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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Parasitología [ 50 tesis ]

De Titto, Ernesto Horacio. "Regulación de la respuesta inmune en la enfermedad de Chagas" (1983) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Doyle, Patricia Susana. "Las subpoblaciones de Trypanosoma Cruzi presentan diferentes capacidades de penetración : Influencia de factores químicos y biológicos sobre la capacidad de penetración en células de mamífero" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Porcel, Betina Mabel. "Caracterización molecular del gen que codifica para una proteína flagelar ligadora de calcio del Trypanosoma cruzi, altamente consevado en Tripanosomátidos" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La fracción flagelar de epimastigotes de Trypanosoma cruzi, enriquecida en flagelos y elementos de membrana, ha mostrado en modelos experimentales murinos las mejores propiedades inmunogénicas, protectivas y no agresivas contra el desafío con el T. cruzi Quizás sólo un pequeño número de los componentes de esta fracción están involucrados en esta inmunidad protectiva en el huésped, en tanto que el resto de ellos podrían actuar en otros procesos esenciales para el parásito. Las señales de calcio juegan un papel preponderante en diversos mecanismos de transducción de señales en parásitos, tanto en relación a la invasión a la célula hospedadora como en los cambios morfo-fisiológicos del mismo a lo largo de su ciclo de vida. Asimismo, la alta conservación de las proteínas moduladoras de calcio en distintos tripanosomátidos, ha sugerido su posible implicancia en dichos procesos de transducción. En este trabajo se describe la caracterización a nivel molecular del gen que codifica para una proteína flagelar ligadora de calcio en T. cruzi, y su versión homóloga en Trypanosoma rangeli. Varios clones de ADN recombinante fueron detectados en una genoteca de expresión construida a partir del ADN total de la forma epimastigote de T. cruzi (clon Miranda/76), en el vector de expresión λgt11 , utilizando suero de conejo anti-fracción flagelar. Dos de esos clones recombinantes fueron seleccionados para la caracterización de sus productos de expresión. La expresión de estos clones recombinantes en bacterias produjo proteínas fusionadas a la enzima g-galactosidasa, las que mostraron poseer epitopes reconocidos por anticuerpos dirigidos contra la fracción flagelar del parásito. La adsorción del suero anti-fracción flagelar por las proteínas expresadas, permitió obtener anticuerpos que identificaron por "inmunoblotting" moléculas de 29 kDa en ambos casos, en homogeneizado total de epimastigotes y fracción flagelar, mientras no reaccionaron con antígenos de Leishmania brasiliensis. Posteriormente, el análisis de la secuencia de bases de ambos fragrnentos confirmaron que los insertos provenientes de ambos clones codifican para una misma proteína de 29 kDa. en T. cruzi. La presencia de este antígeno F29 en la superficie del parásito fue comprobada por inmunofluorescencia. La expresión del gen completo que codifica para la proteína flagelar F29 en el vector pMAL-p2 permitió obtener una proteína recombinante fusionada a proteína de unión a maltosa, que mostró ser ligadora de calcio. Cuando se ensayó la inmunogenicidad del antígeno recombinante F29-MBP, utilizando Bordetella pertussiscomo adyuvante, se observó que esta proteína es capaz de generar una respuesta inmune humoral contra el T. cruzi, demostrada por anticuerpos dirigidos contra la proteína pura y el homogenato total del parásito. Los epitopes generadores de respuesta en F29-MBP fueron reconocidos en un gran número de otras proteínas en el parásito, a igual que se mostraron altamente representados en el T. rangeli. El gen que codifica para la proteína flagelar ligadora de Ca++ F29 mostró encontrarse organizado en al menos 20 copias, altamente conservadas entre cepas pertenecientes a distintos zimodemas, adyacentes una a la otra con una disposición cabeza-cola en el genoma del parásito. Dicho gen se expresa en epimastigotes de T. cruzi transcribiendose a un mensajero policistrónico, el cual podría sufrir un procesamiento post-transcripcional de clivaje y poliadenilación, también observado para otros genes del parásito. El perfil encontrado para diferentes clones y cepas de T. cruzi estudiados por hibridización a cromosomas enteros fraccionados por electroforesis en campo pulsado reveló que el gen que codifica para la proteina flagelar F29 se halla ampliamente representado en T cruzi, mostrando una conservación intraspecífica en las cepas y clones evaluados. Asimismo, estos patrones de hibridización mostraron una alta correlación con la clasificación isoenzimática de las distintas cepas y clones analizadas de acuerdo a su perfil isoenzimático basado en 2, 12, 13 y 19 loci. A su vez, la existencia de al menos dos arreglos de repeticiones de genes, ubicados en un par de cromosomas homólogos fue observada al enfrentar la misma sonda a productos de digestión provenientes de la digestión de cromosomas enteros de distintas cepas, con enzimas sin sitios de corte dentro del inserto. La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa sobre ADN genómico total de T. rangeli (aislado LDG) usando como iniciadores de la síntesis oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia completa del gen que codifica en T cruzi para la proteína flagelar ligadora de calcio F29, permitió la obtención de un fragmento de ADN que codifica para una proteína de 23 kDa con alta homología con proteínas flagelares responsables de la unión a Ca2+ en otros tripanosomátidos. La hibridación a ARN de T. rangeli reveló que esta proteína se expresa como un transcripto poliadenilado de 1.6 kb, a raiz, al igual que en T. cruzi, de un procesamiento post-transcripcional. El gen que codifica para TrCaBP en T. rangeli tambien se encontró organizado en al menos 20 copias por célula, en dos cromosomas de gran tamaño en ciertos aislados del T. rangeli, y a dos pequeños en otros aislados. Los resultados presentados demuestran que la información genética que codifica para la proteína flagelar ligadora de Ca2+ F29 del T. cruzi se encuentra altamente conservada en el genoma de otros tripanosomátidos, sin encontrarse presente en el género Leishmania.

Abstract:
The flagellar fraction of Trypanosoma cruzi epimastigotes contains flagellar membrane components such as glycoproteins and parasite surface enzymes. This fraction has the best immunoprotective properties in the murine model. Just a few of these components would be involved in this protective response, whereas others would play a key role in parasite's essential processes. Calcium signals would play an important regulatory role in signal transduction processes in parasites, being critically involved in the coordination of life cycle events and cell invasion. Likewise, the high conservation of calcium-modulated proteins among different trypanosomatides supports the notion that these cell-surface calflagins would play common roles in these caZ+-transduction processes. In the present study, we report the cloning and molecular characterisation of genes encoding EF-hand calcium-binding proteins in Trypanosoma rangeli and T. cruzi, showing that these genes are highly conserved in these related trypanosomes. A T. cruzi, Miranda/76 clone, genomic Agtl 1 expression library was screened with rabbit anti flagellar fraction polyclonal antibodies and several clones were obtained. Two of them, with inserts of 550 and 750 bp respectively, were selected for recombinant protein production. The IS-galactosidase fusion proteins produced in bacteria by IPTG induction possesed epitopes recognized by antibodies raised against T. cruzi flagellar fraction. Antibodies selected from the anti-flagellar fraction polyclonal sera using these fusion proteins, detected a 29 kDa. protein in T. cruzi epimastigote whole homogenate and flagellar fraction by immunoblotting, whereas no reactivity was observed against Leishmania brasiliensis . Subsequently sequence analysis showed that both inserts encoded for the same 29 kDa. protein in T. cruzi. The presence of F29 antigen on the parasite surface was confirmed by indirect immunofluoresence. Expression of the complete F29 encoded-gene into pMAL-p2 expression vector showed that F29 is a calcium-binding protein. Furthermore, this recombinant protein was inmunogenic in mice, using Bordeteila pertussis as adyuvant. Antibodies raised against F29recognized several proteins in T. cruzi by immunobloting as well as in T. rangeli. F29 is encoded by at least twenty tandemly arranged highly conserved genes, organized in a head-to-tail fashion in the parasite genome. F29-encoding gene is transcribed as a polyadenylated transcript in the parasite. PFGE hybridization experiments revealed the presence of the F29 genes in different T. cruzi isolates, cloned stocks and strains, with common features between T. cruzi isoenzimatic classification and chromosomal hybridization patterns. Similar pattern of one or two bands were seen after PFGE-Southern analysis with rare cutting restriction enzymes, which do not cut inside the tandem array, indicating a disomic chromosomal constitution for F29 genes. PCR amplification of T. rangeli genomic DNA, using primers derived from the T. cruzi F29-encoding sequence made it possible to isolate the homologous gene in T. rangeli, encoding a 23 kDa highly homologous to calcium-binding proteins from trypanosomatids. Northern blot analysis revealed that the Tr CaBP gene is also expressed in T. rangeli as a polyadenylated transcript. The TrCaBP-encoding genes are present in at least 20 copies per cell, organized in tandem arrays on large T. rangeli chromosomes in some isolates, and on two smaller in others. Hence, the calcium-modulated proteins encoding genes, as well as their genomic organization, are well conserved in trypanosomes. The gene, however, seems to be absent from Leishmania sp.

Gutiérrez, Pablo Andrés. "Ecología de monogenea en el Río de la Plata : patrones y procesos en las comunidades de Pimelodus maculatus y P. albicans" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo general de esta investigación fue estudiar los procesos que estructuran las comunidades de Monogenea en peces dulceacuicolas, tomando como modelo los parásitos presentes en las branquias de Pimelodus maculatus y P. albicans (Siluriformes: Pimelodidae) en el Río de la Plata (Puerto de Buenos Aires). En P. maculatus se encontraron 5 especies de Monogenea y 6 en P. albicans. Los Monogenea estudiados corresponden a los géneros Demidospermus, Unibarra, y Anacanthophallus. Los hospedadores compartieron tres especies de parásitos, dos del género Demidospermus y la tercera perteneciente al género Anacanthophalus. El número de Monogenea y la cantidad de sectores branquiales ocupados se correlacionaron positivamente con el largo del hospedador solamente en P. maculatus. En ambos hospedadores la cantidad de espacio disponible (nichos vacantes) fue abundante. En las dos especies hospedadoras se encontró correlación positiva entre el número de especies de Monogenea y la carga parasitaria total. Las asociaciones negativas entre las especies de Monogenea en ambos hospedadores fueron escasas o inexistentes. Se encontraron pocos casos de solapamiento completo de nichos entre las especies de Monogenea. Las especies del género Demidospermus revelaron tener un patrón similar de preferencia por determinadas hemibranquias. Se encontró variación estacional en la caracterización de las infracomunidades de P. maculatus. Los Monogenea que parasitan ambas especies hospedadoras constituyen comunidades componente que no son consecuencia de ensambles estocásticos de especies. Se demuestra que el patrón de encuentros intraespecíficos no se debe a procesos estocásticos. Se analizan los patrones encontrados en base a la hipótesis de segregación no competitiva de especies.

Abstract:
The general goal of this investigation was to examine the processes structuring Monogenea communities in freshwater fishes. Communities of Monogenea occurring on the gills of Pimelodus maculatus and P. albicans (Siluriformes, Pimelodidae) in the Rio de la Plata (Port of Buenos Aires) were used as model system. Five and six species of Monogenea (genus Demidospermus, Unibarra and Anacanthophallus) were found in P. maculatus and P. albicans, respectively. Study hosts shared three of these parasite species, two from the genus Dernidospermus and one from the genus Anacanthophalus. In P. maculatus the total abundance of Monogenea and the number of parasitisized gill sectors were positively correlated with host length. Both host species had large amounts of unoccupied gill space (i.e., vacant niches). The number of Monogenea species increased with total parasite burden per host in both hosts. Strongly negative associations between species of Monogenea were infrequent in the study system; complete niche overlap between parasite species also occurred in only a few cases. Species in the genus Dernidospermus showed similar preferences for some hemibranches. Infracommunities of P. maculatus exhibited strong seasonal variation in structure. Results indicate that the structure of Monogenea component communities in the study hosts is not a consequence of a stochastic assembly of species. In particular, patterns of parasite intraspecific aggregation did not result from random processes. Patterns found in these Monogenea parasite communities are therefore suggested to conform the non-competitive species segregation hypothesis.

Ceriani, María Carolina. "Metabolismo de poliaminas en Crithidia fasciculata : Caracterización, clonado y secuenciación de la enzima ODC" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo, se han caracterizado distintos aspectos del metabolismo de poliaminas en el parásito tripanosomátido Crithidia fasciculata, poniendo especial énfasis en la enzima ornitina decarboxilasa (ODC), que cataliza el primer paso en la síntesis de estas sustancias. El transporte de poliaminas al interior del parásito es muy bajo, y solo se ve aumentado cuando se expone a los cultivos a un inhibidor de la ODC, como es el difluorometilornitina (DFMO). Este dato indicaría que en condiciones normales, la maquinaria biosintética del parásito es suficiente para satisfacer sus requerimientos, pero que al someter a C.fasciculata a un ayuno de poliaminas por bloqueo de su biosíntesis se produce una marcada inducción de la entrada de estas sustancias desde el medio externo. La enzima fue ampliamente caracterizada dsde el punto de vista bioquímico y molecular. Se clonó y secuenció en su totalidad, determinandose a partir de estos datos su PM y las zonas que podrían ser importantes desde el punto de vista de su regulación "in vivo". Por último se estudió la resistencia a DFMO del parásito, y se determinó que este fenómeno no produce diferencias sustanciales en la expresión del gen de ODC. Todas estas observaciones nos llevan a pensar que la enzima ODC de este parásito tiene propiedades que la hacen distintiva entre las estudiadas hasta el momento en otras células, y abren un nuevo capítulo en el estudio general de la estabilidad enzimática.

Abstract:
In this work, different aspects of polyamine metabolism in the trypanosomatid parasite Crithidia fasciculata have been characterized, with special emphasis in ornithine decarboxilase (ODC), which catalyses the first step in the biosynthesis of these substances. Polyamine transport inside the parasite is very low, but it is strongly increased when the cultures are exposed to an ODC inhibitors, like difluoromethilornithine (DFMO). This data could indicate that in normal conditions, the biosynthetic machinery of the parasite is enough to satisfy their requirements, but when C. fasciculata suffers polyamine starvation, by blocking their biosynthesis, there is a great induction of the transport of these substances from the external medium. The enzyme was characterized from the biochemical and molecular point of view. It was cloned and sequenced, and the molecular weight , and some regions that could be considered important for its " in vivo" regulation were determined from the sequence. Last, we studied the resistance to DFMO, and we determined that this fenomena does not produce substancial differences in the expression of the ODC gene. Taken all together, these observations allow us to state that the ODC enzyme from this parasite has propertiers that make it different from the other studied up to this moment, opening a new chaper in the general study of enzyme stability.

Rubel, Diana Nora. "Investigaciones sobre el impacto de la Cava San Nicolás (Florencio Varela) : una intervención epidemiológica" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se evaluó el impacto ambiental de un basural extenso de 25 metros de profundidad ubicado en Florencio Varela, Buenos Aires, en un marco de investigación participativa. El basural se investigó desde dos ángulos, evaluándose: - su influencia sobre la calidad del agua subterránea de los acuíferos de consumo en la zona; y - su rol como posible amplificador de la transmisión de la leptospirosis a la población canina. El impacto del basural sobre las aguas subterráneas se refleja en un aumento de los niveles medios de ciertos parámetros en los sitios de muestreo situados lateralmente o aguas abajo del basural, tales como dureza, cloruro, hierro y manganeso. Se detectaron contaminantes tóxicos, cianuro y mercurio, aunque el últimose originaria también en otras fuentes de contaminación. El basural sería un factor de riesgo adicional para la transmisión de leptospirosis a la población canina, si bien otros factores de riesgo pueden mantener seroprevalencias relativamente elevadas en la población del área. Esto representa un riesgo para la población humana residente, ya que los perros actúan corno un reservorio de la infección y contaminan el medio. La información producida se comunicó a los actores sociales involucrados, lo que contribuyó a la eliminación del basural.

Abstract:
The study was aimed to evaluate the environmental impact of an extensive dump 25 meters deep located in Florencio Varela, Buenos Aires, Argentina. The dump was investigated from two points of view: - their influence on the ground water quality of the acuifers exploited in the area; and - their role as an amplifying factor of leptospiroses tranmission to local dog population. With regards to the impact on ground water quality, the results indicated a increase in the mean levels of some parameters in the sample sites located downstream or Laterally from the dump, such as hardness, chloride, iron and manganese. Toxic contaminants, specially cyanide and mercury, were detected, although other contamination sources would be present. Contact with the dump involves an additional risk to leptospiroses transmission to the dog population, although others risk factors could maintain high seroprevalences in the dogs. This constitutes a risk for local people, since the dog population acts as a reservoir and can contaminate the environment. The produced information was communicated to the involved social actors.

Cecere, María Carla. "Dinámica poblacional de Triatoma infestans en comunidades rurales y en un modelo experimental bajo condiciones naturales" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Triatoma infestans es el principal vector de Trypanosoma cruzi, agente causal de la Enfermedad de Chagas. En este estudio se utilizaron técnicas multivariadas para identificar los factores asociados a la infestación y abundancia domiciliaria de T. infestans en las comunidades rurales vecinas de Amamá y Trinidad-Mercedes (Santiago del Estero, Argentina) antes y después de un rociado de insecticidas. Antes del rociado, una mayor disponibilidad de refugios en los techos y paredes de las viviendas, y la presencia de gallinas empollando en interiores se hallaban asociados en forma positiva y estadísticamente significativa a la abundancia domiciliaria de T. infestans en un modelo de regresión lineal múltiple. Se evaluaron los efectos a largo plazo sobre la dinámica de reinfestación domiciliaria por T. infestans de un programa combinado de manejo ambiental y aplicación de insecticidas (en Amamá) en relación con otro programa basado sólo en aplicación de insecticidas (en Trinidad Mercedes) durante 1992-1997. El programa de control combinado mejoró el revoque de las paredes internas de las viviendas antes del rociado con deltametrina del domicilio y peridomicilio. Se evaluó la reinfestación domiciliaria y peridomiciliaria mediante múltiples métodos, y los atributos demográficos y ambientales de cada familia cada 6 meses. Durante 1993-1995, la comunidad bajo un programa de control combinado alcanzó una infestación domiciliaria significativamente menor que la comunidad donde sólo se hizo control químico. Los peridomicilios fueron los primeros en reinfestarse, y alcanzaron poblaciones de T. Infestans más densas que los domicilios. En un análisis de regresión logística múltiple, los únicos predictores significativos de la probabilidad de reinfestación domiciliaria fueron la presencia de un sitio peridoméstico infestado en la propia casa (en 1993-1995), y la captura de 10 o más T. infestans en domicilio antes del rociado de 1992 (en 1996). Los efectos de la disponibilidad de refugios sobre la dinámica poblacional de T. infestans bajo condiciones climáticas naturales fueron evaluados en pequeños ranchos experimentales que simulan la típica vivienda rural en Punilla (Córdoba). Cada rancho albergó una gallina, fue colonizado con 8 adultos de T. Infestans en Febrero de 1994, y constituyó una población cerrada. Cada una de las 9 poblaciones fue censada mensualmente, y los 3 controles fueron censados anualmente. Los ranchos con máxima disponibilidad de refugios alcanzaron una abundancia de T. infestans y fecundidad significativamente mayores que aquellos con intermedia o mínima disponibilidad de refiigios, y esto se reflejó en una tasa de reproducción básica también mayor. Sólo 2 de las 9 réplicas se extinguieron espontáneamente, y ambas tenian mínima disponibilidad de refugios. La menor disponibilidad de refugios reduciría la disponibilidad de sitios adecuados para la oviposición y la supervivencia de las hembras. Estos resultados son consistentes con las raciones realizadas en ranchos de Santiago del Estero, y apoyan la hipótesis que el o actúa como factor limitante del crecimiento poblacional de T. infestans.

Abstract:
Triatoma Infestans is the principal vector of Trypanosoma cruzi; the causal agent of Chagas disease. In this study multivariate techniques were used to identify factors associated with the domiciliary infestation and abundance of T. infestans in the neighboring rural communities of Amamá and Trinidad-Mercedes (Santiago del Estero, Argentina) before and after insecticide sprays. Before the sprays, refuge availability in roofs and walls, and the presence of chickens nesting indoors were positiver and significantly associated with the domiciliary abundance of T. infestans in a multiple lineal regression model. The long-term effects on the dynamics of domiciliary reinfestation of T. infestans of a combined program of environmental management and insecticide application (in Amamá) relative to other program based only on insecticide application (in Trinidad-Mercedes) were evaluated during 1992-1997. The combined control program improved the plaster of indoor walls, and sprayed with deltamethrin all domestic and peridomestic areas. Each 6 months, domiciliary and peridomestic infestations were evaluated by multiple methods, and demographic and ambient attributes of each household were recorded. During 1993-1995, the community under a combined control program reached a significantly lower domiciliary infestation than the one only subjected to chemical control. Peridomestic sites were the first in reinfesting, and reached more abundant triatomine populations than domiciliary areas. In a multiple logistic regression analysis, the only significant predictors of the probability of domiciliary reinfestation were the presence of an infested peridomestic site in a house (in 1993-1995), and the catch of 10 or more T. infestans in domestic areas before the 1992 insecticide spray (in 1996). The effects of refuge availability on the population dynamics of T. infestans under natural climatic conditions were evaluated in small experimental huts that simulate the-typical rural house in Punilla (Córdoba). Each hut hosted a chicken, was colonized with 8 T. Infestans adults in February 1994, and constituted a closed population. Each one of the 9 populations was censused monthly, and the 3 controls were censused annually. The huts with maximum refuge availability reached significantly greater T. infestans abundance and fecundity than those with intermediate or minimum refuge availability, and this also reflected in a greater basic reproductive rate. Only 2 of the 9 replicates went extinct spontaneously, and both had minimum refuge availability. This would reduce the availability of adequate oviposition sites and decrease female survivorship. This results are consistent with the data collected in ranchos in Santiago del Estero, and support the hypothesis that the resource space is a limiting factor of T. infestans population growth.

Labriola, Carlos Alberto. "Purificación de la cruzipaína por cromatografía de afinidad : Su aplicación en el estudio del control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Parte I: Purificación de cisteína proteinasas de trypanosomátidos por cromatografía de afinidad. Trypanosoma rangeli es un trypanosoma de América del sur capaz de infectar mamíferos pero aparentemente incapaz de causar patología. Tiene una alta reactividad inmunológica cruzada con Trypanosoma cruzi, el agante de la enfermedad de Chagas. La diferencia principal entre ambos parásitos parece ser la localización de las formas infectivas de T. rangeli en las glándulas salivales, comparada con la localización rectal de los trypomastigotes metacíclicos de T. cruzi, y la aparente pérdida de un estadío intracelular en el mamífero, en el caso del primer parásito. El último punto sugiere que algunos o todos de los diferentes factores postulados a estar involucrados en el reconocimiento, adherencia a, y penetración dentro de la célula de mamífero por los trypomastigotes de T. cruzi, podrían estar ausentes o fuertemente disminuidos en T. rangeli. Entre un número de factores de virulencia propuestos, la cruzipaína, cisteína proteinasa principal de T. cruzi ha sido descripta como una enzima esencial en distintos puntos del ciclo biológico del parásito y podría estar directamente involucrada en la penetración. Por esta razón, decidimos investigar actividades de cisteína proteinasa en epimastigotes de T. rangeli. Hemos purificado cruzipaína a homogeneidad proteica (de T. cruzi) y una cisteína proteinasa (de T. rangeli) utilizando cromatografía de afinidad, tanto en cistatina-Sepharosa, específica para cisteína proteinasas, como en concanavalina-A (ConA), específica para glicoproteínas con oligosacáridos de alta manosa, partiendo de extractos crudos de epimastigotes. La última enzima se expresa a un nivel de dos órdenes de magnitud menor que la cruzipaína en epimastigotes de T. cruzi. Ambas enzimas tienen masa molecular aparente, idéntica secuencia N-terminal y reacción inmunológica cruzada, pero difieren en la secuencia completa y en algunos parámetros cinéticos. Parte II: Control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi. Las N-glicoproteínas son al principio glicosiladas con la transferencia de un oligosacárido (Glc3Man9GlcNAc2, en la mayoría de las células) desde un derivado de dolicol-P-P a un residuo de Asn en el lúmen del retículo endoplásmico (RE). Los oligosacáridos unidos a proteína son procesados en la misma localización subcelular por la glucosidasa I (GI) que remueve la unidad de glucosa (Glc) mas externa y la glucosidasa II (GII) que remueve las dos glucosas remanentes. Un proceso adicional en el RE es la reacción catalizada por la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima agrega una unidad de Glc a oligosacáridos libres de glucosa en glicoproteínas que no presentan su plegamiento terciario correcto. La GII deglucosila los oligosacáridos monoglucosilados generados por la GT. Las glicoproteínas adquiren su estructura terciaria final en el RE. Las glicoproteínas que fracasan en adquirir su plegamiento correcto son retenidas en el RE y posteriormente transportadas al citosol donde son degradadas en el proteasoma. Por otro lado, las moléculas que se pliegan correctamente pueden continuar su tránsito a través del camino secretorio a su destino final. Se han descripto en el lúmen del RE, dos chaperones no convencionales, calnexina (Cnx) y calreticulina (Crt). Se ha demostrado que la interacción de la Cnx/Crt con glicoproteínas monoglucosiladas facilita el plegamiento de las glicoproteínas en células de mamíferos previniendo la agregación y la supresión de uniones disulfuro incorrectas. Mas aún, la interacción antes mencionada provee uno de los mecanismos por los cuales las células retienen en el RE glicoproteínas mal plegadas. Las interacción Cnx/Crt con glicoproteínas monoglucosiladas fue considerado por lo tanto, como un control de calidad de plegamiento de glicoproteínas. Este modelo predice que la inhibición de la remoción de la Glc agregada por la GT, retardaría (o aboliría) la salida de las glicoproteínas del RE. Esta predicción no puede ser comprobada, sin embargo, en la mayoría de las células dado que la GII es la responsable de la remoción de ambas unidades de Glc unidas en α(1,3). Mas aún, los inhibidores conocidos de GII también inhiben GI. La adición de estas drogas a las células lleva a la acumulación de oligosacáridos con dos o tres Glc que no son reconocidos por la Cnx/Crt. La predicción puede ser comprobada en T. cruzi. Este parásito transfiere “in vivo” oligosacáridos no glucosilados (Man9GlcNAc2) a los polipéptidos nacientes y, por lo tanto, los oligosacáridos monoglucosilados se forman en ellos solamente vía GT. La cruzipaína, una cisteína proteinasa lisosomal de T. cruzi, teniendo tres sitios potenciales de N-glicosilación, al menos dos de los cuales están ocupados, se aisló en la forma glucosilada de células crecidas en presencia de 1-deoxinojirimicina (DNJ), un inhibidor de la GI y GII. El oligosacárido presente en el único sitio de glicosilación del dominio carboxilo-terminal de la cruzipaína se glucosiló en algunas moléculas de enzima pero no en otras, este resultado es consistente con un plegamiento asincrónico de las glicoproteinas en el RE. A pesar de no afectar la velocidad de crecimiento celular o el metabolismo celular general en incubaciones cortas y largas, la DNJ causó un marcado retraso en el arribo de la cruzipaína a los lisosomas. Este resultado es compatible con el modelo propuesto por el cual las glicoproteinas monoglucosiladas podrían ser transitoriamente retenidas en el RE por anclas tipo lectinas reconociendo oligosacáridos monoglucosilados. También se encontró que este protozoo expresa una molécula tipo Crt, el tercer componente (además de GT y GII) del control de calidad de plegamiento de glicoproteínas. No se detectó un gen que codifique para Cnx. La Crt recombinante de T. cruzi reconoció especificamente oligosacáridos monoglucosilados del tipo alta manosa. El agregado de suero anti-Crt a extractos obtenidos de células de un experimento de “pulse-Chase” con Met más Cys inmunoprecipitó dos proteínas que fueron identificadas como Crt y cruzipaína. La última proteína pero no la primera desapareció durante el período de “chase”. Contrariamente a lo que sucede en células de mamíferos, la adición de DNJ promovió la interacción Crt-cruzipaína. Este resultado es consistente con la vía conocida de N-glicosilación de proteínas y procesamiento de oligosacáridos que ocurren en T. cruzi y explica el retraso en el arribo de la cruzipaína a los lisososmas causado por la DNJ. El tratamiento de los complejos Crt-cruzipaína con endo-β-N-acetilglucosaminidasa H (Endo H) tanto antes como después del agregado del suero anti-Crt abolió por completo la interacción Crt-cruzipaína. Además, la cruzipaína madura monoglucosilada pero no la no glucosilada aislada de los lisosomas interactuó con la Crt recombinante. Concluimos que la Crt de T. cruzi se une a oligosacáridos monoglucosilados pero no a motivos proteicos en la cruzipaína. Mas aún, las evidencias indican que la GT glucosiló a la cruzipaína en sus últimos estados de plegamiento.

