Biblioteca Digital | FCEN-UBA

Biblioteca Digital ¿Por qué?
Objetivos
Impactos
Estadísticas
Documentos
Presentaciones
Notas
Autores y derechos
¿Por qué depositar?
¿Cómo depositar?
Autorización
Depositar y publicar
Editoriales
Publicar mi tesis Formulario Tesis Posgrado
Formulario Tesis Grado
Normativa
Res. CD 2053/05
Res. CD 2533/09
Res. CD 0272/13
Res. CD 2793/15

Colecciones Tesis Doctorales
Fotografías
Publicaciones
Archivo
Libros
Reportes Técnicos

Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Microbiología [ 40 tesis ]

Pando, Pedro J.. "Esquisomicetas" (1882) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Landaburu, Argentino Carlos. "Ecología de pastizales : Descomposición de la materia orgánica" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Dellepiane, Nora Ida. "Estudio de las cepas de virus rábico utilizadas en la preparación de vacuna de cerebro de ratón lactante (tipo Fuenzalida - Palacios)" (1984) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En este trabajo se comparó la capacidad inmunogénica de la vacuna antirrábica del cerebro de ratón lactante (CRL) trivalente con la de tres vacunas monovalentes elaboradas con cada una de las cepas virales que componen antigénicamente la vacuna clásica. Tanto la vacuna trivalente, como las monovalente CVS y 51, alcanzaron valores antigénicos elevados en pruebas de potencia NIH. No ocurrió lo mismo con la vacuna monovalente 91, que mostró ser un inmunógeno pobre. La vacuna trivalente fue superior a todas las monovalentes cuando se compararon la velocidad en inducir la respuesta de anticuerpos y los títulos alcanzados al administrarlas en diluciones crecientes. Los títulos de anticuerpos obtenidos con las vacunas trivalente y monovalentes CVS y51, así como su duración en el tiempo, fueron comparables; la vacuna 91 en cambio, indujo bajos títulos de anticuerpos neutralizantes. El estudio de la capacidad de neutralización cruzada de los anticuerpos inducidos, mostró que el virus 91 difiere antigénicamente de los virus CVS y 51. Al compararse la eficacia de cada vacuna en proteger a ratones inmunizados con ellas del desafío intracerebral con los virus fijos CVS, 51 y 91 y los virus calle 1026/80 y 1426/79, se comprobó que excepto la 91, todas protegían frente a todos estos virus con excepción del 91, frente al cual lo hacían sólo parcialmente. En contraposición, la vacuna 91 fue la única realmente eficaz para proteger a los ratones del posterior desafío con la cepa de virus homóloga, y fue ineficiente para protegerlos del desafío con los virus CVS, 51 y 1426/79. Los resultados de los tratamientos postexposición mostraron que tanto la vacuna trivalente como las monovalentes CVS y 51, a diferencia de la 91, protegen de la infección letal por vía parenteral con virus calle. No se pudo detectar interferón en el suero de los ratones inmunizados con ninguna de las vacunas. Por consiguiente no se pudo establecer que exista una relación directa entre producción de interferón y protección en tratamientos postexposición. Se demostró que la técnica de CIE utilizada para cuantificar anticuerpos en el suero de ratones inmunizados, daba títulos de anticuerpos correlacionados con los obtenidos con la prueba in vivo.

Torruella, Mónica. "Anticuerpos monoclonales contra adenilato ciclasa de eucariotes inferiores" (1984) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Fastame, Inés Gabriela. "Regulación de síntesis proteica en bacterias y parásitos" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Vazquez, Martín Pablo. "Organización y expresión genómica en Trypanosoma cruzi : Proteínas ribosomales P y secuencias repetidas" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Bassi, Daniel Ernesto. "Biosíntesis de succinoglicano y de compuestos relacionados en Agrobacterium radiobacter" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Agrobacterium radiobacter produce un polisacárido extracelular (EPS), el succinoglicano, cuya unidad repetitiva (U.R.) es un octasacárido constituído por Glc, Gal, piruvato y succinato en relación 7:1:1:1 (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal—4-6-4Pyr (ver en versión PDF). Este polisacárido tiene gran importancia en la industria del petróleo, y el producto comercial, se extrae de la bacteria en estudio debido a que lo produce en cantidades elevadas. En otros sistemas, se ha demostrado que la biosíntesis de EPS se realiza fundamentalmente en cuatro etapas (Ielpi et al, 1993, J. Bacteriol, 175: 2490-2500). En la primera, se sintetizan los nucleótido-azúcares precursores. En una segunda etapa, se forma la U.R. por transferencia secuencial de los distintos monosacáridos que la componen a partir de los respectivos nucleótido-azúcares a un prenil-fosfato aceptor ubicado en la membrana plasmática. Estas reacciones están catalizadas por enzimas específicas, las glicosiltransferasas. Una vez completada la U.R., ésta actúa como monómero en una reacción de polimerización, siendo el producto final el EPS. Es probable que la polimerización y el transporte al exterior celular (cuarta etapa) del polímero sean simultáneos. En este estudio, se describe la biosíntesis "in vitro" del succinoglicano en A. radiobacter. Se obtuvieron y caracterizaron algunos prenil difosfato azúcares intermediarios y el producto final, es decir el succinoglicano sintetizado "in vitro". Para estudiar la posible formación de compuestos relacionados con la síntesis de EPS, se realizaron incubaciones con células permeabilizadas con EDTA (García et al, 1974, Eur. J.Biochem. 43:93-105) en presencia de UDP-Glc y/o UDP-Gal uno de los dos marcado con -Glc. La mezcla de incubación se centrifugó y el precipitado de células se lavó con buffer acuoso y luego se trató con solventes orgánicos, que extraen los lípido-azúcares formados. Los lavados se unieron al sobrenadante y en esta fracción se investigó la presencia de EPS. Al realizar incubaciones con células provenientes de la cepa silvestre en presencia de UDP--Glc, si bien se observó la síntesis de numerosos compuestos, algunos de ellos de propiedades novedosas, ninguno presentó las propiedades esperables para los compuestos intermediarios, es decir, los prenil fosfo-azúcares. Sin embargo, fue posible observar polímero en los lavados acuosos aunque en muy baja cantidad. En caso de incubar en presencia de UDP--Gal se pudieron obtener algunos compuestos de interés, uno de ellos liberaba Gal, pero en cantidades no adecuadas como para ser analizadas. Cuando se incubó en presencia de ambos dadores, uno de ellos radioactivo, se obtuvo menor cantidad de radioactividad en los extractos orgánicos que en el caso de incubar en presencia de un solo nucleótido. Este hecho se atribuyó a la dilución de la marca radioactiva, debido a que la cepa silvestre contiene la UDP-Gal-4-epimerasa, enzima que cataliza la interconversión de UDP-Glc en UDP-Gal. Se buscó, entonces resolver el problema utilizando una mutante, defectiva en la síntesis de esta enzima, de forma tal de poder realizar incubaciones con ambos nucleótidos sin observar el efecto de dilución mencionado anteriormente. En efecto, al utilizar la cepa SGN-1, defectiva en la síntesis de la epimerasa, se pudo lograr la síntesis de los siguientes compuestos: Gal-P-P-prenol, celobiosil- galactosa-P-P-prenol y los prenil difosfato derivados de un octasacárido y de su derivado piruvilado, estrechamente relacionados con la U.R. del succinoglicano. La cantidad de polímero obtenida fue sensiblemente mayor que en el caso de la cepa silvestre. Mediante incubaciones en dos etapas, se demostró también que los prenilfosfo-azúcares analizados eran los precursores del polisacárido. Por otro lado, se estudió el efecto de los dadores de grupos no glicosídicos sobre la síntesis del polímero. El PEP estimula discretamente la formación de polímero, probablemente por un aumento en la piruvilación de la U.R., que es, aparentemente un sustrato mas adecuado para la polimerasa, es decir la enzima o grupo de enzimas que catalizan la polimerización de la U.R. El SuccCo-A ejerce un efecto dual. A una concentración de 0,1 mM estimula en forma notoria la polimerización, mientras que a una concentración diez veces mayor se observó una reducción gradual en dicha estimulación. Finalmente, estos estudios se extendieron a una bacteria estrechamente relacionada, patógena de plantas, Agrobacterium tumefaciens que también produce succinoglicano. En esta cepa, se habían aislado y caracterizado parcialmente varios prenil-fosfo-azúcares, pero no se había logrado su polimerización (Staneloni et al, 1984, J. Gen. Microbiol., 130: 869-879). Con la experiencia lograda en A. radiobacter, se logró obtener succinoglicano "in vitro"también en A. tumefaciens.

Abstract:
Agrobacterium radiobacterium produces an extracellular polysaccharide (EPS), succinoglycan, containig an octasaccaharide repeating unit (R.U.) constituted with Glc, Gal, piruvate and succinate in a 7:1:1:1 molar ratio (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal--4-6-4Pyr. This polysaccharide is widely used in the oil industry, and Agrobacterium radiobacter is regularly employed to produce it because of the good yields reached. As it was demonstrated for other systems, the biosynthesis of the EPS takes place mainly in four stages (Ielpi et al, 1993, J.Bacteriol. 175:2490-2500). In the first one, the donor sugar nucleotides are synthesized. In a second stage, the R.U. is made by the secuential transfer of the different monosaccharides that constitute it, from the proper sugar nucleotides, to a plasmatic membrane bound prenyl phosphate. Once the R.U. is completed, it acts as a monomer in a polymerization reaction, the EPS being the final product. It is likely that polimerization and the transport to the extracellular compartment (fourth stage) are simultaneous. In this study, the "in vitro" biosynthesis of succinoglycan in A. radiobacter is described. Some intermediate prenyl phospho sugars and the final product, the "in vitro" synthesised succinoglycan were obtained. In order to search for the posible formation of compounds related to the synthesis of polysaccharide, incubations with EDTA permeated cells (García et al., 1974, Eur. J. Biochem.43:93-105) in the presence of UDP-Glc and/or UDP-Gal, one of them radioactively labelled, were performed. The reactions were ended by dilution and centrifugation and the cell pellet was washed several times with buffer and then extracted with organic solvents, that dissolve the lipid-sugars. The presence of EPS was investigated in the combined supernatants and washings. When the incubations were done using wild type cells, in the presence of UDP--Glc several lipidic compounds were obtained, some with unusual properties, but none of them behaved as expected for prenyl-phospho-sugars. However, polymer was observed in the aqueous supernatant though in very low amounts. When incubating in the presence of UDP--Gal, it could be found some compounds of our interest, one of them liberating Gal, but in quantities not suitable to be analized. Incubations done in the presence of both nucleotides, one of them radioactively labelled, yielded smaller amounts of radioactivity soluble in organic solvents, probably because of the dilution of the labell, due to the activity of UDP-Gal-4-epimerase, the enzime which catalizes the interconversion of UDP-Glc into UDP-Gal. The idea was then to look for a mutant defective in this enzyme activity to be able to perform incubations in the presence of both sugar nucleotides, one of them labelled, in order to avoid this dilution effect. As expected, the synthesis of compounds with the properties of prenylphosphosugars was achieved when the SGN-1 strain, a mutant not able to synthesise the UDP-Gal-4-epimerase, was used as enzime source. The following compounds were characterized: Gal-P-P-prenol; (cellobiosyl)-galactose-P-P- prenol , and the prenyl diphosphate derivatives of an octasaccharide and of its pyruvilated octasaccharide closely related to the structure of the R.U. of succinoglycan. The amount of radioactive labelled polymer was significatively higher and could be identified as succinoglycan. Performing two steps incubations, it was demonstrated that the prenyl-phospho-sugars were the precursors of the EPS. On the other hand, the effects of the non glycosidic donors on the polymer synthesis was studied. Phosphoenolpyruvate stimulates moderately polymer formation, probably due to the rise in the amounts of the pyruvulated R.U., which is apparently a more adequate sustrate for the polimerase. Succinyl coenzyme A excerts a dual effect. At concentrations of 0,1 mM greatly enhances the polimerization, but with a tenfold increase (1 mM) a reduction in the activation was observed. Finally these studies were extended to the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens, a closely related bacteria that also produces succinoglycan. Enzymatic preparations from this strain allowed the synthesis of several prenyl-phospho sugars, but no polymerization was observed (Staneloni et al, 1984 J. Gen. Microbiol, 130: 869- 879). With the experience acquired with A. radiobacter system, "in vitro" succinoglycan synthesis was also obtained.

Vojnov, Adrian Alberto. "Síntesis de exopolisacáridos en Xanthomonas sp." (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Xanthomonas campestris es un patógeno de plantas causando la putrefacción negra en las hojas de las crucíferas. Además, produce un polisacárido extracelular (EPS), de gran importancia industrial, llamado xantano. La estructura de su unidad repetitiva es ( Jansson, P. E. et al., 1975. Carbohydr. Res. 45: 274): (ver figura en el pdf). La biosíntesis in vitro de xantano ha sido estudiada en detalle en nuestro laboratorio (Ielpi et al., 1993. Bacteriol., 175:2490). Se ha determinado que ésta ocurre en al menos dos etapas. En la primera etapa, la unidad repetitiva se ensamba secuencialmente sobre un poliprenol pirofosfato. En una segunda etapa, las unidades repetitivas son polimerizadas y el EPS formado liberado en el medio de crecimiento. Se conoce que los genes involucrados en la biosíntesis del xantano, 12 genes, están agrupados en un segmento de ADN de 16 Kb ( Barrre et al., 1986.Int. Biol. Macromol, 8: 372) y parte de los genes involucrados en la transferencia de azúcares estan identificados (Vanderslice et al., 1990. Synergen, Inc., EEUU), pero no se realizó un estudio detallado de la caracterización de mutantes no productoras de xantano, como asi también, aún se desconoce la ubicación de los genes responsable del proceso de polimerización y exportación. En este trabajo de tesis, presentamos la caracterización de algunas mutantes defectuosas en la producción de EPS, en la cual, en dos de ellas, se realizó un estudio más detallado: X. campestris 8004:: Tn525 y 8004:: Tn570. La primera mutante falló en producir el pentasacárido, unidad repetitiva del xantano, y solamente tres azúcares fueron transferidos al prenil pirofosfato intermediario, esta unidad repetitiva truncada no obstante pudo ser polimerisada. El polímero truncado formado tiene la estructura de una celulosa sustituida alternadamente por residuos de manosa y tiene un potencial interés industrial. El transposón, responsable de la mutación, fue localizado dentro del gen gumk. Por lo tanto, este gene codificaría la glicosil transferasa IV, que cataliza la transferencia de ácido glucurónico al trisacárido manosil-celobiosa. La segunda mutante estudiada resultó ser capaz de sintetizar in vitro el lípido pentasacárido, unidad de repetitiva, con cualquiera de los tres dadores de azúcares utilizados: UDP-Glc, GDP-Man y UDP-GlcA, pero incapaz de polimerizar estas unidades. El Tn5, en la cepa N °70, fue localizado 15 bp "upstream" del sitio de iniciación del gen gumB (primer gen del grupo). Esto suguiere que gumB está involucrado en el proceso de polimerización. Un segundo aspecto desarrollado en este trabajo de tesis fue el efecto de los grupos no glicosídicos en el proceso de polimerización. Se demostró que los niveles más altos de polimerización, en el EPS producido por la cepa mutante N° 25, fueron obtenidos cuando 30 % de las unidades repetitivas truncadas se encontraban acetiladas. Por otra parte, el fosfoenolpiruvato (dador de los grupos piruvatos) se comportó, sobre este polímero, como un regulador positivo en las reacciones de polimerización. En la cepa silvestre solo se observó cierta inhibición en la reacción de polimerización con ambos dadores de grupos no glicosídicos estudiados. Es importante destacar que la unidad truncada que sintetiza la cepa N° 25 no posee grupos piruvatos en su estructura. Finalmente, estudios preliminares mostraron la obtención in vitro de glucanos β -( 1,2 ) lineales y cíclicos utilizando diferentes preparaciones de X. campestris. Algunos resultados preliminares suguieren un posible rol de estos glucanos en el proceso de infección.

Abstract:
Xanthomonas campestris is a plant pathogen causing the disease called black rot. In addition, it produces an extracellular polysaccharide (EPS), of great industrial importance, called xanthan. The structure of its repeating unit is (Jansson, P.E. et al., 1975.Carbohydr.Res.45:274). (see in pdf). The in vitro biosynthesis of xanthan gum has been studied in our laboratory in detail (Ielpi et al., 1993. J. Bacteriol., 175: 2490). It occurs in at least two stages. In the first, the repeating unit is sequentially assembled linked to a polyprenol trough a diphosphate bridge. In a second stage, the repeating units are polimerized and liberated into the growth medium. It has been reported that the genes involved in xanthan biosynthesis are located in a cluster of 12 genes (Barrère et al., 1986. Int. J. Biol. Macromol, 8:372). This cluster was found to have about 16 Kb and some of the genes involved in the sugar transfer were identified (Vanderslice et al., 1990. Synergen, Inc., USA), but the location of the genes responsible for the polimerization and export process is until unclear. In this thesis work, we reported the characterization of some EPS defective strains, two of them in more detail: X. campestris 8004::Tn525 and 8004::Tn570. The first mutant failed to produce the pentasaccharide repeating unit. Only three sugars were transferred to the prenil phosphate intermediate and polimerized. The truncated polymer formed has the structure of a mannose substituted cellulose and has potential industrial interest. The transposon responsible of the mutation was located within gumK gene. Therefore, this gene codify for the glycosyl transferase IV, which catalyzes the glucuronic acid transfer to the mannosil-cellobiosetrisaccharide. The second mutant turned out to be able to synthesize in vitro the lipid linked pentasaccharide repeating unit, from the three sugar donors: UDP-Glc, GDP-Man and UDP-GlcA, but unable to polimerize it. The Tn5 was located 15 bp upstream of the initiation site of gumB gene (first gene of the cluster). It was suggested that gumB is involved in the polimerization process. A second aspect developed in this thesis work was the effect of non glycosidic group on polymerization process. It was shown that higher polymerization levels was obtained when 30 % of the repeating units were acetylated. On the other hand, the phosphoenolpiruvate itself (cetal pyruvic donor) behaved as a positive regulator on the polymerization reactions. On the wild strain only certain inhibition on the polimerization reaction was observed with both donors of groups non glicosydic studied. It is important to emphasize that the truncated unity that synthesizes the strain N° 25 is not possessing pyruvil groups in its srtructure. Finally, preliminary studies showed the in vitro synthesis of lineal and cyclic ß(1,2) glucans by different preparations of X. campestris. A possible rol of these glucans in the infection process was suggested.

Cucchi, Adriana. "Supervivencia y mejoramiento de los bacilos entomopatógenos : Bacillus thuringiensis var. israelensis y Bacillus sphaericus" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El uso de los bioinsecticidas representa una ventajosa alternativa desde el punto de vista ecológico y toxicológico en el control de enfermedades y plagas.% Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) y Bacillus sphaericus (Bf) son especies bacterianas empleadas como bioinsecticidas en la lucha contra los agentes de transmisión del paludismo, la fiebre amarilla y el dengue entre otras enfermedades. Sin embargo su uso se ve restringido debido a la alta especificidad y sedimentación de los preparados de bioinsecticidas así como debido a problemas de supervivencia de los bacilos entomopatógenos. El objetivo de esta tesis es comprender las causas de la baja supervivencia de Bti y Bf y mejorar esta variable para aumentar su eficiencia como bioinsecticidas. En este estudio se evalúan distintas propiedades vinculadas con la supervivencia, eligiéndose a la respuesta osmótica como tema central de estudio. Si bien se analiza el comportamiento en distintos estadios fisiológicos, las esporas constituyen el principal blanco de interés. Esto surge al considerar que los bioinsecticidas son preparados formados por esporas y cristales tóxicos y que son empleados mediante su diseminación en ambientes acuáticos. A partir de los resultados obtenidos en esta tesis se puede concluir que: 1- Distintos factores determinan la baja supervivencia de los bacilos entomo-patógenos Bti y Bf en el ambiente: la temperatura, la luz UV, las variaciones osmóticas y el bajo pH, si bien su reducida tolerancia osmótica es uno de los factores que contribuye en mayor medida. 2- La alta sensibilidad de las esporas de estos bacilos resulta de una deficiencia en un tipo de proteínas llamadas SASP, encontrándose afectados tanto su concentración como el contenido en aminoácidos osmóticamente relevantes. Por otro lado, posiblemente deficiencias relacionadas con las cubiertas y envolturas de las esporas sean también responsables de su gran sensibilidad ambiental. 3- La introducción de genes ssp (codificantes de las proteínas SASP) de B. subtilis permite un mejoramiento de la respuesta osmótica en esporas de Bti y Bf. La expresión de estas proteínas en las cepas transformadas no afecta la esporulación ni otras propiedades biológicas de importancia en el empleo de los bioinsecticidas.

