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Tesis > TEMA

Física [ 418 tesis ]

Microscopía [ 7 tesis ]

Masip, Martín E.. "Microscopía combinada de alta resolucióm. Aplicaciones a la plasmónica y la biofísica" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Ciocci Brazzano, Ligia. "Obtención de imágenes óptimas por técnicas de Fourier. Aplicación al microscopio con análisis de polarización" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo proponemos e implementamos una nueva técnica para la optimización de imágenes del microscopio de gran apertura numérica. En estos sistemas la teoría escalar de la difracción no es una buena aproximación, por lo que para el desarrollo y validación de nuestra técnica, proponemos un modelo numérico original de la teoría vectorial de la difracción. Este modelo permite calcular, en el plano imagen, el campo eléctrico producido por un emisor puntual. Éste basa en una modificación del principio de Huygens-Fresnel, utilizando ondas secundarias esféricas vectoriales, en combinación con un método de integración de Monte Carlo. Aplicando este modelo estudiamos la formación de imágenes en el microscopio, considerando objetos autoluminosos no polarizados, y comparando las predicciones hechas por las teorías escalar y vectorial de la difracción, para microscopios con distintas aperturas numéricas. A partir de estos estudios desarrollamos una técnica de procesamiento de imágenes en el espacio de las frecuencias, a la que denominamos pseudodeconvolución. Ésta se basa en la corrección de la transformada de Fourier de la imagen por un factor dado por la relación simulada entre la función transferencia y una función transferencia meta, con mejores características para la resolución y el contraste. Nuestros estudios con simulaciones numéricas muestran que es posible obtener una mejora en la resolución de entre un 10 y un 15%, y una mejora cualitativa en el contraste. Aplicamos finalmente esta técnica a imágenes experimentales, verificando los resultados obtenidos en las simulaciones numéricas.

Abstract:
In this work we develop a novel technique to optimize images taken with high numerical aperture microscopes. As scalar diffraction theory is a poor approximation for these optical systems, we propose an original numerical model to calculate the image predicted by vector diffraction theory, to validate our technique. This model allows us to calculte the electric field produced in the image plane by a point source. It is based on modification of the Huygens-Frsenel principle that uses spherical vector wavelets, combined with a Monte Carlo integration method. Using this model we investigate image formation in the microscope for self-luminous unpolarized objects, comparing the predictions of scalar and vector diffraction theories, for different numerical apertures. We develop a new image processing technique, named pseudodeconvolution, based on the correction of the Fourier transform of the image. The correction factor is given by the simulated ratio between the transfer function and a goal transfer function, which is selected to provide an improvement in both the resolution and the contrast. Our results show that it is possible to improve the original image resolution by about 10 to 15%, and also obtain a contrast enhancement. Finally, we apply our technique to experimental images, verifying the results obtained by simulated images.

