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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Endocrinología [ 68 tesis ]

Luchelli, María Amalia. "Efecto de la estimulación nerviosa en la velocidad de síntesis de la noradrenalina : Posible regulación a través de receptores presinápticos" (1984) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Pignataro, Omar Pedro. "Mecanismos moleculares en la regulación de la biosíntesis esteroidogénica" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Chaud, Marcela Alicia. "Acción de las prostaglandinas endógenas y exógenas en la motilidad espontánea y respuesta adrenérgica del útero aislado de rata" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Settembrini, Beatriz Patricia. "Estructuras quimiorreceptoras en las fosas nasales de la rata : Su relación con la regulación endocrina de la reproducción" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Franchi, Ana María. "Influencia de hormonas sexuales sobre la síntesis y liberación de prostaglandinas en el útero de rata" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Weisenberg, Liliana Sara. "Receptores para hormonas sexuales en pituitaria y sistema nervioso central" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Lanari, Claudia Lee Malvina. "Efecto de la progesterona y del acetato de medroxiprogesterona (MPA) sobre el crecimiento de fibrosarcomas murinos : Estudios in vivo e in vitro" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de este trabajo surgió de la observación de que la progesterona tiene efectos antifibromatogénicos en cobayos y en el hombre. Se evaluó el efecto de la progesterona y del acetato de medroxiprogesterona (MPA) sobre el crecimiento de un fibrosarcoma murino tanto in vivo como in vitro. También se estudió su efecto sobre la inducción de sarcomas originados por la implantación subcutánea de un cuerpo extraño. (cilindro de vidrio). In vivo, los resultados obtenidos demuestran que el MPA disminuyó la incidencia tumoral cuando se lo inoculó junto con el transplante de fibrosarcoma. Cuando el tratamiento hormonal se comenzó días después del inóculo tumoral no hubo efecto sobre su crecimiento. Se obtuvieron resultados similares con un transplante de una leucemia linfoblástica mientras que no se observó una disminución en la incidencia tumoral con un carcinoma epidermoide indiferenciado. In vitro, también se demostró que los fibroblastos tanto embrionarios como tumorales fueron más sensibles a concentraciones altas (10-5 - 10-4M) de progestágenos que las células epiteliales que constituyen las líneas celulares WISH y HELA. Sobre fibroblastos normales y tumorales la progesterona no sólo tuvo un efecto citostático sino que también por encima de 10-4M se observó un efecto citolítico. Con MPA sólo se pudo evaluar el efecto citostático ya que no se pudieron obtener concentraciones superiores a 7x10-5M. Este efecto fue específico para fibroblastos ya que las células WISH no se inhibieron aún con las altas concentraciones de hormona. En base a la alta concentración de la hormona se postula una acción directa, no mediada por receptores sobre las células tumorales tanto in vivo como in vitro. En cuanto al efecto del MPA sobre la tumorigénesis por cuerpo extraño, se observó una disminución en la incidencia de sarcomas inducidos por la implantación subcutánea de un cilindro de vidrio. Esta disminución fue más evidente cuando se inoculó la hormona en la vecindad del cuerpo extraño que en el flanco contralateral; en el primer caso no sólo disminuyó la incidencia tumoral sino que también fue menor el ritmo de aparición de los sarcomas. Se postula que el efecto inhibidor del MPA sobre la inducción de sarcomas se debería a una disminución en la fibrosis que rodea al cuerpo extraño. Un resultado inesperado, pero de gran relevancia debido al uso indiscriminado de esta hormona, fue la aparición de adenocarcinomas en hembras portadoras de cilindro de vidrio y tratadas con MPA ya sea in situ o en el flanco contralateral. Se puede concluir que si bien los progestágenos tienen un efecto antifibromatogénico, su administración prolongada pude llevar al desarrollo de adenocarcinomas.

Radicella, Juan Pablo. "Mecanismo de acción de la hormona luteinizante y esteroidogénesis en células de Leydig" (1986) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Páez Pereda, Marcelo. "Regulación del sistema de interleuquina-1 por las hormonas del eje hipotálamo-pituitario-adrenal" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Bocanera, Laura Viviana. "Rol de la Guanilil Ciclasa y el GMPc en el metabolismo de la tiroides" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El presente trabajo de tesis tienen como objetivo estudiar el rol en la glándula tiroides de la enzima guanilato ciclasa (GC) y el producto de la reacción catalizada por esta: el GMPc. En la primera sección se detalla la caracterización parcial de la enzima en tiroides bovinas. Los resultados obtenidos, demuestran la presencia de dos tipos de GC: una soluble y una particulada, predominando la actividad soluble (79%) sobre la actividad asociada a membrana (8%). El tratamiento con Tritón X-100 incrementa la actividad de ambas enzimas (350% GC particulada, 70% GC soluble). Con el objeto de descartar cualquier posible contaminación de la fracción soluble con la fracción particulada y viceversa, se determinó las actividades de las enzimas en ambos preparados, previamente tratados con activadores específicos para cada una de ellas: Pépitido natriurético atrial (ANP) para la GC particulada y nitroprusiato de sodio (NP) para la GC soluble. El ANP incrementó la actividad en la fracción de membrana y el NP activó la GC de la fracción soluble, sin observarse ningún efecto del ANP y NP sobre la enzima soluble y particulada respectivamente, descartando una contaminación de las fracciones entre si. Para estudiar el grado de interacción entre la enzima particulada y la membrana, se sometió al precipitado de la centrifugación de 105.000 x g a tratamientos con NaCl 0.5 mM, deoxicolato 1%, o Lubrol PX 1%, obteniéndose mayor actividad en las muestras tratadas con Lubrol PX indicando que la proteína se encuentra fuertemente asociada a la membrana. Cuando se estudió el comportamiento cinético considerando el complejo MnGTP como sustrato, la cinética fue michaelina para la GC soluble con un Km de 0.036 mM, mientras que la enzima particulada mostró un comportamiento alostérico positivo con un S0.5 de 0.230 mM y un coeficiente de Hill de 1.9, indicando que existen en la enzima, por lo menos dos sitios de unión para el sustrato. Con el objeto de estudiar el efecto de diferentes concentraciones de manganeso, se determinó la actividad enzimática trabajando en condiciones de exceso de Mn2+ respecto de la concentración de GTP. Los resultados obtenidos en esta serie de experimentos, muestra un comportamiento alostérico positivo para la enzima soluble con un S0.5 de 1.2 mM y un coeficiente de Hill de 2.9. La cinética para la enzima particulada ensayada en las misma condiciones, resultó michaeliana con un Km de 0.280 mM. Si bien la actividad enzimática es altamente dependiente de manganeso, resultó de interés investigar el efecto sobre la enzima de otros cationes divalentes: Mg2+ y Ca2+. Reemplazando el Mn2+ por Mg2+ en el medio de reacción, no se observó actividad de la enzima asociada a la fracción particulada, obteniéndose con la enzima particulada, sólo un 15% de la actividad determinada en presencia de manganeso. El calcio en ausencia o presencia de concentraciones óptimas de manganeso, no tuvo efecto sobre la actividad de ninguno de los dos tipos de GC. Con concentraciones subóptimas de Mn2+, se observó un aumento de la actividad en la GC soluble a altas concentraciones de calcio. Este este estímulo sólo representa aproximadamente el 20% de los valores obtenidos con concentraciones de manganeso óptimas. Con la GC particulada en las mismas condiciones experimentales se observó una ligera pero significativa inhibición a concentraciones altas de Ca2+. La segunda parte de este trabajo está dedicada a determinar el posible rol biológico asociado a la GC soluble en la glándula tiroides. Para este fin se utilizó como modelo experimental cultivos primarios de tiroides bovinas. La primera serie de experimentos tuvo como objetivo verificar que en el modelo experimental utilizado, la GC soluble es activable por el nitroprusiato de sodio (NP). Los resultados obtenidos indican que el NP produce un incremento en la actividad enzimática que es dependiente de la y del tiempo de tratamiento, incrementando correlativamente los niveles de GMPc. Dado que el transporte de ioduro, constituye el paso inicial y limitante en la síntesis de las hormonas tiroideas, se estudió el efecto del NP sobre la incorporación del halógeno. Se observó una inhibición significativa de la capitación de yoduro a las 2 hs de tratamiento con 5 mM de NP en células previamente tratadas con TSH por 72 hs, sin variaciones sobre los basales (células sin TSH). Este efecto fue reproducido por un análogo del GMPc (8Br-GMPc), y bloqueado por hemoglobina reducida, sugiriendo que este se encuentre mediado por la vía GC-GMPc. La inhibición producida por el NP fue también observada cuando las células son tratadas con activadores del sistema adenilil ciclasa-AMPc tales como forskolina y análogos del AMPc, indicando que el compuesto nitrogenado podría estar inhibiendo un efecto de la TSH desencadenado a través de este sistema de transducción de señales. Sin embargo, el punto de acción sería distal a la formación de AMPc, dado que los niveles del nucleótido no se encuentra disminuidos. Dado que la incorporación de iodo a la célula tiroidea se encuentra determinada por un equilibrio entre la entrada y la salida o eflujo, se consideró de ínterés evaluar que mecanismo se encontraba afectado por el NP. En una primera instancia se estudió el efecto del compuesto nitrogenado sobre la salida o eflujo de iodo, no observándose diferencias significativas en las células tratadas con NP respecto al control. Teniendo en cuenta que la incorporación de yoduro en la célula tiroidea se encuentra inequivocamente ligada a la actividad de la ATPasa Na+/K+ estimulable, se investigó la acción del NP sobre esta enzima. Los resultados obtenidos indicaron una marcada inhibición en la actividad de la enzima en células previamente tratadas con TSH por 72 hs sin efectos significativos sobre los cultivos en condiciones basales. Este efecto es reproducido por 8Br-GMPc confirmando que la inhibición se encuentra mediada por el sistema GC-GMPc.

Abstract:
The present Doctoral Thesis work had as an aim to study the role of guanylil cyclase (GC) and its product, cyclic GMP (cGMP), in the regulation of thyroid function. In the first section the partial characterization of the enzyme in calf thyroid is presented. The results obtained showed the presence of two types of GC: one is soluble and comprises around 79% of total activity, while the remaining is particulate. Treatment with Triton X-100 increases both activities (350% increase for the particulate, 70% for the soluble enzyme). In order to rule out the possibility of a contamination of the soluble fraction with the particulate, and vice-versa, the activity of each of the enzymes was determined after stimulation with specific activators for each one. The atrial natriuretic peptide (ANP) for the particulate GC and sodium nitroprusside (NP) for the soluble enzyme. Both compounds increased their respective effectors and no cross stimulation was observed. In order to analyze the interaction between the particulate enzyme and the membranes the pellet obtained after centrifugation at 105,000 x g was treatedwith either 0.5 mM NaCl, 1% sodium deoxycholate or 1% Lubrol PX 1%. The highest activity was obtained after treatment with Lubrol, suggesting that the enzyme is strongly associated to the membrane. When the kinetics of the enzyme was analyzed, taking the complex MnGTP as a substrate, the results showed a Michaelis type kinetics for the soluble GC, with a Km of 0.036 mM, whereas the particulate GC showed a positive allosteric behaviour with a S0.5 of 0.230 mM and a Hill coefficient of 1.9, indicating that the enzyme has at least two binding sites for the substrate. When the influence of different Mn2+ concentrations was studied, under excess with respect to GTP, apositive allosteric behaviour for the soluble GC was found, with an S0.5 of 1.2 mM and a Hill coefficient of 2.9 The kinetic of the particulate enzyme under similar conditions was of Michaelis type, with a Km of 0.280 mM. Although the enzyme is highly dependent of Mn2+, it was of interest to investigate the possible effects of other divalent cations, such as Ca2+ and Mg2+. The replacement of Mn2+ for Mg2+ caused a complete disappearance of the particulate enzyme, while the soluble activity decreased by 85%. Addition of Ca2+ had no effect on either GC. However, with suboptimum concentrations of Mn2+, high Ca2+ concentrations caused an increase in soluble activity, but it comprised only 20% of maximum activity with optimal Mn concentrations. With the particulate enzyme a slight but significant inhibition was observed. The second part of this study examines the role of GC and cGMP in thyroid regulation. Primary cultures of calf thyroid cells were used as a model. In the first studies the stimulation of soluble GC by NP was confirmed. This increase is time and concentration- dependent, with a correlative increase in cGMP concentrations. Iodide uptake is the limiting step in thyroid hormone biosynthesis and a typical functional parameter. Therefore it was determined as an index of thyroid function. In cells treated with TSH for 72 h, addition of 5 mM NP for the last 2 h caused a significant inhibition of iodide uptake, without change in cells not treated with TSH. This action was mimicked by an analogue of cGMP, 8Br-cGMP, and blocked by reduced haemoglobin, thus suggesting that it is mediated by GC-cGMP pathway. NP also inhibited the stimulation caused by forskolin or analogues of cAMP, indicating that the effect takes place at this pathway, which would be distal to cAMP generation, since cAMP are not decreased by NP. The accumulation of radioiodine by thyroid cells is the consequence of the balance between uptake and efflux. In order to rule out an effect on this last parameter a series of studies were conducted. The results failed to demonstrate that NP affects iodide efflux, therefore concluding that it inhibits uptake. Since iodide transport across the membrane depends of the energy supplied by the Na+/K+ ATPase the possible effect of NP on the enzyme was analyzed. The results showed a significant inhibition of the ATPase by NP in cells treated for 72 h with TSH. This action was reproduced by 8Br-cGMP, thus confirming the role of GC and cGMP in this process.

Dada, Laura Andrea. "Mecanismos de transducción de receptores de hormonas proteicas : Relación entre sistemas adenilato ciclasa dependientes e independientes" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Srebrow, Anabella. "Modulación de la expresión de genes homeóticos en el desarrollo de la glándula mamaria murina" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los genes homeóticos codifican para reguladores transcripcionales involucrados en la formación de patrones y las decisiones de destino celular durante la embriogénesis. Recientemente, ha despertado gran interés la función de dichos genes en tejidos adultos en continuo desarrollo así como también en procesos tumorigénicos. La mayor parte del crecimiento y morfogénesis de la glándula mamaria ocurre durante la vida subadulta y adulta del animal y ciertos estadios de la glándula postnatal presentan características de tipo embrionarias. Regulación de fomación de patrones, diferenciación celular e interacciones epitelio-estroma tienen lugar una vez finalizada la embriogénesis y reocurren durante cada ciclo de preñez, lactancia e involución. Debido a que la matriz extracelular influencia el desarrollo funcional y morfogenético de la glándula mamaria, investigamos si las señales provenientes de dicha matriz podrían estar involucradas en la expresión y regulación de genes homeóticos. Mediante una estrategia basada en reacciones en cadena de polimerasa, identificamos la expresión de 5 genes homeóticos pertenecientes a dos "clusters" del complejo Hox, en células mamarias murinas en cultivo. Un gen de cada uno de estos "clusters", Hoxa-1 y Hoxb-7, fue elegido para una caracterización más profunda. Encontramos que Hoxb-7 se expresa tanto en cultivo como in situ, donde su expresión es regulada a lo largo del desarrollo glandular y se localiza en el epitelio mamario. Hoxa-1 no se expresa en ningún estadio del desarrollo de la glándula murina normal pero sí se expresa en algunos tumores mamarios y en células mamarias funcionales, no malignas, cultivadas sobre plástico de cultivo. La expresión de ambos genes es reprimida cuando las células son cultivadas sobre una membrana basal reconstituída. Mientras que la regulación negativa de Hoxb-7 requiere estrictamente la presencia de membrana basal y cierta conformación celular, la de Hoxa-1 se logra mediante el cultivo de las células sobre un sustrato inerte antiadhesivo que permite una reorganización del citoesqueleto y concomitantemente cambios de morfología celular. En celulas tumorales, la expresión de Hoxb-7 es prácticamente indetectable y la expresión de Hoxa-1 no es regulada por ninguno de estos factores microambientales.

Abstract:
Homeobox-containing genes encode transcriptional regulators involved in cell fate and pattern formation during embryogenesis. Recently, their role in continuously developing adult tissues as well as in tumorigenesis has also become a subject of interest. The mammary gland undergoes most of its growth and morphogenesis in the subadult and adult animal and certain stages of the postnatal gland exhibit embryonic-like features. Regulation of pattern formation, cell differentiation and epithelial-stromal interactions take place after completion of embryogenesis and reoccur during each cycle of pregnancy, lactation and involution. Because the extracellular matrix is known to influence both functional and morphological development of the mammary gland, we asked whether the extracellular matrix signaling could be involved in the expression of homeobox genes. Using a polymerase chain reaction based-strategy, five members of two Hox gene clusters were shown to be expressed in cultured mouse mammary cells. One gene from each cluster, Hoxa-1 and Hoxb-7, was chosen for further analysis. We found that Hoxb-7 is expressed both in culture and in sihr, where it is developmentally regulated and localized to the mammary epithelium. Hoxa-1 is not expressed at any stage of the normal mammary gland but was shown to be expressed in some mammary tumors as well as in non-malignant and functional mammary cells on tissue culture plastic. The expression of both genes was suppressed when cells were cultured on a reconstituted basement membrane. Whereas Hoxb-7 strictly required the basement membrane and a certain cellular conformation for suppression, Hoxa-1 down-regulation could be mimicked by culturing the cells on an inert substratum (polyHEMA) that allows reorganization of actin cytoskeleton and thus changes in cell shape. In malignant cells the expression of Hoxb-7 was practically undetectable and Hoxa-1 expression was not responsive to any of these microenvironmental regulators.

Chamson, Astrid de Reig. "Desarrollo y control de un tumor experimental de ovario" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de esta tesis fue el estudio de un modelo animal de tumor ovárico con ciertas similitudes con patologías ováricas hormono-dependientes y endocrinamente funcionales. El luteoma se desarrolla al autoinjertar un ovario en el bazo de una rata hembra adulta bilateralmente ovariectomizada, por la hipergonadotrofinemia resultante. En estudios de un año de duración determinamos que son tumores benignos y no modifican el estado general del animal. La mayoria de los animales portadores de tumor cursan con gonadotrofinas elevadas por un período de tiempo prolongado. Los luteomas secretan inhibina determinando un patrón particular de secreción de FSH. In vitro estos tumores presentan la esteroidogénesis basal alterada. La administración crónica de buserelina (análogo de GnRH)tuvo un claro efecto antitumoral: redujo la aparición de tumores e inhibió su crecimiento. A través de receptores específicos de afinidad similar al ovario control, la buserelina ejerce un efecto directo sobre las células de luteomas: inhibe la secreción de progesterona estimulada por LH. Las células tumorales son más sensibles a este efecto que las células lúteas control. Sin embargo, los receptores para GnRH en las células de los luteomas se encuentran desacoplados de su via clasica de segundos mensajeros: fosfolipasa C. En nuestros trabajos caracterizamos los luteomas en diversos aspectos que abarcan al animal entero hasta estudios subcelulares.

Abstract:
The aim of the present thesis was the study of an animal model of ovarian tumor. The interest of this tumor lies in its similarities with ovarian pathologies which are hormone-dependent and endocrinologically active. This luteoma develops when an ovary is grafted into the spleen of a bilaterally ovariectomized adult female rat, as a consequence of the resulting hipergonadotrophinemia. In a year-long study we determined that these tumors are benign and do not alter the general condition of the animals. The majority of the tumor-bearing animals display high gonadotrophin levels for long periods of time. Luteoma secrete inhibins, which determine the particular FSH secretion pattern. In vitro these tumors show basal steroidogenesis alterations. Chronic buserelin (a GnRH analog) administration had a clear antitumoral effect: it inhibited initial tumor development and induced a reduction in tumor volume. Buserelin, acting on specific receptors with affinity similar to that in control ovaries, has a direct effect on luteoma cells: it inhibits LH-stimulated progesterone secretion. Tumoral cells are more sensitive to this effect than control luteal cells. However, GnRH receptors in luteoma cells are uncoupled from their classic second messenger generating system: phospholipase C. In our work we have characterized these luteoma in a variety of aspects including the whole animal and subcellular studies.

Canosa, Luis Fabián. "Biosíntesis de esteroides testiculares y su regulación en el sapo Bufo arenarum (Amphibia, Anura)" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La presente Tesis describe el metabolismo de esteroides del testículo de Bufo arenamrm como así también algunos aspectos de la regulación del mismo. Durante el período no reproductivo, la biosíntesis de andrógenos (T y DHT) se realiza por una vía Δ5 que incluye al 5Diol como intermediario. P4 se transforma mayoritariamente en derivados reducidos como 5αP y 5αP3αol,20ona. La función biológica de estos esteroides reducidos en el testiculo de B. arenam se desconoce hasta el momento. En los animales capturados durante el período de reproducción, la capacidad biosintética del testículo se modifica. Este cambio va desde el predominio de esteroides con 19 átomos de carbono, que se observa en el período no reproductivo, hacia la formación de esteroides de 21 átomos de carbono. Así, se encuentra aumentada la transformación de P5 en P4 y la producción de 5αP; 5αP3α,20ona; 5αP3α,20(α/β)diol y un metabolito no caracterizado. La disminución de la síntesis de andrógenos, in vitro, se correlaciona con una disminución de la concentración plasmática de los mismos. Este cambio en el patrón esteroidogénico podría relacionarse con el final de la espermatogénesis (que depende de andrógenos) y el comienzo de la época de apareamiento. El mecanismo por el cual ocurren estos cambios consistiría, principalmente, en la reducción de la actividad de la enzima P450C17. Se confirma el fuerte efecto inhibitorio de CNK sobre la actividad de 3βHSD reportado previamente para interrenal de esta especie. SPNL ejerce un 50 % de inhibición de la actividad de C17-20 liasa, pero presenta un menor efecto sobre la hidroxilación en la posición C17. Finasteride es incapaz de inhibir a la 5αRed de sapo independientemente del sustrato utilizado. Esta enzima es de localización microsomal, tiene dependencia de NADPH como cofactor, presenta un Km menor para P4 que para T y un amplio rango de pH óptimo, entre 6 y 8. Las características mencionadas previamente son válidas tanto para la conversión de P4 como de T, lo que estaría sugiriendo la existencia de un único tipo enzimático para ambas reacciones. La falta de sensibilidad a Finasteride y el rango de pH óptimo de esta enzima se asemejan al tipo I caracterizado en mamíferos. Independientemente de la concentración utilizada, el tratamiento agudo con hCG in vitro no tiene efecto sobre la actividad de 5αRed. Sin embargo, el tratamiento crónico con hCG y FSH provoca una reducción de la actividad enzimática. Por otro lado, GnRH induce un aumento de la actividad de 5αRed, sólo en la menor concentración utilizada. Las actividades asociadas a la enzima P450c17 son inhibidas por el tratamiento crónico tanto con FSH como con GnRH en todas las concentraciones utilizadas y con hCG sólo en la mayor concentracion ensayada. Sin embargo, la actividad de 3βHSD no se ve influenciada por ninguno de estos tratamientos. GnRH, cuyos receptores testiculares se caracterizan en esta tesis, reduce la liberación de T inmunoreactiva tanto basal como estimulada por hCG. El efecto sobre la liberación basal de T solo se observa en la concentración más baja, al igual que lo que ocurre sobre la 5αRed. Por otro lado, el bloqueo de la acción de hCG sobre la secreción de andrógenos se ejerce en todas las concentraciones probadas. Estas diferencias sugieren que los mecanismos subyacentes para cada una de las inhibiciones provocadas por GnRH son diferentes.

Abstract:
This thesis describes studies on the steroid metabolism by the testes of Bufo arenarum as well as some aspects of its regulation. During the reproductive period, androgen biosynthesis (T and DHT) proceeds by a Δ5 pathway including 5Diol as intermediate. P4 mainly converts to reduced metabolites as 5αP and 5αP3αol,20one. At the moment, the function of those steroids in the testis of B. aremm remains unknown. In animals collected during the reproductive period, the biosynthetic properties changes from the predominance of C19-steroids observed during the non-reproductive period, to the formation of C21-steroids. The conversion of P5 to P4 increases together with the production of 5αP; 5αP3α,20one; 5αP3α,20(α/β)diol and an uncharacterized metabolite. Otherwise, there is a correlation between the reduction of androgen biosynthesis in vitro and its plasmatic concentration. These changes in biosynthetic characteristics could be related to the end of androgen-dependent spermatogenesis and the beginning of the breeding season. These changes could be mainly due to a reduction in P450c17 activity. The strong inhibitory effect of CNK on 3βHSD, previously reported for interrenal of this species, is confirmed. SPNL, inhibits 70% the C17-20 lyase activity, but has a lower effect on C17-hydroxylation. Finasteride fails to affect toad enzyme activity when T or P4 are used as substrates. 5α-Red activity localizes in microsomal fraction, uses NADPH as a cofactor and Krn values for P4 is lesser than for T, having broad pH-optima for both substrates. Taken together, these results suggest that toad 5α-Red possesses some characteristics (pH-dependence and Finasteride insensitivity) resembling of type I mammalian enzyme. Acute in vitro treatments with hCG, independently of the concentrations used, do not affect 5αRed activity. However, chronic administration of hCG and FSH provokes a strong reduction of the enzyme activity. Besides, GnRH induces an increment of the mentioned activity only at the lower concentration used. Both FSH and GnRH at all tested concentrations and hCG at the higher concentration inhibit P450cl7 associated activities. However, 3βHSD activity is not modified by any of these treatments. GnRH receptors in testicular tissue were characterized. GaRH reduces basal irnmunoreactive-T secretion only at the low concentration used as it was mentioned for 5α-Red However, in all concentrations employed, GnRH inhibits hCG-stimulated increase of ir-T. These differences suggest that the undergoing mechanisms for each type of GnRH-inhibition are different.

Romero, Damián Gastón. "Regulación de la esteroidogénesis Adrenal: Efectos de endotelina y ACTH, y Rol de la 11beta-Hidroxiesteroide Deshidrogebnasa" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Este trabajo pretende dilucidar algunos de los mecanismos regulatorios de la esteroidogénesís adrenal por Endotelina (ET) y Adrenocorticotrofina (ACTH) y el rol de la 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11β-HSD). Con este fin se obtuvieron los siguientes aportes: Adrenales de ratas infundidas con ET presentan, además del efecto corticoidogénico ya conocido, a) un incremento de la captación del sustrato primario para la esteroidogénesís, colesterol, in vitro; este incremento es mediado por los receptores ETB. b) un incremento en la actividad del citocromo P-4505scc, mediado por los receptores ETA. La actividad de la 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa no se modifica por ET. La glándula adrenal de rata y vaca expresa actividad de las isoformas l y 2 de la 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11β-HSD). Ambas isoformas presentan características bioquímicas y cinéticas similares a las halladas en otros órganos de rata y en otras especies. En ratas, el tratamiento agudo con ACTH in vivo produce una disminución de la actividad adrenal de esta enzima, mientras que el tratamiento crónico (48 hs) causa un aumento de la misma. Este último incremento es mediado por un aumento en los niveles proteicos de la 11β-HSD-2 aunque no se modifican los niveles de su mRNA. Se propone un modelo de regulación de la esteroidogénesís adrenal por la actividad de la 11β-HSD. El tratamiento agudo con ACTH de células dispersas de fasciculata adrenal de rata produce una disminución de la actividad de 11β-HSD determinada en células enteras o en sus microsomas. Esta regulación sería mediada por la vía de cAMP-PKA ya que es revertida por inhibidores de esta kinasa y simulada por db-cAMP. Además, la presencia de fosforilaciones/desfosforilaciones se comprueba con experimentos con fosfatasa alcalina. Se realizó el clonado, expresión y caracterización de la 11β-HSD-2 bovina. Se estudiaron las características bioquímicas y cinéticas de la proteína expresada en células CHOP. La comparación estructural, cinética y funcional de la 11β-HSD-2 bovina demuestra estrecha similitud con su contraparte de rata y humana.

Abstract:
This work is focused on elucidation of some of the regulatory mechanisms of endothelin (ET)- or adrenocorticotrophic hormone (ACTH)- mediated adrenal steroidogenesis and the role of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase (11β-HSD). To this propouse the following contributions were obtained: Adrenal glands from ET-infused rat shows, besides the well-known corticosteroidogenic effect, a) increase of cholesterol uptake (cholesterol is the primary substrate for steroidogenesis); this increment is mediated through ETB receptors. b) Increment of cytochrome P-450scc activity, which is mediated by ETA receptors. ET does not modify 3l3-hydroxysteroid dehydrogenase activity. Rat and bovine adrenal gland expresses isoforms l and 2 of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase (11β-HSD) activity. Both isoforms present biochemical and kinetic characteristics similar to that reported for other rat organs and animal species. Treatment of rats with ACTH (acute experiment) produces a decrease in adrenal activity of this enzyme, while chronic treatment (48 hs) causes an increase. This last increment is mediated by an increase in 11β-HSD-Z protein levels although 11β-HSD-Z mRNA levels were not modified. A model for regulation of steroidogenesis by 11β-HSD is proposed. Acute ACTH treatment of dispersed rat fasciculata adrenal cells causes a decrease in 11β-HSD activity measured in whole cells or in their microsomes. The cAMP-PKA pathway mediates this regulation as it is reverted by inhibitors of this kinase and mimicked by db-cAMP. Also, the existence of phosphorylation/dephosphorylation process is proved by experiments with alkaline phosphatase. Cloning, expression and characterization of bovine 11β-HSD-2 were carried out. Biochemical and kinetic properties of this enzyme were studied in CHOP cells expressing bovine 11β-HSD-2. Structural, kinetic and functional comparisons of bovine 11β-HSD-2 show a high degree of similarity with its rat and human counterparts.

Stefano, Andrea Virginia. "Caracterización bioquímica de las variantes de GnRH (gonadotropin-releasing hormone) presentes en cerebro e hipófisis de pejerrey, Odontesthes bonariensis : Localización neuroanatómica y relación con distintas hormonas hipofisisarias" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Ceballos, Nora Raquel. "Biosíntesis de aldosterona y su regulación en Bufo arenarum (Amphibia, anura)" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la presente Tesis Doctoral se realizaron estudios sobre la biosíntesis de aldosterona, en la glándula interrenal de Bufo arenarum, a partir de distintos sustratos tales como corticosterona, 18-hidroxicorticosterona (18-OH-B) y el compuesto "N" que se biosintetiza a partir de pregnenolona pero no de progesterona. A diferencia de lo que ocurre con la 18-OH-B comercial o de rata, la proveniente de interrenales de sapo presenta una forma menos polar única y distinta de las conocidas hasta el momento. Con respecto a la precursoriedad de aldosterona que posee este esteroide 18-hidroxilado, los resultados mostrados indican que esta hormona no es intermediario en la biosíntesis de aldosterona, por lo menos en las condiciones utilizadas para los experimentos presentados en esta Tesis. También se ensayó la capacidad precursora de aldosterona que tiene corticosterona y la conclusión a la que se arribó es que la capacidad biosintética de este conocido intermediario en la síntesis de aldosterona es, también, muy baja. Se caracterizó por diversos métodos el compuesto "N", esteroide muy polar con movilidad intermedia entre 18-OH-B y cortisol en el sistema Bush B5, como el 3β -hidroxi-5-ene análogo de aldosterona (3β ,11β ,21-trihidroxi-5-pregnen-20-ona-18-al). Cuando se estudiaron las propiedades biosintéticas del compuesto "N", este esteroide demostró ser un muy buen precursor para la síntesis de aldosterona. La importante capacidad precursora de aldosterona que posee "N", a la menor precursoriedad de corticosterona y a la falta de capacidad de 18-OH-B, indican que en Bufo arenarum, la isomerización del doble enlace Δ 5 a Δ 4 es un paso muy tardío en el camino biosintético de aldosterona. La transformación del análogo de aldosterona en el mineralocorticoide es catalizada por la enzima 3β -hidroxiesteroide deshidrogenasa-Δ 4 isomerasa de localización mitocondrial. La actividad de la enzima mencionada es regulada por la concentración de sodio del medio, la que parece regular la cantidad de enzima presente en aquella fracción.

Abstract:
This thesis describes studies on the biosynthesis of aldosterone by the interrenal gland of Bufo arenarum from substrates such as corticosterone, 18-hydroxycorticosterone (18-OH-B) and compound "N", a metabolite synthesized from pregnenolone but not from progesterone. At variance with commercial or rat 18-OH-B, toad 18-OH-B exhibits only one single "less polar form". This form differs from those currently described. Under the present conditions, that 18-hydroxylated steroid is not an intermediate in the biosynthesis of aldosterone. Likewise, corticosterone proved to be a poor precursor for the mineralocorticoid. Several methods were applied to the study and characterization of compound "N", a highly polar metabolite migrating in the Bush B5 paper-chromatographic system as migrates the 3β -hydroxy-5-ene analog of aldosterone (3β ,11β ,21-trihydroxy-5-pregnen-20-one-18-al). This steroid showed to be a good precursor for aldosterone. Its precursorship, surpassing by far those exhibited by 18-OH-B or even corticosterone, suggests that isomerization Δ 5 Δ 4 is a final step of aldosterone biosynthesis. The transformation of the aldosterone-analog into aldosterone is catalised by the enzyme 3β hydroxysteroid dehydrogenase-Δ 4 isomerase, of mitochondrial localization. Enzyme activity is regulated by the sodium concentration of the medium, which apparently controls the amount of enzyme in mitochondria.

Otero Corchón, Verónica. "Participación del neuropéptido Somatostatina en el sistema nervioso central de ratones genéticamente modificados" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Pozzi, Andrea Gabriela. "Regulación de la actividad de la 3 beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa en el testículo de Bufo arenarum : Relación con la espermiación inducida por hCG" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La presente tesis describe los estudios realizados sobre la actividad de la enzima 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa (3βHSD/I), así como su participación en la regulación de la espermiación inducida por hCG en testículos de Bufo arenarum. La enzima 3βHSD/I se localiza en las fracciones mitocondrial y microsomal. Ambas localizaciones muestran diferente especificidad de sustrato, dehidroepiandrosterona (DHE) es el sustrato preferido de la enzima microsomal en tanto que la mitocondrial utiliza solamente pregnenolona. Esta doble localización establecería una compartimentalización de las dos vías de síntesis de esteroides previamente descriptas en B. arenarum: la via Δ4 en las mitocondrias y la via Δ5 en los microsomas. La actividad de ambas fracciones subcelulares es mayor en el período reproductivo que en el no reproductivo. Cuando se incluye DHE en el análisis cinético de la transformación de pregnenolona, se observa una importante modificación de la Vmax, en tanto que el Km permanece constante. Estos resultados indican que DHE se comporta como un inhibidor no competitivo de la conversión de pregnenolona. Los valores de Km y Ki sugieren la presencia de dos sitios de unión. Por otra parte, cuando se utiliza pregnenolona como inhibidor de la transformación de DHE, solo se modifica ligeramente el valor de Km, en tanto que la Vmáx se mantiene constante. Esto indica que pregnenolona se comporta como un inhibidor competitivo. Los valores del coeficiente de Hill para la transformación de DHE y pregnenolona son, respectivamente, 1.04 and 1.01. Estos estudios sugieren que en esta especie la biosíntesis de andrógenos y progesterona es catalizada por sitios activos diferentes. En esta tesis también se ha utilizado un sistema de espermiación in vitro, con el objeto de identificar, en el sapo, los posibles mediadores esteroideos de la espermiación. La espemiación fue inducida con hCG, utilizándose además distintos inhibidores de la esteroidogénesis. Cianocetona, inhibidor de la síntesis de 3-oxo-4-ene esteroides, no afectó la espermiación inducida por hCG aún cuando la síntesis de aquellos esteroides y sus derivados reducidos disminuyó en más de un 95%. Aminoglutetimida, usada en una concentración que bloqueó la síntesis de esteroides, tampoco afectó la espermiación estimulada por la gonadotrofina. Resultados similares se obtuvieron con spironolactona, inhibidor de la enzima 17α-hidroxilasa/17-20 liasa. Como conclusión, puede decirse que en B. arenarum, la espermiación inducida por hCG no está mediada por la síntesis de esteroides. Cuando el ensayo de espermiación se realizó utilizando FSH Humana recombinante (FSHrh), se observó tanto inducción de la espermiación como aumento en la síntesis de esteroides. La capacidad esteroidogénica de las células de Leydig ha sido establecida desde hace tiempo, sin embargo, la potencialidad esteroidogénica de las células de Sertoli es aún controversial. En este trabajo se informa, también, la separación de dos poblaciones celulares que responden diferencialmente a las gonadotrofinas humanas. Las fracciones con una densidad de 1.05 g/ml respondieron a hCG con un aumento en la producción de testosterona (T). Sin embargo no respondieron a FSHrh con un aumento de andrógenos ni de cAMP. La formación de cAMP fue estimulada en las fracciones con una densidad de 1.038 g/ml. Estas también respondieron a FSHrh con un aumento en la síntesis de T. Cuando FSHrh se ensayó sobre fragmentos de testículo, se observó también un aumento dosis-dependiente de la secreción de T. El método utilizado permitió la separación de dos poblaciones de células con características similares a las células de Leydig y Sertoli de cerdo y trucha. Sin embargo, la fracción con una densidad semejante a las células de Sertoli, respondió a FSHrh no solo con un aumento en la formación de cAMP, sino también con un incremento en T. Se podría concluir que el testículo de B. arenarum tendría células de Sertoli con capacidad esteroidogénica, como fuera descripto para otras especies, y que la espermiación podría ser inducida por las gonadotrofinas directamente sobre las células de Sertoli.