Abstract:
Bioinsecticides constitute a convenient choice in plague and disease control, both considering toxicological and environmental perspectives. Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) and Bacillus sphaericus (Bf) are bacteria employed as bioinsecticides in paludism, yellow fever and dengue control. Nevertheless, poor strain survival, restricted host range and sediment problems of formulations in aquatic enviroments limit their application in nature. The objetive of this work is to understand Bti and Bf low survival and to improve it in order to obtain a greater efficacy in field application. The research is focus on the osmotic response, although other parameters are also evaluated. The study is based on spores, but vegetative cell behaviour is also analyzed. This results from bioinsecticides are spore plus crystal complexes which are disseminated in aquatic environments. From the results obtained we can conclude that: 1. Different environmental factors contribute with Bti and Bf poor survival: temperature, UV light, osmotic variations and low pH, although the reduced osmotic tolerance is one of the main factors to consider. 2. The great sensibility of Bti and Bf spores is due to a defficiency in some proteins called SASP, being affected both its concentration and the content of osmotically relevant aminoacids. Possibly, other defficiencies including the spore cortex and spore coats contribute with this great sensibility. 3. Introduction of ssp genes (which code for SASP proteins) from B. subtilis improve the osmotic response of Bti and Bf spores. SASP expression doesn’t interfere with sporulation nor crystal protein synthesis, essential in bioinsecticide application.

Bigi, Fabiana. "Identificación y caracterización de antígenos de Mycobacterium bovis" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Registro Cita

Quagliano, Javier Carlos. "Producción microbiológica del poliester biodegradable poli-3-hidroxibutirato (PHB) a partir de Azotobacter chroococcum 6B" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El poli-3-hidroxibutirato (PHB) es un poliéster de origen bacteriano obtenido bajo condiciones de estrés nutricional en el medio de cultivo. Se acumula en el citoplasma dentro de gránulos y representa para el microorganismo una reserva de carbono y poder reductor. El PHB es un polímero biodegradable, biocompatible, de regular cristalinidad y moderada resistencia mecánica, utilizable en varias aplicaciones una vez procesado, como por ejemplo en la fabricación de envases plásticos completamente biodegradables. Al obtenerse además a partir de fuentes de carbono naturales renovables, representa un material promisorio para reemplazar a los plásticos sintéticos en algunas áreas. En este Trabajo se optimizó en primer lugar un medio de cultivo para la obtención de PHB a partir de una cepa de Azotobacter chroococcum aislada de una muestra de suelo, para luego estudiar el efecto de distintas condiciones y sistemas de cultivo sobre el contenido de biomasa celular y PHB. Se estableció el efecto de la tasa de aireación y de la relación carbono/nitrógeno bajo cultivo en fermentador sobre el contenido de biomasa, PHB, rendimientos de biomasa y PHB a partir de la glucosa consumida, velocidad especifica de crecimiento y de formación de PHB. Un modelo para la obtención del rendimiento real de PHB que utiliza los datos experimentales del contenido de PHB, rendimiento de biomasa y el valor del rendimiento teórico fue aplicado a los resultados obtenidos. Por último, para contribuir al conocimiento de un área poco investigada en Azotobacter sp., se estudió el efecto de las condiciones fermentativas sobre las propiedades fisicoquimicas del PHB obtenido (cristalinidad, resistencia mecánica, estabilidad térmica y especialmente sobre el peso molecular relativo, factor que afecta en mayor medida al PHB en cuanto a su utilización). Tres potenciales aplicaciones del PHB fueron desarrolladas: i) como película de soporte para el cultivo de epidermis, ii) como película para el peleteado de semillas de alfalfa utilizadas como inoculante y iii) como matriz para el microencapsulamiento de enzima celulasa para su uso como aditivo en ensilado de pasturas.

Abstract:
Poly-3-hydroxybutyrate (PHB) is a bacterial polyester obtained under nutritional stress in the culutre media. It accumulates as granules inside the citoplasm and represents a carbon and reducing power source. PHB is a biodegradable and biocompatible polymer, with regular crystallinity and mechanical strength, utilizable in several applications once processed, such as for the production of completely biodegadable containers. Additionally, as it is obtained from natural and renewable carbon sources, it looks as a possible material for replacing synthetic plastics in some areas. At first, on this work, a culture media for PHB production was optimized, using a strain of Azorobacrer chroococcum isolated from a soil sample, then the effect of different conditions and culture systems was studied on biomass and PHB content. The effect of aeration rate and carbon/nitrogen ratio under fermentor cultivation was established over biomass and PHB contents, biomass and PHB yields from consumed glucose, specific growth rate and PHB formation. A model for obtaining overall PHB yields from the experimental data of PHB contents, biomass yield and theoretical yield value was applied to the obtained results. For contributing to the knowledge of a scarcely investigated area on Azorobacrer sp., the effect of fermentation conditions was studied on PHB physicochemical properties (crystallinity, mechanical strength, thermal stability and specially on the relative molecular weight, which affects PHB mostly for its utilization). Ihree potential applications were developed: i) as a film for supporting epiderrmal growth for burn cases, ii) as film for alfalfa seed pelleting used as inoculants and iii) as a matrix for the microencapsulation of the enzyme cellulase for its utilization as additive on grass silage.

Cortón, Eduardo. "Desarrollo y aplicaciones de biosensores enzimáticos y microbianos" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Se construyeron biosensores enzimáticos cableados basados en la inmovilización de una oxidasa (glucosa oxidasa, lactato oxidasa ó peroxidasa) en un hidrogel redox formado por el entrecruzamiento de la enzima, polialilamina conteniendo un cornplejo de osmio (PAAOs) y polietilediglicidiléter (PEG) como entrecruzante, sobre electrodos de carbón vítreo y de oro. Se estudió el rango de linealidad y la reproducibilidad de estos electrodos al ser utilizados como detectores en un sistema FIA. Utilizando electrodos basados en glucosa oxidasa se estudió el efecto de distintas proporciones de entrecruzante (PEG); utilizando técnicas de voltametrías cíclicas se estudió el efecto del cambio de fuerza iónica en el medio. La leche afecta de manera irreversible a estos electrodos monoezimáticos. Se diseñaron distintos tipos de biosensores bienzimáticos bicapa, en los que peroxidasa entrecruzada con PAAOs se encuentra en la capa mas cercana al electrodo, y lactato oxidasa en la capa más externa. Se estudió el efecto de la leche sobre ambas capas enzimáticas, demostrandose que esta configuración es más apropiada para la determinación de la concentración de L-lactato en muestras Iácteas. Se ha descripto un método rápido para determinar la capacidad fermentativa de distintas especies de Lactobacillus. Este método permite cuantificar esta capacidad, proporcionando una información mas completa del metabolismo de los hidratos de carbono; posibilita el estudio de cepas mutantes suministrando inforrnación más completa acerca de las posibles modificaciones en el metabolismo de los fuentes de carbono utilizadas.

Abstract:
Enzymatic "wired" biosensors based in the immobilization of one oxidase (glucose oxidase, lactate oxidase or peroxidase) within an redox hydrogel formed by crosslinking of enzyme, polyallylamine containing an osmium complex (PMOS) and poly(ethy1ene glycol) (PEG), onto glassy carbon or gold electrodes were constructed. We study the reproducibility and lineal span of these electrodes when they were used as detectors in a FIA system. To complete their characterization we study the effect of different PMOS 1 PEG ratios in the construction of enzymatic biosensores, the effect of pH, temperature and ionic strength. The effect of milk samples and their response were analyzed, these complex analytical matrix affect these electrodes catalytic current. We designs bilayer bienzyme biosensors; in these system the peroxidase layer, over the electrode ("wired"), are separated from the outer membrane containing lactate oxidase (not "wired1'). We study the effect over both layer of milk samples; from these studies a bienzyme electrode configuration was found as the most appropriate array from the determination of L-lactate in milk samples. A microbial biosensor based on calcium alginate immobilized Lactobacillus cells coupled to a pH electrode was developed for quantitative determination of carbohydrate fermentation activity. The evolution of acid production in a continuous flow-stopped biorreactor was monitored for different sugar solution. The procedure can give quantitative results compared to other reported techniques for carbohydrate fermentation pattern from which only qualitative results are obtained.

López, Claudia S.. "Caracterización físico-química de la membrana de Bacillus subtilis frente al estrés osmótico : relevancia de los fosfolípidos aniónicos en la osmorrespuesta" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La respuesta de las bacterias al estrés osmótico es actualmente de gran interés debido a los aspectos importantes de su aplicación. La mayoría de los estudios realizados en procariotas se han focalizado sobre la regulación genética y sobre aspectos fisiológicos de la adaptación a la alta osmolaridad. El comportamiento de las envolturas no ha sido prácticamente estudiado, sin embargo, existen diversas evidencias que sugieren que la composición de las envolturas celulares posee un rol importante durante el mecanismo de osmosensado. El objetivo de este trabajo fire el de estudiar el efecto del estrés osmótico sobre la estructura y composición bioquímica y biofisica de las membranas de Bacillus subtilis YB886 utilizando diferentes enfoques como la bioquímica, espectroscopía de fluorescencia y biología molecular. En esta tesis demostramos que se producen importantes variaciones en la composición de lípidos polares y de ácidos grasos (AG) durante la adaptación de B. subtilis. Entre los principales fosfolípidos presentes en la membrana de esta especie, se observó que cuando la bacteria es crecida en medios hipersalinos se produce una disminución en el contenido de fosfatidilglicerol de 40 a 31% y un aumento en el de cardiolipina de 24 a 46%. Además de las variaciones observadas a nivel del grupo polar de los lípidos, se determinó un cambio significativo en la composición de AG entre las diferentes condiciones de cultivo. Las células crecidas en el medio hipersalino presentan una marcada disminución en el contenido de AG saturados ramificados y un aumento en el de los saturados lineales. Asimismo, se observó un aumento en el contenido de los AG monoinsaturados, los cuales representan un 6% bajo condiciones normales de crecimiento y alcanzan un 18% en estrés osmótico. Con el objetivo de caracterizar la estructura y dinámica de la membrana, se utilizaron diferentes técnicas espectroscópicas. Se determinó que en respuesta al estrés osmótico se produce un aumento en el empaquetamiento de los lípidos de las membranas, hecho que fue evidenciado por medio de las tres sondas fluorescentes utilizadas. No obstante, esta variación no se observó en los liposomas preparados con los lípidos extraídos a partir de las células, indicando que el aumento en el empaquetamiento de los lípidos depende de la presencia de las proteínas de membrana. En este trabajo también se determinó que en las membranas de B. subtilis otras propiedades fisicas de la membrana, como la hidratación de la interfaz, cambia en fimción de la osmolaridad del medio exterior. Además, se construyeron diversas cepas mutantes para la biosíntesis de fosfolípidos. Los resultados obtenidos demostraron la importancia de los lípidos aniónicos (cardiolipina y fosfatidilglicerol específicamente) en la adaptación al estrés osmótico en esta especie. Nuestros resultados indican que la interrupción del gen cls2 provoca una deficiencia total en la síntesis de cardiolipina, sugieriendo que el producto del gen cls2 es la principal cardiolipina síntasa en esta especie. En esta tesis se demostró por primera vez los cambios biofisícos y bioquímicos que se producen en la membrana de B. subtilis en respuesta al estrés osmótico. Estos cambios serian indispensables para contrarrestar el desbalance osmótico presente entre las células y el medio externo.

Abstract:
Bacterial response to osmotic stress is of current and increasing interest due to the important aspects of its applications. Most of the studies on prokaryotes have centered on genetic regulation and physiological aspects of their adaptation to high osmolarity. The behavior of the envelopes has been practically unexplored; nevertheless, several evidences suggest that the cell envelope composition plays an important role during the osmosensing mechanism. The aim of the present work was to study the effect of osmotic stress on the biochemical and biophysical parameters of structure and composition of the Bacillus subtilis YB886 membrane using different approaches such as biochemistry, fluorescence spectroscopy and molecular biology. In this thesis we demonstrated that there are important variations in membrane polar lipid composition and fatty acids (FA) during osmoadaptation in B. subtilis. Among the major phospholipids present in the B. subtilis membrane, a decrease in phosphatidylglycerol content from 40 to 31%, and an increase in cardiolipin content from 24 to 46% were observed when the bacteria were grown in hypsaline medium. In addition to the variations observed at the polar group level, the FA composition, in particular, showed a significant change between different growth conditions. Bacterial growth in hypertonic medium resulted in a remarkable decrease in the branched-chain saturated FA content, and an increase in straight-chain saturated FA. There was also a significant increase of unsaturated FA, which represented 6% in normal conditions and reached 18% during osmotic stress. In order to characterize membrane structure and dynamics, different spectroscopic techniques were used. Bacteria growth in hyperosmotic media evoked an increase in the lipid packing in isolated whole membranes, fact that was evidenced by the three fluorescent probes used. However, this effect was not observed in liposomes prepared with the extracted bacterial lipids indicating that it was strongly dependent on the presence of membrane proteins. In this work we also indicate that in B. subtilis membranes, other physical properties as interface hydration change as a function of the external medium osmolarity. In addition, several mutants for phospholipids biosynthesis were constructed. We demonstrated the importance of anionic lipids (cardiolipin and phosphatidylglyerol specifically) for the adaptation of this specie to osmotic stress. Our results indicated that the interruption in gene cls2 resulted in a complete deficiency in cardiolipin synthesis, suggesting that B. subtilis cls2 gene product to be the major cardiolipin synthase. In our knowledge this is the first report about the biophysical and biochemical adaptation of the B. subtilis membranes to osmotic stress. These changes would be indispensable to counteract the osmotic imbalance between the cells and the external medium.

Campos, Eleonora. "Obtención de mutantes de Brucella abortus genéticamente definidas: su caracteización molecular y evaluación de su uso como vacunas para la brucelosis bovina" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El desarrollo de las técnicas de ADN recombinante permitió la generación de vacunas racionalmente diseñadas. Teniendo esto en cuenta, el objetivo de este trabajo es la obtención de cepas de Brucella abortus genéticamente modificadas que puedan ser utilizadas como vacunas contra la brucelosis. La brucelosis es una zoonosis bacteriana causada por especies del género Brucella, un grupo homogéneo de patógenos intracelulares facultativos que tienen la habilidad de sobrevivir y multiplicarse en fagocitos profesionales y no profesionales. En bovinos, Brucella abortus produce una enfermedad crónica caracterizada por aborto, nacimiento de terneros enfermos y fertilidad reducida. La cepa vacunal para la brucelosis bovina en uso en la mayoría de los países es la cepa B. abortus Sl9, que confiere un 70 a 80% de protección contra el aborto pero genera dificultades en el serodiagnóstico y conserva considerable virulencia residual para el hombre. Con el fin de obtener cepas de B. abortus que sean compatibles con un ensayo diagnóstico diferencial y que tengan menor virulencia residual que Sl9, se construyó la cepa doble mutante B. abortus INTA] (II) por inactivación de los genes bp26 y bmp18. BP26 es una proteína periplásmica inmunodominante durante la infección con Brucella que no influye en la persistencia ni en la protección de la cepa en ratones BALB/c. BMP18 es una lipoproteína de membrana externa, también descripta como Ompl9, cuya anulación en Sl9 genera menor capacidad de replicar en el bazo de los ratones aunque con igual persistencia y capacidad protectiva. La cepa INTAl resultó más atenuada que S19, pero mantuvo su capacidad protectiva en el modelo ratón. Esta cepa mostró mayor sensibilidad a temperatura, a agentes hidrofóbicos y a moléculas policatiónicas que Sl9 y esta sensibilidad fue revertida por una copia funcional del gen bmp18. Para determinar la contribución de BMP18 a la virulencia de Brucella, se generó la cepa Ml8v por inactivación de bmpl8 en la cepa patógena B. abortus 2308. M18v no mostró diferencias significativas respecto de S2308 en su habilidad para sobrevivir y replicarse en macrófagos, pero fue más atenuada en ratones. Por lo tanto, la falta de expresión de BMP18 generaría desorganización de la membrana externa, haciendo a la bacteria más susceptible a mecanismos bactericidas del suero pero sin afectar significativamente su supervivencia intracelular. Para evitar el uso de genes que confieren resistencia a antibióticos en el desarrollo de cepas vacunales, se diseñó una estrategia para la generación de mutantes ísogénicas utilizando el gen sacB como marcador de contraselección. Con esta estrategia, se obtuvo la cepa B. abortus Mlluc por reemplazo de parte de la secuencia de bp26 por el gen luc en Sl9 y posteriormente la cepa doble mutante INTA2 (I2) por deleción del gen bmp18 en la cepa M1luc. Al evaluar las cepas Mlluc e I2 en bovinos, la protección obtenida contra el aborto después del desafio con una cepa patógena fue equivalente para Sl9 y Mlluc pero menor para I2. Estos resultados indican que la falta de BP26 no tiene efecto alguno sobre la capacidad de Sl9 de inducir una respuesta inmune protectiva tanto en el modelo ratón como en el hospedador natural. Sin embargo, la falta de expresión de BMP18 en Sl9 genera menor capacidad protectiva en bovinos. En las condiciones de desafio experimental de este ensayo, la respuesta humoral contra BP26 cuantificada por iELISA presentó gran heterogeneidad y bajos niveles de sensibilidad, para parámetros de especificidad óptima. La estrategia desarrollada para la obtención de mutantes ísogénicas en más de un gen sin marcadores de resistencia a antibióticos permitirá la posibilidad de generar cepas de Brucella con múltiples mutaciones definidas de manera de obtener cepas vacunales efectivas y seguras para animales y humanos que puedan ser utilizadas en el control de esta enfermedad.