von Bilderling, Catalina. "Detección, localización y análisis de eventos singulares de reconocimiento molecular mediante microscopías avanzadas" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células pueden ser concebidas como dispositivos capaces de procesar información bioquímica, cuya respuesta al entorno depende del estado funcional de proteínas organizadas espacialmente en una compleja red. Entender la función celular integrando la actividad molecular con la organización espacial representa un gran desafío para la biología moderna. Las fuerzas mecánicas tienen un papel importante en la organización, crecimiento, maduración y función de los tejidos. A nivel celular la transmisión de las fuerzas externas, a través de las adhesiones focales (FAs) y uniones adherentes, parece controlar la maduración o el ensamblado de estas adhesiones e iniciar las cascadas de señalización. En respuesta a las fuerzas aplicadas externamente, las células reacondicionan activamente la organización y la actividad contráctil del citoesqueleto y redistribuyen sus fuerzas intracelulares. Con el objetivo de estudiar la regulación dinámica de los contactos adhesivos y la arquitectura del citoesqueleto de la célula así como su influencia en la señalización celular, en este trabajo de Tesis se estudió la relación entre una fuerza (local o global) aplicada a la célula y el ensamblado, mecánica y dinámica de las adhesiones focales. El objetivo principal de este trabajo fue estudiar la respuesta dinámica de las proteínas de las FAs ante un estímulo mecánico controlado. En este contexto, se implementaron y desarrollaron técnicas de Microscopía de Fluorescencia, Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) y Espectroscopía de Fuerza (FS) aplicadas a distintos sistemas biomoleculares, desde plataformas biomiméticas hasta células vivas. Se optimizaron las mediciones de fuerza a nivel intermolecular y se investigaron la dinámica de las proteínas y las interacciones proteína-proteína en las FA de células vivas. Se implementó la FS mediante el estudio de las fuerzas de interacción entre grupos funcionales químicos y el sistema modelo ligando-receptor, biotina-estreptavidina. Se logró caracterizar la fuerza de interacción a nivel de moléculas individuales entre el sitio de unión RGD de la fibronectina y su receptor, la proteína integrina, en la membrana de células HC11 in vivo. Se obtuvo una fuerza característica de ruptura del complejo RGD-integrina de (37.6 ± 0.7) pN. Se expresaron las proteínas de las FAs zixina, vinculina, FAK, paxilina, integrina y actina unidas a proteínas fluorescentes visibles (VFPs) en células epiteliales mamarias de ratón HC11. Se diseñó y construyó un dispositivo estirador de células, para explorar la relación entre un estímulo mecánico global y los cambios en la dinámica y en las interacciones entre las proteínas. Mediante técnicas de microscopía de fluorescencia como FRAP (Recuperación de la Fluorescencia luego del Fotoblanqueo), FRET (Transferencia de Energía Resonante de Förster) y N&B (Número y Brillo), se estudió el estado mecánico general de las FAs, determinando la tasa de disociación de las proteínas a las FAs (koff) y el estado de agregación de las mismas. Se trabajó en la adaptación de un microscopio combinado AFM/ Fluorescencia desarrollado en el Laboratorio de Electrónica Cuántica (FCEN-UBA) para su utilización en condiciones fisiológicas y con células vivas. Se demostró que dicho microscopio es capaz de obtener imágenes combinadas en condiciones fisiológicas, con alta calidad óptica y con un rango vertical para AFM que permite que la visualización de células in vivo sea de rutina. Mediante la medición de las fuerzas de interacción entre el par ligando-receptor biotina-estreptavidina, se corroboró que el microscopio combinado alcanza la resolución requerida para cuantificar fuerzas de interacción entre moléculas individuales. Utilizando este nuevo microscopio combinado, se estudió mediante fluorescencia la evolución temporal de las proteínas de las FAs, zixina y vinculina, en respuesta a un estímulo mecánico local aplicado por AFM con un sensor de fuerza funcionalizado. Se observó el remodelado de las FAs maduras y el reclutamiento de la proteína vinculina para la formación de nuevas FAs en respuesta a la fuerza local aplicada. En este contexto, se presenta una estrategia novedosa que permite obtener imágenes de alta resolución y medir fuerzas al nivel de moléculas individuales en tiempo real. Nuestra estrategia combina metodologías de alta resolución para sensar y caracterizar cambios físicos/bioquímicos en células vivas. En conclusión, se implementaron técnicas de AFM y fluorescencia para estudiar algunos aspectos de la compleja maquinaria celular. De la correlación directa de estas técnicas en el nuevo microscopio combinado estaríamos en condiciones de abordar nuevos desafíos fundamentales en el entendimiento de la biofísica y la biología celular.

Abstract:
The cell can be conceived as a biochemical information-processing device whose response to the environment depends on the state of spatially organized networks of protein activities. Understanding cell function by integrating molecular activities with spatial organization is an important challenge for modern biology. Mechanical forces play an important role in the organization, growth, maturation, and function of living tissues. At the cellular level, many of the biological responses to external forces originate at two types of specialized structures: focal adhesions and adherent junctions. In order to explore the dynamic regulation of adhesive contacts and of the cytoskeleton architecture of cells, as well as its resultant influence on cellular activities, we are focused on the relationship between local force applied to the cell and the assembly, mechanics and dynamics of focal adhesions (FA). The goal of our work is to study the dynamic response of FA proteins when a precise and punctual force is applied. In this context, we have applied Fluorescence Microscopy (FM), Atomic Force Microscopy (FM) and Force Spectroscopy (FS) techniques on different biomolecular systems -from biomimetic platforms to living cells- in order to optimize force measurements at the intermolecular level and investigate protein dynamics and protein-protein interactions on FA of living cells. We have implemented FS measurements by studying the interaction forces between chemical functional groups and the well known ligand-receptor pair, biotinstreptavidin. We were able to characterize the fibronectin binding site RGD-integrin interaction at the single molecule level by measuring rupture forces between RGD functionalized probe-tips and the integrin receptors in the membrane of living HC11 cells. We found a characteristic interaction force of (37.6 ± 0.7) pN for the single RGDintegrin complex. We have expressed in HC11 epithelial mammalian living cells the FA component proteins zyxin, vinculin, FAK, paxilin, integrin and actin tagged with visible fluorescent proteins (VFPs), and also designed and constructed a cell stretching device to explore the relationship between a global mechanical stimulus and changes in protein dynamics and interactions. By fluorescence techniques such as fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), Förster Resonance Energy Transfer (FRET) and Number and Brightness (N&B), we studied the mechanical state of the FAs, determining the dissociation rate constant parameter (kOFF) and the aggregation state of different FAs proteins. We worked on the adaptation of a combined AFM/Fluorescence microscope, designed and assembled at the Quantum Electronics Lab (FCEyN-UBA) for working under physiological conditions in liquid environments. The combined microscope was tested and validated by successfully imaging of living cells. We also validated the possibility of measuring interaction forces based on molecular recognition of the pair biotin-streptavidin. With this novel combined microscope we studied by fluorescence the temporal evolution of the FAs proteins, vinculin and zyxin, in response to a mechanical local and functional stimulus applied with an AFM force-probe. We were able to observe the remodeling of mature FAs and the recruitment of vinculin to form nascent FAs in response to the locally applied force. In this context, we present a new approach that can be employed for real-time, high-resolution imaging and measurements of forces at the single molecule level. Our strategy combines very highly sensitive technologies for probing and detection of biochemical/physical changes within living cells. In summary, we implemented both AFM and fluorescence techniques to study some aspects of the complex molecular machinery of the cell. From the direct correlation of these techniques in the new combined microscope we may now afford a new level of insight into cell biology and biophysics.

