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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Bioquímica [ 72 tesis ]

Ríos de Molina, María del Carmen. "Porfiria experimental por hexaclorobenceno : estudios sobre porfirinógeno carboxilasa y ferroquelatasa" (1982) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Torruella, Mónica. "Anticuerpos monoclonales contra adenilato ciclasa de eucariotes inferiores" (1984) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Zeni, Susana Noemí. "Necesidades de calcio : Estudio experimental en relación al estado nutricional y a la velocidad de crecimiento" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Orti, Eduardo. "Mecanismo de acción molecular de los corticoides en la médula espinal" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Kerner, Néstor Alberto. "Mecanismo de regulación de la fosfodiesterasa de AMP cíclico del hongo dimórfico Mucor rouxii por fosforilación y proteólisis : Variaciones de las formas enzimáticas durante el crecimiento filamentoso" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Chaud, Marcela Alicia. "Acción de las prostaglandinas endógenas y exógenas en la motilidad espontánea y respuesta adrenérgica del útero aislado de rata" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Rossi, Silvia Graciela. "Quinasa de proteínas dependiente de cAMP durante la germinación del hongo dimórfico Mucor rouxii" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Carrizo, Patricia H.. "Metabolismo hepático del nifurtimox, un nitrofurano antichagásico" (1995) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Bocanera, Laura Viviana. "Rol de la Guanilil Ciclasa y el GMPc en el metabolismo de la tiroides" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El presente trabajo de tesis tienen como objetivo estudiar el rol en la glándula tiroides de la enzima guanilato ciclasa (GC) y el producto de la reacción catalizada por esta: el GMPc. En la primera sección se detalla la caracterización parcial de la enzima en tiroides bovinas. Los resultados obtenidos, demuestran la presencia de dos tipos de GC: una soluble y una particulada, predominando la actividad soluble (79%) sobre la actividad asociada a membrana (8%). El tratamiento con Tritón X-100 incrementa la actividad de ambas enzimas (350% GC particulada, 70% GC soluble). Con el objeto de descartar cualquier posible contaminación de la fracción soluble con la fracción particulada y viceversa, se determinó las actividades de las enzimas en ambos preparados, previamente tratados con activadores específicos para cada una de ellas: Pépitido natriurético atrial (ANP) para la GC particulada y nitroprusiato de sodio (NP) para la GC soluble. El ANP incrementó la actividad en la fracción de membrana y el NP activó la GC de la fracción soluble, sin observarse ningún efecto del ANP y NP sobre la enzima soluble y particulada respectivamente, descartando una contaminación de las fracciones entre si. Para estudiar el grado de interacción entre la enzima particulada y la membrana, se sometió al precipitado de la centrifugación de 105.000 x g a tratamientos con NaCl 0.5 mM, deoxicolato 1%, o Lubrol PX 1%, obteniéndose mayor actividad en las muestras tratadas con Lubrol PX indicando que la proteína se encuentra fuertemente asociada a la membrana. Cuando se estudió el comportamiento cinético considerando el complejo MnGTP como sustrato, la cinética fue michaelina para la GC soluble con un Km de 0.036 mM, mientras que la enzima particulada mostró un comportamiento alostérico positivo con un S0.5 de 0.230 mM y un coeficiente de Hill de 1.9, indicando que existen en la enzima, por lo menos dos sitios de unión para el sustrato. Con el objeto de estudiar el efecto de diferentes concentraciones de manganeso, se determinó la actividad enzimática trabajando en condiciones de exceso de Mn2+ respecto de la concentración de GTP. Los resultados obtenidos en esta serie de experimentos, muestra un comportamiento alostérico positivo para la enzima soluble con un S0.5 de 1.2 mM y un coeficiente de Hill de 2.9. La cinética para la enzima particulada ensayada en las misma condiciones, resultó michaeliana con un Km de 0.280 mM. Si bien la actividad enzimática es altamente dependiente de manganeso, resultó de interés investigar el efecto sobre la enzima de otros cationes divalentes: Mg2+ y Ca2+. Reemplazando el Mn2+ por Mg2+ en el medio de reacción, no se observó actividad de la enzima asociada a la fracción particulada, obteniéndose con la enzima particulada, sólo un 15% de la actividad determinada en presencia de manganeso. El calcio en ausencia o presencia de concentraciones óptimas de manganeso, no tuvo efecto sobre la actividad de ninguno de los dos tipos de GC. Con concentraciones subóptimas de Mn2+, se observó un aumento de la actividad en la GC soluble a altas concentraciones de calcio. Este este estímulo sólo representa aproximadamente el 20% de los valores obtenidos con concentraciones de manganeso óptimas. Con la GC particulada en las mismas condiciones experimentales se observó una ligera pero significativa inhibición a concentraciones altas de Ca2+. La segunda parte de este trabajo está dedicada a determinar el posible rol biológico asociado a la GC soluble en la glándula tiroides. Para este fin se utilizó como modelo experimental cultivos primarios de tiroides bovinas. La primera serie de experimentos tuvo como objetivo verificar que en el modelo experimental utilizado, la GC soluble es activable por el nitroprusiato de sodio (NP). Los resultados obtenidos indican que el NP produce un incremento en la actividad enzimática que es dependiente de la y del tiempo de tratamiento, incrementando correlativamente los niveles de GMPc. Dado que el transporte de ioduro, constituye el paso inicial y limitante en la síntesis de las hormonas tiroideas, se estudió el efecto del NP sobre la incorporación del halógeno. Se observó una inhibición significativa de la capitación de yoduro a las 2 hs de tratamiento con 5 mM de NP en células previamente tratadas con TSH por 72 hs, sin variaciones sobre los basales (células sin TSH). Este efecto fue reproducido por un análogo del GMPc (8Br-GMPc), y bloqueado por hemoglobina reducida, sugiriendo que este se encuentre mediado por la vía GC-GMPc. La inhibición producida por el NP fue también observada cuando las células son tratadas con activadores del sistema adenilil ciclasa-AMPc tales como forskolina y análogos del AMPc, indicando que el compuesto nitrogenado podría estar inhibiendo un efecto de la TSH desencadenado a través de este sistema de transducción de señales. Sin embargo, el punto de acción sería distal a la formación de AMPc, dado que los niveles del nucleótido no se encuentra disminuidos. Dado que la incorporación de iodo a la célula tiroidea se encuentra determinada por un equilibrio entre la entrada y la salida o eflujo, se consideró de ínterés evaluar que mecanismo se encontraba afectado por el NP. En una primera instancia se estudió el efecto del compuesto nitrogenado sobre la salida o eflujo de iodo, no observándose diferencias significativas en las células tratadas con NP respecto al control. Teniendo en cuenta que la incorporación de yoduro en la célula tiroidea se encuentra inequivocamente ligada a la actividad de la ATPasa Na+/K+ estimulable, se investigó la acción del NP sobre esta enzima. Los resultados obtenidos indicaron una marcada inhibición en la actividad de la enzima en células previamente tratadas con TSH por 72 hs sin efectos significativos sobre los cultivos en condiciones basales. Este efecto es reproducido por 8Br-GMPc confirmando que la inhibición se encuentra mediada por el sistema GC-GMPc.

Abstract:
The present Doctoral Thesis work had as an aim to study the role of guanylil cyclase (GC) and its product, cyclic GMP (cGMP), in the regulation of thyroid function. In the first section the partial characterization of the enzyme in calf thyroid is presented. The results obtained showed the presence of two types of GC: one is soluble and comprises around 79% of total activity, while the remaining is particulate. Treatment with Triton X-100 increases both activities (350% increase for the particulate, 70% for the soluble enzyme). In order to rule out the possibility of a contamination of the soluble fraction with the particulate, and vice-versa, the activity of each of the enzymes was determined after stimulation with specific activators for each one. The atrial natriuretic peptide (ANP) for the particulate GC and sodium nitroprusside (NP) for the soluble enzyme. Both compounds increased their respective effectors and no cross stimulation was observed. In order to analyze the interaction between the particulate enzyme and the membranes the pellet obtained after centrifugation at 105,000 x g was treatedwith either 0.5 mM NaCl, 1% sodium deoxycholate or 1% Lubrol PX 1%. The highest activity was obtained after treatment with Lubrol, suggesting that the enzyme is strongly associated to the membrane. When the kinetics of the enzyme was analyzed, taking the complex MnGTP as a substrate, the results showed a Michaelis type kinetics for the soluble GC, with a Km of 0.036 mM, whereas the particulate GC showed a positive allosteric behaviour with a S0.5 of 0.230 mM and a Hill coefficient of 1.9, indicating that the enzyme has at least two binding sites for the substrate. When the influence of different Mn2+ concentrations was studied, under excess with respect to GTP, apositive allosteric behaviour for the soluble GC was found, with an S0.5 of 1.2 mM and a Hill coefficient of 2.9 The kinetic of the particulate enzyme under similar conditions was of Michaelis type, with a Km of 0.280 mM. Although the enzyme is highly dependent of Mn2+, it was of interest to investigate the possible effects of other divalent cations, such as Ca2+ and Mg2+. The replacement of Mn2+ for Mg2+ caused a complete disappearance of the particulate enzyme, while the soluble activity decreased by 85%. Addition of Ca2+ had no effect on either GC. However, with suboptimum concentrations of Mn2+, high Ca2+ concentrations caused an increase in soluble activity, but it comprised only 20% of maximum activity with optimal Mn concentrations. With the particulate enzyme a slight but significant inhibition was observed. The second part of this study examines the role of GC and cGMP in thyroid regulation. Primary cultures of calf thyroid cells were used as a model. In the first studies the stimulation of soluble GC by NP was confirmed. This increase is time and concentration- dependent, with a correlative increase in cGMP concentrations. Iodide uptake is the limiting step in thyroid hormone biosynthesis and a typical functional parameter. Therefore it was determined as an index of thyroid function. In cells treated with TSH for 72 h, addition of 5 mM NP for the last 2 h caused a significant inhibition of iodide uptake, without change in cells not treated with TSH. This action was mimicked by an analogue of cGMP, 8Br-cGMP, and blocked by reduced haemoglobin, thus suggesting that it is mediated by GC-cGMP pathway. NP also inhibited the stimulation caused by forskolin or analogues of cAMP, indicating that the effect takes place at this pathway, which would be distal to cAMP generation, since cAMP are not decreased by NP. The accumulation of radioiodine by thyroid cells is the consequence of the balance between uptake and efflux. In order to rule out an effect on this last parameter a series of studies were conducted. The results failed to demonstrate that NP affects iodide efflux, therefore concluding that it inhibits uptake. Since iodide transport across the membrane depends of the energy supplied by the Na+/K+ ATPase the possible effect of NP on the enzyme was analyzed. The results showed a significant inhibition of the ATPase by NP in cells treated for 72 h with TSH. This action was reproduced by 8Br-cGMP, thus confirming the role of GC and cGMP in this process.

Roccatagliata, Alejandro Jorge. "Aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios polares presentes en equinodermos" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
A partir del extracto polar de la estrella Cosmasterias lurida (Philippi, 1858) se aislaron y caracterizaron dos glicósidos esteroidales (Luridósidos A y B) y cuatro asterosaponinas (Cosmasterósidos A, B, C, y D), todos ellos de estructura novedosa. Se aislaron también el Pycnopodiósido C, Ophidianósido F y Forbésido H reportados con anterioridad en Pycnopodia helianthoides, Ophidiaster ophidianus y Asterias forbesi, respectivamente. El Cosmasterósido A contiene la misma cadena de oligosacárido que el Ophidianósido F con la aglicona (20S)-5α-colesta-9(11),24-dieno-3β,6α,20-triol3β-sulfato. Los Cosmasterósidos B, C y D contienen Thomasterol A como aglicona y difieren en el número e identidad de los monosacáridos de la cadena de azúcares. El Cosmasterósido B contiene una cadena de oligosacáridos novedosa que difiere de la del Ophidianósido F en el reemplazo de la unidad de quinovosa unida a C-6 de la aglicona por glucosa. Los tetrasacáridos Cosmasterósidos C y D están relacionados con el Cosmasterósido B y el Ophidianósido F respectivamente por la pérdida de la fucosa terminal. Del asteroideo Luidia ludwigi scotti Bell (1917) se aislaron dos asterosaponinas, los Acanthaglicósidos B y C aislados previamente de la estrella Acanthaster planci y tres esteroides polihidroxilados. Dos de ellos, 5α-colesta-3β,5,6β,15α, 16β,26-hexaol y Sα-colesta- 3β,5,6β,15α,26-pentol 15-sulfato, fueron previamente aislados de las estrellas Myxoderma platyacanthum y Luidia maculata respectivamente y 5α-colesta-3β,5,6β,15α,26-pentol 26-sulfato resultó novedoso. La presencia de una función hidroxilo en C-26 es común en esteroides polihidroxilados aislados de estrellas. Sin embargo, un grupo sulfato en esa posición es muy poco usual. Los cuatro esteroides polares aislados de Ophioplocus januarii (Lütken 1856) presentan grupos sulfato en C-3α y C-21,los anillos A/B fusionados en cis, y grupos hidroxilos en los carbonos C-4α y C-11β. El esteroide 24-norcolest-(22E)-5β-22-en-3α,4α,11β, 21-tetraol 3,21-disulfato resultó novedoso. Los otros tres esteroides fueron aislados previamente de los ofiuros Ophiocoma dentata, Ophiarthrum elegans y Ophiarachna incrassata. Se estudió la actividad antiviral de los compuestos aislados de Ophioplocus januarii contra cuatro virus patógenos en humanos: virus del Herpes simplex tipo 1 (HSV-1), virus Junin (JV), virus sincitial respiratorio (RSV) y virus del polio (PV). A partir del ofiuro antártico Ophionotus victoriae (Bell, 1902) se aislaron cuatro esteroides sulfatados, resultando dos de ellos novedosos. El estudio del ofiuro Ophiocoma echinata (Lamarck, 1816) permitió aislar dos esteroides polihidroxilados sulfatados 5β-colest-3α,4α,11β,12β,21-pentol-3,21-disulfato y 5β-colest- 3α,4α,11β,21-tetraol-3,21disulfato aislados previamente de Ophioderma longicaudum y Ophiocoma dentata respectivamente y un alqueno sulfatado de estrudura novedosa. El extrado polar del ofiuro antártico Astrotoma agassizii (Lyman, 1875) permitió aislar 5 esteroides polihidroxilados sulfatados. La presencia del grupo sulfato en C-2 es una característica poco común en los esteroides polares aislados de ofiuros. Además, los compuestos novedosos presentan un grupo isoprenilo en la cadena lateral y constituyen los primeros ejemplos de esta cadena en ofiuros. Los dos compuestos conocidos fueron aislados previamente del ofiuro antártico Ophiosparte gigas.

Abstract:
The analysis of polar extracts of the starfish Cosmasterias lurida Philippi (1858) led us to report the structures of two novel polyhydroxylated xylosides sulfated at C-4' of the xylosyl moiety and four new asterosaponins, two pentaglycosides, Cosmasterosides A and B, and two tetraglycosides, Cosmasterosides C and D, together with two known saponins, the major pentaglycoside Ophidianoside F, previously isolated from Ophidaster ophidianus, Linckia laevigata and Thmmidia catalai and small amounts of the tryglycoside Forbeside H, reported before from Asterias foribesi. Cosmasteroside A contains the same oligosaccharide chain as Ophidianoside F and the (20S)-5α-cholesta-9(11),24diene-3β,6α,20-triol 3β-sulfatedag lycone. Cosmasterosides B, C and D contain the known Thomasterol A aglycone and differ in the number and identity of the monosaccharide components of the carbohydrate chain. Cosmasteroside B contains a novel oliosaccharide chain which differs from the one of OphMianoside F in the replacement of the quinovose unit attached to the C-6 of the steroidal aglycone by glucose. The tetraglycosides Cosmasterosides C and D are structurally related to Ophidianoside F and Cosmasteroside B respectively, by the loss of the terminal fucose. The new steroid 5α-cholestane-3β,5,6β,15α,26pentol26-sulfate has been isolated from the starfish Luidia ludwigi scotti Bell (1917). This compound co-occurs with two known asterosaponins, Acanthaglycosides B and C, and two polyhydroxysteroids previously isolated from the startish Myxodrerma platyacanthum. One new and three known sulfated steroidal polyols have been isolated from the ophiuroid Ophioplocus januarii (Liitken, 1856).The four compounds possess 4α, 11 βdihydroxy-3α,21- disulfoxy substituents and the A/B cis ring junction but dlffer in the side-chain. The new compound has been characterized as (22E)-5β-24-norcholest-22-ene3α,4α,11β,21tetrol 3,21-disulfate. The four compounds were tested for their inhibitory effect on the replication of three RNA and one DNA vimses. All compounds showed no cytotoxic effects. We have also isolated from the antartic ophiuroid Ophionotus victoriae (Bell, 1902) a mixture of two new sulfated polyhydroxysteroids as well as two known compounds. From The tropical ophiuroid Ophiocome edllbrala (Lamarck, 1816) we isolated two polyhydroxilated sulfated steroids Sβ-colest-3α,4α,11β,12β,21-pentol 3,21-disulfate and Sβ-colest-3α,4α,11β,21-tetraol-3,21 disulfate, previously isolated from Ophbckma longicaudum and Ophiocoma dentata respectively, and a sulfated afltene. The ophiuroid Astrofoma egassizii (Lyman, 1875) contained three new steroidal sulfates accompanied by two known compounds, previously isolated from the ophiuroid Ophiosparte m s . The new compounds contain a terminal isopropmyl group in the side chain not previously reported in sulfated polyhydroxysteroids isolated from ophiwoids.

Pascuccelli, Verónica. "Caracterización molecular y bioquímica de una nueva proteína quinasa de Trypanosoma cruzi" (1997) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En los organismos eucariotas, la regulación de las complejas interacciones requeridas para la diferenciación y proliferación, está mediada en parte por los sistemas de fosforilación de proteínas. En Trypanosoma cruzi, se han podido caracterizar varias vías de transducción de señales a partir de la identificación y caracterización de sus distintos componentes como proteínas quinasas (PKA, PKC, Cam quinasa, CDK), adeninililciclasa (AC) y proteína G, entre otros. Dentro de la familia de las serina/treonina quinasas, recientemente ha sido identificada una nueva subfamilia de quinasas Llamadas RAC o PKB, cuya principal característica radica en la similitud de identidad que existe a nivel de su secuencia aminoacídica con PKA y PKC por igual. Estas proteínas han sido identificadas en células de mamíferos, Drosophila melanogaster, Caenorabhditis elegans, Dyctiostelium discoideum y Entamoeba histolytica pero no han sido aún detectadas en ningún tripanosomátido. Por lo tanto, nos hemos propuesto clonar el o los genes que codifican para esta nueva proteína quinasa en T. cruzi, para su posterior caracterización molecular y bioquímica y si es posible dilucidar su probable rol in vivo. Como resultado, hemos clonado el gen que codifica para una proteína quinasa RAC homóloga (PKTc), cuyo tamaño es de 1287 pb y codifica para una proteína de 428 aminoácidos. Esta proteína mostró tener entre un 60 y un 70% de homología con otras RAC quinasas. La PKTc recombinante es capaz de fosforilar a la histona IIAS, y de autofosforilarse, fosforilando específicamente residuos de treonina en ambos casos. Utiliza ATP como dador de fosfatos, requiere exclusivamente Mn²+ para su actividad, su valor de pH óptimo es entre 6-8 y su temperatura óptima es de 37°C. El Km aparente para el ATP resultó ser de 1.6 μM. La presencia de diferentes activadores (Ca²+/Cam) o inhibidores (PKI, H7, GF, staurosporina) no mostró tener un efecto significativo sobre su actividad. Experimentos de inmunolocalización utilizando anticuerpos contra la proteína recombinante, demostraron que la enzima se encuentra anclada en la membrana posiblemente, a través de ácido palmítico. Por otro lado, a través de experimentos de Western blot pudimos establecer que la PKTc está presente en los estadios de amastigote, epimastigote y tripomastigote metacíclico sin mostrar un patrón de expresión diferencial, que demuestra que esta proteína sería de carácter constitutivo. Experimentos de inmunoprecipitación nos permitirán en el futuro, identificar otras proteínas que interactúan con PKTc in vivo y dilucidar así la vía de transducción de señales en la que PKTc estaría involucrada.

Abstract:
In eucariotes, the regulation of the complex interactions required for differentiation and proliferation, is partially control by protein phosphorylation. The characteristics of several signal transduction pathways have been described in Trypanosoma cruzi from the dentification and characterization of several components such as protein tinases (PKA,PKC, Cam kinase, CDK), adenylyl cyclase (AC), protein G. Recently, a new subfamily of serine/threonine kinases have been identified, called RAC or PKB, which are closely related to PKC and PKA families at their aminoacidic sequences. This proteins have been identified in mammals cells, Drosophila melanogaster, Caenorabhditis elegans, Dyctiostelium discoideum and Entamoeba histolytica but they haven’t been detected yet in trypanosomatids. So, our objective was the cloning of the gene/s that codifies for these new protein kinase in T. cruzi, its later characterization at the molecular and biochemical level and if it’s possible, elucidate its function in vivo. As results, we cloned the gene that codifies for a protein kinase RAC homolog (named PKTc), with an open reading frame of 1287 pb that corresponds to a protein of 428 aminoacids long. This protein shares 60-70% homology with other RAC proteins. The recombinant PKTc can phosphorylate histone IIAS and itself, in both cases, exclusively in threonine residues. Uses ATP as phosphate donor, requires Mn²+ exclusively for its activity, the optime pH is neutral (6-8) and the optime temperature is 37°C. The apparent Km for the ATP is 1.6 μM. The presence of different activators (Ca²+/Cam) or inhibitors (GF, H7, staurosporine, PKI) did not affect the kinase activity significatly. Experiments of inmunolocalization using antibodies against the recombinant enzyme showed that PKTc is anchored to a membrane probably by a palmitic acid. Western blots experiments were done in order to investigate the differential expression of PKTc during the different stages of the life cycle of T. cruzi. The results demonstrated that this enzyme is present in the 3 stages (amastigote, epimastigote, metacyclic trypomastigote), without a differential expression pattern, so we supposed that it’s a constitutive protein. In the future, inmunoprecipitation experiments will allow us to identified other proteins that could interacted with PKTc in vivo and elucidate the signal transduction pathway in which this enzyme is involved.

Matkovic, Laura Beatriz. "Aspectos cinéticos metabólicos y estructurales en los últimos pasos de la biosíntesis de Aldosterona" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El presente trabajo tuvo como objetivo la elucidación de algunos aspectos (cinéticos, estructurales y metabólicos) relacionados con los últimos pasos de la biosíntesis de aldosterona (ALDO). La última etapa de la biosíntesís de ALDO involucra la oxidación mitocondrial de 11-desoxicorticosterona (DOC), a través de diferentes caminos siendo sus primeros metabolitos corticosterona (B) y 18-hidroxi-1 desoxicorticosterona (18-OHDOC). Todas estas reacciones son catalizadas por enzimas de la familia de los citocromos P-450. Una de estas enzimas es el citocromo CYP11B1 involucrado en la transformación de DOC a B y 18OHDOC. El otro citocromo involucrado, CYP11B2 es el responsable de la transformación de B a 18-hidroxicorticosterona (l8-OHB) y a ALDO. Mediante los resultados obtenidos al trabajar con cortisol como sustrato alternativo en este camino metabólico se pudo clasificar a las enzimas presentes corno sensibles a cortisol (SC) o insensible a cortisol (ISC), siendo esta clasificación compatible con la existencia de las dos enzimas clonadas CYP11B1 y CYP11B2. Cortisol inhibió competitivamente la transformación de B a ALDO y 18-OHDOC a ALDO. Por otro lado, se desarrollo un modelo matemático para el estudio de inhibidores suicidas. Se observó que 18-etinil-11-desoxicorticosterona (18-EtDOC) se comportaba como inhibidor suicida. Mediante la utilización del nuevo modelo propuesto se calcularon los diferentes valores de las constantes de inhibición para los diferentes pasos involucrados. Los valores obtenidos concuerdan nuevamente con la existencia de los dos citocromos CYP11B1 y CYP11B2. Por otro lado se logró caracterizar un intermediario dimérico del camino de 18OHB a ALDO, el cual resultó un buen sustrato para la biosintesis de aldosterona. Mediante los estudios realizados y utilizando como base de estudio animales tratados con litio, se observó que 1a secreción de ALDO por 1a vizcacha (Lagostomus maximus maximus) es más sensible a estos tratamientos que esta secreción por la rata, especie usualmente utilizada en estos tipos de estudio. Se puede concluir que dado que el litio produce efectos colaterales en estos animales, se debería estudiar en humanos si estos efectos se repiten en los tratamientos crónicos con este ión.

Abstract:
This work aims at clarifying certain kinetic, structural and metabolic aspects of the last steps of the biosynthesis of aldosterone (ALDO). These steps comprise the mitochondrial oxidation of 11-deoxycorticosterone (DOC) through different pathways, their first metabolites being corticosterone (B) and 18-hydroxy-11-deoxycorticosterone (18OHDOC). All these reactions are catalyzed by enzymes of the cytochrome P450 family. One of these enzymes is cytochrome CYP11B1 involved in the transformation of DOC to B and 18OHDOC, the other one being CYP11B2, catalyzing the transformation of B to l8-hydroxycorticosterone (18OHB)and ALDO. In view of the results obtained with cortisol as an alternative substrate, enzymes could be classified into those sensitive to cortisol (SC) or unsensitive to cortisol (USC), this categorization being compatible with the occurrence of two cloned enzymes CYP11B1 and CYP11B2. Cortisol inhibited competitiver the transformation ofB to ALDO and 18OHDOC to ALDO. We also developed a mathematical model for the study of suicide-inhibitors. Employing this new model, values were calculated for the inhibtion constants of the different steps involved. The obtained values again agree with those of the two cloned cytochromes CYP11B1 and CYP11B2. We also characterized a dimeric intermediate between 18OHB and ALDO, which showed to be a good substrate for aldosterone biosynthesis. In these studies and others with animals treated with lithium, we found that ALDO secretion by the “vizcacha” (Lagostomns maximus maximus) is more sensitive to these treatments than this secretion by the rat, the latter being the species usually employed in these studies. Since lithium produces collateral effects in these specimens, clinical investigations should be carried out on the effects of chronic treatments with lithium in human.

Gerez, Esther Noemí. "Cáncer hepatocelular y porfirinas : Regulación del camino del Hemo durante el estadío de iniciación de la Carcinogénesis química" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El principal objetivo de esta tesis ha sido el estudio de los cambios bioquímicos, histológicos y moleculares, que ocurren en las etapas tempranas de la hepatocarcinogénesis inducida químicamente. Se trabajó con ratones CF1 machos que recibieron p-dimetilaminoazobenzeno (DAB 0,5% p/p) en la dieta durante un período total de 184 días. En estos animales se estudió el sistema metabolizante de drogas, la regulación metabólica del hemo, y el equilibrio entre la formación de radicales libres y los sistemas de defensa antioxidante. Se observó que a partir de los 35 días el higado sufre cambios significativos tanto a nivel molecular como morfológicos. La administración del carcinógeno produjo un gran aumento en el contenido del P450 con la consecuente inducción de la síntesis y disminución de la degradación del hemo. A su vez, se comprobó una desregulación en esta vía metabólica, por la falta de respuesta a agentes porfirinogénicos. La disminución de las actividades de las enzimas de defensa antioxidante aumentó el grado de estrés oxidativo provocado por la metabolización del carcinógeno. Los antioxidantes ensayados previnieron parcialmente las alteraciones bioquímicas detectadas. El modelo experimental mostró dos patrones de comportamiento bioquímico diferentes según el tiempo de intoxicación. Esto nos llevó a proponer un probable mecanismo para la gestación del proceso hepatocarcinogénico que considera la existencia de un estado primario activante del hígado en su totalidad, referido como estadio de preiniciación, caracterizado por un patrón de alteraciones bioquímicas necesarias para la instauración del estadio de iniciación de la hepatocarcinogénesis.

Abstract:
The aim of this thesis has been to study the biochemical, histological and molecular aspects of the changes occurring during the onset of the chemically induced hepatocarcinogenesis. Male CF1 mice were fed with a diet supplemented with p- dimethylaminoazobenzene (DAB, 0.5% w/w) during a whole period of 184 days. Then, the drugs metabolizing enzyme system, the regulation of heme metabolic pathway, and the balance between free radicals production and the antioxidant defense system were investigated. Significant hepatic changes at the molecular and the morphological level were detected from day 35 of intoxication onwards. The carcinogen administration greatly increased P450 content with the consequent enhancement of heme synthesis and diminution of heme degradation. The lack of response to some porphyrinogenic agents showed the deregulation of this metabolic pathway in the animals exposed to the carcinogen. The decrease in the activities of the antioxidant defense enzymes further increased the oxidative stress provoked by the carcinogen metabolization. The antioxidants assayed partially prevented the observed biochemical alteration. This experimental model showed two different biochemical patterns during the course of the intoxication. This led us to propose the hypothesis about a probable mechanism for the onset of hepatocarcinogenesis that considers a primary activating liver state involving the whole organ, the so-called pre-initiation stage, resulting in a biochemical aberration which then leads to the actual initiation stage.

López, Claudia S.. "Caracterización físico-química de la membrana de Bacillus subtilis frente al estrés osmótico : relevancia de los fosfolípidos aniónicos en la osmorrespuesta" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La respuesta de las bacterias al estrés osmótico es actualmente de gran interés debido a los aspectos importantes de su aplicación. La mayoría de los estudios realizados en procariotas se han focalizado sobre la regulación genética y sobre aspectos fisiológicos de la adaptación a la alta osmolaridad. El comportamiento de las envolturas no ha sido prácticamente estudiado, sin embargo, existen diversas evidencias que sugieren que la composición de las envolturas celulares posee un rol importante durante el mecanismo de osmosensado. El objetivo de este trabajo fire el de estudiar el efecto del estrés osmótico sobre la estructura y composición bioquímica y biofisica de las membranas de Bacillus subtilis YB886 utilizando diferentes enfoques como la bioquímica, espectroscopía de fluorescencia y biología molecular. En esta tesis demostramos que se producen importantes variaciones en la composición de lípidos polares y de ácidos grasos (AG) durante la adaptación de B. subtilis. Entre los principales fosfolípidos presentes en la membrana de esta especie, se observó que cuando la bacteria es crecida en medios hipersalinos se produce una disminución en el contenido de fosfatidilglicerol de 40 a 31% y un aumento en el de cardiolipina de 24 a 46%. Además de las variaciones observadas a nivel del grupo polar de los lípidos, se determinó un cambio significativo en la composición de AG entre las diferentes condiciones de cultivo. Las células crecidas en el medio hipersalino presentan una marcada disminución en el contenido de AG saturados ramificados y un aumento en el de los saturados lineales. Asimismo, se observó un aumento en el contenido de los AG monoinsaturados, los cuales representan un 6% bajo condiciones normales de crecimiento y alcanzan un 18% en estrés osmótico. Con el objetivo de caracterizar la estructura y dinámica de la membrana, se utilizaron diferentes técnicas espectroscópicas. Se determinó que en respuesta al estrés osmótico se produce un aumento en el empaquetamiento de los lípidos de las membranas, hecho que fue evidenciado por medio de las tres sondas fluorescentes utilizadas. No obstante, esta variación no se observó en los liposomas preparados con los lípidos extraídos a partir de las células, indicando que el aumento en el empaquetamiento de los lípidos depende de la presencia de las proteínas de membrana. En este trabajo también se determinó que en las membranas de B. subtilis otras propiedades fisicas de la membrana, como la hidratación de la interfaz, cambia en fimción de la osmolaridad del medio exterior. Además, se construyeron diversas cepas mutantes para la biosíntesis de fosfolípidos. Los resultados obtenidos demostraron la importancia de los lípidos aniónicos (cardiolipina y fosfatidilglicerol específicamente) en la adaptación al estrés osmótico en esta especie. Nuestros resultados indican que la interrupción del gen cls2 provoca una deficiencia total en la síntesis de cardiolipina, sugieriendo que el producto del gen cls2 es la principal cardiolipina síntasa en esta especie. En esta tesis se demostró por primera vez los cambios biofisícos y bioquímicos que se producen en la membrana de B. subtilis en respuesta al estrés osmótico. Estos cambios serian indispensables para contrarrestar el desbalance osmótico presente entre las células y el medio externo.

Abstract:
Bacterial response to osmotic stress is of current and increasing interest due to the important aspects of its applications. Most of the studies on prokaryotes have centered on genetic regulation and physiological aspects of their adaptation to high osmolarity. The behavior of the envelopes has been practically unexplored; nevertheless, several evidences suggest that the cell envelope composition plays an important role during the osmosensing mechanism. The aim of the present work was to study the effect of osmotic stress on the biochemical and biophysical parameters of structure and composition of the Bacillus subtilis YB886 membrane using different approaches such as biochemistry, fluorescence spectroscopy and molecular biology. In this thesis we demonstrated that there are important variations in membrane polar lipid composition and fatty acids (FA) during osmoadaptation in B. subtilis. Among the major phospholipids present in the B. subtilis membrane, a decrease in phosphatidylglycerol content from 40 to 31%, and an increase in cardiolipin content from 24 to 46% were observed when the bacteria were grown in hypsaline medium. In addition to the variations observed at the polar group level, the FA composition, in particular, showed a significant change between different growth conditions. Bacterial growth in hypertonic medium resulted in a remarkable decrease in the branched-chain saturated FA content, and an increase in straight-chain saturated FA. There was also a significant increase of unsaturated FA, which represented 6% in normal conditions and reached 18% during osmotic stress. In order to characterize membrane structure and dynamics, different spectroscopic techniques were used. Bacteria growth in hyperosmotic media evoked an increase in the lipid packing in isolated whole membranes, fact that was evidenced by the three fluorescent probes used. However, this effect was not observed in liposomes prepared with the extracted bacterial lipids indicating that it was strongly dependent on the presence of membrane proteins. In this work we also indicate that in B. subtilis membranes, other physical properties as interface hydration change as a function of the external medium osmolarity. In addition, several mutants for phospholipids biosynthesis were constructed. We demonstrated the importance of anionic lipids (cardiolipin and phosphatidylglyerol specifically) for the adaptation of this specie to osmotic stress. Our results indicated that the interruption in gene cls2 resulted in a complete deficiency in cardiolipin synthesis, suggesting that B. subtilis cls2 gene product to be the major cardiolipin synthase. In our knowledge this is the first report about the biophysical and biochemical adaptation of the B. subtilis membranes to osmotic stress. These changes would be indispensable to counteract the osmotic imbalance between the cells and the external medium.