Abstract:
Recombinant DNA technology has led to the development of rationally designed vaccines. In this context, the aim of this project was to develop genetically modified strains of Brucella abortus that could be used as vaccines against brucellosis. Brucellosis is a bacterial zoonosis caused by species from the genera Brucella, an homogenous group of intracellular facultative pathogens that have the ability to survive and replicate in professional and non-professional phagocytes. In bovines, Brucella abortus produces a chronic disease characterized by abortion, birth of sick calves and reduced fertility. The vaccine strain in use for bovine brucellosis in most countries is B. abortus Sl9. This strain confers 70 to 80% protection against abortion but generates difficulties in serodiagnosis and retains considerable residual virulence for human beings. The double mutant strain B. abortus INTA1 (II) was constructed by inactivation of bp26 and bmp18 genes, with the objective of obtaining strains of B. abortus that could have an associated differential diagnostic test and that are less virulent than Sl9. BP26 is a periplasmic protein that is inmunodominant during infection with Brucella. The lack of expression of this protein in Sl9 does not affect the strain persistence or protection capacity in the mouse model. BMP18 is an outer membrane lipoprotein, also reported as Ompl9. When its expression was abrogated in Sl9, the resulting mutant strain showed less replication in mice spleen, suggesting attenuation, although it maintained its protection capacity. B. abortus I1 resulted more attenuated than Sl9 and retained its protection capacity in the mouse model. This strain showed more sensitivity than Sl9 to temperature, hydrophobic agents and policationic molecules, and this phenotype was reverted by a functional copy of bmp18. In order to establish BMP18 contribution to Brucella virulence, bmp18 gene was mutated in pathogenic strain B. abortus 2308, generating strain Ml8v. This strain did not show any significant differences respect to S2308 in its ability to survive and replicate in murine macrophages, but was more attenuated in mice. Therefore, lack of expression of BMP18 would disrupt membrane integrity, probably leading to more susceptibility to sera bactericidal mechanisms but not affecting significantly intracellular survival. In order to avoid the use of antibiotic resistance markets in the construction of vaccine strains, a mutagenesis strategy for obtaining isogenic strains using sacB as counterselection marker was developed. With this strategy strains B. abortus Mlluc (Sl9 ∆bp26::luc) and INTA2 (I2) (Sl9 ∆bp26::luc Abmpl8) were obtained, replacing most of bp26 coding region for luc gene in M1luc and then deleting also most of bmp18 in the double mutant 12, without incorporating drug resistance markers. When strains M1luc and 12 were evaluated in bovines, protection against abortion was equal for Sl9 and M1luc but considerably reduced for I2. These results indicate that lack of BP26 has no effect in Sl9 protection capacity either in mice or the natural host. However, lack of BMP18 in Sl9 generates less protection capacity in bovines. In the conditions of experimental challenge of this assay, the humoral response against BP26 recombinant protein measured by iELISA after challenge presented high heterogeneity and poor sensitivity respect to LPS response, considering parameters of optimal specificity. The strategy for generation of mutant isogenic strains in more than one gene without the incorporation of antibiotic resistance markers opens the possibility of achieving strains with multiple defined mutations. This will most certainly lead to effective and safer vaccine strains against brucelosis.

Vadell, Eduardo Miguel. "Contribución a la sistemática y ecología de los dictiostélidos del Parque Nacional Iguazú, Misiones, Argentina" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La selva subtropical húmeda en el P.N. Cataratas del Iguazú, Pcia. de Misiones, Argentina, contiene en sus suelos y broza una comunidad de dictiostélidos y taxones afines de alta diversidad. Ésta riqueza es la consecuencia de un conjunto de factores ambientales y biológicos favorables, entre los que se cuentan la diversidad florística, los vectores de dispersión, la fertilidad del suelo y el régimen hídrico-térmico del clima. Se aislaron 32 taxones mediante una técnica de dilución a partir de muestras de la broza y suelo superficial de distintas zonas de muestreo, realizadas durante cuatro años. Algunas zonas con disturbios antrópícos considerables mostraron diferencias importantes en abundancia y riqueza específica, comparativamente con las zonas semi-prístinas. Las especies clasificadas, con excepción de tres, pertenecen a las familias Dictyosteliaceae y Acytosteliaceae dentro de la Subclase Dictyostelidae. Las caracteristicas morfológicas, de crecimiento y desarrollo de cada taxón fueron descriptas, registradas en dibujos, y microfotografiadas. Se anotaron las condiciones óptimas de cultivo en el laboratorio, flora del sitio de muestreo y otros parámetros climáticos y edáficos, registrándose las posibilidades de su conservación permanente por líofilizado, entre otras técnicas. Se valoraron críticamente los caracteres taxonómicos, así como los criterios de clasificación. Se realizó la observación y registro de las interacciones con algunos organismos de la selva. Los nuevos taxones descriptos e ilustrados son Dictyostelium nanopodium, D. schizocaule, D. caulicarpum, D. dichotomum, D.jesuiticum, D. microcaule, Polysphondylium ñandutensis, P. iguazuensis y las nuevas variedades D. quercibrachium var. misionense. P. asymetricum var. diversisporum y D. lavandulum var. apodum. La dominancia de D. macrocephalum, D. giganteum y del género Polysphondylium en la mayoria de las áreas, en términos de Valor de Importancia, y la subdominancia de D. monochasioides, D. polycephalum y D. purpureum, entre otras, muestran un sistema comparable a la de otros trópicos y subtrópicos del mundo, en que la diversidad de taxones es alta pero la densidad es baja. Las bajas densidades respecto a otros biomas comparables, y las variaciones de frecuencias sugieren que existen factores adversos, identificados para otros habitantes de la selva, de distinto origen, que pueden poner en riesgo la riqueza de estas comunidades microbianas.

Estrella, María Julia. "Metabolismos de alfa y beta-glucanos en bacterias que interaccionan con plantas" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las bacterias sintetizan y acumulan diferentes polisacáridos de tipo α y β, los cuales cumplen funciones relevantes en la adaptación a los distintos entornos ambientales y en la interacción de las mismas con otros organismos. Los estudios que realizamos se refirieron especificamente al metabolismo de los glucanos cíclicos y del glucógeno en bacterias del suelo que interaccionan con plantas. Una parte del trabajo estuvo orientada a conocer el tipo de glucano que producen los rizobios que establecen simbiosis con el género Lotus. En dichos estudios se estableció que los glucanos cíclicos producidos por la cepa B. loti NZP 2309 tienen el mismo tipo de unión y estructuras estrechamente relacionadas con los descritos previamente en B. japonicum USDA 110, aunque la estructura de la especie mayoritaria de cada cepa es diferente. La cepa B. loti NZP 2309 produce una mezcla de glucanos cíclicos con uniones β(1-3), β(1-6), que están formados por especies neutras, no sustituidas, con DP= 10, 11 y 12, y la especie cíclica mayoritaria esta ramificada, tiene un DP=11 y está formada por un anillo de 10 residuos de glucosa con un único residuo terminal que forma la rama. La proporción de enlaces glucosidicos que tiene este glucano cíclico es 3:7:1 para las uniones β(1-3), β(1-6)y β(1-3, 6) respectivamente. La comparación de los glucanos cíclicos producidos por las cepas de B. loti NZP 2309 y B. japonicum USDA 110, sugiere que dichas moléculas tienen propiedades hidrofóbicas diferenciales y distinta capacidad de unión con flavonoides de leguminosas. Por otra parte, se observó que ambas cepas de Bradyrhizobium sintetizan in vitro, glucanos cíclicos β(l-3), β(1-6) por mecanismos similares y que dichos glucanos están estructuralmente relacionados. En B. loti NZP 2309 se identificó una proteína de membrana interna de 85 kDa que podría estar involucrada en la sintesis de glucanos solubles β(1-3) y β(1-6); insolubles β(1-3) tipo laminarina, o en la sintesis de ambos compuestos. Las moléculas sintetizadas in vitro están formadas principalmente por enlaces β(1-3), mientras que las moléculas producidas in vivo tienen mayor proporción de enlaces β(1-6). Nuestros resultados sugieren que la síntesis de glucanos cíclicos β(1-3), β(1-6)en Bradyrhizobium sp podria involucrar la formación de un glucano cíclico con uniones β(1-3), al que posteriormente se introducen uniones β(1-6)por transglicosilación, a través de la proteína NdvC Además, determinamos y comparamos el tipo de glucano que sintetizan y acumulan dos cepas de colección de M. loti, y evaluamos si la estrucutra de los mismos está relacionada con la capacidad que tienen dichas cepas para nodular distintas espcecies de Lotus. Se determinó que las cepas M. loti NZP 2213 y NZP 2037 producen glucanos cíclicos neutros y sustituidos con residuos aniónicos y uniones β(1-2), los que son similares a los reportados en otros rizobios de crecimiento rápido. La sintesis de los glucanos de M. loti se realiza a través de una proteína intermediaria que tiene una masa molecular similar a la proteína de 319 kDa reportada en otros rizobios que sintetizan glucanos cíclicos β(1-2).Se estableció que el tipo de glucano producido por las cepas M. loti NZP 2213, NZP 2037 y B. loti NZP 2309 no está relacionado con el rango de hospedante, ya que se determinó que las dos especies de M. loti producen glucanos similares con el mismo tipo de unión y presentan distinto rango de nodulación. Además, se observó que dos cepas con distinto tipo de glucano forman nódulos efectivos en una misma especies de Lotus. Otra parte de la tesis se centró en el metabolismo del glucógeno en bacterias que interaccionan con plantas. Se clonó y caracterizó un fragmento de ADN genómico de B. loti que tiene homologia con el genes de la síntesis de glucógeno y que contiene gran parte del gen glgC y el gen glgA completo, que codifican para las enzimas ADPGlc PPasa y GS, respectivamente. El fragmento clonado es similar a una región presente en el genoma de B. japonicum, indicando que la organización de los genes estructurales del metabolismo del glucógeno en el género Bradyrhizobium está conservada y es diferente a la reportada en otras bacterias. Las secuencias aminoacidicas de la ADPGlc PPasa y GS de B. loti presentan un grado de homologia mayor con las enzimas de B. japonicum que con otras enzimas homólogas de rizobios. La ADPGlc PPasa de B. loti pertenece al grupo V de ADPGlc PPasas que están altamente reguladas ya que se activan por Fru 6P, Fru 1,6 bisP y piruvato. La actividad de esta enzima en nódulos reveló que la ADPGlc PPasa de bacteroides de B.japonicum aumenta con la maduración del nódulo, cuando los mismos todavía tienen actividad reductora de acetileno. Por otra parte, se realizaron experimentos de mutagénesis sitio-dirigida con la ADPGlc PPasa de A. tumefaciens, que se tomó como modelo experimental, para determinar el rol que tienen los residuos de arginina que están conservados y ubicados en la región N-terminal de las ADPGlc PPasas reguladas positivamente por Fru 6P y piruvato. Se determinó que una carga positiva en la posición 32 sería necesaria para mantener la afinidad aparente de las ADPGlc PPasas activadas por hexosas-fosfato y/o piruvato y cualquier modificación de arginina por otro aminoácido que altere el tamaño o la hidrofobicidad, reduce la afinidad aparente por Fru 6P. El comportamiento de las mutantes en la posición 33 respecto a los activadores fue diferente, afectándose de manera más drástica la activación por Fru 6P que la activación por piruvato. La presencia de arginina en la posición 33 es muy importante para la activación de la ADPGlc PPasa de A. tumefaciens y no podría ser reemplazada por otro aminoácido. La presencia de arginina en la posición 45 es importante para la activación de la enzima por Fru 6P pero es poco probable que desempeñe un rol directo en la unión de un efector particular, ya que está completamente conservada entre todas las ADPGlcPPasas bacterianas analizadas.

Raiger-Iustman, Laura J.. "Estudio de la fosforilación de péptidos asociados a membranas fotosintéticas en Rhodovulum sulfidophilum" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Durante más de 10 años, nuestro grupo ha estudiado la relación que existe entre la fosforilación de péptidos asociados a las membranas fotosintéticas de bacterias fototróficas pertenecientes a distintos géneros y la síntesis del aparato fotosíntético. Estudios similares han sido llevados a cabo por diferentes grupos de investigación tanto en organismos fotosintéticos como en cloroplastos de plantas superiores. En Rhodobacter capsulatus se demostró la existencia de péptidos del complejo antena, sobre todo de los péptidos α2 y β1 de, que sufrían una modificación postraduccional por fosforilación y que dicha modificación estaba regulada por las condiciones ambientales en que el cultivo bacteriano se desarrollaba. Esta modificación estaba también relacionada con la regulación genética de la síntesis de los componentes del aparato fotosíntético y el mecanismo de inserción del mismo en las membranas. En el transcurso de este trabajo de tesis se ha observado que en Rhodovulum sulfidophilum existe un péptido de un peso molecular aparente de 6 kDa, al que se lo denominó péptido P, que se fosforila in vivo exclusivamente en tirosina. A pesar de que este péptido resultó no corresponder a ninguna de las proteínas que unen bacterioclorofila descriptas hasta el momento, su fosforilación parece depender de condiciones que regulan, en genreal, la sintesis del aparato fotosíntético, o sea que responde a los cambios en las condiciones de crecimiento: luz-oscuridad, aerobiosis-anaerobiosis. Es probable que este péptido fosforilable esté relacionado con los sitios de iniciación del crecimiento de las membranas intracitoplasmáticas. Durante este trabajo de tesis se también se construyó y caracterizó una mutante LH1- , no polar, denominada rsLRI. Dicha mutante se obtuvo por deleción de los genes pufBA, que codifican para las apoproteínas LH1β y LHIα.

Abstract:
During the last ten years, our group has studied the relationship existing between phosphorylation of peptides of photosynthetic membranes in phototrophic bacteria belonging to different genera, and the synthesis of the photosynthetic apparatus. Similar studies have been performed in chloroplast of higher plants. In Rhodobacter capsulatus the LH2α and LH1β polypeptides were phosphorylated in vivo and the process was regulated by ambient growth conditions. This postranslational modification was related to the gene expression of the antenna polypeptides and their insertion in the membrane The present thesis work has revealed that in Rhodovulum sulfidophilum a small polypeptide of apparent MW of 6 kDa (P peptide) was phosphorylated exclusively in tyrosine This peptide could not be identified as a belonging to the photosynthetic apparatus although its phosphorylation depends on those conditions that regulates the synthesis of the photosynthetic apparatus. Thus it was govemed by changes in light-dark or aerobiosisanaerobiosis conditions. It is possible that peptide P was related with the initiation sites present in the intracitoplasmic membranes. In this work we have obtained and characterised a mutant resulting in a non-polar LH1- mutant was obtained by deleting pufBA genes codifying for LHl and βLH1α polypeptides

Ruiz, Jimena Alicia. "Rol de los polihidroxialcanoatos en la resuesta al estrés desarrollada por P. putida GPo1" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La supervivencia de los microorganismos en la naturaleza depende de su habilidad para adaptarse rápidamente a los cambios en las condiciones ambientales. Por este motivo, las bacterias han desarrollado estrategias de supervivencia, mecanismos de control activos que les permiten hacer frente a las condiciones adversas y que facilitan el reajuste de la célula a nuevas situaciones. Uno de estos mecanismos es la Respuesta general a estrés que se induce en bacterias Gram-negativas ante distintas condiciones de estrés ambiental, tales como escasez en nutrientes, estrés osmótico, estrés oxidativo y cambios bruscos de temperatura. Los genes involucrados en la resistencia al estrés se encuentran bajo el control de una subunidad sigma alternativa de la RNA polimerasa denominada σˢ, codificada por el gen rpoS. El nivel intracelular de σˢ se regula a nivel transcripcional, traduccional y de estabilidad de la proteína. Otra respuesta desencadenada ante condiciones de estrés es la Respuesta Estricta, que se caracteriza por un aumento en el nivel intracelular de la alarmona (p)ppGpp. Dicha molécula modula la expresión de varios genes, entre ellos el rpoS. Tanto en E. coli como en Pseudomonas se demostró que el ppGpp tiene un efecto positivo sobre la transcripción de rpoS. Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polímeros de reserva bacterianos cuya acumulación y degradación favorece la supervivencia de los microorganismos en el ambiente. Resultados obtenidos previamente en el laboratorio, demostraron que la degradación del PHA acumulado incrementaba la supervivencia y la resistencia al estrés de la bacteria Pseudomonas putida en microcosmos de agua de río. Teniendo en cuenta estos aspectos, el objetivo general de la presente tesis doctoral fue estudiar el papel de los polihidroxialcanoatos en los mecanismos de repuesta al estrés en P. putida. Para esto se utilizó una cepa salvaje y una cepa con una mutación en la enzima PhaZ, encargada de degradar PHA, y se analizó el contenido intracelular de ppGpp en condiciones de depolimerización de PHA, así como también la resistencia a estrés térmico y oxidativo, y el contenido intracelular de os durante ayuno en carbono. Los resultados obtenidos mostraron que existe un aumento transitorio en el nivel intracelular de ppGpp, aproximadamente 5 hs después del comienzo de la degradación de PHA. No se observó incremento en el contenido de ppGpp en la cepa mutante incapaz de degradar el polímero. La complementación de la mutación phaZ restauró el fenotipo salvaje. Asimismo, se observó que la capacidad de degradación de PHA incrementaba el nivel intracelular de σˢ y la resistencia a estrés térmico y oxidativo durante ayuno en carbono. La introducción del gen que codifica para la depolimerasa de PHA en la cepa mutante phaZ incrementó el contenido de RpoS y la tolerancia al estrés. Estos resultados sugieren que existe una relación entre la depolimerización de PHA y la Respuesta general a estrés controlada por RpoS, que tal vez se encuentre mediada por ppGpp.

Abstract:
Survival of microorganisms in nature depends on their ability to adapt to changes in environmental conditions. For this reason, bacteria have developed survival strategies, active control mechanisms that allow them to cope with adverse conditions and facilitate the cell readjustment to new situations. One of these mechanisms is the General stress response induced in Gram-negative bacteria in response to several environmental stresses, such as nutrient starvation, osmotic stress, oxidative stress and abrupt temperature changes. The genes involved in stress resistance are under the control of an alternative sigma subunit of the RNA polymerase, σˢ, encoded by the rpoS gene. The intracellular level of σˢ is regulated at several levels, including transcription, translation and protein stability. Another mechanism triggered by stress conditions is the Stringent response. This response is characterized by an increase in the intracellular level of the alarmone (p)ppGpp. This molecule modulates the expression of several genes, including rpoS. The involvement of ppGpp as a positive signal for rpoS expression has been reported in E. coli and Pseudomonas. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are bacteria] reserve polymers that enhance survival and competition abilities of microorganisms in the environment. Previous results of our laboratory, demonstrated that PHA degradation increased survival and stress resistance of Pseudomonas putida in river water microcosms. Considering all these aspects, the general purpose of this PhD. thesis was to study the role of PHAs in the stress response mechanisms in P. putida. For this purpose we used a P. putida wild type strain and a mutant in the PhaZ enzyme, which is involved in PHA degradation, to analyze the ppGpp intracellular levels in PHA depolymerization conditions; as well as the resistance to thermal and oxidative stress, and the intracellular σˢ content during carbon starvation. The results showed that PHA degradation is followed by an increase in ppGpp intracellular levels. This increase was not observed in the mutant strain unable to degrade the polymer. The complementation of the phaZ mutant restored the wild type phenotype. Moreover, it was observed that the capacity of PHA degradation increased the intracellular σˢ level and the resistance to heat shock and oxidative stress during carbon starvation. The introduction of the gene that codes for the PhaZ depolymerase in the mutant strain, increased RpoS content and tolerance to stress agents. These results suggest a relation between PHA depolymerization and the General stress response controlled by RpoS, that could be mediated by ppGpp.