Bianchi, Micaela. "Mecanotransducción celular. Correlación entre las propiedades mecánicas y la organización-dinámica de proteínas de adhesión focal en células vivas" (2016-03-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de señales externas, químicas y físicas, integrar y analizar esta información y, en consecuencia, cambiar su morfología, dinámica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivel celular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos tipos de estructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y uniones adherentes (célula-célula). Las adhesiones focales son complejos de proteínas dispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a través de receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitios de adhesión son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadrados que a menudo están localizadas en la periferia de las células, y que además funcionarían como organelas de señalización en el proceso de mecanotransducción celular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poder integrar y combinar distintas técnicas que nos permitan analizar la dinámica intracelular, la biomecánica de la célula/sustrato, detección de las fuerzas generadas en/por la célula, y observar la respuesta global de la célula en las distintas condiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecánica y dinámica de las proteínas de adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico en células vivas requiere de técnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada la dinámica de eventos localizados en la célula. Estos métodos deben contar con una resolución espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventos transientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en este trabajo de Tesis, distintas microscopías y espectroscopías de alta resolución espacial y temporal, en combinación con técnicas de biología molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecánicas de sustratos y células, en una primera etapa se implementó un modo de operación avanzado en microscopía de fuerza atómica (AFM), denominado PF-QNM (del inglés, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultáneamente la imagen de topografía, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades de elasticidad, adhesión, dureza, disipación de energía y deformación superficial. Se utilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecánicas de manera tal de cubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades de sustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), así también como la línea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesión focal, la estrategia fue transfectar células de epitelio mamario de ratón (HC11), con proteínas componentes de la adhesión (por ejemplo, zixina, FAK, vinculina, paxilina) fusionadas a proteínas fluorescentes visibles. De esta forma, empleando microscopías y espectroscopías de fluorescencia, es posible visualizar la expresión de las proteínas, registrar su localización y evolución en el tiempo y, mediante diferentes análisis, extraer información cuantitativa de dinámica, cinética y organización de los complejos de adhesión focal. El análisis de la dinámica y difusión de los complejos de adhesión focal y sus interacciones, fueron realizados mediante la espectroscopía por correlación de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron los coeficientes efectivos de difusión de las proteínas mencionadas. El análisis de la correlación cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteínas de adhesión focal (FCCS) permitió evidenciar la interacción entre distintas proteínas adhesivas de la adhesión focal. La cinética de disociación de proteínas desde la adhesión focal fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia luego del fotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organización y dinámica de adhesiones focales en células vivas en respuesta a un estímulo mecánico externo global, se empleó un dispositivo de tracción equibiaxial adaptado para ser usado en simultáneo con el microscopio confocal FV1000. La tensión mecánica aplicada por el dispositivo de tracción es capaz de inducir cambios en el área de las células vivas al igual que en las adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecánico se observó un mayor reclutamiento y translocación de la proteína zixina acompañado de una disminución significativa de su constante de disociación. Con el fin de correlacionar las propiedades mecánicas del sustrato y la fuerza de tracción generada por la célula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista la organización y dinámica de las proteínas en la adhesión focal, se implementó la Microscopía de Fuerzas de Tracción (TFM). Esta técnica posee la sensibilidad necesaria para medir la fuerza de tracción generada por la célula sobre un sustrato elástico y transparente, la cual se puede combinar con otras técnicas de microscopía de fluorescencia como FRAP o FCS. El análisis de los datos TFM para la proteína zixina permitió obtener los mapas de deformación y de fuerzas de tracción, a la vez que se evaluó la cinética de disociación mediante FRAP.

