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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Ingeniería Genética [ 25 tesis ]

Vazquez, Martín Pablo. "Organización y expresión genómica en Trypanosoma cruzi : Proteínas ribosomales P y secuencias repetidas" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Calamante, Gabriela. "Utilización del virus X de la papa como vector de expresión transitoria en plantas" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus X de la papa (PVX) es el miembro tipo del grupo potexvirus. En este trabajo de Tesis se obtuvo una copia de ADNc completa e infectiva de PVX. Además, se evaluó la capacidad de PVX como vector de expresión transitoria en plantas. Se obtuvieron vectores virales de reemplazo e inserción capaces de expresar el gen bacteriano uid A. En el primer caso, se reemplazó el gen de la cápside (CP) por el gen marcador, y se evaluó en experimentos de complementación. Sólo se observó actividad de la enzima β-glucuronidasa (GUS) en ensayos de co-inoculación con viriones de PVX purificados. La actividad de GUS estuvo restringida a pocas células en la hoja inoculada. En el segundo caso, se obtuvo un vector de inserción donde el gen uíd A se expresó a partir de una duplicación del promotor subgenómico de CP y se observó actividad de GUS en las hojas inoculadas. También se obtuvo y evaluó un vector de inserción para expresar el gen del factor de crecimiento epidermal humano. Finalmente, se obtuvieron herramientas necesarias para implementar un sistema de trans-complementación entre plantas transgénicas que expresaban la replicasa de PVX y construcciones derivadas de PVX defectivas en la replicación.

Abstract:
Potato virus X (PVX) is the type member of the potexvirus group. In this Thesis an infections, full-length cDNA copy of PVX genome was obtained. Besides, the suitability of PVX as a transient expression vector in plants was evaluated. Replacement and insertion viral vectors able to express the uid A bacteria] gene, was developed. The first, in which the viral coat protein (CP) gene was replaced by the reporter gene, was evaluated in complementation assays. β-glucurunidase (GUS) activity was only detected in co-inoculation experiments with purified PVX virions. GUS activity was restricted to small areas of the inoculated leaves. The insertion vector was able to express uid A from a duplicated CP subgenomic promoter. GUS activity was only detected on the inoculated leaves. The insertion vector was also used to express the human epidermal growth factor gene in tobacco plants. Finally, a trans-complementation system was designed. Transgenic tobacco plants expressing the PVX replicase gene were obtained, and four replication defective versions of PVX were constructed. These tools will be used in the future to perform complementation assays in tobacco protoplasts and plants.

Cerdán, Marcelo Guido. "Especificidad tisular de la expresión de genes Eucariotas en ratones transgénicos : 1) 3,8 kilobases del promotor de beta-caseína bovino dirigen la expresión de proteínas recombinantes a la glándula mamaria y 2) expresión específica del gen de proopiomelanocortina en el sistema nervioso central" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Durante este trabajo se estudio la regulación tejido especifica de dos genes mediante la utilización de ratones transgénicos. l) Se estudio con que eficacia un fragmento de 3,8 kb del promotor bovino de β-caseina puede dirigir una expresión tejido especifica a la glándula mamaria. El patrón de expresión espacial, temporal y hormonal del gen de fusión, resultó altamente regulado y confinado estrictamente a celulas epiteliales de la glándula mamaria lactante. En estudios previos realizados sobre una línea celualar de glándula mamaria de ratón, se había demostrado que con 1,7 kb del promotor bovino de β-caseína era posible obtener expresión celular específica, a su vez regulada hormonalmente. Esta misma construcción no funcionó al intentar dirigir la expresión específica a glándula mamaria de ratones transgénicos. En este trabajo utilizamos un promotor de mayor tamaño del mismo gen, 3.8 kb, para direccionar la expresión del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) a glándula mamaria de ratones transgénicos. Por medio de un ensayo de Northern blot se determinó la presencia de ARNm de hGH únicamente en glándula mamaria de hembras en período de lactancia. Este ARNm no se detectó en glándula mamaria de hembras vírgenes. Un análisis durante el desarrollo de la glándula mamaria demostró que el transgén sigue un patrón de expresión que se asemeja mucho más al bovino que al murino. En estudios de hibridización in situ, realizados sobre secciones de glándula mamaria, se observó que el patrón de expresión del transgén resultó homogeneo en todos los lóbulos, tanto en animales heterocigotas como homocigotas. La cantidad de granos de plata contados sobre tejido mamario se correlacionó áltamente con el contenido de hGH en leche, previamente determinado por radioinmunoensayo (r=0 996). Por lo tanto, las 3,8 kb del promotor bovino de β-caseína pueden direccionar altos niveles de expresión de proteínas terapéuticas a la glándula mamaria de ratones transgénicos con especificidad celular y regulación correcta durante el desarrollo. 2) Se evaluó la expresión celular especifica del gen de Pro-Opiomelanocortin (POMC) en neuronas. El gen de POMC se expresa en una serie de neuronas del hipotálamo y tracto solitario, y en corticotrofos y melanotrofos hipofisarios. En estudios previos se determinó que una porción proximal del promotor de POMC de rata o ratón era suficiente para dirigir expresión celula-específica, regulada hormonalmente y en forma correcta durante el desarrollo, a melenotrofos y corticotrofos, pero no a neuronas. Más recientemente se identificó la presencia de posibles activadores de la transcripción dentro de una zona de 11 kb en la región 5’flanqueante del gen de POMC (entre —13kb y —2kb). En el presente trabajo, por medio de un análisis delecional se ubicó el elemento neuronal específico a una resolución de 4 kb. Se generaron 3 construcciones conteniendo secuencias genómicas de POMC (6 kb de la unidad transcripcional y 2 kb de la región 3’flanqueante) con diferentes longitudes de la región 5’flanqueante, 13 kb (-13/+8POMC-EGFP), 9 kb (—9/+8POMC-EGFP) y 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). A estas secuencias se les introdujo en el exón 2, previo al sitio ATG, una versión mamiferizada de la proteína verde fluorescente de medusa (EGFP). Esta innovación permitió visualizar la expresión transgénica en el cerebro e hipófisis en forma inmediata luego de realizar los cortes de los tejidos. En tres de un total de cuatro lineas de animales transgénicos generados para las construcciones -5/+8POMC-EGFP y -9/+8POMC-EGFP se observó fluorescencia en corticotropos y melanotropos. Estos transgenes se expresaron en neuronas. Contrariamente, la construccion -13/+8POMC-EGFP se expresó correctamente en hipófisis y neuronas de POMC Este resultado nos sugiere que la presencia del elemento neuronal específico buscado se encuentra entre —9 y —l3kb del inicio de la transcripción. En experimentos futuros, nuestro objetivo será clonar e identificar el factor de transcripción neuronal que interactúa con los elementos en cis. Nosotros proponemos inmortalizar un linea celular neuronal que exprese POMC mediante oncogénesis dirigida en ratones transgénicos. Hemos generado 4 lienas de ratones transgénicos con una construcción similar a —l3/+8POMC-EGFP, pero conteniendo una versión termo-sensible del antígeno T largo (AgT-tsA58) insertada en el segundo exón del gen de POMC de ratón. En estas 4 líneas se desarrollaron tumores prematuramente en la región hipofisaria-lúpotalámica, a pesar de que la temperatura corporal del ratón es no permisiva. Tres de estos ratones murieron antes de reporoducirse. Sólo una líena pudo ser mantenida con un programa de aparcamientos utilizando machos jóvenes. En estudio realizado con un Northern blot se observó una expresión considerable de POMC en esos tumores. En próximos experimentos evaluaremos la prsencia de marcadores neuronales e hipofisafios para determinar la naturaleza de dichos tumores.

Abstract:
During this study the tissue specific regulation of two different promoter genes were studied using transgenic mice. 1) The ability of a 3.8-kilobase promoter of the bovine β-casein gene to drive cell specific expression to the mammary gland was evaluated in transgenic mice. The spatial, temporal, and hormonal pattern of expression of the fusion gene is highly regulated and confined to the epithelial cells of the lactating mammary gland. Previous studies have shown that l.7 kb of the bovine β-casein promoter were able to drive cell-specific and hormone-dependent expression in a mouse mammary cell line but failed to induce accurate expression to the mammary gland of transgenic mice. We investigated here the ability of a larger sequence consisting of 3.8 kb of the bovine β-casein gene promoter to drive the expression of the human growth hormone (hGH) gene in transgenic mice. A Northern blot analysis using total RNA obtained from different tissues of lactating and non lactating females revealed the presence of hGH mRNA only in the mammary gland of lactating females. hGH mRNA was not detectable in the mammary gland of Virgin females. A developmental analysis showed that hGH mRNA only peaked on parturition, resembling more closely the bovine β-casein temporal expression pattern rather than the murine. In situ hybridization studies performed on mammary gland sections showed that the cellular pattern of hGH expression was homogeneous in all lobules from heterozygous and homozygous transgenic mice. Silver grain counts on the tissue sections highly correlated with the hGH contents in the milk determined by radio immunoassay (r = 0.996). Thus 3.8 kb of the bovine β-casein promoter direct a high-level expression of therapeutic genes to the lactating mammary gland of transgenic mice in a tissue-specific and developmentally regulated manner. 2) The cell-specific expression of the Pro-Opiomelanocortin (POMC) gene in hypothalamic neurons was evaluated in transgenic mice. The POMC gene is expressed in a subset of hypothalamic and hindbrain neurons and in pituitary melanotrophs and conicotrophs. Previous studies demonstrated that the presence of a proximal promoter of the rat or mouse POMC gene was sufficient to drive cell-specific, developmentally and hormonally regulated expression in melanotrophs and conicotrophs of transgenic mice, but not in neurons. More recently we identified the presence of a putative neuron-specific enhancer/s within 11 kb of 5‘flanking sequences of the mouse POMC gene (-l3 kb to —2 kb). In the present work, by using a deletional analysis in transgenic mice we localised this site/s within a 4 kb resolution. Three different constructs were generated containing genomic sequences of the POMC gene (6 kb of the transcription unit and 2 kb of the 3’flanking region) with different lengths of the 5’flanking region, 13 kb (-13/+ 8POMC-EGFP), 9 kb (-9/+8POMC-EGFP) and 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). We also introduced in the exon 2 of the POMC gene, previous to the ATG site, a “mammalianized” version of the green fluorescent protein (EGFP). This innovation allowed us to visualise transgenic expression in the brain and the pituitary immediately after tissue sectioning. Three out of four lines of transgenic mice generated with each of the constructs, -9/+8POMC-EGFP and -5/+8POMC-EGFP showed green fluorescence in pituitary melanotrophs and conicotrophs. These transgenes failed to direct expression of EGFP to POMC neurons. However, the construct —l3/+8POMC-EGFP showed correct expression in pituitary and hypothalamic neurons, suggesting that a specific neurone element is located between -9 kb and —l3 kb from the transcription initiation point. In future experiments our goal is to clone and identify the neuronal transcription factor that interacts with the cis-acting elements. We propose to immortalise neuronal cell lines expressing POMC by targeted oncogenesis in transgenic mice. We have generated 4 transgenic mouse lines with a construct similar to the —l3/+8POMC-EGFP, but containing the temperature sensitive version of the oncogenic large T antigen (tsA58-Tag) inserted into the second exon of the mouse POMC gene. These four lines showed premature tumors in the pituitary-hypothalamic region despite the non-permissive temperature of the mouse body. Three of these mice died before breeding. Only one line could be maintained by mating young males. Interestingly, Northern blots experiments showed high POMC expression in these tumors. In further experiments we are going to evaluate the presence of neuronal and pituitary markers to establish the nature of these tumors.

Guerchicoff Lemcke, Alejandra. "Aspectos básicos y aplicados de la genética molecular de Bacillus thuringiensis" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los inoculantes basados en Rhizobium son ampliamente usados en plantas luguminosas. Actualmente cepas bacterianas con funciones duales (por ejemplo: fijación de nitrógeno y actividad insecticida) pueden ser una alternativa para el manejo orgánico de pestes de insectos (Madhavi et al., 1993 and 1994). También pueden ser usadas para proteger semillas, reduciendo el uso de insecticidas químicos. El gen cry 4B de B. thuringiensis israelensis que codifica para una proteína tóxica para díptero fue usado como modelo. Para introducir dicho gen se usó el plásmido pTR101, un vector altamente estable, en Rhizobium en ausencia de presión de selección. Las construcciones fueron introducidas en Rhizobium fredii 191 y Rhizobium meliloti 1021, mediante conjugación tripartita con un plásmido ayudante. La expresión fue estudiada mediante Western blot de extractos crudos utilizando un anticuerpo específico contra la proteína Cry4B recombinante. Se observaron reareglos que dieron lugar a deleciones, pero a pesar de esto un polipéptido reactivo se detectó en ambos Rhizobios. Dado que en Argentina muchas pestes de coleópteros y nematodos constituyen un serio problema para cultivos de alfalfa y soja, entre otros, el gen cry3A de B.thuringiensis tenebrionis (Krieg et al., 1983) fue introducido en Rhizobium meliloti 1021. Se eligió al vector de amplio rango pRK404, para evitar que se produzcan reareglos. Este plásmido posee un origen de replicación derivado del RK2, lleva resistencia a kanamicina, puede ser movilizado con una alta frecuencia usando un plásmido ayudante. Los análisis por PCR confirmaron la presencia de este gen en Rhizobium meliloti 1021 pero se observó un bajo nivel de expresión. La presencia del plásmido recombinante no afectó la capacidad nodulativa ni de crecimiento de las plantas inoculadas. La presencia de proteíans tóxicas con actividad citolítica y hemolítica es una característica de Bacillus thuringiensis entre este grupo la primera descubierta fue Cyt1 la citolisina de Bacillus thuringienisis israelensis (Bti) (Earp, D. J., et al. 1987, Ward, E. S., et al. 1984). En esta subespecie hemos detectado la presencia de otro gen cyt, altamente homólogo a la citolisina de 29 KDa, Cyt2 de la subespecie kyushuensis (Drobniewski, F, A., et al. 1989. Knowles, B, H. et al. 1992). Este gen mapea “río arriba “ del gen cry4B en el megaplásmido de 72 Md de la cepa 4Q2-72. El análisis de la secuencia reveló una región 5' estabilizadora del mARN similar a las descriptas para otros genes cry. Los análisis de Western blot revelaron la presencia de un polipéptido inmunoreactivo en Bacillus thuringiensis subespecie 1884 y 4Q2-72. Mediante experimentos de PCR y de Southern blot se confirmó la presencia de este gen en otras subespecies mosquitocidas de Bacillus thuringiensis. Notablemente la subespecie tenebrionis que clasifica dentro del serotipo morrisoni, con actividad tóxica para coleóptero, también lleva este gen. Por otro lado, se obtuvieron resultados negativos con las cepas tóxicas para lepidóptero kurstaki HD-l y aizawai HD-137. Así como los genes cry, que codifican toxinas larvicidas en Bacillus thuringiensis, los genes cyt también parecen constituir una amplia y diversa familia de genes altamente relacionados.La presencia de hemolisinas Cyt ha sido asociada típicamente con cepas de Bacillus thuringiensis con diferente patotipo(Chang, C., et al. 1993; Crickmore, N., et al. 1995). Este es el caso del serotipo morrisoni el cual incluye cepas bilógicamente activas contra larvas de lepidóptero y coleóptero. Mientras que las proteínas Cyt fueron encontradas en la mayoría de las cepas mosquitocidas estudiadas, es probable que más de una citolisina coexista en las cepas más tóxicas para dípteros, como las subespecies israelensis y morrisoni PG14, sugiriendo esto una correlación entre la potencia mosquitocida y la actividad hemolítica. La secuencia parcial de diferentes genes cyt de cepas mosquitocidas y no mosquitocidas fue determinada y en base a estos datos se construyó un árbol filigenético. , Nuestros encuentros sugieren que las proteínas Cyt tienen un espectro de distribución más amplio que el que hasta ahora se conocía y probablemente también de actividad contra insectos. Teniendo en cuenta las diferencias en el mecanismo de acción entre las proteínas Cry y Cyt se sugiere que éstas últimas pueden ser un factor importante en el manejo de la resistencia desarrollado por los insectos a toxinas Cry . Finalmente se sugiere que la actividad biológica de los cristales intactos de muchas subespecies de Bacillus thuringiensis puede ser considerada como la resultante de una compleja interacción entre las toxinas Cry y Cyt.