Abstract:
Part I: Purification of cysteine proteinases of Trypanosomatids by affinity chromatography. Trypanosoma rangeli is a South American trypanosome able to infect mammals, but apparently unable to elicit pathology. lIt has a high immunological cross-reactivity with Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease. The major differences between both parasites seem to be the salivary gland location of the infective forms of T. rangeli, as compared with the rectal localization of the metacyclic trypomastigotes of T. cruzi, and the apparent lack of an intracellular stage in the mammal, in the case of the former parasite. The latter point suggest that some or all of the different factors postulated to be involved in recognition, adherence to, and penetration into the mammalian cell by T. cruzi trypomastigotes might be absent or strongly diminished in T. rangeli. Among a number of proposed virulence factors, cruzipain, the major cysteine proteinase of T. cruzi has been implied as an essential enzyme in several points of the biological cycle of the parasite, and may also be directly involved in penetration. For this reason, we decided to search for cysteine proteinase activities in epimastigotes of T. rangeli. We have purified to protein homogeneity cruzipain (from T. cruzi) and a cysteine proteinase (from T. rangeli), using affinity chromatography, both on cystatin-Sepharose, specific for cysteine proteinases, and ConA-Sepharose, specific for high mannose type N-linked glycoproteins, starting from crude epimastigote extracts. The latter enzyme is expressed at a level at least two orders of magnitude lower than is cruzipain in T. cruzi epimastigotes. Both enzymes have similar apparent molecular mass and identical N-terminal sequence, and cross-react immunologicaly, but differ in full sequence and in some kinetic parameters. Part II: The quality control of glycoprotein folding in Trypanosoma cruzi. N-glycoproteins are first glycosylated upon transfer of an oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2 in most cells) from a dolichol-P-P derivative to Asn residues in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). Protein-linked oligosaccharides are then processed in the same subcellular location by glucosidase I (GI) that removes the more external glucose (Glc) unit and glucosidase II (GII) that excises the two remaining Glc. An additional ER processing reaction is that catalyzed by the UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (GT). This enzyme adds a single Glc unit to Glc-free, high mannose-type oligosaccharides in glycoproteins not displaying their properly folded tertiary structures. GII deglucosylates the monoglucosylated oligosaccharides generated by GT. Glycoproteins acquire their proper tertiary structure in the ER. Glycoproteins that fail to properly fold are retained in the ER and further transported to the cytosol where they are degraded in the proteasomes. On the other hand, properly folded species may continue their transit through the secretory pathway to their final destinations. Two unconventional chaperones calnexin (Cnx) and calreticulin (Crt), have been described in the ER lumen of mammalian cells. It has been shown that interaction of Cnx/Crt with monoglucosylated glycoproteins facilitates glycoprotein folding in mammalian cells by preventing aggregation and suppressing formation of non-native disulfide bonds. Moreover, the above mentioned interaction provides one of the mechanisms by which cells retain misfolded glycoproteins in the ER. The Cnx/Crt interaction with monoglucosylated glycoproteins has been considered to be, therefore, a quality control of glycoprotein folding. This model predicts that inhibition of removal of the Glc unit added by GT would delay (or abolish) exit of glycoprotein from the ER. This prediction can not be tested, however, in most eukaryotic cells as GII is responsible for removal of both α(1,3) linked Glc units. Moreover, known inhibitors of GII also inhibit GI. Addition of those drugs to cells leads to the accumulation of oligosaccharides having two or three Glc that are not recognized by Cnx/Crt. The prediction can be tested in T. cruzi. This parasite transfers “in vivo” unglucosylated oligosaccharides (Man9GlcNAc2)to nascent polypeptide and, therefore, monoglucosylated oligosaccharides are formed in them only by GT. Cruzipain, a T. cruzi lysosomal cysteine proteinase having three potential N-glycosilation sites, at least two of which are occupied, was isolated in a glucosylated form from cells grown in the presence of the GI and GII inhibitor 1-deoxynojirimycin (DNJ). The oligosaccharide present at the single glycosylation site of the carboxy-terminal domain of cruzipain was glucosylated in some enzyme molecules but not in others, this result being consistent with an asyncronous folding of glycoproteins in the ER. In spite of not affecting cell growth rate or the cellular general metabolism in short and long term incubation, DNJ caused a maeked delay in the arrival of cruzipain to lysosomes. This results is compatible with the model proposed by which monoglucosylated glycoproteins may be transiently retained in the ER by lectin-like anchors recognizing monoglucosylated oligosaccharides. It was found also that this protozoan expresses a Crt-like molecule, the third component (in addition to GT and GII) of the quality control of glycoprotein folding. No Cnx-encoding gene was detected. Recombinant T. cruzi calreticulin specifically recognized free monoglucosylated high mannose-type oligosaccharides. Addition of anti-Crt serum to extracts obtained from cells pulse-chased with Metplus Cys immunoprecipitated two proteins that were identified as Crt and the lysosomal proteinase cruzipain. The latter but not the former protein disappeared upon chasing cells. Contrary to what happens in mammalian cells, addition of DNJ promoted Crt-cruzipain interaction. This result is consistent with the known pathway of protein N-glycosylation and oligosaccharide processing occurring in T. cruzi and explains the delay in cruzipain arrival to lysosomes caused by DNJ. A treatment of the Crt-cruzipain complexes with endo-β-N-acetylglucosaminidase H (Endo H) either before or after addition of anti-Crt serum completely disrupted Crt-cruzipain interaction. In addition, mature monoglucosylated but not unglucosylated cruzipain isolated from lysosomes was found to interact with recombinant Crt. It was concluded that T. cruzi Crt binds monoglucosylated oligosaccharides but not the protein moiety of cruzipain. Furthermore, evidence is presented indicating that GT glucosylated cruzipain at its last folding stages. Journal of Cell Biology 130, N° 4 (1995) 771-

Pereira, Claudio Alejandro. "Metabolismo de L-arginina en Trypanosoma cruzi" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Apartir de los resultados obtenidos en nuestro laboratorio sobre la modulación de la motilidad de los epimastigotes de Trypanosoma cruzi a través de los distintos efectores de la ruta metabólica del óxido nítrico, se planteó la necesidad de estudiar en forma más amplia el metabolismo del sustrato de la óxido nítrico sintasa, la L-arginina. Inicialmente se describió el transporte de este aminoácido en epimastigotes de T. cruzi en fase logaritmica de crecimiento. Se determinaron los parámetros cinéticos y sus características bioquímicas, siendo algunas de las más relevantes, las que se detallan a continuación: - El transportador presenta una alta afinidad por el sustrato (Km = 4.16 μM) en comparación con otros sistemas similares. - Es sumamente específico ya que no se inhibe competitivamente en presencia de aminoácidos naturales como así tampoco por análogos estructurales de la arginina. Sólo se observó una disminución significativa en la incorporación de L-arginina en presencia de homoarginina, canavanina y D-arginina. - Es saturable por sustrato, independiente de Na+,pero dependiente de ATP. - Es afectado en forma específica por el tiempo de "ayuno"de L-arginina. Cuando se estudió el destino de la arginina incorporada a las células en 30 minutos, se observó que el 4.3% se incorpora a proteínas, el 68.6% queda formando parte del conjunto de aminoácidos libres y un 27.1% se identificó como fosfoarginina. La presencia de fosfoarginina como fosfágeno involucrado en la regeneración del ATP,hidrolizado principalmente en el flagelo del parásito, explica probablemente la necesidad de un transportador específico de las caracteristicas descriptas. La relevancia de esta actividad biológica como posible blanco terapéutico tripanosomicida está dada por ser éste un sistema diferencial entre el parásito y el hospedador humano, quien carece de esta enzima pues utiliza la creatina como fosfágeno. Estas evidencias nos llevaron a centrar el interés del trabajo en el sistema transportador de arginina y la enzima arginina kinasa. En la segunda parte del trabajo se caracterizó bioquímicamente la enzima arginina kinasa. Se midió la actividad enzimática tanto in vivo como In vitro, se determinó su localización subcelular y sus parámetros cinéticos (Km para arginina, 0.33 mM y para ATP 0.31 mM). Se purificó parcialmente la actividad arginina kinasa en dos pasos cromatográficos, uno de intercambio iónico y el segundo de filtración molecular. También se estudiaron sus requerimientos de ATP y cationes bivalentes. Se ensayaron in vitro inhibidores potenciales de la enzima, siendo los más relevantes,el análogo natural canavanina, la homoarginina y la histidina. Se analizó también la presencia de la arginina kinasa en otros organismos, encontrándose dicha actividaden otras cepas y especies del género Trypanosoma y también en los denominados “trypanosomátidos inferiores" como Herpetomonas y Leptomonas. Finalmente se clonó el gen que codifica para la arginina kinasa de T. cruzi utilizando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)y rastreo en bibliotecas genómicas. El gen de 1074 pb codifica para una proteína de 357 aminoácidos y un peso molecular de 40 kDa (GenBank # AF070451),el cual probablemente se encuentre como copia única dentro del genoma. El análisis de la secuencia obtenida demuestra un alto grado de conservación evolutiva. El gen completo de la enzima se expresó en un sistema heterólogo (Escherichia coll) demostrándose actividad arginina kinasa de la proteína recombinante.

Semenas, Liliana Graciela. "Estructura comunitaria de parásitos en Galaxias maculatus (Pisces, Galaxiidae) y Percichthys trucha (Pisces, Percichthyidae) de lago Escondido (Río Negro, Argentina)" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se estudiaron durante 2 años los ecto y los endoparásitos de Galaxias maculatus y de Percichthys trucha en un ambiente andino oligotrófico, el lago Escondido, para caracterizar comunidades de parásitos en peces autóctonos de Patagonia. Los peces presentaron buen estado sanitario y características tales como sexo, peso, talla y edad fueron similares a las registradas en otras poblaciones de estas especies en lagos andinos. Se registraron un total de 26 taxones, de los cuales 16 parasitaron al puyen y 17 a la perca. Diplodon chilensis (Mollusca). Ergasilus síeboldi (Crustacea), Derogenes patagonicus, Tylodelphys barilochensis (Digenea) y Camallanus corderoí (Nematoda) se encontraron en ambos; Phílureter trigonopsis, Gymdactylus sp (Monogenea), Posthodiplostomum sp, metacercarias de Acanthostomoídes apophalliformis (Digenea), Contracaecum sp (Nematoda) y Nippotaenia sp (Cestoda) en puyen y adultos de Acanthostomoídes apophalliformis, Polylekithum sp (Digenea). Philonema percihthydis, Hysterothylacium patagonense (Nematoda), Acolpenteron sp y Tetracleídus sp (Monogenea) en perca. El gloquidio de D. chilensis ocupó el mayor número de localizaciones en ambos peces y la branquia fue el órgano con el mayor número de especies parásitas. De un total de 8 gremios, reconocidos en el presente trabajo, los parásitos del puyen conformaron 7 y los de las percas, 6. Las distribuciones presentaron un buen ajuste a la Binomial Negativa y las especies mayoritariamente endoparásitas y autogénicas. tienen ciclos heteroxenos. Los reclutamientos presentaron 2 máximos y uno de ellos se produjo durante los meses más cálidos. La abundancia y la intensidad media presentaron diferencias significativas en todas las especies. Las variaciones de la edad fueron importantes para las variables infrapoblacionales, infracomunitarias y de las comunidades componentes. La presencia de especies centrales fue escasa. Los valores de la dominancia, la riqueza, la diversidad, la equitabilidad, la similitud y la estabilidad fueron intermedios. Las características analizadas indicaron que los parásitos de peces del lago Escondido estarían en el continuo entre comunidades aislacionistas e interactivas, de modo que sus patrones no son totalmente estructurados ni totalmente estocásticos.

Abstract:
Ecto and endoparasites of Galaxias maculatus and Percíchthys trucha from lake Escondido, an oligotrophic andean lake, were studied during two years in order to charactenze parasite communities in autochthonous freshwater fishes from Patagonia. Fishes had a good sanitary condition and their population characteristics (sex, length, weigh and age) were similar to those registered for these species in other andean lakes. A total of 26 parasite species were registered, of these 16 were in puyen and 17 in perca. Diplodon chilensis (Mollusca), Ergasilus sieboldí (Crustacea), Derogenes patagonicus, Tylodelphys barilochensis (Digenea) and Camallanus corderoi (Nematoda) were ¡n both hosts, Philureter trigonopsis, Gymdactylus sp. (Monogenea), Posthodiplostomum sp., metacercariae of Acanthostomoídes apophalliformis (Digenea), Contracaecum sp. (Nematoda) and Nippotaenía sp. (Cestoda) in puyen and adult of Acanthostomoides apophallifonnis, Polylekithum sp. (Digenea), Philonema percíhthydis, Hysterothylacium patagonenese (Nematoda), Acolpenteron sp. and Tetracleidus sp. (Monogenea) in perca. The glochidium of D. chilensis had the greatest distribution among sites and, gills were the site parasitized by more species. Parasites defined 8 guilds, 7 of these were in puyen and 6 in perca. ln general, cycles were heterexoneous with autogenic endoparasites and distribution of species had a good fit to Negative Binomial. Recruitments had 2 maximums, one of which took place during the warm period. Significative differences were registered for median abundance and intensity for all the species. Variations of age were an important factor not only for infrapopulations variables but for infracommunities and component communities, too. There were few core species. Values of dominance, diversity, richness, equitability, similarity and stability were medium. All these characteristics showed parasites in lake Escondido were in the continuum between interactive and aislacionist communities so patterns found were neither structured nor stochastic.

Título :	Estructura comunitaria de parásitos en Galaxias maculatus (Pisces, Galaxiidae) y Percichthys trucha (Pisces, Percichthyidae) de lago Escondido (Río Negro, Argentina)
Autor :	Semenas, Liliana Graciela
Director :	Ostrowski, Margarita de Núñez
Año :	1999
Editor :	Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación :	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Biología
Grado obtenido :	Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación :	Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3160_Semenas
Idioma :	Español
Area Temática :	Biología / Parasitología Biología / Ecología
Palabras claves :	GALAXIAS MACULATUS (PUYEN CHICO); PERCICHTHYS TRUCHA (PERCA DE BOCA CHICA); MONOGENEA (PHIURETER TRIGONOPSIS, GYRODACTYLUS SP, ACOLPENTERON SP, TETRACLEIDUS SP); DIGENEA (DEROGENES PATAGONICUS, TYLODELPHYS BARILOCHENSIS, T. CRUBENSIS, ACANTHOSTOMOIDES APOPHALLIFORMIS, POSTHODIPLOSTOMUM SP, POLYLEKITHUM SP); CESTODA (NIPPOTAENIA SP); NEMATODA (CAMALLANUS CORDEROI, CONTRACAECUM SP, PHILONEMA PERCIHTHYDIS, HYSTEROTHYLACIUM PATAGONENSE); MOLLUSCA (DIPLODON CHILENSIS); CRUSTACEA (ERGASILUS SIEBOLDI); DISTRIBUCION; LOCALIZACION; GREMIO; CICLO DE VIDA; INFRAPOBLACION; INFRACOMUNIDAD; COMUNIDAD COMPONENTE; CONJUNTO ESTOCASTICO; CONJUNTO ESTRUCTURADO; GALAXIAS MACULATUS (PUYEN CHICO); PERCICHTHYS TRUCHA (PERCA DE BOCA CHICA); MONOGENEA (PHIURETER TRIGONOPSIS, GYRODACTYLUS SP, ACOLPENTERON SP, TETRACLEIDUS SP); DIGENEA (DEROGENES PATAGONICUS, TYLODELPHYS BARILOCHENSIS, T. CRUBENSIS, ACANTHOSTOMOIDES APOPHALLIFORMIS, POSTHODIPLOSTOMUM SP, POLYLEKITHUM SP); CESTODA (NIPPOTAENIA SP); NEMATODA (CAMALLANUS CORDEROI, CONTRACAECUM SP, PHILONEMA PERCIHTHYDIS, HYSTEROTHYLACIUM PATAGONENSE); MOLLUSCA (DIPLODON CHILENSIS); CRUSTACEA (ERGASILUS SIEBOLDI); DISTRIBUTION; SITE; GUILDS; LIFE CYCLES; INFRAPOPULATIONS; INFRACOMMUNITIES; COMPONENT COMMUNITIES; SOCHASTIC - STRUCTURED ASSEMBLAGES
URL al Documento :	http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3160_Semenas.pdf
URL al Registro :	http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3160_Semenas

Wilkowsky, Silvina Elizabeth. "Trypanosoma cruzi : transducción de señales y transporte endocitico en la interacción parásito-célula huésped" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Durante la invasión del Trypanosoma cruzi se producen alteraciones tanto en la célula huésped como en el parásito para facilitar el éxito de dicha invasión y el establecimiento del mismo en esa célula. En el análisis de estos temas se ha arribado a las siguientes conclusiones: El aumento citosólico del Ca²+ en la célula huésped es necesario para la invasión. La señal disparadora se encuentra en membranas parasitarias sólo del estadío infectivo. Se determinó la participación de una proteína G heterotrimérica del tipo Gαᵢ de la célula huésped que estimula la invasión. El contacto de la célula huésped con membranas del estadío infectivo produce un aumento de la actividad de la fosfatidilinositol 3 kinasa (PI3K) necesaria para la invasión. Existe también una activación temprana de la proteína blanco de la PI3K, la proteína kinasa B (PKB),que se confirma por el aumento de la invasión en células PKB+ y la disminución en PKB-. La participación de las proteínas Rab 5 y Rab 7 (marcadoras de endosomas tempranos y tardíos respectivamente) en la invasión se confirmó por microscopía confocal y experimentos en células transfectadas. Además, la PI3K y las proteínas Gαᵢ y Gαs, ,también presentes en el parásito, tienen influencia definitoria sobre su capacidad invasiva.

Abstract:
Several modifications are induced in the host cell and the parasite during Trypanosoma cruzi invasion that facilitate this process and further parasite establishment. The analysis of these issues led to the following conclusions : A cytosolic Ca²+ increase in the host cell is necessary for parasite invasion. The triggering signal is present in the parasite membrane of the infective stage only. The participation of a host heterotrimeric G protein, Gαᵢ, that is involved in parasite invasion was determined. The contact between host cells and membranes of the infective stage induce a host phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) activation that was necessary for succesful invasion. There is also an early activation of protein kinase B (PKB) which is a target of PI3K. This fact is confirmed by increased infection percentages in transfected PKB+ cells and decreased values in PKB-cells. The host proteins Rab 5 y 7 (early and late endosome markers respectively), are involved in parasite invasion. This fact was confirmed by confocal microscopy and infection experiments with Rab 5 and Rab 7-transfected cells. Besides. T. cruzi's PI3K, Gαᵢ and Gαs have a definitive role on its infective capacity.

Gómez, Eliana Beatriz. "Clonado y caracterización de quinasas relacionadas con la CDC2 en el parásito Trypanosoma cruzi" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Castañera, Mónica Beatriz. "Contribución de los perros a la transmisión de Trypanosoma cruzi en un área rural de Argentina: demografía, rol centinela y modelado matemático" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los perros son los principales reservorios domésticos de Trypanosoma cruzi, el agente causal de la Enfermedad de Chagas. Con el objetivo de estudiar la dinámica poblacional de los perros de Amamá y localidades vecinas (Provincia de Santiago del Estero, Argentina), se realizaron 8 censos cada 6 meses desde Mayo de 1994 a Diciembre de 1997. La abundancia varió muy poco entre años desde 294 hasta 345 perros. La tasa instantánea de crecimiento poblacional (r = 0,016/semestre) no fue significativamente diferente de 0. El 96% de las viviendas habitadas tenían uno o más perros (media, 3,1 perros por casa). La distribución de edades presentó una estructura estable, con un 76% de perros con 3 o menos años de edad, y un 75% de machos. Un 34% de las hembras tuvieron al menos una parición en los 6 meses previos, con una camada promedio de 5,1 cachorros que no fluctuó estacionalmente. En un análisis de factores clave de mortalidad, el sacrificio de los cachorros fue el único factor estadísticamente significativo, pero no se halló evidencia de que actuara en forma densodependiente. La probabilidad de morir específica por edades tuvo la típica forma en U de los mamíferos grandes, y fue superior en las hembras que en los machos. La población de perros se hallaría en estado estacionario y regulada por los propietarios mediante la manipulación de la tasa de mortalidad de los cachorros recién nacidos, especialmente hembras. La reacción de inmunoensayo enzimático (ELISA)fue utilizada para detectar anticuerpos específicos anti-T. cruzi en sueros de 182 perros mestizos rurales también analizados por hemoaglutinación e inmunofluorescencia indirectas. El 86% de los sueros tuvieron resultados concordantes para todas las técnicas serológicas. La especificidad de ELlSA fue del 96,2%. Entre 34 perros adultos con xenodiagnóstico positivo, la sensibilidad estimada fue del 94% para ELlSA e IFI. ELISA es la técnica de elección para la vigilancia serológica de infecciones por T. cruzi en poblaciones de perros de áreas que han sido rociadas con insecticidas. Se investigó si el perro podría ser un eficaz centinela de la transmisión vectorial de T. cruzi en el contexto de la fase de vigilancia. La seroprevalencia global de T. cruzi en la población canina disminuyó del 65,0% (54/83) en 1992, antes de un rociado con deltametrina, al 38,5% (70/182) en 1994, y al 15.2% (36/237) en 1996. Se registraron 12 cachorros nativos infectados nacidos después del rociado. De 13 variables consideradas en un análisis por regresión logística múltiple, las que resultaron significativamente asociadas con la probabilidad de estar infectado fueron (i) el número de Triatoma guasayana capturado en el domicilio para el período 1993-94, y (ii) la seropositividad a T. cruzi de la madre, y el número de perros cohabitantes infectados para 1995-96. La evidencia sugiere que los casos nuevos de infección podrían explicarse por diferentes rutas de transmisión que implicarían a T. guasayana como un vector secundario durante la vigilancia. Con el objetivo de investigar la contribución de los animales domésticos a la transmisión vectorial de T. cruzi, se construyó un modelo matemático de la dinámica poblacional de Triatoma infestans estructurado por estadios, a tiempo continuo, con una dependencia respecto de la temperatura en el tiempo de desarrollo de cada estadio y en la tasa de oviposición de las hembras. y que incorpora estocasticidad demográfica. La abundancia de T. infestans presentó fluctuaciones estacionales con un pico de densidad en los meses de verano. La abundancia promedio de triatominos en la vivienda y la amplitud de las oscilaciones dependió del tipo y número de hospedadores presentes. La incorporación de una gallina durante la estación cálida produjo un incremento del 40% en la densidad promedio de triatominos y oscilaciones de mayor amplitud. Cuando se enfrentó a humanos y perros susceptibles a distintas prevalencias de infección por T. cruzi en el vector, los perros se infectaron más rápidamente que los humanos. La inclusión de estocasticidad demográfica permitió una buena descripción de la evolución del sistema, estimar la probabilidad de que el sistema persista y de la ocurrencia de un evento de infección.

Abstract:
Dogs are the main domestic reservoirs of Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease. To study the population dynamics of dogs from Amamá and neighboring villages (Province of Santiago del Estero, Argentina), 8 censuses were carried out each 6 months from May 1994 to December 1997. The abundance varied very little over years, from 294 to 345 dogs. The instantaneous rate of population increase (r = 0.016/semester) was not significantly different from 0. Ninety nine percent of the inhabited houses owned at least a dog (mean, 3.1 dogs per house). The age distribution was stable, with 76% of dogs aged 3 or less years, and 75% of males. One-third of the females had at least one litter in the preceding 6 months, with a mean litter size of 5.1 pups that did not fluctuate seasonally. Key factor analysis showed that slaughtering of newborn pups was the sole statistically significant factor, but no evidence of a density-dependent relationship was found. The age-specific probability of dying had the typical U-shape of large mammals, and was greater in females than in males. The dog population was in a stationary state, regulated by the owners through manipulation of the mortality rate of recently born pups, especially females. An immunosorbent enzymatic assay (ELISA) was used to detect specific antibodies against T. cruzi in sera from 182 rural dogs that were also examined by indirect hemagglutination and immunofluorescence (IFI). 86% of sera showed concordant results for all serologic techniques. ELISA specificity was 96.2%. Among 34 adult dogs with a positive xenodiagnosis, a 94% sensitivity was estimated for ELISA and IFI. ELISA is the assay of choice for serological surveillance of T. cruzi infection in dog populations residing in areas that had been sprayed with insecticides. I investigated whether the dog could be an effective sentinel of the vectorial transmission of T. cruzi during the surveillance phase. The overall seroprevalence of T. cruzi in the dog population decreased from 65.0% (54/83) in 1992, before the deltamethrin spraying, to 38.5% (70/182) in 1994, and 15.2% (36/237) in 1996. A total of 12 pups infected with T. cruzi were detected among native pups born after the spraying. Of 13 variables considered in logistic multiple regression analysis, those that were significantly related to the likelihood of being infected were (i) the number of Triatoma guasayana captured in domestic areas during 1993-94, and (ii) seroreactivity to T. cruzi of the mother, and the number of infected dogs in the household during 1995-96. The evidence suggests that the occurrence of new cases might be explained by different transmission routes that would also implicate T. guasayana as a secondary vector during the surveillance phase. To investigate the contribution of domestic animals to the vectorial transmission of T. cruzi, a mathematical model of the stage-structured population dynamics of Triatoma infestans was built. The model included temperature-dependent developmental times for each stage and female fecundity, and demographic stochasticity. The abundance of T. infestans fluctuated seasonally with a peak in the summer. The mean abundance of bugs in the house and the amplitude of oscillations depended on the type and number of available hosts. Introduction of a hen during the warm season produced a 40% increase in the mean density of bugs and oscillations of greater amplitude. When susceptible humans and dogs faced different prevalence rates of T. cruzi infection in the bugs, the dogs acquired the infection sooner than humans. Inclusion of demographic stochasticity allowed a good description of the system evolution, estimation of the probability of persistence, and the occurrence of an infection event.

Díaz Añel, Alberto Marcelo. "Caracterización de una ARN Helicasa de Trypanosoma cruzi clonada por el método de Differential Display" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Una de las últimas técnicas aplicadas en biología molecular para detectar diferentes niveles de transcripción en distintos estadios de un mismo tipo celular es el Differential Display. Este ensayo se basa en la técnica de RT-PCR, utilizando un oligo dT “anclado” que se une al nacimiento del pon A+ de los ARN mensajeros, y un oligonucleótido corto de secuencia al azar que, en diferentes combinaciones, van a amplificar un set de bandas característico para cada par de oligos elegidos. Estas reacciones se corren en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y se observan por autorradiografía. De esta forma se comparan ambos estadios celulares y se recuperan del gel aquellas bandas que muestren una amplificación diferencial como producto de distintos niveles de ARN mensajeros. Utilizando el Differential Display en los estadios no infectivo (epimastigotes) e infectivo (trypomastigotes metacíclicos) del parásito Trypanosomacruzi, causante de la enfermedad de Chagas, se purificaron varias bandas de expresión diferencial. Una de ellas aplicada como sonda en un Northern-blot demostró tener una transcripción entre 8 y 9 veces mayor en trypomastigotes metacíclicos. A partir de una biblioteca genómica realizada en el bacteriófago A Fix, se aisló un clon positivo para esta banda que, una vez secuenciado y comparado en bancos de datos, dió una homología de hasta el 46 % a nivel de aminoácidos con diferentes ARN helicasas. Estas proteínas pertenecen a la familia de las proteinas DEAD Box y participan en el relajamiento de estructuras de ARN doble cadena. Por lo tanto son importantes en procesos como transcripción, traducción, ensamblado de ribosomas, splicing y editing.Además se ha descripto su participación en diferenciación y desarrollo celular, por lo cual se abre un campo muy importante con en el estudio de la participación de estas proteinas en los procesos de metaciclogénesis e infectividad del Trypanosoma cruzi. Por otro lado se demostró por Southern-blot que, a diferencia de la mayoría de los genes conocidos de Trypanosoma cruzi, el gen de esta ARN helicasa es de única copia en el genoma. Ensayos de Cromo-blot con ia región que codifica al carboxilo terminal de la proteína mostraron que este gen se encuentra representado en por lo menos nueve cepas del parásito. Por último, se demostró que esta ARN helicasa posee una especificidad enzimática con dirección 3’-5’ sobre transcriptos realizados in-vitro, con una aparente independencia de ATP o GTP, como ocurre con algunos miembros de esta familia El descubrimiento de este gen de transcripción diferencial entre ambos estadios de la metaciclogénesis de T. cruzi y la caracterización parcial de su función enzimática, son el principio para estudiar su participación en la diferenciación y/o infectividad de este parásito y nos permitirá conocer un poco más de este proceso del cual se sabe tan poco y que es parte del comienzo de la enfermedad de Chagas en los huéspedes vertebrados, entre ellos el hombre.

Abstract:
One of the last techniques applied in molecular biology to detect different transcription levels in different stages of one cellular type is the Differential Display. This assay is based on the technique of RT-PCR, using an oligo dT “anchored” that anneals to the birth of the messenger RNAs poly A, and a short oligonucleotide of at random sequence that, in different combinations, they will amplify a characteristic set of bands for each couple of selected oligos. These reactions are run on a dennaturing polyacrylamide gel and they are observed by autoradiography. This way both cellular stages are compared and we can recover of the gel those bands that show a differential amplification as product of different levels of messenger RNAs. Using the Differential Display in the stages non infective (epimastigotes) and infective (metaciclic trypomastigotes) of the parasite Trypanosoma cruzi, causing of the Chagas’ illness, we purified several bands of differential expression. One of them applied as probe in a Northern-blot demonstrated to have a transcription level between 8 and 9 times higher in metaciclic trypomastigotes. Starting from a genomic library carried out in A Fix bacteriophage, a positive clone was isolated for this band that, once sequenced and compared in databases, showed an homology of until 46% at level of aminoacids with different RNA helicases. These proteins belong to the family of the DEAD Box proteins and they participate in the relaxing of RNA double chain structures. Therefore they are important in processes like transcription, translation, ribosome assembling, splicing and editing. Also it has been described their participation in diferentiation and cellular development, reason why a very important field opens up with in the study of the participation of these proteins in the metaciclogénesis processes and infectivity of Trypanosoma cruzi. On the other hand it was demonstrated by Southern-blot that, contrary to most of the well-known genes of Trypanosoma cruzi, the gene of this RNA helicase is single copy in the genome. Assays of Chromo-blot with the region that codes to the carboxy terminal of the protein, showed that this gene is represented in at least nine strains of the parasite. Lastly, it was demonstrated that this RNA helicase possesses an enzymatic specificity with 3’-5' direction with transcripts carried out in-vitro, with an apparent independence of ATP or GTP, like it happens with some members of this family. The discovery of this gene of differential transcription between both stages of the T. cruzi metacyclogenesis, and the partial characterization of their enzymatic function, is the principle to study their participation in the diferentiation and/or infectivity of this parasite, and it will allow to us to know a little more about this process of which is known so little and that it is part of the beginning of the Chagas’ illness in the vertebrate guests, among them the man.

Silber, Ariel M.. "Identificación de dos moléculas de Trypanosoma cruzi involucradas en la invasión de las células del huésped" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Cremona, María Laura. "TRANS-SIALIDASA en Trypanosoma cruzi: estudio de la estructura y función de esta familia de antígenos de superficie" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enfermedad de Chagas es una de las parasitosis endémicas más importantes de América. Dieciocho millones de personas infectadas releva un informe reciente de la Organización Mundial de la Salud (WHO, 1998). Tryparzosoma cruzzi es el parásito responsable de esta enfermedad. Presenta en su superficie la trans-sialidasa, una enzima unida a la membrana por un enlace glicofosfatidilinositol. Esta enzima le otorga la capacidad de adquirir ácido siálico a partir de sialiglicoconjugados del organismo que infecta, ya que T cruzles incapaz de sintetizar este monosacárido. La trans-sialidasa fue involucrada en aspectos clave de la infección y la supervivencia del parásito en sangre. La familia de proteínas de la trans-sialidasa está codificada por al menos 140 genes que pueden clasificarse en tres sub-familias de acuerdo a la estructura y la función de sus productos proteicos. Dos de estos grupos son expresados en tripomastigotes, la forma infectiva del parásito, y se distinguen en su capacidad de trans-glicosidar: las trans-sialidasas activas y las trans-sialidasas inactivas. La comparación de la secuencia de la región N-terminal de proteínas de ambos grupos permitió deducir que la sustitución Tyr-His en la posición 342 de la proteína madura determina su capacidad de actuar como trans-sialidasa. Esta tirosina es imprescindible para que la molécula pueda actuar como enzima y su reemplazo por histidina, residuo presente en los integrantes de la familia sin actividad enzimática, determina la pérdida total de la capacidad trans-glicolítica. Además de la Tyr342,otro aminoácido, Pro231, también es necesario para la actividad enzimática: el cambio Pro231Ala resulta en una trans-sialidasa parcialmente activa con respecto a la enzima natural. Se examinó la capacidad de las proteínas inactivas para unir ácido siálico y galactosa en un ensayo de aglutinación y se comprobó que las trans-sialidasas enzimáticamente inactivas aglutinan glóbulos rojos desialidados que presentan betagalactosas terminales, la misma especificidad que requiere la enzima. La trans-sialidasa podría definirse como una sialidasa particular. En lugar de hidrolizar ácido siálico lo transfiere preferencialmente a beta-galactosas terminales presentes en glicoproteínas y glicolípidos y difiere de las sialil y glicosil-transferasas conocidas en que no requiere un nucleótido-azúcar como dador. De los 16 aminoácidos que constituyen el sitio activo de la sialidasa de Salmonella typhimurium, 14 aminoácidos, incluyendo la Tyr342, están presentes en las mismas o en similares posiciones en la estructura primaria de la trans-sialidasa. Tryparzosoma rangeli, parásito de origen americano no patógeno para el hospedador humano, libera al medio una sialidasa cuya secuencia primaria es 70 % homóloga a la trans-sialidasa de T. cruzi La estructura cristalográfica de la sialidasa obtenida en nuestro laboratorio permitió obtener el modelo de la trans-sialidasa. La comparación de ambas estructuras permitió la identificación de unos pocos aminoácidos que modularían la actividad de transferencia. Los experimentos de mutagénesis dirigida sugirieron la presencia de un sitio distinto de unión para el carbohidrato aceptor del grupo sialilo, y una probable diferencia en la arquitectura de ambos sitios activos.