Abstract:
Cells can detect, generate and respond to a wide range of external, chemical and physical signals, integrate and analyze this information and, consequently, change their morphology, dynamics, behavior and, eventually, their fate. At the cellular level, biological responses to external forces are originated from two types of specialized structures: focal adhesions (cell-extracellular matrix) and adherens junctions (cell-cell). Focal adhesions are protein complexes arranged in multi-molecular assemblies that bind extracellular matrix, through integral membrane receptors, to cytoskeletal components. These adhesion sites are flat, elongated and few square microns which are often located in the periphery of the cells, and also function as signaling organelles in the cellular mechanotransduction process. One of the challenges presented to study the system is to be able to integrate and combine different techniques that allow us to analyze the intracellular dynamics, biomechanics of the cell/substrate, detection of the forces generated in/by the cell, and observing the global response of the cell in different conditions. Thus, the study of the structure, mechanics and dynamics of focal adhesion proteins in response to a mechanical stimulus in living cells requires to visualize and characterize in an integrated way the dynamics of events located in the cell. These methods must have a high spatial and temporal resolution, so as to detect transients and highly localized events. In this context, they have been implemented in this thesis, different microscopies and spectroscopies with high spatial and temporal resolution, combined with the techniques of molecular and cell biology. In order to characterize the mechanical properties of substrates and cells, in a first step, an advanced mode operation was implemented in atomic force microscopy (AFM), called PF- QNM (Peak Force Quantitative nanomechanical Property Mapping). This mode allows simultaneously obtaining the topography, together with quantitative maps of the properties such as elasticity, adhesion, hardness, energy dissipation and surface deformation. Various systems were used with different mechanical properties so as to cover the wide range from GPa to kPa, and study the properties of substrates (glass, silicone membranes and polyacrylamide gels), as well as the cell line used in the Thesis. At focal adhesion level, the strategy was to transfect mouse mammary epithelial cells (HC11), with adhesion proteins (eg zixina, FAK, vinculin, paxillin) fused to visible fluorescent proteins. Thus, using fluorescence microscopy and spectroscopy, it is possible to visualize the expression of proteins, register their location and evolution over time and through different analysis, extract quantitative information about the dynamics, kinetics and organization of focal adhesion complexes. The analysis of the dynamics and distribution of focal adhesion complexes and their interactions were performed by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). The effective diffusion coefficients of the proteins mentioned were characterized. The analysis of the crosscorrelation of fluorescence fluctuations of pairs of focal adhesion proteins (FCCS) allowed to demonstrate the interaction between various adhesive proteins in focal adhesion. The dissociation kinetics of proteins from the focal adhesion was evaluated by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) under different conditions. To study the changes generated in the organization and dynamics of focal adhesions in living cells, in response to a global external mechanical stimulus, an equibiaxial traction device adapted to be used simultaneously with the FV1000 confocal microscope was used. Mechanical tension applied by the pulling device is able to induce changes in the area of living cells as well as in focal adhesions. In response to mechanical stretch increased, the recruitment and translocation of the protein zyixin accompanied by a significant decrease in the dissociation constant was observed. To correlate the mechanical properties of the substrate and the traction force generated by the cell at a focal adhesions level, without losing sight of the organization and dynamics of proteins in focal adhesion, traction force microscopy was implemented (TFM). This technique has the sensitivity necessary to measure the traction force generated by the cell on an elastic and transparent substrate, which can be combined with other fluorescence microscopy techniques such as FRAP or FCS. Analysis of TFM data for zyxin yielded deformation and traction forces maps, while the dissociation kinetics was evaluated by FRAP.

