor. Ciertas proteínas MAGE-I como MageA2 puede bloquear la actividad de p53, pero a su vez ser regulada por p14- ARF (en el caso que la célula tumoral la expresara). Por otro lado MageB2 colabora con el fenotipo proliferativo mediante la regulación de factores de transcripción oncogénicos como E2Fs y c-Myc.

Abstract:
MAGE-I (Melanoma Antigen Gene) proteins are one of the larger tumor expression multigenic families, which bring together the Mage-A, Mage-B, Mage-C. These genes are characterized by its specific expression in tumors, by its high sequence conservation (all contain a common domain called MHD, Mage Homology Domain) and because of its location on the X chromosome. The first functional observations showed a correlation between the Mage-A high expression levels and its resistance to antitumor doxorubicin and paclitaxel drug. So, among this past few years it have been published works about the potential function of these genes. Our working group had contributed to the mage-I genes study describing the mechanism by which MageA2 causes the resistance to certain chemotherapeutic agents in human melanoma cells and reduces the senescence induced by oncogenes such as ha-Ras in normal cells. This mechanism involves inhibition of the transcriptional activity of the p53 oncosupresor by the action of histone deacetylases, HDACs. More recently, we have shown that MageA2 is capable to bound directly to PML-IV (promyelocytic leukemia protein-IV) interfering with the senescence induced by the PML-IV/p53 axis. Our observations on the function and/or localization of others MAGE-I proteins led us to develop our a first hypothesis: the conservation of sequence within the MAGE-I family not necessarily implies functional redundancy. On the other hand, given the importance of p53 function, our second hypothesis is that: there might be some intracellular pathway able to protect p53 activity from MageA2. In the first part of this Thesis work we have characterized another MAGE-I family member from B group: the MageB2 protein, showing that its expression induces induces proliferation in different cell lines independently of p53. MageB2 links this activity to the regulation of pro-oncogenic transcription factors, as c-Myc and E2Fs family. Also, MageB2 accumulates in the nucleolus, although distribution comprises both in cytoplasm and nucleus too. These data prompted us to verify and evidence that MageB2 could be linked to ribosome function. In the second part of this thesis we determined that p14ARF (p14, Alternative Reading Frame) expression reverses the MageA2 inhibition exerted on p53. We observed that p14ARF expression causes MageA2 relocalization from the nucleoplasm to the nucleoli in a similarly way that relocates Mdm2, an inhibitor of p53 function. Taken together, these results demonstrate that MAGE-I proteins may participate in the balance that exists in tumor cells between pro-oncogenic factors and tumor suppressor proteins. Certain MAGE-I proteins such as MageA2 can block the p53 activity, but in turn can be regulated by p14ARF (in the case that the tumor cell express it). On the other hand, MageB2 collaborates with the proliferative phenotype through regulation of oncogenic transcription factors such as E2Fs and c-Myc.

Salvucci, Rubén Darío. "Loci de caracteres cuantitativos (QTLs) de la soja (Glycine max L. Merr) asociados a su capacidad de nodular y fijar nitrógeno" (2015-06-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La soja (Glycine max L. Merr) es la leguminosa más importante cultivada a nivel mundial y en Argentina que, junto con Estados Unidos y Brasil, son los paises que lideran la producción y el comercio de esta oleaginosa. Para obtener materiales con altos rendimientos en las producciones agrícolas, el N se incorpora por medio de la fertilización química y/o biológica. Esta última tiene ventajas por sobre la fertilización química ya que presenta menores riesgos para la contaminación del medio ambiente y contribuye a un manejo sustentable. Ésta consiste en adicionar bacterias del suelo Gram (-) del género Bradyrhizobium que tienen la capacidad de interaccionar con las raíces de la planta, como resultado de lo cual, desarrollan estructuras denominados nódulos, en los cuales la bacteria fija nitrógeno. La soja usa casi todo el nitrógeno fijado en la producción de granos. Las compañías de inoculantes se han focalizado en producir formulados con cepas de bacterias seleccionadas que fijen más eficientemente el N y que puedan ser utilizadas en una amplia variedad de leguminosas. Sin embargo, el foco del mejoramiento en leguminosas ha sido principalmente el rendimiento y la resistencia a factores abióticos y bióticos. Desde 1950 se