Abstract:
Trypanosoma cruzzi is the protozoan haemoflagelate responsible for Chagas’ disease, which affects almost 18 million people in America, as reported recently by the World Health Organization (WHO, 1998). T. cruzzi trypomastigotes acquire sialic acid from host glycoconjugates by means of a plasma membrane associated trans-sialidase, as it is unable to synthesize this sugar. This enzyme differs from all other known sialyl- and glycosyl- transferases in that it does not require a nucleotide sugar as donor. It has been involved in key aspects of parasite’s infection and survival. This enzyme belongs to a large family of proteins encoded by at least 140 genes. These proteins contain the enzymatic region at the N-terminus, the only one required for trans-sialidase activity and an antigenic domain on the C-terminus. Some members of the family lack the enzymatic activity. Gene encoding inactive members are not a few, but rather are present in the same copy number, 60-80 per haploid genome, as those encoding active trans-sialidase. The complete sequences of the enzymatic region of active an inactive members were compared and it showed a limited divergence among them: 20 out of the 642 amino acids in the region were found to differ. From these 20 amino acids, only one was found to be essential for enzymatic activity. A Tyr residue at position 342 of the mature protein is deduced in active proteins while an His at the same position is present in inactive ones. This naturally occurring Tyr324His substitution completely abolished trans-sialidase activity. In addition to Tyr, a second amino acid, Pro231, was found to be necessary for full enzymatic activity. A Pro231Ala change rendered the trans-sialidase protein partially active. Recombinant inactive proteins were purified and assayed for sialic acid and galactose binding activity in agglutination tests. The enzymatically inactive trans-sialidases were found to agglutinated de-sialilated erythrocytes but not untreated red blood cells. Assays made with mouse and rabbit red blood cells suggest that inactive trans-sialidases bind to beta, rather than alpha terminal galactoses, the same specificity required by active trans-sialidases. At least some molecules in the trans-sialidase family that have lost their enzymatic function still retain their Gal-binding properties and might have a function as lectins in the parasite-host interaction. The trans-sialidase could be defined as a particular sialidase that, instead of hydrolyzing sialic acid, it preferentially transfers the monosaccharide to a terminal beta-galactose in glycolipids and glycoproteins. Fourteen amino acids residues, including Tyr342, out of the 16 amino acids that build the active site of the sialidase from Salmonella typhymurium, are present at the same or similar positions in the primary structure of trans-sialidase. The crystal structure of the sialidase from the closely related American trypanosome T. rangeli allowed the modeling of T. cruzi trans-sialidase. Comparison of these structures allowed the identification of few amino acids that may modulate transferase activity. Mutagenesis experiments suggest the presence of a distinct binding site for the acceptor carbohydrate and different arquitectural arrangements of both active sites.

Di Noia, Javier Marcelo. "Familias de genes que codifican proteínas de tipo mucina en Trypanosoma cruzi" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las mucinas son glicoproteínas cuyo esqueleto proteico está densamente cubierto por oligosacáiidos unidos a Thr y Ser. Los azúcares representan hasta un 80% de la molécula, confiriéndole una estructura extendida y un fuerte carácter hidrofílico. Participan en procesos de protección, lubricación y adhesión. Trypanosoma cruzi posee proteínas de tipo mucina en la superficie en todos sus estadios. En por lo menos dos de ellos las mucinas son las principales glicoproteínas de membrana y funcionan como aceptores de ácido siálico, azúcar que el parásito obtiene de glicoconjugados del medio mediante la trans-sialidasa, una enzima solo presente en Tripanosomátidos. Dado que el ácido siálico es importante en diversos procesos relacionados con la infección del parásito a vertebrados, el objetivode esta tesis fue caracterizar los genes de las mucinas de T. cruzi. Se describieron dos familias de genes tipo mucina en el parásito. La primera, denominada TcMUC, es muy compleja y polimórfica con unos 500 genes por genoma haploide. Esta familia puede dividirse en tres grupos de genes que comparten las regiones correspondientes al amino y carboxilo terminal del producto deducido, y que codifican para un péptido señal y para una señal de anclaje por glicosilfosfatidil inositol (GPI), pero difieren en su región central. El grupo I posee un número variable de repeticiones con la secuencia T8KP2 como región central. El grupo II posee regiones centrales no repetitivas pero diferentes para cada miembro, seguidas por repeticiones degeneradas ricas en Thr. El grupo III es homogéneo y no posee repeticiones de ningún tipo. Los productos derivados de los genes del grupo I y II presentan una región hipervariable en su amino terminal debida a la acumulación localizada de mutaciones. El análisis de la expresión de los genes mostró que los ARNm del grupo I se expresan en mayor abundancia en el estadío de tripomastigote mientras que los del grupo II pueden variar según cada miembro. Los productos de los genes del grupo I se identificaron como mucinas ancladas en la membrana por GPI. Sueros de ratones infectados reconocieron proteínas recombinantes del grupo I, indicando que las mucinas codificadas están efectivamente presentes en los estadios relacionados con la infección. De la misma forma, sueros de infección de ratones, humanos y conejos reconocieron algunas regiones hipervariables de mucinas del grupo I indicando que están presentes en la proteína madura y que más de una puede expresarse durante el curso de la infección. Dado que las repeticiones están muy O-glicosiladas deben adoptar una estructura extendida, con el N-terminal hipervariable como extremo externo y su C-terminal anclado a la membrana por GPI. La segunda familia, denominada TcSMUG, es mucho menos compleja, con alrededor de 70 genes por genoma haploide. Está compuesta por dos grupos de genes, denominados S y L, dispuestos en tándems independientes en el genoma. Los productos S y L están estructuralmente muy relacionados pero poseen una regulación diferencial específica de estadío de la abundancia del ARNm, ejercida al nivel de la estabilidad del mensajero. El ARNm del grupo S esta presente en los estadios relacionados con el insecto vector. El ARNm del grupo L está presente en todos los estadios pero es mucho más abundante en los estadios capaces de replicarse. Las proteínas deducidas de esta familia poseen regiones centrales compuestas por repeticiones (grupo L) o no repetidas (grupo S), pero ambas con un contenido alrededor del 50% en Thr y con una estructura muy similar a una apomucina. Sus productos poseen un peso molecular alrededor de 7.000 descontando las señales de importación al reticulo endoplasmático y de anclaje por GPI. La secuencia deducida de las proteinas del grupo S coincide con secuencias de péptidos obtenidos en otro laboratorio a partir de mucinas purificadas del estadio epimastigote. Se identificaron entonces genes que codifican mucinas de los estadios trlpomastigote sanguíneo (TcMUC grupo I) y epimastigote (TcSMUG grupo S). Si bien ambos grupos están estructuralmente muy relacionados, el parásito regula la expresión de ambos de acuerdo al hospedador y, mientras que las mucinas expresadas en el insecto son homogéneas en secuencia aquellas expresadas en el vertebrado poseen en la región más expuesta epitopes que varían entre los diferentes miembros de la familia.

Abstract:
Mucins are glycoproteins whose protein core is densely O-glycosylated in Thr and Ser residues. Sugars account for up to the 80% of the molecular mass, conferring it an extended structure and a strong hydrophilic character. They can be a protective barrier. serve for lubrication and act as adhesion molecules. Trypanosoma cruzi has mucin-type molecules on the surface of all its stages. In at least two of them, mucins are the main surface glycoproteins and sialic acid acceptors. This sugar is transferred to the parasite mucins from glycoconjugates at the medium by a unique Trypanosomatids-specific enzyme called trans-sialidase. Given that sialic acid is important in infection related processes the main objective of this Thesis was to characterize mucin genes in T. cruzi. Two mucin-type gene families were described. The first one, named TcMUC, is very complex and polymorphic with about 500 genes per haploid genome. There are three groups of genes within this family that share the regions corresponding to N and C termini of the deduced product, encoding a signal peptide and a GPI anchor signal respectively, but that differ in their central region. Group I central region is composed of a variable number of tandem repeats with the consensus sequence T8KP2. Each member of Group II has unique non-repetitive central regions followed by degenerated Thr-rich repeats. Group III is homogeneous and has no Thr runs. The products derived from Groups I and II have a hypervariable mature N-terminus due to the localized accumulation of mutations. Gene expression analyses showed that Group I is highly expressed in the cell-derived trypomastigote stage while Group II can vary in abundance among stages depending on the studied member. Group I gene products were identified as mucins GPI anchored to the parasite membrane. Infected mice sera recognized recombinant Group I proteins, indicating that mucins encoded by them are present in the stages of the parasite present during the infection. In the same way, mice, human and rabbit infection sera recognized some hipervariable regions from Group I mucins suggesting that they are present in the mature protein and that more than one can be expressed during the infection. Given that the Thr-rich repeats are highly O-glycosylated they must adopt an extended structure. with the hypervariable N-terminus as external end and GPI anchored to the membrane by its C-terminal end. The second family, named TcSMUG, is much less complex with about 70 genes per haploid genome. It is composed of two groups of genes, named S and L, arranged in independent tandems in the genome. The S and L products are structurally related but have differential stage-specific regulation of their mRNA abundance determined by mechanisms affecting their mRNA stability. Group S mRNA is present in the insect related stages. Group L mRNA is present in all the stages but is much more abundant in the replicative ones. Deduced proteins have central regions composed of tandem repeats (group L) or non-repeated sequences (group S) but both with about 50% Thr content. and with an apomucin-like structure. Their products have a molecular mass around 7 kDa without the signal and GPI anchor peptides. The sequence deduced from proteins of the group S matched peptide sequences obtained elsewhere from epimastigote purified mucins so having a positive identification. Then, genes encoding mucins from tripomastigote (TcMUC group I) and epimastigote (TcSMUG group S) stages were identified. Yet both groups are structurally related, their expression is regulated in a stage-specific manner in the parasite, according to the host. While those expressed in the insect are homogeneous in sequence, those expressed in the vertebrate that are targets of the immune response have variant epitopes in their exposed N-temini.

López Bergami, Pablo. "Estudio molecular y funcional de la patología cardíaca inducida por inmunización con proteínas ribosomales P de Trypanosoma cruzi" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estudio de la respuesta inmune contra las proteínas ribosomales P de Trypanosoma cruzi en el suero de pacientes chagásioos crónicos sugirió que esta respuesta inmune podria jugar un importante rolen el desarrollo de la cardiomiopatía chagásica. En función de esos resultados se encaró una tarea de clonado de las proteinas ribosomales P213 y P0 de T. cruzi en vectores procariontes con el objeto de expresar y purificar abundantes cantidades de proteínas recombinantes. Estas proteínas se utilizaron para desarrollar modelos de inmunización en ratones. En primer término se determinó la especificidad de la respuesta inducida mediante estos modelos. Luego se estudió la respuesta contra los principales epítopes de éstas proteínas localizados en el extremo C-terminal (péptido R13 en TcP2β y P015 en TcP0). Se determinó que la respuesta contra estos epitopes fue similar a la observada en sueros humanos. Paralelamente, se realizaron estudios tendientes a determinar alteraciones en la función cardíaca de los animales inmunizados. De esta forma, mediante la realización de electrocardiogramas, se estableció el desarrollo de alteraciones en la generación del impulso nervioso (arritmias), alteraciones en la conducción intraventricular y en la repolarización. La participación de los anticuerpos anti-P en la generación de alteraciones cardíacas también fue confirmada en ensayos realizados sobre corazones aislados de conejo.

Abstract:
The study of the immune response against ribosomal P proteins of Trypanosoma cruzi in chronic Chagas disease patient's sera suggested that this immune response might play an important role in the development of Chagasic Cardiomiopathy. The molecular cloning of the ribosomal P26 and P0 proteins allowed us to express and purify high amounts of recombinant proteins. These proteins were used to develop animal models of immunization. First, we assessed the specificity of the induced response and determining the induction of high levels of anti-P antibodies. Then, we determined that the response against the C-terminal epitopes of these proteins (peptide R13 in Tc2β Band peptide P015 in TcP0) was similar to those observed in human sera. Immunized animals showed a modified electrocardiographic pattern compared to that in control mice. The participation of anti-P antibodies in the induction of cardiac disturbances was also assessed in a whole rabbit heart isolated system.

García, Gabriela Andrea. "Identificación y caracterización de proteínas en el Trypanosoma cruzi relacionadas con Glutatión - S - transferasas de otros organismos con el fin de definir blancos potenciales para el control de la transmisión de la infección" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las drogas utilizadas para el tratamiento de la infección por T. cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, presentan múltiples efectos colaterales y una eficacia variable en las etapas indeterminada y crónica de la infección. Por otro lado, no existe una vacuna para esta parasitosis que impida la transmisión y/o la enfermedad. Teniendo en cuenta la necesidad de la obtención de buenos inmunógenos y nuevas drogas tripanocidas más efectivas y seguras, el objetivo del Trabajo de Tesis fue definir nuevos posibles blancos para el control de la transmisión de la infección por T. cruzi a partir de la identificación de proteínas en este parásito relacionadas con glutatión-S-transferasas (GSTs)de otros organismos. la selección de las GSTs para dirigir esta búsqueda se basó en la participación de esta enzima, cuyos genes aun no fueron identificados en T. cruzi, en un metabolismo divergente entre el parásito y su hospedero mamífero y en una respuesta inmune protectiva contra la infección experimental por este parásito. En la primera parte del trabajo, que se denominó Parte A, se planteó la identificación de secuencias de genes funcionales resultantes del Proyecto Genoma de T. cruzi con homología con GSTs y su posterior caracterización a fin de determinar si su producto puede postularse como posible blanco de quimioterapia. Como resultado de esta búsqueda se identificó un nuevo gen de copia única, denominado TCGRX,cuyo producto presentó el patrón aminoacídico completo de glutarredoxinas (ers) y similitud con ers y GSl‘sde diversos organismos pero no con enzimas de mamíferos. El modelado molecular de una porción de la TCGRX sobre la Grx 3 de Escherichia coli sugiere que esta proteína tendría la estructura típica de ambas familias. En la segunda parte del trabajo, (Parte B),teniendo en cuenta la existencia en T. cruzi de antígenos de reactividad cruzada con la GST de 26 kDa de Schistosoma japonicum (GSTsj) y que las GSTs son enzimas muy conservadas en su estructura tridimensional se planteó la identificación de estos antígenos utilizando como herramienta un suero anti-GSTsj y su posterior caracterización y evaluación en protocolos de inmunoprotección. Por cromatografía de inmunoafinidad con el suero anti-GSTsj se purificó una fracción a partir de epimatlgotes de T. cruzi, denominada PHGST, que presentó actividad de GST.Por otro lado, el rastreo de una biblioteca genómica de T. cruzi con este antisuero dio como resultado la selección de 38 clones que codificaron para antígenos de la familia Tc13 de la superfamilia de antígenos de superficie de tripomastigotes. la identificación de un miembro de esta familia en la cepa Tulahuén del parásito, denominado PHGST#5, permitió su comparación con los ya conocidos en cuanto a su estructura aminoacídica. Mediante la hibridación de cromosomas separados y transferidos a membranas, se determinó que los genes Tc13 se localizan principalmente en el cromosoma III y su homólogo. Las funciones inmunomoduladoras descriptas para ciertas proteínas de la superfamilia de antígenos de superficie y su participación en el desarrollo de una respuesta inmune protectiva, sustentó la evaluación del antígeno PHGST#5 en experimentos de inmunoprotección en ratones de la cepa BALB/c. La inmunización plasmídica con PHGSTT#5 no indujo una respuesta humoral específica y la respuesta celular, evaluada por efecto de hipersensibilidad retardada (DTH) frente a la inoculación con el antígeno recombinante, fue muy leve; mientras que, la inmunización con la proteína recombinante MBP-PHGST#5 indujo tanto una respuesta humoral como celular, evaluada por DTH. La inmunización plasmídica de PHGST#5, así como la inmunización con MPB-PHGST#5 produjeron una disminución significativa de la parasitemia luego del desafío con formas infectantes del parásito. La inmunización plasmídica con PHGST#5,además disminuyó el daño y el parasitismo tisular luego del desafío. Por lo tanto, la selección de las GSTs para dirigir la definición de nuevos posibles blancos para el control de la transmisión de la infección por T. cruzi permitió identificar el gen TCGRX,cuyo producto por no poseer contraparte en el mamífero, luego de la caracterización bioquímica podría postularse como posible blanco para el diseño de drogas tripanocidas e identificar el antígeno PHGST#5, un nuevo miembro de la familia Tc13 con posibles epitopes compartidos con la GSTsj, y definir su efecto inmunoprotector tanto de la infección y como de la patología chagásica.

Abstract:
Trypanosoma cruzi is the ethiological agent of Chagas’disease. Drugs that have been utilized so far in the treatment of T. cruzi infection have shown colateral effects. No vaccine does exist against this parasitosis. The objective of this thesis has been to define new possible targets for the control of the transmission of T. cruzi infection by means of the identification of parasite proteins related to Glutathion-S-Trasferases (GST)of other organisms. The selection of the GSTs to direct this screening was based on the participation of this enzyme in a divergent metabolism between the parasite and the mammal host and in a protective immune response against the experimental infection with the parasite. These genes have not been identified in T.cruzi yet. The identification of functional T. cruzi gene sequences which showed GST homology resulted from the T. cruzi Genome Project and allowed to identify a unique (single) gene copy TcGRX.The product of this gene showed homology to glutaredoxin (ers) and GSTs from different organisms, but no homology was found to enzymes from mammals. This characteristics support biochemical studies of TcGRX with the purpose of postulating a new possible target for the design of trypanocidal drugs. The utilization of an anti-GST of Schistosoma japonicum serum as a tool for the identification of cross reacting antigens in T. cruzi allowed the purification of an epimastigote fraction, which showed GST activity. The purification of this fraction was performed by immunoaffinity chromatography. The a-GSTsj serum was used to screen a T. cruzi genomic library and allowed the finding of a new member of the Tc13 family. This family belongs to the denominated PHGST#5 superfamily of trypomastigote surface antigens. This antigen showed an immunoprotective effect against the infection as well as the chagasic pathology, and was evaluated by means of both plasmid and recombinant protein immunization.

Lorenzi, Hernán Alejandro. "Estructura genómica y diseño de nuevos vectores de transfección para Trypanosoma cruzi" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Trypanosoma cruzi es un parásito protozoario causante de la enfermedad de Chagas. Dentro del marco del proyecto genoma de T. cruzi y como un activo aporte a su concreción, se ha caracterizado un nuevo tipo de marcador genético asociado a la secuencia repetida SIRE denominado SAS, que condujo a la identificación de cuatro nuevos genes y de las secuencias repetidas TCREL y VIPER. Para contribuir a la construcción del mapa fisico, se construyó y caracterizó una biblioteca de ADN genómico de T. cruzi en vectores YAC con un tamaño promedio de inserto de 365 kpb, que fue utilizada para construir el mapa fisico de una región de ~900 kpb del cromosoma XVI y comenzar la construcción del mapa fisico del cromosoma XX. También se construyeron cromosomas circulares en levaduras por el método de clonado RAT utilizando las secuencias repetidas como base del clonado, y se probó la utilidad de un vector de fragmentación que sirvió para ubicar el gen TcP2β cerca de una región telomérica de un cromosoma de ~1 Mpb. Para contribuir con los estudios genómicos funcionales se diseñó y construyó el vector necesario para obtener cromosomas artificiales de T. cruzi. Finalmente, estos estudios llevaron a utilizar comparaciones de secuencia para definir las características de sintenía de extensas regiones genómicas de T. cruzi, Trypanosoma brucei y Leishmania major.

Abstract:
Trypanosoma cruzi is a parasitic protozoan that causes Chagas disease. As part of the T. cruzi genome project and to contribute to its concretion we have characterized a new type of chromosomal marker associated to the repetitive element SIRE named SAS, that allowed the identification of four novel genes and two repetitive sequences, TcREL and VIPER. To accomplish the construction of the physical map of the T. cruzi genome, we constructed and characterized a genomic YAC library of T. cruzi with an average insert-size of 365 kbp that was used to get the physical map of a ~900 kbp region from chromosome XVI and to start the assembly of contigs from chromosome XX. In addition, we also constructed circular artificial chromosomes in yeast, based on a T. cruzi repetitive sequence by RAT cloning, and verified the utility of a fragmentation vector in the position of the TcP2β gene near a telomeric region of a chromosome of ~1 Mbp. To perform functional genomic studies we designed and constructed a vector that can be used as an artificial chromosome in T. cruzi. Finally, comparison and sequence analysis allowed us the identification of large genomic sintenic regions among T. cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania major.

Tekiel, Valeria. "Autoinmunidad en la infección experimental por Trypanosoma cruzi" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En Argentina, el 10% de la población crónicamente infectada con Trypanosoma cruzi presenta patología en sistema nervioso periférico (SNP). En la presente Tesis se estudió la participación de mecanismos inmunes en la inducción de patología a nivel de lo que denominamos genéricamente SNP, representado por el arco médula espinal-nervio ciático-músculo isquiotibial. Empleamos como modelo, ratones C3H/HeN infectados con las cepas RA o CA-I de T. cruzi que evidencian signos de daño principalmente en nervio ciático y médula espinal o en músculo esquelético, respectivamente. Además, linfocitos T (LT) de estos animales son capaces de injuriar de manera selectiva los órganos antes mencionados por transferencia pasiva en ausencia de parásitos. Hemos definido esos tejidos como blanco de daño para cada una de las cepas de T. cruzi. La respuesta inmune humoral, evaluada por IFI sobre cortes de tejido normal, no mostró diferencias cepa-dependientes; los patrones de marcación evidenciaron depósitos de IgG en intersticio de músculo y en vainas de mielina en nervio. Los sueros con reactividad positiva hacia antígenos conformacionales de nervio fueron definidos como Ne+. La inyección epineural de sueros Ne+ altera la conducción del nervio ciático de manera cepadependiente. Así, sueros de ratones infectados con la cepa RA/Ne+ inducen aumento del tiempo de latencia y disminución en la amplitud del potencial de acción nervioso (PAN) en los animales receptores, 4 días post- inyección (dpy). Por el contrario, sueros de animales infectados con la cepa CA-I no afectan ningún parámetro del PAN. La inyección de IgG purificada de sueros RA/Ne+ también disminuye la amplitud del PAN, indicando la presencia de un menor número de axones funcionantes. En coincidencia se observan depósitos de IgG marcando fibras axonales y/o vainas de mielina e infiltrados inflamatorios leves en los nervios inyectados con suero RA/Ne+ pero no en los inyectados con suero CA-I/ Ne+, a los 4 dpy. No se detecta presencia de parásitos en los nervios de animales receptores de sueros (PCR). Las alteraciones del PAN luego de la inyección de suero RA/Ne+ son similares a las detectadas en animales crónicamente infectados y en ratones inyectados con tripomastigotes en el epineuro l7 dpy. En conjunto, estos resultados indican la participación directa de autoanticuerpos en las alteraciones electrofisiológicas observadas en sistema nervioso periférico en la enfermedad de Chagas. En relación con la participación de LT en esta patología, se estudió el repertorio de las cadenas variables β del receptor de células T (TCRVβ) en distintos tejidos de animales crónicamente infectados con ambas cepas de T. cruzi. En bazo, se observa la sobreexpresión del segmento TCRVβ l3 y sub-expresión del segmento TCRVβ l4, lo cual podría ser marcador de infección. En SNP, se detecta un alto número de cadenas expresadas en los tejidos blanco de daño, que refleja la presencia de un importante infiltrado inflamatorio. Significativamente, se observa el uso relativo aumentado del segmento TCRVβ9 en los tejidos blanco de daño para cada cepa: nervio y médula en los animales infectados con RA y músculo en los infectados con CA-I. Esto demuestra la existencia de un patrón de expresión diferencial de segmentos en el sitio de lesión con respecto a la expresión periférica. El clonado, secuenciación y análisis del polimorfismo de secuencia de la región CDR3 de los segmentos TCRVβ9 sobre-expresados demostró una alta proporción de clones idénticos en animales infectados con RA (médula y nervio), que podría estar indicando la presencia de LT autorreactivos en el sitio de lesión. Además, la elevada producción de citoquinas pro-inflamatorias en los tejidos blanco de daño sugiere que la respuesta inmune local tiene un papel relevante en el proceso inflamatorio. Por otro lado, en los órganos que no son blanco principal de daño para cada una de las cepas de T. cruzi, donde no se encontraba sobre-expresión del segmento TCRVβ9, se observó dominancia clonal en la secuencias de la región CDR3. Este hecho, conjuntamente con la imposibilidad de reproducir daño por transferencia pasiva de células, el hallazgo de material parasitario y la baja producción de IL-6 y TNFα, sugiere que los clones mayoritarios detectados en los tejidos que no son blanco principal de daño están dirigidos hacia antígenos parasitarios contribuyendo al control local de la infección.

Abstract:
In Argentina, l0% of the chronically Trypanosoma cruzi-infected population develops peripheral nervous sytem (PNS) pathology. Herein we studied the participation of immune mechanisms in the pathology of the PNS (spinal cord-sciatic nerve- hamstring muscle axis). Using the C3H/HeN mouse strain and two T. cruzi subpopulations (RA and CA-I) it is possible to induce pathology mainly in skeletal muscle (CA-I) or in sciatic nerve and spinal cord (RA). T cells are able to injure the organs above mentioned in absence of parasites in a strain-dependent way. Therefore, we have defined these organs as target of pathology for each T. cruzi strain. The humoral immune response, evaluated by IFAT, against comformational muscle and nerve antigens was simmilar for RA and CA-I antisera; deposits of IgG were observed at the interstitial matrix in skeletal muscle and in the myelin sheats in sciatic nerve. Sera with positive reactivity against sciatic nerve were defined as Ne+. The epineural injection of sera from infected mice in syngeniec recipients altered the sciatic nerve conduction. This effect was parasite-strain dependent since just recipients of sera obtained from mice infected with the RA strain showed electrophysiological alterations. Moreover, among the sera from RA-infected mice, only those RA/Ne+ were able to induce prolonged latencies and diminished amplitudes of the sciatic nerve action potential (SNAP). On the contrary, sera fron CA-I-infected mice did not alter any SNAP parameter. The abnormalities observed in the amplitude of SNAP seemed to be mediated by IgG since purified antibodies from RA/Ne+ injected epineurally provoke the same effect than the whole sera, demonstrating the expression of a lower number of functional axons. In accordance with these results, IgG deposits labeling the axonal course and/or mielyn sheats as well as mild inflamatory infiltrates were found in the nerves injected with RA/Ne+ sera but not in those injected with CA-I/Ne+ sera 4 days post-injection (dpi). No parasite DNA was detected in the nerves. SNAP alterations in serum recipients are simmilar to those observed in chronically-infected animals or in mice injected in the epineurum with trypomastigotes, l7 dpi. Results presented here indicate the direct participation of autoantibodies in the pathology observed in PNS in chronic Chagas’ disease. To analyze the participation of TL in pathology in our model, we have studied the T cell receptor Vβ (TCRVβ) repertoire in different tissues of chronically-infected mice. Overexpression of TCRVβ 13 and underexpression of TCRVβ l4 segments were observed in spleen of infected mice, suggesting that these peripheral TCRVβ usages can be markers of infection. In PNS tissues, it was deteceted a high number of segments expressed in the target organ of damage, reflecting the strong inflammatory infiltrate. There was an over representation of TCRVβ 9 segment in sciatic nerve and spinal cord in RA- and in skeletal muscle in CA-I-infected mice, showing a differential expression pattern between the target organ of disease and the peripheral repertoire. The sequence polymorphism analysis of the CDR3 region of over-expressed TCRVβ9 segments showed a high proportion of identical clones in sciatic nerve and spinal cord in RA-infected mice, that could denote the presence of autoreactive TL. Moreover, the elevated production of pro-inflammatory cytokines in situ suggests that the local immune response is contributing to the severe pathology observed in those organs. On the other hand, clonal dominance was observed in TCRVβ9 segments not-over-expressed in the tissues that are not the main target of damage for each T. cruzi strain. This fact, together with the fail to induce damage by passive cell transfer in these tissues, the presence of parasite in situ and the low production of TNFα and IL-6, suggest that the the main clones are directed to parasite antigens and contribute locally to the control of the infection.

Carnevale, Silvana. "Diagnóstico de paludismo por Plasmodium Vivax utilizando secuencias repetitivas de ADN parasitario" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La malaria es un problema de salud pública mundial en más de 100 paises habitados por un total de 2.400 millones de personas, representando el 40% de la población mundial. Las cuatro especies más comunes que infectan al hombre son: Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale, de las cuales, las dos primeras, representan el 95% de las infecciones. En Argentina se plantea la necesidad de trabajar sobre P. vivax, pues no se han registrado casos autóctonos de paludismo por P. falciparum. El propósito de este estudio fue disponer de herramientas moleculares para la detección de P. vivax, aplicables a muestras humanas y vectores, adaptables a las condiciones de recolección y procesamiento básico disponibles en las bases operativas del Programa Nacional de Paludismo. Para ello se obtuvieron y caracterizaron secuencias repetitivas de ADN de P. vivax. El fragmento clonado (instPv10) resultó en un tamaño de 6.899 pb y presentó varias repeticiones directas en tandem y un elemento repetitivo del tipo disperso. Este fragmento incluyó la secuencia específica de P. vivax, insPv10-ll, de 75 pb, que fue empleada como sonda en el desarrollo de la técnica de Dot blot, y la secuencia insPvE/C, dentro de la cual se diseñó el blanco de reacción de PCR. Desde el punto de vista del diagnóstico individual, las técnicas de PCR-sangre e insPv10-11-Dot blot demostraron ser valiosas para emplearse como métodos en el diagnóstico de pacientes sintomáticos y asintomáticos, incluyendo aquellos que retoman de una zona endémica de infecciones causadas por P. vivax, y para el seguimiento de pacientes. Desde la perspectiva epidemiológica la técnica de PCR-elutorios desarrollada en este trabajo permitió efectuar el diagnóstico específico de la especie P. vivax en pacientes sintomáticos y asintomáticos, lo que facilitaría su uso en acciones de detección por búsqueda pasiva y activa. Por otro lado, el método de PCR aplicado a vectores mostró ser una de las pocas alternativas disponibles de alta sensibilidad y especificidad para la detección de P. vivax en mosquitos experimental y naturalmente infectados, con condiciones prácticas de conservación de muestras. Las técnicas desarrolladas en este trabajo son de utilidad para el manejo de brotes y epidemias ya contribuyen a la detección del aumento de la tasa de infección en mosquitos, al estudio de las migraciones y la vigilancia de la quimiorresistencia. El trabajo realizado se enmarca como un desarrollo local de herramientas diagnósticas aplicables al control del paludismo en Argentina.

Abstract:
Malaria is a public health problem in more than one hundred countries, meaning that 40% (2,400 million) of the world’s total population is exposed to malaria risk. The four common species that infect humans are Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale, and the two first ones represent 95% of infections. In Argentina it is necessary to work on P. vivax, because there are not local cases of malaria due to P. falciparum. The purpose of this study was to have disposal of molecular tools for the detection of P. vivax, that could be applied to human and mosquito samples, and adapted to the basic conditions of collection and processing available at the operating settings of the National Malaria Programme. In this way we obtained and characterized repetitive sequences of P. vivax DNA. The cloned fragment (insPv10) resulted in a molecular size of 6,899 bp, with several tandem direct repeats and a repetitive interspersed element. This fragment included the insPv10-ll P. vivax-specific sequence (75 bp), employed as probe for the development of the Dot blot technique, and the insPvE/C sequence, inside which the PCR target was designed. At the individual level, the PCR-blood and insPv10-11-Dot blot demonstrated to be valuable methods for the diagnosis of symptomatic and asymptomatic patients, including those returning from P. vivax endemic areas, and for management of cases. At the epidemiological level, the technique of PCR-blood impregnated filter paper disks developed in this work allowed the specific diagnosis of P. vivax in symptomatic and asymptomatic patients. This fact could facilitate its use in active and passive surveillance. The PCR methodology applied to malaria vectors showed to be one of the few available alternatives of high sensitivity and specificity for the detection of P. vivax in experimentally and naturally infected mosquitoes, with practical conditions for sample storage. The techniques developed in this work are useful for management of outbreaks and epidemics, as they contribute to the detection of increased infection ratios in mosquitoes, to the study of migrations, and to the surveillance of drug resistance. This work can be described as a local development of diagnostic tools that can be applied to malaria control in Argentina.