Piegari, Estefanía. "Interacción entre geometría y dinámica en la modulación de señales intracelulares de calcio" (2016-03-30) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las señales de Ca²⁺ son ubicuas y juegan un rol importante en numerosos procesos fisiológicos como la fertilización o la muerte celular. Su versatilidad se basa en la variedad de comportamientos espacio-temporales que puede mostrar la concentración de calcio intracelular y en que distintos comportamientos pueden inducir respuestas diferentes. La liberación de Ca²⁺ desde el retículo endoplasmático (RE) hacia el citosol a través de receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (RIP3s) es una componente clave dentro de los mecanismos de señalización por Ca²⁺. Los RIP3s necesitan unir IP3 y Ca²⁺ para abrirse por lo que la liberación de Ca²⁺ a través de un único RIP3 puede inducir la apertura de otros canales vecinos, mecanismo que se conoce como liberación de calcio inducida por calcio o CICR por las siglas en inglés. Los RIP3s aparentemente se organizan en cúmulos sobre la membrana del RE (clusters). Si el CICR se encuentra limitado a un cluster, las señales pueden permanecer localizadas (puffs). En caso contrario, pueden convertirse en ondas que se propagan entre clusters. Los puffs son los ladrillos de construcción de esas señales más globales que se propagan por toda la célula. Por este motivo, existe un gran interés en la determinación de las propiedades de los puffs, especialmente en vista de la actual controversia sobre la distribución espacial de los RIP3s activables. Las señales de calcio, por otro lado, pueden remodelarse a través de varios mecanismos, entre ellos, el atrapado del Ca²⁺ por parte de buffers. Éstos no sólo disminuyen la concentración de Ca²⁺ libre sino que modifican su distribución espacio-temporal de distintos modos dependiendo de su cinética. Los puffs de Ca²⁺ se han observado en células intactas con técnicas ópticas mostrando que son intrínsecamente estocásticos. La obtención de una imagen correcta de la dinámica de los eventos entonces implica ser capaz de detectar todo el rango de tama~ nos de puffs. Éstos se observan usando indicadores de Ca²⁺ de una longitud de onda visible y buffers exógenos lentos (por ej; EGTA) para disrumpir el CICR entre clusters. Los indicadores de única longitud de onda aumentan su uorescencia al ligar calcio. De esta manera, generan imágenes que dependen fuertemente de su cinética, transporte y propiedades fotofísicas. Por este motivo, es de particular importancia determinar los artefactos que generan las condiciones del experimento. La propia existencia de los puffs depende de que los RIP3s están organizados en cúmulos. Una distribución uniforme de receptores debería dar lugar típicamente a señales propagantes tipo ondas. Los ovocitos de Xenopus laevis son un sistema experimental ventajoso para estudiar estas señales. Durante la fertilización se evoca una onda de Ca²⁺ que se propaga por toda la célula. La fertilización ocurre en el huevo maduro. Se ha observado que, al madurar el ovocito, su RE se configura y la distribución de los RIP3s parece ser más uniforme. Esto tiene un correlato en las características de las señales evocadas en los ovocitos maduros. En esta Tesis se combinaron experimentos, un análisis teórico y simulaciones numéricas para evaluar de qué modo la geometría de la distribución de canales se combina con alguno de los otros aspectos que in uyen sobre la distribución de calcio libre para determinar las características de las señales. El primer aporte fue introducir un método que permite establecer clases equivalentes de experimentos de obtención de imágenes realizados en condiciones diferentes, donde la clase está determinada por la relación señal-ruido que predice el método. Éste también puede utilizarse para estimar el tamaño de las señales más pequeñas que pueden observarse de manera confiable con cada arreglo y para generar imágenes de uorescencia numéricamente con ruido realista. Esta Tesis también contribuyó a estudiar si la presencia del indicador o del EGTA en distintas condiciones experimentales altera la dinámica intracelular de Ca²⁺, en particular, analizar si son capaces de detectar puffs de Ca²⁺ con similar precisión y de qué modo las distintas configuraciones experimentales afectan las propiedades de los puffs observados y la dinámica del Ca²⁺ subyacente. Se pudo determinar que aunque el indicador o el EGTA no alteran la dinámica intracluster del Ca²⁺, el conjunto de eventos observables del experimento es diferente dependiendo del grado de acoplamiento entre clusters. El estudio, por otro lado, permitió inferir que los puffs con mayor liberación de Ca²⁺ provienen de cúmulos donde los RIP3s están muy cerca unos de otros. Para estudiar en más detalle la disrupción del CICR entre clusters vecinos que inducen los buffers lentos, se realizaron experimentos utilizando simultáneamente dos indicadores de calcio de distinta cinética. Utilizando el método introducido pudimos confirmar nuestra conclusión previa sobre cómo se modifica el conjunto de eventos que se evoca en presencia de buffers lentos. Por otro lado, determinamos que la presencia de buffers rápidos da lugar a liberaciones de Ca²⁺ más prolongadas tal vez debido a que reducen el efecto inhibidor del Ca²⁺ sobre los RIP3s. En relación a la razón por la que los buffers lentos disrumpen el acoplamiento entre clusters pudimos concluir que su presencia disminuye el Ca²⁺ basal, aunque no tanto como para explicar la disrupción. El análisis de la diferente distribución espacio-temporal de los buffers lentos y rápidos parecería indicar la presencia de RIP3s en el espacio entre clusters que podrían ser "silenciados" por los buffers lentos evitando así la propagación de las señales entre cúmulos. Finalmente, en la Tesis se han mostrado también resultados preliminares de señales de calcio que se observan en células maduradas, cuyos cambios pueden explicarse en términos de una distribución espacial distinta de RIP3s.

