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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Virología [ 75 tesis ]

León, Marta Esther Lucrecia. "Drogas inhibidoras de la multiplicación del virus Junín" (1978) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Damonte, Elsa Beatriz. "Arenavirus : Persistencia de los virus Junín (FHA) y Tacaribe en células cultivadas in vitro" (1978) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Dellepiane, Nora Ida. "Estudio de las cepas de virus rábico utilizadas en la preparación de vacuna de cerebro de ratón lactante (tipo Fuenzalida - Palacios)" (1984) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo se comparó la capacidad inmunogénica de la vacuna antirrábica del cerebro de ratón lactante (CRL) trivalente con la de tres vacunas monovalentes elaboradas con cada una de las cepas virales que componen antigénicamente la vacuna clásica. Tanto la vacuna trivalente, como las monovalente CVS y 51, alcanzaron valores antigénicos elevados en pruebas de potencia NIH. No ocurrió lo mismo con la vacuna monovalente 91, que mostró ser un inmunógeno pobre. La vacuna trivalente fue superior a todas las monovalentes cuando se compararon la velocidad en inducir la respuesta de anticuerpos y los títulos alcanzados al administrarlas en diluciones crecientes. Los títulos de anticuerpos obtenidos con las vacunas trivalente y monovalentes CVS y51, así como su duración en el tiempo, fueron comparables; la vacuna 91 en cambio, indujo bajos títulos de anticuerpos neutralizantes. El estudio de la capacidad de neutralización cruzada de los anticuerpos inducidos, mostró que el virus 91 difiere antigénicamente de los virus CVS y 51. Al compararse la eficacia de cada vacuna en proteger a ratones inmunizados con ellas del desafío intracerebral con los virus fijos CVS, 51 y 91 y los virus calle 1026/80 y 1426/79, se comprobó que excepto la 91, todas protegían frente a todos estos virus con excepción del 91, frente al cual lo hacían sólo parcialmente. En contraposición, la vacuna 91 fue la única realmente eficaz para proteger a los ratones del posterior desafío con la cepa de virus homóloga, y fue ineficiente para protegerlos del desafío con los virus CVS, 51 y 1426/79. Los resultados de los tratamientos postexposición mostraron que tanto la vacuna trivalente como las monovalentes CVS y 51, a diferencia de la 91, protegen de la infección letal por vía parenteral con virus calle. No se pudo detectar interferón en el suero de los ratones inmunizados con ninguna de las vacunas. Por consiguiente no se pudo establecer que exista una relación directa entre producción de interferón y protección en tratamientos postexposición. Se demostró que la técnica de CIE utilizada para cuantificar anticuerpos en el suero de ratones inmunizados, daba títulos de anticuerpos correlacionados con los obtenidos con la prueba in vivo.

Lampuri, Jorge Salvador. "Infección experimental del Calomys masculinus con virus Junín : Modelo de infección crónica" (1984) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Wigdorovitz, Andrés. "Mecanismos involucrados en la duración de la respuesta inmune humoral al virus de la fiebre aftosa" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La fiebre aftosa constituye un serio problema sanitario que afecta a las especies biunguladas que genera severas consecuencias económicas a nivel mundial. Las vacunas formuladas con virus inactivado como antígeno (Ag) inducen respuestas de anticuerpos seroneutralizantes (AcN) de corta duración y es necesaria la revacunación periódica. La infección experimental en ratón adulto genera una continua e intensa respuesta de AcN tal como sucede en el huésped natural. Esta prolongada síntesis de Acs anti-VFA hace del modelo murino un excelente sistema para el estudio de los mecanismos involucrados en una prolongada respuesta humoral. Aunque este fenómeno es conocido desde hace tiempo, las bases inmunológicas responsables de la prolongada inmunidad inducida luego de la infección se encuentran aún sin dilucidar. Con la intención de comprender la causa de la respuesta inmune humoral al VFA, la primera parte de este trabajo de tesis estuvo dirigida a aclarar si el mantenimiento de los niveles de Acs puede ser explicado por un fenómeno de infección persistente del individuo, o mediante una persistencia antigénica mediada por células presentadoras de antígeno (CPA). La segunda parte del trabajo de tesis fue dirigida a estudiar los mecanismos de acción de dos efectivos inmunomoduladores (Avridine -AVR- y la pared de Mycobacterium -PCM) en la inducción de una prolongada respuesta humoral. Es importante enfatizar que los ensayos de transferencia utilizados en este trabajo permitieron acotar el sistema a los esplenocitos transferidos, debido a que estas células resultaron suficientes para inducir una prolongada respuesta humoral en los animales receptores normales (Tabla 1). La hipótesis de la existencia de una infección persistente fue descartada mediante la utilización de varios métodos, en especial la falta de detección del genoma utilizando un ensayo de PCR cuya sensibilidad es de 10-3 DIRL 50%.(Tabla 3 A y B). Además, el hecho de que haya sido posible obtener resultados similares a través de la inmunización de los animales dadores con antígenos inertes corroboró que la replicación viral definitivamente no es una condición indispensable para que se induzca una prolongada respuesta humoral (figura 6B). La transferencia de esplenocitos irradiados provenientes de animales infectados a animales receptores presensibilizados y negativizados (inmunizados con bajas dosis de virus inactivado) permitió la detección funcional de CPA específicas para el virus aftoso. La inhibición de la presentación antigénica (PA) in vitro, los ensayos de inhibición de la PA in vivo y el establecimiento de una correlación entre la capacidad de presentar el Ag y el título de Acs del animal dador corroboraron que, en el modelo utilizado, la presencia de CPA es el mecanismo que media la prolongada respuesta humoral anti-VFA que se observa en animales que fueron infectados. Dos datos experimentales merecen ser destacados: (i) Las células B son suficientes para la producción del fenómeno (figura 16B). (ii) Las CPA fueron capaces de permanecer en el animal dador por lo menos 365 días después de la infección (figura 15 B) Conociendo que la presencia de CPA es el mecanismo que media la prolongada respuesta humoral anti-VFA en los animales infectados, se analizó: la capacidad de inducir CPA en los animales inmunizados con diferentes formulaciones vacunales. Los ensayos realizados demostraron que tanto las CPA que provenían de animales infectados así como las obtenidas de ratones que fueron inmunizados con las diferentes formulaciones fueron capaces de inducir Acs detectables por ELISA. Sin embargo, solamente los esplenocitos de animales infectados o inmunizados con la vacuna inmunomodulada con AVR indujeron Acs de tipo neutralizante en los ratones receptores presensibilizados (figura 20 B). La utilización del ensayo de doble transferencia (figura 22) demostró que la presencia de Ag circulante en el animal dador no es necesaria para el mantenimiento de las CPA (figura 24). Estos resultados son coincidentes con la continua presencia de CPA en los animales infectados (hasta los 365 días post-infección) en los cuales no es posible encontrar antígeno viral ni partículas infecciosas. Se utilizó un sistema de PA donde el antígeno a ser considerado es mucho más simple en términos de cantidad de determinantes antigénicos para intentar explicar la diferencia observada entre las respuestas inducidas por las distintas vacunas utilizadas. Los esplenocitos extraídos de los animales inmunizados con dosis crecientes correspondiente a la secuencia 135-160 de VP1 del VFA O1C (P1) indujeron respuestas correlativamente incrementadas de Acs detectables primero, por ELISA y, posteriormente, por SN. Estos resultados apuntalan la hipótesis que sostiene que las diferencias entre la inducción de anticuerpos neutralizantes y aquellos detectados solamente por ELISA puede ser meramente debida a la masa antigénica presentada. Posteriormente, se analizó el efecto de los dos inmunomoduladores en un posible procesamiento diferencial de las distintas porciones del P1 Los resultados demostraron que, en efecto, estas diferencias existen, ya que los patrones de reactividad demostrados por los sueros de los animales infectados e inmunizados con AVR resultaron similares y cualitativamente diferentes a aquellos presentados por los sueros de los animales inmunizados con PCM o el vehículo oleoso per se (figura 25). Esto sustentaría que adicionalmente a un fenómeno de tipo cuantitativo, también existe un factor cualitativo como explicación a las diferencias encontradas en la respuesta humoral inducida en los animales receptores de células provenientes de dadores inmunizados con diferentes inmunomoduladores. La estrecha correlación entre la presencia y actividad de las CPA específicas para VFA, y los titulos de Acs observados en los animales que fueron estimulados antigénicamente de la forma más diversa con (infectados experimentalmente o inmunizados con virus inactivo bajo muy diferentes condiciones), poderosamente sugiere que el mecanismo involucrado en el mantenimiento de la respuesta inmune es la presencia de CPA reestimulando en forma permanente la producción de Acs anti-VFA. Estos resultados son de importancia para el diseño y desarrollo de nuevas vacunas en las cuales se debería principalmente focalizar la atención en metodologías que estimulen la inducción y un eficaz mantenimiento de CPA especificas para VFA en los individuos vacunados.

Pérez Filgueira, Daniel Mariano. "Efecto de diferentes inmunomoduladores en la respuesta inmune al virus de la fiebre aftosa en un modelo experimental y en el huésped natural" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se estudió la respuesta de isotipos en ratones de la cepa Balb/c luego de la infección experimental con VFA o de la inmunización con vacunas formuladas con virus inactivado con y sin el agregado de adyuvantes. Se utilizaron tres inmunomoduladores para formular diferentes vacunas usando vehículos acuosos y oleosos: la fracción hidrosoluble de pared celular de Micobacterium sp. (PCM), un extracto purificado de lipopolisacárido de Brucella ovis (LPS) y una amina lipoidal sintética, Avridine (AV). Los animales infectados mostraron respuestas dominadas por el isotipo IgG2b y seguidas por IgG1, IgG2a, IgG3, entre los 14 y 60 d.p.i. o se detectó actividad de IgG3 específicas para la VFA en ninguno de los animales vacunados. Las formulaciones conteniendo adyuvantes presentaron altos y persistentes niveles de IgG2b, similares a los de los animales infectados, hasta los 180 d.p.i., mientras que en las vacunas convencionales este isotipo fue detectado sólo hasta los 60 d.p.i. Los animales vacunados con formulaciones conteniendo estos adyuvantes presentaron una resistencia aumentada al desafío viral realizado a los 210 d.p.i., en relación con aquellos inmunizados con vacunas convencionales. Dos de estos inmunomoduladores (PCM y AV) fueron también probados en bovinos, incluidos en vacunas oleosas. Se elaboraron 11 diferentes formulaciones que fueron inoculadas en grupos de 8 animales. Nuestros resultados muestran que la inclusión de cualquiera de estos dos adyuvantes en sus mayores concentraciones a vacunas formuladas con baja cantidad de antígeno viral, indujeron niveles inactivado sin el agregado de adyuvantes. Los isotipos de IgG inducidos en estas vacunas experimentales también diferían de las formulaciones convencionales y control sin adyuvantes. Se discute la posible relación entre estos cambios inducidos y la inmunidad conferida en cada caso.

Abstract:
The IgG isotype response in Balb/c mice infected with FMDV or immunized with different vaccine formulations using inactivated virus particles as antigen was analyzed at various times post-inoculation. Three immunomodulators, were employed to formulate different vaccines using aqueous and oil vehicles: a water-soluble fraction of the cell wall of Mycobacterium sp.(PCM), apurified extract of lipopolysacharide from Brucella ovis (LPS) and a synthetic lipoamide, Avridine (AV). Infected animals between 14 and 60 days post-inoculation (d.p.i.) showed responses dominated by IgG2b, followed by IgG1, IgG2a and IgG3, respectively. No IgG3 activity was detected in vaccinated animals at any time. With formulations including immunomodulators, persisting high levels of IgG2b (similar to those of infected animals) were detected until 180 d.p.i. while with conventional vaccines IgG2b responses were detected up to 60 d.p.i. Animals vaccinated with formulations including these immunomodulators presented an augmented resistance to viral challenge at 210 d.p.i. in relation with thoseimmunized with conventional vaccines. Two of these immunomodulators (PCM and AV) were also tested in oil vaccines in experiments conducted in bovines. Eleven different formulations were used to vaccinate 8 animals per group. Our results showed that the inclusion of these adjuvants in the higher concentrations to vaccines formulated with a low antigen concentration, induced antibody levels similar to those of vaccines containing twice the concentration of virus and no adjuvants. The IgG isotypes profiles induced in these experimental vaccines also differed from the elicited by the control vaccines without immunomodulators. The possible relation ship of these differences in the isotype response and protection is discussed.

Malirat, Viviana. "Variabilidad genética y antigénica del virus de la fiebre aftosa, serotipo O, entre aislamientos recuperados durante la replicación del virus en animales persistentemente infectados, y entre cepas de campo" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La variación genética y antigénica en el virus de la fiebre aftosa, O1 Campos Brasil 1/58 (O1 C/58) se ha analizado en aislamientos consecutivos, recuperados durante un periodo de uno o dos años, a partir de cuatro bovinos con infección persistente, establecida en forma experimental. La comparación de los mapas bidimensionales de fragmentos resistentes a Rnasa T1, y de la secuencia de nucleótidos de la región que codifica para la proteína inmunogénica VP1, revelaron un aumento irregular de las fijaciones de mutaciones a medida que la infección avanzaba. El grado de variación con respecto a la cepa O1 C/58, usada originalmente para establecer la infección persistente, alcanzó valores máximos de 2,4 por ciento para el genoma total y de 1,4 por ciento para la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP1. La mayoría de los cambios no eran conservados entre aislamientos consecutivos. Estos resultados, junto con los valores substanciales de velocidad de variación genómica observados entre algunos pares de aislamientos recuperados con intervalos de tiempo muy cortos, indicaron la coexistencia de poblaciones heterogéneas, que predominaban unas sobre las otras en periodos irregulares, y que evolucionaban independientemente entre sí. No se observaron padrones de variación relacionados entre los cuatro animales. También fue evaluada la diversificación genética de cepas representativas de brotes de campo, serotipo O, ocurridos en regiones endémicas del sudeste de Brasil y del centro-este de Argentina entre los años 1958 y 1983. En base a los análisis de mapas bidimensionales de fragmentos resistentes a RNasa T1, los aislamientos mostraron diferencias respecto de la cepa O1 C/58, con valores que fluctuaban entre 0,7 por ciento y 4,0 por ciento de variación, y los valores registrados en base a la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP1 fluctuaron desde 1,0 por ciento hasta 17,2 por ciento. La variación genómica registrada era independiente del tiempo transcurrido entre los aislamientos, y los cambios no eran acumulativos. Estos resultados sugieren que las variantes no emergen sucesivamente en el campo, y que probablemente representan padrones independientes de evolución, donde podrían intervenir las infecciones persistentes.

Abstract:
Genetic and antigenic variation in foot-and-mouth disease virus O1 Campos Brasil 1/58 (O1 C/58) has been analyzed in consecutive isolates recovered over a one- or two-year period from four cattle with experimental persistent infections. Comparisons of RNase T1 two-dimensional maps and nucleotide sequences of the VP1-coding region revealed an oscillatory increase in the fixation of mutations as the infection progressed. The degree of variation with respect to the strain O1 C/58 used originally to establish the persistent infection, reached values of up to 2,4 per centum for the overall genome, and 1,4 per centum for the nucleotide sequence of the VP1-coding region. Most changes were not conserved in consecutive isolates. These results, together with the substantial rates of genomic variation observed between some pairs of strains recovered at close time periods, suggested the coexistence of heterogeneous populations in which variants predominate at irregular time intervals and evolve independently from each other. Furthermore, non-related patterns of variation were observed in the four animals. Genetic diversification of representative strains from major serotipe O outbreaks in endemic disease regions of southeastern Brazil and central-eastern Argentina between 1958 and 1983, was evaluated. On the basis of oligonucleotide fingerprinting, isolates showed variations, with respect to the early strain O1 C/58, ranging between 0.7 per centum and 4.0 per centum, and values between 1.0 per centum and 17.2 per centum on the basis of nucleotide sequencing of part of the VP1-coding region. The extent of differences among the genomes was independent of the time elapsed between viral isolations. Moreover, changes did not accumulate in subsequent samples. These results suggested that variants did not emerge successively in the field, and probably represent independent patterns of evolution, where persistent infections might be involved.

O’Donnell, Vivian K.. "Diferenciación de animales vacunados de infectados por el virus de la fiebre aftosa por métodos serológicos" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de la Fiebre Afiosa (VFA), un Aftovirus de la familia Picornaviridae, es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa y de tremenda importancia económica, que afecta al ganado de pezuña hendida. La diferenciación entre animales infectados y vacunados así como la detección de animales portadores del virus o “carriers” es esencial para evaluar la efectividad de campañas de control y erradicación. La detección de anticuerpos (Ac) contra un antígeno (Ag) no estructural asociado con la replicación del virus, el Ag Asociado a la Infección Viral (Ag VIA), cuyo componente principal es la ARN polimerasa o proteína 3D, altamente conservada entre los diferentes serotipos, ha sido una herramienta útil para monitorear programas de control y erradicación, como un indicador indirecto para la evaluación de la actividad viral a nivel poblacional. Es conocido que vacunas inactivadas contra el VFA pueden inducir Ac contra el Ag VIA, si bien los niveles de estos Ac son muy bajos y su permanencia mas corta que en animales infectados. Esta respuesta transitoria y variable se atribuye a la presencia de restos de la polimerasa viral en el Ag vacunal, el cual sería antigénico y resultaría en la producción de Ac contra el Ag VIA. El método más ampliamente utilizado para medir Ac contra el Ag VIA es la Inmunodifusión en Agar Gel (IDAG). Este método es simple de realizar, pero su baja sensibilidad y el uso de un Ag parcialmente purificado derivado de cultivos infectados con el virus, llevó al desarrollo de otras metodologías. Con el objeto de sobrellevar estos inconvenientes, se desarrollaron ensayos inmunológicos capaces de detectar Ac contra proteínas no estructurales del VFA, para la identificación de animales infectados con el virus. Las proteínas no estructurales, 3D y 2C, se expresaron en Escherichia coli, como proteínas de fusión a glutation-S-transferasa (GST). Se desarrolló un método de ELISA en fase-líquida (ELISA-3D) capaz de detectar Ac específicos contra la proteína 3D o RNA polimerasa del VFA. El ELISA-3D, fue capaz de detectar Ac contra la proteína 3D en suero de bovinos luego de una infección natural o experimental, desde los 5 días postinfección (dpi) hasta los 565 dpi, mientras que sueros de bovinos provenientes de zona libre de Fiebre Aftosa, así como sueros de referencia de bovinos y porcinos infectados con diferentes virus ARN y ADN, fueron negativos, resultando en una especificidad del 100%. Los resultados de la comparación del ELISA-3D con la técnica de IDAG y con un ELISA-VIA descripto previamente (Alonso y col., 1990), los que utilizan el Ag VIA semipurificado, mostraron que el ELISA-3D es altamente sensible (95.2 %), específico (100%) y reproducíble (C.V. 2.75 %). Los ensayos en sueros de animales vacunados, mostraron una respuesta transitoria de Ac inducida por algunas vacunas. La evaluación del método de “Western blot” utilizando como Ag la proteína no estructural 2C, mostró una reacción positiva cuando se analizaron sueros de bovinos infectados, mientras que sueros de bovinos de zona libre no mostraron ninguna reactividad. El estudio de sueros de bovinos vacunados mostró 1/79 sueros con reactividad positiva para Ac contra 2C. Estos resultados indican que el método de ELISA-3D, es recomendable para ser utilizado como método complementario en estudios seroepidemiológicos para monitorear actividad viral. La respuesta de Ac contra 3D inducida por la vacunación en animales con una o dos vacunaciones es transitoria. El aumento en la frecuencia de reacciones positivas luego de la revacunación, indica que para el monitoreo de actividad viral en planes de control bajo vacunación, es necesario considerar los parámetros de reacción postvacunal contra 3D para una mejor interpretación de los resultados obtenidos por éstas técnicas. Finalmente, el uso de proteínas biosintéticas tiene ventajas en su estabilidad y pureza, evita el manejo de virus vivo y provee una fuente consistente de Ag. La detección de Ac contra otras proteínas no estructurales del VFA, como es el caso de 2C, proveería un mayor grado de confianza en la identificación de animales infectados con VFA.

Abstract:
Foot-and-mouth disease virus (FMDV), an Aphtovirus of the Picomaviridae family, is the causal agent of a highly contagious and economically important disease of cloven-hooved animals. Differentiation between infected and vaccinated animals and the detection of carriers animals are essential to evaluate the effectiveness of control and eradication campaigns. Detection of antibodies against a non-structural antigen associated with the replication of the virus, the virus-infection-associated (VIA) antigen, the main component of which is the viral RNA polymerase or 3D protein, highly conserved among all serotypes, has been a useful tool in monitoring control and eradication programmes, as an indirect indicator of viral activity at the population level. It is well known that inactivated vaccines against FMDV can induce antibodies against the VIA antigen, although the levels of antibodies and their persistence are lower than in infected animals. This transitory and variable response is attribuited to the presence of traces of the viral polymerase in the vaccine antigen, which could be antigenic and result in the production of antibodies against the VIA antigen. The most widely used method for measuring antibody to the VIA antigen is the Agar Gel Immunodiffusion (AGID). The method is simple to perform, but its low sensitivity and the use of partially purified antigen derived from infected cell cultures, made necesary the development of other methods. With the aim of overcome this difficulties, immunochemical assays were developed, able to detect antibodies against FIVHDV non-structural proteins for the identification of infected animals with the virus. Recombinant non-structural proteins, 3D and 2C, were expressed in Escherichia coli, as fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST). A liquid-phase blocking sandwich ELISA assay (ELISA-3D) able to detect specific antibodies to the 3D protein or RNA polymerase of FMDV was developed. The ELISA-3D, was able to detect antibodies against the 3D protein in cattle sera after natural or experimental infection as early as 5 days postinfection (dpi) and at later stages, 565 dpi, whereas sera from naive cattle from the FMD free area as bovine and porcine reference sera raised against different RNA and DNA viruses were negative, resulting in a specificity of 100%. Comparison of the ELISA-3D with the AGID and the ELISA-VIA previously described (Alonso et al., 1990), which used the semipurified VIA antigen, shows that the ELISA-3D is highly sensitive (95.2%), specific (100%) and reproducible (C.V. 2.75%). Assays in vaccinated cattle sera, demostrated a transitory antibody response induced by some vaccines. The evaluation of the “Western blot”, using as antigen the non-structural 2C protein, shows a positive reaction with sera from infected cattle, whereas sera from naive cattle from FMDV free area did not react. One of 79 sera from vaccinated cattle shows a positive antibody reaction against 2C. The results obtained here indicate that the ELISA-3D method must be used as a complementary method for seroepidemiological studies for monitoring viral activity. Antibody response to 3D induce in vaccinated or revaccinated animals was transient. The increase in the frequency of positive reactions after revaccination, suggest that to monitor viral activity in control programmes under vaccination, it is necessary to take into account the parameters of the post-vaccination anti-3D response, to make a better evaluation of the results obtained. Finally, the use of bioengineered proteins has advantages such as stability and purity, it does not require handling infective virus and provied a consistent source of antigen. The detection of antibodies to other non-structural proteins, as 2C, provides confirmatory evidence for the identification of FMDV infected animals.

Gorostiaga, María A.. "Caracterización de la línea celular VERO como sustrato para la producción de vacunas virales" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las líneas celulares establecidas a partir de células de riñón del mono verde africano, se han usado durante años en Virología. La investigación y el desarrollo que involucra el uso de líneas celulares requiere el conocimiento preciso de las especies de origen y su pureza. Esto se lleva a cabo mediante un monitoreo periódico de los cultivos celulares que comprende varios marcadores genéticos, incluyendo isoenzimas y cromosomas. La estabilidad del cariotipo de la línea celular VERO se estudió con métodos de coloración diferencial de los cromosomas, en cultivos continuos estáticos (10 pasajes). Bajo estas condiciones el número modal (de 58 a 54) y la estructura del cariotipo variaron, tanto en el número de copias de cromosomas normales como en el de marcadores. Los cambios cuantitativos (el aumento del porcentaje de las células diploides, así como la variación en la fracción de células que tienen el número modal, ocurren a pesar de la estabilidad de la composición cromosómica, que limita el uso de las células Vero como sustrato para la preparación de vacunas. Para estandarizar las vacunas patrón en el proceso de producción, se estudió la influencia potencial que los diferentes pasajes podrían tener en la capacidad inmunogénica del virus, con el objetivo de establecer el número máximo y minimo de pasajes que cada tipo de virus admite, sin alterar las características biológicase inmunológicas de las vacunas virales que se usan en la actualidad. El método desarrollado y evaluado en diez pasajes es apto para la producción de vacunas antirrábicas de referencia en células VERO.

Abstract:
Non-tumorigenic cell lines established from African green monkey kidney cells have been used over years in virology. Research and development involving the use of cell lines requires precise knowledge of the species of origin and purity of the cell lines involved. This can only be assured by periodical monitoring of cultured cell lines that involves testing for a combination of genetic markers, including isoenzymes and chromosomes. The Vero cell line karyotypic stability was carried out by methods of differential chromosome staining in continuous static cultures (10 passages). Under these conditions, both the modal number of chromosomes (from 58 to 54) and the karyotype structure, namer the copy number of normal chromosomes and the market composition were shown to change. The quantitative changes (the rising percentage of diploid cells, as well as the change of cell fraction involving the modal number of chromosomes) were shown to occurr in spite of the chromosome composition stability, which limits the time of using Vero cells as a substrate for preparation of vaccines. To the standardization of pattern vaccines in the production process we studied the potential influence of different passages on the virus inmunogenic capability, to establish the minimum and maximum number of passages that each type of virus admit, without change in the biological and inmunological characteristics of viral vaccines that are currently being used. The method developed and evaluated is appropiate for the production of referencial antirrabic vaccines on Vero cells.

Marquina, Silvia Andrea. "Estudio sobre la variabilidad genética del virus de la inmunodeficiencia humana" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El estudio de la variabilidad viral es importante para entender la patogenia, la evolución y la epidemiología del HIV. Esta tesis aborda la variabilidad del HIV desde diversos ángulos. Uno de ellos fue la caracterización molecular del HIV-1 en ciudades con corrientes migratorias importantes como Buenos Aires. San Petersburgo y Estocolmo. Se demostró que estas corrientes introdujeron subtipos del HIV-1 que no circulaban previamente y la existencia de un nuevo subtipo del HIV-1, conocido actualmente como subtipo J. Se caracterizaron cadenas epidemiológicas de transmisión de la infección determinando que las recombinantes virales son frecuentes y transmisibles por vía horizontal y vertical, lo que constituye un hecho de importancia epidemiológica. La presencia de recombinantes virales motivó el desarrollo de un método para buscar posibles sitios de recombinación genómica y otro filogenético que toma en cuenta el evento de recombinación, importante en la evolución de HIV.Además se demostró que la hipermutación G—>A está restringida por la estabilidad del ARN viral. Además del HIV-1 se estudió el HIV-2 y se confirmó el predominio del subtipo A en Guinea Bissau. La carga proviral y el recuento de linfocitos T CD4+ resultaron marcadores del estadio de la infección con HIV-2 similar a lo que ocurre con HIV-1. Existe relación entre el genotipo y el fenotipo viral ya que aislamientos "rapid/high" presentaron aminoácidos positivos con patrones similares al HIV-1. Por otra parte se estudió la contribución del ADN viral extracromosómica a la variabilidad genética in vitro e in vivo resultando que una linea celular persistentemente infectada con HIV-1 puede ser sobre infectada por otra variante cuyo ADN se localiza en la fracción extracromosómica y se dispersa sólo por contacto célula a célula. In vivo el ADN viral extracromosómico contribuye a la variabilidad genética en la población viral de individuos infectados con el HIV-1. En conclusión, aquí se discuten algunos aspectos acerca de la variabilidad genética del HIV desde los puntos de vista molecular, evolutivo y epidemiológico. Además la tesis sugiere posteriores estudios particularmente en los temas de recombinación y sobreinfección para enriquecer el conocimiento sobre la variabilidad del HIV.

Abstract:
Research on viral variability is a crucial issue to understand the pathogenesis, evolution and epidemiology of HIV. This work focuses on the variability issue from different angies. One of this is the HIV-1 molecular characterization in cities with great migratory influx such as Buenos Aires, St. Petersburg and Stockholm. These migrations resulted in the introduction of HIV-1 subtypes that were not previously circulating. The existence of a new HIV-1 subtype, currently known as subtype J was demonstrated. Epidemiological transmission chains were characterized demonstrating that viral recombinants are frequently found and that they are transmissible horizontally and vertically, fact that is epidemiological important. The evidence of viral recombinants lead to the development of a method for searching possible recombination sites and of a phylogenetic method which takes into account the recombination event, relevant during HIV evolution. Besides, G—>A hypermutation is restricted by RNA stability. Besides HIV-1, HIV-2 was studied and the predominance of subtype A was confirmed in Guinea Bissau. Proviral load and T CD4+ cell count demonstrated to be markers of stage of HIV-2 infection similar to HIV-1. There is a correlation between the genotype and the phenotype because "rapid/high" isolates presented positively charged amino acids in env region, similarly to HIV-1. On the other hand, extrachromosomic contribution to variability in vitro and in vivo was studied. A persistently infected cell line can be super infected with other variant whose DNAis in the extra chromosomic fraction and it spreads only by cell to cell contact. Extrachromosomic viral DNA contributes to in vivo genetic variability in HIV-1 infected individuals. Finally, several aspects of HIV genetic variability are discussed from different points of view such as molecular, evolutionary and epidemiological aspects. Besides, this work suggests further studies particularly in recombination and superinfection issues in order to enrich the knowledge about HIV variability.