Abstract:
This thesis describes studies on the activity of the enzyme 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase (3βHSD/I), as well as its participation in the regulation of hCG-induced spermiation in the testes of Bufo arenarum. 3βHSD/I localises in mitochondria and microsomes. Both locations have different substrate-specificity: microsomal enzyme prefers dehydroepiandrosterone (DHE) while mitochondria1 enzyme converts only pregnenolone. As a consequence of this dual localisation, a compartmentalisation of theΔ4 and Δ5 pathway previously described in 5. arenarum, can be proposed: the Δ4 pathway in mitochondria and the Δ5 pathway in microsomes. The activity of both fractions is higher during the reproductive season than during the nonreproductive period. The inclusion of DHE in the kinetic analysis of pregnenolone conversion affected Vmax while Km was not modified, suggesting a non-competitive inhibition of the conversion of pregnenolone. The Km and Ki values suggest the presence of two different binding sites. However, when pregnenolone was added in the assays with DHEA as substrate, no effect was observed on the Vmax while Km values slightly increased with pregnenolone concentration. Consequently, pregnenolone inhibited the transformation of DHEA in a competitive fashion. The Hill coefficient for the conversion of DHE and pregnenolone are 1.04 and 1.01, respectively. These studies suggest that, in this species, the microsomal biosyntheses of androgens and progesterone are catalysed by different active sites. This thesis also employs an in vitro system to identify potential steroidal mediators of spermiation in the toad. Spermiation was induced by hCG and the effect of different inhibitors of steroid-biosynthesis was analysed. Cyanoketone, an inhibitor of 3-oxo-4-ene steroid biosynthesis, do not block hCG-inducing activity even though biosynthesis of 3-oxo-4-ene is inhibited by 95%. Aminogluthetimide, at a concentration that inhibited testosterone (T) biosynthesis, do not alter hCG actions. Similar results were obtained with spironolactone, an inhibitor of 17α-hydroxylase/17-20 lyase activity. It is possible to conclude that in B. arenarum, hCC-induced spermiation is not mediated by steroid biosynthesis. The inclusion of Human recombinant FSH (rhFSH) in the spermiation-assay not only induces spermiation but also an increase of testosterone biosynthesis. The steroidogenic capability of Leydig cell has been largely established, however, the steroidogenic potentially of Sertoli cell is still controversial. in this work it is also reported the separation of two population cells with different responsiveness to human gonadotropins. T production was stimulated by hCG in fraction with a density of 1.05 g/ml. However, this fraction did not respond to rhFSH either with an increase in cAMP production or with T synthesis. rhFSH induced cAMP production in fraction corresponding to 1.038 g/ml. This fraction also responded to rhFSH with an increase in T production. The effect of rhFSH on testosterone production by testis fragment was also assayed. The gonadotropin evoked a dose-dependent increase in T secretion. The method employed in the present work has permitted the separation of two population cells resembling pig and trout Leydig and Sertoli cells. However, the fraction with a density similar to Sertoli cells responded to rhFSH not only with an increase in cAMP production but also with an important augment in androgen synthesis. We can conclude that the testes of B. arenarum have Sertoli cells with steroidogenic capability and that spermiation could be elicited by the action of gonadotropins on Sertoli cells.

González Iglesias, Arturo E.. "Angiotensina II en la hipófisis normal e hiperplásica" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La presencia de todos los componentes del sistema renina-angiotensina (RAS) en la adenohipófisis ha sugerido que el componente activo de este sistema, el octapéptido Angiotensina II (AngII), actuaría en dicha glándula como un factor autócrino o parácrino. Aún cuando se ha demostrado que AngII libera prolactina (PRL) y adrenocorticotrofina (ACTH) tanto in vivo como in vitro a través de sus receptores de tipo l (ATl), sc ignora todavía la relevancia fisiológica dc estos efectos. El objetivo de esta Tesis fue estudiar la participación del octapéptido cn la función hipofisaria normal y cómo la misma puede alterarse por procesos patológicos característicos dc la glándula. Con tal motivo, los ensayos se realizaron en adenohipófisis de ratas hembra adultas normales y en dos modelos experimentales de adenomas hipofisarios prolactinosecretantes (prolactinomas). Dado que AngII es un secretagogo de PRL utilizamos como parametros de estudio diferentes aspectos del proceso prolactinoliberador de AngII, incluyendo su mecanismo de transducción de señales (especialmente la señalización de Ca2+i y los subtipos receptores del octapéptido involucrados en el mismo. En una primera caracterización de los efectos de AngII en adenohipófisis de rata normal (grupo control, CON), demostramos que la producción de inositol trifosfato (IP3), la movilización de Ca2+i y la liberación de PRL inducidas por AngII sufren una rápida y prolongada desensibilización homóloga y heteróloga. Asimismo, puesto que el Ca2+i es un factor esencial para la secreción hormonal y la proliferación y diferenciación celular, ampliamos nuestro estudio del mecanismo de señalización intracelular del Ca2+i en la hipófisis normal y lo comparamos en detalle con los modelos experimentales mencionados. En experimentos de cultivo primario de células adenohipofisarias y ensayos de señalización de i observamos que AngII libera PRL a concentraciones fisiológicas en la hipófisis normal (grupo CON) a través de una respuesta de i bifásica, la cual se compone de una espiga inicial dependiente de la movilización del contenido de Ca2+ de reservorios intracelulares sensibles a tapsigargina e IP3 y una fase posterior de meseta dependiente del influjo de Ca2+e. En contraste, el efecto prolactinoliberador del octapéptido se encuentra significativamente disminuido en células adenohipofisarias provenientes de prolactinomas inducidos mediante el tratamiento crónico in vivo con dietilstilbestrol (grupo DES). Además de la disminución del número de receptores hipofisarios AT1 ya descripta en este modelo experimental, la atenuación del efecto prolactinoliberador del octapéptido en estas células se encontró asociada con una profunda alteración de su patrón de señalización de i, que se caracterizó por la ausencia completa de la fase inicial de espiga de i y la presencia de una señal monofásica de tipo meseta enteramente dependiente del influjo de Ca2+e y mediada parcialmente por canales de calcio dependientes del voltaje tipo L (VDCC). A pesar de estas modificaciones, las respuestas fueron mediadas por el mismo subtipo receptor (AT1) en ambos grupos experimentales. En otros ensayos, demostramos la especificidad de la alteración de la señal de Ca2+i en respuesta al estímulo de AngII, cuyo patrón característico fue reproducido en prolactinomas de ratones con deficiencia funcional del receptor dopaminérgico D2. Por otra parte, dado que se ha descripto que el octapéptido actúa como factor angiogénico y mitogénico en varios tejidos, evaluamos la capacidad de AngII para inducir la proliferación y la activación de p44/p42 en células adenohipofisarias normales e hiperplásicas. Experimentos de incorporación de 3 -timidina indicaron que el octapéptido no promueve la proliferación celular en células adenohipofisarias tanto normales (grupo CON) como hiperplásicas (grupo DES), a pesar de que dicho agonista estimula significativamente la actividad de p44/p42 en ambos grupos. El tratamiento in vivo de las ratas estrogenizadas con el agonista dopaminérgico D2, bromocriptina (DES+Bro), retornó parcialmente la prolactinemia a niveles normales e indujo una marcada regresión de los prolactinomas, si bien no fue evidente una recuperación del contenido hipofisario de PRL. La recuperación parcial de los parámetros in vivo se correlacionó con una restauración paralela de la secreción de PRL y la espiga de Ca2+i inducidas in vitro por AngII en células hipofisarias de este grupo. Inesperadamente, el tratamiento in vivo de la hiperplasia hipofisaria con progesterona (grupo DES+P4) potenció el efecto prolactinoliberador del octapéptido a través de un mecanismo sinérgico entre los receptores AT1 y AT2, a pesar de que dicho progestágeno no revirtió ni la hiperprolactinemia ni el tamaño de los tumores. Resultados de Western Blot indicaron por primera vez la presencia de los receptores AT2 en la adenohipófisis, cuya expresión se encontró marcadamente aumentada en los grupos hiperplásicos (DES y DES+P4). Por otra parte, cuando la hiperplasia fue revertida con el tratamiento in vivo con bromocriptina (DES+Bro), la expresión del receptor AT2 disminuyó hasta recuperar el nivel expresado en el grupo control. Ninguno de los cotratamientos empleados (bromocriptina o P4) indujo cambios en la baja expresión de los receptores AT1 característica del grupo DES. En conclusión, los presentes estudios en modelos animales de prolactinoma indicarían la existencia de una compleja interrelación entre el RAS hipofisario, el sistema dopaminérgico, y los esteroides ováricos en la función hipofisaria. Modificaciones en esta delicada red de interacciones, podrían explicar la alteración del comportamiento hipofisario frente a ciertos secretagogos como AngII. Los resultados obtenidos son compatibles con la hipótesis de una activación del RAS hipofisario durante el proceso de hiperplasia y podrían ser de potencial interés en diversas áreas de la farmacoterapia como el tratamiento de prolactinomas resistentes o no a agonistas D2, el tratamiento hormonal de reemplazo en la postmenopausia y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares como la insuficiencia cardíaca y la hipertensión.

Abstract:
The description of all components of the renin-angiotensin system (RAS) in the adenohypophysis has suggested that the biologically active element of this system, the octapeptide Angiotensin II (AngII), might act locally as an autocrine and paracrine factor. In spite of that it has been previously demonstrated that AngII releases prolactin (PRL) and adrenocorticotrophin hormone (ACTH) in vivo and in vitro through type 1 receptors (AT1), the significance of these effects in endocrine physiology remain largely unknown. The main focus of the present Thesis was on the role of the octapeptide in pituitary physiology and so studies were performed in normal adult female rat adenohypophyseal cells and on prolactin-secreting tumoral cells obtained from two experimental models of prolactinoma. Since AngII is a PRL secretagoge, different aspects of the AngII induced PRL release process such as receptor subtypes involved and signal transduction mechanism (specially, intracellular Ca2+ signaling) were studied as parametters of biological action. In our first characterization studies on AngII action in normal adenohypophyseal rat cells (CON group), we showed that the octapeptide induced inositol triphosphate (IP3) production, Ca2+ mobilization and PRL release undergo homologous and heterologous desensitization that was rapid in its outcome but prolonged in its duration. Since Ca2+i is an essential factor for hormonal secretion and cell differentiation and proliferation, we extend our work on the Ca2+i signaling mechanism evoked by AngII in normal pituitaries in order to compare it in detail with responses obtained in the above mentioned prolactinoma models. In primary cell culture and Ca2+i signaling assays, we demonstrated that AngII releases PRL at physiological concentrations in normal adenohypophyseal cells (CON group) through a biphasic i response composed by an initial spike increase dependent on IP3 and tapsigargin sensitive intracellular Ca2+ pools and a delayed plateau phase that relied in Ca2+e influx. In contrast, the octapeptide PRL releasing effect was found to be significantly diminished in adenohypophyseal cells from experimental prolactinomas induced in vivo by chronic treatment with dietilstilbestrol (DES group). Besides the previously described downregulation of hypophyseal AT1 receptors in this experimental model, attenuation of the AngII induced prolactin releasing effect in these cells was found to be associated with a dramatic alteration in its i signaling pattern, which was characterized by a complete absence of the initial i Spike phase, and the presence of a monophasic, plateau phase entirely dependent on e influx and partially mediated by L- type voltage dependent calcium channels (L type-VDCC). In spite of these changes, responses were mediated by the same receptor subtype (AT1) in both experimental groups. Further studies demonstrated that the alteration of the AngII induced i signal was specific; and its characteristical pattern could be reproduced in experimental prolactinomas from dopamine D2 receptor-deficient mice. Since it was described that the octapeptide can act as both an angiogenic and a mitogenic factor in several tissues, we evaluated the ability of AngII to induce cell proliferation and activation of p44/p42 in normal (CON group) and hyperplasic (DES group) adenohypophyseal cells. -tymidine incorporation assays showed that the octapeptide does not promote cell proliferation in adenohypophyseal cells from either group at the concentration range studied (0.1-100 nM), though the agonist significantly stimulates p44 and p42 activity in these cells. In vivo treatment of estrogenized rats with a D2 receptor dopaminergic agonist, bromocriptine (DES+Bro group), paitially returned prolactinemia to normal values and induced a remarkable regression of the pituitaiy adenomas, though a restoration of pituitary PRL content was not evident. Partial recovery of the in vivo parameters was correlated with a paralleled restoration of in vitro effects of AngII on PRL secretion and i spike increase in freshly obtained adenohypophyseal cells from this group. Unexpectcdly, though the in vivo treatment of pituitary hyperplasia with progesterone (DES+P4 group) could not revert neither the hiperprolactinemia nor the adenoma growth, it effectively potentiated the octapeptide PRL releasing effect through a sinergistic mechanism that couples both AT1 and AT2 receptors. Western blot results indicated for the first time the unequivocal presence of AT2 receptor subtype expression at the adenohypophysis, which was found notably upregulated in the hyperplasic groups (DES and DES+P4 groups). On the other hand, when development of hyperplasia was reverted by the in vivo co-treatment with bromocriptine (DES+Bro group), AT2 receptor expression dropped until it recovered control levels. Neither bromocriptine, nor P4 cotreatrnent induced any change on the diminished AT1 receptor expression level typical of hyperplasic cells. In conclusion, the present studies and results drawn from these animal models of prolactinoma seem to indicate the existence of a complex anay of interactions between the hypophyseal RAS, the dopaminergic system and ovaric steroids, that determine pituitary function. Subtle changes in this delicate net of interactions might explain the alteration of pituitary behaviour in front of certain secretagogues such as AngII. The results obtained are compatible with the hypothesis that RAS becomes activated during the genesis of the hyperplasic process in the pituitary, and thus they might be of potential interest in multiple areas of pharmacotherapy, like the treatment of agonist D2 resistant prolactinomas, replacement hormone therapy at postmenopausia and the management of cardiovascular disorders like cardiac failure and hypertension.

Perez Castro, Carolina Inés. "Rol de la familia de citoquinas gp130 en la regulación de la función hipofisaria" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las cítoquinas mas conocidas en la regulación de la función de células de la pituitaria anterior son LIF e IL-6. Estas cítoquinas, junto con IL-11, oncostatina M, CNTF y cardiotrofma-1, son referidas como cítoquinas gp 130, debido a que comparten el mismo transductor de señales. En la presente tesis, se estudió el papel de las cítoquinas de la familia gp130 en células de la pitutaria anterior. Se encontró que, tanto células TtT (foliculoestrlladas-FS) como GH3 (lactosomatotrofas) expresan el mRNA para la cadena específica α del receptor de IL-11 (IL-11-R) y de CNTF-R. Ambas cítoquinas estimulan la proliferación de células FS y células GH3. También, CNTF estimula la producción hormonal (GH y PRL) en células GH3 e IL-11 la secreción de VEGF en células FS. Ambos tipos celulares expresan el mRNA para CNTF. Células normales de pituitaria anterior y adenomas humanos también expresan CNTF-R(α).IL-11 y CNTF estimulan en forma similar los niveles del mRNA GH en cultivos celulares acromegálicos en monocapa, sin modificar los niveles de secreción hormonal. CNTF estimula la secreción de PRL en monocapa de prolactinomas. En cultivos en monocapa de células normales, IL-11 y CNTF no modifican la secreción de GH y PRL, ni los niveles del mRNA GH. Sin embargo, cuando las células son cultivadas en forma de agregados celulares, ambas cítoquinas estimulan la secreción de dichas hormonas. Se estudió además la acción de esta familia de cítoquinas sobre los procesos tumorigénicos. En clones estables de células GH3 que sobreexpresan gp130 (gp130 sentido), y clones de expresión reducida (gp130 antisentido), se examinó la secreción hormonal, la proliferación celular y la capacidad tumorigénica de los clones en ratones nude. La sobreexpresión de gp130 no modificó el comportamiento celular. Sin embargo, los clones gp130 antisentido, que no responden al estímulo específico de la citoquina gp130, mostraron una marcada inhibición in vitro y en el desarrollo de tumores in vivo. Mediante la técnica de Differential Display se aisló e identificó un cDNA (X2CR1) el cual se expresa diferencialmente en células que sobreexpresan gp130. Este cDNA codifica para una proteina de 195-aa; no posee motivos funcionales conocidos y posee una localización citoplasmática/nuclear. Su perfil de expresión (mRNA) correlaciona con el de gp130. Presenta una secuencia altamente conservada (entre rata y humano), y dos isoformas (mRNA) en los distintos tejidos analizados. La sobreexpresión de X2CR1, regula negativamente tanto la expresión basal del promotor de GH, así como la estimulación con cAMP. De estos resultados se puede concluir: - las cítoquinas gp130 y sus receptores, se expresan y son funcionales en células normales como tumorales de la pituitaria anterior. IL-11 y CNTF son capaces de regular, a través del transductor común gp130, la secreción de hormonas y factores angiogénicos, así como la proliferación celular. La estructura de la glándula es de crítica importancia para la acción de estas cítoquinas; - la sobreexpresión de gp130 en células GH3 no modifica rotundamente el comportamiento celular. Sin embargo, la disminución en los niveles de expresión, refleja la importancia de la acción de las cítoquinas de esta familia no sólo en situaciones fisiológicas sino patofisiológicas como en la formación y/o el mantenimiento de adenomas hipofisarios; - células lactosomatotrofas sobreexpresoras de gp130, expresan diferencialmente X2CR1. Esta nueva proteína podría tener un papel como regulador negativo de las acciones de gp130 así como de otras rutas de señalización intracelular (como en la de CAMP).

Abstract:
Two of the most potent cytokines regulating anterior pituitary cell function are LIF and IL-6. These and others like IL-11, oncostatín M, CNTF and cardiotropin- 1 are referred to as the gp130 cytokines, because they share the gp130 protein as an initial signal transducer. In the present thesis of work, we studied the role of the gpl30 cytokine family in anterior pituitary cells. Receptors (mRNA α-chain specific) for IL-11 and CNTF are expressed on both lactosomatotropic (GH3 cells) and folliculostellate-FS cells (TtT cells). Both cytokines stimulate the proliferation of FS and GH3 cells. In addition, CNTF stimulates the hormonal production (GH and PRL) by GH3 cells and IL-11 stimulates the secretion of VEGF, by FS cells. Both GH3 and FS cells express the CNTF mRNA. The mRNA for the CNTF-R is expressed in all of the human adenoma types analyzed and normal pituitary cells. CNTF and IL-11 exerted a similar stimulatory effect on GH mRNA expression in acromegalic monolayers cell cultures, but these cytokines had no significant influence on GH secretion. CNTF stimulates prolactine secretion in prolactinoma monolayers cell cultures. In monolayers cell cultures from normal rat anterior pituitary, IL-11 and CNTF had no significant effect on the release of either GH or PRL, or on the level of GH mRNA. However, when these cells were cultured in aggregate cultures, both cytokines stimulated hormonal secretion. We generated GH3 gp130 stable clones (gp130 sense and gp130 antisense), in order to study the role of gp130 cytokine family in the tumorigenic process. We examined hormonal secretion, cell growth and tumorigenesis properties in athymic nude mice. The overexpressed gp130 clones did not shown any changes in the cellular behavior. The gp130 antisense clones did not respond to the specific gp130. Likewise, GH3 gp130 antisense cells had severely impaired the in vivo tumor development. By Differential Display technique, we isolated and identified a new cDNA (X2CR1), which differentially expressed in overexpressed gp130 cells. This cDNA encodes a protein of 195-aa, which contains no well-characterized functional motifs and shows a citoplasmic/nuclear localization. Its expression profile (mRNA) is linked with the gp130 expression. The rat X2CRl shares striking sequence homology with its human counterpart, and in the human tissues that we analyzed it presents two different isoforms. GH promoter baseline activity and also under CAMP stimulation were reduced by overexpression of X2CR1. From these results the following conclusions can be drawn: - the gp130 cytokines and their receptors are expressed and are functional in normal anterior pituitary cells and pituitary tumor cells. CNTF and IL-11 regulate, through gp130 transducer, the secretion of hormone, VEGF and the cell proliferation. The three-dimensional structure of the gland is critical for these actions; - the overexpressed gp130 protein did not produce any changes in the GH3 cellular behavior. In contrast, the reduction gp130 level, revealed the importance of the gp130 cytokines actions not only in physiological but also in patophysiological situations, like the beginning and/or the maintenance of pituitary adenoma development; - X2CR1, a novel protein isolated from overexpressed gp130 GH3 cells, may function as a negative regulator of the gp130 cytokines actions, and also may play a similar role in another intracellular pathways (like cAMP signaling).

Parborell, M.Fernanda A.. "Regulación del crecimiento y diferenciación del folículo ovárico por un agonista de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH)" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la administración de un agonista de Gn-RH (Acetato de Leuprolide, LA) sobre la apoptosis y la esteroidogénesis ovárica. Se administró dietilestilbestrol (DES) a ratas prepúberes para obtener una población de folículos antrales tempranos. Por otro lado, se utilizó un modelo de ratas inmaduras superovuladas con gonadotrofinas (PMSG: gonadotrofina de suero de yegua preñada) con el objetivo de estimular la foliculogénesis hasta el estadío de folículos preovulatorios; parte de estos animales fueron tratados in vivo con LA tanto en forma crónica como aguda. En folículos preovulatorios, LA produce un efecto directo inhibitorio sobre el desarrollo folicular, causando una disminución del número de folículos reclutados por las gonadotrofinas o bien llevando a la atresia a un mayor número de los mismos. Tanto el efecto in vivo como in vitro de LA produce un aumento de la apoptosis en los folículos preovulatorios provenientes de ratas tratadas con PMSG y este efecto es revertido parcialmente in vitro por EGF. El IGF-1 y el FGF fueron capaces de inhibir completamente el efecto estimulatorio de la apoptosis inducida por el agregado in vitro de LA. Con respecto a la familia de Bcl-2, LA disminuye la estabilidad de la isoforrna antiapoptótica (Bcl-xL), favoreciendo la apoptosis. LA aumenta los niveles de progesterona tisular y disminuye los niveles de estradiol sérico; no modifica los niveles de la enzima P450 scc pero aumenta el contenido de la StAR en folículos preovulatorios. En folículos antrales tempranos, FSH suprime parcialmente la apoptosis inducida por LA. En presencia del agonista, EGF, FGF e IGF-1 no son capaces de rescatar a los folículos de la apoptosis. Teniendo en cuenta las diferencias entre el efecto de FSH y los factores de crecimiento, se sugiere la existencia de un mecanismo complejo de transducción de señales para FSH en la prevención de la apoptosis que utilizaría un mecanismo de sobrevivencia que incluye señales diferentes a las usadas por los factores de crecimiento. En conclusión, GnRH-a sería un modulador atretogénico intraovárico que interfiere en el desarrollo folicular.

Sorianello, Eleonora Mariana. "Fisiopatología de un tumor ovárico experimental" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de esta tesis fue el estudio de distintos aspectos de la biología y fisiopatología de un tumor ovárico experimental altamente luteinizado (luteoma). Se analizaron parámetros relacionados a la proliferación celular, apoptosis, capacidad de síntesis esteroidogénica y de secreción del tumor. Se halló que el luteoma se desarrollaría preferentemente por hipertrofia y proliferación de células foliculares y una marcada ausencia de apoptosis. Además se detectó la síntesis de las distintas subunidades de inhibina a lo largo de 7 meses de desarrollo tumoral; se evidenciaron patrones fluctuantes a lo largo del tiempo para las subunidades β, que correlacionan estrechamente con los niveles séricos de FSH, demostrando así que tejido altamente luteinizado es capaz de producir inhibinas. Posteriormente, se estudió el camino de señalización de un análogo superactivo del GnRH, Buserelina, en células provenientes del luteoma, evidenciando que el camino clásico de transducción de señales acoplado al receptor de GnRH se encontraba alterado y hallándose los caminos altemativos activados por el decapéptido. Por otro lado, se puso de manifiesto la expresión del mRNA y del péptido de GnRH en células del luteoma, postulándose para el mismo un papel autocrino/paracrino en dicho tejido. Finalmente, evaluamos el efecto de drogas inmunosupresoras, Ciclosporina A y Dexametasona, sobre el desarrollo del tumor in vivo en comparación con animales con operación ficticia (Sham) a lo largo de 7 semanas. Los resultados indicaron que, a pesar de ser efectiva la inmunosupresión inducida por estas drogas sobre variables inmunológicas, las mismas no afectaron el desarrollo tumoral. A diferencia de los animales portadores del tumor, en animales Sham la Ciclosporina A indujo efectos sobre varios parámetros, sugiriendo la presencia de factor/es secretado/s por el tumor que impiden o compensan algunas de las acciones de la droga. Estos estudios aportaron nuevos conocimientos acerca de caracteristicas relacionadas al desarrollo y capacidad de síntesis y secreción del luteoma, como así también de caminos de señalización del receptor de GnRH y comportamiento del tumor bajo tratamiento con drogas inmunosupresoras.

Abstract:
The aim of this thesis was to study different aspects regarding the biology and physiopathology of a highly luteinized experimental ovarian tumor (luteoma). Parameters related to cellular proliferation, apoptosis, steroidogenic capacity and tumor secretion were analyzed. These demonstrated that tumors develop mainly due to proliferation of follicular cells, while a marked absence of apoptosis was also observed. In addition, synthesis of inhibin subunits was detected along 7 months of tumor growth, showing fluctuating expression of B subunits along development, tightly correlating with serum FSH levels. It was thus demonstrated that highly luteinized tissue is able to produce inhibins. The signaling pathways of a superactive analog of GnRH, Buserelin, were studied in luteoma cells, showing that the classical transduction system coupled to the GnRH receptor was markedly altered and describing the alternate pathways activated by the decapeptide in luteoma cells. Moreover, the expression of the GnRH mRNA and peptide was evidenced in luteoma cells, suggesting a possible role as an autocrine/paracrine modulator. Furthermore, the effects of immunosuppressive drugs such as Cyclosporine A and Dexamethasone were evaluated on in vivo tumor growth in comparison to Sham-operated animals along 7 weeks of treatment. Results showed that even though the drug-induced immunosuppression was evidenced on immunological variables, tumor growth was not altered. Marking a difference with tumor-bearing rats, in Sham animals Cyclosporin A affected various parameters, suggesting tumor secreted factor/s which would inhibit or compensate some of the drug’s actions. These studies have contributed new understanding concerning tumor characteristics related to tumor growth, synthesis and secretion capacity as well as different signaling pathways activated by GnRH and tumor behavior under immunosuppression.

Velardez, Miguel Omar. "Efecto del óxido nítrico sobre la fisiología de la adenohipófisis de la rata" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Antecedentes La regulación de los distintos procesos fisiológicos de la adenohipófisis, tales como desarrollo, diferenciación, secreción hormonal y muerte celular, implica la acción de una variedad de factores provenientes tanto de tejidos periféricos como del sistema nervioso central o de la propias células adenohipofisarias. El óxido nítrico (NO) puede regular la secreción de hormonas hipofisarias. Previamente demostramos que el NO inhibe la secreción basal de prolactina afectando diferentes mecanismos intracelulares. Sin embargo la acción del NO sobre las vías de segundos mensajeros de origen lipídico necesita ser estudiada. Por otro lado, existen diversos estados fisiológicos como la terminación de la lactancia o patofisiológicos como los procesos inflamatorios que pueden inducir muerte celular en la adenohipófisis. A pesar de que la muerte celular parece ser un evento frecuente en la adenohipófisis, son pocos los estudios realizados hasta el momento sobre posibles factores intrahipofisarios inductores de apoptosis. Objetivos Evaluar la acción del NO sobre el metabolismo de mensaieros intracelulares de origen lipídico que afectan la secreción de prolactina adenohipofisaria. Investigar el efecto del NO sobre la viabilidad celular adenohipofisaria. Métodos Se investigó el efecto del NO sobre la actividad de las lipooxigenasas (LOX) y de las ciclooxigenasas (COX) y su relación con la secreción de prolactina mediante la utilización de dadores de NO y sustratos e inhibidores de las NO sintasas (NOS) en adenohipófisis enteras. Se determinó la producción de metabolitos del ócido araquidónico (AA) por la técnica de radioconversión usando como precursor AA radioactivo. También se estudió el efecto del NO sobre el metabolismo de fosfoinosítidos en células adenohipofisarias de rata y su relación con la secreción de prolactina. Se utilizaron dadores de NO e inhibidores de las NOS en cultivos primarios de adenohipófisis premarcados con inositol radioactivo como precursor de los distintos inositoles fosfato (IPs). Se cuantificó la producción de IPs por cromatografía de intercambio iónico. En ambos casos se estudiaron los posibles mecanismos por los cuales el NO afectó la síntesis de dichos segundos mensajeros. Para estudiar la acción del NO sobre la viabilidad celular adenohipofisaria, se examinó la actividad celular (ensayo de MTT)y la morfología nuclear de las células adenohipofisarias en cultivo, utilizando DETA/NO como un dador de acción prolongada. Se estudiaron diferentes mecanismos por los cuales el NO podría afectar la viabilidad celular (capacidad nitrosilante, acción de los peroxinitritos, activación de las caspasas). Ademós, mediante técnicas inmunocitoquímicas, se determinaron los tipos celulares afectados por el NO. En todos los casos se cuantificó la liberación de prolactina por radioinmunoensayo. Resultados El NO inhibió la actividad de la LOX produciendo una disminución de la síntesis de 5-HETE y estimuló la actividad de la COX aumentando la síntesis de prostaglandinas y tromboxanos. Dado que el 5-HETE esta involucrado en la estimulación de la secreción basal de prolactina, y que ésta es la única hormona adenohipofisaria con una liberación basal espontánea, es probable que la disminución de la actividad de la LOX inducida por el NO esté mediando en parte el efecto inhibitorio tónico del NO sobre la liberación basal de prolactina. El NO inhibió la síntesis de IPs estimulada por Angll o TRH, sin afectar su síntesis basal. La inhibición de la actividad de la PLC por NO involucraría un mecanismo independiente de la vía guanilil ciclasa soluble / cGMP / PKG. El NO no tendría una acción directa sobre la PLC, sino que estaría modificando algún factor de la vía de transducción de señales localizado entre el receptor de membrana y la proteína G. Con respecto al efecto del NO sobre la viabilidad celular, demostramos que el NO produce muerte celular con características propias de un proceso apoptótico. En este proceso participarían la caspasa-3 y la caspasa-9 pero no estarían involucrados mecanismos de nitrosilación o la acción de peroxinitritos. Asimismo, la acción proapoptótica del NO parece afectar preferencialemente a los lactotropos. Conclusión El NO al afectar dos procesos fisiológicos fundamentales de la adenohipófisis como son la secreción hormonal y la muerte celular, puede ser considerado como un factor clave dentro los reguladores de la fisiología de la adenohipófisis.

Abstract:
Background The regulation of the physiological processes in anterior pituitary, such as development, differentiation, hormone secretion and cell death, involves a variety of factors coming from peripheral tissues, central nervous system and the pituitary itself. Nitric oxide (NO) is able to regulate anterior pituitary hormone release. Previously, we demonstrated that NO inhibits basal prolactin release by affecting several intracellular pathways. However, NO action on lipidic second messengers in anterior pituitary needs further investigation. On the other hand, there are some physiological -such as termination of lactation-, or pathophysiological states -such as inflammation-, which can induce cell death in the anterior pituitary gland. In spite of the fact that cell death is a frequent event in the anterior pituitary gland, there is little evidence about possible apoptosis inducing factors synthesized by anterior pituitary cells. Objectives To evaluate NO action on lipidic intracellular messengers that affect prolactin secretion. To investigate the effect of NO on anterior pituitary cell viability. Methods NO action on lipooxygenase (LOX)and cyclooxygenase (COX) activities and their relation with prolactin release were investigated by using NO donors and NOS substrate and inhibitors in whole anterior pituitaries. Production of arachidonic acid (AA) metabolites was carried out by a radioconversion technique, using radiolabeled AA as a precursor. Also the effect of NO on phosphoinositides metabolism in rat anterior pituitary cells was studied. We used NO donors and NOS substrate and inhibitors in primary cultures of anterior pituitary cells prelabeled with radioactive inositol as a precursor of inositol phosphates (IPs).Production of IPs was quantified by ionic exchange chromatography. In all cases we studied the mechanisms of action by which NO affected the synthesis of those second messengers. In order to study NO action on anterior pituitary cell viability, we investigated the changes in cellular activity (MTT assay) and nuclear morphology in primary cultures of anterior pituitary cells by using DETA/NO as a long term NO releaser. We studied different mechanisms by which NO could affect cell viability (nytrosylating activity, peroxynitrite action, caspases activation). Besides, we determined the cell types affected by NO by immunocytochemistry. In all cases prolactin release was quantified by radioimmunoassay. Results NO inhibited LOX activity producing a decrease in 5-HETE synthesis, and stimulated COX activity producing an increase of prostaglandins and thromboxanes. Since 5-HETE is involved in the stimulation of basal prolactin release and taking into account that prolactin is the only anterior pituitary hormone with an spontaneously high basal release, it is possible that the decrease in LOX activity induced by NO is mediating, at least in part, the tonic inhibitory effect of NO on prolactin release. NO inhibited Angll- or TRH-stimulated IPs synthesis, without affecting basal synthesis. The inhibition of PLC activity may involve a soluble guanylyl cyclase/cGMP/PKG-independent mechanism. NO seems not to act on PLC, but it could be modifying some factor localized between membrane receptor and G protein. Concerning NO effect on cell viability, we demonstrated that NO produces cell death with characteristics of apoptosis. In this effect, caspase-3 and caspase-9 but not nytrosylation events or peroxynitrites may be participating. Likewise, lactotrophs seem to be preferentially affected by the proapoptotic action of NO. Conclusion NO affected two relevant physiological processes in the anterior pituitary gland, hormonal secretion and cell death. Therefore, it could be considered as a key regulatory factor of the physiology of the rat anterior pituitary gland.