Abstract:
Ca²⁺ signals are ubiquitous and play a relevant role in numerous physiological processes as fertilization or cell death. Their versatility relies on the variety of spatiotemporal behaviors that the intracellular calcium concentration can display and that different behaviors can induce different end responses. Ca²⁺ release from the endoplasmic reticulum (ER) into the cytosol through inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP3Rs) is a key component of the Ca²⁺ signaling toolkit. IP3Rs need to bind IP3 and Ca²⁺ to become open an therefore. Therefore, Ca²⁺ released through one open IP3R can induce the opening of neighboring ones, a mechanism that is knwon as Calcium Induced Calcium Release (CICR). IP3Rs are apparently organized in clusters. The signals can remain localized (i.e., Ca²⁺ puffs) if CICR is limited to one cluster or become waves that propagate between clusters. Puffs are the building blocks of global signals that propagate throughout the cell. Thus, there is great interest in determining puff properties, especially in view of the current controversy on the spatial distribution of activatable IP3Rs. Moreover, calcium signals can be remodeled through various mechanisms, such as Ca²⁺ buffers. Buffers not only decrease the concentration of free Ca²⁺ but also modify its spatial and temporal distribution in different ways depending on their kinetics. Ca²⁺ puffs have been observed in intact cells using optical techniques showing that they are intrinsically stochastic. Obtaining a correct picture of their dynamics then entails being able to detect the whole range of puff sizes. Puffs are usually observed using visible single-wavelength dyes and slow exogenous buffers (e.g., EGTA) to disrupt intercluster CICR. Single-wavelength dyes increase their uorescence upon calcium binding producing images that are strongly dependent on their kinetic, transport and photophysical properties. Thus, determining the artifacts that the imaging setting introduces is particularly relevant. The very existence of puffs depends on the fact that IP3Rs are organized in clusters. A uniform distribution of receptors should typically lead to waves-like (propagating) signals. Xenopus laevis oocytes are an advantageous biological system to study these signals since Ca²⁺ release from the ER only occurs through IP3Rs. During fertilization a Ca²⁺ wave that propagates throughout the cell is evoked. Fertilization occurs in the mature egg. It has been observed that maturation of the oocyte induces a reorganization of the ER whereas IP3Rs seem to be distributed more uniformly on its membrane. This has its counterpart on the properties of the Ca²⁺ signals that are evoked in mature oocytes. In this Thesis we have combined experiments, theoretical analyses and numerical simulations to evaluate in which ways the geometry of the channel distributions interacts with the other aspects that affect the intracellular Ca²⁺ dynamics to determine the characteristics of the signals. The first contribution of this Thesis was to introduce a method that establishes equivalence classes of Ca²⁺ imaging experimental conditions, where the class is determined by the signal-to-noise ratio that is predicted by the method. The method can also be used to estimate the smallest signals that can reliably be observed with each experimental setting and to produce numerically generated Ca²⁺ images with realistic noise. The Thesis also contributed to study to what extent experiments performed with different dyes and/or alter the intracellular Ca²⁺ dynamics, in particular, if they are able to detect Ca²⁺ puffs with similar accuracy and in which ways the different experimental conditions affect the observed puff properties or the underlying dynamics of Ca²⁺ itself. We could determine that, although the dye or EGTA does not alter the intra-cluster dynamics, the set of observable events is different depending on the degree of inter-cluster coupling/uncoupling that is induced by the experimental conditions. An analysis of the observations allowed us to show that the events with the largest amounts of released Ca²⁺ came from clusters with densely packed active IP3Rs. To study in more detail the way in which slow buffers disrupt the inter-cluster CICR experiments were performed using two calcium dyes of different kinetics simultaneously. Applying the method introduced previously in the Thesis we could confirm our previous conclusion on how the set of events that is evoked is modified in the presence of slow buffers. We determined that the presence of fast buffers, on the other hand, results in longer periods of Ca²⁺ release perhaps because they reduce the inhibitory effect of Ca²⁺ on IP3Rs. With respect to the way in which the slow buffers disrupt the inter-cluster coupling we could conclude that their presence decreases basal Ca²⁺, although not enough to explain the disruption. The analysis of the different spatial and temporal distribution of Ca²⁺ bound to slow and fast buffers that is observed in the experiments seems to indicate that there are IP3Rs in the space between clusters that could be silenced by the slow buffers thus preventing the propagation of signals between clusters. Finally, in the Thesis we have also shown preliminary results on calcium signals observed in mature cells, whose changes can be explained in terms of a different spatial distribution of IP3Rs with respect to the case of immature oocytes.