Abstract:
Rhizobium-based inoculants are widely used in leguminous crops. Improved strains with dual functions (i.e, nitrogen fixing and insecticidal) could be successfully applied to organic pest management (Madhavi et al., 1993 and 1994). They could also be used as seed protectants, reducing the use of chemical insecticides. The cry4B gene from B. thuringiensis israelensis coding for an anti-dipteran toxin (Goldberg, L., 1977) was used as a model for expression. A highly stable plasmid vector (pTR101) was chosen in order to introduce insecticidal genes in Rhizobium in the absence of selective pressure. Constructions were introduced into Rhizobium fredii 191 and Rhizobium meliloti 1021, through triparental matings with a helper plasmid. Expression was monitored by Western blotting of crude extracts using a specific antibody raised against recombinant Cry4B protein. Although rearrangements leading to deletions were observed, an immunoreactive polypeptide was reproducibly detected in both Rhizobia. Considering that pests such as Coleoptera in alfalfa or Nematoda in soybean constitute a serious problem in Argentina, the cry3A gene from B.thuringiensis tenebrionis (Krieg et al., 1983) was also introduced into Rhizobium meliloti 1021, in order to produce strains with anti-coleopteran activity. A broad host range cloning sistem vector, pRK404, was chosen as alternative vector in order to prevent rearrangements. The tetracycline-resistant plasmid component of this system, pRK404, contains a functional RK2 replicon and can be mobilized at high frequency by using a helper plasmid, but is non-self-transmisible. PCR amplification analysis confirmed the presence of this gene in Rhizobium meliloti 1021, low level of expression was observed. The presence of the recombinant plasmids did not affect either the nodulativen capacity or the growth of the inoculated plants. Mosquitocidal Bacillus thuringienisis strains show as a common feature, the presence of toxic proteins with cytolytic and hemolytic activities, being Cyt1 the characteristic cytolytic toxin of Bacillus thuringienisis israelensis (Bti) (Earp, D. J., et al. 1987, Ward, E. S., et al. 1984) In this species we have detected the presence of another cyt gene, highly homologous to cyt2, that codes for the 29 kDa cytolytic toxin from kyushuensis subspecies (Drobniewski, F, A., et al. 1989. Knowles, B, H. et al. 1992). This gene maps upstream cry4B, on the 72 Md plasmid of strain 4Q2. Sequence analysis revealed, as remarkable feature a 5’ mRNA stabilizing region similar to those described for other cry genes. As predicted by sequence analysis, Western blot reveal Cyt2 cross recating polypeptides in 4Q2 and Bti 1884. PCR amplification and Southern blot analysis confirmed the presence of this gene in other mosquitocidal subspecies. Interestingly, the anti-Coleopteran subspecies tenebrionis belonging to the morrisoni serotype, also showed this gene. On the other hand, negative results were obtained with the anti-Lepidopteran subspecies kurstaki HD-l and aizawai HD-137. As is the case with cry genes, coding for larvicidal delta endotoxins, in Bacillus thuringienisis, the cyt genes for hemolytic toxins seem to form a large and diverse family of highly related genes. The occurrence of Cyt hemolytic toxins has been tipically associated with the host range of Bacillus thuringienisis strains of different pathotypes. This is the case for the morrisoni serovar, that includes strains biologically active against both lepidopteran and coleopteran larvae. While Cyt proteins occur in almost all the mosquitocidal strains studied, it seems that more than one Cyt toxin coexist in highly toxic antidipteran strains, like Bacillus thuringienisis israelensis and morrisoni PG14, suggesting'a correlation betweeen mosquitocidal power and hemolitic activity. Partial DNA sequence for different cyt genes from mosquitocideal and no mosquitocidal strains were determined and a phyologenetic tree was constructed. This novel finding suggests that Cyt protein may have an even broader spectrum of distribution and probably of activity against insects and, owing to their different mechanism of action in comparation to Cry proteins, they might be useful in managing resistance to Cry toxins. These findings suggest that the biological activity of the parasporal cristal of many Bacillus thuringienisis strains, should be viewed as the result of a complex overall interaction between Cry and Cyt toxins.

Cramer, Paula. "Estudio de la relación entre transcripción y Splicing alternativo de mRNAs eucarióticos" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo de tesis nos hemos propuesto buscar evidencias sobre la coordinación entre los procesos de transcripción y splicing alternativo. Nuestro modelo de estudio consistió en construir una batería de minigenes α-globina/ fibronectina que incluyen al exón EDI de la fibronectina capaz de sufrir splicing alternativo, clonados río abajo de diferentes promotores. Con estos minigenes se transfectaron líneas celulares en cultivo, analizándose luego el patrón de splicing alternativo por medio de las técnicas de Northern blot y/o RTPCR. Encontramos así que el tipo de promotor determina el patrón de splicing alternativo. Este efecto del promotor sobre el splicing alternativo no depende de la fuerza del promotor ni de la secuencia de la región 5' no codificante de los mRNAs, sino de la calidad de factores de transcripción reclutados en el promotor. Posteriormente intentamos dilucidar el mecanismo subyacente a este fenómeno. Para ello sobreexpresamos proteínas que participan del splicing general y/o alternativo en otros modelos. Encontramos que sólo las proteínas SF2/ASF, SRp40, SRp55 y SC-35 son capaces de modificar el patrón de inclusión de EDI, mientras que las proteínas SRp20, SRp30c y Tra2βno tienen efecto alguno. El efecto de SF2/ASF, la proteína con mayor actividad estimulatoria, es específico de promotor y opera a través de las secuencias regulatorias en cis presentes en EDI, tal como lo demuestran los experimentos con minigenes mutantes en estas regiones. Los resultados mencionados constituyen la primera evidencia de coordinación entre transcripción y splicing alternativo. A partir de los mismos proponemos un modelo de interacción entre el dominio carboxiterminal (CTD ) de la RNA polimerasa II y los factores de splicing, compatible con los resultados observados en nuestro laboratorio y en otros grupos de investigación.

Abstract:
In this work we searched for evidence of coupling between transcription and alternative splicing. Our model consisted in the construction of a series of alphaglobin/ fibronectin minigenes including the fibronectin alternative ED1 exon, cloned downstream of different promoters. Cell lines were transfected with the minigenes and the alternative splicing pattern was analyzed either by Northern blot and/or RT-PCR. We found that the type of promoter controls the pattern of alternative splicing. This effect is neither dependent on promoter strength nor on the 5' non-coding region of the mRNAs, but on the quality of the transcription factors recruited by the promoter. We then tried to elucidate the mechanism underlying this phenomenon. For this purpose, we overexpressed splicing factors involved in general and/or alternative splicing in other models. We found that SF2/ASF, SRp40, SRp55 y SC-35 were the only the splicing factors with ability to stimulate ED1 inclusion, whereas SRp20, SRp30c y Tra2β had no effect. The effect yielded by SF2/ASF, the protein with the highest stimulation activity, is promoter specific and is mediated by exon regulatory sequences, as revealed by experiments performed with mutants in these regions. The mentioned results comprise the first evidence of coupling between transcription and alternative splicing. Based on our results and evidences presented by other laboratories, we propose a model in which the carboxyterminal domain (CTD) of the RNA polymerase II interacts with the splicing factors.

Dus Santos, María José. "Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas: su utilización como inmunógenos experimentales" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El uso de plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenos relevantes ha sido ampliamente evaluado dada la posibilidad de utilizar plantas modificadas genéticamente para la producción de vacunas. Las vacunas a base de plantas serían más baratas y más fáciles de elaborar en grandes cantidades. Estas vacunas se podrían producir en países en desarrollo sin necesidad de instalaciones sofisticadas y costosas como las que se necesitan en la actualidad. Por otra parte, estas vacunas eliminarlanel riesgo de virus contaminantes que existe en las vacunas producidas en líneas celulares de mamíferos ya que los posibles vian de plantas contaminantes no constituyen un peligro potencial ni para el hombre ni para los animales. Adicionalmente, las plantas transgénicas que expresen antígenos en sus tejidos comestibles podrían ser usadas como sistemas de producciónde vacunas de administración oral. Hasta el momento, la mayoría de los antígenos expresados consisten en péptidos, proteínas únicas ó estructuras muy simples. Sin embargo, la producción de antígenos vacunales en sistemas heterólogos requiere, en muchos casos. ía expresión de estructuras antigénicas complejas. EIVirus de la Fiebre Aftosa (VFA)produce una de las enfermedades más temidas del ganado debido a su amplia distribucióngeográfica y por ser altamente contagiosa. La vacuna utilizada actualmente es polivalente y a virus inactivado. El progreso en la producción de vacunas antiaftosas está dirigido hacia el logro de vacunas de elaboración más fácily económica y que eviten la manipulación de grandes cantidades de virus. Una alternativa a las vacunas convencionales es la preparación de cápsides vacías expresando y procesando la poliproteína precursora en un sistema de expresión heterólogo. Se han obtenido cápsides vacías confonnacionalmente correctas de los serotipos A, 0 y C del VFA utilizando sistemas de expresion en E. CoIi, baculovirus o virus vaccinia. Los resultados obtenidos hasta ahora al expresar cápsides vacías del VFA en sistemas heterólogos, con relación a Ia conservación de epitopes protectivos, las convierten en antígenos candidatos para la formulaciónde vacunas. Sin embargo, aún no se ha logrado un método de expresión masiva de un inmunógeno eficaz como para ser utilizado a campo, ya que los sistemas desarrollados hasta ahora resultan costosos y poco aplicables a nivel industrial. Como primer objetivo de este trabajo de tesis se propuso producir plantas de alfalfa transgénicas conteniendo el gen que codifica para la poliproteína P1 precursora de las proteínas estructurales del VFA. Las construcciones utilizadas involucran únicamente a P1 ó a P1 junto con la proteasa SC. La presencia del gen foráneo se detectó, en las plantas transgénicas, por PCR y su actividad transcripcional específica por RT-PCR y Northern blot. Fue posible visualizar por microscopía electrónica estructuras que por su tamaño y morfología podrían corresponder a cápsides vacías del VFA. La inmunogenicidad de los productos expresados fue evaluada en el modelo murino. Ratones adultos inmunizados intraperitonealmente desarrollaron una respuesta de anticuerpos detectada por su reactividad. en ELISA, frente a un péptido sintetico que representa la zona más inmunogénica de VP1 y partículas virales completas; y, en Western blot, frente a las proteínas estructurales del virus nativo. Además, estos animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes y resultaron completamente protegidos frente al desafío con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la factibilidad de expresar antígenos altamente complejos en plantas transgénicas y su utilizacióncomo efectivos inmunógenos experimentales. Los resultados obtenidos por nuestro y otros grupos de investigación demuestran la factibilidad de la utilización de plantas transgénicas como fuente de producción de antígenos vacunales. Sin embargo, uno de los principales problemas que posee este sistema de expresión es que los niveles de proteína expresada en las plantas transgénicas son relativamente escasos como para extrapolar su uso a una vacuna de aplicabilidad real. De modo que, el desarrollo de estrategias que generen una mayor concentración de la proteína recombinante es sumamente importante, especialmente cuando se desea utilizar los extractos de planta sin ningún proceso de enriquecimiento y/o purificación posterior. Dado que la inserción del transgen en el genoma vegetal es al azar, es altamente probable que los niveles de su expresión varíen entre los individuos producidos. Una alternativa posible, entonces, consiste en poder identificar aquellos individuos que presentan niveles excepcionalmente altos de la proteina foránea. Sin embargo, la identificación de aquellas plantas que expresen cantidades significativas de antígeno por métodos inmunológicos es un proceso lento y labioroso. Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, y como segunda parte de este trabajo de tesis, hemos desarrollado una metodologia que nos permite evaluar un gran número de individuos y seleccionar de un modo fácil y rápido aquéllos que presentan mayores niveles de expresión de la proteina recombinante. Esta metodologia se basa en la expresión de un gen de interés fusionado a un gen reportero, codificante para la enzima B-Glucuronidasa (B-GUS), cuya presencia puede ser detectada cuantitativamente por colorimetrla. A fin de evaluar el sistema de selección propuesto, utilizamos como antígeno un péptido que comprende los residuos 135 a 160 de la proteina VP1 del VFA para generar la proteina de fusión con la enzima B-GUS.Las plantas transgénicas obtenidas fueron primeramente evaluadas por su actividad enzimática de B-GUS. Fue posible detectar por Western blot la proteina de fusión en aquellas plantas que presentaron mayores niveles de B-GUS. Las plantas seleccionadas expresaron 0.5-1 pglmg de proteina soluble total. El péptido p135-160 expresado como proteina de fusión conservó sus caracteristicas inmunogénicas ya que ratones inmunizados parenteralmente con una vacuna elaborada con extracto foliar desarrollaron una respuesta de anticuerpos especificos detectada por su reactividad en ELISAfrente a p135-160, particulas virales completas y en Western blot frente a VP1. Además, se detectaron anticuerpos neutralizantes que resultaron protectores frente al desafio con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la posibilidad de utilizaruna metodologia simple para detectar las plantas que expresan altos niveles del péptido recombinante, el cual conserva sus propiedades antigénicas e inmunogénicas al ser expresado como proteina de fusión.