Tami, María Cecilia. "Evaluación de vacunas peptídicas contra el virus de la fiebre aftosa en bovinos : Aislamiento y caracterización de mutantes de escape" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
EI virus de la fiebre aftosa (VFA) pertenece a la familia Picomaviridae y es el agente causal de la fiebre aftosa (FA). Esta enfermedad causa grandes pérdidas económicas en el mundo y se controla mediante vacunación regular con una vacuna a virus inactivado. Esta vacuna presenta desventajas relacionadas principalmente con la manipulación de grandes cantidades de virus vivo y la inactivación incompleta de las preparaciones virales. En este trabajo se evaluó el potencial de vacunas peptídicas representando los sitios antigénicos A y C derivados del VFA serotipo C3 unidos a un epitope para células T derivado del VFA de seotipo O, como alternativa a las vacunas convencionales. Con este fin, se realizaron 5 experimentos de vacunación que involucraron 120 bovinos en total y se estudiaron los efectos de diferentes esquemas de vacunación y distintas dosis de inmunógeno. En cada experimento se evaluó la inducción de anticuerpos neutralizantes, la linfoproliferaciónen respuesta a antígenos virales y la protección frente al desafío con virus homólogo. Los mayores niveles de protección alcanzados fueron del 40% y no fue posible establecer una correlación entre protección y título de anticuerpos neutralizantes o respuesta linfoproliferativa frente a virus entero. En 12 de 29 lesiones rescatadas de los bovinos vacunados con péptidos sintéticos que no resultaron protegidos frente al desafío viral, se aislaron virus mutantes con sustituciones aminoacídicas únicas en la región del sitio A, en posiciones críticas para la antigenicidad del VFA. Las posiciones que se vieron alteradas fueron R (141) —>G incluida en el triplete RGD altamente conservado en los diferentes serotipos de VFA, L (144) —>P y L (147) —>P. Las variantes virales se caracterizaron fenotipicamente en cuanto al tamaño de placa y a su velocidad de crecimiento y antigénicamente mediante ensayos de ELISA y neutralización con un panel de anticuerpos monoclonales secuenciales y conformacionales. Los resultados mostraron que las sustituciones L(144)—P y L(147)-P tienen un efecto muy importante en la antigenicidad del VFA y afectaron múltiples epitopes dentro del sitio antigénico A. La mutación R(141)-G, en cambio, tuvo un efecto menor afectando sólo la reactividad con un AcM. Se discuten las posibles modificaciones en la formulación de las vacunas peptidicas para aumentar su capacidad protectiva y las implicancias de las sustituciones aminoacídicas encontradas en las variantes virales.

Abstract:
Foot-and-mouth disease virus (FMDV) belongs to the Picomaviridae family and is the causative agent of foot-and-mouth disease (FMD). FMD is the economically most important disease of cattle and other farm animals and its control is based on regular vaccination with an inactivated whole-virus vaccine. However, there are several disadvantages in the use of such vaccines related to the risk of reintroduction of the disease by the handling of large ammounts of infectious virus or by incomplete inactivation of the antigen. In this work, the potential of peptide vaccines bearing antigenic site A and C regions and a T-cell epitope of FMDV serotype C3. was evaluated as an alternative to conventional vaccines. For this purpose, 5 different vaccination experiments, involving a total of 120 bovines, were carried out and the efects of modifications in the timing of the immunizations and of different doses of peptides were studied. Induction of neutralizing antibodies, lymphoproliferation in response to viral antigens and protection against challenge with homologous infectious virus were examined. The highest level of protection achieved was of 40% and protection showed a limited correlation with serum neutralization activity and lymphoproliferation in response to whole virus. In 12 out of 29 lesions from peptide vaccinated cattle that were not protected after challenge, FMDV mutants with a unique amino acid substitutions at antigenic site A, were identified. The replacements found were R(141)-G, at the highly conserved RGD motif, L(144)-P and L(147)-P. The results showed that substitutions L(144)-P and L(147)-P were critically involved in FMDV antigenicity afecting multiple epitopes within antigenic site A. However, substitution R(141)—G had a minor effect, affecting the reactivity of just one Mab. Variant viruses were also phenotipically and antigenically characterized. Possible modifications of the vaccine formulation to increase protective activity as well as implications of the substitutions identified in the viral mutants are discussed.

Bachrach, Estanislao. "Targeting celular utilizando retrovirus recombinantes : Un estudio "fundamental" y un modelo "aplicado" (O...de como usar el mal para hacer el bien)" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La entrada de los retrovirus a la célula es mediada por interacciones específicas entre la glicoproteina retroviral Env y moléculas de superficie celular expresadas en la membrana. A la hora actual, muy pocos datos concernientes a la cuantificación de este proceso son disponibles. En una primera serie de experimentos, utilizando un sistema de expresión inductible, hemos expresado diferentes cantidades de Env en la superficie de vectores retrovirales derivados del Virus Moloney de la Leucemia Murina (MoMLV) y de vectores lentivirales derivados de HIV-I. Estos vectores han sido utilizados para determinar su capacidad de infección. Los resultados muestran que pocas moléculas Env son suficientes para infectar una célula. Sin embargo, incrementando la densidad de Env se acelera claramente el proceso de infección. Además, a bajas concentraciones de Env expresadas en la superficie viral los datos sugieren que estas moléculas podrian actuar en forma cooperativa. Estas observaciones tienen importantes consecuencias con respecto a la mejor comprensión del proceso natural de infección retroviral, pero también a la hora de diseñar vectores retrovirales aplicados a la transferencia de genes o terapia génica. Por otro lado, con la idea de poner a punto un sistema de targeting celular in vivo, hemos diseñado un vector retroviral competente para la replicación que permite infectar la mayoría de las células del bazo de ratones Swiss recién nacidos, durante la primera semana de infección. Estos vectores serán utilizados proximamente para una primera serie de experiencias de targeting. Estos resultados confirman un modelo de transducción eficaz de células del bazo de ratón en una ventana de tiempo determinada. No pudiendo todavia aplicar estos vectores en clínica, resultan al menos interesantes para análisis de diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas en modelos animales, como asi también el estudio del desarrollo y la evaluación de diferentes moléculas que puedan interferir con este proceso.

Dus Santos, María José. "Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas: su utilización como inmunógenos experimentales" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El uso de plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenos relevantes ha sido ampliamente evaluado dada la posibilidad de utilizar plantas modificadas genéticamente para la producción de vacunas. Las vacunas a base de plantas serían más baratas y más fáciles de elaborar en grandes cantidades. Estas vacunas se podrían producir en países en desarrollo sin necesidad de instalaciones sofisticadas y costosas como las que se necesitan en la actualidad. Por otra parte, estas vacunas eliminarlanel riesgo de virus contaminantes que existe en las vacunas producidas en líneas celulares de mamíferos ya que los posibles vian de plantas contaminantes no constituyen un peligro potencial ni para el hombre ni para los animales. Adicionalmente, las plantas transgénicas que expresen antígenos en sus tejidos comestibles podrían ser usadas como sistemas de producciónde vacunas de administración oral. Hasta el momento, la mayoría de los antígenos expresados consisten en péptidos, proteínas únicas ó estructuras muy simples. Sin embargo, la producción de antígenos vacunales en sistemas heterólogos requiere, en muchos casos. ía expresión de estructuras antigénicas complejas. EIVirus de la Fiebre Aftosa (VFA)produce una de las enfermedades más temidas del ganado debido a su amplia distribucióngeográfica y por ser altamente contagiosa. La vacuna utilizada actualmente es polivalente y a virus inactivado. El progreso en la producción de vacunas antiaftosas está dirigido hacia el logro de vacunas de elaboración más fácily económica y que eviten la manipulación de grandes cantidades de virus. Una alternativa a las vacunas convencionales es la preparación de cápsides vacías expresando y procesando la poliproteína precursora en un sistema de expresión heterólogo. Se han obtenido cápsides vacías confonnacionalmente correctas de los serotipos A, 0 y C del VFA utilizando sistemas de expresion en E. CoIi, baculovirus o virus vaccinia. Los resultados obtenidos hasta ahora al expresar cápsides vacías del VFA en sistemas heterólogos, con relación a Ia conservación de epitopes protectivos, las convierten en antígenos candidatos para la formulaciónde vacunas. Sin embargo, aún no se ha logrado un método de expresión masiva de un inmunógeno eficaz como para ser utilizado a campo, ya que los sistemas desarrollados hasta ahora resultan costosos y poco aplicables a nivel industrial. Como primer objetivo de este trabajo de tesis se propuso producir plantas de alfalfa transgénicas conteniendo el gen que codifica para la poliproteína P1 precursora de las proteínas estructurales del VFA. Las construcciones utilizadas involucran únicamente a P1 ó a P1 junto con la proteasa SC. La presencia del gen foráneo se detectó, en las plantas transgénicas, por PCR y su actividad transcripcional específica por RT-PCR y Northern blot. Fue posible visualizar por microscopía electrónica estructuras que por su tamaño y morfología podrían corresponder a cápsides vacías del VFA. La inmunogenicidad de los productos expresados fue evaluada en el modelo murino. Ratones adultos inmunizados intraperitonealmente desarrollaron una respuesta de anticuerpos detectada por su reactividad. en ELISA, frente a un péptido sintetico que representa la zona más inmunogénica de VP1 y partículas virales completas; y, en Western blot, frente a las proteínas estructurales del virus nativo. Además, estos animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes y resultaron completamente protegidos frente al desafío con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la factibilidad de expresar antígenos altamente complejos en plantas transgénicas y su utilizacióncomo efectivos inmunógenos experimentales. Los resultados obtenidos por nuestro y otros grupos de investigación demuestran la factibilidad de la utilización de plantas transgénicas como fuente de producción de antígenos vacunales. Sin embargo, uno de los principales problemas que posee este sistema de expresión es que los niveles de proteína expresada en las plantas transgénicas son relativamente escasos como para extrapolar su uso a una vacuna de aplicabilidad real. De modo que, el desarrollo de estrategias que generen una mayor concentración de la proteína recombinante es sumamente importante, especialmente cuando se desea utilizar los extractos de planta sin ningún proceso de enriquecimiento y/o purificación posterior. Dado que la inserción del transgen en el genoma vegetal es al azar, es altamente probable que los niveles de su expresión varíen entre los individuos producidos. Una alternativa posible, entonces, consiste en poder identificar aquellos individuos que presentan niveles excepcionalmente altos de la proteina foránea. Sin embargo, la identificación de aquellas plantas que expresen cantidades significativas de antígeno por métodos inmunológicos es un proceso lento y labioroso. Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, y como segunda parte de este trabajo de tesis, hemos desarrollado una metodologia que nos permite evaluar un gran número de individuos y seleccionar de un modo fácil y rápido aquéllos que presentan mayores niveles de expresión de la proteina recombinante. Esta metodologia se basa en la expresión de un gen de interés fusionado a un gen reportero, codificante para la enzima B-Glucuronidasa (B-GUS), cuya presencia puede ser detectada cuantitativamente por colorimetrla. A fin de evaluar el sistema de selección propuesto, utilizamos como antígeno un péptido que comprende los residuos 135 a 160 de la proteina VP1 del VFA para generar la proteina de fusión con la enzima B-GUS.Las plantas transgénicas obtenidas fueron primeramente evaluadas por su actividad enzimática de B-GUS. Fue posible detectar por Western blot la proteina de fusión en aquellas plantas que presentaron mayores niveles de B-GUS. Las plantas seleccionadas expresaron 0.5-1 pglmg de proteina soluble total. El péptido p135-160 expresado como proteina de fusión conservó sus caracteristicas inmunogénicas ya que ratones inmunizados parenteralmente con una vacuna elaborada con extracto foliar desarrollaron una respuesta de anticuerpos especificos detectada por su reactividad en ELISAfrente a p135-160, particulas virales completas y en Western blot frente a VP1. Además, se detectaron anticuerpos neutralizantes que resultaron protectores frente al desafio con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la posibilidad de utilizaruna metodologia simple para detectar las plantas que expresan altos niveles del péptido recombinante, el cual conserva sus propiedades antigénicas e inmunogénicas al ser expresado como proteina de fusión.

Abstract:
The use of transgenic plants as a system for expressing recombinant antigens has already been widely evaluated and constitutes a feasible methodology for vaccine production. Plant based vaccines would be less expensive and easier to be produced in large scale. These vaccines could be produced in undeveloped countries without requiring sophisticated facilities, as they are currently needed. On the other hand, the use of these vaccines would eliminate the risk of contaminating viruses present in mammalian cellular lines since the plant contaminating viruses do not constitute an actual risk for animals or humans. Additionally,edible transgenic plants expressing antigens in their tissues could be used as oral vaccines. Up to now, most antigens expressed in plants are peptides, unique proteins or very simple structures. Nevertheless, production of vaccine antigens in heterologous systems often require the expression of complex antigenic structures. Foot and mouth disease virus is the causal agent of a worldwide distributed highly contagious disease of cattle. The currently used vaccine is based in the utilization of polyvalent inactivated virus. In general, progress in the process of FMDV vaccine production are pointed toward the development of simpler and cheaper protocols involving the use of lower amount of virulent viruses. An alternative to the conventional FMDV vaccines are those containing recombinant virus empty capsids after the expression of the precursor polyprotein.In the past, it has been possible to obtain empty capsids of serotypes 0, A and C using as expression systems E. coli, baculovirus and vaccinia virus. Although the products resulted immunogenically efficient, the methodologies for producing them are not suitable to be used at the industrial level. The first objective of this thesis was the production of transgenic plants of alfalfa containing the gene encoding for the polyprotein P1, which is the precursor of all structural FMDV proteins. The transgenic constructs used contained either just P1 nor P1 along with the 3C gene. The presence of the foreign gene in the recombinant plants was detected by PCR and their transcriptional activity analyzed by RT-PCR and Northen blot. Additionally. it was possible to demonstrate, by electron microscopy, the presence of structures with a size and shape resembling those of the FMDV empty capsides. The immunogenicity of the obtained products was evaluated in mice. Intraperitoneally immunized adult mice presented a FMDVantibody response detected by its activity,in ELlSA, against a synthetic peptide representing the major immunogenic area of VP1, and against complete virus particles, and in Western blot, against all the FMDV structural proteins. Additionally, these animals developed a significant neutralizing antibody response and protection when experimentally challenged with the virulent virus. These results demonstrated the feasibility of expressing highly complex structures in transgenic plants and its use as effective experimental immunogens. As stated earlier, results obtained by us and other research groups demonstrated the potential feasibility of using transgenic plants as a source of antigen for vaccine production. Nevertheless, the main problem presented by this approach resides in the relatively low concentration of the recombinant protein in the plant tissues, which hampers its possible utilization at the industrial scale. Thus, the development of strategies which allow the production of transgenic plants expressing high levels of recombinant protein would substantially modify the expectations on the utilization of this system in the future, specially in those cases where no further steps toward the enrichment or purification of the recombinant product will be needed. Due to the fact that the insertion of the transgene in the plant genome is a random process, it is expected the development of individuals presenting very different expression levels of the recombinant protein. An interesting approach could be the identification of those individuals presenting exceptionally high levels of the foreign protein. Nevertheless, the identification of those individuals,using immunological approaches, is usually a laborious and slow process. Focusing in this particular problem, the second part of this thesis deals with the development of a methodology that allows us to evaluate a significant number of individuals and select, in an easy and quick way, those presenting the highest levels of expression of the foreign protein. The methodology is based in the expression of the gene of interest as a fusion protein along with a reporter gene which encodes for the enzyme ß-Glucuronidase (ß-Gus), which could be quantitatively detect by a oolorimetric test. In order to evaluate this methodology, we selected as antigen a peptide which represent the amino acid residues at position 135 to 160 of the structural FMDV protein VP1. This peptide was expressed as a fusion protein along with ß-Gus. The obtained transgenic plants were first evaluated based in their ß-Gus activity. Among those presenting the highest enzymatic activity it was possible to detect, by Western blot, the presence of the FMDV epitope. The selected plants expressed a concentration of the recombinant protein between 0.5 to 1 mg/g of the total soluble protein extracted for the plant tissue. The peptide 135-160 appears as conserving its native immunogenic characteristic since adult mice parenterally immunized with a vaccine prepared with the foliar extracts developed a specific FMDV antibody response detected in ELISA, against the p135-160 synthetic peptide. and complete virus particles, and against native VP1 in Western blot. Additionally,the sera of these animals showed significant neutralizing antibodies titers and the mice resulted protected against the experimental challenge with infectious virus. These results demonstrate the feasibility of using this simple methodology to detect transgenic plants expressing high levels of recombinant peptide, which completely conserves its antigenic and immunogenic properties when expressed as a fusion protein.

Romera, Sonia Alejandra. "Inmunomodulación de la respuesta inmune inducida por vacunas inactivadas contra herpesvirus bovino-1" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se evaluó en bovinos la respuesta inmune humoral y celular inducida después de la vacunación con vacunas contra HVB-l y el subsecuente desafío con la cepa LA de HVB-l. Los animales fueron vacunados intramuscularmente (IM) con vacunas inactivadas contra HVB-I conteniendo aceite mineral , aceite mineral con Avridine (emulsiones agua en aceite), o aceite no mineral (squalane) con un sulfolipocliclodextrin (SL-CD/S/W, emulsión aceite en agua). No se registraron diferencias significativas en los niveles de anticuerpos inducidos por las 3 vacunas evaluadas. Sin embargo la respuesta celular fue más elevada y temprana cuando estaba incluido en la formulación vacunal el SL-CD/S/W. Se evaluó la eficacia de las vacunas después del desafpio intranasal con la cepa virulenta LA de HVB-I. Los animales vacunados con SL-CD/S/W tuvieron menor excreción viral y menores síntomas clínicos que los animales controles sin vacunar. Cuando se relacionaron los niveles de IgG2 e IgG1 con la reducción de excreción viral se observó que, independientemente del adyuvante utilizado, el grupo que presentó al momento del desafío, niveles de la relación IgG2/IgG1 mayores a l fue el grupo que presentó menor número de animales con excreción viral. Además los animales inoculados con SL-CD/S/W no presentaron reacciones adversas. Todos estos factores combinados con la gran eficacia y la fácil manipulación del aceite biodegradable hace de la vacuna formulada con este nuevo adyuvante una importante contribución para la industria de vacunas veterinarias.

Abstract:
The antibody and cell mediated immune responses induced by BHV-l were analysed in cattle after vaccination and challenge exposure to the virulent strain LA of BHV-l. Animals were vaccinated intramuscularly (IM) with inactivated virus vaccines against BHV-I containing either a water in mineral oil adjuvant (W/O), a water in mineral oil adjuvant plus Avridine (W/0+Avridine) or sulfolipo-cyclodextrin in squalane in-water emulsion (SL-CD/ S/W). No significatives difierences were registered in the antibody response induced by the three evaluated vaccines. However, the BHV-l specific cell-mediated immunite response was stronger and appeared earlier when SL-CD/S/W was included in the formulation. The efficacy of the vaccines was also evaluated after intranasal challenge of the calves with a virulent BHV-1 LA strain. Animals vaccinated with SL-CD/S/W had reduced virus excretion and clinical symptoms compared with the mock-vaccinated animals. Comparison of levels of BHV-1 specific IgG2 and IgG1 with virus shedding revealed that, regardless of the adjuvant administered, animals showing BHV-l specific IgG2/IgG1 ratios higher than 1 were those with a significant lower number of individuals shedding virus. Additionally, animals vaccinated with SL-CD/S/W presented no postvaccinal reactions. These factors, combined with the higher efficacy and the ease of manipulation of the biodegradable oil, makes the vaccine formulated with this new adjuvant an important contribution for the veterinary vaccines industry.

Ceballos, Ana. "Evaluación de factores involucrados en la transmisión vertical del HIV-1" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El 95% de los niños infectados con HIV-1 en el mundo contraen la infección por transmisión vertical. En la Argentina han sido informados hasta septiembre del 2001 1260 niños con SIDA, que corresponde al 7% del total de casos, el más alto de América Latina. Se han descripto muchos factores, virológicos e inmunológicos, que inciden sobre la tasa de transmisión. Actualmente existen protocolos eficaces de tratamiento antiviral y de procedimientos obstétricos para la prevención de la transmisión vertical. Sin embargo, el costo de los tratamientos resulta muy oneroso para los países en vías de desarrollo, por lo cual se está muy lejos de la resolución del problema. Por otro lado, el diagnóstico de la infección del niño nacido de madre infectada es más complejo que el del adulto, dada la persistencia de IgG maternas durante los primeros 12 meses de vida. Esta tesis aborda la transmisión vertical del HIV-1 desde distintos enfoques. Inicialmente se realizó un estudio de población en Buenos Aires y alrededores, para evaluar el éxito de las estrategias implementadas para prevenir la transmisión vertical desde 1993 hasta 2001, con el estudio de 874 familias. Se demostró un aumento gradual en el número de madres y niños que siguieron el protocolo ACTG 076 (AZT para la prevención de la transmisión vertical) que alcanzó un 80% en el período 1999-2000. Se registró un aumento en el número de niños nacidos por cesárea que alcanzó un 54.8% durante 1999-2000 contra un 19.4 en 1993-1995. La efectividad de estas medidas se vio reflejada en la disminución de la tasa de transmisión madre a hijo de 37,3% en el período 1993-1995 a 6.5% en el año 2001. Sin embargo, un porcentaje constante de mujeres (12%) continuaron amamantando en el período estudiado, desde 1993 hasta el 2000. El porcentaje de mujeres que se enteraron de su infección luego del nacimiento del niño también fue del 12%. Estos resultados muestran la necesidad de implementar estrategias adicionales que generalicen la educación, la consulta y el diagnóstico en las mujeres jóvenes y sus parejas. Se estudió la eficiencia de la detección de la IgA específica en l4l niños, 46 tratados bajo protocolo ACTG 076 y 95 no tratados, demostrando que no se encontraron diferencias significativas respecto a los niños no tratados, a pesar de que la sensibilidad es menor en los niños tratados. Al cuantificar los sueros de estos niños se observan títulos menores en los niños tratados. Sin embargo, esto no altera la detección e indica el valor de la prueba en niños tratados, que hoy en día son la mayoría. Se estudió la reactividad frente a péptidos del V3 loop del gen env de variantes locales recombinantes y de los subtipos B y F de 22 madres transmisoras y 22 no transmisoras de la infección. Se demostró una mayor reactividad en las muestras de plasma de las madres no transmisoras frente a las transmisoras con el péptido SF2 y B/F, y además una diferencia significativa en la reactividad general frente al péptido recombínante B/F local. Esto indicaría la importancia de la inmunidad humoral en la protección frente a la transmisión vertical del HIV-1. Estos resultados apoyarían el uso de inmunosueros para evitar la transmisión madre a hijo. No se encontraron diferencias significativas entre madres tratadas y no tratadas con antirretrovirales. La transmisión vertical del HIV-1 ocurre predominantemente en el parto, presumiblemente a través del contacto con líquidos y sangre materna. La oxitocina y las prostaglandinas (PGs) son hormonas que inducen el trabajo de parto fisiológicamente, y que son aplicadas en forma terapéutica para activar el proceso del nacimiento. Por otro lado, la oxitocina interviene en la lactancia materna. Se estudió la acción de dichas hormonas in vitro sobre la replicación del HIV-1. Se demostró que la PGF2α disminuye transitoriamente la producción del antígeno p24 en células persistentemente infectadas con HIV-1 y no en células con infección aguda, mientras que la oxitocina y la PGE2 no produjeron ninguna variación en la cantidad de virus. Esto demuestra que tanto la oxitocina como la prostaglandina se pueden utilizar terapéuticamente sin temor a que potencien la replicación viral en el momento del parto. Finalmente se analizó la variabilidad viral en casos de transmisión a niños utilizando métodos moleculares, filogenéticos y de evolución simulada. Se demostraron dos casos de transmisión horizontal de padre a hijo. Aunque estos casos deben ser considerados excepcionales en la clínica, sin embargo, el conocimiento de estas excepciones ayuda a limitar las oportunidades de la transmisión del HIV-1 en lugares poco comunes tales como en el seno familiar y, dado que, la extensión de la epidemia es considerable, podrían presentarse más casos de este tipo en el futuro. Por otro lado, por demanda legal, se demostró un evento de transmisión ocunido 7 años antes de la obtención de las muestras entre un donante, una madre receptora de la transfusión y su hijo. Estos métodos podrían utilizarse en casos semejantes en los cuales no se cuenta con datos epidemiológicos y clínicos suficientes y se debe corroborar un hecho de transmisión. Por otro lado, se analizó la variabilidad viral en cuatro casos de seroconversión materna durante el embarazo y/o la lactancia y se observó que las madres presentaban poblaciones virales con baja variabilidad. A pesar de la similitud entre las variantes maternas, no se observó un fenómeno de selección en la transmisión, las madres pudieron transmitir múltiples variantes virales a sus hijos. Esto puede deberse a la falta de madurez de la respuesta inmune materna, que parecería jugar un papel importante en el origen de la variabilidad viral del gen env y en los mecanismos de selección viral durante la trasnmisión vertical del HIV-1. Estos casos de seroconversión durante el embarazo y transmisión de la infección al niño muestran la necesidad de realizar diagnósticos durante y después del embarazo. Además, en poblaciones donde la incidencia de HIV entre las mujeres jóvenes es alta, se deberia repetir el diagnóstico en los últimos meses del embarazo o en el parto, las cuales permitirían implementar intervenciones para prevenir la transmisión vertical.

Abstract:
Vertical transmission is responsible for 95% of the children infected with HIV-1 in the wordl. In Argentina until September 2001, 1260 children with AIDS were reported, 7% of total AIDS cases in the country, the highest level of Latin America. Many different factors, whether virological or immunological, have been described to have an effect on the transmission rate. There are now efficacious treatment protocols as well as obstetric procedures to avoid vertical transmission. However, the cost of these treatments is too high for developing countries, therefore the problem is far from being solved. Further, the diagnosis of pediatric HIV infection is more complicated than that of the adult, due to the persistence of maternal IgG during the first 12 months of life. This tesis faces the problem of vertical transmission from different sides. Initially a study was performed to evaluate the success of a National Program for the prevention of mother to child transmission (MTCT) in 874 mother-infant pairs from Buenos Aires and its surroundings. This population was referred to the National Reference Center for AIDS for diagnosis of neonatal infection during 1993-2000. The data revealed a substantial increase in the percentage in the use of antiretroviral therapy during pregnancy from 3.2% in 1993-1994 to 73.1% in 1999-2000. An increase in the use of Caesarean section (reaching 54.8% in 1999-2000) was observed. However, the proportion of HIV-infected women who continued to breast feed their children remained steady (around 12%). The general improvement of the conditions to decrease MTCT resulted in a significant decrease of infected infants from 37.3% before 1995 to 10.7% in 1999-2000, and even 6.5% during 2001. Data on the time of diagnosis indicates that only 42.7% of the women knew about their HIV status before pregnancy, 44.8 during pregnancy and 12.3% after the birth of their child. The main risk factor for HIV infection of the mothers was heterosexual contact (73%) and for fathers was injection drug use (67 %). These results point out the urgent need to develop additional strategies to generalize education, counseling, and testing of young women. The efficiency of IgA detection was studied in children treated under protocol O76, showing no significant differences with the untreated children, in spite of a lower sensitivity in treated children. Samples of this groups of children were quantified and the titers for IgA were lower in treated childre. However, this fact doesnt alterate the detection possibilities. These results show the usefulness of this test in ACTG 076 treated children, which today are the majority. The reactivity to V3 loop peptides from env gen of local recombinant forms as well as B & F subtypes was analysed in plasma samples of 22 HIV-transmitting and 22 non transmitting mothers. A higher reactivity was shown in the samples of non transmitting mothers compared to the transmitting ones. Further, there was a general significant reactivity to the B/F recombinant local peptide. These results would point out the importance of humoral immunity in the protection for vertical transmission of HIV-1 and would support the use of hiperimmune sera to avoid mother to child transmission. No significant differences were found between treated and non treated mothers. Mother to child transmision of HIV occurs mainly during birth, probably through the contact with maternal blood and liquids. Oxytocin and prostaglandins (PGs) are hormones involved in labor and are used clinically for its induction. The effect of oxytocin, PGF2α, and PGE2 on HIV-l replication in vitro was analysed. No significant effect on p24 antigen production in acutely or persistently infected cells was found within the range of concentrations of oxytocin or PGs assayed, except for a transient decrease in persistently infected cells treated with 1μM PGF2α. These results showed that oxytocin and PGs could be used clinically for labor induction without any direct enhancement in viral production. Finally, viral variability in cases of transmission of HIV to children was analysed by means of mollecular, filogenetic and simulated evolution methods. Two cases of father to child horizontal transmission were proven with filogenetic methods. Even if these cases should be considered as exceptional in the clinical experience, nevertheless their knowledge helps to limitate the opportunities of HIV transmission in such uncommon places as the nuclear family. Further, since the epidemics is in expansion, new cases like those could appear in the future. By legal demand on our laboartory, an event of transmission which happenned 7 years before was shown with simulated evolution. This event included a male blood donor, a woman receptor of the transfussion during puerperium and her son. These methods could be used in similar situations in which the epidemiological and clinical data are insufficient and a transmission event has to be ascertained. Also, viral variability was analysed by means of mollecular cloning in four cases of maternal seroconversion during pregnancy and/or lactancy. Maternal viral populations presented low variability. In spite of the maternal variant likeness, no apparent selection was observed in mother to child transmission, and the children showed multiple variants shown in ther respective mothers. This could be due to the lack of maturity in the immune response of the mothers, which would apparently play an important rol in the origin of the variability of the env gen and in the mechanisms of viral selection during mother to child transmission of HIV. The mentioned cases of seroconversion show the need to strenghten the counseling ans testing of HIV during pregnancy. Further, in populations where HIV incidence is high, diagnosis should be repeated in the last trimester, to be able to take interventions to avoid mother to child transmission.

