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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Patobiología [ 30 tesis ]

Moreno, Silvia N. J.. "Mecanismo de acción de drogas tripanocidas" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Doyle, Patricia Susana. "Las subpoblaciones de Trypanosoma Cruzi presentan diferentes capacidades de penetración : Influencia de factores químicos y biológicos sobre la capacidad de penetración en células de mamífero" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Carrizo, Patricia H.. "Metabolismo hepático del nifurtimox, un nitrofurano antichagásico" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Farber, Marisa Diana. "Transducción de señales en Phytomonas (parásitos de plantas)" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Phytomonas es un género de la familia Trypanosomatidae que parasita plantas. Si bien muchos de sus componentes no provocan daño a sus respectivos huéspedes, otros en cambio, son responsables de afecciones que acarrean pérdidas económicas. Tal es el caso de las palmas aceiteras en paises como Colombia, Venezuela y Guyana, el café en Brasil y algunos reportes de daño en algunos frutos como el tomate, tanto en Brasil como en España (Granada). La especie objeto de este estudio no es patogénica y corresponde a la aislada de Euphorbia characias (planta laticífera). Contiene una adenilil ciclasa unida a membranas y un sistema transductor de señales de proteínas G, del tipo Gs y Gi. Estas proteínas afectan la actividad de la adenilil ciclasa y posiblemente participan en un mecanismo que involucra a una señal de tipo hormonal. Si bien no existen evidencias directas de la existencia de un receptor, la proteína del tipo Gi es capaz de interaccionar con el peptido tóxico Mastoparán, que mimetiza la acción de los receptores acoplados a proteínas G. Se analizaron distintas fracciones subcelulares para caracterizar una actividad de quinasa de proteínas modulada por AMPc (PKA). Las fracciones subcelulares purificadas por cromatografía en DEAE-celulosa mostraton dos picos de actividad enzimática frente a histona IIA y a kémptido como sustratos. Usando un anticuerpo policlonal contra la subunidad catalítica de PKA de corazón bovino, se inmunoprecipitó un polipéptido con un peso molecular de 40 kDa. Estos datos en conjunto sugieren la presencia de dos tipos de actividad de quinasa de proteína de pendiente de AMPc (tipo I y 11). Experimentos in vivo con toxina del cólera, dieron como resultado un arresto del ciclo celular del parásito, poniendo en evidencia un efecto ambiguo de la vía de señalización mediada por AMPc, que requerirá de futuros estudios para su profundización. Datos preliminares, aunque incompletos nos dan un primer indicio de la conservación de este tipo de vía en una cepa patógena (responsable del Hartrot de las palmas aceiteras). La extrapolación de los resultados anteriores, nos permitirán diseñar aquellos experimentos tendientes a tratar de develar dónde reside la diferencia de patogenicidad de ambas cepas.

Abstract:
Phytomonas constitutes a genus of flagellated trypanosomatids with the capacity to infect plants. Although these trypanosomatids parasitize many plants species without apparent pathogenicity, in some cases they are responsible for economically important diseases including those affecting Solanum lycopersicum (tomato), Coffea liberica (coffee), Cocos nucifera (coconut), and Elaeis guineesis (oilpalm). Phytomonas sp membranes have an Adenylyl cyclase activity wich is greater in the presence of Mn2+ than with Mg2+. The Mg2+ and Mn2+ activity ratio varies from one preparation to another suggesting that the Adenylyl cyclase has a variable activation state. A GTP- -S binding activity with a Kd of 171 nM was detected in Phytomonas membranes. Incubation of these membranes with activated cholera or pertussis toxin and NAD+ led to incorporation of radioactivity into bands of about 40-44 kDa. Crude membranes were electrophoresed on SDS-polyacrylamide gels and analysed, by Western blotting, with the 9188 anti- s antibody and the AS/7 antibody (anti- t, anti- i1, anti- i2). These procedures resulted in the identification of polipeptides of approximately 40-44 kDa. Phytomonas Adenylyl cyclase could be activated by treatment of membrane preparation with cholera toxin in the presence of NAD+, while treatment with pertussis toxin did not affect this enzime activity. These studies indicate that in Phytomonas, Adenylyl cyclase activity is coupled to an unknown receptor entity trough G s proteins. We have identified two types of cyclic AMP-dependent protein kinase activity in Phytomonas citosol. Criteria to assert authenticity of this activity are the followings: 1- The enzime is specifically activated by cAMP; 2- Specificity for phosphate acceptors characteristic of this type of phosphotransferase activity; 3- DEAE-cellulose fractions specifically binds cAMP; 4- Polyclonal antibodies to bovine heart catalytic subunit immunoprecipitates a 40 kDa phosphorylated polypeptide; 5- As occures with mammalian type II cAMP dependent protein kinase, the activity corresponding to peak II is able to phosphorilate its own "regulatory component" an this doesn't occur with the enzime obtained in peak Y. As the present results were done in Phytomonas isolated from E.characias (a non-pathogenic specie) our next goal is to verify the regulation of this signal pathway in others strains, trying to understand the relationship with the host, and find out, why some of them are responsible of plant's deseases.

Menéndez, Ana Bernardina. "Micoparasitismo de Trichoderma spp. sobre el patógeno vegetal de suelo Sclerotinia sclerotiorum : Pruebas preliminares sobre el biocontrol de esta enfermedad" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo se estudió la capacidad de algunas especies de Trichoderma, en particular T. harzianum, como antagonistas del patógeno vegetal Sclerotinia sclerotiorum. En las pruebas de antagonismo "in vierto" se comprobé dicha capacidad en términos de la disminución del crecimiento de la colonia del patógeno y la reducción tanto de la viabilidad de los esclerocios como del desarrollo de otros nuevos. También se describió el proceso del micoparasitismo por parte del antagonista Trichoderma spp. sobre dos fases somóticas del patógeno: sus esclerocios y el micelio. En el primer caso se observó, con microscopía óptica, la colonización de los tejidos de los esclerocios infectados por parte del antagonista, comprobándose la total destrucción de la médula de los mismos. En el segundo, se observaron las interacciones hifales entre el micoparásito (T. harzianum BAFC cult. N§ 742) y el hospedante, tanto en cultivo dual como en un suelo estéril, con microscopía óptica y de barrido. En los cultivos duales, las hifas de T. harzianum crecieron hacia las de S. sclerotiorum enrollándose alrededor de ellas. En los últimos estadíos del proceso micoparasítico, se observaron enrollamientos o "coilings" muy densos y una degradación parcial de las paredes celulares de las hifas del patógeno. En suelo estéril, los conidios de T. harzianum germinaron y el micelio en desarrollo alcanzó al de S. sclerotiorum. Trichoderma formó ramificaciones cortas y cuerpos similares a apresorios los cuales podrían contribuir con la penetración de la pared del hospedante. Por otro lado se comprobé la capacidad del aislamiento de T. harzianum BAFC cult. N§ 742 para producir enzimas extracelulares que degradan las paredes celulares de S. sclerotiorum. Paralelamente se verificó la presencia de lectinas en una medio de cultivo líquido de S. sclerotiorum. En este trabajo se estudió además, la supervivencia de esclerocios de S. sclerotiorum en un suelo inoculado con T. harzianum en función de la concentración de inóculo del antagonista, de la temperatura y del pH. Posteriormente se llevaron a cabo pruebas preliminares sobre control biológico. Primero se desarrolló un sistema "in vierto" para evaluar la habilidad de Trichoderma para controlar la marchitez producida por S. sclerotiorum en plantas de pepino y lechuga: el recubrimiento de semillas con conidios de T. harzianum result¢ en reducciones del efecto de S. sclerotiorum sobre la emergencia y post-emergencia de las plantas de ambos hospedantes. Luego se realizó una búsqueda o "screening" en invernadero, con lechuga, en el cual se ensayaron varios aislamientos de Trichoderma spp. algunos de los cuales aumentaron los porcentajes de semillas germinadas y la supervivencia de las plantas, aunque no significativamente desde el punto de vista estadístico. Uno de estos aislamientos, T. harzianum BAFC cult. N§ 742, indujo además un incremento significativo en el peso seco del vástago de las plantas. Se realizaron dos ensayos independientes con lechuga en los cuales se empleó el aislamiento mencionado anteriormente como antagonista, obteniéndose, en uno de los ensayos, una reducción no significativa en la incidencia de la enfermedad. Sin embargo, se observaron aumentos en la mayoría de los parámetros de crecimiento de la planta medidos, todos estadísticamente significativos. Se efectuaron otros dos ensayos empleando plantas de soja como hospedante, uno en invernadero y el otro a campo. En ambos se verificó un control significativo de la enfermedad en los tratamientos con la aplicación de T. harzianum BAFC cult. N§ 742. En cambio, no se registraron diferencias significativas en el desarrollo de las plantas en ninguno de los dos casos. Se realizaron dos ensayos de biocontrol más, empleando girasol como hospedante, de los cuales se extrajeron resultados significativos referentes al aumento en el desarrollo de las plantas y la reducción de la incidencia de la enfermedad producida por S. sclerotiorum. Los resultados se discuten en forma independiente por capítulos y finalmente en forma global.

Abstract:
In this work, the ability of some species of Trichodema, particularly T. harzianum, as antagonists of the soilborne plant pathogen Sclerotinia sclerotiorum, was studied. Such hability was demonstrated in "in vierto" assays, in terms of the reduction of the pathogen colony, the sclerotia viability, as well as the development of new ones. The process of mycoparasitism by the antagonist Trichoderma spp. is also described on two somatic phases: the sclerotia and the mycelium. In the first case, the colonization of infected tissues of the sclerotia by the antagonists was observed with light microscopy, and verified the total destruction of the sclerotia medulla. In the second, hiphal interactions between the mycoparasite (T. harzianum BAFC cult. N§ 742) and its host, were observed in dual cultures and also in sterilized soil, with both light and scanning microscopy. In dual cultures, hyphae grew towards and coiled around the S. sclerotiorum hyphae. Dense coils and partial degradation of the Sclerotinia cell wall were observed in later stages of the parasitism. In sterile soil, T. harzianum conidia germinated and the developing mycelium made contact with that of S. sclerotiorum. Trichoderma formed short branches and appressorium-like bodies which propably aid in holding and penetrating the host cell wall. On the other hand, the capacity of the isolate BAFC N§ 742 of T. harzianum to produce enzimes degrading cell wall of mycelium and sclerotia of S. sclerotiorum, was demonstrated. Parallely, the presence of lectins in a liquid culture medium of S. sclerotiorum was also shown. In this work, the survival of sclerotia of S. sclerotiorum in soil inoculated with T. harzianum was studied, versus the concentration of the antagonist inoculum, the temperature and the pH. Later, preliminary assays on biological control were carried out "in vierto", in greenhouse and in the field. An "in vierto" system was developed to test the Trichoderma ability to control Sclerotinia wilt in cucumber and lettuce: coating seeds with T. harzianum conidia resulted in a reduction in the pre- and post-emergence effect of S. sclerotiorum in both hosts. Several isolates of Trichodema spp. were assayed in a greenhouse screening of antagonists, using lettuce plants as the host. Some isolates increased seeds germination and plants survival, although the differences were not significant at statistical level. One of these isolates, T. harzianum BAFC cult. N§ 742, also induced a significant increase of the aerial dry weight of plants. Two independent assays with lettuce were performed in which the above mencioned isolate was employed as antagonist. A reduction of the diseases incidence was obtained in one of the experiments but it was not significant. However, most of the growth parameters measured in the plants increased significantly. Another two experiments were carried out with soybean as the host, one in greenhouse and the other in the field. A significant control of the disease was verified when T. harzianum BAFC cult. N§ 742 was applied, in both experiments. In contrast, there were not significant differences regarding growth parameters of the plants in any of the two experiments. Sunflower plants were employed as hosts in two biocontrol assays, from which significant results, related to increase of plants development and disease control were obtained. Results are discused separatly in each chapter and globaly at the end.

Biondi, Ricardo M.. "Aislamiento, purificación y caracterización de la nucleósido difosfato quinasa del hongo patógeno Candida albicans : Comparación con otras especies" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enzima nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa) es ubicua y cataliza la síntesis de NTPs a partir de sus correspondientes NDPs y un NTP dador (fisiológicamente el ATP). La reacción sigue una cinética de ping-pong con la formación del intermediario de alta energía (P)NDP quinasa. Aparte de su rol fundamental en la síntesis de NTPs, se ha relacionado a esta enzima con a) la activación de proteínas G en la transducción de señales, b) la diferenciación de Drosophila y distintas líneas celulares, c) inhibición de metástasis (nm23), y recientemente ha sido identificada como d) un factor de transcripción. En el presente trabajo se presentan resultados de la purificación y caracterización de la NDP quinasa de Candida albicans, un hongo patógeno oportunista de vertebrados. Se caracterizó la enzima bioquímicamente, en cuanto a su tamaño, al número de subunidades, su punto isoeléctrico, su estabilidad térmica, y la posibilidad de usar distintos NTPs y NDPs como dadores y aceptores de la reacción. A través de dos enfoques experimentales diferentes se demostró que los nucleótidos de guanina y adenina son los mejores aceptores de la reacción (Arch). Biochem. Biophys. (1995), 187-194). Se evaluó a su vez, la capacidad de NDP quinasas de distinto origen de fosforilar a análogos de nucleótidos utilizados en terapias antivirales; para ello, se desarrolló la metodología para medir la actividad NDP quinasa con estos sustratos (J. Biol. Chem. (1996), 271, en prensa). Se estudió la actividad y la presencia de la enzima durante el crecimiento y la morfogénesis del hongo; la actividad específica máxima se encontró durante el crecimiento logarítmico (An. Asoc. Quím. Argent. (1993), 81, 4-5, 359-366). Se realizó un estudio detallado del proceso de autofosforilación de la NDP quinasa, y se encontró que sólo se encuentra autofosforilada en residuos de histidina. La autofosforilación de la enzima también se realizó en extractos crudos de C. albicans y de Escherichia coli. Dado que la NDP quinasa se autofosforila en residuos de histidina como parte de su mecanismo de acción, los ensayos para estudiar la posible regulación de la enzima por fosforilación a través de alguna quinasa necesitan de una metodología que pueda distinguir la fosforilación en histidina de aquella en serina o treonina. Se desarrolló entonces una metodología sobre membranas de Immobilon con el uso de buffers de pH 1 y 14 con el agregado de 5 por ciento metano. Esta metodología se utilizó para estudiar la fosforilación in vivo en C. albicans y en células HeLa en cultivo. Se discuten las posibles implicancias de la fosforilación en serina in vivo.