Carrillo, Carolina. "Metabolismo de las poliaminas y su regulación en parásitos tripanosomatidos : expresión del gen de la Ornitina decarboxilasa (ODC) de C. fasciculata en T. cruzi" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Trypanosoma cruzi es el agente causal del “Mal de Chagas”, enfermedad endémica en América Latina. Este parásito unicelular, al igual que otros parásitos tripanosomátidos, presenta un complejo ciclo de vida a través de diferentes hospedadores (insecto vector - hospedador vertebrado). A lo largo de su ciclo el parásito pasa por distintos estadios celulares, sufriendo profundos cambios morfológicos, fisiológicos y bioquímicos que le permiten adaptarse a los distintos ambientes. Uno de los estadios, el epimastigote, no es infectivo para el hospedador vertebrado y presenta una capacidad proliferativa que permite su cultivo en el laboratorio sin mayores dificultades. Trypanosoma cruzi presenta numerosas características metabólicas que lo diferencian de otros organismos incluso del mismo orden. Describir estas diferencias permitiría conocer más detalladamente al parásito aportando datos de utilidad taxonómica y evolutiva y contribuiría al posible desarrollo de tratamientos quimioterapéuticos más específicos y eficientes que los disponibles hasta el presente. Un punto clave en el metabolismo de los tripanosomátidos está asociado a las poliaminas. Estos policationes alifáticos (putrescina, esperrnidina y espermina) están presentes en la mayoría de los organismos, tanto procariotas como eucariotas, cumpliendo funciones celulares esenciales tales como asistir la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas, estabilizar macromoléculas y estructuras celulares y participar en la proliferación y diferenciación celular. La biosíntesis de poliaminas comienza por la conversión de ornitina en putrescina por acción de la ornitina decarboxilasa (ODC). Esta enzima es fundamental en la regulación de la síntesis de poliaminas y su actividad esta rigurosamente controlada a distintos niveles. Además, se ha descripto un inhibidor específico e irreversible, difluorometilornitina (DFMO), que ha facilitado el estudio de dicha enzima. Una vía alternativa de síntesis de putrescina actúa a través de la arginina decarboxilasa (ADC) cuyo sustrato es el aminoácido arginina. Esta enzima fue inicialmente descripta en plantas y bacterias y recientemente ha sido encontrada en ciertos tejidos de mamíferos. En parásitos protozoarios existen controversias con respecto a la existencia de las enzimas que catalizan el primer paso de la síntesis de poliaminas, especialmente la ADC. La discutida carencia de dichas actividades es suplida por un transporte activo constitutivo de poliaminas desde el medio extracelular. A lo largo de este trabajo confirmamos que los epimastigotes de distintas cepas de T. cruzi son auxótrofas para poliaminas. Esta auxotrofia esta ocasionada por la falta de la actividad enzimática de ODC y de ADC que, a su vez, se da por la ausencia de los genes correspondientes. Además, se transfectaron epimastigotes de T. cruzi con un vector de expresión recombinado con el gen de ODC de Crithidia fasciculata (clonado en este laboratorio). De este modo, caracterizamos al cultivo transfectado con el gen heterólogo de ODC a nivel fisiológico (capacidad proliferativa), bioquímico (síntesis y concentración intracelular de poliaminas y caracterización de la actividad enzimática heteróloga) y molecular (ubicación del gen heterólogo, determinación del número de copias, etc.). El cultivo transfectado se volvió autótrofo para poliaminas y sensible al inhibidor de la ODC, el DFMO. Sin embargo, luego de un cierto tiempo de cultivo en presencia del inhibidor se seleccionó una subpoblación resistente a DFMO. Este cultivo también fue caracterizado comparándolo con los cultivos sensibles. Finalmente, el parásito transfectado con el gen heterólogo de ODC contribuyó con los estudios sobre el metabolismo de las poliaminas en T. cruzí y podría ser útil en futuras investigaciones acerca de la relación poliaminas - diferenciación a tripomastigote (metaciclogénesis) y poliaminas - infectividad en células de mamíferos.

Abstract:
Trypanosoma cruzi is the etiological agent of “Mal de Chagas”, an endemic illness in Latin America. This unicellular parasite, as other trypanosomatid protozoa, has a complex life cycle involving different hosts (insect vectors - vertebrate hosts). During its life cycle the parasite pass through several differentiation stages undergoing mayor morphological, physiological and biochemical changes in order to adapt to variable environments. Epimastigote is the noninfective form, which proliferates inside the insect and can be easily cultivated in axenic media. Trypanosoma cruzi differs from other trypanosomatid parasites in many physiological and metabolic characteristics. The study of these properties would increase the knowledge of the parasite, providing useful taxonomic and evolutive information. It would also contribute to the development of more specific and efficient chemoterapies against this protozoo. A key point of trypanosome metabolism is related to polyamines. These aliphatic cationes (putrescina, espermidina y espermina) are present in almost all living organisms (prokaryotes as well as eukaryotes). It is well known that polyamines participate in nucleic acids and protein syntheses and can stabilize macromolecules and cellular structures, therefore playing essential roles in cellular proliferation and differentiation. The biosynthesis of polyamines begins with the conversion of ornithine to putrescine by ornithine decarboxylase (ODC). This enzyme is essential in the regulation of the pathway and its activity is tightly controlled at different levels. Difluoromethil-ornitine (DFMO), an specific and irreversible inhibitor of ODC, has been described ago. Arginine decarboxylase (ADC), which catalyses an alternative route to synthesize putrescine from arginine has been first described in plants and bacteria, but recently has also been found in some mammal tissues. The presence of both polyamine biosynthetic pathways (from ornithine and arginine) in some protozoa has been a matter of controversy for many years. In this work, we confirmed that epimastigotes from different wild type strains of T. cruzi are auxotrophic for polyamines. This auxotrophy is due to the absence of ODC and ADC genes in the protozoa genome. These parasites which contain neither ODC nor ADC enzymatic activities are able to obtain polyamines from the environment through an active transport mechanism. We have been able to transform wild type T. cruzi epimastigotes with a recombinant plasmid bearing the ODC gene from Crithidia fasciculata (cloned in a previous work of our laboratory). The resulting transgenic parasites have been studied at the physiological, biochemical and molecular levels in order to determine the relationship among proliferation capacity, intracellular polyamine levels and exogenous gene location and expression. The transfected cultures became autotrophic for polyamine and sensitive to the presence of DFMO. However, after some time of exposure to high levels of the inhibitor, a DFMO resistant subpopulation was naturally selected. This resistant culture has been characterized together with the sensitive counterpart. The transfected parasites containing the heterologous ODC gene is a valuable tool to improve our knowledge about polyamine metabolism in T. cruzi; it could be very useful to study the relationship among differentiation to trypomastigote form (metacyclogenesis), infectivity towards mammalian cells and polyamine endogenous concentrations.

Santori, María Isabel. "Clonado y caracterización de proteínas relacionadas al control del ciclo celular del parásito Trypanosoma cruzi" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En nuestro laboratorio se clonaron dos CRKs (CDK1 Related Kinases) de T. cruzi, TzCRK1 y TzCRK3 (Gómez y col., 1998) y se identificaron, por doble híbrido, proteínas que se asocian a TzCRK1 con similitud a una familia de ciclinas (Gómez y col., 2001). En el presente trabajo de tesis se caracterizaron y clonaron proteínas candidatas a participar en el control del ciclo celular de T. cruzi. Se secuenciaron en su totalidad los fragmentos de los genes obtenidos por doble híbrido y se los denominó TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Además se clonaron los genes completos y se secuenciaron. La secuencia predicha para las tres proteinas mostró similtud con ciclinas denominadas PHO, presentes en S. cerevisiae. TzCYC5 posee una región rica en histidinas próxima al amino terminal. Se determinó que los tres genes son de copia única mediante Southern blot y por rastreo de una biblioteca genómica. La expresión de los tres genes mostró variaciones particulares en distintos estadios de T. cruzi. TzCYC6 complementó una cepa mutante de S. cerevisiae, deficiente en las ciclinas de G1, demostrando que es una ciclina funcional. Se determinó el patrón de expresión de TzCRK3 en estadíos de T. cruzi. El ARNm de TzCRK3 es más abundante en el estadío amastigotes que en epimastigotes o tripomastigotes. Se obtuvo un suero específico contra TzCRK3, inmunizando conejos con la proteína recombinante expresada en bacterias. Ensayos de Western blot mostraron, en epimastigotes la presencia de una proteína del peso molecular esperado, 35 kDa. En amastigotes y tripomastigotes, se observaron bandas específicas de menor movilidad. Se estableció que la proteina identificada en epimastigotes se asocia a p13ˢͧͨ¹-agarosa, proteína con alta afinidad por CDK1. TzCRK3 endógena mostró actividad quinasa de histona H1 y fue inhibida por inhibidores de CDKs: flavopiridol, roscovitina y olomoucina. Flavopiridol inhibió el crecimiento de epimastigotes en cultivo, aunque no en forma total. La actividad quinasa de la TzCRK3 de dichos epimastigotes se inhibió en forma dosis dependiente. La actividad de quinasa de histona H1 asociada a p13ˢͧͨ¹ mostró las mismas variaciones estadío especificas y similar sensibilidad a los CK1s que TzCRK3. En los cultivos con flavopiridol el IC50 no mostró diferencias significativas con el de TzCRK3. La actividad de TzCRK3 en epimastigotes sincronizados mostró un pico en G2/M mientras que la actividad asociada a p13ˢͧͨ¹ aumentó al mismo tiempo pero no disminuyó hasta M. La expresión de TzCRK3 fue constante. Los patrones de actividad y expresión de TzCRK3 son tipicos de una CDK. Esta evidencia indica que TzCRK3 está involucrada en el control del ciclo celular de T. cruzi, controlando el pasaje de G2/M, aunque no se puede excluir la presencia de otra CDK. Se identificó un EST con alta similitud de secuencia con Lmmp12ͨᴷˢ¹, el gen homólogo a p13ˢͧͨ¹ en Leishmania mexicana. Se clonó el gen completo y se determinó que es copia única. La secuencia esperada de la proteína muestra una alta identidad de secuencia con la familia de proteinas CKS. Su expresión mostró variaciones estadío especificas. La proteina recombinante se expresó en bacterias, en fusión a histidinas, se la purificó y se inmunizaron conejos para obtener un anti suero.

Abstract:
In our laboratry two CRK genes: TzCRK1 and TzCRK3 from T. cruzi were previously isolated (Gómez et al., 1998), and using the yeast two-hybrid system open reading frames coding for proteins able to associate with TzCRK1 were identified (Gómez et al, 2001). Positive clones obtained in the two hybrid screen were sequenced and compared in data banks. Clones sharing identity with S. cerevisiae PHO cyclins were named TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Full lenght genes were cloned and sequenced. Identity with proteins from the PHO family was still observed when the predicted aminoacidic sequences were compared. An histidine-rich domain was observed in the TzCYC5 amino terminal region. All three genes were shown to be single copy. Cyclins mRNA levels varied in a stage specific manner. TzCYC6 was able to functionally complement a S. cerevisiae deficient for G1 cyclins. To establish if TzCRK3 has a role in the regulation of the parasite cell cycle, its expression and activity were studied. Northern and Western blot analyses detected the enzyme in three forms of the parasite; mRNA levels, subcellular localization and apparent molecular weight of the protein varied throughout the stages. TzCRK3 from epimastigote soluble extracts interacted with p13ˢͧͨ¹-beads. Endogenous TzCRK3 phosphorylated histone H1 and this activity was inhibited by specific CDK inhibitors (CKIs): olomoucine, flavopiridol and roscovitine. In addition, p13ˢͧͨ¹ beads coprecipitated with a kinase activity that was inhibited by the CDK inhitors mentioned above. Flavopiridol partially inhibited the growth of T. cruzi epimastigotes at 50 nM, the lowest concentration used, but even with the highest (5 mM), cell growth was not completely arrested. TzCRK3 from flavopiridol inhibited epimastigotes extracts exhibited a dose dependent inhibition of histone H1 phosphorylation. T. cruziˢͧͨ¹- binding CRK displayed the same inhibition profile. TzCRK3 IC50 did not significatively differed from the shown by the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹. This indicates that TzCRK3 is the enzyme responsible for the majority of the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹. TzCRK3 activity of hydroxyurea (HU) synchronized epimastigotes peaked in G2/M boundary while the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹ beads increased at the same time point but remained high until late G2/M. In addition, TzCRK3 expression was constant along the cell cycle. This is a common pattern of CDK activity regulation. Taken together, these results contribute to support the idea that TzCRK3 is involved in control of the cell cycle in T. cruzi. A T. cruzi EST sharing high identity values with the Leishmania mexicana p13ˢͧͨ¹ homologous, Lmmp12ͨᴷˢ¹ was identified. The full lenght gene was cloned. The predicted aminoacidic sequence showed high identity scores with proteins belonging to the CKS family. This protein was named Tzp12ͨᴷˢ¹. mARN levels in different stages of the parasite varied. The recombinant protein, fused to a histidine tag, was expressed in bacteria. It was purified and used to immunize rabbits, in order to obtain a specif antibody.

Wainszelbaum, Marisa. "Trypanosoma cruzi : Mecanismos reguladores de la metaciclogénesis" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el intestino de su vector, insecto hematófago, Trypanosoma cruzi, se encuentra expuesto a una gran variedad de compuestos. Algunos de éstos inducen la diferenciación del parásito hacia su estadío de tripomastigote metacíclico, que es la forma infectante. Este proceso implica la activación de vias especificas de señalización. En esta Tesis investigamos la generación de moléculas liposolubles con actividad metaciclogénica y su mecanismo de acción. Demostramos que los ácidos grasos libres, juegan un rol importante en la metaciclogénesis, el que puede explicarse por la activación de la proteína kinasa C (PKC). La generación de estos ácidos grasos libres tiene lugar por efecto de fosfolipasas exógenas (del intestino del vector) y endógenas (del tripanosoma) actuando en forma concurrente. Estas fosfolipasas han sido aisladas y caracterizadas. Los ácidos grasos libres estimulan la generación de diacilglicerol, contribuyendo a explicar su efecto activador sobre la PKC. A este efecto, se suma la aparición de aumentos de calcio citoplásmico, por exposición a extractos intestinales, que ha sido demostrada anteriormente, con lo que se generan simultáneamente los dos segundos mensajeros (iones calcio y diacilglicerol), requeridos para la activación de la PKC. Estudios previos indicaron que la digestión de la hemoglobina genera péptidos metaciclogénicos que actúan a través de la proteina kinasa A (PKA) del parásito. Existen en consecuencia mecanismos redundantes, mediados por la PKC y la PKA, que aseguran la diferenciación celular en Trypanosoma cruzi. En ambos casos, péptidos de la hemoglobina y ácidos grasos libres, son productos de la digestión de la sangre. Un posible significado biológico de estas observaciones es que dichos productos desempeñen un rol coordinador entre la fisiología alimentaria del insecto y la aparición de las formas infectantes del parásito.

Abstract:
Inside the intestinal medium of its blood sucking vector, Trypanosoma cruzi is exposed to large variety of compounds. Some of these induce the differentiation of the parasite to its infective metacyclic trypomastigote stage. This process implies the activation of specific signaling pathways. In this Thesis we investigate the generation of lipid soluble molecules with metacyclogenic activity and their mechanism of action. We show that free fatty acids play a key role in this process which can be explained through the activation of protein kinase C (PKC). The generation of those free fatty acids takes place through exogenous (intestinal) and endogenous (trypanosomal) phospholipases which act concurrently. These phospholipases have been characterized in this work. The free fatty acids stimulate the formation of diacylglycerol thus, accounting for the PKC-activating effects. Cytoplasmic calcium peaks have been demonstrated to take place upon stimulation with the intestinal extracts. Therefore, both second messengers, diacylglycerol and calcium; appear simultaneously as required for PKC activation. Previous work has shown that peptides derived from the digestion of hemoglobin, have metacyclogenic activity through the activation of protein kinase A (PKA) in the parasite. Thus, there are redundant mechanisms, involving PKC and PKA that ensure cell differentiation in Trypanosoma cruzi. In both cases, hemoglobin peptides and free fatty acids, the regulatory compounds, are blood digestion products. A possible biological meaning of these observations is that such products serve a coordinated role between the feeding physiology of the insect and the appearance of the infective forms of the parasite.

Portal, Daniel. "Control de la expresión génica en Trypanosoma Cruzi : proteínas que participan en la regulación del procesamiento de pre-RNA mensajeros" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Trypanosoma cruzi. es el parásito protozoario flagelado responsable de la enfermedad de Chagas en Latinoamérica. Esta enfermedad produce miles de muertes y un costo elevado para los países de la región. El mecanismo de control de la expresion génica en el parásito es objeto de fuertes estudios, ya que éste procesa sus pre-RNA mensajeros de manera diferente a la forma en que lo hacen sus hospedadores, mediante un mecanismo conocido como trans-splicing. Por lo tanto, entender las bases moleculares de dicho control es importante para encontrar puntos potenciales para el desarrollo de drogas terapéuticas que puedan interrumpir el ciclo vital del parásito. Presentamos aquí el clonado y la caracterización de dos proteínas importantes para la catálisis y el control del procesamiento de los pre-RNAm jamás descriptas anteriormente en ningún protozoario poseedor del sistema de trans-splicing. Estas proteínas, llamadas TcSR, perteneciente a la familia de factores de splicing ricas en serina y arginina y su quinasa asociada, TcSRPK mostraron un altísimo grado de conservación a todo nivel con sus contrapartes de eucariotas superiores tanto en ensayos in vivo como in vitro. Si bien esto las descarta, en principio, como base para el desarrollo de drogas terapéuticas, ilustra sobre el grado de conservación que pueden tener dos vias aparentemente discímiles como el cis- y el trans-splicing. Además, los resultados sugieren que los mecanismos de control de la expresión génica a nivel del procesamiento del RNA están altamente conservados a pesar de la distancia evolutiva, demostrando la enorme presión de selección a la que está expuesto dicho mecanismo.

Abstract:
The Trypanosome cruzi, is a flagellate protozoan parasite responsible for the Chagas' disease in Latin America. The mechanisms of control of gene expression are not well understood, since the parasite processes nearly all of its pre-mRNAs by trans-splicing which is different from cis-splicing, in their insect and mammalian hosts. Understanding the molecular basis of such mechanism is important in order to develop drugs that could interrupt the parasite's vital cycle. Here we present for the first time in a trans-splicing performing organism, the cloning and characterization of two important proteins involved in the catalysis and control of pre-mRNA processing. These proteins, called TcSR, a member of the serine-arginine (SR) protein family of splicing factors and its associated kinase. TcSRPK, showed a highly conserved activity both in vitro and in vivo, in a variety of functional assays. Although this discards the proteins as potential targets for therapeutic drug development, it illustrates on the striking conservation that two apparent different pathways like cis- and trans-splicing can show. Moreover, the results suggest that the mechanisms of control of gene expression at the pre-mRNA processing level are highly conserved despite the evolutionary distance that separates the organisms. This demonstrates the huge selection pressure to which pre-mRNA processing is exposed.

Vezzani, Darío. "El hábitat de Aedes aegypti (Diptera : Culicidae) en Buenos Aires para distintas escalas espaciales de estudio" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estudio del hábitat de Aedes aegypti es de gran importancia para el desarrollo e implementación de acciones de control efectivas. Con el objetivo de caracterizar el hábitat de este mosquito e identificar los factores que influyen en su calidad, se realizaron estudios para las siguientes escalas espaciales: los cementerios como macrohábitats, los parches dentro de un mismo cementerio, los microhábitats dentro de un mismo parche, y los recipientes donde cría. Entre 1998 y 2001 se llevaron a cabo monitoreos de actividad de oviposición de las hembras y de sitios de cría. Se estudió la asociación entre el nivel de infestación y la oferta de recipientes, la cobertura vegetal, la proximidad de otros sitios favorables, la sombra, la temperatura del agua, el orden y la limpieza del ambiente, y distintas características de los recipientes. En todas las escalas estudiadas se observaron gradientes del nivel de infestación del vector. Los ambientes que alcanzaron los mayores niveles de infestación, también fueron los que permanecieron infestados durante más tiempo. Entre las variables estudiadas, la vegetación y la proximidad a otras áreas favorables demostraron una asociación positiva con la calidad del hábitat de Ae. aegypti. La variable oferta de recipientes no se halló asociada con los niveles de infestación, en ambientes con más de 100 recipientes por hectárea. El material de los recipientes influyó en la calidad como hábitat de cría, dependiendo de las características del ambiente. Los recipientes de plástico fueron los más favorables y los de metal los menos favorables para la proliferación del vector. El nivel de infestación no se halló asociado con la capacidad de los recipientes. Los resultados sugieren que en áreas urbanas los ambientes más favorables para Ae. aegypti son aquellos de gran acumulación de recipientes con agua, protegidos de las condiciones ambientales extremas por la vegetación o por estructuras antrópicas. Estos ambientes actuarían como focos de proliferación y dispersión hacia el resto de la ciudad y sobre ellos habría que concentrar los esfuerzos para reducir la abundancia del mosquito. Los cementerios en Buenos Aires son sitios adecuados para ser utilizados como modelo en estudios ecológicos de culícidos urbanos que crían en recipientes artificiales.

Abstract:
The study of the habitat of Aedes aegypti is of great importance for the development and implementation of effective control measures. In order to characterize the habitat of this mosquito species and to identify factors affecting its quality, studies were conducted at the following spatial scales: cemeteries as macrohabitats, patches within a same cemetery, microhabitats within a same patch, and breeding containers. Female oviposition activity and breeding sites were monitored from 1998 to 2001. The associations between the infestation level and different environmental variables were evaluated. Those variables were container availability, vegetation cover, proximity to other favourable sites, shade, water temperature, cleanness of the environment, and container characteristics. The vector infestation level showed a gradient at all scales studied. Those environments with highest infestation levels also remained infested for a longer period. Among the studied variables, vegetation and proximity to other favourable sites showed a positive association with the habitat quality of Ae. aegypti. The infestation level was not associated with container availability in environments with more than 100 containers per hectare. Containers made of different materials showed a variable suitability as breeding sites of Ae. aegypti, according to environmental characteristics. Plastic and metal containers were the most and less favourable breeding sites, respectively. The infestation level was not associated with the capacity of containers. Results suggest that in urban areas the most favourable environments for Ae aegypti are sites with a large number of water-filled containers, sheltered from extreme environmental conditions by vegetation or manmade structures. Efforts to reduce the mosquito abundance should be focused on these sites, which represent potential proliferation and dispersal foci towards the rest of the city. Cemeteries in Buenos Aires are suitable areas to be used as a model in ecological studies of urban culicids breeding in artificial containers.

Martin, Valentina. "Regulación de la respuesta inmune contra el toxoplasma gondii en la mucosa intestinal y análisis del valor inmunoprofiláctico de antígenos del parásito en el modelo murino" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Toxoplasma gondii, es un parásito protozoario que infecta al hospedador mediante la ingestión oral de quistes tisulares u ooquistes induciendo una respuesta inmune en el intestino y sistémica del tipo Thl, produciendo inmunidad contra una re-infección. La infección experimental oral de diferentes cepas de ratones resulta en dos modelos interesantes de regulación de la respuesta inmune. Los ratones C57BL/6 (H-2b) desarrollan una ileitis inflamatoria aguda (IBD), caracterizada por la sobreproducción de IFN-γ y la síntesis de óxido nítrico en el intestino delgado dentro de los primeros siete días que, dependiendo de la dosis parasitaria inicial, puede producir la muerte debido al proceso inflamatorio. En cambio los ratones C3H/HeJ y CBA/J (H-2k) muestran solo pequeños procesos inflamatorios, cursando una infección aguda normal con establecimiento de la infección crónica. En el presente estudio, se demuestra que los linfocitos intraepiteliales (IELs) primados con antígeno de T. gondii previenen la ileitis aguda en ratones susceptibles (C57BL/6), e in virro reducen la producción de quemoquinas inflamatorias por enterocitos infectados, evento que estaría mediado por el TGF-β que secretan. Los IELs serían un componente esencial en la homeostasis del intestino luego de la infección oral con este parásito. Como un primer acercamiento en el conocimiento de la respuesta que este parásito genera en ratones que cursan una infección aguda normal, se caracterizó la respuesta de la línea celular enterocítica MODE-K (H-2k)frente a la infección para estudiar su valor como modelo in vitro. Estas células mostraron activarse frente a la infección con taquizoitos del T. gondii, secretando un patrón de citoquinas y quemoquinas cuya cinética resulta cepa específica. Los IELs derivados de los ratones CBA/J mostraron reducir la expresión de quemoquinas en los enterocitos infectados, y este efecto fue observado tanto en IELs no primados como primados. Estos IELs de ratones naïve, a diferencia de los provenientes de ratones susceptibles, producirían citoquinas anti-inflamatorias en forma endógena lo cual podría ser un componente importante en la resistencia al desarrollo de la ileitis aguda frente a la infección. La segunda parte de esta tesis estuvo enfocada al estudio de la habilidad de antígenos específicos del parásito de estimular in vitro una respuesta a nivel sistémico y de mucosas luego de una infección oral de ratones susceptibles (C57BL/6) y resistentes (BALB/c

Abstract:
Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that infects the host by oral ingestion of tissue cysts or oocysts, with the induction of a systemic and intestinal Thl immune response resulting in the production of immunity against re-infection. There are two interesting models of the immune response regulation in the experimental oral infection with cysts of different strains of mice. C57BL/6 mice (H-2^b) develop acute inflammatory ileitis (IBD) characterized by the overproduction of IFN-γ and nitric oxide synthesis in the gut after seven days of infection, and depending on the initial parasite-dose this inflammatory response can result lethal. In contrast, oral infection of C3H/HeJ and CBA/J (H-2^k) reveal only mild inflammation in the gut, resulting resistant to the acute phase of the infection with the establishment of the chronic infection. In the present study, we report that T. gondii antigen-primed intraepithelial lymphocytes (IELs) prevent the acute ileitis in C57BL/6 susceptible mice, and in vitro, reduce the production of inflammatory chemokines by infected enterocytes, event that would be mediated by TGF-β secretion. IELs could be an essential component in the gut homeostasis after oral infection with this parasite. As a first attempt to study the immune response induced by this parasite in mice resistant to the acute infection, we have characterized the response elicited by the infection of the enterocyte cell line MODE-K (H-2^k)to evaluate its value as an in vitro model. Infection with T. gondii tachyzoites induced the activation of these cells, with the secretion of a cytokine and chemokine pattem with a strain-specific kinetics. Both unprimed and antigen-primed IELs isolated from CBA/J mice reduce chemokine expression by infected enterocytes. These IELs from naïve resistant mice, in contrast to the IELs from naïve susceptible mice, would produce endogenous anti-inflammatory cytokines that could result in an important component in the resistance to acute ileitis after infection. The second part of this thesis, has been focused on the study of the ability of specific parasite antigens in stimulating in vitro a systemic and mucosal response in orally infected susceptible (C57BL/6) and resistant (BALB/c

Ghio, Sergio Claudio. "Clonado y caracterización de un antígeno rico en aminoacidos ácidos de Trypanosoma cruzi y su posible rol en la inmunopatogenia de la cardiopatía chagásica crónica" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se ha postulado la hipótesis de un origen autoinmune para explicar la etiología de la enfermedad de Chagas. Este proceso autoinmune podría ser el resultado de una respuesta inmune cruzada contra componentes específicos de células cardíacas que comparten epítopes con antígenos de Trypanosoma cruzí (mimetismo molecular). En trabajos anteriores demostramos que los anticuerpos de pacientes crónicos, inmunopurificados con el péptido correspondiente a los 13 aa C-terminales de la proteína ribosomal P28 de T. cruzi (TcP2β),alteraron la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ya que también podían reconocer el segundo bucle de los receptores cardiacos (M2 muscarínicos y β-adrenérgícos). Lo mismo ocurrió con los inmunopurificados contra un péptido correspondiente a la proteína ribosomal P0 (TcP0). Tanto los epítopes parasitarios como los del hospedador reconocidos por estos anticuerpos estaban formados por secuencias aminoacídicas ácidas. En la búsqueda de nuevos antígenos que pudieran producir este tipo de reacción cruzada, se propuso el rastreo de ESTs (Expressed Sequence Tags) producidos en el Proyecto Genoma T. cruzi que codificaran para proteínas ricas en secuencias ácidas. De este modo se aisló un EST de 718 pb. Se obtuvo la secuencia completa del gen que denominamos garp (glutamic acid rich protein) de 3500 pb, que es de copia única y origina un único ARNm de aproximadamente 4 kb. Según la comparación de secuencias se encontró una identidad de hasta 72% con secuencias de T. brucei. La proteína es de 130 KDa, y según ensayos de Western blot e inmunofluorescencia se localiza en el citoplasma del parásito. Aproximadamente el 20% de los sueros de pacientes con la enfermedad de Chagas crónica fueron capaces de reconocer la proteína recombinante GARP, y todos ellos lo hicieron con la región más C-terminal de la proteína, que contiene los aminoácidos ácidos. La inmunización con la proteína recombínante GARP provocó la aparición de anticuerpos dirigidos contra toda la proteína. Estos anticuerpos no modificaron la frecuencia de latidos de los cardiocítos en cultivo, y consecuentemente los ratones no sufrieron alteraciones electrocardiográficas. Como un método alternativo de inmunización, ensayamos la metodologia de inmunización con ADN. Con esta técnica de inmunización se pretendía reflejar mejor la situación de la infección crónica, ya que la presentación constantes de los antígenos parasitarios por las células musculares del hospedador podría ser mas adecuada para estudiar la patogenicidad de la enfermedad. Para poner a punto esta metodología, realizamos inmunizaciones con las proteínas ribosomales TcP2β y TcP0. Las inmunizaciones de ADN con TcP2β ,TcP0 y GARP generaron anticuerpos capaces de reconocer epítopes diferentes a los reconocidos en la infección natural. Los anticuerpos no provocaron alteraciones en la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ni se observaron alteraciones electrocardiográficas tales como las ocurridas cuando ratones fueron inmunizados con proteínas recombinantes TcP2β y TcP0. Por tanto concluimos que la inmunización con ADN es capaz de generar anticuerpos que reconocen epítopes diferentes a los inducidos por inmunizaciones con proteínas recombinantes o por la infección natural, lo cual es de utilidad al momento de generar una vacuna contra T. cruzi.