Puntel, Mariana. "Nuevas vacuna contra herpevirus bovino tipo 1 : Desarrollo de una cepa viral con patrón antigénico diferencial con respecto al de las cepas circulantes en el campo" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se obtuvo la cepa HVB-1ΔgEβlgal, a partir de la cepa HVB-1 LA en la cual el gen de la glicoproteina E (gE)fue reemplazado por el gen de la enzima ,βgalactosidasa, por técnicas de ingeniería genética. La cepafue caracterizada tanto a nivel genómico y antigénico,como en cuanto a sus propiedades de crecimiento en cultivo celulares. La inmunogenicidad de la cepa HVB-1ΔgE-βgal se mantuvo intacta, comparada con la cepa parental, cuando se la utilizó como un inmunógeno inactivado y permitió la diferenciación entre animales vacunados e infectados en base a su respuesta de anticuerpos. Utilizado como vacuna atenuada, HVB-1ΔgE-βgal indujo una buena respuesta inmune especifica que resultó protectora frente al desafio viral, independientemente de la via de inoculación. Además, se comprobó la seguridad de la cepa HVB-1ΔgE-βgal ya que, en las condiciones de la experiencia, no se transmitió por contacto, ni fue abortigénica. Asimismo, se verificó la respuesta inmune difierencial inducida frente a la vacunación con la cepa desarrollada, con respecto a la inducida por la infección viral. La respuesta inducida por la vacuna atenuada en bovinos adultos fue sostenida durante 330 días y se mantuvo negativa contra gE. La vacuna atenuada fue altamente inmunogénica tanto cuando fue administrada en animales adultos como en terneros jóvenes. En particular, en aquellos bovinos que al momento de la vacunación tenían 3 meses de vida, hijos de madres vacunadas y que por lo tanto contaban con niveles detectables de anticuerpos especificos. Si bien se evidenció un efecto de interferencia de los anticuerpos maternos frente al desarrollo de una respuesta inmune específica,fue posible detectar el aumento de los anticuerpos frente a una revacunación realizada cuando los bovinos contaban con 8 meses de vida (l60dpv).

Abstract:
A glycoprotein E gene-deleted and βgal expressing bovine type 1 recombinant (BHV-1ΔgEβgal) was developed by deleting the glicoprotein E (gE) gene and replacing it by the ,βgalactosidase coding region ,into the BHV-1 LA parental strain. The new BHV-1ΔgEβgal strain was characterized both by genetic, antigenic, as well as related to its properties about growing in tissue culture conditions. The immunogenicity of the strain BHV-1ΔgEβgal was maintained intact compared with the parental strain and allowed immunologic differentiation between infected and vaccinated animals in studies as an inactivated vaccine made in bovines. At the same time, bovines resulted protected against virus infection in a challenge experience. Pathogenicity of BHV-1ΔgEβgal virus in calves was mild and the immune induced response was protective against virus challenge with the parental strain, independently of the inoculation route used for the live vaccine. In addition, it was demonstrated the security of the live vaccine none abortigenic effect or change in the pregnancy period were observed; neither transmission between vaccinated and unvaccinated bovines. It was verified a differential immune response to the live BHV-1ΔgEβgal strain when compared to the virus infection, and the long lasting immunity during 330 days since vaccination. The live vaccine was highly immunogenic as well in adults bovine as in young calves. In particular, in those calves that were 3 months old at vaccination time born from vaccinated seropositive heifers, it was detected interference effect on the immune response of the calf but that effect disappeared when the same vaccinated calves were 8 months old. It was possible to detect a rice in the humoral response level when the calves were first vaccinated at 3 months of age and revaccinated at 8 months of age.

Capozzo, Alejandra Victoria. "Evaluación de la respuesta inmune humoral contra el virus de la fiebre aftosa inducida por inmunógenos tradicionales y recombinantes : Desarrollo de métodos de vacunación alternativa utilizando proteínas quiméricas y ADN como inmunógenos" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La fiebre aftosa (FA) es una enfermedad viral altamente contagiosa que afecta a animales de pezuña hendida, como vacunos y porcinos; es causante de epidemias repentinas que acarrrean grandes pérdidas económicas. El control de esta enfermedad se realiza mediante la aplicación regular de vacunas a virus inactivado que son efectivas, pero que poseen el riesgo de re-introducción de la enfermedad debido al manipuleo de grandes cantidades de vian infeccioso o por la inactivación incompleta del antígeno. Este trabajo tiene por objetivos establecer parámetros serológicos que puedan ser útiles para la evaluación del nivel de protección de los animales, y el desarrollo de una estrategia de vacunación alternativa que conjugue seguridad y bajos costos. En primer lugar se evaluó la respuesta imnune humoral y su eventual correlación con el grado de protección contra la fiebre aftosa. Se estableció una correlación entre los niveles de isotipo IgG1 especificos contra VFA y protección. En una segunda parte, se construyeron genes quiméricos codificantes del gen para la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G),una glicoproteína altamente inmunogénica que posee epitopes T funcionales, como carrier del principal sitio antigénico presente en la proteína capsidal VP1 de VFA (ASA), blanco de la respuesta neutralizante. Estos genes quiméricos, uno con la secuencia entera de la G y otro con una deleción de la zona central y 3’, fueron expresados y caracterizados antigénicamente en sistemas libre de células y por transfección de células de mamíferos. Las proteínas quiméricas lograron exponer el epitope elegido en la conformación adecuada, similar sino idéntica a la presente en los viriones. Las construcciones expresadas en el sistema Baculovirus recombinante-céluias de insecto fueron inoculadas i.m. en bovinos en dos dosis de 30 ó 100 μg. La versión delecionada indujo una respuesta humoral con altos niveles de IgG1 y buena actividad neutralizante a los 90 días post vacunación (d.p.v). Se evaluaron las mismas construcciones como vacunas genéticas. Ratones vacunados con ADN codificante para estas quimeras respondieron con un perfil de respuesta Th1, presentando altos niveles de IgG2a. Bovinos vacunados con ADN codificante de la versión delecionada de la quimera, desarrollaron títulos de IgG1 anti VFA específicos tras una sola dosis (15 d.p.v) de 150 μg, pero los niveles de IgG2 prevalecieron a partir de los 45 d.p.v. En este trabajo se propone una estrategia de control de la FA mediante vacunación, combinando la utilización de proteinas recombinantes y ADN a fin de lograr una respuesta protectiva a largo plazo, sin los riesgos asociados a las vacunas a virus inactivado.

Abstract:
Foot and mouth disease (FMD) is a highly contagious viral disease of cloven-hoofed animals. It has the potential to cause explosive epidemics and huge economic losses to the agricultural industry worldwide. FMD control relies on regular vaccination with inactivated virus, which have been proven to be effective. However, current vaccines posses the risk of re-introduction of the disease due to handling of large amounts of infectious virus and by incomplete inactivation of the antigen. The main objectives of this work are, searching for serological parameters that could be useful in the evaluation of the potency of anti FMDV vaccines and subsequently, to develop efficient recombinant immunogens with potential as a safe and low cost non infectious candidates for massive vaccination of farm animals against FMDV. Qualitative aspects of bovine humoral response to commercial vaccines were first evaluated through the analysis of more than 200 samples. It was found that high levels of IgG1 isotype are directly correlated with protection and recovery from the disease. In a second part, hybrid genes coding for a carrier protein and a major antigenic site of FMDV VP1 were developed. Vesicular stomatitis virus (VSV) glycoprotein (G), which is highly immunogenic and has T-cell epitopes along its sequence, was chosen as a carrier for the 140-160 FMD virus major B- epitope of the capsidal protein VP1. One chimeric gene having the whole sequence of VSV-G and a second one, containing only the 3' third of the G gene, displayed FMD virus B-cell epitope activity, conformational dependent and somehow emulating the exposure encountered in the whole virus. Cattle vaccinated twice with 30 or 100 μg of the deleted baculovirus-expressed version of the chimera elicited a humoral immune response with high specific IgG1 levels and efficient neutralizing activity at 90 days post vaccination. DNA vaccines, that elicit both humoral and cellular immune response and are stable at room temperature, were also evaluated. Mice vaccinated with DNA encoding the G-VFA chimeras elicited a Th1 biased response, with high IgG2a levels. Cattle vaccinated with equivalent chimeric genes developed high IgG1 titers after 1 dose (150 μg) at 15 days post vaccination, but higher IgG2 levels were induced at longer periods. A strategy based in combining protein and DNA vaccination is proposed so as to immunize young animals and achieve a long lasting response, avoiding the risks associated with whole-virus inactivated vaccines.

Boggiano, César. "Uso de bibliotecas sintéticas combinatorias para el desarrollo de vacunas y antirretrovirales para el tratamiento y prevención del SIDA" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el año 2002, 3 millones de personas murieron como consecuencia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y se estima que 5 millones se infectaron con el virus de la inmunodeficiencia adquirida humana (HIV). Hasta la fecha no existe un tratamiento que pueda erradicar la infección en todos los pacientes HIV+ y tampoco una vacuna efectiva profiláctica o terapéutica. Las bibliotecas sintéticas combinatorias (BSCs) son colecciones de compuestos orgánicos, peptidomiméticos o peptídicos. Debido a su alta complejidad (miles a millones de compuestos diferentes) son excelentes herramientas para la identificación de compuestos capaces de alterar diferentes eventos biológicos. En primer lugar, se estudió la capacidad de las bibliotecas de inhibir el primer evento del ciclo replicativo de HIV-1, adsorción y entrada, en un sistema de fusión de membranas dependiente de HIV-1 Env y receptores celulares. Los compuestos individuales derivados de bibliotecas de piperazinas y triaminas, mostraron actividad inhibitoria de la fusión aunque con elevada toxicidad. También se identificaron D-decapéptidos capaces de inhibir en el rango micromolar, la replicación de cepas de laboratorio HIV-1 y un aislamiento clínico resistente a AZT. El mecanismo inhibitorio de la replicación involucra la entrada viral. Además, se descubrieron compuestos antagonistas de la quiomiotaxis inducida por SDF-1α en células CXCR4+, aunque este mecanismo no parece estar involucrado en la inhibición de la replicación. Por otra parte, una BSC de L-nonápeptidos fue utilizada para identificar inmunógenos naturales y sintéticos específicos para un clon de células T citotóxicas derivadas de un paciente HIV+. Se identificaron superagonistas capaces de estimular no sólo el clon original mejor que el péptido natural (Gag77-85), sino también clones con la misma especificidad aislados de otro paciente HIV+. También se identificaron por primera vez, secuencias derivadas de virus heterólogos que son capaces de estimular un clon específico para HIV-1 Gag77-85.

Distéfano, Ana Julia. "Caracterización molecular del Mal de Río Cuarto virus (MRCV) del maíz : estudio de los segmentos genómicos S1-S6, S8 y S10 y de las proteínas codificadas por los mismos" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Mal de Rio Cuarto es la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Es causado por el Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y transmitido por una chicharrita de la especie Delphacodes kuscheli. El MRCV pertenece a la familia Reoviridae, género Fijivirus, y tiene la propiedad de multiplicar tanto en plantas de maíz como en el insecto vector. Las particulas virales consisten en una cápside icosahédrica formada por una doble capa de proteínas y contiene en su interior lO segmentos genómicos de RNA de doble cadena (dsRNA) llamados Sl a SlO, siendo el tamaño del genoma de aproximadamente 29 kbp. En los últimos años, y en muchos casos en paralelo con el desarrollo de éste trabajo, se han reportado las secuencias de algunos segmentos de virus relacionados: el MRDV (Maize rough dwarf virus), el FDV (Fiji disease virus), el ODSV (Oat sterile dwarf virus), el genoma completo del RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) y del NLRV (Nilaparvata lugens reovirus). En este trabajo se clonaron, secuenciaron y analizaron los segmentos genómicos Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 y SlO completos del MRCV. Se determinó que todos los segmentos genómicos analizados poseen secuencias 5’ y 3’ terminales conservadas y características del serogrupo al cual pertenece el MRCV: 5’AAGUUUUU3’ (extremo 5’) y 5’CAGCUnnnGUC3’ (extremo 3’). Adyacente a los extremos conservados se encuentran repeticiones de 7 a 12 nucleótidos invertidas e imperfectas que son segmento específicas. La predicción de la estructura secundaria de las cadenas codificantes de todos los segmentos estudiados, muestra que las regiones terminales son capaces de formar estructuras secundarias determinadas y estables que fueron propuestas como señales de replicación y empaquetamiento en virus del género Rotavirus. Se compararon las secuencias de nucleótidos obtenidas y las secuencias de aminoácidos deducidas con las secuencias de otros reovirus depositadas en las bases de datos, y se identificó la presencia de motivos característicos, a menudo indicativos de función. Se determinó que el MRCV Sl codifica para una proteína básica de 168,4 kDa que contiene motivos conservados en las RNA polimerasas dependientes de RNA y es homóloga a las RNA polimerasas codificadas por los virus RBSDV, FDV y NLRV, asi como a las codificadas por miembros de otros géneros de la familia Reoviridae. El MRCV S2 codifica para una proteína de 134,4 kDa y posee homología con las proteínas codificadas por el RBSDV S4, el FDV S2 y NLRV S2. En este trabajo presentamos evidencias de que la proteína codificada en éste segmento es no estructural. El MRCV S3 codifica para una proteína de 141,7 kDa, y hemos demostrado que es la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral y posee una alta homología con las proteínas correspondientes codificadas por el RBSDV S2 y FDV S3. El MRCV S4 codifica para una proteina de 131,7 kDa y su función se desconoce. Presenta una relativamente alta homología con miembros del género Fijivirus como así también con otros miembros de la familia Reoviridae. El MRCV S5 codifica para una proteína de 106,9 kDa cuya función se desconoce. Esta proteína presenta homología con las proteínas codificadas por los segmentos S5 del RBSDV y del FDV. El MRCV S6 codifica para una proteína de 90 kDa cuya función se desconoce. Esta proteína presenta una llamativa baja homología con las proteínas codificadas por los segmentos S6 del RBSDV y del FDV. El MRCV S8 codifica para una proteína de 68,3 kDa que contiene un motivo de unión de ATP/GTP que es característico de helicasa. Además la proteína es homóloga con las proteínas codificadas por el RBSDV S8, el MRDV S7, el OSDV S9 y el NLRV S7, todas con probable función de helicasa. El MRCV SlO codifica para una proteína de 63,5 kDa y su probable función sería la de proteína de cápside externa. Esta proteína presenta una alta homología con las proteínas correspondientes codificadas por los segmentos SlO de los virus RBSDV, MRDV y FDV. El análisis de los valores de homología encontrados entre los distintos segmentos del MRCV y los segmentos de virus relacionados, apoyaría la idea de evolución independiente de cada segmento viral. El análisis filogenético realizado con las secuencias obtenidas del MRCV permitió proponer que a pesar de que el MRCV está relacionado con el MRDV y el RBSDV, debe ser considerado una especie diferente del género Fijivirus (Distéfano y col., 2002) y no una raza geográfica del MRDV, como había sido inicialmente propuesto. El análisis filogenético realizado con las secuencias de aminoácidos de polimerasas representativas de todos los géneros de la familia Reoviridae mostró la existencia de dos grupos evolutivos separados: uno agrupa a los Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus y Rotavirus, y otro agrupa a los Fijivirus, Cypovirus, Olyzavirus y Coltivirus. Se expresaron algunos de los segmentos virales en estudio en bacterias obteniéndose proteínas de fusión con un péptido rico en histidinas que facilita su posterior purificación. Se obtuvieron antisueros policlonales contra las proteínas codificadas por los segmentos S2, S3, S4 y S6. El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 fue capaz de reconocer específicamente una de las proteína estructurales presentes en partículas virales purificadas del MRCV en un ensayo de “Western blot”. Esta proteina correspondería a la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral. En un experimento complementario, un antisuero obtenido contra las proteínas de la partícula viral fue capaz de reconocer a la proteína del MRCV S3 expresada en bacterias. Asimismo el antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 reconoce una proteína de tamaño similar al esperado en extractos de plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificada por el S3 del MRCV es una proteína estructural del virus y se demostró que forma parte del “core” viral El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV 82, reconoció específicamente a una proteína de menor tamaño al esperado en extractos proteicos totales de plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificada por el S2 del MRCV seria una proteína no estructural presente en los viroplasmas. En experimentos de “Far-Western blot” se observó que la proteína codificada por el MRCV S3 era capaz de interactuar consigo misma, con una proteína de 130 kDa que correspondería a la espícula viral de tipo B y con la RNA polimerasa dependiente de RNA codificada por el MRCV Sl. En Rotavirus se demostró que las proteínas equivalentes interaccionan entre sí. Los resultados presentados en este trabajo contribuyeron al avance en el estudio del virus que causa la enfermedad del Mal de Río Cuarto, a la clasificación taxonómica del mismo y al estudio de su origen evolutivo. Además los datos obtenidos permitieron el diseño de una estrategia de resistencia al MRCV en plantas transgénicas de maíz basada en el desencadenamiento del silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS).

Abstract:
Mal de Río Cuarto is the most important maize disease in Argentina. lt is caused by the Mal de Río Cuarto virus (MRCV) and transmitted by the planthopper Delphacodes kuschell. MRCV belongs to the Reoviridae family, Fijivirus genus, and has the interesting feature of being able to multiply both phloem cells of maize plants and in vector insects. The viral icosahedral double-shelled particles contain lO double-stranded RNA segments (dsRNA) called Sl -SlO, with a total genome size of nearly 29 kbp. In the last years, and in many cases simultaneously with this work, the nucleotide sequences of some Fijivirus genome segments have been reported: MRDV (Maize rough dwarf virus), FDV (Fiji disease virus) and ODSV (0at sterile dwarf virus). In addition the entire RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) and NLRV (Nilaparvata lugens reovirus) has been published. This work reports the cloning, sequence and analysis of the genomic nucleotide sequences of MRCV Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 and SlO. All the analyzed segments have the conserved 5’ and 3’ ends that were reported for viruses of the same serogroup to which MRCV belongs: 5’AAGUUUUU3’ and 5’CAGCUnnnGUC3’, respectively. In addition segment-specific imperfect inverted repeats of 7-12 nucleotides were identified immediately adjacent to the conserved sequences. Prediction of the secondary structure of all segments coding strands showed that terminal regions were able to form defined and stable secondary structures that are proposed to be replication and packaging signals in Rotavirus. We compared their nucleotide and amino acidic sequences with the ones deposited in Genebank for other reoviruses. MRCV Sl potentially encodes a 168.4 kDa basic protein that contains RdRp distinctive motifs and has identity with the RdRps encoded by RBSDV, FDV and NLRV as well as with RNA polimerases coded by virus belonging to other genera of the Reovirdae family. MRCV S2 encodes a single 134.4 kDa protein which has and intermediate identity to RBSDV S4, FDV S2 and NLRV S2-encoded proteins. In this work we showed that the protein coded by this segment is a non-structural protein. MRCV S3 codes for a l4l .7 kDa protein and we demonstrated that is the major core protein and has an extremely high homology with the proteins coded by RBSDV S2 and FDV S3. MRCV S4 codes for a 131.7 kDa protein and its function is unknown. It shows identity to members of Fijivirus as well as to two other genera of the Reoviridae family. MRCV S5 codes for a 106.9 kDa protein and its function is unknown. It shows identity with RBSDV SS and FDV S5-encoded protein. MRCV S6 codes for a 90 kDa protein and its function is unknown. It has a very low homology with the proteins coded by RBSDV S6 and FDV S6. MRCV SBcodes for a 68.3 kDa protein Significantly, MRCV S8 encoded protein contains an ATP/GTP-binding site motif that is a common feature of dsRNA helicases. In addition, MRCV S8 revealed identity with the proteins coded by RBSDV S8, MRDV S7, OSDV S9 and NLRV S7, all of them with proposed helicase function. MRCV SlO codes for a 63.5 kDa protein that probably corresponds to the outer capsid protein. This protein shows a high identity with the proteins coded by RBSDV SlO, MRDV SlO and FDV SlO. The comparative level of homology between different MRCV encoded proteins varied noticeably, supporting an independent evolution of the different genome segments. We discussed the evolutionary relationships of MRCV to other Reoviridae, and based on phylogenetic analysis we proposed that although MRCV is related to MRDV and RBSDV, it could be regarded as a new species of the Fijivirus genus and not a geographic race of MRDV as it was previously proposed. Phylogenetic analysis based on RdRps amimo acidic sequences of viruses belonging to all the genus of the Reoviridae family, showed the existence of two major evolutionary divisions of polymerase proteins among them: one grouped Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus and Rotavirus, and the second one grouped Fijivirus, Cypovirus , Oryzavirus and Coltivirus. Some of the studied segments were expressed in bacteria as fusion proteins with an histidine-rich peptide. Polyclonal antibodies were raised against S2, S3, S4 and S6 coded proteins. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S3 was able to specifically recognize a single structural protein present in the purified virus particles in a Western blot assay and a 140 kDa protein present in infected plants. This protein corresponds to the major core protein. On the other side, a polyclonal antiserum against the purified virus particle was able to recognize a MRCV S3 fusion protein expressed in bacteria. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the protein coded by MRCV S3 reacted with viral cores. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S2 was able to specifically detect a single protein of a smaller size as predicted in total proteins extracts from infected maize plants. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the protein coded by MRCV S2 reacted with viroplasms present in the phloem cells of infected maize plants. “Far-Westem blot” experiments showed that MRCV S3 coded protein interacts with itself with a protein of l30 kDa that probably correspond to the B-spike and with the RNA dependent RNA polimerase encoded by MRCV Sl. In Rotavirus the correspondent proteins also interact. The results showed in this work contribute to the understanding of the virus that cause Mal de Rio Cuarto disease, helped redefine the virus taxonomic classification within the genera, and collaborated with the determination of the evolutionary origin of the fijivirus genus. Also these results allowed to the design of a MRCV resistance strategy in trasgenic maize plants based on the triggering of post-transcriptional gene silencing (PTGS).

Pontoriero, Andrea. "Epidemiología molecular de los virus influenza humanos circulantes en la Argentina en el período 1995-2002" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se realizó un estudio de aislamiento de virus (virus respiratorios sincicial, adenovirus, parainfluenza, influenza A y B) causantes de infecciones respiratorias, en muestras de pacientes menores de cinco años internados por infección respiratoria aguda baja, entre los años l995 a l999. Se pudo demostrar que alrededor del 6% de los casos son debidos al virus influenza. Para ese mismo período las curvas de mortalidad por influenza y neumonía muestran que los grupos de riesgo de la población son los menores de cuatro años y los mayores de 65, siendo muy importante la mortalidad por esta causa para los mayores de 75 años. El análisis de los datos recolectados por el SINAVE durante el período l995-1999 permitieron correlacionar los máximos de aislamientos positivos de virus influenza con los picos de morbilidad por síndrome tipo influenza notificados para toda la población. El análisis antigénico y genómico de aislamientos de virus Influenza humano provenientes de distintas localidades de la República Argentina durante el periodo l995- 2002 permitió establecer que las cepas circulantes de virus influenza A (H3N2) se relacionaron en forma cercana antigénicamente con las correspondientes cepas vacunales sólo a partir del año l999, mientras que las cepas HlNl se relacionaron con las componentes vacunales durante los años l998, 2000, 2001 y el 2002. Las cepas de influenza B no se relacionaron con las vacunales en los años l995, 2002 y lo hicieron parcialmente en el 2001. En la mayoría de los años estudiados hubo co-circulación de cepas de influenza A (HlNl), (H3N2) e influenza B. El análisis de la epidemiología del virus influenza en la Argentina permite concluir que el patrón epidemiológico es similar a lo que ocurre en el resto de los países del mundo desconociendo por el momento si nuestras aves también actúan como reservorios del virus así como el papel de los cerdos y otros mamíferos en el ciclo de vida de estos virus. Este estudio demuestra también que una situación similar ocurre en los países del Cono Sur, especialmente para la cepas de virus influenza A.

Celma, Cristina Cecilia del Pilar. "Virus de inmunodeficiencia de simios: estudio de la participación del dominio citoplasmático de la glicoproteína viral de envoltura (Env) en la infectividad viral y en la incorporación de Env a viriones" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En las últimas etapas del ciclo de replicación de los virus de immunodeficiencia de simios (SIV), ocurre el ensamblado de las partículas virales en la membrana plasmática de las células infectadas. Durante la morfogénesis de los viriones se produce la incorporación de la glicoproteína viral de envoltura (Env), proceso que es esencial para la infectividad viral. La glicoproteína Env se sintetiza como un precursor proteico, el cual es clivado en las subunidades de superficie y transmembrana por proteasas celulares. A diferencia de otros retrovirus, SIV posee una proteína transmembrana con un dominio citoplasmático (CD) particularmente largo, de 164 residuos. Para investigar el rol que cumple el CD en la incorporación de Env a las partículas virales y en la infectividad, se generaron y caracterizaron glicoproteínas Env mutantes llevando pequeñas deleciones internas de 4 a 7 aminoácidos en el CD o bien acortamientos progresivos de 20 residuos desde su extremo carboxilo. Las mutaciones introducidas no tuvieron efecto alguno sobre la síntesis, procesamiento y expresión en la superficie celular de la glicoproteína Env. Sin embargo, las deleciones internas que afectaron el tercio carboxilo terminal del CD de Env inhibieron significativamente tanto la incorporación de Env a viriones como la infectividad viral. El mismo fenotipo defectivo fue observado al remover 20 a 100 aminoácidos del extremo carboxilo del CD. En cambio, glicoproteínas Env con CDs de 44 o 24 aminoácidos se incorporaron a viriones en forma más eficiente que la proteína Env salvaje, e incrementaron no menos de 10 veces la infectividad viral respecto de la de viriones llevando la Env salvaje. Por otro lado, se realizó un estudio de evolución forzada de un virus mutante llevando una deleción interna en el CD de Env que bloquea la capacidad replicativa del virus. La propagación durante períodos prolongados de tiempo de células linfoideas infectadas con este virus mutante condujo a la selección de poblaciones virales revertantes. En estos virus, el fenotipo defectivo causado por la deleción original fue revertido por mutaciones puntuales en el gen env que acortaron el CD a una longitud de 52 o 48 aminoácidos. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de Tesis demuestran cómo variaciones en la longitud del CD de la glicoproteína Env de SIV modulan las funciones virales mediadas por Env.

Abstract:
During the late stages of simian immunodeficiency virus (SIV) replication, particle assembly takes place at the plasma membrane of the infected cells. During virus morphogenesis, the envelope glycoprotein (Env) is incorporated into virions, a step that is essential for virus infectivity. The Env glycoprotein is synthesized as a heavily glycosylated precursor that is cleaved by cellular proteases into the surface and transmembrane subunits. The cytoplasmic domain of the SIV transmembrane protein is unusually long (164 amino acids) compared to those of other retroviruses. To investigate the role that the SIV Env cytoplasmic domain plays in Env incorporation into virions and virus infectivity, we generated and characterized two sets of SIV Env mutants: a series of mutants carrying small in-frame deletions throughout the entire Env cytoplasmic domain, and another series of Env mutants bearing progressively truncated cytoplasmic tails. None of these mutations had an effect on the synthesis, processing and cell surface expression of the SIV Env glycoproteins. Interestingly, in-frame deletions targeting domains in the C-terminal third of the Env cytoplasmic tail impaired both Env incorporation into particles and virus infectivity. Asimilar defective phenotype was observed for the SIV Env mutants lacking the C terminal 20 to 100 amino acids. Of note, SIV Env glycoproteins bearing a 44- or 24- amino acid cytoplasmic tail were incorporated into virions at levels significantly higher than those of wild-type Env and increased virus infectivity by more than 10-fold with respect to that conferred by the full-length Env protein. In addition, we performed a “forced evolution” study in which we propagated for a long period of time cells infected with a replication-defective mutant virus containing an in-frame deletion within the SIV Env cytoplasmic domain. These experiments led to the selection of second-site revertant viruses in which the defective phenotype imposed by the original deletion was reversed by mutations in the env gene that truncate the Env cytoplasmic tail to 52 or 48 amino acids. In conclusion, our results demostrate how variations in the length of the SIV Env cytoplasmic domain modulate Env-mediated viral functions.