Abstract:
Nucleoside diphosphate kinase (NDP kinase) is a ubiquitous enzyme catalysing the synthesis of NTPs from its corresponding NDPs using a NTP donor (physiologically ATP). The reaction follows a ping-pong mechanism of catalysis with a (P)NDP kinase high energy intermediate. Apart of its essential role in the synthesis of NTPs, this enzyme has been related to a) G-protein interaction in signal transduction, b) differentiation in Drosophila and different cell lines, c) inhibition of metastasis (nm23), and has recently been identified to d) a transcription factor. In the present work, data are presented on the purification of Candida albicans NDP kianse as well as a biochemical characterization of the enzyme, number and type of subunits, pI, thermal stability and the possibility to use as substrates different NTPs and NDPs. By two different approaches, guanine and adenine di and triphosphates were found to be the better acceptors and donors of the reaction (Arch. Biochem. Biophys. (1995), 187-194). The ability of NDP kinase to phosphorylate different anti-HIV nucleotide analogs was addressed, and a methodology was developed to measure the enzyme activity with these substrates (J. Biol. Chem. (1996), 271, in press). The specific activity of the enzyme during the growth and morphogenesis of C. albicans was studied; the specific activity was found to be maximal during logarithmic growth (An. Asoc. Quím. Argent. (1993), 81, 4-5, 359-366). Using purified enzyme, a detailed study of the pure enzyme autophosphorylation was carried out; the results indicated that only histidine autophosphorylation was found. Autophosphorylation in C. albicans and Escherichia coli crude extracts was also performed. As NDP kinase autophosphorylates in a histidine residue as part of its kinetic mechanism of action, the studies of phosphorylation by other kinases need to discriminate between phosphorylation on serine/threonine and histidine residues. A method on Immobilon membranes using 5 per centum methanol in buffers of pH 1 and 14 is described. This method was used to study the in vivo phosphorylation of the enzyme in C. albicans and in HeLa cells in culture. Possible implications of in vivo NDP kinase serine phosphorylation are discussed.

Mirkin, Gerardo A.I.. "Mecanismos inmunopatogénicos en la neuromiopatía chagásica experimental" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los mecanismos patogénicos subyacentes a las alteraciones neuromusculares producidas durante la infección con Trypanosoma cruzi fueron estudiados en un modelo murino empleando una cepa miotrópica de escasa virulencia (CA-I) y una cepa letal pantrópica (RA), mediante técnicas electrofisiológicas, histológicas e inmunológicas. Ratones C3H/HeN infectados con la cepa CA-I manifestaron un patrón electromiográfico de compromiso muscular primario, en tanto los infectados con RA, revelaron un patrón neuropático primario. Los estudios histopatológicos evidenciaron alteraciones inflamatorias de severidad creciente en los tejidos afectados estudiados en este modelo: músculo isquiotibial, nervio ciático y médula espinal. Las lesiones musculares eran de mayor intensidad en la infección con CA-I y las de tejido nervioso predominaban con RA, lo cual está de acuerdo con el tropismo parasitario. El fenotipo celular predominante en los infiltrados inflamatorios dependió de la cepa de T.cruzi, del tejido y del tiempo post-infección. Los rasgos más destacados en la infiección con la cepa CA-I fueron: a) Predominio de linfocitos T CD4 en músculo esquelético durante la fase aguda y crónica temprana y, b) Presencia de linfocitos B con IgM de superficie en la fase crónica tardía en todos los tejidos. Las características más relevantes de la infección con RA fueron: a) predominio de linfocitos T CD8 en tejido nervioso durante todo el curso de la infección, b) presencia de células NK (asialo-GMl+) en tejido muscular durante la fase crónica y, c) presencia células CD4-, CD8- en tejido nervioso durante la fase crónica. Estudios de proliferación linfocitaria realizados durante la infección crónica con el clon K-98 de CA-I demostraron la existencia de linfocitos T CD4 y CD8 autorreactivos frente a Ag de tejido muscular esquelético y sistema nervioso. En estudios similares con la cepa RA ambassubpoblaciones de linfocitos T sólo proliferaron frente a Ag de SN. La transferencia pasiva de linfocitos T CD4 de ratones infectados con K-98, indujo miositis con predominio de células T CD4+ y macrófagos en ratones singeneicos normales, sugiriendo el desarrollo de hipersensibilidad retardada (HR), frente a Ag musculares. Los linfocitos T CD8 de los mismos ratones no desencadenaron patología neuromuscular en los receptores. La transferencia de linfocitos T CD4 y CD8 de ratones infectados con RA, indujo neuritis y leptomeningitis, sugiriendo el desarrollo de mecanismos de HR como de citotoxicidad dependiente de linfocitos T frente a Ag de sisterna nervioso.

Abstract:
The pathogenic mechanisms underlying the newomuscular alterations during manosoma d infedion were studied in a mnurh?e model by means of electrophysiological, histological and immunological techniques in inbred mice infected with a low virulence myotropic strain (CA-I) and a highly virulent pantropic strain by means of electrofisiological, histological and immunological techniques. C3H/HeN mice infected with CA-I showed an electromyographic pattern of primaxy muscle compromise while those infected with RA disclosed a primary neuropathic pattern. Histological studies revealed inflammation of increasing severity in the affected tissues studied in this model: hamsting muscle, sciatic nerve and spinal cord. The muscle lesions were more intense in mice infected with CA-I, and those in nervous tissue were more intense in mice infected with RA in agreement with the parasite tropism. The predominant phenotype in the inflammatory infiltrates depended on the T.cruzi strain, the tissue and post-infection time studied. The relevant features in the infection with CA-I were: a) Predominance of CD4 T lymphocytes in skeletal muscle during the acute and early chronic phases and, b) Presence of surface IgM positive B lymphocytes during the late chronic phase in all tissues. The relevant fatures in the infection with RA were: a) Predominance of CD8 T lymphocytes in nervous tissue during the course of infection, b) Presencia of NK cells (asialo-GMl+) in muscle tisuue during the chronic phase and, c) Presence of CD4-, CD8- cells in nervous tissue during the chronic phase. Lymphocyte proliferation studies performed during the chronic phase with the K-98 clone of CA-I showed the existence of nervow system Ag and muscle Ag autoreactive CD4 and CD8 T lymphocytes. In similar studies with the RA strain both T cell subsets proliferated against nervous tissue Ag only. Pasive cell transfer of CD4 T lymphocytes fiom K-98-infected mic, induced myositis with predominance of CD4 T cells and macrophages in normal syngeneic mice, suggesting the development of delayed-type hypemdtivity (DTH) against muscle Ag. CD8 T lymphocytes fiom the same donors did not develop neuromuscular pathology in recipients. The transfer of CD4 and CDS T lymphocytes fiom RA-infected mice induced neuritis and leptomeningitis in recipients, suggesting the development of both DTH and T lymphocyte-dependent cytotoxicity against nervous system Ag.

Lorenzo, Marcelo G.. "Factores que afectan la distribución espacial de la vinchuca Triatoma infestans y búsqueda de nuevas herramientas para su control" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se utilizó un modelo artificial de refugio para estudiar diversos aspectos de su uso por T. infestans. Estos insectos salen de sus refugios al comienzo de la escotofase para procurar alimento. Se muestra que la búsqueda de refugio ocurre al final de la fase oscura. El nivel de ayuno tiene una relación directamente proporcional con la actividad de búsqueda del hospedador entre la salida de refugio y la vuelta al mismo. Esto implica que los insectos ayunados se mantienen activos durante toda la fase oscura. Se describe un comportamiento de defecación, mediante el cual las vinchucas abandonan los refugios para eliminar sus deyecciones en proximidad de estos. Como consecuencia, se observa la acumulación de deyecciones en los accesos a refugios. Se demuestra que las heces actúan como marcas químicas de las inmediaciones del refugio, orientando a los insectos hacia éste. Explotando este comportamiento, se desarrollo un diseño muy sencillo de refugio artificial cebado, que es capaz de reclutar vinchucas a su interior. Pudo determinarse que la temperatura, y en particular la humedad relativa, son factores que afectan la elección de un refugio por parte de las vinchucas. Se presenta la primer trampa para vinchucas, asociada con cultivos de Saccharomices cerevisiae como cebos atrayentes. Dicha trampa cebada resultó altamente efectiva en ensayos de laboratorio, capturando al 50 % de los insectos presentes en una noche. En ensayos a campo se determinó la efectividad de la trampa, capturándose números significativos de vinchucas en periodos breves de tiempo.

Abstract:
A model of artificial refuge was used to study different aspects of its exploitation by T. infestans. These insects get out from shelters at the beginning of the dark phase in order to find a host. We show that the search for refuges occurs at the end of the scotophase. The fasten interval has a direct relationship to the level of host searching activity during the interval between refuge outgoing and incoming. This means that fastened insects keep active during the whole night. A behaviour is described, by means of which the vinchucas go out from shelters in order to defecate in their vicinity. As a consequence, an accumulation of faecal droppings is observed at the refuge entrance. It is shown that dry faeces act as a chemical mark of the surroundings of the shelter orienting the insects toward the refuge. A simple baited artificial refuge was developed, capable to draw triatomines inside. It was demonstrated that the temperature and specially the relative humidity at the refuge, affect the selection of a shelter by the bugs, The first trap for triatomine bugs is presented, associated with cultures of Saccharomices cerevisiae that act as a bait improving dramatically the captures of bugs. That trap showed to be highly effective in laboratory assays, capturing 50 % of the present bugs in single night assays. In field trials, this trap captured significant numbers of bugs in one night assays.

Cucchi, Adriana. "Supervivencia y mejoramiento de los bacilos entomopatógenos : Bacillus thuringiensis var. israelensis y Bacillus sphaericus" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El uso de los bioinsecticidas representa una ventajosa alternativa desde el punto de vista ecológico y toxicológico en el control de enfermedades y plagas.% Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) y Bacillus sphaericus (Bf) son especies bacterianas empleadas como bioinsecticidas en la lucha contra los agentes de transmisión del paludismo, la fiebre amarilla y el dengue entre otras enfermedades. Sin embargo su uso se ve restringido debido a la alta especificidad y sedimentación de los preparados de bioinsecticidas así como debido a problemas de supervivencia de los bacilos entomopatógenos. El objetivo de esta tesis es comprender las causas de la baja supervivencia de Bti y Bf y mejorar esta variable para aumentar su eficiencia como bioinsecticidas. En este estudio se evalúan distintas propiedades vinculadas con la supervivencia, eligiéndose a la respuesta osmótica como tema central de estudio. Si bien se analiza el comportamiento en distintos estadios fisiológicos, las esporas constituyen el principal blanco de interés. Esto surge al considerar que los bioinsecticidas son preparados formados por esporas y cristales tóxicos y que son empleados mediante su diseminación en ambientes acuáticos. A partir de los resultados obtenidos en esta tesis se puede concluir que: 1- Distintos factores determinan la baja supervivencia de los bacilos entomo-patógenos Bti y Bf en el ambiente: la temperatura, la luz UV, las variaciones osmóticas y el bajo pH, si bien su reducida tolerancia osmótica es uno de los factores que contribuye en mayor medida. 2- La alta sensibilidad de las esporas de estos bacilos resulta de una deficiencia en un tipo de proteínas llamadas SASP, encontrándose afectados tanto su concentración como el contenido en aminoácidos osmóticamente relevantes. Por otro lado, posiblemente deficiencias relacionadas con las cubiertas y envolturas de las esporas sean también responsables de su gran sensibilidad ambiental. 3- La introducción de genes ssp (codificantes de las proteínas SASP) de B. subtilis permite un mejoramiento de la respuesta osmótica en esporas de Bti y Bf. La expresión de estas proteínas en las cepas transformadas no afecta la esporulación ni otras propiedades biológicas de importancia en el empleo de los bioinsecticidas.

Abstract:
Bioinsecticides constitute a convenient choice in plague and disease control, both considering toxicological and environmental perspectives. Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) and Bacillus sphaericus (Bf) are bacteria employed as bioinsecticides in paludism, yellow fever and dengue control. Nevertheless, poor strain survival, restricted host range and sediment problems of formulations in aquatic enviroments limit their application in nature. The objetive of this work is to understand Bti and Bf low survival and to improve it in order to obtain a greater efficacy in field application. The research is focus on the osmotic response, although other parameters are also evaluated. The study is based on spores, but vegetative cell behaviour is also analyzed. This results from bioinsecticides are spore plus crystal complexes which are disseminated in aquatic environments. From the results obtained we can conclude that: 1. Different environmental factors contribute with Bti and Bf poor survival: temperature, UV light, osmotic variations and low pH, although the reduced osmotic tolerance is one of the main factors to consider. 2. The great sensibility of Bti and Bf spores is due to a defficiency in some proteins called SASP, being affected both its concentration and the content of osmotically relevant aminoacids. Possibly, other defficiencies including the spore cortex and spore coats contribute with this great sensibility. 3. Introduction of ssp genes (which code for SASP proteins) from B. subtilis improve the osmotic response of Bti and Bf spores. SASP expression doesn’t interfere with sporulation nor crystal protein synthesis, essential in bioinsecticide application.

Mahler, Evelina Bárbara. "Rol de las proteínas ribosomales P de Trypanosoma cruzi en lasgeneración de anticuerpos con autorreactividad funcional en la cardiomiopatía crónica chagásica" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La cardiomiopatía crónica chagásica (CCCh) se caracteriza por su compleja sintomatología arritmogénica presentando diversos disturbios que incluyen arritmias ventriculares y disfunción de nódulo sinusal, cuya progresión puede llevar a la muerte súbita. Pese a que la CCCh es la resultante de un complejo número de factores, nuestro grupo ha demostrado que los anticuerpos que se generan contra las proteínas ribosomales P de T.cruzi en los pacientes podrían ejercer efectos patogénicos “no deseados” por reacción cruzada sobre el tejido cardíaco (estimulando los receptores β1-A y M2-Ch). En este trabajo demostramos la prevalencia de anticuerpos que reconocen receptores cardiovasculares en la CCCh y su correlación con la sintomatología arritmogénica de los pacientes. Investigamos el rol que desempeña la región C-terminal de la proteína ribosomal TcP2β,el péptido R13, en la generación de los anticuerpos que reaccionan en forma cruzada por un tanto con los receptores β1-A como con los receptores M2-Ch por un mecanismo de mimetismo molecular. Se demostró que los anticuerpos anti-R13 ejercen un efecto sobre la contractilidad de cardiomiocitos y sobre la cascada de señalización asociada a los receptores acoplados a proteína G. El estudio fino de los anticuerpos anti-R13 de diversos pacientes con CCCh y la caracterización de un anticuerpo monoclonal anti-R13 demostraron la heterogeneidad entre estos anticuerpos que fueron generados por un mismo antígeno pero con especificidad diferencial hacia los receptores cardíacos. El estudio de la especificidad de estos anticuerpos explicaría elementos de la compleja sintomatología en la CCCh. Finalmente, se construyó una biblioteca combinatorial de anticuerpos a partir de médula ósea de un paciente con CCCh y se identificaron anticuerpos recombinantes humanos anti-R13 que reproducen algunas de las características de los anticuerpos policlonales y el anticuerpo monoclonal. Esta biblioteca constituye una herramienta importante para comprender más profundamente los mecanismos moleculares implicados en la generación de anticuerpos con efectos cardíacos patogénicos y podrían permitir el diseño de estrategias terapéuticas para mejorar la calidad de vida del paciente con CCCh.