Bordenave, Martín Diego. "Mediciones con resolución nanométrica mediante depleción por emisión estimulada" (2016-11-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Desde los estudios de Ernst Abbe, a finales del siglo XIX, se dio por aceptado que la microscopía óptica de campo lejano tenía un límite en su poder de resolución espacial: objetos que se encontraran más cercanos entre sí que media longitud de onda de la luz utilizada no podrían distinguirse. Sin embargo, en las últimas dos décadas se han desarrollado un número de técnicas basadas en fluorescencia que mantienen las ventajas de la microscopía óptica de campo lejano, y proporcionan una resolución espacial limitada únicamente por el tamaño del marcador fluorescente. Estas técnicas se denominan microscopías de superresolución o nanoscopías de fluorescencia e involucran la transición entre estados moleculares de los fluoróforos que permitan o no la emisión de fluorescencia. En particular, en la nanoscopía STED (Stimulated Emission Depletion), se produce esta transición mediante depleción por emisión estimulada, con el fin de desactivar fluoróforos en regiones controladas del espacio y de esta forma reducir el volumen efectivo de observación. En el marco de esta tesis, y gracias a una colaboración formal y activa con Stefan W. Hell (Department of NanoBiophotonics, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany), galardonado en 2014 con el premio Nobel de Química por su trabajo pionero en las nanoscopías de fluorescencia, se construyó el primer nanoscopio STED de Argentina (Grupo de Nanofísica Aplicada, Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires (BA), Argentina). El nanoscopio STED se aplicó para indagar y dilucidar problemas biofísicos con resolución nanométrica. En colaboraciones interdisciplinarias se estudió: (a) la organización de proteínas en la membrana del Trypanosoma cruzi, en colaboración con el Grupo de Inmunología Molecular, Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB), Universidad Nacional de San Martín (UNSAM), CONICET, BA, Argentina; (b) procesos de reestructuración del citoesqueleto de los conos de crecimiento durante la polarización neuronal, en colaboración con el Laboratorio de Neurobiología, Instituto de Investigación Médica de Córdoba (INIMEC), CONICET, Córdoba, Argentina; y (c) la formación y estabilidad de estructuras periódicas de actina en procesos de degeneración axonal, en colaboración con el Laboratorio de Neurobiología, INIMEC, CONICET, Córdoba, Argentina y el Grupo de Neurobiología Molecular, Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires (IBIOBA), CONICET, BA, Argentina. Asimismo, se desarrolló un nuevo esquema de implementación de la nanoscopía STED que expande considerablemente su campo de aplicación. Generalmente, luz de longitud de onda situada en la zona roja lejana del espectro de emisión del fluoróforo es utilizada para inducir el fenómeno de emisión estimulada. En esta tesis, se demuestra que STED continuo (CW) también es posible utilizando longitudes de onda de STED ubicadas en el máximo de emisión, donde la sección eficaz de emisión estimulada puede ser hasta 10 veces mayor. Como resultado, es posible obtener imágenes de STED utilizando potencias proporcionalmente menores. Además, fluoróforos que se consideraban inadecuados para ciertas configuraciones espectrales de nanoscopía STED, pueden ser utilizables.

Abstract:
Since the studies made by Ernst Abbe, by the end of the XIXth century, it was accepted that far field optical microscopy had a limit in its spatial resolution: objects found closer together than half the wavelength of the light used would not be distinguished apart. However, in the last two decades, a number of techniques based on fluorescence have been developed, that keep all the advantages of far-field optical microscopy and provide spatial resolution only limited by the size of the fluorescent marker. These techniques are called super-resolution fluorescence microscopies or fluorescence nanoscopies and they involve the transition between molecular states of the fluorophores that allow or not fluorescence emission. Particularly, in STED (Stimulated Emission Depletion) nanoscopy, this transition is produced by stimulated emission depletion, in order to disable fluorophores in controlled regions of space and thereby reduce the effective volume of observation. In the framework of this thesis, and supported by a formal and active collaboration with Stefan W. Hell (Department of NanoBiophotonics, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany), awarded in 2014 with the Nobel Prize in Chemistry for his pioneering work in fluorescence nanoscopies, the first STED nanoscope of Argentina was built (Grupo de Nanofísica Aplicada, Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires (BA), Argentina). The STED nanoscope was applied to investigate and elucidate biophysical questions with nanometric resolution. In interdisciplinary collaborations it was studied: (a) the organization of proteins in the membrane of Trypanosoma cruzi, in collaboration with the Group of Molecular Immunology, Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB), Universidad Nacional de San Martín (UNSAM), CONICET, BA, Argentina; (b) processes of cytoskeleton restructuring in growth cones during neuronal polarization, in collaboration with the Laboratory of Neurobiology, Instituto de Investigación Médica de Córdoba (INIMEC), CONICET, Córdoba, Argentina; and (c) the formation and stability of periodic structures of actin in the process of axonal degeneration, in collaboration with the Laboratory of Neurobiology, INIMEC, CONICET, Córdoba, Argentina and the Group of Molecular Neurobiology, Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires (IBIOBA), CONICET, BA, Argentina. Also, a new implementation scheme of STED nanoscopy was developed, which expands considerably its field of application. Generally, light of a wavelength located in the far-red zone of the emission spectrum of the fluorophore is used to induce stimulated emission. In this thesis, it is shown that continuous wave STED (CW), is also feasible using STED wavelengths located at the maximum of emission, where the stimulated emission cross section can be up to 10 times higher. As a result, super-resolved STED images are obtained using proportionally less power. Also, fluorophores considered unsuitable for certain spectral configurations of STED nanoscopy, may become usable with this scheme.