Marzocca, Marina Patricia. "Caracterización de antígenos recombinantes de la glicoproteína E2 del virus de la diarrea viral bovina y su utilización como vacunas y reactivos de diagnóstico" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) pertenece al género Pestivirus de la familia Flaviviridae y es causante de importantes pérdidas económicas en la industria ganadera regional y mundial. Las manifestaciones clinicas de la infección son variadas y las pérdidas en la producción ganadera se deben principalmente a la disminución en la producción de leche, retraso en el crecimiento, aumento de infecciones secundarias y aumento de la mortalidad en animales jóvenes. El control epidemiológico de BVDV se realiza a través de programas de vacunación masiva y eliminación de animales persistentemente infectados, principales diseminadores del virus en los rebaños. Los bajos títulos virales obtenidos en cultivo de tejidos constituyen una dificultad importante en la elaboración industrial de vacunas inactivadas. La utilización de cepas atenuadas como vacunas anti BVDV es, por otra parte, un riesgo mayor ya que la aparición de revertantes en un animal pre-infectado con BVDV podría desencadenar la “enfermedad de las mucosas”, que es fatal y en vacas preñadas podría dar origen a una camada de terneros persistentemente infectados. El diagnóstico de las infecciones con BVDV, realizada a través de la detección de anticuerpos en suero bovino por seroneutralización y/o inmunoensayo enzimática (ELISA) también presenta dificultades debidas, entre otras, a la necesidad de contar con infraestructuras adecuadas para el cultivo de células y a los desafios técnicos que presenta la obtención de antígeno purificado. En este trabajo se expresó en sistemas recombinantes y se caracterizó bioquímica e inmunológicamente al principal inmunógeno de BVDV, la glicoproteína E2. La proteína fue expresada en células de mamífero y de insecto, en su forma entera (rE2) y delecionada en su extremo carboxilo terminal de anclaje a membrana (ΔrE2) y se ensayó su desempeño como vacuna y como antígeno para diagnóstico. La proteína recombinante E2 (rE2) presento características electroforéticas e inmunoquímicas idénticas a la E2 viral y resultó ser un potente inmunógeno en bovinos. La incorporación del gen de rE2 en el genoma de un Virus de la estomatitis vesicular (VSV) recombinante permitió, también , la creación de un virus atenuado de VSV (VSV-E2) capaz de inducir una excelente respuesta humoral anti BVDV en ratones y óptima producción de E2 recombinante en células de BHK en cultivo. En este trabajo también se demostró que la proteína ΔrE2 es expresada y liberada al sobrenadante del cultivo de células de Drosophila melanogaster lo que permitió contar con una preparación rápida y relativamente pura de antígeno. Este fue utilizado en un test de ELISA de captura (a través de un anticuerpo monoclonal anti rE2, también desarrollado en el curso de este trabajo de Tesis) que presenta alta sensibilidad y especificidad para la detección de anticuerpos anti BVDV en sueros bovinos.

Abstract:
The Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) belongs to the genus Pestivirus of the family Flaviviridae and is responsible for important economic losses in the cattle industry throughout the world. The clinical manifestations of the infection are varied and the looses in the cattle production are mainly due to the decreased production of milk, delay in the growth, increase of secondary infections and increase of the mortally in young animals. Control of BVDV is carried through programs of massive vaccination and elimination of persistently-infected animals that are the main source of contagious virus in the field. Deficient virus production in cell culture constitutes an important difficulty in the industrial elaboration of inactivated vaccines. The use of attenuated viruses as BVDV immunogens on the other hand, is risky since revertants could produce mucosal disease in preinfected animals. This is eventually fatal and, in the case of pregnant cows, could give origin to persistently infected calves. The diagnosis of BVDV infections is accomplish by detection of specific antibodies in bovine serum in seroneutralization and/or enzyme linked immuno (ELISA) assays. These techniques also present difficulties related, for instance, to the necessity of having appropiate infrastructures for cell culture and obtaining purified antigen in workable amounts, as well. In this work the main immunogenic protein of BVDV, the glycoprotein E2, was expressed in different recombinant systems and characterized, subsequently , biochemically and immunologically. The protein was expressed in mammalian and in insect cells either as a whole protein (rE2) or as a deleted form lacking its carboxi terminal membrane anchor (ΔrE2) and its potential as immunogen and as a diagnostic antigen was explored. The recombinant protein E2 (rE2) showed electrophoretic and immunochemical characteristics identical to those of its viral counterpart and also induced a potent anti BVDV serum response in bovines when administerd in an oil emulsion. Incorporation of the rE2 gene in a recombinant Vesicular stomatitis virus (VSV) genome allowed us, in addition, to generate an attenuated virus of VSV (VSV-E2) able to induce an excellent humoral anti-BVDV response in mice and to produce recombinant E2 in infected BHK cell cultures. The protein ΔrE2 is expressed and released to the extracellular medium of transformed Drosophila melanogaster cells expressing the recombinant protein, in what turned to be a quick and simple way to get relatively pure and soluble antigen. This allowed the design of an ELISA test using soluble rE2 as antigen and a specific anti E2 capture MAb (developed during this Thesis work using rE2 expressed by baculovirus) that presents high sensibility and specificity for the detection of anti BVDV antibodies in bovine sera.

Edelstein, Alexis. "Epidemiología molecular y caracterización genética del hantvirus Andes causante de síndrome pulmonar en Argentina" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
A partir de una zoonosis emergente en el año 1995, se determinó la presencia de un hantavirus asociado al sindrome pulmonar en la Argentina, desconociéndose la magnitud del problema. Este trabajo tiene como objetivo aportar al conocimiento de la infección por hantavirus, su replicación, transmisibilidad ecoepidemiología y caracterización de virus circulantes. El estudio de la caracterización viral de las muestras humanas provenientes de distintas regiones geográficas determinó la existencia de 3 regiones endémicas asociadas a hantavirosis responsables del SPH en nuestro país: La región Norte (Salta y Jujuy) donde se estableció la existencia del linaje viral AND Nort., la región Sur (Rio Negro, Chubut y Neuquén) donde circula el linaje AND Sout,. y la región Central (Provincia de Buenos Aires) donde se detectaron los linajes AND Cent. Lec, AND Cent Plata y AND Cent Bs.As Los distintos análisis filogenéticos realizados sobre las secuencias nucleotídicas de los segmentos genómicos S y M mostraron claramente la evolución monofilética de los hantavirus. En esta evolución, el antecesor del virus Andes sería el virus Laguna Negra. Este análisis filogenético es apoyado por el aparente desplazamiento migratorio realizado por los Sigmodontinos desde América del Norte hasta el extremo sur del continente. Dentro del grupo Andes, la divergencia evolutiva no resultó tan clara, probablemente debido a que este grupo monofilético es de reciente radiación. Se obtuvo por primera vez la secuencia completa del virus Andes amplificándose y secuenciándose los segmentos S y M correspondientes al genoma viral y una porción del segmento L. Del análisis de dicho genoma se identificó al virus Andes como una nueva especie viral. Se determinó además para los 3 segmentos virales, la composición nucleotídica no putativa de sus extremos, responsables de la estabilidad del ARN viral y asociados además a su replicación /trascripción. A diferencia del segmento S, los segmentos M y L presentaron deleciones en ambos extremos posiblemente asociadas a la regulación de la persistencia viral. El análisis del brote ocurrido en El Bolsón en el año 1996, demostró por primera vez en el mundo, la existencia de un hantavirus capaz de transmitirse a través de contacto interhumano. Esta vía de contagio representó un evento único entre los hantavirus del grupo renal y pulmonar, solamente asociada hasta el momento al linaje Andes Sout. Con el objeto de determinar las posibles alteraciones genéticas asociadas a la vía de contagio interhumano hallada en Andes Sout, se amplificaron y secuenciaron en forma completa los segmentos S y M de un hantavirus perteneciente al linaje Andes Cent Plata, hasta el momento no asociado a contagio interhumano. La comparación de los segmentos S y M de las cepa transmisora y no transmisora no presentó diferencias estructurales significativas. La transmisión interhumana no parecería ser dependiente de la cepa viral requiriéndose la evaluación de factores alternativos como la carga viral o la respuesta inmune dependiente del huésped. Los hallazgos del presente trabajo de tesis aportaron las bases para el estudio de los mecanismos que influyen en la interrelación genética-viral y los aspectos biológicos tales como factores ambientales y ecológicos, cuyos efectos provocan alteraciones demográficas en huéspedes infectados y susceptibles, que conducen a la emergencia de enfermedades zoonóticas humanas.

Abstract:
From an emergent zoonosis in 1995, it was determined the presence of hantavirus associated to the pulmonary syndrome in Argentina, not knowing the magnitude of the problem. This work takes as target to reach to the knowledge of the infection with hantavirus, its replication, contagiousness, ecoepidemiology and characterization of circulating viruses. Viral characterization of human samples from different geographic regions determined the existence of 3 endemic regions associated to hantavirus illness responsible for the hantavirus pulmonary syndrome in our country: north region (Salta and Jujuy) where settled down the existence of viral lineage AND Nort., south region (Rio Negro, Chubut and Neuquén) where circulates lineage AND Sout. and central region (Province of Buenos Aires) where cocirculate lineages AND Cent. Lec, AND Cent Plata and AND Cent Bs.As. The different phylogenetic analyses realized on the sequences of the genomic segments S and M clearly showed a monophyletic evolution of the hantavirus. In this evolution, the predecessor of the virus Andes would be the virus Laguna Negra. This phylogenetic analysis is supported by the apparent migratory displacement realized by the sigmodontines from North America up to the south end of the continent. Inside the group Andes, the evolutionary difference did not turn out to be so clear, probably due to the fact that this monophyletic group is of recent radiation. The complete sequence of Andes virus was obtained for the first time through complete S and M segments amplification corresponding to the viral genome and a portion of segment L. The analysis of this genome identified Andes virus as a new viral species. It was determined in addition for the 3 viral segments, the non putative nucleotidic extremes sequences, which are responsible of RNA viral stability and associated in addition to its replication/trascription. Unlike S segment, segments M and L displayed deletions in both extremes possibly associated to the regulation of viral persistence. Analysis of the outbreak happened in El Bolsón in the year 1996, demonstrated for the first time in the world, the existence of a hantavirus capable of being transmitted across interhuman contact. This route of contagion represented a unique event between hantaviruses of renal and pulmonary group, only associated up to the moment with the lineage Andes Sout. In order to determine the possible genetic alterations associated with the route of interhuman infection found in Andes Sout, the complete S and M segments of a hantavirus belonging to the lineage Andes Cent Plata, not associated to interhuman infection until the moment, were amplified and sequenced. The comparison of segments S and M of the transmitting and nontransmitting lineages did not display significant structural differences. The interhuman transmission would not seem to be dependent of the viral lineage requiring the evaluation of alternative factors like viral load or immune response dependent of the guest. The findings of the present thesis work contributed the bases for the study of the mechanisms that influence in the genetic-viral interrelation and the biological aspects such as environmental and ecological factors, whose effects cause demographic alterations in infected and susceptible guests, who lead to the emergency of human zoonotic diseases.

Pacheco Tobín, Juan Manuel. "Virus emergentes : Especificidad de especie de los topotipos Catay y panasiático del virus de la fiebre aftosa. Rol de las proteínas no estructurales 3A y 3B." (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de la fiebre aftosa pertenece a la familia Picornaviridae y es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa y de gran importancia económica, que afecta a los animales de pezuña hendida. Algunos de los aislamientos pertenecientes al serotipo O originarios de Asia fueron clasidicados en tres topotípos, el topotipo Catay ( con una deleción en los aminoácidos 93-102 de la proteína 3A) y el topotipo Sudeste Asiático (con deleción en los aminoácidos 133-143 de la proteína 3A) y el topotipo Panasiático (sin deleción). Con algunos de estos aislamientos se contruyeron virus quimeras con las diferentes formas de 3A descriptas e inclusive virus con una deleción aún mayor, entre los aminoácidos 63-144. Se construyeron tambipen virus quimeras con una sola proteína 3B. Tanto los aislamientos naturales como los virus quimeras fueron evaluados in vitro, en células derivadas de bovino y porcino, e in vivo, en porcinos. Estudios de efectividad en células y en porcinos, así como estudios en virulencia, patogenia y transmisibilidad en porcino nos permiten concluir que los virus pertenecientes al topotico Catay, aunque atenuados para el bovino, son altamente virulentos para el procino y prodijeron una enfermedad aguda y sincrónica, de transmición rápida y efectiva. Mientras que los virus pertenecintes al topotipo Panasiático mostraron similar replicación en ambos tipos celulares, su comportamiento in vivo fue más heterogéneo, no fueron tan virulentos y produjeron una enfermedad más atenuada. Los virus con una sola proteína 3B mostraron una inefectividad reducida en células de porcino y nula en células de bovino, mientras que prodijeron una enfermedad suave en porcino.

Abstract:
Foot-and-mouth disease virus is a number of the Picornaviridae family, is the casual agent of a highly contagious and economically important disease of cloven-hoofed animals. Some of the isolates obtained from Asia that belong to a serotype 0 were classified in three topotypes: Cathay (with a deletion in protein 3A in aminoacids 93-102), Southeast Asia (with a deletion in protein 3A in aminoacids 133-143) and PanAsia (non-deleted). With some of this isolates, genetically engineered viruses were constructed with the different forms of 3A and with an even larger deletion, in between aminoacids 93-144 of 3A. Viruses with only one single 3B protein were also recovered. All the isolates as well as genetically engineered viruses were evaluated in vitro, in bovine and porcine derived cells, and in vivo, in swine. Studies of inefectivity in cells and in swine, together with studies of virulence, pathogenicity and transmissibility in swine, let us conclude, that although when the were attenuated for bovine, viruses of the Cathay topotype are highly virulent and produce an acute and synchronic disease, of fast and effective transmission in porcine. Whereas viruses of the PanAsia topotype showed similar replication in both cell types, bovine or porcine, showed to be more heterogeneous in vivo, not so virulent, and they produced a milder disease. Viruses harboring one single 3B showed a decreased infectivity in porcine cells, and null infectivity in bovine cells, and they produced a mild disease in swine.

D’Agostino, Agata Magdalena. "Estudio de los mecanismos moleculares de patogénesis del sarcoma de Kaposi mediados por el Herpesvirus Humano-8/KSHV y su oncogén, el receptor acoplado a proteína G (vGPCR), en modelos animales" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
KSHV es un oncovirus implicado en Sarcoma de Kaposi (KS) y otros cánceres asociados a SIDA. KS es un neoplasma caracterizado por la proliferación de células ahusadas y la intensa angiogénesis. Los mecanismos a través de los cuales KSHV causa la respuesta angioproliferativa de KS se desconocen y la reproducción de todos los aspectos de KS mediante infección experimental por KSHV aún no ha podido ser demostrada. El receptor acoplado a proteína-G (vGPCR) de KSHV puede estimular cascadas de señalización que inducen angiogénesis y transformación celular. Identificar estas cascadas puede tener significancia terapéutica. Ciclooxigenasa-2 (COX-2) es un medidor involucrado en angiogénesis tumoral que puede ser regulada por antinflamatorios (AINEs). En la primera parte de este trabajo demostramos que vGPCR regula la actividad y la expresión de COX-2 vía ERK-1/2. Encontramos que la inhibición de COX-2 impide la angiogénesis inducida por vGPCR y que la administración del AINE Celecoxib retarda el crecimiento tumoral con disminución en la vascularata y producción de VEGF. Así, COX-2 sería uno de los componentes moleculares del cambio angiogénico de vGPCR y un posible blanco terapéutico. En la segunda parte mostramos que la transfección con KSHV clonado en un Cromosoma Artificial Bacteriano (KSHVBac36) en preparaciones de médula ósea murinas enriquecida en precursores de células endoteliales (mEC) es suficiente para inducir tumorigénesis y llevar al cambio fenotípico angiogénico. Las células mEC transfectadas con KSHVBac36 (mECK36) estaban infectadas con KSHV, secretaban VEGF, eran angiogénicas in vivo e indujeron en ratones inmunodeficientes la formación de sarcomas de células ahusadas vascularizados que expresaban LANA y marcadores característicos de KS. La inhibición de la expresión de vGPCR en las mECK36 utilizando siRNA condujo a la inhibición de su angiogenicidad y tumorigenicidad. Estos resultados definen un modelo animal para estudiar la patogénesis de KS mediada por KSHV y señalan a vGPCR como uno de sus principales oncogenes angiogénicos.

Abstract:
KSHV ia a human oncovirus associated with Kaposi´s sarcoma (KS) an AIDS associated cancer. KS is a neoplasm characterized by proliferation of spindle-shaped cells and intense angiogenesis. The mechanisms whereby KSHV causes KS angioproliferative response are not well defined and the reproduction of KS by experimental KSHV infection has not yet been shown. vGPCR is a G protein-coupled receptor encoded by KSHV that subverts host´s signaling pathways to induced cell transformation and angiogenesis. Cyclooxygenase-2 (COX-2) is a mediator involved in tumor angiogenesis that can be inhibited by NSAIDS. We demonstrated that vGPCR upregulates COX-2 activity and expression, and we found that inhibition of COX-2 by the NSAID Celecoxib impairs vGPCR-driven angiogenesis and tumorigenesis. Taken together these results show that COX-2 is a molecular mediator of vGPCR angiogenicity and potential target for KS therapy. On the second part we show that transfection of KSHV cloned in a Bacterial artificial chromosome (Bac36) into mouse Bone marrow preparations enriched in endothelial cells and its progenitors (mEC) is sufficient to induce tumorigenesis and angiogenesis. mEC transfected with KSHVBac36 (mECK36) were infected with KSHV, displayed high levels of VEGF secretion, were angiogenic in vivo and induced spindle-cell sarcomas expressing KSHV LANA and KS phenotypic markers. The inhibition of vGPCR expression mediated by siRNA led to inhibition of mECK36 angiogenesis and of tumor growth. These results define an animal model of KSHV-mediated KS pathogenesis in vivo and point to vGPCR as one of its major angiogenic oncogenes.

Barrero, Paola Roxana. "Secuencia nucleotídica completa del Adenovirus 7h: análisis de los polimorfismos del gen del hexón de los Adenovirus circulantes en Buenos Aires entre los años 1990-2002" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los Adenovirus circularon en el período 1999-2002 durante todo el año, registrándose un mayor número de casos en el período invernal de baja temperatura y primaveral con cambios de temperatura frecuentes. El diagnóstico virológico se realizó tempranamente luego de la internación siendo la bronquiolitis el diagnóstico clínico al ingreso más frecuente. Se registró un mayor número de casos en menores de 12 meses y la evolución en general fue favorable registrándose 9 casos fatales en un total de 362 muestras analizadas. Se encontró una correlación negativa de grado medio con respecto a la temperatura, indicando un aumento en el número de casos cuando el registro térmico desciende. En cuanto a la humedad relativa y el índice UVB, la relación no es tan clara aunque es siempre de grado menor. Este parece ser un parámetro no necesariamente asociado a la aparición de casos de Adenovirus. El análisis filogenético del hexón completo permitió agrupar las muestras fatales y las separó de las graves y leves en el periodo 1990-1999. El análisis de las regiones hipervariables en el período 1990-2002 posicionó a las muestras analizadas en el cluster GTC2 junto al AV7h. La secuencia completa del AV7h se llevó a cabo por una estrategia de ensamblado de 8 contigs que permitieron elaborar una secuencia consenso de 35259 pb. con un porcentaje G+C del 51%. Se conservaron intactos los genes para las regiones tempranas, intermedias y tardías. El análisis filogenético ubicó al genoma AV7h junto con el AVB con el que tiene una homología del 84%. Se hallaron ORFs relacionados con proteínas pulmonares que podrían inducir autoanticuerpos o daño pulmonar crónico postviral.

Abstract:
In Argentina, Adenovirus 7h (AV7h) has been frequently associated with fatal cases and chronic lung disease. In to order to understand the characteristics of AV7h we accomplished the entire reference sequencing and analysed sample polymorphism in the hexon gene from a twelve-year period (1990-2002). Nasopharyngeal aspirates from children with acute lower respiratory infections were characterized by multiplex-PCR. Primers were designed and PCRs were performed to obtain the full genome for the reference 7h strain 87-922 and the entire hexon gene or hipervariable regions for samples. Amplicons were sequenced, contigs were aligned, a consensus full-length sequence was obtained for the reference strain 87-922 and phylogenetic relationships for hexon gene were inferred by maximum-likelihood criteria. Overall differences between AV7h hexon gene and prototype for serotype 7 (Gomen) sequence were <4% at nucleotide level and <3.5% at amino acid level. Phylogenetic analysis clustered together fatal cases apart from severe and mild cases. The entire genome was completed in 8 contigs with 44, 16, 7, 15, 14, 26, 18 and 15 primer reactions respectively. AV7h was 35263 bp in length and had a GC content of 51% and genes from the early, intermediate, and late regions were present in the expected human adenovirus locations. The genome differs from prototype strain for AVB (subspecie B2) in 16%, and 4% from vaccinal strain AV7(subspecie B1). This work constitutes the first attempt to elucidate intragenotypic variations within AV7h and to reveal particular features of this strain.

Manrique, Mariana Lorena. "Rol de la proteína matriz (MA) del virus de inmunodeficiencia de felinos (FIV) en el ensamblado viral : relación funcional entre la MA de FIV y la de los lentivirus de primates" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de inmunodeficiencia de felinos (FIV) es un lentivirus que causa en gatos domésticos un síndrome de inmunodeficiencia similar al SIDA de humanos. Por ello, el sistema FIV-gato doméstico es considerado un modelo adecuado para el estudio de las infecciones producidas por el virus de inmunodeficiencia de humanos (HIV). El gen gag de FIV, al igual que el del resto de los lentivirus, codifica para el precursor poliproteico Gag el cual se ensambla en partículas virales en la membrana plasmática de la célula infectada. Gag es procesado por la proteasa viral en las proteínas maduras de la cápside: matriz (MA), cápside y nucleocápside. Sin embargo, se desconocía hasta el momento la contribución de cada uno de los dominios de Gag de FIV al ensamblado viral. Con el objeto de estudiar el proceso de ensamblado de FIV, utilizamos el sistema del virus vaccinia para producir la formación de partículas a través de la expresión del gen gag. Los estudios bioquímicos y de microscopía electrónica realizados con células infectadas con este virus vaccinia recombinante demostraron que la poliproteína Gag de FIV se autoensambla en partículas con morfología lentiviral que son liberadas al medio extracelular. Para estudiar el rol de la proteína MA de FIV en la morfogénesis viral, se construyeron virus vaccinia recombinantes lleando mutaciones en este dominio del gen gag de FIV. La caracterización del fenotipo de estas proteínas Gag mutadas llevó a la identificación de dominios en la MA de FIV necesaios para el transporte de Gag a la membrana plasmática y para el ensamblado de partículas virales. Por otra parte, se decidió estudiar la relación estructural y funcional que existe entre la proteína MA de FIV y la del virus de inmunodeficiencia de simios (SIV), caracterizando el fenotipo de ensamblado de virus quiméricos derivados de SIV o FIV, en los que se reemplazó total o parcialmente el dominio MA de un virus por el del otro. El reemplazo total de la MA de SIV por su equivalente de FIV (quimera SIV) interfiere con el ensamblado de Gag en viriones. La poliproteína quimérica Gag SIV(MA FIV1-130) no se asocia eficientemente a membranas a pesar de miristilarse en igual nivel que el precursor Gag de SIV. El defecto en el ensamblado de la proteína Gag SIV(MA FIV1-130) es revertido por mutaciones que incrementan el carácter básico de la MA de FIV (mutación G31K/G33K) o por la coexpresión con el precursor Gag salvaje de SIV. Esto último indica que la proteína Gag quimérica mantiene la capacidad de establecer interacciones Gag-Gag. Por otro lado, las proteínas Gag quiméricas SIV(MA FIV1-36) y SIV(MA FIV37-130) en las que se sustituyó parcialmente el dominio MA de SIV por la región equivalente de FIV, se ensamblan en viriones con la misma eficiencia que el precursor Gag salvaje de SIV. Sin embargo, estos viriones son incapaces de incorporar la glicoproteína viral de envoltura y resultan significativamente menos infecciosos que el virus SIV salvaje. Finalmente, se construyó el virus quimérico FIV(MA SIV1-130) que contiene la MA de SIV en reemplazo de la de FIV. Este virus quimérico no sólo se ensambla eficientemente en viriones, sino que además es capaz de replicarse en una línea celular linfoidea felina. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis contribuyen así a comprender la homología funcional que existe entre las proteínas MA de lentivirus evolutivamente distantes.

Abstract:
Feline immunodeficiency virus (FIV) is a lentivirus that induces in cats an immunodeficiency syndrome similar to AIDS caused by human immunodeficiency viruses (HIVs) in humans. These similarities make the feline-FIV system a useful model for the study o HIV-1 infections. The FIV gag gene, like that of other lentiviruses, codes for the polyprotein precursor Gag that assembles into particles at the plasma membrane of infected cells. Gag is processed by the viral protease into the matrix (MA), capsid and nucleocapsid proteins which from the mature virions. However, the contribution of each of the FIV Gag domains to virus assembly had not as yet been addressed. To study the assembly process of FIV, we made use of the vaccinia virus system to reproduce particle formation by expressing the FIV gag gene. The biochemical and electron microscopy studies performed with cells infected with this recombinant vaccinia virus demonstrated that the FIV Gag polyprotein self-assembles into typical lentiviral particles that are released into the extracellular medium. To study the role of the FIV MA protein in virus morphogenesis, we generated a series of recombinant vaccinia viruses carrying mutations within the MA domain of the FIV gag gene. Phenotypic characterization of these FIV Gag mutants led to the identification of MA domains that are necessary for Gag transport to the plasma membrane and for particle production. Moreover, we investigated the structural and functional relationship between the FIV MA protein and that of the primate lentivirus simian immunodeficiency virus (SIV) by analyzing the assembly phenotype of SIV- and FIV-derived chimeric viruses in which the MA-coding region was partially or fully swapped. The replacement of the SIV MA domain with that of FIV (chimera SIV) severely impairs Gag assembly into virions. The chimeric Gag SIV (MA FIV1-130) polyprotein exhibits low membrane-binding capacity despite being myristylated in a wild-type manner. The assembly defect of the chimeric Gag SIV(MA FIV1-130) is reversed either by mutations that increase the basic character of the FIV MA (mutation G31K/G33K) or by coexpression with the wild-type Gag precursor; which indicates that the chimeric Gag protein retains the ability to participate in Gag-Gag interactions. Furthermore, the chimeric Gag polyproteins SIV(MA FIV1-36) and SIV(MA FIV37-130), in which SIV MA regions were replaced by their equivalent counterpart of the FIV MA, assemble into virions as efficiently as wild-type SIV Gag. However, these chimeric viruses do not incorporate the viral envelope glycoprotein and are significantly less infectious than wild-type SIV virions. Finally, we constructed the chimeric FIV(MV SIV1-130) virus containing the SIV MA-coding region in the context of the FIV genome. This chimeric virus not only assembles into virions with an efficiency similar to that of FIV, but is able to replicate in a feline lymphoid cell line as well. The results presented in this thesis thus provide further insight into the functional homology between MA proteins from distantly related lentiviruses.