Abstract:
Chronic Chagas' Heart Disease (cChHD) is characterized by a complex arrhythmogenic symptomatology, displaying various dísturbances including ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction, leading in many cases to sudden death. Even if the pathogenesis of cChHD is the result of a multiple símultneaous events, our group demonstrated that cross-reactive antibodies raised against T.cruzi ribosomal P proteins could exert pathogenic effects on heart membranes (stimulating β1-adrenergic and M2-cholínergic receptors). In this work, we investigated the prevalence of antibodies that stimulate G protein coupled receptors (GPCR) and their clinical correlation with electrical disorders amongst patients with cChHD. We further investigated the role of the C-terminal region of TcP2β, peptide R13, in raising antibodies that cross react with both β1-adrenergic and M2-cholinergic receptors by a mechanism of molecular mimicry. The ability of anti-R13 antibodies to exert various effects on the contractility and signal transduction associated with GPCR in cardiomyocytes was demonstrated. The detailed studies on anti-R13 antibodies purified from different cChHD patients and the characterization of an anti-R13 monoclonal antibody provided further insight on the heterogeneous features of these antibodies that are generated against a common antigen but display differential specificity on cardiac receptors. The study of the fine specificity of anti-R13 antibodies allowed us to understand part of the complex symptomatology of cChHD. Finally, a combinatorial antibody library, made from bone marrow of a cChHD donor, was constructed. Anti-R13 recombinant human Fab fragments were identified and their properties compared to the observed features in the policlonal response and the murine monoclonal antibody. This library represents an important tool to gain further insight into the molecular mechanisms underlying the generation of cross-reactive antibodies with pathogenic effects on the human heart in cChHD and could provide some elements to design new therapeutic strategies.

Campos, Eleonora. "Obtención de mutantes de Brucella abortus genéticamente definidas: su caracteización molecular y evaluación de su uso como vacunas para la brucelosis bovina" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El desarrollo de las técnicas de ADN recombinante permitió la generación de vacunas racionalmente diseñadas. Teniendo esto en cuenta, el objetivo de este trabajo es la obtención de cepas de Brucella abortus genéticamente modificadas que puedan ser utilizadas como vacunas contra la brucelosis. La brucelosis es una zoonosis bacteriana causada por especies del género Brucella, un grupo homogéneo de patógenos intracelulares facultativos que tienen la habilidad de sobrevivir y multiplicarse en fagocitos profesionales y no profesionales. En bovinos, Brucella abortus produce una enfermedad crónica caracterizada por aborto, nacimiento de terneros enfermos y fertilidad reducida. La cepa vacunal para la brucelosis bovina en uso en la mayoría de los países es la cepa B. abortus Sl9, que confiere un 70 a 80% de protección contra el aborto pero genera dificultades en el serodiagnóstico y conserva considerable virulencia residual para el hombre. Con el fin de obtener cepas de B. abortus que sean compatibles con un ensayo diagnóstico diferencial y que tengan menor virulencia residual que Sl9, se construyó la cepa doble mutante B. abortus INTA] (II) por inactivación de los genes bp26 y bmp18. BP26 es una proteína periplásmica inmunodominante durante la infección con Brucella que no influye en la persistencia ni en la protección de la cepa en ratones BALB/c. BMP18 es una lipoproteína de membrana externa, también descripta como Ompl9, cuya anulación en Sl9 genera menor capacidad de replicar en el bazo de los ratones aunque con igual persistencia y capacidad protectiva. La cepa INTAl resultó más atenuada que S19, pero mantuvo su capacidad protectiva en el modelo ratón. Esta cepa mostró mayor sensibilidad a temperatura, a agentes hidrofóbicos y a moléculas policatiónicas que Sl9 y esta sensibilidad fue revertida por una copia funcional del gen bmp18. Para determinar la contribución de BMP18 a la virulencia de Brucella, se generó la cepa Ml8v por inactivación de bmpl8 en la cepa patógena B. abortus 2308. M18v no mostró diferencias significativas respecto de S2308 en su habilidad para sobrevivir y replicarse en macrófagos, pero fue más atenuada en ratones. Por lo tanto, la falta de expresión de BMP18 generaría desorganización de la membrana externa, haciendo a la bacteria más susceptible a mecanismos bactericidas del suero pero sin afectar significativamente su supervivencia intracelular. Para evitar el uso de genes que confieren resistencia a antibióticos en el desarrollo de cepas vacunales, se diseñó una estrategia para la generación de mutantes ísogénicas utilizando el gen sacB como marcador de contraselección. Con esta estrategia, se obtuvo la cepa B. abortus Mlluc por reemplazo de parte de la secuencia de bp26 por el gen luc en Sl9 y posteriormente la cepa doble mutante INTA2 (I2) por deleción del gen bmp18 en la cepa M1luc. Al evaluar las cepas Mlluc e I2 en bovinos, la protección obtenida contra el aborto después del desafio con una cepa patógena fue equivalente para Sl9 y Mlluc pero menor para I2. Estos resultados indican que la falta de BP26 no tiene efecto alguno sobre la capacidad de Sl9 de inducir una respuesta inmune protectiva tanto en el modelo ratón como en el hospedador natural. Sin embargo, la falta de expresión de BMP18 en Sl9 genera menor capacidad protectiva en bovinos. En las condiciones de desafio experimental de este ensayo, la respuesta humoral contra BP26 cuantificada por iELISA presentó gran heterogeneidad y bajos niveles de sensibilidad, para parámetros de especificidad óptima. La estrategia desarrollada para la obtención de mutantes ísogénicas en más de un gen sin marcadores de resistencia a antibióticos permitirá la posibilidad de generar cepas de Brucella con múltiples mutaciones definidas de manera de obtener cepas vacunales efectivas y seguras para animales y humanos que puedan ser utilizadas en el control de esta enfermedad.

Abstract:
Recombinant DNA technology has led to the development of rationally designed vaccines. In this context, the aim of this project was to develop genetically modified strains of Brucella abortus that could be used as vaccines against brucellosis. Brucellosis is a bacterial zoonosis caused by species from the genera Brucella, an homogenous group of intracellular facultative pathogens that have the ability to survive and replicate in professional and non-professional phagocytes. In bovines, Brucella abortus produces a chronic disease characterized by abortion, birth of sick calves and reduced fertility. The vaccine strain in use for bovine brucellosis in most countries is B. abortus Sl9. This strain confers 70 to 80% protection against abortion but generates difficulties in serodiagnosis and retains considerable residual virulence for human beings. The double mutant strain B. abortus INTA1 (II) was constructed by inactivation of bp26 and bmp18 genes, with the objective of obtaining strains of B. abortus that could have an associated differential diagnostic test and that are less virulent than Sl9. BP26 is a periplasmic protein that is inmunodominant during infection with Brucella. The lack of expression of this protein in Sl9 does not affect the strain persistence or protection capacity in the mouse model. BMP18 is an outer membrane lipoprotein, also reported as Ompl9. When its expression was abrogated in Sl9, the resulting mutant strain showed less replication in mice spleen, suggesting attenuation, although it maintained its protection capacity. B. abortus I1 resulted more attenuated than Sl9 and retained its protection capacity in the mouse model. This strain showed more sensitivity than Sl9 to temperature, hydrophobic agents and policationic molecules, and this phenotype was reverted by a functional copy of bmp18. In order to establish BMP18 contribution to Brucella virulence, bmp18 gene was mutated in pathogenic strain B. abortus 2308, generating strain Ml8v. This strain did not show any significant differences respect to S2308 in its ability to survive and replicate in murine macrophages, but was more attenuated in mice. Therefore, lack of expression of BMP18 would disrupt membrane integrity, probably leading to more susceptibility to sera bactericidal mechanisms but not affecting significantly intracellular survival. In order to avoid the use of antibiotic resistance markets in the construction of vaccine strains, a mutagenesis strategy for obtaining isogenic strains using sacB as counterselection marker was developed. With this strategy strains B. abortus Mlluc (Sl9 ∆bp26::luc) and INTA2 (I2) (Sl9 ∆bp26::luc Abmpl8) were obtained, replacing most of bp26 coding region for luc gene in M1luc and then deleting also most of bmp18 in the double mutant 12, without incorporating drug resistance markers. When strains M1luc and 12 were evaluated in bovines, protection against abortion was equal for Sl9 and M1luc but considerably reduced for I2. These results indicate that lack of BP26 has no effect in Sl9 protection capacity either in mice or the natural host. However, lack of BMP18 in Sl9 generates less protection capacity in bovines. In the conditions of experimental challenge of this assay, the humoral response against BP26 recombinant protein measured by iELISA after challenge presented high heterogeneity and poor sensitivity respect to LPS response, considering parameters of optimal specificity. The strategy for generation of mutant isogenic strains in more than one gene without the incorporation of antibiotic resistance markers opens the possibility of achieving strains with multiple defined mutations. This will most certainly lead to effective and safer vaccine strains against brucelosis.

Carbajo, Aníbal E.. "Distribución espacio-temporal de Aedes aegypti (Diptera :Culicidae) : su relación con el ambiente urbano y el riesgo de transmisión del virus dengue en la Ciudad de Buenos Aires" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Logarzo, Guillermo A.. "Estudio del barrenador de tallos Apagomerella versicolor (Boh.) (Coleoptera: Cerambycidae) como candidato para el control biológico del abrojo grande, Xanthium strumarium L. en los EE.UU." (2007) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Con el objetivo de evaluar las potencialidades de Apagomerella versicolor (Boheman) (Coleoptera: Cerambicidae) como agente de control biológico de Xanthium strumarium L. (Asteraceae) en los Estados Unidos, se realizaron estudios de laboratorio y de campo sobre el ciclo de vida, la fenología, las plantas hospedadoras, la especificidad, y el daño producido a Xanthium cavanillesii. Además, se realizaron estudios de laboratorio sobre preferencia de oviposición, ADN mitocondrial y pruebas de éxito reproductivo para estudiar las variabilidad intraespecífica en la utilización de las plantas hospedadoras. El ataque de A. versicolor redujo la producción de frutos en X. cavanillesii, el componente sudamericano del complejo Xanthium, en un 66%, y mató a las plantas jóvenes. En Buenos Aires A. versicolor es univoltino y los adultos aparecen en el campo a principios de la primavera. En el laboratorio los adultos vivieron en promedio 18.5 días. Cada hembra puso un promedio de 38 huevos, un huevo en cada oviposición; la larva se alimentó barrenando el tallo en dirección a la raíz. A principios del otoño, la larva realizó un corte circular interno en el tallo a la altura de la corona cuando las plantas ya estaban maduras causando la caída de su parte aérea. El último estadio larval entra en una diapausa obligada y empupa en la raíz de las plantas muertas y ya secas en la primavera. En el laboratorio, las larvas invernantes sobrevivieron a exposiciones continuas de temperaturas de -8oC por 3 días y a la inmersión en agua por un período de 20 días. El cerambícido uso en el campo siete plantas hospedadoras pertenecientes a tres géneros de la familia Asteraceae: Xanthium, Ambrosia, y Pluchea. La variación geográfica en el uso de las plantas hospedadoras estuvo determinada genéticamente y estuvo asociada a por lo menos tres razas geográficas, indicando que A. versicolor puede estar en un proceso de expansión de plantas hospedadoras. El cerambícido evolucionó de ser bivoltino y monófago sobre Pluchea sagittalis en el norte, a ser oligófago y univoltino en poblaciones derivadas en el centro y sur de Argentina. Los cambios parecen haber sido desencadenados por presión selectiva de ciertos rasgos de las plantas hospedadoras como la fenología. Por último, a partir de características de A. versicolor, como los parámetros del ciclo de vida, la amplia distribución y tolerancia ecológica y de hábitat, sumado al daño que provoca a la planta objeto de control biológico, se estima que A. versicolor podría controlar a Xanthium strumarium. Sin embargo, dado que A. versicolor no es específico sobre el género Xanthium ni sobre la subtribu Ambrosinae, que lo contiene, y además es posible que esté en un proceso de formación de razas por plantas hospedadoras su uso como agente de control biológico es riesgoso ya que no están garantizados los requisitos mínimos de especificidad. Por lo tanto, no se recomienda su utilización como agente de control. Sin embargo, A. versicolor y su variación intraespecífica en la utilización de plantas hospedadoras constituye un interesante modelo de estudio de procesos evolutivos recientes.

Abstract:
Laboratory and field studies on Apagomerella versicolor (Boheman), life cycle, phenology, host use, host specificity and amount of damage on Xanthium spp. were carried out in Argentina to evaluate its potential as a biocontrol agent of Xanthium strumarium L. in the United States. Also, laboratory studies on oviposition preference, mDNA and mating choice were performed to study intraspecific variation in host use. Attack by A.versicolor reduced fruit production in X. cavanillesii, the South American component of Xanthium complex, by 66%, and killed young plants. In Buenos Aires, A. versicolor is univoltine and adults appear in the field in early spring. In the laboratory, the adults lived an average of 18.5 days. Each female laid an average of 38 eggs, one egg per oviposition; larvae fed boring their way toward the root. At the beginning of the fall, larvae girdled the stem of the mature plant near the crown, causing the dry aerial part of the plant to fall over. The last instar entered diapause and pupated within the roots in dead and dry plants until spring. All overwintering larvae survived continuous exposure to -8oC for 3 days, and immersion of larvae in tap water for 20 days did not affect their survival. The insect used in the field seven hosts in three genera, Xanthium, Ambrosia, and Pluchea belonging to the Asteraceae family. Host use had geneticallydetermined geographical variation resulting in at least three geographic races indicating that the insect may be in the process of host expansion. Apagomerella versicolor has evolved from being bivoltine and monophagous on Pluchea saggitalis in the north to being oligophagous and univoltine in derived populations in central and southern Argentina; and changes seem to have been triggered by selective pressure of host plants traits, i.e. phenology. Finally, characteristics of A. versicolor, like the life cycle parameters, the broad ecological tolerance and habitat distribution, and the damage provoked to attacked plants may result in an effective control of the target plant Xanthium strumarium in the field. However, the fact that A. versicolor is not specific on Xanthium spp. or the subtribe Ambrosinae and that may be in the process of host race formation indicates its use as a biocontrol agent may not be safe since host specificity is not guaranteed. Therefore its utilization in alien areas for biocontrol purposes is not recommended. Nevertheless, A. versicolor and its pattern of host utilization constitute an interesting case-study of a recent or on-going evolution process.