Helguero, Luisa Alejandra. "Expresión y funcionalidad del receptor de progesterona (RP) en la modulación del crecimiento hormono-dependiente y en la adquisición de resistencia al tratamiento hormonal de un modelo murino de carcinogénesis mamaria" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de mama es la segunda causa de muerte en las mujeres, luego del cáncer de pulmón. En el desarrollo de esta enfermedad se postulan distintas etapas biológicas que van progresando desde un crecimiento hormono-dependiente a uno hormono-independiente, lo que está asociado a un aumento de la agresividad. En la clínica, si el tumor expresa receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP), una parte importante de los enfoques terapéuticos de elección, es la hormonoterapia con el antiestrógeno tamoxifeno. Sin bien en un principio la gran mayoría de los pacientes responden, con frecuencia el tumor evoluciona hacia la resistencia al tratamiento hormonal, lo que se asocia a diseminación generalizada. Esta resistencia, cuyos mecanismos aun se desconocen, no implica en general una pérdida de expresión de receptores hormonales y todo parece indicar que, o bien existe un cambio intrínseco en éstos, o en los mecanismos que regulan su expresión y activación. En nuestro laboratorio desarrollamos un modelo de adenocarcinomas mamarios murinos por la administración prolongada de MPA en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Estos tumores son en su mayoría de origen ductal con capacidad invasora. En un principio poseen un comportamiento progestágeno-dependiente (PD), requiriendo de la hormona trófica para su crecimiento y expresan RE y RP, pero con el tiempo pueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, en el cual se conserva aún la expresión de receptores. Previamente hemos demostrado que el RP estaria involucrado en la adquisición de hormonodependencia. El objetivo de este trabajo fue estudiar el papel del RP en la transición de hormono-dependencia a independencia y en la adquisición de resistencia hormonal. Para este estudio utilizamos seis tumores PD y nueve progestágeno-independientes. Caracterizamos la respuesta in vivo de los tumores independientes al tratamiento con los antiprogestágenos onapristona y mifepristona y al 17-β-estradiol. Seis tumores respondieron regresionando, y los llamarnos progestágeno-independientes respondedores (PI-NR) y tres no respondieron; a éstos los denominamos progestágeno-independientes no respondedores (PI-NR). En nuestro laboratorio ya se había evaluado la respuesta in vivo de los tumores PD, y respondieron a estrógenos y antiprogestágenos con regresión. Cuando, en cultivos primarios de un tumor PD, estudiamos la respuesta proliferativa a MPA in vitro observamos que la misma fue bifásica, con dos pendientes estimulatorias, una a concentraciones muy bajas (EC50 = 1.5 ± 0.7 fM) y la otra a concentraciones más altas (EC50 = 0.33 ± 0.3 nM). Con estos resultados, evaluamos por unión del ligando la expresión de receptores en todos los tumores y en tejidos normales. En útero normal, y en tumores PD y PI-R, descubrimos dos sitios receptores de progesterona, uno de alta afinidad no descrito previamente en el RP (Kd = 43 ± 9 pM, Q = 9 ± 2 fmoles/mg de proteína) y el otro sitio clásico que habíamos hallado previamente (Kd= 9.2 ± 4 nM). En los tumores PI-NR no se pudieron determinar estos parámetros. El estudio de la distribución subcelular de RP mostró que en los tumores PD y PI-R se localizan principalmente en el citosol, y son regulados por MPA, mientras que en los tumores PI-NR están principalmente en el núcleo y no son regulados. Sin embargo, durante el ciclo estral, los sitios receptores son regulados en todos los tipos de tumor estudiados. Para caracterizar la expresión de las isoformas del RP utilizamos Western blot. En los tumores PD y PI-R se encontraron ambas isoformas, RPa y RPb, con patrón de expresión similar al de los controles normales, útero y mama de ratón. Encontramos además, una proteína de 78 kDa que se expresa exclusivamente en los tumores, pero no en los tejidos normales. Desconocemos su naturaleza, pero se ha descrito una proteína similar en un 25 % de tumores humanos. Su ausencia de tejidos normales sugiere una posible aplicación como marcador tumoral. Con MPA, ambas isoformas RPA y RPB se regulan negativamente en forma similar. En los tumores PI-R se regula preferencialmente RPb, esto sugeriría un papel del RP en este tipo de crecimiento en particular por RPb. En los tumores PI-NR se detectaron menores niveles de RP, principalmente de RPb. Por estudios de Western Blot se podría predecir la capacidad de los tumores de responder al tratamiento hormonal. Por inmunohistoquímica, no se observaron diferencias en el patrón de marcación entre los tres tipos de tumores. Todos fueron positivos, con un porcentaje de células marcadas del 50 % o más. Los resultados de SSCP indican que la reactividad diferencial de los anticuerpos con Western blot e inmunohistoquímica no se debe a mutaciones en el gen de RP. Hemos teorizado la posibilidad de cambios de expresión de epitopes secundarios al distinto procesado de los tejidos en las técnicas. La caracterización de ARN por protección a RNasa indica que los niveles de RP en tumores PI-R y PI-NR son similares. Es probable que, en los tumores PI-NR, las diferencias de expresión observadas con Western blot se deban a cambios post-traduccionales. Con oligonucleótídos antisentido del RP (asRP) en cultivos primarios de tumores PI-NR demostramos que los RP están involucrados en la proliferación celular aún cuando han perdido la capacidad de unir al antiprogestágeno. Estos resultados, de ser extrapolables al humano indicarían que, en el tratamiento del cáncer de mama resistente a la terapia hormonal aún se podrían utilizar estrategias diseñadas a bloquear la funcionalidad de los receptores hormonales.

Abstract:
Breast cancer is, after lung cancer, the second cause of death in women. The development of this disease occurs through different stages from a hormone-dependent to a hormone-independent growth, which is associated to increased aggressiveness. One of the treatments of choice for ER and PR positive breast cancer is hormone therapy with the antiestrogen tamoxifen. Most of the patients respond, although eventually the tumor becomes refractory and the disease progresses. The mechanisms of resistance remain unknown, but most tumors still express hormone receptors, indicating that there is either an intrinsic modification on these molecules, or in the regulation of their expression and activation. In our laboratory, we have developed a murine mammary adenocarcinoma model by prolonged administration of MPA on female virgin BALB/c mice. Most of these tumors are invasive ductal carcinomas, disclosing a progestin-dependent pattern of growth (PD) and they express ER and PR. Either spontaneously or by successive transplantations in animals not treated with hormones, progestin-independent tumors may arise that maintain the expression of hormone receptors. Our goal was to study the role of PR in the transition from hormone-dependence to independence and in the acquisition of resistance to hormonal therapy. We characterized the in vivo response of progestin-independent tumors to the antiprogestins onapristone and mifepristone and to 17-β-estradiol. Six tumors regressed, and we named them responsive progestin-independent (R-PI); three did not respond and were named unresponsive progestin-independent tumors (UR-PI). We studied the proliferative response to MPA in vitro on primary cultures of a PD tumor, and observed that it was biphasic, with two stimulatory slopes, one at very low concentrations (EC50 = 1.5 ± 0.7 fM), and the other at higher concentrations (EC50 = 0.33 ± 0.3 nM). Based on these results we evaluated the receptor expression by radioligand binding in all the tumors and normal tissues. In uterus, PD and R-PI tumors, we discovered two sites for the progesterone receptor, one of high affinity not previously reported (Kd = 43 ± 9 pM, Q = 9 ± 2 fmoles/mg de protein) and the other site which corresponds to the classical PR described by others (Kd = 9.2 ± 4 nM, Q = 376 ± 74 fmoles/mg de protein). PR, in PD and R-PI tumors, are mainly localized in the cytosol, and are regulated by MPA, while in UR-PI tumors they are mainly in the nucleus and are not regulated by this hormone. Nevertheless, the receptor sites were regulated through the estral cycle in all the tumor types studied. To characterize PR isoform expression we used Western blot. We found both PRa and PRb isoforms in PD and R-PI tumors, with a similar expression pattern compared to the control tissue uterus and normal mammary gland. We also found a 78 kDa protein which is exclusively expressed in tumors but not in normal tissue. Its nature remains unknown but a similar protein has been described in 25 % of human cancers. Its absence in normal tissues suggests a possible use as a tumor marker. With MPA treatment, both PRa and PRb are down regulated. PRb is preferentially down regulated in R-PI tumors and this may be indicating its role in this type of growth. Lower levels of PR were detected in UR-PI tumors, particularly PRb. Based on the Western blot studies the ability of the tumors to respond to hormonal treatment could be predicted. PR expression was also studied by immunohistochemistry. No differences were observed between the staining patterns of the three tumor types. The signal was positive in 50% or more nuclei. We conclude based on the SSCP studies that the differential reactivity between the antibodies used in Western blot and immunohistochemistry is not due to mutations in the PR gene. We theorize the possibility that these changes are product of modifications in the epitope expression due to the processing of the sample for each technique, or to post-translational changes. The studies at RNA level by RNase protection assay indicate that PR expression levels in R-PI and UR-PI tumors are similar. Probably, in UR-PI tumors the lower expression levels observed with Western blot are due to post-translational modifications. In primary cultures of UR-PI tumors, using antisense oligonucleotides to PR (asPR) we demonstrated that PR are involved in cell proliferation even when they have lost their ability to bind to the antiprogestagens. The importance of these observations relies in that, if these results to humans are possible to extrapolate to human, in the treatment of hormone resistant breast cancer strategies designed to block the functionality of these receptors could still be used.

Lamb, Caroline A.. "Mecanismos involucrados en la adquisición de la hormono-independncia : interacción entre receptores de progesterona y otras vías de señalización" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo de Tesis se evaluaron las siguientes hipótesis: 1. El receptor de progesterona (RP) está involucradoen el crecimiento tumoral progestágeno-independiente (PI). 2. Vias preliferativas activadas por factores de crecimiento activan al RP. 3. Factores del estrema tumoral participan en la transición hacia la hormono-independencia activando RP. 4. Los receptores de estrógenos alfa (REα) tienen un rol en el crecimiento tumoral pregestágeno-dependiente (PD). Los ensayos se realizaron en un modelo experimental de inducción de cáncer de mama por administración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Los tumores utilizados fueron todos carcinomas ductales metastáticos con alto contenido de RE y RP, que se comportan como hormono-dependientes en los primeros pasajes subcutáneos singeneicos, creciendo sólo en presencia de progestágenos. En pasajes sucesivos pueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, independizándose del requerimiento de hormonas, pero aún así mantienen la expresión de RE y RP. Un estudio de comportamiento de una serie de tumores PI, nos condujo a subclasificarlos en respondedores (PI-R) o no respondedores (PI-NR) (Helguero y col. Breast Cancer Res and Treat 79: 379-390, 2003) de acuerdo a la sensibilidad in vivo para regresionar con el tratamiento a antiprogestágenos. Para evaluar si existen factores de crecimiento capaces de reemplazar a los progestágenos en la estimulación de la proliferación celular en cultivos primarios de un tumor PD, el CC4-HD, usamos al bFGF y bloqueamos el RP mediante el uso de antiprogestágenos (RU 486 y ZK 299) y mediante el uso de oligonucleótidos antisentido. En todos los casos el bloqueo del RP inhibió la proliferación celular inducida por MPA, factores séricos o bFGF, de manera específica. Resultados similares se obtuvieron utilizando cultivos primarios de 3 tumores PI diferentes: 59-2-HI, C7-2-HI y CC4-HI. Estudios de Mobility Gel Shift confirmaron que tanto el MPA como el bFGF pueden inducir la activación del RP en células en cultivo y que los mismos se encuentran constitutivamente activados en cultivos primarios de tumores PI. Por otra parte se demostró que in vivo la terapia con oligonucleótidos antisentido de RP fue capaz de inducir una inhibición del crecimiento tumoral. Los tumores de animales tratados mostraron una significativa reducción de células en fase proliferativa y en la expresión de RP. Se observó incremento de apoptosis sólo en un tumor en el cual el tratamiento indujo reducción de tamaño. Para evaluar la expresión del bFGF y los receptores (RFGF 1 al 4) en los tumores PD y PI procedimos a evaluar primero su expresión en distintos estadios del desarrollo de glándulas mamarias normales por inmunohistoquímica. Si bien la expresión de bFGF en la mama normal de ratón ya estaba reportada, nuestros estudios revelaron una regulación de la expresión en el desarrollo. Los 4 receptores también se expresan en las mamas normales y su expresión también está regulada en los distintos estadíos del desarrollo. Por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia no se detectaron diferencias evaluables de expresión de bFGF o de sus receptores entre tumores PD y PI-R; si bien se pudo determinar la marcación de bFGF predominantemente estromal y la de los receptores en el parénquima tumoral. Los RFGF 2 y 3 están ampliamente expresados con localización nuclear además de la convencional. Debido a que con la técnica inmunohistoquímica no se puede discriminar entre las distintas isoformas de bFGF, se hicieron estudios de Western blots para identificar la isofonna clásica de 16kDa. Se detectó una mayor expresión de esta isoforma cuando los tumores PD crecían en ausencia de progestágenos. Para poder evaluar mejor la contribución de las células epiteliales o los fibroblastos en la expresión de bFGF, separamos ambas poblaciones y se hicieron cultivos primarios. Observamos mayor expresión de bFGF en los fibroblastos estromales de tumores PI que en los de tumores PD. En su conjunto estos datos indicarían que el bFGF estromal podría contribuir a inducir la proliferación celular en tumores PI a través de la activación de RP. En co-cultivos de células epiteliales obtenidas de un tumor PD con fibroblastos estromales obtenidos de un tumor PD o de uno PI se demostró que ambos fibroblastos ejercían un efecto sinérgico de la proliferación celular y que este efecto era mayor con los fibroblastos PI. A la inversa, células epiteliales PI cultivadas con fibroblastos PD crecieron más lentamente que al cultivarlas con fibroblastos PI. En el primer capitlo concluímos que los tumores con fenotipo PD y los PI-R necesitan de un RP funcional para proliferar y que el estroma cumple una participación activa en el crecimiento tumoral. En el crecimiento PI-R, el bFGF junto con otros factores provenientes del estroma podría estar activando los RP presentes en el parénquima, contribuyendo al fenotipo PI. El estroma PI liberaría una mayor cantidad de factores en respuesta a señales del parénquima. En el segundo capítulo estudiamos la participación del RE en el crecimiento tumoral PD y para ello bloqueamos el REα con un antiestrógeno puro, el ICI 182.780 y oligonucleótidos antisentido de REα. Como resultado, en ambos casos obtuvimos una inhibición de la proliferación celular acompañada por una disminución de expresión de RP, sugiriendo que el REα participa en el crecimiento PD y que la alta expresión de RP pueda deberse a la presencia de RE activados. En el tercer y último capítulo estudiamos el efecto de dos SERMs, y del antiestrógeno puro ICI 182.780, utilizados en la clínica sobre el crecimiento de un tumor PD y sobre la síntesis de RP. El ICI 182.780, el tamoxifeno y el raloxifeno mostraron efectos inhibitorios per se en el crecimiento in vitro al igual que el 17-β—estradiol (E2) pero en mayores concentraciones. El raloxifeno indujo una estimulación de la proliferación en presencia de progestágenos. EI ICI 182.780 y el raloxifeno revirtieron el efecto inhibitorio del E2 mientras que el tamoxifeno fue inhibitorio. El ICI 182.780 disminuyó la síntesis de RP mientras que el tamoxifeno y el E2 los aumentaron y el raloxifeno no tuvo efectos significativos. Concluimos que el tamoxifeno tiene un efecto similar al observado en la clínica en nuestro modelo experimental inhibiendo el crecimiento tumoral y aumentando la expresión de RP. Estos resultados nos llevan a hipotetizar que el tamoxifeno pueda ejercer efectos inhibitorios por su efecto estrogénico leve más que por su acción antiestrogénica. En conjunto estos resultados: a) jerarquizan el rol del receptor de progesterona en el crecimiento de carcinomas mamarios, b) brindan al estroma un posible rol protagónico en la adquisición de la hormono-independencia y c) la similitud entre los efectos del tamoxifeno obtenidos en la clínica y en estos tumores son interesantes para validar aún más los dos ítems anteriores en cuanto a su relevancia clínica.

Abstract:
In this Thesis work we have tested the following hypothesis: 1. Progesterone receptors (PR) are involved in progestin-independent (PI) tumor growth. 2. Proliferative pathways activated by growth factors activate PR. 3. Tumor stromal factors activate PR and participate in the transition to hormone-independency. 4. Estrogen receptors alpha (ERα) are involved in progestin-dependent (PD) tumor growth. All experiments were carried out in an experimental model in which the continuous administration of medroxyprogesterone acetate (MPA) to virgin BALB/c female mice induces mammary carcinomas. The tumors are metastatic ductal carcinomas expressing high levels of PR and ER showing a hormone-dependent growth pattern in syngeneic passages, since they only grow in the presence of MPA. In successive passages the tumors may acquire a progestin-independent phenotype and they can grow in the absence of MPA, even though they retain ER and PR levels. In a recent work of our laboratory (Helguera et al Breast Cancer Research and Treatment 79: 379-390, 2003) we classified PI tumors in responsive (PI-R) and unresponsive (PI-UR) based on their capacity to regress with antiprogestin treatment. In order to evaluate the ability of growth factors to mimic the stimulatory effect of progestins on cell proliferation, primary cultures of the PD tumor line (CC4-HD), were used. Cells were incubated with either MPA or bFGF and PR expression was blocked using antiprogestins or antisense oligonucleotides. Both treatments were able to reduce significantly ³H-thymidine uptake and cell number suggesting that PR are mediating bFGF induced cell proliferation. Using primary cultures from three different PI tumors: 59-2-HI, C7-2-HI and CC4-HI we were also able to demonstrate that antiprogestins and antisense oligonucleotides were able to inhibit cell growth. Specificity of antisense treatment was assessed using unrelated cells and using scrambled oligonucleotides. The elfectiveness was assessed by Western blots and by binding techniques. Mobility Gel Shift studies confirmed that both MPA and bFGF can induce PR activation in PD cells and that PR are constitutively activated in primary cultures of PI tumors. On the other hand, these in vitro studies were supported by in vivo assays in which we demonstrated that antisense therapy using phosphorothioated oligonucleotides inhibited tumor growth. Tumors from antisense-treated animals showed a significant reduction of proliferating cells and PR expression, while no differences were found when comparing tumors from scrambled- treated or control mice. We next wanted to explore the expression of bFGF and its receptors (FGFR 1 to 4) in PD and PI tumors and in different developmental stages of normal mammary glands. The presence and distribution of bFGF in normal murine mammary gland has already been described, but no studies regarding its expression in different developmental stages have been acknowledged. The four receptors were present in normal mammary glands and their expression, as bFGF, were also regulated in the different developmental stages. Immunofluorescence and immunohistochemical studies did not reveal any significant differences in bFGF and FGFR expression between PD and PI tumors; although we could determine a basically stromal and parenchymal staining for bFGF and FGFR respectively. FGFR-2 and FGFR-3 were expressed in the nuclei of parenchymal cells in addition to the reported conventional localization. Immunohistochemical studies could not distinguish between the different bFGF isoforms so Western blot assays were used to determine the expression of the classical bFGF isoform of 16 kDa. This isoform was highly expressed in tumors from untreated as compared to MPA-treated mice. As bFGF was more expressed in stroma than in the parenchyma of both PD and PI tumors and to further evaluate the contribution of epithelial or fibroblastic cells to bFGF expression, we separated both populations obtaining tumor epithelial or fibroblastic enriched primary cultures. An impressive increase in bFGF expression was observed in stromal fibroblasts from PI tumors as compared to those of PD tumors. On the other hand, epithelial PD cells co-cultivated with fibroblastic PD cells or with Pl fibroblasts showed that both fibroblastic populations had a synergic effect on cell proliferation but this effect was greater when epithelial PD cells were co cultured together with PI fibroblasts. These data altogether indicate that stromal bFGF could contribute to activate cell proliferation in PI tumors through PR activation. In the first chapter we concluded that PD and PI-R tumors need a functional PR in order to proliferate and that the stroma has an active role in tumor growth. In Pl-R tumor growth, bFGF and other factors coming from the stroma could be activating PRs present in tumor parenchyma, contributing to the PI phenotype. In the second chapter we studied the role of ER in PD tumor growth. We blocked ERα with a pure antiestrogen (ICI 182.780) and antisense oligonucleotides to ERα. As a result, in both cases cell proliferation was inhibited and this was associated to a decrease in PR expression, suggesting that ERα participates in PD tumor growth and that the high levels of PR expression may be due to constitutive ER activation. In the last chapter, we studied the effects of two SERMs and a pure antiestrogen (ICI 182.780) commonly used in clinical studies, on PD tumor growth and on PR synthesis. ICI 182.780, tamoxifen and raloxifene disclosed inhibitory effects per se in in vitro cell proliferation as 17-β-estradiol (E2) although at higher concentrations. Raloxifene stimulated cell proliferation in the presence of MPA. ICl 182.780 and raloxifene reversed E2 inhibitory effect whereas tamoxifen was inhibitory. ICI 182.780 reduced PR expression while tamoxifen and E2 increased them and raloxifene had no significant effect. We conclude that tamoxifen has a similar effect to that observed in the clinic in our experimental model inhibiting tumor growth and increasing PR expression. These results led us to hypothesize that tamoxifen can exert its inhibitory effects as a result of small estrogenic effects and not because of its antiestrogenic action. Altogether our results: a) underline the role of PRs in the growth of mammary carcinomas, b) highlight the role of stromal factors in the acquisition of hormone-independence and c) the similarity between the effects of tamoxifen obtained in the clinic and in our tumors validate even further our experimental model of breast cancer highlighting the clinical relevance of the two items described above.

Fabris, Victoria T.. "Contribución de los estudios cromosómicos a la comprensión de los mecanismos de la carcinogénesis hormonal: estudio citogenético de carcinomas mamarios murinos inducidos por progestágenos" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El tratamiento prolongado con acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones de la cepa BALB/c induce carcinomas mamarios de histología ductal, que expresan receptores de estrógenos y progesterona, y son metastásicos en pulmón y ganglio linfático. Estos tumores se mantienen in vivo por pasajes singeneicos, siendo hormono-dependientes (HD) ya que requieren del agregado exógeno del MPA para crecer, y no crecen en animales sin tratar con MPA. Se seleccionaron variantes hormono-independientes (HI) a partir de los tumores HD que comenzaron a crecer en los animales sin MPA. Estos tumores HI son capaces de crecer en animales sin tratar con MPA, pero mantienen los receptores hormonales. Los tumores HI presentan una respuesta diferencial a1 tratamiento con l7-ᵝ-estradiol (E2) y los antiprogestágenos mifepristona y onapristona. Se los clasifica en respondedores, aquellos tumores HI que inhiben su crecimiento in vivo por el tratamiento hormonal, y no respondedores a aquellos que no regresionan por el tratamiento. En la primera parte de este trabajo se estudió el cariotipo de los tumores HD (n=5) y sus variantes HI (n=ll) con técnicas de citogenética clásica (bandeo G) y molecular (hibridación in situ fluorescente, FISH), con el objetivo de relacionar el número de cromosomas y las alteraciones del cariotipo presentes con las características biológicas de los tumores. Tres de los 5 tumores HD (60%) presentaron un número de cromosomas en el rango diploide (ratón normal, 2n=40), mientras que los tumores HD que presentaron números modales en el rango triploide a tetraploide fueron estudiados en pasajes muy avanzados. Los tumores HI en pasajes tempranos presentaron números modales diploides. En pasajes tardíos la mayoría de los tumores HI (8 de los ll estudiados) presentaron cariotipos en el rango triploide a tetraploide. Todos los tumores presentaron alteraciones numéricas y estructurales de sus cromosomas. No se observó una alteración común a todos los tumores, o que estuviera asociada con la dependencia hormonal. Sin embargo, podemos inferir que los tumores con números modales diploides responderán al tratamiento con E2 y antiprogestágenos. Las alteraciones más frecuentes fueron ganancia de los cromosomas 3, 4 y 6 (entre el 50% y 60% de los tumores) y pérdida de los cromosomas 16 y X (en el 70% y 100% de los tumores, respectivamente). En un análisis global, la pérdida del cromosoma X resultó significativa. Se observaron numerosas translocaciones, que involucraron a los cromosomas 4 y 7 con mayor frecuencia (presentes en tres de las cuatro familias tumorales con alteraciones evaluables), observándose el mismo punto de ruptura para el cromosoma 7. Por otra parte, las alteraciones presentes en los tumores HD se conservan en los pasajes tempranos del crecimiento autónomo. En base a estos resultados podemos concluir que los tumores inducidos por el MPA serían diploides, y que con el continuo pasaje in vivo puede aumentar el número de cromosomas. La adquisición de la hormono-indepedencia no es causada por el aumento de la ploidía, y los tumores HI conservarían el cariotipo diploide de los tumores HD en los pasajes tempranos. El aumento del número de cromosomas y la adquisición de nuevas alteraciones sería posterior a la adquisición de la hormono-independencia y ocurriría como consecuencia del aumento de los pasajes. La ocurrencia en pasajes más tempranos de variaciones en el cariotipo observada en los tumores HI con p53 mutado, respecto de los tumores HI con p53 normal, podría estar asociada a las mutaciones en p53. Sin embargo, en el tumor HD la presencia de p53 mutado no está acompañada de inestabilidad cromosómica, sugiriendo que serían necesarios otros factores además de dichas mutaciones. En la segunda parte del trabajo se estudiaron los cambios del cariotipo durante el establecimiento de líneas celulares a partir de carcinomas mamarios murinos HD y HI. Se analizaron las variaciones en ploidía y de las alteraciones cromosómicas a lo largo de los repiques de las 8 líneas celulares obtenidas. Las líneas celulares conservaron el número de cromosomas diploide de los tumores parentales en los primeros repiques, este número de cromosomas aumentó con los posteriores pasajes in vitro, y se estabilizó en el rango triploide en 5 de las 8 líneas celulares, sugiriendo que éste les daría cierta ventaja para el crecimiento en cultivo. Sin embargo, una de las líneas celulares mantiene su cariotipo diploide hasta repiques avanzados. Todas las líneas celulares conservan los cromosomas marcadores de los tumores parentales a través de los repiques, pero 7 de las 8 líneas adquieren alteraciones nuevas desde repiques muy tempranos. Podemos concluir que el aumento de la ploidía se vería favorecido por el avance de los repiques. Por otra parte, los cromosomas marcadores del tumor no se pierden por el continuo cultivo in vitro, pero se favorece la formación de nuevas alteraciones. El conocimiento del cariotipo permitió, además de caracterizar las líneas celulares, discernir sobre el origen de una de las líneas establecidas. En resumen, en este trabajo de tesis se investigó la evolución cariotípica de diferentes tumores mamarios murinos en su evolución desde la hormono-dependencia hacia la independencia, y de las líneas celulares derivadas. En nuestro conocimiento, este es el primer informe del estudio citogenético en relación con la independencia hormonal en tumores mamarios murinos. Los genes ubicados en los sitios de ruptura de las translocaciones observadas, como por ejemplo Aurora C, merecen ser estudiados en investigaciones futuras.

Abstract:
Medroxyprogesterone acetate treatment in BALB/c female mice leads to the development of ductal mammary carcinomas which express estrogen and progesterone receptors and are metastatic in axilar lymph nodes and lungs. They are maintained by syngeneic transplantation in progestin treated female mice disclosing a hormone dependent (HD) pattern of tumor growth. Occasionally hormone independent (HI) variants have been selected. These HI tumors are able to grow without exogenous hormone supply. Some of them are able to regress completely afier l7-ᵝ-estradiol or antiprogestin administration and are so called responsive HI tumors while others are unresponsive to both treatments. In the first part of this study we have investigated the karyotype of 5 HD tumors and of ll HI variants using classic cytogenetic techniques as G banding and molecular approaches as fluorescence in situ hybridization (FISH). The aim of this study was to evaluate possible relationships between ploidy, chromosome markers and acquisition of hormone independence. A near diploid karyotype (2n=40) was found in 3/5 HD while a triploid to tetraploid karyotype was observed in the other two HD tumors which were studied in late passages. In early passages from HI tumors we obtained diploid karyotypes while in advanced passages they were mainly poliploid (8/11 tumors). All tumors showed number and structural chromosomal rearrangements. The tumors studied did not share chromosomal abnormalities neither chromosome markers could be related to HD or HI tumors. However, it seems that in this experimental model it can be inferred that a diploid tumor will be responsive to hormones whereas a poliploid tumor may be HD, responsive HI or unresponsive to hormone treatments. The most frequent chromosomal rearrangements found in individual tumors were gains in chromosomes 3, 4 and 6 (in 50 and 60% of the tumors) and loses in chromosomes 16 and X (70% and 100% respectively). In a global analysis of frequencies only loses of chromosome X were statistically significant. Nearly all tumors disclosed several translocations (22 in 9 tumors studied). Chromosomes 4 and 7 were involved independently in 3 of the 4 tumor families which could be studied. Twice they were together, and in the case of chromosome 7, in the same breakpoint. Abnormalties present in HD tumors were maintained in early passages of HI tumors although later on new rearrangements were observed. It can be concluded that MPA dependent tumors are probably diploid and polyploidy arises by continuous in vivo transplantation. The acquisition of hormone independence is not caused by an increase in ploidy. Conversely, HI tumors may maintain the same diploid karyotype in early passages while progressively losing and acquiring new markets in later passages. SSCP revealed a point mutation in p53 in 4/5 tumors of the same family. The parental HD tumor showed a diploid stable karyotype while the HI variants were poliploid and did not share common markers suggesting that mutated p53 is not uniquely involved in chromosome instability. HI variants may have acquired other alterations that together with mutated p53 may confer this phenotype. In the second part of this study the karyotype of 8 cell lines derived from 2 of these diploid tumors was investigated. Cell lines maintained the diploid karyotype during the early passages and nearly all of them after passage 35 changed to a stable triploid karyotype. Only one cell line, the MC4-L5 remained diploid for more than 45 passages. All cell lines maintained the same chromosome markers than the parental tumors and 7/8 acquired new markers which were different for each cell line and were characterized in this study. It can be concluded that the onset of the cell lines are not defined by increases in ploidy but that in vitro culturing favors their evolution towards a triploid state. The fact that the onset of the cell lines were associated with new different rearrangements suggests that these may favor this event. Thus cytogenetic analysis is extremely important to identify cell lines. In addition, cytogenetic studies helped to determine if one of the cell lines could have been originated as a consequence of an epithelial mesenchymal transition from the same cells or if it could have been originated from a different cell. Summing up, in this thesis we have investigated the evolution of karyotypes of different mammary tumors from a hormone dependent to a hormone independent state and in their derived cell lines. To our knowledge this is the first report on the field studying cytogenetics in relation to hormone independence in mouse mammary tumors. Genes located in breakpoints, such as Aurora C in chromosome 7, deserve further investigations.

Vitale, Alejandra Mariel. "Acción autocrina/paracrina de la inhibina sobre la selección del folículo ovárico" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de la presente investigación consistió en evaluar los efectos in vivo e in vitro de la inhibina A recombinante humana durante distintos estadios del desarrollo folicular. En particular se evaluó el efecto de esta glicoproteína sobre la proliferación de células de la granulosa en cultivo, sobre la apoptosis y la expresión de proteínas pro y anti apoptóticas y sobre la esteroidogénesis ovárica en ratas prepúeberes tratadas con DES o con PMSG. Los resultados indican que la inhibina A es producida in vitro por las células de la granulosa en cultivo obtenidas de ovarios de ratas estimuladas con DES y que su producción es estingulada por FSH, TGFβ y estradiol. También se observa que concentraciones fisiológicas de inhibina A disminuyen la proliferación celular inducida por estos tres factores. Además del efecto antiproliferatívo se observa, en este mismo modelo experimental, que la administración de inhibina A in vivo produce un retraso en el desarrollo folicular y un aumento de la apoptosis. Estos hallazgos fueron confirmados por ensayos in vitro donde se observa un aumento significativo de a fragmentación del ADN en folículos antrales tempranos incubados con inhibina A. Con respecto a la expresión de proteínas pro y anti apoptóticas la inhibina A produce tanto in vivo como in vitro un aumento en los niveles de Bax, mientras que los niveles de Bcl-2 permanecen constantes. Por otra parte la inhibina no tiene ningún efecto en la esteroidogénesis. En cuanto a los ensayos realizados con ovarios de ratas estimuladas con PMSG se observó que la inhibina A no tiene efecto alguno sobre la proliferación de células de la granulosa en cultivo. Tampoco se advirtió ningún efecto de esta glicoproteina sobre la fragmentación del ADN en cultivos de folículos preovulatorios. Por otra parte la administración in vivo de inhibina en estas ratas produce un retraso en el desarrollo folicular de folículos inmaduros, pero no tiene ningún efecto en el crecimiento de folículos preovulatorios. Asimismo, en todos los tipos foliculares estudiados se observa una disminución de la apoptosis. Como conclusión, estos resultados sugieren que la inhibina A posee una acción local en el ovario, siendo uno de los factores de acción autocrina o paracrina que regula el crecimiento folicular.

Abstract:
The purpose of this study was to evaluate the role of inhibin A in follicular development and apoptosis- related mechanisms, in preantral and early antral follicles from prepubertal DES- treated rats and in preovulatory follicles in PMSG- treated rats. Granulosa cells isolated from the ovaries of 23-25-day-old DES- treated rats were cultured in serum-free medium containing FSH, TGFβ, and estradiol in the presence and absence of different concentratíons of inhibin A. 3H- thymidine incorporation was decreased in the presence of inhibin, while no significant changes were observed in culture media on progesterone and estradiol levels. An increase in low molecular weight DNA fragmentation indicative of apoptosis, and an increase in the protein levels of Bax with no changes in Bcl-2, were evident in early antral follicles incubated 24 h with inhibin. For each animal inhibin (0.5 μg/ovary) was injected intrabursally in one ovary while the contralateral ovary served as control. Ovarian histology revealed an inhibitory effect of inhibin treatment on the follicular development induced by DES. At 24 h of inhibin injection, the number of preantral follicles was increased as compared to controls, whereas the number of early antral follicles was decreased. In addition, in vivo inhibin treatment caused an increase in the percentage of apoptotic cells in preantral, and early antral follicles with a subsequent increase in Bax levels. On the other hand, granulose cells isolated from the ovaries of PMSG- treated rats were cultured in serum- free medium containing FSH, TGFβ, and estradiol in the presence and absence of different concentratíons of inhibin A. 3H- thymidine incorporation was not changed in the presence of inhibin. There were no changes in low molecular weight DNA fragmentation in early antral follicles incubated 24 h with inhibin. For each animal inhibin (0.5 μg/ovary) was injected intrabursally in one ovary while the contralateral ovary served as control. Ovarian histology revealed no effect of inhibin treatment on follicular development of preovulatory follicles induced by PMSG. At 24 h of inhibin injection, the number of preantral follicles was increased as compared to controls, whereas the number of early antral follicles was decreased. There were no changes in the number of preovulatory follicles. In addition, in vivo inhibin treatment caused a decrease in the percentage of apoptotic cells in all kind of follicles. These results suggest that inhibin produced by the dominant follicle may act as a paracrine factor inhibiting the growth of neighboring follicles; thus participating in the mechanism of follicular selection.

Agote Robertson, Marcos. "Modulación de la función tiroidea por radiación y factores de crecimiento" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El trabajo de investigación realizado en la presente tesis doctoral tuvo dos objetivos principales: l. la investigación de la posible aplicación de radiosensibilizadores en el tratamiento del cáncer de tiroides o el hipertiroidismo, con radioiodo. 2. Elucidar el rol de las diferentes isoformas del TGF-β en la regulación de la función y proliferación celular tiroidea en células normales y tumorales con distintos grados de diferenciación y la variación de su expresión durante la evolución y prevención del bocío. Los resultados pueden resumirse de la siguiente manera: l. Estudios in vivo en ratas normales y bociosas demostraron que la administración de nicotinamida incrementó la radiodestrucción de la tiroides causada por el 13l-I. Esta acción radiosensibilizadora no está relacionada con mecanismos de poli-ADP ribosilación de proteínas nucleares, proceso involucrado en la reparación del ADN dañado. La nicotinamida produjo un incremento del flujo sanguíneo tiroideo y por lo tanto, postulamos que esto a su vez incrementaría la oxigenación tisular, aumentando asi la producción de radicales libres, altamente dañinos para las células. Para confirmar esta última hipótesis, fueron analizadas las actividades de diversas enzimas y la concentración de algunos compuestos relacionados con el metabolismo de los radicales libres. Nuestros resultados demuestran que la administración de nicotinamida y radioiodo causa un aumento significativo en la producción de peróxidos orgánicos y en la expresión de la eNO sintasa. No ocurrió lo mismo con las actividades de SOD (superóxido dismutasa), catalasa y glutatíón peroxidasa. Estos resultados abren la posibilidad de la utilización de la nicotinamida como radiosensibilizador de la acción del radioiodo en las terapias antitiroideas. 2a. Estudios in Vitro Las 3 isofonnas del TGF-β causaron una inhibición de magnitud similar en la proliferación de células normales tiroidas de la línea FRTL5. Un incremento progresivo a la resistencia a esta acción inhibitoria encontramos en las líneas tumorales, de acuerdo con el grado creciente de pérdida de funciones diferenciadas tiroideas: cáncer tiroideo folicular humano (WRO) < cáncer papilar humano(NPA) < cáncer tiroideo indiferenciado humano (ARO). Notamos, asimismo que las isoformas 2 y 3 son más potentes, en líneas generales, que la l. 2b. Estudios in Vivo La expresión de la proteína TGF-β3 se incrementó a medida que evolucionaba el bocio. La administración simultánea de 6-iodo-delta lactona del ácido araquidónico inhibió la formación del bocio ydisminuyó la expresión del TGF-β3. La inyección de ioduro de potasio en conjunto con un inhibidor de la peroxidasa tiroidea, mostró que no redujo la formación del bocio ni la expresión de la isoforma 3. Per se, ni el ioduro ni la iodolactona alteraron los niveles de expresión del TGF-β3 Estos resultados confirman el rol de la iodolactona en la autorregulación tiroidea y nos permiten descartar un rol para el TGF-β3 en este mecanismo.