García, Cybele Carina. "Actividad inhibitoria de compuestos reactivos contra motivos Zn-fingers sobre la infección con arenavirus" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los virus de la familia Arenaviridae incluyen patógenos humanos causantes de severas fiebres hemorrágicas, como los virus Lassa (LASV)y Junín (JUNV). La proteína Z de los arenavirus, posee un motivo RING finger altamente conservado entre los distintos arenavirus, necesario para la interacción con proteínas celulares y virales, y por lo tanto es un punto de ataque ideal para la quimioterapia antiviral contra las fiebres hemorrágicas. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la actividad inhibitoria de compuestos electrofílicos reactivos con motivos Zn fingers. provistos por el National Cancer Institute (USA), comprobar que Z es el blanco de acción de dichos compuestos y demostrar que su rol es esencial en el ciclo de multiplicación viral. Los compuestos, que incluyeron disulfuros alifáticos y aromáticos, derivados azoicos e hidrazidas fueron inicialmente evaluados por su capacidad inhibitoria sobre la infección de células Vero contra los arenavirus JUNV y Tacaribe (TCRV). De un total de 15 compuestos ensayados, 2 presentaron similar eficacia en sus propiedades antivirales y virucidas, 6 presentaron una actividad virucida superior a su efecto antiviral, 3 fueron estrictamente antivirales, 1 ejerció únicamente acción inactivante y 2 fueron inactivos. Los compuestos inactivantes mostraron ser efectivos también contra el virus de la coriomeningitis linfocitaria (LCMV), arenavirus prototipo de la familia. El análisis de los parámetros (tiempo y temperatura) que afectan la inactivación de JUNV y TCRV, demostró que la cinética de inactivación es rápida y que la reacción es dependiente de la temperatura, ya que no hubo inactivación del virus a 4°C. La interacción entre el virus y el compuesto inactivante lleva a un bloqueo del ciclo de multiplicación viral a nivel de la transcripción y replicación, ya que el mismo se adsorbe y penetra en las células con igual eficacia que el virus control, pero no se detecta RNA correspondiente a los genes N, GPC y Z, en los viriones inactivados. Este hecho se verificó por la ausencia total de síntesis de proteínas virales cuando se infectan células con virus inactivado. Sin embargo, los viriones inactivados mantienen la funcionalidad de las proteínas externas, ya que se observaron títulos comparables de anticuerpos neutralizantes en animales inoculados con viriones inactivados con respecto a los inoculados con JUNV y TCRV infecciosos, indicando así la preservación de la capacidad antigénica de las glicoproteínas luego del tratamiento inactivante. La acción diferencial de estos agentes sobre HSV-1 y los arenavirus confirma que la proteína Z de los arenavirus juega no sólo un rol regulatorio durante el ciclo viral, sino que tiene también importancia estructural, ya que los compuestos ejercen su acción tanto en la célula infectada, como directamente sobre el virión.Los resultados del estudio del efecto inhibitorio sobre la proteína Z purificada de LCMV y LASV, indicarían que los compuestos están dirigidos particularmente hacia la proteína Z de los arenavirus, interaccionando con ella y provocando su multimerización, con la consiguiente pérdida de funcionalidad y capacidad infectiva del virión. Por otro lado, se sabe que la infección con LCMV conduce a la recolalización de cuerpos nucleares de la proteína celular con homeodominios ricos en prolina (PRH) al citoplasma de la célula infectada. En células infectadas con LCMV se observó que el tratamiento con NSC20625 inhibe la replicación del RNA viral, sin afectar la transcripción del gen celular prh. Además, el tratamiento con NSC20625, no sólo inhibió la expresión de la proteína viral Z en las células infectadas con LCMV, sino que además revirtió el patrón de distribución de la proteína PRH al patrón de PRH observado en células normales. Por último, el compuesto azoico ANNB mostró un amplio rango de acción contra los arenavirus, ya que fue también inhibidor de la multiplicación de otras cepas de JUNV, asi como de TCRV, Pichinde y LCMV. El estudio del modo de acción antiviral manifestó que el ANNB afecta las etapas tardías del ciclo de multiplicación viral; esto se comprobó al observar que ni las etapas tempranas de adsorción e internalización viral, ni la síntesis y expresión de proteínas virales estaban afectadas. La producción de virus asociado a células está igualmente afectada que el virus extracelular, por lo que el ANNB estaría bloqueando el correcto ensamblado dentro de la célula. Estos resultados demuestran por primera vez que una proteína esencial para los arenavirus es el blanco de acción de compuestos que representan agentes antivirales promisorios contra estos patógenos, mostrando similar eficacia in vitro que la ribavirina, la única droga conocida que ha sido ensayada en los pacientes infectados con arenavirus.

Abstract:
The Arenaviridae family includes several human pathogens like Lassa virus (LASV) and Junín virus (JUNV) causing hemorrhagic fevers. The Z protein of arenavirus presents a highly conserved RING finger motif which turns this protein an attractive target for antiviral therapy. In the present study, we have evaluated fifteen selected Zn fingers reactive compounds, provided by the National Cancer Institute, for their capacity to act as inhibitors of arenavirus infection. From the total of compounds evaluated against JUNV and Tacaribe (TCRV), 2 presented similar effectiveness in their antiviral and virucidal properties, 6 presented a virucidal activity superior to the antiviral effect, 3 were exclusively antivirals, 1 exerted only virucidal action and 2 were totally inactive. The virucidal compounds demonstrated to be effective also against the Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). The time course of virucidal activity showed that the inactivation started a few minutes after addition of the compound to the virus suspension and proceeded in a time dependent manner. Arenavirus inactivation was also energy-dependent since a temperature higher than 30°C was required to destroy virus infectivity. The mode of inactivation of these compounds rendered non-infectious virus particles but preserving the conformational integrity of the virion glycoproteins. This conclusion was supported by the following results: binding of inactivated virions to cellular receptor was performed with the same efficacy as native virions; internalization via fusion between viral and endosome membranes was not affected in inactivated virions; after inoculation of adult mice with 10 4 PFU of either JUNV and TCRV control or treated virus with NSC20625, comparable levels of antibodies were detected indicating that the inmunogenecity of viral glycoproteins was preserved. In order to further understand the antiviral mechanism we studied the transcription and replication of inactivated JUNV virions on Vero cells by detection of the N, GPC and Z genes. No amplification products were detected, demonstrating a blockade in viral transcription. The differential inhibitory action observed against arenavirus and HSV-1 confirmed that Z is playing structural and regulatory roles during the multiplication cycle. These zinc finger inhibitors were reported to establish disulfides linkages between zinc finger motifs in proteins. The results obtained after investigating the extent of Z multimer formation exhibited significant altered patterns showing high-molecular-weight multimers, suggesting the establishment of inter-and possibly intramolecular disulfide bonds, leading to the formation of Z multimers. It has been reported that LCMV gene expression and replication affect the subcellular localization of PRH in human hepatocytes and that the PRH protein can be physically associated with the arenavirus Z protein. It was observed that the treatment with NSC20625 of LCMV infected-cells inhibited the replication of the viral RNA, without affecting the transcription of the cellular gene prh. The NSC20625 treatment, not only inhibited the expression of Z viral protein in LCMV infected-cells, but in addition, reverted the distribution pattern of PRH protein in these treated cells to the observed pattern of PRH in normal cells. On the other hand, the azoic compound ANNB showed a broad spectrum of action against arenavirus, since it was also inhibitor of the multiplication of several strains of JUNV, as well as of TCRV, Pichinde and LCMV. The mode of action showed that ANNB affects late stages of the viral multiplication cycle; this was verified when observing that neither the early stages of adsorption and internalization, nor the viral protein synthesis and expression were affected. The production of associated virus to cells was affected, so the ANNB would be blocking the correct assembly within the cell. The present work demonstrate for the first time that an arenavirus protein is the target of compounds that represent a promising class of agents against highly pathogenic arenaviruses showing similar effectiveness in vitro to the ribavirin, the only well-known drug that has been used in patients with hemorrhagic fevers caused by arenavirus.

Chimeno Zoth, Silvina Andrea. "Estudio antigénico e inmunogénico de tres proteínas aisladas del virus de la diarrea viral bovina (BVDV): su aplicación al diagnóstico y al desarrollo de vacunas experimentales" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de la diarrea viral bovina (BVDV)es el agente etiológico de una importante enfermedad que afecta al ganado ocasionando grandes pérdidas económicas a nivel mundial. La infección por BVDV es a menudo subclínica o causa sintomatología clínica leve y poco específica, sin embargo, la infección transplacentaria puede ocasionar desórdenes reproductivos, malformaciones congénitas y nacimiento de animales persistentemente infectados (PI). La vacuna empleada actualmente en Argentina se formula con virus inactivado químicamente. Sin embargo, los datos existentes sobre su efectividad para inducir anticuerpos neutralizantes son contradictorios y la protección frente a la infección no resulta plenamente satisfactoria. En nuestro país, la prevalencia de anticuerpos anti BVDV en el ganado bovino es de 40-90%, según los reportes; aproximadamente el 2% de la población total de animales se encuentra persistentemente infectado. En esta compleja situación epidemiológica, la técnica de referencia utilizada para la detección de anticuerpos anti BVDV es la seroneutralización en cultivo celular. Si bien esta técnica resulta muy especifica y sensible, requiere de un laboratorio de diagnóstico de mediana-alta complejidad y resulta económicamente desventajosa para analizar un número alto de muestras. En el presente trabajo se abordaron ambas problemáticas centrales para el control de la enfermedad. Por un lado, se desarrollaron y evaluaron ensayos de ELISA para detectar anticuerpos anti BVDV en el suero de los bovinos. Los ensayos se diseñaron utilizando cada una de las tres proteínas más inmunogénicas del virus, E0, E2 y NS3, expresadas en el sistema baculovirus / células de insecto. Los ensayos de ELISA demostraron ser altamente sensibles y específicos en la detección de anticuerpos anti BVDV, de manera similar a la neutralización. Más aún, la inclusión de la proteína no estructural NS3 permitió detectar anticuerpos anti BVDV en animales tipificados como negativos en ensayos de seroneutralización. Por otro lado, se ensayó una vacuna experimental basada en la glicoproteína E2. Para ello se llevó a cabo una prueba de vacunación y desafío en la que se evaluó la respuesta inmune humoral y la protección conferida por la vacuna experimental frente a una de las vacunas comerciales usada actualmente. El nivel de anticuerpos neutralizantes presentes en el suero de los animales vacunados con la vacuna recombinante E2 fue significativamente mayor que el inducido por la vacuna inactivada convencional. Al momento del desafío, los animales vacunados con E2 presentaron altos niveles de anticuerpos neutralizantes, mientras que en los animales de los grupos vacunados con vacuna inactivada o con placebo, éstos fueron indectables. Coincidentemente, la sintomatología clínica desarrollada por los bovinos vacunados con la vacuna E2 recombinantes después del desafío viral fue más leve. Los resultados obtenidos demuestran que es posible mejorar las actuales vacunas contra BVDV, así como diseñar nuevos ensayos diagnósticos sencillos, sensibles, específicos y económicos basados en la utilizaciónde las proteínas recombinantes E2 y E2/E0/NS3, respectivamente. Este trabajo puede considerarse como un primer paso hacia la resolución de ambos problemas.

Abstract:
Bovine viral diarrhea virus (BVDV)is the ethiological agent of an important disease that affects cattle producing elevated economic Iosses worlwide. Usually, BVDV infection is subclinical or causes mild disease. However, transplacental infection may result in reproductive desorders, teratogenic effects or persistent infection in the neonatal calf (PI animals). Vaccines used nowadays in Argentina are based on chemically inactivated virus, however, existent data on their effectivity as neutralizing antibodies inducers are contradictory and protection against viral infection is not entirely satisfactory. In our country, prevalence of anti-BVDV antibodies of 40-90% has been reported, and near the 2% of the cattle population is considered persistently infected. In the context of this complex epidemiological situation, the reference technique employed for the detection of anti BVDVantibodies is the seroneutralization assay in cell culture. This technique is very specific and sensible, but it requires a middle-high complex laboratory equipment and results economically unproductive when a high number of samples must be processed. In the present work, both central concerns for the disease control were considered. On one hand, ELISA assays for anti-BVDV antibodies detection in cattle sera were developed and evaluated. Assays were designed using the most immunogenic proteins of BVDV, EO, E2 and NS3 expressed in the baculovirus / insect cells system. ELISA assays showed to be highly sensible and specific for anti-BVDV antibodies detection. Moreover, the inclusion of non structural protein NS3 made possible the detection of specific antibodies in animals classified as negative by seroneutralization assays. On the other hand, a recombinant subunit vaccine based on E2 glycoprotein was tested. Humoral immune response and protection conferred in cattle vaccinated with the experimental vaccine or a commercialy available vaccine were evaluated. The level of neutralizing antibodies in sera of animals vaccinated with the recombinant E2 vaccine was significantly higher than the one induced by the conventional vaccine. At challenge, animals experimentally vaccinated showed high levels of neutrallizing antibodies whereas animals vaccinated with the inactivated vaccine or the negative control group showed undetectable neutrallizing antibody levels. The results obtained showed that it is possible to improve current used BVDV vaccines and to design better diagnostic assays based on the use of recombinants E2 and E2/E0/NS3 proteins respectively. This work may be considered as a first step towards the resolution of both problems.

Cordo, Sandra M.. "Interacción del virus Junín con el citoesqueleto y la membrana de la célula huésped" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
EI virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, es un miembro de la familia Arenaviridae. Es un virus envuelto de genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación ha sido caracterizado en varios aspectos. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de PH. Una vez que la nucleocápside se encuentra dentro del citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales, mediante una estrategia de codificación ambisense. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside es denominada NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), sintetizado en el retículo y exportado a la membrana plasmática de la célula, se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2. Ambas conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. Se desconocen hasta el momento los mecanismos detallados y las estructuras celulares involucradas en el transporte de las distintas proteínas virales hacia el sitio de brotación. El ensamblado de las partículas virales se lleva a cabo en la membrana plasmática de las células infectadas. En este trabajo se estudiaron algunos aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando la asociación de NP, GPC y GP1 a distintas estructuras celulares. En primer lugar se estudió la interacción del virus con la red de filamentos intermedios (FI) del citoesqueleto. Se utilizó el compuesto acrilamida capaz de desorganizar específicamente los FI. La producción de virus infeccioso disminuyó de manera dosis-dependiente en presencia del mismo. Los resultados, observados en celulas Vero, cultivos de fibroblastos humanos y astrocitos murinos, fueron comparables. Se analizó luego el efecto del compuesto sobre diferentes pasos del ciclo de multiplicación. De esta manera se determinó que la integridad de los FI es crucial al menos durante los pasos previos a la síntesis de proteínas virales y posteriores a la internalización. Mediante extracciones específicas realizadas con detergentes no iónicos se encontró que NP se asocia a la fracción celular correspondiente al citoesqueleto, aunque no se determinó a que componente correspondería esta interacción. Las glicoproteínas no mostraron asociación específica a estas fracciones celulares en iguales condiciones. Por otro lado, modificaciones en el contenido de colesterol de las células infectadas y tratadas con inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa, disminuyeron la infectividad y localización de las glicoproteinas en la membrana de las mismas. Estos resultados llevaron al análisis de la asociación de GPC y GP1 a estructuras de membrana ricas en colesterol denominadas rafts. Los ensayos de fraccionamiento celular específicos para estos microdominios de membrana mostraron la localización de las glicoproteínas en rafts. Esta interacción fue dependiente de la temperatura y de la presencia de colesterol en los cultivos infectados. Además, la asociación de las glicoproteínas a las fracciones rafts fue estabilizada a 37°C por la adición de anticuerpos específicos. Estos resultados sugieren la utilización de esta vía como mecanismo de transporte para GPC y GP1 a la membrana celular de las células infectadas. Asimismo la localización de las glicoproteínas en los microdominios rafts podría representar una estrategia para el reclutamiento de los componentes virales previo al paso de liberación de la progenie en las células infectadas.

Abstract:
Junin virus (JUNV), the etiological agent of argentine hemorrhagic fever, is a member of the Arenaviridae family. The viral cycle multiplication of this RNA virus has been characterized in different aspects. The entrance in the target cells is performed by receptor-mediated endocytosis following pH dependant fusion step. Once the nucleocapsids are within the cytoplasm the ambisense strategy allows expression of five structural proteins. The major nucleocapsid associated protein is named NP. As a result of the glycoprotein precursor synthesis and after its maturation and exocytic transport to plasma membrane of infected cells, two glycoproteins are obtained. Both proteins, named GP1 and GP2, form the claviform structures found in the viral envelope. At this moment, the detailed mechanisms and cellular structures involved in the transport of different viral proteins towards the budding site are not known although the fact that viral assembly is carried out in plasma membrane of infected cells is currently accepted. In this work we have studied some aspects of virus-cell interaction characterizing the association of NP, GPC y GP1 to cellular structures. First, we have studied the interaction between virus and cytoskeletal intermediate filaments (IF). In the presence of acrylamide, compound that selectively disrupt IF, viral yield was diminished. The results were similar in Vero cells, human fibroblast cultures and murine astrocytes. Then, we analyzed the effect of acrylamide on different steps of the multiplication cycle. It was determined that IF integrity is essential at least between the step of internalization and viral protein synthesis. Detergent extractions of infected cultures demonstrated that NP associates to cellular cytoskeletal fraction although it was not possible to identify the specific cytoskeletal framework involved in that association. Glycoproteins did not show specific association to these cytoskeletal fractions under similar conditions assayed. On the other hand, modifications in the cholesterol contents of infected cells induced by HMG-CoA reductase inhibitors, diminished infectivity and glycoproteins membrane localization. This result leded us to analyse the association of GPC and GP1 to membrane cholesterol enriched structures named rafts. Specific cellular fractionation assays showed glycoproteins associated to raft microdomains. This interaction was temperature and cholesterol dependant. Moreover, glycoprotein association to membrane rafts was stabilized at 37°C by specific antibody addition. These results suggest that GPC and GP1 may utilize the exocytic raft pathway to reach the plasma membrane of infected cells. Finally, glycoproteins raft association may represent the strategy to recruit viral proteins before releasing progeny from the cells.

König, Guido Alberto. "Desarrollo de un sistema de vigilancia epidemiológica molecular para el virus de la fiebre aftosa" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La fiebre aftosa es una enfermedad que provoca importantes trabas en el comercio internacional y en el desplazamiento de animales en las zonas afectadas. El agente etiológico de la enfermedad es el virus de la fiebre aftosa (VFA). El avance de la Epidemiología Molecular en los últimos años ha facilitado la caracterización de las cepas que circulan en un brote y permite la determinación del probable origen y evolución del mismo. Con el objeto de estudiar los brotes surgidos en Sudamérica y especialmente en la Argentina en los últimos 15 años, se amplificó por trascripción reversa asociada a la reacción en cadena de 1a polimerasa (RT-PCR) y se secuenció la región nucleotidica que codifica para la proteína VP1 de 94 muestras del VFA. En el período 2000-2002 se identificaron y caracterizaron las dos cepas virales responsables de los brotes de serotipo A (A Argentina 2000 y A Argentina 2001) y las dos variantes del virus responsable de los brotes de serotipo O (O Argentina 2000). Asimismo se determinó la cocirculación viral de distintas cepas del VFA para los serotipos A, O y C en el período 1990-1994. Además se establecieron las relaciones filogenéticas dentro del topotipo Europeo-Sudamericano de cada uno de los serotipos y se elaboró una clasificación interna de los topotipos. Finalmente se creó un banco de secuencias nucleotïdicas de la proteína VP1 de los aislamientos sudamericanos y se optimizó la metodología molecular a utilizar en la caracterización del VFA, en casos de emergencias sanitarias en el país.

Abstract:
Foot and Mouth disease causes significant loses in international trade and animal movements in affected areas. The etiologic agent of the disease is the Foot and Mouth Disease Virus (FMDV). The progress of Molecular Epidemiology on past years allowed the characterization of an outbreak and the discrimination of his origin and evolution. The nucleotide VP1 coding region of 94 samples of FMDV were amplified by reverse transcription and polimerase chain reaction (RT-PCR)and sequenced. These isolates belong to South America, but most of them were obtained from Argentina in the last 15 years. In 2000-2002 period, two strains responsible for serotype A outbreaks, have been identified (A Argentina 2001 and A Argentina 2000). Also, two variants of the virus liable to serotype O outbreaks were recognized (O Argentina 2000). Viral co circulation of different serotypes A, Oand C stains has been detected on 1990-1994 years. Moreover, phylogenetic relationships have been established inside the Europe-South American topotype of each serotype and an internal classification has been established. Finally, in case of a new outbreak of the disease, a VP1 nucleotide sequence database of South-American isolates has been built up. Also, the molecular methodology has been optimised in order to characterize the FMDV strain.

Petrera, Erina. "Acción dual de meliacina, un compuesto aislado de Melia azedarach L., como agente antiherpético e inductor de citoquinas" (2007) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Meliacina (MA), un limonoide presente en las hojas de la planta Melia azedarach L., es capaz de inhibir in vitro la replicación de un amplio espectro de virus y actuar también como un potencial inmunomodulador. En este trabajo de tesis se demuestra la efectividad de meliacina como antiviral contra el patógeno HSV-2, ya sea inhibiendo la replicación del virus en cultivos celulares o por su efecto terapéutico administrado en forma tópica en un modelo de infección genital en ratones. Se confirma, además, su actividad como inmunomodulador por su efecto sobre macrófagos peritoneales murinos cultivados in vitro. MA aumenta la producción de citoquinas, en especial el TNF-α, cuando es administrada sola o en combinación con distintos inductores y este aumento está relacionado con la activación del factor de transcripción NF-kB. Por otro lado, MA inhibe la replicación del virus HSV-2 en células Vero suministrada sola o en forma aditiva en combinación con IFN-α, IFN-γ o los dos juntos indicando que aumenta la acción de ambas citoquinas. Estos resultados en conjunto sugieren que MA puede ejercer distintos efectos dependiendo del tipo celular sobre el que actúa: como antiviral en células epiteliales y como modulador de la producción de citoquinas en los macrófagos. A estas acciones combinadas podría deberse el efecto terapéutico ejercido en el modelo in vivo.

Abstract:
Meliacine (MA), a limonoid present in leaf extracts of Melia azedarach L., exhibits a broad range of virus inhibition in vitro and is able to act as a potential immunomodulator. In this work we demonstrate meliacine effectiveness as antiviral against HSV-2, inhibiting virus replication in cell cultures or due to the therapeutic effect exerted on murine genital infection. The immunomodulator activity of meliacine was confirmed, studding its action on peritoneal macrophages in vitro cultured. MA enhances cytokine production, especially TNF-α, when is administered alone or in combination with different inductors. This increase is associated with transcription factor NF-kB activation. On the other hand, MA inhibits HSV-2 replication and enhances IFN-α and IFN-γ inhibition on epithelial cells. In addition, MA increases, in an additive way, the synergistic inhibition produced by IFN combination. These results suggest that meliacine improves interferon action. These results together suggest that meliacine is able to exert different effects depending on the cellular type which is acting on: as antiviral on epithelial cells and a cytokine modulator on macrophages. The therapeutic effect exhibited on in vivo infection could be due to these combined actions.

Martínez, María Guadalupe. "Estudio de las etapas tempranas del ciclo de replicación del Virus Junín" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, es un miembro de la familia Arenaviridae. Es un virus envuelto de genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación ha sido caracterizado en varios aspectos. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de pH. Una vez que la nucleocápside se encuentra dentro del citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales, mediante una estrategia de codificación ambisentido. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside es denominada NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP). Estos conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. Se desconocen hasta el momento los mecanismos detallados y las estructuras celulares involucradas en los eventos tempranos del ciclo de replicación viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos del ciclo de multiplicación del JUNV. En primer lugar se analizó la vía de entrada utilizada por el JUNV para ser endocitado en las células, así como también se estudiaron las proteínas celulares esenciales para este proceso. Con este fin se utilizaron plásmidos que expresan proteínas dominantes negativas, encontrándose que es esencial la Eps-15 y dinamina en el proceso de endocitosis, mientras que las proteínas Rab5 y Rab7 juegan un rol esencial en el paso posterior a la internalización y previo a la fusión. Luego se estudio la interacción del virus con las principales redes del citoesqueleto: los microfilamentos y los microtúbulos. Se utilizaron compuestos capaces de despolimerizar o estabilizar específicamente cada una de estas redes. La internalización del virus disminuyó de manera dosisdependiente en presencia de compuestos que alteraban la integridad de los microfilamentos o estabilizaban los microtúbulos. El tropismo de los virus está regulado por la interacción entre factores celulares y virales durante la transmisión, diseminación y replicación en el huésped. La unión del virus a receptores de superficie específicos determina la susceptibilidad de las células a ser infectadas. La entrada y diseminación de diferentes familias virales puede ser mediada por lectinas de tipo C, como DC-sign o L-sign. Por este motivo se estudió si estas actúan en la infección con el JUNV. Para esto se utilizaron células relativamente no permisivas a la infección por JUNV como las células CHO, las cuales al expresar transientemente las lectinas DC-sign o L-sign fueron infectadas por el JUNV de forma altamente eficiente. Fue demostrado que las células 3T3, que en su forma salvaje no permiten la infección del JUNV, se vuelven permisivas al mismo al expresar de forma estable estas lectinas, y esta interacción es específica lo cual fue demostrado al bloquear la infección con anticuerpos específicos contra las lectinas o el compuesto mannan. Actualmente no hay tratamiento para las fiebres hemorrágicas, por lo que existe una necesidad crítica de desarrollar terapias efectivas para tratar los brotes anuales y contrarrestar su potencial uso como armas biológicas. Todos los virus causantes de fiebres hemorrágicas infectan preferencialmente monocitos, macrófagos y células dendríticas durante las etapas tempranas de la enfermedad. Es por este motivo que estas células representan un blanco potencial en el tratamiento de las fiebres hemorrágicas.

Abstract:
Junín virus (JUNV), the etiological agent of argentine hemorrhagic fever, is a member of the Arenaviridae family. The viral cycle multiplication of this RNA virus has been characterized in different aspects. The entrance in the target cells is performed by receptor-mediated endocytosis following pH dependant fusion step. Once the nucleocapsids are within the cytoplasm the ambisense strategy allows expression of five structural proteins. The major nucleocapsid associated protein is named NP. As a result of the glycoprotein precursor synthesis and after its maturation, two glycoproteins and a signal peptide are obtained. These components, named GP1, GP2 and SP, form the claviform structures found in the viral envelope. At this moment, the detailed mechanisms and cellular structures involved in the early steps of the virus replication cycle are not known although. In this work the interaction between virus and host cells was studied, characterizing the role of cellular proteins in early events of virus replication cycle. It was first evaluated the way of entry used by JUNV to entry host cells and the proteins involved in this process. With this end, plasmids that express dominant negative mutants were used, demonstrating that EPS-15 and dynamin were key proteins in this step, while Rab5 and Rab7 were essential in a step after entry prior to fusion. Then the interaction between JUNV and the main components of the cytoskeleton was evaluated. Compounds that specifically disrupt or stabilized microfilaments or microtubules were used. Virus entry was extremely reduced in a dose dependent way in the presence of compounds that depolimerized microfilaments or stabilized microtubules. Target cell tropism of enveloped viruses is regulated by interactions between viral and cellular factors during transmission, dissemination, and replication within the host. Binding of viral envelope glycoproteins to specific cellsurface receptors determines susceptibility to viral entry. The entry and dissemination of viruses in several families can be mediated by C-type lectins such as DC-sign and L-sign. Results from transduction with JUNV pseudovirus show that infection of relatively non-permissive CHO cells was markedly enhanced when we over expressed DC-sign or L-sign. Experiments using non-permissive mouse 3T3 cells showed that they become permissive to JUNV pseudovirus transduction when they stable express DC-sign, or its homologue L-sign, and that transduction of 3T3 stable expressing DC-sign or L-sign is blocked by anti–DC-sign and/or L-sign antibodies and mannan. Therefore hDC- and hL-sign can act as a novel attachment factors that mediate entry of JUNV. To the date there is no treatment for hemorrhagic fevers, so there is an important requirement to develop specific therapies against annual outbreaks and reduce its potential use as a bioterrorism agent. All hemorrhagic fever viruses infect preferentially monocytes, macrophages and dendritic cells during early stages of the disease. For this reason these cells represent a potential target in the treatment of hemorrhagic fevers.

Rodríguez, Ana María. "Relevancia de la inmunidad celular subtipo específica en el desarrollo de estrategias de vacunación frente a VIH-1" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Han pasado casi 30 años de la detección de los primeros casos de VIH-1 y aún no se ha conseguido desarrollar una vacuna efectiva y segura. La epidemia de VIH en Argentina está caracterizada por una alta prevalencia de infecciones causadas por virus pertenecientes al subtipo B y formas recombinantes circulantes BF (CRF12_BF). A pesar de la amplia gama de trabajos dedicados a la caracterización de la respuesta inmune y al desarrollo de vacunas frente a VIH, no queda claro cuál es el impacto de la variabilidad en la elección del antígeno. Nef es una de las proteínas virales elegida como antígeno en los ensayos clínicos y pre- clínicos para vacunas. En este trabajo de Tesis, Nef fue usada como una herramienta para evaluar la importancia de las variantes recombinantes BF de VIH en el diseño de futuras vacunas. Vectores de ADN, MVA y VV que expresan NefBF y NefB fueron generados y caracterizados. Luego de la inmunización en ratones Balb/c con una dosis simple de ADN seguida por otra de MVA, se encontró que NefBF generó una respuesta altamente específica sin detectarse reactividad cruzada frente a Nef del subtipo B. Sin embargo, luego de aplicar un esquema de inmunización más extenso (tres dosis de ADN más una dosis de MVA) se indujo una respuesta específica mayor, acompañada con el aumento de la reactividad cruzada frente a B, aunque de menor magnitud que frente al antígeno homólogo NefBF. Por otro lado, al aplicar el vector VVnefBF se obtuvo una respuesta específica cerca de tres veces mayor que con MVA, pero con el mismo grado de reactividad cruzada; mientras que la inmunización con VVnefB generó una respuesta de menor magnitud, pero con mayor grado de reactividad cruzada contra NefBF. La aplicación de IL-12 y GM-CSF desde vectores de ADN (como moléculas adyuvantes) aumentó la respuesta hasta seis veces, al aplicarse por separado, y 14 veces al aplicarse juntas. Este nivel de respuesta permitió caracterizar los epítopes de mayor inmunogenicidad. Estos resultados son de crucial importancia para el desarrollo de una futura vacuna para nuestra región, indicando que antígenos de estas variantes virales BF deberían ser considerados en el diseño de las mismas.