Wainszelbaum, Marisa. "Trypanosoma cruzi : Mecanismos reguladores de la metaciclogénesis" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el intestino de su vector, insecto hematófago, Trypanosoma cruzi, se encuentra expuesto a una gran variedad de compuestos. Algunos de éstos inducen la diferenciación del parásito hacia su estadío de tripomastigote metacíclico, que es la forma infectante. Este proceso implica la activación de vias especificas de señalización. En esta Tesis investigamos la generación de moléculas liposolubles con actividad metaciclogénica y su mecanismo de acción. Demostramos que los ácidos grasos libres, juegan un rol importante en la metaciclogénesis, el que puede explicarse por la activación de la proteína kinasa C (PKC). La generación de estos ácidos grasos libres tiene lugar por efecto de fosfolipasas exógenas (del intestino del vector) y endógenas (del tripanosoma) actuando en forma concurrente. Estas fosfolipasas han sido aisladas y caracterizadas. Los ácidos grasos libres estimulan la generación de diacilglicerol, contribuyendo a explicar su efecto activador sobre la PKC. A este efecto, se suma la aparición de aumentos de calcio citoplásmico, por exposición a extractos intestinales, que ha sido demostrada anteriormente, con lo que se generan simultáneamente los dos segundos mensajeros (iones calcio y diacilglicerol), requeridos para la activación de la PKC. Estudios previos indicaron que la digestión de la hemoglobina genera péptidos metaciclogénicos que actúan a través de la proteina kinasa A (PKA) del parásito. Existen en consecuencia mecanismos redundantes, mediados por la PKC y la PKA, que aseguran la diferenciación celular en Trypanosoma cruzi. En ambos casos, péptidos de la hemoglobina y ácidos grasos libres, son productos de la digestión de la sangre. Un posible significado biológico de estas observaciones es que dichos productos desempeñen un rol coordinador entre la fisiología alimentaria del insecto y la aparición de las formas infectantes del parásito.

Abstract:
Inside the intestinal medium of its blood sucking vector, Trypanosoma cruzi is exposed to large variety of compounds. Some of these induce the differentiation of the parasite to its infective metacyclic trypomastigote stage. This process implies the activation of specific signaling pathways. In this Thesis we investigate the generation of lipid soluble molecules with metacyclogenic activity and their mechanism of action. We show that free fatty acids play a key role in this process which can be explained through the activation of protein kinase C (PKC). The generation of those free fatty acids takes place through exogenous (intestinal) and endogenous (trypanosomal) phospholipases which act concurrently. These phospholipases have been characterized in this work. The free fatty acids stimulate the formation of diacylglycerol thus, accounting for the PKC-activating effects. Cytoplasmic calcium peaks have been demonstrated to take place upon stimulation with the intestinal extracts. Therefore, both second messengers, diacylglycerol and calcium; appear simultaneously as required for PKC activation. Previous work has shown that peptides derived from the digestion of hemoglobin, have metacyclogenic activity through the activation of protein kinase A (PKA) in the parasite. Thus, there are redundant mechanisms, involving PKC and PKA that ensure cell differentiation in Trypanosoma cruzi. In both cases, hemoglobin peptides and free fatty acids, the regulatory compounds, are blood digestion products. A possible biological meaning of these observations is that such products serve a coordinated role between the feeding physiology of the insect and the appearance of the infective forms of the parasite.

Policastro, Lucía Laura. "Participación de las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno en la transformación celular y en la modulación de la radiosensibilidad" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las poblaciones celulares en un organismo están estrictamente controladas por el balance de señales complejas que estimulan o inhiben la proliferación, diferenciación y sobrevida de las células. Existen evidencias experimentales que sugieren que las especies reactivos del oxigeno estón involucradas en el desarrollo del cancer. El primer objetivo de este trabajo fue evaluar la participación de las especies reactivos del oxígeno en los mecanismos de proliferación y transformación celular y modular los niveles de estas especies a fin de inhibir la proliferación y de esta forma controlar el crecimiento tumoral. Los resultados demostraron que existe un aumento de la actividad de superóxido dismutasa y una disminución de los niveles de catalasa y glutatión peroxidasa, enzimas disipadoras de peróxido de hidrógeno, en función de la malignidad. Este desbalance enzimótico se correlacionó con aumento de la producción de peróxido de hidrógeno. La disipación de peróxido de hidrógeno de manera exógena mediante tratamientos con catalasa inhibió la proliferación en líneas celulares de diversos orígenes tisulares y de organismos diferentes, lo que sugiere que la participación del peróxido de hidrógeno en el control de la proliferación sería un fenómeno general. Por otro lado, tratamientos con catalasa inhibieron el desarrollo de tumores experimentales. En concordancia con estos resultados, se demostró que la transfección estable del cDNA de la catalasa en una línea celular tumoral humana, disminuyó la tasa de proliferación y revirtió características de fenotipo maligno. Con respecto a los mecanismos de la inhibiciónde proliferación por secuestro de peróxido de hidrógeno, se demostró aumento de los niveles de óxido nítrico en los tratamientos con catalasa, sugiriendoa esta especie como un posible mediador de esta vía. Por otro lado, dado que la radioterapia constituye junto a la quimioterapia una de las principales formas de tratamiento contra el crecimiento tumoral, el segundo objetivo de esta tesis fue la caracterización de la radiosensibilidad intrínseca de líneas celulares con diferente grado de malignidad, de la respuesta celular a diferentes tipos de radiaciones ionizantes y el estudio del efecto del óxido nítrico como posible radiosensibilizador selectivo de las células tumorales. Los estudios de radiosensibilidad intrínseca demostraron un aumento de la radiorresistencia en función de la malignidad en las células tumorales de ratón evaluadas, que no se manifestó en las células de origen humano. Con respecto a las irradiaciones con haces de protones y de litio en comparación con la radiación gamma, se demostró un aumento de la eficiencia biológica relativa (RBE) en función de la transferencia lineal de energía (LET) de la radiación, que resultó consistente con los datos bibliográficos. Por otro lado, los estudios de la acción del óxido nítrico mostraron un mayor efecto radiosensibilizador en las células con mayor capacidad tumorigénica. Este efecto podría ser explicado por el estado prooxidativo basal de las células mas malignas, que potenciaría la acción de la radiación. Se demostró también la acción del óxido nítrico como radiosensibílizadoren tumores experimentales. Estos resultados sugieren la posibilidad de explorar terapias antioxidantes específicas y radiosensibílizadores selectivos para el control del crecimiento tumoral.

Abstract:
Cell populations in a living organism are strictly controlled by the balance of complex signaling systems, which stimulate or inhibit cell proliferation, dífferentiation and survival. Substantial experimental evidence suggests a role of reactive oxygen species in the development of cancer. The first aim of the present study was to evaluate the involvement of reactive oxygen species in the mechanisms of cell proliferation and transformation and to modulate the levels of these species to inhibit proliferation and thus control tumor growth. The results showed an increase in superoxide dismutase activity and a fall in the activities of H2O2-detoxifying enzymes, catalase and glutathione peroxidase, as a function of malignancy. This imbalance in the antioxidant system was coupled to a rise in the levels of H2O2. The exogenous removal of H2O2 by treatment with catalase induced an inhibition of proliferation in all the tested cell lines of different tissues from several species, suggesting that the regulation of proliferation by H2O2 would be a general phenomenon. Moreover, in vivo treatments with catalase inhibited the growth of experimental tumors. Furthermore, the rate of proliferation was inhibited and some features of malignant phenotype were reversed by a stable transfection of the cDNA of catalase in a human tumor cell line. Regarding the mechanisms of the inhibition of cell proliferation by scavenging H2O2,an increase in the levels of nitric oxide by treatment with catalase was found, suggesting that nitricoxide could be a mediator of this signaling pathway. Taking into account that radiotherapy coupled to chemotherapy is one of the main forms of treatment for cancer, the second aim of this study was to characterize the intrinsic radiosensitivity of cell lines with different degrees of malignancy, the cellular response to different types of ionizing radiation and the effect of nitricoxide as a possible selective radiosensitizer of tumor cells. The studies of intrinsic radiosensitivity demonstrated an increase in radioresistance as a function of malignancy in the mouse tumor cells evaluated. However, this correlation was not found in the human cells tested. Regarding proton and Lithium beam irradiations as compared with gamma irradiations, an increase in relative biological effectiveness (RBE)as a function of the linear energy transfer (LET) was found, which was consistent with previous reports. Furthermore, the studies of the action of nitric oxide resulted in a greater radiosensitizing effect on the more tumorigenic cells. These differential effects could be due to the basal prooxidative state of the more malignant cells that could potentiate the effect of radiation. The radiosensitizing effect of nitric oxide on experimental tumors was also demonstrated. These results suggest the possibility of exploríng specific antioxidant therapies and selective radiosensitizers for the control of tumor growth.

Franco, Paula Gabriela. "Rol del ácido retinoico durante la neurogénesis primaria de Xenopus Laevis" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El primer paso para la construcción del sistema nervioso de los vertebrados es la formación de la placa neural. Varios reportes sugieren que la señal retinoide es esencial para el establecimiento normal del patrón neural y la diferenciación neuronal. Aunque se ha progresado mucho en este sentido, quedan aún muchas preguntas sin respuestas para tratar de elucidar el rol que los retinoides juegan durante el desarrollo embrionario. En este trabajo, dentro del contexto de la cascada de la neurogénesis primaria de Xenopus laevis, exploramos la habilidad de los retinoides de regular diferentes pasos de la cascada que lleva a la diferenciación neuronal. Mostramos que el tratamiento con ácido retinoico (RA) produjo un sustancial aumento en el número de neuronas primarias que expresan N-tubulina debido a un incremento de la diferenciación neuronal sin involucrar cambios en la proliferación o muerte celular programada. Las evidencias indican que este efecto se origina en los pasos iniciales de la cascada neurogénica, ya que este tratamiento alteró el balance entre dos genes de prepattern de expresión temprana. Por un lado, se observó inducción de la expresión de Gli3, que promueve el destino neuronal y por otro, inhibición de Zic2, un represor de la neurogénesis. Además, se modificó la expresión de otros marcadores que participan en los pasos intermedios de la cascada como Neurogenina, MyT1 y X-Delta-1. Paralelamente, determinamos que los retinoides reprimen la expresión de sonic hedgehog (shh) en la línea media del embrión tanto en la placa del piso como en la notocorda y establecímos por primera vez un nexo entre shh, el RA y la neurogénesis primaria. En experimentos de rescate fenotípico demostramos que el RA no es capaz de revertir el efecto inhibitorio de shh, Zic2 o una versión costitutivamente activa de Notch (NotchICD) sobre la neurogénesis primaria. Estos resultados, junto con el hecho de que un pulso corto de RA alrededor del comienzo de la gastrulación es suficiente para desencadenar la inhibición de la expresión de shh, sugieren que el RA participa muy tempranamente en la regulación de esta vía. El tratamiento con agonistas y antagonistas selectivos de los receptores de ácido retinoico (RAR) nos permitió, por un lado, confirmar que la activación de los RAR es suficiente para inhibir la expresión de shh e inducir la neurogénesis y por otro, determinar que RARα es necesario in vivo tanto para regular la expresión de shh, como para establecer el patrón normal de neuronas primarias. Mediante una estrategia de dominancia negativa establecimos que el receptor RARα1 es requerido para la correcta regulación de shh, ya que cuando se interfiere con su función, la expresión de shh se desinhibe. Finalmente, el bloqueo específico de la síntesis de RARγ1 por microinyección de un oligo morfolino antisentido produjo un aumento muy marcado de la expresión de shh, sugiriendo que esta isoforma también es necesaria para mediar la regulación negativa que los retinoides ejercen sobre la expresión de shh. Contrariamente, mostramos mediante esta misma estrategia, que el receptor RARα2.2 no es necesario para ejercer in vivo esta regulación. Todos estos resultados en conjunto proveen nuevas evidencias que profundizan la comprensión del rol de los retinoides durante el desarrollo embrionario, en particular durante la neurogénesis primaria y aportan herramientas críticas para ayudar a descifrar los mecanismos moleculares que determinan la construcción en espacio y tiempo de la placa neural.

Abstract:
The first step in making the nervous system of a vertebrate is the segregation of the neural plate. Several reports suggest that retinoid signal is essential for normal neural patterning and neuronal differentiation. Although there was a lot of progress in this way, many questions remain without answers to elucidate the role that retinoids play during development. In this work, inside the context of Xenopus laevis primary neurogenesis cascade, we explored retinoid's ability to regulate different steps of the cascade that lead to neuronal differentiation. We show that retinoic acid (RA) treatment produced a substantial induction in the number of primary neurons that express N-tubulin due to a promotion of neuronal differentiation without involving changes in proliferation or programmed cell death. Evidences indicate that this effect originates in the initial steps of neurogenic cascade, as this treatment altered the balance between two prepattern genes with early expression. By one side, we observed an induction in Gli3 expression, a promotor of neuronal fate and by the other side, inhibition of Zic2, a repressor of neurogenesis. Furthermore, the expression of other markers that participate in the intermediate steps of the cascade, as neurogenin, MyT1 and Delta-1, was also modified. At the same time, we determined that retinoids repressed sonic hedgehog (shh) expression in the embryo midline, both in the floor plate as well as in the notochord and we established for the first time a link between shh, RA and primary neurogenesis. In phenotypic rescue experiments, we show that RA is not capable to reverse the inhibitory effect caused on primary neurogenesis by shh, Zic2 or a constitutively active form of Notch (Notch ICD). These results, together with the fact that a short RA pulse near the beginning of gastrulation is sufficient to inhibit shh expression, suggest that RA participate very early in the regulation of these processes. The treatment with selective agonists and antagonist of RA receptors (RAR) allowed us, first, to confirm that RAR activation is sufficient to inhibit shh expression and to induce neurogenesis, and second, to determine that RARα is required for proper shh regulation, as when we interfered with its function, shh inhibition was lost. Finally, the specific blockade of RARγ1 synthesis, by microinjection of a morpholino antisense oligo, produced a great induction of shh expression suggesting that this isoform is also necessary to mediate the negative regulation that retinoids exert over shh expression. On the contrary, we showed by the same strategy, that RARα2.2is not required for this regulation in vivo. All these results together, provide new evidences to understand the role that retinoids play during development, particularly during primary neurogenesis and contribute with critical tools to decipher the molecular mechanisms that lead to neural plate construction in space and time.

Vittori, Daniela Cecilia. "Mecanismos de acción del aluminio sobre la eritropoyesis" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La exposición a aluminio (Al) afecta la eritropoyesis. Sin embargo, poco se conoce acerca de las características de este efecto, así como de los mecanismos involucrados. En el presente trabajo de investigación se planteó, como primer objetivo, la necesidad de caracterizar la anemia producida por sobrecarga oral crónica con Al. Después de ocho meses de tratamiento, los animales desarrollaron anemia no ferropénica. La disminución de la concentración plasmática de haptoglobina, el aumento de reticulocitos y la presencia de esquistocitos apoyan la naturaleza hemolítica de la anemia desarrollada. A causa del tratamiento, se observó una importante inhibición del desarrollo de CFU-E en ensayos ex vivo de células de médula osea. El otro signo notable fue la aparición de severas alteraciones morfolófgicas en eritrocitos de sangre periférica, lo que sugirió una acción directa del A1 sobre las células eritroides maduras. Esa posibilidad fue corroborada en ensayos in vitro de eritrocitos humanos incubados en presencia del metal, en los cuales el rasgo persistente fue la desaparición de la típica forma bicóncava. El aumento de la degradación de la proteína estructural banda 3, observado junto con la detección de depósitos de A1 en la membrana, apoya no sólo la estrecha relación entre la morfología celular y la estructura y organización de la membrana del eritrocito, sino también una acción directa del metal sobre componentes de la membrana. La disminuida respuesta de las células progenitoras CFU-E a la eritropoyetina (Epo), después de la exposición crónica a Al, motivó la investigación de los efectos del metal sobre mecanismos involucrados en la vía de activación del receptor para Epo (EpoR). La exposición a A1 provocó disminución del EpoR a nivel de ARNm y de proteína, hallazgo que coincidió con la anulación del efecto antiapoptótico de la Epo sobre células K562. En la línea UT-7, altamente dependiente de Epo, sólo una exposición crónica a Al modificó la respuesta a la 1a hormona. Después de esa exposición, el aumento del EpoR a nivel de ARNm y de proteína, detectado bajo condiciones de carencia de Epo, sugiere un aumento de la sensibilidad de esta línea celular a1 factor de crecimiento. En conclusión, es evidente que el Al no resulta un elemento inocuo. Actúa sobre el sistema eritropoyético afectando a las células eritroides en distintos estadios de maduración. Los resultados sugieren una acción directa del metal sobre los componentes de la membrana celular de los eritrocitos maduros y un mecanismo de interferencia en distintos caminos de activación de células eritroides inmaduras mediados por la formación del complejo eritmpoyetina-receptor.

D’Angelo, Maximiliano A.. "Identificación y caracterización de enzimas involucradas en la regulación de los niveles de AMPc en Trypanosoma cruzi" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo se caracterizó la adenilil ciclasa TczAC. Se determinó que el gen que codifica para esta enzima se encuentra altamente conservado con los genes de adenilil ciclasas identificados en otros tripanosomátidos, es parte de una familia multigénica y se expresa en todos los estadios del ciclo de vida de T. cruzi. Se determinó que el producto de este gen es una enzima funcional capaz de complementar una cepa de levaduras carente de actividad adenilil ciclasa. Esta enzima es específica para AMPc, presenta una mayor actividad en presencia de Mn+2 que de Mg+2 y es inhibida por Zn+2 y el inhibidor del sitio P, 2'-deoxy-3'AMP. Por otro lado, el Ca+2 estimula la actividad de la misma manera independiente de calmodulina. Utilizando la técnica de doble híbrido en levaduras se demostró que TczAC dimeriza a través de su dominio catalítico y se identificaron 13 clones capaces de interaccionar específicamente con la misma. En particular se analizó la interacción de TczAC con el clon correspondiente a la proteína de flagelo paraflagellar rod. Asimismo, TczAC fire expresada en una cepa mutante de levaduras S. pombe. Los resultados obtenidos con estos experimentos sugieren que este sistema de expresión podría ser de gran utilidad para la búsqueda de inhibidores específicos. Por otra parte, se identificó y caracterizó el gen TczPDE que codifica para la primer fosfodiesterasa de AMPc de T. cruzi. Se determinó que este gen es parte de una familia multigénica y codifica para una proteína que presenta un posible péptido señal, dos dominios GAF de unión a GMPc y un dominio catalítico altamente conservado. La funcionalidad de esta proteína se confirmó por ensayos de complementación en levaduras carentes de actividad fosfodiesterasa. En dichas levaduras TczPDE se encontró asociada a la fracción particulada, mostró una alta afinidad por el AMPc y no fue capaz de hidrolizar GMPc. Por ensayos de Western blot se confirmó la asociación de TczPDE a la membrana de las levaduras y se observó que esta se encuentra fuertemente asociada a la misma. La localización subcelular de TczPDE en T. cruzi se estudió por fraccionamiento subcelular e inmunolocalización. Estos experimentos demostraron que TczPDE se encuentra localizada en la membrana plasmática del parásito y concentrada en el flagelo.

Abstract:
In this work we have characterized TczAC adenylyl cyclase. The gene encodes an enzyme which is highly conserved with the adenylyl cyclase genes identified in other trypanosomatids, is part of a multigene family and is expressed in all the stages of T. cruzi life cycle. The product of this gene is a functional enzyme that can complement a yeast strain deficient in adenylyl cyclase activity. The enzyme is specific for cAMP, has a higher activity in the presence of Mn+2 instead of Mg 2+, and is inhibited by Zn+2 and the P-site inhibitor, 2'-deoxy-3 'AMP. On the other hand, Ca+2 stimulates its activity in a calmodulin independent manner. Using the yeast two-hybrid technique it was demonstrated that TczAC dimerizes through its catalytic domains, and 13 clones that interact with this protein were identified. In particular, the interaction of TczAC with the flagellar protein paraflagellar rod was analyzed. Besides, TczAC was expressed in a S. pombe mutant strain. The results obtain in these experiments suggest that this expression system could be useful for the identification of specific inhibitors. Apart from that, the gene TczPDE that codes for the first cAMP phosphodiesterase of T. cruzi was identified and characterized. It was found that this gene is part of a mutligene family and encodes a protein that presents a putative signal peptide, two GAF domains for cGMP binding and a highly conserved catalytic domain. The functionality of this protein was confirmed by complementation assays in yeasts lacking phosphodiesterase activity. In these yeasts TczPDE was found to be associated to the particulate fraction, showed a high affinity for CAMP and was not able to hydrolyze cGMP. By Western blot analysis, the association of TczPDE to the yeast membrane was confirmed, and it was observed that this enzyme is strongly associated to it. The subcellular localization of TczPDE in T. cruzi was studied by subcellular fractionation and immunolocalization. These experiments demonstrated that TczPDE is localized in the plasma membrane of the parasite and concentrated in the flagellum.

Juárez, Angela Beatriz. "Estudios biológicos y enzimáticos en Chlorella kessleri (trebouxiophyceae, chlorophyta)" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo de tesis, se abordaron estudios sobre distintos aspectos de la biología de una cepa de Chlorella kessleri, aislada de la Laguna verde (Complejo Termal Copahue, Neuquén, Argentina), que no había sido estudiada previamente. Se realizó la caracterización morfológica, ultraestructural, bioquímica y fisiológica de esta cepa autóctona y se asignó su correcta identidad taxonómica. La identificación de esta especie constituyó una cita nueva para la Argentina, el segundo registro mundial de la especie en un ambiente natural, y una nueva cita de una especie del género Chlorella en un ambiente de origen volcánico. Además, se realizaron estudios enzimáticos, relacionados con los pasos regulatorios claves del camino biosintético de las clorofilas. Se determinaron, por primera vez en Chlorella kessleri, las actividades de dos enzimas involucradas en el primer paso regulatorio de este camino (síntesis del primer metabolito, ácido d -aminolevulínico), detectándose la presencia de actividad de las enzimas d -aminolevulínico sintetasa y g ,d -dioxovalerato transaminasa. Se estudió y caracterizó por primera vez en una Chlorophyta y por segunda vez en algas en general, la enzima del segundo paso regulatorio clave del camino (uroporfirinógeno decarboxilasa, UroD). Los estudios realizados sobre la actividad de esta última enzima en función de distintas condiciones (fase de crecimiento del cultivo, pH, temperatura, tiempo de incubación, tiempo de almacenamiento, concentración de proteínas, concentración de sustrato) permitieron caracterizar la UroD de C. kessleri y sentar las bases para la determinación de su actividad en las microalgas. Adicionalmente, se llevó a cabo la purificación parcial de esta enzima y se estableció que su estructura correspondería a un heterodímero de ca. 116 ± 7 kDa constituido por dos monómeros de ca. 72 ± 7 kDa y 66 ± 5 kDa de masa molecular. Al mismo tiempo, se estudiaron dos aspectos importantes relacionados con la biología aplicada de las microalgas: La potencial aplicación de esta cepa y alguna de sus propiedades como índice de contaminación ambiental con metales y xenobióticos, analizando el efecto de un metal pesado (cobre) y un hidrocarburo aromático polihalogenado (hexaclorobenceno) sobre la actividad de la enzima UroD. Se observó que, en las condiciones ensayadas, C. kessleri tolera concentraciones de cobre más elevadas que las informadas para otras especies del género (no se registró inhibición de la tasa de crecimiento) y que este metal afecta principalmente el contenido de clorofila y la actividad de la enzima UroD. Mientras que el hexaclorobenceno afecta principalmente el crecimiento de la especie y su actividad UroD a tiempos cortos de exposición, existiendo una recuperación a tiempos más largos. Los resultados obtenidos muestran que la determinación de la actividad UroD puede constituir un biomarcador de la contaminación reciente con hidrocarburos aromáticos polihalogenados y de la toxicidad de niveles de cobre que no alcanzan a producir efectos ponderables sobre el crecimiento algal. La potencialidad de esta cepa como fuente de compuestos biológicamente activos, evaluando la actividad antimicrobiana de extractos extracelulares de cultivos axénicos de C. kessleri frente a 11 cepas de microorganismos patógenos. Estos extractos mostraron actividad inhibitoria frente a todas las cepas ensayadas, tres de las cuales corresponden a bacterias altamente patógenas y resistentes a las drogas antibacilares de uso clínico actual. Los resultados obtenidos muestran la potencialidad de los cultivos de C. kessleri para la extracción, aislamiento e identificación de metabolitos farmacológicamente activos que puedan ser producidos y utilizados en la industria farmacéutica.

Abstract:
This disertation deals with the study of different biological aspects of a Chlorella kessleri strain isolated from Laguna Verde (Complejo Termal Copahue, Neuquén, Argentina). It was carried out the morphological, ultrastructural, biochemical and physiological characterization and the correct taxonomical determination of this autochtonous strain. This species is a new record for Argentina, the second record in the world and a new specific recording of the genera for volcanic environments. In addition enzymatic studies related with the regulatory steps of the chlorophyll biosynthetic pathway were made. For the first time in C. kessleri the activity of two enzymes related with the first regulatory step of this pahtway were studied. Evidences of the activity of the enzymes d -aminolevulinic synthase and g ,d -dioxovalerate transaminase were detected. For the first time in a green algae (Chlorophyta) and for second time in an algae, it was studied and characterized the enzime uroporphyrinogen decarboxylase (UroD). The studies in the activity of the UroD in different conditions (growing culture phase, pH, temperature, incubation time, storage time, protein concentration and substrate concentration), allow to characterize the enzyme. In addition partial purificated enzyme was obtained and it was established that UroD is an heterodimer of ca. 116 ± 7 kDa formed by two monomers of ca. 72 ± 7 kDa and 66 ± 5 kDa. At the same time two important aspects related with the applied biology of the microalgae were studied: 1) The potential application of this strain as an index of heavy metal and xenobiotic environmental contamination. 2) The potential usage of this strain as an source of products with biological activity. Analizing the effect of the copper and hexachlorobenzene on the C. kessleri strain it was observed that this species has a higher rank of tolerance for this heavy metal than other species of the same genera. This metal affect the chlorophyll content and the activity of the UroD. On the other hand, the hexachlorobenzene affect the growing of the species and the UroD activity in short exposure times. The results show that the activity of the UroD it would be an excellent tool to establish the levels of contamination due to HCB or copper contamination. In the other aspect C. kessleri extracellular extracts were tested against 11 pathogenic strains, testing its inhibitory properties, the results were positive in all cases. The results show C. kessleri cultures potential as a source of pharmacological substance.

Powazniak, Yanina. "Activación de vías involucradas en la apoptosis y proliferación en huvec. Agonistas relacionados con hormonas determinantes del sexo. Efecto sobre la liberación del factor Von Willebrand y Adamts13" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El VWF es una glicoproteína adhesiva, sintetizada en las CE y megacariocitos. Se sintetiza en forma monomérica, luego se organiza en dímeros y se multimeriza. El VWF media la adhesión de plaquetas al subendotelio vascular dañado y lel transporte del factor FVIII. La ADAMTS13, proteasa que cliva al VWF, pertenece a la familia de metaloproteasas ADAMTS, llamadas así por la combinación característica de una desintegrina y una metaloproteasa con motivos trombospondina tipo 1. La ADAMTS13 es sintetizada en el hígado. Además, se ha demostrado que se sintetiza y almacena en las CE, y que tiene actividad en los lisados celulares en condiciones estáticas y de flujo. La ADAMTS13 está involucrada en el proceso fisiológico de clivar a los multímeros extragrandes altamente trombogénicos, que cuando están presentes en el plasma o en la superficie de las CE llevan a una agregación intravascular y a la formación de un trombo plaquetario. Hemos observado que los niveles de ADAMTS13 descienden, mientras que los del VWF aumentan a medida que progresa el embarazo. En 1972, varios autores han descripto el aumento del 17β estradiol. También se ha observado que la administración de estradiol a las CE en dosis no fisiológicas produce un aumento de VWF. Hay antecedentes acerca de la acción de las hormonas determinantes del sexo en la muerte o proliferación celular en distintas líneas celulares y cultivos primarios. Se demostró la existencia de un factor embrionario liberador de histamina y una alta expresión de receptores para histamina durante la gestación en humanos. Además, se observó un aumento en los niveles de histamina en las últimas semanas de gestación en modelos de ratas y hamsters dorados. Los objetivos de esta tesis fueron: 1- analizar si los cambios hormonales que inducen o inhiben la síntesis o liberación de VWF y ADAMTS13 tienen influencia en la muerte o proliferación celular y 2- qué modificaciones producen las hormonas y concentraciones altas de histamina en la producción de VWF y ADAMTS13. Los experimentos se realizaron en cultivos de HUVEC. Se analizaron los efectos de las hormonas, a distintas dosis, en la proliferación o apoptosis, mediante el uso de técnicas de citometría de flujo y ensayo por colorimetría (MTS). Para evaluar el mecanismo de señalización se analizó la fosforilación de MAPK utilizando la técnica de SDS-PAGE e inmunotransferencia. Se observó que el efecto proliferativo del estradiol en HUVEC, ocurre a través de un aumento de la fosforilación de ERK2, inducido por el estímulo de la deprivación del suero. La progesterona y testosterona en dosis suprafisiológicas promovieron la apoptosis de HUVEC vía activación de p38 y JNK. Además se analizaron los niveles de mRNA (por Real Time PCR) y proteína intracelular y liberada (por SDS-PAGE e inmunotransferencia y ELISA) de VWF y ADAMTS13, en respuesta a los distintos tratamientos hormonales y con histamina. El estradiol, la progesterona y testosterona, no produjeron ningun cambio en la liberacion de VWF en las HUVEC, sin embargo combinadas con histamina, agonista de la liberación de VWF, produjeron inhibición de la actividad de la histamina. Por otra parte el estradiol, la progesterona y la testosterona no produjeron cambios significativos en la liberación de ADAMTS13, sin embargo el tratamiento con histamina indujo una disminución en los niveles de ADAMTS13, que fue revertida en la combinación con estradiol y progesterona. Finalmente, el estradiol, produjo un aumento en los niveles de mRNA de VWF y ADAMTS13. En la síntesis de ambos mRNA, el estradiol y la histamina presentan un efecto antagónico y la combinación de la progesterona y la histamina presentarían un efecto sinérgico.

Abstract:
VWF is a multimeric protein produced by endothelial cells and megakaryocytes. It is synthesized into a monomeric form, arranged into dimmers and multimers. VWF promove the platelet adhesion to the vascular subendothelium, also plays critical role in blood coagulation as it is the carrier protein for FVIII. ADAMTS13, the 13th member of the ADAMTS family of metalloprotease characterized by the combination of A disintegrin-like metalloprotease with ThromboSpondin type 1 motif, is the main physiological modulator of the size of VWF in plasma. ADAMTS13 is synthesized in liver cells. Recently it has been shown that ADAMTS13 it is synthesized and stored in the EC, and it has enzymatic activity using both stationary and flow assays. ADAMTS13 impairs the physiological process of cleavage of the largest, higly thrombogenic multimers of VWF wich, when present in plasma and/or on the endothelial cell surface, lead to massive intravascular aggregation and platelet thrombus formation in the terminal circulation. We have observed that during pregnancy VWF levels increased and ADAMTS13 levels decreased. Since 1972, several authors have described the increase of 17β estradiol levels. Also, it has been observed that the treatment of EC with estradiol induced an increase in VWF,in non physiological dose. There are several reports about the sexual hormones action in different cell lines and primary cultures, either in cell death or cell proliferation. It was shown the existence of an embryonic histamine-releasing factor and a high expression of receptors for histamine during gestation in humans. In addition, there was an increase of histamine levels in the final weeks of gestation in models of golden hamsters and rats. The thesis objectives were: 1- to analyze if the hormonal changes that induce or inhibit the synthesis or release of VWF and ADAMTS13 have influence in the cell death or cell proliferation and 2- what changes are produced with hormone and high histamine levels in the production of VWF and ADAMTS13. The experiments were carried out in HUVEC cultures. The effects of different doses of hormones on the proliferation or apoptosis were analyzed by flow cytometry techniques and testing by colorimetry (MTS). The MAPK phosphorylation was tested by SDS-Page and immunoblotting to check the signal mechanism. It was noted that the proliferative effect of estradiol on HUVEC, occurred through an increase in phosphorylation of ERK2, induced by the deprivation of serum. Progesterone and testosterone promoted apoptosis, via activation of p38 and JNK, in supraphysiological doses. In addition, VWF and ADAMTS13 were analyzed by: 1- levels of mRNA (Real Time PCR) and 2- levels of intracellular VWF and ADAMTS13 and their release induced by hormonal and histamine treatments (by SDS-Page, inmunoblotting and ELISA). Estradiol, progesterone and testosterone did not produce any change in the VWF and ADAMTS13 released from HUVEC. However, when the hormones were combined with histamine (agonist for VWF release), they induced the inhibition of the histamine effect. On the other hand, the treatment with histamine produced a decrease in ADAMTS13 levels, which was reversed by the combination of histamine with estradiol and progesterone. Finally, estradiol increased mRNA levels of VWF and ADAMTS13. Estradiol and histamine had an opposite effect in the synthesis of both mRNA. The combination of progesterone and histamine present a synergistic effect.

Prado Acosta, Mariano. "S-layer de Lactobacillus acidophilus: caracterización y análisis funcional" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las S-layers son estructuras externas de una sola especie de (glico) proteína, Se calcula que aproximadamente 5×105 monómeros de la proteína S-layers son necesarios cubrir una célula bacilar procariótica. Las funciones biológicas que se han sugerido para las S-layer son aún hipotéticas y requieren de mayor comprobación experimental. Se las asocia con roles de protección contra enzimas hidrolíticas, cambios de pH y estrés, la captación de moléculas y iones. Otra posible función que cumplirían sería la de adhesina, facilitando que la bacteria se adhiera a distintas superficies y ayudar a mantener la forma y rigidez de la célula. Durante el transcurso de mi tesis de Doctorado, he elegido a la proteína S-layer de Lactobacillus acidophilus, la opción de este microorganismo se debió a las características probióticas y la importancia del mismo en la industria alimentaria. Se caracterizó una nueva función biológica para la proteína S-layer de Lactobacillus acidophilus ATCC4356 que no había sido descripta previamente. La capacidad de murein-hidrolasa es una característica nueva que cumpliría un rol adaptativo en esta bacteria. La actividad lítica de la proteína S-layer de demostró sobre la pared celular y células enteras de Salmonella entérica serovar Newport el cual fue usada como patógeno modelo. Esta actividad respaldaría la característica probiótica de la cepa de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (Prado Acosta et al. 2008). También se utilizó a la S-layer como compuesto sinérgico con el antibiótico nisina, esto sirvió para disminuir la concentración inhibitoria minima casi un 50 % en organismos patógenos del tracto intestinal como Bacillus cereus y Staphylococcus aureus (Prado Acosta et al. 2009). Nuestros resultados también mostraron una variación de la expresión de S-layer en Lactobacillus acidophilus creciendo en condiciones de alta salinidad y se mostró que son de gran importancia para la supervivencia de la célula en estas condiciones.