Abstract:
The research work performed in the present Doctoral Thesis deals with two main objectives: l. to investigate the possible applicaction of radiosensitizers in the treatment of thyroid cancer and hyperthyroidism with radioiodine. 2. To clarify the role of the isoforms of TGF-β in the regulation of thyroid cell proliferation and function in normal and tumoral cells with distinct degrees of undifferentiation, and the variations of their expression in the course of goiter induction and involution. The results obtained can be summarized as follows: l. In vivo studies in rats demonstrated that the administration of nicotiamide to normal rats increase the degree of thyroid ablation produced by different doses of 131-I. Similar results were obtained with rats bearing goiter induced by the previous administration of a goitrogen. The radiosensitizing action of nicotinamide is not related to the inhibition of poli-ADP ribosylation of nuclear proteins, a biochemical pathway involved in DNA repair. Nicotinamide produced a very significant increase in thyroid blood flow, and therefore we postulated that this would in turn increase tissue oxygenation, thereby causing a greater production of free radicals, responsible for the greater tissue damage. In order to explore this latter hypothesis the activities of varios enzymes and compounds related to feer radical metabolism were assayed. Our results demonstrated that simultaneous administration of nicotinamide and radioiodine caused a significant increase in the production of organic peroxides and the acitivty of the eNO synthase. No significant changes were observed in SOD (superoxide dismutase), catalase and glutathion peroxidase. These results open the possibility of applying the simultaneous use of radioiodine and nicotinamide to clinical trials. 2a. In Vitro Studies The three isoforms of TGF-β caused a similar degree of inhibition of normal thyroid cell proliferation (FRTL5). A progressive increase in the resistance to this effect was observed as the degree of undifferentiation increased: human thyroid follicular cancer (WRO) < human papillary cancer (NPA) < undifferentiated thyroid cancer (ARO). A tendency to show that isoforms 2 and 3 are more potent inhibitors than the isoform l was observed. 2b. In Vivo Studies The expression of the protein of TGF-β3 was increased during goiter induction. The simultaneous administration of 6-iodo-delta lactone of arachidonic acid inhibited goiter growth and decreased the expression of TGF-β3. The injection of iodide plus a blocker of iodide organification, showed no significant action on both goiter growth and TGF-β3 expression. Neither iodide nor iodolactone by themselves caused a significant increase in the expression of TGF-β3 These results confirm the role of iodolactone in thyroid autoregulation and allow us to discard the participation ofTGF-β3 in this mechanism.

Ribeiro, María Laura. "Participación del factor de crecimiento epidermal en el inicio del parto en la rata" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El parto es un proceso complejo, resultado de la delicada interconexión espacial y temporal entre los sistemas endocrinos materno y fetal. Los mecanismos precisos a través de los cuales ejercen su efecto las moléculas involucradas en el disparo del parto aún no han sido dilucidados. En el presente trabajo se investigó la participación de una de estas moléculas, el Factor de Crecimiento Epidermal (EGF) sobre el inicio del parto. En primer lugar se estudió el efecto del tratamiento intra-uterino (i/u) con EGF sobre el inicio del parto. Se realizó una curva dosis — tiempo — respuesta y se observó que la administración i/u de 500 ng de EGF en el día 21 de gestación retrasó 19.8 ± 0.7 h el inicio del parto con respecto a las hembras sham (hembras tratadas i/u con solución fisiológica). Por lo tanto, las hembras tratadas con EGF parieron el día 23 de gestación en lugar del día 22, como ocurrió en el caso de las hembras sham. Seguidamente se investigó el mecanismo por el cual el EGF exógeno modulaba el inicio del parto. Los resultados mostraron que 500 ng de EGF i/u administrados en el día 21 de gestación fueron capaces de: disminuir la síntesis de PGE2 y PGF2α en útero y en líquido amniótico; disminuir la expresión uterina de ambas isoformas de COX; aumentar la concentración de progesterona sérica y disminuir la fuerza de las contracciones miometriales. Los valores obtenidos para estas variables analizadas, fueron similares a los obtenidos en el día 21 de gestación para las hembras controles (día previo al inicio del parto), y recién en el día 23 de gestación (día del parto en las tratadas) alcanzaron el nivel obtenido durante el día 22 por las hembras sham. En la rata, el cuerpo lúteo es responsable de mantener la síntesis de progesterona indispensable para el éxito de la gestación, durante todo este proceso. Se ha postulado que a término, el aumento uterino de la expresión de COX-I y de la síntesis de PGF2α, desencadenaría el proceso luteolítico con la consecuente caída de la progesterona y el desencadenamiento del trabajo de parto. Dado que los resultados anteriores sugerían que el EGF podía estar ejerciendo su efecto a través de un mecanismo protector sobre el cuerpo lúteo, prolongando así la preñez, se procedió a analizar la morfología de los cuerpos lúteos de las hembras tratadas con EGF. Se observó que el tratamiento con 500 ng de EGF i/u en el día 21 de gestación, fue capaz de “re-luteinizar" el cuerpo lúteo, es decir que tomaron un aspecto similar al que poseen aquellos cuerpos lúteos con una alta capacidad de síntesis y secreción de progesterona. Los resultados hasta aquí descriptos, indican que el EGF exógeno estaría participando de los mecanismos moleculares involucrados en el inicio del parto, probablemente a través de un efecto inhibitorio sobre la luteólisis. Por último analizamos si el EGF endógeno participa en el inicio del parto. Se estudió la expresión uterina de los receptores de EGF, observándose una correlación temporal con el transcurso de la gestación. Además, analizamos la concentración de EGF en liquido amniótico y encontramos que este factor se encuentra aumentado en la mañana del día 21, sufriendo una abrupta caída doce horas después, correlacionándose con el aumento en la síntesis de la PGF2α, esencial para la luteólisis previa al inicio del parto.

Abstract:
Parturition is a complex process that results from the interaction between the maternal and fetal endocrine systems. Despite the remarkable increase in the knowledge of the mechanisms underlying parturition, the way in which the molecules involved in this process exerts their action remains unknown. In the present work we investigated the participation of one of these molecules, the epidermal growth factor (EGF) in the onset of labor. First of all we studied the effect of the intra-uterine (i/u) administration of EGF in the onset of labor. A dose — time — response curve was made and we observed that the i/u administration of 500 ng of EGF on day 21 of gestation was capable of delaying 19.8 ± 0.7 h the onset of labor compared to the sham animals (female rats that were treated i/u with saline solution). Thus, rats treated with EGF delivered during day 23 of gestation instead of day 22, as happened with the sham animals. Then we investigated the mechanism by which EGF was modulating gestation. The results showed that 500 ng of EGF administered i/u on day 21 of gestation was capable of: diminishing PGE2 y PGF2α in the uterus and amniotic fluid; diminishing the expression of both COX isoforms; augmenting serum progesterone level and reducing the amplitude of uterine contractions. The values obtained for the variables examined, were similar to those obtained for control rats during day 21 of gestation (the day before delivery), and only on day 23 (day of delivery for EGF treated rats) they reached the values observed on day 22 for the sham animals. In the rat, the corpus luteum is responsible for the maintenance of serum progesterone levels indispensable for the exit of pregnancy, during whole gestation. It has been postulated that at term, the rise in uterine COX-I expression and PGF2α synthesis, promotes the luteolitic process and in consequence the withdrawal of serum progesterone and the onset of delivery. The results presented above, suggested that EGF might have been exerting its effect on the onset of labor through a protective effect over the corpus luteum. Thus, we analyzed the morphology of the corpus luteum from EGFtreated rats. We observed that the i/u administration of 500 ng of EGF on day 21 of gestation was capable of “re-luteinizing” the corpus luteum, as its appearance was similar to that observed for the copus luteum with a high capacity of synthesizing and secreting progesterone. These results demonstrates that exogenous EGF might participate in the mechanisms underlying parturition, probably through an inhibitory effect over luteolysis. At last, we investigated the participation of endogenous EGF in the initiation of labor. When we analysed the expression of uterine EGF receptors, we found a temporal correlation with pregnancy progression. The concentration of EGF in the amniotic fluid was maximun in day 21 of gestation and abruptly decreased 12 h later, correlating with the PGF2α augmentation, essential for the mechanism of luteolysis previous to the initiation of labor.

Bianchi, María Silvia. "Receptores GABAB en el eje hipotálamo-hipofisario:ontogenia, regulación de su expresión y mecanismo de acción" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de esta tesis fue el estudio de los receptores GABAb en la pituitaria anterior y el hipotálamo de ratas hembras y machos durante el desarrollo y en la adultez. Observamos un patrón de expresión ontogénico, con una disminución de la expresión de ambas subunidades del receptor GABAb (RGABAb) a lo largo del desarrollo, encontrándose sus niveles más bajos en la adultez. En la hipófisis anterior determinamos, además, una clara expresión secualmente dimórfica, siendo los niveles del receptor significativamente más abundantes en ratas hembras que en machos en edades tempranas del desarrollo. Esta diferencia sexual depende del nivel de andrógenos presente durante etapas críticas de diferenciación sexual, ya que la supresión de los dos picos androgénicos en el macho lleva a una expresión alta, tipo hembra, mientras que la administración neonatal de testosterona a las hembras disminute la expresión del RGABAb1 a niveles de macho. Los niveles hipotalámicos de GABA siguen el mismo patrón que la expresión de los RGABAb1 hipofisiarios y este neurotransmisor es capaz de inducir la expresión de RGABAb1 exclusivamente en células adenohipofisiarias de hembras. Los andrógenos, por su parte, inducen la expresión de la subunidad RGABAb2 en ambos sexos, marcando así una regulación diferencial para cada subunidad del RGABAb. Los RGABAb hipofisiarios están acoplados a proteínas G i/o, y su activación disminuye los niveles de AMPc y lleva al cierre de los canales de calcio, de calcio dependientes del voltaje, modulando así la secresión hormonal. Los RGABAb en el hipotálamo muestran patrones ontogénicos similares a los hipofisiarios, sin evidenciarse diferencias sexuales en su expresión en edades tempranas del desarrollo.

Abstract:
The aim of the present thesis was the study of GABAb receptors (RGABAb) in the anterior pituitary and the hypothalamus in adult and developing male and female rats. We observed an ontogenic expression pattern for this receptors, showing a decrease in both subunits along development, with the lowest levels being detected at adulthood. Furthermore, in the anterior pituitary, we described a clear sexually dimorphic expression of GABAb. These receptors are significantly more abundant in females than in males early in development. This sex difference depends on androgen levels present in the male in critical stages of differentiation, as suppression of both androgenizing peaks in males leads to high, female-like expression levels, while neonatal testosterone administration to female decreases pituitary RGABAb expression to male titers. Hypothalamic GABA titers follow the same pattern as pituitary RGABAb expression levels and this neurotransmitter induces an increase in RGABAb1 expression exclusively in female anterior pituitary cells. Moreover, androgens induce RGABAb2 expression in pituitary cells of both sexes, demonstrating a differential regulation in the expression of each RGABAb subunit. Pituitary GABAb receptors are coupled to G i/o proteins and their activation lead to a decrease in cAMP levels and to the closure of voltage sensitive calcium channels, modulating, this, hormonal secretion. Hypothalamic RGABAb follow ontogenic expression patterns similar to the hypophysis, without evidencing sex differences at early stages of development.

Suárez, Cecilia Ana. "Mecanismos involucrados en la regulación de la hipófisis normal e hiperplásica : angiotensina II y esteroides" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El eje hipotalámico-hipofisiario es una estructura fundamental en el control neuroendócrino del organismo y es en la eminencia media donde se establece la principal conecxión entre ambos componentes a travéz de la liberación de factores hipofisotropos controladores de la secreción hormonal hipofisiaria. De este modo la liberación de PRL está sujeta principalmente a un control tónico de tipo inhibitorio ejercido por la DA, mientras que la sereción de la GH está controlada por la liberación cíclica de GHRH y STT. A nivel periférico, los estrógenos son los principales estimuladores de la síntesis y secreción de PRL y un tratamiento estrogénico crónico produce en la rata el desarrollo de nuestro modelo experimental: un prolactinoma o adenoma de lactotropos. La Angiotensina II (AII), además de ser una hormona involucrada en la regulación de la presión arterial sistémica, es uno de los factores que inducen endócrina y parácrinamente la secreción de PRL. Este octapéptido resulta interesante porque tiene además en diferentes tejidos efectos de tipo proliferativo y angiogénico y, en muchos casos, las acciones estimulatorias ejercidad a través del receptor AT1 son parcialmente compensadas y reguladas por efectos opuestos producidos vía AT2. El sistema renina-angiotensina (SRA) hipofisiario local se encuentra ampliamente influenciado por la acción estrogénica , y nosotros ya habíamos descripto en trabajos previos una alteración de la respuesta a AII en la hipófisis hiperplásica. Especificamente, se encontró alterado el patrón de movilización interna del ciclo y la secreción de PRL. Por los tanto la primera parte de la tesis decidimos analizar con el mayor detalle algunas de las alteraciones de la respuesta a AII en los tumores hipofisiarios, especificamente en relación con la participación de los subtipos de sus receptores. De este modo detectamos por Western-blot y por RT-PCR que el tratamiento estrogénico induce una sobreexpresión de AT2 y una subexpresión de AT1 en hipófisis. Por otro lado, describimos por primera vez la activación de ERK1/2 en la respuesta hipofisiaria a AII y definimos la vía de transducción involucrada en la glándula normal. Este proceso involucra la activación de una proteina Gq, un aumento intracelular del calcio y la transactivación del receptor EGF vía una tirosin kinasa no receptora de la familia Scr. Encontramos además que, en el caso del prolactinoma, la activación de ERK1/2 incluida por AII está en parte mediada por AT2, siendo ésta la primera evidencia de la participación funcional de este receptor en la hipófisis. La terapia farmacológica actual de los prolactinomas en muchos casos no resulta ser suficiente ni definitiva, ya que muchas veces es necesario recurrir a una combinación de cirugía y fármacos, e incluso así, el tumor suele reincidir una vez suspendida la aplicación de la droga. Por lo tanto se continúa en la busqueda de nuevas y más eficientes alternativas para completar la farmacoterapia tradicional. Se ha descripto que la progesterona (P4) es capaz de antagonizar efectos estrogénicos y que la dehidroepiandrosterona (DHEA) tiene un amplio espectro de acciones antitumorales y rejuvenecedoras. Entre otras cosas, DHEA inhibiría la génesis y progresión de distintos tipos de tumores de piel, pulmón, hígado, cólon, mama y próstata. Por otro lado se le ha adjudicado a este esteroide efectos benéficos sobre otras patologías asociadas al envejecimiento y el estrés, como enfermedades cardiovasculares, diabetes, enfermedades autoinmunes, obesidad y decaimiento cognitivo o anímico. Sin embargo, también se han descripto en algunos casos efectos deletéreos asociados a un tratamiento prolongado con dosis farmacológicas de DHEA. Entre ellos, una acción estrogénica sobre algunos tumores estrógeno-dependientes, hipertrofismo uterino y hepático, y desarrollo de ovarios poliquísticos. Por lo tanto decidimos estudiar el efecto de la P4 y la DHEA en nuestro modelo de hiperplasia hipofisiaria. Un tratamiento in vivo con P4 no evidenció efectos de tipo terapéutico, ya que no redujo el aumento del peso hipofisiario ni la hiperprolactinemia inducida por el tratamiento crónico con estrógenos. Sin embargo, pudimos determinar que la P4, sinergizando con los estrógenos, induce la participación de AT2 en la secreción de PRL astimulada por AII, lo que constituye la segunda evidencia de la participación funcional de este receptor en la hipófisis. En cuanto al tratamiento con DHEA, demostramos por primera vez su efecto benéfico sobre el tumor hipofisiario inducido por estrógenos, ya que fue capaz de revertir parcialmente los parámetros tumorales mencionados. Sin embargo, el esteroide mostró también per se una cierta acción hiperplásica, prolactinoliberadora y, bajo ciertas condiciones, estimuladora de la secreción de GH. En células adenohipofisiarias normales en cultivo evidenciamos una acción directa de DHEA a nivel hipofisiario. Si bien no se modificó la secreción basal de PRL y GH, si se vió alterada la respuesta a reguladores hiportalámicos. Así, demostramos que DHEA en hipófisis potencia la liberación de PRL y GH en respuesta a AII y a GHRH respectivamente y reduce la inhibición ejercida por la DA y la STT. Determinamos asimismo que la influencia de DHEA sobre la acción dopaminérgica estaría mediada por la movilización de calcio intracelular, mientras que la influencia sobre la cción de la GHRH estaría mediada por el AMPc. Creemos que los resultados presentados en esta tesis contribuyen a una mayor comprensión de los mecanismos que relacionan la acción estrogénica con la actividad de componentes del SRA, lo que es importante a la hora de entender en mayor profundidad procesos tumorigénicos que implican tanto la hiperplásia como la angiogénesis. Por otro lado, aportan a la explicación de las actuales controversias existentes en relación con la acción de DHEA sobre algunos tipos de tumores, especialmente estrogéno-dependientes, y de los efectos secundarios que muchas veces presenta un tratamiento crónico con este esteroide.

Abstract:
The hypothalamic-pituitary axis is a fundamental structure in the neuroendocrine control of the body. The median eminence is where the main connection between both components is achieved through hypophysotrophic factors that control the pituitary hormonal release. By this means PRL secretion is mainly regulated by an inhibitory tonic control exerted by DA and GH release is controlled by the cyclic liberation of GHRH and STT. At the peripheral level, estrogens are the main stimulators of PRL synthesis and secretion. A chronic estrogenic treatment induces in the rat the development of our experimental model: a prolactinoma or lactotrope adenoma. Angiotensin II (AII), in addition of being involved in the systemic arterial pressure regulation, is one of the endocrine and paracrine inductors of PRL secretion. This octapeptide is interesting because ir also has proliferative and angiogenic effects in different tissues. Besides, it has been described in many cases that the stimulatory actions showed by AII acting at the AT1 receptor subtype are partially counterbalanced and regulated by opposite effects induced via the AT2 receptor subtype. The local pituitary renin-angiotensin system (RAS) is widely influenced by the astrogenic action. Among these influences, we have previously described an alteration in the hyperplastic pituitary response to AII. Specifically, there is an altered pattern of internal calcium mobilization and secretion of PRL. In the first part of this thesis we analyze the altered response to AII present in pituitary tumor, with special relation to AII receptor participation. We detected by Western-blot and RT-PCR that the estrogenic treatment induces an upregulation of AT2 and a downregulation of AT1 pituitary receptors. On the other hand, we described by the first time an ERK1/2 activation in the pituitary response to AII and defined the signal transduction pathway present in the normal gland. This pathway involves the action of a Gq protein, an intracelular calcium increment through PLC and IPE, the fosforilation of a non-receptor tyrosine kinase of the Src family and the EGF´s receptor transactivation. We also found that in the pituitary hyperplasia ERK1/2 activation in response to AII is partially mediated by AT2, being this the first evidence of a functional participation of the receptor in the gland. The present pharmacological therapy of prolactinomas is in many cases incomplete and not definitive. It is often necessary to apply a combination of surgery and pharmacology, and even so the tumor may reappear once the therapeutic drug is removed. So it is still necessary to look for new and more efficient alternatives to complement the traditional pharmacotherapy. It has been described that progesterone (P4) is able to antagonize estrogenic effects and that dehidroepiandrosterone (DHEA) has a wide range of antitumoral and youth-promoting actions. It is proposed that DHEA inhibits the genesis ad promotion of different kinds of tumors of skin, lung, liver, colon, breast and prostate. On the other side it has been ascribed to this steroid beneficial effects in the prevention and treatment of other pathologies associated to aging and stress, like cardiovascular diseases, diabetes, self-immune diseases, obesity, and cognitive impairment. Nevertheless, in some cases some deleterious effects associated to a prolonged and pharmacological treatment with DHEA have also been described. For example, an estrogenic action of DHEA observed in some estrogen-dependent tumors, uterine and hepatic hypertrophism, and development of policystic ovaries. In this context we decided to study the effects of (p4) and DHEA in our hyperplasic pituitary model. An in vivo chronic treatment with P4 did not evidence therapeutic effects, as it did not reduce the pituitary weight increment for the hyperprolactinemia induced by the estrogens. Nevertheless, we could determine that P4, in a synergism with the synthetic estrogens DES, induces the participation of AT2 in the AII-stimulated PRL secretion. This constitutes the second evidence of the functional participation of this receptor in the pituitary. On the other hand, a chronic DHEA treatment was able to partially revert the tumoral parametes previously mentioned though it also showed per se a mild hyperplasic, hyperprolactinemic and, under certain conditions, GH secretory action. In normal adenohypophysial cells in culture, we observed a direct DHEA action at the pituitary level. Although basal PRL and GH secretion were not modified by this steorid, releasing responses to hypotalamic regulators were. We proved that DHEA increases PRL and GH pituitary release in response to AII and GHRH, respectively, and reduces the inhibition induced by DA and STT. We also determined that the influence of DHEA on the dopaminergic action was mediated by and effect on the intracellular calcium mobilization, while the influence on GHRH action was mediated by the cAMP production. We believe that the present results contribute to a better understanding of the mechanisms involved in the relationship between the RAS components and the estrogen effects, which is important to achieve a more accurate description of tumorigenic processes that include hyperplasia and angiogenesis. On the other hand, they may help to explain the present controversies in relation to the action of DHEA in some kinds of tumors, specially the estrogen-dependent ones, and to the side effects which in many cases are produced by a chronic treatment with this steroid.

Alvarez, Laura. "Efecto del hexaclorobenceno sobre la homeostasis de las hormonas tiroideas y parámetros funcionales del tejido adiposo marrón" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Ell hexaclorobenceno (HCB)es un contaminante ambiental ampliamente difundido. Se ha demostrado que el tejido epididimal blanco, interscapular marrón (TAM), el hígado y la tiroides son blancos primarios de la toxicidad del HCB. Se ha demostrado que el HCB disminuye los niveles circulantes de tiroxina total (T4) y tiroxina libre (LT4),sin alterar los de triiodotironina (T3). Este efecto diferencial indica que varios mecanismos podrían estar involucrados en la homeostasis de las hormonas tiroideas. En el presente trabajo se realizaron curvas de tiempo para la actividad de la T4 5’ deiodinasa I (5' D-I) en tiroides, hígado y riñón, y T4 5’ deiodinasa II (5' D-II)en TAM de ratas Wistar macho tratadas con HCB (1000 mg/kg p.c.), con el propósito de evaluar si un aumento en la actividad de las deiodinasas podría contribuir al mantenimiento de la T3 sérica. La actividad de la 5’ D-I aumentó en la tiroides desde los 21 dias. Tanto en riñón como en el TAM la actividad de la 5' D-I y 5’ D-II respectivamente disminuyeron en función del tiempo. La actividad total de 5’ D-I corporal aumentaba a los 30 días, sugiriendo que la tiroides y el hígado hipertrofiado por el tratamiento crónico con HCB podrían al menos contribuir en parte al mantenimiento de los niveles normales de T3 sérica. El HCB aumentaba la actividad de la uridin difosfo glucuronil transferasa (UDPGT) involucrada en la glucuronidación de T4 en forma dependiente del tiempo, sugiriendo que los niveles disminuidos de T4 sérica podrían deberse en parte a un aumento en la glucuronidación de la misma. La UDPGT-T3 no se modificaba. El HCB no modificaba los niveles de RNAm de UCP-1 analizados en TAM de ratas en termoneutralidad y con exposición aguda al frío. Previamente demostramos que el HCB aumentaba los depósitos lipídicos en el TAM. En este trabajo medimos la actividad de la acetil-CoA carboxilasa (ACC) que no se alteraba por efecto del HCB. La actividad del la lipoproteinlipasa (LPL) aumentaría de forma post.transcriptacional ya que el contenido de RNAm de la misma no se modificaba por el HCB. Tanto el contenido del transportador de glucosa (GLUT-4), como la captación de 2-deoxiglucosa por el TAM aumentaban en las ratas intoxicadas en forma crónica. Estos resultados sugieren que el aumento en la captación de glucosa junto con el de los ácidos grasos libres, podrían dar cuenta de los depósitos aumentados de lípidos observados histológicamente en el TAM de ratas tratadas cronicamente con HCB.

Abstract:
Hexachlorobenzene (HCB) is one of the most widespread environmental pollutants. It has been shown that epididymal white, interscapular brown adipose tissue (BAT), liver and the thyroid are primary targets of HCB toxicity. Findings in our and others laboratory have indicated that treatment of rats with HCB decreases circulating levels of total thyroxine (T4) and free L-thyroxine (FT4) but does not affect those of triiodothyronine (T3). Different effects of HCB in terms of serum T3 and T4 indicate that several mechanisms are involved in the development of the particular thyroid hormone status. In the present work, time courses were determined for thyroxine 5' deiodinase I (5’ D-I)activity in thyroid, liver, and kidney and T4 5'deiodinase II (5’ D-II) activity in BAT in male Wistar rats treated with HCB (1000 mg/kg B.W),to test the possibility that increased deiodinase activity in these tissues might contribute to the maintenance of the serum T3 level. 5' D-I activity was increased in the thyroid at 21 days and thereafter, and didn't change in the liver. Kidney and BAT5’ D-I activity was decreased in a time dependent manner. Total whole body 5’ D-I activity increased by 30 days, suggesting that increased T. to T3 conversion in the thyroid and in the greatly enlarged liver of chronic treated rats contribute at least in part to the maintenance of serum T3. Uridine diphosphoglucuronosyl transferase (UDPGT) activity involved in the glucuronidation of thyroid hormones was increased in a time dependent manner. suggesting that decreased serum T4 levels of HCB treated rats may be due in part to increased glucuronidation of T4. T3 UDPGT was not altered under the same experimental conditions. UCP-1 mRNA levels analyzed on thermoneutrality and in rats acuter exposed to cold were not modified by HCB treatment. We have previously demonstrated that HCB increased BAT lipid depots. To gain further insight into lipid metabolism we measured the activity of the key rate-limiting enzyme acetyl-CoA carboxilase (ACC). Our results showed that HCB did not modify this parameter. Lipoprotein lipase (LPL) activity might be increased in a post transcriptional manner, as LPL mRNA content was not modified by HCB. In response to HCB, BAT glucose transporter (GLUT-4),as well as 2-deoxygluoose uptake increased. These results suggest that the increase in 2-deoxyglucose uptake as well as free fatty acids derived from plasma circulating triglycerides may account for the increased lipid depots observed in BAT from HCB-treated rats.

Medesani, Daniel Alberto. "Efectos de metales pesados sobre la síntesis y secreción hormonal en el cangrejo de estuario Chasmagnathus granulatus, DANA 1851 (Decapoda, Varunidae)" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo se evaluó en el cangrejo de estuario Chasmagnathus granulatus el posible efecto de los metales pesados cadmio y cobre, a concentraciones subletales, sobre el control hormonal de la glucemia y de la reproducción. La exposición crónica de cangrejos intactos a ambos metales, provocó un severo y significativo descenso de la glucemia. Se observó una tipica relación dosis-respuesta al exponer estos animales a diferentes concentraciones de cadmio y cobre, con una mayor sensibilidad a este último metal. El bajo nivel de glucosa detectado en los animales intactos expuestos, fue similar al registrado en animales ablacionados de sus pedúnculos oculares, lo cuál está indicando un posible efecto inhibitorio de ambos metales sobre la secreción y/o sintesis de la hormona hiperglucemiante, CHH, que se produce y secreta en tales pedúnculos. La ausencia de diferencias entre los animales ablacionados controles (sin metal) y ablacionados expuestos a cada metal, está indicando por otra parte que no existe un efecto directo de los tóxicos sobre el nivel basal de glucosa (no regulado por CHH peduncular). Cuando el extracto de pedúnculo ocular de cangrejos previamente expuestos a cadmio o cobre se inyectó en animales intactos, provocó un incremento significativo de la glucemia similar al que provocó la inyección de extractos de animales controles, indicando que no existe un efecto de los tóxicos sobre el contenido de CHH en los pedúnculos oculares, lo que sugiere a su vez que la síntesis hormonal no se veria afectada. Por otra parte, la inyección de CHH purificada de Cancer pagurus, sobre animales intactos expuestos crónicamente a los tóxicos, provocó la reversión del efecto hipoglucémico causado por los metales. Los animales expuestos a cadmio alcanzaron un nivel de glucemia elevado y similar al registrado en cangrejos inyectados con CHH pero no expuestos, demostrando que éste metal no interfiere con la interacción hormona-receptor y/o la transducción de la señal hormonal en los tejidos blanco. Los animales expuestos a cobre incrementaron también la glucemia pero alcanzando un nivel similar al medido en cangrejos no expuestos inyectados con solución salina, lo cuál indica que el cobre afectaría en alguna medida la interacción hormona-receptor, y/o algún paso en la transducción de la señal hormonal máxima. En consecuencia, los resultados obtenidos en esta primera parte de la Tesis apoyan la Hipótesis de que la hipoglucemia observada en animales intactos por exposición a los metales estudiados, se debe a una inhibición que esos metales ejercen sobre la secreción de CHH por parte del centro neuroendocrino ubicado en los pedúnculos oculares, sumado, para el caso de cobre en particular, a una interferencia con los efectos hormonales a nivel de órganos blanco. Con respecto a los ensayos sobre el control de la reproducción, se realizaron ensayos in vivo (14 días) e in vitro (24 horas), con hembras adultas de C. granulatus. En los ensayos in vivo, no se observaron cambios significativos en el indice gonadosomático (IG) de hembras intactas de sus pedúnculos oculares expuestas a cadmio o cobre, mientras que ambos metales provocaron un descenso significativo en el IG de los cangrejos ablacionados. En función de estos resultados, pusimos a prueba la Hipótesis de que esos metales estén interfiriendo con la via estimuladora extrapeduncular del crecimiento gonadal. Para esto, se realizaron ensayos in vitro coincubando ovario con ganglio torácico, fuente de la hormona estimuladora gonadal; como resultado, no se detectaron diferencias entre los grupos control y expuestos a los metales pesados. Sin embargo, cuando el ovario fue incubado con metil farnesoato o l7-hidroxiprogesterona, ambas hormonas estimuladoras del crecimiento gonadal, la incorporación de leucina tritiada fue significativamente menor en los grupos expuestos, corroborando la Hipótesis planteada en términos de una interferencia de cadmio y cobre con los mecanismos de transducción de tales hormonas estimulatorias a nivel gonadal. Por otro lado, ovarios coincubados con tejido peduncular y expuestos a ambos metales pesados, mostraron una incorporación de leucina tritiada significativamente mayor que en los controles (ovario y pedúnculos, pero sin metales en el medio de incubación), sugiriendo un efecto inhibitorio de los tóxicos ensayados sobre la secreción de la hormona inhibidora gonadal (GIH) desde los pedúnculos oculares. La interferencia de cadmio y cobre con los mecanismos de transducción de GIH a nivel ovárico fue descartada como hipótesis alternativa, ya que el agregado de extracto de pedúnculo ocular al medio de incubación fue capaz de revertir por completo el efecto causado por cada tóxico. Por último, el conjunto de resultados obtenidos in vitro con ambos metales, i.e., interferencia con el efecto de hormonas estimulantes (metil famesoato y l7-hidroxiprogesterona) e inhibición de la secreción de la hormona inhibibora GIH, permiten explicar el similar crecimiento gonadal observado en animales intactos, entre controles y expuestos a los metales.

Abstract:
The present study was aimed at studying the effect of chronic exposure to cadmium and cooper on hormonal control of CHH-mediated glycemia and of reproduction in the estuarine crab Chasmagnathus granulatus. For both heavy metals assayed, the exposed male intact crabs showed a significant (p<0.05) decrease of glycemia, as compared to the intact crabs in clean water. The clear hypoglycemia produced by both cadmium and copper was in fact verified in intact crabs exposed to a wider concentration range. A typical dose-response relationship was observed for both heavy metals; crabs showed a higher sensitivity to copper than to cadmium, according to the concentrations that produced a significant drop of glycemia, with respect to the control. This response was consistent with the lower acute LC50 value for copper than for cadmium, although the difference in the chronic toxicity on glycemia between both heavy metals (a factor of ╧ 2) was not as high as the difference in lethal acute toxicity (a factor of 5). A slow glucose level in exposed intact crabs is similar to that of the control and heavy metals-exposed eyestalkless crabs. Since no differences (p>0.05) were detected in any case between control and heavy metals-exposed eyestalkless crabs, no direct effect of the assayed pollutants on basal glycemia levels (not regulated by CHH) seems to have occurred. The very significant differences (p<0.01) detected between the group injected with saline solution and the group injected with eyestalk extract from crabs in clean water, clearly show the high hyperglycemic effects of the CHH normally present in the sinus glands of the control animals. The group injected with eyestalk extract from crabs previously exposed to cadmium or copper showed the same level of glycemia as that of the respective groups, indicating that no apparent effect of either cadmium or copper in the content of CHH in the eyestalks seems to have occurred. Although, the hypoglycemia produced by both metals was probably due to inhibition of CHH secretion, any consequent accumulation of this hormone in the sinus gland was not apparent, perhaps there was a compensatory decreased rate of CHH synthesis in the exposed crabs. The regulatory mechanisms of CHH turnover in the neurons that synthesize CHH could also be maintaining a steady state of CHH availability, i.e., reducing synthesis when secretion of the hormone decreases; however, the possibility of some interaction of cadmium or copper with CHH receptors in several tissues should not be discarded for explaining the hypoglycemic responses. We analyzed the effect of different inyected dosis of purified CHH of Cancer pagurus, onto heavy metals-exposed intact crabs. The inyection produce a reversion in the hypoglycemic effect generated when it was previously exposed to the heavy metals. This effect was dosis independent. In the cadmium-exposed crabs, a similar glucose level to that of the control crabs also injected with CHH was attained, demonstrating that this heavy metal is not interfering with hormonal reception and/or transduction in the target tissues. ln the case of the copper-exposed crabs, the increase of glycemia after CHH injection was less than in the control crabs injected with CHH, suggesting that some interference with hormonal transduction or with the enzymes involved in glucose mobilization could have occurred to some extent. The effects of cadmium and copper on the hormonal control of ovarian growth were evaluated on the same specie, by means of both in vivo (14 days exposure) and in vitro (24 h) assays. No significant (p>0.05) change of the gonadosomatic index was observed in the in vivo assays with intact females exposed to HM, while eyestalk-ablated exposed females showed significantly (p<0.05) lower GSI values than their respective controls. This latter result led us to consider the possibility that the HM interfered with extra-eyestalk hormones. ln this sense, no differences were noted between control and HM exposed groups after coincubating ovary with thoracic ganglion (the source of the gonad stimulating hormone). However, when ovary was incubated with methyl famesoate or l7-hydroxyprogesterone, ³H-leucine incorporation was significantly lower in the HM-exposed groups than in the controls, indicating a possible interference of cadmium and copper with the transduction pathway of those hormones. On the other hand, ovaries coincubated in vitro with eyestalk tissue (ET) and exposed to either HM, showed significantly higher ³H-leucine incorporation than did the controls, suggesting an inhibitory effect of the HM on the secretion of the gonad inhibiting hormone (GIH) from the ET. Interference by copper and cadmium with the transduction mechanisms of GIH at the ovarian level does not appear to be a viable hypothesis, because the addition of eyestalk extracts to the incubation medium reversed the effect caused by each HM.

Daroqui, María Cecilia. "Caracterización del sistema TGF-ß/TßRs en carcinomas de mama y pulmón murinos. Rol en la progresión tumoral" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo analizamos el rol de TGF-β en la progresión tumoral, empleando dos modelos de adenocarcinoma murino, de mama y de pulmón. Nuestro modelo de tumor de mama está constituido por los tumores parentales M3 y MM3, poco y altamente metastásicos, respectivamente, y por las lineas celulares derivadas LM3 y LMM3, altamente invasivas y metastásicas. Todas las células de nuestro modelo expresan el sistema completo TGF-β y sus receptores específicos TβRs, y éste es funcional. Además, mediante estudios in vitro determinamos que TGF-β activa la vía de transducción de señales Smads y otras vias, como p38Mapk y MEK/ERK, en las células de carcinoma de mama de nuestro modelo. En cuanto a su acción biológica, TGF-β tiene un efecto antiproliferativo sobre los cultivos primarios de M3 y MM3, mientras que las líneas son resistentes a dicho efecto. Por otra parte, TGF-β induce la actividad de MMP-9 en todas las células de nuestro modelo. Determinamos por primera vez que las vías de señalización p38Mapk y MEK/ERK bloquean la inducción de MMP-9 por TGF-β y que los receptores de señalización TβRI y TβRII son esenciales en esta respuesta. Además, estudiamos el rol de TGF-β sobre la expresión y/o actividad de distintos componentes del sistema de activación del plasminógeno, incluyendo activadores como el uPA y el uPA unido a membrana, e inhibidores como PAI-1. Detectamos que TGF-β inhibe el balance neto de este sistema en las células poco metastásicas, mientras que lo estimula en las células de fenotipo más agresivo. Por otro lado, analizamos la función de TGF-β en la reorganización del citoesqueleto de acfina y determinamos que TGF-β no modula las tropomiosinas ni la proteina HSP27, moléculas relacionadas con actina. Sin embargo, demostramos por primera vez que la actividad del complejo Arp2/3, fundamental en la polimerización de actina, aumenta en respuesta a TGF-β,si bien su consecuencia biológica debe aún esclarecerse mediante otros estudios. Además, TGF-β induce una leve remodelación de la actina cortical en nuestro modelo, sin producir cambios fenotípicos como la formación de fibras de stress y la transición epitelio-mesenquimática como ocurre en sistemas epiteliales no-tumorigénicos. Asimismo, determinamos que la via de señaligación MEK/ERK bloquea la formación de fibras de stress en las células tumorales en estudio y que además está involucrada en la inducción de la migración celular por TGF-β, junto con la vía p38Mapk. Por otra parte, TGF-β estimula la capacidad invasiva in vitro de todas las células de nuestro modelo de tumor de mama. Observamos que la presencia de TβRI y TβRII funcionales, así como las vías de señalización p38Mapk y MEK/ERK, son esenciales en este proceso. Estos datos son muy novedosos, ya que no ha sido descripto previamente un mecanismo de acción de TGF-β en la invasión celular. Mediante estudios in vivo determinamos que TGF-β no modula la capacidad angiogénica en nuestro modelo. Por otro lado, empleando células LM3 transfectadas con formas dominantes negativas de los receptores de señalización de TGF-β, encontramos que la tasa de crecimiento tumoral y la capacidad metastásica de las células de adenocarcinoma mamario en estudio dependen de un sistema funcional TGF-β/TβRs. Por otro lado, estudiamos el sistema TGF-β/TβRs en la línea de adenocarcinoma de pulmón LP07, altamente metastásica. Encontramos que estas células han perdido la capacidad de expresar la proteina TGF-β, respecto del tumor P07 que le dio origen. Además, determinamos que las células LP07 expresan los receptores de señalización TβRI y TβRII. Por medio de estudios in vitro detectamos que si bien las células LP07 no producen TGF-β, la via de Smads y otras vías de transducción de señales pueden ser activadas por TGF-β, por lo que son capaces de responder a la citoquina. Así, TGF-β es un potente inhibidor del crecimiento de LP07. Además, TGF-β inhibe marcadamente la actividad de las proteasas uPA y MMP-2 en las células LPO7 y controla su motilidad in vitro. Y también es capaz de inhibir la angiogénesis in vivo de LP07. De este modo, nuestros resultados indican que TGF-β podría funcionar como un supresor tumoral en nuestro modelo de adenocarcinoma de pulmón, y que la pérdida de funcionalidad del sistema TGF-β/TβRs podria contribuir a la progresión tumoral en estas células.