Bonomi, Hernán Ruy. "Rol del metabolismo de flavinas en la virulencia de Brucella abortus" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Brucella spp. son las bacterias causantes de la brucelosis, la enfermedad zoonótica con más incidencia en el mundo. Brucella es un patógeno exitoso que probablemente infecta animales desde hace millones de años, y se encuentra extremadamente adaptado al estilo de vida intracelular. La virulencia de este patógeno reside en su capacidad de invadir al hospedador, resistir los mecanismos de defensa y, establecerse y replicar en el inhóspito nicho replicativo. El nicho replicativo se caracteriza por ser escaso en nutrientes, tener baja tensión de O2 y someter a Brucella al daño oxidativo. A pesar de que Brucella no posee factores de virulencia “clásicos” posee una batería de mecanismos fisiológicos y adaptaciones metabólicas que en definitiva son los que le permiten sortear las defensas de los hospedadores y adaptarse a la vida intracelular. En este trabajo de tesis, se ha caracterizado y estudiado una parte de la fisiología básica de Brucella, como lo es el metabolismo de las flavinas. Se ha hecho foco en los genes rib, en particular en ribH2 que codifica una enzima lumazina sintasa (LS) que cataliza el penúltimo paso la ruta biosintética de la riboflavina. Se describió la regulación de la expresión de ribH2 por el elemento regulatorio riboswitch FMN, y se identificaron posibles proteínas que interactúan con RibH2 en Brucella. También, se estableció una relación directa entre virulencia y el metabolismo de flavinas en Brucella, resaltando la importancia de RibH2 para la supervivencia, tráfico y persistencia de las bacterias durante la infección en los modelos in vitro e in vivo. El rol de las flavinas en la simbiosis de Rhizobium leguminosarum con plantas, también fue estudiado. Los resultados muestran que el papel que juegan las proteínas RibH2 en el establecimiento bacteriano con el hospedador eucariota no está restricto sólo a Brucella, sino que parece ser compartido por otros Rhizobiales. Los hallazgos de este trabajo de tesis pueden dar lugar a nuevos estudios que lleven al desarrollo de vacunas y drogas contra la brucelosis y mejoras en las cepas bacterianas de inoculantes para uso agronómico.

Abstract:
Brucella spp. are the bacteria responsible for brucellosis, the most widespread zoonotic disease in the world. Brucella is a successful pathogen that has been infecting animals probably for millions of years and it is extremely adapted to the intracellular lifestyle. Its virulence lays in its ability to invade the host, resist defense mechanisms, establish and replicate in the inhospitable replicative niche. The replicative niche exhibits limited nutrients availability, low O2 tension and exposes Brucella to oxidative damage. In spite of the fact that Brucella does not possess “classic” virulence factors, it displays a variety of physiological mechanisms and metabolic adaptations that let these bacteria cope with the host’s defenses and adapt to live inside the cell. During this Thesis, part of the basic physiology of Brucella, the flavin metabolism, has been studied and characterized. The focus was laid on the rib genes, in particular on ribH2 which codes for a lumazine synthase (LS), the enzyme that catalyses the penultimate step in the riboflavin biosynthetic pathway. The regulation of the ribH2 gene expression by the FMN riboswitch was described, and some proteins that may interact with RibH2 were identified in Brucella. The direct relation between flavin metabolism and virulence was also established, highlighting the importance of RibH2 for survival, trafficking and persistence during infection in both in vitro and in vivo models. The role of flavins in the Rhizobium leguminosarum-plant symbiosis was also addressed. The results show that the part that RibH2 plays in the bacterial establishment in the eukaryotic host is not restricted only to Brucella, but it is shared with other Rhizobiales. The findings of this PhD Thesis, can lead to deeper and more specific studies culminating in the development of vaccines and drugs against brucellosis as well as improvements in the bacterial inoculants of agronomic use.

Cardo, María Victoria. "Estructura de las comunidades de mosquitos de cuerpos de agua en el suelo en el Bajo Delta del Río Paraná: un enfoque multiescalar considerando la heterogeneidad ambiental y las estrategias de oviposición" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los humedales son ecosistemas muy favorables para los insectos con estadios acuáticos, y dada su compleja dinámica del agua, son escenarios ideales para evaluar la influencia de las características ecofisiológicas de las especies en la estructuración de las comunidades en función del ambiente. En esta tesis, se investigó cómo se estructuran las comunidades de mosquitos (Diptera: Culicidae) que habitan en cuerpos de agua en el suelo (CAS) en función de la heterogeneidad ambiental a tres escalas espaciales de un humedal considerando sus efectos sobre distintas estrategias de oviposición. Entre los 1.689 CAS inspeccionados durante 2008- 2012 en el Bajo Delta del Río Paraná, se colectaron en total 10.626 inmaduros de mosquitos pertenecientes a 32 especies de siete géneros. Mediante el uso de modelos lineales generalizados y análisis de nicho se identificaron variaciones en la estructura de distintas comunidades en respuesta a la estacionalidad, a las características propias de los CAS, al uso de la tierra y al paisaje. Dichas respuestas dependieron de la estrategia de oviposición, siendo distintas las asociaciones entre la dinámica del agua (lluvia y mareas) y el uso de la tierra para mosquitos de inundación y de balsa. La composición del ensamble en CAS temporarios varió en función del paisaje, no así los otros atributos comunitarios; los patrones de recambio de especies estuvieron dominados por mosquitos de inundación. El conjunto de resultados sugiere que la heterogeneidad ambiental a distintas escalas espaciales afecta distintos atributos de las comunidades de mosquitos, y que las estrategias de oviposición tienen un rol central en dicha relación.

Abstract:
Wetlands are highly favorable ecosystems for insects with aquatic stages and, given their complex water dynamics, they are the ideal setting to assess the influence of ecophysiological characteristics of the species in the structuring of the communities as a function of the environment. In this thesis, the structuring of mosquito (Diptera: Culicidae) communities breeding in ground-water habitats (GWH) as a function of environmental heterogeneity in a wetland was evaluated, considering its effects at three spatial scales on different oviposition strategies. A total of 10,626 mosquito immatures of 32 species from seven genera were collected among 1,689 GWH inspected during 2008-2012 in the Paraná Lower Delta. Using generalized linear models and outlying mean index analysis, variations in the structure of different communities were identified in response to seasonality, the characteristics intrinsic to each GWH type, the landuse and the landscape. Such variations depended on the oviposition strategy, with floodwater and raft-laying mosquitoes showing distinct associations between water dynamics (precipitation and tidal regime) and landuse. In contrast to all other community attributes evaluated, the composition of the assemblage of temporary GWH varied as a function of the landscape, with floodwater mosquitoes dominating species replacement patterns. These results suggest that the environmental heterogeneity at different spatial scales affect different attributes of mosquito communities, and that oviposition strategies play a central role in this relation.

Balboa, Luciana. "Alteraciones de las células presentadoras de antígenos en pacientes con tuberculosis pulmonar" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La tuberculosis (TB) es considerada la segunda causa de muerte por infección, causando 1.7 millones de muertes al año. Se estima que un tercio de la población mundial está actualmente infectada con Mycobacterium tuberculosis (Mtb) y que sólo entre el 5‐10% de aquellos infectados desarrollarán la enfermedad, siendo desconocidos los mecanismos que conducen al establecimiento de la enfermedad tuberculosa latente o activa. El éxito de la infección depende principalmente de las estrategias de evasión de la respuesta inmune y de la capacidad de las células presentadoras de antígeno (CPA) de iniciar una eficiente respuesta. En este sentido, las células dendríticas (CD) son críticas para el desarrollo de la respuesta inmune antibacteriana y, por lo tanto, constituyen un blanco fundamental en la inmuno‐evasión inducida por Mtb. Nuestra hipótesis de trabajo es que durante la infección con Mtb se inducirían alteraciones en las CPA determinando la eficiencia de la respuesta inmune así como el curso de la infección; teniendo en cuenta esto, nuestro objetivo fue investigar las alteraciones en la generación de las CPA y su impacto en el desarrollo de la respuesta inmune en pacientes con TB. Para ello, caracterizamos el efecto de la bacteria sobre la diferenciación de monocitos (Mo) en controles sanos, observando que Mtb altera la diferenciación hacia CD a través de la secreción de IL‐10 y la activación de TLR‐2. Las células obtenidas presentaron baja expresión de receptores de entraba para la bacteria, baja capacidad de presentación de antígenos micobacterianos en el contexto de moléculas CD1 y mayor proliferación de clones T específicos de perfil TH2. Por otro lado, caracterizamos el fenotipo y la función de las CD obtenidas a partir de los Mo de pacientes con TB, las cuales presentaron alteraciones en la expresión de los marcadores típicos de CD así como una baja capacidad de presentación de antígenos micobacterianos. Finalmente, los Mo de los pacientes con TB mostraron un alto grado de activación y un enriquecimiento en la población de Mo CD16+, la cual fue previamente descripta como proinflamatoria. Esta población resultó ser menos eficiente para diferenciarse hacia CD y ha sido asociada a la severidad radiológica de la TB y a los niveles plasmáticos de TNF‐α, poniendo de manifiesto la relevancia clínica del hallazgo. En conclusión, en este trabajo de Tesis describimos un nuevo paso en la regulación de la respuesta inmune contra Mtb a través de la modulación de la capacidad de diferenciación de los Mo. Nuestros resultados amplian el conocimiento de los mecanismos involucrados en la evasión de la respuesta inmune ejercida por Mtb y, de ese modo, podrían contribuir al desarrollo de nuevos tratamientos y vacunas en esta enfermedad re‐emergente tanto a nivel local como mundial.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is the second most common cause of death from infectious diseases in the world and it causes an estimated 1.7 million deaths worldwide. Overall, one‐third of the world's population is currently infected with the TB bacillus (Mycobacterium tuberculosis) and 5‐10% of those infected individuals may develop TB disease. The exact mechanism leading to latent or acute TB disease is unknown, but it mainly depends on immune evasion strategies displayed by M. tuberculosis and the efficiency of the immune response initiated by antigen presenting cells (APC). As dendritic cells (DC) are critical for initiating a M. tuberculosis‐specific T‐cell response, they may represent a crucial target of M. tuberculosis immune evasion. Our hypothesis is that M. tuberculosis infection could induce alterations in APC, determining the outcome of the infection. Therefore, our aim was to evaluate the impact of M. tuberculosis infection on the generation of APC and on the host immune response. Thus, we characterized the effect of M. tuberculosis in the differentiation of monocytes (Mo) from healthy donors into DC. We determined that M. tuberculosis alters Mo differentiation through IL‐10 release and TLR‐2 activation, promoting the generation of cells with a low expression of M. tuberculosis pattern recognition receptors, a reduced specific CD1‐restricted lymphocytes proliferation, and a preferential polarization towards a TH2 pattern. In this line, the phenotype and function of DC from Mo in TB patients also showed alterations in DC loyal markers and a reduced antigenpresenting capacity. Finally, we found that circulating Mo from TB patients presented an activated phenotype with an enrichment of the proimmflamatory CD16+ subset, being this subset less prone to differentiate into DC. Moreover, the percentages of CD16+ Mo correlated with disease severity and with TNF‐α plasma levels, highlighting the clinical relevance of this finding. In conclusion, we have described a new step in the regulation of the immune response to M. tuberculosis through modulation of Mo differentiation. Our results may contribute to a better understanding of the immune evasion strategies of M. tuberculosis, therefore facilitating the development of effective therapeutic and prophylactic approaches for controlling M. tuberculosis infection.

González, Laura Elisabeth. "Interacción de la inmunoglobulinas G de pacientes con Esclerosis Lateral Amiotrófica con la placa neuromuscular y su relación con los canales de calcio de tipo P/Q" (2012-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa de motoneuronas. Se encuentra mayormente asociada a una forma esporádica de etiología desconocida. Numerosas evidencias favorecen a la auto-inmunidad como uno de los potenciales contribuyentes a esta patología. Para estudiar los posibles antígenos que interactúan con las IgGs de pacientes con ELA esporádica (IgGs-ELA), evaluamos su inmuno-reactividad hacia la placa neuromuscular (PNM), comparando animales normales con aquellos carentes de la subunidad formadora del poro del canal de calcio (Ca2+) de tipo P/Q (CaV2.1). Las IgGs-ELA mostraron una importante reactividad hacia la PNM de ratones CaV2.1+/+ e incrementaron la frecuencia de potenciales de placa miniatura (MEPPs). Ambos parámetros disminuyeron significativamente al evaluar tejido de animales CaV2.1-/-. Ensayos de inmuno-precipitación y western blot indican que el blanco de los anticuerpos no sería el canal mismo sino una proteína asociada. Estudios de proteómica sugieren a la proteína BASP-1 (proteína ácida soluble de cerebro-1) como un candidato a evaluar en forma más detallada en fututos ensayos. Nuestros resultados adicionan evidencias a favor de la auto-inmunidad como uno de los posibles mecanismos contribuyentes a la patología de ELA. También sugieren que los auto-anticuerpos en el suero de una serie de pacientes interactúan con proteínas cuya presencia en la PNM disminuye cuando los canales de Ca2+ de tipo P/Q se encuentran ausentes.

Abstract:
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a motoneuron neurodegenerative disease. It is primarily associated with a sporadic form of unknown etiology. Several pieces of evidence favor auto-immunity as a potential contributor to this pathology. To gain understanding concerning possible antigens interacting with IgGs from sporadic ALS patients (ALS-IgGs), we studied immuno-reactivity against the neuromuscular junction (NMJ) of mice with and without the pore-forming subunit of the P/Q-type calcium (Ca2+) channel (CaV2.1). ALS-IgGs showed a strong reactivity against NMJs of WT diaphragms and increased the miniature end-plate potential (MEPP) frequency. Both parameters were significantly diminished when evaluating tissue from CaV2.1-/- animals. Immuno-precipitation and western blot assays indicate that antibody target would not be the channel itself but an associated protein. Proteomic studies suggest BASP-1 (brain acid soluble protein-1) as a candidate to evaluate in more detail in future assays. Our findings add further evidence supporting auto-immunity as one of the possible mechanisms contributing to ALS pathology. They also suggest that serum auto-antibodies in a subset of ALS patients would interact with NMJ proteins downregulated when P/Q-type Ca2+ channels are absent.

Furman, Nicolás. "Desarrollo de alternativas biotecnológicas para la obtención de plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck resistentes a la enfermedad de la Cancrosis de los cítricos" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Entre las enfermedades bacterianas más relevantes para la citricultura argentina se encuentra la Cancrosis de los cítricos, presente en la mayoría de las zonas productoras de todo el mundo, a excepción de Europa. Las pérdidas económicas más importantes son ocasionadas por las restricciones cuarentenarias a los frutos, impuestas por países libres de estas enfermedades, que limitan las exportaciones a tales destinos. Dado que no se ha encontrado resistencia natural a la enfermedad, ni en el germoplasma disponible para el mejoramiento, ni en las especies utilizadas como pie para propagar las variedades comerciales de citrus, actualmente se intenta controlar al patógeno causante de la Cancrosis (Xanthomonas axonopodis pv. citri) mediante la aplicación de bactericidas de contacto a base de cobre. Si bien éstos permiten controlar parcialmente el desarrollo de la enfermedad, no sólo son eliminados por las lluvias y el viento, sino que también resultan contaminantes para el ambiente y para el hombre. Por estas razones el desarrollo de estrategias biotecnológicas representa una alternativa atractiva para la búsqueda de la resistencia a la Cancrosis. En tal sentido, el objetivo principal de esta Tesis fue desarrollar plantas transgénicas de Citrus sinensis (naranjo dulce) resistentes a la enfermedad, a partir de la expresión del péptido antimicrobiano dermaseptina. En primer lugar, se demostró el efecto bactericida del péptido frente a Xanthomonas spp. en ensayos in vitro. Siguiendo estos resultados, se realizó una construcción que permite la expresión constitutiva de dermaseptina y su exportación a apoplasto, región donde se multiplica la bacteria durante la infección. Luego, se transformaron plantas de C. sinensis y se obtuvieron 7 positivas para los genes marcadores de selección utilizados (resistencia kanamicina y GFP), cuya posterior caracterización molecular confirmó la presencia de la secuencia de dermaseptina en el genoma de las plantas. Finalmente, mediante ensayos de infección en cámaras de crecimiento, se estableció que la expresión del péptido antimicrobiano en las plantas transgénicas de naranjo indujo resistencia parcial frente a la infección con X. axonopodis. Si bien aún resta desarrollar ensayos de infección en invernadero, estos resultados permitieron convalidar la estrategia biotecnológica escogida para conferir resistencia a la Cancrosis.