Caimi, Karina Cynthia. "Genómica comparativa en micobacterias responsables de enfermedades zoonóticas pertenecientes al Complejo Mycobacterium tuberculosis" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El Complejo M tuberculosis (CMT) está formado por distintas especies de micobacterias entre las que se encuentra el agente causal de la tuberculosis en humanos, Mycobacterium tuberculosis y micobacterias responsables de enfermedades zoonóticas como M. bovis, M. microti y M. pinnipedii. La genómica comparativa en micobacterias brinda una vasta información acerca de la relación entre los genomas de distintas micobacterias pertenecientes al CMT. En la primera parte de este trabajo se estudió la Región de Repeticiones Directas (DR). Esta región está compuesta por repeticiones directas conservadas de 36pb separadas por secuencias no repetitivas llamadas espaciadores (sps). El polimorfismo observado en esta región entre aislamientos de micobacterias pertenecientes al CMT dio origen a la técnica de tipificación, ampliamente aplicada en tuberculosis denominada Spoligotyping. La secuenciación y comparación de la región DR entre distintos aislamientos argentinos de M. bovis permitió encontrar 5 espaciadores nuevos. Estos espaciadores conjuntamente con una colección de otros descriptos previamente, fueron incluidos en una nueva membrana de spoligotyping obteniéndose un total de 104 espaciadores. La utilización del spoligotyping de lO4-sps. permitió la diferenciación de aislamientos del CMT en 174 spoligotipos, mientras que el uso de la membrana tradicional tipificó estos mismos aislamientos en 160 spoligotipos distintos. Particularmente para M. bovis se obtuvo un incremento de 17 a 26 spoligotipos respectivamente. El análisis comparativo in silico en micobacterias no pertenecientes al CMT como M. smegmatis, M. avium, M. marinum y M. leprae, permitió establecer que los marcos de lectura abiertos (MLAs) flanqueantes a la Región DR de M. tuberculosis, se encuentran adyacentes entre sí en estas otras micobacterias. En cambio en el genoma de M. tuberculosis esta región comprende 24kb. que incluyen 23 MLAs así como la región DR ausentes en las mencionadas micobacterias. Este resultado fue corroborado in vitro mediante amplificación por PCR. Debido a la ausencia del locus DR descripto y los MLAs adyacentes, en M. avium y M. smegmatis y debido a que estas micobacterias fueron descriptas como más antiguas que M. tuberculosis, se postula que esta región podría haber sido adquirida por las especies del CMT o por un ancestro común a ellas a lo largo del proceso evolutivo. La segunda parte de este trabajo implicó el estudio de la variabilidad genética entre distintos aislamientos de M. bovis, M. microti y M. pinnipedii, estas últimas responsables de tuberculosis en ratones de campo denominados “vole” y en mamíferos marinos respectivamente, mediante comparación de genomas completos. Se encontró una nueva deleción en M. microti denominada MiD4. Esta región remueve 5 genes que codifican para antígenos de la familia ESAT-6 y PE-PPE. En M. pinnipedii se encontraron dos nuevas deleciones, PiD1 que removió dos genes, uno de los cuales codifica para una oxidoreductasa (Rv3530c) involucrada en el metabolismo celular. La segunda deleción PiD2, fue denominada como RD2seal debido a estar superpuesta con la región de 10.7kb, RD2, ausente en algunas M. bovis BCG. Esta región abarca los genes Rv1977 y Rv1978. Los experimentos de Southern blot mostraron que MiD4 está también ausente en M pinnipedii, en cambio PiDl es una deleción específica para M. pinnipedii. Por otra parte mediante la comparación del genoma de M. bovis con el genoma de M. tuberculosis in silico, se pudieron identificar nuevos marcadores capaces de diferenciar entre estas dos especies y respecto de otras especies del CMT. Uno de estos nuevos marcadores denominado rpfA presentó polimorfismos en los aislamientos de M. bovis estudiados, lo que podría ser usado en la tipificación y diferenciación.

Abstract:
The Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) is composed by different mycobacteria species, the agent of human tuberculosis and mycobacteria responsible of zoonotic disease as M. bovis, M. microti and M. pinnipedii are among them. Comparative genomics gives broad information about the relationship between the different micobacterial genomes of the MTC. In the first part of this work the Direct Repeat (DR) region was studied. The DR region is composed of multiple well-conserved 36-bp DRs interspersed with non-repetitive DNA spacer sequences (sps). The polymorphism in the DR region has led to the development of a methodology highly applied in tuberculosis research called Spoligotyping. Upon analysis of this region in argentine bovine isolates of M. bovis, five new spacers were detected. These spacers and a collection of others previously described were included in a new spoligotyping membrane reaching a total of 104 different spacers. The application of the lO4-sps spoligotyping allows the differentiation of isolates from the MTC in 174 spoligotypes while with the application of the traditional membrane 160 spoligotypes were obtained. The discriminatory power of M. bovis isolates was increased from l7 to 26 different patterns respectively. The comparative analysis in silico performed in mycobacteria not-belonging to the MTC as M. smegmatis, M. avium, M. marinum and M. leprae allow to establish that the open reading frames (ORFs) flanking the DR region of M. tuberculosis are adjacent in these mycobacteria. In M. tuberculosis genome, this fragment includes 24kb. with 23 ORFs absent from the referred mycobacteria. This observation was experimentally confirmed by PCR. As the DR locus and the ORFs around it, are absent in M. smegmatis and M. avium and, as it is possible that these species are older than M. tuberculosis, we postulated that the DR locus was acquired by the MTC species or by an ancestor bacterium during evolutionary process. In the second part of this work the genetic variability of different isolates of M. bovis, M. microti and M pinnipedii, these last species agents of tuberculosis in wild voles and marine mammals respectively, was studied by whole genome sequence analysis. A novel M. microti deletion was found here called MiD4. This region removes 5 genes that code for ESAT-6 family antigens and PE-PPE. Two new deletions were found in the M. pinnipedii isolates: PiD1, which removes two genes where one of them code for an oxidoreductase (Rv3530c) involved in cellular metabolism. A second deletion found in M. pinnipedii isolates, PiD2, has been recently defined as RD2 seal since it overlaps the 10,7 kb RD2 region. This region encompasses Rv1977 and Rv1978 genes. Southern blot experiments showed that MID4 was also deleted from M. pinnipedii, but PID1 is a deletion specific to M. pinnipedii. By the other hand the analysis in silico between the M. bovis and M. tuberculosis genomes, allow the identification of new markers. These markers were used to differentiate between both species and from another species. One of these new markers called rpfA, present polymorphism between M. bovis isolates. This polymorphism could be used in typification and differentiation.

Basile, Laura Ana. "Estructura y dinámica de comunidades bacterianas en sistemas de barros activados que degradan fenol" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La forma en la que las comunidades responden a las alteraciones suelen manifestarse a través de cambios en la composición o en la abundancia relativa de las especies. Frecuentemente estos cambios pueden ser atribuídos a caracteres funcionales o adaptativos. La búsqueda de modelos que expliquen los patrones de composición de especies y la coexistencia de especies similares dentro de comunidades ecológicas, pueden aportar datos sobre los mecanismos subyacentes que regulan la biodiversidad y su relación con el funcionamiento del ecosistema. En este trabajo se estudió la dinámica de las comunidades bacterianas, a nivel taxonómico y funcional, y el funcionamiento de sistemas de barros activados especializados en la degradación de fenol. Se evaluó en primer lugar la dinámica de las comunidades bacterianas en función del tiempo de aclimatación al fenol, operando bioreactores a escala de laboratorio bajo condiciones constantes a lo largo de 9 meses. En una segunda etapa se analizó el modo en que las comunidades bacterianas respondían a un aumento escalonado en la concentración de fenol. El funcionamiento de los reactores se analizó por mediciones de biomasa, niveles de turbidez y de fenol en el sobrenadante y velocidades de degradación de fenol. La estructura de la comunidad bacteriana se estudió por medio de geles de gradiente desnaturalizantes (DGGEs) del dominio variable V3 del ADN ribosomal 16S. La estructura a nivel funcional se determinó mediante la cuantificación por ensayos de PCR en tiempo real de las distintas variantes del gen de la subunidad mayor de la enzima fenol hidroxilasa multicomponente (LmPH), que cataliza la oxidación de fenol a catecol, paso limitante de la vía de degradación de fenol. Finalmente, buscando relacionar los patrones de abundancia de los grupos LmPH con sus propiedades cinéticas, se estudiaron representantes de los grupos LmPH obtenidos mediante técnicas de cultivo y aislamiento. Los resultados demuestran que la actividad de degradación de fenol en el sistema es debida a la acción combinada de un número de organismos funcionalmente redundantes. La comparación de los patrones de abundancia de las poblaciones que degradan fenol sugiere un grado de determinismo considerable, donde la abundancia relativa de cada especie parece determinada por la concentración de fenol en el alimento. Las características cinéticas de representantes de siete de los ocho genotipos LmPH, obtenidos utilizando un amplio rango de condiciones de cultivo, exhibieron un intervalo relativamente acotado de variabilidad fisiológica, indicando que la capacidad de una bacteria particular de volverse un miembro predominante de la comunidad bajo condiciones ambientales cambiantes no puede ser inferida únicamente de las propiedades de degradación de fenol.

Abstract:
Communities' responses to disturbance are commonly manifested as changes in species composition or relative species abundances. These changes are often attributed to functional or adaptive traits. The understanding of the patterns of species abundance, and the coexistence of similar species within ecological communities can provide important insights into the underlying mechanisms that regulate biodiversity and its relationship with ecosystem function. In this work we studied bacterial communities dynamics, using both taxonomic and functional approaches, and its relationship with the activity of phenol degrading acitvated sludge systems. Firstly, we evaluated bacterial communities dynamics as a function of phenol acclimation time, over 9 months of reactor operation under constant conditions. In a second stage, we analyzed the responses of bacterial communities to a step-increase in phenol concentration. Reactors performance was analyzed by biomass concentration, turbity and phenol concentration in supernants, and degradation rates. The structure of bacterial communities was studied using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of the variable domain V3 of PCR-amplified 16S ribosomal DNA. Functional structure was determined by real time quantitative PCR on different gene variants of the major subunit of the multicomponent phenol hydroxylase enzyme (LmPH), which catalyzes the oxidation of phenol to catechol, the rate limiting step in phenol biodegradation pathway. Finally, looking for a relationship between LmPH abundance patterns and kinetic properties, we studied representatives of LmPH groups, which were obtained through cultivation and isolation techniques. We concluded that phenol degradation activity in our systems depend on the combinated action of a number of functional redundant organisms. Comparison of the abundance patterns of phenol degrading populations suggests a considerable degree of determinism, where the relative abundance of each species seems to be determined by the concentration of phenol in the feed. The kinetics characteristics of representatives of seven from eight LmPH groups, obtained using a wide range of culture conditions, exhibited a rather narrow range of physiological variability, suggesting that the ability of a particular bacteria to became a predominant member of the community under changing ambiental conditions cannot be infered exclusively from the phenol-degrading properties.

Bonomi, Hernán Ruy. "Rol del metabolismo de flavinas en la virulencia de Brucella abortus" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Brucella spp. son las bacterias causantes de la brucelosis, la enfermedad zoonótica con más incidencia en el mundo. Brucella es un patógeno exitoso que probablemente infecta animales desde hace millones de años, y se encuentra extremadamente adaptado al estilo de vida intracelular. La virulencia de este patógeno reside en su capacidad de invadir al hospedador, resistir los mecanismos de defensa y, establecerse y replicar en el inhóspito nicho replicativo. El nicho replicativo se caracteriza por ser escaso en nutrientes, tener baja tensión de O2 y someter a Brucella al daño oxidativo. A pesar de que Brucella no posee factores de virulencia “clásicos” posee una batería de mecanismos fisiológicos y adaptaciones metabólicas que en definitiva son los que le permiten sortear las defensas de los hospedadores y adaptarse a la vida intracelular. En este trabajo de tesis, se ha caracterizado y estudiado una parte de la fisiología básica de Brucella, como lo es el metabolismo de las flavinas. Se ha hecho foco en los genes rib, en particular en ribH2 que codifica una enzima lumazina sintasa (LS) que cataliza el penúltimo paso la ruta biosintética de la riboflavina. Se describió la regulación de la expresión de ribH2 por el elemento regulatorio riboswitch FMN, y se identificaron posibles proteínas que interactúan con RibH2 en Brucella. También, se estableció una relación directa entre virulencia y el metabolismo de flavinas en Brucella, resaltando la importancia de RibH2 para la supervivencia, tráfico y persistencia de las bacterias durante la infección en los modelos in vitro e in vivo. El rol de las flavinas en la simbiosis de Rhizobium leguminosarum con plantas, también fue estudiado. Los resultados muestran que el papel que juegan las proteínas RibH2 en el establecimiento bacteriano con el hospedador eucariota no está restricto sólo a Brucella, sino que parece ser compartido por otros Rhizobiales. Los hallazgos de este trabajo de tesis pueden dar lugar a nuevos estudios que lleven al desarrollo de vacunas y drogas contra la brucelosis y mejoras en las cepas bacterianas de inoculantes para uso agronómico.

Abstract:
Brucella spp. are the bacteria responsible for brucellosis, the most widespread zoonotic disease in the world. Brucella is a successful pathogen that has been infecting animals probably for millions of years and it is extremely adapted to the intracellular lifestyle. Its virulence lays in its ability to invade the host, resist defense mechanisms, establish and replicate in the inhospitable replicative niche. The replicative niche exhibits limited nutrients availability, low O2 tension and exposes Brucella to oxidative damage. In spite of the fact that Brucella does not possess “classic” virulence factors, it displays a variety of physiological mechanisms and metabolic adaptations that let these bacteria cope with the host’s defenses and adapt to live inside the cell. During this Thesis, part of the basic physiology of Brucella, the flavin metabolism, has been studied and characterized. The focus was laid on the rib genes, in particular on ribH2 which codes for a lumazine synthase (LS), the enzyme that catalyses the penultimate step in the riboflavin biosynthetic pathway. The regulation of the ribH2 gene expression by the FMN riboswitch was described, and some proteins that may interact with RibH2 were identified in Brucella. The direct relation between flavin metabolism and virulence was also established, highlighting the importance of RibH2 for survival, trafficking and persistence during infection in both in vitro and in vivo models. The role of flavins in the Rhizobium leguminosarum-plant symbiosis was also addressed. The results show that the part that RibH2 plays in the bacterial establishment in the eukaryotic host is not restricted only to Brucella, but it is shared with other Rhizobiales. The findings of this PhD Thesis, can lead to deeper and more specific studies culminating in the development of vaccines and drugs against brucellosis as well as improvements in the bacterial inoculants of agronomic use.

Sarnacki, Sebastián Hernán. "Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente.

Abstract:
DNA adenine methyltransferase (Dam) enzyme is a global regulator of bacterial gene expression. In previous studies, Salmonella Typhimurium dam mutants have been proposed as excellent vaccines strains because of their characteristic of attenuation and protective capabilities. By extension, dam gene mutation has been proposed as a method for attenuating a variety of bacterial species. Given our interest in the study and prevention of infections with Salmonella Enteritidis, a serotype that most commonly causes enterocolitis in humans, we generate S. Enteritidis dam mutants by transposition and site-directed mutagenesis by replacement. Interestingly, studies in Balb/c mice showed that the S. Enteritidis dam mutants, are only moderate in their attenuation. Thirty percent (30%) of animals inoculated by the intragastric route with the mutant died within 3 weeks. Moreover, the protection of immunized animals challenge with the virulent strain of Salmonella Enteritidis # 5694, did not reach acceptable levels. Given the critical role that macrophages play in innate immunity against Salmonella, we analyzed the interaction between SEΔdam mutant and macrophage cell line RAW 264.7. By Western blot, we found that the expression of inflammatory molecules in macrophages infected with SEΔdam is attenuated. As activation of the inflammatory response of macrophages is generated in part by bacterial antigens, we wondered whether the lack of Dam might be affecting the structure or function of certain effector proteins or lipopolysaccharide (LPS) of Salmonella Enteritidis. Therefore, we studied the involvement of Dam on protein synthesis and secretion of two effector proteins both dependent on type 3 secretion systems. To this purpose, we constructed and characterized Salmonella dam mutants carrying sopA and sopB genes tagged with the FLAG epitope. The results showed that the dam mutant has a reduced expression and secretion of SopA and SopB invasion proteins, which are Salmonella pathogenicity island (SPI-1)-dependent. This finding indicates that Dam methylation is involved in the regulation of the synthesis and secretion of SopA and SopB proteins in Salmonella as an upregulator of these genes. We also investigated the involvement of the Dam enzyme in S. Enteritidis LPS synthesis. We found that compared to the parental strain, a SEΔdam mutant synthesized LPS with shorter O-antigen polysaccharide chain lengths. Since Wzz is responsible for the chain length distribution of O-antigen, we investigated whether Dam methylation is involved in regulating wzz gene expression. Densitometric analysis of Western blot with samples of protein extracts showed that the relative amount of Wzz protein produced by SEΔdam is three-fold lower than that of the parental strain. Concomitantly, wzz gene promoter activity in SEΔdam was reduced, as measured by chromosomal transcriptional fusion with a reporter gene, and this result was further confirmed by the amount of mRNA as measured by RT-PCR quantitative real-time analysis. Also, the expression of pmrA and rcsB genes (two wzz gene regulators) in the dam mutant was reduced. However, the defect in the chain length distribution of O-antigen of the SEΔdam, was associated only with RcsB. Our results show that Dam methylation regulates the LPS synthesis of Salmonella. Overall, these results indicate that Dam methylation in Salmonella regulates functions related intimately to the host-bacteria interaction. Therefore, the dam gene deletion as a method of attenuation of vaccine strains must be analyzed critically.

Fuxman Bass, Juan Ignacio. "Reconocimiento del ADN bacteriano extracelular por neutrófilos humanos: su impacto en la respuesta a biofilms" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Previamente demostramos que el ADN bacteriano extracelular activa a los neutrófilos a través de un mecanismo diferente al canónico CpG-dependiente. El ADN extracelular es un componente central en la formación y estructura de los biofilms bacterianos, comunidades responsables de más del 60% de las infecciones ocasionadas por estos microorganismos. La presente tesis tuvo como objetivos centrales determinar el impacto del ADN de la matriz de los biofilms en la activación de los neutrófilos humanos y la identificaron del receptor involucrado en el reconocimiento de ADN. Los estudios realizados indicaron que la degradación con DNAsa I del ADN de la matriz extracelular de los biofilms de P. aeruginosa redujo marcadamente su capacidad de inducir la activación de los neutrófilos, determinada en función de su habilidad para producir citoquinas proinflamatorias, incrementar marcadores de activación fisiológicamente relevantes, de mediar la fagocitosis y de liberar trampas extracelulares de los neutrófilos (NET). La aplicación de técnicas de MALDI-TOF nos permitió identificar, en el neutrófilo, 16 proteínas con capacidad de unir ADN bacteriano. A pesar de que ninguna de ellas resultó ser el receptor de la superficie celular para ADN, es posible que dos de las proteínas encontradas constituyan sensores intracelulares de ADN, cuya relevancia queda por ser explorada. Los hallazgos realizados en la presente Tesis confirman la existencia de una proteína de la superficie del neutrófilo capaz de mediar el reconocimiento de ADN y la activación celular por esta molécula. Además, indican que el ADN de la matriz extracelular representa un componente proinflamatorio relevante de los biofilms de P. aeruginosa. Los mismos permiten especular que el reconocimiento del ADN de la matriz de biofilms podría representar un mecanismo seleccionado evolutivamente para permitir al huésped incrementar su capacidad de responder a este tipo de infecciones bacterianas persistentes

Abstract:
We have previously demonstrated that extracellular bacterial DNA activates neutrophils through a non-canonical mechanism. Extracelular DNA is a key component in the formation and composition of bacterial biofilms, that are communities responsible for more than 60% of the infections caused by these microorganisms. The aims of this Thesis were to determine the impact of DNA present in the biofilm matrix in triggering human neutrophil activation and to identify the receptor involved in DNA recognition. We found that extracelluar DNA degradation of P. aeruginosa biofilm matrix with DNase I markedly reduced its ability to induce neutrophil activation, determined by evaluating proinflammatoy cytokines production, the increase of physiologically relevant activation markers, phagocytosis and neutrophil extracelullar traps (NET) release. By application of MALDI-TOF techniques we identified 16 neutrophil proteins that bind bacterial DNA. Although none of them proved to be the DNA surface receptor, it is possible that two of these proteins correspond to intracellular DNA sensors whose relevance remains to be explored. The findings presented in this Thesis confirm the existence of a neutrophil surface protein capable of mediating DNA recognition and cell activation. Additionaly, they indicate that extracellular matrix DNA represents a relevant proinflammatory component of P. aeruginosa biofilms. Thus, it is possible to speculate that recognition of extracellular DNA of the biofilm matrix represents an evolutionary selected mechanism that increases the ability of the host to respond to these types of persistent bacterial infections.