Abstract:
In the present work we have studied the role of TGF-β in tumor progression, by using a mammary and a lung murine adenocarcinoma experimental models. The mammary tumor model is composed by two closer related tumors, the poorly metastatic M3 and the highly metastatic MM3 ones, as well as the derived highly invasive and metastatic cell lines, LM3 and LMM3. We determined that all these cell types express both TGF-β and its receptors (TβRs), so they present the complete TGF-β/TβRs system. By in vitro studies we found that TGF-β induces the activation of different signaling pathways in our model, including Smads, p38Mapk and MEK/ERK. Besides, TGF-β exerts an antiproliferative action on M3 and MM3 primary cultures while the derived cell lines are resistant to this effect. On the other hand, TGF-β estimulates MMP-9 activity in all the cell types of our tumor model. We show here for the first time that p38Mapk y MEK/ERK pathways block MMP-9 by TGF-β, as well as that the TGF-β signaling receptors, TβRI and TβRII, are key components of this response. We also studied the role of TGF-β on the expression and/or activity of distinct components of the plasminogen activation system, including activators like uPA and membrane-bound uPA and inhibitors like PAI-1. We found that TGF-β inhibits the net balance between activators and inhibitors in the poorly metastatic cells, enhancing it in those cells with the more aggressive phenotype. On the other hand, we studied TGF-β action on actin cytoskeleton reorganization and we determined that TGF-β is not able to modulate the actin-related molecules tropomyosins and HSP27. However, we show here for the first time that TGF-β enhances Arp2/3 complex activity, although its biological significance remains to be fully determined. Besides, we found that TGF-β induces only a slight remodelling on the cortical actin in our tumor model, without affecting the cellular phenotype like the formation of stress fibers and the epithelial-to-mesenchymal transition showed by some normal epithelial cells. We also demonstrate that the MEK/ERK pathway blocks stress fiber formation in the tumor cells studied here, and that this pathway is also implicated in TGF-β-mediated cell migration, together with the p38Mapk pathway. Besides, we found that TGF-β induces the in vitro invasive ability of all the cell types studied here, and that this effect requires TβRI and TβRII activity as well as p38Mapk and MEK/ERK pathways. This is the first time that a signaling pathway is implicated in TGF-β-induced cellular invasion. By in vivo studies we showed that TGF-β is not able to modulate the angiogenic ability of the mammary tumor cells studied here. Finally, by using LM3 cells stably transfected with dominant negative forms of TGF-β signaling receptors, we determined that the tumor growth rate as well as the ability to form metastases depend on a functional TGF-β/TβRs system. On the other hand, we studied the role of the TGF-β/TβRs system in the highly metastatic lung tumor LP07 cell line. We found that LP07 cells do express TβRs but they have lost the ability to express TGF-β at the protein level showed by P07 parental cells. Using in vitro studies we detected that despite LP07 cells do not produce TGF-β, Smads and other signaling pathways can be activated by TGF-β, so these cells are able to respond to the cytokine. Besides, TGF-β markedly inhibits the activity of proteases like uPA and MMP-2 in LP07 cells as well as it reduces the in vivo angiogenic ability of these cells. So, our data suggest that TGF-β could function as a tumor suppressor in our lung tumor model, and that a disruption in the TGF-β/TβRs system regulation may thus contribute to tumor progression.

Solano, María Emilia. "Mecanismos moleculares involucrados en la activación de linfocitos T y su relación con procesos de androgenización incrementada" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El síndrome del ovario poliquístico (SOP) es un desorden endocrino que afecta a mujeres en edad reproductiva, constituyendo una de las primeras causas de infertilidad por anovulación. Asimismo, los andrógenos promueven la acumulación abdominal de la adiposidad que se relaciona a insulino-resistencia e inflamación crónica sistémica. Tanto a nivel ovárico como sistémico existen evidencias de que el sistema inmune contribuiría a la patogénesis del SOP. Por ello en este trabajo se estudiaron alteraciones inmunes, metabólicas y endocrinas en un modelo murino de SOP por androgenización con dehidroepiandrosterona (DHEA). A nivel sistémico, se observó mayor peso corporal, insulino-resistencia y parámetros de inflamación crónica incrementados Los quistes ováricos mostraron una expresión alterada de moléculas de adhesión que coincidió con infiltración leucocitaria, daño tisular, incremento en el estrés oxidativo y disminución de la prostaglandina E2 ovárica. In vitro, DHEA incrementó la expresión de moléculas de adhesión y marcadores de activación en leucocitos pero falló en estimular su proliferación y secreción de citoquinas. Estos resultados muestran que el sistema inmune colabora en los desórdenes ováricos y sistémicos inducidos en este modelo de SOP. DHEA promueve la activación leucocitaria in vitro pero no puede inducir por si misma una respuesta inflamatoria completa, resaltando la importancia del ambiente endócrino y metabólico en las alteraciones inmunes asociadas a SOP in vivo.

Abstract:
Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) is an endocrine disease that affects women in their reproductive age. It is one of the main causes of anovulatory sterility and is associated to abdominal fat distribution, which often leads to insulin resistance and chronic inflammation. Increasing evidence points that immune system could contribute to PCOS symptoms both at systemic and ovarian levels. Therefore, the aim of this study was to study the alterations on immune, metabolic and endocrine features induced by dehydroepiandrosterone (DHEA) administration as a murine model of PCOS. The ovarian cysts showed an altered expression of adhesion molecules, that lead to increased leucocyte infiltration, tissue damage, oxidative stress and reduced levels of prostaglandin E2 in the ovary. Furthermore, the animals showed increased weight gain, insulin resistence and chronic inflammation markers. In vitro assays showed that DHEA per se stimulates the adhesion molecules and activation markers expression but fails to induce proliferation and cytokine production. Therefore, we conclude that immune system is involved both in the ovary and the systemic DHEA-induced alterations. DHEA itself promotes leucocytes activation but fails to elicit a complete inflammatory response, highlighting the role of the endocrine and metabolic environment in PCOS.

Sander, Valeria Analía. "Rol de la hiperandrogenización en la presentación antigénica y su consecuencia en la funcionalidad lútea y activación de linfocitos T. Acción de la metformina como tratamiento. Mecanismos moleculares involucrados" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Síndrome del Ovario Poliquístico (SOP) es la endocrinopatía más frecuente en las mujeres en edad reproductiva y constituye la causa más común de esterilidad femenina. Su característica principal es el hiperandrogenismo, una condición que ha sido asociada a la insuficiencia lútea y a un incrementado riesgo de pérdida de la preñez temprana. A pesar de la relevancia del cuerpo lúteo (CL) en la reproducción, prácticamente no existen investigaciones abocadas al estudio de esta glándula en SOP. Por ello, en este trabajo evaluamos los mecanismos por los cuales el exceso de andrógenos modula la funcionalidad e involución del CL, en un modelo murino de androgenización con dehidroepiandrosterona (DHEA). También determinamos la capacidad de metformina de revertir dichas alteraciones. Durante la etapa funcional del CL, el hiperandrogenismo indujo la disminución de la progesterona sérica mediante la modulación de las enzimas esteroidogénicas. Por el contrario, la administración de DHEA durante la regresión funcional provocó el “rescate” del CL, incrementando los niveles de progesterona mediante la regulación de su biosíntesis y degradación, su acción anti-oxidante y la modulación de las prostaglandinas. El hiperandrogenismo durante la regresión estructural incrementó la apoptosis y reguló la expresión de moléculas involucradas en la presentación antigénica en las células del CL. La metformina previno muchos de los efectos del hiperandrogenismo en la luteólisis, pero no evitó la disfuncionalidad lútea en su etapa funcional. Concluimos que el hiperandrogenismo posee un efecto dual sobre el CL, dependiendo del estado de desarrollo lúteo en el cuál actúe, generando estados patológicos y disfuncionales, la mayoría de los cuales pueden ser evitados por la metformina.

Abstract:
Polycystic ovary syndrome (PCOS), the most frequent endocrine disease that affects women of childbearing age, constitutes the major cause of female infertility. The main characteristic of PCOS is hyperandrogenism, a condition that has been associated to luteal insuficience and high rates of early pregnancy loss. In spite of the relevance of corpus luteum (CL) in reproduction, research about the influence of PCOS on luteal function is scarce. Therefore, the aim of the present study was to assess the mechanisms by which hyperandrogenization affects the lifespan of CL in a dehydroepiandrosterone (DHEA)-androgenized murine model. We also investigate the action of metformin in preventing ovarian dysfunctions produced by DHEA. During the functional stage of CL, hyperandrogenism induced a decline in serum progesterone levels, mainly due to the modulation of steroidogenic enzymes. On the contrary, treatment with DHEA during functional regression “rescued” CL from luteolysis, increased progesterone levels by regulating its biosyntheses and degradation, modulating prostaglandins and acting as an anti-oxidant agent. Hyperandrogenization during structural regression increased apoptosis and regulated molecules envolved in antigen presentation. Metformin prevented most of the effects of hyperandrogenization at both stages of luteal regression, but did not prevent luteal dysfunction at functional stage. Therefore, we conclude that hyperandrogenism has a dual effect on CL, depending on the stage of its development, leading to pathological and dysfunctional conditions, most of which metformin is able to restore.

La Rosa, Isabel. "Rol del factor morfogenético del hueso 4 (BMP4) en la maduración ovocitaria y el desarrollo embrionario de bovinos" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El factor morfogenético del hueso 4 (BMP4, por sus siglas en inglés Bone Morphogenic Protein) cumple funciones en distintos aspectos del desarrollo como diferenciación, morfogénesis, apoptosis y crecimiento celular en diversos tipos celulares. Nogina es un potente inhibidor de BMP4 que actúa evitando la unión de BMP4 con sus receptores. El objetivo de este trabajo fue investigar el rol de BMP4 en la maduración ovocitaria y en el desarrollo embrionario in vitro de bovinos. Se maduraron in vitro ovocitos bovinos en presencia de BMP4 o de Nogina. A partir de estos ovocitos, se produjeron embriones por activación partenogénica (AP) y por fecundación in vitro (FIV). Por otro lado, se produjeron embriones por AP y por FIV y fueron cultivados en presencia de BMP4 o de Nogina. BMP4 está implicado en la maduración ovocitaria en bovinos con efectos en las tasas de clivaje y el estado pluripotente de los blastocistos; Y Nogina modifica la expresión de ciertos genes en ovocitos. Más aún se demuestra por primera vez que un balance equilibrado del sistema de señalización de BMP es necesario para el correcto desarrollo embrionario preimplantatorio en bovinos.

Abstract:
BMP4 acts on many aspects of development such as differentiation, morphogenesis, apoptosis and cell growth in different cell types. Noggin is a potent BMP inhibitor that exerts its function by binding to BMPs preventing interactions with its receptors. The aim of this work was to investigate the role of BMP4 on oocytes in vitro maturation and embryos in vitro development of bovine. For this, oocytes were in Vitro matured in the presence of BMP4 or Noggin and these oocytes were used to produce embryos by parthenogenic activation (PA) or in Vitro fertilization (IVF). On the other hand, embryos were produced by PA or IVF and cultured in the presence of BMP4 or Noggin. We found that BMP4 is implicated in oocyte maturation with effects on cleavage rates and pluripotency state of the cells. Noggin supplementation up-regulated the expression of certain genes in matured oocytes. Our results show that BMP4 is implicated in bovine oocytes maturation and embryo development. Moreover, our findings demonstrate, for the first time, that a correct balance of BMP signaling is needed for proper preimplantation development of bovine embryos.

Elia, Evelin Mariel. "Efecto del hiperandrogenismo sobre la fisiología uterina. Acción de la Metformina como tratamiento" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Síndrome del Ovario Poliquístico (SOP) es una de las endocrinopatías más frecuentes en mujeres en edad reproductiva. Su característica principal es el hiperandrogenismo, condición que tiene efectos perjudiciales sobre la función endometrial, contribuyendo a las altas tasas de aborto, de hiperplasia y cáncer endometrial. La administración de Metformina en pacientes SOP presenta numerosos beneficios aunque existe controversia sobre su efectividad para mejorar las tasas de embarazo. Además, muchas pacientes no responden a este tratamiento y en esos casos se obtienen mejores resultados al administrarla junto con Rosiglitazona. En el presente trabajo estudiamos los mecanismos por los cuales el hiperandrogenismo altera la funcionalidad uterina y la capacidad del tratamiento con Rosiglitazona y/o Metformina de prevenir dichas alteraciones. El hiperandrogenismo, a nivel uterino, alteró su histología, el balance apoptosis/proliferación celular, el metabolismo del ácido araquidónico, la activación de los factores de transcripción PPARγ e incrementó el estrés oxidativo. La administración de Metformina evitó muchas de dichas alteraciones excepto el estrés oxidativo uterino. La combinación Metformina+Rosiglitazona, mejoró las defensas antioxidantes. Concluimos que esta sería una de las causas por las cuales la terapia combinada daría mejores resultados en el tratamiento de mujeres SOP, especialmente en aquellas que no responden óptimamente a Metformina.

Abstract:
Polycystic ovary syndrome (PCOS) is one of the most frequent endocrine diseases that affect women in their childbearing age. This syndrome is characterized by hyperandrogenism that shows detrimental effects on the endometrial function, contributing to the high rates of pregnancy loss, hyperplasia and endometrial cancer. Metformin in the treatment of PCOS shows numerous benefits although there is controversy about its effectiveness to improve pregnancy rates. In addition, many patients do not respond to Metformin-treatment and in those patients better results are obtained when Metformin is administered together with Rosiglitazone. In the present work, we studied the mechanisms by which hyperandrogenism alters uterine function and the capacity of Rosiglitazone and/or Metformin treatment/s to prevent such alterations. Hyperandrogenism altered the uterine histology, the balance between apoptosis/cell proliferation, the arachidonic acid metabolism, the activation of the transcription factors PPARγ and increase the oxidative stress. The administration of Metformin avoided many of these alterations except the oxidative stress. The combination Metformin+Rosiglitazone improved the antioxidant defenses. We conclude that this would be one of the reasons because of the fact that the combined therapy would give better results in the treatment of PCOS women, especially in those who do not respond optimally to Metformin.

Regueira, Eleonora. "Regulación de las variaciones estacionales en la sensibilidad testicular a la acción de los glucocorticoides en Rhinella arenarum (Amphibia, Anura). Interrelación testículo-interrenal" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los anfibios anuros tienen variaciones estacionales en los andrógenos y glucocorticoides (GCs) plasmáticos. En Rhinella arenarum la concentración plasmática de GCs aumenta durante el período reproductivo provocando una disminución en la síntesis de andrógenos vía un receptor citosólico (GR). El objetivo de esta tesis fue evaluar las variaciones estacionales en la sensibilidad testicular a la acción de los GCs. Para ello se estudiaron los cambios en la cantidad de GR así como el efecto de los andrógenos, los GCs y la melatonina en la regulación de dichos cambios. Los estudios de la interrelación entre la glándula interrenal y el testículo indicaron que la cantidad de proteína GR testicular varía estacionalmente y que los GCs regulan de manera positiva su propio receptor mientras que melatonina disminuye la unión del GC al GR y antagoniza el efecto de los GCs. En cambio, melatonina no disminuye la síntesis de andrógenos de manera directa. En la glándula interrenal, una concentración de andrógenos alta (período prerreproductivo) disminuye la síntesis de GCs. El estudio histológico de la glándula mostró que hay dos tipos de células esteroidogénicas que podrían producir distinta cantidad de GCs y que ambas presentan una regionalización antero-posterior. Se infiere que las variaciones estacionales de andrógenos y GCs están determinadas, en parte, por la regulación recíproca entre ambas hormonas y que la sensibilidad del testículo a la acción de los GCs, cuando se considera la cantidad de GR, varía de manera estacional y está regulada por los mismos GCs y la melatonina.

Abstract:
Anuran amphibians are characterized by having seasonal changes in plasma androgens and glucocorticoids (GCs). In Rhinella arenarum, plasma GCs concentration is highest during the reproductive season and GCs produce a decrease in androgen synthesis via a testicular cytosolic glucocorticoid receptor (GR). The aim of this thesis was to evaluate seasonal variations in testicular sensitivity to GCs’ action by studying changes in the amount of testicular GR as well as the effect of androgens, GCs, and melatonin on its regulation. In addition, it was analyzed the interrelation between the interrenal gland and the testis. Results indicated that the amount of GR protein varies seasonally and GCs positively regulate its own receptor whereas melatonin decreases the binding of GC to the GR antagonizing GCs’ effect. However, melatonin has no a direct effect on androgen synthesis. In the interrenal gland, high concentrations of androgens - corresponding to the pre-reproductive period - decrease the synthesis of GCs. Histological examination of the interrenal showed two anteroposterior regionalized steroidogenic cell types that could produce different amounts of GCs. Taking together, these results suggest that the seasonal variations of androgens and GCs are determined, at least in part, by the interregulation between these hormones. In addition, the GR-dependent sensitivity of the testis to the action of GCs varies seasonally and is regulated by GCs and melatonin.

Miler, Eliana Andrea. "El cadmio como disruptor endocrino. Estudios de la exposición al cadmio sobre la adenohipófisis de rata" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Introducción: El cadmio (Cd2+) es un contaminante ambiental que produce numerosos efectos tóxicos en los organismos. Este metal puede actuar como un disruptor endocrino en diferentes tejidos. La adenohipófisis es la glándula directriz y presenta una alta sensibilidad al Cd2+. Objetivos: 1) Investigar posibles formas de tratamiento que reviertan los efectos inducidos por la exposición crónica al Cd2+ en la adenohipófisis de rata in vivo. 2) Investigar el papel xenoestrogénico del Cd2+ a nivel adenohipofisario. Resultados: 1) La exposición al Cd2+ in vivo induce estrés oxidativo y disminuye los niveles séricos de prolactina (PRL) y de hormona luteinizante (LH). La melatonina, administrada a posteriori de la exposición al Cd2+, revierte los efectos del metal sobre la expresión de la hemo-oxigenasa-1, mientras que tiene un efecto per se sobre la expresión de la metalotioneína-1 y de la óxido nítrico sintasa 1. El cese de la exposición al Cd2+, en cambio, revierte totalmente los efectos del metal sobre los marcadores de estrés oxidativo y sobre los niveles séricos de PRL y LH. 2) El Cd2+, en concentraciones nanomolares, es capaz de inducir la proliferación celular y la secreción de PRL en las células adenohipofisarias. Ambos efectos son mediados por el receptor de estrógenos alfa (REα). Este metal también regula la expresión proteica del REα y de sus variantes truncadas. El Cd2+ y el estradiol muestran un efecto cooperativo sobre la expresión del mensajero del REα y del de PRL. Conclusión: El Cd2+ es un disruptor endocrino que inhibe o estimula la secreción hormonal adenohipofisaria, efecto que depende del mecanismo involucrado: generación de estrés oxidativo o efecto xenoestrogénico.

Abstract:
Introduction: Cadmium (Cd2+) is an environmental contaminant that produces many toxic effects on organisms. This metal can act as an endocrine disruptor in different tissues. The anterior pituitary gland is the directive gland and presents high sensitivity to Cd2+. Objetives: 1) To investigate possible forms of treatments those reverse the effects induced by Cd2+ chronic exposure in the rat anterior pituitary gland in vivo. 2) To investigate Cd2+ xenoestrogenic role at anterior pituitary level. Results: 1) Cd2+ exposure in vivo induces oxidative stress and decreases prolactin (PRL) and luteinizing hormone (LH) serum levels. Melatonin, administered a posteriori of Cd2+ exposure, reverses metal effects on heme oxygenase-1 expression, while having a per se effect on metallothionein-1 and nitric oxide synthase 1 expression. Suspension of Cd2+ exposure, instead, completely reverses metal effects on oxidative stress markers and serum levels of PRL and LH. 2) Cd2+, in nanomolar concentrations, is able to induce cellular proliferation and PRL secretion in anterior pituitary gland cells. Both effects are mediated by the estrogen receptor alpha (ERα). The metal also regulates protein expression of ERα and its truncated variants. Cd2+ and estradiol show a cooperative effect on ERα and PRL mRNA expression. Conclusion: Cd2+ is an endocrine disruptor that inhibits or stimulates anterior pituitary gland hormonal secretion and its action depends on the involved mechanism: oxidative stress generation or xenoestrogenic effect.

Ferré, Lilian Elizabeth. "Niveles de vitelogenina en la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus (Decápoda: Parastacidae): ensayos in vitro e in vivo" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se determinaron los niveles de vitelina (Vn) y vitelogenina (Vg) en hembras de la langosta dulceacuícola Cherax quadricarinatus durante todo su ciclo reproductivo y además en respuesta a tratamientos tanto in vitro como in vivo con las siguientes hormonas o neuroreguladores: metil farnesoato (MF), 17α-hidroxiprogesterona (17PG) y naloxona (Nx), ensayando adicionalmente 17β-estradiol (E2) in vitro. Los niveles de Vn y Vg se midieron en ovario (OV), hemolinfa (HL) y hepatopáncreas (HP) mediante la técnica inmunoenzimática ELISA puesta a punto especialmente para el desarrollo de esta Tesis. En el estudio del ciclo reproductivo, se determinó la variación anual de los niveles de Vn yVg en hemolinfa, ovario y hepatopáncreas de hembras adultas de C. quadricarinatus y se correlacionaron tales niveles con los índices gonadosomático (IGS) y hepatosomático (IHS). Se encontró una concentración máxima de vitelogenina circulante en el período reproductivo medio, en correlación con valores elevados de IHS y de contenido de Vg en hepatopáncreas. En el caso de los ensayos in vitro, los compuestos ensayados se agregaron al medio de incubación, mientras que en el ensayo in vivo se incorporaron al alimento. Los resultados obtenidos tanto in vitro como in vivo, indican que el MF estimula la síntesis endógena de vitelina en el ovario, durante la maduración temprana e intermedia del mismo, siendo incluso capaz de inducir la síntesis de Vn en un ovario en quiescencia reproductiva (periodo postreproductivo). El MF no mostró efectos sobre la producción de vitelogenina en sitios extraováricos. Las hormonas esteroideas estimularon la vitelogénesis endógena (en el ovario) durante el periodo pre-reproductivo ó reproductivo temprano. El antagonista encefalinérgico naloxona no tuvo efecto sobre la s vitelogénesis indicando que la hormona estimulante gonadal, cuya secreción es estimulada por naloxona, no estaría involucrada directamente en la síntesis de Vn, aunque sí tendría efecto sobe la síntesis de otras proteínas ováricas. El presente trabajo provee herramientas de potencial aplicación en acuicultura a fin de optimizar la producción de la especie en estudio.

Abstract:
Vitellin (Vn) and vitellogenin (Vg) levels were determined in females of the freshwater crayfish Cherax quadricarinatus during the entire reproductive cycle, and also in response to the following hormones and neuroregulators: methyl farnesoate (MF), 17α- hidroxyprogesterone (17PG) and naloxone (Nx); additionally, 17β-estradiol (E2) was assayed in vitro. Vn and Vg levels were measured in hemolymph (HL), ovary (OV) and hepatopancreas, by means of the immunoenzymatic technique ELISA, specially developed for this Thesis. In the study of the reproductive cycle, the annual variation of Vn and Vg levels in ovarty, hemolymph and hepatopancreas was determined and correlated to both the gonsadosomatic (GSI) and hepatosomatic (HSI) indexes. A maximum concentration of circulating Vg was found in the mid reproductive period, in correlation to high values of both HIS and Vg content in hepatopancreas.. For the in vitro assays, the assayed compounds were added to the incubation medium, while for the in vivo assay, the same compounds were incorporated to the provided food. The results obtained both in vitro and in vivo indicate that MF stimulates the endogenous Vn synthesis in the ovary, during both its early and intermediate maturation, even being able to induce the Vn synthesis in a quiescent ovary (i.e., during the post-reproductive period). On the other hand, MF did not show any stimulating effect on Vg synthesis in extra-ovarian sites. Steroid hormones stimulated endogenous vitellogenesis (in the ovary) during either the prereproductive or early reproductive period. The enkephalinergic antagonist naloxona showed no effect on vitellogenesis process, indicating that the gonad stimulating hormones, whose secretion is stimulated by naloxona, would not be directly involved in the Vn synthesiss; instead, it would be stimulating the synthesis of other ovarian proteins. The current study provides tools of potential application in aquaculture, to improve the production of the studied species.

Hernández, Silvia Fátima. "Regulación de la luteólisis funcional y estructural. Rol de la esfingosina 1-fosfato (S1P) y del sistema Notch" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El primer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar si la administración local de S1P en el ovario de ratas preñadas bloquea efectivamente la luteólisis inducida por prostaglandina F2 alfa (PGF2α). Se utilizaron ratas preñadas en el día 19 de la gestación a las cuales se les administró en forma local S1P o su vehículo y dos horas después una dosis luteolítica de PGF2α. Los animales se sacrificaron a las 0, 4 y 36 hs de la PGF2α. Se midió la actividad de las caspasas que contribuyen a los eventos iniciales (caspasa -2, -8 y -9) y finales (caspasa-3) de la apoptosis en grupos de CLs de cada animal. Se evaluó también la expresión de las formas fosforiladas de AKT y ERK y los niveles del factor de necrosis tumoral alfa (TNF- α) mediante la técnica de ELISA. Además se estudió la muerte celular por la técnica de ME y TUNEL y la funcionalidad luteal midiendo como parámetro la progesterona (P4) luteal. La actividad de la caspasas -2, -3 y -8 aumentó significativamente a las 4 horas de la inyección de PGF2α, no así la actividad de caspasa -9. Además aumentó el número de células apoptóticas. De forma contraria la expresión de pAKT y TNF-α y el contenido de P4 luteal disminuyó considerablemente. El tratamiento con S1P pudo prevenir el incremento en la actividad de las caspasas -2, -8 y -3 inducido por PGF2α, redujo el número de células apoptóticas, restauró la funcionalidad luteal y aumentó la expresión de pAKT, pERK y TNF-α. El tratamiento con PGF2α incrementó el número de células luteales con signos avanzados de apoptosis, (por ejemplo: fragmentación nuclear, condensación de la cromatina y la presencia de cuerpos apoptóticos) a las 36 horas de la PGF2α. En cambio S1P pudo suprimir estos efectos y además aumentó la densidad vascular en los CL. Estos resultados demuestran, por primera vez, que la administración in vivo de S1P es capaz de bloquear la acción luteolítica de la PGF2α en ratas preñadas. El segundo capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la expresión y la localización celular de los receptores Notch1, Notch4 y el ligando Dll4 en CL de ratas durante la gestación y la luteólisis inducida por PGF2α. También estudiamos el contenido de P4 sérica y de proteínas luteales relacionadas a la apoptosis luego de la administración local de un inhibidor de esta vía llamado DAPT (N- -S-phenylglycine t-butyl ester). Se detectó marca específica de los receptores NOTCH1 y 4 principalmente en las células luteales grandes y pequeñas. Además la inmunomarcación fue evidente en los núcleos de las células luteales, de forma coincidente con el hecho de que el dominio intracelular de Notch (NICD) una vez activo se transloca al núcleo. Además, se detectó marca citoplasmática difusa para DLL4 en las células luteales grandes y pequeñas, coincidiendo con el hecho de que Dll4 se somete a la degradación proteolítica después de unión al receptor. La expresión del ARNm de Notch1, Notch4 y Dll4 en CL aislados en el día 19 de preñez se redujo significativamente después de la administración de PGF2α. En forma coincidente, la PGF2α disminuyó el fragmento activo de los receptores NOTCH1 y 4, por el contrario, no se detectaron cambios significativos en los niveles proteicos del ligando DLL4. La administración intraovárica de DAPT disminuyó los niveles séricos de P4, aumentó los niveles del fragmento activo de la caspasa-3 y la relación BAX: BCL2 24 horas después del tratamiento. También se demostró que la inhibición in vitro de la síntesis de P4 en CL de ratas preñadas con aminoglutetimida (inhibidor específico de la enzima P450scc) disminuyó el contenido proteico de NOTCH1, pAKT, y pERK. Sin embargo no se observaron diferencias significativas en los niveles proteicos de NOTCH4 y el factor de transcripción HES1. Estos resultados respaldan el rol luteotrópico de la vía de señalización de Notch para promover la viabilidad celular y la esteroidogénesis luteal, y sugieren que la hormona luteolítica PGF2α puede actuar, en parte, disminuyendo la expresión de algunos miembros del sistema Notch.

Abstract:
The first chapter of this thesis was designed to study if local administration of the antiapoptotic agent sphingosine 1-phosphate (S1P) to pregnant rats effectively blocks the luteolytic action of prostaglandin F-2alpha (PGF2α). On day 19 of pregnancy, 2 hr before systemic PGF2α administration, rats were injected intrabursa with either S1P or vehicle and euthanized at 0, 4 and 36 hr after PGF2α injection. The activity of four caspases, which contribute to the initial (caspase-2, -8, and - 9) and final (caspase-3) events in apoptosis was measured. The expression of the phosphorylated form of AKT (pAKT), ERK (pERK) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) was analyzed by ELISA. In addition, cell death was evaluated by TUNEL technique and electronic microscopy. We also examined luteal progesterone. The activity of caspase-2, -3, and -8 was significantly greater by 4 hr after PGF2α, but not the caspase-9 activity and the number of apoptotic cells in CL was higher. In contrast, expression of pAKT and TNF-α decreased significantly. Administration of S1P suppressed these effects, decreasing caspase activities and increasing pAKT, pERK and TNF-α expression. The administration of S1P also significantly decreased the percentage of luteal apoptotic cells induced by PGF2α. PGF2α treatment increased the prevalence of luteal cells with advanced signs of apoptosis (i.e., multiple nuclear fragments, chromatin condensation, or apoptotic bodies). S1P treatment suppressed these changes and increased the blood vessel density. These results suggest for the first time that S1P blocks the luteolytic effect of the PGF2α in pregnant rats. The second chapter of this thesis was designed to investigate the expression and cell localization of NOTCH1, NOTCH4, and the delta-like ligand DLL4 in corpus luteum (CL) from rats during pregnancy and PGF2α-induced luteolysis. We also examined serum progesterone (P4) and CL proteins related to apoptosis after local administration of the Notch inhibitor N--S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT). Specific staining for NOTCH1 and NOTCH4 receptors was detected predominantly in large and small luteal cells. Furthermore, in line with the fact that the notch intracellular domain (NICD) is translocated to the nucleus, where it regulates gene expression, staining was evident in the nuclei of luteal cells. In addition, we detected diffuse cytoplasmic immunostaining for DLL4 in small and large luteal cells, in accordance with the fact that DLL4 undergoes proteolytic degradation after receptor binding. The mRNA expression of Notch1, Notch4, and Dll4 in CL isolated on Day 19 of pregnancy decreased significantly after administration of PGF2α. Consistent with the mRNA results, administration of PGF2α to pregnant rats on Day 19 of pregnancy decreased the protein fragment corresponding to the cleaved forms of NOTCH1/4 CL receptors. In contrast, no significant changes were detected in protein levels for the ligand DLL4. The local intrabursal administration of DAPT decreased serum P4 levels and increased luteal levels of active caspase 3 and the BAX:BCL2 ratio 24 hr after the treatment. In addition we demonstrated that in vitro treatment of pregnat rat CL with aminoglutethimide (blocker of cytochrome P450scc), decreased luteal levels of NOTCH1, pAKT and pERK. In contrast, no significant changes were detected in protein levels for the receptor NOTCH4 and the transcriptional factor HES1. These results support a luteotropic role for Notch signaling to promote luteal cell viability and steroidogenesis, and they suggest that the luteolytic hormone PGF2α may act in part by reducing the expression of some Notch system members.

Pagotto, Romina María del Luján. "Influencia de la histamina en la regulación del desarrollo y el mantenimiento de las funciones de los tejidos esteroidogénicos testicular y córticoadrenal" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La histamina (HA) es una amina biógena asociada a diversas funciones llevadas a cabo a través de cuatro subtipos de receptores pertenecientes a la familia de los GPCR. En este trabajo de Tesis se evaluó el efecto de HA sobre la esteroidogénesis y proliferación de tumores córticoadrenales utilizando dos líneas celulares, las Y1 murinas y las H295R humanas y se profundizaron estudios previos del laboratorio en células de Leydig (CL), analizando la participación de esta amina en su desarrollo. En las células córticoadrenales la esteroidogénisis no se vió modificada por HA, lo que supone que el efecto modulador reportado previamente en CL no sería extrapolable a todos los sistemas esteroidogénicos. En cambio, HA inhibió la proliferación de las células H295R a 24h, provocando un arresto de las células en la fase G2/M en un mecanismo mediado por el subtipo de receptor H1 e IP3 y DAG como segundos mensajeros. Estos resultados permitieron identificar un nuevo rol de HA sobre la proliferación de células córticoadrenales humanas que podría contribuir a una mejor comprensión de la patología tumoral y al desarrollo de nuevos agentes terapéuticos. En lo que respecta a las CL, HA fue capaz de inhibir la proliferación de CL inmaduras (CLI) en ensayos in vitro a través de la activación del subtipo de receptor H4, mientras que en estudios in vivo el tratamiento con esta amina produjo un incremento en el número de CL con morfología adulta. Estos datos sugieren que esta amina modularía la proliferación en un paso previo a la diferenciación y pone en evidencia la necesidad de continuar los estudios sobre su función en la transición de los distintos estadíos de desarrollo de CL así como en la génesis de patologías tumorales.

Abstract:
Histamine (HA) is a biogenic amine associated with heterogeneous functions carried out through the activation of four receptor subtypes, all of them members of the GPCR family. In this doctoral thesis the effects of HA on steroidogenesis and proliferation of adrenocortical tumors were evaluated using two experimental models, the murine Y1 and the human H295R cell lines. Also previous studies in Leydig cells (LC) were continued, evaluating the participation of the cited amine in their development. Steroidogenesis was not modified by HA in adrenocortical cells, which suggests that the modulatory effect previously reported in LC can not be extrapolated to all steroidogenic systems. Nevertheless, HA inhibited the proliferation of H295R cells after a 24 h-treatment through activation of the H1 receptor subtype and an increase in the production of IP3 and DAG second messengers, causing a cell cycle arrest in the G2/M phase. These results indicate a new role of HA on human adrenocortical cells proliferation that could contribute to a better understanding of tumor pathology, and to the development of new therapeutic agents. With respect to LC, HA was able to inhibit the proliferation of immature and progenitor LC in in vitro assays via the activation of the H4 receptor subtype, whereas in in vivo studies HA caused an increase in LC number. These data suggest that the amine would modulate the proliferation of LC before differentiation takes place and highlights the need for further studies on its role on the transition of different LC development stages as well as on its influence on tumor pathogenesis.