Abstract:
The hypothesis of an autoimmune origin has been postulated to explain the etiology of the Chagas' heart disease. This autoimmune process could be the result of an immune response capable of cross-reacting to specific components of heart (issues that share epitopes with antigens of Trypanosoma cruzi (molecular mimicry). As we have previously reported, antibodies of chronic patients, recognizing a peptide corresponding to the 13 aminoacid C-terminus (peptide R13) of the T. cruzi ribosomal P2 β protein (TcP2β) altered the frequency of cardiomyocyte beating culture. This antibodies were also able to recognize the second extracellular loop of the G-protein coupled receptors (M2 muscarinic and β-adrenergic receptors). Antibodies immunopurified against the C-terminus of the T. cruzi ribosomal P0 protein (TcP0) present a similar functional and physicochemical features. Both the parasitic and the host epitopes recognized by these antibodies are composed of acidic sequences. In the search of new antigens that could produce this type of cross-reaction, we looked for ESTs (Expressed Sequence Tags) in the Genome Project of T. cruzi coding for acidic residues rich proteins. So we identified a EST of 718 bp. The complete sequence of the gene (3500 bp) was obtained and we named it garp (glutamic acid rich protein). This gene exists in a single copy and gives origin to only transcript of approximately 4 kb. Its sequence was compared with database, finding a identity up to 72% with T. brucei sequences. The protein has 130 KDa, and both Western blot and immunofluorescence assays located it into cytoplasm. Approximately 20% of the sera of chronic chagasic patients were capable to recognize the recombinant protein GARP, and all of them recognized only the C-terminus of GARP, which contains the acidic sequences. When we immunized mice with the recombinant protein GARP, we achieved antibodies against the whole protein GARP. With anti-GARP serum we carried out assays on beating rat cardiomyocytes. With neither of the antisera beating frequency was altered and immunized mice with high anti-GARP titers showed no electrocardiografic alterations. As alternative method of immunization, we assayed immunizations with DNA plasmids. With this immunization technique we attempted to reflect better the situation of the chronic infection, since the constant presentation of the parasitic antigens from the host’s muscular cells could be more appropriate to study the pathogenicity of the disease. To set up this methodology we achieved immunizations with DNA coding genes of ribosomal TcP2β and TcP0 proteins. The DNA immunizations with TcP2β, TcP0 and GARP generated antibodies capable to recognize different epitopes to those obtained in the natural infection. No alterations in cardyocytes culture nor electrocardiografics recording in mice were observed. In contrast, immunization with TcP2β and TcP0 recombinant proteins generated functionally active antibodies. So we conclude that DNA immunization is useful to generate antibodies against epitopes that are different than the antibodies obtained in immunization with recombinant protein o in the natural infection. This could be useful to generate a vaccine against T. cruzi.

Grassi, Lubiana. "Interacción Schistosoma mansoni y sus hospederos : mecanismos de resistencia en poblaciones argentinas de biomphalarias frente a S. mansoni y dinámica de la transmisión de ésta parasitosis por el hospedero mamífero" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La esquistosomosis es una enfermedad causada por parásitos del género Schistosoma, transmitidos por caracoles de agua dulce del género Biomphalaria (hospedero intermediario) y que infectan al mamífero entre ellos al hombre (hospedero definitivo). En el presente trabajo de Tesis se ha estudiado la interacción parásito-huésped, especialmente con el hospedero intermediario y, en relación al hospedero mamífero, la calidad del huevo/miracidio en función de su capacidad para infectar al caracol. Se estudió el sistema de defensa de poblaciones argentinas de biomphalarias descriptas como resistentes a S. mansoni (B. straminea y B.orbignyi) en comparación con B. glabrata (susceptible). Se abarcaron aspectos histológicos e inmunológicos para estudiar la respuesta celular y humoral del hospedero tendientes a determinar posibles mecanismos involucrados en la resistencia a S. mansoni. Por otro lado, se evaluó la dinámica en la tasa de eclosión de huevos recuperados de distintos tejidos del hospedero mamífero, así como la capacidad infectiva de los miracidíos obtenidos de estos huevos durante 12 meses de infección murina por S. mansoni. Los resultados de esta investigación evidenciaron que B. straminea posee un sistema de defensa muy potente que en menos de 24 hs es capaz de reconocer y destruir a los distintos estadios larvales de S. mansoni. No se logró romper esta resistencia, aún cuando se usaron elevadas dosis de miracidíos o exposiciones sucesivas al parásito. B. orbignyi fue descartado como especie refractaria a la infección al igual que como especie resistente. El parásito penetró y evolucionó hasta esporoquiste. Este hecho no pudo asociarse a un sistema defensivo potente, dado que aún pasados 30-60 días de la exposición al parásito se encontraron esporoquistes viables en distintos grados de desarrollo en sus tejidos, sin respuesta celular asociada a ellos pero sin otros progresos a partir de este estadio. En periodos más prolongados que 60 días de infección no se pudo evaluar la evolución de S. mansoni puesto que a estos tiempos el caracol infectado presentó un importante deterioro de la arquitectura tisular, que lo llevó a la muerte. Cuando se coinfectó B. orbignyi con otro trematode, S. mansoni evolucionó hasta la emisión de cercarias. Sin embargo, estas cercarias fueron menos exitosas para infectar al hospedero mamífero. La falta de respuesta celular aún en la especie resistente B. straminea podría estar compensada con una adecuada defensa humoral mediada por proteinas tipo citoquinas. En este sentido B. straminea presentó niveles basales altos de TNF-α e IL-6 con respecto a la especie susceptible B. glabrata y, a pesar que la exposición al parásito modificó estos niveles, los mismos se mantuvieron siempre por encima de los presentados por B. glabrata. Se podría especular que se requiere un umbral de estas citoquinas para mantener la resistencia frente a la infección, y que, los caracoles susceptibles no tendrían capacidad para producir o mantener esos niveles de citoquinas. Por el contrario en B. orbignyi los valores de estas citoquinas estuvieron siempre por debajo de las otras especies independientemente de la exposición al parásito. La falta de respuesta celular antes mencionada y el bajo nivel de citoquinas registrado en B. orbignyi, así como la mala calidad de las cercarias de S. mansoni emitidas al coinfectarlo con otros trematodes nos inducen a proponer a esta especie como un hospedero inadecuado. El patrón de proteinas de hemolinfa y tejido se evaluó con el propósito de determinar aquellas que pudieran estar expresadas diferencialmente pre y post exposición al parásito. En el caso de hemolinfa se registraron modificaciones en la expresión de 2 proteínas (76 y 79 kD). Las mismas se expresaron en B. orbignyi y desaparecieron en B. straminea luego de la exposición al parásito. En tejidos de B. orbignyi expuestos a S. mansoni también se expresaron 2 proteínas de 66 y 72 kD, mientras que en B. straminea una banda de 224 kD desapareció post-exposición. Ninguna de estas proteinas fue detectada en B. glabrata. Si bien estos son resultados preliminares seria interesante caracterizarlas y estudiar si están asociadas a infección y/o resistencia en estas especies. Dado que la efectividad de la transmisión de esta parasitosis está ligada a la calidad de los estadios parasitados que se liberan al medio para infectar al molusco, se estudió la potencialidad de transmisión de S. mansoni a lo largo de 12 meses de infección del hospedero definitivo. Se observó que tanto el éxito de eclosión de los huevos como la infectividad de los miracidios para B. glabrata, especie susceptible, disminuyeron con el tiempo de infección del mamífero. El conjunto de estos resultados indican que ante la eventual introducción en una región libre de esquistosomosis como es la Argentina, de mamíferos parasitados provenientes de áreas endémicas, la probabilidad de establecimiento de un foco sería dependiente, por lo menos, del tiempo de infección del hospedero vertebrado así como de la susceptibilidad de los caracoles y las modificaciones que los mismos puedan sufrir por coinfecciones con otros trematodes.

Abstract:
Schistosomosis is a disease caused by parasites of the gender Schistosoma, transmitted by freshwater snails of the gender Biomphalaria (Intermediate host) and capable to infect the human (Definitive host). Herein we studied the parasite-hosts interactions with special reference to the intermediate host and, when referred to the mammalian host, with the quality of egg/miracidia to infect the snail. We have studied the defense system to S. mansoni in Argentinean populations of biomphalarias (B. straminea and B.orbignyi) in comparison with B. glabrata (susceptible control). Histological and immunological aspects were considered to study the host cellular and humoral responses in order to determine possible mechanisms involved in resistance to S. mansoni. On the other hand, during 12 months of the murine infection the dynamics of the hatching rate of S. mansoni eggs obtained from different host tissues were evaluated, as well as the miracidia capacity to infect their intermediate hosts. The results of this investigation showed that B. straminea possess an efficient defense system which in less than 24 hs recognized and destroyed the S. mansoni larval stages. Resistance was equally efficient even when high doses of miracidia were used or successive exposition to the parasite were performed. B. orbignyi, was discarded as a refractory especie as well as a resistant one, because infection progresses up to sporocyst stage. This fact could not be associated to a potent defense system, since past 30-60 days post-exposition viable esporocyts in different development stages, without cellular response were observed. Thereafter, further progress of S. mansoni was impossible to evaluate because the huge deterioration of the snail’s architecture tissue after 60 days post-exposition. On the other hand, coinfection with another trematode allowed S. mansoni to progress up to cercarial emission. However, these cercaria were less effective to infect the definitive host. The lack of cellular response could be compensated by humoral defense mediated by hemolymph proteins. In this sense, B. straminea presented high basal levels of TNF-α-like and IL-6-like cytokines compared with the susceptible species. Despite that parasite increased or decreased cytokine levels, values always remained over those of B. glabrata. It might be speculated that a certain cytokines threshold level would be required to excert resistance. Therefore, it is possible that as a result of parasite-mediated interference, snails produce cytokine levels under the threshold and become susceptible to the infection. In the B. orbignyi cases, cytokines levels were always below the values registered for the other species, independently of the parasite exposuse. However, S. mansoni failed to progress in these snails. The lack of cellular reponse together with the extremely low level of cytokines as well the poor quality of the cercaria emited by coinfected snails, allowed us to classify B. orbignyi as an inadequate host. The protein patterns of hemolymph and tissues were evaluated in order to determine those that could be differentially expressed before and after parasite exposition. Modifications in the expression of two proteins of 76 and 79 kD were registered in hemolymph. Both were expressed in B. orbignyi and vanished in B. straminea, after-parasite exposition. In tissues of B. orbignyi other two proteins of 66 and 72 kD were expressed while other of 224 kD vanished in B. straminea afterexposition. Neither of these proteins were detected in B. glabrata. Even when these are preliminary results it will be interesting to characterize these proteins and to study whether they are or not associated to infection and/or resistance in these snail species. Since the effectiveness of the transmission of this parasitosis is bound to the quality of egg/miracidia that are liberated to infect the molluscs, the potentiality of S. mansoni transmission by the definitive host was studied along 12 months of infection. It was observed through this period that the capacity of the eggs to hatch and the miracidia to infect B. glabrata diminished with the time of infection of the definitive host. Summing up, the results of this Thesis indicate that the probability of establishment of a focus of schistosomiasis in a region free of this parasitosis like is Argentina will be dependent, at least, on the susceptibility of the snails, the modifications that coinfections can introduce in the intermediate host and the time evolved since the infection of the vertebrate host .

Torres Jordá, Martín. "Estudio de la relación entre el parásito Leidya Distorta (isopoda: bopyridae) y su hospedador Uca Uruguayensis (brachyura: ocypodidae), y descripción de los estadíos larvales de L. Distorta" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En 1994 se descubrió que algunos cangrejos Uca uruguayensis de Punta Rasa, bahía Samborombón, estaban infestados por el isópodo bopírido Leidya distorta. Este parásito había sido previamente encontrado en otras especies del género Uca y en el cangrejo Ucides cordatus, sobre la costa atlántica entre New Jersey (EE.UU.) y Rio de Janeiro (Brasil). Con el fin de estudiar la interacción entre L. distorta y su hospedador, se recolectaron mensualmente ejemplares de Uca uruguayensis en Punta Rasa, bahía Samborombón, desde febrero de 1995 hasta marzo de 1996. Se emplazaron 5 estaciones; en cada fecha de muestreo y en cada estación se trazaron dos transectas de 5 m de largo por 0,2 m de ancho, orientadas en la dirección de la pendiente de la playa. Las transectas fueron excavadas hasta una profundidad de 30 cm. Los cangrejos fueron separados a mano, fijados en formalina 5% y conservados en etanol 70%. De un total de 12.033 cangrejos recolectados a lo largo de los 14 meses de muestreo, 1.115 (9,3%) estaban infestados por algún estadio de L. distorta. El estudio de estos estadios permitió seguir el desarrollo del parásito en su hospedador definitivo. Cuando una larva criptonisquia invade una cámara branquial desocupada, se asienta en el espacio limitado por dos laminillas branquiales contiguas. Un tiempo después la criptonisquia muda al estadio bopyridium, el que permanece entre las laminillas branquiales. Este último es sucedido por varios estadios juveniles hembra, que se fijan al techo de la cámara branquial. Al alcanzar un cierto grado de desarrollo la hembra juvenil atrae a otra criptonisquia, que a poco de asentarse sobre su cuerpo deviene macho. Los machos van cambiando de posición sobre las hembras a medida que éstas crecen. Las hembras adultas son asimétricas y ocupan la mayor parte de la cámara branquial; se orientan con la cabeza hacia atrás, el vientre hacia arriba y el dorso contra las branquias del cangrejo. Estas hembras obtienen hemolinfa de un gran vaso horizontal que corre por debajo del epitelio interno del branquiostegito del cangrejo. El porcentaje de cangrejos infestados (prevalencia) por L. distorta varió entre 5,24% y 17,8% a lo largo de los l4 meses de muestreo. Todos los estadios del parásito fueron más abundantes en los cangrejos grandes. Siendo que los machos de U. uruguayensís alcanzan mayor talla que las hembras, la prevalencia fue mayor entre los primeros. Los cangrejos macho infestados mayores que 10,5 mm, si bien representaron solo 5,92% de los cangrejos recolectados, hospedaron 68,8% del total de parásitos. Las larvas criptonisquias fueron mucho más frecuentes entre los cangrejos que estaban mudando (blandos) que entre los cangrejos en intermuda (duros). La distribución estadística de las criptonisquias en los cangrejos en intermuda fue “agrupada” o “contagiosa”, en conformidad con el modelo binomial negativo. Los cangrejos infestados sufren varias alteraciones morfológicas. Aquellos que albergan un parásito hembra adulto a menudo presentan un área despigmentada sobre la pared lateral del caparazón. Un área despigmentada adicional se observa algunas veces en el fondo del surco ocular. Las hembras adultas del parásito producen un ligero abultamiento de la cámara branquial del hospedador, siendo esta deformación más marcada en los cangrejos pequeños. Las branquias de los cangrejos parasitados pueden estar deformadas: la hembra adulta de L. distorta tiene una robusta carena dorsal que encaja entre las branquias 4ta. y 5ta. del cangrejo, desplazándolas lateralmente. Por último, L. distorta inhibe el crecimiento alométrico del quelípedo mayor de los cangrejos macho: en los machos parasitados por hembras adultas el quelípedo mayor fue en promedio 6,5% más corto que en los no parasitados. La densidad de U. uruguayensis varió entre 133 y 207 ind./m² a lo largo del año. Los machos representaron 61,6% del total de individuos recolectados. Entre los cangrejos pequeños la razón de sexos fue 1:1, entre los medianos predominaron las hembras y entre los grandes prevalecieron los machos. La población presenta un componente de individuos adultos de tamaño grande que permanece estable a lo largo de todo el año. Los cangrejos se reproducen desde noviembre hasta febrero, dando lugar cada año a una nueva cohorte. Las hembras de L. distorta se reprodujeron activamente durante la primavera tardía y el verano. En otoño la actividad reproductiva fue decreciendo, de tal suerte que para el invierno todas las hembras adultas tenían sus marsupios vacíos. El crecimiento de los parásitos inmaduros se detuvo en invierno y recomenzó en primavera. En octubre-noviembre ya no quedaban criptonisquias en los cangrejos; aquellas larvas que sobrevivieron al invierno mudaron al estadio bopyridium al comienzo de la primavera y luego crecieron con rapidez, para reproducirse en diciembre o enero. La taxonomía de la superfamilia Bopyroidea ha sido establecida sobre la base de la forma de los adultos, sin prestar mayor atención a los estadios larvales. Sin embargo, la clasificación de los Bopyroidea está lejos de ser estable, dado que los individuos adultos muestran amplias variaciones aun dentro de una misma especie. En un esfuerzo por encontrar criterios más confiables para la clasificación de las especies del grupo, se describen en detalle las larvas epicarídea y criptonisquia de Leidya distorta. La larva criptonisquia de L. distorta tiene pleópodos unirramosos y urópodos con una larga seda caudal. En la literatura se encuentran descriptas tres criptonisquias que comparten estas características. Una es Cancricepon elegans que, al igual que L. distorta, pertenece a la subfamilia Ioninae. Otra, no identificada, fue encontrada en la desembocadura del río Tocantins, Brasil. La tercera fue asignada a Probopyrus bithynis, aunque su identidad específica es dudosa. El género Leidya contiene 4 especies, siendo Leidya bimini de las islas Bermudas la más próxima a L. distorta. Los adultos de estas dos especies se diferencian principalmente por la posición, más central o lateral, de los tubérculos que conforman la carena torácica dorsal. Las criptonisquias de L. bimini y L. distorta difieren en la longitud de las sedas caudales, hecho que refuerza la validez de estas especies.

Abstract:
In 1994, some specimens of the fiddler crab Uca uruguayensis from Punta Rasa, Samborombón Bay, Argentina, were found housing the bopyrid isopod Leidya distorta in their branchial Chambers. This parasite was previously reported from other species of Uca and Ucides cordatus, ranging from New Jersey (USA) to Rio de Janeiro (Brazil). In order to study the relationship between L. distorta and U. uruguayensis, fiddler crabs were monthly collected in Punta Rasa, Samborombón Bay, from February 1995 to March 1996. The sampling program included five stations; on each sampling date, two transects 5 m long and 0.2 m wide were delimited in each station. Transects were dug with shovels to a depth of 30 cm, and the chunks of sediment were examined for crabs. These were picked by hand, fixed in 5% formaldehyde and preserved in 70% ethanol. Throughout the study, 1,115 of 12,033 crabs (9.3%) were infested by different developmental stages of L. distorta. The inspection of these stages allowed me to follow the development of the parasite in the definitive host. When a cryptoniscus larva arrives in an unoccupied branchial chamber, it settles in the space between two contiguous gill lamellae. Then the cryptoniscus molts into bopyridium, which stays between the gill lamellae. The bopyridium is followed by several juvenile female instars that are attached to the roof of the branchial chamber. As a female grows, it becomes attractive to new arriving cryptonisci, which settle on the female’s body and develop into males. These males change their position on the female as the latter develops. Adult females occupy the branchial chamber almost completely, with the head directed backwards and the dorsurn in contact with the crab gills. They suck hemolymph from a large horizontal vessel that runs below the internal epithelium of the crab’s branquiostegite. Prevalence of L. distorta varied between 5.24% and 17.8% throughout the study. All parasite stages were more abundant among the larger crabs. Since the males of U. uruguayensis attain larger sizes than females, parasite prevalence was higher among the former. Infested male crabs larger than 10.5 mm carapace width, which represented only 5.92% of the crabs collected, housed 68.8% of all the parasites recovered. Cryptoniscus larvae were much more frequent among molting (soft) crabs than intermolt (hard) crabs. The frequency distribution of cryptonisci among hard crabs was contagious and could be fitted by a negative binomial model. Infected crabs showed several morphological pathologies. Those that housed an adult female parasite frequently bore an unpigmented area on the lateral wall of the carapace. An additional faded area was sometimes observed on the bottom of the eye orbit. Adult female parasites usually produced a subtle lateral swelling on the carapace of the host, this deformation being more marked in smaller crabs than in larger ones. Alterations of the host’s gills were noticed: the adult female parasite has a strong dorsal carina that fits between the fourth and fifth gills of the crab, displacing them laterally. Finally, L. distorta inhibits the allometric growth of the mayor cheliped of male crabs. In males that harbored adult female parasites, the chela was on average 6.5% shorter that in non-parasitized males. Density of U. uruguayensis ranged from 133 to 207 ind/m² throughout the study period. Males represented 61.6% of the crabs collected. Sex ratio among the smaller crabs was 1:1, however females outnumbered males in the medium-size classes, whereas the opposite was true in the larger size classes. The crab population presented a component of large adults that remained stable throughout the year. Reproduction extended from November to February, yielding a new cohort each year. Females of L. distorta bred actively during late spring and summer. In autumn reproductive activity decreased and by winter all the adult females had empty marsupia. The growth of immature parasites stopped in winter and resumed in spring. By October-November no cryptonisci remained in the crabs. Overwintered larvae molted to the bopyridium stage in early spring and then grew rapidly, attaining the ovigerous condition in December or January. The taxonomy of the Superfamily Bopyroidea has been based mainly on adults, whereas the larval instars have been paid little attention. However, adult bopyroids show high intraspecific variability and thus their classification is rather unstable. In order to provide more rigorous criteria for the classification of the species of this group, the epicaridium and cryptoniscus larvae of L. distorta are herein described in detail. The cryptoniscus larva of L. distorta has unirameous pleopods and uropods with long caudal setae. There are three other cryptonisci that share these features. One is Cancricepon elegans which, like L. distorta, belongs to the subfamily Ioninae. Another one, still unidentified, was collected in the plankton at the mouth of the Tocantins River, Brazil. The third was identified as Probopyrus bithynis; however, its taxonomical status remains questionable. The genus Leidya contains four species, of which L. bimini is the most closely related to L. distorta. The adults of these two quite similar species differ mainly by the position of the dorsal carina, which can be more lateral or more medial. In contrast, an unambiguous criterion can be drawn from their cryptoniscus larvae, which markedly differ in the lengths of the caudal setae of their uropods.

Mougabure Cueto, Gastón Adolfo. "Caracterización de la resistencia a insecticidas piretroides en pediculus humanus capitis De Geer 1778 : estudio comparativo entre estados embrionarios y postembionarios" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los objetivos de este trabajo de tesis están relacionados a la evaluación de la resistencia a insecticidas piretroides en los estados embrionarios t postembrionarios de poblaciones de Pediculus humanus capitis de Buenos Aires resistentes a permetrina. Durante el desarrollo de la tesis fueron planteados objetivos a posteriori necesarios para el desarrollo de los objetivos originales. Los objetivos fueron: Observar la posible expresión de resistencia a insecticidas en embriones en poblaciones de P. humanus capitis con resistencia detectada en estadios postembrionarios. Estudiar los mecanismos de resistencia a insecticidas expresados en embriones y estados postembrionarios. Estudiar los mecanismos de resistencia a insecticidas expresados en embriones y estados postembrionarios de P. humanus capitis. Los objetivos a posteriores fueron: Caracterizar morfológicamente el desarrollo embrionario de P. humanus capitis y P. humanus humanus a fin de trabajar con homogéneo en cuanto al tiempo de desarrollo. Determinar las condiciones ambientales óptimas (T°C y HR%) para el desarrollo de P. humanus capitis en laboratorio. Puesta a punto de los métodos de medición de actividad enzimática en los embriones. De acuerdo a estos objetivos se obtuvieron los siguientes resultados y conclusiones: Se caraterizó el desarrollo embrionario según caracteres morfológicos vistos a través de la transparencia del corion. Los caracteres morfológicos fueron: apéndices y manchas oculares. La ombinación de los distintos estados de desarrollo de estos caracteres permitieron determinar rtes etapas en la embriogénesis:etapa temprana, etapa media, y etapa tardía (manchas oculares negras). Se determinaron las condiciones ambientales optimas (temperatura y humedad relativa) en laboratorio para la embriogénesis de P. humanus capitis: 27-31°C de temperatura y 45-75% humedad relativa. Se observó que en poblaciones con resistencia a piretroides y DDT expresada en los estados postembrionarios los embriones también expresan resistencia a los mismos insecticidas. En estados postembrionarios, no se observó resistencia a carbaril ni a spinosad. En embriones no se observ+o resistencia a spinosad pero se determinó una incipiente resistencia a carbaril. Se midió actividad esterasa en embriones por la stres metodologías utilizadas (Gomori, Ellman y Fluorométrico), por el contrario no fue posible determinar actividad del complejo P450 por el método fluorométrico utilizado. Según los resultados de inhibición enzimática in vivo y la determinación de las actividades enzimáticas una mayor actividad esterasa no parece estar involucrada en la resistencia observada en adultos y en embriones. Según el análisis global de los resultados, la resistencia en las poblaciones de P. humanus capitis utilizadas en este trabajo se debería: 1) modificación de sitio de acción de piretroides y DDT (tipo-kdr) (estados embrionarios y postembrionarios), 2) aumento metabolismo oxidativo (estados postembrionarios). Se plantea al insecticida spinosad como posible activo en formulaciones pediculicidas.

Abstract:
The aim of this thesis are related to the evolution of the pyrethroids insecticide resistance in embryonic and postembryonic stages of Pediculus humanus capitis populations from Buenos Aires resistant to permethrin. During the development of the thesis a posteriori objetives were settled necessary for the development of the original aims. The original aims were: To observe the possible expression of insecticide resistance in embryos in P. humanus capitis population with detected resistance in postembryonic stages. To study the insecticide resistance mechanism expressed in P. humanus capitis embryos and postembryonic stages. The a posteriori aims were: To characterize morphologically the embryonic development of P. humanus capitis and P. humanus in order to work with homogeneous material as regards development time. To determinate the optimal environmental conditions (T°C and HR%) for the P. humanus capitis in laboratory. To determinate the measure methods of enzimatic activity in embryos. According to these aims the following results and conclusions were drawn: The embryonic development according to morophological characters seen through the corion transparence were characterized. The morphological characters were: appendages and oculars spots. The combinations of different development stages of these characters allowed to determinate three periods of time in the embryogenesis: early period, middle period and late period. Optimal environmental conditions were determinated (T°C and HR%) in the laboratory for P. humanus capitis: 27-31°C temperature and 45-75 relative humidity. It was observed that in populations with resistance to pyrethoids and DDT expressed in postembryonic stages, the embryos also express resistance to the same insecticides. In postembryonic stages, carbaryl and spinosad resistance was not observed. Resistance to spinosad was not observed in embyos but an incipient carabryl resistance was determined. Esterase activity embryos was measured by the three used methods (Gomori, Ellman and Fluorometric) on the contrary it was not possible to determine P450 complex activity by the fluorometric method. According to in vivo enzimatic inhibition results and the enzimatic activities determination, an increased in esterase activity is not involved in the resistance observed in adults and embryos. According to the global analysis of results, the resistance in P. humanus capitis population used in this research would be due to: 1)pyrethroids and DDT site of action modification (kdr-like) (embryonic and postembryonic stages), 2) oxidative metabolism increase (postembryonic stage). Spinosad insecticide as a possible active in pediculicide formulations is questioned.

Kleiman, Florencia. "Fasciola hepática (Trematoda: Digenea) en ganado bovino de los valles cordilleranos patagónicos: factores involucrados en su transmisión." (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La fasciolosis, causada por Fasciola hepatica, es una de las enfermedades parasitarias de mayor importancia para la actividad ganadera por que produce considerables pérdidas económicas a escala mundial. Con el objetivo de caracterizar la transmisión en un área de alta endemicidad como son los valles cordilleranos patagónicos, se realizaron estudios en un establecimiento ganadero de la localidad de Cholila, Chubut, entre diciembre de 1998 y febrero de 2002. Se identificó al caracol que actúa como hospedador intermediario de F. hepática, se caracterizaron los ambientes donde se desarrolla y se estudió su dinámica temporal en relación con las condiciones climáticas de la zona. Se estimaron las prevalencias en el hospedador intermediario y en el hospedador definitivo por observación directa del parásito y por métodos coprológicos, respectivamente. Se recopiló información sobre el tiempo de permanencia del ganado en cada ambiente. Lymnaea viatrix resultó ser la única especie de la familia Lymnaeidae presente en el área de estudio. El hallazgo de esta especie a latitudes superiores a los 41° S amplía su rango de distribución austral mundial. Se comprobó que L. viatrix puede desarrollarse en cualquier cuerpo de agua (Temporal o permanente) que presente parches poro disturbados, con el suelo de barro cubierto por una delgada película de agua y escasa vegetación. Los caracoles hibernaron durante el invierno, entraron en actividad durante la primavera, ovipusieron a comienzos del verano y luego los individuos de mayor tamaño murieron a comienzos del otoño. Esta dinámica se vió fuertemente afectada por la disponibilidad de agua en el suelo. Se registró infección por F. hepática durante todo el estudio únicamente en caracoles adultos y las prevalencias fluctuaron entre 1 y 14%. Los caracoles parasitados sólo se detectaron en verano y otoño. La inflacipon en caracoles no estuvo relacionado con su abundancia en cada ambiente ni con su estructura de tamaños, pero se relacionó con el tiempo que el ganado estuvo pastando en cada ambiente. En el ganado, la prevalencia al comienzo del estudio resultó mayor en los animales jóvenes que en los adultos, y a pesar de que esta tendencia desapareció luego de tres años de tratamientos antihelmínticos, los niveles de infección general fueron cercanos al 50% en todo momento. La utilización de drogas no tuvo efecto sobre la prevalencia en el ganado ni redujo la cantidad de huevos eliminados al ambiente. Los resultados sigieren que el manejo sanitario basado en la aplicación de antihelmínticos no contribuyó a disminuir la proliferación del parásito en el ambiente, ya sea por una alta oferta de metacercaria todo el año o por una baja eficacia de las drogas. En el área de estudio, los noveles bajos de infección en caracoles mantienen altas prevalencias en el ganado, aún con la continua aplicación de antiparasitários. Debido a que la mejor estrategia de control es la que combina manejo ambiental con quimioterapia estratégicamente adecuada a las características de la transmición en cada región, la información microepidemiológica generada en este estudio puede ser útil para implementar una estrategia adecuada.

Abstract:
Fasciolosis in cattle, caused by Fasciola hepática, is a worldwide disease of major economical importance. The object of this thesis was to investigate the factors involved in the parasite transmission in a highly endemic area such as the Andean Valleys in Argentine Patagonia. Research was conducted in a livestock farm located in the Locality of Cholila, Chubut, between December 1998 and February 2002. Studies comprised the identification of the intermediate snail host, habitat characterization, and the relationship between temporal dynamics on the snail population and local climatic conditions. Parasite prevalences were estimated in snails and cattle grazing in each environment was registered. Lymneae viatrix was the only lymnaeid species in the study area and its finding south of parallel 41°S extends its distribution range. This snail occurred in temporary and permanent waterbodies with scarcely distribution patches of mud covered by a thin water layer and bare vegetation. Snails hibernated during winter, resumed activity in spring, oviposited at the beginning of summer and large-sized individuals died at the beginning of autumn. Population dynamics was strongly influenced by water availability in the soil. F. hepatica was only detected in adult snails during summer and autumn, and prevalences ranged from 1 to 14%. Snail infection was not related with snail abundance or size structure, and was related to the duration of cattle grazing in each environment. At the beginning of the study prevalence in cattle was higher in young animals than in older ones, and although this tendency disappeared after three years of anthelmintic treatment, values remained high in both groups of animals. Overall infection levels were about 50% throughout the study. Anthelmintic drugs has no effect on cattle prevalence or on the reduction of egg-shedding. Results suggest that sanitary management based on anthelmintics did not diminish parasite build-up in the environment, either by a high offer of metacercariae all year round or lack of chemotherapy efficacy. Low infection prevalences in snails were responsible for high levels of infection in cattle, despite the continuous administration of anthelmintics. On the basis that the best control strategy should combine environmental management with chemotherapy adapted to the particular regional features, micro-epidemiological information provided herein would contribute to limit looses in live-stock.