Abstract:
Lactobacillus acidophilus is one of the major species found in human intestines. Some strains of lactobacilli are believed to be probiotic and are extremely used in food industry Many species of the genus Lactobacillus possess S-layers, this proteins are arrays composed of a single protein that constitute the outermost cell envelope in numerous Bacteria, they have been considered to function as protective coats, cell shape determinants, and be involved in cell adhesion. To date several studies focus on the structure of S-layers, but their biological functions remain poorly understood. Zymogram analysis with cell-wall extracted from Salmonella enterica serovar Newport as substrate revealed a true uncharacterized lytic activity coincident with that identified by western blot. This activity was also observed with both cell wall and whole cells. The analysis of the peptidoglycan breakage products showed an increase of free amino- acids suggesting that this S-layer acts as an endopeptidase. This gene was sequenced and showed 99% homology with other slpA from Lb. acidophilus strains and in silico analysis of the deduced protein showed a C-terminal motif which aligned with murein hydrolases of several Lactobacillus strains. The C-terminal motif was cloned and expressed in Bacillus subtilis where it conserved the murein hydrolase activity. Due to this enzymatic activity we show that in combination with nisin they act synergistically to inhibit the growth of Salmonella, Staphylococcus and Bacillus. We postulate that S-layer enhanced nisin incorporation into the cell membrane enabling it to penetrate the cell wall resulting in increased inhibitory activity. We also proved the S-layer protein is essential in the adaptation of the Lactobacillus during osmotic stress. We analyzed the role of the S-layer by exposing cells to osmotic stress, we found an over expression in this condition demonstrate by Western blot and real time PCR to quantify mRNA. We also tested the growth aptitude of Lactobacillus acidophilus in high osmotic conditions with and without S-layer protein showing its importance in the adaptation to this kind of stress.

Maymó, Julieta L.. "Regulación de la expresión de leptina y su acción en células placentarias" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Conocida inicialmente como la “hormona de la gordura” por su asociación con la saciedad y el balance energético del organismo, la leptina, una proteína de 16 kDa, también es reconocida actualmente por el papel fundamental que posee en la biología reproductiva. La expresión de la leptina y de sus receptores, descubierta originalmente en tejido adiposo, se ha evidenciado en otros tejidos tales como placenta, en donde la síntesis de leptina es altamente regulada. Los niveles de leptina aumentan tempranamente durante la gestación, aún antes de que se incremente el tejido adiposo, sugiriendo que existen otros factores que modulan su producción. Sin embargo, los mecanismos de acción de la leptina sobre la implantación y el crecimiento embrionario son aún desconocidos. El presente trabajo ha sido desarrollado con el objeto de estudiar las vías de transducción de señales activadas por leptina en placenta y para elucidar los mecanismos que median el efecto antiapoptótico de leptina. Más aún, dado que la leptina sería importante en la supervivencia celular y en el mantenimiento de la placenta, analizamos la regulación de la expresión de leptina en placenta por la hormona gonadotrofina coriónica y por AMPc. Se utilizaron como modelo las líneas celulares trofoblásticas JEG-3 y BeWo, y explantos de placenta humana a término. Demostramos que la unión de la leptina a su receptor causa la estimulación de las vías de señalización de JAK/STAT, MAPK, p38MAPK y PI3K. Asimismo, hallamos que la leptina cumple una función antiapoptótica en células trofoblásticas y que ejerce dicha función principalmente a través de la vía de MAPK. Cuando estudiamos la regulación de la expresión de leptina, los resultados mostraron que la hCG, una hormona esencial del embarazo, estimula la transcripción y la síntesis de leptina en placenta. Contrario a lo esperado, el AMPc inhibió la inducción de leptina por hCG. El efecto de hCG sobre leptina parece estar mediado por la vía de MAPK. Observamos que el AMPc estimula la expresión de leptina en placenta y que el nucleótido es capaz de activar no sólo la vía de señalización de PKA sino también la de MAPK. En este sentido, demostramos que la acción inductora del AMPc sobre leptina estaría mediada por un entrecruzamiento entre dichas vías. En síntesis, los resultados obtenidos contribuyen a esclarecer el modo de acción de la leptina en placenta así como los mecanismos de regulación de la expresión de la proteína, y sustentan la importancia de la leptina en la biología de la reproducción.

Abstract:
Leptin is a 16000 MW protein product of the obese gene, originally considered as an adipocyte-derived signaling molecule for the central control of metabolism. However, leptin has been suggested to be involved in other functions during pregnancy, particularly in placenta, where it was found to be expressed. Leptin levels rise early in pregnancy, even before the augmentation of adipose tissue, suggesting that others factors modulate its production. The mechanism of leptin action in implantation and fetal development remains unknown. In the present work we aimed to study the signal transduction pathways activated by leptin in placenta and to elucidate the mechanisms that mediate the antiapoptotic effect of leptin. Moreover, since leptin could be important in trophoblastic cell survival, and therefore in maintenance of the placenta, we attempted to study the regulation of leptin expression in placenta. BeWo and JEG-3 choriocarcinoma cell lines, as well as trophoblastic cells from human placenta explants were used. We determined that both models of work express leptin and leptin receptor. We have found that leptin stimulates JAK-STAT, MAPK and PI3K signaling pathways. We demonstrated that leptin has an antiapoptotic effect in placental cells and this effect is mediated mainly by the MAPK pathway. We have also found that hCG added to BeWo cells showed a stimulatory effect on leptin expression and transcription. Similar results were obtained with placental explants thus evidencing physiological relevance. We found that dbcAMP counteracted hCG effect on leptin expression. Moreover, hCG effect on leptin is mediated by the MAPK pathway. We showed that cAMP stimulates leptin expression in placental cells. More interestingly, we demonstrated that the cAMP effect on leptin expression probably involves both the PKA classic signaling pathway and the MAPK signal transduction pathway. A cross talk between these pathways would be responsible for the observed effects. In summary, our results will lead to a better understanding of the regulatory mechanisms of leptin expression by human placental trophoblasts and further support the importance of leptin in the biology of reproduction

Llorente, Briardo Ernesto. "Un rol biológico propuesto para las misteriosas polifenol oxidasas vegetales" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las polifenol oxidasas son ciertamente enzimas muy intrigantes. A pesar de haber sido estudiadas durante décadas y ser sus reacciones catalíticas ampliamente conocidas, no ha sido posible asignarles una localización precisa dentro de ninguna ruta metabólica. Aún más notable es que, incluso luego de más de 110 años de investigación transcurridos desde su descripción inicial en 1896, su función biológica es todavía un misterio. Las PPO son enzimas plastídicas ubicuas en vegetales que catalizan la conversión oxígeno-dependiente de fenoles a quinonas. Los sustratos fenólicos de PPO se localizan en la vacuola y entran en contacto con la misma cuando se producen daños en la compartimentación intracelular. Las quinonas formadas por la actividad de PPO son especies altamente reactivas, capaces de reaccionar con virtualmente todos los componentes celulares. Estas conducen a la formación y precipitación de polímeros oscuros similares a la melanina, un fenómeno conocido con el nombre de pardeamiento enzimático. Este fenómeno es responsable de cuantiosas pérdidas económicas en el mercado de frutos y vegetales y, actualmente, sólo puede ser parcialmente controlado mediante el uso de aditivos potencialmente dañinos para la salud humana. Con el propósito de contribuir al entendimiento del rol biológico y la evolución de estas enzimas, y a su vez generar un cultivo exento del deterioro oxidativo mediado por PPO, diversas líneas transgénicas (-PPO) de papa (Solanum tuberosum) con reducida actividad PPO fueron obtenidas mediante ingeniería genética y caracterizadas tanto a nivel fisiológico como molecular. El cultivo de papa fue elegido como modelo para este trabajo por ser el tercer cultivo de mayor consumo en el mundo y una de las alternativas principales para suplir las próximas necesidades alimentarias de la creciente población mundial. Considerando la relevancia intelectual y económica de estas enzimas, esta tesis trata tanto con aspectos biológicos como prácticos del estudio de las PPO. Un exhaustivo análisis de seguridad reveló que las papas -PPO son seguras para el consumo, si bien son metabólicamente diferentes a sus parentales silvestres (WT, de sus siglas en ingles Wild Type). Este estudio instauró el debate sobre la relevancia de los conceptos actualmente utilizados para la evaluación de la seguridad de cultivos transgénicos. En esta línea, diversos estudios sensoriales realizados en ratones y humanos revelaron que, además de su vida útil más prolongada, los tubérculos -PPO poseen mejoras organolépticas. Esta serie de estudios representaron el primer ejemplo exitoso de la aplicación de un modelo animal y paradigmas neurobiológicos en el estudio de un cultivo genéticamente modificado. Paralelamente, experimentos con patógenos e insectos fueron llevados a cabo para explorar las potenciales implicancias de PPO en los procesos de resistencia a estrés biótico. El desarrollo de un nuevo método para estudiar la enfermedad más devastadora del cultivo de papa, el tizón tardío, causado por el oomiceto Phytophthora infestans, permitió identificar que las plantas -PPO son más resistentes a este patógeno mediante mecanismos que parecen involucrar la participación de compuestos fenólicos. Inversamente, experimentos realizados con el insecto plaga Cyclocephala signaticollis mostraron que los tubérculos -PPO eran consumidos en una mayor proporción que los tubérculos WT por este coleóptero. A su vez, los análisis filogenéticos sugieren que las PPO vegetales fueron adquiridas por transferencia génica horizontal a partir de bacterias como una adaptación de las plantas primitivas al ambiente terrestre. En conjunto, estos estudios añaden una pequeña pero importante contribución a la comprensión de la evolución y la función biológica de las enzimas PPO que podría ser útil para el futuro desarrollo de nuevos cultivos mejorados. Finalmente, y probablemente el aspecto más interesante de esta tesis, es que, de la síntesis de los experimentos realizados durante el transcurso de este estudio, ha emergido una hipótesis que propone por primera vez una sugestiva explicación sobre el rol biológico de las PPO vegetales como parte de un sistema de defensa contra la depredación. El modelo propuesto aporta una explicación para el mecanismo de acción de PPO que es coherente con las evidencias evolutivas y, a su vez, permite interpretar una serie de intrigantes resultados previamente reportados por otros grupos de investigación.

Abstract:
The polyphenol oxidases are certainly very intriguing enzymes. Despite having been studied for decades and their catalytic reactions are well known, no precise location has been assigned to this enzyme in any known metabolic pathway. Remarkably, even after over 110 years of research since its initial description in 1896, its biological function is still a mystery. The PPOs are ubiquitous plastid plant enzymes that catalyze the oxygen-dependent conversion of phenols to quinones. PPO phenolic substrates are located in the vacuole and come into contact with the enzyme when disruption of the intracellular compartmentalization takes place. The quinones formed by PPO activity are highly reactive species that can react with virtually all cellular components, leading to the formation and precipitation of dark melanin-like polymers, a phenomenon known as enzymatic browning. This phenomenon is responsible for enormous economic losses in the fruit and vegetable industry and is currently partially controlled through the use of additives which have some adverse effects on human health. In an attempt to contribute to the understanding of the biological function and evolution of these enzymes, and to generate a quality improved crop exempt from the PPO-mediated oxidative damage, several transgenic potato (Solanum tuberosum) lines (-PPO or nonbrowning) with reduced PPO activity were genetically engineered and characterized both at the physiological and molecular levels. Potato was chosen as a model for this study because it is currently the third most important food crop consumed worldwide and a critical alternative for feeding the world’s growing population. Considering the intellectual and economic relevance of these enzymes, this thesis deals with both biological and practical aspects of the study of PPO. A comprehensive evaluation of the safety assessment of the transgenic lines revealed that the nonbrowning potatoes present no risk for adverse health effects. Although, they are metabolically different from wild-type (WT) potatoes. An exhausted safety assessment analysis evidenced no adverce health effects, establishing a debate about the relevance of the concepts currently used to assess the safety of genetically modified crops. In line with these aspects, sensory studies in mice and humans revealed that, in addittion to their extended shelf life, nonbrowning potatos have organoleptic improvements over the WT potatos. This series of studies represented the first successful example of the implementation of an animal model and neurobiological paradigms in the study of a genetically modified crop. In parallel, studies with pathogens and insects were carried out to study the potential implications of PPO in biotic stress resistance processes. A new method to study the most devastating disease affecting potato, the “late blight”, caused by the oomycete Phytophthora infestans, was developed and applied to evaluate the disease resistance of -PPO plants. The transgenic plants presented an increased resistance to this pathogen through mechanisms that seem to involve the participation of phenolic compounds. Conversely, experiments performed with the insect pest Cyclocephala signaticollis showed that -PPO tubers were consumed in greater proportions than WT tubers by this coleopteran. In turn, phylogenetic analyses suggests that plant PPOs were acquired by horizontal gene transfer from bacteria as an adaptation of primitive plants to the terrestrial environment. In summary, these studies provide a small but important contribution to the understanding of the evolution and biological function of PPO enzymes that could be useful for the future development of new improved crops. Finally, and perhaps the most interesting and relevant aspect of this thesis, is that a new hypothesis that provides an suggestive explanation for the biological role of plant PPOs as part of a defense system against predation has emerged from the work done. The proposed model provides an explanation for the mechanism of action of PPO that, is consistent with the evolutionary evidence, and also allows to interpret a number of intriguing results previously reported by other research groups.

Posadas, Diana M.. "Transporte y adhesión en Brucella suis: caracterización de una proteína de la familia TolC en el eflujo de compuestos tóxicos y de tres posibles adhesinas en la colonización del hospedador" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Brucella es un patógeno intracelular facultativo, responsable de una infección zoonótica llamada brucelosis. Un aspecto clave en la virulencia de este género es su habilidad para invadir y proliferar dentro de células fagocíticas y no fagocíticas, en las que se establece. En esta tesis se identificaron y caracterizaron factores imprescindibles para la interacción de este patógeno con su hospedador. Uno de estos factores fue la proteína BepC, que pertenece a la familia TolC de proteínas de membrana externa. BepC resultó crucial en la detoxificación de la bacteria tanto in vivo como in vitro, probablemente formando parte de sistemas tripartitos de eflujo. Los otros factores fueron tres adhesinas que pertenecen a la familia de autotransportadores de tipo I. Estas proteínas, a las que denominamos BmaA, B y C (por Brucella monomeric autotransporter), participarían en: i) la adhesión de Brucella suis a las células del hospedador, ii) la interacción con otras superficies como la matriz extracelular y iii) las interacciones bacteria-bacteria, para ambas, BmaA y BmaB. Estos factores pueden ser base de estudios futuros más específicos y profundos que lleven al desarrollo de vacunas o terapias que mejoren el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de la brucelosis.

Abstract:
Brucella is an intracellular pathogen responsible of the zoonotic disease called brucellosis. A key feature of Brucella virulence is its ability to invade and proliferate inside professional and non-professional phagocytic cells, were it establishes. In this thesis, essential factors for the interaction of this pathogen with its host were identified and characterized. One such factor was the BepC protein, that belongs to the TolC family of outer membrane proteins. BepC was shown to be crucial for the detoxification of the bacteria both in vivo and in vitro, probably as part of tripartite efflux systems. The other factors were three adhesins belonging to the type I autotransporters family. These proteins that we called BmaA, B and C (Brucella monomeric autotransporter) were shown to be involved in: i) Brucella suis adhesion to host cells, ii) the interaction of B. suis with other surfaces such as the extracellular matrix and iii) for both BmaA and BmaB, in bacteria-bacteria interactions. These factors can be the basis of future studies, more specific and profound, that lead to the development of vaccines or therapies that improve the diagnosis, prevention and treatment of brucellosis.

Marazita, Mariela C.. "P19INK4D y su fosforilación secuencial son críticas para el mantenimiento de la integridad del genoma" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas INK4 (p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c, y p19INK4d) componen una familia de inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CDKs) que funcionan en la fase G1 bloqueando la actividad de las quinasas CDK4 y CDK6. Mientras que comparten similitudes en sus estructuras formadas por repeticiones de motivos ankirina, estas proteínas difieren en sus patrones de expresión durante el desarrollo y en el adulto. Más allá de la aparente redundancia de su función en el control del ciclo celular, algunos de sus miembros han sido involucrados en distintos procesos tales como diferenciación, senescencia y supresión tumoral. En este trabajo demostramos que p19INK4d es inducido por radiación UV en diferentes tipos celulares (células de Leydig MA-10, cultivos primarios de células de Leydig, BHK-21 y WI-38) y que la inducción es específica de este miembro de la familia. Planteamos que la inducción podría implicar una posible participación de p19INK4d en la reparación del ADN. Mediante diversas estrategias, establecimos que p19INK4d efectivamente tiene una función en este proceso. Además, frente a daño genotóxico la disminución en los niveles de p19INK4d aumentó el número de aberraciones cromosómicas, concluyendo que la actividad de p19INK4d afecta el mantenimiento de la integridad del genoma. Sumado a esto, las células con niveles reducidos de p19INK4d resultaron con menor capacidad de sobrevivir al tratamiento con radiación UV. En respuesta al daño al ADN se encienden una serie de cascadas de señales que involucran diversas proteínas quinasas. Estas quinasas activan a su vez diferentes sustratos efectores de la respuesta conduciendo a la reparación, o no, del daño. Habiendo descripto una función de p19 en este proceso el siguiente objetivo consistió en estudiar si p19 formaba parte de este grupo de proteínas efectoras fosforiladas frente al daño. Encontramos que p19 es fosforilada por agentes que inducen diferentes tipos de daño (radiación UV, péptido β-amiloide y cisplatino). Identificamos dos sitios de fosforilación, serina 76 y treonina 141, los cuales son fosforilados en forma secuencial. Los resultados señalan a CDK2 y CDK5 como responsables de la fosforilación en serina 76 y a PKA en treonina 141. La fosforilación de ambos sitios ocurre en el citoplasma y la serina 76 es necesaria para la translocación de p19 al núcleo en esta respuesta. Evaluamos luego la relevancia fisiológica de la fosforilación en estos sitios. Encontramos que tanto la serina 76 como la treonina 141 son estrictamente necesarias para la función de p19 en la reparación del ADN. Sin embargo, mutantes en estos sitios incapaces de ser fosforiladas, mantienen la misma capacidad de inhibir la proliferación del ciclo celular cuando son sobreexpresadas. Esto señala que existe una independencia en la función de reparación respecto de la función inhibitoria de CDK4/CDK6. Por último, iniciamos el estudio referido a las posibles proteínas que interactúan con p19INK4d relacionadas a la función de reparación del ADN. Describimos seis interactores encontrados por análisis de doble híbrido en levaduras que resultan de particular interés porque presentan funciones en procesos comunes a p19INK4d. Estos posibles interactores participan en la reparación del ADN, en la remodelación de la cromatina y en la regulación de factores de transcripción del ciclo celular y la apoptosis. En vista de la participación de p19INK4d en respuesta a diversos agentes genotóxicos, que activan distintos mecanismos de reparación, postulamos que p19INK4d actuaría en la reparación del ADN específicamente en una etapa temprana de la respuesta celular al daño al ADN. El análisis de los potenciales interactores de p19INK4d, luego de la injuria genotóxica, permite sugerir la participación de esta proteína en los complejos remodeladores de la cromatina necesarios para permitir el acceso de las maquinarias de reparación en los sitios de daño.

Abstract:
INK4 proteins are members of a family of cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors that function in G1 to block the activity of CDK4 and CDK6. While they share clear structural similarities, numerous studies have shown that INK4 proteins differ in their expression patterns during development and in the adult, and have differing roles in differentiation, senescence and tumor suppression. We demonstrated that p19INK4d is induced in response to UV radiation in different cell types (Leydig MA-10 cell line, primary Leydig cell culture, BHK-21 y WI-38) and that this induction is specific of this family member. We hypothesized that this fact could be related to a role of p19INK4d in DNA repair. Taking advantage of diverse strategies, we found that p19INK4d effectively participates in this process. Adding to this, diminished p19INK4d levels when cells are exposed to genotoxics leads to an increase in the number of chromosomal aberrations. From these facts we concluded that p19INK4d influences the maintenance of genome integrity. Furthermore, cells with reduced p19 expression resulted in a significant decrease of the survival rate upon UV damage. In DNA damage response different pathways are triggered involving the activity of protein kinases. These kinases in turn activate diverse substrates that act as effectors of the response leading or not to DNA repair. Having described a function of p19INK4d in this process, the next aim leaded the study to analize whether p19INK4d is part of the effector proteins phosphorylated after DNA damage. We found out that p19 is phosphorylated by treatment with agents which induce different types of DNA damage (UV light, β-amyloid peptide and cisplatin). We identified two phosphorylation sites, serine 76 and threonine 141, which are sequentially phosphorylated. Our results pointed out CDK2 and CDK5 as responsible kinases to act on serine 76 and PKA as the one acting on threonine 141. Both sites are phosphorylated in the cytoplasmic space but only serine 76 is required for p19INK4d translocation to the nucleus in this response. We investigate the physiological relevance of the phosphorylation process in these sites. We showed that serine 76 and threonine 141 are strictly necessary for p19 function in DNA repair. However, those mutants of p19 not able to be phosphorylated have full capacity for inhibiting cell proliferation when they are overexpressed. This fact indicates the independence of p19INK4d functions. Lastly, we began the study related to potential proteins interacting with p19INK4d linked to DNA repair. We described six interactors found by a yeast two hybrid screening which appear particularly interesting because they have functions in common processes to p19INK4d. These interactors participate in processes such as: DNA repair, chromatin remodelling and regulation of transcription factors of the cell cycle and apoptosis. Taking into account p19INK4d participation in response to diverse genotoxic agents which activate different DNA repair mechanisms, we finally raised the hypothesis that p19 would be taking part in an early step in DNA damage response, specifically in DNA repair. The analysis of potential p19INK4d interactors, after genotoxic injury, suggests that this protein could play a role as a member of chromatin - remodeling complexes necessary for the accessibility of DNA repair machineries to DNA damaged sites.

Girotti, María Romina. "Análisis proteómico de los mecanismos moleculares de progresión tumoral relacionados con la proteína Sparc" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
SPARC (proteína secretada acídica y rica en cisteínas) es una glicoproteína sobreexpresada en una gran variedad de tumores favoreciendo la progresión tumoral y metástasis. Su rol biológico ha sido demostrado además en remodelación de tejidos, migración celular endotelial, morfogénesis y angiogénesis. Nuestro laboratorio ha demostrado que la transfección estable de células tumorales de melanoma con una secuencia de ADN antisentido de SPARC, promovió la inhibición del crecimiento tumoral en un modelo murino in vivo. Sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares por los cuales SPARC ejerce su efecto protumoral. Esta tesis de doctorado se enfocó en la búsqueda de intermediarios moleculares por los cuales SPARC favorece la progresión tumoral. Mediante análisis proteómicos globales aplicados al modelo de melanoma humano con disminución forzada de la expresión de SPARC, pudimos dilucidar un mecanismo molecular por el cual SPARC actúa sobre la progresión tumoral. Esta vía se centra en el eje TGFbeta1/ colágeno tipo I/ integrinas alfa2beta1 a través del cual SPARC regula la invasividad celular mediada por catepsina B. Por otro lado, se demostró que SPARC induce el cambio de E‐ a N‐caderina de membrana permitiéndoles a las células de melanoma transmigrar a través de una monocapa de células endoteliales mediante un mecanismo molecular independiente al descripto para la inducción de catepsina B. Además, las células deficientes en SPARC presentaron una expresión disminuida de genes asociados con propiedades mesenquimales revelando que SPARC está involucrada activamente en la transición epitelio‐mesenquimal y en la progresión metastásica.

Abstract:
SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteins) is a secreted glycoprotein related to tumor progression and metastasis and overexpressed in different tumors. Its role has been described in several biological processes that include tissue remodelling, endothelial cell migration, morphogenesis and angiogenesis. Our laboratory showed that the stable transfection of tumor cells with antisense SPARC DNA abolished tumorigenicity in an in vivo melanoma murine model. However, little is known about the molecular mechanisms affected by SPARC during tumor growth. This thesis was focused in the search of molecular mediators of SPARC protumoral effect and to address this objective a proteomic strategy was applied. Global protein expression analysis of the melanoma proteome following enforced downregulation of SPARC expression led us to elucidate a molecular mechanism where SPARC makes use of TGFbeta1/collagen I and integrin alfa2beta1 to promote cathepsin B‐mediated melanoma invasiveness. SPARC also induces E‐ to N‐cadherin switch enabling melanoma cells to transmigrate across an endothelial layer through a mechanism that does not involve the molecular mediators showed for cathepsin B. In addition, SPARC‐deficient cells also exhibited decreased expression of genes associated with the acquisition of mesenchymal traits revealing that SPARC plays a key role in the promotion of epithelial to mesenchymal transition and melanoma aggressiveness.

Viale, Diego Luis. "Caracterización y desarrollo de promotores quimera que permitan la replicación viral específica en el entorno tumoral" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los tumores están compuestos de una masa heterogénea de células tumorales que incluyen células estromales asociadas que pueden convertirse en una barrera para la lograr una terapia exitosa contra la enfermedad. En los últimos años, los Adenovirus Replicativos Condicionales (CRAds) regulados por promotores recombinantes surgieron como una nueva modalidad de terapia para el cáncer. SPARC se encuentra expresada en forma muy elevada tanto en células tumorales como en endotelio y en los fibroblastos activados de tumores. A partir de estos datos, decidimos utilizar al promotor de SPARC para dirigir la replicación de los virus tanto en las células tumorales como en las células que forman parte del tumor. Logramos clonar un promotor que demostró mayor actividad en las células que expresan SPARC (F512) que se utilizó para dirigir la replicación de un CRAd (Ad-F512). Ad-F512 tiene efecto oncolítico en diferentes líneas celulares de melanoma y en ensayos in vivo se observó la eliminación de tumores SB2. Por el contrario, los tumores de melanoma A375N, Mel J y el tumor SB2/WI-38, que combina células de melanoma con fibroblastos, su efecto oncolítico es muy reducido. Para aumentar su eficacia adicionamos secuencias de ADN conteniendo elementos de respuesta a diferentes condiciones pato‐fisiológicas que caracterizan al tejido tumoral para aumentar la replicación. A partir de los resultados obtenidos, seleccionamos el promotor kBF512HRE conteniendo elementos de respuesta a hipoxia (HRE) y elementos de respuesta a NFkB (kB). Construimos el CRAd Ad-kBF512HRE que eliminó el tumor SB2/WI-38 en todos los ratones pero no se observa el mismo efecto sobre tumores Mel-Les y A375N. A partir de estos resultados se cambió la fibra adenoviral involucrada en el pegado al receptor celular y el virus resultante, Ad-5/3-kBF512HRE tiene efecto anti-tumoral sobre los tumores Mel-Les. Estos resultados indican que la adición de elementos de respuesta a condiciones que caracterizan al tejido tumoral y el cambio de la proteína involucrada en la unión al receptor celular aumentan el efecto terapéutico de un CRAd en las líneas celulares resistentes y, además, pueden sobrepasar la restricción en la replicación que implica la presencia de células estromales.

Abstract:
Human tumors are composed of a heterogeneous mass of malignant cells that also include tumor‐associated stromal cells that might become a barrier for successful therapies. In the last years, Conditionally Replicative Adenoviruses (CRAds) regulated by recombinant promoters appear as a new modality for cancer therapy. SPARC is over‐expressed in tumor cells and associated-endothelial and –fibroblast cells. Due to these results we utilized SPARC promoter for transcriptional regulation due to its overexpression on tumor melanoma cells and tumor associated stromal cells. We cloned a promoter that shows higher transcriptional activity in SPARC-expressing cells (F512) and we used to drive adenoviral replication (Ad-F512). This CRAd shows oncolytic activity in different melanoma cell lines and stromal cells and eliminated SB2 tumors in vivo, however, in A375N, Mel J and mixed tumor cell /fibroblast SB2/WI-38, its oncolytic effect was strongly reduced. In order to improve its efficacy we added DNA sequences containing responsive elements to different patho‐physiological conditions that characterize tumor tissue to increase its replication. Based on their activity/ specificity ratio we selected kBF512HRE, containing Hypoxia Response Elements (HRE) and NFkB response elements (kB). We constructed Ad-kBF512HRE and eliminated SB2/WI-38 tumor in all mice, on the other side, this effect was not observed on A375N and Mel-Les tumors. After this, we changed the adenoviral fiber, protein responsible of cellular receptor attachment. Ad-5/3-kBF512HRE eliminates 2/4 tumors of AdkBF512HRE-resistant Mel-Les tumors. These results indicate that addition of enhancer elements responsive to tumor-environmental conditions and fiber change improved the therapeutic effect of a CRAd over resistant cells and might overcome the restriction imposed by the presence of stromal cells.

Peluffo, Guillermo D.. "Rol de la ciclooxigenasa-2 en la progresión de tumores de pulmón y mama" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Diversos tipos de tumores poseen elevados niveles de expresión de la ciclooxigenasa-2 y de producción de prostaglandinas. El uso de los antiinflamatorios no esteroides resultó beneficioso en el tratamiento de distintos modelos tumorales, a veces independientemente de la expresión de las ciclooxigenasas, sus blancos primarios. Nuestro objetivo en este trabajo de tesis fue estudiar el papel de la COX-2 en la progresión de distintos modelos tumorales. Utilizamos el adenocarcinoma de pulmón murino LP07 y hallamos que la COX-2 es un componente importante del comportamiento maligno de estas células. En este modelo, la inhibición de la COX-2 redujo el crecimiento del tumor primario y el desarrollo metastásico así como también los síndromes paraneoplásicos provocados por el tumor. La COX-2 y la PGE2 tienen un papel clave en la modulación de la supervivencia de las células LP07, que ejerce modulando las actividades de las quinasas Akt y p38, así como también la actividad del factor de transcripción NF-κB. En los adenocarcinomas de mama murinos LM3 y LMM3 la importancia de la COX-2 es menos relevante, ya que si bien el uso de un inhibidor selectivo de esta enzima, el celecoxib, produjo esencialmente los mismos resultados que en las células LP07, un análogo carente de actividad inhibitoria se comportó de manera similar. La PGE2 exógena no revirtió ninguno de los efectos del celecoxib. En estas células, la modulación de la biología tumoral involucró también un aumento de la apoptosis y el arresto del ciclo celular posiblemente mediado por p21 y p27. Finalmente, utilizamos un modelo más complejo, con el cocultivo de células de un carcinoma ductal in situ de mama humano y fibroblastos inflamatorios de artritis reumática. Las células del CDIS MCF10DCIS.com no expresan COX-2, la cual es inducida cuando son cocultivadas con los fibroblastos de AR. Encontramos que los fibroblastos inducen la progresión hacia el carcinoma invasivo, en parte modulada por la COX-2, cuya inhibición disminuyó los niveles de la MMP-14 y la actividad de la MMP-9. La inhibición de la COX-2, el NF-κB y la MMP-9 redujo la capacidad invasiva de las células MCF10DCIS.com inducida por las interacciones con los fibroblastos inflamatorios. En conjunto, este trabajo sugiere la utilidad de los inhibidores de la COX-2 para el tratamiento de la progresión tumoral y la participación de esta enzima en la modulación del comportamiento de algunos tumores ya sea mediante su expresión constitutiva o inducida por un microambiente inflamatorio.

Abstract:
COX-2 expression is increased in a number of tumors along with elevated PG production. NSAID treatment was found to have antitumor properties in different types of cancers, although the dependency of COX-2 inhibition remains controversial, in spite of being their primary target. We aimed to study the role of COX-2 in tumor progression using different cancer models. We found that COX-2 is a key player for the malignant behavior of the LP07 murine lung adenocarcinoma. COX-2 inhibition delayed not only tumor growth but also the metastatic outcome and the development of paraneoplastic syndromes. COX-2 and PGE2 were found to have an important role for LP07 cell survival by modulating the Akt and p38 kinase activities and the transcription factor NF-κB. The relevance of COX-2 activity in the murine mammary adenocarcinomas LM3 and LMM3 was somewhat less important. The COX-2 specific inhibitor celecoxib renders nearly the same outcome in these cells than in LP07 cells. However the closely related analogue dimethyl-celecoxib, devoid of COX-2 inhibitory activity, was found to be equally effective. Moreover, exogenously added PGE2 did not revert the effect of celecoxib. The antitumor properties also involved an increased apoptosis and the cell cycle arrest possibly modulated by p21 and p27. Finally, we studied the role of COX-2 in mediating the interaction between breast cancer epithelial cells and inflammatory fibroblasts leading to the transition between DCIS and invasive carcinoma. The MCF10DCIS.com cells express COX-2 upon coculture with rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. We found that RASF-induced progression to invasive carcinoma involved in part the induction of COX-2 expression, and that MMP-14 levels and MMP-9 activity were reduced by COX-2 inhibition. The increased invasiveness of MCF10DCIS.com cells acquired though the interaction with the inflammatory fibroblasts were lowered by COX-2, MMP-9 or NF-κB inhibition. Taken together, these results suggest COX-2 inhibitors are useful antitumor drugs and the key role for COX-2 in modulating the behavior of some tumors by being either constitutively expressed or induced by an inflammatory stroma.

Grandellis, Carolina. "Identificación de la proteína quinasa dependiente de calcio isoforma 3 de Solanum tuberosum (StCDPK3): estudio genómico, transcripcional y bioquímico" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las CDPKs acoplan un sensor de calcio a un dominio quinasa y coordinan respuestas fisiológicas frente a estímulos. StCDPK3 codifica una CDPK funcional homóloga a isoformas de tomate y tabaco. Se amplificó el gen StCDPK3 (11366 pb), se generó y purificó la proteína recombinante y se determinaron sus parámetros cinéticos. Antagonistas de calmodulina disminuyen la actividad de 6xHisStCDPK3. La proteína recombinante se autofosforila y fosforila histonas. Se generó un anticuerpo policlonal que detecta a StCDPK3 en extractos particulados de hojas. StCDPK3 se expresa en respuesta a PGA y ABA, pero disminuye en respuesta a GA. Líneas transgénicas de fusión del promotor a GUS indican que es activo en hojas, raíces, ojos y brotes de minitubérculos y en estolones elongantes. La actividad GUS disminuye tras la elongación del estolón previo al inicio del crecimiento radial y aumenta en tubérculos tempranos. El factor de transcripción NtRSG es fosforilado por NtCDPK1. Se subclonó su homólogo en papa que es fosforilado in vitro por 6xHisStCDPK3. Además, StCDPK3 fosforila a StABF1. StCDPK3 podría participar en la transducción de señales asociada a procesos de crecimiento y elongación durante el desarrollo del tubérculo (modelo I), el desarrollo de raíces y brotes (modelo II) y como quinasa específica del FT StRSG (modelo III).

Abstract:
CDPKs couple calcium sensors to a kinase domain, and coordinate physiological responses to stimuli. StCDPK3 encodes an active CDPK homologous to tobacco and tomato isoforms. The gene was amplified (11366 bp), the recombinant protein was produced and kinetic parameters were evaluated. Calmodulin antagonists, CPZ and 48/80 reduce 6xHisStCDPK3 activity. The recombinant protein autophosphorylates and is able to phosphorylate histones. A policlonal antibody was produced that detected StCDPK3 in particulate extracts from leaves. StCDPK3 is induced in response to PGA and ABA, but is reduced after GA treatment. Transgenic lines carrying the StCDPK3promotor fused to GUS displayed GUS activity in leaves, roots, minitubers eyes, sprouts and in elongating stolons. When stolon elongation ceases before the onset of radial growth, GUS activity was downregulated to be later detected in early tubers. NtRSG is a transcription factor (TF) phosphorylated by NtCDPK1. The potato homologue, StRSG, was subcloned. In vitro, 6xHisStCDPK3 could phosphorylate NtRSG and StRSG, and an ABA transcription factor, StABF1, suggesting that these TFs could be endogenous targets of the kinase. StCDPK3 could play a role in elongation and proliferation events associated to tuber development (model I), root and sprout growth (model II) and as a specific kinase for StRSG (model III).