Abstract:
It has been almost 30 years since the detection of the first HIV-1 cases and yet an effective and safe vaccine has not been developed. The HIV epidemic in Argentina is characterized by the high prevalence of infections caused by subtype B and BF variants. Despite the wide range of publications on the immune response against HIV and the vaccine development effort, the impact of variability on vaccine antigen selection is still unclear. Nef is a viral protein that has been selected as antigen in clinical and pre-clinical vaccine trials. In this thesis, Nef protein was used as a tool to study the impact of HIV-1 BF variants on the design of future vaccines. DNA, MVA and VV vectors expressing Nef from the CRF12_BF recombinant form or from subtype B of HIV-1 were generated and characterized. After the administration of single DNAprime/MVAboost immunization schedules in Balb/c mice, it was found that NefBF delivered from these vectors generated a response of high specificity without cross-reactivity against subtype B. But, when a more potent response was induced after 3 priming DNA doses and a booster with MVA recombinant virus, cross-reactivity against NefB was detected, although of lower magnitude than the NefBF specific response. Furthermore, the application of VVnefBF vector generated a nearly three-fold enhanced immune response than the schedule using MVA, but with the same level of low cross-reactivity, whereas immunization with VVnefB generated a slightly lower response, but with a greater cross-reactivity against NefBF. The application of IL-12 or GM-CSF as molecular adjuvants increased the specific response by six-fold, and 14-fold when they were applied together. This level of response allowed the characterization of the most immunogenic epitopes. These results will be pivotal for HIV vaccine design in our region, indicating that antigens from these viral variants should be considered for a future vaccine.

Mongelli, Vanesa Claudia. "Estudio funcional de las proteínas codificadas por el virus del Mal de Río Cuarto en hospedantes vegetales" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Este virus es capaz de replicar de manera persistente y no citopática en delfácidos (chicharritas) y en el floema de varias especies de gramíneas donde provoca síntomas severos y económicamente importantes. Nuestro trabajo anterior demostró que el MRCV es una especie viral independiente de las conocidas hasta el momento cuyo genoma está formado por 10 segmentos de RNA de doble cadena que codifican para 13 proteínas (PMRCVs) e identificó aquellas proteínas estructurales. Sin embargo, aún se desconoce la función de la mayoría de las proteínas virales (en particular de aquellas no estructurales) y los mecanismos moleculares que determinan el establecimiento y desarrollo de la infección. El objetivo general de esta Tesis fue estudiar, definir y caracterizar la función de distintas proteínas codificadas por el MRCV a nivel molecular en hospedantes vegetales. En particular se propuso identificar las proteínas virales implicadas en el movimiento intercelular del virus dentro de la planta, en la producción de los síntomas del MRCV en plantas (determinantes de patogenicidad) y la(s) posible(s) proteina(s) con actividad supresora del silenciamiento de RNA. Este trabajo de Tesis representa el primer avance en la caracterización a nivel molecular de la función de 10 las 13 PMRCVs (P4, P5-1, P5-2, P6, P7-1, P7-2, P8, P9-1, P9-2 y P10) en sistemas vegetales. Para identificar proteínas del MRCV responsables del movimiento viral en plantas, se ensayó la capacidad de las distintas proteínas en estudio de complementar el movimiento de un Potato virus X (PVX) mutante, defectivo en esta función en Nicotiana benthamiana (Nb). Mediante este sistema, no fue posible identificar proteínas de movimiento entre las codificadas por el MRCV. A continuación se analizaron las características de la infección de plantas de Nb con recombinantes de PVX portando distintas secuencias codificantes para las PMRCVs. Se encontró que la expresión temprana de la proteína no estructural P7-2 produce un drástico aumento en la severidad sintomática que no es acompañado por un aumento en la acumulación viral, mientras que la expresión de P7-1 a partir del mismo vector retrasa la infección viral y reduce la severidad sintomática. Por otra parte, la presencia de los secuencias codificantes para las proteínas P9-1 (mayoritaria del viroplasma) y P10 (mayoritaria de cápside externa) en el mismo vector viral impidió el establecimiento de la infección, sugieriendo que estas proteínas podrían desencadenar una respuesta de resistencia a la infección viral en Nb. Con el objetivo de identificar proteínas del MRCV con actividad supresora del silenciamiento del RNA se utilizó un sistema modelo que se basa en la inducción del silenciamiento en plantas transgénicas que expresan GFP mediante la agroinfiltración con una cepa capaz de expresar un inductor de silenciamiento (GFP o dsGFP). Ninguna de las proteínas del MRCV evaluadas logró interferir con el silenciamiento tanto local como sistémico en este sistema. Sin embargo, mediante el uso de este sistema modelo se logró demostrar que la expresión de las proteínas no estructurales P7-1 y P7-2 codificadas por el segmento 7 del MRCV da lugar a reducciones en la acumulación del mRNA de transgenes expresados de manera transitoria o estable en un proceso que probablemente sea de origen postranscripcional. Esta actividad no había sido descripta hasta el momento para otras proteínas virales y es muy novedosa e interesante, en particular cuando se considera que la proteína P7-2 no está presente en el virus Nilaparvata lugens reovirus (NLRV) que pertenece al mismo género que el MRCV pero que es incapaz de infectar plantas. En conjunto los resultados sugieren que las proteínas P7-1 y P7-2 podrían estar implicadas en la regulación de la expresión tanto de genes virales como del hospedante durante el desarrollo de la infección del MRCV. Finalmente, al estudiar la expresión transitoria de las PMRCVs en Nb se encontró que sus niveles de expresión son bajos y que la utilización de dicotiledóneas como sistemas modelo para el estudio funcional de estas proteínas podría no ser conveniente en ciertos casos. Al analizar comparativamente el uso de codones de las PMRCVs en Nb, maíz y Nilaparvata lugens (delfácido en el que replica el NLRV), no se encontraron diferecias en el uso de codones que pudieran explicar los bajos niveles de expresión en Nb. La información y herramientas biológicas aquí generadas constituyen un gran progreso en el estudio de la actividad de las proteínas coficadas por el MRCV lo cual contribuirá al diseño de futuras estrategias efectivas de control de esta enfermedad en plantas.

Abstract:
Mal de Río Cuarto virus (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causes the most important maize disease in Argentina. This virus is able to replicate both in delphacid vectors (planthoppers) where it replicates in a persistent and non-cytopathic manner and in the phloem tissue of several grass species where it produces severe and economically important symptoms. Our previous work showed that MRCV is a new viral species and that its genome consists of 10 segments of double-stranded RNA that encode for 13 proteins (PMRCVs). The identity of the viral structural proteins was also defined. However, the biological function of the different PMRCVs (particularly in the case of non-structural proteins) and the mechanisms that determine the establishment and development of MRCV infection in both hosts are still unknown. The aim of this Thesis was to study, define and characterize the role of different MRCV-encoded proteins in plant hosts at a molecular level. Our particular goals were to identify those viral proteins involved in the virus spread within the plant, those involved in the development of MRCV symptoms in plants (pathogenicity determinants) and the possible viral RNA silencing suppressors. This Thesis represents the first general survey of the biological function at a molecular level of 10 of the 13 PMRCVs (P4, P5-1, P5-2, P6, P7-1, P7-2, P8, P9-1, P9-2 y P10) using plant model system. In order to identify those PMRCVs involved in plant intercellular movement, the capacity of different viral-encoded proteins to complement movement of a mutant Potato Virus X (PVX) in Nicotiana benthamiana (Nb) was assessed. Using this model system no movement protein was found amongst PMRCVs. Next, general features of infections caused by recombinant PVX viruses carrying PMRCVs-coding sequences in Nb were analyzed. It was found that the early expression of P7-2 causes a drastic increase in symptom severity without producing a concomitant increase in recombinant PVX accumulation. Expression of P7-1 from the same PVX vector, on the other hand, lead to a delay in the progress of viral infection and reduced symptom severity. Inoculation of Nb with PVX recombinant vectors harboring P9-1 (major viroplasm protein) or P10 (major outher capsid protein) coding sequences produced no infection, suggesting that these proteins might trigger a resistance response. With the aim of identifying viral suppressors of RNA silencing among PMRCVs, a model system based on the induction of RNA silencing in transgenic plants expressing GFP by agroinfiltration with a strain capable of expressing an inducer of silencing (GFP or dsGFP) was used. None of the analyzed PMRCVs interfered with local or systemic RNA silencing. However using this same model system it was found that the expression of non-structural proteins P7-1 and P7-1, both encoded by MRCV genomic segment 7, caused reductions in the accumulation of mRNA from trangenes either transiently or stably expressed in a process that most probably is of postrancriptional origin. This activity has not been described so far for other viral protein and is very novel and interesting, especially considering that P7-2 is not present in Nilaparvata lugens reovirus (NLRV), a Fijivirus that is unable to infect plants. Overall, the results suggest that P7-1 and P7-2 may be involved in regulating the expression of both viral and host genes during MRCV infection. Finally, upon studying the transient expression of PMRCVs in Nb it was shown that their expression levels are low and that the use of dicots species as model systems for the functional study of these proteins may not be appropriate in certain cases. Comparative analysis of the codon usage of PMRCVs in Nb, maize and Nilaparvata lugens (delphacid in which NLRV replicates), showed that the low levels of expression of PMRCVs in Nb cannot be explained by differences in codon usage between these species. The information and tools generated here represent an important advancement in the study of MRCV-coded activities that will in turn contribute to the development of effective long-term strategies for disease control in plants.

Ferrer, María Florencia. "Construcción y evaluación de virus MVA recombinantes que expresan la glicoproteína D del virus BoHV-1" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus vaccinia Ankara modificado (MVA) es un virus altamente atenuado que se utiliza eficientemente como vector viral no replicativo para el desarrollo de nuevas vacunas. En este trabajo de Tesis se desarrolló un nuevo inmunógeno basado en MVA que expresa como antígeno de interés la glicoproteína D (versión secretada, gDs) del virus herpes bovino tipo I (BoHV-1), un agente infeccioso ampliamente distribuido en Argentina. Primeramente, se diseñó y construyó el vector de transferencia para obtener MVA recombinantes utilizando como sitio blanco de inserción el gen no esencial MVA086R. Se obtuvieron virus MVA-gDs recombinantes y se demostró la correcta expresión, antigenicidad y N-glicosilación de la glicoproteína D expresada a partir de dichos virus. Posteriormente, se evaluó la capacidad inmunogénica de los virus MVA-gDs en animales de experimentación (ratones y conejos). En el modelo de ratón, se observó que los virus MVA-gDs desencadenaron una respuesta inmune específica, de tipo humoral, que se mantuvo en niveles similares durante un período de siete meses (luego de la aplicación de dos dosis del inmunógeno). Además, se demostró que la síntesis de novo de la glicoproteína D a partir del vector viral no replicativo MVA-gDs fue la responsable de la respuesta inmune específica. La inoculación de conejos con virus MVA-gDs (por vía intramuscular o subcutánea) desencadenó una respuesta inmune específica de tipo humoral, observándose la máxima respuesta a los 9 días post dosis de refuerzo. En un ensayo de desafío de conejos con el virus BoHV-1, se observó que la inmunización por vía intramuscular de los animales con virus MVA-gDs disminuyó la excreción del virus de desafío. Finalmente, se demostró que la inmunización de ratones por vía intranasal con virus MVA-gDs adicionados con toxina colérica indujo respuestas inmunes humorales específicas de tipo IgA en muestras de lavados nasales y broncopulmonares y de tipo IgG en muestras de suero. De esta forma, se obtuvo, caracterizó y evaluó un nuevo inmunógeno denominado MVA- gDs que, en el futuro, podría ser evaluado como candidato a vacuna contra el virus BoHV-1 en bovinos.

Abstract:
Modified vaccinia virus Ankara (MVA) is a highly attenuated virus. During the past years, non-replicative recombinant MVA vectors have gained major interest in the development of new veterinary vaccines. Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) infection is widely distributed in Argentina and there are no efficacious vaccines to prevent the diseases caused by this virus. In order to develop a candidate vaccine for BoHV-1, the secreted version of glycoprotein D (gDs) was selected as the antigen to be expressed in new recombinant MVA non-replicative based vectors. First, the design and construction of the transference vector necessary to obtain recombinant MVA viruses was achieved using the non-essential gene MVA086R. Recombinant MVA-gDs virus was obtained and molecularly characterized, confirming the correct expression, antigenicity and N-glycosilation of glycoprotein D. Then, immunogenicity of recombinant MVA-gDs viruses was assessed in experimental animals (mice and rabbits). Mice immunized with MVA-gDs viruses developed a specific humoral immune response that was maintained for seven months and was dependent on the booster dose. In addition, mice immunized with MVA-gDs virus demonstrated that MVA-gDs non-replicative viral vector was responsible for the de novo synthesis of glycoprotein D and, consequently, for the immune response induced in animals immunized with not inactivated MVA-gDs virus. Intramuscular and subcutaneous rabbit inoculation with MVA-gDs virus was immunogenic and induced a specific humoral immune response. In a rabbit BoHV-1 challenge assay, diminished viral excretion was observed in those animals intramuscularly immunized with recombinant MVA-gDs. Finally, in order to evaluate MVA-gDs virus as a mucosal vaccine, two doses of MVA-gDs supplemented with cholera toxin were delivered by intranasal immunization of mice. These immunizations induced anti-gD IgA humoral immune responses in nasal and bronchopulmonar lavages as well as anti-gD IgG antibodies in serum samples. In conclusion, the new immunogen designated MVA-gDs was developed, characterized and evaluated in experimental animals. In the future, it could be evaluated in cattle as a candidate bovine vaccine for BoHV-1.

De Maio, Federico Andrés. "Relevancia de la variabilidad genética del HIV-1 y del hospedador en el SIDA pediátrico: sistema Vif-APOBEC3" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas APOBEC3 son citidina deaminasas que pueden determinar cambios G→A en la secuencia codificante de HIV-1, propiedad que les confiere una capacidad antiviral. Esta actividad puede ser contrarrestada por el virus al expresar la proteína Vif, la cual recluta un complejo ubiquitina ligasa basado en Culina5 que desestabiliza a las moléculas APOBEC3. La variabilidad genética tanto del virus como del hospedador puede afectar la eficiencia con la que se desarrollan estos procesos. Una elevada edición G→A puede resultar en la restricción de HIV-1 (fenómeno de mutagénesis letal denominado hipermutación), aunque cambios en niveles subletales podrían favorecer a la diversificación viral. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la variabilidad del sistema Vif-APOBEC3 en niños perinatalmente infectados por HIV-1, determinando su relevancia para el desarrollo de SIDA infantil. Los polimorfismos APOBEC3G H186R, APOBEC3G C40693T y CUL5 SNP6 no parecieron modificar el curso clínicos de la infección. En cambio, mutaciones en Vif (inserción de un aminoácido en posición 61 y las sustituciones V13I, V55T, A62D/N/S, L81M y Q136P) sí se relacionaron con diferencias en los tiempos de progresión a SIDA. Se hallaron además evidencias de que ciertos alelos de APOBEC3G/CUL5 seleccionarían variantes particulares de Vif. Se determinó una baja frecuencia de casos con una población proviral constituida mayoritariamente por formas de HIV-1 hipermutadas. El grado de edición en niveles subletales exhibió diferencias entre variantes de CUL5 y Vif. En conclusión, la variabilidad del sistema Vif-APOBEC3 afectaría los tiempos de desarrollo de SIDA pediátrico y también los niveles de edición sufridos por HIV-1.

Abstract:
The APOBEC3 proteins are cytidine deaminases able to determine G→A changes in the HIV-1 coding sequence, a property that confers them antiviral capacity. This activity can be counteracted by the virus through the expression of the Vif protein, which recruits a Cullin5- based ubiquitin ligase complex that destabilizes APOBEC3 molecules. The genetic variability of both virus and host may affect the efficiency of these processes. A high G→A editing can result in the restriction of HIV-1 (phenomenon of lethal mutagenesis called hypermutation), although changes at sublethal levels could favor viral diversification. The aim of the present work was to study the variability of the Vif-APOBEC3 system in perinatally HIV-1 infected children and to asses its relevance to the pediatric AIDS development. The APOBEC3G H186R, APOBEC3G C40693T and CUL5 SNP6 polymorphisms did not seem to modify the clinical course of infection. In contrast, Vif mutations (a one-amino-acid insertion at position 61 and substitutions V13I, V55T, A62D/N/S, L81M and Q136P) were related to different times of progression to AIDS. Evidences suggesting that certain APOBEC3G/CUL5 alleles could select for particular Vif variants were also found. Cases showing a proviral population mainly composed by hypermutants were observed in a low frequency. The grade of editing at sublethal levels exhibited differences linked to CUL5 and Vif variants. In conclusion, the variability of the Vif-APOBEC3 system could affect the time of progression to pediatric AIDS and also the level of editing carried by HIV-1.

Eirin, María Emilia. "Epidemiología molecular del virus linfotrópico T-humano tipo 1 (HTLV-1) en Argentina: análisis étnico-geográfico y variabilidad viral" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo principal de esta tesis fue profundizar los conocimientos sobre la infección por HTLV-1 en Argentina. Con tal fin, se estimó la prevalencia de infección en comunidades originarias de las provincias de Jujuy, San Juan, Misiones, Formosa y Chaco, detectándose una prevalencia en Kollas de 9.8% que confirmó un área naturalmente endémica en Jujuy con una restricción étnico-geográfica ya descripta. El análisis filogenético determinó que las secuencias HTLV-1, tanto de Jujuy como de Buenos Aires, eran subtipo Cosmopolita subgrupo Transcontinental (aA) a excepción de dos, cuyas muestras provenían de individuos residentes de Buenos Aires nacidos en Perú (Neu2 y Neu6) que fueron clasificados en un nuevo subgrupo denominado F. Por otro lado, se detectaron 4 secuencias evolutivamente relacionadas con referencias de Sudáfrica, demostrando la circulación de cepas virales de origen africano en Buenos Aires. Al estudiar el origen étnico de los individuos HTLV-1 positivos, se evidenció la presencia de un componente autóctono predominante, detectándose los cuatro haplogrupos panamericanos (A2, B2, C1, D1) en los Kollas y en el 73% de los residentes de Buenos Aires. En el resto se identificaron haplogrupos alóctonos con un 17,9% de origen Euroasiático Occidental (H, J, T, U, N1b), un 4,5% de origen Africano (L0 y L1) y un 1,5% de origen Asiático Oriental (M7a). Las cepas clasificadas filogenéticamente como de origen africano pertenecieron a individuos con haplogrupo B2 amerindio, mientras que una secuencia de Buenos Aires que agrupó junto a las de Jujuy provenía de un donante con haplogrupo de origen africano. Estos datos sugieren el contacto entre estas poblaciones y sustenta la hipótesis de introducción de la infección con la llegada de esclavos africanos en la época pos-colombina. El análisis in sílico de las secuencias LTR reveló una menor variabilidad en individuos asintomáticos en comparación con pacientes con HAM/TSP y ATL(p menor 0,05), mientras que la variabilidad de la proteína viral Tax fue significativamente menor en secuencias de portadores de Jujuy que en individuos asintomáticos o con enfermedad de Buenos Aires. De todos modos, no se detectó un polimorfismo determinado asociado con la presencia de patología.

Abstract:
The aim of this thesis was to gain an in-depth knowledge of HTLV-1 infection in Argentina. In order to achieve this, HTLV-1 prevalence was estimated in aboriginal populations of Jujuy, San Juan, Misiones, Formosa and Chaco provinces, yielding a 9.8% among Kollas and confirming a naturally endemic area in Jujuy, associated to an ethnic-geographic restriction as previously described. The phylogenetic analysis determined that HTLV-1 sequences, both from Jujuy and Buenos Aires, were Cosmopolitan subtype Transcontinental (aA) subgroup with the exception of two sequences belonging to residents of Buenos Aires city but born in Peru (Neu2 y Neu6) who were classified in a new subgroup named F. On the other hand, 4 sequences evolutionally related to South Africa were detected, demonstrating the presence of viral strains with African origin in Buenos Aires city. Regarding the ethnic origin of all HTLV-1 positive individuals, the presence of a predominant autochthonous component (Pan-American haplogroups A2, B2, C1, D1) was detected, being all four present in Kollas and in 73% of Buenos Aires inhabitants. In the other populations alloctonous haplogroups were identified with a 17,9% Occidental Eurasian origin (H, J, T, U, N1b), a 4,5% African origin (L0 y L1) and a 1,5% de Oriental Asian origin (M7a). The strains phylogenetically classified as African belonged to individuals with Amerindian B2 haplogroup, while a sequence from Buenos Aires which grouped together with sequences from Jujuy belonged to a blood donor with an African origin haplogroup. This data suggests contact between these populations and sustains the hypothesis of the introduction of HTLV-1 infection with the arrival of African slaves in the post-Columbian era. The analysis in sílico of LTR sequences revealed a lower variability in asymptomatic individuals compared to HAM/TSP and ATL patients (p < 0,05), while the variability of Tax viral protein was significantly lower in asymptomatic individuals from Jujuy compared to asymptomatic or HAM/TSP and ATL patients from Buenos Aires. Regardless this situation, not a specific polymorphism was detected in association to the presence of pathologies.

dos Ramos Farias, María Sol. "Epidemiología molecular de HIV, HBV, HCV y HTLV-1/2 en población de trabajadores sexuales hombres y trans (travestis, transexuales o transgénero) de Argentina" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo general de esta tesis fue aportar conocimiento sobre las infecciones de transmisión sexual (ITS) en poblaciones de alta vulnerabilidad y en las que la información era casi inexistente como son los hombres trabajadores sexuales (HTS) y trans (travestis, transexuales o transgénero, hombre a mujer) trabajadoras sexuales (TTS). La incidencia de HIV fue mayor en TTS que en HTS (10,7 y 2,3 por 100 personas-año, respectivamente). Las TTS (N= 273) mostraron una prevalencia significativamente mayor que los HTS (N= 114) de HIV (34,1 vs. 11,4%), HBV (40,2 vs. 22,0%) y Treponema pallidum (50,4 vs. 20,4%). Las prevalencias de HCV y HTLV-1/2 no fueron significativamente diferentes entre TTS y HTS (HCV: 4,5 y 6,1%; HTLV-1/2: 1,8 y 1,0%, respectivamente). Las variantes de HIV más frecuentes fueron el subtipo B y la recombinante BF. En el caso de HBV, se detectó una muestra de genotipo F, dos muestras de genotipo A y una de genotipo C. Respecto al HCV, se detectaron cinco muestras con genotipo 1, tres con genotipo 3 y tres con genotipo 4. Además, en un grupo de TTS fue posible determinar la prevalencia de HPV y Chlamydia trachomatis y sus variantes. Las TTS resultaron positivas para HPV en 111/114 casos y para C. trachomatis en 5/113 casos. Los genotipos más frecuentes de HPV fueron el 16, 42, 81 y 58 (el primero y el último de alto riesgo oncogénico). En las muestras positivas para C. trachomatis se detectaron dos con genotipo D, una con genotipo E y una con genotipo L2 correspondiente a linfogranuloma venéreo. La alta prevalencia de ITS y la alta incidencia de HIV demuestran la gran vulnerabilidad de estas poblaciones e indican la urgente necesidad de implementar estrategias preventivas y de facilitar el acceso a programas de salud para las mismas

Abstract:
The general objective of this thesis was to generate knowledge on sexually transmitted infections among highly vulnerable groups which information is scarce, namely male sex workers (MSW) and male-to-female trans sex workers (TSW). HIV incidence among TSW was higher than MSW (10.7 and 2.3 per 100 person-years respectively). TSW (N= 273) showed a significantly higher prevalence of HIV (34.1 vs. 11.4%), HBV (40.2 vs. 22.0%) and Treponema pallidum (50.4 vs. 20.4%) than MSW (N= 114). HCV and HTLV-1/2 prevalence was not significantly different among TSW and MSW (HCV: 4.5 and 6.1%; HTLV-1/2: 1.8 and 1.0% respectively). The most frequently found HIV variants were subtype B and BF recombinant. Regarding HBV, one genotype F was detected as well as two genotype A samples and one genotype C. HCV detected types were one genotype 1, three genotype 3 and three genotype 4. Besides, it was possible to determine HPV and Chlamydia trachomatis prevalence and variants in one group of TSW. TSW tested positive for HPV in 111/114 cases and for C. trachomatis in 5/113 cases. The most frequent HPV genotypes were 16, 42, 81 y 58 (the first and the last corresponding to high risk or oncogenic types). Among C. trachomatis positive samples two genotypes D, one genotype E and one genotype L2 (Lymphogranuloma venereum type) were detected. The high prevalence of STIs and the high incidence of HIV demonstrate the great vulnerability of these high risk populations and indicate the urgent need for preventive strategies on intervention and facilitation of access to healthcare programs.

Linero, Florencia N.. "Estrategia de reprogramación traduccional del virus Junín en infecciones in vitro: estudio de las principales vías de regulación del inicio de la traducción" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Dentro de los factores que determinan el éxito de una infección viral la eficiencia en la traducción de las proteínas del virus constituye un factor clave a la hora de definir tanto la citopatogenicidad como la virulencia de estos agentes. Los virus son parásitos intracelulares obligados, por lo cual dependen completamente de la maquinaria traduccional de la célula hospedadora para sintetizar sus proteínas. Esta dependencia los ha llevado a desarrollar distintas estrategias de reprogramación traduccional a fin de asegurar la competencia efectiva de sus mARNs con los mARNs celulares por la maquinaria de traducción. En este trabajo de tesis doctoral se analizó la estrategia de reprogramación traduccional utilizada por el virus Junín (JUNV) para lograr la traducción de sus mARNs. El estudio se centró fundamentalmente en el proceso de inicio de la traducción, evaluándose la participación del complejo eIF (eIF4E, eIF4A y eIF4GI) y del factor eIF2 y la modulación de sus principales mecanismos de regulación. En este trabajo se demostró que JUNV es capaz de traducir las proteínas virales aún en ausencia del factor de unión al cap, eIF4E, a pesar de que sus mRNAs presentan dichas estructuras en sus extremos 5´. Esto fue comprobado mediante el empleo de inhibidores de la vía de PI3K/Akt/mTOR, principal vía regulatoria de la traducción dependiente del cap, observándose que la inhibición de PI3K posterior a la entrada del virus no tuvo efectos significativos en la replicación de JUNV. Estos resultados fueron corroborados mediante el tratamiento con la droga rapamicina, un inhibidor del complejo mTOR/raptor, la cual no afectó la síntesis de antígenos virales. La expresión de una proteína dominante negativa de 4E-BP, proteína reguladora de eIF4E, tampoco afectó la replicación de JUNV, reforzando la idea de que el factor eIF4E no sería necesario en la replicación de JUNV. Asimismo, la inhibición de la vía de PI3K/Akt en un cultivo persistentemente infectado con JUNV tampoco afectó la síntesis de los antígenos virales. Por otro lado, se demostró un bloqueo en la fosforilación de eIF2α ejercido por JUNV. La fosforilación de este factor constituye uno de los principales mecanismos de la respuesta celular antiviral, mediante el cual la célula induce el bloqueo global de la traducción con el fin de impedir la replicación viral. La consecuencia de esta fosforilación es el secuestro de los factores de inicio de la traducción en estructuras citoplasmáticas denominadas gránulos de estrés (SGs). Los resultados obtenidos demostraron que el bloqueo en la fosforilación de eIF2α inducido por JUNV inhibe la formación de SGs cuando las células infectadas son tratadas con un inductor de estrés oxidativo. Este impedimento sería mediado fundamentalmente por la expresión de los antígenos virales N y GPC y tendría por finalidad mantener activo al factor eIF2 como así también asegurar el acceso a los factores de inicio de la traducción, que de otra manera podrían quedar secuestrados en los SGs. Esta modulación de la respuesta a la estrés celular no fue observada en los cultivos persistentemente infectados con JUNV, indicando que la ausencia de expresión de G1 y probablemente los bajos niveles de la proteína N en su forma completa serían responsables de que estos cultivos persistentemente infectados no logren bloquear la respuesta celular al estrés. Por otro lado, se demostró el requerimiento de los factores de inicio de la traducción del complejo eIF: eIF4A y eIF4G, mediante ensayos de silenciamiento y el empleo de inhibidores específicos, indicando una estrategia de traducción alternativa en la cual la participación de eIF4E, integrante canónico de dicho complejo, no sería requerida. Probablemente la participación de una proteína viral en reemplazo del factor de unión al cap eIF4E, favorecería la traducción de los mARNs de JUNV, sin inducir un bloqueo en la síntesis de las proteínas celulares. La interacción de N con los factores eIF4A y eIF4GI, evaluada mediante ensayos de inmunoprecipitación y microscopía confocal, sugiere que esta proteína viral estaría formando parte de los complejos de traducción de los mARNs virales. En función de los resultados expuestos se plantea un modelo de reprogramación traduccional para JUNV en el cual el factor de unión al cap, eIF4E, no sería mayoritariamente requerido para la traducción de los antígenos virales. La actividad de este factor sería reemplazada por la proteína N que mediante su interacción con los factores eIF4A y eIF4GI constituiría los complejos de traducción del virus. Sin embargo, no puede descartarse la participación de eIF4E en la traducción inicial de los mARNs de N, hasta que los niveles de esta proteína puedan competir efectivamente con dicho factor.