Barabas, Federico M.. "Nanoscopía de fluorescencia por localización estocástica de moléculas individuales" (2017-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Hasta hace unos 20 años se creía que la difracción de la luz imponía un límite fundamental de unos 200 nm a la resolución espacial de un microscopio óptico. Las nanoscopías de fluorescencia, también llamadas microscopías de superresolución, han quebrado esta barrera y permiten en teoría alcanzar la máxima resolución espacial con sentido físico, es decir el tamaño mismo de la fuente de luz. En la práctica, sin embargo, la resolución se ve limitada a unos 20 nm por efecto de variables experimentales como la relación señal-ruido y el fotoblanqueo de los marcadores fluorescentes. Además, las nanoscopías de fluorescencia mantienen las ventajas de la microscopía de fluorescencia tradicional, como el acceso poco invasivo y la alta sensibilidad y especificidad. Se denomina "localización de una molécula individual" al proceso numérico por el cual se extrae la posición de un emisor único a partir de la medición de su patrón de intensidad. La nanoscopía por localización estocástica de moléculas individuales (o simplemente "nanoscopía por localización") consiste en la adquisición secuencial de imágenes en las que en cada una un subconjunto estocástico de los fluoróforos de una muestra son resueltos individualmente. Como los patrones de emisión no se superponen, la precisión de localización solo depende del número de fotones detectados de cada emisión. La imagen final se construye con las posiciones de cada fluoróforo previamente localizado. Para obtener una imagen de superresolución es necesario que los marcadores estén separados por distancias menores a su imagen limitada por difracción y que éstos emitan de manera intermitente (que se enciendan y apaguen), de manera que en algún momento puedan observarse individualmente. La nanoscopía por localización comprende a un conjunto de técnicas diferenciadas entre sí de acuerdo al mecanismo que permite el encendido y apagado de los marcadores fluorescentes. En la presente Tesis se estudian aspectos fundamentales e instrumentales de la nanoscopía por localización y se la aplica al estudio de preguntas biológicas. En el Capítulo 1 se desarrollan los conceptos fundamentales y limitaciones de la microscopía de uorescencia, y se introducen las técnicas de superresolución. En el Capítulo 2 se detallan los métodos y estado del arte de la nanoscopía por localización. En el Capítulo 3 se caracteriza el nanoscopio por localización con posibilidad de obtener imágenes en 3D y a dos colores de emisión, que fuera construido como parte del trabajo de Tesis. Finalmente, en los Capítulos 4 y 5 se describen aplicaciones de dicho nanoscopio en dos proyectos de relevancia biológica: el estudio en neuronas hipocampales de la estructura periódica de espectrina y la distribución espacial de proteínas presentes en la membrana del Trypanosoma cruzi que median la interacción entre el parásito y el huésped.

Abstract:
Until twenty years ago it was considered that the diffraction of light imposed a fundamental limit of around 200 nm to the resolution of an optical microscope. Fluorescence nanoscopy, also known as super-resolution uorescence microscopy, has overcome this limit. It achieves the theoretical maximum spatial resolution, which is the size of the light source itself. In practice, however, the resolution is limited to around 20 nm by experimental factors like the signal-to-noise ratio and the photobleaching of uorescent markers. Besides, fluorescence nanoscopy maintains the advantages of traditional fluorescence microscopy, like its low invasivity and its high sensitivity and specificity. Single-molecule localization is the numerical process that extracts the single molecule position from measuring its emission pattern. Sigle-molecule stochastic localization nanoscopy (or simply "localization nanoscopy") consists of the sequential acquisition of images of well separated fluorophores from a stochastic subset of all fluorophores in the sample. As their emission patterns do not overlap, the position of each molecule can be determined with a precision only limited by the number of detected photons. A final super-resolved image is reconstructed from the localizations of all the fluorophores of the sequence of images. In order to obtain a super-resolved image, it is essential to have fluorescent markers closer to each other than the diffraction limit. Also, they must intermittently switch on and off, so that at a given point in time they can be imaged individually. Stochastic localization nanoscopy denotes a group of techniques each with a different mechanism for the on-off switching of the fluorophores. In this thesis we study fundamental and instrumental aspects of localization nanoscopy and we apply it to the study of biological questions. In Chapter 1 the fundamental concepts, potential and limitations of fluorescence microscopy are presented, followed by an introduction to super-resolution techniques. The fundamental principles and methods of single-molecule localization fluorescence nanoscopy are explained in detail in Chapter 2. Chapter 3 gives a complete description of the nanoscope built as part of this thesis work at the Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION), along with guidelines for its operation and an illustration of its performance. In Chapters 4 and 5 two biological applications of the nanoscope are presented, that address nanoscale organization proteins: firstly, the quantification of the periodic spectrin structure present in hippocampal neurons and secondly, the spatial distribution of proteins on the outer membrane of the Trypanosoma cruzi that mediate the parasite-host interaction. Finally, the conclusions of this thesis and future perspectives are unfolded in Chapter 6.

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