Piola, Lucas. "Ensayos ecotoxicológicos para la evaluación del impacto de plaguicidas en suelos agrícolas de Argentina" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se estudió el impacto del uso de glifosato y clorpirifos en la estructura y función de suelos agrícolas de nuestro país, mediante bioensayos integrados laboratoriocampo, a través de una batería de biomarcadores, empleando un enfoque por niveles. Lombrices Eisenia andrei se seleccionaron como bioindicadores para ensayos de laboratorio. En estudios preliminares, éstas se expusieron a los plaguicidas en papel de filtro o suelo artificial (SA). Se optimizaron biomarcadores celulares/subcelulares, y parámetros de relevancia ecológica, que se aplicaron al monitoreo de suelos agrícolas, en cultivo de soja o trigo, rociados con los plaguicidas a las concentraciones recomendadas. Algunos biomarcadores fueron sensibles a las bajas concentraciones de plaguicidas. Los ensayos de tiempo de retención del rojo neutro y Cometa fueron más sensibles al clorpirifos que los de reproducción y evasión. Estos últimos resultaron buenos indicadores del efecto de glifosato. La actividad alimentaria en laboratorio y campo presentó un patrón similar de respuesta. Los bioensayos en SA suplementado con los plaguicidas a las concentraciones ambientales previstas mostraron una respuesta similar a la obtenida en campo, pudiendo resultar útiles para evaluar efectos de los plaguicidas en estos organismos no blanco. Se enfatiza la importancia de realizar ensayos laboratorio-campo en condiciones locales.

Abstract:
We studied the impact of glyphosate and chlorpyrifos on structure and function of Argentine agricultural soils, through integrated laboratory-field bioassays. For assessing the ecotoxicological impact of both pesticides, a battery of biomarkers was studied, using a tiered approach. Earthworms Eisenia andrei were selected as bioindicator organisms in laboratory tests. In preliminary studies, they were exposed to both pesticides on filter paper and artificial soil (AS). Cellular/subcellular and ecologically relevant biomarkers were optimized. The selected biomarkers were applied for monitoring soya or wheat cultured agricultural soils, sprayed with the pesticides at recommended doses. Some biomarkers were responsive to the low concentrations of pesticides. Neutral red retention time (NRRT) and Comet assays were more sensitive to chlorpyrifos than reproduction and avoidance tests. The latter were good indicators of the presence of glyphosate. Laboratory and field feeding activity exhibited a similar pattern of response. Bioassays on AS spiked with the pesticides at the predicted environmental concentrations showed a similar response to that obtained in the field, and may be useful to evaluate the effects of pesticides on these non-target organisms. We emphasize the relevance to perform laboratory-field bioassays in local conditions.

Tudisca, Vanesa Romina. "Especificidad de la proteína quinasa A en Saccharomyces cerevisiae vía fosforilación y localización de las isoformas catalíticas" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Proteína Quinasa dependiente de cAMP (PKA) participa en una amplia variedad de procesos fisiológicos. En Saccharomyces cerevisiae un único gen codifica para la subunidad regulatoria (BCY1) y tres genes para las subunidades catalíticas (TPK1, TPK2 y TPK3). El desarrollo de esta tesis permitió comprender parte del mecanismo por el cual la vía de transducción de señales cAMP-PKA logra especificidad espacio-temporal en respuesta a variaciones en el medio ambiente. Particularmente, nos propusimos establecer si las tres isoformas de PKA son reguladas diferencialmente por fosforilación y localización subcelular en respuesta a diferentes condiciones nutricionales y de estrés. Hemos determinado que Tpk2 y Tpk3, pero no Tpk1, se localizan en gránulos de procesamiento de mRNA en respuesta al arresto traduccional evocado por estrés nutricional y fase estacionaria. Estos resultados sugieren que la vía de PKA conecta el estado nutricional de la célula con la regulación de la traducción de proteínas. Además hemos identificado a Pkh1 como una quinasa común a Tpk1, Tpk2 y Tpk3 cuya fosforilación diferencial regula la interacción con la subunidad regulatoria y la localización subcelular. Los resultados obtenidos en esta tesis contribuyen a ampliar el conocimiento sobre la especificidad temporal y espacial de la vía de transducción de señales.

Abstract:
cAMP dependent Protein Kinase (PKA) is involved in a wide variety of physiological processes. In Saccharomyces cerevisiae one gene encodes for the regulatory subunit (BCY1) and three genes encode for the catalityc subunits (TPK1, TPK2 and TPK3). This thesis has allowed us to understand some aspects of the mechanism involved in the spatio-temporal regulation of PKA in response to specific stimuli. Our main aim was to determine if specificity of action of PKA catalytic isoforms is achieved through differential phosphorylation and subcelular localization in response to different nutritional and stress conditions. We found that Tpk2 and Tpk3, but not Tpk1, localize in mRNA processing granules in response to translational inhibition induce by nutritional stress and stationary phase. These results indicate that PKA pathway connects the nutritional state of the cell with protein translation regulation. Even more, we have identified Pkh1 as a common kinase of the three Tpks, which differential phosphorylation regulates the interaction with the regulatory subunits and the subcelular localization. The results obtained in this thesis improve our knowledge of the spatio-temporal specificity of signal transduction pathways.

Allievi, Mariana Claudia. "S-layer de Bacillus sphaericus: caracterización, regulación, análisis funcional y aplicaciones" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las cepas de Bacillus sphaericus 2362 (cepa de referencia), C7 y C11 (nuevos aislamientos) todas pertenecientes al grupo IIA, son entomopatógenas contra larvas de mosquitos. Además de las envolturas habituales de bacterias Gram positivas, estas cepas están recubiertas de una capa externa de una estructura proteica cristalina: la capa S o Surface layer (S-layer) que estaría asociada un polímero secundario de pared (SWCP). En las 3 cepas se observa que la proteína S-layer tiene un PM de aproximadamente 125 kDa y que es reconocida por el mismo anticuerpo. Tratamientos con LiCl, que remueven la S-layer sin afectar la viabilidad, permitieron observar que en esa condición estas células (carentes de S-layer) crecen más lentamente que las células con S-layer y que en medios hipersalinos solo crecen al recuperar S-layer. El análisis por western blot con un anticuerpo anti S-layer de la cepa 2362, mostró que en las células tratadas la síntesis de S-layer se inició muy temprano durante el crecimiento bacteriano. Las modificaciones en tamaño, concentración, ubicación (fijadas a membrana, asociada a esporas, o libres en el sobrenadante) en función de las etapas de su crecimiento y de las condiciones de estrés hiperosmótico (altas concentraciones de NaCl), nos indican posibles modificaciones postraduccionales, siendo la glicosilación la más frecuentemente reportada. Los resultados de agregación de cultivos y tinción con azul de bromo-timol fueron contradictorios respecto a la presencia de glicosilación cuando se comprarn con los de tinción empleando un kit comercial que distingue proteínas glicosiladas. Se discuten distintas posibilidades: Oglicosilación no enzimática, desprendimiento de la S-layer con el SWCP. Por otro lado se exploraron dos funciones importantes que estas proteínas aportarían a la bacteria: bioabsorción de metales y actividad mosquitocida. Distintas especies de Bacillus han sido involucradas en la asociación con metales como bioadsorbentes, pero hasta el momento no hay un claro entendimiento de las propiedades quelantes. Con ese objetivo, se analizó la capacidad de bioadsorción de cobre en cultivos y esporas de bacterias Gram positivas de especies que producen o no S-layer. Sólo aquellas cepas provistas de S-layer, como Bacillus sphaericus y B. thuringiensis, mostraron una bioadsorción significativa tanto en cultivos como en esporas. Esta capacidad (cercana al 50%) se retuvo luego de un proceso de calentamiento suave de los cultivos, indicando que elementos estructurales de la envoltura son los responsables de esta propiedad. Las S-layer purificadas de dos cepas de Bacillus sphaericus mantuvieron la capacidad de bioadsorber cobre mostrando que la propiedad está directamente asociada a ellas. Se determinaron los parámetros de bioadsorción para la cepa B. sphaericus 2362 que responden al modelo de Langmuir. Tanto la afinidad como la capacidad de bioadsorción fueron comparables con otros bioadsorbentes de origen bacteriano. Se observó un efecto competitivo de Ca2+ y Zn2+, aunque no de Cd2+, lo que indicaría que esta proteína podría retener otros metales además de cobre lo que explicaría su persistencia en ambientes contaminados. La utilización del anticuerpo anti-S-layer permitió determinar que la S-layer permanece adherida a la espora y que sólo las esporas sin lavados intensivos (que eliminan la Slayer) captan eficientemente el cobre. Por primera vez se mostró una correlación directa entre el contenido de S-layer y la capacidad de bioadsorción. Esta capacidad está ligada a la retención de las S-layer adheridas a las células y esporas de Bacillus. Algunas cepas de Bacillus sphaericus son tóxicas para larvas de mosquitos, y sus propiedades insecticidas se deben principalmente a la inclusión cristal que se produce durante la esporulación. Se inspeccionó la actividad insecticida de las S-layer de las cepas 2362 y C7. Se encontró que las S-layer per se muestran actividad contra larvas de Culex. En experimentos con preparaciones de espora-cristal tóxicas en conjunto con la S-layer, se observó un efecto sinérgico aportado por esta proteína. La S-layer de la cepa C7 en particular aumenta el rango de huésped hacia mosquitos del género Aedes para los cuales B. sphaercius no es eficiente. Los análisis in silico de la estructura de la Slayer muestran un motivo con actividad hemolítica que fue confirmado por experimentos realizados in vitro. Esta actividad explicaría los resultados de toxicidad de las S-layer.

Abstract:
Bacillus sphaericus strains 2362 (reference strain), C7 and C11 (new isolated strains), all of them belonging to the homology group IIA, are entomopathogenic against mosquito larvae. In addition to the usual envelopes of Gram positive bacteria, this strains are covered by an external layer with a crystalline protein structure: the S-layer or surface layer. This layer could possibly be associated to a secondary wall polymer (SWCP). In the 3 strains the S-layer protein has a molecular weight of approximately 125 kDa recognized by the same antibody. Treatments with LiCl, that removed the S-layer without affecting their viability, allowed to observe that in this condition these cells (without S-layer) grow slower than those with S-layer. In hypersaline mediums they only grow when they restore the S-layer. The western blot analysis using the anti S-layer antibody against strain 2362, showed that treated cells recover S-layer synthesis early during the start of bacterial growth The modifications in size, concentration, location (fixed to membrane, associated with spores, or free in the supernatant) are related to the growing stages and stress conditions (high NaCl concentrations) indicating possible posttranslational modifications, being the glycosylation the most frequent. The cultures segregation and staining with bromothymol blue results are in contradiction with those obtained with commercial kit staining that distinguishes glycosylated proteins. Different possibilities are discussed as non enzymatic O-glycosylation and S-layer detachment with the SWCP. On the other hand, two important functions of this protein as metal biosorption and mosquitocidal activity have been explored. Various Bacillus species have been implicated as biosorbents of metals, but so far there is no clear understanding of the chelating properties. To that end, we examined the ability of copper biosorption in cultures and spores of Gram positive species with and without S-layer. Only those strains provided with S-layer as Bacillus sphaericus and B. thuringiensis, showed a significant biosorption both in cultures and spores. This capacity (about 50%) was retained after a mild heating of cultures, indicating that structural elements of the envelope are responsible for this property. The S-layer extracted from two strains of Bacillus sphaericus maintained the ability to bioadsorb copper showing that the property is directly associated with this protein. Biosorption parameters were determined for S-layer of strain B. sphaericus 2362 and showed to respond to the Langmuir model. Both the affinity and biosorption capacity were comparable with other bacterial biosorbents. A competitive effect of Ca2+ and Zn2+, but not of Cd2+, was also observed, indicating that other cations may be biosorbed by this protein, which would explain the persistence of this bacterium in polluted environments. The use of anti-S-layer antibody allowed to determine that the S-layer remains attached to spores and that only those not submitted to intensive washing (which eliminate the Slayer), efficiently capture copper. This was the first time that a direct correlation between the content of S-layer and the capacity of biosorption was shown. This capacity is linked to the retention of S-layer proteins attached to Bacillus spores and cells. Some Bacillus sphaericus strains are toxic to mosquito larvae, and their insecticidal properties are mainly due to crystal inclusions produced during sporulation. The insecticidal activity of the S-layer of strains 2362 and C7 was inspected. It was found that the S-layer per se showed activity against Culex larvae. In experiments with toxic spore-crystal preparations in conjunction with the S-layer, we observed a synergic effect provided by this protein. In particular, the S-layer of strain C7 increased the host range to Aedes mosquitoes for which B. sphaercius is not efficient. In silico analysis of the structure of the S-layer show a domain with possible hemolytic activity which was confirmed by in vitro experiments. This activity would explain the results of S-layer toxicity and increased host range.

Stigliano, Ivan Daniel. "Rol de la subunidad beta de la glucosidasa II en el control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en el retículo endoplásmico" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Glucosidasa II (GII) cumple un rol fundamental en la biogénesis de glicoproteínas en el retículo endoplásmico (RE). Es responsable por la remoción secuencial de los dos residuos de glucosa (Glc) más internos del glicano (Glc3Man9GlcNAc2) transferido a los residuos de Asn en las glicoproteínas nacientes en la vía secretoria. GII participa en los ciclos de Calnexina (CNX)/Calreticulina (CRT) ya que remueve el residuo de Glc agregado a intermediarios de plegamiento por la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT). La GII un es un heterodímero soluble del RE cuya subunidad α (GIIα) posee el sitio catalítico mientras que el rol de la subunidad β (GIIβ) es controvertido, si bien ha sido involucrada en la retención en el RE de GII y en el plegamiento de GIIα. En esta tesis demostramos que en ausencia de GIIβ, la subunidad catalítica GIIα de la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe (un organismo que posee un mecanismo de control de calidad de plegamiento de proteínas similar al presente en células de mamíferos) adopta una conformación activa y es capaz de hidrolizar el análogo de sustrato p-nitrofenil-α-D-glucopiranósido. Sin embargo GIIβ es necesaria para la correcta localización de GII en el RE y para la deglucosilación eficiente de los sustratos fisiológicos Glc2Man9GlcNAc2 y Glc1Man9GlcNAc2. El dominio homólogo al dominio lectina del receptor de Manosa 6-fosfato presente en el C-terminal de GIIβ interacciona con manosas en las ramas B y/o C de los N-glicanos mediando la hidrólisis del sustrato por GIIα. Demostramos, también, que el dominio G2B del N-terminal de GIIβ es necesario para la interacción GIIα-GIIβ. Por último, demostramos que una reducción en el contenido de manosas de los N-glicanos disminuyó significativamente la deglucosilación in vivo mediada por GII pero no afectó la glucosilación in vivo mediada por UGGT, favoreciendo la formación de derivados monoglucosilados. Esto sugiere que GII funcionaría como un regulador de la permanencia en los ciclos de CNX/CRT de las glicoproteínas que se pliegan muy lentamente, y por lo tanto han sido demanosiladas, otorgando más oportunidades de plegamiento a las proteínas antes de enviarlas a degradación.

Abstract:
Glucosidase II (GII) plays a key role in glycoprotein biogenesis in the endoplasmic reticulum (ER). It is responsible for the sequential removal of the two innermost glucose residues from the glycan (Glc3Man9GlcNAc2) transferred to Asn residues in proteins. GII participates in the Calnexin (CNX)/Calreticulin (CRT) cycle as it also removes the single glucose unit added to folding intermediates and misfolded glycoproteins by the UDPGlc: glycoprotein glucosyltransferase (UGGT). GII is a heterodimer whose α subunit (GIIα) bears the glycosyl hydrolase active site, whereas its β subunit (GIIβ) role is controversial and has been reported to be involved in GIIα ER retention and folding. Here, we report that in the absence of GIIβ, the catalytic subunit GIIα of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (an organism displaying a glycoprotein folding quality control mechanism similar to that occurring in mammalian cells) folds to an active conformation able to hydrolyze p-nitrophenyl- α-D-glucopyranoside. However, GIIβ is required for correct GII ER retention and for efficient deglucosylation of the physiological substrates Glc2Man9GlcNAc2 and Glc1Man9GlcNAc2. The interaction of the mannose 6-phosphate receptor homologous domain present in the Cterminal of GIIβ and mannoses in the B and/or C arms of the glycans mediates N-glycan hydrolysis enhancement. We also found that the N-terminal GIIβ G2B domain is essential for GIIα-GIIβ interaction. Finally, we show that a decrease in the N-glycan mannose content significantly diminished in vivo GII-mediated deglucosylation but did not affect in vivo UGGT activity. This suggests that GII may be an in vivo regulator of misfolded and slow-folding glycoprotein permanence in the ER as these glycoproteins are characterized by a detectable ER mannosidase(s)-catalyzed N-glycan demannosylation and therefore, an increased possibility of displaying monoglucosylated structures able to interact with CNX or CRT for longer time periods is likely to occur.

Alaimo, Agustina. "Neurotoxicidad inducida por manganeso. Vías de muerte apoptóticas y rol de la dinámica mitocondrial" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Manganismo es un desorden neurológico originado por exposición crónica al manganeso (Mn) que presenta características clínicas y vías de señales similares a las de la enfermedad de Parkinson Idiopático (EPI). El Mn se acumula preferentemente en los ganglios basales y en particular, en las mitocondrias de los astrocitos. Estas organelas son dinámicas y de morfología variable como resultado del balance entre eventos de fusión y fisión mitocondrial, el cual está alterado en varias enfermedades neurodegenerativas. En el presente trabajo, se estudiaron las cascadas de señalización molecular implicadas en la muerte celular inducida por Mn, con particular énfasis en el rol de la dinámica mitocondrial. Los estudios in vitro realizados en la línea C6 de astrocitoma de rata indicaron que el Mn indujo muerte celular apoptótica dependiente de caspasas con participación de las Vías Extrínseca e Intrínseca, la cual estuvo mediada por la generación de especies reactivas de oxígeno. Aún más, el Mn promovió la fragmentación exacerbada de las redes mitocondriales y disturbios en los niveles de expresión de las proteínas de fusión y fisión Opa-1 y Drp-1, generando un desequilibrio hacia éste último evento, lo cual contribuyó a la muerte celular. Por otra parte, estudios in vivo realizados en ratas expuestas a Mn indicaron la presencia de lesiones en el tejido estriatal y de alteraciones en los niveles de expresión de las proteínas reguladoras de la dinámica mitocondrial. En conjunto, nuestros resultados contribuyen al esclarecimiento de los mecanismos moleculares participantes en la apoptosis inducida por Mn y demuestran por primera vez que las proteínas Opa-1 y Drp-1 juegan roles protagónicos en la ejecución de la vía apoptótica mitocondrial.

Abstract:
Manganism is a neurological disorder caused by chronic exposure to Mn, closely resembling Idiophatic Parkinson´s Disease (IPD) at both clinical characteristics and molecular signaling pathways. Mn accumulates predominantly in the basal ganglia, particularly in the mitochondria of astrocytes. These are dynamic organelles which morphology is variable as a result of a delicate equilibrium between mitochondrial fission and fusion events. This balance is known to be altered in neurodegenerative diseases. In this research, we studied the molecular signaling pathways involved in Mn-induced cell death, with special focus on the role of mitochondrial fusion and fission proteins. In vitro studies conducted in rat astrocytoma C6 cells demonstrated that Mn induced cell death by caspase-dependent apoptosis mediated by ROS. A detailed analysis of signaling pathways showed the involvement of the Extrinsic and Intrinsic pathways. Moreover, Mn induced exacerbated mitochondrial network fragmentation and disturbances in the expression levels of fusion and fission proteins, Opa-1 and Drp-1, shifting the balance towards to the fragmentation event and contributing to cell death. Furthermore, in vivo studies conducted in rats exposed to Mn showed that Mn produce lesions in the striatal tissue and alterations in mitochondrial dynamics regulatory proteins. Taking together, these findings contribute to a deeper elucidation of the molecular signaling mechanisms underlying Mn-induced apoptosis and demonstrate for the first time that Opa-1 and Drp-1 are central protagonists in the execution of mitocondrial apoptotic pathway.

Rossi, Lucas Ezequiel. "Impacto de los inhibidores de Deacetilasas de Histonas (iHDAC) sobre la funcionalidad de células NK" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Desde el descubrimiento de que la expresión y funcionalidad de las deacetilasas de histonas (HDAC) se encuentra alterada en muchos tumores y que las mismas contribuyen a la carcinogénesis, se han desarrollado inhibidores de HDAC (iHDAC) para el tratamiento del cáncer. Los iHDAC inducen apoptosis, arresto del ciclo celular e inhibición de la angiogénesis en células tumorales. Sin embargo, no se ha estudiado adecuadamente el impacto de los iHDAC sobre células del sistema inmune involucradas en la respuesta anti‐tumoral. Por eso y debido a la relevancia de las células NK en la respuesta contra tumores, el objetivo de esta tesis fue estudiar el impacto de los iHDAC sobre estas células. Hemos demostrado que los iHDAC Tricostatina A (TSA), valproato de sodio (VPA) y butirato de sodio (NaB) inhibieron la producción de IFN-γ y la actividad citotóxica de células NK humanas. Aunque las drogas indujeron apoptosis en una fracción de las células NK, la marcada inhibición de sus funciones efectoras también se debió a la inhibición de la translocación nuclear de NF-κB y a una modulación negativa en la expresión de receptores activadores (NKG2D, NKp44 y NKp46), receptores de citoquinas (IL-12Rβ1, IL-15Rβ, IL-2Rγ e IL-18R) y de la subunidad α del receptor de IL-2 de alta afinidad (CD25). Además, demostramos que esta modulación negativa de NKG2D, NKp46 y CD25 fue funcionalmente relevante. Estos resultados fueron validados in vivo con células NK de ratones tratados con TSA, las que mostraron una menor expresión de los receptores NK1.1, NKG2D y NKp46, y una menor producción de IFN‐γ en respuesta a la estimulación ex vivo con citoquinas. Asimismo, comenzamos un estudio con muestras de sangre de pacientes epilépticos tratados con VPA ya que las células NK de estos pacientes se encuentran expuestas sólo a los efectos de la droga. Observamos un menor porcentaje de células NK en células mononucleares de los pacientes, las que exhibieron una menor expresión de receptores activadores, una menor producción de IFN-γ y una menor capacidad de degranulación. Estos resultados indican que estas drogas poseen efectos supresores sobre células NK (comprometidas en la inmunovigilancia contra tumores) y contribuyen al diseño de nuevos enfoques para el desarrollo de drogas terapéuticas que no comprometan la respuesta inmune anti-tumoral.

Abstract:
Since the discovery that many tumors exhibit altered expression and activity of different histone deacetylases (HDAC) and that they contribute to carcinogenesis, many HDAC inhibitors (HDACi) have been developed for the treatment of cancer. HDACi can induce apoptosis, cell cycle arrest and inhibit angiogenesis on tumor cells. However, their impact on cells of the immune system involved in immune surveillance against tumors has not been studied. Thus, the aim of this work was to investigate the effect HDACi on NK cells as they constitute critical actors of the anti‐tumor immune response. We have demonstrated that the HDACi Tricostatin A (TSA), sodium valproate (VPA) and sodium butyrate (NaB) inhibited in vitro IFN-γ production and cytolytic activity by human NK cells. Although the drugs induced apoptosis of a minor fraction of NK cells, the strong inhibition of their effector functions involves additional mechanisms such as inhibition NF-κB p50 nuclear translocation and down‐regulation of activating receptors (NKG2D, NKp44 and NKp46), cytokine receptors (IL-12Rβ1, IL-15Rβ, IL-2Rγ, IL-18R) and CD25 (the α chain of the high affinity IL-2R). Downregulation of NKG2D, NKp46 and CD25 were functionally relevant. Our results were validated in vivo, in HDACi treated mice, which exhibited NK cells with lower expression of the activating receptors NK1.1, NKp46 and NKG2D, and produced less IFN-γ upon ex vivo stimulation with cytokines. Preliminary data obtained with peripheral blood mononuclear cells from epileptic patients treated with VPA, showed that these patients exhibited lower percentages of NK cells than normal controls, and these NK cells presented lower expression of NKG2D and NKp46, lower IFN-γ production upon stimulation with citokynes and lower degranulation after stimulation with K562 cell line. Thus, our results suggest that HDACi have immunosuppressive effects on NK cells that may dampen their immune surveillance capacity. Our results may contribute to the development of drugs with a higher therapeutic eficacy which do not compromise immune response.

Olivares, Carla Noemí. "Regulación del crecimiento del tejido endometrial en respuesta a nuevas alternativas terapéuticas propuestas para tratar la endometriosis" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La endometriosis se caracteriza por la presencia de focos de tejido endometrial por fuera de la cavidad uterina confiriéndole, a las mujeres que la padecen, fuertes dolores pélvicos e infertilidad. Basándonos en trabajos previos realizados en cáncer, evaluamos la aplicación de los inhibidores de aromatasa, los inhibidores de ciclooxigenasa (COX)-2 y los agonistas de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR)γ como posibles alternativas terapéuticas para la endometriosis. Específicamente evaluamos los efectos del inhibidor de aromatasa, anastrozole, del inhibidor selectivo de COX-2, celecoxib y del ligando de PPARγ, rosiglitazona sobre el crecimiento de células endometriales in vitro y sobre la implantación y crecimiento de lesiones endometriósicas en un modelo murino de endometriosis. Los resultados obtenidos son promisorios ya que todos los tratamientos provocaron efectos inhibitorios del desarrollo de la endometriosis así como efectos antiproliferativos, proapoptóticos y antiangiogénicos tanto in vivo como in vitro. Por otro lado, luego de administrar anastrozole y celecoxib en forma conjunta, no pudimos demostrar una mejora del tratamiento combinado por sobre la aplicación de cada una de las terapéuticas de manera individual. Nuestros resultados avalan al inhibidor de COX-2 como una alternativa terapéutica concreta para la endometriosis y, sugieren que la combinación de celecoxib con una glitazona podría mejorar la involución de la endometriosis, aunque aún se requiere profundizar los estudios para confirmar estos últimos datos.

Abstract:
Endometriosis is characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity. Women suffering from endometriosis experience pelvic pain and infertility. On the basis of previous cancer research, we evaluated aromatase inhibitors, cyclooxygenase (COX)- 2 inhibitors and peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)γ agonists as possible alternatives for endometriosis treatment. Specifically, we evaluated the effects of anastrozole, an aromatase inhibitor, celecoxib, a selective COX-2 inhibitor, and rosiglitazone, a PPARγ agonist on endometrial cell growth in vitro and on the implantation and growth of endometriotic lesions in a murine model of endometriosis. The results obtained are promising given that all treatments inhibited endometriosis development and had antiproliferative, proapoptotic and antiangiogenic effects both in vitro and in vivo. On the other hand, after anastrozole and celecoxib combined administration we could not demonstrate an improvement over the drugs administered individually. Our results support the COX-2 inhibitor as a real option as an alternative for endometriosis treatment and suggest that celecoxib combined with a glitazone might improve endometriosis involution, although this must be further confirmed.

Teijo, María Julieta. "Mecanismos de muerte y supervivencia celular por terapia fotodinámica basada en ácido 5-aminolevúlico" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Terapia Fotodinámica (TFD) es utilizada para el tratamiento del cáncer y otras patologías no malignas. Se basa en la administración un compuesto fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido maligno y al recibir luz de longitud de onda adecuada, éste interactúa con el O2 produciendo especies reactivas del oxígeno (ROS), que son altamente tóxicas y desencadenan la muerte celular. La administración exógena del ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de los tetrapirroles, induce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), el único FS endógeno. En la erradicación de tumores mediante TFD intervienen diferentes procesos de muerte celular, los que incluyen apoptosis, necrosis, y autofagia. En el presente trabajo se estudiaron los mecanismos que llevan a la muerte celular por TFD basada en ALA en células de adenocarcinoma de pulmón humanas (A549) cultivadas de modo convencional -en monocapa- o en esferoides multicelulares (EMCs, agregados celulares compactos que desarrollan gradientes de nutrientes y oxígeno), y en una variante resistente derivada mediante sucesivos ciclos de tratamiento fotodinámico y recuperación. La acumulación de PpIX a partir de ALA aumentó con el tiempo de incubación y la concentración de ALA hasta alcanzar un plateau con 1 mM tanto en monocapas como en EMCs. Estudios de microscopía confocal indicaron que las mitocondrias son el principal sitio de localización de PpIX endógena pero no de PpIX administrada exógenamente, la cual se localiza en la membrana plasmática. Los EMCs presentaron una capacidad de síntesis de PpIX similar a las células en monocapa, mientras que en células resistentes se observaron niveles menores de acumulación. La TFD-ALA reduce significativamente la supervivencia celular de manera dosis lumínica dependiente aunque en menor medida tanto en células resistentes como en EMCs. La TFD-ALA induce en las células la generación de ROS tales como ¹O2, O2ֿ y peróxidos, en células en monocapa pero no en EMCs; y esa producción puede ser modulada por agentes antioxidantes de alto grado de protección como el ascorbato y el trolox, con un consecuente aumento en la viabilidad celular. Se observaron eventos asociados a apoptosis 1 h luego de la TFD: reducción del tamaño celular, irregularidades en la membrana plasmática, condensación de la cromatina, despolarización de la membrana mitocondrial, liberación de citocromo c al citoplasma, externalización de fosfatidilserina y activación de caspasa-3. En cambio, tanto en EMCs como en células resistentes se observó una reducción notable en la producción de ROS y en los parámetros de apoptosis. Por otro lado, en todos los casos se hallaron indicios de un proceso autofágico, caracterizado por la formación de vacuolas de doble membrana y la detección de LC3-II, así como la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2. La activación del factor nuclear NFκB únicamente se halló en células tratadas con dosis bajas de TFD, mientras que las células resistentes mostraron presencia de este factor en el núcleo en todos los tiempos de irradiación, de manera creciente. Los resultados obtenidos en este trabajo permiten determinar que los mecanismos de muerte celular post-TFD ocurren principalmente por la vía apoptótica intrínseca, pueden ser modulados por agentes antioxidantes, y coexisten con procesos autofágicos. Por otro lado, el modelo de EMCs es más adecuado para el estudio de los efectos de la TFD-ALA respecto de la monocapa, ya que simula la estructura de microtumores avasculares y refleja características histológicas como la secreción de mucopolisacáridos y la expresión del factor inducido por hipoxia (HIF1-α). La autofagia es el mecanismo principal de respuesta a TFD en células resistentes, las cuales a su vez incrementan mecanismos de sobrevida como la activación de NFκB. Estos son factores condicionantes de la eficacia del tratamiento a considerar al aplicar TFD repetidamente en el tratamiento de tumores y al emplear agentes antioxidantes para minimizar el fotodaño a tejidos no tumorales.

Abstract:
Photodynamic therapy (PDT) is a treatment for malignant and non malignant pathologies. It consists on the administration of a photosensitizing drug (PS) which selectively accumulates in tumor cells and upon irradiation with appropriate wavelength light reacts with O2 and produces reactive oxygen species (ROS) leading to cell death. Exogenous administration of 5-aminolevulinic acid (ALA) induces the accumulation of the endogenous PS, protoporphyrin IX (PpIX). Different cell death pathways develop after PDT, such as apoptosis, necrosis, and autophagy. Mechanisms of cell death after ALA-PDT were evaluated in a human adenocarcinoma cell line (A549) cultured in conventional monolayers, or as multicellular spheroids (MCSs, compact cell aggregates which generate nutrient and oxygen gradients) and in a derived PDT-resistant cell culture obtained after repetitive PDT-recovery cycles. PpIX accumulation from exogenous ALA increased with incubation time and ALA concentration reaching a plateau at 1 mM, both in monolayers and MCSs. Confocal microscopy images showed that endogenously generated PpIX localized in mitochondria, and exogenous PpIX in the plasma membrane. Similar PpIX accumulation rates were found in MCSs with respect to monolayers, whereas derived resistant cells showed lower levels. ALA-PDT significantly reduced cell survival in a light-dose dependent manner, but to a lesser extent in resistant cells and MCSs. Cells subjected to ALA-PDT in monolayers produce ROS like ¹O2, O2ֿ and peroxides, but not in MCSs. They can be modulated by high protection grade antioxidants such as ascorbate or trolox, with the consequent increase in cell viability. Several apoptosis related features were observed after PDT: cell shrinking, membrane blebbing, chromatin condensation, mitochondrial membrane despolarization, cytocrome c release to the cytoplasm, phosphatidylserine externalization and caspase-3 activation. MCSs and resistant cells showed a marked reduction in ROS production and apoptotic features; as well as autophagic signs including doble membrane vacuoles and LC3-II detection, in addition to antiapoptotic protein Bcl-2 expression. Nuclear factor NFκB was detected only after low dose PDT, but in resistant cells all irradiation times showed presence of NFκB in the nucleus, increasing with irradiation time. Results presented in this work indicate that cell death mechanisms induced by ALA-PDT occur mainly by the apoptotic intrinsic pathway, which can be modulated by antioxidant agents, and coexist with autophagic processes. In addition, MCSs are an appropriate model for the study of ALA-PDT because they mimic avascular microtumors and present hystological features like mucopolysacharides secretion and hipoxia-inducible factor expression (HIF1-α). Autophagy is the principal cell death pathway occurring in resistant cells in which increased survival mechanisms, like NFκB activation, were found. Factors conditioning PDT efficacy should be considered when applying repetitive PDT for tumor treatment together with the use of antioxidants to minimize photodamage to non malignant tissue.