Ainciart, Natalia. "Estudio de Lumazina Sintasa de Brucella como proteína transportadora de antígenos: relación entre estructura, estabilidad e inmunogenicidad" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La proteína lumazina sintasa de Brucella abortus (BLS) tiene características estructurales, de estabilidad y de inmunogenicidad que la convierten en un candidato interesante para su utilización como carrier o proteína transportadora de distinto tipo de moléculas (péptidos, dominios proteicos, azúcares, etc) BLS tiene una estructura de dímero de pentámero en solución y los estudios realizados en el laboratorio establecieron que tiene una temperatura de melting aparente de 89 °C y un ΔG de desnaturalización de 320 ± 22 kJ/mol. Además, genera una alta respuesta tanto celular como humoral cuando la proteína recombinante es administrada en ratones o conejos (inclusive sin adyuvante) o como vacuna a DNA en un vector de expresión eucariota. La fusión de distintos péptidos y dominios proteicos en su extremo amino terminal da lugar a quimeras de BLS y permite utilizarla como proteína transportadora y aumentar la inmunogenicidad contra las moléculas transportadas en distintos modelos animales. BLS se disocia en dos pentámeros plegados cuando es incubada con cloruro de guanidinio 2M o en buffer fosfato a pH 5. Si la concentración de desnaturalizante aumenta por encima de 2,3 M, se produce una disociación y desnaturalización concertadas que dan lugar a monómeros desplegados. Conocer en detalle estos equilibrios nos permitió diseñar dos estrategias para obtener proteínas mixtas de BLS que contuvieran una mezcla de péptidos provenientes de dos quimeras diferentes. Obtuvimos proteínas mixtas con diferente cantidad de péptido OMP31 y pudimos establecer una relación lineal entre la inmunogenicidad y la densidad de epitopes en la presentación antigénica. Al mismo tiempo, obtuvimos mutantes de estabilidad de BLS y estudiamos el efecto que tiene la estabilidad de la proteína transportadora en la inmunogenicidad contra el péptido transportado. Mediante el estudio de este modelo pudimos establecer que la densidad local de epitopes que se consigue con las quimeras de BLS y las elevadas estabilidad e inmunogenicidad intrínseca de BLS son las principales características que hacen que esta proteína funcione tan eficientemente como carrier de moléculas.

Abstract:
The enzyme lumazine synthase from Brucella spp. is highly immunogenic. This decameric protein is remarkably stable to thermal or chemical denaturation, suggesting a correlation between thermodynamic stability, polymeric arrangement and immunogenicity. The three-dimensional structure of this protein shows that is possible to insert foreign peptides or full-length proteins at the amino terminus without disrupting its general folding. These peptides are presented to the immune system in a polymeric way and in the context of a high specific immune response. BLS is a dimer of pentamers in solution, has a melting temperature of 89 °C and a ΔG of denaturation of 320 ± 22 kJ/mol. BLS induces a high humoral and cellular response when the recombinant protein is inoculated in mice and rabbits (even in the absence of adjuvants) or when is used as a DNA vaccine in an eukaryotic expression vectors. The decoration with peptides or protein domains (chimeras) show that of BLS acts as an efficient carrier and enhances the immunogenicity against the transported molecules. BLS dissociates into two folded pentamers when is incubated in 2 M guanidinium chloride in phosphate buffer at pH 5. Guanidinium chloride concentrations above 2.3 M produce a concerted dissociation and denaturation process resulting in unfolded monomers. The knowledge of these equilibria allowed us to design two different strategies to obtain mixed proteins of BLS with peptides from different chimeras. We obtained mixed chimeras decorated with different number of OMP31 peptides and established a linear relationship between the immunogenicity against the peptide and the epitope density. At the same time, we obtained mutants of BLS with decreased stability and studied the effect of the stability of the carrier protein in the immunogenicity of the peptide. This experimental model allowed us to demonstrate that the local density of epitopes and the high stability and intrinsic immunogenicity of BLS are the main features that make BLS an efficient carrier for vaccine design.

Malamud, Florencia. "Bases moleculares del desarrollo de biofilms en Xanthomonas axonopodis pv citri y su rol en el proceso infectivo" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis de los cítricos, una enfermedad endémica en nuestro país. Xac es capaz de desarrollar biofilms in vitro y sobre hojas, propiedad importante para el desarrollo de esta enfermedad. En esta tesis se buscaron nuevos genes involucrados tanto en la adhesión como en el desarrollo del biofilm. Para esto, se realizaron mutantes en genes candidatos y se utilizó una biblioteca de mutantes generadas al azar. Mediante mutagénesis dirigida se estudiaron los roles del flagelo, de la adhesina FhaB y de los dos sistemas de secreción de tipo II presentes en la bacteria. Todas las mutantes deficientes en estos sistemas tuvieron problemas en la adhesión in vitro. Se observó que las bacterias mutantes en el gen que codifica para las proteínas que conforman el gancho flagelar además presentaron dificultades en el desarrollo del biofilm in vivo y deficiencias en la patogenicidad. A través de la realización de un screening donde se utilizó una colección de mutantes generadas al azar, mediante la inserción del transposón Tn5, se encontraron genes cuya participación en el desarrollo del biofilm de Xac ya se conocía: gumB (codifica para una proteína involucrada en la exportación del xantano), xcsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xcs), xpsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xps). También se encontraron nuevos genes implicados en la adhesión de esta bacteria, algunas de estas mutantes presentaron además una importante disminución en su patogenicidad. Se siguió caracterizando en mayor profundidad a una de ellas. La mutante posee una inserción en el gen hrpM, que codifica una glucosiltransferasa implicada en la síntesis de glucanos lineales, de acuerdo a lo que se conoce en otras bacterias. Se observó que esta mutante tiene disminuida su patogenicidad y además es incapaz de sintetizar glucanos cíclicos.

Abstract:
Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) is the causative agent of citrus canker. This disease is endemic in our country and it attacks different types of cultivars. Xac is able to develop biofilms in vitro and on leaves, a very important property for the development of the disease. In this thesis we look for new genes that were involved in adhesion and biofilm formation. For this, both a generation of mutants in candidate genes and and a library of of randomly generated mutants were used. By directed mutagenesis of candidate genes the roles of flagellar proteins, FhaB adhesin, and two proteins of the two type II secretion systems present in Xac were studied. All these defective mutants had problems with adhesion in vitro. Bacteria lacking the gene coding for the flagellar hook also had problems in the development of biofilm in vivo and was also deficient in pathogenicity. With the aim of finding new genes implicated in the biofilm formation a library of mutants was generated using a Tn5 transposon and tested. Some of the mutants found here were previously known as deficient in adhesion: gumB (polysaccharide export outer membrane protein), xcsD (type II secretion system protein D), xpsD (general secretion pathway protein D). New genes implicated in adhesion were also found, some of these mutants were also severely impaired in the development of canker disease. We continue with the characterization of one mutants. The mutant has an insertion in the hrpM gene, implicated in the elaboration of lineal glucans. We observe that this mutant was impaired in canker development. The synthesis of cyclic glucan was also affected.

Tribelli, Paula María. "Influencia del regulador global Anr en la fisiología de Pseudomonas extremaustralis, una bacteria productora de polihidroxibutirato" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Pseudomonas extremaustralis es un organismo Antártico, que presenta alta resistencia al estrés y produce polihidroxibutirato (PHB). En este trabajo, se estudió su metabolismo microaeróbico, que está regulado en Pseudomonas por Anr. Se observó que es capaz de utilizar nitrato, reduciéndolo solo a nitrito. El genoma posee todos los genes involucrados en la desnitrificación, con excepción de los genes nir. Los genes de la fermentación de L-arginina son funcionales en esta especie. Anr afectó positivamente la síntesis de PHB. Asimismo, influenció el estado redox celular, el consumo de oxígeno, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la producción de exopolisacáridos (EPS) y proteínas extracelulares, la biosíntesis de aminoácidos y la utilización de distintas fuentes de carbono. Los biofilms presentan gradientes de O2. El PHB contribuyó a la supervivencia en forma planctónica en biofilms en frío y su ausencia resultó en una mayor formación de biofilms y EPS y menor movilidad. Anr también afectó el desarrollo de biofilms, dado que mutantes anr mostraron defectos en su formación, así como menor adhesión, agregación y mayor movilidad. En el genoma de esta especie se detectaron 167 probables blancos de regulación (Regulon Anr). Los resultados en conjunto muestran la importancia de Anr sobre la fisiología de P.extremaustralis.

Abstract:
Pseudomonas extremaustralis is an Antarctic organism that shows high stress resistance and polyhydroxybutyrate (PHB) production. We studied the microaerobic metabolism, which is controlled by Anr in Pseudomonas species. This strain was capable to reduce nitrate, used as an electron acceptor, to nitrite. P.extremaustralis genome presented the genes involved in denitrification, excepting the nir genes. The genes involved in L-arginine fermentation were also functional in this species. Anr positively affected PHB synthesis. In addition, this regulator influenced the cellular redox state, oxygen consumption, the presence of oxygen reactive species, the exopolysaccharides (EPS) and extracellular proteins production, the aminoacid biosynthesis and carbon source utilization. Biofilms show oxygen gradients. PHB contributed to the survival of planktonic cells in the biofilm at cold conditions and its absence resulted in higher biofilm formation and EPS production and also lower motility. Additionally, Anr affected biofilm development; since an anr mutant strain showed defects in biofilm formation and cellular adhesion and aggregation and motility alterations. We detected 167 putative regulated target genes at the P.extremaustralis genome. These results show the important role of Anr in the P.extremaustralis physiology.

Palomino, María Mercedes. "Modificaciones en la envoltura de Lactobacillus casei durante el crecimiento bajo estrés osmótico" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Este trabajo de Tesis se estructura en seis capítulos que tienen como objetivos estudiar los cambios a nivel de envoltura de Lactobacillus casei BL23, una bacteria Gram positiva, a través del análisis bioquímico y genético, cuando las células son sometidas a estrés osmótico empleando alta concentración de NaCl. Se verificó una diferencia en la sensibilidad a la lisis enzimática en la condición de crecimiento en alta sal (N), y se muestra que dos factores contribuyen a este efecto dado por una mayor permeabilidad de la enzima facilitando su acceso a su sustrato, asociado con un menor nivel de polímeros aniónicos (WTA y LTA) y una diferencia en los niveles de D- alanilación de estos y una disminución en el grado de entrecruzamiento del PG en las paredes de las células asociado a una actividad diferencial de HMW y LMW PBP. El estudio genético avala los resultados bioquímicos que demostraron una disminución tanto en el contenido de polímeros aniónicos como en el grado de D-alanilación de los mismos. La expresión génica de los genes responsables de la D-alanilación de los ácidos teicoicos (dltA y dltC) demostró una disminución de la actividad transcripcional durante el crecimiento en alta sal. La expresión del gen de síntesis de LTA (yfnI) también marcó una disminución durante el crecimiento en esta condición. Los cambios en el contenido como así también en el nivel de sustitución por ésteres de D- Alanina de ácidos teicoicos durante el crecimiento en estrés osmótico conducen a efectos pleiotrópicos que incluyen: 1) Mayor sensibilidad frente a antimicrobianos de naturaleza catiónica (Nisina) y glicopéptidos con blanco de acción la pared celular (Vancomicina) 2) Mayor capacidad de formación de Biofilm sobre superficies artificiales 3) Aumento en el pegado o “ binding” de cationes bivalentes La construcción y análisis de una mutante dltA que muestra una disminuida capacidad de crecimiento en alta sal, confirma la sospecha del rol de la D-alanilación en la capacidad de respuesta frente al estrés omótico. De los resultados obtenidos se desprende una aplicación, un nuevo método para la electroporación de las especies de Lactobacillus que consiste esencialmente en el debilitamiento de la pared celular a partir del crecimiento en condiciones de alta sal. 5 Con este nuevo método se obtienen mayores eficiencias comparadas con los métodos convencionales de electroporación y puede ser extensivo a otras especies del género Lactobacillus que muestren una fragilización de la pared como consecuencia del estrés osmótico.

Abstract:
The aim of this thesis was to study the changes of envelope of Lactobacillus casei BL23, a Gram positive bacteria, through biochemical and genetic analysis, when cells are subjected to osmotic stress using high concentration of NaCl. It shows difference in susceptibility to enzymatic lysis when growth was carried in high salt condition (N). Two factors contribute to this effect, first an increased permeability of the enzyme by facilitating access to its substrate. It is associated with a lower level of anionic polymers (WTA and LTA) and a difference in the level of D-alanilation of these ones and secondly a decrease in the degree of PG cross-linking in cell walls associated with differential activity of HMW and LMW PBP. The genetic study supports biochemical results that showed a decrease in the content of LTA and the level of D-alanilation. Gene expression studies of genes for D-Alanilation of teichoic acids (dltA and dltC) showed a decrease in the transcriptional activity during growth in high salt. yfnI (LTA synthesis) showed a decreased as well in this condition. The changes in content as well as the level of D-Alanine substitution in teichoic acid during growth in high salt condition leads to pleiotropic effects including: 1) Increased sensitivity to cationic antimicrobials (nisin) and glycopeptides with target action the cell wall (vancomycin) 2) Increased capacity of biofilm formation on artificial surfaces 3) Increased binding of divalent cations The construction and analysis of a dltA mutant showing a decreased ability to grow in high salt, confirmed the important role of the D-alanilation in the stress osmotic response. An application was suggested from the results. A new method for electroporation of Lactobacillus species based on the cell wall weakening resulting from growth in high salt media. The new method showed higher efficiencies compared with conventional methods of electroporation and could be extended to other species of Lactobacillus with a cell wall weakening as a result of osmotic stress.

Guerrero, Leandro Demián. "Comunidades bacterianas en suelos bajo siembra directa en la región agropecuaria pampeana. Influencia del manejo y propuesta de nuevos indicadores biológicos" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Los suelos son considerados uno de los ambientes más diversos y heterogéneos que se conocen. En ellos se producen innumerables procesos que permiten el reciclado y transformación de sustancias esenciales para la vida de plantas y animales. La mayoría de estos procesos son realizados por bacterias, y se ven afectados por distintos factores en el ambiente. Una de las principales causas que modifican estos ecosistemas es la producción agrícola. En los últimos tiempos el desarrollo de nuevas tecnologías, como la siembra directa podrían atenuar parcialmente el impacto de esta explotación. Sin embargo, el uso sustentable implica también la aplicación de prácticas de manejo, que incluyen rotaciones de cultivos, reposición de nutrientes y manejo integral de plagas. En este trabajo estudiamos la composición y dinámica de las comunidades de bacterias bajo prácticas contrastantes en siembra directa, con los objetivos de determinar de qué manera las prácticas agrícolas impactan sobre el suelo, y encontrar variaciones en las comunidades que puedan servir como indicadores de biológicos de calidad del suelo. Para el estudio se analizaron ambientes naturales y dos tratamientos de siembra directa que difieren principalmente en el régimen de rotación de cultivos, y otras características que los separan en Buenas y Malas prácticas agrícolas. Se tomaron datos de cuatro localidades diferentes de la región que abarca desde la provincia de Córdoba hasta Entre Ríos durante un periodo de dos años. Mediante la utilización de herramientas moleculares encontramos que las diferencias entre los distintos ambientes a nivel de las comunidades de bacterias y los taxones mayoritarios se ven influenciadas en primer lugar por las diferencias geográficas y en menor medida por los efectos del uso del suelo. A medida que aumentamos el nivel de resolución taxonómica encontramos que existen diferencias para determinados grupos que pueden separar las Buenas de las Malas prácticas. El número de bacterias pertenecientes al grupo de Acidobacteria Gp1 y al género Rubellimicrobium varían de forma dependiente de los tratamientos, por lo cual son potenciales candidatos como indicadores de calidad de suelos. Para esto proponemos la confección de un índice calculado como el cociente entre la proporción de bacterias de cada grupo encontradas en la muestra (Acidobacteria Gp1/Rubellimicrobium), respecto del número encontrado en un ambiente natural próximo.

Abstract:
The soil is considered one of the most diverse and heterogeneous environments. They produce many processes that enable the recycling and transformation of substances essential for plant life and animals. Most of these processes are performed by bacteria, and are affected by different factors in the environment. One of the main causes that modify these ecosystems is agricultural production. The recent development of new technologies, such as no-till crop could reduce the impact of this exploitation. However, the sustainable use also involves the implementation of management practices, including crop rotations, nutrient replenishment and integrated pest management. In this work we have studied the composition and dynamics of bacterial communities under contrasting no-till crop systems in order to determine how impacts on soil, and to find variations in the communities that can serve as biological indicators of soil quality. For the study, two tillage treatments that differ mainly in the rotation regime and other features that separate into good and poor agricultural practices were analyzed. Data were collected from four different locations in the region from the province of Cordoba to Entre Rios for a period of two years. Using molecular tools we found that the differences between the different environments at the level of bacterial communities and major taxa, are influenced primarily by geographic differences and in lesser extent by the effects of land use. As we increased the level of taxonomic resolution, we found that there were differences for certain groups that can separate good from poor practices. The number of bacteria belonging to the Acidobacteria Gp1 group and the genus Rubellimicrobium varied depending on the treatments, suggesting that they could be potential candidates indicators of soil quality. To this end we propose the confection of an index calculated as the ratio (Acidobacteria Gp1/Rubellimicrobium) between the proportion of each group of bacteria found in the sample and the number found in a nearby grassland soil.

Hovsepian, Eugenia. "Estudio de los efectos antiinflamatorios de 15-deoxi-delta 12,14-prostaglandina J2 e IL-10 en miocardiocitos infectados con Trypanosoma cruzi. Mecanismos moleculares involucrados" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En la fase aguda de la enfermedad de Chagas, la infección por T. cruzi produce una intensa respuesta inflamatoria en diversos tejidos del organismo incluso en el corazón, donde los miocardiocitos constituyen un importante blanco. Si bien la reacción inflamatoria es importante para el control inicial de la infección, un desequilibrio o una mala resolución de la misma puede generar daños y alteraciones en la funcionalidad cardíaca. Las células cardíacas responden a la infección mediante la expresión de enzimas inflamatorias como óxido nítrico sintasa 2 (NOS2) y metaloproteasas (MMPs) y citoquinas como TNF-α e IL-6. Esta respuesta está mediada por la activación de vías de señalización que incluyen al factor de transcripción nuclear-ĸB (NF-ĸB) y a las quinasas reguladas por señales extracelulares-proteínas quinasas activadas por mitógenos (ERK1/2-MAPK), cuya participación es fundamental en procesos inflamatorios. Los receptores activados por factores de proliferación peroxisomal γ (PPARγ) son factores de transcripción dependientes de ligando que han sido implicados en la regulación del metabolismo lipídico y de procesos inflamatorios. En este trabajo evaluamos el aporte de 15-deoxi-Δ12,14-prostaglandina J2 (15dPGJ2), ligando natural de PPARγ y de la citoquina antiinflamatoria IL-10 en la resolución de la respuesta inflamatoria en cultivos primarios de miocardiocitos neonatales de ratón infectados con la cepa letal pantrópica/reticulotrópica (RA) de T. cruzi. Los resultados de esta evaluación evidencian que 15dPGJ2 es capaz de inhibir la expresión y actividad de diferentes enzimas inflamatorias como NOS2, MMP-9 y MMP-2, así como la expresión de las citoquinas proinflamatorias TNF-α e IL-6 inducidas por la infección. Los efectos inhibitorios ejercidos por 15dPGJ2 involucran participación de mecanismos dependientes e independientes de PPARγ. La contribución de su receptor en los efectos ejercidos por 15dPGJ2 fue confirmada al silenciar la expresión mediante ARN de interferencia (siARN-PPARγ). Por otro lado, a partir de la utilización de inhibidores específicos de ERK1/2 y de NF-ĸB, demostramos que 15dPGJ2 también ejerce sus efectos de manera independiente a PPARγ, a través de estas vías. IL-10 es una de las principales citoquinas antiinflamatorias y fue identificada originalmente como un factor inhibidor de la síntesis de citoquinas proinflamatorias y modulador de ciertas funciones asociadas a la activación de macrófagos y/o monocitos. En este trabajo se describe que la adición de IL-10 exógena inhibe la activación de las vías de señalización de ERK1/2 y de NF-ĸB y reduce los niveles de expresión y actividad de NOS2, MMP-9 y MMP-2, así como la expresión de TNF-α e IL-6 inducidas por la infección. La señalización por IL-10 a través de su receptor promueve fosforilación de STAT3, el cual actúa como factor de transcripción induciendo la expresión de proteínas supresoras de la señalización por citoquinas-3 (SOCS-3). Tanto la infección con T. cruzi como IL-10 inducen fosforilación de STAT3 y la expresión del ARNm de SOCS-3. El silenciamiento de la expresión de esta proteína mediante ARN de interferencia (siARNSOCS- 3) pone en evidencia la participación de la vía STAT3/SOCS-3 en los efectos ejercidos por IL-10. El conocimiento más profundo sobre el papel de ligandos de PPARγ y de IL-10 podría ser de gran utilidad para formular estrategias alternativas o coadyuvantes de la terapéutica clásica en la infección por T. cruzi.