han caracterizado varios genes involucrados en el reconocimiento de las señales disparadas por los rizobios y las distintas etapas de la infección y nodulación. Sin embargo, los caracteres capacidad de nodulación y de fijación biológica de nitrógeno (FBN) presentan una arquitectura genética compleja, y además depende de la interacción planta-bacteria y del ambiente. Debido al gran tamaño y complejidad del genoma de la soja, todavía resta identificar genes de la planta involucrados en la nodulación y fijación de nitrógeno. Por lo tanto, en el objetivo del presente trabajo de tesis fue identificar a los loci de caracteres cuantitativos (QTLs) asociados a la capacidad de nodulación de la soja, de manera de disponer de la información y de los marcadores moleculares que permitan mejorar al hospedante en lo que hace a la nodulación y por ende a la fijación de nitrógeno. Para ello se analizó la habilidad de 31 cultivares comerciales argentinos de soja para desarrollar nódulos cuando estos fueron inoculados con una mezcla de las cepas Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5079 (CPAC 7) y SEMIA 5080 (CPAC 15). Los experimentos se realizaron en condiciones controladas de luz y temperatura. Se utilizaron para evaluar la capacidad de nodulación tres variables cuantitativas: número de nódulos (NN), peso seco de nódulos (PSN) y peso seco de la parte aérea de la planta (PSA). Los resultados permitieron seleccionar cultivares con alta, media y baja capacidad de nodulación. En un segundo experimento se confirmó la respuesta diferencial para la capacidad de nodulación y en un tercer experimento se comprobó que la capacidad de nodulación no es dependiente de la cepa inoculada ya que los cultivares de alta y baja capacidad de nodulación mostraron el mismo fenotipo cuando fueron inoculados con la estirpe E109. Los cultivares con alta capacidad de nodular tuvieron el doble de nódulos que aquellos con menor capacidad, confirmando resultados de trabajos previos. Además, se demostró la existencia de una variabilidad fenotípica amplia para las variables estudiadas. Los resultados señalaron valores medianos a altos de heredabilidad H2, siendo la variable NN la que denotó mayor variabilidad genética. La respuesta de la planta a la inoculación con una concentración determinada de bacterias estuvo condicionada al número de bacterias inoculadas. Un aumento en la concentración de células bacterianas resultó en un incremento del número de nódulos, hasta una concentración umbral, por encima de la cual la nodulación fue inhibida, lo que probablemente esté vinculado al mecanismo de “quorum sensing”. Esto último se observó tanto en los dos cultivares de alta como en los dos de baja capacidad de nodulación. La densidad celular de los rizobios no alteró la respuesta al comparar los cultivares a la inoculación. Luego se procedió a caracterizar la diversidad genética de los cultivares argentinos de alta y baja capacidad de nodulación por medio de SSRs ligados a QTLs asociados a nodulación en cultivares brasileros. Se determinó la asociación de estos marcadores con la capacidad de nodulación y otras características agronómicas de los cultivares de soja y se identificó la generación parental con capacidad de nodulación contrastante para que a partir del cruzamiento entre ellas se obtenga poblaciones segregantes aplicables al análisis de QTLs. Se encontró polimorfismo para 10 marcadores SSR. En los cultivares argentinos e encontró asociación entre la capacidad de nodulación y los marcadores SSR definidos por los cultivares brasileros. Metodologías de análisis multivariados permitieron tomar la decisión de seleccionar un cultivar de alta nodulación (NA 5485 RG) y uno de baja nodulación (A 7053 RG). Éstos fueron los parentales que se utilizaron para generar la población segregante F2:3 como población de mapeo. En la generación F2 se realizó el genotipado de los individuos a partir de ADN foliar con un “screening” de 221 marcadores SSR a lo largo del genoma de los cuales sólo 36 fueron polimórficos. Se construyó un mapa genético parcial conteniendo 5 grupos de ligamiento. El fenotipado se realizó sobre 94 familias F3 en un ensayo de nodulación en condiciones controladas de luz y temperatura y se evaluaron los caracteres cuantitativos que definen la capacidad de nodulación: número de nódulos (NN), peso seco de nódulos (PSN) y peso seco de nódulo por nódulo (PSNN) calculado como PSN/NN. También otros caracteres relacionados con el crecimiento de la planta fueron considerados: la biomasa seca de hojas (PSH) y biomasa seca de tallo (PST) y la suma de ambas, peso seco de la parte aérea (PSA). Se realizó un análisis de correlaciones entre las variables y de coeficientes de