Pontillo, Carolina Andrea. "Acción del hexaclorobenceno en la migración, invasión y metástasis en modelos experimentales de cáncer de mama" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Hexaclorobenceno (HCB) es un pesticida organoclorado considerado como probable carcinógeno humano. A nivel regional, este contaminante fue encontrado en leche materna de puérperas y en muestras de leche vacuna para consumo humano. Es un tóxico tipo dioxina, y como tal se une al receptor de hidrocarburos aromáticos (RHA), un factor de transcripción que modula procesos tales como apoptosis, proliferación y migración celular. El RHA está presente en el citosol e interacciona con el complejo que contiene a la quinasa de tirosina c-Src. Cuando estos tóxicos se unen al RHA, se pueden desencadenar dos mecanismos: 1) que el complejo tóxico-RHA se transloque al núcleo y module la expresión de genes con elementos de respuesta a dioxinas (DREs) en sus promotores y 2) que se libere la c-Src del complejo citosólico y active receptores de factores de crecimiento, como el Receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (HER1). Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron que el HCB aumenta el desarrollo y malignidad de tumores mamarios inducidos por N-Nitroso-N-metilurea en rata. En este mismo modelo se observó que el HCB activa la vía de señalización de c-Src/HER1 y disminuye la actividad del receptor de estrógenos (REα) en los tumores mamarios. Por otro lado, en estudios in vitro se demostró que el tóxico incrementa la proliferación y la actividad de c-Src en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 (+REα). La tumorigénesis ocurre frecuentemente como resultado de la sobreexpresión de proteínas como el HER1 y la c-Src, que están involucradas en procesos celulares normales. Estas proteínas están usualmente sobreexpresadas en cáncer de mama en estadíos tardíos, y cooperan en la formación y progresión tumoral al favorecer procesos como la proliferación, migración e invasión celular, actividad de metaloproteasas y metástasis. Los objetivos de este trabajo fueron investigar en ensayos in vitro, utilizando una línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (-REα) los efectos del tóxico en: a) la migración e invasión celular, b) la actividad y expresión de c-Src y HER1, c) la estimulación de las vías de señalización de ERK1/2, Akt2 y STAT5b, d) la actividad y expresión de metaloproteasas 2 y 9 (MMP2 y 9), y e) si los efectos observados dependen de las vías de señalización en estudio y de la unión del pesticida al RHA. Por otro lado, nos propusimos estudiar en ensayos in vivo, la acción del HCB sobre el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos espontáneos y experimentales. Nuestros resultados muestran que el HCB estimula las vías de transducción de señales de c- Src/HER1/STAT5b y HER1/ERK1/2, la migración e invasión celular, la expresión de MMP2 y 9, así como la secreción y actividad de MMP9 en la línea celular MDA-MB-231, in vitro. Observamos que la migración e invasión celular inducida por el tóxico están mediadas por c-Src, HER1 y el RHA. A su vez, la secreción y actividad de la MMP9 estimulada por el HCB depende de HER1 y del RHA, mientras que el aumento en la expresión de MMP2 depende tanto de c-Src, HER1 como del RHA. Asimismo, en un modelo de xenotrasplante con la línea celular MDA-MB-231 en ratones atímicos, demostramos que el pesticida estimula el crecimiento tumoral (0.3 y 3 mg/kg p.c.), mientras que induce la activación de c-Src, HER1, ERK1/2 y STAT5b e incrementa los niveles proteicos de MMP2 y 9 en los tumores mamarios en todas las dosis ensayadas. Por otro lado, en estudios de metástasis espontánea con tumores C4-HI en ratones BALB-c, encontramos que el HCB (0.3 y 3 mg/kg p.c.) aumenta el crecimiento de los tumores mamarios y el número de micrometástasis en hígado y pulmón. En los estudios de metástasis experimental con la línea celular LM3 en ratones BALB-c, el pesticida (3 mg/kg p.c.) incrementa el tamaño de las metástasis en pulmón. En conclusión, en el presente trabajo demostramos por primera vez, que el HCB promueve la migración e invasión celular por las vías de c-Src/HER1/STAT5b y HER1/ERK1/2, así como la expresión de MMP2 y MMP9 de manera dependiente del RHA. A su vez, observamos que el tóxico estimula el crecimiento tumoral y metástasis en pulmón e hígado en modelos experimentales de cáncer de mama.

Abstract:
Hexachlorobenzene (HCB) is an organochlorine pesticide considered as a probable human carcinogen. This pollutant was found in puerperal mother milk and in samples of bovine milk for human consumption, at regional level. It is a dioxin-like compound and a weak ligand of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) protein, which is a transcription factor that modulates processes as apoptosis, proliferation and cell migration. AhR interacts with cytosolic complex containing c-Src kinase. Upon dioxin binding, two mechanisms can be triggered: 1) the AhR-toxic complex translocates to the nucleus and modulates gene expression with dioxin-responsive elements (DREs) and 2) c-Src kinase frees from its complex and activates growth factors receptors like Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR/HER1). In previous studies of our laboratory, we found that HCB has a co-carcinogenic effect in N-Nitroso N-methyl urea–induced mammary tumors in rats, enhancing their development and malignancy. We have also demonstrated that HCB activates c-Src/HER1 signaling pathway and decreases estrogen receptor α (ERα) activity of mammary tumors, in the same model. In previous in vitro studies, we observed that HCB induces cell proliferation and c-Src activity in ERα (+) MCF-7 breast cancer cell line. Tumorigenesis frequently occurs as a result of the overexpression of proteins that are otherwise involved in normal cell processes, as HER1 family and c-Src tyrosine kinase. These proteins are overexpressed in a high percentage of certain late-stage human breast cancers, and they cooperate in tumor formation and progression, promoting processes like cell proliferation, migration and invasion, metalloprotease activities and metastasis. The aim of our study was to investigate the effects of HCB on: a) cell migration and invasion, b) c-Src and HER1 expression and activities, c) ERK1/2, Akt2 and STAT5b signaling pathways activation, d) MMP2 and MMP9 expression and activities, and e) AhR and c-Src/HER1 signaling pathways roles in ERα (-) MDA-MB-231 breast cancer cell line, in vitro. On the other hand, we studied the action of HCB on tumour growth and metastasis in spontaneous and experimental models, in vivo. Our results demonstrate that HCB stimulates c-Src/HER1/STAT5b and HER1/ERK1/2 signaling pathways, cell migration and invasion, MMP2 and 9 expression, as well as MMP9 secretion and activity in MDA-MB-231, in vitro. We observed that c-Src, HER1, and AhR are involved in cell migration and invasion increased by HCB. Moreover, HCB-induced MMP2 expression depends on c-Src, HER1 and AhR; whereas only HER1 and AhR are involved in HCB-induced MMP9 secretion and activity. When MDA-MB-231 were xenotrasplanted in athymic mice, we observed that HCB estimulates tumoral growth (0.3 and 3 mg/kg b.w.), whereas the pesticide also increases c-Src, HER1, ERK1/2 and STAT5b activities, as well as MMP2 and 9 protein levels in mammary tumors at all assayed doses. On the other hand, we found that HCB (0.3 and 3 mg/kg b.w.) enhaces mammary tumor growth, as well as lung and liver micrometastasis levels in spontaneous metastasis models with C4-HI tumors in BALB-c mice. Furthermore, we observed that the pesticide (3 mg/kg b.w.) enhances the lung metastasis size, in experimental metastasis assay with LM3 cell line in BALB-c mice. In conclusion, in the present study we demonstrate for the first time, that HCB promotes cell migration and invasion through c-Src/HER1/STAT5b and HER1/ERK1/2 signaling pathways activation, as well as MMP2 and MMP9 expression in an AhR dependent manner. Moreover, we observe that the pesticide estimulates tumor growth and lung and liver metastasis in breast cancer experimental models.

Marotte, Clarisa. "Interacción entre el metabolismo del calcio y el metabolismo energético en ratas normales y en animales espontáneamente obesos" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo fue comparar absorción y retención de Ca, y cambios en la composición corporal y en diferentes parámetros del metabolismo energético durante el crecimiento. Ratas espontáneamente obesas (IIMb/β) (O) y ratas Wistar (W), fueron apareadas; las madres se alimentaron con una dieta isocalórica con diferentes concentraciones de Ca: Alto (ACa: 0.9%), Normal (NCa: 0.5%) y Bajo (BCa: 0.2%). Las crías macho continuaron recibiendo la misma dieta materna hasta los 60 días de edad (ACa, NCa y BCa). En O, el PC fue inverso al contenido dietario de Ca sin diferencias en % de agua; OBCa presentó el menor % corporal de proteínas (p<0.01). El %ACa fue inverso al contenido de Ca de la dieta y el %A grasas no se modificó. OBCa presentó los mayores niveles de TGL, glucosa, insulina en ayunas, y HOMA-IR (p<0.01) y el menor valor de Ca y P corporal, CMO del esqueleto total y DMO de tibia y columna (p<0.01). OACa presento similar %Ca corporal pero CMO del esqueleto total y DMO de tibia proximal y columna fueron menores que ONCa (p<0.01). En W, AWCa presentó mayor % de grasa que los otros dos grupos (p<0.01). WBCa y WACa presentaron % de proteínas y cenizas menores a WNCa (p<0.01). WACa presentó los mayores niveles de TGL, glucosa, insulina y HOMA-IR (p<0.01) y WBCa mayores que WNCa (p<0.01). Al comparar O con W se observó en O mayor depósito graso y menor % de proteínas para una misma dieta experimental, menor niveles de marcadores bioquímicos y mayores niveles de glucosa, insulina, TGL y HOMA-IR. La BGP guardó una relación inversa con dichos parámetros y directa con CTX. Conclusiones: Durante el período de crecimiento, la baja ICa o relación Ca/P dietaria modularía el PC, induciendo cambios en la composición corporal. La masa grasa no sería beneficiosa para la salud ósea. La BGP se asocia negativamente a la glucosa en ayunas y resistencia a la insulina; la deficiente ingesta de Ca induce cambios más negativos.

Abstract:
The aim of the present study was to compare absorption and retention of Ca, changes in body composition and in different parameters of energetic metabolism during growth. Spontaneously obese (IIMb/β) (O) and Wistar (W) rats were mated; the dams fed an isocaloric diet with different Ca concentrations: High (ACa: 0.9%), Normal (NCa: 0.5%) and Low (BCa: 0.2%). Male pups continued receiving mother´s diet until 60 years of age (ACa, NCa and BCa). Body weight of O groups was inversely related to dietary Ca content, with no differences in water %; body protein % was lower in OBCa (p<0.01). The ACa% was inversely related to dietary Ca content, while fat % did not changed. OBCa presented the highest triglycerides and fasting glucose and insulin levels, and HOMA-IR (p<0.01), the lowest body Ca and P content, total body BMC and, tibial and spinal BMD (p<0.01). OACa showed similar body Ca% but lower total body BMC and, tibial and spinal BMD than ONCa (p<0.01). AWCa showed the highest fat% (p<0.01). WBCa and WACa presented lower protein and ashes % than WNCa (p<0.01). WACa showed the highest levels of triglycerides, glucose, insulin and HOMA-IR (p<0.01). Comparing O and W, the O groups showed a higher fat store and a lower protein %, a lower bone turnover and higher glucose, insulin and HOMA-IR levels for a same experimental diet. BGP levels presented an inverse relationship with these biochemical parameters, and a direct relationship with CTX. Conclusions: During the growth period, the low Ca intake or dietary Ca/P relationship could modulate the body weight, inducing changes in body composition. The fat mass would not be beneficial for bone health. BGP levels are negatively associated to glucose and insulin resistance levels and the low Ca intake increase this negative effect.

Cámara, María de los Milagros. "Avances en el estudio de la Adenilato Quinasa Nuclear de Trypanosoma cruzi" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Trypanosoma cruzi, el agente etiológico del Mal de Chagas es un eucariota inferior en donde el control de la expresión génica recae mayormente en mecanismos postraduccionales. Durante todo su ciclo de vida se observan fluctuaciones en la expresión génica. En la presente tesis se realizó el estudio de una adenilato quinasa nuclear (TcADKn) que se encuentra involucrada en la biogénesis ribosomal. Las adenilato quinasas nucleares han sido descriptas en muy pocos organismos, se las ha asociado al metabolismo del ARN, pero su función en el núcleo todavía es incierta. Todas las isoformas descriptas son esenciales para la viabilidad celular. La función de TcADKn es llevar a cabo el procesamiento del 18S, en el sitio D en el citoplasma, vía interacción directa con la proteina ribosomal S14 (Rps14). Establecimos la presencia de una señal de localización nuclear atípica en su extremo amino terminal, que involucraría la región del sitio activo. Además identificamos una posible señal de exportación nuclear hacia el carboxilo terminal de la proteína. Por otra parte determinamos que su localización nuclear es dependiente de la transcripción activa del ARN ribosomal, el ensamblado correcto de los ribosomas, la integridad del ADN, los niveles de nutrientes en el medio y posiblemente involucre a la vía TOR (“Target of Rapamycin”). Además detectamos que los niveles de TcADKn disminuyen a lo largo de la curva de crecimiento de epimastigotes en cultivo, pudimos determinar que las secuencias responsables de dicha regulación se encontrarían en su 3’ UTR y probablemente exista un mecanismo de autorregulación de la expresión de TcADKn. Finalmente se comenzó con el estudio del locus ribosomal de T. cruzi tanto a nivel de su secuencia como así también en cuanto a la biogénesis ribosomal identificándose los sitios de procesamiento del ribosoma.

Abstract:
Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, is an early divergent eukaryote in which the control of gene expression relies mainly in post-transcriptional mechanisms. Translation process is globally up and down regulated during the transition between proliferating and non-proliferating life-cycle stages. In this thesis we report the presence of a nuclear isoform of adenylate kinase (TcADKn) which is involved in ribosome biogenesis. Nuclear adenylate kinases have been recently described in a few organisms; however their role in nuclear and ribosomal processes is still unclear. Depending on ribosomal RNA transcription and assembly, TcADKn is located in the nucleolus or cytoplasm. Nuclear transport and the signals that determine this process were also identified for the first time. A non-canonical nuclear localization signal was mapped towards the N-terminal of the protein, being the phosphate-binding loop of the catalytic site essential for its localization. Nucleolar localization presented a nutrient availability, oxidative stress and probably by the equivalent in T. cruzi of the mammalian TOR pathway regulation. TcADKn is involved in ribosomal 18S RNA processing which involves its interaction with the ribosomal protein S14 (Rps14). Furthermore, TcADKn expression is regulated by its 3’ UTR. Finally we started with the study of T. cruzi ribosomal locus, at a sequence and biogenesis level.

Pozo Devoto, Victorio Martín. "Estudio bioquímico y estructural de la muerte celular propia del desarrollo y la inducida por un evento hipóxico en el SNC durante el desarrollo" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los eventos de hipoxia tienen consecuencias nocivas que se manifiestan de múltiples formas en el SNC durante el desarrollo. El presente estudio analiza los daños generados en el tectum óptico por una hipoxia aguda normobárica sobre embriones de aves. Encontramos que tanto la vulnerabilidad diferencial como el retraso temporal de la muerte celular son dos fenómenos producto del evento hipóxico. Dicho daño se caracteriza por ser independiente de aferencias de la retina y por presentar una muerte celular mediada por la vía apoptótica intrínseca. Esto fue determinado ultraestructuralmente y bioquimicamente mediante la inmunomarcación de proteínas involucradas en la cascada apoptótica. Por otro lado, se determinó que la muerte celular propia del desarrollo presenta un perfil morfológico y bioquímico apoptótico similar al observado en condiciones de hipoxia. Frente a la evidente semejanza entre estos dos procesos de muerte postulamos que la hipoxia en nuestro modelo genera un desequilibrio transitorio en la homeostasis del tectum óptico, incrementando la muerte celular propia del desarrollo. Además, observamos una disminución transitoria en la actividad de la vía de supervivencia PI3K/Akt durante el evento hipóxico. Los resultados preliminares derivados de la administración de drogas que logran estimular esta vía de supervivencia en cultivos de embriones ex ovo, sugieren un rol ejecutor de esta vía en la muerte hipóxica. Por último, hemos determinado que la administración de estradiol posterior al evento hipóxico presenta efectos neuroprotectores a través de la unión a receptores y posiblemente mediante acciones no genómicas a través de PI3K/Akt.

Abstract:
Hypoxic insults during CNS development have multiple deleterious outcomes. In the present thesis, we analize the cell death evolution in the chick optic tectum layers after an acute normobaric hypoxia, showing two important features: differential vulnerability of optic tectum layers and delayed neuronal death. Our results show that hypoxic cell death is independent of retinal inputs and we found that this cell death is mediated by the apoptotic intrinsic pathway. This was determined by ultrastructural analysis and immunofluorescence against apoptotic pathway proteins. With minor differences, developmental cell death itself presents a morphological and biochemical apoptotic profile. The similarity between these two cell death processes lead us to postulate that hypoxia generates a temporary imbalance in the homeostasis of the optic tectum, increasing developmental cell death. In addition, we observed a transient decrease in the activity of the PI3K/Akt survival pathway during the hypoxic event, suggesting an important role as executor of hypoxic cell death. This is supported by the results obtained from the administration of drugs in a model of cultured ex ovo embryos, where the stimulation of pAkt levels reverts the hipoxic cell death. Finally, we have determined that administration of estradiol after the hypoxic event exerts neuroprotective effects through estrogen-estrogen receptor interaction and possibly through nongenomic actions via PI3K/Akt pathway.

Jungblut, Lucas David. "El sistema olfatorio y vomeronasal en larvas de anfibios anuros y su participación en la detección de estímulos químicos en el ambiente" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La mayoría de los tetrápodos poseen dos órganos quimiosensoriales nasales: el epitelio olfatorio (EO) y el órgano vomeronasal (OVN). Ambos sistemas sensoriales, olfatorio (SO) y vomeronasal (SVN), presentan diferencias morfológicas, bioquímicas y moleculares lo que indica que participan en procesos fisiológicos diferentes. Usualmente se asocia al SVN con la detección de feromonas, mientras que el SO participaría en la detección de “olores comunes” no vinculados a la comunicación intraespecífica. Sin embargo, varias evidencias contradicen esta hipótesis y actualmente no está claro cuáles serían las funciones diferenciales de ambos sistemas sensoriales, o qué tipo de estímulos son detectados en cada uno de ellos. Más aún, inclusive el propio origen de este sistema “dual” de quimiodetección, durante la evolución de los vertebrados, presenta algunas controversias. Generalmente se interpreta que el SVN apareció en tetrápodos como consecuencia de la adaptación al ambiente terrestre. Sin embargo, las evidencias moleculares y morfológicas actuales sugieren que tanto el SO como el SVN aparecieron tempranamente en la filogenia de los vertebrados, probablemente en un ancestro común acuático de los tetrápodos; aunque nada se sabe de la funcionalidad del SVN en este ambiente. En este contexto, los anfibios constituyen un grupo sumamente interesante para el estudio de los sistemas quimiosensoriales en tetrápodos ya que poseen una etapa larval acuática. Las pocas especies estudiadas hasta la actualidad sugieren que las larvas de anuros poseen tanto SO como SVN, pero nunca se ha realizado un análisis comparado abarcando un número considerable de especies. Por otra parte, los renacuajos presentan un repertorio muy variado de comportamientos mediados por detección de claves químicas, como: detección de comida, predadores, señales de alarma liberadas por coespecíficos, etc. Curiosamente, nada se sabe de la participación de los distintos sistemas quimiosensoriales en la detección de estos estímulos. En la presente tesis se analizaron larvas de catorce especies de anuros, en las cuales se demuestra que, tanto el SO como el SVN, se desarrollan tempranamente y están presentes durante toda la etapa larval. Las características morfológicas, histológicas y bioquímicas observadas en varias de estas especies, sugieren que un grado importante de maduración, se alcanza en ambos sistemas sensoriales durante la etapa larval. Las neuronas del EO y el OVN expresan marcadores específicos descriptos en neuronas quimiosensoriales de otros vertebrados. Además, sus axones proyectan a zonas específicas de telencéfalo: el bulbo olfatorio principal y accesorio, respectivamente, donde establecen conexiones sinápticas. Estas características nos hacen suponer que ambos sistemas sensoriales son funcionales en renacuajos. Finalmente, se ha caracterizado, en larvas del sapo común Rhinella arenarum, las respuestas comportamentales a dos tipos de estímulos diferentes mediados por detección de claves químicas. Por un lado, la detección de estímulos que indican la presencia de una fuente de alimento, y por otro, la detección de señales de alarma liberadas por otros renacuajos, un fenómeno de comunicación social conocido en larvas de otras especies de anuros. Ambos estímulos parecen estar mediados por el SO en R. arenarum, ya que las larvas con OVN ablacionado responden igual que los controles, mientras que si se ablaciona el EO las respuestas comportamentales a ambos estímulos desaparecen. Además, los análisis cuantitativos de activación neuronal mostraron que el número de neuronas sensoriales activadas aumenta en el EO luego de la exposición a ambos estímulos, mientras que en el OVN no varía respecto a los controles.

Abstract:
Most tetrapods have two nasal chemosensory organs: the olfactory epithelium (OE) and the vomeronasal organ (VNO). Both sensory systems, olfactory (OS) and vomeronasal (VNS), are morphologically, biochemically and molecularly different, indicating that they are involved in different physiological processes. The VNS is usually associated with pheromone detection, while the OS would detect “common odours”, which may not be involved in intraspecific communication. This hypothesis, however, has been contradicted by several data, and it is not clear, at this time, which would the relative functions of the OS and the VNS or what kinds of stimuli are detected by each sensory system. Moreover, even the evolutionary origin of this “dual” chemosensory system during vertebrates’ evolution is still controversial. It is generally believed that the VNS arose in tetrapods as an adaptation to terrestrial environment. However, the current molecular and morphological evidence, suggest that both OS and VNS appeared early in vertebrate evolution, probably in a common aquatic ancestor of tetrapods, but nothing is known about the functionality of VNS in aquatic environment. In this context, amphibians represent an extremely interesting group to study chemosensory systems among tetrapods, as they have an aquatic larval stage. The few species analysed to the present suggest that anuran larvae have both an OS and a VNS, but a comparative analysis involving a considerable number of species has never been carried out. By the other hand, tadpoles show a diverse repertoire of chemodetection mediated behaviors, such as food detection, predators’ recognition, alarm signals released by conspecifics, etc. Curiously, nothing is known about the involvement of the different chemosensory systems in detecting these stimuli. In this thesis, the analysis of 14 different anuran larvae species demonstrates that both, the OS and the SVN, are early developed in anurans, and both sensory system are present throughout the entire larval stage. The morphological, histological and biochemical characteristics founded in many of these species, suggest that a significant level of maturity is reached in both sensory systems during the larval stage of anurans. Chemosensory neurons of the EO and the VNO express specific markers described in chemosensory neurons of other vertebrates. Moreover, axons from olfactory and vomeronasal chemosensory neurons project to specific areas in the telencephalon: the main and accessory olfactory bulb, respectively, where they establish synaptic connections. These features led us to speculate that both sensory systems are functional in tadpoles. Finally, the behavioural responses to two different stimuli, mediated by chemical cues detection, has been characterized in larvae of the common toad Rhinella arenarum: First, the chemodetection of cues that indicate the presence of a food source. And second, the chemodetection of alarm signals released by other tadpoles, a social communication phenomenon widely known in other anuran larvae species. Both stimuli appear to be mediated by the OS in R. arenarum as larvae without VNO responded equally to the control animals, while if the EO is removed the behavioural responses to both stimuli was not observed. In addition, the quantitative analyses of activated neurons shows that the number of chemosensory neurons activated increases in the EO after exposure to both stimuli, while there is no detectable variation in the VNO compared to control animals.

Bertucci, Paola Yanina. "Efectos del receptor de progesterona sobre la elongación transcripcional del gen bcl-x humano" (2012-08-06) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los Receptores de Esteroides (SRs) regulan la expresión génica mediante su interacción con Elementos de Respueta a Hormona (HREs) ubicados en las regiones promotoras de sus genes blanco. Según el modelo clásico de activación transcripcional, los SRs reclutan complejos que relajan el estado de la cromatina favoreciendo, así, los pasos tempranos de la transcripción. Sin embargo, a partir del uso de la técnica de inmunoprecipitacion de cromatina seguida de secuenciación masiva (ChIP-seq), se encontró que una gran parte de los sitios de unión de los SRs al ADN se encuentra ubicada en regiones intragénicas. Adicionalmente, algunos de los complejos modificadores de la cromatina asociados a los efectos de los SRs en las regiones promotoras de sus genes blanco, también fueron encontraron favoreciendo la elongación transcripcional a lo largo de las regiones transcribibles. El objetivo de esta tesis es estudiar el posible efecto de los SRs unidos a las regiones intragénicas sobre la elongación de la Pol II en genes endógenos. Para ésto se utilizaron células humanas T47D tratadas con el progestágeno sintético R5020 y al gen bcl-x como modelo de estudio. Los resultados mostraron que el Receptor de Progesterona (PR) se recluta únicamente a sitios intragénicos, conjuntamente con las histonas acetiltransferasas CBP y GCN5 y el factor positivo de elongación P-TEFb. El reclutamiento de estos factores correlaciona con un aumento en la acetilación de las histonas, el desplazamiento parcial de los nucleosomas, un aumento en la abundancia de la Pol II principalmente en el extremo 3´del gen y una mayor procesividad de la Pol II a lo largo del mismo. En su conjunto los resultados presentados en este trabajo sugieren que la modulación de elongación de la Pol II en bcl-x humano supondría un nuevo mecanismo de regulación de la expresión génica mediada por el PR.

Abstract:
Steroid Receptors (SRs) regulate gene expression througth their interaction with the Hormone Response Elements (HREs) located in the promoter regions of their target genes. The classical mechanism of SR transcriptional activation explains that the SRs recruit modifying complexes to these regions, which in turn open the target chromatin thus, favoring the first steps of gene transcription. However, recently developed genome wide technologies, as ChIP-seq, revealed that a main part of SRs binding sites are located in intragenic regions. Additionaly, some chromatin modifying complexes classically found in the promoter regions of the SRs target genes were also found favoring the elongation process. In this sense, it was propossed that changes in the chromatin context in intragenic regions would affect Pol II elongation. The aim of this thesis is to analyze the putative effect of the SRs bound to their intragenic sites on Pol II elongation in hormone-regulated endogenous genes. To tackle this, we used T47D human breast cancer cell line treated with the synthetic progestin R5020 and bcl-x as a gene model. The results showed that, after the progestin addition, the Progesterone Receptor (PR) is recruited together with the acetyltransferases CBP and GCN5 and with the elongation factor PTEFb to different binding sites distributed along the intragenic region of bcl-x gene. The recruitment of these factors correlates with an increase of histone acetylation levels, the pantial decrease in nucleosome occupancy and the improvement of Pol II processivity along this gene. All together, these results suggest a new mechanism which involves the PR control of endogenous Pol II elongation.

Binaghi, María. "Rol de la fosforilación en la regulación funcional de la proteína de movimiento TGBp1 del potato virus X" (2012-08-21) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas perteneciente al género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para el movimiento viral célula a célula en la planta hospedera. Se ha demostrado que esta MP es fosforilada en los residuos T193 y T214 por una quinasa tipo CK2. Diferentes líneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puede regular la replicación y el movimiento viral. El objetivo de este trabajo fue estudiar el rol de la fosforilación en la regulación funcional de la proteína de movimiento TGBp1 de PVX y en su interacción con la proteína de plantas remorina (REM). Para ello se construyeron por mutagénesis dirigida versiones de TGBp1 no fosforilables (T193A y T214A) y otras que simulan la fosforilación (T193D y T214D). En ensayos de transcomplementación de la movilización célula a célula de un virus defectivo para dicha función, se demostró que las modificaciones en ambas treoninas resultan perjudiciales en la complementación del movimiento viral. Se determinó que la fosforilación de TGBp1 en la T193 regula la estabilidad de esta proteína viral por medio de un mecanismo que involucra la presencia de una secuencia de degradación tipo PEST en el extremo C-terminal de dicha proteína. A través de la combinación de estudios que involucran el análisis comparativo in silico de varias TGBp1s de virus de los géneros Alpha y Betaflexiviridae y de estudios por mutagénesis dirigida, se determinó que la T193 y la secuencia PEST C-terminal se encuentran conservadas en todas las TGBp1s analizadas, sugiriendo que la fosforilación en la T193 de estas MPs sería un mecanismo regulatorio de la estabilidad de dichas proteínas. Por otra parte, el análisis funcional de las fosfomutantes T193 y T214 de TGBp1 determinó que la fosforilación en dichos residuos afecta negativamente la actividad supresora del PTGS de TGBp1. Los ensayos de interacción entre TGBp1 de PVX y la proteína REM determinaron que tanto el dominio N- como el C-terminal de TGBp1 son necesarios para la interacción y que la misma no es regulada por fosforilación en los residuos T193 y T214 de TGBp1. Por otro lado, este trabajo presenta las primeras evidencias que la interacción entre distintas proteínas TGBp1s y REM se encontraría conservada entre los virus que utilizan estrategias de movilización del tipo Triple Bloque de Genes (TGB). Los análisis realizados para determinar el efecto biológico de REM sobre la TGBp1 de PVX demostraron que la proteína REM no interfiere en la actividad del PTGS de esta proteína viral. Finalmente estudios de localización subcelular determinaron que la localización subcelular de TGBp1 es influenciada por la presencia de las otras proteínas virales y que a su vez varía según si la proteína se encuentra fusionada en su extremo N- o C- terminal a GFP.

Abstract:
Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome is based on a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movement proteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capsid protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside the host plant. Previously it has been demonstrated that TGBp1 is phosphorylated by a CK2-like kinase in T193A and T214 residues. Recent works on other plant viruses have indicated that viral protein phosphorylation by host kinases can regulate processes such us viral replication and mobilization. The aim of this work is to evaluate the role of phosphorylation in regulating the functional activities of the movement protein TGBp1 of PVX and its interaction with the protein Remorin (REM). For this aim different TGBp1 mutants have been developed by direct mutagenesis where the identified threonines have been replaced by alanine (T193A and T214A) or aspartate (T193D and T214D) residues. The virus movement function of the phosphomutants was assessed by complementation of PVX cell-to-cell movement in trans. It was shown that all mutants were non-functional for virus movement, and that phosphorylation of T193 is essential for stability of the MP by a degradation mechanism that involves a PEST sequence at the C-terminus of TGBp1. Several experimental approaches involving sequence comparison among TGBp1 homologues from viruses belonging to the Alpha and Betaflexiviridae genera and direct mutagenesis show that the T193 residue and the PEST sequence are conserved among all TGBp1 analyzed, suggesting that phosphorylation of T193 in these MPs could be a mechanism by which protein stability is regulated in several viruses. The results obtained in this work also have shown that phosphorylation of T193 and T214 of TGBp1 negatively affects the PTGS suppression activity of this MP. Two-hybrid assays and pull down experiments demonstrated that the N- and C-term domain of TGBp1 are involved in the interaction between PVX TGBp1 and REM and that this interaction is not regulated by TGBp1 phosphorylation. In addition, this work presents the first evidence that the interaction between REM and other TGBp1s could be a conserved mechanism used by different TGB-containing viruses. The studies conducted to determine the biological effect of REM on TGBp1 from PVX showed that REM protein does not interfere with PTGS- suppressing activity of TGBp1. Finally, sub-cellular localization studies demonstrated that TGBp1 localization is influenced by the presence of other viral proteins and by the use of N- or C-terminal GFP fusion proteins.

Molinari, Ana Julia. "Captura neutrónica en boro (BNCT) para el tratamiento del cáncer bucal: desarrollo de nuevas modalidades de BNCT, evaluación de su radiobiología, eficacia terapéutica y potencial radiotoxicidad en un modelo de hámster" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Captura Neutrónica en Boro (BNCT) es una terapia binaria que se basa en la acumulación selectiva de compuestos borados dentro del tumor y la subsiguiente irradiación con neutrones térmicos. La reacción de captura que se produce entre el 10B y los neutrones genera partículas letales de corto alcance que dañan el tumor sin causar daño significativo al tejido normal. Previamente en nuestro laboratorio se reportó el éxito terapéutico de una única aplicación de BNCT mediada por los compuestos borados borofenilalanina (BPA), decahidrodecaborato de sodio (GB-10) o la administración combinada de ambos, para el tratamiento del cáncer bucal en un modelo de hámster. Si bien los resultados en términos de eficacia terapéutica fueron muy buenos, pueden ser mejorados. En este trabajo de tesis, buscamos optimizar la terapia de BNCT potenciando el control tumoral y minimizando su radiotoxicidad. Para ello desarrollamos una nueva modalidad terapéutica denominada BNCT secuencial (BPA-BNCT seguido de GB-10-BNCT luego de 24 ó 48 horas), establecimos un método para inducir la normalización de los vasos sanguíneos tumorales (con talidomida) y evaluamos el efecto de esta normalización en la eficacia terapéutica del BNCT mediado por BPA. Complementariamente estudiamos la combinación de ambas modalidades (normalización con talidomida y BNCT secuencial). Asimismo, realizamos un análisis exhaustivo de los posibles cambios en la microdistribución de los compuestos borados por autorradiografía neutrónica. En el presente estudio demostramos que el BNCT secuencial mejora el control del cáncer bucal, que el tratamiento previo con talidomida aumenta la eficacia terapéutica del BNCT mediado por BPA a través de la normalización de los vasos sanguíneos aberrantes del tumor, y que con el tratamiento con talidomida previo al BNCT secuencial se alcanza una respuesta tumoral total (respuesta completa + parcial) del 100% de los tumores. Además, en todos los casos se redujo la radiotoxicidad en el tejido precanceroso circundante al tumor.

Abstract:
Boron Neutron Capture Therapy (BNCT) is based on targeting of tumor cells with boron compounds followed by irradiation with thermal neutrons. The capture reaction that occurs between the 10B and the neutrons generates short-range lethal particles that destroy the tumor cells but spare normal tissue. We previously reported the therapeutic success of a single application of BNCT mediated by boronophenylalanine (BPA), decahydrodecaborate (GB-10) or by the combined administration of BPA and GB-10, for the treatment of oral cancer in the hamster cheek pouch experimental model. These previous BNCT studies showed marked therapeutic efficacy but left room for improvement. In this thesis, we explored the way to improve the therapeutic effect without causing unacceptable toxicity in normal or dose-limiting precancerous tissue. Here we developed a novel approach to BNCT termed Sequential BNCT based on the sequential application of BPA-BNCT followed by GB-10-BNCT with an interval of 24 or 48 h between the two treatments. We developed a technique to normalize aberrant blood vessels with thalidomide and assessed its effect prior to the administration of BPA on the therapeutic efficacy of BNCT. As a third new protocol we studied the combination of both modalities, thalidomide treatment prior to Sequential BNCT. Additionally, we performed an autoradiography analysis to explore potential changes in boron microdistribution and content that are not detectable by gross boron measurements. We can conclude based on the observations reported in this thesis that Sequential BNCT enhanced tumor response, that the pretreatment with thalidomide prior to BNCT mediated by BPA was therapeutically beneficial, and that tumor blood vessel normalization before Sequential BNCT controlled the entire population of tumors. For all the new protocols, no extra cost in terms of mucositis in the dose-limiting precancerous tissue was observed.

Lelli, Sandra Marcela. "Cómo se altera el metabolismo y transporte de glucosa en porfiria experimental crónica y aguda. Una aproximación mecanística" (2013-02-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Este trabajo de Tesis fue realizado utilizando ratas Wistar como animales de experimentación y drogas tales como el hexaclorobenceno para inducir una porfiria crónica, y la 2-alil-2-isopropilacetamida junto con el 3´,5´-dietoxicarbonil-1,4- dihidrocolidina, para modelar una porfiria aguda. Se logró así relacionar ambas patologías modeladas con importantes alteraciones en diversos aspectos del metabolismo de los hidratos de carbono (rutas anabólicas y catabólicas del glucógeno, de la glucosa y su transporte), del metabolismo oxidativo (que lleva a la producción de especies reactivas de oxígeno, ROS), del triptófano (TRP) y de los glucocorticoides (GC) (niveles, síntesis y receptores), todos ellos campos que han sido muy poco estudiados en las porfirias. Se establecen además inter-relaciones e inter-regulaciones metabólicas y hormonales entre el metabolismo del hemo (que es donde las fallas generan la porfiria), los metabolismos recién mencionados, el de los GC y la insulina, con particular atención en la actividad de la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (PEPCK), enzima regulatoria clave de la gluconeogénesis. Así los disturbios hormonales y metabólicos encontrados en los modelos tanto de porfiria crónica como aguda, confluyen y dan cuenta de un descenso en la disponibilidad de glucosa en el hepatocito que modularía la porfiria, exacerbando la enzima regulatoria del camino del hemo, ALA-sintetasa. Por otro lado sustentarían el porqué del efecto benéfico de la administración de glucosa en la terapia de las porfirias, especialmente de la porfiria aguda, que es la más crítica y provoca un riesgo de vida. Asimismo, es de destacar el efecto benéfico de la melatonina, reportado en el presente trabajo, en los tres metabolismos investigados para la porfiria aguda. Así como la importante disrupción hormonal que se reporta a nivel de los GC tanto a nivel plasmático como en su síntesis adrenal y receptores hepáticos en el modelo crónico de porfiria cutanea tarda. También es mencionable la contribución de las ROS, TRP y GC al descenso de la PEPCK. Los resultados de esta Tesis tienen implicancias en el campo de la toxicología, medicina y de la química biológica.