Abstract:
The use of transgenic plants as a system for expressing recombinant antigens has already been widely evaluated and constitutes a feasible methodology for vaccine production. Plant based vaccines would be less expensive and easier to be produced in large scale. These vaccines could be produced in undeveloped countries without requiring sophisticated facilities, as they are currently needed. On the other hand, the use of these vaccines would eliminate the risk of contaminating viruses present in mammalian cellular lines since the plant contaminating viruses do not constitute an actual risk for animals or humans. Additionally,edible transgenic plants expressing antigens in their tissues could be used as oral vaccines. Up to now, most antigens expressed in plants are peptides, unique proteins or very simple structures. Nevertheless, production of vaccine antigens in heterologous systems often require the expression of complex antigenic structures. Foot and mouth disease virus is the causal agent of a worldwide distributed highly contagious disease of cattle. The currently used vaccine is based in the utilization of polyvalent inactivated virus. In general, progress in the process of FMDV vaccine production are pointed toward the development of simpler and cheaper protocols involving the use of lower amount of virulent viruses. An alternative to the conventional FMDV vaccines are those containing recombinant virus empty capsids after the expression of the precursor polyprotein.In the past, it has been possible to obtain empty capsids of serotypes 0, A and C using as expression systems E. coli, baculovirus and vaccinia virus. Although the products resulted immunogenically efficient, the methodologies for producing them are not suitable to be used at the industrial level. The first objective of this thesis was the production of transgenic plants of alfalfa containing the gene encoding for the polyprotein P1, which is the precursor of all structural FMDV proteins. The transgenic constructs used contained either just P1 nor P1 along with the 3C gene. The presence of the foreign gene in the recombinant plants was detected by PCR and their transcriptional activity analyzed by RT-PCR and Northen blot. Additionally. it was possible to demonstrate, by electron microscopy, the presence of structures with a size and shape resembling those of the FMDV empty capsides. The immunogenicity of the obtained products was evaluated in mice. Intraperitoneally immunized adult mice presented a FMDVantibody response detected by its activity,in ELlSA, against a synthetic peptide representing the major immunogenic area of VP1, and against complete virus particles, and in Western blot, against all the FMDV structural proteins. Additionally, these animals developed a significant neutralizing antibody response and protection when experimentally challenged with the virulent virus. These results demonstrated the feasibility of expressing highly complex structures in transgenic plants and its use as effective experimental immunogens. As stated earlier, results obtained by us and other research groups demonstrated the potential feasibility of using transgenic plants as a source of antigen for vaccine production. Nevertheless, the main problem presented by this approach resides in the relatively low concentration of the recombinant protein in the plant tissues, which hampers its possible utilization at the industrial scale. Thus, the development of strategies which allow the production of transgenic plants expressing high levels of recombinant protein would substantially modify the expectations on the utilization of this system in the future, specially in those cases where no further steps toward the enrichment or purification of the recombinant product will be needed. Due to the fact that the insertion of the transgene in the plant genome is a random process, it is expected the development of individuals presenting very different expression levels of the recombinant protein. An interesting approach could be the identification of those individuals presenting exceptionally high levels of the foreign protein. Nevertheless, the identification of those individuals,using immunological approaches, is usually a laborious and slow process. Focusing in this particular problem, the second part of this thesis deals with the development of a methodology that allows us to evaluate a significant number of individuals and select, in an easy and quick way, those presenting the highest levels of expression of the foreign protein. The methodology is based in the expression of the gene of interest as a fusion protein along with a reporter gene which encodes for the enzyme ß-Glucuronidase (ß-Gus), which could be quantitatively detect by a oolorimetric test. In order to evaluate this methodology, we selected as antigen a peptide which represent the amino acid residues at position 135 to 160 of the structural FMDV protein VP1. This peptide was expressed as a fusion protein along with ß-Gus. The obtained transgenic plants were first evaluated based in their ß-Gus activity. Among those presenting the highest enzymatic activity it was possible to detect, by Western blot, the presence of the FMDV epitope. The selected plants expressed a concentration of the recombinant protein between 0.5 to 1 mg/g of the total soluble protein extracted for the plant tissue. The peptide 135-160 appears as conserving its native immunogenic characteristic since adult mice parenterally immunized with a vaccine prepared with the foliar extracts developed a specific FMDV antibody response detected in ELISA, against the p135-160 synthetic peptide. and complete virus particles, and against native VP1 in Western blot. Additionally,the sera of these animals showed significant neutralizing antibodies titers and the mice resulted protected against the experimental challenge with infectious virus. These results demonstrate the feasibility of using this simple methodology to detect transgenic plants expressing high levels of recombinant peptide, which completely conserves its antigenic and immunogenic properties when expressed as a fusion protein.

Agüero, Fernán Gonzalo. "Purificación, caracterización, clonado y expresión de malato dehidrogenasas del helminto parásito Echinococcus granulosus" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las isoformas de malato dehidrogenasa presentes en protoescólices de E. granalosus fueron purificadas a homogeneidad, mediante un protocolo que incluye un fraccionamiento con sulfato de amonio y la separación de las isoformas citosólica y mitocondrial mediante cromatografía de afinidad en 5'-AMP-Sefarosa. La mMDH es llevada a homogeneidad mediante la adición de una cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. La cMDH en cambio es purificada siguiendo un protocolo ya descripto que incluye cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa, filtración molecular en columna de Superosa 12 y cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. la identidad de las isoformas fue confirmada mediante i) el estudio del comportamiento cinético de ambas en presencia de exceso del sustrato oxaloacetato, ii) el comportamiento diferencial que muestran las dos isoformas frente al detergente catiónico CTAB y iii) la secuenciación de péptidos a partir de ambas. En el caso de la mMDH, cuyo gen no se encontraba clonado, la información peptídica obtenida permitió comenzar el clonado del mismo, por amplificación de dos fragmentos del ADNc codificante de la enzima. Con ellos, se rastreó una biblioteca de ADNc de protoescólices que permitió extender la secuencia del ADNc hacia el extremo 3'. Finalmente, la secuencia del ADNc se completó utilizando la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (5' RACE), que permitió amplificar y secuencia: el extremo 5’ faltante. El ADNc completo fue utilizado para expresar, en forma recombinante, a la mMDH, en forma de fusión con la glutation-S-transferasa de S. japonicum. La proteína recombinante resultó activa y los parámetros cinéticos de la misma fueron comparados con los obtenidos para la enzima obtenida de la fuente natural. La cMDH recombinante, clonada y expresada por el grupo del Dr. Arnaldo Zaha también fue comparada cinéticamente con la enzima natural purificada en esta Tesis.

Abstract:
The isoforms of malate dehydrogenase present in protoscolices of E. granulosus were purified to homogeneity using a protocol that includes an ammonium sulfate precipitation step and an afinity chromatogmphy step on 5’-AMP Sepharose to separate cMDH from mMDH. The mMDH is obtained in apparently homogeneous form by an additional affinity chromatography step on Blue Sepharose. The cMDH is purified following a previously described protocol that includes ion exchange chromatography on DEAE-cellulose, gel filtration on Superose 12 columns and affinity chromatography on Blue Sepharose. The identity of the purified isoforms was confirmed based on i) the kinetic behaviour of the enzymes in the presence of an excess of oxaloacetate, ii) the differential behaviour shown in the presence of the cationic detergent CTAB, and iii) by sequencing of internal peptides from both isoforms. Peptide information from mMDH was used to start the cloning of its gene. This information allowed us to amplify two fragments from the cDNA that were then used to screen a protoscolex cDNA library and obtain a positive phage which contained sequence information corresponding to the 3’ end of the cDNA. The remaining 5' end was amplified using the 5' RACE technique. The full-length CDNA was then used to produce recombinant mMDH as a fusion protein with the S. japonicum glutathione-S-transferase. The recombinant protein was active and its kinetic parameters were compared with those of the natural enzyme. The recombinant cMDH, cloned and expressed by Dr. Zaha’s group was also compared kinetically with the natural enzyme purified in this Thesis.

Bellani, Marina. "Replicación de plásmidos en Escherichia coli recBC sbcBC" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Este trabajo estudia la replicación de plásmidos en Escherichia coli recBC sbcB sbcCD, un contexto Rec+, en el cual se amplifican procesos de recombinación que involucran intermediarios conteniendo extremos doble cadena (en función de la deficiencia en RecBCD). En este contexto genético, plásmidos con diversos origenes de replicación acumulan multimeros lineales de muy alto peso molecular denominados HMW Se re-evaluó el proceso de generación de multimeros HMW en el contexto recBC sbcBC, a la luz de los nuevos conceptos vigentes acerca de la interrelación replicación / recombinación. Durante la primer etapa del trabajo, se utilizó el sistema de recombinación especifico-de-sitio del transposón γδ para poner a punto un sistema de complementación regulable, que permitiera generar células conteniendo un mínimo porcentaje de multimeros, para analizar luego la síntesis de HMW a lo largo de la curva de crecimiento. Utilizando este sistema, se demostró que las células recBC sbcBCD pueden sintetizar multimeros del plásmido descontroladamente, durante las primeras horas de la fase estacionaria. La capacidad de replicar descontroladamente el plásmido durante la fase estacionaria está determinada por las condiciones de cultivo y depende en parte de la respuesta de fase estacionaria, gobernada por el regulador de la respuesta general al estrés σˢ. Una vez establecida la cinética de acumulación de HMW, se realizó un análisis genético para individualizar las funciones celulares involucradas en la síntesis de estos multímeros. Se analizó la incidencia de anular funciones de recombinación (RecA, RecF, RecR, LexA) y funciones involucradas en el re-inicio de la replicación sobre una horquilla restaurada (PriA, PriC, Rep), sobre la capacidad de las células de sintetizar HMW. La comprobación de que PriA resulta indispensable para la generación de HMW en un contexto RecBC- SbcBC-, constituye una evidencia de que la generación de HMW involucra el colapso de intermediarios normales de replicación del plásmido y el reinicio de la replicación por un mecanismo alternativo. En base a los resultados reportados, se proponen dos modelos para explicar el mecanismo de generación de HMW, que involucran el colapso de un intermediario de replicación y el restablecimiento de la replicación por un mecanismo de invasión/replicación entre multimeros lineales (similar al que utiliza T4 en su etapa tardía de replicación) o por un mecanismo de tipo círculo rodante (equivalente al utilizado por el fago ʎ para generar concatémeros).

Abstract:
This work studies plasmid replication in Escherichia coli recBC sbcBC, a Rec+ background, in which recombination processes involving linear DNA (or DNA molecules containing a double strand end) are amplified, given the deficiency in RecBCD characteristic of this genetic context. In recBC sbcBC cells, plasmids with diverse replication origins, were reported to accumulate high molecular weight linear multimers (HMW). During the course of this work we have re-evaluated the phenomenon of HMW synthesis, in terms of the current understanding of the link between replication, recombination and repair. Acomplementation system was designed, based on the site-specific recombination system from transposon γδ, which permitted the reduction of the percentage of HMW in the culture to a minimum, in order to analyze the kinetics of HMW accumulation along the growth curve. This system allowed us to demonstrate that recBC sbcBC cells can synthesize plasmid multimers in an unregulated manner, during the first hours of stationary phase. The ability of non-growing cells to replicate the plasmid in an uncontrolled manner during stationary phase is determined by growth conditions and depends in part on the stationary phase response, which is regulated by σˢ (the regulator of the general stress response). A genetic analysis was performed in order to characterize the cellular functions involved in HMW synthesis. We analyzed the effect of inactivating recombination functions (RecA, RecF, RecR, LexA) or genes involved in re-initiating replication upon replication fork repair (PriA, PriC, Rep), on the ability of the cells to synthesize HMW. PriA proved to be essential for HMW synthesis in a RecBC- SbcBC- strain, providing strong evidence for a model for HMW synthesis involving replication fork collapse and re-initiation of plasmid replication through an alternative mechanism. We postulate two models to explain the alternative mechanisms to initiate the synthesis of HMW in a recBC sbcBC context.

Asurmendi, Sebastián. "Desarrollo y aplicación de un sistema de expresión de poliproteínas autoclivables basado en la proteasa NIa del virus TEV para la obtención de plantas transgénicas con capacidad de procesar, secretar y dirigir subcelularmente las proteínas expresadas" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se desarrolló, perfeccionó y evaluó la factibilidad de aplicación práctica de un vector de transformación genética vegetal que permite la coexpresión de varias proteínas bajo el control de un promotor común. El sistema desarrollado basado en la proteasa NIa derivada del TEV fue capaz de procesar poliproteínas quiméricas y producir la acumulación de varias proteínas a partir de una única unidad transcripcional in vivo. Se expresaron diferentes combinaciones de proteínas (indicadoras, como GFP y GUS, cápsides de PVX, PVY y PLRV, así como proteínas de defensa antifúngica) in vivo e in vitro. El nivel de acumulación de cada proteína no dependió de la posición del ORF en la poliproteína. A pesar de lo expuesto el nivel de acumulación total de una proteína expresada a través de la poliproteína puede ser influenciada por propiedades intrínsecas de las mismas. Mediante microscopía electrónica se demostró que la cápside de PVY expresada a través de la poliproteína no sólo se procesa correctamente sino que el producto del procesamiento es capaz de formar partículas parecidas a virus (cápsides vacías). Cuando se agregó la señal de exportación al RE del gen de la patatina a poliproteínas conteniendo GUS y GFP, éstas fueron dirigidas al RE en protoplastos de tabaco de la línea BY-2. Las plantas transgénicas de papa expresando estas poliproteínas mostraron menor actividad GUS que las plantas control expresando la misma poliproteína pero sin señal de exportación. Este menor nivel de actividad podría ser atribuido a que la proteína GUS resulta glicosilada en el RE. Estos resultados sugieren que la poliproteína es dirigida al RE y luego en el lumen procesada para liberar las proteínas individuales. Se obtuvieron plantas de papa transgénica expresando poliproteínas conteniendo cuatro genes antifúngicos, codificantes para una quitinasa, una glucanasa, AP24 y RIP. Se obtuvieron plantas altamente resistentes a el ataque de R. solani, demostrando el correcto procesamiento de la poliproteína y el sinergismo de las proteínas antifúngicas expresadas para producir resistencia. Se encontró una asociación entre el espacio subcelular de acumulación de las proteínas glucanasa y AP24 (vacuolar versus apoplásmico) con el nivel de resistencia contra Rhizoctonia.

Abstract:
Development, characterization, as well as practical application of a plant transformation vector allowing the coexpression of different proteins under the control of a single promoter, is described. The system, based on NIa protease gene derived from tobacco etch potyvirus was shown to express and process chimerical polyproteins and to accumulate different proteins from a single transcription unit, including reporter genes (green fluorescent protein —GFP-and β-glucurunidase —GUS-), as well as coat proteins of potato virus Y (PVY), potato virus X (PVX) and antifungal proteins. Thus, different combinations of proteins were expressed in vitro or in vivo showing that protein accumulation does not depend upon relative position of the ORF within the cassette. However, the overall level of accumulation may be influenced by intrinsic properties of the expressed proteins. Electron microscopy showed that the PVY CP expressed in the polyprotein cassette assembled in vivo to form void virus-like-particles. Addition of the endoplasmic reticulum (ER) targeting sequence from patatin to the polyprotein containing GUS and GFP, targeted the protein to ER, in BY-2 tobacco protoplasts. Transgenic plants that encode the thus polyprotein exhibited lower enzymatic activity than transgenic plants expressing GUS from the cassette without the patatin leader sequence. Indirect evidence suggests that the low level of activity is the result of glycosylation of GUS in the ER. These results suggest that the polyprotein is first targeted to the ER where the polyprotein is processed to release the individual proteins. Transgenic potato plants expressing a polyprotein including four anti-fungal ORFs (chitinase, glucanase, AP24 and a RIP) were produced. High levels of protection against Rhizoctonia solani attack were shown, confirming the correct processing and synergism of these proteins to produce resistance. We found an association between the subcellular localization of the introduced glucanase and the level of resistance. Protein AP24 showed a similar but less apparent behavior. We conclude that the vector system pPRO10/20 is highly effective to express several proteins in planta. The expressed proteins can be, cytoplasmic or exported to the apoplasm or other subcellular compartments like vacuoles.