Toloza, Ariel Ceferino. "Bioactividad y toxicidad de componentes de aceites esenciales vegetales, en Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) resistentes a insecticidas piretroides" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los piojos de la cabeza, Pediculus humanus capitis De Geer (Phthiraptera: Pediculidae) son ectoparásitos obligados de humanos. La infestación con piojos produce irritación de la piel, prurito y riesgo de infecciones secundarias como consecuencia del rascado. El control químico de esta plaga ha sido mediante el uso de insecticidas clorados (DDT y lindano), organofosforados (malatión), carbamatos (carbaril), piretrinas naturales y piretroides (deltametrina, permetrina, d-fenotrina). Actualmente el uso de estos insecticidas está limitado por el desarrollo de poblaciones de piojos resistentes. Una alternativa a los insecticidas convencionales son los compuestos botánicos tales como los aceites esenciales (AE) de plantas aromáticas y sus componentes, los cuales han despertado alto interés por su actividad adulticida, ovicida y repelente en varios insectos plaga. Los objetivos planteados en esta tesis fueron: a) establecer la actividad biológica de los vapores de aceites esenciales y de sus componentes provenientes de plantas autóctonas y exóticas que crecen en Argentina sobre poblaciones de huevos y adultos de piojos resistentes a piretroides; b) analizar el efecto repelente de los mencionados aceites; y c) estudiar los mecanismos involucrados en el modo de acción y el rol de las enzimas monooxigenasas en la toxicidad de los monoterpenoides sobre piojos de la cabeza. Los piojos utilizados se recolectaron mediante el uso de peine fino de cabezas de niños de entre 3 y 13 años provenientes de escuelas primarias de Buenos Aires. Los 49 aceites esenciales fueron colectados en diversas regiones de Argentina durante la primavera de los años 2003-2004 y 2006-2007. Los 26 monoterpenoides estudiados en esta tesis fueron de origen comercial. Previo al estudio del efecto insecticida de los AEs, se determinó el grado de pediculosis (presencia de al menos una forma viable de piojo) y los niveles de resistencia a permetrina de las poblaciones a estudiar. Para el estudio de la fase vapor de los AEs y de los monoterpenoides sobre las liendres y sobre los adultos, se empleó una cámara cerrada que permitió la liberación progresiva del aceite o componente puro. En el caso de las formas eclosionadas, se midió el volteo de los piojos cada 5 min durante 1 h, y luego se calculó el tiempo de volteo necesario para afectar el 50% de los piojos (TV50). Con respecto a las liendres, las mismas fueron expuestas durante 24 hs al vapor de las sustancias en estudio y se registró el porcentaje de mortalidad (%). La actividad repelente de los AEs y de los monoterpenoides fue medida sobre una arena experimental concéntrica diseñada para este estudio. Se midió el porcentaje de insectos que estaban en el área tratada y control, y se calculó el índice de repelencia (IR). Con respecto a la medición enzimática de la actividad de acetilcolinesterasa (AChE), la misma fue determinada por un método espectrofotométrico y cinético. En primer lugar se estudió el efecto de los monoterpenoides sobre la inhibición de la AChE de anguila eléctrica. Luego se calculó la concentración de inhibición al 50% (CI50) del compuesto más efectivo usando las enzimas de AChEs de anguila eléctrica y la extraída a partir de homogenatos de piojos. Posteriormente, se expusieron piojos a los vapores del compuesto más efectivo y a los de un compuesto organofosforado volátil (diclorvos-DDVP-) del que se conoce su gran poder inhibitotio sobre la actividad de acetilcolinestarasa. Para analizar el posible rol de las enzimas monooxigenasas en la degradación de monoterpenoides, se topicaron las formas post-embrionarias de piojos con diferentes concentraciones del butóxido de piperonilo (PBO)- un conocido inhibidor de oxidasas-, y luego los piojos fueron expuestos a los vapores del monoterpenoide más efectivo y del compuesto organofosforado diclorvos-DDVP-. Los resultados demostraron un promedio de 29,7% de los chicos analizados tenían piojos, siendo encontrados más frecuentemente en las nenas que en los varones. Los grados de resistencia (GRs) de las poblaciones estudiadas de P.h.capitis variaron desde un 28,57 hasta un 71,42 (en comparación con la cepa de referencia susceptible de P.h.humanus). No se encontraron diferencias significativas en los valores de TV50 de las poblaciones con grados de resistencia diferentes. Esto sugiere que los mecanismos de resistencia a piretroides no afectan de manera prioritaria o directa a la toxicidad a los vapores de AEs y a sus componentes. En relación a al efecto fumígeno de los AEs sobre formas eclosionadas hay que mencionar que 24 de los 49 aceites estudiados (49%) produjeron un efecto tóxico sobre los piojos resistentes a permetrina. De estos aceites los más efectivos fueron aquellos obtenidos de plantas aromáticas autóctonas tales como Cinnamomun porphyrium, Myrcianthes cisplatensis, Aloysia citriodora (quimiotipo 2), Myrcianthes pseudomato, con valores respectivos de TV50 de 1,12; 1,29; 3,02 y 4,09 m. Estos aceites fueron entre 9 y 20 veces más tóxicos que los aceites que los precedieron. En relación a los compuestos monoterpenoides con mayor actividad fumígena sobre piojos, tenemos que destacar que el 1,8-cineol y el anisol fueron los más efectivos, con TV50s de 11,1 y 12,7m. Luego estuvieron los compuestos limoneno, 1S-(-)-α- pineno, β-pineno, (+)-α-pineno, linalol, mentona, α-pineno, pulegona, β- mirceno y alcohol bencílico. El TV50 del control positivo DDVP (un conocido fumigante) fue de 40,15 m y fue menos efectivo significativamente que los compuestos más efectivos, tales como el 1,8-cineol, el anisol y el limoneno. Se halló una correlación significativa entre los valores de TV50 y la presión de vapor de estos monoterpenoides, indicando que las sustancias más efectivas son las que poseen mayor presión de vapor. Cuando se profundizó en el estudio de aceites esenciales modificados genéticamente (híbridos de Eucaliptos), se halló que los híbridos Eucalyptus grandis X Eucalyptus camaldulensis y Eucalyptus grandis X Eucalyptus tereticornis produjeron mayor volteo (TV50= 13,6 y 12,9m) que sus formas parentales con TV50s de 25,6; 31,3 y 35m. Además, se halló una correlación significativa entre el porcentaje de 1,8-cineol y el TV50 de los mismos. Con respecto a la toxicidad de los monoterpenoides sobre los embriones hay que destacar que los compuestos más efectivos y de manera similar fueron el 1,8- cineol, anisol, el α-pineno, el β-pineno, el (+)-α-pineno, el 1S-(-)- α-pineno, el anetol, la carvona, el limoneno y el linalol. Esto es similar a lo observado para formas eclosionadas. En relación con la repelencia, el aceite esencial que produjo mayor repelencia sobre piojos de la cabeza fue el obtenido de la planta exótica Mentha pulegium y no difirió significativamente del control positivo piperonal. El compuesto con mayor efectividad repelente fue el alcohol bencílico con un índice de repelencia promedio de 57,74%, seguido de (-)-mentol, mentona y (+)-mentol con valores de IR respectivos de 53,56; 39,23 y 36,45%. Las lactonas estudiadas tuvieron efecto repelente en valores similares al control positivo. Con respecto a la actividad enzimática de acetilcolinestarasa medida sobre anguila eléctrica, se encontró diferencias significativas entre los 20 monoterpenoides, siendo el 1,8-cineol el que mayor inhibición produjo con un valor de CI50=6x10־³M. EL 1,8-cineol produjo inhibición de AChE obtenida de piojos, con una CI50=7,7x10־²M. Cuando se estudio la actividad sintomatológica de intoxicación del 1,8-cineol y del organofosforado DDVP, y se procedió a medir la inhibición de la AChE de piojos, se encontró que el 13% de la AChE estaba inhibida por el 1,8-cineol, mientras que el 80% de la enzima fue inhibida por el DDVP. Estos resultados demostraron relación entre la toxicidad del monoterpeno 1,8-cineol y la inhibición de la actividad AChE de piojos, y sugieren que habría otros mecanismos asociados a la sintomatología de volteo de piojos. El análisis del rol de las oxidasas de función mixta mostró una relación creciente entre la dosis subletal topicada con butóxido de piperonilo (PBO) y el TV50 de los piojos expuestos a los vapores del 1,8-cineol y del DDVP. Esto indica la importancia de este complejo enzimático en la degradación del monoterpeno 1,8-cineol. Para finalizar, hay que resaltar que es la primera vez que se realiza un estudio de toxicidad y repelencia de aceites esenciales obtenidos de plantas aromáticas de Argentina (y de sus componentes), sobre piojos resistentes a permetrina. Adicionalmente estos resultados aportan información para avanzar en el conocimiento del efecto de los monoterpenoides sobre la actividad de la enzima acetilcolinesterasa, y del rol de las enzimas monooxigenasas en la degradación de dichos compuestos.

Abstract:
The human head louse, Pediculus humanus capitis De Geer (Phthiraptera: Pediculidae) is an obligate ectoparasite of humans. The infestation with head lice is unpleasant and may cause itching, prurito and secondary skin infections due to scratching of irritated scalp. Chemical control of head lice has been based on a variety of insecticides, such as organoclorides (DDT and lindane), organophosphates (malathion), carbamaes (carbaryl), natural pyrethrins and pyrethroids (deltamethrin, permethrin, d-phenothrin). The overuse of these insecticides is limited due to the development of resistant head lice populations. Alternatives to conventional insecticides might be found in aromatic plants such as essential oils (EOs) and their monoterpenoids. Some of these natural products are repellents, adulticides and ovicidal against a wide variety of pests. The aims of the present thesis were: a) to establish the biological activity of the vapour phase of the essential oils and their main compounds obtained from aromatic plants of Argentina against eggs and adults of permethrin-resistant head lice; b) to analyzed the repellent activity of the essential oils; and c) to study the mechanisms involved in the mode of action and the role of the monooxygenases in the toxicity of the monoterpenoids against head lice. Head lice were collected from from heads of infested children 3-13 yr old, using a fine toothed antilouse comb. Fourty nine essential oils were collected from in the spring season of 2003-2004 and 2006-2007 from different regions of Argentina. Twenty six monoterpenoids were purchased from Aldrich. Prior to the study of the insecticide effect of the essential oils, pediculosis percentage (evidence of at least one living head lice) was calculated, and the permethrin resistance levels of the studied populations. An enclosed chamber was employed to study the fumigant activity of EOs and their components against eggs and adults of head lice. This method allowed creating a saturated micro-atmosphere as a result of the evaporation of the essential or component. Adults and nymphs III were observed for evidence of knockdown every 5 min for 60 min. Then, time in minutes to knockdown of 50% of each unit’s subjects (KT50). With respect to the eggs, each set was exposed to the substances for 24 h and mortalitity data was recorded. Repellency of EOs and components was estimated in an experimental arena with two areas. The number of lice was recorded every 5 min and each experiment was completed within 1 h. Then, a repellency index (RI) was calculated. The inhibition of the acetylcholinesterase activity (AChE) was calculated by a spectrofotometric and kinetic method. First, the inhibition of the monoterpenoids against AChE from electric eel was measured. Then, the inhibition concentration at 50% (IC50) of the most effective monoterpenoid was recorded from either AChE from electric eel or homogenate of lice. Finally, head lice were exposed to the vapours of the most effective compound and to the organophosphate dichlorvos-DDVP-, a well known AChE inhibitor. To study the role of the monooxygenases in monoterpenoide degradation, adult insects were topicated at different piperonil butoxide (PBO) concentrations and then exposed to the vapours of the most effective monoterpenoide and DDVP. The results showed that, in average, 29.7% of the anayzed children had lice, and with the girls being more infected than boys. The resistant ratios (RRs) of the studied populations of P.h.capitis varied from 28.57% to 71.42% (in comparison with the laboratory susceptible strain of P.h.humanus). There were no significant differences among the KT50 values of the different permethrin-resistant populations. These indicate that pyrethroid-resistance mechanisms were no affected by the toxicity of the EOs and monoterpenoids. About the fumigant activity of the EOs against postembryonic insects, 24 of the 49 studied (49%) oils were effective against permetrhin-resistant head lice. Of these EOs, the most effective were from the native aromatic plants like Cinnamomun porphyrium, Myrcianthes cisplatensis, Aloysia citriodora (chemotype 2), Myrcianthes pseudomato, KT50 values of 1.12, 1.29, 3.02 and 4.09 min; respectively. The mentioned oils were 9- to 20-fold more toxic than the studied EOs. The most effective monoterpenoids were 1,8-cineole and anisole, with values of 11.1 and 12.7m; respectively. They were followed by limonene, 1S-(-)-α-pinene, β-pinene, (+)-α-pinene, linalool, mentone, α-pinene, pulegone, β-myrcene and benzyl alcohol. The KT50 value of the positive control DDVP was 40.15 min, and was less effective than the three more toxic compounds like 1,8-cineole, anisole and limonene. A positive relationship was found between the KT50 values of the effective compounds and corresponding vapour pressures, suggesting that the more volatile the compounds, the more effective it was as a fumigant. With respect to the study of the genetically modified oils (eucalypt hybrids), it is important to show that fumigant activity of the hybrids Eucalyptus grandis X Eucalyptus camaldulensis and Eucalyptus grandis X Eucalyptus tereticornis was higher (KT50= 13.6 and 12.9 min; respectively) than that for pure species (KT50= 25.6, 31.3 and 35 min). Moreover, a significant correlation was found between KT50 data and % of 1,8-cineole in the essential oils. The toxicity of the eggs revealed that the most effective monoterpenoids were anisole, α-pinene, β- pinene, (+)-α-pinene, 1S-(-)- α-pinene, anethole, carvone, limonene, linalool and 1,8-cineole. It was in accordance with the pattern found in adult head lice. The most repellent essential oil was from the exotic Mentha pulegium and it was not significantly more repellent than the positive control piperonal. The most repellent monoterpenoid was benzyl alcohol with a RI= 57.74%, followed by (-) menthol, mentone y (+)-menthol with RI values of 53.56, 39.23 and 36.45%; respectively. The studied lactones possessed similar repellent activity than the positive control. Concerning the enzymatic activity of acetylcholinesterase from electric eel, there were significant differences among the 20 studied monoterpenoids, with the 1,8-cineole as the most inhibitor with a IC50=6x10־³M. Moreover, 1,8-cineole was an inhibitor of the AChE obtained from homogenate of head lice with a IC=7.7x10־²M. The study of the sintomatology of intoxication of the 1,8-cineole and DDVP, followed by the analyses of the inhibitory activity of AChE of lice revealed that 1,8-cineole inhibited 13% of the AChE while DDVP inhibited 80%. The analysis of OFM showed a relationship between the sublethal dose of PBO and the KT50 of the exposed head lice to the vapours of 1,8-cineole and DDVP. Finally, it is important to note that it is the first study of toxicity and repellency of essential oils and their compounds obtained from aromatic plants of Argentina against permethrin-resistant head lice. Additionally, the results obtained in the present thesis bring new insight into the knowledge of the mode of action of the monoterpenoids over the acetylcholinesterase activity and the role of the monooxigenases in the degradation of the mentioned components.

Maroniche, Guillermo Andrés. "Estudio de la interacción hospedante-patógeno entre el Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y el delfácido transmisor Delphacodes kuscheli" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Reoviridae, Fijivirus) causa la principal enfermedad que afecta al maíz en la Argentina. Su genoma consiste en diez segmentos de ARN de doble cadena (S1 a S10) que codifican para un total de trece proteínas. El virus es transmitido de manera persistente y propagativa por insectos de la familia Delphacidae. Luego de adquirir el virus, sólo una pequeña proporción de los insectos vectores pueden transmitir la enfermedad al alimentarse de plantas sanas. Se desconocen aún las bases moleculares de la transmisión de MRCV y en general de las funciones que las proteínas virales cumplen durante la infección. Para establecer si existe una correlación entre la acumulación viral y la transmisión, se desarrolló un protocolo útil para la cuantificación de MRCV u otros ARN endógenos en insectos individuales mediante RT‐qPCR. Se optimizaron los pasos a seguir desde el almacenamiento de muestras hasta la cuantificación viral. Debido a que la técnica de RT‐qPCR requiere la previa validación de controles internos invariables en los tratamientos a estudiar, se seleccionaron, clonaron y secuenciaron 7 genes de mantenimiento del delfácido transmisor Delphacodes kuscheli y se evaluó la estabilidad de su expresión durante la infección con MRCV. Se determinó que, de los 7 genes estudiados, el gen de la ubiquitina es el más establemente expresado y por lo tanto adecuado para ser utilizado como control interno de referencia. La plataforma desarrollada no sólo permitirá la cuantificación precisa del título de MRCV en individuos D. kuscheli, sino que además abre el camino a futuros estudios del cambio en la expresión de genes endógenos de los insectos infectados con MRCV. Esto permitirá aportar datos moleculares para lograr una compresión más integral de la interacción MRCV‐delfácido vector. En paralelo, se decidió estudiar la función que cumplen las proteínas de MRCV durante la replicación viral en el insecto expresándolas en células Sf9 (de insecto no hospedante) y se analizó su localización subcelular por inmunofluorescencia y en células vivas. Se determinó que tanto las proteínas estructurales P3, P4 y P8 como la proteína no estructural P7‐1, se distribuyen en el núcleo y el citoplasma celular. Dado que el tamaño de estas proteínas excede el límite permitido por el complejo del poro nuclear, los resultados sugieren que las mismas serían transportadas activamente al núcleo celular. Asimismo, se observó que la proteína P5‐2 se localiza exclusivamente en el núcleo. Es posible que estas proteínas de MRCV capaces de ingresar al núcleo celular jueguen un rol en la regulación transcripcional de las células del hospedante. Se observó que la proteína P5‐1 posee una distribución citoplasmática heterogénea de aspecto granuloso y que dicha distribución se torna homogénea en ausencia del tripéptido carboxilo terminal TKF, el cual es un presunto motivo de unión a proteínas PDZ o de importación a peroxisomas. Por otro lado, se determinó que P6 forma grandes cúmulos perinucleares amorfos y es capaz de relocalizar parte de la tubulina celular a éstas formaciones. Esto sugiere un posible rol para P6 en la formación del material fibrilar que se observa en células de insecto y planta infectadas con MRCV. La proteína P9‐2 fue capaz de localizar en la membrana plasmática e indujo la formación de filopodios membranosos en la superficie de las células, por lo que esta proteína podría estar involucrada en el transporte del virus a través de la membrana durante la infección del insecto vector. Por su lado, la proteína de cápside externa P10 fue capaz de localizar en el retículo endoplasmático y de colocalizar completamente con tubulina, sugiriendo que el MRCV explota el sistema de secreción y el citoesqueleto de tubulina para el ensamblado y/o transporte viral. Finalmente, P9‐1 fue capaz de formar inclusiones citoplasmáticas conspicuas similares a cuerpos de inclusión virales (VIBs) o viroplasmas. A continuación, se utilizaron algunas combinaciones de fusiones fluorescentes de proteínas del MRCV para analizar su colocalización subcelular. No se logró observar colocalización entre la proteína P9‐2 y P5‐1, P7‐1, P7‐2, P9‐1 o P10. Tampoco se observó colocalización entre P9‐1 y P10 o P5‐2. Por otro lado, se determinó que P6 colocaliza con P10, P9‐1 y P7‐2, indicando que P6 podría cumplir algún rol en la formación del viroplasma y/o reclutamiento de otras proteínas a estas estructuras, así como en el movimiento intracelular de los viriones. Dado que la localización subcelular de P9‐1 es similar a la distribución característica de las proteínas mayoritarias de viroplasma de reovirus, decidimos estudiar más en profundidad sus propiedades funcionales y bioquímicas. Observamos que, al igual que otras proteínas mayoritarias de viroplasmas de reovirus, P9‐1 se auto asocia en complejos de alto peso molecular al ser expresada en bacterias, auto interacciona in vivo localizadamente en los cuerpos de inclusión que forma en células de insecto, tiene la capacidad de unir ácidos nucleicos de simple cadena, posee actividad ATPasa y alberga un dominio importante para la formación de cuerpos de inclusión en su mitad carboxilo terminal. Estos resultados indican que P9‐1 es el componente mayoritario de los viroplasmas y por lo tanto juega un rol fundamental en la replicación y ensamblado del MRCV en las células hospedantes.

Abstract:
Mal de Río Cuarto virus (MRCV, Reoviridae, Fijivirus) causes the most important maize disease in Argentina. Its genome consists of ten double‐stranded RNA segments (S1 to S10) that encode a total of thirteen proteins. The virus is persistently and propagatively transmitted by planthoppers of the family Delphacidae. Planthoppers acquire the virus by feeding on infected plants and after a 10 days latency period (during which the virus replicates and moves) a small proportion of them become infective and can transmit the virus to healthy plants. The molecular basis of the transmission and the general function of MRCV proteins during infection are still unknown. To establish whether the differences in transmission between individuals are due to differences in viral accumulation, a protocol useful for quantification of MRCV or endogenous RNAs in individual insects by RT‐qPCR was developed. The protocol steps, from the sample storage to the viral quantification were optimized. Since the RT‐qPCR technique requires the previous validation of invariable internal controls in the studied conditions, 7 housekeeping genes from the planthopper vector Delphacodes kuscheli were selected, cloned, sequenced and evaluated for their expression stability during MRCV infection. Out of the 7 studied genes, the polyubiquitin gene was the most stably expressed and consequently the most reliable as a reference internal control. The platform developed along this work will be useful for the precise quantification of MRCV titers in individual D. kuscheli insects as well as for future gene expression studies in MRCV infected delphacids. In parallel, we studied the role of MRCV proteins during the insect viral infection by expressing them in Sf9 non‐host insect cells and analyzing their subcellular localization by immunofluorescence and live imaging. We determined that the structural proteins P3, P4, and P8, and the non‐structural protein P7‐1, are distributed in the nucleus and cytoplasm. Because the size of these proteins exceeds the limits allowed by the nuclear pore complex, the results suggests that they are actively transported to the cell nucleus. Likewise, we observed that P5‐2 is located exclusively in the nucleus. Those MRCV proteins able to enter the cellular nucleus may perhaps be involved in transcriptional regulation of the host genes. We also observed that P5‐1 displays a heterogeneous granular cytoplasmic distribution that turns into a homogeneous localization when the C‐terminal tripeptide TKF, which in turn is a putative PDZ protein interaction motif and/or a peroxisomal import motif, is absent. On the other hand, it was shown that P6 accumulates in big amorphous perinuclear inclusions, being able to relocalize some of the cellular tubulin to these structures. This suggests that P6 might be involved in the formation of the fibrillar material observed in MRCV‐infected insect and plant cells. The P9‐2 protein was able to localize to the plasma membrane of cells and induced the formation of superficial filopodia‐like formations, suggesting that this protein might be involved in the viral transport across the plasma membrane during the insect vector cells infection. The putative outer capsid protein P10 was located in the endoplasmic reticulum and completely co‐localized with tubulin, suggesting that MRCV might also exploit the secretion pathway and the microtubules cytoskeleton for assembly and/or viral transport. Finally, P9‐1 was able to form conspicuous cytoplasmic VIB‐like structures. Next, some of the fluorescent fusions of MRCV proteins were used to analyze its subcellular co‐localization. We could not observe co‐localization between P9‐2 and P5‐1, P7‐1, P7‐2, P9‐1 or P10. Similarly, co‐localization of P9‐1 with P10 or P5‐2 was not detected. On the other hand, we showed that P6 co‐localize with P10, P9‐1 and P7‐2, which suggests that P6 might play a role in viroplasm formation and/or recruitment of other proteins to this structure as well as in the viral intracellular movement. Given that P9‐1 subcellular localization is similar to the distribution characteristically displayed by reovirus major viroplasm proteins, we carried out a more comprehensive study of its functional and biochemical properties. We observed that, like other reoviral major viroplasm proteins, P9‐1 self‐associates to form high molecular weight complexes when expressed in bacteria, displays a localized in vivo self‐interaction in the inclusion bodies formed in insect cells, has the ability to bind single stranded nucleic acids, has ATPase activity and contains an important domain for the formation of inclusion bodies at its C‐terminal half. These results suggest that P9‐1 is the major component of viroplasms, and thus plays a fundamental role in MRCV replication and assembly during the infection of host cells.

Menoret, Adriana. "Relaciones tróficas y parasitismo en peces marinos: uso de cestodes Trypanorhyncha como marcadores biológicos" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los cestodes Trypanorhyncha son parásitos con ciclos de vida complejos en los que intervienen varios hospedadores. Las larvas infectan invertebrados y peces teleósteos (hospedadores intermediarios y/o paraténicos) y los adultos se desarrollan en elasmobranquios (hospedador definitivo). La transmisión de los tripanorrincos se produce entre los hospedadores, a través de la red trófica. Dado que estos cestodes presentan ciertas características morfológicas y ecológicas tienen el potencial de ser utilizados como marcadores biológicos de sus hospedadores. El objetivo principal fue realizar la revisión taxonómica de cestodes tripanorrincos en el Mar Argentino y evaluar su potencialidad como marcadores biológicos a partir de la (1) la estimación de la diversidad de tripanorrincos en el área de estudio mediante la descripción de nuevos taxa y la verificación de la identidad de las epecies de tripanorrincos previamente registradas en el área, (2) la caracterización de los ciclos de vida de los especímenes coleccionados y el rol que desempeñan los peces en su transmisión, (3) la evaluación del grado de especificidad de los estadios de cestodes, (4) la reconstrucción de las tramas tróficas de los peces involucrados en los ciclos de vida, y (5) la evaluación de los tripanorrincos como marcadores biológicos en el área de estudio. Se examinaron 1332 peces (897 teleósteos y 435 elasmobranquios) capturados a lo largo del Mar Argentino. Los tripanorrincos obtenidos fueron preparados adecuadamiente según distintas técnicas (histología, microscopía óptica y electrónica de barrido). Se identificaron 10 especies de tripanorrincos (4 familias), de las cuales 5 fueron registradas previamente en el área y 4 resultaron nuevas especies (Grillotia patagonica Heteronybelinia mattisi, Heteronybelinia n. sp. 1 y Parachristianella n. sp. 1). Además se registró por primera vez a Dollfusiella cf. aculeata en el Atlántico sudoccidental, se amplió el rango de hospedadores para G. (C.) carvajalregorum (16 nuevos registros) y para C. gracilis (1 hospedador nuevo). La mayoría de los teleósteos parasitados con tripanorrincos pertenecen a las familias Sciaenidae, Carangidae y Nototheniidae, mientras los hospedadores definitivos en su mayoria, parasitan rayas Arhynchobatidae. De las especies de tripanorrincos registradas previamente, 4 registros se consideran dudosos en el área, ya que no fueron obtenidos de peces indicados como sus hospedadores. En muchos casos se identificaron otras especies de tripanorrincos de características similares a aquellas, lo que estaría demostrando casos de identificaciones erróneas. Hepatoxylon trichiuri, Dasyrhynchus pacificus y Callitetrarhynchus gracilis se obtuvieron en estadio larval, mientras que D. cf. aculeata, Dollfusiella vooremi y Parachristianella n. sp. 1 como adultos. Grillotia (C.) carvajalregorum, G. patagonica, H. mattisi y Heteronybelinia n sp. 1 fueron identificadas como adultos y larvas, lo que permitió estimar sus ciclos de vida parciales. Tanto Heteronybelinia n. sp. 1 como D. pacificus podrían resultar buenos marcadores tróficos en el área debido a su estricta especificidad por sus respectivos hospedadores intermediarios. La presencia de G. (C.) carvajalregorum, G. patagonica y H. mattisi en algunos hospedadores, podría indicar relaciones tróficas que hasta el momento no han sido documentadas en base al contenido estomacal.

Abstract:
Trypanorhynch cestodes have complex life cycles that involve several hosts. Larvae parasite teleost fishes and invertebrates (intermediate and/or paratenic hosts), and adults develop in elasmobranchs (definitive hosts). Transmission through hosts depends on trophic relationships. These cestodes have morphological and ecological features that made them potentially useful as biological tags. The main goals of this work were the systematic revision of trypanorhynchs from the Argentine Sea and the evaluation of their putative use as biological tags. It was carried on by (1) the appraisal of the diversity of trypanorhynchs by describing new taxa and verifying the identity of trypanorhynch species previously reported in the area, (2) the description of their life cycles and the role each fish host plays in parasite transmission, (3) the evaluation of host specificity at different stages of development, (4) the reconstruction of food webs, and (5) the evaluation of trypanorhynchs as biological tags in the studied area. A total of 1332 fishes (897 teleosts and 435 elasmobranchs) were caught along the Argentine Sea. Cestodes were properly prepared for the study of their morphology using different techniques (whole mounts, temporarily mounts, serial histology, scanning electron microscopy). Ten species of trypanorhynchs (belonging to 4 families) were identified, 5 species were previously reported in the area, and 4 resulted in new species (Grillotia patagonica, Heteronybelinia mattisi, Heteronybelinia n. sp. 1 y Parachristianella n. sp. 1). Dollfusiella cf. aculeata was reported for the first time in the Southwest Atlantic. Additionally, the host range for G. carvajalregorum (16 new reports), and for C. gracilis (1 new host) was extended. Most of teleost parasitized by trypanorhynchs are represented by Sciaenidae, Carangidae and Nototheniidae, whereas mostly definitive hosts are batoids in Arhynchobatidae. Among trypanorhych previously reported, 4 records are considered dubious, as they were not collected from fishes reported as their former hosts. In many cases the cestodes obtained from the same hosts are similar in morphology, supporting cases of misidentifications. Hepatoxylon trichiuri, Dasyrhynchus pacificus, and Callitetrarhynchus gracilis were obtained as larvae, D. cf. aculeata, Dollfusiella vooremi y Parachristianella n. sp. 1 as adults. Grillotia (C.) carvajalregorum, G. patagonica, H. mattisi y Heteronybelinia n sp. 1 were obtained in both stages, allowing the proposal of their life cycles. Certain prey-predator relationships were estimated on the basis of the scheme of their parasite´s life cycles. Heteronybelinia n. sp.1 and D. pacificus are suggested as potentially useful as trophic tags in the studied area. Additionally, the presence of G. (C.) carvajalregorum G. patagonica y H. mattisi in several hosts could indicate new trophic relations that have not been documented based only on the study of stomach contents.

Fernández, María Soledad. "Eco-epidemiología de vectores de Leishmania spp. en el noreste de la Argentina (Provincia de Misiones)" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La leishmaniasis es una enfermedad de transmisión vectorial producida por parásitos tripanosomatídeos del género Leishmania (Kinetoplastida: Trypanosomatidae), los vectores involucrados son flebótomos (Díptera: Psychodidae: Phlebotominae) y los reservorios son mamíferos. En nuestro país el ser humano es considerado un hospedador accidental. En Misiones (noreste de la Argentina), donde se realizó esta tesis, se registran casos de leishmaniasis tegumentaria (LT) y leishmaniasis visceral (LV). El trabajo se llevó a cabo en dos áreas: 1) un área endémica de LT, en una zona de chacras ubicada en un frente de deforestación al sur de la ciudad de Puerto Iguazú donde se registró un brote en los años 2004-2005, con Nyssomyia whitmani como vector de Leishmania braziliensis y con reservorio desconocido; y 2) en un foco de LV (ciudad de Posadas), donde se registró el primer caso humano en el país (2006), con Lutzomyia longipalpis como vector de L. infantum (syn chagasi) y el perro doméstico como reservorio. Para el área endémica de LT se realizaron estudios de la composición de la comunidad de vectores en el tiempo y entre ambientes dentro de las chacras, relacionando a los flebótomos con variables climáticas y ambientales. Además se estudió el papel de los micromamíferos como potenciales reservorios de Leishmania spp. Para la ciudad de Posadas, se describió la distribución de Lu. longipalpis y sus cambios en el tiempo y se relacionó la abundancia con variables ambientales. Para ambos escenarios se encontró que la abundancia de los vectores estaría explicada al menos en parte por variables ambientales (principalmente relacionadas con la cobertura vegetal y la abundancia de animales silvestres y/o domésticos) y en el caso del escenario de transmisión de LT se encontró asociación positiva con variables climáticas (temperatura, precipitación). La abundancia de vectores se asoció con la de micromamíferos, sin embargo no se encontró evidencia suficiente para incriminarlos como reservorios. La distribución espacial de vectores resultó heterogénea en ambos escenarios, en la ciudad de Posadas se encontró un patrón de islas de alta abundancia de vectores, incrementándose la abundancia del vector entre los años 2007 y 2009. Para ambos escenarios (LT y LV) se recomienda alejar sitios de cría y dormideros de animales domésticos de la vivienda y de la ceja de monte (LT) cuando corresponda y reforzar cuidados de protección personal y tenencia responsable de mascotas (LV) en situaciones de riesgo donde exista mayor probabilidad de contacto hombre-vector, siendo la primavera y el verano las estaciones de mayor abundancia de los vectores.