Recouvreux, María Victoria. "Caracterización del sistema TGF-ß1 hipofisario: en búsqueda de un blanco terapéutico para prolactinomas resistentes a agonistas dopaminérgicos" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los prolactinomas son tumores benignos que en general responden bien al tratamiento con agentes dopaminérgicos. Sin embargo alrededor del 15% de estos tumores son resistentes y aún no existen terapias médicas alternativas. TGF-β1 es un inhibidor de las funciones del lactotropo, y un intermediario de la inhibición que ejerce la dopamina, por lo tanto, resulta un candidato atractivo como blanco terapéutico para prolactinomas resistentes. El objetivo de la presente tesis fue caracterizar el sistema TGF-β1 hipofisario y la regulación de sus componentes, incluyendo los niveles de citoquina total y activa, sus proteínas de latencia (LTBPs) y activadores locales, para evaluar su posible utilidad para el desarrollo de nuevas terapias. Utilizamos dos modelos experimentales de prolactinomas: 1) ratones hembra con mutación nula del receptor dopaminérgico D2 (Drd2-/-); y 2) ratas tratadas crónicamente con estrógenos. Nuestros resultados demuestran que el sistema TGF-β1 se encuentra inhibido en las hipófisis tumorales de ambos modelos. Describimos por primera vez en la literatura una regulación diferencial de los niveles de TGF-β1 activo hipofisario por dopamina y estrógenos que podría explicar en parte las diferencias sexuales en la formación de prolactinomas. Determinamos la expresión de las tres isoformas de LTBPs capaces de unir TGF-β1, y su regulación frente a estímulos con estrógenos y agentes dopaminérgicos. Por último, identificamos a trombospondina 1 (TSP1) y calicreína 1 (KLK1) como posibles activadores de TGF-β1 a nivel local. Asimismo, ensayamos la eficacia de un tratamiento con péptidos análogos de TSP1 (ABT-510 y ABT-898) en el modelo de ratas estrogenizadas. Este tratamiento logró disminuir los niveles de prolactina sérica y el tamaño hipofisario incrementados por los estrógenos. Nuestro estudio contribuye al conocimiento del sistema TGF-β1 hipofisario y su regulación local. Siendo TGF-β1 un inhibidor de la función del lactotropo, proponemos que la restauración de su actividad local podría ser efectiva para frenar el crecimiento de prolactinomas resistentes a los tratamientos clásicos.

Abstract:
Prolactinomas are common benign adenomas that are generally treated with dopaminergic agonists. However, around 15% of these tumors become resistant, and there are still not alternative therapeutical approaches. TGF-β1 is a potent cytokine that inhibits lactotrope function and, that mediates dopamine inhibitory action. Therefore, we postulate TGF-β1 as a candidate for developing new therapies against dopamine - resistant prolactinomas. The aim of this thesis was to characterize the pituitary TGF-β1 system (active and total cytokine levels, latent TGF-β1 binding proteins (LTBPs) and local activators) and its regulation, in order to identify potential therapeutical targets. We used two different experimental models of prolactinoma development: 1) the female dopamine D2 receptor knock-out mice (Drd2-/-) and 2) the estrogen-treated rat. We demonstrated that TGF-β1 system is down-regulated in both prolactinoma models. We described for the first time in the literature a differential regulation of pituitary active TGF-β1 levels by dopamine and estradiol in vivo. These differences may contribute to sexual dimorphism found in prolactinoma development. We found that LTBPs isoforms were differentially expressed in normal vs. tumoral pituitaries in both prolactinoma models, and each isoform was also differentially regulated by dopamine and estradiol. We identified thrombospondin 1 (TSP1) and kallikrein 1 as candidates to mediate pituitary TGF-β1 activation. Finally we explored the efficacy of an in vivo treatment with TSP1 mimetic peptides (ABT-510 and ABT-898) in the rat prolactinoma model. TSP1 analogs treatment caused a significant reduction in prolactin serum levels and pituitary weight induced by estrogen after 2-weeks treatment. Our findings provide novel evidence of TGF-β1 system function and regulation in pituitary tumorogenesis. Since TGF-β1 exerts a negative control on lactotrope cells, we postulate that recovering its local activity could be effective in inhibiting tumor growth of dopamine agonist resistant prolactinomas.

Di Yorio, María Paula. "Regulación de la expresión de los receptores de leptina en el eje reproductivo de la rata" (2012-09-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Leptina, proteína de 16 kDa sintetizada y secretada principalmente por el tejido adiposo, parece ser un regulador de la función reproductiva. En este trabajo evaluamos la acción de distintos niveles de leptina sobre la expresión de las principales isoformas de su receptor en el eje hipotálamo-hipófisis- ovario, y el efecto de NPY y 17β-estradiol sobre estos receptores en el eje hipotálamo-adenohipófisis, ambos durante el proceso ovulatorio. Utilizamos como modelo biológico ratas inmaduras estimuladas con gonadotrofinas y evaluamos mediante estudios in vivo e in vitro la expresión del mensajero (RTPCR) y de la proteína (western blot) de los receptores de leptina. Encontramos que tanto leptina como las gonadotrofinas son capaces de regular diferencialmente la expresión del mensajero y de la proteína de ambos tipos de isoformas en el eje reproductivo, en forma dosis y tejido dependiente. Por otro lado, NPY y 17β-estradiol fueron capaces de inducir la expresión del mensajero y de la proteína de ambas isoformas en el eje hipotálamo-adenohipófisis a través del receptor de NPY tipo 1 y de los receptores estrogénicos α y/o β, respectivamente. Como el efecto estimulatorio o inhibitorio de leptina sobre la función ovárica podría depender de la activación diferencial de sus receptores, estudiamos las vías JAK2/STAT3 y ERK1/2, y la expresión de SOCS3 (western blot) en el eje reproductivo durante el proceso ovulatorio. Utilizamos ratas estimuladas con gonadotrofinas las que recibieron los siguientes tratamientos: i) tratamiento agudo, las que recibieron 5 dosis de leptina (5 μg c/u) o vehículo durante el proceso ovulatorio, o ii) tratamiento diario, las que recibieron 3 μg de leptina o vehículo por día durante 12 días a partir del destete. Observamos que el tratamiento agudo, que inhibe la función ovárica, i) disminuye la expresión de p-ERK1/2 en hipotálamo, adenohipófisis y ovario; ii) disminuye la expresión de p-STAT3 en adenohipófisis y ovario; y iii) aumenta la expresión de SOCS3 en adenohipófisis y ovario. En el tratamiento diario, que estimula la función ovárica, observamos que i) aumenta la expresión de p-STAT3 y p-ERK1/2 en hipotálamo y en ovario; ii) disminuye la expresión de SOCS3 en ovario; y iii) no hubo cambios en estas vías en adenohipófisis. Al evaluar in vitro la acción directa de leptina sobre estos caminos de señalización en ovario observamos que la presencia de leptina es capaz de aumentar la expresión de p-STAT3 a bajas y altas concentraciones, la expresión de p-ERK1/2 a bajas concentraciones y los niveles de SOCS3 a altas concentraciones. Con estos resultados podemos concluir que las gonadotrofinas, leptina, NPY y 17β-estradiol son capaces de regular la sensibilidad a leptina a lo largo del eje reproductivo por modular la expresión de sus receptores, y que los cambios observados en las distintas vías de señalización inducidos por diferentes niveles de leptina pueden ser, al menos en parte, responsables del efecto positivo o negativo que leptina ejerce sobre el proceso ovulatorio. Palabras claves: receptor de leptina, leptina, NPY, 17β-estradiol, hipotálamo, adenohipófisis, ovario, proceso ovulatorio, JAK2/STAT3, ERK1/2, SOCS3.

Abstract:
Leptin, a 16 kDa protein synthesized and secreted mainly by adipocytes, modulates the reproductive function. The aims of the present work were to investigate the expression of leptin receptors in the hypothalamic-pituitary-ovarian axis, and to assess whether different levels of leptin in this axis were able to modulate the expression of both the long and the shorts isoforms of its receptors. Moreover, we also evaluated the direct effects of some factors involved in the reproductive function, like NPY and 17β-oestradiol, on the expression of these receptors in the hypothalamic-pituitary axis. Immature rats primed with gonadotropins were used and either in vivo or in vitro assays were performed to evaluate the expression of both RNA messenger (RT-PCR) and proteins (western blot) of the leptin receptors. Gonadotropins and leptin were able to regulate the expression of RNA messenger and proteins of both isoforms in the reproductive axis in a differential way and in a dose and tissue dependent manner. Furthermore, NPY and 17β-oestradiol up-regulated the receptor expression in the hypothalamic-pituitary axis by the interaction with the receptor Y type 1 and the oestrogen receptors α and/or β, respectively. Leptin is able to both stimulate and inhibit the ovarian function and this effect could be induced by a differential activation of its receptors. Thus, we investigated whether changes in the signalling pathways, mediated by JAK2/STAT3 or ERK1/2 and the SOCS3 expression (western blot), were involved in this biphasic response in the hypothalamic-pituitary-ovarian axis during the ovulatory process. Immature rats primed with gonadotropins received one of the following treatment: i) acute treatment, in which the rats received five ip injection of leptin (5 μg each) or vehicle during the ovulatory process, and ii) daily treatment, at 22 days of age, in which the rats received an ip injection of leptin (3 μg) or vehicle per day for 12 days. We found that the acute treatment, which inhibits the ovulatory process, caused a reduction in the expression of p-ERK1/2 in hypothalamus, pituitary and ovary; p-STAT3 in pituitary and ovary; and an increase in SOCS3 expression in pituitary and ovary. The daily treatment, which induces the ovulatory process, increased the expression of both p-STAT3 and p-ERK1/2 in hypothalamus and ovary; caused a reduction of SOCS3 expression in the ovary; but no changes were found in pituitary. In vitro studies were performed to evaluate a direct effect of leptin on those signaling pathways in the ovarian tissue. Leptin was able to activate both STAT3 and ERK1/2 in the presence of physiological levels, but only STAT3 at high concentrations. In addition, the expression of SOCS3 protein increased at high levels of leptin. These results indicate that gonadotropins, leptin, NPY and 17β-oestradiol are able to modulate the responsiveness to leptin by regulating the expression of its receptors. Furthermore, changes in different signaling pathways throughout the reproductive axis, induced by different levels of leptin may be, at least in part, responsible for the positive or negative effects of leptin on the ovulatory process. Key words: Leptin receptor, leptin, NPY, 17β-oestradiol, hypothalamus, pituitary, ovary, ovulatory process, JAK2/STAT3, ERK1/2, SOCS3.

Loreti, Rosana Nazareth. "Implicancia del grado de sialilación y complejidad de los oligosacáridos de FSH en la regulación de la función ovárica: estudios clínicos y experimentales" (2012-12-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La FSH se sintetiza y secreta como una familia de variantes glicosiladas, las cuales difieren en el grado de sialilación y complejidad de sus oligosacáridos y en la inducción de respuestas biológicas en células blanco, in vivo e in vitro. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue establecer la relación existente entre las características de los carbohidratos presentes en la molécula de FSH y la inducción de respuestas biológicas en las células de la granulosa. La acción de variantes glicosiladas, aisladas de FSH recombinante humana (FSHrh), fue evaluada in vitro utilizando dos modelos experimentales. Se estudió la producción de inhibinas diméricas en células de la granulosa de rata; de esteroides e inhibinas en la línea celular de granulosa humana, KGN, como así también el patrón de expresión génica global y la expresión de enzimas esteroidogénicas y subunidades de inhibinas. Estudios in vitro demostraron que el grado de sialilación y la complejidad de los oligosacáridos presentes en la FSHrh reguló en forma diferencial la producción de esteroides y péptidos. Asimismo, el análisis de ontología génica reveló la capacidad que poseen las variantes glicosiladas de FSHrh de modular en forma diferencial la expresión de genes involucrados en funciones o procesos esenciales para el mantenimiento de la función celular. Las características de las variantes glicosiladas de la FSH circulante fueron determinadas en condiciones fisiológicas y en pacientes infértiles con ciclos regulares. Se observaron alteraciones en el grado de sialilación de la FSH circulante en las pacientes con trastornos reproductivos y en mujeres jóvenes ovodonantes. Los resultados obtenidos demuestran que los oligosacáridos de la molécula de FSH regulan distintas funciones de la célula de la granulosa. Alteraciones precoces en el grado de sialilación de la gonadotrofina podrían comprometer la capacidad reproductiva en la mujer.

Abstract:
FSH is produced and secreted as a family of glycosylation variants which differ from each other in the oligosaccharide sialylation and complexity and in the induction of different biological responses in vitro and in vivo. The aim of this Doctoral Thesis was to establish the relationship between the FSH carbohydrate characteristics and the induction of biological responses in granulosa cells. The effect of recombinant human FSH glycosylation variants were evaluated in two experimental models in vitro. Dimeric inhibin production was assessed in rat granulosa cells, steroids and inhibin production in human granulosa cell line KGN, as well as global gene expression profile and the expression of steroidogenic enzymes and inhibin subunits. In vitro studies demonstrated that sialylation and complexity of rhFSH oligosaccharides induced a differential regulation of steroid and inhibin production. Gene ontology analysis revealed the ability of rhFSH glycosylation variants to differentially modulate the expression of genes involved in essential cell biological processes and molecular functions. Circulating FSH oligosaccharides characteristics were determined under physiological conditions and in infertile patients. Alterations in FSH sialylation were observed in infertile patients and in ovodonors. The results obtained in this study show that FSH oligosaccharides regulate different functions in granulosa cells. Early alterations in FSH sialylation may jeopardize the reproductive capacity in women.

Gómez, Natalia Valeria. "MAP quinasa fosfatasa-2 (MKP-2): regulación hormonal y rol funcional en células de Leydig" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La hormona luteinizante (LH) regula las funciones de las células de Leydig, principalmente la esteroidogénesis, a través de un mecanismo que incluye la activación de PKA y ERK1/2. Las MAPK fosfatasas (MKPs, MAP Kinase Phosphatase) desfosforilan específicamente a las MAPKs (MAP Kinase) y, consecuentemente, regulan procesos fisiológicos dependientes de MAPK. En este trabajo se demostró que, en células de Leydig MA-10, la activación del receptor de LH con gonadotrofina coriónica humana (hCG) o el aumento de AMPc intracelular provocan la acumulación de MKP-2 y su translocación al núcleo. La acumulación es consecuencia de la activación transcripcional y de la estabilización de la proteína por modificaciones posttraduccionales. El bloqueo de la expresión de MKP-2 mediante un shARN – desarrollado en el marco de este trabajo– aumentó la fosforilación de ERK1/2 inducida por AMPc, particularmente a tiempos prolongados de estimulación. El bloqueo de la expresión de MKP-2 también aumentó la actividad del promotor y los niveles del ARNm correspondiente al gen CYP11A1, que codifica para una enzima esteroidogénica y se induce por LH/hCG vía ERK1/2. Se concluye que LH/hCG regula estrictamente la expresión de MKP-2 para controlar la fase terminal de actividad de ERK1/2 y “apagar” la expresión de genes inducidos por LH vía ERK1/2.

Abstract:
The Luteinizing hormone (LH) regulates Leydig cell functions, mainly steroid synthesis, through a mechanism including PKA and ERK1/2 activation. MKPs (MAP Kinase Phosphatases) specifically dephosphorylate MAPKs (MAP Kinases) and, consequently, regulate MAPK-dependent physiological processes. The aim of this work was to analyze the regulation and function of MKP-2 in MA-10 Leydig cells. Results show that the increase in intracellular cAMP and the activation of the LH receptor with human Chorionic Gonadotropin promote MKP-2 accumulation and protein translocation to the nucleus. This accumulation results from gene transcription activation and posttranslational modifications that increase protein stabilization. The specific downregulation of MKP-2 by a shRNA –developed as part of this work– increased cAMPinduced ERK1/2 phosphorylation, particularly after prolongued stimulation. MKP-2 down-regulation by shRNA also increased both the promoter activity and mRNA levels of CYP11A1, which codifies for a steroidogenic enzyme induced by LH/hCG through an ERK-dependent mechanism. These findings demonstrate that LH/hCG tightly regulates MKP-2 expression to control the terminal phase of ERK1/2 activity and “turn off” the expression of LH/ERK-dependent genes.

Bonfiglio, Juan José. "Mecanismos moleculares involucrados en la señalización celular de la hormona CRH en el sistema nervioso central" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La hormona liberadora de corticotrofina (CRH) juega un rol clave en la coordinación de la respuesta neuroendocrina, autonómica, inmune y comportamental frente al estrés. Se ha visto que el receptor de CRH de tipo 1 (CRHR1) estimulado por CRH activa ERK1/2 en función del contexto celular. En trabajos previos realizados en nuestro laboratorio, demostramos que CRH activa ERK1/2 en zonas límbicas del cerebro de ratón (hipocampo y amígdala basolateral). ERK1/2 es un mediador esencial de los procesos fisiológicos del hipocampo, incluyendo el comportamiento emocional, la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la memoria. Para dilucidar los mecanismos moleculares mediante los cuales CRH activa ERK1/2 en neuronas del hipocampo, utilizamos una línea celular ampliamente empleada como modelo neuronal hipocampal, las HT22. En este trabajo demostramos por primera vez que la activación de ERK1/2 en respuesta a CRH es de tipo bifásica, con una primera fase mediada por cAMP y B-Raf, y una segunda fase que depende fundamentalmente de la proteína β-arrestina2 y de la internalización de CRHR1. Teniendo en cuenta el hecho de que las interacciones biomoleculares juegan un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, decidimos analizar el interactoma de B-Raf mediante estudios de espectrometría de masa. En una primera etapa describimos el interactoma de B-Raf en células en estado basal. Habiendo encontrado interactores de esta MAPKKK que podrían ser componentes clave en la regulación de la señalización vía B-Raf- MEK1/2-ERK1/2, nos propusimos, en una segunda etapa, estudiar complejos proteicos asociados a B-Raf después de la activación de CRHR1 a tiempos cortos, donde B-Raf juega un rol clave. Usando herramientas farmacológicas y moleculares, evaluamos el impacto funcional de algunas de las proteínas identificadas en asociación a B-Raf en dichos tiempos cortos. Nuestros resultados indican que las proteínas 14-3-3, PKA, y Rap1, son esenciales para la etapa temprana de activación de ERK1/2 inducida por CRH, mientras que dinamina y vimentina son necesarias para la fase dependiente de la internalización de CRHR1. Demostramos que ambas fases de pERK1/2 dependen de la entrada de calcio y se ven afectadas por la inhibición de la CaMKII. Por lo tanto, este trabajo describe la dinámica y la naturaleza bifásica de la activación de ERK1/2 río abajo CRHR1 en un contexto neuronal e identifica nuevos componentes críticos de la maquinaria de señalización de CRHR1 que controlan selectivamente, o bien la fase temprana, o bien la fase tardía de la activación de ERK1/2, proporcionando así nuevos posibles blancos terapéuticos para trastornos relacionados con el estrés.

Abstract:
Corticotropin-releasing hormone (CRH) is a key regulator of neuroendocrine, immune, autonomic and behavioral response to stress. CRH-stimulated CRH receptor 1 (CRHR1) activates ERK1/2 depending on intracellular context. In a previous work from our laboratory, we demonstrated that CRH activates ERK1/2 in limbic areas of the mouse brain (hippocampus and basolateral amygdala). ERK1/2 is an essential mediator of hippocampal physiological processes including emotional behavior, synaptic plasticity, learning and memory. To elucidate the molecular mechanisms by which CRH activates ERK1/2 in hippocampal neurons, we employed the mouse hippocampal cell line HT22, widely used as a model of hippocampal neuronal cells. We document for the first time that ERK1/2 activation in response to CRH is biphasic, involving a first cAMP and B-Raf-dependent early phase, and a second phase that critically depends on CRHR1 internalization and β-arrestin2. Considering the fact that biomolecular interactions play a crucial role in many cellular processes, we decided to analyze the B-Raf interactome by means of mass spectrometry analysis. In a first step, we described the B-Raf interactome in non-stimulated cells. Having found interactors of this MAPKKK which could be key components in the regulation of the B-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway, we decided, in a second stage, to study the B-Raf partners after CRHR1 activation at short times, where B-Raf plays a key role. Using molecular and pharmacological tools, the functional impact of selected B-Raf partners in CRH-dependent ERK1/2 activation was dissected. Our results indicate that 14-3-3 proteins, PKA, and Rap1, are essential for early CRHinduced ERK1/2 activation, whereas dynamin and vimentin are required for CRHR1 internalization-dependent phase. Both phases of ERK1/2 activation depend on calcium influx and are affected by CaMKII inactivation. Thus, this report describes the dynamics and biphasic nature of ERK1/2 activation downstream neuronal CRHR1 and identifies several new critical components of the CRHR1 signaling machinery that selectively controls the early and late phases of ERK1/2 activation, thus providing new potential therapeutical targets for stress-related disorders.

Carlini, María José. "Rol del factor de crecimiento transformante beta en la progresión del cáncer de pulmón" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cáncer de pulmón es la causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo y se clasifica en dos tipos principales: de células pequeñas y de células no pequeñas (NSCLC). El factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) regula un amplio espectro de funciones celulares y juega un rol importante en las enfermedades del pulmón, incluyendo el NSCLC. El objetivo de este trabajo de tesis fue estudiar el papel del TGFβ en la progresión tumoral de la línea de adenocarcinoma de pulmón murino LP07. Más aún, se realizó un estudio retrospectivo con muestras de tumores de pacientes con NSCLC estadios I-III para evaluar el rol clínico-patológico y la significancia pronóstico de moléculas moduladas por TGFβ; incluyendo la galectina-1 (gal-1), el receptor de TGFβ tipo I (TβRI) y los factores de transcripción FoxM1 y DEC2. En el modelo experimental LP07, el TGFβ moduló múltiples aspectos vinculados con la progresión tumoral, incluyendo la proliferación, la apoptosis, la migración, la actividad de enzimas proteolíticas, la secreción de citoquinas, la angiogénesis, el acondicionamiento del órgano blanco de la metástasis y la retención de las células tumorales en el pulmón. Se demostró que si bien el tratamiento con TGFβ retrasó el crecimiento en el sitio primario, no indujo un programa de quiescencia sostenido, y se observó un cambio hacia la progresión maligna en el sitio metastásico. En los pacientes con NSCLC, se definió el valor como biomarcadores de pronóstico de la expresión alta de gal-1 conjuntamente en las células tumorales y el estroma, así como la expresión alta de TβRI en la membrana de las células tumorales, que se asociaron con menor supervivencia global y mayor riesgo de caída, respectivamente, luego del ajuste por otros pronosticadores. Por otro lado, la expresión del supresor tumoral candidato DEC2 en las células tumorales se asoció con una mejor supervivencia global, en particular para los pacientes con tamaño tumoral T2. La evaluación de la expresión del marcador de proliferación FoxM1 en las células tumorales o el infiltrado no arrojó datos de importancia clínica, aunque el análisis conjunto de la expresión contrapuesta de FoxM1 y DEC2 en los tumores podría aportar información de pronóstico en una cohorte de pacientes mayor. En conjunto, este trabajo demuestra la modulación por TGFβ del comportamiento de los tumores de pulmón y proporciona potenciales herramientas de pronóstico y posibles blancos moleculares para el tratamiento.

Abstract:
Lung cancer is the most frequent and one of the most deadly cancer types and is classified into small cell lung carcinoma and non–small cell lung carcinoma (NSCLC). Transforming growth factor beta (TGFβ) regulates a wide array of cell functions and plays a major role in lung diseases, including NSCLC. We analyzed the role of TGFβ1 on the progression of the murine lung adenocarcinoma cell line LP07. Furthermore, we undertook a retrospective study with tissue samples from stage I-III NSCLC patients to assess the clinical pathologic role and prognostic significance of several targets of the TGFβ pathway; including galectin-1 (gal-1), type I TGFβ receptor (TβRI), and the transcription factors FoxM1 and DEC2. In our model, TGFβ1 affected various aspects of tumor progression, including proliferation, apoptosis, migration, proteolytic enzyme activity, cytokine secretion, angiogenesis, conditioning of the metastatic target organ and tumor cell retention in the lungs. We demonstrated that although TGFβ delayed tumor growth at primary site, a sustained dormancy program was not induced, and a switch towards malignant progression upon TGFβ treatment was observed at the metastatic site. In NSCLC patients, we defined the prognostic value of gal-1 expression at both tumor cells and stroma, and TβRI membrane expression in tumor cells. Respectively, high expression of these biomarkers was associated with decreased overall survival and greater risk of relapse, after adjustment for other predictors of outcome. On the other hand, the expression of the candidate tumor suppressor DEC2 was associated with better overall survival, especially for patients with T2 size tumors. Assessment of the expression of the proliferation marker FoxM1 did not reveal significant outcomes. However, the combined evaluation of opposite expression of FoxM1 and DEC2 in a larger cohort of patients may reveal prognostic information. Altogether, these studies suggest the involvement of TGFβ in the behavior of lung tumors and provide potential prognostic tools and may help identify novel molecular targets for lung cancer treatment.

Martinez Calejman, Camila. "Cambios morfológicos y funcionales en la corteza adrenal en un modelo animal de resistencia a la insulina inducida por la administración de una dieta rica en sacarosa" (2013-03-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La activación del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal ha sido ampliamente descripta tanto en pacientes como en modelos animales de insulinorresistencia (IR). Sin embargo, el efecto del desarrollo de este estado de IR sobre la función adrenal no ha sido dilucidado por completo. En este sentido, el objetivo del presente trabajo de tesis fue estudiar los cambios morfológicos y funcionales que ocurren en la glándula adrenal en animales con insulinorresistencia inducida por una dieta rica en sacarosa (DRS). Los animales del grupo DRS mostraron un mayor peso corporal y de sus depósitos lipídicos junto con una alteración en el perfil metabólico característica de la IR en la séptima semana de tratamiento. En cuanto a la función adrenal, estos animales presentaron mayores niveles basales de corticosterona circulantes y una respuesta disminuida al ACTH exógeno. En forma paralela observamos un aumento en los niveles de expresión de proteínas claves de la esteroidogénesis (StAR y CYP11A1) y una disminución en la expresión del receptor de ACTH (MC2R). Las glándulas adrenales del grupo DRS fueron más pequeñas y livianas que las de los correspondientes controles y mostraron un aumento en la infiltración lipídica con predominio de triglicéridos. Demostramos también que los animales alimentados con DRS desarrollan en forma local un estado inflamatorio evidenciado por el aumento en la expresión de citoquinas y marcadores proinflamatorios, en la actividad de NOS y en la expresión de COX-2. También observamos un incremento del sistema de HO-1, posiblemente como respuesta a la generación de estrés oxidativo en la corteza adrenal. La desregulación en la actividad de estos sistemas posiblemente también afecte la esteroidogénesis adrenal. Finalmente estudiamos el efecto de dos tratamientos insulinosensibilizadores. Tanto el tratamiento farmacológico como la implementación del protocolo de ejercicio lograron prevenir las alteraciones funcionales y morfológicas observadas en la corteza adrenal de los animales alimentados con DRS.

Abstract:
Studies performed both in humans and in animal models of insulin resistance (IR) show hyperactivation of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis. However, a possible direct effect of the IR state on the adrenal function has not been fully investigated. The aim of the present studies was to analyze morphological and functional changes arising in the adrenal cortex of adult Wistar male rats rendered insulin resistant by means of a sucrose rich diet (SRD). The SRD group showed an increase in body weight and lipid depots, as well as a characteristically altered metabolic profile at the seventh week of dietary treatment. At this time point, SRD animals showed elevated basal serum corticosterone concentrations, and a diminished response to ACTH injection. In parallel, higher expression levels of key proteins involved in steroidogenesis (StAR and CYP11A1), and a lower expression of the ACTH receptor (MC2R) were detected. Adrenal glands from the SRD group were smaller and lighter than those from the matching control group and showed an increased lipid infiltration. Animals fed a SRD also developed a local inflammatory state evidenced in the adrenal cortex by an increased cytokine and proinflammatory markers expression as well as an increase in NOS activity and in the expression of COX-2. We also detected an induction of the HO-1 system, possibly as a response to the oxidative stress generated within the adrenal cortex. Dysregulation of these systems may also affect adrenal steroidogenesis. Finally we studied the effect of two proven insulin-sensitizing treatments. Both therapies were able to prevent the morphological and functional changes observed in the adrenal cortex of the animals that received the SRD.

Gervasi, María Gracia. "Participación de la anandamida en la liberación de los espermatozoides del epitelio oviductal bovino" (2013-05-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El oviducto de los mamíferos actúa como un reservorio funcional de espermatozoides proveyendo un ambiente que permite su mantenimiento y competencia para la fecundación del oocito. La unión de los espermatozoides con las células epiteliales del oviducto (CEO) prolonga la vida del espermatozoide, retrasando la capacitación, hasta que señales asociadas a la ovulación inducen su liberación. Varias moléculas del fluido oviductal participan en la regulación de la interacción espermatozoide-oviducto. La anandamida es un endocannabinoide que actúa a través de los receptores cannabinoides y ha sido detectada en el fluido oviductal. Previamente demostramos que la anandamida induce la liberación de los espermatozoides de las CEO en bovinos. En este trabajo estudiamos la regulación y el mecanismo de acción de la anandamida en este proceso. Se caracterizó la principal vía metabólica de la anandamida durante el ciclo estral en el oviducto bovino, encontrándose que tanto las CEO como los espermatozoides expresan a las enzimas del metabolismo de la anandamida. Además la mayor concentración de anandamida en el fluido oviductal bovino fue detectada en el momento peri-ovulatorio, siendo el estradiol la hormona involucrada en la vía de activación de este endocannabinoide. Asimismo la anandamida indujo la capacitación espermática y la liberación de los espermatozoides de las CEO a través de los receptores CB1 y TRPV1 con un incremento de Ca2+ espermático. En conjunto, proponemos que en el momento peri-ovulatorio, las hormonas ováricas podrían inducir un incremento de anandamida oviductal favoreciendo la capacitación espermática con la consecuente liberación de los espermatozoides del reservorio oviductal.

Abstract:
Mammals’ oviduct acts as a functional reservoir of spermatozoa, providing an environment that is proper for their maintenance and competence for the fecundation of the oocyte. The interaction of spermatozoa with oviductal epithelial cells (OEC) prolongs spermatozoa’s life, delaying capacitation, until ovulation-related signals induce their release. Several molecules from the oviductal fluid participate in the regulation of the spermoviduct interaction. Anandamide is an endocannabinoid that acts through cannabinoid receptors and it has been detected in oviductal fluid. In previous work, we have demonstrated that anandamide induces spermatozoa release from OEC in bovines. In this work we studied the regulation and the mechanism of action of anandamide in this process. The main metabolic pathway of anandamide during estrous cycle in bovine oviduct was characterized. Both OEC and spermatozoa express enzymes from anandamide metabolism. Also, the highest anandamide concentration in oviductal fluid was found in peri-ovulatory stages, being estradiol the hormone involved in the activation pathway of this endocannabinoid. Also, anandamide induced sperm capacitation and sperm release from the OECs through CB1 and TRPV1 receptors with an increase of intracellular calcium in spermatozoa. From these results we propose that in peri-ovulatory stages, ovarian hormones could induce an increase in oviductal anandamide, promoting sperm capacitation of bound spermatozoa with subsequent release of spermatozoa from the OECs.

Pallarés, María Eugenia. "Participación de los andrógenos en la formación de las vías dopaminérgicas mesocórtico-límbicas en un modelo de estrés prenatal" (2013-05-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Existen numerosas evidencias en la literatura que demuestran que la exposición a situaciones de estrés durante el período de la gestacion produce alteraciones a largo plazo en los niveles de hormonas sexuales y en el desarrollo del sistema dopaminérgico de la descendencia. En nuestro laboratorio, empleando un modelo en la rata, observamos que dichas alteraciones en el sistema dopaminérgico variaban según si éstas se evaluaban antes o después de la adolescencia. Por otra parte, en el ser humano se ha demostrado ampliamente que varias psicopatologías tales como la esquizofrenia, adicciones a sustancias de abuso y depresión se desencadenan durante o hacia el final de la adolescencia. Definida como el período de transición entre la niñez y la vida adulta, la adolescencia es una etapa donde las hormonas gonadales ejercen sus efectos sobre los tejidos periféricos induciendo la aparición de los caracteres sexuales secundarios, pero también actúan centralmente influyendo sobre el remodelado y desarrollo final del cerebro. Teniendo en cuenta estos antecedentes hipotetizamos que el estrés prenatal estaría interfiriendo con el desarrollo del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal, a la vez que modificaría la maduración del sistema dopaminérgico mesocórticolímbico deviniéndolo vulnerable a los cambios hormonales que ocurren durante la adolescencia. En este contexto, el objetivo general en el que se encuadra este trabajo de tesis consiste en avanzar sobre el conocimiento del rol de las hormonas gonadales masculinas sobre las alteraciones de la neurotransmision dopaminérgica en la cría estresada prenatalmente. En una aproximación hacia la evaluación de este objetivo se caracterizó el efecto del estrés prenatal sobre el eje reproductor masculino y sobre ciertos aspectos del sistema dopaminérgico, para por último intentar simular el efecto del estrés prenatal administrando prenatalmente a un antagonista del receptor de andrógenos: la flutamida. Mediante el empleo de un modelo de estrés prenatal por inmovilización de la madre durante la última semana de gestación en ratas Wistar, se evaluó la reactividad del sistema de estrés de las crías macho, al mismo tiempo que se estudiaron los efectos del estrés prenatal sobre diversos aspectos morfológicos, bioquímicos y moleculares del eje reproductor. En el mismo modelo, en crías macho prepuberales y adultas, se examinó la expresión de los receptores dopaminérgicos del tipo D2, de andrógenos y de estrógenos en diversas áreas cerebrales pertenecientes al sistema dopaminérgico mesocórtico-límbico y se estudiaron las arborizaciones dendríticas en las mismas áreas. Finalmente mediante la administración de la flutamida durante la última semana de gestación, se estudió si la disminución perinatal en los niveles de andrógenos circulantes podría influir sobre el desarrollo del sistema dopaminérgico. Los resultados obtenidos mostraron que el estrés prenatal indujo modificaciones a largo plazo en los niveles de las hormonas pertenecientes al eje reproductor masculino. A su vez, el estrés prenatal modificó parámetros de la morfología sexual externa y de la histomofometría gonadal de la descendencia. Por su parte, los efectos del estrés gestacional sobre los receptores dopaminérgicos del tipo D2 y a hormonas sexuales presentes en el cerebro, mostraron variaciones conforme al área en la cual se estaba realizando la observación y a la edad de las crías, mientras que la reducción en las arborizaciones dendríticas inducida por el estrés prenatal se registró en todas las áreas evaluadas y en ambas edades. Por último demostramos que la administración prenatal de flutamida afecta la morfología sexual interna y externa de la descendencia, al mismo tiempo que induce alteraciones en parámetros morfológicos del sistema dopaminérgico mesocórtico-límbico. De esta manera, la manipulación prenatal de andrógenos mostró consecuancias similares a las observadas en individuos que habían recibido estrés prenatal, sugiriendo que uno de los mecanismos por los cuales el estrés gestacional podría interferir sobre el desarrollo del cerebro es mediante la alteración del rol organizacional de los andrógenos y la modulación del rol activacional de los mismos.

Abstract:
Several studies have demonstrated that stress exposure during pregnancy impairs the dopaminergic system in the offspring. Employing a rat prenatal stress paradigm we have observed that several alterations of the dopaminergic pathway vary if evaluated before or after puberty. It is well known that numerous psychopathologies (i.e. schizophrenia, substance abuse disorder and depression) develop during, or after, the adolescence period. Adolescence is defined as a transient and dynamic phase of development, when gonadal hormones act not only on peripheral tissues to cause the appearance of secondary sex characteristics, but they also act centrally to influence both the remodeling of the adolescent brain and behavioral maturation. Taking this background into account, we hypothesized that prenatal stress might be impairing the hypothalamic-pituitary-testicular axis development, while affecting the mesocortico-limbic dopaminergic system by becoming vulnerable to the hormonal changes that take place during the adolescence. In this context, the general aim or this research was to study the role of sexual hormones on the dopaminergic neurotransmission of prenatally stressed male offspring. Our first approach was to characterize the prenatal stress effects on the reproductive axis development and on the mesocortico-limbic dopaminergic pathway to finally simulate prenatal stress effects by prenatally administering the androgen receptor antagonist flutamide. Employing a prenatal stress paradigm that consisted on immobilization of the pregnant dam during the last week of gestation, we characterized the stress system of the gestant mother and of the male offspring, and the effects of early programming on morphological, biochemical and molecular parameters of the male reproductive axis. In the same model, we evaluated the androgen, oestrogen and D2-dopamine receptors expression, as well as the dendrite arborization status on several brain areas of the mesocortico-limbic dopaminergic pathway of prenatally stressed male offspring at prepubertal and adult stages. Finally, we administered flutamide during the last week of gestation in order to evaluate if decreased androgen levels might affect the dopaminergic system development. Our results show that repeated exposure to maternal restraint stress markedly modulates the development of the offspring reproductive axis by inducing longterm changes in sexual maturation, hormone secretion patterns, testicular histology, and testicular biochemistry. Moreover, prenatal stress induces impairment on the D2- dopamine receptors and sexual hormone receptors depending on the area, and the age of the offspring. Finally, prenatal administration of flutamide affected sexual morphology of the descendants, as well as the mesocortico-limbic dopaminergic dendrite morphology that resemble those described for prenatally stressed animals. In summary, prenatal androgen manipulations induce similar consequences as prenatal stress suggesting that one of the possible mechanisms of action is by affecting the organizational role of androgens and differentially modulating their activational role on brain development.