Abstract:
In the acute phase of Chagas disease, T. cruzi infection produces an intense inflammatory response in different tissues including the heart where cardiomyocytes are an important target. Although the inflammatory reaction is important for the initial control of the infection, an imbalance or poor resolution can generate damage and impaired cardiac function. Cardiac cells respond to infection by the expression of inflammatory enzymes like nitric oxide synthase 2 (NOS2) and metalloproteases (MMPs) and cytokines such as TNF- α and IL-6. This response is mediated by the activation of nuclear factor-кB (NF-кB) and extracellular signal-regulated kinases-mitogen-activated protein kinase (ERK1/2-MAPK) pathways, whose participation is essential in inflammatory processes. Peroxisome proliferator-activated receptors γ (PPARγ) are ligand-dependent transcription factors that have been implicated in the regulation of lipid metabolism and inflammatory processes. In this study we evaluated the contribution of 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2 (15dPGJ2), natural PPARγ ligand, and the antiinflamatory cytokine IL-10 in primary cultures of neonatal mouse cardiomyocytes infected with the lethal pantropic/reticulotropic T. cruzi strain (RA). The obtained results show that 15dPGJ2 is able to inhibit the expression and activity of different inflammatory enzymes such as NOS2, MMP-9 and MMP-2 as well as the proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 induced by T. cruzi infection. 15dPGJ2 antiinflammatory effects involve participation of PPARγ-dependent and - independent mechanisms. PPARγ contribution in 15dPGJ2 effects was confirmed by silencing PPARγ expression with small interfering RNA (PPARγ-siRNA). On the other hand, the use of specific ERK1/2 and NF-кB pharmacological inhibitors demonstrated that 15dPGJ2 can also exert its effects through these pathways. IL-10 is one of the most important antiinflammatory cytokines and has been originally identified as a cytokine synthesis inhibitor factor and modulator of certain functions associated with macrophages and/or monocytes activation. This work describes that exogenous addition of IL-10 inhibits ERK1/2 and NF-кB activation and reduces NOS2, MMP-9 and MMP-2 expression and activities as well as TNF-α and IL-6 expression after T. cruzi infection. IL-10 signaling through its receptor promotes STAT3 phosphorylation, which acts as a transcription factor inducing the expression of suppressor of cytokine signaling-3 (SOCS- 3). Both T. cruzi infection and IL-10 treatment promote STAT3 phosphorylation and SOCS- 3 mRNA expression. SOCS-3 silencing with small interfering RNA (SOCS-3-siRNA) reveals STAT3/SOCS-3 signaling participation in IL-10 effects. A better understanding of the role exerted by PPARγ ligands and IL-10 could be useful in finding new or alternative strategies which could replace the classic parasiticidal therapeutic in T. cruzi infection.

Schiaffino, María Romina. "Análisis de la estructura del picoplancton y sus patrones biogeográficos en lagos comprendidos en una transecta Patagónico-Antártica" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
En esta tesis se estudiaron 45 cuerpos de agua (lagos, lagunas y lagunas temporarias) ubicados a lo largo de un gradiente latitudinal que se extiende desde Patagonia Austral Argentina (45º 22' S) hasta Antártida Marítima (63º 24' S), con el objetivo central de analizar la estructura (abundancia, composición y diversidad) del picoplancton autotrófico y heterotrófico. Los estudios involucraron un enfoque polifacético mediante la utilización de técnicas moleculares, microscopía de epifluorescencia y citometría de flujo. Otro de los objetivos principales fue analizar la existencia de patrones biogeográficos para estos microorganismos. Los resultados obtenidos constituyen un importante aporte al conocimiento de la estructura de los distintos componentes picoplanctónicos en estos ambientes únicos y permiten avanzar en el conocimiento de sus patrones biogeográficos a lo largo de escalas espaciales extensas (>2100 km). Las investigaciones realizadas mostraron que al aumentar la distancia geográfica disminuyó significativamente la similitud en la composición del picoplancton, y a pesar de que algunas secuencias y muchas unidades taxonómicas operativas (OTUs) fueron compartidas entre Patagonia y Antártida (60-70%), la composición de estas comunidades fue significativamente diferente. Por otro lado, se observaron diferencias en la composición del picoplancton entre los lagos relacionadas con su estado trófico. La influencia de los factores ambientales locales y geográficos en el modelado de las comunidades picoplanctónicas revela que ambos controlan la estructura del picoplancton, sugiriendo una distribución no aleatoria del picoplancton y aportando nuevas evidencias que apoyan la hipótesis de la existencia de patrones biogeográficos en la ecología microbiana.

Abstract:
In this Doctoral Thesis the structure (abundance, composition and diversity) of autotrophic and heterotrophic picoplankton of 45 freshwater environments (lakes, shallow lakes and ponds) located along a latitudinal gradient from Southern Argentinean Patagonia (45º 22' S) to Maritime Antarctica (63º 24' S) was analyzed. The studies involved a polyphasic approach combining molecular techniques, epifluorescence microscopy and flow cytometry. The existence of biogeographic patterns for these microorganisms was also analyzed. The results constitute an important contribution to the knowledge of the structure of the different picoplanktonic components in these unique environments and allow understanding patterns over large spatial scales (>2100 km). The results showed that with increasing geographic distance, the similarity in the composition of picoplankton significantly decreased, and even though some sequences and a high percentage of OTUs (operational taxonomic units) were shared between Patagonia and Antarctica (60%-70%), the composition of these communities was significantly different. On the other hand, differences in the picoplankton structure among the lakes were also related with their trophic state. The influence of local environmental factors and geographic factors on picoplankton communities reveals that both control and shape the structure of picoplankton, suggesting a nonrandom distribution of picoplankton and providing new evidence supporting the hypothesis of biogeographic patterns in microbial ecology.

Vozza, Nicolás Federico. "Factores de adhesión de Rhizobium leguminosarum y su rol en la formación de biofilms" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Rhizobium leguminosarum es una α-proteobacteria que puede establecer simbiosis con ciertas leguminosas. La formación de un biofilm puede favorecer la persistencia en suelos y en la rizosfera y también contribuir a la competitividad para la infección de la leguminosa. En esta tesis se estudiaron factores importantes para la adhesión a diversos sustratos y la formación de biofilms. Uno de los factores estudiados fue la proteína de adhesión RapA1, secretada a través del sistema PrsDE. Se sobreexpresó RapA1 y se observó que esto produjo diversos fenotipos de superficie, incluido el aumento de adhesión a sustratos abióticos y la formación aumentada de biofilms in vitro. Se estudió la relación entre RapA1 y el exopolisacárido acídico (EPS) y el requerimiento del EPS y PrsDE para formar biofilms en flujo continuo. Se analizó la localización de RapA1 y de otras proteínas relacionadas y se estudiaron posibles mecanismos involucrados en la localización. Algunos estudios complementarios sobre el efecto de RapA1 sobre la superficie, efecto de expresión de otras Raps y regulación de genes relacionados con la adhesión fueron encarados de manera inicial. La interacción entre Polisacáridos de superficie y adhesinas proteicas resulta clave para la adhesión y formación de biofilms, dos fenómenos importantes en la biología de Rhizobium y de relevancia para la humanidad.

Abstract:
Rhizobium leguminosarum is an α-proteobacteria that can establish symbiosis with certain legumes. Biofilm formation can improve persistence in soil and in the rhizosphere and can also contribute to competitivity for legume infection. Several factors, important for substrate adhesion and biofilm formation, were studied in this thesis. The PrsDE-secreted protein RapA1 was one of the adhesion factors studied in this work. RapA1 was overexpressed and we observed this produced a complex surface phenotype, enhancing adhesion to abiotic substrata and the formation of biofilms in vitro. The interaction between RapA1 and the acidic exopolysaccharide (EPS) was examined as well as the requirement for EPS and a functional PrsDE for biofilm formation in continuous-flow conditions. The subcellular localization of RapA1 and related proteins was also examined and putative mechanisms for localization were studied. Some additional studies on the effect of RapA1 overexpression on cell surface, the expression of other Rap family members and the analysis of the expression of adhesion-relevant genes were performed but only preliminary results were obtained. The intarections between surface polysaccharides and adhesion proteins is key for adhesion and biofilm formation; two important phenomena in the biology of Rhizobium and of great relevance to man.

Fermani, Paulina. "Patrones de abundancia de los componentes del bucle microbiano en las lagunas pampeanas" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El objetivo general de esta Tesis es estudiar los patrones de abundancia de los componentes del bucle microbiano en lagunas pampeanas, utilizando como marco de referencia la Teoría de Estados Estables Alternativos (Scheffer et. al.; 1993) y el modelo de Gasol (1994). En la laguna El Triunfo (aguas claras) la abundancia de bacterias heterótrofas (BH) y flagelados heterótrofos (FH) se encuentran sobre el extremo más productivo del modelo de Gasol (1994), y el grado de acople entre estos componentes es débil; concordando con las predicciones de Perntahler (2005) quienes utilizan el model de Gasol (1994) como marco de referencia. Desde el punto de vista de la teoría de estados alternativos, esta laguna constituye un caso en el que parecen cumplirse sus predicciones. No obstante, uno esperaría que en un cuerpo de agua dominado por macrófitas, el metazooplancton se caracterice por ser abundante y con una alta eficiencia de filtración, lo cual implicaría también un débil acoplamiento entre BH y FH; sin embargo, no se encontró evidencia de este tipo de zooplancton. En la laguna Chascomús (aguas turbias), las abundancias de BH exceden el límite máximo contemplado en el modelo de Gasol (1994), lo que constituye un aporte en sí mismo. El grado de acople observado entre FH y BH resultó levemente superior a las predicciones del modelo. Desde la perspectiva de la teoría de estados alternativos, se esperaría que el metazooplancton de una laguna turbia estuviese dominado por rotíferos y/o copépodos ciclopoideos. Durante el estudio se pudo distinguir dos períodos que difieren marcadamente en la composición del zooplancton: el año 2008 dominado por pequeños cladóceros y copépodos, y el año 2009 dominado por rotíferos y copépodos. Estas diferencias no modificaron el grado de trofismo general de la laguna, pero sí se tradujeron en un distinto grado de acople entre FH y BH: el dasacople (D) resultó significativamente menor durante el primer período que en la segunda mitad del estudio. Ni el modelo original de Gasol (1994) ni sus desarrollos posteriores proveen elementos para interpretar estos resultados. Los patrones de abundancia de BH y FH en 40 lagunas pampeanas confirman la existencia de una gran diversidad de ambientes. Este estudio permite completar el modelo de Gasol (1994), ya que muchas de estas lagunas proporcionan valores que exceden los límites de abundancia del modelo y resultan comparables, o superiores, a los valores más altos reportados en la literatura. Desde el punto de vista de la teoría de estados alternativos, no se encontró evidencia de que la población de lagunas pampeanas se segreguen en dos estados alternativos discretos, sino que se encontró un gradiente de condiciones, tanto de indicadores de estado trófico, como de transparencia. Por otra parte, el grado de acople entre FH y BH no mostró ninguna tendencia ni con los indicadores de estado trófico, ni con los de transparencia. Por lo tanto esta teoría no parece ser de utilidad para evaluar los patrones de abundancia de FH y BH en el conjunto de las lagunas pampeanas, dado que no se cumplen ni sus supuestos ni sus predicciones.

Abstract:
The aim of this thesis is to study the abundance patterns of microbial loop components in Pampean lakes, using as a framework the theory of alternative stable states (Scheffer et. al., 1993) and Gasol model (1994). In shallow lake El Triunfo (clear water) the heterotrophic bacteria (HB) and heterotrophic flagellates (HF) abundances are on the far more productive in the Gasol model (1994), and the degree of coupling between these components is weak, in accordance with the predictions of Perntahler (2005) who used the Gasol’s model (1994) as a reference. According with the theory of alternative states, one would expect in a shallow lake dominated by macrophytes that the metazooplankton will be characterized by abundant and high efficiency filtration, which would also imply a weak coupling between HB and HF, but there was no evidence this type of zooplankton. In shallow turbid lake (Chascomús), the HB abundance exceeds the ceiling set in the Gasol model (1994), which itself is a contribution. The degree of coupling observed between HF and HB was slightly higher than model predictions. From theory of alternative states perspective, one would expect that the metazooplankton was dominated by rotifers and/or cyclopoid copepods. During the study it was possible to distinguish two periods that differ markedly in the composition of zooplankton: 2008 dominated by small cladocerans and copepods, and 2009 dominated by rotifers and copepods. These differences did not change the overall trophic level of the lake, but led to a different degree of coupling between HF and HB: the decoupling (D) was significantly lower during the first period in the second half of the study. Neither the original model of Gasol (1994) and subsequent developments provide elements to interpret these results. HB and HF abundance patterns in 40 Pampas wetlands confirm the existence of a wide range of environments in terms of abundance of HF and HB. This study allows to complete the model of Gasol (1994), as many of these gaps provide values which exceed the limits of abundance of the model and are comparable or superior to the highest values reported in the literature. From the standpoint of the theory of alternative states, there was no evidence that the population of Pampean lakes are segregated into two discrete alternative states, but found a gradient of conditions, both trophic status indicators, such as transparency. Moreover, the degree of coupling between HF and HB showed no tendency with trophic status indicators or with transparency. Therefore this theory does not seem to be useful for assessing patterns of HF and HB abundance in the whole of the Pampas wetlands, as not met or their assumptions or their predictions.

Allievi, Mariana Claudia. "S-layer de Bacillus sphaericus: caracterización, regulación, análisis funcional y aplicaciones" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
Las cepas de Bacillus sphaericus 2362 (cepa de referencia), C7 y C11 (nuevos aislamientos) todas pertenecientes al grupo IIA, son entomopatógenas contra larvas de mosquitos. Además de las envolturas habituales de bacterias Gram positivas, estas cepas están recubiertas de una capa externa de una estructura proteica cristalina: la capa S o Surface layer (S-layer) que estaría asociada un polímero secundario de pared (SWCP). En las 3 cepas se observa que la proteína S-layer tiene un PM de aproximadamente 125 kDa y que es reconocida por el mismo anticuerpo. Tratamientos con LiCl, que remueven la S-layer sin afectar la viabilidad, permitieron observar que en esa condición estas células (carentes de S-layer) crecen más lentamente que las células con S-layer y que en medios hipersalinos solo crecen al recuperar S-layer. El análisis por western blot con un anticuerpo anti S-layer de la cepa 2362, mostró que en las células tratadas la síntesis de S-layer se inició muy temprano durante el crecimiento bacteriano. Las modificaciones en tamaño, concentración, ubicación (fijadas a membrana, asociada a esporas, o libres en el sobrenadante) en función de las etapas de su crecimiento y de las condiciones de estrés hiperosmótico (altas concentraciones de NaCl), nos indican posibles modificaciones postraduccionales, siendo la glicosilación la más frecuentemente reportada. Los resultados de agregación de cultivos y tinción con azul de bromo-timol fueron contradictorios respecto a la presencia de glicosilación cuando se comprarn con los de tinción empleando un kit comercial que distingue proteínas glicosiladas. Se discuten distintas posibilidades: Oglicosilación no enzimática, desprendimiento de la S-layer con el SWCP. Por otro lado se exploraron dos funciones importantes que estas proteínas aportarían a la bacteria: bioabsorción de metales y actividad mosquitocida. Distintas especies de Bacillus han sido involucradas en la asociación con metales como bioadsorbentes, pero hasta el momento no hay un claro entendimiento de las propiedades quelantes. Con ese objetivo, se analizó la capacidad de bioadsorción de cobre en cultivos y esporas de bacterias Gram positivas de especies que producen o no S-layer. Sólo aquellas cepas provistas de S-layer, como Bacillus sphaericus y B. thuringiensis, mostraron una bioadsorción significativa tanto en cultivos como en esporas. Esta capacidad (cercana al 50%) se retuvo luego de un proceso de calentamiento suave de los cultivos, indicando que elementos estructurales de la envoltura son los responsables de esta propiedad. Las S-layer purificadas de dos cepas de Bacillus sphaericus mantuvieron la capacidad de bioadsorber cobre mostrando que la propiedad está directamente asociada a ellas. Se determinaron los parámetros de bioadsorción para la cepa B. sphaericus 2362 que responden al modelo de Langmuir. Tanto la afinidad como la capacidad de bioadsorción fueron comparables con otros bioadsorbentes de origen bacteriano. Se observó un efecto competitivo de Ca2+ y Zn2+, aunque no de Cd2+, lo que indicaría que esta proteína podría retener otros metales además de cobre lo que explicaría su persistencia en ambientes contaminados. La utilización del anticuerpo anti-S-layer permitió determinar que la S-layer permanece adherida a la espora y que sólo las esporas sin lavados intensivos (que eliminan la Slayer) captan eficientemente el cobre. Por primera vez se mostró una correlación directa entre el contenido de S-layer y la capacidad de bioadsorción. Esta capacidad está ligada a la retención de las S-layer adheridas a las células y esporas de Bacillus. Algunas cepas de Bacillus sphaericus son tóxicas para larvas de mosquitos, y sus propiedades insecticidas se deben principalmente a la inclusión cristal que se produce durante la esporulación. Se inspeccionó la actividad insecticida de las S-layer de las cepas 2362 y C7. Se encontró que las S-layer per se muestran actividad contra larvas de Culex. En experimentos con preparaciones de espora-cristal tóxicas en conjunto con la S-layer, se observó un efecto sinérgico aportado por esta proteína. La S-layer de la cepa C7 en particular aumenta el rango de huésped hacia mosquitos del género Aedes para los cuales B. sphaercius no es eficiente. Los análisis in silico de la estructura de la Slayer muestran un motivo con actividad hemolítica que fue confirmado por experimentos realizados in vitro. Esta actividad explicaría los resultados de toxicidad de las S-layer.