Abstract:
Canker disease is one of the most important bacterial diseases affecting citric production in Argentina, and it is also present in most producing areas around the world, except in Europe. Since that a substantial percentage of lemon, grapefruit and orange is intended for export, outbreaks of this disease provoke an immediate quarantine for the fruits harvested in the affected areas, with the subsequent losses of economic income. As no natural resistance has been found, neither in commercial orange varieties nor in any of the common graft stock varieties, current attempts to control the Canker causative pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri consists of preventive sprayings with copper-based bactericides. Despite this approach confers partial disease control, copper-based bactericides are not only be eliminated by rain and wind, but they also result harmful to the environment and to human beings. Due to these limitations, biotechnological strategies represent an attractive alternative for the search of Canker resistance. In that way, the main aim of this work was to obtain transgenic Citrus sinensis (sweet orange) plants expressing an antimicrobial peptide (dermaseptin) in order to confer resistance against Xanthomonas axonopodis pv. citri infections. First of all, bactericidal effect of dermaseptin against Xanthomonas spp. was demonstrated by in vitro assays. Following these results, a genetic construct allowing the constitutive expression of dermaseptin and its export to apoplast was generated. That´s where bacteria multiplies during infection. Then, C. sinensis plants where transformed with this construction, obtaining seven positive plants for the GFP and kanamycin marker genes. Later molecular characterization confirmed the presence of dermaseptin sequence in the corresponding genomes. Finally, controlled X. axonopodis infection assays showed significant reduction of disease symptoms in transgenic plants. Even though the results obtained in this work should be confirmed at the level of greenhouse and field trial assays (since controlled infection assays cannot be directly extrapolated to real agricultural conditions), they indicate that the strategy used in this work could be effective in achieving Canker resistance.

Monteverde, Martín Julio. "Selección de hábitat denso-dependiente y riesgo de exposición al Hantavirus Andes: un estudio experimental con un ensamble de roedores en Patagonia norte, Argentina" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La selección de hábitat denso-dependiente, los efectos competitivos intra e interespecíficos y algunos aspectos de la ecología espacial de tres especies de un ensamble de roedores sigmodontinos (Oligoryzomys longicaudatus, Abrothrix olivaceus y Abrothrix longipilis) fueron estudiados en el Paraje El Contra del Parque Nacional Lanín (Pcia. del Neuquén, Argentina) y los resultados fueron luego analizados en el marco del riesgo de exposición humana al Hantavirus “Andes”, agente causal del Síndrome Pulmonar por Hantavirus, una grave enfermedad endémica en esta región. El trabajo estuvo centrado en dos tipos de hábitats (silvestre y peridoméstico) en donde los individuos de las especies mencionadas fueron mensualmente capturados utilizando la metodología de captura-marcado-recaptura. Los patrones de uso y selección de hábitat, interacciones competitivas y efectos denso-dependientes fueron analizados empleando los modelos de isolegs e isodaras, junto con la estimación de algunos parámetros de la ecología espacial (movimientos entre hábitats y áreas de acción) de los individuos de las especies de roedores involucradas. O. longicaudatus, principal reservorio del Hantavirus “Andes” en Patagonia, seleccionó el hábitat silvestre solo durante el verano y el otoño, mientras que durante los meses primavero-invernales usó indistintamente el hábitat silvestre y peridoméstico. Este comportamiento selectivo estuvo influenciado por A. olivaceus durante todo el año. Además, O. longicaudatus verificó el mayor número absoluto de capturas en hábitats peridomésticos y la mayor cantidad de movimientos inter-hábitat. Este uso alternativo de ambos hábitats, respondió (probablemente) a su subordinación dentro del ensamble. Como resultado de esto, los mayores efectos competitivos los tuvo con individuos de A. olivaceus (especie competitivamente intermedia). De esta manera, la especie menos perjudicada debido a interacciones interespecíficas fue A. longipilis, ya que es la especie competitivamente superior y claramente dominante en el hábitat silvestre. El modelo de organización de la comunidad de roedores varió estacionalmente, alternando entre un modelo de preferencias compartidas de hábitat (verano y el otoño) y uno de preferencias de hábitat diferenciales (invierno y la primavera). O. longicaudatus podría categorizarse como un “utilizador estratégico de hábitats peridomésticos” (probablemente para minimizar efectos competitivos en los hábitats silvestres), mientras que A. olivaceus y A. longipilis podrían considerarse como “intolerantes de hábitat” con preferencia por el hábitat silvestre. Los aportes o contribuciones de esta tesis a la salud humana son discutidos en términos del riesgo de exposición y transmisión de Hantavirus a humanos como resultado de la influencia de factores denso-dependientes en el comportamiento selectivo de O. longicaudatus por el hábitat.

Abstract:
Density-dependent habitat selection, intra and interspecific competitive effects, and some aspects of the spatial ecology of three species (O. longicaudatus, Abrothrix olivaceus and Abrothrix longipilis) of an assemblage of sigmodontine rodents were studied in Paraje El Contra within Lanín National Park (Neuquén Province, Argentina), assessing their implications on the risk of human exposure to Hantavirus “Andes”, the causative agent of Hantavirus Pulmonary Syndrome, an endemic and severe illness in this region. Rodents were trapped monthly following capturemark- recapture method in two types of habitats (sylvan and peridomestic). Patterns of habitat use and selection, competitive interactions and density-dependent effects among the species involved were analyzed with isolegs and isodars, and some parameters of their spatial ecology (home ranges and movements between habitats) were estimated. O. longicaudatus, the main reservoir of Hantavirus "Andes" in Patagonia, positively selected the sylvan habitat in summer and autumn and used both habitat types throughout the spring and winter months. This selective behavior was influenced by A. olivaceus throughout the year. Moreover, O. longicaudatus achieved the highest absolute number of captures in peridomestic habitats and showed the highest number of interhabitat movements. This alternative use of both habitats (probably) responded to its subordination within the assemblage. As a result, the competitive effects between O. longicaudatus and A. olivaceus (the intermediate competitively species) were the greatest in this assemblage. Abrothrix longipilis is the superior competitor of this assemblage and clearly the dominant species in the sylvan habitat, and consequently less affected by interspecific interactions. The model of rodent community organization varied seasonally, alternating among models of shared habitat preferences (summer and fall) and differential habitat preferences (winter and spring). O. longicaudatus may be labeled as a strategic user of peridomestic habitats (probably to minimize competitive effects) while A. olivaceus and A. longipilis as "habitat intolerants" after their marked preference for the sylvan habitat. The contributions of this thesis to human health are discussed in terms of risk of exposure and transmission of Hantavirus to humans as a result of densitydependent factors influencing habitat selective behavior of O. longicaudatus.

Carlini, María José. "Rol del factor de crecimiento transformante beta en la progresión del cáncer de pulmón" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de pulmón es la causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo y se clasifica en dos tipos principales: de células pequeñas y de células no pequeñas (NSCLC). El factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) regula un amplio espectro de funciones celulares y juega un rol importante en las enfermedades del pulmón, incluyendo el NSCLC. El objetivo de este trabajo de tesis fue estudiar el papel del TGFβ en la progresión tumoral de la línea de adenocarcinoma de pulmón murino LP07. Más aún, se realizó un estudio retrospectivo con muestras de tumores de pacientes con NSCLC estadios I-III para evaluar el rol clínico-patológico y la significancia pronóstico de moléculas moduladas por TGFβ; incluyendo la galectina-1 (gal-1), el receptor de TGFβ tipo I (TβRI) y los factores de transcripción FoxM1 y DEC2. En el modelo experimental LP07, el TGFβ moduló múltiples aspectos vinculados con la progresión tumoral, incluyendo la proliferación, la apoptosis, la migración, la actividad de enzimas proteolíticas, la secreción de citoquinas, la angiogénesis, el acondicionamiento del órgano blanco de la metástasis y la retención de las células tumorales en el pulmón. Se demostró que si bien el tratamiento con TGFβ retrasó el crecimiento en el sitio primario, no indujo un programa de quiescencia sostenido, y se observó un cambio hacia la progresión maligna en el sitio metastásico. En los pacientes con NSCLC, se definió el valor como biomarcadores de pronóstico de la expresión alta de gal-1 conjuntamente en las células tumorales y el estroma, así como la expresión alta de TβRI en la membrana de las células tumorales, que se asociaron con menor supervivencia global y mayor riesgo de caída, respectivamente, luego del ajuste por otros pronosticadores. Por otro lado, la expresión del supresor tumoral candidato DEC2 en las células tumorales se asoció con una mejor supervivencia global, en particular para los pacientes con tamaño tumoral T2. La evaluación de la expresión del marcador de proliferación FoxM1 en las células tumorales o el infiltrado no arrojó datos de importancia clínica, aunque el análisis conjunto de la expresión contrapuesta de FoxM1 y DEC2 en los tumores podría aportar información de pronóstico en una cohorte de pacientes mayor. En conjunto, este trabajo demuestra la modulación por TGFβ del comportamiento de los tumores de pulmón y proporciona potenciales herramientas de pronóstico y posibles blancos moleculares para el tratamiento.

Abstract:
Lung cancer is the most frequent and one of the most deadly cancer types and is classified into small cell lung carcinoma and non–small cell lung carcinoma (NSCLC). Transforming growth factor beta (TGFβ) regulates a wide array of cell functions and plays a major role in lung diseases, including NSCLC. We analyzed the role of TGFβ1 on the progression of the murine lung adenocarcinoma cell line LP07. Furthermore, we undertook a retrospective study with tissue samples from stage I-III NSCLC patients to assess the clinical pathologic role and prognostic significance of several targets of the TGFβ pathway; including galectin-1 (gal-1), type I TGFβ receptor (TβRI), and the transcription factors FoxM1 and DEC2. In our model, TGFβ1 affected various aspects of tumor progression, including proliferation, apoptosis, migration, proteolytic enzyme activity, cytokine secretion, angiogenesis, conditioning of the metastatic target organ and tumor cell retention in the lungs. We demonstrated that although TGFβ delayed tumor growth at primary site, a sustained dormancy program was not induced, and a switch towards malignant progression upon TGFβ treatment was observed at the metastatic site. In NSCLC patients, we defined the prognostic value of gal-1 expression at both tumor cells and stroma, and TβRI membrane expression in tumor cells. Respectively, high expression of these biomarkers was associated with decreased overall survival and greater risk of relapse, after adjustment for other predictors of outcome. On the other hand, the expression of the candidate tumor suppressor DEC2 was associated with better overall survival, especially for patients with T2 size tumors. Assessment of the expression of the proliferation marker FoxM1 did not reveal significant outcomes. However, the combined evaluation of opposite expression of FoxM1 and DEC2 in a larger cohort of patients may reveal prognostic information. Altogether, these studies suggest the involvement of TGFβ in the behavior of lung tumors and provide potential prognostic tools and may help identify novel molecular targets for lung cancer treatment.

Otero, Constanza. "Respuesta inmune al Streptococcus pneumoniae en pacientes con Asma y pacientes con deficiencia específica de respuesta a antígenos polisacáridos" (2013-04-08) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Durante años se ha considerado que la defensa inmune frente al Streptococcus (S.) pneumoniae (Spn) depende de anticuerpos anticapsulares, que protegen frente a la infección invasiva y a la colonización por este microorganismo. Sin embargo, la inmunidad adaptativa puede ser importante para generar memoria celular frente a la bacteria. Algunas patologías de la infancia como el asma atópico y la deficiencia específica de anticuerpos frente a antígenos polisacáridos (SPAD), parecen predisponer a un riesgo mayor de infección por Spn. Estudiamos la respuesta inmune al Spn en estos pacientes y en individuos sanos (S) en edades pediátricas. En los pacientes asmáticos (A) se observó una tendencia a una menor expresión de CD69 en linfocitos T (LT) convencionales y LTγδ frente al estímulo con Spn. Los LT CD8+ mostraron un aumento en la expresión de CD25 solo frente al estímulo con Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en las células de los A y no en los S. Para evaluar la respuesta Th1 se midieron los niveles de IFN‐γ frente a Spn y a Mtb, encontrándose muy elevados en los A. Al estudiar los pacientes SPAD (P), encontramos varias diferencias en las subpoblaciones de monocitos (Mo) y LT con respecto a los S. Observamos que los Mo CD14++CD16+, se encuentran en proporciones alteradas con respecto a los S a distintas edades, lo que podría relacionarse con una menor capacidad de respuesta T, dado que frente al neumococo los Mo modulan la diferenciación de LT hacia los perfiles Th1 y Th17. La expresión temprana de CD69 en los LT previene la diferenciación hacia el perfil Th17. En los P, los LT CD69+ y LTCD8+CD25+ se vieron disminuidos con respecto a los S, aún con Mtb, evidenciando alteraciones en su capacidad de respuesta celular. Creemos que nuestro reporte de alteraciones en los P puede ser útil en la búsqueda de otros métodos diagnósticos. Consideramos que deben evaluarse en los Mo las vías de señalización necesarias para activar a las células presentadoras de antígeno frente al neumococo, encargadas de modular la respuesta T en condiciones normales. Esto podría contribuir a identificar la base molecular de la inmunodeficiencia SPAD, aún desconocida.

Abstract:
The immune defense against Streptococcus (S.) pneumoniae (Spn) was considered dependent on capsular antibodies that provide protection against invasive infection and colonization by this microorganism. However, adaptive immunity may be important in the generation of cellular memory against this pathogen. Some childhood diseases like atopic asthma and specific polysaccharide antibody deficiency (SPAD) seem to be associated to a higher risk of infection with Spn. We studied the immune response to Spn in these patients and in healthy children (H). In asthmatic patients (A) we observed a reduced expression of CD69 in conventional T lymphocytes (T cells) and γδ T cells with Spn. The CD8 + T cells from A showed an increased expression of CD25 only with Mycobacterium tuberculosis (Mtb), when compared to healthy individuals. As a measure of Th1 response, we evaluated the IFN‐γ production after stimulating cells from A and H with the bacterial antigens. We found high levels of this cytokine in both groups. When we studied SPAD patients (S), we found several differences in monocyte (Mo) subpopulations and in T cells, which had never before been described. We observed that in S the proportion of CD16+CD14++ Mo at different ages was altered when compared to healthy individuals. This could be correlated to a decreased T cell responsiveness, since it was described that Mo modulate T cell response towards a Th1 or a Th17 profile, in the defense against Spn. Early up regulation of CD69 in T cells prevents them from generating a Th17 response. In S we observed that the expression of both CD69 and CD25 was reduced when compared to H. We also found lower percentages of CD8+ activated T cells, even with Mtb, suggesting alterations in the T cell response capacity of S. We believe that the alterations in leukocyte populations we report here can be useful to find new diagnostic methods for S. The necessary signaling pathways activate after Spn recognition in Mo ‐ that will result in a correct antigen presentation to T cells ‐ must be studied in normal conditions. This could also contribute to identify the molecular basis of the SPAD immunodeficiency, still unknown.