Abstract:
Translation efficiency of viral proteins is a key factor in defining both cytopathogenicity and virulence of viruses, which are obligate intracellular parasites and entirely dependent on the cellular translational machinery to synthesize their proteins. This dependence has led them to develop different strategies of translational reprogramming to ensure effective competition of viral mRNAs with cellular mRNAs. In this doctoral thesis the translational reprogramming strategy used by Junin virus (JUNV) to achieve the translation of its mRNAs, was analyzed. The study was focused primarily on the process of translation initiation, to evaluate the involvement of eIF complex (eIF4E, eIF4A and eIF4GI) and the eIF2 factor and the modulation of main regulatory mechanisms. Results suggest that JUNV might be able to translate viral proteins even in the absence of the cap-binding factor, eIF4E, although its mRNAs have cap structures in their 5 'ends. This is supported by the fact that inhibitors of PI3K/Akt/mTOR pathway, the main regulatory pathway of capdependent translation were effective only during virus entry but not on JUNV protein translation. Treatment of infected cells with rapamycin, an mTOR complex/raptor inhibitor and the expression of a dominant negative protein 4E-BP, eIF4E regulatory protein, had no effect on JUNV replication, reinforcing the idea that the eIF4E factor would not be required for JUNV replication. Furthermore, inhibition of PI3K/Akt pathway in a JUNV persistently infected culture did not affect the synthesis of viral antigens. On the other hand, a blockage on the eIF2α phosphorylation exerted by JUNV was observed. Phosphorylation of this factor is one of the main mechanisms of the antiviral cellular response, by which cell induces a global translation blockade to prevent viral replication. The consequence of this phosphorylation is the sequestering of the initiation translation factors in cytoplasmic structures named stress granules (SGs). The results showed that blockage in the phosphorylation of eIF2α induced by JUNV inhibits the formation of SGs when infected cells are treated with an oxidative stress inductor. This blockage would be mediated primarily by the expression of viral antigens N and GPC and would aim to keep eIF2 factor active to ensure virus access to initiation translation factors which might otherwise be sequestered into SGs. This modulation on the cellular stress response was not observed in cultures persistently infected with JUNV, indicating that the absence of expression of G1 and probably low levels of the complete form of N protein would be responsible for these persistently infected cultures inability to block the cellular stress response. Requirement of initiation translation complex eIF: eIF4A and eIF4G has been assessed by ARN interfering assays and the use of specific inhibitors. Results indicate an alternative translation strategy in which the involvement of eIF4E, a canon member of this complex would not be required. Probably, the involvement of a viral protein to replace the cap binding factor eIF4E, would favor the translation of JUNV mRNAs without inducing a blockage in cellular proteins synthesis. N interaction with eIF4A and eIF4GI factors was assessed by immunoprecipitation assays and confocal microscopy suggesting that this viral protein would be part of the translation complex of viral mRNAs. Based on the above results a model for JUNV translational reprogramming is presented. In this model, the cap-binding factor, eIF4E, would be replaced by N protein through its interaction with eIF4A and eIF4GI factors constituting the translation complex for viral proteins. However, it cannot be ruled out the involvement of eIF4E at the initial translation step of N mRNA, until the level of this protein can be high enough to compete effectively with this factor.

Acosta, Eliana Gisela. "La entrada del virus dengue a la célula huésped" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección con dengue, resultando la enfermedad viral transmitida por artrópodos de mayor importancia en todo el mundo. A pesar de la creciente incidencia de este virus, al momento no existen vacunas o quimioterapia antiviral disponibles. Dado que el conocimiento del ciclo de multiplicación viral es indispensable como punto de partida para el diseño de agentes quimioterapéuticos, el presente trabajo de tesis se propuso estudiar los pasos iniciales de la infección con DENV: el mecanismo de entrada a la célula huésped. Nuestro estudio se centralizó en el análisis in vitro de los factores celulares involucrados en la internalización, transporte intravesicular y desnudamiento del virus y la influencia del tipo de célula (mamífero o insecto), cepa y serotipo viral sobre dichos procesos. Mediante el uso combinado de inhibidores químicos y moleculares, medidas de infectividad y técnicas de microscopía electrónica y de fluorescencia demostramos que la entrada del serotipo DENV-1 en células Vero ocurre por endocitosis dependiente de clatrina, mientras que la entrada del serotipo DENV-2 tiene lugar por un mecanismo no clásico independiente de clatrina, caveolas y lipid-rafts, pero dependiente de dinamina. Al extender nuestro estudio a otros sistemas celulares (C6/36 HT y A549) encontramos que la endocitosis de DENV-1 y DENV-2 ocurre por un mecanismo clásico dependiente de clatrina. Por lo tanto, estos resultados demuestran por primera vez que un mismo serotipo viral puede utilizar diferentes vías de entrada en líneas celulares de distinto origen, y que a su vez, distintos serotipos virales pueden utilizar vías de entrada alternativas en un mismo tipo celular. Asimismo, observamos que en todos los sistemas celulares analizados, la entrada de DENV ocurre con dependencia de la exposición de los viriones a pH ácido. Esto implica un tránsito de las partículas virales en compartimentos endosomales hasta el momento en que se dispara la fusión entre la membrana viral y la membrana de la vesícula transportadora. Encontramos que los viriones son primeramente transportados hacia endosomas tempranos para luego continuar hasta endosomas tardíos o endosomas de reciclaje dependiendo de características propias de cada cepa viral. Por lo tanto, los hallazgos presentados en este trabajo no sólo aportan conocimientos básicos sobre los pasos iniciales del ciclo de replicación de este importante patógeno humano, sino que además proveen una nueva perspectiva para encarar el desarrollo racional de agentes antivirales para esta enfermedad de creciente reemergencia global.

Abstract:
At present, nearly half of the world population is at risk of dengue infection, resulting in the arthropod-borne viral disease of major importance worldwide. Despite the increasing incidence of this virus, there are no vaccines or antiviral chemotherapy available. Since knowledge of the viral multiplication cycle is essential as a starting point for the design of chemotherapeutic agents, this thesis aimed to examine the initial steps of DENV infection: the mechanism of virus entry into the host cell. Our study was centered in the in vitro analysis of the cellular factors involved in the internalization, intravesicular transport and penetration of the virus and the influence of the cell type (mammalian or insect), strain and serotype in these processes. Through the combined use of chemical and molecular inhibitors, infectivity assays and electron and fluorescence microscopy techniques we show that the entry of the serotype DENV-1 in Vero cells occurs by clathrin-mediated endocytosis, while entry of DENV-2 takes place by a nonclassical mechanism independent of clathrin, caveolae and lipid-rafts, but dependent on dynamin. By extending our study to other cell systems (C6/36 HT and A549) we found that endocytosis of DENV-1 and DENV-2 occurs by a classical clathrin-dependent mechanism. Therefore, these results demonstrate for the first time that the same serotype may use diverse pathways in cell lines of different origin, and in turn, different serotypes can use alternative entry pathways in the same cell line. We also observed that in all cell systems analyzed by us, the entry of DENV occurs with dependence of exposure of the virions to acidic pH. This implies a transport of viral particles in endosomal compartments until fusion between the viral membrane and the membrane of the carrying vesicle is triggered. We found that virions are first transported to early endosomes and then continue to late endosomes or recycling endosomes depending on characteristics of each viral strain. Therefore, the findings presented here not only provide basic knowledge about the initial steps of the replication cycle of this important human pathogen, but also provide a new perspective to address the rational development of antiviral agents against this re-emerging global disease.

Bellusci, Carolina Paula. "Implicancias de la farmacogenética en la infección pediátrica por HIV-1" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El gen de resistencia a múltiples drogas (MDR1) codifica para la Glicoproteína P (P-gp), que bombea diversos sustratos hacia el exterior de la célula, entre ellos los antirretrovirales: inhibidores de proteasa (PI). Además, el nivel de expresión de MDR1 está regulado por el receptor nuclear PXR. En el presente trabajo de Tesis Doctoral evaluamos la influencia de los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) de MDR1 (T-129C, C1236T y C3435T) y PXR (C63396T) en la infección pediátrica por HIV-1, la respuesta al tratamiento antirretroviral y la expresión de P-gp. Los SNPs C1236T y C3435T cumplirían un rol protector retrasando la progresión a SIDA pediátrico, pero no afectarían la transmisión vertical por HIV-1. Además, evaluamos el efecto de los SNPs en la respuesta antirretroviral al PI lopinavir, demostrando que el SNP C1236T se asocia con una menor concentración plasmática de la droga y una mayor carga viral. Por otra parte, analizamos si los niveles de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ se asocian con los SNPs de MDR1 o PXR, sin hallar diferencias entre los distintos genotipos. Sin embargo, observamos que el nivel de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ aumenta con la edad y la infección pediátrica por HIV-1. En conjunto, nuestros resultados sugieren que P-gp es un factor clave tanto en la modulación de la infección por HIV-1, independientemente de su función en el transporte de drogas, como en la respuesta a la terapia antirretroviral.

Abstract:
The multidrug resistant gene (MDR1) encodes for P-glycoprotein (P-gp), which pumps several substrates out of the cell, such as the antiretroviral protease inhibitors (PI). In addition, the MDR1 expression level is regulated by the nuclear receptor PXR. In the present PhD Thesis we evaluated the influence of the single nucleotide polymorphisms (SNP) T-129C, C1236T y C3435T of MDR1 and C63396T of PXR in HIV-1 pediatric infection, response to antiretroviral therapy and P-gp expression. The SNPs C1236T and C3435T may play a protective role delaying progression to pediatric AIDS, but we did not observe an effect HIV-1 vertical transmission. In addition, we evaluated the effect of SNPs on antiretroviral response to the PI lopinavir, demonstrating that the SNP C1236T is associated with a lower drug plasma concentration and a higher viral load. We analyzed whether P-gp expression levels in CD4+ lymphocytes are associated with the SNPs of MDR1 or PXR, but no differences between the genotypes were found. However, we observed that P-gp expression levels in CD4+ lymphocytes increase with the age and the HIV-1 pediatric infection. Our results suggest that P-gp is a key factor either in the modulation of the HIV-1 infection, independently of its function in drug transport, or in the response to antiretroviral therapy.

Mondotte, Juan Alberto. "Estudio de las interacciones del virus del dengue con la célula hospedadora" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus del dengue produce en humanos la enfermedad viral más frecuentemente transmitida por artrópodos y no existe hasta el momento terapia antiviral ni vacuna alguna. En este trabajo se desarrollaron diferentes herramientas genéticas con el fin de estudiar las distintas etapas de la replicación viral y la interacción del virus con la célula huésped. Así, se obtuvo el primer clon infeccioso del virus del dengue de un aislamiento argentino y distintas generaciones de virus con proteínas reporteras. Empleando estos sistemas genéticos se pudieron disecar las distintas etapas de la replicación viral. La manipulación del genoma viral permitió caracterizar mutantes de N-glicosilación de las proteínas de envoltura y pre-membrana, y estudiar su importancia en las distintas etapas del ciclo viral. El ensayo del virus reportero, el cual permite evaluar la actividad de luciferasa como un marcador de replicación viral, fue miniaturizado para realizar una búsqueda de quinasas de la célula huésped involucradas en la replicación. Para esto se utilizó la tecnología del RNA de interferencia a gran escala. Mediante este ensayo se identificaron distintas quinasas claves en la replicación del virus y se estudió su importancia en la replicación viral. Por último, se aportó nueva infomación sobre el mecanismo celular por el cual la proteína de cápside se dirige a las organelas celulares lipid droplets, y su relación con la proteína celular ADRP. Este trabajo provee nuevas herramientas genéticas y nueva información sobre los requerimientos del virus del dengue para replicar en la célula infectada. Además, realiza un aporte que podría llevar al desarrollo de nuevas estrategias antivirales.

Abstract:
Dengue is the most prevalent viral disease transmitted by arthropods. At present, neither antiviral therapies or licensed vaccine exist. In this work, we developed new genetic tools to study different steps of viral replication and host-viral interactions. We obtained the first infectious clone from an Argentinean clinical isolate, and several dengue virus reporter systems. Using these tools, we dissected each step of the viral replication process through a luciferase activity assay. Genetically manipulating the viral genome, we characterized N-glycosylation mutants of envelope and pre-membrane proteins, and their role during the viral life cycle. The reporter virus assay was miniaturized to perform an RNA interference screen to search for host kinases involved in viral replication. We identified several kinases important for different steps of viral replication. Finally, we provided new information about the cellular mechanism by which the capsid protein is targeted to cellular organelles known as lipid droplets, and investigated the relationship of capsid with the cellular protein ADRP. This thesis provides new genetic tools and new information on the cellular requirements for dengue virus replication, which could lead to the development of new antiviral strategies.

Módena, Natalia A.. "Estudios sobre la fosforilación de la proteína de movimiento TGBp1 del Potato Virus X" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas, miembro tipo del género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para el movimiento viral de célula a célula en la planta hospedera. Diferentes líneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puede regular la replicación y el movimiento viral. En este estudio, se demostró que la proteína TGBp1 es fosforilada por al menos una proteína quinasa, presente en extractos de plantas de Nicotiana tabacum infectadas con PVX y no infectadas, que posee características distintivas de la caseína quinasa 2 (CK2). El análisis en geles bidimensionales de extractos de plantas infectadas permitió determinar que la proteína TGBp1 producida durante la infección viral presenta múltiples isoformas de diferentes puntos isoeléctricos; el tratamiento con fosfatasas de los extractos de plantas infectadas indicó la presencia de isoformas fosforiladas. A través de la combinación de estudios de determinación de aminoácidos fosforilados por espectrometría de masa, comparación de secuencias aminoacídicas de TGBp1 de distintos virus y evaluación de la fosforilación in vitro de mutantes puntuales y de deleción de la proteína TGBp1, se identificaron tres probables sitios de fosforilación por la quinasa CK2 de N. tabacum: S-165, T-193, T-214. Se observó que la simulación de la fosforilación en los residuos T-193 y T-214 regula negativamente la dispersión viral y la capacidad de la proteína TGBp1 de hidrolizar ATP. Los resultados sugieren firmemente que una proteína quinasa de la familia de CK2 estaría involucrada en la fosforilación de TGBp1 durante el curso de la infección viral de N. tabacum. Además, se discute el modo en que la fosforilación podría regular las actividades de la proteína TGBp1 durante la infección viral.

Abstract:
Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome is based on a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movement proteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capside protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside the host plant. Recent work on other plant viruses has indicated that viral proteins phosphorylation by host kinases can regulate processes such us viral replication and mobilization. The results obtained during this Thesis work show that TGBp1 is phosphorylated by at least one kinase protein with properties characteristic of Caseinkinase 2 (CK2). This kinase activity is present in crude extracts prepared from both non-infected and PVX infected Nicotiana tabacum plants. Bi-dimensional gel experiments with crude extracts from PVX infected plants showed that TGBp1 expressed during infection presented several isoforms with different Isoelectrical points. Some of these isoforms were sensitive to phosphatase treatment, suggesting that TGBp1 is phosphorylated in multiple residues. Several experimental approaches (mass spectrometer identification of phosphorylated aminoacids, sequence comparison among TGBp1 homologues from several viruses, and in vitro phosphorylation experiments with mutated versions of TGBp1), allowed the identification of three potential phosphorylation sites by recombinant alpha subunit N. tabacum CK2: S-165, T-193 and T-214. Mimicking phosphorylation on residues T-193 and T-214 had a negative impact on viral spreading and TGBp1 ATP hydrolysis activity. The results presented in this Thesis strongly suggest that a N. tabacum kinase protein belonging to CK2 family is involved in the phosphorylation of TGBp1 during PVX infection. How the phosphorylation regulates TGBp1 activities is discussed.

Harburguer, Laura V.. "Efectos letales y subletales de una pastilla fumígena conteniendo permetrina y pyriproxyfen sobre Aedes aegypti (Díptera: Culicidae)" (2011-12-14) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El dengue es una infección viral aguda y sistémica, producida por un flavivirus. En América solamente ha sido demostrada la transmisión del dengue a través de mosquitos de la especie Aedes aegypti. En ausencia de una vacuna efectiva, la única forma de controlar la transmisión del dengue, es el control del vector. Durante este trabajo se estudió la estabilidad térmica de los insecticidas pyriproxyfen y un piretroide (permetrina o cis-permetrina) como parte de una formulación fumígena y sus efectos letales y subletales sobre las formas inmaduras y los adultos del mosquito Ae. aegypti. Se obtuvo una recuperación de los ingredientes activos en los humos de alrededor del 95% para el pyriproxyfen y del 50% para los piretroides. Estos mostraron una gran efectividad sobre las larvas y los adultos de Ae. aegypti. Se produjo una inhibición de la emergencia de los adultos de más del 95% con una dosis de 2 g/kg de pyriproxyfen; la mortalidad de los individuos ocurrió principalmente durante el estadio de pupa. Además, se encontró que este activo es capaz de reducir la fertilidad y la fecundidad de las hembras, aunque no interferiría con el desarrollo de las ovariolas. Se evaluó la efectividad de esta formulación en forma de pastilla en un ensayo de campo en la provincia de Misiones. Los resultados mostraron que su aplicación redujo las poblaciones del vector dentro de las viviendas. Por otro lado, la formulación fue ampliamente aceptada por la comunidad demostrando que ésta es capaz de participar en un programa de control de los mosquitos a través de la aplicación de herramientas de control de uso no profesional, como la pastilla fumígena.

Abstract:
Dengue disease is an acute viral and systemic infection, caused by a flavivirus. In America, only has been demonstrated dengue transmission by mosquitoes of the species Aedes aegypti. In the absence of an effective vaccine, the only way to control the transmission of dengue is vector control. In this work we studied the thermal stability of the insecticides pyriproxyfen and a pyrethroid (permethrin or cis-permethrin) as part of a smoke-generating formulation together with their lethal and sublethal effects on the immature stages and adults of Ae. aegypti. We obtained a recovery of the active ingredients in the smoke of about 95% for pyriproxyfen and 50% for pyrethroids. When released in the fumes of the smokegenerating formulation showed a great efficacy on the larvae and adults of Ae. aegypti. There was an inhibition of adult emergence over 95% with a dose of 2 g/kg pyriproxyfen, mortality occurred mainly during the pupal stage. It was found that pyriproxyfen is capable of reduce fertility and fecundity of females but not interfere with the development of the ovarioles. We evaluated the efficacy of this formulation in a field trial in the province of Misiones. The results showed that its application reduced vector populations inside the dwellings. On the other hand, the formulation was widely accepted by the community demonstrating that it is able to participate in a program of mosquito control through the application of non-professional control tools, such as the smoke-generating tablet.

Mateu, Cecilia Gabriela. "Polisacáridos y variantes del virus Herpes simplex como herramienta en el esclarecimiento de la patogenia viral" (2011-12-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los carragenanos (CGNs), galactanos sulfatados aislados de algas rojas, han sido identificados como potentes inhibidores del virus Herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2) afectando principalmente la adsorción de HSV a la célula, etapa inicial del ciclo viral. Dado que presentan una similitud estructural con el heparan sulfato (HS), receptor celular que media la adsorción de HSV a la célula, actúan bloqueando la interacción virus-HS, en la que participan glicoproteínas de la envoltura viral. En estudios previos se seleccionaron y caracterizaron variantes virales sinciciales (syn) de HSV-1 (F) por pasajes sucesivos del virus en células Vero en presencia de un CGN natural 1C3 (de estructura relacionada con CGNs Iota (ι) y Kappa (κ)) con el fin de evaluar la capacidad de los CGNs de generar variantes virales resistentes durante el proceso de selección. En el presente trabajo se profundizó el estudio de la caracterización citopática y patogénica de las variantes 1C314-1 y 1C317-2. Las variantes mostraron un bajo nivel de resistencia a 1C3, heparina, aciclovir (ACV) y foscarnet (PFA). Las mismas resultaron avirulentas en ratones BALB/c infectados por vía intravaginal respecto de la cepa patrón que mostró alta mortalidad. La atenuación se correlacionó con bajos niveles de04:00 p.m. 22/12/2014 citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-6) en lavados vaginales, aunque el título viral fue similar al obtenido con la cepa patrón. Por vía intranasal las variantes mostraron una marcada virulencia en ratones BALB/c, conduciendo a una generalizada diseminación viral. En ratones C57BL/6 resultaron avirulentas empleando las mismas vías de infección. Para evaluar la capacidad de generar variantes atenuadas con otro serotipo de HSV empleando la misma estrategia usada con HSV-1, se realizaron pasajes seriados de HSV-2 cepa MS en células Vero en presencia de concentraciones crecientes de CGNs ι y κ. Se seleccionaron 4 clones, ι22-9, ι22-12, κ22-12 y κ22-13, los cuales mostraron tener fenotipo syn, leve resistencia a los CGNs y a la heparina, pero variable susceptibilidad al ACV y al PFA. Todos los clones fueron menos virulentos que la cepa patrón (100% mortalidad) particularmente para ratones C57BL/6 por inoculación intravaginal e intranasal. La atenuación de las variantes de HSV-2 se correlacionó con altos niveles de TNF-α e IL-6 en lavados vaginales, y la infectividad cuantificada en los mismos fue similar a la obtenida con la cepa parental. Las variantes mostraron una replicación similar a la cepa parental en células Vero. Sin embargo, en cultivos primarios de astrocitos murinos mostraron un menor rendimiento viral. Los estudios in vitro realizados, mostraron que los CGNs ι y κ estimulan la proliferación celular y la liberación de citoquinas en macrófagos murinos (RAW264.7). Sin embargo, inoculados en ratones BALB/c por vía intravenosa no lograron elevar los niveles de citoquinas séricas. El conjunto de estos resultados indica que el sistema inmune innato, especialmente en la regulación de los niveles de TNF-α e IL-6, juega un rol de importancia en la patología del virus herpes simplex y apunta a considerar la posibilidad que este tipo de variantes virales tanto de HSV-1 como de HSV-2 emerjan durante las terapias antivirales basadas en CGNs.

Abstract:
Natural carrageenans (CGNs), extracted from red seaweeds, are well known as potent and selective inhibitors of Herpes Simplex virus type 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2). They have a chemical structure similar to heparan sulfate (HS) that serves as a primary receptor for adsorption. Their mode of antiviral action is by interference with HSV attachment to cells, blocking the interaction virus-HS, involving viral glycoprotein‟s. In a previous work, viral variants of HSV-1 were obtained by successive passages on Vero cells under selective pressure with the CGN 1C3, (partially cyclized μ/v-carrageenan, related to ι and κ CGNs) in order to test the ability of the carrageenan to generate resistant variants during the selection process. In the present work, a more detailed study of the cytopathic and pathogenic behavior of HSV-1 syncytial (syn) variants 1C314-1 and 1C317-2 was carried out. The variants showed low levels of resistance to 1C3, heparin, Aciclovir (ACV), and Foscarnet (PFA). They also showed to be avirulent for BALB/c mice infected by intravaginal route, although the parental strain F was highly lethal. The attenuation of the variants was correlated with lower levels of proinflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) in vaginal lavages with respect to the parental strain, despite that viral titers were similar between the viral variants and the F strain. Nevertheless, the variants were highly lethal for BALB/c mice inoculated by the intranasal route, with a generalized organ spreading. To evaluate the capacity to generate attenuated variants using another HSV serotype employing the same strategy used before, 22 passages of HSV-2 (MS) were made on Vero cells with increasing amounts of κ or ι carrageenan. As a result of this, four clones were selected and named, ι22-9, ι22-12, κ22-12 and κ22-13. The clones showed a 100% syn phenotype, a mild resistance to CGNs and heparin and a variable susceptibility to ACV and PFA. All the clones were less virulent for mice intravaginal and intranasal inoculated, particularly for C57BL/6 strain, whereas MS strain produced 100% of mortality. In contrast to HSV-1 variants, the attenuation was correlated with high levels of pro-inflammatory cytokines (TNF-α y IL-6), on vaginal lavages. The variants of HSV-2 showed that although all of them grew equally on Vero cells, a partially restricted phenotype was observed when a primary culture of mouse astrocytes was employed. Finally, the CGNs were able to stimulate the proliferation of several cells lines and cytokines secretion in vitro but they did not showed this behavior on BALB/c mice inoculated by intravenous route. Taking all these results together, we can conclude that the innate immune system, specially TNF-α and IL-6 expression, plays an important role in the pathology of herpes simplex virus, and the possibility that this kind of HSV-1 and HSV-2 variants could emerge during an antiviral therapy for humans based on CGNs, must be considered.

Pérez Recalde, María Mercedes. "Polisacáridos del alga roja Nemalion helminthoides: caracterización, modificación química y actividad biológica" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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La presente Tesis comprende cuatro temas principales: Estudio del sistema de polisacáridos del alga roja Nemalion helminthoides, familia Liagoraceae, orden Nemaliales. Se determinó que la matriz de la pared celular estaba compuesta: (i) mayoritariamente por α-D-(1→3)-mananos con unidades monosulfatadas en C-4 ó C-6, con un promedio de un grupo sulfato cada cuatro residuos, y un grado de polimerización de ~200; (ii) en menor proporción por α-D-(1→3)-mananos con ramificaciones simples de β-D-xilosa en C-2, de similar grado de sulfatación también en C-4 ó C-6, y peso molecular promedio de ~10 kDa; (iii) por xilanos neutros β-D- (1→3;1→4), de ~6 kDa. Por último, de pared fibrilar se aislaron (1→4)-β-D-xilanos neutros. Modificaciones químicas de las fracciones de mananos y xilomananos de Nemalion helminthoides. (i) A partir de los mananos nativos se generaron polisacáridos modificados con 43-50% de sulfatación, constituidos mayormente por unidades disulfatadas en C-2 y C-6 y de unidades trisulfatadas. (ii) A partir de las fracciones de xilomananos se obtuvieron, por degradación de Smith, derivados sin ramificaciones de xilosa. Estudio de actividad antiviral de fracciones nativas y modificadas de Nemalion helminthoides. Los xilomananos inhibieron in vitro al virus herpes simplex (HSV-1 y HSV-2) y al virus dengue (DENV-2) agregados durante la adsorción viral. Los mananos sobresulfatados inhibieron DENV-2 agregados durante la adsorción viral, y HSV-1 y HSV-2 colocados durante y/o después de la adsorción viral in vitro. Utilizando un modelo de infección intranasal de ratones BALB/c con HSV-2, los mananos sobresulfatados protegieron de la enfermedad en un 100% con una única dosis, por la misma vía. Evaluación de acción inmunomoduladora de polisacáridos de Nemalion helminthoides. Fracciones de xilomananos indujeron proliferación de linfocitos T humanos (línea H9) y macrófagos murinos (línea RAW). En macrófagos, además, estimularon la secreción de citoquinas proinflamatorias IL-6 y TNF-α y de óxido nítrico. La respuesta de citoquinas también se detectó en plasma de ratones BALB/c inyectados por vía intravenosa. Los animales tratados con xilomananos no desarrollaron la enfermedad al ser infectados, una hora después, con HSV-2.

Abstract:
This Thesis comprises four main topics: Study of the polysaccharide system from the red seaweed Nemalion helminthoides family Liagoraceae, order Nemaliales. It was determined that the cell wall matrix was composed: (i) mainly by α-D-(1→3)-mannans with monosulfated units at C-4 or C-6, one sulfate group every four residues, on average, and a polymerization degree of ~200; (ii) in minor amount by α-D-(1→3)-mannans with β-D-xylose at C-2, with similar sulfation degree at C-4 or C-6, and average molecular weigth of ~10 kDa; (iii) by neutral β-D-(1→3;1→4) mixed linkage xylans, of ~6 kDa. Finally, from the fibrillar wall, neutral (1→4)-β-D-xylans were isolated. Chemical modifications of mannan and xylomannan fractions from Nemalion helminthoides. (i) From the native mannans, oversulfated polysaccharides with a 43- 50% sulfation were prepared. These mainly constituted by disulfated units at C-2 and C- 6, and trisulfated units. (ii) From the xylomannan fractions, derivatives without xylose branches were obtained, by Smith degradation. Study of antiviral activity of native and modified fractions of Nemalion helminthoides. Xylomannans were inhibitors of herpes simplex virus (HSV-1 and HSV- 2) and dengue virus (DENV-2) in vitro when were added during viral adsorption. Oversulfated mannans were inhibitors of DENV-2 when were incorporated during viral adsorption, and HSV-1 and HSV-2 during and/or after viral adsorption in vitro. Oversulfated mannans were evaluated in BALB/c mice with intranasal infection with HSV-2, 100% of the mice receiving one dose were protected. Evaluation of immunomodulatory effect by Nemalion helminthoides polysaccharides. Xylomannans fractions were inductors of human T lymphocites (H9 line) and murine macrophages (RAW line) proliferation. Besides, this compounds were able to stimulate secretion of nitric oxide and cytokines (IL-6 and TNF-α) in macrophages. Cytokine response was also observed in BALB/c mice inoculated by intravenous route. Remarkably no illness was developed in mice treated with xylomannans fractions one hour before HSV-2 infection.