Abstract:
Bacillus sphaericus strains 2362 (reference strain), C7 and C11 (new isolated strains), all of them belonging to the homology group IIA, are entomopathogenic against mosquito larvae. In addition to the usual envelopes of Gram positive bacteria, this strains are covered by an external layer with a crystalline protein structure: the S-layer or surface layer. This layer could possibly be associated to a secondary wall polymer (SWCP). In the 3 strains the S-layer protein has a molecular weight of approximately 125 kDa recognized by the same antibody. Treatments with LiCl, that removed the S-layer without affecting their viability, allowed to observe that in this condition these cells (without S-layer) grow slower than those with S-layer. In hypersaline mediums they only grow when they restore the S-layer. The western blot analysis using the anti S-layer antibody against strain 2362, showed that treated cells recover S-layer synthesis early during the start of bacterial growth The modifications in size, concentration, location (fixed to membrane, associated with spores, or free in the supernatant) are related to the growing stages and stress conditions (high NaCl concentrations) indicating possible posttranslational modifications, being the glycosylation the most frequent. The cultures segregation and staining with bromothymol blue results are in contradiction with those obtained with commercial kit staining that distinguishes glycosylated proteins. Different possibilities are discussed as non enzymatic O-glycosylation and S-layer detachment with the SWCP. On the other hand, two important functions of this protein as metal biosorption and mosquitocidal activity have been explored. Various Bacillus species have been implicated as biosorbents of metals, but so far there is no clear understanding of the chelating properties. To that end, we examined the ability of copper biosorption in cultures and spores of Gram positive species with and without S-layer. Only those strains provided with S-layer as Bacillus sphaericus and B. thuringiensis, showed a significant biosorption both in cultures and spores. This capacity (about 50%) was retained after a mild heating of cultures, indicating that structural elements of the envelope are responsible for this property. The S-layer extracted from two strains of Bacillus sphaericus maintained the ability to bioadsorb copper showing that the property is directly associated with this protein. Biosorption parameters were determined for S-layer of strain B. sphaericus 2362 and showed to respond to the Langmuir model. Both the affinity and biosorption capacity were comparable with other bacterial biosorbents. A competitive effect of Ca2+ and Zn2+, but not of Cd2+, was also observed, indicating that other cations may be biosorbed by this protein, which would explain the persistence of this bacterium in polluted environments. The use of anti-S-layer antibody allowed to determine that the S-layer remains attached to spores and that only those not submitted to intensive washing (which eliminate the Slayer), efficiently capture copper. This was the first time that a direct correlation between the content of S-layer and the capacity of biosorption was shown. This capacity is linked to the retention of S-layer proteins attached to Bacillus spores and cells. Some Bacillus sphaericus strains are toxic to mosquito larvae, and their insecticidal properties are mainly due to crystal inclusions produced during sporulation. The insecticidal activity of the S-layer of strains 2362 and C7 was inspected. It was found that the S-layer per se showed activity against Culex larvae. In experiments with toxic spore-crystal preparations in conjunction with the S-layer, we observed a synergic effect provided by this protein. In particular, the S-layer of strain C7 increased the host range to Aedes mosquitoes for which B. sphaercius is not efficient. In silico analysis of the structure of the S-layer show a domain with possible hemolytic activity which was confirmed by in vitro experiments. This activity would explain the results of S-layer toxicity and increased host range.

Rascovan, Nicolás. "Abriendo la caja negra de los microbiomas ambientales argentinos. Caracterizaciones funcionales y ecológicas en lagunas de altura andinas y suelos de la pampa húmeda con secuenciación de alto rendimiento" (2013-12-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La metagenómica basada en tecnología de secuenciación de alto rendimiento revolucionó en los últimos años el campo de la microbiología. Esta metodología permite estudiar a las comunidades de microorganismos ambientales, tanto cultivables como no cultivables, a partir de su información genética. Para poder realizar este tipo de estudios fue necesario instalar, por primera vez en nuestro país, una plataforma de genómica y bioinformática que contara con el equipamiento necesario para la secuenciación masiva de ADN y el análisis posterior de los datos. Los estudios metagenómicos realizados en este trabajo se enfocaron en dos ambientes contrastantes: Las lagunas de altura de la Puna Andina (LAPA) y los suelos de los agroecosistemas de la pampa húmeda (SAPH). Los microbiomas de LAPA en ambientes prístinos presentaron una biodiversidad relativamente baja y no caracterizada previamente. Esto sirvió como modelo de análisis Taxonómico-funcional para describir los primeros estromatolitos vivos de altura en el mundo y biofilms compuestos por haloarqueas encontrados por primera vez en la naturaleza. Los SAPH, por otro lado, son ambientes altamente biodiversos y con alto impacto antropogénico sirviendo como modelo de estudio del impacto ecológico sobre el microbioma en dichas condiciones. Específicamente para este fin, se generó el set de datos PAMPA de casi 8000 millones de bases de ADN que ha sido posteriormente abierto públicamente para el análisis comunitario. Esta investigación es pionera en nuestro país en el emergente campo de la metagenómica ambiental por secuenciación masiva y es a su vez la más detallada caracterización de microbiomas hecha hasta el momento en Argentina.

Abstract:
Metagenomics by high throughput sequencing (HTS) has revolutionized the field of microbiology in the past few years. This method is a powerful tool for the study of environmental microbial communities of both, culturable and nonculturable organisms, based on their genetic information. To be able to perform these type of studies in Argentina, it became necessary to set up a genomic and bioinformatic platform with the appropriate HTS and data analysis equipment. The metagenomic studies presented here were focused in two contrasting environments: the high altitude Andean lakes (HAAL) and the soils from humid Pampas agroecosystems (HPAS). The HAAS microbiomes in pristine environments have been poorly characterized and presented a relatively low biodiversity. they were chosen as a model for taxonomic/functional analyses of the first high-altitude living stromatolites and the first haloarchaea biofilms found in nature. In contrast, the HPAS are highly diverse environments with high impact from anthropogenic activities. Ecological oriented analyses were performed to study the effects of agricultural practices on microbial communities. Specifically for this study, we generated the PAMPA datasets with almost 8 Gb of soil metagenomic data that has been now opened to the scientific community for crowdsourcing analyses. This is a pioneer work in Argentina in the metagenomic emerging field and the most detailed characterization until date of argentinean microbiomes.

Carbonetto, María Belén. "Diversidad de las comunidades microbianas de los suelos pampeanos. Enfoques ecológicos y metagenómicos" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El suelo es uno de los ambientes más biodiversos y heterogéneos del planeta y los ciclos biogeoquímicos que en él suceden son de suma importancia para la vida. Estos procesos son llevados a cabo por microorganismos, mayoritariamente del grupo Bacteria y Arquea. A su vez, el suelo es un recurso esencial para los seres humanos ya que es su fuente principal de alimentos, pero como cualquier recurso natural, es finito. Por lo tanto el estudio del impacto de las modificaciones agrícolas en las características físicas, químicas y biológicas del suelo y por ende en los procesos del ecosistema, es imprescindible. El 50% de la superficie de Región Pampeana está dedicada a la agricultura. El impacto de las prácticas agrícolas sobre las características físicas y químicas del suelo, ha sido ampliamente estudiado en la región. Sin embargo, y más allá del gran esfuerzo realizado, todavía hay una deuda por comprender las consecuencias del uso agrícola sobre la biodiversidad y procesos biológicos. El trabajo aquí presentado pretende saldar parte de esta deuda estudiando el impacto que ejerce la agricultura sobre las comunidades bacterianas de suelos de la Región Pampeana. Se utilizaron técnicas de metagenómica y un enfoque ecológico. El primer capítulo se centró en estudiar el impacto de más de 100 años de agricultura sobre la estructura de las comunidades microbianas y sus perfiles metabólicos (metagenómicos). Se encontraron diferencias significativas entre comunidades de suelos con y sin historia de manejo agrícola. El segundo capítulo se dedicó a la comparación de dos sistemas de labranza. Se estudió la estructura de diversidad y el perfil metagenómico de comunidades de suelos bajo labranza convencional y bajo siembra directa. Vimos que las comunidades difirieron en su composición taxonómica y metabólica según el tipo de labranza a la cual fueran sometidas. El objetivo del tercer capítulo fue determinar el patrón regional de distribución bacteriano. Este análisis se realizó dentro del marco de la Teoría de Metacomunidades y utilizando datos de suelos con y sin historia de manejo de una transecta Este-Oeste que abarcó el gradiente edáfico y climático completo de la Región Pampena. Los resultados mostraron que los efectos de la dispersión fueron más importantes que los efectos contemporáneos a nivel regional, enmascarando así los impactos locales generados por el uso agrícola.

Abstract:
Soil is one of the most biodiverse and heterogeneous environments of Earth. Soil bio-chemical processes are essential for life and are carried out by microorganisms, mainly Bacteria and Archaea. Moreover soil is very important for humans, since it is the main source of food; but as any other natural resource it is not limitless. Though studying the impact of agriculture on soil physical, chemical and biological characteristics, and hence on ecosystem processes is imperative. The 50% of Pampas surface is devoted to agriculture. The impact of agricultural practices on soil physical and chemical properties has been extensively studied in the region. However, beyond the great effort made, there is a debt yet to understand the consequences of agriculture on biodiversity and biological processes. The work presented here aims to repay part of this debt by studying the impact of agriculture on soil bacterial communities of the Pampas. We used an ecological approach and 50% of the surface of Pampas is devoted to agriculture. The impact of agricultural practices on soil physical and chemical characteristics has been extensively studied in the region. However, beyond the great effort made, there is a debt yet to understand the consequences of agricultural biodiversity and biological processes. The work presented here aims to repay this debt of studying the impact that agriculture on soil bacterial communities of the Pampas. We used an ecological approach and metagenomics. The first chapter was focused on the study of the impact of over 100 years of farming on the structure of microbial communities and their metabolic (metagenomic) profiles. Significant differences between communities of soils with and without a history of agricultural management were found. The second chapter is devoted to the comparison of two tillage systems. We studied the structure and metagenomic profiles of soil communities under conventional tillage and no-tillage. We found that communities differ in their taxonomical composition and metabolisms. The aim of the third chapter was to determine the regional pattern of bacterial distribution. This analysis was performed within the framework of the theory of metacommunities. We sampled soils with and without soil management history, in an East-West transect that spanned the entire climatic and edaphic gradient of the Pampas. The results showed that dispersion was more important than environmental contemporaneous effects at the regional level, thus masking local impacts generated by agricultural use.

Fernández Di Pardo, Agustina. "Contaminación en suelos de la provincia de Buenos Aires con el herbicida organofosforado (glifosato) : impacto sobre la comunidad de hongos filamentosos" (2014-03-31) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El herbicida más utilizado en Argentina es el N-phosphonomethylglycine (nombre comercial: Glifosato). Éste puede ser rápida y completamente degradado por los microorganismos, por lo que el tiempo de vida en el suelo es bajo. Sin embargo, el comportamiento del glifosato puede variar en función de las características físicas y químicas del suelo sobre el que se aplique. Por lo tanto, el tiempo de permanencia en el suelo podría ser mayor. Es importante estudiar el comportamiento de este herbicida dada las potenciales alteraciones que puede provocar en las comunidades de microorganismos que viven en el suelo y en algunos de sus procesos. La contaminación de los suelos no sólo está afectando su biodiversidad microbiana sino también a su fertilidad, dado que los microorganismos son fundamentales para el proceso de reciclaje de nutrientes. En este trabajo, se compararon comunidades de hongos filamentosos provenientes de suelos con y sin historia de aplicación de glifosato y se evaluó la capacidad de los hongos filamentosos en la recuperación de suelos contaminados por el herbicida glifosato. Para ello, se aislaron y caracterizaron hongos filamentosos del suelo en dos sitios con distinta historia de aplicación de glifosato utilizando dos técnicas distintas (método tradicional de lavado de muestras múltiples y siembra de partículas de suelo y el método de pirosecuenciación). Se seleccionaron cepas tolerantes a glifosato, se estudiaron los efectos del glifosato sobre los hongos luego de una aplicación puntual y se evaluó la presencia de glifosato en el suelo. Se observó que las poblaciones fúngicas del suelo varían en su composición específica y en su biomasa en suelos expuestos a glifosato en comparación con suelos sin exposición. La mayor riqueza específica y los mayores valores de ergosterol, como medida indirecta de biomasa, se obtuvieron en suelos sin historia de prácticas agrícolas. Se lograron obtener cepas tolerantes al glifosato: T. harzianum; F. oxysporum; P. lilacinus; C. didymum. Finalmente, los valores de concentración de glifosato en suelos fueron bajos y prácticamente nulos luego de 3 meses de la aplicación en la mayoría de los casos.

Abstract:
The most widely used herbicide in Argentina in de N-phosphonomethylglycine (glyphosate). Because it can be rapidly and completely degraded by microorganisms, it disappears quickly from soil. However, the destiny of glyphosate in soil may vary depending on the physical and chemical soil characteristics. It is important to study the behavior of this herbicide given the potential changes that may produce in the communities of microorganisms and in the processes that involves them. The soil contamination with this herbicide no only affects the microbial biodiversity, but also its fertility, considering that microorganisms are a fundamental part of the nutrient recycling process in soil. In this study, changes in filamentous fungi communities’ from soils that were previously or not exposed to the herbicide and the capacity of some strains of remediating contaminated soils were evaluated. Soil fungi were isolated and communities were characterizes in two sites with different history of exposure to glyphosate, using two techniques: traditional isolation method (morphological) and pyrosequencing (molecular). Tolerant strains of fungi were selected; effects of recent glyphosate application on soils fungal communities was evaluated and remnant glyphosate in soil was quantified. In conclusion, soil fungal community changes and fungal biomass reduction were observed after glyphosate application. Six tolerant strains were obtained: T. harzianum; F. oxysporum; P. lilacinus; C. didymum. The concentration of glyphosate in soil was practically zero after 3 month from application.

Ramírez Albuquerque, L. Diana. "Estudio comparativo de las condiciones ambientales que influencian la producción de tricotecenos en cepas de Fusarium graminearum aislados de trigo cultivado en Argentina" (2014-04-29) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El trigo es uno de los cultivos de mayor importancia en Argentina ya sea para consumo local o como producto de exportación. Una de las principales enfermedades que afectan el cultivo es la “Fusariosis de la Espiga de Trigo” (FET). Es una enfermedad endémica en nuestro país causada por Fusarium graminearum, el agente más común de la Fusariosis de la espiga (FET) en muchas partes el mundo. La infección está fuertemente influenciada por parámetros ambientales y ocurre principalmente cuando se dan las condiciones favorables de humedad y temperatura durante la antesis o floración del trigo. Esta destructiva enfermedad afecta al trigo, cebada y otros granos pequeños y tiene la capacidad de destruir cultivos, causando grandes pérdidas económicas debido a la reducción de la calidad de los granos pudiéndose además acumular niveles significativos de micotoxinas, como los tricotecenos. La presente Tesis abarcó el estudio de la influencia de la temperatura y la aw sobre el crecimiento y la biosíntesis de micotoxinas utilizando una cepa de Fusarium graminearum productora de deoxinivalenol (DON), 3- y 15-acetildeoxinivalenol (3- y 15-ADON). El análisis en este estudio mostró que los factores ambientales tuvieron gran influencia en la síntesis relativa de los derivados acetilados, siendo esta influencia más marcada en el caso de la temperatura. Las interacciones entre estos factores: aw, temperatura y el tiempo de incubación, resultaron significativos sobre la producción de DON y 3-ADON. En cambio, la aw no produjo un efecto significativo sobre la producción de 15-ADON, aunque sí lo hicieron la temperatura, y el tiempo de incubación, así como sus interacciones. Las diferentes condiciones estudiadas mostraron que, para DON, no existen diferencias significativas entre las cantidades producidas en las condiciones óptimas (0.99 aw, 30 ºC, 14 días) y las observadas a la misma aw a 25 y 20 ºC, luego de 14 días de incubación, o la producción a 0,95 aw, 25 ºC y 21 días de incubación. El resto de las condiciones resultaron en una acumulación significativamente menor de DON. En cambio, para 3-ADON, las condiciones de máxima producción (0,99 aw, 30 ºC y 21 días) resultaron en una cantidad de toxina significativamente mayor que para el resto de las condiciones estudiadas. Lo mismo se observó para 15-ADON, para el cual las condiciones óptimas de producción fueron de 0,99 aw, 10 ºC y 7 días de incubación y la cantidad de toxina acumulada difirió significativamente con la que se detectó en el resto de las condiciones de estudio. De acuerdo a estudios realizados los últimos años, se demostró que el quimiotipo 3- ADON está desplazando rápidamente al quimiotipo 15-ADON en poblaciones de F. graminearum del oeste de Canadá. Estudios efectuados en invernadero demostraron que aislamientos pertenecientes al quimiotipo 3-ADON producían concentraciones de DON superiores a los aislamientos pertenecientes al quimiotipo 15-ADON, lo cual es motivo de preocupación para los productores de granos y las industrias relacionadas. Tanto la distribución geográfica de las especies como de los quimiotipos está influenciada fuertemente por los factores climáticos, el calentamiento global tendrá entonces un gran impacto en esta distribución. Por este motivo, el estudio del efecto de los factores climáticos (temperatura y actividad acuosa) sobre la producción relativa de tricotecenos por Fusarium graminearum permitirá predecir el riesgo al que están expuestos los cultivos susceptibles en este nuevo escenario.

Abstract:
Wheat is one of the most important crops in Argentina, either for local consumption or export. One of the major diseases affecting the crop is the Fusarium Head Blight (FHB). It is an endemic disease in our country caused by Fusarium graminearum, the most common agent of Fusarium head blight (FHB) around the world. The infection is strongly influenced by environmental parameters and occurs mostly when there are favorable conditions of moisture and temperature during wheat anthesis or flowering. This destructive disease affects wheat, barley and other small grains and has the capability of destroying crops, causing great economic losses due to reduced grain quality, and accumulating significant levels of mycotoxins such as trichothecenes. This thesis involved the study of the influence of temperature and aw on growth and mycotoxins biosynthesis, using a strain of Fusarium graminearum producing deoxynivalenol (DON), 3- and 15 acetyldeoxynivalenol (3- and 15-ADON). The analyses showed that environmental factors greatly influenced the relative synthesis of the acetylated derivatives, this influence being more pronounced in the case of temperature. The interactions between these factors: aw, temperature and incubation time were significant on DON production and 3-ADON. However, aw showed no significant effect on the production of 15-ADON, although temperature and incubation time incubation were significant, as well as their interactions. The different conditions studied showed that there are no significant differences between the amount of DON produced under optimal conditions (0.99 aw, 30 °C, 14 days) and those at the same aw, 25 and 20 °C, after 14 days of incubation, or 0.95 aw, 25 °C and 21 days of incubation. The rest of the conditions resulted in significantly lower accumulation of DON. In contrast, for 3-ADON, the maximum production conditions (0.99 aw, 30 and 21 days) resulted in a significantly greater amount of toxin than for the rest of the conditions studied. The same effect was observed for 15-ADON, for which the optimal production conditions were 0.99 aw, 10 °C and 7 days of incubation, and the amount of accumulated toxin differed significantly with those detected in the rest of the studied environmental conditions. According to studies conducted in recent years, it was demonstrated that the 3-ADON chemotype is rapidly displacing the 15-ADON chemotype of F. graminearum populations from western Canada. Greenhouse studies showed that isolates belonging to 3-ADON chemotype produced higher concentrations of DON than isolates belonging to the 15-ADON chemotype, which is of concern to grain producers and related industries. Both the geographical distribution of species and chemotypes is strongly influenced by climatic factors, and thus global warming will have a major impact on this distribution. For this reason, the study of the effect of climatic factors (temperature and water activity) on the relative production of trichothecenes by Fusarium graminearum will allow to predict the risk to which susceptible crops are exposed in this new scenario.