Fernández, Paula del Carmen. "Análisis genómico de girasol: desarrollo de colecciones de ESTs y de una plataforma bioinformática para estudios de expresión de genes candidato en respuestas a estreses abióticos" (2006) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El girasol es uno de los principales cultivos oleaginosos del mundo por su volumen de producción y composición en ácidos grasos insaturados. En promedio, durante los últimos cinco años, la producción mundial se ha mantenido estable concentrándose el 72% de la misma entre Argentina y la Unión Europea. A pesar de esto y debido a las condiciones de los precios internacionales y la productividad comparativa con otros cultivos, el área de producción se está desplazando a regiones más áridas a nivel mundial cobrando relevancia la incidencia de estreses abióticos como sequía, salinidad y bajas temperaturas. Pese a la importancia económica del girasol a escala mundial, el grado de avance de los conocimientos públicos sobre el genoma de girasol es limitado cuando se lo compara con cultivos como el arroz, el maíz, la soja, el tomate, el trigo, la papa, la cebada. Sin embargo, en los últimos cinco años, en paralelo al avance de este trabajo, se han iniciado distintos proyectos a nivel nacional e internacional orientados al análisis genómico de girasol con lo cual ha aumentado significativamente la disponibilidad de secuencias genómicas y de ADNc, con el consecuente impacto en el avance de las investigaciones y el conocimiento sobre esta especie. El objetivo de este trabajo es contribuir al conocimiento de las regiones codificantes del genoma de girasol a partir de una estrategia de genómica funcional que sirva como base para la caracterización transcripcional simultanea de los perfiles de expresión inducidos bajo condiciones de estrés y el desarrollo de marcadores funcionales. Para lo cual se abordo el desarrollo de un banco local de secuencias que se expresan o ESTs ("expressed sequence tags") diferenciales para distintos órganos y/o estadios de desarrollo de girasol y el desarrollo de una plataforma bioinformática para la caracterización de los perfiles transcripcionales de las mismas en respuesta a estrés abióticos. En una primera etapa se evaluaron distintas estrategias de secuenciación a pequeña y mediana escala para la identificación de genes diferencialmente expresados en girasol a partir de la generación colecciones de ADNc diferencial. La técnica utilizada se basó en la hibridación substractiva como herramienta para la identificación de genes diferencialmente expresados en un tejido definido, disminuyendo significativamente la redundancia en la secuenciación de clones que representan a genes abundantes y maximizando la detección de los transcriptos “raros” o poco abundantes. Esta estrategia posibilitó un incremento de la eficiencia de secuenciación dentro del marco de un proyecto genómico de pequeña escala que apunta a la identificación de genes de utilidad para propósitos de mejoramiento y la búsqueda de marcadores funcionales. Como resultado, se obtuvieron clonotecas diferenciales a partir de hoja, tallo, raíz y flor en dos estadios de desarrollo (R1 y R4). El uso de diferentes fuentes de ARN como objeto o “tester” y referencia o “driver” fue de utilidad para la selección y detección de transcriptos poco abundantes. La especificidad órgano- específica varió dentro de un rango de 75 a 100% de las secuencias no- redundantes (unigenes) dentro de cada clonoteca de ADNc. La clonoteca correspondiente al estadio R4 de flor fue la menos redundante con un 62% de secuencias únicas y la que aportó el número más elevado de secuencias nuevas de girasol. El análisis bioinformático se llevó a cabo mediante la instalación de un servidor local (INTA 01) conteniendo las herramientas de distribución pública para la edición, análisis y ensamblado de secuencias como Phred/Phrap, CAP3 y algoritmos de comparación de secuencias como BLAST y el desarrollo de BioPipeline® una plataforma desarrollada en entorno Windows para el análisis automatizado de secuencias utilizando los mismos programas y algoritmos mencionados anteriormente. La información de secuencias generadas fue depositada en la base dbESTs de NCBI para su distribución pública. Para el manejo local de esta información se desarrolló una base relacional de tipo ACeDB para la integración de la información generada y su anotación funcional. Sobre un total de 919 secuencias que fueron editadas y anotadas, 318 representan secuencias únicas. Las comparaciones contra bases de datos públicos arrojaron un valor del 60% de secuencias no-redundantes con similitud a secuencias conocidas. El número de genes novedosos predichos varió según la clonoteca analizadas, en un rango que va de 56% en las clonotecas de flor estadio R4 al 16% en las de flor R1. Las comparaciones con los ESTs de girasol depositados y reportados en bases de datos mostraron que 197 secuencias (59,9%) del total) representaban secuencias nuevas, sin similitud significativa con secuencias conocidas. Este enfoque fue exitoso respecto del aislamiento de un número significativo de secuencias reportadas asociadas en su función inferida (probable) a caracteres de importancia agronómica, procesos regulatorios y fisiológicos clave. En una segunda etapa se abordó la evaluación de la expresión relativa simultánea de los transcriptos correspondientes a las secuencias de la base de ESTs desarrollada bajo diferentes condiciones de estrés abiótico utilizando la tecnología de micromatrices de ADN. Se imprimieron los fragmentos representativos de los 318 unigenes anotados en las clonotecas previamente descriptas en micromatrices sobre soporte de vidrio. Se evaluaron tres muestras biológicas tanto para tratamiento de frío (estrés térmico), tratamiento de salinidad (estrés salino) y controles representados por plantas crecidas en condiciones regulares. Estos estreses fueron seleccionados considerando al girasol como una planta con grado intermedio-alto de sensibilidad a bajas temperaturas en la zona radicular, así como también particularmente susceptible al desarrollo en condiciones de alta salinidad. El análisis transcripcional permitió detectar 3 grupos de genes bien diferenciados en sus patrones de expresión. Por una parte el Grupo 2, integrado por 126 genes, no mostró variación en sus niveles medios a través de los tratamientos. En cambio, el Grupo 1 (integrado por 112 genes) evidenció sobre- expresión respecto del control cuando las plantas fueron sometidas a estrés (por frío o por salinidad). De manera análoga, 49 genes conformaron el Grupo 3, pero en este caso se observó una sub-expresión respecto del control en ambos tratamientos. Dentro del grupos 1 y 3, se detectaron perfiles de expresión diferenciales para ambos tipos de estrés, siendo la sobre expresión y/o sub expresión de los genes evaluados más pronunciada en respuesta al estrés por frío respecto al estrés por salinidad. Finalmente, surgieron 80 genes candidato en la separación de tratamientos de acuerdo a su p-valor en la prueba de comparación de medias por análisis de la varianza y su ubicación en la región periférica del plano de ordenación generado por los dos primeros ejes principales de un Análisis de Componentes Principales (ACP) de la matriz de expresión génica escalada gen a gen por la desviación estándar residual del análisis de la varianza. De estos genes, 7 fueron validados por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Real Time PCR), habiéndose obtenido patrones transcripcionales similares con ambas estrategias de análisis La diferencia en expresión génica fue analizada en relación al origen de las secuencias en evaluación. Las secuencias provenientes de la colección de hoja mostraron en general patrones de subexpresión génica en respuesta a ambos estreses (la mayoría corresponden a genes asociados al proceso de fotosíntesis) mientras que las secuencias aisladas de colecciones de tallo o flor en estadio R4 mostraron patrones de inducción génica frente a los mismos estreses. Si se considera que los cambios transcripcionales en respuesta a frío y salinidad fueron evaluados en hoja, estos resultados confirman la eficiencia de la técnica de SSH utilizada para la generación de las colecciones de ADNc órgano específicas y explica la alta relación de transcriptos que muestra cambios en su perfil en respuesta a estreses en relación a los que no varían su nivel transcripcional en las condiciones evaluadas. Durante la segunda etapa de este trabajo se realizó un análisis de los 80 genes candidatos, detectándose 48 como sobre o sub expresados frente a uno u otro estrés, indicando la implicancia de mecanismos regulatorios comunes a ambos estreses. Asimismo 17 y 12 genes se detectaron inducidos o sub expresados específicamente frente a un estrés y no frente al otro. De acuerdo al análisis funcional comparativo estos genes estarían involucrados en mecanismos de regulación incluyendo procesos de transcripción, traducción, degradación/plegado o interacción de proteínas o asociados a mecanismos de generación y procesamiento de especies reactivas de oxigeno. De estas secuencias, 12 corresponden a secuencias con funcionalidad desconocida. Sólo 3 de las secuencias analizadas en este trabajo mostraron patrones transcripcionales opuestos incluyendo una con similitud a un transportador de lípidos. La información generada a partir de la caracterización del banco de ESTs constituye por una parte una fuente de información sobre genes candidatos involucrados en mecanismos de respuesta a estreses abióticos que pueden ser incluidos en ensayos de complementación en plantas transgénicas modelo y asimismo permite identificar secuencias nuevas no descriptas anteriormente para el desarrollo de marcadores funcionales a ser utilizados en programas de mejoramiento asistido de este cultivo

Abstract:
Sunflower is one of the most important oil crops worldwide regarding its production volume and composition in unsaturated fatty acids. However due to international price conditions and productivity respect to other crops, sunflower production is progressively expanding to arid regions worldwide. Consequently, abiotic stresses as drought, low temperatures and salinity arise as main constrains nowadays. Sunflower is considered a medium-high tolerant plant crop to low temperatures in the radial zone and sensitive to saline environment. Compared to other crops such as rice, maize, soybean, tomato, wheat, potato and barley genetic and genomic sunflower knowledge was limited until the onset of the present decade. However, in parallel to the advance of this thesis (last five years), different projects aimed to the genome analysis of cultivated sunflower and its related wild species, resulted in a significant increase of the number of available expressed and genome sequences in public databases. The objective of this work was to develop tools for structural and functional analysis of cultivated sunflower through the development of a model organ-specific ESTs ("expressed sequence tags") database, the creation and actualization of a bioinformatics platform to characterize transcriptional profiles of the represented genes in response to abiotic stress conditions with the aim to identify novel genes as a source of functional molecular markers associated to important traits, under the scope of an alternative, cost-effective strategy to high-throughput sequencing projects. In the first stage of this work a low scale sequencing strategy based on suppressed subtracted hybridization method was evaluated for the construction of organ- specific cDNA libraries in order to identify differentially expressed genes in sunflower Differential organ-specific ESTs were generated from leaf, stem, root and flower bud at two developmental stages (R1 and R4). Organ-specificity ranged from 75 to 100% of non-redundant sequences in the different cDNA libraries. Sequence redundancy varied according to the target and driver cDNA used for each library. The R4 flower cDNA library was the less redundant library with 62% of unique sequences. Bioinformatics analysis was achieved through the development of BioPipeline®, a bioinformatic tool for sequence quality analysis, contaminant sequence removal and sequence assembly and automatic annotation based on the utilization of free available software as Phred/Phrap, CAP3 and BLAST algorithms using a local server installed at the Institute of Biotechnology, INTA01. Processed sequences were deposited for public distribution in the dbEST database at NCBI. Biological information related to these sequences was locally stored using an ACeDB-based relational database as a laboratory information management system. Out of a total of 919 sequences that were edited and annotated, 318 were non redundant sequences. Comparison against sequences in public databases showed that 60% of non redundant sequences showed significant similarity to known sequences. The number of predicted novel genes varied among the different cDNA libraries, ranging from 56% in the R4 flower to 16 % in the R1 flower bud library. Comparison with sunflower ESTs on public databases showed that 197 of non- redundant sequences (60%) did not exhibit significant similarity to previously reported sunflower ESTs. This approach helped to successfully isolate 33 newly reported unique sequences for sunflower putatively related to responses to biotic and/or abiotic stresses. Application of suppressed subtracted hybridization technology not only enabled the cost effective isolation of differentially expressed sequences but it also allowed the identification of novel sequences in sunflower from a relative small number of analyzed sequences when compared to major sequencing projects. In a second stage, functional genomic studies were performed using microarray technology. A cDNA glass slide chip containing the 318 organ-specific unigenes was constructed in order to evaluate the expression profile under cold and salinity stress conditions. Three biological leaf samples from treated plants, exposed either to low temperatures or watered with NaCl solution, as well as control plants grew under standard condition, were evaluated by hybridization of fluorescence labeled treated and control RNA to target genes. Transcriptional analysis allowed the detection of three groups of genes well differentiated in their expression profiles during the exploratory analysis. One group composed by 126 genes did not show variation along treatments; a second group composed by 112 genes showed evidence of up-regulation under abiotic stress (cold or salinity), whereas a SUB- regulation in both treatments was observed in the 49 genes belonging to a third group. During the second phase of this analysis, 80 candidate genes were identified according to the p-value obtained by classical ANOVA and their peripheral location in the PCA analysis of the gene matrix. Seven genes were experimentally validated by quantitative real time PCR (qRT-PCR) being the transcriptional patterns derived from the two methods highly similar in all cases. Differences in genes expression were analyzed according to the differential organ-specific cDNA library from which they were isolated. While differential leaf library sequences showed the majority of genes sub-regulated (most of them corresponding to photosynthesis or general metabolism related genes), R4 flower developmental stage and stem libraries showed a larger number of up-regulated genes. Considering that transcriptional changes in response to salt and cold stresses were evaluated in leaf tissue, these results confirmed the efficiency of SSH technique in the generation of the differential organ specific libraries and explained the large transcription change / transcription unchanged ratio detected in these assays. Within the 80 candidate a large number of evaluated sequences (48) were either up-regulated or sub-regulated under both abiotic stresses, thus supporting common regulatory mechanisms and general responses to low temperature and salinity. Interestingly 17 sequences were specifically up regulated and 12 were specifically sub-regulated in one stress but not in the other. These genes are potentially involved in different regulatory mechanisms including transcription / translation / protein degradation / protein folding or correspond to genes involved in ROS production or ROS-scavenging and some of them (12) did not show similarity to reported gene products. Only three of the evaluated sequences in this work showed an inverted transcriptional pattern under cold and salinity stress, including one with similarity to a LTP transcript. The information obtained from this EST library characterization not only contributed as a major source of knowledge about candidate genes involved in the mechanisms of abiotic stress responses in sunflower that can be incorporated in future complementary gene studies in model or sunflower transgenic plants but also allows the detection of new putative functional markers as a key tool for marker assisted selection in sunflower.