Raffo, Diego Alejandro. "Terapia endócrina y enriquecimiento en células con propiedades "stem" de cáncer de mama: implicancias para la respuesta a la terapia" (2013-12-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El 75% de los tumores de mama son positivos para receptores de estrógeno y progesterona y el tamoxifeno es la terapia más utilizada. Se propone que las células stem podrían ser iniciadoras de tumores y que tendrían una menor susceptibilidad a la quimio y radioterapia. El objetivo fue estudiar el efecto del tamoxifeno y de los elementos del microambiente tumoral sobre las poblaciones con propiedades stem y los mecanismos involucrados utilizando las líneas LMO5-E murina y MCF-7 humana in vitro y el tumor M05 in vivo. Se realizaron ensayos de mamoesferas, de actividad de la enzima ALDH1 y clonogénicos para estudiar a las células con propiedades stem y también se evaluó el crecimiento de los tumores in vivo y de las líneas in vitro y su expresión génica y proteica. Se observó que el tamoxifeno llevó a un enriquecimiento de células con propiedades stem in vivo e in vitro y que estos cambios perduraron luego de finalizado el tratamiento. Los elementos del microambiente tumoral redujeron la proporción de células con estas propiedades probablemente induciendo su diferenciación. De los resultados podemos concluir que el tamoxifeno podría llevar a un enriquecimiento de células con propiedades stem el cual podría ser responsable de las recurrencias observadas luego de la finalización del tratamiento apoyando los estudios que indican que prolongar el tratamiento a 10 años es más efectivo.

Abstract:
Seventy-five percent of breast tumors are positive for estrogen and progesterone receptors and tamoxifen is the therapy of choice. It has been proposed that stem cells could be tumor initiating cells and are more resistant to radio and chemotherapy. The aim of this work was to study the effect of tamoxifen and tumor microenvironmental factors on the proportion of cells with stem cells properties, and the mechanisms involved. To do so we used the LM05-E murine cell line and MCF-7 human cell line in vitro and the M05 tumor in vivo. Mammospheres, ALDH1 and clonogenic assays were performed in order to study cells with stem cell properties. In addition, tumor growth, cell line proliferation and genes and protein expression were studied. Tamoxifen led to an enrichment in cells with stem cell properties both in vivo and in vitro and this enrichment was maintained even after treatment was removed. Microenvironmental elements led to a reduction of cells with stem cells properties, probably due to an induction of differentiation of these cells. From these results we can conclude that endocrine therapy could lead to an enrichment of cells with stem cells properties that would be responsible for late recurrences observed after treatment interruption, supporting studies that indicate that ten-year treatment with tamoxifen is a better clinical alternative.

Rossi, Soledad Paola. "Interacciones neuro-inmuno-endócrinas en el testículo: rol de la melatonina" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La melatonina, hormona secretada por la glándula pineal, modula los ritmos biológicos diarios y los ciclos de sueño/vigilia. A través de su acción regulatoria sobre la producción y secreción de hormonas hipotalámicas e hipofisarias, participa también en la modulación de la actividad sexual en especies con ciclos reproductivos anuales controlados por el fotoperíodo. En este Trabajo de Tesis Doctoral se investigaron dos mecanismos de acción diferenciales de la melatonina en el testículo: su rol como hormona y su rol como agente anti/pro oxidante. Los estudios realizados permitieron establecer: a) las señales intracelulares asociadas al rol inhibitorio ejercido por el sistema melatonina/CRH sobre la regulación de la esteroidogénesis en células de Leydig del hámster Dorado, b) la concentración testicular de melatonina y la expresión de los principales componentes de la cascada de señalización del sistema melatonina/CRH en el testículo de pacientes que padecen infertilidad idiopática, y c) la acción regulatoria ejercida por melatonina sobre la proliferación, estado oxidativo y capacidad secretoria en macrófagos y mastocitos testiculares. La melatonina desempeñaría un rol clave en la modulación de la esteroidogénesis testicular en el hámster. En el testículo humano patológico, ejercería además acciones regulatorias sobre la población local de macrófagos y mastocitos.

Abstract:
Melatonin is a hormone secreted by the pineal gland that mediates the physiological regulation of both daily rhythms and sleeping/waking cycles. In seasonal breeders, this hormone also participates in the modulation of annual reproductive activity through its action on the hypothalamic-pituitary axis. In this Doctoral Thesis two differential mechanisms of action of melatonin in the testis were studied: its role as a hormone and its role as an anti/pro-oxidant agent. Studies performed in this Thesis allowed us to establish: a) the intracellular events triggered by melatonin/CRH that lead to a down-regulation of the steroidogenic process in Syrian hamster Leydig cells, b) the testicular melatonin concentration and the expression of the main components of the signaling cascade linked to the melatonin/CRH system in testicular biopsies of men suffering from idiopathic infertility, c) the effects of melatonin on proliferation, oxidative state and secretory capability in testicular macrophages and mast cells. Thus, melatonin would play a key role in the regulation of testicular steroidogenesis in the hamster. In the pathological human testis, melatonin would also participate in the modulation of the local macrophage and mast cell populations.

Wolfson, Manuel Luis. "Participación del sistema endocannabinoide en el sitio de implantación y de las células infiltrantes en la reabsorción embrionaria inducida por LPS" (2014-03-25) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se ha demostrado una estrecha asociación entre el aborto y cambios en el sistema endocannabinoide (SEC) en linfocitos periféricos de mujeres. En un modelo murino de reabsorción embrionaria (RE) inducida por LPS estudiamos la participación del SEC tanto del sitio de implantación como de las células inmunes infiltrantes y su posible regulación por progesterona (P). En este modelo observamos niveles plasmáticos elevados del principal endocannabinoide, anandamida (AEA). Por otro lado encontramos que la RE inducida por LPS era mucho menor en ratones transgénicos deficientes en el receptor de cannabinoides tipo 1, como así también la disminución de los niveles séricos de P. Demostramos la presencia del SEC en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ratón y que la actividad de la enzima metabolizante de la AEA (hidrolasa de amidas de ácidos grasos, FAAH) de las PBMC de ratones preñados es mayor que la de los ratones no preñados. Asimismo observamos un efecto protector de la P sobre la actividad de la FAAH y que el mismo estaba mediado por los receptores clásicos de esta hormona (PR). Encontramos que el 70% de las PBMC estudiadas son linfocitos T, demostramos la presencia de los PR en estas células. Por otro lado el LPS incrementó tanto los niveles de óxido nítrico (NO), como de la enzima que lo sintetiza (NOSi). La P abolió el incremento inducido por el LPS, actuando a través de los receptores de glucocorticoides. Durante la RE, la decidua es infiltrada por células del sistema inmune, sufre importantes daños y finalmente es expulsada. Investigamos el efecto de la infiltración leucocitaria sobre la actividad de FAAH en las deciduas mediante un sistema de cocultivo. Cuando las deciduas de animales controles se cultivaron en presencia de PBMC provenientes de animales preñados tratados con LPS, la actividad de la FAAH decidual disminuyó, efecto que fue revertido por la coadministración de P o la de un inhibidor selectivo de la NOSi, aminoguanidina. Asimismo observamos un aumento en la nitración de las proteínas deciduales y específicamente de la FAAH cuando las decidua se co-cultivaban junto a las PBMC de animales tratados con LPS y que este efecto fue revertido por la P. Este trabajo demuestra que el SEC participa en la RE inducida por LPS y que los cambios de este sistema en la decidua están influenciados tanto por las células inmunes infiltrantes como por alteraciones en el sistema endócrino. Palabras claves: Reabsorción embrionaria - Lipopolisacárido - Sistema endocannabinoide - Células mononucleares de sangre periférica - Progesterona - Anandamida - Óxido nítrico

Abstract:
A close association between abortion and changes of the endocannabinoid system (eCS) in peripheral lymphocytes of women has been demonstrated. In a murine model of LPSinduced embryonic resorption (EmR), we studied the involvement of eCS in the site of implantation and in the infiltrating immune cells and its possible regulation by progesterone (P). We observed an elevated anandamide (AEA) plasma levels, a major endocannabinoid, in this model. On the other hand, we found that the LPS-induced less EmR in cannabinoid receptor 1 (CB1) knock-out mice, together with a lower drop of P plasma levels. We showed the presence of eCS in murine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and that the PBMC’s fatty acid amide hydrolase activity (FAAH, the main catalytic enzyme for AEA) from pregnant mice was higher than from non pregnant mice. Moreover, we observed that P, via its classical receptors for this hormone (PR), has a protective effect on FAAH activity. Given that the 70% of PBMC are lymphocytes, we demonstrated the presence of PR in this subpopulation. Furthermore, LPS produced an increased levels of both nitric oxide (NO) and inducible NO synthase (iNOS). Interestingly, P abolished these LPS effects acting through glucocorticoid receptors. During EmR, decidua is infiltrated with immune system cells, suffers important damage and is finally expelled. Using a co-culture system, we investigated the effects of leukocytary infiltration on decidual FAAH activity. When deciduas from control mice were cultured in presence of PBMC from LPS-treated animals, decidual FAAH activity was abolished. This effect was reverted by the co-administration of P or aminoguanidine (a selective inhibitor of iNOS). When deciduas were co-cultured with PBMC from LPS treated mice, we observed an increase in decidual protein nitration and particularly in FAAH enzyme; an effect that was reverted by P. This work shows that the eCS is involved in the LPS-induced EmR and that changes in the decidua are influenced both by infiltrating immune cells as well as by alterations in the endocrine system. Keywords: Embryonic resorption - Lipopolysaccharide - Endocannabinoid system - Peripheral blood mononuclear cells - Progesterone - Anandamide - Nitric oxide

Mestre Citrinovitz, Ana Cecilia. "Regulación de la proliferación y diferenciación de células de endometrio por hormonas esteroideas ováricas" (2014-04-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estroma uterino experimenta cambios morfológicos y funcionales que dan lugar a la decidua, un tejido compacto cuya función es el correcto progreso de la preñez. El receptor de progesterona (RP) y el receptor de estradiol (RE) participan en el crecimiento y la diferenciación de las distintas áreas deciduales del endometrio de la rata. En esta tesis se estudia el papel de estos receptores, sus vías de señalización y la participación de nuevas moléculas involucradas en las etapas iniciales de la decidualización. Caracterizamos, mediante el uso de ARN pequeño de interferencia específico, el papel de una nueva proteína regulada en la decidualización, la proteína de unión a ARN CSD-C2. Encontramos que el bloqueo del RP, mediante su antagonista onapristona, produjo la reabsorción de los sitios de implantación (SIs) y la disminución en la expresión proteica del RP, RE, PCNA, DESMINA y CCND3, en los niveles de ARNm de Prl8a2, y de Hand2 y Bmp2, y en la activación de ERK. El efecto deletéreo de onapristona fue parcialmente contrarrestado por el antagonista del RE faslodex, restituyendo los niveles de los receptores de hormonas, de los marcadores de proliferación y diferenciación analizados, y aumentando compensatoriamente los niveles de Hand2 y Bmp2, y pERK. El tratamiento de ratas preñadas con el inhibidor de pERK, evidenció su importancia en la formación de la decidua, manteniendo la capacidad proliferativa de las células estromales y limitando su diferenciación en las distintas áreas deciduales. Estos hallazgos muestran la importancia del balance de señalización de los receptores hormonales, a la vez que describen nuevas moléculas responsables de la decidualización endometrial durante la preñez temprana.

Abstract:
The uterine stroma undergoes complex morphological and functional shifts that build the decidua, a specialized compact tissue leading to successful pregnancy. Progesterone receptor (PR) and estrogen receptor (ER) participate in growth and differentiation of several rat decidual regions. This thesis studies the role of these receptors, related signalling pathways and novel molecules during the initial steps of pregnancy. We characterized the role of the RNA binding protein, CSD-C2, during decidualization by specific siRNA in vivo administration. Early suppression of progesterone receptor activity by treatment with the progesterone antagonist (onapristone) resulted in resorption of the implantation sites (ISs) with concomitant decrease in the expression of PR, ER, PCNA, DESMIN, CCND3, Prl8a2, and signalling players such as Hand2, Bmp2 and ERK activation. The deleterious effect of onapristone was partially counteracted by the ER antagonist (Faslodex) with rescue of hormone steroid receptors, markers of proliferation and differentiation and the probably compensatory increase of Hand2, Bmp2 and ERK activation compared to oil treated controls. The treatment of pregnant rats with MEK inhibitor showed ERK activation relevance during the late stage of decidua development, keeping the proliferation capacity of stromal cells and limiting the differentiation process in specified regions of decidual tissues. These findings highlight the balance of ovarian steroid hormone receptors during early pregnancy, and describe new players in the decidualization process.

Andreone, Luz. "Nuevos aspectos de la regulación endocrina y paracrina de la producción gonadal de inhibinas y activina A" (2014-11-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las inhibinas y activinas, son glicoproteínas diméricas formadas por subunidades α y β. Las inhibinas, producidas en las células de la granulosa en el ovario y en las células de Sertoli (CS) en el testículo, han sido aisladas por su capacidad de inhibir selectivamente la producción de la hormona folículo estimulante (FSH) en el gonadotropo. Las activinas, potentes estimuladores de la síntesis y secreción de FSH, actúan además como factores de crecimiento en distintos tipos celulares. Ambos factores resultan esenciales en la regulación del eje hipotálamo-hipófiso- gonadal. El presente trabajo de Tesis tuvo como objetivo esclarecer, utilizando diferentes modelos experimentales, nuevos mecanismos de regulación involucrados en la expresión de las subunidades de inhibina/activina (α, βA y βB) y la producción de inhibinas y activina A en células ováricas y testiculares. Los resultados obtenidos en cultivos de folículos antrales tempranos de rata, evidenciaron la importancia de la interacción de los distintos tipos celulares para mantener el predominio de la inhibina B en los primeros estadios del desarrollo folicular. Asimismo, permitieron describir el efecto modulador diferencial del entorno esteroideo intrafolicular y su interacción con la FSH sobre la producción de inhibinas y activina A. Un hallazgo particularmente original fue la acción regulatoria del 25-hidroxicolesterol sobre la expresión de estos péptidos. Los estudios realizados en cultivos de CS de rata demostraron que la acción de FSH y de factores paracrinos sobre la producción de inhibinas y activina A varía de acuerdo al grado de maduración de la gonada. En la CS inmadura, factores provenientes de las células peritubulares tendrían un papel importante en el sostenimiento de la alta producción de inhibina B característica de esta etapa del desarrollo. En las CS en estadios avanzados de maduración, la FSH, en forma conjunta con factores provenientes de las células germinales, constituiría el estímulo más relevante para estimular la producción de inhibina B. La FSH se sintetiza y secreta como una familia de variantes de glicosilación, las cuales difieren en la composición de sus oligosacáridos y en la capacidad de inducción de respuestas biológicas. Los estudios in vitro realizados en CS en estadios avanzados de maduración demostraron que el grado de sialilación y complejidad de los oligosacáridos presentes en la FSH sería un factor regulatorio adicional de la producción de inhibinas en la gonada masculina. Finalmente, la incapacidad de producir inhibina B in vivo observada en un paciente con un desorden del desarrollo sexual, impulsó el estudio de factores inhibitorios de la producción de inhibinas en cultivos de túbulos seminíferos humanos y CS de rata. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de Tesis contribuyen a esclarecer los mecanismos de regulación de la producción de inhibinas y activina A en la gonada y confirman el valor de estos péptidos como marcadores de la función ovárica y testicular.

Abstract:
Inhibins and activins are structurally related dimeric glycoproteins composed of α and/or β subunits. Inhibins, produced by granulosa cells in the ovaries and in Sertoli cells (SC) in the testes, were isolated on the basis of their capacity to specifically suppress follicle stimulating hormone (FSH) secretion by the gonadotropes. Activins are potent stimulators of FSH synthesis and secretion and they act as growth factors on different cell types. Both peptides are essential for the modulation of the hypothalamic–pituitary–gonadal axis function. The present study was aimed at elucidating, using different in vitro experimental models, new regulatory mechanisms involved in inhibin/activin subunit (α, βA y βB) expression as well as inhibins and activin A production in ovarian and testicular cells. The results obtained in cultured rat early antral follicles, revealed the importance of the interaction among different types of follicular cells to sustain the predominance of inhibin B at early stages of follicular development. Furthermore, the results showed that the complex interplay between FSH and the steroid follicular microenvironment differentially modulate the gene expression of inhibin/activin subunits, their assembly and secretion. In addition, a novel modulatory action of 25-hydroxycholesterol on inhibin/activin follicular expression was described. The studies carried on using rat SC cultures demonstrated that the action of FSH and paracrine factors on inhibin and activina A production varies according to the stage of gonadal maturation. Factors produced by peritubular cells might have an important role in sustaining the high production of inhibin B in the immature SC. At later stages of SC maturation, FSH and factors derived from germ cells, constitute the most relevant stimulus for modulating inhibin B production. FSH is synthesized and secreted as a family of glycosylation variants, which differ in their oligosaccharide composition and in their ability to induce biological responses. The in vitro studies performed in SC at more advanced stages of maturation demonstrated that the sialylation degree as well as the complexity of oligosaccharides present in the FSH molecule should be considered as additional factors in the modulation of inhibin production in the pubertal male gonad. In the last section of this study, the incapacity to produce inhibin B in vivo, observed in a patient with a disorder of sex development, led us to study inhibitory factors of inhibin production in cultured human seminiferous tubules and rat SC. The results obtained herein contribute to deepen the knowledge of the regulatory mechanisms underlying inhibins and activin A production, confirming their usefulness as peripheral markers of ovarian and testicular function from birth to adulthood.

Ronchetti, Sonia Alejandra. "Efectos del arsénico sobre la adenohipófisis. Mecanismos de acción" (2014-12-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Introducción: El arsénico es un metaloide ampliamente distribuido en el ambiente el cual presenta potentes efectos tóxicos. La contaminación provocada por arsénico inorgánico (iAs) es uno de los mayores problemas sanitarios a nivel mundial. Si bien se han reportado efectos adversos del iAs sobre la función reproductiva, poco se conoce de sus acciones sobre la liberación hormonal y la fisiología adenohipofisaria. Objetivos: 1) Estudiar el efecto citotóxico del iAs sobre la fisiología adenohipofisaria y caracterizar los mecanismos de acción. 2) Investigar el papel del iAs como agente xenoestrogénico en la adenohipófisis y el útero. Resultados: 1) La exposición al iAs, a través del agua de bebida en diferentes concentraciones (5, 25 o 100 ppm) durante 30 días en ratas machos, disminuyó los niveles plasmáticos de prolactina (PRL) en forma dosis dependiente, mientas que la hormona luteinizante (LH) se vio afectada sólo con la máxima concentración utilizada. La administración del metaloide in vivo alteró la expresión del ARNm de genes de respuesta al estrés oxidativo en la adenohipófisis sugiriendo que, en estas condiciones, el iAs induce estrés oxidativo en la glándula. Confirmando los resultados in vivo, el iAs, en concentraciones micromolares, disminuyó la liberación de PRL en forma tiempo-dependiente sin afectar la de LH en cultivos primarios de células adenohipofisarias. Además, el iAs redujo la viabilidad celular adenohipofisaria, efecto debido principalmente a la inducción de apoptosis. Este proceso se caracterizó por un incremento de las especies reactivas del oxígeno, la despolarización del potencial de la membrana mitocondrial y un aumento en la expresión del ARNm de MT-1 y HO-1. El tratamiento con el antioxidante Nacetilcisteína previno el efecto citotóxico y la inhibición de la liberación de PRL inducida por iAs. 2) La administración del iAs a dosis bajas (0,1 ppm) durante 30 días a ratas hembras ovariectomizadas (OVX) indujo la aparición de proestros y estros respecto al control OVX. En la adenohipófisis, se observó un estímulo en la proliferación celular, especialmente de los lactotropos y un incremento en la secreción de PRL. Este metaloide también reguló la expresión proteica del REa y de su variante truncada. En el útero, la exposición al metaloide causó modificaciones citoestructurales mostrando un incremento del área glandular y de la altura del epitelio. Además, el iAs alteró la expresión del REa en las células epiteliales y en el estroma. Conclusiones: El iAs es un disruptor endocrino cuyos efectos varían con la dosis y el tiempo de exposición. A concentraciones micromolares, el iAs induce apoptosis e inhibe la secreción de prolactina. La generación de estrés oxidativo parece ser el principal mediador de los efectos tóxicos del metaloide. Por otro lado, a concentraciones más bajas, el iAs reproduce las acciones del estrógeno, estimulando la proliferación celular en tejidos hormona-dependientes.

Abstract:
Introduction: Arsenic is a metalloid ubiquitously present in the environment with potent toxic effects. Inorganic arsenic (iAs) contamination is considered one of the top environmental health threats worldwide. Many reports have shown that iAs affects reproductive system, however, little is known about the effect of iAs on hormone release and anterior pituitary physiology. Objectives: 1) To study the cytotoxic effect of iAs on anterior pituitary physiology and describe its mechanisms. 2) To investigate iAs xenoestrogenic role on anterior pituitary and uterus. Results: 1) iAs exposure (5, 25 or 100 ppm) to male rats through drinking water for 30 days decreased prolactin (PRL) serum levels in a dose-dependent manner whereas luteinizing hormone (LH) levels were affected only at the highest concentration used. In vivo iAs administration increased mRNA expression of several oxidative stress-responsive genes in anterior pituitary gland, suggesting that this metalloid induces oxidative stress in pituitary gland. iAs, at micromolar concentrations, significantly decreased PRL release in a timedependent fashion whereas LH levels remained unaltered in anterior pituitary cells in culture. Besides, iAs reduced cell viability mainly by apoptosis. This process is characterized by increased levels of reactive oxygen species, early depolarization of mitochondrial membrane potential and augmented expression of some key oxidative stress-responsive genes such as HO-1 and MT-1. The antioxidant N-acetylcysteine prevented iAs-induced cytotoxic effects and prolactin release inhibition. 2) iAs administration at lower doses (0,1 ppm) to female ovariectomized rats (OVX) for 30 days induced the apparition of proestrus and estrus. In the pituitary gland iAs stimulated cell proliferation, especially of lactotroph and increased PRL secretion. This metalloid also regulated protein expression of ERa and its truncated variant. In uterus, iAs exposure caused cytoarchitectural changes by increasing both glandular area and uterine epithelium height. Besides, iAs altered ERa expression in epithelial cells and stroma. Conclusions: iAs is an endocrine disruptor whose effects vary with dose and exposure time. At micromolar concentrations iAs induces apoptosis and inhibits PRL secretion. Oxidative stress generation seems to be the main mediator of the metalloid’s toxic effects. On the other hand, at lower concentrations, iAs mimics estrogen actions by stimulating cell proliferation on hormone-dependent tissues.

Bourguignon, Nadia Soledad. "El arsenito de sodio, un disruptor endócrino que afecta el eje reproductivo y la homeostasis de la glucosa" (2014-12-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La contaminación con As (As) en el agua de bebida se considera una amenaza para la salud en todo el mundo, ya que está asociado a un mayor riesgo de contraer enfermedades como cáncer de piel y pulmón, provocar efectos indeseables sobre el desarrollo, la reproducción las secreciones internas y alteraciones cardiovasculares. Debido a que el As puede actuar como un disruptor endócrino aquí investigamos el efecto de la exposición a As, durante períodos críticos del desarrollo neuroendócrino como es la gestación y las semanas postparto, sobre el eje reproductivo y el metabolismo de la glucosa, en las madres y sus crías. Se administraron 5 (A5) o 50 ppm (A50) de arsenito de sodio en el agua de bebida a ratas Sprague Dawley preñadas, desde el día 1 de gestación hasta el sacrificio (2 meses postparto). Al destete, se dividieron las crías en dos grupos: uno continuó recibiendo el mismo tratamiento que la madre y el otro recibió agua destilada hasta el día del sacrificio (4 meses). En las madres, la exposición a As produjo alteraciones en la homeostasis de la glucosa durante la preñez, probablemente alterando la funcionalidad de las células β, incrementando el riesgo de desarrollar diabetes gestacional. Además, alteró la fisiología reproductiva, sugiriendo el desarrollo de una falla ovárica prematura. Las crías expuestas a As durante el desarrollo presentaron alteraciones en la fisiología reproductiva, principalmente las hembras, mientras que el metabolismo de la glucosa no se vio afectado.

Abstract:
Arsenic contamination in drinking water is considered a worldwide threat to health, that is associated with an increased risk of diseases such as skin and lung cancer, cause undesirable effects on development, internal reproduction secretions and cardiovascular disorders. Because As can act as an endocrine disruptor, here we investigated the effect of As exposure, during critical periods of neuroendocrine development as gestation and postnatal weeks, on the reproductive axis and metabolism of glucose in dams and their offspring. We administered 5 (A5) or 50 ppm (A50) of sodium arsenite in drinking water to Sprague Dawley rats from gestational day 1 until sacrifice (two months postpartum). At weaning the offspring were divided in two groups: one of each continued to receive the same treatment and the other one received distilled water until sacrifice (4 months of age). In dams, As exposure induces glucose homeostasis alterations during pregnancy, probably by altering β-cell function, increasing the risk of developing gestational diabetes. In addition, profoundly impaired reproductive physiology, suggesting premature ovarian failure due to arsenic exposure, may have developed. Offspring rats exposed to arsenic during development present altered reproductive physiology, mainly females, while metabolism is not affected.

Luque, Guillermina María. "La disrupción específica del receptor dopaminérgico D2 en lactotropos devela un rol de la prolactina en el control de la ingesta y el metabolismo" (2015-03-12) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La prolactina es una hormona altamente versátil secretada principalmente por los lactotropos de la hipófisis anterior. Su función en la reproducción y fertilidad ha sido muy estudiada, pero poco se sabe de su acción en la regulación del peso corporal y el metabolismo. Altos niveles de prolactina se observan durante la preñez y la lactancia, estados en los que se favorece la hiperfagia. Durante la preñez, los mecanismos normales que regulan el apetito son modificados para generar un balance energético positivo, incrementando la ingesta y los reservorios grasos para abastecer el requerimiento del feto en crecimiento, y ser utilizados posteriormente en la lactancia. Existen numerosos resultados que apoyan la hipótesis de que la prolactina posee un rol significativo en la regulación del peso corporal. Por ejemplo, el ratón deficiente del receptor de prolactina presenta peso corporal y depósitos de grasa disminuidos, la administración de prolactina estimula la ingesta de alimento, y niveles elevados de esta hormona de manera crónica (como ocurre durante la preñez) incrementan la ingesta posiblemente por la inducción de una resistencia a leptina. Sin embargo, ratones macho conteniendo hipófisis ectópicas muestran sólo un mínimo incremento en el peso corporal con un descenso en el tejido adiposo, y ratones hembra que sobreexpresan prolactina no muestran modificaciones en el peso. Por otro lado, en nuestro laboratorio hemos descripto que los ratones hembra carentes del receptor de dopamina D2 en todo su organismo (Drd2-/-) presentan una hiperprolactinemia crónica e hiperplasia hipofisaria, pero con pesos corporales y niveles de ingesta similares a los ratones salvajes. Cabe destacar, que el ratón Drd2-/- no resultaría un modelo óptimo para el estudio de los efectos de altos niveles de prolactina en el balance energético, dada la importancia fundamental de los receptores de dopamina D2 (RD2s) centrales en las adicciones y los mecanismos de recompensa relacionados al comportamiento alimenticio. La evidencia disponible sugiere que la falta de RD2s centrales en el ratón Drd2-/- podría estar activando mecanismos compensatorios para limitar finalmente la ingesta de alimento en este modelo hiperprolactinémico. Por lo tanto, nuestra hipótesis sostiene que la deleción específica de los RD2s solamente en lactotropos nos permitiría estudiar los efectos de altos niveles de prolactina en la ingesta y adiposidad, sin los efectos solapados, fisiológicos y patofisiológicos, presentes en el modelo mutante knockout global. Para ello usamos ratones carentes de los RD2s solamente en lactotropos (lacDrd2KO) generados por la tecnología Cre LoxP. Las hembras presentaron hiperprolactinemia crónica e hiperplasia hipofisaria, relacionada a un aumento en la proliferación celular y angiogénesis, resultando un modelo ideal para el estudio de prolactinomas resistentes a agonistas dopaminérgicos. Presentan, por otra parte, un eje de GH conservado. En los ratones hembra lacDrd2KO, pero no los machos, la hiperprolactinemia se asoció a un incremento en el peso corporal relacionado a mayores los niveles de ingesta. En cuanto a la regulación de la ingesta, en el hipotálamo observamos una expresión incrementada del péptido orexigénico Npy, mientras que los niveles de Pomc y Ppo no se vieron alterados (en contraste con los resultados previamente obtenidos en los ratones Drd2-/-). Determinamos a su vez, una posible resistencia a la leptina. Es decir que en este nuevo contexto, pudimos determinar un efecto orexigénico de la prolactina, mediado por una acción hipotalámica sobre la expresión del neuropéptido Npy. Se evidenció, además, un incremento significativo en los depósitos de grasa, tamaño de los adipocitos, triglicéridos y ácidos grasos no esterificados séricos, como consecuencia de una disminución en la expresión de enzimas lipolíticas en el tejido adiposo. A nivel hepático, el ratón hembra lacDrd2KO también presentó adiposidad incrementada, con aumento en los triglicéridos hepáticos, que no se relacionó a cambios en la expresión de enzimas lipogénicas/lipolíticas, pero sí al aumento de factores de transcripción que estimulan la lipogénesis mediada por glucosa. A su vez, los ratones hembra lacDrd2KO presentaron una intolerancia a la glucosa y deficiencia en la liberación de insulina, sin resistencia a la misma. Nuestros resultados revelan un rol fundamental de la prolactina en la ingesta y adiposidad e ilustran el valor de estudiar modelos transgénicos tejido específicos, para evaluar mecanismos patofisiológicos, de otra manera enmascarados en mutantes nulos o animales tratados con agentes farmacológicos.

Abstract:
Prolactin is a pleiotropic hormone secreted by lactotropes in the anterior pituitary gland. Although its role in reproduction and fertility has been extensively studied, less is known about its action on metabolism and body weight regulation. The high prolactin levels typically observed in pregnant and lactating females contribute to a hyperphagic state. During pregnancy, the normal homeostatic mechanisms regulating appetite are modified to generate a state of positive energy balance, increasing food intake and fat storage to supply the growing fetus with its energy requirements and to be used during lactation. Consistent with the hypothesis that prolactin has a significant role in the regulation of body weight, prolactin receptor deficient mice exhibit lower body weight and reduced fat mass, prolactin administration stimulates food intake, and chronically elevated prolactin levels, such as those seen during pregnancy, increase food intake, probably by inducing a state of leptin resistance. However, male mice bearing ectopic pituitary glands show a small increase in body weight with a decline in fat mass, and female mice overexpressing prolactin do not show greater body weight. Furthermore, we found that female mice lacking dopamine D2 receptors (Drd2-/-) exhibit chronic hyperprolactinemia and pituitary lactotrope hyperplasia but have body weight similar to that of wild-type females in adulthood as well as food intake. However, Drd2-/- mice are not an optimal model to study the effects of chronic hyperprolactinemia on energy balance, given the fundamental importance of central dopamine D2 receptors (D2Rs) in addiction and reward mechanisms related to feeding behavior. The available evidence suggests that lack of central D2Rs in the Drd2-/- model might activate compensatory mechanisms that could ultimately limit food intake in this hyperprolactinemic transgenic model. Therefore, we hypothesize that limiting Drd2 ablation specifically in lactotropes would allow us to study the effect of high prolactin secretion on food intake and adiposity, without the confounding physiological and pathophysiological mechanisms present in global null allele Drd2 mutants. We used conditional mutant mice lacking D2Rs in pituitary lactotropes (lacDrd2KO) performed by Cre loxP technology. LacDrd2KO female mice exhibited chronic hyperprolactinemia and pituitary hyperplasia related to an increase in proliferation and angiogenesis, being an excellent animal model for the study of dopamine resistant prolactinomas. They also present a preserved GH axis. In lacDrd2KO female, but not male mice, hyperprolactinemia was associated with increased body weight and food intake. Hypothalamic Npy mRNA expression was increased, while Pomc and Ppo mRNA levels were unaltered (in contrast to results in global D2R knockout mice). In addition, a state of leptin resistance was shown. Thus, the orexigenic effect of prolactin and its action on hypothalamic Npy expression were fully evidenced, leading to increased food intake. Marked increments in fat depots, adipocyte size, serum triglycerides, and nonesterified fatty acid levels were seen as a consequence of a decrease in lipolytic enzymes in adipose tissue. On the other hand, the liver of female lacDrd2KO mice had increased lipid content as indicated by oil red staining and triglyceride content, which was not related to changes in lipogenic/lipolytic enzyme expression, but with an increase in mRNA expression of lipogenic transcription factor regulated by glucose. Furthermore, lacDrd2KO female mice had glucose intolerance, deficient insulin secretion but a preserved response to it. Our results highlight an important role of prolactin in the regulation of food intake and adiposity and illustrate the value of studying cell-specific mutant mice to disentangle the pathophysiological mechanisms otherwise masked in null allele mutants or in animals treated with pervasive pharmacological agents.

Scaia, María Florencia. "Rol de los estrógenos en la fisiología testicular del sapo Rhinella arenarum (Amphibia, Anura)" (2015-03-31) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El órgano de Bidder (BO) es una estructura característica de los bufónidos, entre ellos, Rhinella arenarum. Este órgano expresa varias enzimas esteroidogénicas, incluyendo la aromatasa, responsable de la síntesis de estrógenos. En algunos anfibios se propuso que el estradiol (E2) tiene un efecto negativo directo sobre la función testicular, más allá de la regulación de las gonadotrofinas hipofisarias. En este marco, y utilizando como modelo experimental machos de R. arenarum, los objetivos de esta tesis fueron: analizar la capacidad del BO de producir E2 a partir de sustratos endógenos, medir las variaciones estacionales en la concentración plasmática de E2, determinar la presencia del receptor testicular de estrógenos (ER) y analizar el efecto del E2, a lo largo del año, sobre las enzimas esteroidogénicas citocromo P450 17α-hidroxilasa-C17–20 liasa (CypP450c17) y 3β- hidroxiesteroide deshidrogenasa/ isomerasa (3β-HSD/I), sobre la apoptosis y la proliferación. Los resultados obtenidos muestran que los niveles de E2 plasmático son significativamente menores durante el período pre reproductivo (PreR) y que el BO es una de las principales fuentes de E2. Además, se determinó la presencia de ER en testículo. El tratamiento con E2 no modificó ni la actividad ni la expresión del CypP450c17, mientras que se detectó una inhibición significativa de la actividad de 3β-HSD/I durante el período post reproductivo (PostR). Por otra parte, se observó una elevada tasa de proliferación espermatogonial durante el período reproductivo (R) y una marcada apoptosis durante el PostR. El tratamiento con E2 estimuló la apoptosis solo durante el período R y no se observó efecto en la proliferación de la línea espermatogénica. En conclusión, esta tesis describe las variaciones estacionales en el E2 plasmático, la apoptosis y la proliferación testicular, y demuestra que el E2 regula la esteroidogénesis testicular y la espermatogénesis.

Abstract:
Bufonids, among them Rhinella arenarum, are characterized for having a structure called Bidder's organ (BO). This organ expresses steroidogenic enzymes, including aromatase that is responsible for estrogens synthesis. In several amphibians, it has been proposed that besides regulating pituitary gonadotropins, estradiol could have direct negative effects on testicular function. In this context, the purpose of this study was to describe seasonal variations in plasma estradiol (E2) in males of R. arenarum, to determine the capacity of the BO to synthesize E2 from endogenous substrates, to determine the presence of estrogen receptor (ER) in the testes and to analyze the effect of E2 on testicular steroidogenic enzymes, like the cytochrome P450 17α-hidroxilase-C17–20 liase (CypP450c17) and 3β- hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase (3β-HSD/I), and on proliferation and apoptosis of the germ line. Results indicate that plasma E2 is significantly lower during the pre reproductive (PreR) season than during the reproductive (R) and post reproductive (PostR) seasons, and that the BO is one of the main sources of plasma E2. After the presence of ER was determined, testicular fragments were incubated with different concentrations of E2. Results indicate that E2 has no effect either on CypP450c17 activity or on protein level, while it reduces 3β-HSD/I activity only during the PostR season. Furthermore, high rate of spermatogonial proliferation was found during the breeding and elevated apoptosis in the PostR season, mostly in spermatocytes. Treatments with E2 stimulate testicular apoptosis during the R season, with no effect on testicular proliferation all year long. Taken together, these results demonstrate that E2 is involved in the regulation of testicular steroidogenesis and spermatogenesis.