Murta, Veronica. "Estudio de estímulos pro-inflamatorios secundarios sobre una lesión desmielinizante en un modelo de inflamación crónica asociado a esclerosis múltiple" (2013-08-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La esclerosis múltiple (EM) es un desorden inflamatorio autoinmune del sistema nervioso central, caracterizado por desmielinización, inflamación y pérdida axonal. La etiología de la enfermedad es aún desconocida, pero muchos trabajos en modelos animales han puesto en evidencia un rol importante de la neuroinflamación en su patogénesis y progresión. La mayoría de los pacientes presentan episodios de recaídas y remisiones. A medida que la enfermedad evoluciona el proceso de remielinización comienza a fallar, lo cual resulta en la eventual pérdida de funciones en los pacientes. El rol de la inflamación en la regeneración de la mielina es aún incierto. Considerando la heterogeneidad y complejidad que presenta la EM es importante generar modelos apropiados que recapitulen la enfermedad, pero también otros modelos de estudios más sencillos que faciliten la comprensión de los mecanismos involucrados. En la presente tesis nos propusimos estudiar el efecto de estímulos inflamatorios repetidos mediante la reinyección de un estímulo pro-inflamatorio crónico, en eventos similares a episodios de recaída. También nos propusimos estudiar la influencia de inflamaciones periféricas sobre las lesiones desmielinizantes en el SNC. Para ello utilizamos un adenovector que expresa interleuquina 1β en forma crónica. Hemos demostrado que la respuesta a un estímulo central secundario varia dependiendo de si la lesión primaria está activa o no. Así, la presencia de una lesión inflamatoria central aún activa disminuye la respuesta a un estímulo pro-inflamatorio secundario dentro del SNC. Sin embargo, esta repuesta secundaria disminuida no se observa cuando el segundo estímulo se aplica con la lesión primaria completamente recuperada. Por otro lado, un estímulo pro-inflamatorio proveniente de la periferia recrudece la respuesta inflamatoria central previa, incluso cuando la BHE se encuentra intacta. Los estímulos inflamatorios, tanto centrales como periféricos, deberían ser considerados como factores de riesgo al momento de estudiar la etiología y progresión de la EM. Una mejor comprensión de los mecanismos que intervienen en la recaída/remisión, y de la influencia de infecciones periféricas sobre la misma colaboraría con la identificación y el desarrollo de nuevas terapias para un mejor tratamiento de la EM.

Abstract:
Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune inflammatory disorder of the central nervous system characterized by demyelination, inflammation and axonal damage. The etiology of the disease is still unknown, but many studies have shown a role of neuroinflammation in the pathogenesis and progression of MS. Throughout the development of the disease most patients present relapsing and remitting episodes, while others progress to a chronic stage. The role of inflammation in myelin regeneration is still uncertain. As the disease progresses remyelination fails, resulting in the eventual loss of function in patients. It is as important to generate appropriate models that recapitulate the disease, as well as other more simplistic ones that facilitate the understanding of the mechanisms involved. There are few suitable models for the study of demyelination as a result of chronic inflammation. In this thesis we studied the effect or repeated inflammatory demyelinating events by re-injecting a chronic pro-inflammatory stimulus, thus mimicking the relapsing-remitting episodes of MS. We also studied the influence of peripheral inflammation on these phenomena in the CNS. For the generation of the chronic inflammatory event we used an adenovector expressing interleukin-1β. We have shown that the response to a secondary central stimulus varies depending on whether the primary lesion is still active or not: The presence of a previous active injury decreases the response to the second pro-inflammatory stimuli within the CNS. However, this secondary response does not change when the primary lesion is completely recovered. Furthermore, pro-inflammatory stimuli from the periphery exacerbate the central lesion. Inflammatory stimuli, both central and peripheral, should be considered as risk factors when studying the etiology and progression of MS.

Tironi Farinati, Alicia Carla Flavia. "Acción de la toxina Shiga 2 producida por Escherichia coli enterohemorrágica en el Sistema Nervioso" (2013-08-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La toxina Shiga 2 (Stx2) producida por Escherichia coli enterohemorrágica es la principal causa de diarrea asociada a síndrome urémico hemolítico e insuficiencia renal. El 30 % de la población infantil que sufre SUH padece alteraciones en el sistema nervioso central (SNC). Nos propusimos determinar la expresión del receptor Gb3, el cual produce la entrada de la toxina en las células que lo poseen, en condiciones normales y luego de la administración intracerebroventricular de Stx2 en cerebros de roedores. Observamos que el receptor Gb3 se expresa en neuronas y aumenta con la administración local de Stx2. La interacción Gb3-Stx2 en neuronas podría contribuir al daño producido por las encefalopatías derivadas del SUH en niños intoxicados por ingestión de productos contaminados por E. coli enterohemorrágica. También caracterizamos el efecto de dosis subletales de Stx2 (dsStx2) administrada vía intravenosa por ultraestructura que se correlacionó con tests de comportamiento por primera vez. Este modelo translacional nos fue útil para determinar que dosis subletales de la toxina son capaces de generar un daño cronológico significativo de eventos en cerebros de ratones, que podría explicar las lesiones neurológicas que remiten o resultan ser permanentes en pacientes intoxicados. Un significativo edema perivascular se observó luego de 2 días de la administración sistémica de Stx2, daño en astrocitos a los 4 días, y en neuronas y oligodendrocitos luego de 8 días. También fue importante encontrar extravasación de mastocitos y sinapsis interrumpidas. Finalmente el tratamiento de la Dexametasona, un antiinflamatorio, el Lactobacillus Plantarum, y/o anticuerpos anti-Stx2 logran neutralizar la acción de Stx2. Estos estudios servirán como antecedentes para desentrañar a futuro los mecanismos celulares y moleculares involucrados en los procesos neuropatológicos durante la fase aguda de la intoxicación. En base a este conocimiento, agentes terapéuticos pueden ser utilizados para neutralizar la Stx2 a nivel central.

Abstract:
Shiga toxin (Stx2) produced by Escherichia coli enterohemorragic is the main cause of diarrhea associated to the hemolytic uremic syndrome. 30% of the child population that suffers from HUS shows alterations in the central neurosystem (CNS). We observed that Stx2’s receptor Gb3 is expressed in neurons and it’s expression is upregulated after the administration of Stx2. The Gb3-Stx2 interaction in neurons could contribute to the damage produced by HUS derived encephalopaties in children. We also studied the effect of the sub lethal doses of Stx2 administrated endovenously and for first time we found comportamental changes in mice. This translational model was useful to determine that sublethal doses of Stx2 are able to produce a significative chronologic damage in the mice brain, that might explain the neuropatological lesions that occurs in intoxicated patients. Two days after the administration of Stx2 we observed perivascular edema, astrocitary damage at the 4th day and damage in neurons and oligodendrocites at the 8th day. Another important discovery was to found tripartite synapses and mastocyte extravasation. Finally a treatment with Dexamethasone, an antiinflamatory, the Lactobacillus Plantarum, and/or antibodies anti-Stx2 neutralize the action of Stx2. These studies will serve as antecedents to unveil the cell and molecular mechanisms involved in the neuropathologic processes during the acute phase of the intoxication. Based on this knowledge, therapeutic agents can be used to neutralize Stx2 at central level.

Ruiz, Verónica. "Factores involucrados en la interacción inicial de Brucella suis con el hospedador: rol de los autotransportadores triméricos" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El género Brucella comprende patógenos intracelulares facultativos que causan una zoonosis conocida como brucelosis. Esta zoonosis es una de las más dispersas alrededor del mundo y afecta a una amplia variedad de mamíferos, entre ellos muchos de importancia agropecuaria. Un aspecto fundamental en la virulencia de Brucella reside en su capacidad de invadir y replicar dentro de células fagocíticas y no fagocíticas. El objetivo del trabajo de tesis fue identificar y caracterizar moléculas de B. suis asociadas a la adhesión y/o invasión a las células del hospedador. Mediante análisis bioinformáticos del genoma de B. suis 1330 se identificaron posibles proteínas que potencialmente podrían cumplir una función en la adhesión y/o invasión. En esta tesis se estudiaron tres de las proteínas candidatas (BtaE, BtaF y MapA). Diferentes análisis in silico indicaron que BtaE y BtaF pertenecen a la familia de los autotransportadores triméricos, los cuales median su propia translocación a través de la membrana externa. Enfoques mutacionales y heterólogos demostraron que BtaE y BtaF están involucradas en la adhesión a células no fagocíticas del hospedador y a componentes de la matriz extracelular. En particular, BtaE confirió adhesión a ácido hialurónico mientras que BtaF conferiría una adhesión promiscua a una amplia variedad de componentes de la matriz extracelular del hospedador y participaría en la formación de un biofilm in vitro. La adhesina BtaF cumpliriría una función adicional ya que confirió a la bacteria que la porta tolerancia a la actividad bactericida del complemento presente en el suero. Ambos autotransportadores fueron necesarios para que B. suis genere una completa virulencia en ratones inoculados intragástricamente. Por otro lado, por inmunofluorescencia se pudo detectar a BtaE, BtaF y a la adhesina BmaC en un número reducido de células pero en todos los casos las adhesinas se localizaron en el polo nuevo bacteriano generado luego de la división asimétrica de Brucella. Se propuso que en Brucella dicho polo estaría funcionalmente diferenciado para la adhesión. En cuanto a MapA, la cepa mutante defectiva en esta proteína fue menos eficiente en la adhesión a células no fagocíticas. Sin embargo, la mutante también presentó una sensibilidad notable a diversos compuestos, como polimixina B, Triton X-100 y lisozima, sugiriendo que la membrana externa se encuentra alterada. Proponemos que MapA estaría involucrada en la síntesis de algún componente de membrana, lo cual a su vez podría afectar directa o indirectamente la adhesión a componentes del hospedador y alterar la resistencia característica de Brucella al sistema inmune del hospedador. Estudios futuros permitirán dilucidar la función bioquímica de MapA en la biogénesis de la membrana de Brucella y su rol en la interacción de la bacteria con el hospedador.

Abstract:
The Brucella genus contains facultative intracellular pathogens, which cause a zoonotic disease called brucellosis. This zoonos is spread around the world and affects a wide range of mammals, among them many of agricultural importance. A fundamental aspect in the virulence of Brucella is its ability to invade and replicate within phagocytic and non-phagocytic cells. The aim of this thesis was to identify and characterize Brucella suis molecules associated to adhesion and/or invasion of host cells. Proteins that potentially could play a role in adhesion and/or invasion were identified through bioinformatic analysis of the B. suis 1330 genome. In this thesis three of the candidate proteins (BtaE, BtaF and MapA) were studied. Different in silico analysis indicated that BtaE and BtaF belong to the trimeric autotransporter family, which mediate their own translocation across the outer membrane. Mutational and heterologous aproaches demostrated that BtaE and BtaF are involved in the adhesion to non-phagocytic cells and components of the extracellular matrix. Particularly, it was shown that BtaE confers adhesion to hyaluronic acid while BtaF confers a promiscuous adhesion to a variety of compounds of the extracellular matrix and it would be involved in the formation of biofilms in vitro. The adhesin BtaF was involved in an additional function since it conferred the bacteria that carried it, tolerance to the bactericidal activity of the complement present in serum. Both autotransporters were necessary for B. suis to exhibit a full virulence in mice inoculated intragastrically. On the other hand, by immunofluorescence BtaE, BtaF and BmaC were detected in a reduced number of cells but in all cases the adhesins were localized at the new bacterial pole generated after the asymmetric division of Brucella. We propose that this pole of Brucella is functionally differentiated for adhesion. Regarding MapA, the mutant strain defective in this protein was less efficient in the adhesion to non-phagocytic cells. However, this mutant also presented a remarkable sensitivity to several compounds such as polymyxin B, Triton x-100 and lysozyme, suggesting that the bacterial outer membrane is altered. We propose that MapA would be involved in the synthesis of some membrane component, which could directly or indirectly affect the adhesion to components of the host and alter the characteristic resistance of Brucella to the immune system of the host. Future studies will be carried out to determine the biochemical function of MapA in the biogenesis of Brucella´s membrane and its role in the interaction of the bacteria with the host.

Bruzzo Iraola, Juan. "Rol de la inflamación sistémica en la patología generada por tumores murinos" (2014-04-24) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La asociación entre cáncer e inflamación en un órgano o tejido se encuentra sólidamente establecida. En efecto, se sabe que ciertos tumores, tienen una mayor probabilidad de originarse en sitios de inflamación crónica y que procesos inflamatorios locales pueden acelerar el crecimiento de tumores preexistentes en animales y seres humanos. Por otro lado, la relación entre cáncer e inflamación sistémica no ha sido particularmente estudiada. En esta tesis, demostramos que durante el crecimiento de 4 tumores murinos, de diferente origen, estirpe histológico e inmunogenicidad y de un tumor humano creciendo en ratones nude, se generaron 2 picos temporalmente separados de inflamación sistémica. El primer pico fue relativamente pequeño y transitorio ya que fue detectado durante la primera semana luego de la inoculación del tumor. Tal vez represente, en parte, una respuesta del organismo al trauma mecánico de la inoculación de elementos extraños, ya que la inoculación de fibroblastos murinos normales también produjo una manifestación de inflamación sistémica, aunque menor, que la observada después de la inoculación de células tumorales. Por otro lado, el inicio del segundo pico de inflamación sistémica fue observado cuando el volumen tumoral fue mayor que 500 mm3 y coincidente con el inicio del crecimiento exponencial de cada tumor. Este segundo pico de inflamación sistémica fue significativamente más prominente que el primero y su intensidad aumentó en relación directa con el incremento de la masa tumoral. Estos resultados sugieren que la inflamación sistémica podría ser un fenómeno general de la patología neoplásica y su importancia se puso de manifiesto en el hecho de que, en nuestra colección de tumores, se observó, sorpresivamente, una correlación directa entre la magnitud de la inflamación sistémica generada por cada tumor y su agresividad, correlación que no se observó con la capacidad de generar metástasis. Esto indica, al menos en los tumores analizados por nosotros, que la capacidad de generar una potente respuesta inflamatoria sistémica, produce más efectos deletéreos sobre el organismo que la propia capacidad metastásica, disminuyendo de este modo la sobrevida. En este sentido, se encontró gran infiltración de neutrófilos y alteraciones estructurales en diferentes órganos, que son compatibles con disminución y aún pérdida de función, independiente de la capacidad metastásica de cada tumor. La inflamación sistémica generada por el tumor exacerba el propio crecimiento tumoral estableciendo un circuito de retroalimentación positivo entre ambos, al menos en parte por la activación del receptor TLR-4. Además, la disminución de las manifestaciones de inflamación sistémica mejoró los efectos anti-tumorales obtenidos con quimioterapia y radioterapia, aunque estos resultados fueron relativamente modestos. Esto se debe a que el tumor cuando supera los 1500 mm3, comienza un crecimiento exponencial, generando un fenómeno de inflamación sistémica progresivo, a pesar de que se continúan administrando las drogas antiinflamatorias, que hasta ese momento habían sido bastante efectivas para limitar la naciente inflamación sistémica y para retardar el crecimiento tumoral. En cambio, un excelente resultado terapéutico fue alcanzado cuando se realizó el tratamiento antiinflamatorio junto con la escisión quirúrgica de tumores > 2000 mm3. En este caso, la eliminación quirúrgica de la fuente principal de inflamación sistémica y de posible refractariedad, permitió al tratamiento antiinflamatorio tener muchas más chances de actuar, contra la inflamación sistémica residual, pero aún deletérea, que perdura al menos 2 semanas después de la extirpación del tumor. Si esta condición inflamatoria sistémica fuera una característica distintiva de muchos canceres avanzados, un conocimiento más preciso de los mecanismos por los cuales esta inflamación sistémica promueve el crecimiento tumoral y produce múltiples daños en el organismo y la búsqueda de sustancias antiinflamatorias más efectivas y con menores efectos adversos, serían muy importantes para complementar y mejorar las terapias actuales contra el cáncer.