paso. A partir de una matriz básica combinada con los datos genotípicos (SSR) y fenotípicos se realizó finalmente el análisis mapeo de QTLs para estos caracteres mediante tres metodologías: por locus simple (ANOVA y regresión), por intervalo (SIM) e intervalo compuesto (CIM). Los resultados encontrados para la mayoría de los QTLs y sus efectos génicos coincidieron en general por los dos primeros métodos. Se pudo confirmar que el QTL Satt414 se asoció a NN y PSN (locus simple). Se concluyó que las variables asociadas a capacidad de nodulación en la población F3, presentaron altos valores de varianza genética y heredabilidad. Se localizaron QTLs para las variables estudiadas que explicaron valores mayores al 15% de la varianza fenotípica total de la población segregante. Se observó una segregación transgresiva para la mayoría de las variables asociadas a capacidad de nodulación. Se probó asociación en acoplamiento entre variables relacionadas con la capacidad de nodular y el aumento de la biomasa. Para caracteres de capacidad de nodulación, se localizaron QTLs en los siguientes grupos de ligamiento: GL H para NN; PSN y PSNN; GL D1b para NN; GL A2 para NN; GL J para NN y PSN; GL B2 para PSN y PSNN; GL B1 para PSNN, GL C1 para PSNN. Estos QTLs explicaron entre 12.2-13.4% de la variación fenotípica total. Para caracteres de biomasa, relacionados con la FBN, se localizaron QTLs en los siguientes grupos de ligamiento: GL H para AP y PST; GL M para AP. GL D1b para AP, PST, PSA y PSH; GL B2 para AP; GL N para PSA. GL L para PSA; GL G para PSH. Estos QTLs explicaron entre 8.3-25.6% de la variación fenotípica total. Si bien la metodología aplicada permitió localizar algunos QTLs de nodulación en intervalos. Estas regiones deberían saturarse con otros marcadores de mayor eficiencia y variabilidad como los SNPs. Una mayor saturación conjuntamente con la información disponible sobre el genoma de la soja y los bancos de ESTs permitirán identificar genes candidatos relacionados con el carácter en estudio. Estos resultados aportan herramientas útiles como punto de partida para realizar mejoramiento asistido por marcadores para la capacidad de nodular y fijar nitrógeno en soja promoviendo rendimientos superiores bajo una agricultura sustentable. Palabras clave: Soja (Glycine max), Bradyrhizobium japonicum, marcador molecular, análisis de mapeo de QTLs, nodulación, fijación biológica de nitrógeno.

Abstract:
Soybean (Glycine max L. Merr) is the most important legume cultivated worldwide. Argentina, Brazil and USA are the most important countries in terms of production and exports of soybean products. In order to make get the most of the production potential of soybean cultivars, N is incorporated by chemical and/or biological fertilization methods. The latter is aimed at using Biological Nitrogen Fixation (BNF) that has an advantage over the chemical fertilization since it reduces the risks of environmental pollution and contributes to a sustainable agriculture. BNF is the result of the plant rizobia interaction, because of this a biotechnological process was developed and is known as inoculation. It consists in adding Gram-negative soil bacteria from the genus Bradyrhizobium that has the ability to interact with the soybean root, to the plant that as a result of this develops structures known as nodules, where bacteria fix nitrogen. In soybean almost most of the nitrogen fixed biologically is used by the plant growth therefore production is improved. Companies improved nitrogen fixation by developing formulations containing bacteria. selected based on its outstanding efficiency to fix nitrogen in an interaction with a wide array of cultivars and/or legume species. However, on the plant side breeding programs have been focused mostly in improving yield and resistance to biotic and abiotic factors. Starting in 1950, several genes that are involved in rhizobia-soybean interactions have been characterized. However, the ability of soybean cultivars to nodulate and fix nitrogen has a complex genetic architecture that depends on plant-bacterial and environment interactions. The size and complexity of the soybean genome, delayed the identification of plant genes involved in nitrogen fixation. Therefore the aim of this work was to identify quantitative trait loci (QTLs) associated to the ability of soybean to develop nodules, as well as to identify molecular markers associated to this trait. I analyzed the nodulation ability of 31 Argentinian commercial soybean cultivars which were inoculated with a mixture of Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 5079 (CPAC 7) and SEMIA 5080 (CPAC 15). The results allowed me to classify cultivars in high, medium and