Abstract:
This Thesis work was performed using Wistar rats as experimental animals and drugs such as hexachlorobenzene to induce chronic porphyria, and 2-allyl-2- isopropylacetamide combined with 3',5'-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine to model acute porphyria. Thus, both modeled pathologies were related with significant alterations in several aspects of carbohydrates metabolism (catabolic and anabolic pathways of glycogen, glucose and its transport), of oxidative metabolism (which leads to production of reactive oxygen species, ROS), of tryptophan (TRP) and glucocorticoids (GC) (levels, synthesis and receptor), all fields that have been very poorly studied in porphyrias. In addition, metabolic and hormonal inter-relations and inter-regulations were established between heme metabolism (where defects generate porphyria), the metabolisms above mentioned, that of GC and insulin, with particular attention on phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) activity, key regulatory enzyme of gluconeogenesis. Thus, hormonal and metabolic disturbances found in experimental models of both chronic and acute porphyria, converge and account for a decrease in the availability of glucose in the hepatocyte that would modulate the porphyria, exacerbating the regulatory enzyme of heme pathway, ALA-synthase. Furthermore they could explain why the beneficial effect of the glucose administration in the therapy of porphyrias, especially of acute porphyria, which is the most dangerous since it is a life-threatening disease. It is also noteworthy the beneficial effect of melatonin, observed in three metabolisms investigated in acute porphyria, here reported. Just as the important hormonal disruption found at the level of GC, both in plasma as well as in the adrenal synthesis and hepatic receptors in chronic model of porphyria cutanea tarda. Also worth of mentioning is the contribution of ROS, TRP and GC to the PEPCK decrease. The results of this Thesis have implications in fields of toxicology, medicine and biological chemistry.

Gambino, Yésica Paola. "Regulación de la expresión génica de leptina por estradiol en células placentarias" (2013-03-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La placenta produce un amplio número de moléculas esenciales para el establecimiento y el mantenimiento del embarazo. En este contexto, la leptina presenta un papel importante en la reproducción. La leptina es una proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, y fue descripta originalmente como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo a nivel central. Sin embargo, se ha sugerido que esta proteína presenta otras funciones durante la gestación, particularmente en la placenta, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. La síntesis de leptina en células trofoblásticas está modulada por diferentes agentes endógenos, pero aún no se comprende totalmente cómo se regula su expresión génica. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β-estradiol (E2) sobre la expresión de leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales: la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas humanas a término. Se ha observado la estimulación de la expresión de leptina endógena en respuesta a E2, a través de ensayos de Western blot y qRT-PCR. Este efecto fue dosis y tiempo dependiente e involucraría a los receptores de estrógenos, ya que el antagonista ICI 182,780 inhibió la acción del E2. Además, experimentos de transfección transitoria mostraron que el tratamiento con E2 aumentó la actividad transcripcional del promotor de leptina, y la región promotora comprendida entre -1951 pb y -1847 pb sería necesaria y suficiente para observar los efectos del E2. La acción de E2 también involucraría receptores de membrana, ya que la incubación con este esteroide promovió la fosforilación de MEK, ERK 1/2 y AKT en explantos placentarios. Apoyando esta hipótesis, el análogo E-BSA, que no atraviesa la membrana plasmática, indujo la expresión de leptina en ambos modelos experimentales, y activó rápidamente las vías de señalización de las MAPKs y PI3K. Los efectos del E2 y del E-BSA fueron bloqueados por inhibidores farmacológicos de las vías MAPKs y PI3K así como también a través de la expresión de mutantes dominantes negativas de MEK, ERK 1/2 y AKT, sugiriendo que estas cascadas de señalización estarían involucradas en la regulación de la expresión de leptina. Por otro lado, se ha demostrado la presencia del receptor de estrógenos alfa (ERα) en el núcleo y en la membrana plasmática de las células BeWo. Esta proteína podría mediar los efectos genómicos y no genómicos del E2. Apoyando esta idea, la sobreexpresión de ER potenció los efectos del E2, mientras que la disminución de los niveles de ERα a través de un ARN de interferencia específico disminuyó los efectos del E2 y del E-BSA sobre la expresión de leptina. El análisis in silico del promotor de leptina mostró posibles sitios ERE y half ERE para la unión de receptores ER, además de distintas secuencias que podrían interactuar con los factores de transcripción AP-1, CREB, NFκB y Sp1. La expresión de isoformas wild type o mutantes dominantes negativas de estas proteínas mostraron una posible interacción entre ellas y los ERs, la cual podría estar implicada en la regulación de la expresión de leptina placentaria. En conclusión, este trabajo demuestra que el E2 induce la expresión de leptina en células trofoblásticas a través de acciones genómicas y no genómicas, donde participan receptores de estrógenos de membrana y nucleares, distintos factores de transcripción y diferentes vías de transducción de señales. Estos mecanismos pueden estar desregulados en distintas patologías del embarazo.

Abstract:
The placenta produces a wide number of molecules that play essential roles in the establishment and maintenance of pregnancy. In this context, leptin has emerged as an important player in reproduction. Leptin, the 16,000 MW protein product of the LEP gene, was originally described as an adipocyte-derived signaling molecule for the central control of metabolism. However, it has been suggested that leptin is involved in other functions during pregnancy, particularly in the placenta, where it was found to be expressed. The synthesis of leptin in trophoblastic cells is regulated by different endogenous biochemical agents, but the regulation of placental leptin expression is still poorly understood. In the present work, we analyzed the effect of 17β-estradiol (E2) on leptin expression in human placenta using two experimental models: BeWo choriocarcinoma cells and human placental explants. We have found a stimulatory effect of E2 on endogenous leptin expression, which was analyzed by Western blot and qRT-PCR. This effect was time and dose dependent and involved estrogen receptors, as the antagonist ICI 182 780 inhibited E2-induced leptin expression. Moreover, transient transfection experiments showed that E2 treatment enhances leptin promoter activity, and a minimal promoter region between -1951 and -1847 bp is both necessary and sufficient to achieve E2 effects. E2 action probably involves membrane receptors too, since treatment with E2 promoted MEK, ERK 1/2 and AKT phosphorylation in placental explants. Supporting this hypothesis, the membrane-constrained E2 conjugate, E-BSA, induced leptin expression in both experimental models, and rapidly activated different MAPKs and PI3K pathways. The effects of E2 and E-BSA could be blocked by pharmacologic inhibition of these signaling pathways or through the expression of dominant negative mutants of MEK, ERK 1/2 or AKT, suggesting that those signaling pathways are involved in the regulation of leptin expression. On the other hand, we demonstrated the presence of estrogen receptor alpha (ERα) in the nucleus and its association to the plasma membrane of BeWo cells. We showed that E2 genomic and nongenomic actions could be mediated by ERα Supporting this idea, the over-expression of ERα potentiated the effects of E2, while the downregulation of ERα level through a specific siRNA, decreased E2 and E-BSA effects on leptin expression. In silico analysis of a region of the leptin promoter revealed potential consensus ERE and half ERE sites for ER and also elements for different transcription factors such as AP-1, CREB, NFκB and Sp1. The expression of wild type or dominant negative mutant isoforms of these proteins demonstrated a possible interaction between them and ERs, which could be implicated in the regulation of placental leptin expression. In conclusion, we provide evidence demonstrating that E2 induces leptin expression in trophoblastic cells through genomic and nongenomic actions, involving crosstalk between membrane and nuclear estrogen receptors, transcription factors and different signal transduction pathways. These mechanisms could be dysregulated in pathological pregnancies.

Gutiérrez, María Laura. "Regulación del receptor GABA A inducida por su activación en corteza cerebral de rata" (2013-03-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La activación del receptor GABAA durante un breve período de tiempo (5-10 minutos) por GABA, en neuronas de corteza cerebral de rata, induce horas más tarde una reducción en la interacción entre los sitios de unión de GABA y benzodiacepinas, llamada desacoplamiento, en ausencia de cambios en el número de receptores. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el mecanismo molecular del desacoplamiento inducido por GABA. Nuestros resultados sugieren que el desacoplamiento inducido por GABA está asociado a una reducción en el porcentaje de receptores GABAA conteniendo la subunidad α3. Por otro lado, los resultados de nuestros experimentos indicarían que el desacoplamiento está también mediado por un aumento en el grado de fosforilación de la subunidad γ2 del receptor. Por lo tanto, el desacoplamiento sería el resultado de al menos dos mecanismos regulatorios que actuando en forma conjunta producen una alteración adaptativa en la función del receptor GABAA. Si bien no se conocen las vías de señalización intracelulares activadas, es posible que un aumento en la internalización del receptor GABAA inducido por GABA represente la señal que desencadenaría los procesos responsables del desacoplamiento.

Abstract:
GABAA receptor activation during a brief period of time (5-10 minutes) by GABA, in rat cerebral cortical neurons, induces hours later a reduction in the interaction between GABA and benzodiazepine binding sites, named uncoupling, in the absence of changes in receptor number. The aim of the present work was to study the molecular mechanism of GABA-induced uncoupling. Our results suggest that GABA-induced uncoupling is associated with a reduction in the percentage of α3-containing GABAA receptors. On the other hand, results from our experiments might indicate that uncoupling is also mediated by an enhancement in the phosphorylation degree of γ2 receptor subunit. In conclusion, uncoupling would be the result of at least two regulatory mechanisms that act together to produce an adaptive alteration of the GABAA receptor function. The intracellular signaling pathways are unknown, however, a GABA-induced increase in GABAA receptor internalization could provide a signal that triggers the processes responsible for uncoupling.

Portal, Patricio. "Citocromo P450 reductasas y metabolismo redox en Trypanosoma cruzi" (2013-03-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La citocromo P450 reductasa (CPR) es una flavoproteína que coordina la transferencia de electrones desde el NADPH hacia distintas hemoproteínas, como los citocromo P450 (CYPs), el citocromo b5, y la hemooxigenasa. Los CYPs se encuentran involucrados tanto en la síntesis de compuestos endógenos, tales como esteroles y ácidos grasos, como en la activación y detoxificación de compuestos exógenos. Pese a que existen numerosos genes CYP funcionales en mamíferos, existe sólo una CPR en cada especie. La producción de una clase especial de esteroles, entre los que se incluyen el ergosterol y otros metil-esteroles, es una importante vía metabólica involucrada en el crecimiento y la viabilidad celular de microorganismos eucarióticos, como protozoos u hongos, que se encuentra ausente en mamíferos. En T. cruzi se han identificado y caracterizado bioquímicamente una familia de genes integrada por tres putativas CPRs, llamadas TcCPR-A, TcCPR-B y TcCPR-C, cuyas secuencias poseen los dominios conservados para FMN, FAD y NADPH. TcCPR-A carece del domino hidrofóbico amino terminal. La sobreexpresión de TcCPR-B en epimastigotes incrementa su resistencia a drogas, sugiriendo su participación en el metabolismo de detoxificación del parásito. En la búsqueda de un rol fisiológico para las TcCPRs, en el presente trabajo se analizó el efecto de la sobreexpresión de las mismas, centrándose principalmente en su posible participación en la biosíntesis de esteroles. Una cepa de Saccharomyces cerevisiae deficiente para CPR fue utilizada en ensayos de complementación con las TcCPRs recombinantes de T. cruzi. La baja tasa de crecimiento y la disminución de la resistencia al ketoconazole de la levadura mutante, lograron revertirse parcialmente sólo con TcCPR-B y -C. La sobreexpresión de TcCPR-A en células de epimastigotes resulta letal, produciendo un aumento del contenido de ADN, una morfología aberrante y numerosas alteraciones ultraestructurales. La sobreexpresión de TcCPRB y -C incrementó la biosíntesis de ergosterol y la relación NADP+/NADPH. Los parásitos transgénicos con mayor contenido de ergosterol presentaron un aumento en el orden de membrana, con la respectiva disminución de la endocitosis. Notablemente, TcCPR-B se ha encontrado en reservosomas mientras que TcCPR-C se ha localizado en el retículo endoplasmático. Los resultados obtenidos en esta Tesis junto al correspondiente análisis bibliográfico permiten proponer un rol para las TcCPRs en mecanismos de estrés (TcCPR-A), en reacciones de detoxificación (TcCPR-B) y en la biosíntesis de esteroles (TcCPR-C).

Abstract:
Cytochrome P450 reductase (CPR) is a flavoprotein that coordinates transfer of electrons from NADPH to various hemoproteins such as cytochrome P450 (CYPs), cytochrome b5, and heme oxygenase. CYPs are involved both in the synthesis of endogenous compounds, such as sterols and fatty acids, as in the activation and detoxification of exogenous compounds. Although there are numerous functional CYP genes in mammals, there is only one CPR in each species. Sterol production is an important metabolic pathway involved in cell growth and viability. Eukaryotic microorganisms such as protozoa and fungi produce a special class of sterols absent in mammals, including ergosterol and other methyl-sterols. It has been identified and biochemically characterized three putative CPRs in Trypanosoma cruzi, called TcCPR-A, TcCPR-B and TcCPR-C. These sequences have the characteristic conserved domains for FMN, FAD and NADPH. However TcCPR-A lacks the Nterminal hydrophobic domain. Overexpression of TcCPR-B epimastigotes of T. cruzi increased drug resistance, suggesting it involvement in detoxification metabolism of the parasite. In search for a physiological role of TcCPRs, function of these enzymes and the effect of overexpression were analyzed, focusing mainly on their possible involvement in sterol biosynthesis. A Saccharomyces cerevisiae mutant, CPR deficient strain, was used in complementation assays with recombinant TcCPRs. Only TcCPR-B and -C partially succeed to reverse low growth rate and decreased resistance to ketaconazole of the mutant. Overexpression of TcCPR-A is lethal in epimastigote cells, producing an increase in DNA content, aberrant morphology and numerous ultrastructural alterations. TcCPR-B and -C overexpression increased ergosterol biosynthesis and NADP+/NADPH ratio. Moreover, transgenic parasites present more ergosterol and higher membrane order, with a corresponding decrease in endocytosis. Notably, TcCPR-B was found in reservosomas, while TcCPR-C was located in the endoplasmic reticulum. Results obtained in this Thesis suggest a role for TcCPRs in stress mechanisms (TcCPR-A), in detoxification reactions (TcCPR-B) and in biosynthesis of sterols (TcCPR-C).

Risso, Guillermo Javier. "Regulación de la proteína quinasa Akt por conjugación a SUMO" (2013-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La proteína quinasa Akt está involucrada en una gran variedad de procesos celulares tales como supervivencia, crecimiento, proliferación, migración, angiogénesis, metabolismo, resistencia a estrés, entre otros. Durante el desarrollo de esta tesis doctoral descubrimos una nueva modificación post-traduccional para esta quinasa, la conjugación a SUMO. Realizando mutaciones puntuales pudimos mapear los sitios blanco de SUMOilation en esta proteína, los aminoácidos lisina 276 y 301. Una proteína doble mutante en K276R y K301R (2KR) mostró niveles disminuídos de SUMOilación. De modo interesante, la sobre-expresión de Akt1 2KR no aumenta, y hasta inhibe, los niveles de fosforilación de un patrón global de sustratos de Akt. En este sentido demostramos que la conjugación de SUMO a Akt es necesaria para la mayoría de los procesos estudiados en los que esta quinasa participa, tales como activación del factor de transcripción NFkB, regulación del splicing alternativo, progresión del ciclo celular y supervivencia celular. Sin embargo, la función inhibitoria de Akt sobre el factor de transcripción FOXO1 no depende de su SUMOilación. Por otro lado, alteraciones en los niveles de fosforilación de Akt1 no afectan los niveles de SUMOilación de esta quinasa, y viceversa. Por último observamos altos niveles de SUMOilación en una variante hiperactiva de esta quinasa (Akt E17K) encontrada en diferentes tumores humanos. Esta hiperactividad de Akt E17K se ve afectada por la disminución en sus niveles de SUMOilación. Estos resultados son muy alentadores y permitirán en el futuro intentar determinar la relación de la conjugación de SUMO a Akt con la participación de esta proteína en el desarrollo y progresión tumoral.

Abstract:
The protein kinase Akt is involved in a large variety of cellular processes such as survival, growth, proliferation, migration, angiogenesis, metabolism, stress resistance, among others. During the course of this thesis we discovered a new post-translational modification for this kinase, SUMO conjugation or SUMOylation. Performing point mutations we mapped the SUMO conjugation sites within this protein, the lysine residues 276 and 301. A double mutant protein K276R and K301R (“2KR”) showed lower levels of SUMOylation. Interestingly, over-expression of Akt1 2KR does not increase, and even inhibits phosphorylation levels of a global pattern of Akt substrates. In this regard, we demonstrated that SUMO conjugation to Akt is necessary for most of the studied processes in which this kinase participates, such as activation of the transcription factor NFkB, alternative splicing regulation, cell cycle progression and cell survival. However, the inhibitory role of Akt on FOXO1 transcription factor does not depend on its SUMOylation. Furthermore, alteration of Akt1 phosphorylation levels does not affect its SUMOylation levels and vice versa. Finally, we observed increased levels of SUMOylation in a hyperactive variant of this kinase (Akt E17K) found in various human tumors. This hyperactivity of Akt E17K is affected by the decrease on its SUMOylation levels. These results are very encouraging and will allow determining the connection between the conjugation of SUMO to Akt with the participation of this protein in tumor development and progression.

Weigel Muñoz, Mariana. "Las proteínas CRISP: desde la fertilización al sistema inmune" (2013-04-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas CRISP (Proteínas Secretorias Ricas en Cisteínas) de mamíferos se encuentran presentes en el tracto reproductor masculino y han sido propuestas como mediadores del proceso de fertilización. En base a ello, y a su alta homología con las proteínas PR1 y Ag5 involucradas en el sistema de defensa, el objetivo de esta Tesis ha sido investigar la relevancia de las CRISP tanto para la fertilidad como para el sistema inmune. Previos resultados de nuestro grupo indican que los ratones knockout para la proteína epididimaria CRISP1 (Crisp1-/-) son fértiles pese a presentar espermatozoides con una menor capacidad fertilizante. Dado que una mutación puede producir fenotipos diferentes según su fondo genético, evaluamos el fenotipo de los animales Crisp1-/- generados en un fondo genético homogéneo. Los resultados revelaron que los machos presentaron no sólo una desventaja en la fertilidad sino también nuevos defectos en parámetros funcionales de los espermatozoides, confirmando la importancia de realizar estudios en animales con diversos fondos genéticos. La proteína testicular CRISP2 participa en el proceso de fertilización y ha sido propuesta como un auto-antígeno capaz de generar orquitis. Con el fin de investigar su relevancia para la fertilidad, ratas macho y hembra fueron inmunizadas con CRISP2, observando que esta proteína es capaz de generar una respuesta inmune específica en animales de ambos sexos, que no genera orquitis ni compromete la fertilidad. Estos resultados sugieren que, a diferencia de CRISP1, CRISP2 no seria un blanco anticonceptivo ni un antigeno responsable de la inmunoifertilidad. En cuanto a CRISP3, observamos que si bien existen dos isoformas en el espermatozoide humano, una de las cuales se libera durante la capacitación y otra que permanece en el espermatozoide capacitado, esta proteína no actuaría como factor decapacitante ni sería relevante para la fertilización. Finalmente, en lo que respecta al posible rol de las CRISP en el sistema inmune, observamos que tanto CRISP3 como su homólogo CRISP1 se expresan en células dendríticas inmaduras y maduras. Más aún, el empleo de animales knockout para CRISP1 reveló que esta proteína modularía el perfil secretorio de citoquinas de las células dendrítricas. En conjunto, los resultados obtenidos indican la relevancia de las CRISP para la regulación tanto de la fertilidad como del sistema inmune.

Abstract:
The CRISP proteins (Cysteine Rich Secretory Proteins), in mammals, are primarily expressed in the male reproductive tract and have been proposed to participate in the fertilization process. Based on this, and considering the high homology between the CRISP proteins and the PR1 y Ag5 proteins involved in the immune system, the objective of the present thesis was to investigate the relevance of CRISP in fertility and in the immune system. Previous results from our group indicated that in spite of been fertile, the CRISP1 knockout mice contain sperm that exhibit a reduced ability to fertilized eggs. Considering that it has been reported that different phenotypes can arise from the same mutation depending on the genetic background, we investigated the phenotype of Crisp1−/− animals of a homogenous background. Results showed that males exhibited not only a disadvantage in fertility but also new defects on sperm parameters, confirming the importance of performing studies in animals with different genetic background. Testicular protein CRISP2 is involved in the fertilization process and has been proposed as an auto-antigen capable of generate autoimmune orchitis. With the aim of investigate its relevance for fertility, male and female rats were immunized with CRISP2. Results showed that this protein is capable of generating a specific immune response in male and female rats that neither generates autoimmune orchitis nor compromises fertility. These results suggest that, differently from CRISP1, CRISP2 would not be a target for immunocontraception or a molecule responsible for immunoinfertility. About CRISP3, we observed that even though two forms of the protein exist in human sperm, one of which is released from the sperm during capacitation and the other one that remains associated with the sperm after the acrosome reaction, this protein would not behave as a decapacitating factor and would not be relevant for fertility. Finally, regarding the role of CRISP in the immune system, we observed that CRISP3 and CRISP1 are expressed in immature and mature dendritic cells. Moreover, the use of CRISP1 knockout animals revealed that this protein would modulate cytokine secretion by dendritic cells. Altogether, the results obtained in the present thesis indicate not only the relevance of the CRISP protein in the regulation of fertility but also of the immune system.

Gervasi, María Gracia. "Participación de la anandamida en la liberación de los espermatozoides del epitelio oviductal bovino" (2013-05-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El oviducto de los mamíferos actúa como un reservorio funcional de espermatozoides proveyendo un ambiente que permite su mantenimiento y competencia para la fecundación del oocito. La unión de los espermatozoides con las células epiteliales del oviducto (CEO) prolonga la vida del espermatozoide, retrasando la capacitación, hasta que señales asociadas a la ovulación inducen su liberación. Varias moléculas del fluido oviductal participan en la regulación de la interacción espermatozoide-oviducto. La anandamida es un endocannabinoide que actúa a través de los receptores cannabinoides y ha sido detectada en el fluido oviductal. Previamente demostramos que la anandamida induce la liberación de los espermatozoides de las CEO en bovinos. En este trabajo estudiamos la regulación y el mecanismo de acción de la anandamida en este proceso. Se caracterizó la principal vía metabólica de la anandamida durante el ciclo estral en el oviducto bovino, encontrándose que tanto las CEO como los espermatozoides expresan a las enzimas del metabolismo de la anandamida. Además la mayor concentración de anandamida en el fluido oviductal bovino fue detectada en el momento peri-ovulatorio, siendo el estradiol la hormona involucrada en la vía de activación de este endocannabinoide. Asimismo la anandamida indujo la capacitación espermática y la liberación de los espermatozoides de las CEO a través de los receptores CB1 y TRPV1 con un incremento de Ca2+ espermático. En conjunto, proponemos que en el momento peri-ovulatorio, las hormonas ováricas podrían inducir un incremento de anandamida oviductal favoreciendo la capacitación espermática con la consecuente liberación de los espermatozoides del reservorio oviductal.

Abstract:
Mammals’ oviduct acts as a functional reservoir of spermatozoa, providing an environment that is proper for their maintenance and competence for the fecundation of the oocyte. The interaction of spermatozoa with oviductal epithelial cells (OEC) prolongs spermatozoa’s life, delaying capacitation, until ovulation-related signals induce their release. Several molecules from the oviductal fluid participate in the regulation of the spermoviduct interaction. Anandamide is an endocannabinoid that acts through cannabinoid receptors and it has been detected in oviductal fluid. In previous work, we have demonstrated that anandamide induces spermatozoa release from OEC in bovines. In this work we studied the regulation and the mechanism of action of anandamide in this process. The main metabolic pathway of anandamide during estrous cycle in bovine oviduct was characterized. Both OEC and spermatozoa express enzymes from anandamide metabolism. Also, the highest anandamide concentration in oviductal fluid was found in peri-ovulatory stages, being estradiol the hormone involved in the activation pathway of this endocannabinoid. Also, anandamide induced sperm capacitation and sperm release from the OECs through CB1 and TRPV1 receptors with an increase of intracellular calcium in spermatozoa. From these results we propose that in peri-ovulatory stages, ovarian hormones could induce an increase in oviductal anandamide, promoting sperm capacitation of bound spermatozoa with subsequent release of spermatozoa from the OECs.

Salinas, Silvina R.. "Caracterización bioquímica y estructural de glicosiltransferasas bacterianas" (2013-06-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los polisacáridos juegan un papel esencial en el metabolismo celular y en el funcionamiento de los organismos. Son sintetizados empleando enzimas glicosiltransferasas (GTs), cuyas propiedades determinan el tamaño y la estructura del producto final. Muchas GTs están localizadas en membranas celulares, dificultando su purificación y caracterización. En este trabajo de Tesis se estudian bioquímica y biofísicamente dos GTs que participan en la síntesis del polisacárido xantano producido por Xanthomonas campestris. La primer GT es GumI, de la cual sólo había escasos antecedentes genéticos. En esta Tesis se presenta la primera caracterización bioquímica y funcional de GumI, demostrando su actividad glicosiltransferasa previamente propuesta. Se realizaron ensayos de complementación funcional, demostrando su actividad manosiltransferasa in vivo. Además, se demostró que GumI está unida a la membrana, y que la interacción está mediada por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. GumI fue purificada y su actividad fue estudiada in vitro, obteniéndose los parámetros óptimos de reacción. GumI dio origen a una nueva familia, GT-94, en la clasificación Carbohydrate Active EnZymes. Finalmente, mediante ensayos de cristalización se obtuvieron agujas bidimensionales que al presente no fueron aptas para resolver la estructura de GumI por cristalografía de rayos-X. La segunda GT es GumK, cuya estructura cristalina se resolvió en el laboratorio y, como GumI, es una GT monotópica de membrana. Se profundizó sobre las bases moleculares de la unión a sus sustratos y a la membrana. Se realizaron diferentes mutaciones sobre la zona propuesta de unión a la membrana, demostrando la complejidad de dicha interacción. Además, se realizaron estudios por simulación computacional con el fin de obtener la estructura del complejo GumK/UDP-GlcA. El modelo obtenido explicaría la especificidad por este sustrato. Estudios realizados en este trabajo mediante diversas técnicas -tales como proteólisis limitada, fluorescencia, dicroísmo circular, calorimetría isotérmica de titulación, resonancia magnética nuclear y dispersión de rayos-X a bajo ángulo- sugieren fuertemente la presencia de cambios conformacionales disparados por la unión de UDP-GlcA.

Abstract:
Polysaccharides, which play a crucial role in cellular metabolism and in the performance of organisms, are synthesized by glycosyltransferase (GT) enzymes, whose properties determine the size and structure of the final product. Many GTs are localized in cellular membranes, difficulting their purification and characterization. In this Thesis, two GTs (GumI and GumK) which participate in the synthesis of the polysaccharide xanthan produced by Xanthomonas campestris were studied biochemically and biophysically. The genetic background data on GumI is limited. This Thesis reports the first functional and biochemical characterization of GumI, demonstrating its previously proposed glycosyltransferase activity. Functional complementation demonstrated its in vivo mannosyltransferase activity. Results also show that GumI is a membrane-associated protein, and that the interaction is mediated by hydrophobic and electrostatic forces. GumI was purified and its activity was studied in vitro, obtaining optimal reaction parameters. Finally, crystallization experiments allowed obtaining bidimensional needles, which were not suitable to resolve GumI structure by X-ray crystallography. GumK, whose structure was resolved in the laboratory, is a monotopic GT, like GumI. This Thesis deepened on the molecular basis of the binding to its substrate and the membrane. Mutagenesis of residues of the region proposed for membrane binding was performed, resulting in no-soluble protein and thus demonstrating the complexness of membrane interaction. Moreover, computational simulation studies were carried out with the aim to obtain a model of the GumK/UDP-GlcA structure. The model obtained may explain the GumK specificity for this substrate. Studies performed by various techniques, such as fluorescence, circular dichroism, isothermal titration calorimetry, nuclear magnetic resonance, and small-angle X-ray scattering, strongly suggest the presence of conformational changes in GumK triggered by the UDP-GlcA binding.

Coria, Mirta Lorena. "Estudio de la capacidad adyuvante de la proteína Omp19 de Brucella spp. sobre la respuesta inmune adaptativa" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En nuestro laboratorio nos encontramos investigando la utilidad de la porción proteica de la lipoproteína de membrana externa de 19 kiloDalton de Brucella abortus (U-Omp19) como adyuvante vacunal. Resultados previos proponían a U-Omp19 como un inhibidor de serin proteasas de estómago e intestino. En esta tesis hemos comprobado que U-Omp19 posee actividad de inhibidor de cisteín proteasas lisosomales y que la co-administración de U-Omp19 inhibe parcialmente la degradación del antígeno (Ag) dentro de las células presentadoras de Ag incrementando su vida media y promoviendo su presentación cruzada a las células T CD8+. UOmp19 también es capaz de activar células dendríticas (DCs) induciendo un aumento en la expresión de moléculas co-estimulatorias y secreción de citoquinas pro-inflamatorias. Por último, estudiamos la respuesta inmune inducida en ratones luego de la co-administración de OVA y U-Omp19 por vía subcutánea. Observamos que U-Omp19 como adyuvante de OVA induce una eficiente respuesta inmune celular de tipo T CD8+ y citotóxica con producción de IFN-γ. Los resultados obtenidos indican que la actividad adyuvante de U-Omp19 está dada, por un lado, por su capacidad de activar DCs y por otro lado, por promover la estabilidad y la presentación de Ags a través de su acción como inhibidor de proteasas, éste último representa un novedoso mecanismo aún no descripto para un adyuvante vacunal.

Abstract:
In our laboratory we are investigating the usefulness of the protein moeity of the outer membrane lipoprotein of 19 kiloDalton from Brucella abortus (U-Omp19) as a vaccine adjuvant. Previous results proposed U-Omp19 as a serine protease inhibitor. In this thesis we found that U-Omp19 possesses inhibitory activity of lysosomal cysteine proteases, and that the coadministration of U-Omp19 partially inhibits the antigen (Ag) degradation in Ag presenting cells increasing its half life and promoting its cross presentation to CD8+ T cells. U-Omp19 is also capable of activating dendritic cells (DCs) inducing the upregulation of co-stimulatory molecules and secretion of pro-inflammatory cytokines. Finally, we studied the immune response induced in mice after subcutaneously co-administration of U-Omp19 and OVA. We observed that UOmp19 as adjuvant of OVA induces an effective T CD8+ and cytotoxic cellular immune response with IFN-γ production. These results indicate that the adjuvant activity of U-Omp19 is given, in one hand, by its ability to activate DCs and in the other hand, by promoting Ag stability and presentation through its action as a protease inhibitor, the latter represents a novel mechanism not yet described for a vaccine adjuvant.

Mori Sequeiros Garcia, María de las Mercedes. "Expresión y función de las MAP quinasas fosfatasas 1 y 3 (MKP-1 y MKP-3) en células de Leydig" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
MKP-3 es una enzima inducible sólo por estímulos proliferativos que desfosforila específicamente a ERK1/2. En cambio MKP-1 desfosforila diferentes MAPKs y se induce por diversos tipos de estímulos. En este trabajo se analizaron aspectos regulatorios y funcionales de ambas enzimas en células de Leydig MA-10 bajo la estimulación del receptor de LH (RLH) con hCG o en presencia del derivado del segundo mensajero correspondiente, 8Br-AMPc. Este estudio pone en evidencia, por primera vez, que la activación del RLH regula la expresión de MKP-3. hCG y 8Br-AMPc aumentan los niveles de MKP-3 activando la expresión génica por eventos dependientes e independientes de ERK1/2 y promoviendo modificaciones post-traduccionales que estabilizan la proteína. Se demostró que la activación del RLH conduce a la inducción p21, un inhibidor de la proliferación, y que este efecto es dependiente de MKP-3. Respecto de la enzima nuclear MKP-1, se determinó que el AMPc regula su estabilidad por múltiples fosforilaciones, involucrando la fosforilación por ERK1/2 en sitios consenso relacionados con la estabilidad (S359 y S364) y con la inestabilidad (S296 y S323) de la proteína. Se demostró que la inducción del factor de transcripción NUR77 por 8Br-AMPc, factor que participa en expresión de genes cruciales para la esteroidogénesis, es dependiente de ERK1/2 y se determinó que MKP-1 y sus modificaciones post-traduccionales impactan en la inducción de NUR77 por 8Br-AMPc. Se concluye que la inducción de MKP-1 y MKP-3 por estimulación del RLH modula las acciones de LH sobre la esteroidogénesis y la proliferación de las células de Leydig.

Abstract:
MKP-3 is an enzyme inducible only by proliferative stimuli and involved specifically in ERK1/2 dephosphorylation. In contrast, MKP-1 is an enzyme inducible by different stimuli and able to dephosphorylate different MAPKs. This work analyzes regulatory and functional aspects of both phosphatases in MA-10 Leydig cells under the stimulation of the luteinizing hormone receptor (LHR) with human chorionic gonadotropin hormone (hCG) or a permeable derivative of the corresponding second messenger (8Br-cAMP). The present study demonstrates, for the first time, the expression of MKP-3 by the activation of LHR. hCG and cAMP increase MKP-3 levels by activating gene expression –through ERK1/2-dependent and independent events- and promoting posttranslational modifications that increase protein stabilization. This work also demonstrates that the activation of LHR leads to the induction of p21, an inhibitor of cell proliferation, by a mechanism involving MKP-3 expression. Regarding the nuclear enzyme MKP-1, this work shows that cAMP regulates MKP-1 half life by ERK1/2-mediated phosphorylation in sites involved in protein stabilization (S359 and S364) and destabilization (S259 and S263). It is also established that transcription factor NUR77, whose action is essential for the expression of crucial steroidogenic genes, is cAMP-induced by an ERK-dependent mechanism. In line with this finding, this study also demonstrates that MKP-1 and its post-translational modifications impact on MKP-3 expression. It is concluded that the induction of MKP-1 and MKP-3 by LHR activation modulates LH actions on steroidogenesis and proliferation of Leydig cells.