Abstract:
The link between cancer and inflammation in an organ or tissue has firmly been established on the basis that cancer tends to occur at sites of chronic inflammation and that local inflammatory processes can accelerate the growth of preexisting tumors in both animals and human beings. In contrast, the relationship between cancer and systemic inflammation has been less studied. In this work, we demonstrated that during the growth of 4 murine tumors of different origin, histological type and immunogenicity and 1 human tumor in nude mice, two temporally separate peaks of systemic inflammation were detected. The first peak was relatively small and transient detected during the first week after tumor inoculation. It probably represented, at least in part, the response of the organism to the mechanical trauma of inoculation of foreign bodies, because the inoculation of normal fibroblasts produced a rather similar manifestation of systemic inflammation than that observed after the inoculation of tumor cells. On the other hand, the onset of the second peak was observed when the tumor was 500 mm3, coincidental with the beginning of the exponential tumor growth. This second peak of systemic inflammation was significantly more prominent than the first one and its magnitude increased progressively in parallel with the increase of tumor mass. These results suggest that systemic inflammation could be a general phenomenon of neoplastic pathology and its importance became manifest in the fact, that in our tumor collection, was observed, surprisely, a direct correlation between the magnitude of systemic inflammation generated by each tumor and its aggressiveness. On the other hand, in our tumor models, tumor aggressiveness did not correlate to the tumor´s ability to disseminate or metastasize, suggesting that the magnitude of systemic inflammation rather than the metastatic ability produce more deleterious effects in the organism, diminishing survival. In fact, was observed a large number of PMN and damage in tissues and organs, that are compatible with impair function, indepently of tumor´s metastatic ability. The systemic inflammation generated by tumor enhance tumor growth, establishing a positive feedback between both, at least in part, by activation of TLR-4 receptor. In addition, the attenuation of the manifestations of systemic inflammation improves the anti-tumor effects obtained with radiotherapy and chemotherapy. However, this results were relatively modest. This is probably due to the fact that when tumor surpass 1500 mm3, begins an exponential growth, generating a systemic inflammation which magnitude increase progressively, even though the continue inoculation of the anti-inflammatory drugs. Instead, an excellent therapeutic result was obtained when the anti-inflammatory treatment schedule was combined with surgery. In this case, the surgery eliminated the main source of systemic inflammation and in consequence an anti-inflammatory treatment had a better chance to act against the residual, but still deleterious, systemic inflammation. If a systemic inflammatory condition were a hallmark of many advanced cancers, a more accurate knowledge of the underlying mechanisms by which systemic inflammation promotes tumor growth and produces multiple deleterious effects on the organism and the search for new more effectives and with lesser side effects anti-inflammatory factors will help to design new strategies to complement and to improve the current therapies against cancer.

Rimondi, Agustina. "Estudio de la patogenia del Virus de Influenza Aviar de baja patogenicidad en aves de corral inmunosuprimidas por la afección con el virus de la Anemia Infecciosa Aviar" (2014-12-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Influenza Aviar es considerada una zoonosis con potencial pandémico. El agente etiológico responsable de esta enfermedad es el Virus de Influenza A, cuyo reservorio natural son las aves silvestres acuáticas. En ellas, la infección con el Virus de Influenza Aviar (AIV) generalmente es asintomática, mientras que en las aves de corral la infección con AIV puede producir una variedad de síntomas que se extienden desde presentaciones asintomáticas o suaves a una enfermedad aguda y fatal. En consecuencia, se generan grandes pérdidas económicas asociadas al control y erradicación de este agente en las aves domésticas. Por ello, en la presente tesis nos propusimos estudiar, primero, la presencia del AIV en las aves silvestres acuáticas de la Argentina y, luego, su introducción y difusión en aves de corral con diferente estado inmunológico. Los resultados obtenidos permitieron evidenciar la circulación de veinte Virus de Influenza Aviar de Baja Patogenicidad (LPAIV) de diversos subtipos en las aves silvestres que habitan en la Argentina. Estos LPAIV aislados presentaron características genéticas particulares en sus genes que los diferencian de los AIV aislados en otras regiones. En particular, se evidenció la existencia de un linaje Sudamericano con evolución independiente para los seis genes que codifican las proteínas internas del Virus de Influenza Aviar. Debido a que la mayoría de los LPAIV aislados en nuestro país fueron de subtipo H6, se estudió la patogenia de estos virus en las aves de corral. Los resultados demostraron que estos virus de subtipo H6 tienen capacidad de infectar pollos y de transmitirse por contacto, evidenciando el riesgo potencial de introducción de estos virus en las aves de corral. Por otra parte, se sabe que en la Argentina, como en cualquier país con una producción avícola intensiva, existe una alta incidencia del Virus de Anemia Infecciosa Aviar (CAV) dentro de los planteles de aves domésticas. Actualmente, se carece de conocimiento acerca de la importancia que puede tener el estado de inmunosupresión provocado por este agente en la evolución de la patogenia del AIV. Por ello, en el trabajo de tesis que se presenta a continuación se estudió de patogenia del LPAIV subtipo H6 en pollos inmunosuprimidos experimentalmente por la infección con una cepa de CAV autóctona. Los resultados obtenidos demostraron que el AIV utilizado, aislado de aves silvestres en la Argentina, tiene igual capacidad de infectar pollos y de transmitirse por contacto directo en aves inmunocompetentes e inmunosuprimidas con CAV. En conjunto, los resultados presentados en esta tesis permiten colaborar con mejores análisis de riesgo para el diseño de estrategias de control y prevención con el objetivo de proteger las aves domésticas de nuestro país. Además, haber aumentado la información acerca de la epidemiología de la Influenza Aviar en la región es de suma importancia para comprender en mayor profundidad las potenciales consecuencias de esta enfermedad, tanto en las aves silvestres como en las aves domésticas. Sumado a esto último, es importante destacar que la Influenza Aviar es una zoonosis, con lo cual el aumento de la información disponible sobre este agente infeccioso es de relevancia para el sistema de Salud Pública nacional.

Abstract:
Avian influenza is considered a zoonosis with pandemic potential. The etiologic agent responsible for this disease is influenza A virus, whose natural reservoir are aquatic wild birds. In this species, the infection with Avian Influenza Virus (AIV) is generally asymptomatic, while in poultry AIV infection can cause a variety of symptoms ranging from asymptomatic or mild presentations to an acute and fatal disease. Consequently, there are large economic losses associated with control and eradication of this agent in commercial sheds. Therefore, in this thesis we intended to study the presence of AIV in wild aquatic birds circulating in Argentina and their possible introduction and spread in poultry with different immunologic status. The results obtained showed the circulation of twenty Low Pathogenic Avian Influenza Virus (LPAIV) from wild birds in Argentina. These viruses were from different subtype and all showed particular genetic characteristics in their genes that differ from AIV isolated in other regions. Particularly, genetic and phylogenetic analyses of their internal gene segments revealed a close relationship with influenza viruses from South America, forming a unique clade and supporting the notion of independent evolution from influenza A viruses in other latitudes. Due to AIV from H6 subtype were most consistently isolated in Argentina, we investigated the replication and transmission of these Argentine H6 AIV in poultry. The results suggested that these Argentine H6 viruses could replicate and transmit in chickens, demonstrating the potential risk of introduction of these viruses in poultry. It is known that in Argentina, as in any country with intensive poultry production, there is a high incidence of Chicken Infectious Anemia Virus (CAV) in commercial flocks. Currently, there is a lack of knowledge about the importance of the immunosuppression caused by this agent in the evolution of the pathogenesis of AIV. Therefore, in this thesis we studied the pathogenesis of LPAIV H6 subtype in chickens experimentally immunosuppressed by infection with an Argentinean field CAV strain. The results obtained showed that, under our experimental conditions, Argentinean H6 AIVs have equal ability to infect chickens and be transmitted as a result of direct contact, either in immunocompetent chickens or immunosuppressed chickens with CAV. Overall, the results presented in this thesis allow cooperate with better risk analysis for the design of prevention and control strategies to protect commercial poultry farms in our country. Also, it has increased the information about the epidemiology of AIV in South America, critical to understand in greater depth the potential consequences of this disease in both wild birds and domestic poultry. In addition, it is noteworthy that avian influenza is a zoonosis, thereby our results increase the information available on this infectious agent which is relevant to the national public health system.

Varni, Vanina Delia. "Epidemiología molecular y genómica comparativa de Leptospira spp. en Argentina" (2015-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La leptospirosis es una enfermedad infecciosa causada por bacterias del género Leptospira y constituye una zoonosis de amplia distribución mundial. La enfermedad puede ser contraída a través del contacto con ambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la principal vía de transmisión es el agua. Los brotes de leptospirosis en Argentina están asociados a cambios climáticos y en particular a inundaciones. A pesar de ello, en nuestro país existe escasa información de la situación epidemiológica actual de la enfermedad, principalmente debido a la subnotificación de casos y a su persistencia de tipo endémico en los animales. En los últimos años se han reforzado los análisis tendientes al conocimiento epidemiológico de esta enfermedad. En el campo de la epidemiología molecular, se desarrollaron distintos enfoques basados en PCR para la identificación y tipificación de aislamientos de Leptospira, siendo las más utilizadas: MLVA (análisis de VNTRs en múltiples loci) y MLST (tipificación por secuenciación de múltiples loci). Ambas tecnologías se basan en la amplificación por PCR, con la diferencia de que en el primer caso se trata de elementos de tipo minisatélite (unidades repetitivas en un rango de 8 a 100 pares de bases) y en el segundo caso los blancos de amplificación constituyen fragmentos de genes conservados o housekeeping que son secuenciados para su posterior análisis. Esta última se ha convertido en una técnica líder entre los métodos de tipificación molecular, debido a su alto poder discriminatorio entre distintos aislamientos bacterianos, su fácil aplicación y estandarización, además de la posibilidad de transmitir la información obtenida en distintos laboratorios a través de bases de datos públicas. Asimismo, las secuencias génicas obtenidas son aplicables a estudios poblacionales y epidemiológicos. En este trabajo se evaluaron y desarrollaron los principales métodos para la tipificación de Leptospira; la evaluación y aplicación de las técnicas MLVA y MLST permitieron identificar genotipos circulantes de manera mayoritaria entre aislamientos argentinos, tanto provenientes de animales de producción como en humanos. Se logró generar un nuevo esquema de MLST (7LA) para leptospiras patógenas a partir de la combinación de dos esquemas existentes, optimizando y unificando la metodología de tipificación. Las secuencias génicas generadas en este trabajo se encuentran publicadas en una base de datos disponible en internet (http://pubmlst.org/leptospira/), donde además de acceder a las mismas, puede aplicarse la metodología para la determinación de genotipos a partir de nuevos aislamientos, posibilitando la comparación de cepas a nivel mundial. El nuevo esquema se aplicó no solamente a los aislamientos argentinos, sino que se utilizó en la tipificación in silico a partir de 283 secuencias genómicas de aislamientos y cepas de referencias mundiales que fueron generadas en el marco de un proyecto de secuenciación genómica de este género. Se establecieron 199 genotipos diferentes donde el perfil de MLST denominado ST47 agrupó el 34 % de los aislamientos estudiados, similarmente a lo ocurrido para las muestras argentinas. Como consecuencia de los análisis filogenéticos y de formación de complejos clonales, se logró establecer una correlación entre genotipos y serogrupos al que pertenecen los aislamientos, aportando de esta manera una alternativa complementaria al diagnóstico serológico actual. En este sentido, se logró también la generación de un esquema de MLST reducido utilizando tan sólo tres de los siete marcadores del esquema 7LA. El esquema reducido (3LA) permitió la tipificación molecular directamente a partir de muestras clínicas, sin necesidad de contar con el aislamiento, que muchas veces es sumamente difícil de lograr debido a las características propias de esta bacteria. Este trabajo permitió entonces profundizar en el conocimiento de la variabilidad genética del género Leptospira y así generar información epidemiológica adecuada que pueda ser utilizada en programas de control y métodos de diagnóstico de esta enfermedad, constituyendo el primer trabajo en su tipo realizado en nuestro país. PALABRAS CLAVE: Leptospira, epidemiología, Multilocus Sequence Typing, serogrupos, genotipos, diversidad genética.

Abstract:
Leptospirosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Leptospira, and constitutes a zoonosis of worldwide distribution. The water becomes the main route of transmission when it is contaminated by the urine of infected animals. The outbreaks of leptospirosis in Argentina are associated to climate changes and particularly to the occurrence of floods. However, there is little information on the current epidemiological situation of the disease in our country, mainly due to underreported cases and the persistence of endemicity in animals. Recently, epidemiological analyses have strengthened the understanding of this disease. In the field of molecular epidemiology, PCR-based approaches for the identification and typing of isolates of Leptospira have been developed. Currently, the most frequently used approaches are MLVA (Multiple Locus VNTRs Analysis) and MLST (Multilocus Sequence Typing). Both technologies are based on PCR amplification. However, for MLVA the amplification targets are minisatellite elements (repeats in a range of 8 to 100 base pairs), whereas MLST targets fragments of housekeeping genes that are sequenced for further analysis. MLST has become a leading technique among the molecular typing methods, because of its high discriminatory power between different bacterial isolates, easy application and standardization, plus the ability to share information obtained in different laboratories through public databases. Besides, the gene sequences generated by this method area applicable to population and epidemiological studies. In this work, we evaluated and developed the main methods for typing Leptospira. The implementation of MLVA and MLST techniques led to the identification of major genotypes circulating among Argentine isolates from both livestock and humans. A new MLST scheme (7LA) was generated for pathogenic leptospires by optimizing and unifying two pre-existing MLST strategies. The gene sequences generated through this work have been published in a database available online (http://pubmlst.org/leptospira/). The methodology can also be applied for the genotyping of new isolates, enabling the comparison of genotypes worldwide. In addition, the new scheme was applied not only to Argentine isolates, but was used in silico for the characterization of 283 genomic sequences of isolates and strains of global distribution, which were generated as part of a genome sequencing project dedicated to this genus. A total of 199 different genotypes were established, and the MLST allelic profile named ST47 grouped 34% of the studied isolates, in agreement with the previous studies on Argentine samples. As a result of the phylogenetic and clonal complexes analyses, we could establish a correlation between genotypes and serogroups, thus providing a complementary alternative to the current serological diagnosis. In this regard, the generation of a reduced MLST scheme was also achieved, by selecting only three of the seven markers from the 7LA scheme. The reduced MLST scheme (3LA) was applied to the molecular typing from clinical sample without the need of isolation, which is often difficult to achieve because of the particular characteristics of this bacterium. In summary, this work allowed us to deepen the understanding of the genetic variability of the genus Leptospira, thus contributing with suitable epidemiologic information useful to apply in the design of control strategies and also diagnostic methods for this illness. Thus, this study constitutes the first work of its kind conducted in our country. KEYWORDS: Leptospira, epidemiology, Multilocus Sequence Typing, serogroups, genotypes, genetic diversity.