Mengoni, Eleonora Soledad. "Búsqueda y aislamiento de metabolitos secundarios en plantas y su caracterización como antiinflamatorio y antimicrobiano. Potencial uso de estos en pacientes con fibrosis quística" (2016-04-06) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva producida por mutaciones en el gen que codifica un canal para iones cloruro, el CFTR. La principal complicación a la que se enfrentan las personas que padecen FQ es el daño pulmonar crónico y progresivo causado principalmente por el patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa. En esta tesis, se estudiaron compuestos provenientes de fuentes naturales con el objetivo de establecer si alguno de ellos poseía actividad antimicrobiana sobre P. aeruginosa PAO1 y/o anti-inflamatoria en modelos in vitro e in vivo. En una etapa preliminar, se empleó un extracto acuoso (RACU) y otro etanólico (RETOH) obtenidos a partir de hojas frescas de romero, y posteriormente se evaluaron sus compuestos mayoritarios: el ácido rosmarínico (RA), el ácido carnósico (CA) y el carnosol (CS). De todos, el CA, disminuyó el crecimiento de P. aeruginosa de manera dosis dependiente, potenció la actividad del antibiótico tobramicina, redujo la adhesión bacteriana a placas de poliestireno, e interfirió con la motilidad a concentraciones subinhibitorias. Mediante el uso de la cepa sensora de acil homoserina lactonas (AHLs), C. violaceum CV026,se observó que el CA afectó la producción de las AHLs C4-AHL, C6-AHL, C8-AHL y C12-AHL, responsables de la activación de genes reguladores del sistema quorum sensing (QS). En los ensayos de inflamación, tanto CA como el CS presentaron una importante actividad anti-inflamatoria tópica en modelos de ratón, corroborándose este efecto por estudios histopatológicos, y demostrándose por primera vez que el CA y el CS decrecen significantemente la expresión de IL-1β y TNF-α, e inhiben completamente la expresión de COX-2. Otro compuesto estudiado fue el xilitol debido a que es empleado en la prevención de patologías relacionadas con la colonización bacteriana en las fauces y vías aéreas superiores, se hipotetizó sobre la posibilidad de que se pueda emplear para inhibir el crecimiento de P. aeruginosa. Los resultados revelaron efectos pleiotrópicos del xilitol sobre los genes controlados por QS tanto en la producción de elastasa, piocianina, los movimientos de swarming, twitching y la formación de biofilm, sugiriendo que la producción de AHLs se encontraba afectada. El empleo de los plásmidos pME3853 (lasl::LacZ) y pME3846 (rhll::LacZ) en PAO1, permitieron demostrar la disminución de la producción de AHLs en presencia del xilitol. Por otra parte el cultivo de PAO1 crecido durante toda la noche en presencia de xilitol, se adhirió menos a las células epiteliales bronquiales Calu-3 crecidas en monocapa, disminuyendo el daño oxidativo producido por el proceso inflamatorio y la liberación de IL-8 por parte del epitelio bronquial comparado con el control (crecido sin xilitol). En conclusión, esta tesis presenta evidencias sobre el potencial uso de compuestos bioactivos provenientes de plantas en la inhibición del crecimiento de microorganismos de difícil erradicación y los posibles mecanismos involucrados.

Abstract:
Cystic Fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene encoding the CFTR chloride channel. The main complication for people with CF is chronic and progressive lung damage caused mainly by the opportunistic pathogen, P. aeruginosa. In this thesis, natural compounds were studied in order to determine if these, had antimicrobial activity on P. aeruginosa PAO1 and/or anti-inflammatory activity in vitro and in vivo models. In the first stage, an aqueous (RACU) and ethanolic (RETOH) extracts, from fresh leaves of rosemary, and its main constituents such as rosmarinic acid (RA), carnosic acid (CA) and carnosol (CS) were studied. From these compounds, CA, not only reduced the growth of P. aeruginosa in a dose-dependent manner, but also enhanced the activity of tobramycin antibiotic. Also decreased adhesion on polystyrene plates, and interfered with bacterial motility at subinhibitory concentrations. However, the production of AHLs (C4-AHLs, C6-AHL, C8-C12-AHLs) molecules responsible for the activation of genes regulating system quorum sensing (QS), were increased by CA, when C. violaceum CV026 was employed. In inflammatory test, both CA and CS had higher topical anti-inflammatory activity in mouse models, being corroborated by histopathological studies and demonstrating for the first time that CA and CS decreased significantly, the expression of IL-1β and TNF-α, and a complete inhibition of COX-2 expression. Subsequently, xylitol other natural component employed in the prevention of pathologies related to bacterial colonization of fauces and upper airways was studied. This compound showed pleiotropics effects on genes controlled by QS, such as elastase, pyocyanin, swarming, twitching and biofilm, suggesting that the production of AHLs were affected. To confirm this point, pME3853 (lasl::LacZ) and pME3846 (rhll::lacZ) plasmids were employed in PAO1, confirming that AHLs expression were decreased. In vitro, the growing of PAO1 with xylitol, reduced the adhesion of the bacteria on bronchial epithelial Calu-3 cells, also reduced the oxidative damage and decreased significantly the IL-8 release by bronchial epithelium. In conclusion, the plant kingdom offers a large number of components and bioactive compounds with its potential use against microorganisms where their eradication is difficult to control.

Ibarbalz, Federico Matías. "Metagenómica de lodos activados. Factores determinantes del ensamblado de comunidades bacterianas en el tratamiento de efluentes" (2016-04-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El tratamiento biológico de efluentes domésticos o industriales por lodos activados se basa en la actividad de poblaciones microbianas capaces de autoensamblarse para constituir una comunidad dinámica de alta diversidad. Revelar los factores que determinan la estructura de las comunidades microbianas y los mecanismos que conducen a su ensamblado es crítico para mejorar la gestión del proceso de tratamiento y para proveer un marco conceptual que pueda ser aplicado a comunidades microbianas en otros procesos de biotecnología ambiental. Varios estudios previos realizados en plantas de tratamiento de lodos activados municipales, de diferente configuración y provenientes de sitios geográficamente distantes, sugerían la presencia de taxones bacterianos de alto rango (filos) comunes a todos los sistemas estudiados. En base a estos antecedentes, se planteó la hipótesis de que los determinantes ecológicos del proceso de tratamiento relacionados con la formación del agregado biológico (floc), que permite la retención de la biomasa en el sistema, serían los principales responsables de definir la composición de la comunidad bacteriana en lodos activados. Los objetivos de esta tesis fueron: 1) comprobar si existe un grupo común (core) de taxones bacterianos y funciones en plantas de tratamiento de efluentes municipales e industriales, y 2) determinar cuáles son las variables ambientales y operacionales relevantes en la estructuración de las comunidades bacterianas de los lodos activados. Se realizaron estudios de metagenómica comparativa, utilizando técnicas de pirosecuenciación de amplicones de las regiones variables V1-V3 del gen de ARN ribosomal 16S (ARNr 16S), y secuenciación al azar de ADN metagenómico. Se analizaron lodos activados de 9 plantas de tratamiento de efluentes ubicadas en Argentina, dos municipales y siete industriales, cada una muestreada en dos oportunidades, separadas por períodos de hasta 4 años, conjuntamente con los datos metagenómicos de 12 plantas de tratamiento industriales y municipales localizadas en China, India, Singapur y Corea del Sur, generados en otros laboratorios. Se determinó que la diversidad taxonómica y funcional es significativamente mayor en lodos activados municipales que en industriales. Cada sistema de lodos activados que trata un efluente industrial particular presentó una composición bacteriana característica, reproducible en el tiempo, y marcadamente distinguible del patrón de filos y clases bacterianas observado en plantas municipales. A pesar de los cambios a nivel de género dentro de cada planta, se observó una conservación de los perfiles de contenido de GC en los metagenomas. Se detectó una preferencia particular de ciertos grupos bacterianos consistente con diferencias subyacentes en las abundancias de categorías funcionales particulares, que a su vez se relacionaron con la metabolización de constituyentes específicos de los efluentes. Se concluye que las características del efluente son el principal determinante de la estructuración de las comunidades bacterianas en sistemas de lodos activados. Asimismo, se sugiere que el aumento en la variedad de sustratos que ingresan a los procesos de tratamiento, por ejemplo combinando efluentes de diferentes orígenes en parques industriales, permitiría la conformación de comunidades microbianas más robustas en términos de resistencia y resiliencia frente a perturbaciones. Los modelos mecanicísticos como el ASM1 o el ASM3, que son herramientas valiosas para la representación de procesos biológicos que ocurren en biorreactores, son calibrados utilizando parámetros derivados de plantas de tratamiento municipales. Los resultados obtenidos en esta Tesis resaltan la importancia de considerar las diferencias taxonómicas y funcionales entre lodos activados industriales y municipales, ya que las mismas podrían reflejar cambios en la cinética de consumo de sustratos y en la formación de productos de almacenamiento.

Abstract:
Biological treatment of domestic and industrial wastewater by activated sludge relies on a self-assembled, highly diverse and dynamic microbial community. Revealing the factors that determine the community structure and the mechanisms that drive microbial community assembly in activated sludge is critical to improve the reliability of wastewater treatment management and to help developing a conceptual framework that could be applied to microbial communities in other processes of environmental biotechnology. Several previous studies, conducted on municipal wastewater treatment plants of varying configuration and geographical location, indicated the presence of a common core of high-rank bacterial taxa (phyla). Based on these results, it was hypothesized that the ecological drivers related to the floc formation, a biological aggregate that allows biomass retention, would be the main factors defining the bacterial community composition in activated sludge. The objectives of this work were: 1) to test the existence of a common core of bacterial taxa and functions across municipal and industrial wastewater treatment plants, and 2) to determine which environmental and operational variables are relevant in structuring the bacterial communities of activated sludge. Comparative metagenomic studies were performed utilizing amplicon-sequencing of V1-V3 variable regions of the 16S rRNA gene, and shotgun-sequencing of metagenomic DNA. Two municipal and seven industrial wastewater treatment plants located in Argentina were surveyed, each sampled twice, at times separated by periods of up to 4 years, and analyzed in conjunction with the metagenomic data sets of 12 other municipal and industrial wastewater treatment plants located in China, India, Singapore and South Korea, generated in other laboratories. The taxonomic and functional diversity in municipal activated sludge was found to be significantly higher than that of industrial activated sludge. Each industrial activated sludge exhibited a unique bacterial composition, occurring in a reproducible manner, clearly distinguishable from the high-rank bacterial taxa pattern present in municipal plants. Interestingly, in spite of a changing genera profile within each community, there was a distinct GC content profile in their metagenomes. A particular preference of certain bacterial groups was detected, and it was consistent with underlying differences in the abundance of specific functional categories, which were at the same time related with metabolic pathways involving specific wastewater components. The conclusion is that wastewater features are the main drivers for bacterial community structure in activated sludge. Moreover, an increase in the variety of influent substrates, e.g. by the combination of different influents within an industrial park, would allow the existence of more robust microbial communities, in terms of resistance and resilience against disturbances. Mechanistic models like ASM1 or ASM3, which are valuable tools for the representation of biological processes taking place in bioreactors, are calibrated using parameters from municipal treatment plants. The results obtained in this Thesis highlight the importance of considering the taxonomic and functional differences between municipal and industrial activated sludge, as these may reflect changes in the kinetics of substrate consumption and storage products formation.

Ibarra, Jose Gervasio. "Estudios microbiológicos relacionados con el mejoramiento de cultivos vegetales en zonas desfavorables" (2017-03-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

pdf

Resumen Registro Cita

Resumen:
El desarrollo de estrategias para incrementar la producción agrícola es de relevancia debido a la importancia de los vegetales en la alimentación humana. Entre estas estrategias se incluyen la expansión de la frontera agrícola a zonas menos aptas, como los ambientes fríos o áridos, pero es necesario que las plantas puedan resistir y prosperar en esas condiciones. El uso de cultivos transgénicos resistentes a la sequía constituye una buena alternativa que puede ser mejorada con el uso de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB), que puedan desarrollarse en condiciones de estrés, manteniendo sus actividades. El objetivo de este trabajo consistió en el análisis de cepas bacterianas aisladas de suelos, con diferentes regímenes hídricos, y de Pseudomonas extremaustralis, procedente de un ambiente extremo, en cuanto a su potencialidad para ser utilizadas como promotoras de crecimiento vegetal. Además se analizó la influencia de cultivos de maíz genéticamente modificados (GM) resistentes a la sequía sobre la composición de las comunidades bacterianas del suelo por técnicas secuenciación masiva. Las características de PGP en P. extremaustralis se analizaron en comparación con P. protegens Pf-5, una conocida PGPB. P. extremaustralis presentó una buena capacidad de solubilización y mineralización de fósforo, tanto a 28°C como en frio. El perfil de ácidos orgánicos, responsables de la solubilización de fosfato inorgánico, fue diferente al de P. protegens Pf-5. Estas diferencias se correlacionaron con la ausencia del gen gad responsable de la producción de 2-ceto-gluconato, en el genoma de P. extremaustralis. Esta bacteria también fue capaz de producir ácido indol acético (AIA) y posee genes relacionados a la resistencia a ácido fusárico y otros que la capacitan para resistir la desecación. Posee también la ruta metabólica completa para la síntesis y liberación de pioverdinas y se observó un efecto del regulador global anaeróbico Anr sobre la producción de estos compuestos. Ensayos de quimiotaxis mostraron que P. extremaustralis es atraída por exudados radiculares de plantas de trigo y es capaz de colonizar raíces de trigo y maíz de forma estable e incrementar el peso seco de vástago de plantas de trigo, mostrando que además de sus características como PGPB es capaz de interactuar con vegetales. También se analizaron características de PGP en aislamientos bacterianos obtenidos a partir de suelos de la provincia de Buenos Aires con distinto régimen de lluvias. Se obtuvieron 19 cepas bacterianas capaces de solubilizar fósforo, 3 de las cuales mostraron una alta capacidad de solubilización. Se encontraron 22 aislamientos positivos para la producción de AIA. Se observó un efecto positivo sobre el crecimiento de plantas de maíz en un sistema axénico autotrófico de 2 de las cepas, IIM-Man4 e IIA-Man30, indicando que pueden ser buenas candidatas como PGPB. Para analizar si existe un impacto de plantas GM resistentes a la sequía sobre la comunidad bacteriana del suelo se realizaron experimentos en macetas con suelo de dos localidades Río Cuarto(RC) e Inés Indart (II) en cámaras de cultivo con condiciones controladas, utilizando cultivares de maíz portadores del gen Hahb4 que confiere resistencia a sequía y salinidad. Las plantas fueron sometidas a dos tratamientos hídricos: alta y baja irrigación. Se analizó la diversidad bacteriana de las muestras de suelo mediante la secuenciación de amplicones del gen que codifica el 16S rRNA. Los suelos analizados fueron diferentes en cuanto a la α diversidad. En II no hubo diferencias en β diversidad, mientras que en RC se encontraron diferencias al utilizar los índices cuantitativos (Bray Curtis y Weighted UniFrac) al comparar el tipo de planta. La composición de los grupos mayoritarios fue similar, siendo las Proteobacterias el más representado en ambos suelos con alrededor del 30%, seguido por Acidobacterias con alrededor del 17% y Planctomycetes y Verrucomicrobia representando aproximadamente un 10% del total cada uno. En todas las muestras el género predominante fue Acidobacterium con 14 a 20 % de los registros (lecturas). La mayoría de los géneros presentó una abundancia relativa de 0,01-0,1 %. Se realizó un análisis para determinar que géneros bacterianos son afectados por cada condición de riego. Se detectaron 10 géneros en II y 16 géneros en RC que estuvieron significativamente (p<0,05) más representados en la condición de sequía con respecto a buena irrigación; siendo Chromatium, perteneciente a las Gamma Proteobacterias, el que mayor proporción de cambio mostró en II y Amycolatopsis, perteneciente al grupo de las Actinobacterias, y Nevskia, dentro de las Gamma Proteobacterias, en RC. También se observaron 29 géneros que mostraron diferencias significativas en relación al tipo de planta en II y 61 géneros en suelo de RC. Los tratamientos tuvieron menos efecto en II en comparación con RC. En II no se observaron diferencias significativas ni con el régimen de irrigación ni con el tipo de planta y hubo un menor número de géneros afectados. EN RC se observó un efecto significativo del tipo de planta pero no de la irrigación.

Abstract:
Due to the continuous human population growth, food production may be insufficient in the coming years, so it is necessary to implement strategies to increase crop production. These strategies include expanding the agricultural frontier to less suitable areas, such as cold or arid environments. To reach this goal it is necessary that plants can withstand and thrive in these conditions. The use of genetically modified (GM) crops resistant to drought can be a good option, as well as the use of plant growth promoting bacteria (PGPB) that can grow under stress conditions, maintaining their plant-beneficial traits. The objective of this study was to analyze bacterial strains isolated from environments under different rainfall regimes and cold, in relation to their potential as PGPB under unfavorable conditions. We also assessed the influence of drought-tolerant GM maize on the composition of the soil bacterial communities, using high throughput sequencing techniques. Pseudomonas extremaustralis isolated from an extreme environment (Antarctica) was analyzed for PGP traits in comparison with P. protegens Pf-5, a well known PGPB. P. extremaustralis presented a good solubilization and mineralization capacity of phosphate in comparison to P. protegens Pf-5, both at 28°C and under cold conditions. The profile of organic acids, responsible for the inorganic phosphate solubilization, was different from that of P. protegens Pf-5. These differences were correlated with genetic differences between both genomes, including lack of the gad gene in P. extremaustralis genome, related to 2-ketogluconate production. P. extremaustralis was also able to produce indole acetic acid (IAA); possesses genes encoding fusaric acid resistance and genes that enable it to withstand desiccation. It is, also a good siderophore producer, posses a complete genetic pathway to produce and release pyoverdine. We observed that pyoverdine production was influenced by the global anaerobic regulator Anr. Chemotaxis and colonization assays showed that P. extremaustralis was attracted to wheat root exudates and was able to colonize wheat and maize roots forming stable colonies in root surface, improving the dry weight of the stem in wheat plants. In addition, different characteristics related to the ability to promote plant growth in bacterial isolates obtained from soils with different rainfall regimes were analyzed. We found 19 isolates able to solubilizing inorganic phosphate, three of which showed a high solubilizing capacity and 22 isolates that were positive for IAA production, some of which reached high production (up to 60 μg / ml). Two strains, IIM-Man4 and IIA-Man30, showed a positive effect on the growth of maize plants in an autotrophic axenic system. The results indicate that P. extremaustralis, as some of the isolated bacterial strains, could be good candidates for their analysis in experimental plots subjected to stress conditions. Another expanding strategy to improve crop yield involves the use of GM plants. However, the evaluation of the impact of these organisms on the soil communities has not been deeply analyzed yet. We evaluated the effect of drought tolerant GM corn plants carrying the Hahb4 gene, on soil microbial community. Experiments were carried out in pots with soil from two locations Río Cuarto (RC) and Inés Indart (II) in culture chambers under controlled conditions. The plants were subjected to two soil irrigation regimes. Bacterial diversity of the soil community was analyzed using global amplicon sequencing techniques of the gene encoding the 16S rRNA. Soils were different in terms of α diversity. In II there were not differences in β diversity, while in RC differences were found when comparing the type of plant using the quantitative index (Bray Curtis and Weighted UniFrac). The composition of the major groups was similar, with Proteobacterias being more represented in both soils with about 30%, followed by Acidobacterias with around 17% and Planctomycetes and Verrucomicrobia representing approximately 10% of the total. In all the samples the genus Acidobacterium was predominant with 14 to 19% of the records (readings). Most genera had a relative abundance of 0.01-0.1%. Analysis of bacterial genera affected by irrigation conditions was performed. Ten genera in II and 16 genera in RC were detected that were significantly (p <0.05) more represented in drought conditions in comparison with good irrigation; being Chromatium belonging to GammaProteobacteria that showed the highest proportion of change in II soil, and Amycolatopsis belonging to Actinobacterias and Nevskia within the GammaProteobacteria in RC. We also observed 29 genera that showed significant differences in relation to the type of plant in II and 61 genera in RC soil. Treatments had less effect on II as compared to RC. In II, no significant differences were observed either with the irrigation regime or the type of plant and there were fewer affected genera. The analysis of bacterial community of RC soils showed a significant effect of the type of plant but not of irrigation regimes.

http://digital.bl.fcen.uba.ar

Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34