low nodulating cultivars. In a second experiment, a subset of the already analyzed cultivars was selected for further analysis and their response to inoculation was confirmed. In a third experiment, four cultivars two with high and two with low nodulation capacity were inoculated with another bacterial strain, B. japonicum E109 (recommended by INTA for the soybean crop in Argentina). Cultivars responded like in previous experiments suggesting that the response was governed by the plant genome. Cultivars with high nodulation ability doubled the number of nodules developed by low nodulating cultivars. Heritability was estimated (H2) for the nodule number (NN), nodule dry weight (NDW) and shoot dry weight (SDW) and the results showed that the values of heritability was either medium or high and that NN was the most variable genetic trait. Soybean cultivars, whether with low or high nodulation capacity, increased nodulation as the concentration of bacteria in the inoculum increased though this occurred till a threshold value, decreasing thereafter. Probably nodulation was inhibited by a "quorum sensing" mechanism. Then we analyzed the genetic diversity of Argentinian soybean cultivars by means of SSR markers linked to QTLs linked to nodulation capacity. In addition to this, also the association between markers with nodulation capacity and other agronomic traits was studied and cultivars with contrasting nodulation capacity were identified, to cross them and in order to get a segregating population for QTL analysis. It was found that 10 SSR loci were polymorphic among Argentinian cultivars and that NN, NDW and SDW were associated to SSR markers previously described in Brazilian cultivars. Cultivar NA 5485 RG (high nodulating) and cultivar A 7053 RG (low nodulating) were selected as parents to generate the mapping population F2:3. Genotyping was carried out in the F2 generation. Genomic DNA was screened 221 SSR loci along the whole soybean genome. Among them only 36 were polymorphic. A partial genetic map was constructed containing 5 linkage groups. Phenotyping was carried out over 94 families (F3) in a nodulation essay with light and temperature controlled conditions and quantitative traits that define the nodulation capacity: nodule number (NN), of nodule dry weight (NDW) and nodule dry weight per nodule (NDWN) calculated as NDW/NN. Other traits related to plant growth also were considered in the analysis: leaves dry biomass (LDB) and stem dry biomass (SDB) and the sum of both, shoot dry weight (SDW) and plant height (PH). A matrix with genotypic and phenotypic data was constructed and QTL mapping analysis was performed by three methods: single marker (ANOVA and regression), interval mapping (IM) and composite interval mapping (CIM). Satt414 locus was confirmed as QTL associated with NN and NDW (single marker). It was concluded that the variables associated with nodulation capacity in the F3 population presented high values of genetic variance and heritability. Identified QTLs for studied variables explained values higher than 15% of the phenotypic variance. A transgressive segregation was observed for most of the variables associated with nodulation capacity. In addition I also found that variables related to the nodulation capacity and biomass were associated. QTLs associated to nodulation capacity were located in linkage group GL H for NN; NDW and NDWN; GL D1b for NN; GL A2 for NN; GL J for NN and NDW; GL B2 for NDW and NDWN; GL B1 for NDWN, GL C1 for NDWN. These QTLs explained 12.2-13.4 % of the phenotypic variation. QTLs related to growth and biomass were located in the following linkage groups: GL H for PH and SDB; GL M for PH. GL D1b for PH, SDB, SDW and LDB; GL B2 for PH; GL N for SDW; GL L for SDW and GL G for LDB. These QTLs explained 8.3-25.6% of the phenotypic variation. The applied methodology allowed me to locate a few QTLs for nodulation in intervals. However, these regions should be saturated with more and/or other molecular markers with better efficiency and variability as e.g. SNPs. A higher level of saturation as well as the information regarding the soybean genome sequence and EST's should help in the identification of genes related to nodulation and nitrogen fixation. To my knowledge this is the first work aimed at identifying nodulation and nitrogen fixation genes in soybean cultivars from Argentina and provide the starting point for marker assisted selection for nodulation capacity and nitrogen fixation in soybean in order to promote better yields under a sustainable agriculture. Keywords: Soybean (Glycine max), Bradyrhizobium japonicum, molecular marker, QTL mapping analysis, nodulation, biological nitrogen fixation.