Sycz, Gabriela. "Caracterización de la vía de señalización de LOVHK implicada en mecanismos de respuesta a estrés y virulencia en Brucella spp" (2015-04-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Brucella spp. son bacterias Gram-negativas que pertenecen al grupo de las α-2- proteobacterias. Son el agente causal de la brucelosis, una enfermedad zoonótica que produce abortos e infertilidad en animales, y fiebre en humanos. Brucella es un patógeno intracelular facultativo, el cual reside en un nicho replicativo derivado del retículo endoplásmico. Su capacidad de sobrevivir dentro de las células hospedadoras se debe a los diversos mecanismos que ha desarrollado para tolerar las distintas condiciones de estrés presentes en el proceso de infección. Las bacterias pueden detectar y responder a cambios en el ambiente por medio de los sistemas de dos componentes, los cuales están formados por una Histidina Quinasa sensora (HK) y un Regulador de Respuesta (RR). Previo al inicio de este trabajo, se caracterizó en Brucella abortus 2308 una proteína histidina quinasa (LOVHK), la cual posee un dominio LOV sensible a la luz azul, un dominio PAS, seguido de un domino HK. Cuando la proteína es iluminada con luz azul, el dominio LOV inicia un fotociclo, el cual promueve la autofosforilación del dominio HK iniciando una cascada de transducción de señales que culmina con un incremento en la virulencia de Brucella. En el presente trabajo se ha estudiado la vía de señalización iniciada por LOVHK en Brucella abortus 2308. Por medio de ensayos de doble híbrido y experimentos de fosfotransferencias, se identificaron dos RRs como compañeros de interacción de LOVHK: PhyR y LovR. Los resultados in vitro sugieren que LovR podría funcionar como un sink de fosfato de LOVHK. Ensayos realizados in vivo sugieren que LOVHK, por medio de PhyR, contribuye a la activación del sistema de Respuesta General a Estrés (GSR- por sus siglas en inglés). Además, en ausencia de LOVHK la expresión de virB se encuentra alterada. Estos resultados sugieren que LOVHK podría participar en más de una vía de señalización intracelular. En resumen, los hallazgos del presente trabajo contribuyen al conocimiento del mecanismo de señalización de LOVHK y el efecto de dicha vía en la virulencia de Brucella.

Abstract:
Brucella spp. are Gram-negative bacteria that belong to the α-2-proteobacteria group. They are the causative agent o brucellosis, a zoonotic infection that causes miscarriage and infertility in animals, and a febrile disease in humans. Brucella is a facultative intracellular pathogen, which resides in a replicative niche derived from the endoplasmic reticulum. Its ability to survive inside its host is due to the different mechanisms that it has developed in order to cope with the different stress conditions that it encounters during the infection process. Bacteria can detect and respond to environmental changes through two-component signalling systems (TCS), which consist of a sensor Histidine Kinase (HK) and its cognate Response Regulator (RR). Previously, it has been characterized in Brucella abortus 2308 a histidine kinase protein (LOVHK), which has a LOV domain sensible to blue-light, a PAS domain and a C-terminal HK domain. After exposure to blue-light, the LOV domain initiates a self-contained photocycle, which promotes autophosphorylation of the HK domain, initiating a signal transduction pathway that produces an increment in Brucella virulence. In the present work, the intracellular signalling pathway initiated by LOVHK in Brucella abortus 2308 is characterized. Using two-hybrid assays and phosphotransfer experiments we identified two RRs as interacting partners of LOVHK: PhyR and LovR. These in vitro results suggest that LovR could be functioning as a phosphate-sink for LOVHK. In vivo results suggest that LOVHK, through PhyR, contributes to the activation of the General Stress Response System (GSR). Furthermore, the expression of virB is altered in the absence of LOVHK. Altogether, these results suggest that LOVHK could be involved in more than one intracellular signaling pathway. In conclusion, the results obtained in the present work contribute to the understanding of the signaling mechanism initiated by LOVHK and the effect of this pathway on Brucella virulence.

Hollender, Daiana. "Brucella abortus: tipificación molecular por MLVA en aislamientos locales, análisis in silico de sus lipoproteínas e implicancia de las lipoproteínas en virulencia" (2015-07-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La brucelosis es una enfermedad zoonótica de distribución mundial, con un alto impacto en la salud pública y en la economía. De las 10 especies de Brucella reconocidas, B. abortus es la causante de la brucelosis bovina. La publicación del genoma de varias especies de Brucella facilitó el diseño de distintos esquemas basados en marcadores moleculares. El objetivo de la primera parte de la tesis fue emplear un esquema de análisis multilocus de VNTR (Multiple Locus VNTR Analysis, MLVA) en 58 aislamientos de B. abortus de Argentina. El empleo de este esquema de MLVA nos permitió discriminar entre las dos biovariedades de B. abortus analizadas y poner de manifiesto la gran diversidad de genotipos de esta especie circulantes en el país. Además, a través del análisis mediante goeBURST se pudo relacionar a todos los genotipos entre sí y proponer al genotipo de la biovariedad 2, E1, como genotipo fundador. Este hecho ya había sido propuesto por Margaret Meyer en los años 90 basándose únicamente evidencias bioquímicas, en este trabajo se aportan, además, evidencias moleculares. Dada su localización expuesta, las lipoproteínas bacterianas cumplen una gran variedad de funciones, muchas de ellas asociadas a virulencia. En la actualidad, solo tres lipoproteínas de B. abortus, Omp10, Omp16 y Omp19, se encuentran bien caracterizadas. Como primer objetivo de la segunda parte de la tesis, nos propusimos conocer cuántas lipoproteínas están codificadas por el genoma de B. abortus S2308 y qué roles cumplen en la bacteria. Se identificaron 58 lipoproteínas de B. abortus mediante herramientas bioinformáticas. Para determinar su rol en virulencia, se generaron cepas mutantes mediante disrupción integrativa de los genes que codifican para 24 de ellas y posteriormente, se evaluó si presentan fenotipo atenuado en el modelo murino de infección esplénica. Una de las mutantes resultó atenuada (B. abortus Lp1, siendo BAB1_0009 el marco de lectura interrumpido) por lo que se realizaron diferentes estudios para caracterizarla. Posteriormente, se analizó la capacidad de generar una respuesta inmune protectora de la cepa mutante atenuada empleando el modelo de protección esplénica en ratones BALB/c. Los resultados mostraron una capacidad protectiva superior a la generada por la cepa B. abortus S19, empleada como cepa vacunal en la actualidad en bovinos. Para determinar si la 3 atenuación en virulencia de la mutante en B. abortus también se observa al interrumpir los genes ortólogos de B. suis y B. melitensis, se construyeron las respectivas cepas mutantes, se evaluó su virulencia y se caracterizaron. Se confirmó el fenotipo atenuado sólo en la cepa mutante de B. suis. Esta parte de la tesis contribuyó a determinar los posibles roles que cumplirían las lipoproteínas en B. abortus y a identificar a una lipoproteína, OppA, codificada por BAB1_0009, que participaría en virulencia en B. abortus y B. suis y que, al menos la cepa mutante B. abortus Lp1, sería capaz de generar una respuesta inmune protectora en el modelo murino. Estos resultados sientan las bases para el diseño y evaluación de nuevas vacunas contra la brucelosis.

Abstract:
Brucellosis is a zoonotic disease, worldwide spread, which remains an important problem due to economic loss and public health concern. Of the ten species described, B. abortus is the causative agent of bovine brucellosis. Publication of microorganism genomes facilitates the design of molecular markers. The aim of the first part of the thesis was to employ Multiple Locus VNTR Analysis (MLVA) scheme for strains from Argentina isolated in our laboratory. This scheme allowed differentiating each isolate to B. abortus biovar 1 or biovar 2 and to show a wide diversity among the genotypes present in our country. Also, through goeBURST analysis all the genotypes were related and the genotype of biovar 2, E1, was proposed as founder genotype. This fact have been previously proposed by Margaret Meyer based only in biochemical evidence. Our work, also, provides molecular evidence in this sense. Since lipoproteins are surface exposed, they accomplish a wide variety of roles, some of them related with virulence. Currently, only three lipoproteins of B. abortus, Omp10, Omp16 and Omp19, are well characterized. Our aim was to know how many lipoproteins are encoded by B. abortus S2308 genome and what their roles in the bacterium are. A total of 58 lipoproteins were identified by bioinformatic tools. To determine whether lipoproteins participate in functions related with virulence, 24 mutant strains were generated by integrative disruption of the genes that codes to the lipoproteins. Then, it was evaluated if they are attenuated in the murine model of spleenic infection. One of them was attenuated (B. abortus Lp1, being BAB1_0009 the ORF interrupted) and therefore it was characterized. Also, the ability to induce a protective immune response was analyzed through the spleenic protection model in BALB/c mice. The results show that the protection induced by B. abortus Lp1 was greater than the protection induced by B. abortus S19, which is the strain used as vaccine in bovine. In order to determine whether attenuation in virulence is also observed when the ortholog genes are interrupted in B. suis and B. melitensis, the corresponding mutant strains were constructed and characterized. Virulence of the mutant strains was evaluated. An attenuated phenotype was observed only in B. suis mutant strain. This part of the thesis contribute to determine the putative roles of lipoproteins in B. abortus and to identify a lipoprotein, OppA, enconded by BAB1_0009 5 that would be involved in virulence in B. abortus and B. suis. And, at least in B. abortus S2308, it would induce a protective immune response in the murine model. These results establish the basis for the development of new vaccines against brucellosis.

Serer, María Inés. "Estudio de la Síntesis de flavinas en Brucella abortus como potencial blanco terapéutico contra la brucelosis" (2015-11-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los miembros del género Brucella son bacterias Gram-negativas intracelulares facultativas que se adaptan a la vida intracelular en una gran variedad de mamíferos. Brucella spp causan brucelosis, la zoonosis de mayor incidencia en el mundo que afecta al ganado y a humanos, y para la cual aún no se dispone de una vacuna segura y confiable. A pesar de que Brucella no presenta factores de virulencia clásicos, exhibe una gran flexibilidad metabólica la cual le permite adaptar su fisiología en respuesta a los distintos microambientes encontrados durante su ciclo de vida intracelular. Esta adaptación fisiológica se basa en un ágil ajuste de la expresión de distintos subconjuntos de genes, entre los que se encuentran aquellos involucrados en el metabolismo de flavinas. La riboflavina (vitamina B2) es el precursor de FMN y FAD, dos cofactores esenciales que están implicados en una amplia variedad de procesos celulares en todos los organismos. Esta vitamina es sintetizada en microorganismos y plantas, pero no en humanos y animales, los cuales deben adquirirla a través de su dieta. Los dos últimos pasos de la biosíntesis de riboflavina son catalizados por las enzimas Lumazina Sintasa (LS) y Riboflavina Sintasa (RS). Debido a la ausencia de esta vía metabólica en animales y el hecho de que las bacterias patógenas muestran una estricta dependencia de su biosíntesis de riboflavina, se ha propuesto a LS y RS como dianas potenciales para el desarrollo de fármacos antimicrobianos. En este trabajo se presentan datos que sugieren una regulación diferencial de los genes involucrados en la biosíntesis de riboflavina en B. abortus. Asimismo, se resolvió la estructura cristalográfica de RS de B. abortus unida al producto de reacción riboflavina y a dos análogos de producto. Para complementar estos resultados, se realizaron también estudios cinéticos y de unión sobre RS; y se llevó a cabo un ensayo de high throughput screening de microelectroforesis capilar de una biblioteca de 44.000 compuestos en colaboración con la empresa farmacéutica Novartis en Suiza. A partir de éste se identificaron diez compuestos con potencia micromolar del cual se identificó una serie de cinco compuestos con actividad in vivo contra B. abortus en cultivo bacteriano. En conclusión, la determinación de nuevas estructuras de RS unida a ligandos, su caracterización bioquímica y el hallazgo de nuevos inhibidores con actividad contra B. abortus in vivo representan un avance en la búsqueda de los antimicrobianos contra la brucelosis.

Abstract:
Brucella spp. are facultative intracellular Gram-negative bacteria, which are adapted to intracellular life within cells of a large variety of mammals. They cause brucellosis, a zoonotic infection with the highest incidence in the world affecting livestock and humans and for which a safe and completely reliable vaccine is still unavailable. Although Brucella has not classical virulence factors, it exhibits high metabolic flexibility, which allows it to adapt its physiology in response to different microenvironments found during its intracellular life cycle. This physiological adaptation is based on a flexible adjust of the expression of different subsets of genes, among which are those involved in the metabolism of flavins. Riboflavin (vitamin B2) is the precursor of FMN and FAD, two essential cofactors for all organisms that are involved in a wide variety of cellular processes. This vitamin is biosynthesized in microorganisms and plants but not in humans and animals, which must acquire it through their diet. The last two steps of riboflavin biosynthesis are catalyzed by Lumazine Synthase (LS) and Riboflavin Synthase (RS). Owing to the absence of this pathway in animals and the fact that most pathogenic bacteria show a strict dependence on riboflavin biosynthesis, it has been proposed that these enzymes may be promising targets for the development of new antimicrobial agents for the treatment of brucellosis. In this work, we show data that suggest a differential regulation of genes involved in the biosynthesis of riboflavin in B. abortus. Furthermore, we present the crystallographic structure of RS from B. abortus. In order to describe its substratebinding sites, we solved the structure of the enzyme in the presence of bound ligands, namely one of the products of the reaction (riboflavin) and two product analogues. To complement these findings, we performed kinetic and binding studies on the enzyme. A newly High-throughput Screening capillary electrophoresis assay of 44.000 compounds library was developed in collaboration with Novartis in Switzerland, which identified 10 compounds with micromolar potency. From this subset we identified a series of 5 compounds with in vivo activity against B. abortus. In conclusion, these newly determined structures, biochemical characterization of RS and finding of novel inhibitors with activity against B. abortus represent a progress in the pursuit of antimicrobial compounds against brucellosis.

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