Fusari, Corina Mariana. "Mapeo por asociación en girasol: diversidad nucleotídica, desequilibrio de ligamiento e identificación de genes involucrados en la resistencia a la podredumbre húmeda del capítulo" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El mapeo por asociación es una herramienta poderosa que permite la identificación de loci cuya contribución explica parte de la variación fenotípica observada. En general, los marcadores utilizados en estos estudios son los Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms) y los indels (eventos de inserción, insertion/deletion). Los objetivos de este trabajo comprendieron el estudio de la diversidad nucleotídica y el alcance del desequilibrio de ligamiento (DL) en girasol cultivado, y el diseño de una estrategia de mapeo por asociación para la resistencia a la Podredumbre Húmeda del Capítulo (PHC), causada por Sclerotinia sclerotiorum. La frecuencia de SNPs (1/61) y la diversidad nucleotídica (θ=0,0067) se determinaron sobre un panel de 31 genes y 19 líneas endocriadas de girasol. La frecuencia de SNPs en conjunto con un alcance del DL hasta 100 kb (r2~0,1) permitieron diseñar un estudio de asociación a través de la estrategia de genotipificación de genes candidatos. Un total de 30 genes candidatos fueron seleccionados a partir de: (1) el análisis de los perfiles transcripcionales de un genotipo de Brassica napus resistente a S. sclerotiorum, (2) una colección de transcriptos de expresión diferencial de una línea de girasol moderadamente resistente desafiada con S. sclerotiorum y (3) genes descriptos en literatura como partícipes en los procesos de defensa frente a PHC. La elección, caracterización y genotipificación de genes candidatos implicó la generación de herramientas para la selección de los mismos y la optimización de técnicas de genotipificación de SNPs a gran escala. La detección de moléculas heterodúplex mediante: (1) corte con la enzima endonucleasa CEL1 (CEL1CH) y (2) cromatografía líquida de alto rendimiento en condiciones de desnaturalización parcial (dHPLC), demostraron ser técnicas robustas y versátiles para aumentar el número de loci e individuos a incluir en los estudios de mapeo por asociación. Un total de 16 genes se genotipificaron exitosamente en la población de mapeo por asociación constituida por 134 accesos del Banco Activo de Girasol de la Estación Experimental Agropecuaria (EEA) INTA Manfredi. El análisis estadístico de asociación incluyó el uso de modelos lineales mixtos que corrigieron los problemas de estructuración y las relaciones de parentesco entre los individuos de la población de mapeo. Un alelo del gen RhoBP_B exhibió una asociación estadísticamente significativa con una menor incidencia de PHC (pp<0,05). Los resultados obtenidos demuestran que es posible encontrar alelos útiles implicados en caracteres complejos a través de los estudios de mapeo por asociación en girasol.

Abstract:
Association mapping is a powerful tool to identify gene loci that may contribute to phenotypic variation. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions (indels) have become the markers of choice to conduct these studies. The aims of this thesis were to study nucleotide diversity and the extent of linkage disequilibrium (LD) in cultivated sunflower to conduct association mapping for the resistance to Sclerotinia Head Rot disease. SNP frequency and nucleotide diversity were assessed using a set of 31 genes and 19 sunflower inbred lines (1SNP/61 pb, θ=0.0067). The relatively high frequency of SNPs found here, along with the predicted extent of LD over distances of 100 kb (r2~0.1) allowed the development of an association mapping strategy through candidate gene approach. A total of 30 genes were selected based on: (1) a microarray analysis from Brassica napus genotypes resistant to S. sclerotiorum, (2) differentially expressed genes from cDNA libraries from sunflower infected tissues; (3) previous literature reports. Different methods of candidate gene selection and optimization of SNP genotyping technologies for scale-up throughput were explored. CEL1 cleavage of heteroduplex (CEL1CH) and denaturing high performance liquid chromatography (dHPLC) proved to be robust and versatile techniques to increase the amount of loci and individuals to be included in the association panel. Sixteen genes were successfully genotyped in the association population composed by 134 inbred lines from INTA Manfredi Sunflower Germplasm Bank. Mixed linear models accounting for population structure and kinship relatedness were used for the statistical analysis of associations. One candidate gene, RhoBP_B, had significant results from association analysis, indicating that it might affect the quantitave variation in sunflower resistance to Sclerotinia Head Rot disease. These results demonstrate the potential of candidate gene association mapping for complex trait dissection in sunflower.

Viale, Diego Luis. "Caracterización y desarrollo de promotores quimera que permitan la replicación viral específica en el entorno tumoral" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los tumores están compuestos de una masa heterogénea de células tumorales que incluyen células estromales asociadas que pueden convertirse en una barrera para la lograr una terapia exitosa contra la enfermedad. En los últimos años, los Adenovirus Replicativos Condicionales (CRAds) regulados por promotores recombinantes surgieron como una nueva modalidad de terapia para el cáncer. SPARC se encuentra expresada en forma muy elevada tanto en células tumorales como en endotelio y en los fibroblastos activados de tumores. A partir de estos datos, decidimos utilizar al promotor de SPARC para dirigir la replicación de los virus tanto en las células tumorales como en las células que forman parte del tumor. Logramos clonar un promotor que demostró mayor actividad en las células que expresan SPARC (F512) que se utilizó para dirigir la replicación de un CRAd (Ad-F512). Ad-F512 tiene efecto oncolítico en diferentes líneas celulares de melanoma y en ensayos in vivo se observó la eliminación de tumores SB2. Por el contrario, los tumores de melanoma A375N, Mel J y el tumor SB2/WI-38, que combina células de melanoma con fibroblastos, su efecto oncolítico es muy reducido. Para aumentar su eficacia adicionamos secuencias de ADN conteniendo elementos de respuesta a diferentes condiciones pato‐fisiológicas que caracterizan al tejido tumoral para aumentar la replicación. A partir de los resultados obtenidos, seleccionamos el promotor kBF512HRE conteniendo elementos de respuesta a hipoxia (HRE) y elementos de respuesta a NFkB (kB). Construimos el CRAd Ad-kBF512HRE que eliminó el tumor SB2/WI-38 en todos los ratones pero no se observa el mismo efecto sobre tumores Mel-Les y A375N. A partir de estos resultados se cambió la fibra adenoviral involucrada en el pegado al receptor celular y el virus resultante, Ad-5/3-kBF512HRE tiene efecto anti-tumoral sobre los tumores Mel-Les. Estos resultados indican que la adición de elementos de respuesta a condiciones que caracterizan al tejido tumoral y el cambio de la proteína involucrada en la unión al receptor celular aumentan el efecto terapéutico de un CRAd en las líneas celulares resistentes y, además, pueden sobrepasar la restricción en la replicación que implica la presencia de células estromales.

Abstract:
Human tumors are composed of a heterogeneous mass of malignant cells that also include tumor‐associated stromal cells that might become a barrier for successful therapies. In the last years, Conditionally Replicative Adenoviruses (CRAds) regulated by recombinant promoters appear as a new modality for cancer therapy. SPARC is over‐expressed in tumor cells and associated-endothelial and –fibroblast cells. Due to these results we utilized SPARC promoter for transcriptional regulation due to its overexpression on tumor melanoma cells and tumor associated stromal cells. We cloned a promoter that shows higher transcriptional activity in SPARC-expressing cells (F512) and we used to drive adenoviral replication (Ad-F512). This CRAd shows oncolytic activity in different melanoma cell lines and stromal cells and eliminated SB2 tumors in vivo, however, in A375N, Mel J and mixed tumor cell /fibroblast SB2/WI-38, its oncolytic effect was strongly reduced. In order to improve its efficacy we added DNA sequences containing responsive elements to different patho‐physiological conditions that characterize tumor tissue to increase its replication. Based on their activity/ specificity ratio we selected kBF512HRE, containing Hypoxia Response Elements (HRE) and NFkB response elements (kB). We constructed Ad-kBF512HRE and eliminated SB2/WI-38 tumor in all mice, on the other side, this effect was not observed on A375N and Mel-Les tumors. After this, we changed the adenoviral fiber, protein responsible of cellular receptor attachment. Ad-5/3-kBF512HRE eliminates 2/4 tumors of AdkBF512HRE-resistant Mel-Les tumors. These results indicate that addition of enhancer elements responsive to tumor-environmental conditions and fiber change improved the therapeutic effect of a CRAd over resistant cells and might overcome the restriction imposed by the presence of stromal cells.

Sarnacki, Sebastián Hernán. "Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente.

Abstract:
DNA adenine methyltransferase (Dam) enzyme is a global regulator of bacterial gene expression. In previous studies, Salmonella Typhimurium dam mutants have been proposed as excellent vaccines strains because of their characteristic of attenuation and protective capabilities. By extension, dam gene mutation has been proposed as a method for attenuating a variety of bacterial species. Given our interest in the study and prevention of infections with Salmonella Enteritidis, a serotype that most commonly causes enterocolitis in humans, we generate S. Enteritidis dam mutants by transposition and site-directed mutagenesis by replacement. Interestingly, studies in Balb/c mice showed that the S. Enteritidis dam mutants, are only moderate in their attenuation. Thirty percent (30%) of animals inoculated by the intragastric route with the mutant died within 3 weeks. Moreover, the protection of immunized animals challenge with the virulent strain of Salmonella Enteritidis # 5694, did not reach acceptable levels. Given the critical role that macrophages play in innate immunity against Salmonella, we analyzed the interaction between SEΔdam mutant and macrophage cell line RAW 264.7. By Western blot, we found that the expression of inflammatory molecules in macrophages infected with SEΔdam is attenuated. As activation of the inflammatory response of macrophages is generated in part by bacterial antigens, we wondered whether the lack of Dam might be affecting the structure or function of certain effector proteins or lipopolysaccharide (LPS) of Salmonella Enteritidis. Therefore, we studied the involvement of Dam on protein synthesis and secretion of two effector proteins both dependent on type 3 secretion systems. To this purpose, we constructed and characterized Salmonella dam mutants carrying sopA and sopB genes tagged with the FLAG epitope. The results showed that the dam mutant has a reduced expression and secretion of SopA and SopB invasion proteins, which are Salmonella pathogenicity island (SPI-1)-dependent. This finding indicates that Dam methylation is involved in the regulation of the synthesis and secretion of SopA and SopB proteins in Salmonella as an upregulator of these genes. We also investigated the involvement of the Dam enzyme in S. Enteritidis LPS synthesis. We found that compared to the parental strain, a SEΔdam mutant synthesized LPS with shorter O-antigen polysaccharide chain lengths. Since Wzz is responsible for the chain length distribution of O-antigen, we investigated whether Dam methylation is involved in regulating wzz gene expression. Densitometric analysis of Western blot with samples of protein extracts showed that the relative amount of Wzz protein produced by SEΔdam is three-fold lower than that of the parental strain. Concomitantly, wzz gene promoter activity in SEΔdam was reduced, as measured by chromosomal transcriptional fusion with a reporter gene, and this result was further confirmed by the amount of mRNA as measured by RT-PCR quantitative real-time analysis. Also, the expression of pmrA and rcsB genes (two wzz gene regulators) in the dam mutant was reduced. However, the defect in the chain length distribution of O-antigen of the SEΔdam, was associated only with RcsB. Our results show that Dam methylation regulates the LPS synthesis of Salmonella. Overall, these results indicate that Dam methylation in Salmonella regulates functions related intimately to the host-bacteria interaction. Therefore, the dam gene deletion as a method of attenuation of vaccine strains must be analyzed critically.

Lucca, A. María Florencia. "Búsqueda de genes candidatos que controlen QTLs involucrados en la resistencia al estrés hídrico mediante el análisis de perfiles transcripcionales en especies silvestres de Solanum" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La papa (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) es el tercer cultivo más importante y la dicotiledónea de mayor importancia en la alimentación. El estrés hídrico es la mayor limitante de la producción. En respuesta a la sequía las plantas activan estrategias que involucran adaptaciones morfológicas, fisiológicas y bioquímicas controladas por un número de genes aditivos y en muchas ocasiones sinérgicos. Esta tesis se focalizó en el análisis de los cambios transcripcionales de las especies silvestres de Solanum: S. venturii (VNT) y S. cardiophyllum (CPH) que presentan comportamientos contrastantes frente al estrés hídrico mediante hibridación con micromatrices de ADNc. Se analizaron 1.033.250 datos de expresión de 32 soportes de cristal de papa, que monitorearon 10 días de evolución del estrés. El análisis bioinformático de los datos de expresión de estas especies arrojó diferencias significativas en los perfiles transcripcionales. El análisis comparativo de estos perfiles reveló que en CPH se ven afectados por el tratamiento de sequía un total de 235 genes, mientras que en VNT la diferenciación involucra 4133 genes. Ambas especies presentan una expresión de 151 genes comunes. Los genes expresados diferencialmente no solo variaron en el número sino también en sus perfiles temporales de expresión. Los genes diferencialmente expresados como respuesta al tratamiento tendieron a agruparse mostrando comportamientos particulares en ambas especies. En CPH, los perfiles de expresión permitieron identificar al menos 5 conglomerados que resumen las principales tendencias del comportamiento de los transcriptos frente al estrés, mientras que en VNT la dinámica de expresión mostró expresiones contrastantes y agrupadas, que sugieren una regulación común sincrónica, confirmando la diversidad genética de respuestas en el germoplasma de especies silvestres de papa. Estas diferencias de expresión entre las especies silvestres de papa sugieren nuevas vías para explotar la variabilidad genética del germoplasma silvestre para el mejoramiento del cultivo. La información generada brinda interesantes genes candidatos involucrados en respuesta al estrés hídrico a la vez que permite identificar secuencias para el desarrollo de marcadores funcionales útiles en programas de mejoramiento asistido.

Abstract:
The potato is the third most important crop and the most relevance dicot in feeding. Water stress is the greatest limitation of production. In response to drought, plant triggers strategies that involve morphological, physiological and biochemical changes controlled by a number of additive genes and often synergistic. This Thesis focused on the analysis of transcriptional profiling on Solanum wild species: S. venturii (VNT) and S. cardiophyllum (CPH) that present contrasting behavior under water stress using cDNA microarray hybridizations. We analyzed 1,033,250 expression data of 32 potato chips, which monitored 10 days of stress treatment. Bioinformatic analysis of expression data of wild species showed significant differences in transcriptional profiles. The comparative analysis of these profiles revealed that CPH differentially expressed under drought 235 genes, while VNT involves 4133 differentially genes. Both species have a common expression of 151 genes. Differentially expressed genes vary not only in number but also in their temporal expression profiles. The genes differentially expressed in response to stress tended to cluster following a particular behaviors in both species. In CPH, the expression profiles helped to identify at least 5 clusters that summarize the main trends of behavior of the transcripts under stress, while the dynamics of expression in VNT showed contrasting clustered patterns, suggesting a common regulation synchronously, confirming the genetic diversity of wild potato species responses. These differences in expression between wild potato species suggest new ways to exploit the genetic variability of wild germplasm for crop breeding. The information generated provides interesting candidate genes involved in response to water stress as well as to identify sequences for the development of useful functional Marker Aided Selection (MAS) in Plant Breeding programs.