Fantini, Lucía. "Evolución cromosómica y divergencia de especies en Cebus y Ateles (Primates: Platyrrhini) desde un enfoque citogenético molecular" (2015-12-04) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La diversidad de los primates neotropicales (Platyrrhini), analizada en el GIBE a partir de la diversidad cariotípica, ha permitido plantear, al menos, dos posibles “estrategias especiogénicas” generales. Según una de ellas, las inversiones y la variación en heterocromatina constituirían los reordenamientos y cambios distintivos entre especies. La especiación en Platyrrhini, además, ocurriría acompañada de cambios cuantitativos en el genoma. Como ejemplo, Cebus y Ateles, los géneros con mayor proporción de heterocromatina, comparten además un patrón específico de distribución geográfica coincidente con la proporción y presencia de heterocromatina en sus genomas. En este trabajo se analizó la diversidad de especies en Cebus y Ateles tomando como eje la variabilidad en el tamaño del genoma y su influencia en parámetros fenotípicos como la diversidad cariotipíca y la distribución y proporción de heterocromatina. Fueron estimados los tamaños de genoma (Valor C) de 13 especies, entre ellas 3 pertenecientes al género Ateles y 6 del género Cebus. Por medio de Hibridación Genómica Comparativa se identificaron las regiones cromosómicas correspondientes a las diferencias cuantitativas entre los genomas, dentro de cada género. En Ateles, éstas se ubican principalmente en regiones heterocromáticas, aunque también en regiones eucromáticas. Los genomas de menor valor C de Ateles estarían completamente incluidos en los genomas de mayor tamaño, mientras que las regiones de ganancia de ADN detectadas en las especies de mayor valor C sólo corresponderían a amplificaciones o repeticiones del mismo tipo de secuencias, y no a secuencias especie-específicas. Las únicas diferencias cuantitativas entre las especies de Cebus analizadas se hallaron en el cromosoma Y. Como parte del estudio de la evolución del cariotipo primate se estableció el mapa de homologías cromosómicas de A. chamek y Cebus sp. respecto del cariotipo humano, así como también se obtuvo el primer registro de homología entre el cromosoma Y humano y un primate neotropical, mediante FISH con el gen ZFY en Ateles paniscus. Finalmente, se discuten los resultados obtenidos y la divergencia de especies en cada género en el contexto de la citogenética molecular, respecto de la presencia y proporción de heterocromatina y tamaño del genoma. Los hallazgos citogeneticos y los datos genómicos aquí presentados podrían estar indicando que durante los procesos especiogénicos en Cebus y Ateles el genoma se modula complementariamente entre regiones de eucromatina y heterocromatina, pero compensado de distinta manera según el género considerado. Palabras clave: Cebus, Ateles, Valor C, Genoma, CGH, Evolución del cariotipo

Abstract:
The karyotype diversity of Neotropical primates (Platyrrhini) has enabled us to propose at least two possible general "speciation strategies." According to one, chromosomal inversions and variation in heterochromatin are the distinctive chromosomal rearrangements and changes between karyotypes. Also, speciation in Platyrrhini appears to be accompanied by quantitative changes in the genome at inter- e intrageneric level. As an example, Cebus and Ateles, both genus with the highest proportion of heterochromatin, share a specific pattern of geographic distribution corresponding to the presence and proportion of heterochromatin in the genome. In this work, species diversity in Cebus and Ateles was analyzed taking variability in genome size and its influence on phenotypic parameters such as karyotypic diversity and distribution and proportion of heterochromatin as main axis. Genome size (C value) of 13 species were estimated, including 3 belonging to the genus Ateles and 6 of the genus Cebus. Using Comparative Genomic Hybridization (CGH) chromosomal regions associated with quantitative differences among species genomes were identified. In Ateles, these regions are mainly heterochromatic but also euchromatic.. The genomes of Ateles species with small C value are completely included in the genomes of the species with bigger C value. Regions of gained DNA in the bigger genomes represent amplifications or repetitions of sequences of the same type, not speciesspecific sequences. The only quantitative differences between Cebus genomes were located in chromosome Y. Regarding chromosomal evolution in Primates, an homeology map between karyotypes of A. chamek, Cebus sp. and the human is presented. Also the first record of homeology between human chromosome Y and that of a neotropical primate was observed with hybridization of human gene ZFY in A. paniscus. Finally, results and species divergence are discussed in a molecular cytogenetic context, relative to presence and proportion of heterochromatin and genome size. All in all, the cytogenetic and genomic findings and species characterizations here presented seems to point out that genomes, during a speciation process in Cebus and Ateles, are modulated in a complementary fashion between euchromatic and heterochromatic regions, but distinctively balanced in the genus considered. Key words: Ateles, Cebus, C value, genome, CGH, karyotype evolution