Maur, Damián Gustavo. "Participación del óxido nítrico en las alteraciones comportamentales y neuroendócrinas inducidas por estrés prenatal" (2015-08-21) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Durante el desarrollo prenatal los organismos son vulnerables a factores que pueden afectar su homeostasis. Ha sido demostrado que el estrés durante la preñez tiene efectos en la descendencia que pueden perdurar hasta la adultez, afectando numerosos procesos fisiológicos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes aún no han sido completamente dilucidados. El objetivo de esta tesis fue estudiar la participación del óxido nítrico (NO) en las alteraciones comportamentales y neuroendócrinas inducidas por estrés prenatal (EP). Se observó un incremento en el comportamiento de tipo ansiogénico y un peor desempeño en una tarea de aprendizaje asociativo en machos EP que revirtió parcialmente con un dador de NO. Se detectó una disminución de la óxido nítrico sintasa (NOS) en el hipocampo de machos adultos, mientras que en las hembras no se encontraron cambios. En el hipotálamo se observó un incremento en nNOS en hembras EP, mientras que en los machos no se observaron cambios. La exposición a estrés agudo en la adultez estimuló el incremento de corticosterona en plasma, que revirtió más lentamente en los machos EP que en los controles. En las hembras, la recuperación fue más rápida en las EP que en controles. El tratamiento con un dador de NO atenuó la respuesta al estrés en ambos grupos de hembras y en los machos EP, pero no en los controles, en los que facilitó la reversión. El tratamiento con un inhibidor de nNOS anuló en todos los grupos la reversión de la corticosterona a niveles basales luego del estrés agudo. Por lo tanto, la señalización mediada por NO estaría involucrada en las alteraciones conductuales y neuroendócrinas descriptas en este modelo.

Abstract:
During prenatal development organisms are vulnerable to factors that can affect homeostasis. It has been established that stress during pregnancy affects many physiological processes in the offspring that persist in adulthood. However, the underlying mechanisms have not been fully ellucidated. The objective of this thesis was to study the role of nitric oxide (NO) in the behavioural and neuroendocrine alterations induced by prenatal stress (PS). An increase in anxiety-like behaviour and an impairment in associative learning in male PS rats were found. Treatment with a NO donor partially reverted these changes. There was a decrease in hippocampal nitric oxide synthase (NOS) in male adults, without changes in females. Levels of hypothalamic nNOS in PS female rats were increased, while in male rats there were no changes. Acute stress exposure in adulthood led to an increase in plasma corticosterone levels that reverted slower in PS males than controls. Treatment with a NO donor atenuated stress response in both female groups and in PS males, while in control males it facilitated reversion. Treatment with a nNOS inhibitor blocked the revertion of corticosterone levels to basals after stress in all experimental groups. Therefore, NO mediated signaling would be involved in the behavioural and neuroendocrine alterations here described.

Regueira, Mariana. "Mecanismos moleculares involucrados en la regulación de la oxidación de ácidos grasos en células de Sertoli" (2015-11-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La célula de Sertoli (CS), componente somático del tubo seminífero, provee el soporte estructural y nutricional para el desarrollo de las células germinales. La CS metaboliza glucosa a lactato, principal sustrato energético para las células germinales, por lo que se ha postulado que utiliza ácidos grasos (AG) como fuente energética propia. Los factores de transcripción de la familia de los PPARs son receptores activados por ligando que participan en la regulación del metabolismo de AG en diversos tejidos. El objetivo general del presente trabajo de tesis fue estudiar los mecanismos moleculares que intervienen en la regulación del metabolismo energético en el túbulo seminífero. Para ello se utilizó como modelo experimental el cultivo de CS de rata de 20 días de edad. Se observó que la activación farmacológica de PPAR α y PPAR β/δ produce un aumento en la oxidación de AG y en la expresión de genes vinculados con su transporte y metabolismo (FAT/CD36, CPT1, LCAD y MCAD). Además, se observó que sólo la activación de PPAR β/δ regula de manera simultánea la oxidación de AG y la producción de lactato. Asimismo, se evaluaron posibles mecanismos fisiológicos que podrían conducir a la activación de los PPARs en el túbulo seminífero. Se observó que las células germinales apoptóticas (CGA) y el ácido palmítico, AG que podría provenir de la hidrólisis de las gotas de lípidos –generadas por la fagocitosis de CGA– o del exterior de la célula, regulan la expresión de genes vinculados con el transporte y metabolismo de AG y por otra parte, que en dicha regulación participa la activación del PPAR β/δ. Por último, se evaluó la posible regulación hormonal de la oxidación de AG en CS y la participación del PPAR β/δ en dicha regulación. Se demostró que existe una modulación diferencial del metabolismo de AG por FSH y bFGF en CS. Se observó que FSH –hormona anabólica de la CS– disminuye la oxidación de AG y aumenta la expresión génica sin participación de PPAR β/δ, mientras que bFGF regula positivamente el catabolismo de AG y la producción de lactato de manera PPAR β/δ dependiente. En su conjunto, estos resultados revelan la existencia de una compleja regulación de los mecanismos moleculares que participan en la oxidación de ácidos grasos y la producción de lactato en CS que refleja el ajuste fino del metabolismo energético en el túbulo seminífero necesario para una adecuada espermatogénesis.

Abstract:
The purpose of this study was to evaluate the molecular mechanisms involved in the regulation of the energetic metabolism in the seminiferous tubule. To achieve this purpose Sertoli cell (SC) cultures obtained from 20-day-old rats were used. We observed that the pharmacological activation of PPAR α and PPAR β/δ increases fatty acid (FA) oxidation and the expression of genes involved in FA transport and metabolism. However, only activation of PPAR β/δ increases SC lactate production as a result of an increase in pyruvate availability. Next, we evaluated possible physiological mechanisms implicated in PPARs activation in the seminiferous tubule. SC were cocultured with apoptotic germ cells or treated with palmitic acid. We observed that both treatments increase the expression of genes that are involved in FA transport and metabolism with the participation of PPAR β/δ activation. Finally, we evaluated the possible hormonal regulation of FA metabolism in SC. We observed that FSH –the SC trophic hormone– decreases FA oxidation and increases gene expression and lactate production in a PPAR β/δ independent manner. On the other hand, we observed that bFGF –a growth factor secreted by germ cells– increases FA oxidation, CPT1 expression and lactate production in a PPAR β/δ dependent manner. Altogether, these results suggest that in SC a fine-tuning of FA metabolism and lactate production occurs in order to ensure the energetic requirements of SC and germ cells simultaneously.

Mercau, María Elisa. "Mecanismos celulares involucrados en la regulación del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal en un modelo animal de insulinorresistencia inducida por la ingesta de carbohidratos simples" (2016-02-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Diversas evidencias experimentales demostraron que el desarrollo de insulinorresistencia (IR) se acompaña de cambios en la actividad del eje hipotálamo-hipófiso_adrenal (HHA) que se traducen en variaciones en los niveles sanguíneos de glucocorticoides (GC), tanto en pacientes como en modelos animales de la enfermedad. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos un aumento en los niveles de GC en animales tratados con una dieta rica en sacarosa (DRS) durante 7 semanas que se asoció con una respuesta adrenal disminuida en la prueba de estimulación con la hormona adrenocorticotropina (ACTH). Dado que la principal hormona reguladora de la secreción de GC es la ACTH, el objetivo central de este trabajo de tesis consistió en evaluar los efectos de la administración de DRS sobre la producción de ATCH en distintos estadios del dearrollo de IR y estudiar los mecanismos subyacentes a las alteraciones encontradas a nivel adenohipofisario. En ese marco, evaluamos los efectos del tratamiento antioxidante sobre cambios tempranos inducidos por el consumo de DRS y del ejercicio moderado como medida preventiva de los efectos de la exposición prolongada a la dieta. Los resultados obtenidos indicaron que en el modelo animal de IR por la administración de DRS, los animales presentaron cambios en la secreción de ACTH y corticosterona. En etapas tempranas del tratamiento (3 semanas) encontramos un aumento en la actividad del eje HHA, que fue previa a la detección de cambios en la insulinosensibilidad sistémica (evidente a partir de la séptima semana del inicio del consumo de DRS). Sin embargo, en animales tratados por períodos más prolongados (15 semanas) observamos una disminución de los niveles circulantes de ACTH y de corticosterona. Postulamos que la hiperactivación temprana del eje podría estar asociada con la generación de estrés oxidativo a nivel adenohipofisario, dado que el tratamiento antioxidante sistémico previno tanto el aumento de marcadores de este proceso como la hipersecreción de ACTH. La disminución en la actividad del eje HHA detectada en etapas más tardías del tratamiento podría ser consecuencia de la exposición crónica del tejido hipofisario al estrés oxidativo, inducido por concentraciones elevadas de ácidos grasos no esterificados (AGNE) circulantes, un efecto que podría ser medido por la inducción de autofagia. Demostramos que el ejercicio moderado previno la inducción de estos procesos y la inhibición de la secreción de ACTH en animales alimentados con DRS durante 15 semanas, además de evitar el incremento de AGNE. Finalmente, estudiamos con mayor profundidad estos procesos en células adenohipofisarias en cultivo evaluando el efecto de la incubación de células de la línea ArR-20 con ácido palmítico (C16:O) y con inductores de estrés oxidativo y autofagia. En suma, nuestros resultados indican que la administración de una DRS produce un incremento temprano en la expresión de Pomc y ACTH posiblemente mediada por la generación de estrés oxidativo tisular. Una exposición prolongada del tejido a niveles incrementados de nutrientes, como los ácidos grasos, adicionalmente induce el proceso autofágico, lo que lleva a una hipofunción de la glándula. Los GC afectan el metabolismo estimulando la movilización de las reservas energéticas. Sin embargo, un aumento sostenido de los niveles de estas hormonas podría contribuir al agravamiento de las características metabólicas del síndrome de IR, y precipitar la aparición de las complicaciones a largo plazo relacionadas con la enfermedad. En nuestro modelo, el estado de IR crónico se correlacionó con una inhibición de la actividad basal del eje HHA, lo que contribuiría al restablecimiento de la homeostasis metabólica. Sin embargo, también podría dar lugar a complicaciones adicionales, como la insuficiencia adrenal, afectando la respuesta del organismo frente a situaciones de estrés, lo que representaría otro factor de riesgo para los pacientes con IR.

Abstract:
It has been previously described that insulin resistant (IR) individuals (humans and animals) have an altered function of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA), which translates into changes in their blood levels of glucocorticoids (GC). Previous studies from our group have shown that animals fed a sucrose-rich diet (SRD) for 7 weeks exhibit an increase in basal GC secretion, associated with an impairment os adrenal response to an exogenous ACTH challenge. Given that the adrenocorticotropic hormone (ACTH) secreted by the pituitary gland is the main regulator of adrenal function, the main goal of the present study was to analyse the effect of SRD consumption on ACTH production at different stages of the development of IR, and elucidate possible underlying mechanisms operating at pituitary level. In this context, we analyzed the effects of antioxidant treatment on the early changes induced by SRD consumption, and of moderate exercise as a preventive measure to counteract the effects of prolonged exposure to SRD. Our results indicate that in the experimental model of SRD-induced IR, animals present alterations in the production and blood levels of ACTH and corticosterone. In this sense, we observed that SRD treatment induces an early hyperactivation of the HPA axis (3rd week), which was prior to the observed changes in insulin sensitivity (only evident after 7 weeks os treatment). However, as treatment progresses, prolonges SRD-consumption (15 weeks) inhibits basal HPA activity, as evidenced by lower circulating ACTH and corticosterone levels. We propose that the early hyperactivation of the HPA axis found in SRD-treated animals could be associated with the generation of oxidative stress at pituitary level, given that systemic antioxidant treatment prevented the induction of these processes and also ACTH hypersecretion. The impairment in HPA activity induced by long-term SRD treatment (15 weeks), could ba a consequence of chronic overexposure of the pituitary tissue to increased levels of circulating non-esterified fatty acids (NEFA), which could trigger oxidative-stress induced autophagy in ACTH-producing cells. Our results show that moderate exercise prevented the induction of these cellular processes, as well as SRD-induced corticotroph dysfunction, while also normalizing NEFA levels. In order to confirm these results, we studied the underlying mechanisms in cultured corticotrophs by incubating ArT-20 cells in the presence of plamitic acid (C16:O), a main component of the NEFA fraction, or with oxidative stress and autophagy inductors. From these studies we concluded that oxidative stress generation and autophagy mediate POMC inhibition triggered by palmitic acid treatment. Taken together, our results show that SRD administration induces an early increase in Pomc expression and ACTH release, possibly mediated by an increase in oxidative stress at pituitary level. Chronic exposure of pituitary tissue to an increased concentration of nutrients (e.g. fatty acids, among others) additionally induces autophagy in corticotroph cells, which could lead to inhibition of ACTH production. Among other actions, GC affect metabolism by stimulating the mobilization of energy stores in order to cope with increased metabolic demands. However, a sustained increase in circulating GC levels could contribute to aggravate the clinical manifestations of metabolic syndrome. In our animal model, chronic IR correlated with inhibition of basal HPA axis activity, which could help to restore metabolic homeostasis. However, this could also lead to complications, such as adrenal insufficiency, that might affect the response to stressful stimuli, representing an additional risk for patients with IR.

Título :	Mecanismos celulares involucrados en la regulación del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal en un modelo animal de insulinorresistencia inducida por la ingesta de carbohidratos simples = Cellular mechanisms involved in the regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in a animal model of sucrose-induced insulin resistance
Autor :	Mercau, María Elisa
Director :	Cymeryng, Cora B.
Consejero de estudios :	Pecci, Adalí
Jurados :	Silberstein, Susana I. ; Perone, Marcelo J. ; Giovambattista, Andrés
Año :	2016-02-22
Editor :	Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación :	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Bioquímica Humana. Laboratorio de Endocrinología Molecular Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO)
Grado obtenido :	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación :	Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5865_Mercau
Idioma :	Español
Area Temática :	Química / Química Biológica Biología / Endocrinología
Palabras claves :	INSULINORRESISTENCIA; EJE HIPOTALAMO-HIPOFISO-ADRENAL; ACTH (ADRENOCORTICOTROFINA); POMC (PROOPIOMELANOCORTINA); CORTICOSTERONA; ESTRES OXIDATIVO; MACROFAGOS; ESTRES DE RETICULO ENDOPLASMATICO; AUTOFAGIA; CELULAS ATT-20; ACIDO PALMITICO; TRATAMIENTOS ANTIOXIDANTES; MELATONINA; ACIDO ALFA-LIPOICO; EJERCICIO MODERADO; INSULIN RESISTANCE; HYPOTHALAMIC-PITUITARY-ADRENAL AXIS; ACTH (CORTICOTROPIN HORMONE); POMC (PROOPIOMELANOCORTIN); CORTICOSTERONE; OXIDATIVE STRESS; MACROPHAGES; ER STRESS; AUTOPHAGY; ATT-20 CELLS; PALMITIC ACID; ANTIOXIDANT TREATMENT; MELATONIN; ALFA LIPOIC ACID; MODERATE EXERCISE
URL al Documento :	http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_5865_Mercau.pdf
URL al Registro :	http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5865_Mercau

Sahores, Ana. "Rol de la vía FGF2/FGFR en la resistencia a la terapia hormonal en cáncer de mama" (2016-03-17) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El 75% de los carcinomas mamarios expresan receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP) y son susceptibles a una terapia endocrina. Sin embargo, con el tiempo, algunos pacientes desarrollan resistencia (resistencia hormonal adquirida) y otros no responden al tratamiento desde el comienzo (resistencia constitutiva). En nuestro laboratorio, utilizando modelos de carcinomas mamarios murinos y humanos, hemos demostrado que los tumores respondedores a la terapia con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) tienen mayor expresión de la isoforma A del RP (RPA) que de la isoforma B (RPB). A su vez, los tumores con resistencia constitutiva o adquirida, se caracterizan por manifestar la relación inversa (RPB>RPA). Se han propuesto diversas hipótesis para explicar los mecanismos que conducen a la resistencia endócrina, entre ellas, la activación constitutiva de vías de transducción de señales. La vía que involucra al FGF2 y sus receptores está constituida por cuatro receptores (FGFR1-4) y cinco isoformas de FGF2 con distinto peso molecular: la isoforma de 18 kDa o LMW-FGF2 y las de alto peso o HMW-FGF2 de 22; 22,5; 24 y 34 kDa. En trabajos previos demostramos que, en muestras de carcinomas mamarios humanos, existe una asociación significativa entre la expresión de FGFR2 y REα; también observamos una correlación positiva entre la expresión de FGFR1 y un alto grado histológico. Demostramos también que, en tumores sensibles a la terapia endocrina, el FGFR2 activado por el FGF2 estromal participa en el crecimiento tumoral a través de la activación de los RP. Si bien se ha demostrado que la vía del FGF2/FGFR se encuentra desregulada en numerosas neoplasias y patologías del desarrollo, en muestras de pacientes con cáncer de mama aún es controvertida la asociación entre la expresión de FGF2 y el pronóstico de la enfermedad. En base a estos antecedentes, nuestra hipótesis de trabajo es que durante la adquisición de la resistencia endocrina se produce un cambio en la expresión y señalización de FGF2 que favorece el crecimiento y la progresión tumoral. Nuestro objetivo general fue evaluar el rol de la vía FGF2/FGFR en el crecimiento y la progresión del cáncer de mama. En primer lugar, utilizamos el modelo murino de carcinomas mamarios generados en nuestro laboratorio. Observamos, tanto por inmunohistoquímica como por Western blot, que las variantes resistentes de tres familias tumorales diferentes (C4, 59 y C7) expresan mayores niveles de FGFR1 y FGF2 que los tumores sensibles. Por inmunohistoquímica, observamos que el FGF2 se localiza predominantemente en el epitelio o en el estroma tumoral de las variantes resistentes y sensibles, respectivamente. Es interesante observar que, el análisis de la expresión de las distintas isoformas de FGF2 reveló que las variantes resistentes expresan mayores niveles de las isoformas HMW-FGF2 que las variantes sensibles. Asimismo, mediante ensayos de ELISA mostramos que, en los tumores resistentes adquiridos y constitutivos, la localización es mayormente intracelular y extracelular, respectivamente. Luego, evaluamos la funcionalidad de la vía de FGF2/FGFR en cultivos primarios de células epiteliales de las tres familias tumorales. Observamos que el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular de tumores sensibles y resistentes constitutivos, pero no afecta la proliferación celular de los tumores resistentes adquiridos de la familia C4. Por otra parte, el tratamiento con dos inhibidores distintos de FGFR, PD 173074 y BGJ398, inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres familias tumorales, lo que indica un rol proliferativo de esta vía. Sin embargo, al realizar ensayos in vivo con el inhibidor BGJ398, éste sólo reduce parcialmente el crecimiento tumoral de las variantes C4-HI (sensible) y C7-HI (resistente constitutiva). El inhibidor no tuvo efectos significativos sobre el crecimiento tumoral de las variantes resistentes de la familia C4, aunque indujo signos de regresión tumoral temprana en todas las variantes tumorales ensayadas (C4-HI, C4-2-HI, C4-HIR, 59-HI, C7-HI). Las diferencias en el alcance de los efectos observados en cultivo e in vivo sugieren que deben desarrollarse inhibidores con mayor eficacia in vivo. En conjunto, los resultados obtenidos con el modelo murino muestran una correlación positiva entre la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 con la resistencia hormonal y sugieren que, en la progresión tumoral, habría un aumento en la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 en el epitelio tumoral. Este aumento conduce a un cambio de una señalización paracrina en las variantes sensibles, a una autocrina o intracrina en los tumores resistentes constitutivos o adquiridos, respectivamente. A continuación, validamos los resultados en un modelo de cáncer de mama humano, para lo cual utilizamos la línea celular T47D-WT y sus variantes: la línea T47D-YA, con alta expresión de RPA y sensible a MFP, y la línea T47D-YB, con alta expresión de RPB y resistente a MFP. Por inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y Western blot, observamos que la línea T47D-YB expresa mayores niveles de FGFR1, FGFR2 y HMW-FGF2 respecto de la línea T47DYA. Por otro lado, el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular en las líneas T47D-WT e -YA pero no altera su proliferación en las células T47D-YB. La línea resistente presenta mayor actividad basal de la vía de FGF2/FGFR, ejemplificada en la fosforilación de FRS2 y activación predominantemente de la vía de AKT, en comparación con la línea sensible. El LMW-FGF2 modularía principalmente la activación de las vías mencionadas en las líneas T47D-WT e -YA, lo que sugiere una activación constitutiva en la línea resistente. El BGJ398 inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres líneas celulares, indicando que la vía de FGF2/FGFR cumple un rol proliferativo. Finalmente, generamos variantes de la línea T47D-YA que sobreexpresan las isoformas de 18 y 22,5 kDa de FGF2 y evaluamos su efecto sobre la sensibilidad a MFP, TLP y TAM. En ensayos de recuento celular observamos que la sobreexpresión de las isoformas de 18 y 22,5 kDa promovió un aumento en la tasa de proliferación celular y resistencia al tratamiento endocrino en comparación con la línea T47D-YA infectada con el plásmido vacío (T47D-YA-Vac). La resistencia a MFP se mantuvo aún en ensayos in vivo y se observaron signos de malignidad en los tumores primarios, particularmente en la línea T47D-YA-22,5. Esto se evidenció en la capacidad para invadir tejidos adyacentes al tumor, como piel, músculo y tejido adiposo. Si bien algunos de los animales portadores de tumores T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa focos metastásicos en los pulmones, 100% de los ratones con T47D-YA-22,5 presentaron metástasis pulmonares y un mayor número de focos con respecto a T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa. Nuestras observaciones indican que el FGF2 promueve el crecimiento tumoral en ambas variantes, sensibles y resistentes. Sin embargo, los resultados sugieren que, en los tumores sensibles, el estroma proveería el FGF2 que induciría el crecimiento tumoral a través de sus receptores de membrana y el RP de forma paracrina. Por otro lado, en los tumores resistentes, el propio parénquima tumoral expresaría elevados niveles de FGF2 (particularmente LMW-FGF2) y que, a través de un loop autocrino que involucra al FGFR1, gatillaría señales de proliferación, independientemente de la presencia de progestágenos o antiprogestágenos. No descartamos que exista también un loop intracrino, donde el FGF2 intracelular, particularmente las HMW-FGF2, serían responsables de la proliferación celular, resistencia a endocrina y diseminación metastásica. Nuestros estudios contribuyen a esclarecer el rol de las isoformas de FGF2 en la progresión tumoral mamaria y representan la primera evidencia de resistencia hormonal vinculada a HMW-FGF2.

Abstract:
Two-thirds of breast cancers express estrogen and progesterone receptors (ER and PR, respectively) and are standard targets for endocrine therapy. Most tumors initially respond to endocrine therapy, but many will eventually develop resistance (acquired hormone resistance) while others will fail to respond from the beginning (constitutive hormonal resistance) despite expressing hormone receptors. In our lab, using murine and human mammary carcinomas, we have demonstrated that tumors which respond to antiprogestin therapy (mifepristone; MFP) express higher levels of the isoform A of PR (PRA) than the isoform B (PRB), whereas tumors with constitutive or acquired hormonal resistance have the inverse ratio (PRB>PRA). Many hypothesis have been proposed to explain the mechanisms that lead to endocrine resistance, among them, the constitutive activation of proliferative pathways. In humans, the FGF2/FGFR pathway is formed by four receptors (FGFR1-4) and five FGF2 isoforms with different molecular weight: low molecular weight isoform or LMW-FGF2 of 18 kDa and high molecular weight isoform or HMW-FGF2 of 22; 22,5; 24 and 34 kDa. In previous experiments and using human breast cancer samples, we found a significant association between the expression of FGFR2 and ERα, and reported a positive correlation between the expression of FGFR1 and a higher histological grade. We also demonstrated that stromal FGF2 activates FGFR2 and PR pathways, inducing tumor growth in hormone responsive carcinomas. It has been proved that the FGF2/FGFR pathway is dysregulated in numerous neoplasias and developmental pathologies. However, its association with breast cancer progression is still controversial. Taking into account these findings, our working hypothesis is that during tumor progression there is a switch in FGF2 expression and signaling that favors tumor growth and progression. Our main goal, therefore, was to study the role of the FGF2/FGFR pathway in breast tumor growth and progression. We used a murine model of mammary carcinomas developed in our laboratory. By immunohistochemistry and Western blot assays, we observed that all the resistant variants of three different tumor families (C4, 59 y C7) express higher FGFR1 and FGF2 levels than the responsive variants. By immunohistochemistry assays we observed that FGF2 labeling was predominantly localized in the epithelium and in the tumor stroma of the resistant and responsive variants, respectively. Analysis of the expression of the different FGF2 isoforms revealed that the resistant variants express higher levels of total FGF2, especially HMW-FGF2, compared to the responsive variants. We confirmed these findings using an ELISA assay and observed that acquired and constitutive resistant tumors differ in their FGF2 localization; whereas the former predominantly accumulate it within the cell, the latter also secrete it to the conditioned media. Next, we studied the activity of the FGF2/FGFR pathway in primary cultures of epithelial cells from three tumor families (C4, 59, and C7). Treatment with LMW-FGF2 induced cell proliferation in responsive and constitutive resistant tumors, though failed to affect cell proliferation of acquired resistant tumors of the C4 family. Furthermore, treatment with two different FGFR inhibitors, PD 173074 and BGJ398, significantly inhibited basal and FGF2- induced cell proliferation in the three tumor families, indicating a proliferative role of FGF2/FGFR pathway. In in vivo experiments, BGJ398 only inhibited tumor growth of C4-HI (responsive) and C7-HI (constitutive resistant) tumors. However, blocking the pathway induced early signs of regression in all evaluated variants (C4-HI, C4-2-HI, C4-HIR, 59-HI, and C7-HI). The observed differences in the in vitro and in vivo assays suggest that more efficient inhibitors should be developed. Altogether, these findings show a positive correlation between HMW-FGF2, FGFR1 expression, and hormone resistance. Moreover, during tumor progression there would be an increase in HMW-FGF2 and FGFR1 expression in the tumor epithelium, leading to a switch from a paracrine signaling in the responsive variants to an autocrine or intracrine loop in constitutive and acquired resistant tumors, respectively. Later, we validated the results in a human breast cancer model using the T47D-WT cell line and its variants: T47D-YA with high expression of PRA and responsive to MFP, and T47D-YB with high expression of PRB and resistant to MFP. By immunofluorescence, immunohistochemistry and Western blot, we observed that T47D-YB cells express higher levels of FGFR1, FGFR2, and HMW-FGF2 compared to the T47D-YA cells. By contrast, treatment with LMW-FGF2 induces cell proliferation only in T47D-WT and -YA cells and does not affect cell proliferation in the -YB line. The resistant variant presents higher basal activation of the FGF2/FGFR pathway, evidenced by phosphorylation of FRS2 and activation of the AKT pathway, compared to the responsive cell line. Consistent with the results obtained in the murine model, LMW-FGF2 regulates the activation of the mentioned pathways only in T47D-WT and -YA cells, suggesting a constitutive activation in the resistant cell line. Treatment with BGJ398 significantly inhibits basal and FGF2-induced cell proliferation in the three cell lines, indicating that the FGF2/FGFR pathway has a proliferative role in these cell lines. Finally, we generated T47D-YA cell line variants over-expressing the 18 and 22,5 kDa FGF2 isoforms, and studied their effect over MFP, TLP, and TAM sensibility. The over-expression of both isoforms increased cell proliferation and conferred resistance to endocrine therapy compared to the T47D-YA cell line infected with the control plasmid (T47D-YA-Vac). The MFP resistance was confirmed in in vivo assays and interestingly, we even observed malignant signs in the primary tumors, particularly in the YA-22,5 kDa cell line. These tumors were able to invade adjacent tissue, such as skin, muscle, and adipose tissue. Only some animals bearing -YA-Vac and -YA-18 kDa primary tumors registered lung metastasis, while 100% of the mice bearing -YA 22,5 kDa tumors presented lung metastasis and had more foci compared to YA-Vac and -YA-18 kDa. Our results suggest that FGF2 promotes tumor growth in both responsive and resistant tumor variants. However, we believe the underlying mechanisms are not the same, given that in responsive variants the stroma is the main producer of FGF2, which induces tumor growth through its membrane receptors and PR forming a paracrine loop. In resistant tumors, the parenchyma expresses high levels of FGF2 (mostly LMW-FGF2) that triggers proliferative and survival signals through an autocrine loop involving membrane FGFR1, regardless of the presence of progestins or antiprogestins. We still cannot rule out the existence of an intracrine loop, where the intracellular FGF2 (mostly HMW-FGF2) would be responsible for cell proliferation, resistance to antiprogestins, and metastatic dissemination. Altogether, these findings help to clarify the role of the FGF2 isoforms in breast tumor progression and are the first evidence of endocrine resistance associated to HMW-FGF2.

Delgadin, Tomás Horacio. "Respuesta del eje hormona de crecimiento (GH)/factor de crecimiento tipo insulina-I (IGF-I) a alteraciones en la ingesta en el pez cíclido Cichlasoma dimerus" (2016-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El eje hormona de crecimiento (GH)/ factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1) es clave en la regulación del crecimiento somático en los vertebrados. Existen dos tipos de receptores para GH (GHR1 y GHR2), aunque actualmente no hay consenso sobre su especificidad. Cichlasoma dimerus en un pez cíclido social capaz de crecer a una tasa elevada en condiciones de laboratorio, pero la regulación de su crecimiento aún no ha sido estudiada. Esta Tesis se propone evaluar el crecimiento somático y su relación con el eje GH/IGF-1 bajo condiciones de ayuno y realimentación. Para ello en una primera etapa se caracterizó a GHR2, ya que en esta especie no estaba descripto. Se obtuvo una secuencia parcial que incluye parte de la región extracelular, el dominio transmembrana y parte de la región intracelular. Cuatro semanas de ayuno resultaron en un arresto del crecimiento somático, un incremento de la expresión de GHR2 en hígado y músculo y una disminución de IGF-1 muscular, sin variaciones en GHR1 ni en IGF-2 en ambos tejidos. Tres semanas de realimentación restituyeron completamente el estado nutricional y condujeron a un estado de “crecimiento acelerado” asociado a un incremento en la eficiencia de conversión alimentaria (FCE) sin observarse hiperfagia. Además, se restablecieron los niveles de expresión de GHR2 e IGF-1 a valores controles. Interesantemente la expresión de GH se incrementó a los 3 días de realimentación. Estos resultados muestran que no sólo hay una recuperación rápida del estado nutricional debido a la realimentación tras el ayuno prolongado, sino que se verifica una fase de crecimiento compensatorio asociado a cambios en el eje GH/IGF-1. Esto resultados nos permiten tener un conocimiento a nivel molecular de los cambios asociados al ayuno-realimentación que puede tener implicancias al momento de diseñar estrategias de crecimiento en acuicultura.

Abstract:
Growth hormone (GH)/insulin-like growth factor 1 (IGF-1) axis is the key regulator of somatic growth in vertebrates. Two types of growth hormone receptors have been described in teleost fish (GHR1 and GHR2) although its specificity is under debate. Cichlasoma dimerus is a social cichlid fish capable of growing at high rates under laboratory conditions, but knowledge on somatic growth regulation is still unclear. The aim of this study was to evaluate the somatic growth and changes in the GH/IGF-I axis after 4 weeks of food deprivation and refeeding in C. dimerus. As a first step, we obtained a partial sequence of GHR2, consisting of a fragment of the extracellular domain, the transmembrane domain and a region of the intracellular domain. Fasting impaired body growth and increased liver and muscle GHR2 expression along with a reduction in muscle IGF-1 mRNA levels. Additionally, no changes were observed in liver IGF-1, muscle and liver GHR1 and IGF-2 expression. Three weeks of refeeding completely restored nutritional status of fish and led to a fast growing period during the first week associated with higher feed conversion efficiency values but surprisingly, with no hyperphagia. In addition, expression of GHR2 and IGF-1 was recovered to control levels after three days of refeeding. Interestingly, GH mRNA levels were increased at day 3 of refeeding. These results not only show a complete recovery of nutritional status of fish with refeeding but also demonstrate a compensatory growth period associated with alterations on the GH/IGF-1 axis. Taken together, these results allow us to get knowledge on molecular aspects related to fasting-refeeding in fish that may have implications on feeding manipulation in aquaculture.

Ramallo, Martín Roberto. "Aromatasa cerebral (Cyp19a1b): caracterización y relación con el comportamiento agonístico y el período de cuidado parental en el pez cíclido Cichlasoma dimerus" (2016-12-02) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En todos los vertebrados, la enzima citocromo P450 aromatasa, es la responsable de la síntesis de estrógenos a partir de andrógenos. En ciertas áreas específicas del cerebro de los peces teleósteos la producción de estrógenos cerebrales es entre 100 y 1000 veces mayor comparada con las regiones homólogas del cerebro de otros grupos de vertebrados. La base de tales niveles radica en parte a la expresión de una variante de la enzima aromatasa, conocida como aromatasa cerebral, producto de uno de los dos genes parálogos que codifican para aromatasas (cerebral y gonadal) en teleósteos. Ya que la distribución neuroanatómica de las células productoras de aromatasa cerebral coincide parcialmente con áreas del cerebro involucradas en la regulación de comportamientos sociales, decidimos analizar el papel de la misma en la regulación del comportamiento agonístico y del cuidado maternal, en la chanchita Cichlasoma dimerus. Por medio de un protocolo de inmunohitoquímica se detectó la presencia de esta enzima en el cerebro anterior de la chanchita, en áreas involucradas en la regulación de comportamientos sociales. Luego, se caracterizaron la fisiología y el comportamiento de machos de chanchita de distinto estatus social (dominante vs. subordinado), y su relación con la expresión de aromatasa cerebral en el cerebro y la hipófisis. Los machos dominantes presentaron niveles mayores de andrógenos circulantes, mientras que los machos subordinados se caracterizaron por poseer niveles más altos de 17β-estradiol, y una tasa espermatogénica relativamente menor. Si bien no se observó un efecto del estatus social sobre la expresión de la enzima, los niveles de expresión de la misma en hipófisis correlacionaron con la frecuencia de comportamientos agonísticos, sugiriendo un papel novedoso de la hipófisis en la regulación del comportamiento social a través de la síntesis de estrógenos. En las hembras se analizaron los perfiles de expresión de ambas variantes de la enzima aromatasa (cerebral y gonadal) a lo largo del período de cuidado parental, y su relación con parámetros fisiológicos y reproductivos. El inicio del cuidado maternal resultó en una caída específica de la síntesis de esteroides sexuales y de la tasa de maduración ovárica, mientras que los niveles de expresión de ambas aromatasas resultaron independientes de la presencia de la progenie. Por lo tanto, el estatus social en los machos y el cuidado parental en las hembras, repercuten fuertemente sobre los niveles de esteroides sexuales y el estado de las gónadas, o viceversa, sin que resulte afectada la expresión de aromatasa en cerebro anterior e hipófisis.

Abstract:
In all vertebrates, the enzyme aromatase cytochrome P450, is responsible for estrogen synthesis by aromatization of androgens. Estrogen synthesis within particular brain regions of the teleost brain is between 100 and 1000 times higher than that observed in the homologues brain areas of other vertebrates. The basis of such high levels lies in part due to the expression of a variant of the enzyme aromatase, known as brain aromatase, which is the product of one of two paralogous genes encoding aromatase enzymes (brain and gonadal aromatase) in teleosts. The neuroanatomical distribution of brain aromatase overlaps with brain areas involved in the regulation of social behavior. Thus, the objective of this thesis was to analyze the role of brain aromatase in the regulation of agonistic behavior and maternal care in Cichlasoma dimerus, locally known as chanchita. Through an immunohistochemical study, the presence of the enzyme was detected in forebrain regions, in areas involved in the regulation of social behaviors. Then, the physiology and behavior of male chanchitas of different social status (dominant vs. subordinate) were characterized, and their relationship with the expression of brain aromatase in the brain and pituitary was assessed. Dominant males had higher circulating androgen levels, while subordinate males were characterized by a higher 17β-estradiol plasma concentration, and a relatively lower spermatogenic rate. While the social status ha no effect on the expression of forebrain and pituitary brain aromatase, the expression levels at pituitary correlated with the frequency of agonistic behaviors, suggesting a novel role of the pituitary gland in the regulation of social behavior through estrogen synthesis. In female chanchitas, the expression profiles of both aromatase gene variants (brain and gonadal) were examined throughout the parental care period, and their relation to physiological and reproductive parameters were analyzed. The onset of maternal care resulted in a specific downregulation in sex steroid synthesis and ovarian maturation rate, while levels of expression of both aromatases were independent of the presence of the progeny. Therefore, the social status in males and parental care in females of the cichlid chanchita, have a strong effect on sex steroids levels and gonadal state, or vice versa, though aromatase expression in whole forebrain and pituitary samples was unaffected.

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