Robaldo, Laura. "Síntesis, caracterización y aplicaciones de dnazimas modificadas con 2´-desoxi-2´-c-metilnucleósidos" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las enzimas de ADN (DNAzimas) son moléculas catalíticas formadas por una cadena simple de desoxirribonucleótidos. Estas moléculas no se encontraron en la naturaleza sino que fueron obtenidas a través de procesos de selección molecular in vitro. En particular, la DNAzima 10-23 es una enzima de ADN que fue descripta por Santoro y Joyce en 1997. Es la más utilizada en estudios de silenciamiento génico en sistemas biológicos debido a su capacidad de reconocer, unirse e hidrolizar una molécula de ARNm. Su secuencia se compone de un núcleo catalítico conservado de 15 desoxirribonucleótidos y dos brazos de reconocimiento a ambos lados del núcleo. Luego de unirse por complementariedad de bases, la DNAzima 10-23 puede hidrolizar al ARNm blanco entre una purina desapareada (A, G) y una pirimidina apareada (U, C) en presencia de Mg2+. La estabilidad de una DNAzima se puede mejorar mediante la incorporación de nucleósidos modificados tanto en el núcleo catalítico como en los brazos de reconocimiento. Estas modificaciones pueden aumentar la estabilidad y prolongar la vida media de la DNAzima en sistemas biológicos. Por otro lado, el uso de modificaciones químicas permite estudiar y resolver interrogantes respecto a la relación entre la estructura y la función de estas moléculas. Esta tesis consiste en la síntesis y caracterización de DNAzimas modificadas en el núcleo catalítico con (2'R) y (2'S)-2'-desoxi-2'-C-metilnucleósidos. Estos nucleósidos presentan una restricción de la conformación del anillo furanósico dependiendo de la configuración del carbono 2 ́. Por otra parte, al incluir estas modificaciones en secuencias de oligonucleótidos, se ve aumentada la estabilidad ante la degradación por nucleasas. El objetivo principal fue obtener DNAzimas resistentes a la degradación nucleolítica que pudieran ser útiles en la inhibición de la expresión de ARNms terapéuticos. Por otra parte, se analizaron las consecuencias funcionales y estructurales generadas por la incorporación de estas modificaciones a la estructura de la DNAzima 10-23. Los resultados obtenidos muestran que las modificaciones (2'R) y (2'S)-2'-desoxi-2'-C- metilnucleósidos pueden ser estratégicamente introducidas en diferentes posiciones del núcleo catalítico de la DNAzima 10-23 sin observarse una pérdida significativa de la actividad. También se observó que estas modificaciones aumentan la vida media de las DNAzimas en diferentes sistemas biológicos. En base a estos resultados, podemos concluir que las DNAzimas sintetizadas en este trabajo podrían ser útiles como molécula antisentido en la inhibición de la expresión de ARNms terapéuticos.

Abstract:
DNA enzymes (DNAzymes) are catalytic molecules composed of a single strand of deoxyribonucleotides. They are unnatural sequences that were discovered through molecular in vitro selection processes. The 10 23 DNAzyme is a specific DNA enzyme that was described by Santoro and Joyce in 1997. It is the most commonly used in biological studies of gene silencing because it shows the ability to recognize, bind and then cleave RNA. The 10 23 DNAzyme sequence is composed of a conserved catalytic domain of 15 deoxyribonucleotides and two substrate recognition arms on both sides. It can cleave any RNA substrate between an unpaired purine (A, G) and a paired pyrimidine (U, C) in presence of Mg2+. DNAzyme stability may be improved by employing chemically modified nucleotides at either the core or the flanking regions. The modifications can increase the stability of the macromolecule and extend DNAzyme half life in biological systems. On the other hand, the inclusion of modifications could also solve questions related to structure function relationships of these molecules. This thesis involves the synthesis and characterization of modified 10-23 DNAzymes in the catalytic core with (2 R) and (2 S)-2 -deoxy-2 -C-methylnucleosides. These nucleosides show differential preferred sugar conformation depending on the configuration of the 2 ́-carbon. The inclusion of these modifications into oligonucleotides sequences increases the stability to nuclease degradation. The main objective was to obtain active modified DNAzymes with increased resistance to nucleolitic degradation and could therefore be useful for targeting interesting mRNA. On the other hand, the functional and structural implications of the introduction of these restricted modifications in the catalytic core of the 10-23 DNAzyme were also studied. The results presented herein show that (2 R) and (2 S)-2 -deoxy-2 -C- methylnucleosides can be strategically introduced in different positions of the catalytic core without significant loss of activity. They also show that these modifications enhance the half life of modified DNAzymes in different biological systems. For these reasons we concluded that the modified DNAzymes synthesized in this work could potentially be used as resistant antisense molecules against therapeutics mRNA targets.

Defays, Raquel. "Base genética de la respuesta a diferentes agentes de estrés ambiental y de la longevidad en el organismo modelo Drosophila" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La expectativa de vida de una especie puede evolucionar a través de los genes que están involucrados en la reparación del soma, tales como los sistemas de la respuesta al estrés, según lo propone la teoría del soma desechable o genes con mutaciones perjudiciales o deletéreas de efecto tardío. En los ambientes naturales, los organismos frecuentemente soportan condiciones de estrés por falta de alimento y por baja temperatura. Como la energía ocupa un rol central en la vida de los organismos, mejorar la resistencia al estrés involucra cambios fenotípicos a diferentes niveles, desde señalización intracelular hasta caracteres de historia de vida. La resistencia al hambre severo se define como el tiempo de sobrevida a la privación total de alimento y sus valores fenotípicos rondan entre 20 a 200 horas en esa condición. La resistencia al estrés por baja temperatura es un carácter ecológicamente relevante que puede regular el nivel de actividad bajo condiciones de frío en la naturaleza. Este carácter adaptativo puede tener múltiples correlatos a nivel de otros caracteres de historia de vida. En la presente tesis con el objetivo general de elucidar la base genética y molecular que relaciona el proceso de envejecimiento, y los mecanismos de la respuesta al estrés ambiental, se estudiaron caracteres de historia de vida como la longevidad, la resistencia a la falta de alimento y al frío y la relación entre ellos mediante dos metodologías: mapeo de QTL y utilización de isolíneas en los organismos modelo Drosophila melanogaster y D. buzzatii, respectivamente. Se estudió la longevidad a 25°C en condiciones de control como así también luego de un pre-tratamiento de estrés por calor en líneas recombinantes endogámicas (RIL) de D. melanogaster. También se estudió la resistencia a la inanición o al hambre (RH) en adultos y pre-adultos mediante un mapeo por intervalo compuesto sobre líneas RIL de D. melanogaster. Todos estos caracteres resultaron variables en las RIL analizadas. Se identificaron varios QTL que mapean sobre los tres cromosomas mayores de Drosophila melanogaster que explican gran parte de la variabilidad en la longevidad. El tratamiento de calor redujo el número de QTL significativos, encontrando solo dos QTL para la longevidad (rangos 3C1-4F2 y 38E1-42A) en esta condición. Estos QTL, serían QTL generales de la longevidad más bien que QTL específicos de una condición. Con respecto a la resistencia al hambre, encontramos QTL que explican la variabilidad de la RH tanto en adultos como en pre-adultos. Una región de QTL, 16F3-19F6, resultó significativa tanto en machos como en hembras adultas y en el estadio pre-adulto. Se observó una correlación positiva en machos entre la longevidad de moscas tratadas y la RH de adultos, en uno de los paneles de RIL. A su vez, las regiones 16F3-19F6, 42A- 49C y 67A-86E3 corresponden a QTL que colocalización entre el estudio de mapeo de la longevidad y de la RH. Esta colocalización entre caracteres está en concordancia con la teoría del soma desechable. Con un abordaje diferente, la utilización de isolíneas de D. buzzatii se estudió la variabilidad de caracteres de historia de vida y sus posibles correlaciones, se continuó con el estudio de la base genética de la respuesta al estrés y la senescencia. Para ello se midió la longevidad a 25ºC, la resistencia al hambre (RH), la resistencia a la desecación (RD) y dos caracteres de resistencia al frío (RF). Todos los caracteres resultaron variables en las isolíneas de D. buzzatii, con una varianza entre líneas varía desde un 14% hasta un 38 a través de los diferentes caracteres medidos. Se encontró una correlación positiva entre la RH y la RF, sin embargo no comprobamos una correlación entre la RH y la longevidad o la RD. Las isolíneas mostraron una clara correlación positiva entre estos dos caracteres (RH y RF), en contraposición a la hipótesis del tradeoff planteada por Hoffmann et al (2005). También encontramos una correlación positiva entre la longevidad y RD y RF. Las correlaciones positivas entre los diferentes tipos de caracteres estudiados y también con la longevidad están en concordancia con la teoría del soma desechable, que propone justamente que las respuestas a los diversos tipos de estresores y la longevidad pueden evolucionar a través de los mismos genes. De acuerdo a esta teoría, los individuos que soporten mejor el estrés ambiental serán a la vez los más longevos.

Abstract:
Life span of different species can evolve through genes that are involved in soma reparation, such as stress response systems as proposed by the disposable soma theory and also through genes with harmful or deleterious late effect mutations. In nature organisms often support r stress condition as lack of food and low temperature. Energy plays a central role in organisms life, increased resistance to stress involves phenotypic changes at different levels, from intracellular signaling to life history characters. Starvation resistance is defined as the survival time in conditions of total food deprivation and its phenotypic values are between 20 to 200 hours in that condition. The resistance to low temperature is an ecologically relevant character that can regulate the insect activity level under cold conditions in nature. Adaptive characters are expected to be correlated to other life history characters. The aim of my thesis is to investigate the genetic basis that links aging with mechanisms of response to environmental stress. For this purpose we studied life history characters such as longevity, starvation and cold resistance and the relationship between characters following two different methodologies: QTL mapping and isofemales lines in the model organisms D. melanogaster and D. buzzatii, respectively. Longevity was measured at 25 °C under controlled conditions and also after a pre-treatment of heat stress on a set recombinant inbred lines (RIL) of D. melanogaster. The starvation resistance (SR) phenotypes of pre-adults and adults were used in a composite interval mapping of RIL lines of D. melanogaster. We identified several QTL that map on the three major chromosomes of Drosophila melanogaster that explain part of the variance in longevity. The heat treatment reduced the number of significant QTL, finding only two QTL for longevity (3C1-4F2 and 38E1-42A ranges) for this condition. These QTL, would be general longevity-QTL rather than specific of a condition. We found QTL that explain the variance of RH both in pre-adults and adults individuals. The QTL region, 16F3-19F6, was significant in both adult (males and females) and in the pre-adult stage of the life cycle. There was a positive correlation between longevity in treated male flies and adults-SR, in a RIL panels. In turn, 16F3- 19F6, 42A-49C and 67A-86E3 regions correspond to QTL that colocalized between both characters mapped, longevity and SR. This colocalization between characters is consistent with the disposable soma theory. With a different approach, using isofemales lines of D. buzzatii, we continued studying the genetic basis of stress response and senescence. In this way, we analyzed the variability of life history characters and their putative correlations, measuring longevity at 25 °C, starvation resistance (SR), desiccation resistance (DR) and two coldresistance traits (RF). All characters were variable in the isofemales lines of D. buzzatii, with a variance component between lines from 14% to 38 through the different characters measured. We found a positive correlation between SR and RF, but we found no correlation between SR and longevity or DR. The isofemales lines show a clear positive correlation between these two characters, as opposed to the trade-off hypothesis proposed by Hoffmann et al 2005.We also found a positive correlation between longevity and RD and also between longevity and RF. The positive correlations between the different characters studied and longevity are also consistent with the disposable soma theory, which proposes that the response to different kind of stressors and longevity could evolve through the same genes. According to this theory, individuals with enhanced environmental stress-resistance will be also the longer-lived.

Lentz, Ezequiel Matías. "Producción de antígenos y anticuerpos de interés veterinario en plantas transplastómicas de tabaco" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta Tesis Doctoral, se evaluó la factibilidad de utilizar plantas transplastómicas de tabaco (Nicotiana tabacum) para la producción de proteínas de interés en medicina veterinaria: dos antígenos virales y un anticuerpo de camélido de cadena simple (VHH). La primera proteína producida en este sistema consistió en una fusión entre un epítope inmunogénico de la proteina VP1 del virus de la fiebre aftosa y la enzima β-glucuronidasa (VP-βGUS). Se generaron plantas transplastómicas, las cuales fueron caracterizadas a nivel molecular. La proteína heteróloga se acumuló de un modo importante en los cloroplastos de las plantas transformadas: hasta el 51% de las proteínas solubles totales (PST) (8 mg/g de tejido fresco ), conservando su actividad enzimática e inmunogenicidad. Los niveles de expresión observados resultaron claramente mayores a los obtenidos previamente en plantas transgénicas nucleares utilizando la misma construcción. A pesar de estos altos niveles de expresión, el fenotipo de las plantas transplastómicas resultó ser indistinguible del de las plantas wild-type. Esta prueba de concepto con resultados alentadores nos permitió avanzar en la producción de otras moléculas mediante este sistema. El segundo antígeno expresado fue VP8*, una proteína no glicosilada de la cápside de rotavirus bovino (RVB). Se utilizó una versión del vector que permite la acumulación de VP8* en el estroma y se generaron dos construcciones adicionales, una para expresarla como una fusión a la β-glucuronidasa (GUS-E-VP8*), y otra para dirigirla al lúmen de los tilacoides (str- VP8*). VP8* se acumuló como agregados insolubles en el estroma de los cloroplastos y pudo ser solubilizada parcialmente por sonicación. Se obtuvieron extractos de VP8* utilizando la fracción soluble, donde VP8* representaba el 4% de las PST (250 μg/g TF). Al extraerse VP8* a partir de la fracción insoluble sin incluir el paso de sonicación, fue posible enriquecer la preparación en la proteína recombinante, eliminar la nicotina, y mejorar el rendimiento al obtenerse 500 μg/g TF. La proteína VP8* obtenida a partir de ambas fracciones resultó ser inmunogénica y protectiva contra el virus en el modelo del ratón lactante. Las estrategias alternativas para la expresión de VP8* no fueron exitosas. GUS-E-VP8* se acumuló como una proteína soluble en el estroma del cloroplasto, pero en niveles significativamente menores que VP8*. La construcción str-VP8* permitió la translocación de VP8* al lúmen de los tilacoides, pero se observó una proteólisis no esperada de la proteína, y la presencia de una forma truncada de la misma. Estos resultados sugieren que la acumulación de VP8* en el estroma del cloroplasto es favorecida por su insolubilidad, que la protegería del ataque proteolítico. La tercera molécula expresada fue el VHH clon 3B2 dirigido contra un epítope conformacional de la proteína VP6 de RVB. Para la expresión de este nanoanticuerpo también se evaluaron tres estrategias: expresión de VHH en el estroma, redirección al lúmen de los tilacoides (pep- VHH) y fusión a la enzima β-glucuronidasa (GUS-E-VHH). Todas las líneas de plantas transplastómicas expresando VHH mostraron un fenotipo heteroplástico. El análisis molecular confirmó la heteroplastía en líneas que habían sido regeneradas en medio selectivo al menos tres veces. La proteína VHH se acumuló en niveles bajos, los cuales se acercaban al límite de la detección por la técnica de western blot. La expresión se mejoró significativamente tanto en las plantas pep-VHH (2,5% de las PST; 60 μg/g TF) como en las GUS-E-VHH (3% de las PST; 70 μg/g TF), aunque en este último caso se observaron productos de degradación. Las plantas pep-VHH homoplásticas tenían un fenotipo clorótico que se intensificaba con la mayor iluminación. Los resultados obtenidos muestran la dificultad de expresar este VHH en cloroplastos y sugieren un efecto tóxico del transgén. La redirección al lúmen de los tilacoides favorecería la estabilidad de esta proteína heteróloga, lo cual es consistente con su expresión exitosa en E. coli cuando se expresa en el periplasma bacteriano. Los resultados presentados en este trabajo aportan evidencias que promueven el uso y optimización de plantas transplastómicas como biorreactores, para llegar a ser alternativas rentables y concretas de uso en la industria.