Lavinia Oblanca, Pablo Damián. "Estudio de los patrones de diversificación de la avifauna neotropical a través del análisis de especies de ambientes selváticos" (2016-03-04) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El Neotrópico posee la avifauna más diversa del mundo con más de 3.000 especies que se reproducen en sus tierras. Gran parte de esta diversidad se encuentra concentrada en sus ambientes selváticos, entre los cuales se incluyen la Selva Atlántica y las Yungas y su transición con la selva Amazónica. En esta tesis se estudiaron los patrones y procesos responsables de la diversificación de las aves neotropicales a través del análisis de tres especies de Passeriformes de ambientes selváticos sudamericanos: Habia rubica (Cardinalidae), Ramphotrigon megacephalum (Tyrannidae) y Pipraeidea melanonota (Thraupidae). Las tres especies poseen distribuciones disyuntas que incluyen poblaciones alopátricas en la Selva Atlántica y el complejo Yungas-Amazonas, y a su vez representan algunas de las principales radiaciones de Passeriformes del Neotrópico. Se utilizó un enfoque integrador, combinando análisis genéticos (marcadores nucleares y mitocondriales) con el estudio de la variación fenotípica (coloración del plumaje) y comportamental (vocalizaciones). Los resultados sugieren que las historias evolutivas de estas especies han sido afectadas de distinta forma por un factor común: el establecimiento del corredor de vegetación abierta que aisla actualmente a la Selva Atlántica del complejo Yungas-Amazonas. No obstante, la diversificación de cada una de estas especies evidenció, al mismo tiempo, ciertos atributos idiosincráticos, sugiriendo que sus historias evolutivas han sido moldeadas por factores tanto compartidos como específicos de las mismas. Las diferencias en las historias evolutivas de estas tres especies podrían asociarse a sus ecologías contrastantes. En conclusión, esta tesis sustenta la idea de que la diversificación de la avifauna neotropical no puede ser restringida a una única ventana temporal ni explicada a través de uno o unos pocos mecanismos evolutivos. PALABRAS CLAVE: Amazonas, Ambientes selváticos, Aves, Canto, Citocromo b, COI, Coloración, Diversificación, Especiación, Filogenética, Filogeografía, Habia rubica, Neotrópico, Pipraeidea melanonota, Ramphotrigon megacephalum, Selva Atlántica, Yungas.

Abstract:
The Neotropics possess the highest avian diversity of the world with over 3,000 breeding species. Most of this richness is found within its rainforests, which include some of the most biodiverse regions in the planet like the Atlantic Forest and the Yungas Forest together with the Amazonia. Here I studied the factors and processes that have promoted avian diversification in the Neotropics through the analysis of three species of Passeriformes that inhabit South American forests: Habia rubica (Cardinalidae), Ramphotrigon megacephalum (Tyrannidae) and Pipraeidea melanonota (Thraupidae). All of these species have disjunct distributions that include allopatric populations in the Atlantic Forest and the Yungas-Amazonia complex, and at the same time represent some of the main passerine radiations in the Neotropics. I applied an integrative approach combining genotypic (mitochondrial and nuclear markers) and phenotypic (plumage coloration and vocalizations) evidence. The results suggest that the evolutionary histories of these species have been differentially affected by one common factor: the establishment of the open vegetation corridor that currently isolates the Atlantic Forest from the Yungas-Amazonia complex. However, the diversification processes of each of these species showed some idiosyncratic features, suggesting that their evolutionary histories have been shaped by both shared and unique factors. The differences found among these species could be associated with their contrasting ecologies. In conclusion, this thesis supports the idea that the diversification of the Neotropical avifauna cannot be restricted to a single temporal period or explained by a single or a few evolutionary drivers. KEY-WORDS: Amazonia, Atlantic Forest, Birds, COI, Cytochrome b, Diversification, Habia rubica, Neotropics, Pipraeidea melanonota, Phylogenetics, Phylogeography, Plumage coloration, Rainforests, Ramphotrigon megacephalum, Song, Speciation, Yungas Forest.