Abstract:
Leishmaniasis is a vector-borne disease caused by parasites of the genus Leishmania (Kinetoplastida: Trypanosomatidae), sandflies are the vectors involved (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) and mammals are the reservoirs. In our country the man is considered an accidental host. In Misiones (northeastern Argentina), where this thesis were performed, tegumentary leishmaniasis (TL) and visceral leishmaniasis (VL) were recorded. This work was carried out in two areas: 1) an intense deforestated area endemic of LT, composed by farms, in the south of the city of Puerto Iguazú where an outbreak took place in 2004-2005, with Nyssomyia. whitmani as a vector of Leishmania braziliensis and unknown reservoir, and 2) in a focus of VL (Posadas), where the first case were recorded for the country (2006), with Lutzomyia longipalpis as vector and the domestic dog as reservoir. For the LT endemic area studies of the sandfly community were conducted along the time and between habitats within the farms, relating sandflies with climatic and environmental variables. In addition we studied the role of small mammals as potential reservoirs of Leishmania spp. In the city of Posadas, the distribution of Lu. longipalpis and its changes over time and abundance were related to environmental variables. For both scenarios it was found that the abundance of vectors would be explained at least partially by environmental variables (mainly related to vegetation cover and abundance of wildlife and /or domestic animals) and in the case of the LT scenario it was found a positive association between vectors and climatic variables (temperature, precipitation). The abundance of vectors was associated with small mammals, but it was not found enough evidence to incriminate them as reservoirs. The spatial distribution of vectors was heterogeneous in both scenarios and in the city of Posadas it was found vectors concentrated in limited „islands‟ of high abundance, and that the vector abundance increased between 2007 and 2009. For both scenarios (TL, VL, LV) is recommended to remove resting and breeding sites of domestic animals near the house and the forest edge (TL) where it is appropriate and enhance protective care and responsible pet ownership (VL) at risk situations where there is greater probability of man-vector contact, being the spring and summer the seasons of greatest abundance of vectors.

Hovsepian, Eugenia. "Estudio de los efectos antiinflamatorios de 15-deoxi-delta 12,14-prostaglandina J2 e IL-10 en miocardiocitos infectados con Trypanosoma cruzi. Mecanismos moleculares involucrados" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la fase aguda de la enfermedad de Chagas, la infección por T. cruzi produce una intensa respuesta inflamatoria en diversos tejidos del organismo incluso en el corazón, donde los miocardiocitos constituyen un importante blanco. Si bien la reacción inflamatoria es importante para el control inicial de la infección, un desequilibrio o una mala resolución de la misma puede generar daños y alteraciones en la funcionalidad cardíaca. Las células cardíacas responden a la infección mediante la expresión de enzimas inflamatorias como óxido nítrico sintasa 2 (NOS2) y metaloproteasas (MMPs) y citoquinas como TNF-α e IL-6. Esta respuesta está mediada por la activación de vías de señalización que incluyen al factor de transcripción nuclear-ĸB (NF-ĸB) y a las quinasas reguladas por señales extracelulares-proteínas quinasas activadas por mitógenos (ERK1/2-MAPK), cuya participación es fundamental en procesos inflamatorios. Los receptores activados por factores de proliferación peroxisomal γ (PPARγ) son factores de transcripción dependientes de ligando que han sido implicados en la regulación del metabolismo lipídico y de procesos inflamatorios. En este trabajo evaluamos el aporte de 15-deoxi-Δ12,14-prostaglandina J2 (15dPGJ2), ligando natural de PPARγ y de la citoquina antiinflamatoria IL-10 en la resolución de la respuesta inflamatoria en cultivos primarios de miocardiocitos neonatales de ratón infectados con la cepa letal pantrópica/reticulotrópica (RA) de T. cruzi. Los resultados de esta evaluación evidencian que 15dPGJ2 es capaz de inhibir la expresión y actividad de diferentes enzimas inflamatorias como NOS2, MMP-9 y MMP-2, así como la expresión de las citoquinas proinflamatorias TNF-α e IL-6 inducidas por la infección. Los efectos inhibitorios ejercidos por 15dPGJ2 involucran participación de mecanismos dependientes e independientes de PPARγ. La contribución de su receptor en los efectos ejercidos por 15dPGJ2 fue confirmada al silenciar la expresión mediante ARN de interferencia (siARN-PPARγ). Por otro lado, a partir de la utilización de inhibidores específicos de ERK1/2 y de NF-ĸB, demostramos que 15dPGJ2 también ejerce sus efectos de manera independiente a PPARγ, a través de estas vías. IL-10 es una de las principales citoquinas antiinflamatorias y fue identificada originalmente como un factor inhibidor de la síntesis de citoquinas proinflamatorias y modulador de ciertas funciones asociadas a la activación de macrófagos y/o monocitos. En este trabajo se describe que la adición de IL-10 exógena inhibe la activación de las vías de señalización de ERK1/2 y de NF-ĸB y reduce los niveles de expresión y actividad de NOS2, MMP-9 y MMP-2, así como la expresión de TNF-α e IL-6 inducidas por la infección. La señalización por IL-10 a través de su receptor promueve fosforilación de STAT3, el cual actúa como factor de transcripción induciendo la expresión de proteínas supresoras de la señalización por citoquinas-3 (SOCS-3). Tanto la infección con T. cruzi como IL-10 inducen fosforilación de STAT3 y la expresión del ARNm de SOCS-3. El silenciamiento de la expresión de esta proteína mediante ARN de interferencia (siARNSOCS- 3) pone en evidencia la participación de la vía STAT3/SOCS-3 en los efectos ejercidos por IL-10. El conocimiento más profundo sobre el papel de ligandos de PPARγ y de IL-10 podría ser de gran utilidad para formular estrategias alternativas o coadyuvantes de la terapéutica clásica en la infección por T. cruzi.

Abstract:
In the acute phase of Chagas disease, T. cruzi infection produces an intense inflammatory response in different tissues including the heart where cardiomyocytes are an important target. Although the inflammatory reaction is important for the initial control of the infection, an imbalance or poor resolution can generate damage and impaired cardiac function. Cardiac cells respond to infection by the expression of inflammatory enzymes like nitric oxide synthase 2 (NOS2) and metalloproteases (MMPs) and cytokines such as TNF- α and IL-6. This response is mediated by the activation of nuclear factor-кB (NF-кB) and extracellular signal-regulated kinases-mitogen-activated protein kinase (ERK1/2-MAPK) pathways, whose participation is essential in inflammatory processes. Peroxisome proliferator-activated receptors γ (PPARγ) are ligand-dependent transcription factors that have been implicated in the regulation of lipid metabolism and inflammatory processes. In this study we evaluated the contribution of 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2 (15dPGJ2), natural PPARγ ligand, and the antiinflamatory cytokine IL-10 in primary cultures of neonatal mouse cardiomyocytes infected with the lethal pantropic/reticulotropic T. cruzi strain (RA). The obtained results show that 15dPGJ2 is able to inhibit the expression and activity of different inflammatory enzymes such as NOS2, MMP-9 and MMP-2 as well as the proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 induced by T. cruzi infection. 15dPGJ2 antiinflammatory effects involve participation of PPARγ-dependent and - independent mechanisms. PPARγ contribution in 15dPGJ2 effects was confirmed by silencing PPARγ expression with small interfering RNA (PPARγ-siRNA). On the other hand, the use of specific ERK1/2 and NF-кB pharmacological inhibitors demonstrated that 15dPGJ2 can also exert its effects through these pathways. IL-10 is one of the most important antiinflammatory cytokines and has been originally identified as a cytokine synthesis inhibitor factor and modulator of certain functions associated with macrophages and/or monocytes activation. This work describes that exogenous addition of IL-10 inhibits ERK1/2 and NF-кB activation and reduces NOS2, MMP-9 and MMP-2 expression and activities as well as TNF-α and IL-6 expression after T. cruzi infection. IL-10 signaling through its receptor promotes STAT3 phosphorylation, which acts as a transcription factor inducing the expression of suppressor of cytokine signaling-3 (SOCS- 3). Both T. cruzi infection and IL-10 treatment promote STAT3 phosphorylation and SOCS- 3 mRNA expression. SOCS-3 silencing with small interfering RNA (SOCS-3-siRNA) reveals STAT3/SOCS-3 signaling participation in IL-10 effects. A better understanding of the role exerted by PPARγ ligands and IL-10 could be useful in finding new or alternative strategies which could replace the classic parasiticidal therapeutic in T. cruzi infection.

Germano, Mónica Daniela. "Herencia y efectos demográficos de la resistencia a deltametrina en Triatoma infestans" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Triatoma infestans es un insecto de alta importancia sanitaria en Latinoamérica debido a su rol como vector de la enfermedad de Chagas. Este insecto es controlado mediante el rociado de las viviendas con insecticidas. A partir de las década de 1980, las medidas de control se focalizaron en el uso de la deltametrina, un insecticida de alta efectividad triatomicida y baja toxicidad en humanos. Sin embargo, a fines de la década de 1990 se detectaron fallas de control que fueron correlacionadas con una disminución de la efectividad del compuesto en las poblaciones de insectos. El desarrollo de resistencia a deltametrina fue detectado en diferentes localidades de Argentina y Bolivia, y durante los primeros años de la década 2000 ha sido causal de la disminución de la efectividad de los rociados con deltametrina. En este trabajo de tesis se determinó el alcance de la zona resistente en las provincias de Salta, Santiago del Estero y Chaco. Se evaluaron distintas localidades en cada provincia y se demostró que existen poblaciones de vinchucas con alto y mediano grado de resistencia, como así también prevalecen las áreas con T. infestans susceptibles a la deltametrina. Con el fin de determinar la posible reversión de la resistencia a deltametrina, resultó de interés determinar el modo de herencia de la resistencia a deltametrina en T. infestans. Se condujeron cruzamientos recíprocos de insectos susceptibles y resistentes, y se evaluó el grado de resistencia en la descendencia. Se demostró que la resistencia a este insecticida se hereda de manera autosómica y semidominante, y que se trata de un carácter determinado por al menos un gen mayoritario. Además, se evaluó la respuesta a la deltametrina en generaciones sucesivas de T. infestans resistentes, y se determinó la estabilidad de esta característica en poblaciones de campo y laboratorio. Mediante el uso de bioensayos se determinó la toxicidad de la deltametrina en los distintos estadios de desarrollo de T. infestans. Este ensayo demostró que la cantidad de insecticida necesario para eliminar al cincuenta por ciento de los insectos de una población susceptible aumenta con el estadio, y que la ninfa V es el estadio más tolerante al tratamiento químico. Por otra parte, se verificó que la resistencia a la deltametrina se expresa en todos los estadios de desarrollo. Además, se verificó que la ninfa V representa el estadio más resistente al insecticida en estudio, en comparación con la cepa susceptible. La confección de una tabla de vida permitió determinar las variaciones en el ciclo de vida del vector, en relación a la expresión de la resistencia. La evaluación de la duración de los estadios permitió demostrar que existen diferencias significativas entre la duración de los estadios II, III y V de las cepas susceptible y resistente. La mayor contribución a las diferencias estuvo dada por la duración de la ninfa V, la que presentó una duración significativamente mayor en la cepa resistente. Estos resultados sugirieron que la ninfa V ocupa un lugar clave en la estructura de las poblaciones resistentes a insecticidas mediante un mecanismo doble de resistencia: un alto grado de resistencia toxicológica, y un posible comportamiento de letargo de desarrollo asociado al refugio de la aplicación de insecticida. Además, la estructura poblacional fue evaluada mediante la confección de una matriz poblacional de estadios para las cepas susceptible, resistente, y sus cruzas recíprocas. La proyección de esta matriz demostró una menor tasa reproductiva en las cepas resistentes, en relación a la susceptible. El análisis prospectivo y retrospectivo de los parámetros poblacionales demostró que la causa fundamental de las diferencias en la tasa de crecimiento está asociada a una importante disminución de la fecundidad de las hembras resistentes. Además, se detectó una fuerte contribución de la duración de la ninfa V en este estadio, posiblemente debido a su asociación directa con la muda al estadio reproductivo. Los resultados de este trabajo de tesis indican que la resistencia a la deltametrina está presente en las provincias de Salta y Chaco. Además, se demuestra que es posible el cruzamiento entre insectos de zonas distantes geográficamente, y que el cruzamiento entre insectos susceptibles y resistentes genera una disminución amplia del grado de resistencia. Sin embargo, se observa que existen diferencias reproductivas entre las poblaciones susceptibles y las resistentes a deltametrina. Estas diferencias podrían estar asociadas a la resistencia a deltametrina y manifestarse no sólo con una menor fecundidad, sino como un cambio en la estructura poblacional y las tasas de muda al estadio adulto.

Abstract:
T. infestans is an insect of sanitary importance due to its role in Chagas disease transmission in Latin America. This insect is currently controlled by the use of chemical compounds for house impregnation. Since 1980s, deltamethrin has been the main compound used for its control because of its high triatomicidal action and its low human toxicity. However, campaigns have started to decrease in success since the end of the 1990s, when the development of resistance started to affect its effectiveness in Argentina and Bolivia. In this thesis the spread of deltamethrin resistance was evaluated. It was determined that its range includes Salta and Chaco provinces, where both high and moderated levels of resistance were determined. However, no resistance to this compound was found in Santiago del Estero populations. With the aim of determining a possible reversion of resistance, the way that this character is inherited was evaluated by conducting reciprocal crosses between susceptible and resistant insects. This assay demonstrated that resistance to the insecticide is produced by at least one main gene, and that it is inherited semi‐dominantly. Also, it demonstrated that there are no mother effects affecting resistance. The evaluation of deltamethrin toxicity in successive generations of resistant field and laboratory populations showed that the levels of resistance are not reversed after several years without chemical treatment. Through the use of bioassays the doses necessary to treat each of development stage were evaluated. Lethal doses for eliminating fifty percent of susceptible insects were determined to increase with the age of the insect. Moreover, resistance was expressed in all of the development stages. In fact, both the most tolerant, and the most resistant stage was the fifth nymph. A life table analysis was performed. The length of each stage was determined, and compared between the susceptible and the resistant colonies, including progeny of reciprocal crosses. The length of each development stage was compared, and the result indicated that there are significant differences between the susceptible and resistant colonies, when considering the second, third, and fifth nymph. In particular, the fifth nymph represented the major contribution to the differences between the colonies. The fact that this stage was the most tolerant to deltamethrin and that it represented the major difference between the colonies suggested that it plays a major role in the development of resistance, through two possible mechanisms: the toxicological change in response, and an ecological response related to avoidance of insecticide and possible developmental delays. In addition, life table information was analyzed using a stage structured population model. The population matrix was projected in time and it was determined that the resistant population shows a smaller intrinsic rate of increase. This difference was also detected for the reciprocal crosses progeny, which suggested that the decrease in reproductive success was associated to resistance, although not strictly to the degree of resistance. Prospective and retrospective analysis established that the main cause for this decline in the rate of increase was a lower fecundity of the resistant colony. In addition, the delay in moulting detected for the fifth nymph represented an important contribution to the differences between the colonies, possibly related to the delay in entering the reproductive state. The results presented in this thesis show that deltamethrin resistance is present in Salta and Chaco provinces. Moreover, they demonstrate that insects from distant geographical areas can reproduce effectively, although the crossing of susceptible and resistant insects importantly decreases the level of resistance. On the other hand, it was demonstrated that susceptible and resistant T. infestans present differences in their reproductive output. These differences could be related to deltamethrin resistance and be expressed not only as a fecundity decrease but also as a change in the population structure and rates of moulting to the adult stage.

Caro, Florence. "Estudio de la traducción a escala genómica y métodos de manipulación genética en el parásito de la Malaria, Plasmodium falciparum" (2012-08-01) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Plasmodium falciparum es el parásito que causa la malaria más severa en humanos, enfermedad que afecta mundialmente a 200–300 millones de individuos al año. La descripción del genoma, del transcriptoma y del proteoma son un recurso importante para poder entender la función y la regulación de la expresión génica. En el caso del parásito P. falciparum, el 60% de los genes anotados siguen siendo hipotéticos, debido a la gran distancia evolutiva del parásito respecto de organismos modelo. Por otro lado, la presencia y abundancia de un ARNm no necesariamente se correlaciona con la abundancia de la proteína correspondiente y la cuantificación de estos parámetros son por lo tanto representaciones imperfectas de la regulación génica y proteómica subyacente. En esta tesis se establece la conexión entre ARNm y proteína midiendo directamente la traducción a nivel genómico usando la técnica de perfilamiento ribosomal, revelando por primera vez la dinámica de este proceso durante los estadíos intraeritrocíticos del parásito. Los resultados obtenidos demuestran que los procesos de transcripción y traducción están estrechamente acoplados, que el 11% del transcriptoma está regulado traducciónalmente y que este tipo de regulación juega un rol importante en genes con funciones de egreso e invasión del merozoito. Además, se presenta un conjunto de métodos mejorados para la manipulación genética a escala genómica de P. falciparum. Este conjunto de protocolos puede ser aplicado para la investigación y descubrimiento de la función de los genes del parásito.

Abstract:
Plasmodium falciparum is the causative agent of the most burdensome form of human malaria, affecting 200–300 million individuals per year worldwide. For the study of P. falciparum, the description of the genome, the transcriptome and the proteome are a tremendous resource for understanding gene function and gene expression regulation. However, 60% of the annotated genes in the genome remain hypothetical due to the evolutionary distance of this parasite to model organisms, and mRNA and protein abundance measurements remain imperfect representations of the underlying genetic and proteomic regulation, since the presence and abundance of an mRNA species does not necessarily correlate with the abundance of the corresponding protein. The work presented in this thesis bridges this disconnect by measuring whole genome translation, using the ribosome profiling technique, revealing for the first time translation dynamics throughout the asexual intraerythrocytic developmental cycle. The findings show that transcription and translation are tightly coupled in this parasite, that 11% of the transcriptome is translationally regulated and that this type of regulation plays a major role on genes related to merozoite egress and invasion. Additionally, presented here is an improved set of methods for 96-well plate-based transfection and culture that facilitate genome-scale genetic manipulation of P. falciparum. This set of protocols can be applied to investigation and discovery gene functions in this parasite.

Fassolari, Matías. "Estudio funcional de la familia de enzimas Aurora quinasa en Trypanosoma cruzi" (2013-05-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Arredondo, Nathalia J.. "Platyhelminthes (Digenea, Proteocephalidea) y Acanthocephala parásitos de peces teleósteos de la cuenca del Río Paraná: diversidad, especificidad y morfología" (2013-09-02) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo se presentan los resultados del estudio taxonómicomorfológico de Platyhelminthes (Digenea; Proteocephalidea) y Acanthocephala parásitos de peces de agua dulce encontrados en dos localidades pertenecientes a la cuenca del Río Paraná en su parte Media (Río Colastiné) e Inferior (Río Paraná-Guazú). Se muestrearon un total de 1617 peces pertenecientes a 57 especies, 7 órdenes y 24 familias. El estudio de los Digenea permitió registrar un total de 30 especies (pertenecientes a 13 familias) entre las cuales cinco son especies nuevas (Parspina carapo, P. pimelodellae, P. virescens, Megacoelium sp. n. y Cheloniodiplostomun sp. n.); se redescribieron dos, Parspina argentinensis y Parspina bagre que es la especie tipo del género de un pez de Venezuela; 3 especies se citan por primera vez en nuestro país y 18 amplían su espectro de hospedadores. El estudio de los Proteocephalidea reveló la presencia de 39 especies (pertenecientes a 8 subfamilias), de las cuales seis resultaron nuevas y se crearon 2 géneros nuevos (Margaritaella gracilis, Monticellia santafesina, Regoella brevis, Lenhataenia sp. n, Nupelia sp. n. y Pseudocrepidobotrium sp. n.); también se redescribió la especie Cangatiella arandasi; 9 especies se citan por primera vez en nuestro país; y 6 amplían su espectro de hospedadores. Se estudió por primera vez el cariotipo de una especie sudamericana, Ageneiella brevifilis cuyo número cromosómico fue 2n = 18 y en la cual la morfología cromosómica difiere de las especies europeas conocidas. El estudio de los Acanthocephala permitió el registro de 10 especies (pertenecientes a 4 familias), que incluye dos especies nuevas (Neoechinorhynchus (H.) colastinense y Pomphorhynchus omarsegundoi); dos especies fueron redescriptas (Neoechynorhynchus (N.) maconucleatus y N. (N.) pimelodi); 7 especies se citan por primera vez en nuestro país; y 5 amplían su espectro de hospedadores. Se estudió por primera vez la superficie del tegumento de digeneos de Argentina. En las tres especies de Parspina analizadas se observó la presencia de espinas pectinadas con proyecciones digitiformes y la presencia de diferentes tipos de papilas (ciliadas, en forma de domo y en roseta). En Proteocephalidea se estudiaron ocho especies, en las que se encontraron cuatro tipos de microtricos: filitricos papiliformes, aciculares y capiliformes y espinitricos gladiados distribuidos sobre las superficies del escólex y estróbilo. En acantocéfalos el estudio con microscopía electrónica de barrido se llevó a cabo en cinco especies y permitió aclarar la distribución de los ganchos proboscídeos, la forma del cuerpo, la ubicación de los poros genitales y detectar la presencia de poros tegumentarios en todas ellas. Se registró el sitio de infección y se calcularon los índices de infección (prevalencia, intensidad media y abundancia media) de todas las especies de helmintos parásitos encontradas durante el estudio. Los índices resultaron bajos para la mayoría de las especies de digeneos y acantocéfalos, mientras que en proteocefalídeos fueron más elevados. Para todas las especies registradas se provee además el espectro de hospedadores en Sudamérica y se sugiere el tipo de especificidad para cada especie. La riqueza de especies de Digenea, Proteocephalidea y Acanthocephala es mayor que la que se conocía previamente al estudio y comparable a la que presentan otras cuencas hidrográficas sudamericanas como la cuenca Amazónica. Palabras clave: Digenea – Proteocephalidea – Acanthocephala – peces teleósteos dulceacuícolas – MEB – microtricos – espinas pectinadas- papilas sensitivas – poros – especificidad – espectro de hospedadores – Argentina – Sudamérica

Abstract:
This work reports the results of taxonomic and morphological studies on Platyhelminthes (Digenea; Proteocephalidea) and Acanthocephala parasitizing freshwater fishes from two localities in the lower (Paraná-Guazú River) and middle (Colastiné River) parts of the Paraná River basin. A total of 1617 fishes belonging to 57 species, 7 orders and 24 families were examined. A total of 30 species of Digenea were recorded (belonging to 13 families), 5 of which are new to science: Parspina carapo, P. pimelodellae, P. virescens, Megacoelium sp. n. and Cheloniodiplostomun sp. n.; 2 species were redescribed: Parspina argentinensis and Parspina bagre, the latter being the type species of a genus from a Venezuelan fish; 3 species are reported from Argentina for the first time; and the spectrum of known hosts has been extended for 18 species. A total of 39 species of Proteocephalidea were found (belonging to 8 subfamilies), 6 of which are new to science; 2 new genera were erected (Margaritaella gracilis, Monticellia santafesina, Regoella brevis, Lenhataenia sp. n, Nupelia sp. n. and Pseudocrepidobotrium sp. n.); Cangatiella arandasi was redescribed; 9 species are first reported from Argentina; and the spectrum of known hosts has been extended for 6 species. This is the first study reporting the karyotype of a South American proteocephalidean species: Ageneiella brevifilis has a chromosome number of 2n = 18 and its chromosomes differ in morphology from those of the known European species. A total of 10 species of Acanthocephala were recorded (belonging to 4 families), 2 of which are new to science: Neoechinorhynchus (H.) colastinense and Pomphorhynchus omarsegundoi); two species were redescribed: Neoechynorhynchus (N.) maconucleatus and N. (N.) pimelodi); 7 species are reported from Argentina for the first time; and the spectrum of known hosts has been extended for 5 species. In addition, the present study provides the first description of the tegument of digeneans (scanning electron microscope) from Argentina. The tegumental surface of the three Parspina species analyzed is covered with pectinate spines armed with digitiform projections and different types of papillae (ciliated, rosette, and domed). The tegument of 8 species of Proteocephalidea revealed the presence of four microthrix types: papilliform, acicular and capilliform filitriches, and gladiate spinitriches distributed on the scolex and strobila. In regard to Acanthocephalans, the study of 5 species by SEM has helped to clarify the distribution of the proboscis hooks, body shape, position of genital pores, and to detect the presence of tegumentary pores in all species examined. The site of infection was recorded and the infection indexes (prevalence, mean intensity and mean abundance) were calculated for every parasitic helminth species collected. These infection indexes were low for most digenean and acanthocephalan species, while proteocephalideans showed higher values. Moreover, the host spectrum in South America and type of specificity are suggested for each species. This research has extended the richness of Digenea, Proteocephalidea and Acanthocephala species, which turned out to be comparable to that reported for other South American hydrographic basins, such as the Amazon basin. Key Words: Digenea – Proteocephalidea – Acanthocephala – freshwater teleostean fishes – SEM – microtriches – pectinate spines – sensitive papillae – pores –specificity – host spectrum – Argentina – South America.

Eberhardt, María Ayelén Teresita. "Evaluación de la dinámica de salud en poblaciones de Hydrochoerus hydrochaeris L. 1766 (RODENTIA: Caviidae): intensidad del parasitismo gastrointestinal" (2014-06-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Con la premisa que los helmintos son causa y consecuencia de la condición de salud de sus hospedadores, este trabajo tuvo como objetivos: i. Evaluar el uso de la intensidad de los parásitos gastrointestinales específicos como herramienta para el estudio de la salud poblacional en carpinchos ii. Relacionar cargas parasitarias con factores ambientales, demográficos e interacciones interespecíficcas de parásitos co-infectantes, iii. Evaluar la relación de la intensidad del parasitismo de determinados helmintos y/o protozoarios específicos con el estrés y el estado inmuno-fisiológico del carpincho. Se recolectaron 1600 heces frescas en la ecoregión “LLagunas y Esteros del iberá”, Corrientes, desde septiembre 2010 hasta febrero de 2013. Se realizaron 72 necropsias de ejemplares de carpinchos silvestres, y se realizó un experimento con 30 carpinchos de cautiverio. A partir de los análisis coproparasitologico de las heces y los parásitos adultos, se identificaron y contabilizaron los nematodes: Vianella hydrochoeri, Hydrocherisnema anomalobursata, Trichostrongylus cf axei, Strongyloides cf. chapini, Echinocoleus hydrochoeri, Trichuris sp. y Protozoophaga obesa; cestodes del género Monoecocestus sp.; trematodes de las especies Taxorchis cabrali, T. schistocotyle e Hippocrepis hippocrepis y ooquistes de especies del genero Eimeria spp. Según los resultados obtenidos, los conteos de las formas evolutivas en materia fecal son indicativos en niveles aceptables de la carga parasitaria interna para la superfamilia Trichostrongyloidea, S. chapini y Trichuris sp. En general, no se evidenció estacionalidad marcada para ningún taxón de parásito encontrado en las heces debido a que existió una interacción entre las estaciones y el año de muestreo. Además la abundancia de las distintas especies parasitarias estuvo asociada (positiva o negativamente dependiendo del parásito) a factores ambientales (precipitaciones y temperaturas) y a las densidades del hospedador. La interacción entre nematodos (Viannaiidae) y Eimeria spp. dependió de factores ambientales y del hospedador. La relación fue positiva en algunas circunstancias (dependió de la temporada, año, sexo o tamaño de los animales), y antagónica bajo diferentes escenarios. Estas interacciones antagonistas no siguieron un patrón estacional en particular y se encontraron predominantemente en el sexo femenino (cuando dependieron del sexo) o en 2010 y 2011 (cuando dependieron del año de muestreo). Los carpinchos estresados del experimento, tuvieron significativamente mayores intensidades de infección de coccidios, pero los individuos de menor tamaño, consistentemente mostraron bajas cargas de helmintos comparado con los controles. El estrés tuvo un marcado impacto negativo sobre el crecimiento y la condición corporal, pero un efecto positivo significativo en algunos de los componentes del sistema inmune. Nuestros resultados sugieren que: i. durante los períodos prolongados de estrés los carpinchos preventivamente invierten energía en algunos componentes de su sistema inmunológico, lo que podría considerarse una profilaxis dependiente del estrés, ii. se encontró que el estrés provoca una mayor intensidad de infección de protozoos, pero cargas más bajas de nematodos, lo que indica que la relación entre el estrés, las regulaciones fisiológicas y la infección depende del tipo de parásito en cuestión. Se propone que la inversión inmune contexto-dependiente documentada en este experimento con carpinchos podría ser la causa de las diversas interacciones intra e interespecíficas documentadas para los parásitos de los carpinchos silvestres.

Abstract:
Helminths are cause and consequence of the health of their host condition, so the overall objetives of this study were: i. Evaluate the use of intensity of specific gastrointestinal parasites as a tool to asses the population health in capybaras; ii. Establish link between parasites loads and environmental factors, demography of the host and interspecific interactions of parasite co-infection; iii. Evaluate the impact of food restriction and physical restraint on the infection intensity of specific gastrointestinal nematodes and coccidia, and how these stressors affected the growth, body condition, and some immuno-physiological parameters. 1600 feces were collected from September 2010 to February 2013 from a population of capybaras from Esteros del Iberá, Corrientes, Argentina. 72 necropsy of wild capybaras were performed and a experiment with 30 female captive capybara was carried out. There were identified and counted nematodes: Vianella hydrochoeri, Hydrocherisnema anomalobursata, Trichostrongylus cf axei, Strongyloides cf. chapini, Echinocoleus hydrochoeri, Trichuris sp. and Protozoophaga obesa; cestodes of gen Monoecocestus sp.; trematodes: Taxorchis cabrali, T. schistocotyle and Hippocrepis hippocrepis and oocytes of species of Eimeria spp. According to results, counts of fecal evolutionary forms are indicative at acceptable levels of internal parasite burdens of Trichostrongyloidea, S. chapini and Trichuris sp. In general, no seasonality was evident for any taxon of parasite found in feces due to an interaction existed between seasons and years of sampling. Besides the abundance of different parasite species was associated (positively or negatively depending on the parasite) with environmental factors (rainfall and temperature) and densities of the host. The interaction between nematodes (Viannaiidae) and Eimeria spp. depended on environmental and host factors. The relationship was positive in some circumstances (depending on season, year, sex, or animal size), but it appeared to become antagonistic under different scenarios. These antagonist interactions did not follow a particular seasonal pattern, but they were predominantly found in females (when they depended on sex) or in 2010 and 2011 (when they depended on the sampling year). These results suggest that the relationship between coccidia and nematodes in capybaras may be context dependent. Stressed capybaras had significantly higher coccidia infection intensities; but among individuals that were smaller, those stressed consistently showed lower helminth burdens than controls. Both stress treatments had a marked negative impact on growth and body condition, but they had a significant positive effect on some components of the immune system. Our results suggest, on the one hand, that during prolonged periods of stress capybaras preventatively invest in some components of their immunity, which could be considered a stress-dependent prophylaxis. On the other hand, stress was found to cause greater infection intensities of protozoans but lower burdens of nematodes, indicating that the relationship between stress, physiological trade-offs and infection depends on the type of parasite in question. We propose that the context-dependent immune investment documented in capybaras may be the cause of these varying interactions.