Abstract:
In this PhD Thesis, we evaluated the feasibility of using transplastomic plants (Nicotiana tabacum) for the production of proteins of interest in veterinary medicine: two viral antigens and a camelid single-chain antibody (VHH). The first protein produced in this system was a translational fusion of an immunogenic peptide from VP1 of foot-and-mouth disease virus and the enzime β-glucuronidase (VP-βGUS). Transplastomic plants engineered to express the aforementioned construction were characterized at the molecular level. The heterologous protein accumulated up to 51% of the total soluble leaf protein (TSP), or 8 mg/g of fresh tissue (FT), while retaining its enzymatic activity and immunogenicity. The observed expression levels were clearly higher than those obtained previously in nuclear transgenic plants, using the same construction. Despite these high levels of expression, the phenotype of the transplastomic plants was indistinguishable from that of wild-type plants. This proof of concept with encouraging results, allowed us to continue evaluating this system for the production of other recombinant proteins. The second antigen expressed was VP8*, a non-glycosilated capside protein from bovine rotavirus (BRV). Two additional constructions were used to express it in the chloroplast stroma as a β-glucuronidase fusion (GUS-E-VP8*), and to accumulate it in the thylakoid lumen (str- VP8*). VP8* formed insoluble aggregates in the stroma and was partially solubilized by sonication. In the soluble extracts obtained from VP8* transplastomic plants, the recombinant protein represented 4% of the TSP (250 μg/g FT). The insoluble fraction from these plants was highly enriched in VP8*, devoid of nicotine, and contained 500 μg/g FT. The protein from both fractions was immunogenic and conferred protection against the virus in the suckling mouse model. The alternative strategies for VP8* expression were unsuccessful. GUS-E-VP8* accumulated as a soluble protein at barely detectable levels. The construction str-VP8* allowed translocation of VP8* into the thylakoid lumen, but the protein was processed in an unexpected manner. These results suggest that VP8* accumulation in the chloroplast stroma is boosted by its insolubility, which would protect the recombinant protein from proteolytic attack and degradation. The third molecule expressed was the VHH clone 3B2 directed against a conformational epitope of the VP6, an inner capsid protein of BVR. This nanobody was expressed using three strategies: accumulation in the stroma by itself (VHH) or as a fusion to the β-glucuronidase (GUS-E-VHH), and translocation into the thylakoid lumen (pep-VHH). All the transplastomic lines expressing the single-chain antibody presented an heteroplastic phenotype. Southern blot analysis confirmed the heteroplasmy of these plants. In VHH transplastomic plants the protein accumulated at very low levels, almost undetectable by western blot. Expression levels were improved in both pep-VHH (2,5% of TSP; 60 μg/g TF) and GUS-E-VHH plants (3 % of TSP; 70 μg/g TF), but in the latter case degradation products were observed. Homoplastic pep-VHH plants had a chlorotic phenotype, which was more intense when the plants were grown with higher illumination. These results show the difficulty of expressing this VHH in chloroplasts and suggest a toxic effect of the transgen on the plant. The redirection to the lumen of thylakoids favors the stability of the heterologous protein, which is consistent with its successful expression in E. coli when it is directed to the bacterial periplasm. The results presented in this work support the use and optimization of transplastomic plants as biorreactors, in order to become concrete industrial alternatives.

Benedetti, Lorena Gabriela. "Rol de la proteína de matriz extracelular SPARC en el crecimiento y diseminación metastásica del cáncer de mama" (2011-12-21) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El crecimiento tumoral resulta de la interacción de la célula neoplásica y su entorno. SPARC “Secreted Protein Acid and Rich in Cystein” es una proteína de matriz extracelular cuya expresión normal se asocia al desarrollo y a tejidos en remodelación. En la mayoría de las neoplasias el aumento de la expresión de SPARC se asocia con un mal pronóstico. Sin embargo, en cáncer de mama la función que cumple la expresión de esta proteína en relación al crecimiento del tumor primario y la diseminación metastásica es controvertida. En este trabajo nos propusimos profundizar las funciones de SPARC, proveniente tanto del estroma como de las células epiteliales en la biología del cáncer de mama. A partir de los estudios realizados con animales transgénicos (SP-/-) que no expresan SPARC en ninguna de sus células, diferentesmodelos de cáncer de mama humanos con distintos niveles de expresión de SPARC, y la cuantificación de la expresión de la proteína en muestras de pacientes con cáncer de mama, determinamos que la expresión de SPARC en ambos componentes tumorales, epitelio y estroma, favorece el fenotipo maligno. Mientras que la elevada expresión en el epitelio tumoral resultó ser más relevante, encontramos que la expresión de SPARC en el estroma tumoral favorece el crecimiento del tumor sólo si el epitelio es negativo. Por otro lado, mediante la utilización del modelo murino 4T1, representativo de un tumor humano estadio IV, pudimos establecer una relación positiva entre la expresión de SPARC y la etapa metastásica de la enfermedad. A partir de la tecnología de microarreglos de ADN, encontramos que SPARC es un importante modulador transcripcional del espacio extracelular y de la proliferación celular, así como también de la respuesta inmune. Finalmente identificamosalgunos genes como posibles efectores de SPARC, favorecedores del crecimiento tumoral y la diseminación metastásica.

Abstract:
Tumor growth is the result of the crosstalkbetween neoplastic cells and theirmicroenvironment.SPARC “Secreted Protein Acid and Rich in Cystein” is a matricellular protein whose normal expression is associated with remodeling tissues. Despite some authors describe this protein as a marker of bad prognosis, its role during development and breast cancer progression remains controversial.Our goal was to understand the role of SPARC expressed either by the epithelial cells or by the surrounding stroma in tumor growth and metastatic dissemination of breast cancer. Using SPARC KO mice (SP-/-), human breast cancer lines with different SPARC expression levels, and the quantification of SPARC expression in human breast cancer samples, we were able to determine that both, epithelial and stromal SPARC contributes to tumor progression. While high epithelial SPARC expressionis more relevant, stromal SPARC only facilitates tumor growth in the presence of a SPARC negative epithelium. Moreover, using 4T1 murine model that very closely models a stage IV human breast carcinoma, we established a positive relation between SPARC expression and the metastatic stage of the disease. DNA microarray data revealed SPARC as an important transcriptional regulator of the extracellular region part, cellular proliferation and an immune response modulator. We identified some new genes as possible effectors of SPARC that regulate tumor growth and metastatic dissemination.

Robredo, Claudio Gabriel. "Caracterización de un segmento del cromosoma seis de una línea de maíz portadora de un Sistema de Letales Balanceados (BLS)" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La línea BLS1A posee un sistema de letales balanceados localizado en las cercanías del centrómero del cromosoma 6 de maíz formado por un gen letal clorofílico estrechamente ligado en fase de repulsión con un gen letal gamético. Los objetivos de esta tesis fueron los de caracterizar agronómica y molecularmente el segmento cromosómico balanceado de la línea de maíz BLS1A. Los resultados de ensayos a campo mostraron diferencias estadísticamente significativas entre BLS1A y algunos de sus recombinantes. La línea BLS1A mantuvo su vigor a pesar de los años de endocría. La caracterización genética a nivel molecular se realizó a través de la búsqueda de polimorfismos con marcadores moleculares de RAPD, RFLP, STS, AFLP y Microsatélites. Se analizaron más de 13200 loci génicos en todo el genoma de las líneas. Cinco microsatélites resultaron polimórficos para en el segmento y se lograron clonar y secuenciar siete bandas de RAPD y AFLP que mapearon en la región cromosómica en estudio. Las técnicas moleculares permitieron demostrar la alta homocigosis de la línea BLS1A, por fuera del segmento balanceado, luego de más de 25 años de endocría Del resultado de algunos de los ensayos de rendimiento de híbridos se observó que las líneas Rec 9 y Rec 10 que perdieron los letales, debido a la recombinación, parecerían corresponderse a los “homocigotas” de cada uno de los brazos del segmento balanceado original. La línea BLS1A como sus Recombinantes presentan buena aptitud combinatoria con las líneas públicas Mo17 y B73 representativas de los 2 grupos heteróticos más importantes en la producción de híbridos comerciales.

Abstract:
BLS1A maize line has a Balanced Lethal System located near the centromeric region of chromosome 6, formed by a chlorophyll lethal gene closely linked in repulsion phase with a gametic lethal gene. The objective of this tesis was to characterize agronomic and at the molecular level the Balanced Lethal System of BLS1A corn line. The results of field trials showed statistically significant differentces between BLS1A and some of their Recominant lines. BLS1A remained strong vigor despite the 25 years of inbreeding. Genetic caracterización was performed at the molecular level by searching for polymorphisms with RAPD, RFLP, STS,AFLP and microsatellites molecular markers. More than 13,200 gene loci were analized across the lines genome. Five microsatellites were polymorfic for the segment and seven RAPS and AFLP bands, that mapped in the chromosomal region under study. The molecular markers allow to demostrate the high hozygosity of the BLS1A, outside the balanced system, after more than 25 years of inbreeding. At the field yield trials of hybrids was observed that the lines Rec 9 and Rec 10, that lost the lethal ones due to the recombination, would seem to correspond to the "homozigous" of each arms of the original balanced lethal system. The BLS1A as its Recombinants present good (ac) with the public lines Mo17 and B73 representative of the 2 more important heterótic groups in the production of commercial hybrids

Bello Gay, Estefanía Pilar. "Estudio funcional del receptor dopaminérgico D2 en el sistema nervioso central mediante el uso de ratones mutantes inducibles" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Liberaciones subóptimas o excesivas de dopamina son rasgos característicos de varias patologías muy frecuentes que incluyen a la enfermedad de Parkinson, esquizofrenia, desorden de déficit atencional e hiperactividad (ADHD) y autoadministración compulsiva de drogas de abuso. En este trabajo se estudió el rol del D2R mediante la generación de ratones mutantes condicionales. En primer lugar, generamos ratones deficientes de D2R en las neuronas dopaminérgicas (autorreceptores). Estos ratones tienen la síntesis y liberación de dopamina aumentada, son hiperactivos e hipersensibles a los efectos psicomotores de la cocaína, y tienen mayor motivación para trabajar por la comida. En segundo lugar, estudiamos los efectos de la pérdida de D2Rs en animales adultos que se habían desarrollado normalmente en comparación con ratones deficientes en D2Rs constitutivos que desarrollan programas compensatorios tempranos. La abrupta remoción de los D2R en la adultez provocó una marcada disminución de la locomoción, problemas severos en el aprendizaje y la coordinación de rutinas motoras. En algunos casos, se observó rigidez y temblor en los animales en reposo con características de parkinsonismo. Los resultados obtenidos, demostraron la importancia de la estricta regulación mediada por los D2R (pre y postsinápticos) en el control de la actividad locomotora, la sensibilidad a drogas de abuso y el estado motivacional de los animales.

Abstract:
Suboptimal or excessive dopamine (DA) release are characteristic of a number of very common diseases, including Parkinson's disease, schizophrenia, attention deficit disorder with hyperactivity (ADHD) and compulsive self-administration of drugs of abuse. In this paper, we study the role of D2R by generating mutant mice. First, we generated mice lacking D2R in dopaminergic neurons (autoreceptors). These mice have increased dopamine synthesis and release, are hyperactive and hypersensitive to the psychomotor effects of cocaine, and show enhanced motivation to work for food. Second, we generated a model that allows us to eliminate D2R of adult animals normally developed. The abrupt removal of the D2R in adulthood causes a marked decrease in locomotion, severe learning problems and motor coordination routines. In some cases, it can induce rigidity and tremor at rest. These results demonstrate the importance of the strict regulation mediated by the D2R (pre and postsynaptic) in the control of locomotor activity, sensitivity to drugs of abuse and particularly in the motivational state of animals.

Ricardi, Martiniano María. "La proteína ASR1 de tomate. Aspectos estructurales y funcionales. Búsqueda de sus genes blanco" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas ASR, exclusivas del reino vegetal, se encuentran relacionadas con la respuesta al estrés por falta de agua y otros estreses. ASR1 tiene funciones de chaperona y factor de transcripción. Esta función dual de ASR1 se condice con su presencia en extractos citosólicos y nucleares. Hemos corroborado in planta esta localización dual y demostrando que la misma ocurre por difusión y no mediante transporte activo. Además demostramos que dicha proteína puede homodimerizar en el citosol y se encuentra como dímero en el núcleo. Por otra parte, hemos adaptado exitosamente una metodología de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) para tomate. Este protocolo fue utilizado para realizar un ChIP “semi-nativo” y detectar marcas de histonas relacionadas a represión y activación de genes en todo el genoma de tomate a lo largo de diferentes estadíos de maduración del fruto. Además, experimentos de ChIP sobre hojas de plantas de tomate estresadas, usando un anticuerpo anti-ASR1, mostraron que la mayoría de las regiones genómicas se ubicaron cerca de genes. Los grupos de genes hallados, y por lo tanto posiblemente regulados por ASR1, están relacionados a la síntesis y remodelación de la pared celular, y al transporte de agua y solutos. Finalmente, encontramos una robusta secuencia de ADN consenso de "binding" para ASR1.

Abstract:
ASR proteins, exclusive to the plant kingdom, are related to water stress and other abiotic stresses. ASR1 has chaperone and transcription factor functions. This dual function is correlated with a dual nuclear/cytosolic subcellular localization, demonstrated to be due to diffusion rather than active transport. Additionally, we observed homodimerization in cytosol and homodimers in the nucleus. We have also successfully adapted a chromatin immunoprecipitation protocol (ChIP) for tomato. This protocol was used to perform semi-native ChIP for detection of repressive and activating histone modifications genome wide at different fruit maturation stages. In addition, ChIP assays on leaves from stressed tomato plants, performed with an anti-ASR1 antibody, showed that most of the enriched genomic regions were located near genes. The gene groups found, and hence probably regulated by ASR1, were related to cell wall synthesis and remodeling, and water and solute transport. Finally, we were able to find a robust consensus ASR1-binding DNA sequence.