Mansilla, Sabrina Florencia. "La degradación de p21 inducida por luz UV facilita la replicación de ADN lesionado y preserva la estabilidad genómica" (2014-03-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Mientras que el incremento en los niveles del inhibidor de quinasas dependiente de ciclinas p21 ha sido reportado extensamente en respuesta a variados tratamientos genotóxicos, lo opuesto ocurre en respuesta a la irradiación UVC en donde p21 disminuye sus niveles de expresión como consecuencia de una proteólisis. Esta degradación sugiere que p21 podría estar reprimiendo algún proceso relevante para la respuesta celular a la irradiación UVC. En este trabajo demostramos que la estabilización forzada de p21 luego de luz UV bloquea la replicación sobre ADN lesionado. Este impedimento está relacionado con un defecto en el reclutamiento de polimerasas especializadas necesarias para replicar sobre ADN dañado, que forman parte de un proceso conocido como Síntesis de ADN por Translesión, TLS, (del inglés Translesion DNA Synthesis). Los defectos observados en la replicación de ADN lesionado correlacionan con un aumento en los marcadores de estrés replicativo, inestabilidad genómica y aumento de la muerte celular. Interesantemente estos efectos deletéreos desaparecen si se remueve el sitio de unión a PCNA, (PIP box) de p21, sugiriendo que la perdida de interacción entre p21 y PCNA es suficiente como para permitir el reclutamiento de proteínas de unión a PCNA (como las polimerasas especializadas) relevantes para la respuesta a irradiación UV. Por otro lado la expresión de una construcción degradable de p21 tuvo un efecto transiente sobre los eventos de replicación temprana y sobre el reclutamiento de las polimerasa de TLS en respuesta a irradiación UV. Estos defectos temporarios desaparecen en correlación con la degradación de p21, sin observarse consecuencias sobre eventos de replicación tardía o sobre la estabilidad genómica. En conjunto, nuestros datos sugieren que la función biológica asociada a la degradación de p21 en respuesta a irradiación UV es la de promover la replicación sobre ADN lesionado a través de una correcta y efectiva activación de los eventos de TLS.

Abstract:
While many genotoxic treatments upregulate the ciclin kinase inhibitor p21, agents such as UV irradiation trigger p21 degradation. This suggests that p21 blocks a process relevant for the cellular response to UV. Here we show that forced p21 stabilization after UV strongly impairs damaged-DNA replication, which is associated with permanent deficiencies in the recruitment of DNA polymerases from the Y family (involved in translesion DNA synthesis -TLS), with the accumulation of DNA damage markers and increased genomic instability. Remarkably, such noxious effects disappear when disrupting the PCNA interacting motif (PIP) of stable p21, thus suggesting that the release of PCNA from p21 interaction is sufficient to allow the recruitment to PCNA of partners (such as Y polymerases) relevant for the UV response. Expression of degradable p21 only transiently delays early replication events and Y polymerase recruitment after UV irradiation. These temporary defects disappear in a manner that correlates with p21 degradation with no detectable consequences on later replication events or genomic stability. Together, our findings suggest that the biological role of UV- triggered p21 degradation is to prevent replication defects by facilitating the tolerance of UV-induced DNA lesions.

Scarcia, Paola Inés. "Biomarcadores de contaminación de teleósteos dulceacuícolas como herramienta de evaluación de ambientes acuáticos afectados por compuestos orgánicos persistentes" (2014-03-12) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo de tesis se evaluó la respuesta de una batería de parámetros biomarcadores fisiológicos, bioquímicos y moleculares en teleósteos dulceacuícolas, útiles y aplicables en la evaluación de la calidad de cuerpos de agua afectados por compuestos orgánicos persistentes (COPs) de origen antrópico. Se evaluaron biomarcadores de contaminación asociados a la biotransformación (actividad enzimática de glutatión-Stransferasa, inmunodetección de la proteína CYP1A y la actividad catalítica de la EROD, niveles de metabolitos biliares); al estrés oxidativo (actividad enzimática de la catalasa, superóxido dismutasa y niveles de TBARS) y asociado a la presencia de desorganizadores endócrinos (inmunodetección de vitelogenina plasmática). También se determinaron los índices fisiológicos factor de condición e índice hepatosomático. Se utilizaron como organismos prueba ejemplares juveniles de Cyprinus carpio y de diferentes especies nativas frecuentadoras de fondo. Se evaluaron los efectos adversos por exposición de dichas especies a diferentes tipos de COPs (hidrocarburos aromáticos policíclicos, bifenilos policlorados y compuestos con efecto desorganizador endócrino) por medio de ensayos de laboratorio y mediante evaluaciones a campo por exposición en jaulas (Río de la Plata y río Luján) y de recolección de especies nativas. Los resultados obtenidos permitieron caracterizar y comparar el efecto de los diferentes COPs sobre las respuestas de los biomarcadores en las especies prueba. Se demostró que el confinamiento de peces en jaulas es una metodología de trabajo útil en la evaluación de la calidad ecotoxicológica de ríos periurbanos. Se utilizaron técnicas que permitieron realizar un análisis de los resultados comparando e integrando las respuestas de los biomarcadores en los ensayos de laboratorio y de campo in situ. Se elaboró una línea de base para cada parámetro biomarcador y se proporcionó información de referencia sobre la variabilidad natural de los mismos que puede ser empleada en futuros ensayos de laboratorio y de evaluación de ambientes acuáticos afectados por COPs.

Abstract:
In this thesis we evaluated the response of a battery of physiological, biochemical and molecular biomarkers of freshwater teleost, useful and relevant in the evaluation of the quality of water bodies affected by anthropogenic inputs of persistent organic compounds (POCs). Biomarkers of contamination associated with biotransformation (enzymatic activity of glutathione-s transferase, immunodetection of CYP1A protein and catalytic activity of EROD, biliary metabolites levels), oxidative stress (enzymatic activity of catalase and superoxide dismutase, TBARS levels) and endocrine disruption (immunodetection of vitellogenin plasmatic protein) were assessed. Physiological indices, condition factor and liver somatic index were also assessed. Cyprinus carpio and bottom dweller native species juveniles were used as test organisms. Adverse effects were assessed by exposing those species to different kind of POCs (polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls and endocrine- disrupting chemicals) by means of laboratory and field evaluations by cage exposure (Rio de la Plata and Luján river) and native collected fish. Results allowed comparing and characterizing the effect of different POCs on the responses of biomarkers in the test species. Fish exposure in cages proved to be a useful ecotoxicological methodology when evaluating the condition of periurbans rivers. An integrated analysis of the results allowed comparing laboratory assays and field in situ biomarker responses of test species. A baseline for each biomarker was developed and reference information was provided about their natural variability that can be used in future laboratory tests and in the assessment of aquatic environments affected by POCs.

Baccarini, Leticia Cecilia. "Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae" (2014-03-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La regulación de la expresión génica mediada por proteínas quinasas es esencial para la correcta adaptación celular frente a un estímulo extracelular. En S. cerevisiae, la PKA está formada por tres subunidades catalíticas: Tpk1, Tpk2 y Tpk3 y una subunidad regulatoria: Bcy1. Existen antecedentes que indican la asociación de Tpk1 y Tpk2 a la cromatina durante el crecimiento en glucosa, glicerol y estrés oxidativo (Pokholok et al, 2006). El rol de la vía cAMP/PKA sobre la expresión génica en glucosa ha sido ampliamente estudiado (Livas et al, 2011). Por otro lado, se ha descripto, que la activación de la PKA limita la expresión de genes de respuesta a estrés (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). Durante el desarrollo de esta tesis analizamos la unión de Bcy1, Tpk1 y Tpk2 a diferentes regiones génicas en respuesta a estrés osmótico y oxidativo. Describimos que tanto las subunidades catalíticas como la subunidad regulatoria de la PKA se encuentran asociadas tanto a regiones transcriptas como a promotores de los genes blancos de manera estrés-dependiente. Además analizamos el requerimiento de la actividad quinasa y el papel de Bcy1 en la asociación de las Tpks a la cromatina. Versiones inactivas de Tpk1 y Tpk2 no se asociaron a la cromatina. La deleción de Bcy1 promueve una mayor asociación de Tpk1, mientras que anuló la asociación de Tpk2. Luego analizamos el posible rol de las Tpk en el remodelado de la cromatina en respuesta a estrés a través del análisis de la cinética de unión de factores remodeladores de la cromatina a las regiones donde encontramos asociadas a Tpk1 y Tpk2. Observamos unión transitoria a la cromatina de Arp8, Rsc1 y Snf2 seguido temporalmente por la asociación de las Tpk. Observamos también, la ocupación concomitante de Tpk2 y el factor de transcripción de unión al DNA Rap1. En conjunto los datos existentes y los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la PKA podría participar en la expresión génica mediante fosforilación in situ de los reguladores transcripcionales o de la cromatina. La distribución núcleo-citoplasmática permite regular la actividad diferencial de muchas proteínas quinasas. Hemos analizado la localización subcelular de las subunidades de PKA y su mecanismo de transporte durante estrés. Hemos observado que Tpk1-GFP y Tpk3-GFP acumulan en el núcleo post-estrés oxidativo y osmótico, sin embargo Tpk2- GFP y Bcy1-GFP no cambian su acumulación nuclear. El análisis cinético de la acumulación nuclear de Tpk1 mostró mayor velocidad en respuesta a estrés osmótico versus oxidativo. Hemos determinado que la acumulación nuclear de Tpk1, Tpk2, Tpk3 y Bcy1 es un mecanismo de transporte activo. Sorprendentemente, cada una de las subunidades de PKA es importada al núcleo por diferentes carioferinas. Por otra parte, las cepas defectivas en carioferinas las cuales impiden la acumulación nuclear específicamente de Tpk1 o Tpk2 no mostraron asociación a la cromatina las Tpks, lo que sugiere el requerimiento de acumulación nuclear de las subunidades catalíticas para la asociación a sus genes blancos.

Abstract:
Regulation of gene expression by intracellular stimulus-activated protein kinases is essential for cell adaptation to environmental changes. There are three PKA catalytic subunits in S. cerevisiae: Tpk1, Tpk2 and Tpk3 and one regulatory subunit: Bcy1. Previous data indicates that Tpk1 and Tpk2 were found associated to the chromatin during growth on glucose, glycerol and oxidative stress (Pokholok et al, 2006). Using ChIP-real time assay we analyzed the Bcy1, Tpk1 and Tpk2 association to 5 genes regions in response to osmotic and oxidative stresses. We had demonstrated that both catalytic and regulatory subunits of PKA were associated to transcribed regions and promoters of target genes in a stress dependent manner. Furthermore we analyze the requirement of kinase activity and the role of Bcy1 protein on Tpk chromatin association. Inactive versions of Tpk1 and Tpk2 do not associate to chromatin. Deletion of BCY1 promotes higher Tpk1 association, whereas it abolished Tpk2 association. We then analyze the possible role of Tpk on chromatin remodeling in response to stress conditions. We analyze the kinetics of binding chromatin remodelers in the regions bound by Tpk1 and Tpk2 in response to stress. During stress stimulus there is a transient binding to chromatin of Arp8, Rsc1 and Snf2 - chromatin remodelers followed temporarily by Tpk association. We also observe cooccupancy of Tpk2 and DNA-binding transcription factor Rap1. The role of cAMP / PKA on gene expression in glucose has been extensively studied (Livas et al, 2011). However PKA activation limits the expression of stress responsive genes (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). These results suggest that PKA could participate in gene expression by in situ phosphorylation of transcriptional or chromatin regulators. Actually it is known that a single protein kinase distributed dynamically between cytoplasm and nucleus, can regulate target genes expression by both nuclear and cytoplasmic signaling mechanisms. Thus, the nucleus-cytoplasmic kinases transport would be important to regulate differential activity in both compartments. Here we analyze stress subcellular localization of PKA subunits and their transport mechanism, using fluorescence microscopy. We observed that Tpk1 and Tpk3 accumulate in the nucleus post-oxidative and osmotic stress however Tpk2 and Bcy1 not change their nucleus-cytoplasmic distribution, staying preferentially nuclear. Our results over Tpk1 stress re-localization kinetics suggest that under osmotic stress is necessary its faster nuclear accumulation. We determined that Tpk1, Tpk2, Tpk3 and Bcy1 nuclear accumulation is ATP dependent suggesting an active transport mechanism. Surprisingly, we found that each PKA subunits is transported into the nucleus by different karyopherins. Moreover, karyopherin mutant strains which prevent nuclear accumulation of Tpk1 or Tpk2 prevented its association with chromatin, suggesting that nuclear accumulation of catalytic subunits to association to their targets genes is required.

Mestre Citrinovitz, Ana Cecilia. "Regulación de la proliferación y diferenciación de células de endometrio por hormonas esteroideas ováricas" (2014-04-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estroma uterino experimenta cambios morfológicos y funcionales que dan lugar a la decidua, un tejido compacto cuya función es el correcto progreso de la preñez. El receptor de progesterona (RP) y el receptor de estradiol (RE) participan en el crecimiento y la diferenciación de las distintas áreas deciduales del endometrio de la rata. En esta tesis se estudia el papel de estos receptores, sus vías de señalización y la participación de nuevas moléculas involucradas en las etapas iniciales de la decidualización. Caracterizamos, mediante el uso de ARN pequeño de interferencia específico, el papel de una nueva proteína regulada en la decidualización, la proteína de unión a ARN CSD-C2. Encontramos que el bloqueo del RP, mediante su antagonista onapristona, produjo la reabsorción de los sitios de implantación (SIs) y la disminución en la expresión proteica del RP, RE, PCNA, DESMINA y CCND3, en los niveles de ARNm de Prl8a2, y de Hand2 y Bmp2, y en la activación de ERK. El efecto deletéreo de onapristona fue parcialmente contrarrestado por el antagonista del RE faslodex, restituyendo los niveles de los receptores de hormonas, de los marcadores de proliferación y diferenciación analizados, y aumentando compensatoriamente los niveles de Hand2 y Bmp2, y pERK. El tratamiento de ratas preñadas con el inhibidor de pERK, evidenció su importancia en la formación de la decidua, manteniendo la capacidad proliferativa de las células estromales y limitando su diferenciación en las distintas áreas deciduales. Estos hallazgos muestran la importancia del balance de señalización de los receptores hormonales, a la vez que describen nuevas moléculas responsables de la decidualización endometrial durante la preñez temprana.

Abstract:
The uterine stroma undergoes complex morphological and functional shifts that build the decidua, a specialized compact tissue leading to successful pregnancy. Progesterone receptor (PR) and estrogen receptor (ER) participate in growth and differentiation of several rat decidual regions. This thesis studies the role of these receptors, related signalling pathways and novel molecules during the initial steps of pregnancy. We characterized the role of the RNA binding protein, CSD-C2, during decidualization by specific siRNA in vivo administration. Early suppression of progesterone receptor activity by treatment with the progesterone antagonist (onapristone) resulted in resorption of the implantation sites (ISs) with concomitant decrease in the expression of PR, ER, PCNA, DESMIN, CCND3, Prl8a2, and signalling players such as Hand2, Bmp2 and ERK activation. The deleterious effect of onapristone was partially counteracted by the ER antagonist (Faslodex) with rescue of hormone steroid receptors, markers of proliferation and differentiation and the probably compensatory increase of Hand2, Bmp2 and ERK activation compared to oil treated controls. The treatment of pregnant rats with MEK inhibitor showed ERK activation relevance during the late stage of decidua development, keeping the proliferation capacity of stromal cells and limiting the differentiation process in specified regions of decidual tissues. These findings highlight the balance of ovarian steroid hormone receptors during early pregnancy, and describe new players in the decidualization process.

Mac Keon, Soledad. "Vacunación con células dendríticas y regulación de la respuesta inmune en melanoma experimental" (2014-07-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo del presente trabajo de Tesis fue explorar el mecanismo mediante el cual la vacuna CD-Apo/Nec, constituida por células dendríticas cocultivadas con células apoptóticas y necróticas del melanoma murino B16-F1, genera protección antitumoral, y establecer condiciones que potencien la capacidad inmunoestimuladora de la misma. En el trabajo de Tesis que se presenta se demuestra que la protección generada por la vacuna es sistémica, evitando el desarrollo s.c. de melanoma B16-F1 y controlando micrometástasis latentes. Se detectó en el sitio de vacunación la novedosa formación de una estructura linfoide terciaria, la cual no se evidenció con otras vacunas que no desarrollan protección antitumoral. En esta estructura se observaron vénulas con expresión de Adresina de Nódulo Linfático Periférico y el reclutamiento de linfocitos T CD4+ y CD8+ en estrecho contacto con células dendríticas. Para la formación de la estructura linfoide terciaria fue necesario el cocultivo ex vivo durante 24 horas de las células dendríticas con células Apo/Nec. En los ganglios linfáticos drenantes, la vacunación no indujo la acumulación de linfocitos T regulatorios, pero sí fue posible detectar allí el reclutamiento y proliferación de linfocitos T CD8+ vírgenes B16-F1-específicos. Se determinó al finalizar el esquema de vacunación la producción anticuerpos IgM/IgG anti-B16-F1, que podrían actuar opsonizando células B16-F1. Se ensayaron diferentes estrategias de maduración in vitro de las células CD-Apo/Nec. Sin embargo, no fue posible generar un aumento significativo en su capacidad inmunoestimuladora. Se dedujo que las células apoptóticas y necróticas de melanoma inducen una pérdida en la capacidad funcional de las células dendríticas. Se comprobó la acumulación de lípidos neutros en las células dendríticas, que podría estar afectando el procesamiento y presentación de antígenos tumorales. En este trabajo de Tesis se logró determinar diferentes aspectos de la respuesta inmune anti-tumoral gatillados en los animales vacunados con CD-Apo/Nec. Creemos que las células de melanoma irradiadas son una fuente completa de antígenos de melanoma, y que este trabajo contribuye a planear nuevas aproximaciones y estrategias de combinación que logren mejorar las terapias anti-melanoma existentes.

Abstract:
The aim of this Ph.D. Thesis was to explore the mechanisms of antitumor protection elicited by DC-Apo/Nec vaccine, constituted by dendritic cells charged with apoptotic and necrotic murine B16-F1 melanoma cells, and to establish new conditions to enhance it´s immunostimulatory capacity. In this PhD Thesis it is demonstrated that the DC-Apo/Nec vaccine generates systemic protection against s.c. B16-F1 melanoma and dormant micrometastasis. The neoformation of a tertiary lymphoid structure was described at the vaccination site, which was not evidenced with other vaccines lacking antitumor capacity. Within this structure the expression of Peripheral Lymph Node Addressin and the recruitment of CD4+ and CD8+ T lymphocytes, in close contact with dendritic cells, were observed. For the tertiary lymphoid structure to be formed, a 24 hour coculture of dendritic cells with apoptotic and necrotic melanoma cells was required. In draining lymph nodes, B16-F1 specific T CD8+ lymphocyte recruitment and proliferation was detected, and regulatory T lymphocytes were not induced. Anti- B16-F1 antibodies were detected, which could be assisting by opsonization in the immune detection of B16-F1 melanoma cells. New maturation approaches for DC-Apo/Nec cells were assayed, but it was not possible to enhance significantly their immunostimulatory capacity. It was deduced that during the coculture period the apoptotic and necrotic melanoma cells induce a loss in the functional properties of dendritic cells. Lipid accumulation was shown in these dendritic cells, which could be affecting the processing and presentation of tumoral antigens. Different aspects of the antitumor response elicited by DC-Apo/Nec vaccination were determined in this Ph.D. Thesis. We believe that apoptotic and necrotic melanoma cells are an complete melanoma antigen source, and that this work contributes on the search for new approximations and combination strategies to improve actual anti-melanoma therapies.

Andreone, Luz. "Nuevos aspectos de la regulación endocrina y paracrina de la producción gonadal de inhibinas y activina A" (2014-11-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las inhibinas y activinas, son glicoproteínas diméricas formadas por subunidades α y β. Las inhibinas, producidas en las células de la granulosa en el ovario y en las células de Sertoli (CS) en el testículo, han sido aisladas por su capacidad de inhibir selectivamente la producción de la hormona folículo estimulante (FSH) en el gonadotropo. Las activinas, potentes estimuladores de la síntesis y secreción de FSH, actúan además como factores de crecimiento en distintos tipos celulares. Ambos factores resultan esenciales en la regulación del eje hipotálamo-hipófiso- gonadal. El presente trabajo de Tesis tuvo como objetivo esclarecer, utilizando diferentes modelos experimentales, nuevos mecanismos de regulación involucrados en la expresión de las subunidades de inhibina/activina (α, βA y βB) y la producción de inhibinas y activina A en células ováricas y testiculares. Los resultados obtenidos en cultivos de folículos antrales tempranos de rata, evidenciaron la importancia de la interacción de los distintos tipos celulares para mantener el predominio de la inhibina B en los primeros estadios del desarrollo folicular. Asimismo, permitieron describir el efecto modulador diferencial del entorno esteroideo intrafolicular y su interacción con la FSH sobre la producción de inhibinas y activina A. Un hallazgo particularmente original fue la acción regulatoria del 25-hidroxicolesterol sobre la expresión de estos péptidos. Los estudios realizados en cultivos de CS de rata demostraron que la acción de FSH y de factores paracrinos sobre la producción de inhibinas y activina A varía de acuerdo al grado de maduración de la gonada. En la CS inmadura, factores provenientes de las células peritubulares tendrían un papel importante en el sostenimiento de la alta producción de inhibina B característica de esta etapa del desarrollo. En las CS en estadios avanzados de maduración, la FSH, en forma conjunta con factores provenientes de las células germinales, constituiría el estímulo más relevante para estimular la producción de inhibina B. La FSH se sintetiza y secreta como una familia de variantes de glicosilación, las cuales difieren en la composición de sus oligosacáridos y en la capacidad de inducción de respuestas biológicas. Los estudios in vitro realizados en CS en estadios avanzados de maduración demostraron que el grado de sialilación y complejidad de los oligosacáridos presentes en la FSH sería un factor regulatorio adicional de la producción de inhibinas en la gonada masculina. Finalmente, la incapacidad de producir inhibina B in vivo observada en un paciente con un desorden del desarrollo sexual, impulsó el estudio de factores inhibitorios de la producción de inhibinas en cultivos de túbulos seminíferos humanos y CS de rata. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de Tesis contribuyen a esclarecer los mecanismos de regulación de la producción de inhibinas y activina A en la gonada y confirman el valor de estos péptidos como marcadores de la función ovárica y testicular.

Abstract:
Inhibins and activins are structurally related dimeric glycoproteins composed of α and/or β subunits. Inhibins, produced by granulosa cells in the ovaries and in Sertoli cells (SC) in the testes, were isolated on the basis of their capacity to specifically suppress follicle stimulating hormone (FSH) secretion by the gonadotropes. Activins are potent stimulators of FSH synthesis and secretion and they act as growth factors on different cell types. Both peptides are essential for the modulation of the hypothalamic–pituitary–gonadal axis function. The present study was aimed at elucidating, using different in vitro experimental models, new regulatory mechanisms involved in inhibin/activin subunit (α, βA y βB) expression as well as inhibins and activin A production in ovarian and testicular cells. The results obtained in cultured rat early antral follicles, revealed the importance of the interaction among different types of follicular cells to sustain the predominance of inhibin B at early stages of follicular development. Furthermore, the results showed that the complex interplay between FSH and the steroid follicular microenvironment differentially modulate the gene expression of inhibin/activin subunits, their assembly and secretion. In addition, a novel modulatory action of 25-hydroxycholesterol on inhibin/activin follicular expression was described. The studies carried on using rat SC cultures demonstrated that the action of FSH and paracrine factors on inhibin and activina A production varies according to the stage of gonadal maturation. Factors produced by peritubular cells might have an important role in sustaining the high production of inhibin B in the immature SC. At later stages of SC maturation, FSH and factors derived from germ cells, constitute the most relevant stimulus for modulating inhibin B production. FSH is synthesized and secreted as a family of glycosylation variants, which differ in their oligosaccharide composition and in their ability to induce biological responses. The in vitro studies performed in SC at more advanced stages of maturation demonstrated that the sialylation degree as well as the complexity of oligosaccharides present in the FSH molecule should be considered as additional factors in the modulation of inhibin production in the pubertal male gonad. In the last section of this study, the incapacity to produce inhibin B in vivo, observed in a patient with a disorder of sex development, led us to study inhibitory factors of inhibin production in cultured human seminiferous tubules and rat SC. The results obtained herein contribute to deepen the knowledge of the regulatory mechanisms underlying inhibins and activin A production, confirming their usefulness as peripheral markers of ovarian and testicular function from birth to adulthood.

Fassolari, Marisol. "Mecanismo de reconocimiento de un epítope intrínsecamente desordenado por un anticuerpo monoclonal: integración mecanística y estructural" (2014-11-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El reconocimiento de antígenos por medio de anticuerpos es un evento fundamental en la respuesta inmune adaptativa. A su vez la formación de los complejos Antígeno:Anticuerpo es extensivamente utilizada como modelo de estudio de interacción proteína-proteína. En la presente tesis estudiamos el mecanismo de reconocimiento de un anticuerpo monoclonal específico, M1, por la proteína E7 del papilomavirus humano (HPV). E7 es la oncoproteína que constituye la principal actividad transformante del virus y además es paradigma de proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). E7 se expresa constitutivamente en tejidos de carcinoma y la aparición de anticuerpos específicos ocurre con alta frecuencia en pacientes con cáncer cervical. Llevando a cabo un mapeo epitópico determinamos que el anticuerpo M1 reconoce específicamente una región inmunodominante de la proteína de HPV- 16 denominada “bisagra”, por conectar el dominio IDP N-terminal con el dominio globular Cterminal de la misma. Experimentos cinéticos mostraron que la región reconocida por M1, la cual posee dos residuos de prolina, comprende al menos dos poblaciones separadas por una alta barrera energética (~ 22 Kcal/mol). Los estudios de Resonancia Magnética Nuclear identificaron el origen de esta barrera como un evento de isomerización cis-trans de las prolinas presentes en el epítope de reconocimiento. Se determinó que el anticuerpo M1 reconoce específicamente al epítope en su conformación minoritaria (10%), que posee sus prolinas en cis, mediante el mecanismo de selección conformacional. Por lo tanto, se requiere que el 90% de las moléculas que se encuentran en configuración trans isomericen previo a la unión con el anticuerpo. La velocidad de asociación del conformero cis por M1 ( kon = 6 x 107 M-1 s-1) se encuentra entre las más rápidas para las interacciones Antígeno:Anticuerpo, a pesar de que la reacción global es extremadamente lenta (t1/2 ~ 4 min). Esto indica que la reacción de asociación se encuentra limitada por un evento de isomerización de prolina. Utilizando mutantes puntuales demostramos que la P41 en su conformación cis es la requerida para la unión con el anticuerpo. Luego del evento lento de pre-equilibrio y de la unión con M1, ocurre un evento de rearreglo unimolecular, formándose finalmente un complejo consolidado de alta afinidad (KD 120 nM). Nuestros resultados sugieren que la presentación de este epítope viral por las células presentadoras de antígeno tiene que haber estado en su configuración minoritaria cis, al generar el clon que produce el anticuerpo específico. Finalmente, mostramos la importancia de los determinantes estructurales presentes en regiones desordenadas en el reconocimiento entre macromoléculas. Dado que numerosas proteínas virales son multifuncionales debido a su naturaleza IDP, los resultados presentados en esta tesis sientan la bases para el análisis del mecanismo de reconocimiento por medio de anticuerpos de epítopes virales intrínsecamente desordenados.

Abstract:
Recognition of antigens by antibodies is a critical event in the adaptive immune response. Furthermore, the Antigen:Antibody complex is extensively used as a model of protein-protein interactions. In the present thesis, we present a detailed mechanistic study of the interaction between a specific monoclonal antibody, M1, with the E7 oncoprotein of human papillomavirus. E7 is the main transforming factor of this virus and also emerges as a paradigmatic example of an intrinsically disordered protein or IDP. E7 is constitutively expressed at high levels in carcinoma tissues and antibodies are frequently raised in patients with cervical cancer. Epitope mapping studies reveal that the M1 antibody specifically recognizes an immunodominant region of the HPV-16 E7 protein called "hinge", located between the IDP N-terminal and the globular C-terminal domains of the protein. Kinetic experiments show that this hinge, which has two proline residues, has at least two populations separated by a high energy barrier (~ 22 kcal / mol). Nuclear magnetic resonance traced the origin of this barrier to a very slow trans/cis prolyl isomerization event present in E7 epitope. The less populated (10%) cis isomer is the binding-competent species. Thus, the 90% of the molecules in the trans configuration require isomerization before binding. The association rate for the cis isomer approaches 6x107 M-1s-1, a ceiling for antigen-antibody interactions, although the overall reaction is extremely slow (t1/2 ~ 4 min). Therefore, the E7 epitope:M1 antibody complex formation is limited by a proline isomerization event. Mutagenesis experiments showed that Pro 41 in the epitope was required for both binding and isomerization. After the slow pre-equilibrium event and M1 binding, a post-binding unimolecular event occurs and a consolidated complex with a KD = 1.2!10-7 M is reached. Our results suggest that presentation of this viral epitope by the antigen presenting cells would have to be “locked” in the cis conformation in opposition to the most populated trans isomer in order to select the specific antibody clone. Finally, we show the importance of the structural determinants within disordered regions in the recognition mechanism between macromolecules. Many viral proteins are multifunctional due to its IDP nature. Therefore, the results presented in this thesis establish the basis for the analysis of the recognition mechanism by antibodies of intrinsically disordered viral epitopes.

Mezzina, Mariela Paula. "Análisis funcional y estructural de la phasina PhaP de Azotobacter sp. FA-8 y su rol en Escherichia coli recombinante" (2014-12-04) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las phasinas son un grupo de proteínas que se encuentran asociadas a gránulos de polihidroxialcanoatos (PHA). Además de su rol estructural como parte de la cubierta del gránulo, se han encontrado diferentes funciones estructurales y regulatorias asociadas a varias de estas proteínas, y se han desarrollado aplicaciones biotecnológicas utilizando proteínas fusionadas a phasinas. A pesar de su diversidad funcional, la estructura de estas proteínas ha sido analizada en detalle en muy pocos estudios. PhaP de Azotobacter sp. FA8 (PhaPAz) pertenece al grupo más representado de la multifuncional familia de las phasinas. Esta proteína ha sido clonada y expresada en Escherichia coli. Las cepas recombinantes de E. coli que sobreexpresan phaPAz crecen más y acumulan más polímero, lo que sugiere que PhaPAz ejerce un efecto promotor del crecimiento. Se observó también que la expresión de PhaPAz tiene un inesperado efecto protector en E. coli no productora de PHA, tanto en condiciones normales como en condiciones de estrés, resultando en un mayor crecimiento y mayor resistencia a estrés oxidativo y estrés térmico. El objetivo de este trabajo doctoral es realizar una caracterización funcional y estructural de esta phasina para estudiar sus diversas propiedades y dilucidar el mecanismo por el cual ejerce su efecto protector. Su estructura primaria reveló que no posee claros dominios hidrofóbicos, característica que parece ser común a la mayoría de las phasinas, a pesar de su capacidad de unión a gránulos lipídicos. La estructura secundaria de esta proteína consiste en α-hélices, combinadas con regiones desestructuradas que le confieren una notable flexibilidad dependiente del entorno. Los datos experimentales obtenidos revelaron que PhaPAz es un tetrámero formado por interacciones de tipo coiled coil entre los monómeros. Estas características estructurales tambén fueron encontradas en otras phasinas y podrían estar relacionadas con su diversidad funcional. Se realizaron experimentos de actividad chaperona in vitro para dilucidar el mecanismo por el cual PhaPAz ejerce su efecto protector. PhaPAz demostró evitar la agregación térmica de la proteína Citrato Sintasa (CS) y facilitar el proceso de replegado de la enzima luego de la desnaturalización por métodos químicos in vitro. Estos experimentos mostraron que PhaPAz tiene actividad chaperona in vitro. Se utilizaron técnicas de microscopía de fluorescencia y de transmisión electrónica para analizar la localización intracelular de PhaPAz en cepas de E. coli productoras y no productoras de PHB con el objetivo de estudiar el rol de PhaPAz en el plegado de proteínas in vivo, el agregado de proteínas y la dinámica de formación de cuerpos de inclusión. PhaPAz colocalizó con los cuerpos de inclusión de PD, proteína que forma grandes y visibles agregados cuando es sobreexpresada en E. coli. Se observó una reducción en el número de cuerpos de inclusión cuando PD fue coproducida con PhaPAz o con la chaperona GroELS. Estos resultados demuestran que PhaPAz presenta actividad chaperona tanto in vitro como in vivo en E. coli recombinante, y sugieren que las phasinas podrían tener un rol protector general en los productores naturales de PHA. Estas observaciones hacen posible el uso de esta proteína en el desarrollo de nuevas aplicaciones biotecnológicas, como por ejemplo la producción de proteínas recombinantes y otros productos heterólogos en E. coli.

Abstract:
Phasins are a group of proteins associated to granules of polyhydroxyalkanoates (PHAs). Apart from their structural role as part of the PHA granule cover, different structural and regulatory functions have been found associated to many of them, and several biotechnological applications have been developed using phasin protein fusions. Despite their remarkable functional diversity, the structure of these proteins has not been analyzed except in very few studies. PhaP from Azotobacter sp. FA8 (PhaPAz) is a representative of the prevailing type in the multifunctional phasin protein family. This protein has been cloned and expressed in Escherichia coli. Recombinant E. coli strains overexpressing phaPAz grow more, and accumulate more polymer, suggesting that PhaPAz exerts a growth promoting effect. Expression of PhaPAz was also observed to have an unexpected protective effect in E. coli strains that do not synthesize PHAs, under both normal and stress conditions, resulting in increased growth and higher resistance to both superoxide stress and heat shock. The aim of this work was to perform a physiological and structural characterization of this protein, to shed light on its properties. Its secondary structure revealed that it lacks clear hydrophobic domains, a characteristic that appears to be common to most phasins, despite their lipid granule binding capacity. The secondary structure of this protein, consisting of α- helices and disordered regions, has a remarkable capacity to change according to its environment. Several experimental data support that is a tetramer, probably due to interactions between coiled-coil regions. These structural features have also been detected in other phasins, and may be related to their functional diversity. In vitro chaperone activity experiments were performed in order to shed light on the mechanisms by which PhaPAz exerts its protective effect. PhaPAz was shown to prevent in vitro thermal aggregation of the model protein citrate sinthase (CS) and to facilitate the refolding process of the enzyme after chemical denaturation. These experiments showed that PhaPAz presents in vitro chaperone activity. Fluorescence microscopy and electron transmission microscopy were used to analyze the subcellular localization of PhaPAz in PHB producing and non PHB producing E. coli strains and to study the role of PhaPAz in in vivo protein folding, protein aggregation and inclusion body dynamics. PhaPAz was shown to colocalize with inclusion bodies of PD, a protein that forms large inclusion bodies when overexpressed. A reduction in the number of inclusion bodies of PD was observed when the insoluble protein PD was coexpressed with PhaPAz or with the known chaperone GroELS. These results demonstrate that PhaPAz has chaperone like functions both in vitro and in vivo in E. coli recombinants, and suggests that phasins could have a general protective role in natural PHA producers, that in these microorganisms is masked by the fitness enhancing properties of the polymer. These observations open the door for novel biotechnological applications of this protein, for example, in the production of recombinant proteins and other heterologous products in E. coli.