Schlesinger, Mariana. "Clonado, caracterización y estudios funcionales de las enzimas poli (ADP-ribosa)polimerasa y poli (ADP-ribosa) glicohidrolasa de Trypanosoma brucei" (2015-03-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El metabolismo de polímeros de ADP-ribosa (PAR) está involucrado en múltiples funciones celulares, como la señalización y reparación del ADN, el mantenimiento de la integridad genómica, la decisión entre la supervivencia y muerte celular y el mecanismo de muerte. Poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) y poli(ADPribosa) glicohidrolasa (PARG) son las proteínas involucradas en esta vía metabólica. PARP es la enzima encargada de sintetizar al polímero, mientras que PARG es responsable de su degradación. En Trypanosoma brucei ambas proteínas, denominadas TbPARP y TbPARG, son codificadas por un gen de copia única. En la presente tesis se muestra la caracterización de la actividad de TbPARP in vitro en la reacción de PARilación. Estudios funcionales de TbPARP y TbPARG en el contexto del parásito permitieron identificar su localización subcelular en condiciones normales y de estrés oxidativo. También se describe aquí la cinética de aparición de PAR en el núcleo. Mediante la obtención de líneas transgénicas de parásitos procíclicos sobreexpresantes de TbPARP y silenciados (ARNi) para ambas enzimas se realizaron ensayos de supervivencia a distintas concentraciones del agente genotóxico H2O2. Los mismos presentaron diferentes grados de citotoxicidad y variaciones en el mecanismo de muerte celular de acuerdo a la presencia o ausencia de polímero en el núcleo. También se estudió el efecto de la acumulación nuclear del polímero sobre la progresión del ciclo celular en cultivos transgénicos sincronizados. Palabras claves: Trypanosoma brucei, PARP, PARG, PAR, ciclo celular, estrés oxidativo, Enfermedad del sueño.

Abstract:
Poly(ADP-ribose)polymerase (PAR) metabolism is involved in multiple cellular functions such as DNA signaling and repair, maintenance of genomic integrity, switching between cell survival and death, and decision of death pathways. Poly(ADPribose) polymerase (PARP) and poly(ADP-ribose)glycohydrolase (PARG) are proteins involved in this metabolic pathway. PARP synthesizes the polymer while PARG is in charge of its hydrolysis. In Trypansoma brucei both proteins, named TbPARP and TbPARG, are codified by a single copy gene. The present thesis shows the characterization of in vitro activity of TbPARP carried out in the PARylation reaction. Functional studies of TbPARP and TbPARG in the context of the parasite allowed the identification of their subcelular localization in normal conditions and under oxidative stress. Kinetics of PAR appearance in the nucleus is also described here. We obtained transgenic lines of procyclic parasites which over-expressed TbPARP or downregulated both enzymes to perform survival assays at different concentrations of the genotoxic agent H2O2. They presented variation in the cytotoxicity levels and in the death pathway involved according to the presence or absence of PAR in the nucleus. It has also been studied the effect of PAR nuclear accumulation on cell cycle progression in synchronized transgenic cultures. Key words: Trypanosoma brucei, PARP, PARG, PAR, cell cycle, oxidative stress, African trypanosomiasis.

Devescovi, Francisco. "Estudios sobre el superparasitismo de larvas de la mosca del Mediterráneo Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) por el parasitoide Diachasmimorpha longicaudata (Hymenoptera: Braconidae)" (2015-03-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El endoparasitoide solitario larval Diachasmimorpha longicaudata ha sido ampliamente utilizado como agente de control de moscas de la fruta que generan grandes pérdidas económicas. Con el objetivo general de conocer los procesos que influyen en su desarrollo y ciclo de vida utilizando Ceratitis capitata como especie hospedadora, en esta tesis se evaluaron los efectos del fenómeno conocido como superparasitismo (i.e. oviposición en un hospedador previamente parasitado por la misma u otra hembra de la misma especie) sobre parámetros relacionados al éxito reproductivo y aspectos del comportamiento, genética y electrofisiología. El superparasitimo resultó ser un fenómeno común en la cría experimental del IGEAF (INTA, Castelar). En aquellos niveles de superparasitismo en los que fue posible un completo desarrollo del adulto, no se registraron consecuencias asociados al éxito reproductivo. La eliminación de las larvas competidoras durante el primer estadio larval permitiría que la mayor parte del desarrollo se produzca sin competencia, explicando la falta de efecto sobre el adulto. Estudios comportamentales mostraron que algunas hembras evitan superparasitar mientras que otras oviponen al azar, sugiriendo en éstas últimas, una incapaciadad para discriminar larvas parasitadas y no parasitadas. Al evaluar un posible componente genético en hembras con y sin esa habilidad no se encontró una correlación con sus respectivas hijas (análisis de correlación e isolineas). Estimulaciones en el extremo del ovipositor mediante técnicas de electrofisiología no evidenciaron una habilidad de discriminación entre larvas parasitadas y no parasitadas por parte del adulto. En conjunto, los resultados de esta tesis aportan nueva información sobre la biología básica de D. longicaudata, y contribuyen a futuros estudios dirigidos a una mejora en el proceso de cría artificial de este agente de control biológico de moscas de los frutos.

Abstract:
The solitary larval endoparasitoid Diachasmimorpha longicaudata has been widely used as a biological control agent against fruit flies of economic importance. With the aim of assessing processes affecting its development and life cycle when artificially reared on Ceratitis capitata as host species, in the current thesis the effects of the phenomenon known as superparasitism (i.e. oviposition in a previously parasitized host) on fitness related parameters and several aspects regarding behavior, genetics and electrophysiology were studied. Superparasitism was a common phenomenon in the experimental rearing located at IGEAF (INTA, Castelar). For those levels in which a full development was possible, no negative consequences on the adult fitness were recorded. Elimination of supernumerary larvae during the first instar probably allowed to the surviving larva an almost normal development without the effects of a prolonged competition. Behavioral studies showed that some individually tested females avoid superarasitism, while other females laid their eggs randomly, suggesting a lack of host discrimination ability for the latter. When the possible genetic component of females´ oviposition behavior regarding host discrimination and superparasitism was studied, neither a correlation with their respective daughters nor differences between isofemales strains were observed. Stimulations on the ovipositor apex using electrophysiological techniques did not provide a sensory basis for discrimination among parasitized and unparasitized larvae. In all, the results of this thesis contribute with new information about the basic biology of D. longicaudata for future studies aimed to improve artificial rearing processes of this important biological control agent.

Barrantes, María Eugenia. "Influencia de la calidad del hospedador y de la competencia por recursos energéticos durante la ontogenia sobre el estado fisiológico y el éxito reproductivo del parasitoide Mallophora ruficauda (Diptera: Asilidae)" (2015-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Mallophora ruficauda es un ectoparasitoide solitario de larvas de coleópteros Scarabaeidae, con una alta preferencia por Cyclocephala signaticollis. La hembra ovipone fuera del hospedador y la larva busca, encuentra y parasita al hospedador actuando como el equivalente ecológico de la hembra adulta de los parasitoides tradicionales. En un contexto de forrajeo, las larvas pueden reconocer y orientarse a C. signaticollis frente a otras especies potenciales, y poseen la capacidad de discriminar a los hospedadores parasitados, sin embargo en la naturaleza el superparasitismo es frecuente. Al tener una única oportunidad de parasitismo, el fitness del parasitoide dependerá completamente de este evento, por lo que el costo de elegir un hospedador de baja calidad (pequeño, parasitado o estresado) es alto. Se desconoce si las larvas pueden evaluar parámetros del hospedador indicadores de su condición corporal, así como la influencia que tiene la toma de decisiones de las larvas sobre la condición o desempeño del adulto que emerge. En esta Tesis se estudió la influencia de la calidad del hospedador seleccionado y de la competencia intraespecífica de las larvas sobre el éxito reproductivo del parasitoide adulto. Se encontró que la probabilidad de ganar la competencia en larvas que están superparasitando a un hospedador son independientes del orden de llegada en que las larvas atacaron al hospedador y del tiempo transcurrido entre el aferramiento de la primera larva y la siguiente, lo que explica en parte la ocurrencia natural del superparasitismo. Al evaluar la orientación de las larvas en parches de hospedadores sanos o parasitados que diferían en tamaño y número se observó que la distribución de larvas entre hospedadores no presentó un patrón definido, a pesar que las larvas detectaron a sus coespecíficos en el parche, sugiriendo que elegir un hospedador de alta calidad en recursos energéticos carecería de importancia en interacciones prolongadas en el tiempo. Por otro lado, se encontró que las larvas pueden discriminar y seleccionar a los hospedadores en función del grado de estrés, utilizando una clave de naturaleza química, y que eligen parasitar al menos perturbado o de mejor calidad. Finalmente, el peso del hospedador y el superparasitismo serían factores importantes que tienen influencia sobre la condición corporal de los parasitoides adultos de la nueva generación.

Abstract:
Mallophora ruficauda is a solitary ectoparasitoid of Scarabaeidae beetle larvae, with a high preference for Cyclocephala signaticollis. The female oviposits outside of the host and the larva seeks, finds and parasitizes the host acting as the ecological equivalent of the adult female in traditional parasitoids. In a foraging context the larvae can recognize and orient towards C. signaticollis against other potential species, and possess the ability to discriminate parasitized hosts, but in nature super-parasitism is common for this species. By having a single opportunity to parasitize, parasitoid fitness depends entirely on this event, therefore the cost of choosing a host of low quality (small, parasitized, or stressed) is high. It is unknown whether larvae can evaluate parameters of the host indicative of its bodily condition, as well the influence these decisions can have on the condition when the adult emerges. In this thesis we studied the influence of the quality of the selected host and larval intraspecific competition on the reproductive success of the adult parasitoid. We found that the probability of winning the competition in larvae that are superparasitizing a host is independent of the order of arrival, where on its body the larvae attacks the host and the time between the attachment of the first larva and the next, which explains in part the natural occurrence of super-parasitism. In assessing the orientation of larvae in patches of healthy or parasitized hosts that differed in size and number we observed no clear pattern in the distribution of larvae between hosts, even though larvae detected conspecifics in the patch, which suggests that choosing a host with high quality energy resources would be irrelevant in prolonged interactions. Furthermore, it was found that the larvae can discriminate and select the host according to its degree of stress, using a chemical cue, and choose to parasitize the least disturbed or of better quality. Finally, the weight of the host and super-parasitism would be important factors influencing the body condition of adult parasitoids of the new generation.

Moretti, Ariadna Noelia. "Efectos letales y subletales de monoterpenos sobre vectores de Chagas y su posible uso como herramientas de control" (2015-04-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El control de vectores de la Enfermedad de Chagas se realiza en Argentina mediante la aplicación de insecticidas piretroides. En las últimas décadas, la aparición del fenómeno de resistencia a los piretroides y la necesidad de identificar sustancias menos peligrosas para los humanos y el ambiente, motivaron la búsqueda de alternativas naturales para el desarrollo de nuevas herramientas de control y diagnóstico entomológico (presencia de insectos vectores en viviendas). El objetivo de esta tesis doctoral fue explorar la bioactividad de sustancias de origen natural sobre los triatominos vectores de la Enfermedad de Chagas Triatoma infestans y Rhodnius prolixus. Para tal fin se evaluaron los síntomas visibles de intoxicación, la repelencia, el volteo, el efecto sobre la actividad locomotora y la capacidad expurgante, de once monoterpenos componentes de aceites esenciales (el éter cíclico 1,8-cineol, también conocido como eucaliptol, y diez alcoholes). Se describieron por primera vez en insectos los síntomas visibles de intoxicación por exposición a un monoterpeno (1,8-cineol). En ambas especies, este monoterpeno produjo síntomas similares a los que ocasionan insecticidas neurotóxicos como organofosforados y piretroides, y se registró por primera vez el fenómeno de distensión abdominal en insectos expuestos a un monoterpeno. Se evaluó por primera vez en triatominos la repelencia producida por los monoterpenos de origen botánico carvacrol, (-)-carveol, 1,8-cineol, citronelol, eugenol, linalool, mentol, α-terpineol, timol y (S)-cis-verbenol. La mayoría de los monoterpenos mostró un buen efecto repelente, similar al de la dietiltoluamida (DEET). La toxicidad de los once monoterpenos, aplicados como filmes sobre papel de filtro, siguió la tendencia observada por otros autores en otros insectos: fueron menos tóxicos que los insecticidas convencionales; el timol se destacó de los demás monoterpenos por su mayor toxicidad y las moléculas cíclicas fueron más tóxicas que las lineales. Cuando se aplicó en forma tópica en ninfas del primer estadio de ambas especies, el 1,8-cineol presentó una toxicidad muy baja en comparación con la de deltametrina, siguiendo también la tendencia esperable. La aplicación conjunta de BP no sinergizó la toxicidad de este monoterpeno. Se cuantificó por primera vez el efecto de monoterpenos sobre la actividad locomotora en triatominos. En ambas especies, la tetrametrina no resultó hiperactivante para el primer estadio (por esta razón, la deltametrina fue utilizada como control positivo) pero hiperactivó al quinto estadio (a concentraciones varios órdenes de magnitud menores que los monoterpenos). En el primer estadio de ambas especies, la mayoría de los once monoterpenos mostró efecto hiperactivante a partir de una concentración tres órdenes de magnitud superior a la del control positivo. Eugenol, 1,8-cineol, linalool, mentol, α-terpineol y timol resultaron buenos hiperactivantes y, por tanto, fueron seleccionados para su evaluación en ninfas del quinto estadio. Linalool y mentol hiperactivaron solamente al quinto estadio de T. infestans; 1,8-cineol y α-terpineol, solamente al quinto estadio de R. prolixus. Se evaluó por primera vez la capacidad de expurgue de monoterpenos en triatominos. Los monoterpenos que hiperactivaron a las ninfas del quinto estadio de T. infestans (linalool y mentol), también resultaron expurgantes. El linalool se destacó como expurgante en condiciones de laboratorio, si bien fue necesario aplicar una concentración trescientas veces mayor para obtener un tiempo equitóxico al del control positivo (tetrametrina). Al aplicar linalool y mentol, las ninfas abandonaron los refugios a una tasa aproximadamente constante a lo largo de treinta minutos. El eugenol, en cambio, presentó una dinámica de expurgue particular: en promedio cerca del 40% de las ninfas fue expurgado en menos de cuatro minutos y este valor se mantuvo constante hasta el fin del tiempo experimental. Los bioensayos de expurgue en condiciones de semi-campo, si bien preliminares, permitieron observar el fenómeno en condiciones más cercanas al futuro campo de aplicación de estos compuestos y alientan a continuar explorando la potencialidad de linalool, eugenol y sus mezclas como potenciales principios activos de un formulado expurgante. Los resultados de esta tesis apoyan la idea de que el desarrollo de herramientas para el monitoreo y control de triatominos con monoterpenos es factible. Sería de gran valor continuar esta línea de investigación mediante el estudio de diferentes formulaciones (incluyendo el agregado de sinergistas) de los monoterpenos destacados (fundamentalmente 1,8-cineol, eugenol, linalool y timol) y los métodos de aplicación más eficaces para cada caso (repelencia, volteo o expurgue). Palabras clave: monoterpenos, 1,8-cineol, Triatoma infestans, Rhodnius prolixus, repelencia, volteo, actividad locomotora, expurgue.

Abstract:
Vector control of Chagas disease in Argentina is performed by applying pyrethroid insecticides. In recent decades, the emergence of the phenomenon of resistance to pyrethroids and the need to identify less hazardous substances for human and the environment, led to the search for natural alternatives for the development of new control and entomological diagnosis (presence of insect vectors in houses) tools. The aim of this PhD thesis was to explore the bioactivity of natural substances on the triatomines, Chagas’ Disease vectors, Triatoma infestans and Rhodnius prolixus. To this end, the visible symptoms of intoxication, the repellency, the knock-down, the effect on locomotor activity and the flushing-out capacity of eleven monoterpenes components of essential oils (the cyclic ether 1.8-cineole, also known as eucalyptol, and ten alcohols), were evaluated. The visible symptoms of intoxication of insects exposed to a monoterpene (1,8-cineole) were, for the first time, described. On both species, this monoterpene produced symptoms resembling the ones caused by neurotoxic insecticides like organophosporates and pyrethroids, and the phenomenom of abdomen distension in insects exposed to a monoterpene, was for the first time registered. The repellency produced by the monoterpenes of botanical origin carvacrol, (-)-carveol, 1,8- cineole, citronellol, eugenol, linalool, menthol, α-terpineol, thymol y (S)-cis-verbenol; was for the first time evaluated. The mayority of the monoterpenes showed a good repellent effect, similar to the one of diethyl toluamide (DEET). The toxicity of the eleven monoterpenes, applied as films on filter papers, followed the tendency observed by other authors on other species: they were less toxic than conventional insecticides, thymol highlighted because of its higher toxicity and cyclic molecules were more toxic than linear ones. When applied topically on first instar nymphs of both species, 1,8-cineole presented a very low toxicity compared to the one of deltamethrin, also following the expected tendency. The joint application of BP did not synergize the toxicity of these monoterpene. The locomotor activity of monoterpenes in triatomines was for the first time quantified. On both species, tetramethrin did not result hyperativant for first instars (for this reason, deltamethrin was used as positive control) but hyperactivated fifth instars (at concentrations several order of magnitude lower than the ones for monoterpenes). The mayority of the evaluated monoterpenes on first instar nymphs of both species showed hyperativant effect from a concentration three orders of magnitude superior to the one of positive control. Eugenol, 1,8-cineole, linalool, menthol, α-terpineol and thymol resulted good hyperactivants and, because of that, were chosen for evaluation on fifth instars. Linalool and menthol hyperactivated only fifth instars of T. infestans, 1,8-cineole and α-terpineol only fifth instars of R. prolixus. The flushing-out capacity of monoterpenes on triatomines was for the first time evaluated. The monoterpenes which hyperactivated fifth instars of T. infestans (linalool y menthol), also showed flushing-out effect. Linalool highlighted as flushing-out agent in lab conditions, although it was necessary to apply a concentration three hundred times higher to obtain an equitoxic time to positive control (tetramethrin). Applying linalool and menthol, nymphs left their refuge at a rate aproximatly constant during thirty minutes. Eugenol, in contrast, presented a particular flushing-out dynamic: a percentage of near 40% of the nymphs was flushed-out in less than four minutes and this value kept constant till the end of the experimental time. The semi-field flushing-out bioassays, although preliminary, allowed to observe the phenomenom in conditions more close to the future field of application of these compounds and so encourage to continue exploring the potential of linalool, eugenol and their mixes as potential active ingredients of a flushing-out formulate. The results of this thesis support the idea that the development of control and monitoring tools for triatmines with monoterpenes is feasible. It would be valuable to continue this line of research by studying different formulations (including the addition of synergists) of the highlighted monoterpenes (mainly1.8-cineole, eugenol, linalool and thymol) and the methods of application more accurate for each case (flushing-out, repellence or knock-down). Keywords: monoterpenes, 1.8-cineole, Triatoma infestans, Rhodnius prolixus, repellency, knock-down, locomotor activity, flushing-out.

Hancke, Diego. "La comunidad de helmintos en roedores sinantrópicos de la Ciudad de Buenos Aires: su relación con los ensambles de especies hospedadoras y su importancia zoonótica" (2016-03-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo general de esta tesis fue conocer el efecto del ensamble de roedores sobre la estructura de las comunidades de parásitos en diferentes ambientes de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires (CABA). Para esto se identificaron las especies de helmintos presentes en muestras de roedores capturados en tres ambientes representativos de la CABA: barrios residenciales donde la especie de roedor dominante es Rattus rattus, villas de emergencia donde las especies dominantes son R. norvegicus y Mus musculus y espacios verdes donde existe una dominancia de R. norvegicus y M. musculus, acompañados por la especie nativa Oligoryzomys flavescens. Los resultados mostraron que el 75.4% del total de roedores prospectados (n=203) estuvieron parasitados con al menos una de las 12 especies de helmintos identificadas (1 acantocéfalo, 3 cestodes y 8 nematodes). Las infracomunidades se agruparon a partir de las características de su composición y abundancias relativas y lo hacen en relación a la comunidad componente a la cual pertenecen. Las comunidades componentes de mayor diversidad de helmintos correspondieron a R. norvegicus que estuvieron caracterizadas por la presencia de dos especies centrales, Nippostrongylus brasiliensis y Heterakis spumosa. La comunidad componente de O. flavescens presentó una única especies central, Stilestrongylus brasiliensis, y se detectó además la presencia de especies de helmintos típicos de hospedadores múridos, producto de la coexistencia entre roedores invasores y nativos. En cambio, el reducido valor de diversidad que mostraron R. rattus y M. musculus puede interpretarse a partir de que solamente presentaron especies satélites de helmintos. Las unidades de paisaje fueron los predictores más fuertes de los niveles de infección de las especies de helmintos más abundantes del ensamble. Entre los parásitos identificados, encontramos Hymenolepis nana e H. diminuta, cuya reconocida importancia sanitaria confirma a los roedores urbanos como potenciales reservorios de enfermedades zoonóticas. Palabras clave: roedores, helmintos, ecología, infracomunidades, comunidades componentes, ambientes urbanos, importancia sanitaria

Abstract:
The overall goal of this thesis was to study the effect of rodents assembly on the structure of parasite communities in different environments of the city of Buenos Aires (CBA) (Argentina). To this end, we identified the helminth species present in samples of rodents captured in three representative CBA environments: residential neighborhoods where Rattus rattus the dominant rodent species is, slums where R. norvegicus and Mus musculus the dominant species are and open green spaces where also R. norvegicus and M. musculus there dominants are but accompanied by the native species Oligoryzomys flavescens. The results showed that 75.4% of the prospected rodents (n = 203) were parasitized with at least one of 12 identified helminth species (1 acanthocephalan, 3 cestodes and nematodes 8). The infracommunities were grouped according the characteristics of their composition and relative abundance and they did it in relation to the component community to which they belonged. The most diverse helminth componente communities corresponded to R. norvegicus wich were characterized by the presence of two main species, Nippostrongylus brasiliensis and Heterakis spumosa. The component community of O. flavescens presented a single central species, Stilestrongylus brasiliensis, but typical murine helminths species were also detected due to the coexistence between invaders and native rodents. Instead, the reduced diversity showed by R. rattus and M. musculus could be interpreted by the fact that they harbourded only satellites helminth species. The landscape units were the strongest predictors of helminth infection levels. Among the parasites identified, Hymenolepis nana and H.diminuta, whose recognized health importance confirmed urban rodents as potential reservoirs of zoonotic diseases. Key words: rodents, helminths, ecology, infracommunities, componente communities, urban environments, health importance

Jaramillo Ortiz, José Manuel. "Desarrollo de candidatos vacunales contra Babesia bovis basados en vectores virales y proteínas recombinantes" (2016-03-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La babesiosis bovina es una enfermedad parasitaria trasmitida por garrapatas y causada por los protozooarios intraeritrocíticos Babesia bovis y B. bigemina. Esta infección provoca importantes pérdidas económicas en varias regiones tropicales y subtropicales del mundo donde el vector está presente. En nuestro país, la zona ganadera afectada incluye el noreste y noroeste por encima del paralelo 33°S en donde la garrapata vector Rhipicephalus microplus encuentra las condiciones ecológicas adecuadas para su desarrollo. La vacunación contra la babesiosis bovina es una de las medidas de control existente para esta parasitosis y se realiza en terneros menores a los nueve meses de edad utilizando principalmente hemovacunas refrigeradas a base de cepas vivas atenuadas de estos parásitos. Si bien esta vacuna es efectiva en una única dosis, confiriendo protección durante toda la vida útil del bovino, presenta algunas desventajas en su producción, vida media y logística de distribución. Por este motivo, el desarrollo de alternativas vacunales que superen estas dificultades resulta de interés para mejorar las condiciones sanitarias de la región y aumentar la competitividad del sector. En este presente trabajo de tesis, se han desarrollado tres candidatos vacunales basados en las regiones inmunodominantes de tres antígenos de B. bovis altamente conservados e inmunodominantes para el bovino; estos son las proteínas MSA-2c (del inglés, Merozoite Surface protein – 2c), RAP-1 (Rhoptry Associated Protein – 1) y HSP20 (Heat Shock Protein 20). Estos 3 antígenos se han obtenido en dos plataformas de expresión diferentes: como vectores virales no replicativos y como proteínas recombinantes. El primer candidato es un virus vaccinia Ankara modificado (rMVA), un poxvirus no replicativo que codifica en un único marco de lectura estas tres regiones antigénicas como un multiantígeno al que denominamos rMABbo. Asimismo se ha desarrollado un Adenovirus recombinante (rAd) que codifica el mismo multiantígeno. También, se han obtenido en un sistema procariota las tres proteínas por separado y el multiantígeno recombinante como única poliproteína. Con los tres inmunógenos desarrollados, se estudió la respuesta inmune celular y humoral inducida por los mismos en el modelo murino en esquemas de vacunación “prime – boost” homólogos y heterólogos. Los resultados mostraron que la vacunación heteróloga que combinó el prime con rAd o con el rMABbo y el boost con el virus rMVA resultaron ser más efectivas que sus esquemas homólogos, pudiendo detectarse en ambos tipos de esquemas heterólogos altos títulos de anticuerpos específicos de tipo IgG con una mayor proporción del isotipo IgG2a, niveles significativos de IFN secretado y un alto porcentaje de células CD4+ y CD8+ productoras de una y ambas citoquinas de perfil Th1: IFNγ y TNFα Los aportes de este trabajo de tesis permitieron desarrollar nuevos inmunógenos recombinantes basados en un diseño racional de antígenos y plataformas de expresión para optimizar la respuesta inmune protectiva hacia Babesia bovis. Además se ha caracterizado la respuesta inmune inducida en el modelo murino, permitiendo dilucidar los aspectos claves a tener en cuenta para seleccionar la mejor estrategia vacunal a ser evaluada frente al desafío con Babesia bovis en bovinos, único modelo biológico para este parásito.

Abstract:
Bovine babesiosis is a tick – borne disease caused by the intraerythrocytic protozoan parasites Babesia bovis and B. bigemina. This infection causes economic losses in tropical and subtropical areas where the tick is present. In Argentina, the livestock area affected includes the northeast and northwest of the parallel 33° S, where the natural vector Rhipicephalus (Boophilus) microplus finds the ecological conditions for its development. To prevent babesiosis outbreaks in endemic areas, 4-9-month-old calves are vaccinated with live attenuated strains of both parasites. Even though these vaccines are effective in a single dose, conferring protection throughout the life of the bovine, they have some disadvantages in their production, half-life and distribution logistics. Hence, the development of alternative vaccines to overcome these difficulties is of great interest to improve sanitary conditions in order to increase the competitiveness of the livestock production. In this present work, three vaccine candidates have been developed. These immunogens are based on the immunodominant regions of three highly conserved B. bovis antigens that are also immunodominant for cattle: MSA-2c (Merozoite Surface protein - 2c), RAP-1 (Rhoptry Associated Protein - 1) and HSP20 (Heat Shock Protein 20). These three antigens were obtained on two different expression platforms: as non-replicative viral vectors and as recombinant proteins. The first candidate is a recombinant modified vaccinia Ankara vector (rMVA), a nonreplicative poxvirus which encodes an open reading frame of a multi-antigen (rMABbo) . This multi-antigen includes B and T cells epitopes of the three antigens mentioned above. In addition, a recombinant adenovirus (rAd) expressing the same rMABbo was developed. Besides, the complete rMABbo and each of the three antigens were expressed separately in E.coli and purified by affinity chromatography for delivery as subunit vaccines. The humoral and cellular immune responses induced by the three vaccine candidate were evaluated in both homologous and heterologous prime – boost immunizations. The results show that heterologous immunization combining the rAd or the rMABbo as a prime, with rMVA as a boost elicit the most effective immune response in terms of high specific IgG antibody titters with a major IgG2a subclass proportion (indicating a Th1 immune response), a significant level of secreted IFNγ and high percentages of both CD4+ and CD8+ T cells producing both IFNγ and TNFα cytokines. The present work contributes to the development of a new generation vaccine candidates based on a rational design and antigen expression platforms to optimize the protective immune response to Babesia bovis. The characterization of the immune response in the murine model is also an accessible approach to optimize the best vaccination strategy to be evaluated in cattle which is the only biological model against Babesia bovis infection.

Mild, Jesica Gabriela. "Búsqueda de extractos naturales con propiedades antiparasitarias y nuevos blancos moleculares para la terapia contra la enfermedad de Chagas" (2016-04-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los tratamientos disponibles contra la Enfermedad de Chagas son poco efectivos y pueden presentar efectos secundarios severos. Existe una urgente necesidad de encontrar nuevos blancos moleculares y nuevas terapias antiparasitarias. El primer objetivo de este trabajo consistió en la búsqueda de extractos naturales con capacidad de interrumpir interacciones entre proteínas que participan en procesos esenciales del parásito y presentan características divergentes respecto de su contraparte en humanos. El rastreo se realizó sobre la interacción entre las proteínas p14 y Sf3b155 a través de un ensayo basado en la transferencia de energía resonante bioluminiscente (BRET). Contrariamente al objetivo original, encontramos que un extracto de Nardophyllum bryoides provocó un aumento de la señal de BRET, lo cual reflejaría su capacidad de modular positivamente la interacción; asimismo, el extracto presentó propiedades antiproliferativas sobre cultivos de epimastigotes. Por otra parte, se planteó la identificación de nuevos blancos moleculares a partir de dos estrategias. La primera se basó en la caracterización de potenciales interacciones entre proteínas del parásito, en particular, a través de la búsqueda de ligandos de una proteína exclusiva de T. cruzi, TcCLB.504427.180, que presenta dominios WW y podría participar en diversos procesos fisiológicos. La segunda, se enfocó en la búsqueda de nuevos efectores de la vía del AMPc en T. cruzi. Si bien la primera estrategia no arrojó resultados positivos, el segundo enfoque nos permitió demostrar que la proteína TcCLB.508523.80 es capaz de unir AMPc y que podría estar involucrada en la invasión de la célula hospedadora. Estas evidencias sugieren que TcCLB.508523.80 sería un novedoso sensor primario del AMPc en la biología del parásito.

Abstract:
Available treatments against Chagas Disease are not completely effective and may present severe side effects. There is an urgent need to find new molecular targets and new antiparasitic therapies. The first objective of this work was to search for natural extracts with the ability to interrupt interactions between proteins that are involved in essential processes of the parasite and posses divergent characteristics regarding its human counterparts. The screen was performed on the interaction between the proteins p14 and Sf3b155 through a bioluminescent resonance energy transfer (BRET) assay. Contrary to the original goal, we found that an extract of Nardophyllum bryoides caused an increase in BRET signal, which might reflect its ability to positively modulate the interaction; in accordance, the extract showed antiproliferative properties on epimastigote cultures. Moreover, we intended to identify new molecular targets by using two approaches. The first was based on the characterization of potential interactions between parasite proteins, in particular, through searching ligands for TcCLB.504427.180, a T. cruzi exclusive protein, which contains WW domains and could be involved in various physiological processes. The second, was focused on finding new effectors of the cAMP pathway in T. cruzi. While the first strategy showed no positive results, the second approach allowed us to demonstrate that the protein TcCLB.508523.80 is able to bind cAMP and could be involved in host cell invasion. These evidences suggest that TcCLB.508523.80 could be a novel primary cAMP sensor in the parasite biology.

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