Juiz, Natalia Anahí. "Factores genéticos del hospedero asociados a la enfermedad de Chagas: transmisión vertical y cardiopatía chagásica crónica" (2017-03-01) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La enfermedad de Chagas es producto de una compleja interacción entre factores ambientales, del parásito Trypanosoma cruzi y del hospedero. En el marco de esta Tesis nos hemos enfocado en describir el rol que estos últimos juegan en dos escenarios de alto impacto en salud pública como son la transmisión congénita y la cardiopatía chagásica crónica. La transmisión congénita es parcialmente responsable de la urbanización del Chagas, que puede perpetuarse en sucesivas generaciones. Aún no han sido esclarecidos los mecanismos que la placenta ofrece en defensa contra la infección, así como tampoco por qué sólo una proporción de niños nacidos de madres infectadas adquieren Chagas congénito. Con el objetivo de describir la respuesta genética del microambiente placentario producido frente a la infección, hemos realizado un estudio de genómica funcional a través de un microarreglo en modelo murino C57BL/6J, comparando placentas de animales no infectados e infectados por dos cepas de T. cruzi: K98, no letal y miotrópica y VD, aislada de un caso humano de infección congénita. Nuestro análisis de redes biológicas sugiere que el microambiente placentario ejerce una fuerte respuesta inmune en detrimento del metabolismo celular modulada por la cepa parasitaria. Más aún, las diferencias encontradas entre ambas cepas podrían ser el resultado de un tropismo placentario observado en VD. Por otra parte, en el marco de esta Tesis se han evaluado polimorfismos de nucleótido simples (SNPs) en genes que codifican para enzimas de expresión placentaria como marcadores genéticos de susceptibilidad a esta transmisión. Para analizar dicha asociación hemos realizado un estudio del tipo caso-control comparando dos grupos de niños con y sin infección congénita nacidos de madres seropositivas. Para la genotipificación de las muestras de ADN humano, hemos diseñado técnicas de análisis de curvas de disociación de alta resolución para análisis de SNPs y de electroforesis capilar para análisis de microsatélites. Los resultados obtenidos del estudio de 11 sitios sugieren un papel importante en la infección congénita por parte de los polimorfismos en los genes de las proteínas MMP2 y ADAM12, implicadas en procesos de remodelación de la matriz extracelular y en la respuesta inmune. El último objetivo de este trabajo ha sido evaluar polimorfismos en los genes CCR2 y CCR5 como posibles marcadores genéticos de susceptibilidad a desarrollar la cardiopatía chagásica crónica en poblaciones originarias de Argentina. En particular, hemos encontrado que individuos de la etnia wichi, con menor prevalencia de problemas cardíacos, no presentan una de las mutaciones en CCR5, que es factor de riesgo en poblaciones no-wichi.

Abstract:
Chagas disease is caused by a complex interaction of environmental factors, Trypanosoma cruzi parasite and host. As part of this Thesis we have focused on describing the role that host factors play in two scenarios of high public health impact as congenital transmission and chronic Chagas cardiomyopathy. Congenital transmission is partially responsible for the urbanization of Chagas, which can remain in the following generations. Until now, it has not been elucidated the mechanisms that the placenta provides as defense against infection, nor why only a proportion of children born to infected mothers acquire congenital Chagas. In order to describe the genetic response of the placental environment produced during infection, we performed a study of functional genomics using a microarray approach in a C57BL/6J murine model, comparing placentas from uninfected and infected animals by two strains of T. cruzi: K98, a non-lethal myotropic strain and VD, isolated from a human case of congenital infection. The analysis of biological networks suggests that the placenta environment exerts a strong immune response to the detriment of cell metabolism modulated by the parasitic strain. Moreover, the differences between the two strains could be the result of a stronger placental tropism in the VD strain. Moreover, in the framework of this Thesis we have evaluated single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes coding for enzymes of placental expression as genetic markers of susceptibility to vertical transmission. To analyze the association we performed a case-control study comparing two groups of children with and without congenital infection born to seropositive mothers. In order to genotype human DNA samples, we have designed techniques of high resolution melting analyses for SNPs discrimination and capillary electrophoresis for analysis of microsatellites. The results of the 11 loci studied suggest an important role in congenital infection by human polymorphisms in genes coding for MMP2 and ADAM12 proteins, involved in extracellular matrix remodeling processes and in immune response. The last aim of this research was to evaluate polymorphisms in CCR2 and CCR5 genes as potential genetic markers of susceptibility to develop chronic Chagas cardiomyopathy in populations from Argentina. In particular, we have found that individuals belonging to the wichi ethnia, with lower prevalence of heart problems, do not exhibit one of the mutations in CCR5, a risk factor in non-wichi populations.