Crisp, Renée Leonor. "Esferocitosis hereditaria: avance en la metodología diagnóstica, estudios demográficos e investigación de mecanismos involucrados" (2014-12-18) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Esferocitosis Hereditaria (ESH) es una anemia hemolítica de observación frecuente, caracterizada por alteraciones cuali y/o cuantitativas –genéticamente determinadas– de las proteínas de la membrana eritrocitaria. Consecuentemente, se debilita la unión entre la membrana eritrocitaria y el citoesqueleto subyacente, produciéndose la pérdida progresiva de la membrana con formación de hematíes de forma esférica, osmóticamente frágiles, que son selectivamente atrapados y destruidos en el bazo. Muchas alteraciones en diferentes genes pueden generar la misma enfermedad. Clínicamente se caracteriza por anemia, ictericia y esplenomegalia. La ESH es la anemia hemolítica hereditaria más frecuente en Argentina. A pesar de ello, es muy escasa la información sobre su comportamiento en nuestro país. Los objetivos de esta tesis son: a) Investigar avances en la metodología de diagnóstico a partir del análisis e implementación de nuevas pruebas que han sido desarrolladas durante la última década; b) Establecer aspectos demográficos de la ESH en la población atendida por nuestro grupo de trabajo; c) Dilucidar algunos mecanismos involucrados en la enfermedad. En este trabajo se utilizaron las pruebas tradicionales (fragilidad osmótica eritrocitaria y prueba de autohemólisis) y se desarrollaron por primera vez en nuestro país las nuevas pruebas diagnósticas (citometría de flujo con 5’eosina maleimida, criohemólisis hipertónica y fragilidad osmótica por citometría de flujo) estableciendo sus puntos de corte, sensibilidad, especificidad y valores predictivos. El análisis de los resultados de los ensayos electroforéticos de las membranas eritrocitarias permitió establecer que las deficiencias de espectrina y ankirina son las prevalentes en nuestra población. En los casos en que fue posible, el estudio se extendió al grupo familiar primario pudiendo detectar portadores sanos y establecer el patrón de herencia. Para poder realizar el diagnóstico en forma precoz, se desarrollaron las nuevas pruebas utilizando sangre capilar, estableciendo la presencia de la patología en neonatos de hasta 2 días de vida. El seguimiento clínico permitió observar la alta frecuencia de crisis hemolíticas asociadas a episodios febriles por lo que se decidió evaluar la posibilidad de que el agravamiento de la anemia fuera debido, en parte, a un efecto directo de la temperatura sobre los esferocitos. Se pudo observar que la hipertermia induce eriptosis mediada por la entrada de calcio a la célula, lo que podría contribuir al empeoramiento de la anemia o al desarrollo de la misma en individuos asintomáticos. La heterogeneidad clínica no pudo relacionarse al tipo de alteración proteica ni a los resultados de las pruebas diagnósticas. En la búsqueda de una alteración en común que pudiera correlacionar con la severidad de la anemia encontramos una expresión disminuida de acuaporina 1 (AQP-1), canal responsable del flujo de agua en el eritrocito, independientemente de la proteína de membrana afectada. El trabajo de tesis presentado implica un avance metodológico por haber desarrollado las nuevas técnicas diagnósticas en nuestro país y haber establecido la equivalencia para realizar los estudios con sangre capilar, conduciendo a un diagnóstico certero y precoz en los neonatos. Los antecedentes y el seguimiento clínico permitieron describir el comportamiento de la enfermedad en los pacientes pertenecientes a nuestra población. Por otra parte, los estudios in vitro, que mostraron sensibilidad de los eritrocitos de los pacientes a la temperatura y asociación de la disminución de AQP-1 en eritrocitos con la severidad de la enfermedad, abren un nuevo camino en la investigación de la esferocitosis hereditaria con una potencial aplicación terapéutica a futuro.

Abstract:
Hereditary spherocytosis (HS) is a common hemolytic anemia, characterized by genetically determined quantitative and/or qualitative abnormalities of the red cell membrane proteins. As a consequence, the connection of skeleton and bilayer gets weakened, loss of membrane surface occurs and changes in red cell lead to the formation of spherical, osmotically fragile erythrocytes, which are selectively trapped and destroyed in the spleen. Diverse mutations in different genes can generate the same disease. HS is characterized by anemia, jaundice, and splenomegaly. Although HS is the most common hereditary hemolytic anemia in Argentina, information concerning its behavior in our country is very scarce. Aims of this thesis are: a) To evaluate advances on diagnostic methodology since the development of new diagnostic tests described throughout the last decade; b) To establish demographics characteristics of HS in the population attended by our working group; c) To elucidate some mechanisms involved in the disease. In this study, standard screening tests –osmotic fragility and autohemolysis– and novel diagnostic tests –eosin-5’maleimide flow cytometry, hypertonic cryohemolysis, and flow cytometric osmotic fragility– were carried out. As these new diagnostic techniques were developed for the first time in our country, their cut-off points, sensitivity and specificity were established. Electrophoresis of membrane proteins established that spectrin and ankyrin are the most frequently found deficiencies in our population. As far as possible, direct relatives were also studied, allowing to detect silent carriers and to establish the inheritance pattern. Novel tests were also developed using capillary blood, to accomplish an earlier diagnosis. So, HS could be diagnosed in neonates aged only 2 days. Patients’ follow-up showed a high frequency of hemolytic crisis associated to febrile diseases. Therefore, we decided to evaluate whether the temperature increment on spherocytes may be one factor responsible for the worsening of hemolysis. Results showed that hyperthermia induced eriptosis mediated by calcium influx to the erythrocyte, which could play a role either for anemia worsening or for anemia development in previously asymptomatic individuals. No correlation between severity of the disease and either deficient protein or results of diagnostic tests could be demonstrated. Searching for an unique factor associated with severity of anemia, a decreased expression of aquaporin-1 (AQP-1), the channel responsible of water influx in the erythrocyte, was found irrespectively of the type of protein deficiency. This thesis implies a methodological advance due to the development for the first time in Argentina of the novel diagnostic tests, as well as the demonstration that they can also be performed with capillary blood, allowing an early and accurate diagnosis in neonates and small infants. Antecedents and clinical follow-up enabled to establish the behavior of the disease in the population of our country. Furthermore, results of in vitro studies showing a harmful effect of hyperthermia on erythrocytes of patients, and association of AQP-1 decrease with severity of the disease, open a new way on HS research with potential future applications.

Sacristán, Hernán Javier. "Evaluación de dietas, horarios de alimentación, disponibilidad de alimento, atractantes y tiempo de ayuno en juveniles de la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus (Decapoda, Parastacidae). Aplicaciones a su cultivo" (2015-03-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La langosta de agua dulce, Cherax quadricarinatus, presenta numerosas características biológicas y comerciales que la convierten en una especie apropiada para la acuicultura. Sin embargo, el crecimiento productivo ha sido poco significativo en la Argentina debido a diferentes motivos tales como la ausencia de tecnologías de cultivo, elección inadecuada del sitio de cultivo y, principalmente, por la falta de ―semilla" en distintas fases para su comercialización. Dada la escasa información existente sobre el cultivo de esta especie, se plantearon los siguientes objetivos generales: evaluar y comparar los efectos de alimentos comerciales y formulados especialmente para esta especie sobre la fisiología digestiva; estudiar el ritmo diario de secreción de las enzimas digestivas y su posible modificación en función del momento de alimentación y el período de ayuno; evaluar la inclusión de la harina de calamar como atractante y analizar el efecto de la disponibilidad de alimento luego de un ayuno corto o moderado sobre la actividad de enzimas digestivas y estudiar el efecto del ayuno prolongado y posterior alimentación sobre las respuestas bioquímicas y fisiológicas de C. quadricarinatus. Los animales alimentados con el alimento especialmente formulado presentaron una buena condición fisiológica en función de la actividad enzimática digestiva y una estructura celular y tisular conservada de la glándula digestiva. Sin embargo, la dieta diseñada para esta especie presentó baja digestibilidad in vitro de proteínas. La secreción de las enzimas digestivas no mostró un patrón diario y el momento de alimentación (matutina o vespertina) afectó la actividad de las enzimas digestivas. El ayuno moderado provocó modificaciones en el patrón de ritmo diario de secreción de las enzimas digestivas. La harina de calamar no actuó como atractante para C. quadricarinatus, mientras que la disponibilidad de alimento luego de un período de ayuno corto no causó modificaciones en la actividad de las enzimas digestivas; por el contrario, dicha actividad se vio alterada por la disponibilidad de alimento cuando los animales fueron expuestos previamente a un ayuno prolongado. En función de los resultados obtenidos sobre la disponibilidad de alimento y a estudios previos de otros autores, se propone una posible vía de regulación de la actividad de la lipasa digestiva. Finalmente, el ayuno prolongado provocó la disminución de reservas energéticas (glucógeno y lípidos), niveles de glutatión reducido, actividad de lipasa y proteasa; y alteraciones en la estructura celular y tisular de la glándula digestiva, aunque no causó un incremento en el daño oxidativo. La posterior alimentación, luego del ayuno prolongado, provocó que se restablecieran todos los parámetros anteriormente descriptos. La presente tesis aporta información novedosa e importante sobre la respuesta fisiológica de la langosta de agua dulce C. quadricarinatus que podría ser de gran utilidad para el cultivo de la especie.

Abstract:
The freshwater crayfish, Cherax quadricarinatus, have many biological and commercial characteristics which turn it into a suitable species for aquaculture. Nevertheless, productive breeding has been hardly significant in Argentina due to different reasons, such as the absence of breeding technologies, the bad choice of the breeding sites, and mainly to the lack of the ―seed" in the different stages of the commercialization process. Due to the scarce available information on the breeding of this species, the following general objectives were considered: to evaluate and compare the effects of commercial feeds, as well as specifically formulated feeds for this species based on its digestive physiology; to study the daily secretion pattern of the digestive enzymes, and its possible modification based on the time of feeding and the fasting period; to evaluate the inclusion of squid meal as an attractant, and analyze the effect of food availability on the activity of digestive enzymes after a short or moderate starvation; and to study the effect of extended starvation and subsequent feeding on the biochemical and physiological parameters of C. quadricarinatus. The animals fed with the specifically formulated feed, showed a good physiological condition according to digestive enzymatic activity, and a conserved tissue structure of the digestive gland. Notwithstanding, the designed diet for this species presented low in vitro protein digestibility. The digestive enzymes secretion did not show a daily secretion pattern, and the moment of feeding (morning or evening) affected the activity of digestive enzymes. Moderate starvation caused modifications in the pattern of the daily secretion of digestive enzymes. The squid meal did not act as an attractant for C. quadricarinatus, whereas food availability after a short starvation period did not modify the activity of digestive enzymes. On the contrary, such activity was altered by food availability when animals were previously exposed to an extended starvation. In consideration of the observed results on food availability, and other author’s previous studies, it is proposed a possible way of regulation of the activity of digestive lipase. Finally, the extended fasting caused a reduction in the energetic reserves (glycogen and lipids), reduced levels of glutathione, activity of lipase and proteinase and alterations in the cellular and tissue structure of the digestive gland, even though it did not increase the oxidative damage. The subsequent feeding, after extended starvation, brought the restoration of all previously described parameters. The present thesis contributes with new and meaningful information on the physiological responses of freshwater crayfish, C. quadricarinatus, which could be very useful for the breeding of this species.

Bordone, Melina Paula. "Estudio de las vías visuales superiores en el glaucoma experimental" (2015-03-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El glaucoma, una de las principales causas de ceguera irreversible, se caracteriza por una pérdida progresiva de las funciones visuales, que se asocia a la muerte de células ganglionares retinianas (CGRs) y atrofia de la cabeza del nervio óptico (NO). El principal factor de riesgo es el aumento de la presión intraocular (PIO). Aunque el glaucoma fue concebido como una enfermedad limitada al ojo, los axones de las CGRs son extraoculares, con componentes intraorbitales e intracraneales. En este trabajo de Tesis se examinaron los efectos del glaucoma experimental agudo y crónico sobre el sistema visual consciente (SV-C) y el sistema visual no formador de imagen (SV-NFI). El SV-C en la rata, se compone de las CGRs clásicas y sus axones que proyectan al colículo superior (CS) y al núcleo geniculado lateral (NGL). El SV-NFI se compone por las CGRs intrínsecamente fotosensibles que expresan melanopsina (CGRsm) y proyectan a los núcleos supraquiasmáticos (NSQ), al núcleo pretectal olivar (NPO) y al intergeniculado (IG), que participan en la sincronización del reloj circadiano y el reflejo pupilar, entre otros. El modelo de glaucoma agudo consistió en un aumento de la PIO a 70 mm de Hg durante 90 min (hipertensión ocular aguda, HOA), en tanto que el glaucoma crónico se indujo a través de inyecciones intracamerales de condroitín sulfato (CSU), una vez por semana, durante 15 semanas. A los 7 días post-HOA se observó una alteración significativa de la función y estructura retinianas, con una pérdida significativa de CGRs, así como cambios astro- y microgliales en el CS y una disminución en el transporte anterógrado desde la retina al CS y NGL, pero no a los NSQ y al NPO. El número de CGRsm, los niveles de melanopsina y el reflejo pupilar consensual permanecieron inalterados aún a las 4 semanas post-HOA. La administración de CSU por 6 semanas indujo alteraciones en la función retiniana y en la vía visual, una disminución en el transporte anterógrado a todas las áreas de proyección y cambios gliales a nivel del NO, el CS y la retina. En el CS, estas alteraciones incluyeron una marcada respuesta micro- y oligodendroglial y una moderada respuesta astrocitaria, que se acompañaron de una disminución del contenido lipídico. A las 15 semanas de glaucoma crónico, estas alteraciones fueron más marcadas e incluyeron alteraciones en los axones, sin afectar el número de neuronas coliculares. La minociclina previno algunas de las alteraciones inducidas por la hipertensión ocular crónica, como el déficit en el transporte anterógrado desde la retina al CS. En cuanto al SV-NFI, el glaucoma crónico indujo una caída significativa en el número de CGRsm y los niveles de melanopsina, así como en el transporte desde la retina a los NSQ y el NPO, con una disminución en el reflejo pupilar consensual. En suma, los resultados obtenidos en esta Tesis aportan datos de relevancia respecto a la participación de las áreas visuales post-retinianas en el daño glaucomatoso. Palabras clave: células ganglionares, glaucoma, glía, hipertensión ocular, minociclina, sistema visual consciente, sistema visual no formador de imagen, transporte axonal.

Abstract:
Glaucoma, one of the main causes of irreversible blindness, is characterized by a progressive loss of visual functions, which is associated to retinal ganglion cell (RGCs) death and optic nerve (NO) atrophy. The increase in intraocular pressure (IOP) is one of the main risk factors. Classically, glaucoma has been conceived as a disease limited to the eye, but axons of RGCs have extraorbital and intracranial components. In this Thesis work, the effects of acute and chronic experimental glaucoma on the conscious visual system (C-VS) and the non-image forming visual system (NIF-VS) were examined. The C-VS in rats includes classical RGCs and their axons that project to the superior colliculus (SC) and the lateral geniculate nucleus (LGN). The NIF-VS is composed by intrinsically photosensitive RGCs expressing melanopsin (mRGCs) that project to the suprachiasmatic nuclei (SCN), pretectal olivary nucleus (OPN) and intergeniculate leaflet (IG), which drive circadian rhythms and pupillary light reflex (PLR), among others. The acute glaucoma model was induced by increasing IOP to 70 mm Hg for 90 min (acute ocular hypertension, AOH), whereas chronic glaucoma was induced by intracameral injections of chondroitin sulfate (CSU), once a week, for 15 weeks. At seven days post-AOH, a significant impairment of retinal function and structure, with a significant RGCs loss, and astro- and microglial changes were observed in the CS. At the same time, a marked reduction in anterograde transport to the SC and LGN, but not to the SCN and the OPN, was observed. At 4 weeks post-AOH, mRGCs cell number, melanopsin levels, and consensual PLR remained unchanged. CSU administration for 6 weeks induced alterations in retinal and visual pathway function, a decrease in anterograde transport to all of the RGCs projecting areas, and glial changes at the level of the retina, ON, and SC. In the SC, these alterations included a marked microand oligodendroglial response and a moderate astrocytic response, which were accompanied by a decrease in lipid content. At 15 weeks of chronic glaucoma, these changes were more intense and included axonal changes, without affecting collicular neuron number. Minocycline prevented some of the alterations induced by chronic ocular hypertension, and the anterograde transport deficit to the CS. As for the NIF-VS, chronic glaucoma induced a significant reduction of mRGCs number, melanopsin levels, and anterograde transport to the SCN and OPN, as well as a decrease in consensual PLR. In summary, the results obtained in this Thesis work provide relevant information regarding the participation of post-retinal visual areas in glaucomatous damage. Keywords: retinal ganglion cells, glaucoma, glia, ocular hypertension, minocycline, conscious visual system, non-image forming visual system, axonal transport.

Rodríguez Castro, María Carolina. "Capacidad de depuración de sustancias bioaprovechables en arroyos de llanura y su relación con el arsénico" (2015-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los arroyos pampeanos tienen elevados niveles de fósforo y una alta producción primaria, mayoritariamente debida al perifiton. Esta comunidad es esencial en la retención del fósforo. Otra característica relevante de estos arroyos es la presencia de arsénico, considerado tóxico para las algas. La similitud química entre el arseniato, forma oxidada del As, y el fosfato, ocasiona toxicidad celular debida a la competencia por la entrada a la célula lo que, a una escala mayor, deriva en cambios en los procesos ecosistémicos. Nuestros objetivos fueron relevar la calidad del agua de arroyos pampeanos en relación al P y al As y entender el efecto del As sobre el metabolismo, la retención de P y la tolerancia del perifiton a distintas escalas. Se realizaron experimentos en microcosmos, colonizaciones a campo y experimentos en el campo. En microcosmos se observó que la exposición crónica al As y al P aumenta la tolerancia al As y que este disminuye la retención de P del perifiton. Con los sustratos colonizados en el campo se observó que la relación As/P podría explicar el escaso desarrollo de biomasa en algunos ambientes que, aunque tienen adecuadas concentraciones de P, el crecimiento se vería inhibido por altas concentraciones de As. Asimismo, el As reduciría la colonización del perifiton excepto en ambientes con alto contenido de P donde el As reduciría su efecto. Este estudio ayuda a dilucidar las implicancias ecológicas de la presencia de As en arroyos sistemas fluviales. Los cambios en el metabolismo de los organismos, debidos a la exposición crónica al As pueden derivar en una disminución de la retención de nutrientes, una menor eficiencia en la depuración del curso de agua o una menor capacidad para sostener una red trófica.

Abstract:
Pampean streams have high phosphorus concentration and primary production, mainly due to periphyton. This community is essential in phosphorus retention. Another important feature of these streams is the presence of arsenic, considered toxic to algae. The chemical similarity between arsenate, oxidized form of As, and phosphate causes cellular toxicity due to competition for entry into the cell which, on a larger scale, results in changes in ecosystem processes. The aim of this investigation was to study the occurrence of P and As in pampean streams and understand the effect of As on the metabolism, P retention and tolerance of periphyton at different scales. Microcosm experiments, in field colonization and field experiments were conducted. Chronic exposure to As and P in microcosms increased tolerance to As, but As and diminished P retention in periphyton. Also the As/P ratio could explain the lack of development of biomass in fieldcolonized- substrata of some environments that, despite having adequate concentrations of P, the growth would be inhibited by high concentrations of As. Also, As would reduce periphyton colonization except in environments with high P where As effect is reduced. This study helps elucidate the ecological implications of the presence of As in fluvial systems. Changes on the metabolism of organisms, due to the chronic exposure of As may result in decreased nutrient retention, reduced autodepuration of the stream or less ability to sustain a trophic web.

Odeon, María Mercedes. "Consecuencias del estrés postnatal repetido y la exposición a etanol sobre la actividad del transportador de glutamato y la conducta en ratas" (2015-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La exposición a situaciones de estrés durante los primeros años de vida ha demostrado tener profundas consecuencias en el crecimiento y en el desarrollo de un individuo. Los efectos adversos tempranos aumentan el riesgo de sufrir estrés postraumático, depresión y adicción a las drogas de abuso, como el alcohol. Nuestro objetivo fue evaluar las consecuencias a nivel conductual, bioquímico y molecular del estrés postnatal crónico (EPC) y su posible reversión por un ambiente enriquecido en ratas adultas enfocándonos en la ingesta voluntaria de alcohol. Nuestros resultados mostraron que el EPC indujo la ingesta de etanol en ratas adultas, comportamiento que fue revertido por un ambiente enriquecido. Una vez puesto a punto este modelo experimental, se realizaron estudios de los parámetros bioquímicos y conductuales que lo subyacen. El EPC y la ingesta de etanol modificaron la captación de glutamato en dos áreas cerebrales y alteraron la expresión de los transportadores de glutamato, tanto gliales como neuronales. Los niveles basales de la hormona liberadora de corticotrofina, de la hormona adrenocorticotrofina y de la corticosterona también se vieron modificados en nuestro modelo. Por último, el EPC alteró la conducta de los animales en pruebas de conflicto, aumentando significativamente la exploración de los ambientes aversivos. En conclusión, el EPC induce la ingesta voluntaria de etanol y tiene consecuencias a nivel conductual afectando claramente al sistema glutamatérgico y al eje hipotálamo-hipófisis-adrenal.

Abstract:
Exposure to stress during the first years of life has been shown to have profound effects on the growth and development of an individual. Early adverse effects increase the risk of postraumatic disorder, depression and addiction to drugs of abuse, such as alcohol. Our objective was to assess the consequences on a behavioral, biochemical and molecular level of chronic postnatal stress (CPS) and its possible reversion by an enriched environment in adult rats focusing on voluntary alcohol intake. Our results showed that CPS induced ethanol intake in adult rats, a behavior that was reversed by an enriched environment. Once we got this model we wanted to begin the study of biochemical and behavioral parameters that underlie them. CPS and ethanol intake altered glutamate uptake in two different brain areas as well as the expression of glial and neuronal glutamate transporters. The basal levels of corticotrophin-releasing-hormone, adrenocrticotrophic hormone and corticosterone were also modified in our model. Finally, the CPS altered the animal’s behavior in conflict tests, increasing significantly the exploration of aversive environments. In conclusion, CPS induces voluntary ethanol intake and has consequences on a behavioral level and induces clearly alterations in the glutamatergic system and in hypothalamic-pituitary-adrenal axis

Adrover, Ezequiela. "Alteraciones del sistema glutamatérgico en un modelo de estrés prenatal" (2015-06-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estrés experimentado durante la gestación tiene un gran impacto sobre el desarrollo del sistema nervioso fetal. Esta situación altera la capacidad del organismo para enfrentar estímulos estresantes y lo hace más vulnerable a expresar trastornos comportamentales y neuropsiquiátricos como el desorden de ansiedad, la depresión y la auto-administración de drogas. La mayoría de estas alteraciones han sido atribuidas a desbalances en los sistemas de neurotransmisión del cerebro. En los mamíferos, el glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio del sistema nervioso central y participa en el desarrollo neuronal, en la integración de las funciones, promueve la plasticidad de las conexiones sinápticas y participa en los procesos de memoria y aprendizaje. En el sistema glutamatérgico la síntesis de glutamato, la regulación de los niveles de los receptores, la función de los transportadores y el control de la función sináptica en su conjunto dependen de la interacción entre las neuronas y las células gliales. Las alteraciones en el funcionamiento de los distintos componentes de la sinapsis glutamatérgica han sido asociadas con el desarrollo de desórdenes neurológicos como los déficits cognitivos, las psicosis, desordenes de aprendizaje y memoria, así como también con la esquizofrenia. Los estudios retrospectivos y prospectivos con humanos, al igual que las investigaciones con animales de experimentación han señalado que la exposición temprana a eventos adversos puede alterar la bioquímica del sistema glutamatérgico, así como también el comportamiento de los individuos en la edad adulta. Para evaluar el efecto del estrés prenatal sobre el metabolismo, la liberación y la captación del glutamato, se sometieron a estrés por inmovilización a ratas preñadas en su última semana de gestación. Se extrajo el cerebro de la cría adulta y se utilizaron la corteza frontal y el hipocampo para medir la síntesis de glutamato, los niveles de los receptores y de los transportadores del sistema y su función. Los resultados de los ensayos, que se exponen en este trabajo, indicaron que el estrés gestacional afecta los niveles de expresión de los trasportadores de glutamato en el cerebro de las crías macho, aumentando la cantidad de vGluT-1 en la corteza frontal y elevando el ARN mensajero y la proteína de GLT1 en el hipocampo. Paralelamente se registró en estos individuos un aumento de la recaptación de glutamato en la corteza frontal efecto que no se observó en el hipocampo. Estos cambios demuestran que la influencia del estrés gestacional es específica para cada área del cerebro y que produce cambios a largo plazo que alteran el sistema de neurotransmisión glutamatérgica. Palabras claves: estrés prenatal, sistema glutamatérgico, transportadores de glutamato, ratas Wistar.

Abstract:
Prenatal stress exerts a strong impact on fetal brain development in rats impairing adaptation to stressful conditions, subsequent vulnerability to anxiety, altered sexual function, and enhanced propensity to self-administer drugs. Most of these alterations have been attributed to changes in the brain neurotransmitter systems. Glutamate is the principal excitatory neurotransmitter in the mammalian central nervous system, participating in the integration of brain function and in synaptic plasticity, memory and learning processes. The glutamatergic normal function depends on the interactions between neurons and surrounding astroglia. This relationship is necessary for the synthesis of the amino acid, the regulation of the receptors and transporters levels and for the control of synaptic transmission. Due to this particular characteristic this brain system is considered a tri-partite synapse. Dysfunction of different components of the glutamatergic system, such as receptors, transporters and glutamate levels have been associated with development of several neurological disorders, e.g. cognitive deficits, psychosis, memory and learning problems, and schizophrenia. Evidences provided by animal research, as well as retrospective and prospective studies in humans, pointed out that exposure to adverse events in early life can alter adult behaviors and neurochemical indicators of glutamate activity, suggesting that the development of the glutamatergic system is sensitive to disruption by exposure to early stressors. To study the effect of prenatal stress on the glutamate metabolism, release and uptake pregnant rats were subjected to restrain stress during the last week of gestation. Brains of the adult offspring were used to assess glutamate synthesis and levels, as well as expression and function of glutamate receptors and transporters. While glutamate metabolism was not affected it was found that prenatal stress changed the expression of the transporters, thus, producing a higher level of vesicular vGluT-1 in the frontal cortex and elevated levels of GLT1 protein and messenger RNA in the hippocampus of adult male prenatally stressed offspring. In these animals, we also observed increased uptake capacity for glutamate in the frontal cortex. On the other hand, no such changes were observed in the hippocampus brain area. The results show that changes mediated by gestational stress on the adult glutamatergic system are brain region specific. Overall, prenatal stress produces longterm changes in this system that altered the synaptic transmission of the adult brain. Key words: prenatal stress, glutamatergic system, glutamate transporters, Wistar rat.

Maselli, Gustavo Ariel. "Fosfatasas de proteínas con dominios Kelch en Arabidopsis thaliana. Estudios funcionales, estructurales y evolutivos" (2016-05-31) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las fosfatasas de proteínas con dominios Kelch (PPKL) son miembros de la familia PPP de fosfatasas de serinas y treoninas que están presentes sólo en algas verdes, plantas y alveolados. Las PPKL son proteínas bimodulares con un dominio N-terminal de tipo turbina β y un dominio catalítico en el extremo C-terminal, separados por una extensa secuencia conectora sin homología con otras conocidas. En las plantas, las PPKLs han sido descriptas como efectoras de la señalización por brassinosteroides y aparecen involucradas en el control de la proliferación celular. En este trabajo se han reevaluado los roles de los cuatro miembros de la familia PPKL presentes en Arabidopsis thaliana (BSL1, BSL2, BSL3 y BSU1) mediante análisis filogenéticos, funcionales y genéticos. BSL1 y BSL2/BSL3 pertenecen a dos clados evolutivos antiguos que han sido altamente conservados en las plantas terrestres; en cambio, los genes de tipo BSU1 se encuentran exclusivamente en la familia Brassicaceae y muestran una notable divergencia de secuencia, incluso entre especies estrechamente emparentadas. La pérdida de función simultánea de dos parálogos cercanamente relacionados, BSL2 y BSL3, causa un conjunto de alteraciones fenotípicas peculiares y novedosas; la pérdida de función de BSL1 es, en cambio, fenotípicamente silenciosa. Sin embargo, los tres parálogos más importantes cumplen juntos un papel esencial en etapas tempranas del desarrollo, en el cual BSU1 no puede suplantarlos. Estos patrones evolutivos se ven reflejados en un comportamiento inusual de las PPKL que las diferencia del resto de las fosfatasas de tipo PPP: su capacidad de participar en interacciones homotípicas. BSL1, BSL2 y BSL3 se comportan in vivo como homodímeros, mientras que BSU1 sólo es capaz de realizar interacciones débiles y/o transitorias consigo misma. Curiosamente, se encontró que los determinantes de la interacción son diferentes entre los miembros de los clados principales. En BSL1, el dominio catalítico es el principal impulsor de la interacción; en contraste, el dominio catalítico de BSL2 es necesario, pero no suficiente, y la dimerización requiere de dos porciones de secuencia en el dominio conector. El dominio conector de BSL2 se comporta en solución como una proteína intrínsecamente desordenada propensa a formar elementos de estructura secundaria frente a perturbaciones leves del medio. La presencia de un miembro altamente divergente, en conjunto con la inusual capacidad de formar homodímeros y las diferencias presentes entre parálogos con alto grado de conservación, ponen de manifiesto la complejidad de esta pequeña y esencial familia génica, al tiempo que cuestionan los fundamentos de la asignación de sus roles funcionales.

Abstract:
Protein phosphatases with Kelch-like domains (PPKL) are members of the PPP family present in green algae, plants and alveolates. PPKL are bimodular proteins with a β-propeller domain at the N-terminus and a catalytic domain akin to PP1 at the C-terminus; both domains are tethered by an intermediate sequence of unknown affiliations. In plants, PPKLs have been described as effectors of brassinosteroid signaling and cell proliferation. We reappraised the roles of the four members of the family present in Arabidopsis thaliana -BSL1, BSL2, BSL3 and BSU1- through phylogenetic, functional and genetic analyses. BSL1 and BSL2/BSL3 belong to two ancient evolutionary clades that have been highly conserved in land plants; in contrast, BSU1-type genes are exclusively found in the Brassicaceae and display a remarkable sequence divergence, even among closely related species. Simultaneous loss of function of the closely related paralogs BSL2 and BSL3 causes a peculiar array of phenotypic alterations; loss of function of BSL1 is, in turn, phenotypically silent. However, the three major paralogs play together an essential role in early stages of development, that BSU1 is unable to supplement. These evolutionary patterns mirror an unusual behaviour in PPP phosphatases: the ability of PPKL to form homotypic interactions. BSL1, BSL2 and BSL3 behave in vivo as homodimers, whereas BSU1 is only able of transient interactions. The interaction determinants are, however, different among members of the main clades. In BSL1, the catalytic domain is the main driver of interaction; in contrast, the catalytic domain of BSL2 is necessary but not sufficient, and dimerization requires two conserved sequence stretches in the linker domain. The linker domain of BSL2 behaves in solution as an intrinsically disordered protein prone to form secondary structure elements upon mild perturbations. The presence of a highly divergent member, together with the unusual ability to form homodimers and the existing differences between paralogs with a high degree of conservation, reveal the complexity of this small and essential gene family, while questioning the foundations of their functional role assignment.

Radusky, Leandro Gabriel. "Herramientas bioinformáticas para el análisis estructural de proteínas a escala genómica" (2017-03-10) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El desarrollo de herramientas computacionales para el cálculo y análisis de datos se encuentra actualmente en constante expansión en diferentes campos de la ciencia, particularmente en el campo de las ciencias de la vida, donde la cantidad de datos disponibles, generados por nuevas técnicas experimentales convierte en fundamental la implementación de técnicas computacionales para el análisis y manejo de datos y su transformación en conocimiento. En este sentido, focalizándose en el campo de la bioinformática estructural de proteínas y la quimioinformática, nos hemos concentrado en la generación de herramientas y aplicación de las mismas en problemas relacionados con la salud humana. El presente trabajo de tesis tiene como primer objetivo proponer nuevos procedimientos para el descubrimiento de blancos proteicos relevantes en organismos bacterianos, usando como caso de estudio Mycobacterium tuberculosis . El segundo objetivo de esta tesis es el de, seleccionado el blanco proteico dentro de un genoma de interés, estudiar cuáles son las características que debiera cumplir una molécula para tener buenas probabilidades unirse a dicho blanco y a partir de la misma proponer posibles ligandos derivados de bases de datos de compuestos. El tercer objetivo de esta tesis es poder comprender y predecir cuáles serán los efectos en la función de una proteína determinada (potencialmente cualquiera que sea de interés del usuario) de mutaciones no sinónimas que se produzcan en su secuencia. Los tres objetivos han sido abordados desde un punto de vista computacional y todos los métodos desarrollados pueden considerarse herramientas i nsilico. Más allá de su aplicación en organismos o proteínas puntuales como casos de estudio, todos los desarrollos pueden ser extendidos y reutilizados de manera directa y automática sobre otros organismos o proteínas. Los resultados obtenidos han sido validados contra la literatura existente, permitiendo reproducir resultados experimentales y/o manualmente curados de una manera automática, lo que supone una reducción de tiempo y recursos en los procesos en los que estas herramientas están involucradas.

Abstract:
The development of computational tool for data calculation and analysis is actually in constant expansion through the different fields of science, particularly in the field of the life sciences, where the amount of available data produced by novel experimental techniques makes indispensable the implementation of computational techniques to handle and analyze the data and its transformation into knowledge. In this sense, focusing in the field of the protein's structural bioinformatics and the cheminformatics, we concentrated our efforts in building tools and apply them in problems related to human health. The present thesis work has as first objective to propose novel procedures to discover relevant protein targets in bacterial organisms, using as case of study Mycobacterium tuberculosis . The second objective of this thesis is to, once selected the protein target within a genome, to study which are the properties that a molecule has to fulfill to have good chances of binding to this target, and based in it to propose possible ligands derived from a compound database. The third propound objective is to comprehend and predict which will be the effects in the protein function (potentially any protein of user interest) of nonsynonymous mutations produced in their sequence. All the three objectives has been addressed from a computational point of view and all the developed methods can be considered in-silico tools. Besides of its application in punctual organisms or protein targets as cases of study, all this developments can be extended and reused in a direct manner over other organisms/proteins. The obtained results has been validated against the existent literature, allowing to reproduce experimental and/or manually curated results in an automatic way, which supposes a saving of time and resources in the processes where this tools are involved.

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