Gómez, Maximiliano. "Desarrollo de caña de azúcar transgénica resistente al Sugarcane mosaic virus (SCMV) y al Sorghum mosaic virus (SrMV) por silenciamiento génico" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El desarrollo de plantas transgénicas que explotan el mecanismo de silenciamiento génico contra los virus causales del mosaico (SCMV y SrMV) representa una interesante estrategia alternativa a los métodos de mejoramiento genético clásico. Sin embargo hasta el momento dichas estrategias han sido implementadas en base al conocimiento de unas pocas secuencias virales, lo que incrementa la posibilidad de que la resistencia sea quebrada por variantes poco frecuentes del virus. Se desarrolló un protocolo simple, rápido y económico diseñado para obtener secuencias virales a partir de un gran número de hojas de caña sintomáticas. Utilizando dicho protocolo se analizó la estructura poblacional de los virus causales del mosaico de la caña de azúcar en la Argentina y las áreas cañeras limítrofes de Bolivia, Uruguay y Paraguay, incluyendo 103 sitios de muestreo. Se analizaron 567 muestras sintomáticas por RT-PCR (pertenecientes a 104 genotipos de caña de azúcar) amplificando un fragmento del gen de la proteína de cápside del SCMV y del SrMV con iniciadores reportados en la literatura. Los productos de amplificación fueron secuenciados directamente. El análisis de las secuencias virales determinó que el principal agente causal de mosaico en la región es el SCMV, presente en 94% de las muestras. El SrMV estaba presente en solo 2,8% de las muestras, con bajos porcentajes de coinfección de los dos virus (0,5%). Las secuencias fueron analizadas filogenéticamente y clasificadas en cuatro grupos virales utilizando un valor de corte de 0,91 de identidad de secuencia, con un nuevo grupo viral (W) propuesto dentro de la clasificación del SCMV reportada en la literatura. Se diseñó un transgén de resistencia para desencadenar el silenciamiento génico contra todas las variantes virales encontradas en el muestreo realizado. Se seleccionaron tres fragmentos del genoma viral evolutivamente conservados: parte del gen P3 (función probables de anclaje a membrana del complejo de replicación) y dos fragmentos no homólogos del gen de la proteína de cápside, para ser clonados en direcciones opuestas a ambos lados de un intrón (construcción tipo horquilla), bajo la dirección del promotor del gen de la ubiquitina de maíz. Se obtuvieron plantas transgénicas de cinco variedades de caña de azúcar de interés comercial y fueron desafiadas con el SCMV en un ensayo de inoculación artificial en invernáculo y en un ensayo a campo bajo condiciones naturales de infección en la Chacra Experimental (provincia de Salta). Resultados preliminares indican la ocurrencia de eventos resistentes a la infección con mosaico de cuatro variedades de caña. El análisis molecular de un grupo de eventos es consistente con una resistencia mediada por silenciamiento génico. Se planea la realización de ensayos a campo para confirmar el fenotipo de resistencia a mosaico e identificar eventos que conserven las características agronómicas del genotipo transformado.

Abstract:
Attractive alternatives to traditional resistance breeding in sugarcane against sugarcane and sorghum mosaic virus (SCMV and SrMV, respectively), both causal agents of mosaic disease, have derived from transgenic approaches exploiting gene silencing. Such approaches, however, have been implemented based upon relatively few available virus sequences, therefore it is possible that infrequent variants escape gene silencing and break resistance. We developed a simple, fast and economic protocol designed to obtain viral sequences from a large set of symptomatic sugarcane leaf samples. Using this protocol, we estimated the population structure of potyviruses causing sugarcane mosaic disease throughout the sugarcane growing area of Argentina and neighboring regions in Bolivia, Uruguay and Paraguay by analyzing sugarcane leaf samples showing mosaic symptoms from 103 locations, including commercial and experimental fields. A set of 567 samples from 104 sugarcane genotypes were extracted and analyzed for the presence of a genomic fragment including most of the SCMV and SrMV coat protein coding regions by RT-PCR using reported sets of primers. PCR products were directly sequenced using the same amplification primers. Sequence analysis demonstrated that SCMV is the predominant mosaic virus infecting sugarcane in the region, and is present in 94% of the samples. SrMV was present only in 2.8% of samples, with low (0.5%) coinfection rates. Sequences were subject to phylogenetic analysis and classified into four viral groups using a 0.91 nucleotide identity cutoff, and a new group (W) was proposed to be included in the SCMV classification previously reported. A resistance transgene was designed to trigger silencing mediated resistance against all virus variants found in the large scale survey. Three viral fragments: a P3 gene fragment and two nonoverlapping fragments from the coat protein gene, were cloned in opposite directions separated by an intron in a hairpin construct, and placed under the maize UBI promoter. Transgenic sugarcane plants belonging to 5 varieties were obtained and putative events were tested in the greenhouse with artificial inoculation and in a field trial at Chacra Experimental (Salta province) under natural infection conditions. Preliminary results indicate the occurrence of events from four sugarcane varieties that are resistant to mosaic infection. Preliminary molecular analysis are consistent with a resistance mechanism mediated by gene silencing. Further analysis are needed to identify resistant events that have a good agronomic performance as well.

Morgenfeld, Mauro Miguel. "Desarrollo de un sistema de expresión plastídico para producir el antígeno E7 del papilomavirus humano en tabaco" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Durante este trabajo se obtuvieron distintas líneas de plantas de tabaco transplantómicas para el antígeno viral E7 del virus del papiloma humano (VPH). La capacidad del sistema plastídico para producir el antígeno viral fue verificada. Asimismo se comprobó que la proteólisis del péptido es el factor determinante de la expresión y principal limitante de los niveles de acumulación de la proteína recombinante. La modificación de las características intrínsecas del polipéptido mediante la fusión traduccional a otras proteínas como la cápside viral de PVX o la enzima β-glucuronidasa mostró ser una estrategia válida para reducir la tasa de degradación de E7. De esta forma se alcanzó un incremento de la expresión entre 5 y 10 veces superior a lo observado con E7 por masa de tejido. Sin embargo los mejores resultados se obtuvieron al reorientar la acumulación del antígeno viral hacia un entorno con características bioquímicas diferentes como es el lumen tilacoide. Por primera vez se logró translocar una proteína codificada por el plastoma a través de la membrana tilacoide utilizando una secuencia específica de la misma especie, la señal bipartita amino-terminal del gen OEC23 de tabaco. Los niveles de acumulación del antígeno en el tilacoide resultaron ser dos órdenes de magnitud superiores a los observados en el estroma. Los resultados de este trabajo muestran distintos abordajes basados en la utilización de plantas de tabaco transplastómicas como biorreactores para la producción de proteínas de interés inestables como E7 del VPH.

Abstract:
In this work, different lines of transplantomic tobacco plants for the viral antigen E7 of human papillomavirus (HPV) virus were obtained. The plastid system capacity to produce the viral antigen was verified. Furthermore, we found that proteolysis of this peptide is the primary determinant of the expression and main limiting factor for recombinant protein accumulation. The modification of the intrinsic characteristics of the polypeptide by translational fusion with other proteins such as PVX coat protein or the enzyme β- glucuronidase proved to be a valid strategy to reduce the rate of E7 degradation. Using this strategy an increase in the expression from 5 to 10 times that of the observed value for E7 by tissue mass was achieved. However, the best results were obtained by redirecting the viral antigen into an environment with different biochemical characteristics such as the thylakoid lumen. For the first time, we achieved the translocation of a protein encoded by the plastoma across the thylakoid membrane by using a specific sequence from the same species, the bipartite signal amino-terminal of the OEC23 gene in Tobacco. Accumulation levels of the antigen in the thylakoid were two orders of magnitude higher than those observed in the stroma. The results of this work demonstrate different approaches based on the use of transplastomic tobacco plants as bioreactors for the production of unstable proteins of interest, such as E7 from HPV.

Calderazzo Pereyra, Julio César. "Consecuencias de mutaciones y polimorfismos sobre la actividad de ADAMTS13" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los objetivos de esta tesis fueron: 1- Optimizar la amplificación de los 29 exones correspondientes al gen de ADAMTS13 y realizar la secuenciación completa del gen en pacientes con PTT congénita y 2- Realizar la expresión “in vitro" de la primera nueva mutación descripta en Argentina A4085T (sustitución de un ácido aspártico (D) por una valina (V) en la posición 1362). Evaluar la actividad proteolítica intra y extracelular de la ADAMTS13 resultante para analizar cómo impacta sobre los mecanismos de biosíntesis y secreción de la ADAMTS13. Los experimentos se realizaron en cultivos de células HEK 293 transfectadas con las construcciones plasmídicas de la secuencia WT y del mutante A4085T sintetizado a partir del plásmido WT por mutagénesis sitio-dirigida para evaluar cuál es el dominio afectado y cómo impacta sobre los mecanismos de biosíntesis y secreción de la ADAMTS13. Estos estudios ayudaron a una mejor evaluación del exón 29 del dominio CUB-2. Para medir el antígeno y la actividad de ADAMTS13 en células, sobrenadantes y células transfectadas con vector de expresión de ADAMTS13 WT y de A4085T, se utilizaron técnicas de ELISA con sustratos cromogénicos, técnicas de SDS-PAGE, inmuno-transferencia y microscopia de inmunofluorescencia. Se observó que la mutación produce acumulación intracelular de ADAMTS13. La nueva mutación D1362V identificada en el dominio CUB-2 codificada por el exón 29, donde aún no se han reportado mutaciones de sentido erróneo, produce una deficiencia plasmática de ADAMTS13 que estaría inducida por una secreción reducida de la proteasa a la circulación.

Abstract:
The aims of this thesis were: 1- To optimize the amplification of the ADAMTS13 gene 29 exons, and to perform the complete sequencing of this gene in patients with hereditary TTP, and 2- To perform the in vitro expression of the first new mutation described in Argentina, A4085T (substitution of an aspartic acid for valine at position 1362). The resulting ADAMTS13 intra and extracellular proteolytic activity will be evaluated to analyze its impact on ADAMTS13 biosynthesis and secretion mechanisms. The experiments were performed in cultures of HEK 293 cells transfected with plasmid constructions of the WT sequence, and of the A4085T mutant synthesized from the WT plasmid through site-directed mutagenesis, in order to evaluate which the affected domain is and how it impacts on ADAMTS13 biosynthesis and secretion mechanisms. These studies have helped to improve the evaluation of exon 29 at CUB-2 domain. ADAMTS13 antigen and activity on cells, supernatants and cells transfected with expression vector of ADAMTS13 WT and of A4085T, were measured by ELISA with chromogenic substrates, SDS-PAGE, immune transference technics applied and immunofluorescence microscopy. It was observed that the mutation produces intracellular accumulation of ADAMTS13. The new D1362V mutation identified in CUB-2 domain and encoded by exon 29, where no missense mutations have been reported yet, produces a plasmatic deficiency of ADAMTS13 that could be induced by a reduced secretion of circulating protease.

Darino, Martín Alejandro. "Estudio de las resistencias a roya común del maíz y a roya de la hoja del trigo" (2015-03-09) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La roya común, causada por el hongo biótrofo Puccinia sorghi Schwein. es una importante enfermedad del maíz. En la Argentina poco se conoce acerca de fuentes de resistencia, no existen híbridos comerciales identificados como portadores de resistencia durable a la enfermedad y se desconoce acerca de la estructura poblacional de P. sorghi presente en la zona núcleo de cultivo. Los objetivos del presente trabajo consistieron en: la identificación de fuentes de resistencia a la enfermedad mediante la evaluación de un set de líneas de maíz con 66 aislamientos del patógeno y con infecciones naturales a campo; evaluación de la variabilidad patogénica y molecular de los 66 aislamientos; y profundizar en el conocimiento acerca de las bases genéticas que controlan la resistencia durable en cereales para poder implementarlas en programas de mejoramiento de maíz, mediante el estudio de una variedad de trigo llamada Buck Poncho que fue identificada como portadora de resistencia durable a roya de la hoja (Puccinia triticina Erikss.). Las líneas de maíz Rp3-A, Rp1-K, Rp-GI, Rp-G5, Rp-G5JD, PIO19802, PIO28760 y PIO17570 resultaron resistentes a más del 75% de los aislamientos y en más del 78% de las localidades evaluadas. En las líneas PIO68752, PIO28427 y PIO36420 se identificó un nuevo tipo de resistencia cuya expresión comenzó en el estadio V4. Las líneas PIO12345 y PIO74876 mostraron resistencia parcial en el estadio V2. Se identificaron en la población de P. sorghi por lo menos 3 grupos de virulencia y 26 fenotipos de virulencia o razas que podrían ser 40 razas si se consideran los genotipos de AFLP. En Buck Poncho se detectaron la existencia de por lo menos tres genes de resistencia LrBP1, LrBP2 y LBP3. La combinación de los genes de resistencia detectados en las distintas líneas de maíz podría generar variedades comerciales que posean resistencia más durable. Los grupos de virulencia identificados en la población de P. sorghi no mostraron diferencias en el nivel molecular indicando que aislamientos pertenecientes a un mismo grupo de virulencia pueden tener distintos orígenes dentro de la población. La resistencia durable observada en Buck Poncho se puede explicar en parte por los efectos combinados de los genes LrBP1, LrBP2 y LrBP3 aunque no puede descartarse la presencia de genes menores y/o QTLs menores cuyos efectos sean detectados con poblaciones segregantes de mayor tamaño a la utilizada en este estudio.

Abstract:
Common rust caused by the biotrofic fungus Puccinia sorghi Schwein. is an important disease of maize. In Argentina little is known about maize lines carrying resistance to the disease, the existence of corn hybrids with durable resistance and about the existence of distinct virulence groups in the P. sorghi population. The objectives of this work were: the evaluation of a set of maize lines with 66 isolates of the pathogen and with natural pathogen population present in field in order to identify resistance sources to the diseases; the study of the population structure of P. sorghi population; and in order to deepen the knowledge about the genetic basis that control durable resistance, genetic and molecular studies of a wheat variety called Buck Poncho that was identified as durable resistance to wheat leaf rust (Puccinia triticina Erikss.) were performed. Maize lines Rp3-A, Rp1-K, Rp-GI, Rp-G5, Rp-G5JD, PIO19802, PIO28760 and PIO17570 were resistant over the 75% of the isolates and over the 78% of the field locations where they were evaluated. A new class of resistance was identified in maize lines PIO68752, PIO28427 and PIO36420 whose expression of the resistance began at leaf stage V4. In inbred lines PIO12345 and PIO74876 showed partial resistance at leaf stage V2. At least, 3 virulence groups were identified, 26 virulent phenotypes or races were distinguished that could become 40 races if AFLPs genotypes are considered. Three leaf rust resistance genes, LrBP1, LrBP2 and LrBP3 were identified in Buck Poncho. Pyramiding the resistant genes detected in maize lines could be a useful strategy to increase durability of the resistance. The virulence groups identified in P. sorghi population did not differ at genetic level, indicating that isolates from each group could have different origins within the population. The durable resistance observed in Buck Poncho could be explained in part by the combination effects of LrBP1, LrBP2 and LrBP3 genes and the presence of minor genes or minor QTLs whose effects could perhaps be detected in segregant populations bigger than the one that was used in this study.

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