De Panis, Diego Nicolás. "Estudios genómicos y transcriptómicos de la adaptación al ambiente de cría en un modelo de especiación por especialización ecológica en Drosophila" (2017-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los estudios de secuenciación de alto rendimiento están abriendo nuevos caminos para investigar las respuestas adaptativas que los organismos despliegan en entornos alternativos. Sin embargo, mucho queda por entender sobre las bases genéticas de la adaptación a las plantas hospedadoras. La especies cactófilas de Drosophila que se encuentran en América del Sur tienen distinto grado de divergencia y especialización en la explotación de los cactus que habitan. La utilización de tejidos necróticos como hospedadores ha ligado su historia evolutiva a la expansión, retracción y diversificación de las cactáceas durante los cambios climáticos promovidos por los periodos glaciales del cuaternario. Las especies hermanas D. buzzatii y D. koepferae divergieron hace unos cinco millones de años y actualmente muestran una marcada diferenciación en caracteres de historia de vida, morfología y hábito, que aparentemente habrían evolucionado como adaptaciones a las distintas plantas hospedadoras. En su región simpátrica, ubicada en el noroeste Argentino, utilizan alternativamente cardones (Trichocereus terscheckii) y tunas (Opuntia sulphurea) como recursos de cría, donde el hospedador primario de una resulta en el secundario de la otra. Sin embargo, el cambio de hospedador afecta seriamente los componentes del fitness cuando ambas especies son criadas en el recurso secundario, lo que sugiere un importante papel de los metabolitos secundarios en el proceso de especialización ecológica. En la presente tesis, se estudiaron las particularidades genómicas de estas especies hermanas, así como la expresión génica en diferentes aproximaciones a las condiciones naturales de cría. A partir de los resultados, se desprenden diferencias entre ambas especies, tanto en su arquitectura genética como en su modulación transcripcional. Precisamente la mayor diferencia se encontró en la modulación transcripcional que llevan a cabo en los diferentes recursos de cría, aunque en ambos casos los genes diferencialmente expresados estuvieron principalmente relacionados con detoxificación, óxido-reducción y respuesta a estrés, pero también con desarrollo y procesos neurobiológicos. Esta trabajo aporta nuevos datos sobre el rol de la plasticidad transcripcional y las bases genómicas de estrategias adaptativas a ambientes de cría alternativos.

Abstract:
High-throughput sequencing studies are breaking new ground to investigate the adaptative responses that organisms deploy in alternative environments. Nevertheless much remains to be understood about the genetic basis of host plant adaptation. The cactophilic species of Drosophila that are found in South America have different degrees of divergence and specialization in the exploitation of the cactus they inhabit. The use of necrotic tissue as hosts has linked its evolutionary history to the expansion, contraction and diversification of cacti during climate changes promoted by Quaternary glacial periods. The sister species D. buzzatii and D. koepferae diverged about five million years ago and currently show a marked difference in life history traits, morphology and habit, which apparently have evolved as adaptations to different host plants. In its sympatric region located in northwestern Argentina, they alternatively use cardones (Trichocereus terscheckii) and prickly pears (Opuntia sulphurea) as breeding resources, where the primary host for one results in the secondary of the other. However, the host change seriously affects fitness components when both species are raised in the secondary resource, suggesting an important role of secondary metabolites in the process of ecological specialization. In this thesis, the genomics particularities of these sister species were studied, along with the genetic expression in different approaches to natural breeding conditions. From the results, differences arose between species, both in the genetic architecture as in the transcriptional modulation. Precisely, the biggest difference was found in transcriptional modulation carried out in the different breeding resources, although in both cases the differentially expressed genes were mainly related to detoxification, oxidation-reduction and response to stress, but also with development and neurobiological processes. This work contributes new data onto the role of transcriptional plasticity and the genomic bases of adaptive strategies to alternative rearing environments.

http://digital.bl.fcen.uba.ar

Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34