Musikant, Alejandro Daniel. "La trans-sialidasa como factor de virulencia en la infección experimental con Trypanosoma cruzi" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo nos propusimos comprender los mecanismos asociados a la patología inducida por Trypanosoma cruzi en el modelo murino empleando cepas de baja y de alta virulencia. Estas últimas generan altos porcentajes de mortalidad en pocos días y expresan grandes cantidades de un factor de virulencia, la trans-sialidasa (TS) que induce, en la etapa temprana de la infección, apoptosis y desorganización de la histoarquitectura de órganos como el bazo, ganglio y timo. En esta Tesis Doctoral nos propusimos analizar las poblaciones celulares involucradas en las alteraciones producidas por la actividad de TS utilizando dos estrategias: - mediante la neutralización de la actividad circulante de TS durante la infección aguda observamos que el tratamiento no fue capaz de prevenir los desórdenes en las poblaciones linfocitarias maduras e inmaduras. El análisis de marcadores de migración linfocitaria permitió describir por primera vez que el parásito altera el tráfico de los linfocitos B en el bazo. - mediante un modelo de estimulación de la respuesta inmune con un antígeno definido observamos que el tratamiento con TS recombinante activa no fue suficiente para alterar el armado de los centros germinales. En la segunda etapa de este trabajo, analizamos la capacidad de T. cruzi de modular la expresión de las metaloproteasas (MMPs) del huésped. Observamos en la fase aguda de la infección, que las cepas/clones de alta virulencia inducen aumento de la actividad de MMP-2 y disminución de la actividad de MMP-9 plasmática, mientras que las de baja virulencia solo inducen disminución de MMP-9. El timo, ganglio e hígado de animales infectados con cepas/clones de alta virulencia poseen alterada la actividad de estas dos MMPs y observamos el mismo fenómeno en una línea celular de fibroblastos humanos. Utilizando ensayos in vivo e in vitro demostramos que la actividad de TS está relacionada con el aumento de la actividad de MMP-2. En este último sistema determinamos que el efecto es por hidrólisis de ácido siálico y pudimos reproducirlo utilizando neuraminidasas de origen bacteriano. Por último describimos vías de transducción de señal asociadas al aumento de la actividad de MMP-2 por la acción de TS y las neuraminidasas ensayadas. Nuestros hallazgos constituyen un aporte novedoso acerca del comportamiento de las MMPs en la infección murina por T. cruzi y su modulación diferencial dependiente de la virulencia. Es destacable que la modulación de MMP-2 está asociada a la actividad de TS que es altamente expresada en las mismas cepas que son inductoras de MMP-2 en la infección experimental.

Abstract:
In this work we have studied mechanisms associated with Trypanosoma cruzi pathology in a murine model employing different virulences strains. High-virulence parasites induce an increase mortality rate in a few days and also express high amount of trans-sialidasa (TS), a virulence factor that induces apoptosis and histological disorganization of organs such as spleen, thymus and lymph. In this thesis we analyze the cell populations involved in the alterations produced by the activity of TS using two strategies: - by neutralizing the activity of circulating TS during the acute phase of infection we observed that this treatment was not able to prevent disturbances in the mature and immature lymphocyte populations. The analysis of lymphocyte migration markers allow us to describe for the first time that the parasite alters B lymphocytes traffic in the spleen. - by using a immune response stimulation model with a specific antigen we showed that active recombinant TS treatment was not able to alter the assembly of the germinal centers. In the second stage of this work, we analyze if T.cruzi was able to modulate host matrix metalloproteinases (MMPs) expression. We showed that during the acute phase of infection high-virulence parasites (with detectable TS activity) induce an increase MMP-2 and diminished MMP-9 plasmatic activity and low-virulence parasites only induce reduction of MMP-9 plasmatic activity. Organs such as thymus, lymph and liver of infected animals with high-virulence parasites have an altered activity of both MMPs and the same results were observed in a human trofobroblast cell line. Using both in vivo and in vitro experiments we showed that TS activity is related with the increase of MMP-2 activity. We determined in vitro that the mechanism of the increase of MMP-2 is the hydrolysis of sialic acid and this was confirmed by using bacteria neuraminidases. Finally, we described signaling transduction pathways related to the increase of MMP-2 activity induced by TS and neuraminidases. Our findings constitute a novel contribution regarding MMPs behavior in murine infection by T. cruzi and differential modulation by different strains. Besides, modulation of MMP-2 activity is associated with TS, a virulence factor that is highly expressed in those strains that induce MMP-2 in the experimental infection.

Sepúlveda, Claudia Soledad. "Estrategias antivirales para la prevención y tratamiento de infecciones con arenavirus: actividad inhibitoria contra virus Junín de disulfuros y acridonas" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo se realizó la evaluación de la actividad biológica de diversos compuestos que incluyeron disulfuros aromáticos, disulfuros de tiuramo, tiosulfonas y acridonas, encontrándose compuestos con una muy selectiva actividad antiviral y potente efecto virucida contra varios miembros de la familia Arenaviridae. El disulfuro aromático NSC4492 mostró el efecto virucida más potente, y los más efectivos agentes antivirales resultaron el disulfuro de tiuramo NSC14560 y la acridona 3f, las tiosulfonas fueron totalmente inactivas. Los compuestos antivirales NSC14560 y 3f resultaron igualmente efectivos en distintos tipos celulares. Estudios mecanísticos de la actividad antiviral indicaron que la acción de estos compuestos parecería afectar pasos tempranos e intermedios de la infección viral, sin bloquear la entrada del virus a la célula. La síntesis del RNA viral se vio inhibida con ambos compuestos, y, para el caso de 3f, fue posible recuperar parcialmente la infectividad y los niveles de RNA por el agregado de guanosina exógena. Los compuestos inactivantes mostraron ser efectivos también contra varios arenavirus, con una cinética de inactivación rápida y dependiente de la temperatura. El tratamiento con NSC4492 no mostró efectos sobre el autoensamblaje y la brotación de partículas tipo virales (VLPs) pero sí una alteración en el patrón electroforético de la proteína Z y una fuerte inhibición en la síntesis del RNA viral. En conclusión, se han detectado nuevos compuestos con potente y selectiva acción antiviral contra los arenavirus que parecen interferir con procesos relacionados a la síntesis de RNA viral así como agentes con fuerte capacidad inactivante de los viriones que alteran irreversiblemente proteínas virales de JUN lo que conduciría a la pérdida de la infectividad viral.

Abstract:
In the present study we evaluated the biological activity of various compounds including aromatic disulfides, thiuram disulfide, thiosulfones and acridones finding compounds with highly selective antiviral activity and potent virucidal effect against several members of the family Arenaviridae. The aromatic disulfide NSC4492 showed the most potent virucidal effect, and the most effective antiviral agents were thiuram disulfide NSC14560 and acridone 3f, the thiosulfones were totally inactive. Antiviral compounds NSC14560 and 3f were equally effective in different cell types. Mechanistic studies of antiviral activity indicated that these compounds affect early and intermediate steps of viral infection, without blocking viral entry into cells. Viral RNA synthesis was inhibited with both compounds and, in the case of 3f, it was possible to partially restore the infectivity and RNA levels by adding of exogenous guanosine. Inactivating compounds shown to be effective also against several arenavirus, with fast inactivation kinetics and temperature dependent. NSC4492 treatment showed no effect on the self-assembly and budding of virus-like particles (VLPs) but an alteration in the electrophoretic pattern of protein Z and a strong inhibition of viral RNA synthesis were evidenced. In conclusion, we have identified new compounds with potent and selective antiviral action against arenavirus that seem to interfere with processes related to the synthesis of viral RNA as well as inactivating agents with strong capacity of virions that alter JUNV viral proteins and lead to the loss of viral infectivity.

Romanutti, Carina. "Evaluación de la respuesta inmune inducida por distintos inmunógenos recombinantes dirigidos contra el Virus de la Fiebre Aftosa" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo del presente trabajo de tesis fue, emplear distintos sistemas de expresión para el desarrollo de vacunas recombinantes y de estrategias de vacunación contra el virus de la fiebre aftosa (VFA). Se trabajó con vacunas derivadas de vectores virales no replicativos (Adenovirus y Herpesvirus) y vacunas génicas (pCI). El antígeno utilizado fue la poliproteína P1, cuyos subproductos son las proteínas capsidales virales, junto con la proteína 2A y la proteasa 3C, del serotipo O1/Campos del VFA. Con las vacunas recombinantes disponibles (HSV-P12A3C, Ad-P12A3C y pCI-P12A3C) y una vacuna convencional a virus inactivado (VFAi) en formulación oleosa, se procedió a estudiar la respuesta inmune generada, utilizando estrategias de tipo prime-and-boost homólogo y heterólogo en un modelo murino. En general, la vacunación heteróloga con vectores virales fue más efectiva que la homóloga, en inducir una respuesta inmune α-VFA, tanto humoral como celular. Los títulos más altos de anticuerpos (Acs) específicos correspondieron a los animales vacunados con 2 dosis de VFAi, pero los ratones primados con Ad-P12A3C que recibieron una dosis de refuerzo con HSV-P12A3C o VFAi, también indujeron títulos significativamente más altos que los otros grupos analizados. Los regímenes de inmunización con vectores virales generaron respuestas con predominio de Acs de isotipo IgG2a, sugiriendo un sesgo hacia una respuesta de tipo Th1, mientras que en la inoculación con 2 dosis de VFAi se generaron altos niveles de Acs con predominio de isotipo IgG1. Estos resultados fueron confirmados por la evaluación de las citoquinas inducidas (IL-2, IFNγ e IL-4). En los ensayos de desafío no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de protección, entre el esquema de dos dosis de vacuna convencional frente a una dosis de vacuna vectorial con un refuerzo de HSV-P12A3C o VFAi. Por otra parte, la re- exposición de los distintos grupos inmunizados al virus inactivado a los 5 meses, generó un rápido aumento de los anticuerpos específicos α-VFA en todos los grupos, demostrando la presencia de células B de memoria, funcionales in vivo. En este mismo tiempo post vacunación, los ratones inmunizados con la combinación Ad-P12A3C/HSV-P12A3C fueron capaces de reducir la viremia post desafío en un 100%. Es decir que esta combinación de inmunógenos resultó efectiva para desencadenar una respuesta inmune protectiva a mediano plazo contra el VFA en ratones adultos.

Abstract:
In the present work, different recombinant vaccine candidates and vaccination regimes against foot-and-mouth disease virus (FMDV) were tried. The antigen used was the P1 polyprotein, which includes the viral capsid proteins. Defective vectors derived from heterologous virus (adenovirus and herpesvirus) and a classic genetic DNA vector (pCI) carrying these sequences were constructed. To characterize the immune responses, a well known murine model was used. BALB/c mice were immunized following a prime-and-boost delivery system combining the different vaccine candidates (HSV-P12A3C, Ad-P12A3C, and pCI-P12A3C) and the inactivated adjuvanted virus (FMDVi), mimicking the conventional vaccine. The heterologous prime-and-boost regimes resulted in more effective humoral and cellular immune responses than the homologous viral vector boosting. The highest antibody titers corresponded to the groups vaccinated with 2 doses of inactivated virus, but significant high titers were also obtained when mice primed with Ad-P12A3C were boosted either with HSV-P12A3C or FMDVi. The predominat presence of antibodies of the IgG2a isotype and increased levels of mRNA of IL-2 e INFγ was detected in the groups immunized with the viral vectors, suggesting a Th1 response, while inoculation with conventional vaccine generated high antibodies titers of the IgG1 isotype. No difference was found in protection from challenge with live O1/Campos virus, between animals vaccinated with inactivated virus or primed Ad-P12A3C and boosted either with HSV-P12A3C or FMDVi. The rapid induction of specific antibodies and antibody secreting cells in animals re-exposed to FMDV 5 months later, suggest that B memory and plasmatic cells were functional in vivo. At the same time point after vaccination, mice vaccinated with the combination Ad-P12A3C/HSV-P12A3C were 100% protected from viral challenge, suggesting that this combination was effective to elicit a protective immune response in the medium term against FMDV in adult mice.

Lorenzetti, Mario Alejandro. "Caracterización de variantes del virus de Epstein Barr en la infección aguda en pacientes pediátricos y su comparación con linfomas pediátricos EBV +" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de Epstein Barr (EBV) posee dos ciclos de infección, lítica y latente, en linfocitos B, el segundo está asociado a procesos neoplásicos. Se han descripto polimorfismos en los genes BZLF1, BKRF1 (EBNA1) y BNLF1 (LMP1), algunos asociados a linfomas EBV+, a los compartimentos del hospedador o al origen geográfico del virus. Con el objetivo de identificar polimorfismos en estas regiones génicas y su dinámica de distribución en el tiempo y entre los compartimentos del hospedador, se estudió una serie de 35 pacientes pediátricos, 15 con mononucleosis infecciosa (MNI) y 20 con linfoma EBV+, todos de nuestra región geográfica. Mediante amplificación por PCR y posterior secuenciación, se caracterizaron las variantes virales de dichos genes en distintos compartimentos de pacientes i) con MNI al momento del diagnóstico (D0), al mes (D30) y a los tres meses (D90) durante la convalecencia y ii) en muestras de biopsias ganglionares de linfomas EBV+. Se identificaron variantes de BZLF1 estadísticamente asociadas a tumores EBV+, variantes de EBNA1 de circulación exclusiva en nuestra región geográfica y variantes de LMP1 preferentemente asociadas a patologías EBV+, tanto malignas como benignas.

Abstract:
Epstein Barr virus (EBV) displays two infective cycles, lytic cycle and latency within B cells, and it is the latter which is associated with neoplasic processes. Polymorphisms within BZLF1, BKRF1 (EBNA1) and BNLF1 (LMP1) genes were described, and some seemed to associate with malignancy, distribution between compartments or the geographical origin of the virus. With the aim to characterize polymorphisms within these genetic regions and their distribution over time and/or anatomical compartments, we studied a series of 35 pediatric patients from our geographic region: 15 with infectious mononucleosis (IM) and 20 with EBV-related lymphomas. Viral variants from these genes were characterized after direct sequencing of PCR products obtained from different anatomical compartments from patients with IM at diagnosis (D0), at a month time (D30) and after three months (D90), during the convalescence and also from EBV+ tumor biopsies. We identified BZLF1 variants statistically associated with EBV-related lymphomas, EBNA1 variants exclusively circulating in our region and LMP1 variants preferentially occurring in EBV-related pathologies, both malignant and benign.

Bolcic, Federico Martín. "Coinfección HIV-Hepatitis C: análisis molecular de factores genéticos del HCV que influyen sobre la respuesta al interferón" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de la hepatitis C y el HIV comparten las mismas vías de transmisión, lo que conlleva a una elevada tasa de coinfección. En este escenario, la tasa de respuesta al peg-IFN+RBV es más baja que en pacientes monoinfectados con HCV. El objetivo central de este trabajo fue estudiar si diferentes proteínas del HCV, estructurales (E2) y no estructurales del HCV (NS5A), son capaces de interrumpir las acciones antivirales desencadenadas por el IFN, contribuyendo hacia una respuesta disminuida a la terapia. El genotipo de HCV implicado en la infección denotó una prevalencia elevada del 1a así como un crecimiento del 4. Ambos son conocidos por su baja tasa de respuesta al IFN. Se encontró una relación temporal en la introducción en Argentina del genotipo 1a del HCV y el subtipo BF de HIV. La glicoproteína E2 no dio evidencia de rol alguno en la respuesta al tratamiento. Dominios definidos de la proteína NS5A arrojaron resultados encontrados dependiendo de la población bajo estudio. La co-presencia de HIV no parece impactar en la génesis de variantes de escape de HCV, ni modificar la composición de cuasiespecies. No obstante el HCV tendría capacidad replicativa en sitios extrahepáticos aunque las variantes virales halladas en células mononucleares de sangre periférica no exhibieron diferencias con las presentes en plasma. La menor respuesta al tratamiento con peg-IFN+RBV en la coinfección guardaría relación con la mayor presencia de genotipos 1a y 4. La proteína NS5A podría contribuir en tal sentido. Es necesario analizar el rol que desempeñan factores inherentes al hospedador.

Abstract:
The HIV and HCV share the same transmission routs which lead to a high prevalence of coinfection. In this scenario, the rate of response to peg-IFN + RBV is lower than in HCV monoinfected patients. The aim of this work was to analyze whether different HCV proteins, structural (E2) and nonstructural HCV (NS5A), are able to disrupt viral actions triggered by IFN, contributing to a decreased response to therapy. The HCV genotype infection epidemiology denoted that the most prevalent was 1a and growth of 4. Both are known for their low response rate to IFN. We found a temporal relationship in the introduction in Argentina of HCV genotype 1a and BF subtype of HIV. The E2 glycoprotein gave no evidence of any role in the response to treatment. Defined domains of the NS5A protein yielded results depending on the population under study. The co-presence of HIV does not appear to impact the selection of HCV resistant variants, or modify the composition of quasispecies. However, the HCV may have replicative capacity in extrahepatic compartments but viral variants found in peripheral blood mononuclear cells did not differ with those present in plasma. The lower response to treatment with peg-IFN + RBV in HIV coinfected patients would be related to the increased presence of genotypes 1a and 4. NS5A protein could contribute to this effect. It is necessary to analyze the role that factors inherent to the host.

Binaghi, María. "Rol de la fosforilación en la regulación funcional de la proteína de movimiento TGBp1 del potato virus X" (2012-08-21) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas perteneciente al género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para el movimiento viral célula a célula en la planta hospedera. Se ha demostrado que esta MP es fosforilada en los residuos T193 y T214 por una quinasa tipo CK2. Diferentes líneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puede regular la replicación y el movimiento viral. El objetivo de este trabajo fue estudiar el rol de la fosforilación en la regulación funcional de la proteína de movimiento TGBp1 de PVX y en su interacción con la proteína de plantas remorina (REM). Para ello se construyeron por mutagénesis dirigida versiones de TGBp1 no fosforilables (T193A y T214A) y otras que simulan la fosforilación (T193D y T214D). En ensayos de transcomplementación de la movilización célula a célula de un virus defectivo para dicha función, se demostró que las modificaciones en ambas treoninas resultan perjudiciales en la complementación del movimiento viral. Se determinó que la fosforilación de TGBp1 en la T193 regula la estabilidad de esta proteína viral por medio de un mecanismo que involucra la presencia de una secuencia de degradación tipo PEST en el extremo C-terminal de dicha proteína. A través de la combinación de estudios que involucran el análisis comparativo in silico de varias TGBp1s de virus de los géneros Alpha y Betaflexiviridae y de estudios por mutagénesis dirigida, se determinó que la T193 y la secuencia PEST C-terminal se encuentran conservadas en todas las TGBp1s analizadas, sugiriendo que la fosforilación en la T193 de estas MPs sería un mecanismo regulatorio de la estabilidad de dichas proteínas. Por otra parte, el análisis funcional de las fosfomutantes T193 y T214 de TGBp1 determinó que la fosforilación en dichos residuos afecta negativamente la actividad supresora del PTGS de TGBp1. Los ensayos de interacción entre TGBp1 de PVX y la proteína REM determinaron que tanto el dominio N- como el C-terminal de TGBp1 son necesarios para la interacción y que la misma no es regulada por fosforilación en los residuos T193 y T214 de TGBp1. Por otro lado, este trabajo presenta las primeras evidencias que la interacción entre distintas proteínas TGBp1s y REM se encontraría conservada entre los virus que utilizan estrategias de movilización del tipo Triple Bloque de Genes (TGB). Los análisis realizados para determinar el efecto biológico de REM sobre la TGBp1 de PVX demostraron que la proteína REM no interfiere en la actividad del PTGS de esta proteína viral. Finalmente estudios de localización subcelular determinaron que la localización subcelular de TGBp1 es influenciada por la presencia de las otras proteínas virales y que a su vez varía según si la proteína se encuentra fusionada en su extremo N- o C- terminal a GFP.

Abstract:
Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome is based on a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movement proteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capsid protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside the host plant. Previously it has been demonstrated that TGBp1 is phosphorylated by a CK2-like kinase in T193A and T214 residues. Recent works on other plant viruses have indicated that viral protein phosphorylation by host kinases can regulate processes such us viral replication and mobilization. The aim of this work is to evaluate the role of phosphorylation in regulating the functional activities of the movement protein TGBp1 of PVX and its interaction with the protein Remorin (REM). For this aim different TGBp1 mutants have been developed by direct mutagenesis where the identified threonines have been replaced by alanine (T193A and T214A) or aspartate (T193D and T214D) residues. The virus movement function of the phosphomutants was assessed by complementation of PVX cell-to-cell movement in trans. It was shown that all mutants were non-functional for virus movement, and that phosphorylation of T193 is essential for stability of the MP by a degradation mechanism that involves a PEST sequence at the C-terminus of TGBp1. Several experimental approaches involving sequence comparison among TGBp1 homologues from viruses belonging to the Alpha and Betaflexiviridae genera and direct mutagenesis show that the T193 residue and the PEST sequence are conserved among all TGBp1 analyzed, suggesting that phosphorylation of T193 in these MPs could be a mechanism by which protein stability is regulated in several viruses. The results obtained in this work also have shown that phosphorylation of T193 and T214 of TGBp1 negatively affects the PTGS suppression activity of this MP. Two-hybrid assays and pull down experiments demonstrated that the N- and C-term domain of TGBp1 are involved in the interaction between PVX TGBp1 and REM and that this interaction is not regulated by TGBp1 phosphorylation. In addition, this work presents the first evidence that the interaction between REM and other TGBp1s could be a conserved mechanism used by different TGB-containing viruses. The studies conducted to determine the biological effect of REM on TGBp1 from PVX showed that REM protein does not interfere with PTGS- suppressing activity of TGBp1. Finally, sub-cellular localization studies demonstrated that TGBp1 localization is influenced by the presence of other viral proteins and by the use of N- or C-terminal GFP fusion proteins.

Manacorda, Carlos Augusto. "Estudio de los cambios transcriptómicos producidos por infecciones virales en plantas, rol de fitohormonas y su vinculación con la progresión de síntomas" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las pérdidas en cultivos ocasionadas por virus dependen mayormente de la severidad de los síntomas producidos. La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la producción de síntomas es de importancia para el desarrollo de estrategias que permitan reducir las pérdidas ocasionadas por fitovirus. Mediante el uso de cepas de virus de los géneros Tobamovirus y Potyvirus, el presente trabajo analizó la relación entre la severidad de sus síntomas en Nicotiana tabacum y Arabidopsis thaliana con su capacidad para alterar diferencialmente parámetros morfológicos, fisiológicos y transcriptómicos relevantes para los procesos de desarrollo y respuestas a estrés, hormonas y defensa. Los resultados indicaron que a tiempos tempranos de la infección en tejidos sistémicos, cuando aún no son visibles los síntomas característicos de la infección, se producen cambios moleculares importantes. Éstos incluyen alteraciones en la acumulación de metabolitos vinculados con procesos de señalización y defensa, así como cambios transcriptómicos en genes clave en redes de senescencia, defensa y respuesta a hormonas. La respuesta de microRNAs con importantes roles en el desarrollo ante tratamientos con hormonas y virus exhibió un componente transcripcional y muchos de estos genes reguladores evidenciaron un patrón bifásico de cambios, sugiriendo que los procesos que conducen a su alteración en etapas tempranas de la infección difieren de los que condicionan la misma a etapas avanzadas. En Arabidopsis, gran parte de las diferencias en alteraciones fisiológicas y de síntomas inducidas por distintas cepas de un Potyvirus se perdieron en plantas mutantes para la vía del ácido salicílico. A la luz de estos hallazgos, se propone un mecanismo por el cual la retroalimentación entre ácido salicílico y especies reactivas de oxígeno determina la activación de genes clave en los procesos de desarrollo y senescencia.

Abstract:
Losses on crops caused by virus mostly depend on symptoms severity. The understanding of the molecular mechanisms underlying the production of symptoms is important for the development of strategies that will reduce the losses caused by plant virus. By using viral strains of virus of the genus Tobamovirus and Potyvirus, this study analyzed the relationship between the severity of their symptoms in Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana with their ability to differentially alter physiological, morphological and transcriptomic parameters relevant to the processes of development and responses to stress, hormones, and defense. The results indicated that at early times of infection in systemic tissues, when the characteristic symptoms of the infection are still not visible, important molecular changes occur. These include alterations in the accumulation of metabolites linked to processes of signaling and defense, as well as transcriptomic changes in key genes in senescence, defense and response to hormones networks. The response of microRNAs with important roles in development following treatment with hormones and viruses exhibited a transcriptional component and many of these regulatory genes showed a biphasic pattern of changes, suggesting that the processes that lead to their alteration at early stages of infection differ from which condition it to advanced stages. In Arabidopsis, much of the differences in physiological changes and symptoms induced by different strains of a Potyvirus were lost in mutant plants for salicylic acid pathway. In the light of these findings, a mechanism is proposed by which the feedback between salicylic acid and reactive oxygen species determines the activation of key gen es in the processes of development and senescence.

Monteverde, Martín Julio. "Selección de hábitat denso-dependiente y riesgo de exposición al Hantavirus Andes: un estudio experimental con un ensamble de roedores en Patagonia norte, Argentina" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La selección de hábitat denso-dependiente, los efectos competitivos intra e interespecíficos y algunos aspectos de la ecología espacial de tres especies de un ensamble de roedores sigmodontinos (Oligoryzomys longicaudatus, Abrothrix olivaceus y Abrothrix longipilis) fueron estudiados en el Paraje El Contra del Parque Nacional Lanín (Pcia. del Neuquén, Argentina) y los resultados fueron luego analizados en el marco del riesgo de exposición humana al Hantavirus “Andes”, agente causal del Síndrome Pulmonar por Hantavirus, una grave enfermedad endémica en esta región. El trabajo estuvo centrado en dos tipos de hábitats (silvestre y peridoméstico) en donde los individuos de las especies mencionadas fueron mensualmente capturados utilizando la metodología de captura-marcado-recaptura. Los patrones de uso y selección de hábitat, interacciones competitivas y efectos denso-dependientes fueron analizados empleando los modelos de isolegs e isodaras, junto con la estimación de algunos parámetros de la ecología espacial (movimientos entre hábitats y áreas de acción) de los individuos de las especies de roedores involucradas. O. longicaudatus, principal reservorio del Hantavirus “Andes” en Patagonia, seleccionó el hábitat silvestre solo durante el verano y el otoño, mientras que durante los meses primavero-invernales usó indistintamente el hábitat silvestre y peridoméstico. Este comportamiento selectivo estuvo influenciado por A. olivaceus durante todo el año. Además, O. longicaudatus verificó el mayor número absoluto de capturas en hábitats peridomésticos y la mayor cantidad de movimientos inter-hábitat. Este uso alternativo de ambos hábitats, respondió (probablemente) a su subordinación dentro del ensamble. Como resultado de esto, los mayores efectos competitivos los tuvo con individuos de A. olivaceus (especie competitivamente intermedia). De esta manera, la especie menos perjudicada debido a interacciones interespecíficas fue A. longipilis, ya que es la especie competitivamente superior y claramente dominante en el hábitat silvestre. El modelo de organización de la comunidad de roedores varió estacionalmente, alternando entre un modelo de preferencias compartidas de hábitat (verano y el otoño) y uno de preferencias de hábitat diferenciales (invierno y la primavera). O. longicaudatus podría categorizarse como un “utilizador estratégico de hábitats peridomésticos” (probablemente para minimizar efectos competitivos en los hábitats silvestres), mientras que A. olivaceus y A. longipilis podrían considerarse como “intolerantes de hábitat” con preferencia por el hábitat silvestre. Los aportes o contribuciones de esta tesis a la salud humana son discutidos en términos del riesgo de exposición y transmisión de Hantavirus a humanos como resultado de la influencia de factores denso-dependientes en el comportamiento selectivo de O. longicaudatus por el hábitat.

Abstract:
Density-dependent habitat selection, intra and interspecific competitive effects, and some aspects of the spatial ecology of three species (O. longicaudatus, Abrothrix olivaceus and Abrothrix longipilis) of an assemblage of sigmodontine rodents were studied in Paraje El Contra within Lanín National Park (Neuquén Province, Argentina), assessing their implications on the risk of human exposure to Hantavirus “Andes”, the causative agent of Hantavirus Pulmonary Syndrome, an endemic and severe illness in this region. Rodents were trapped monthly following capturemark- recapture method in two types of habitats (sylvan and peridomestic). Patterns of habitat use and selection, competitive interactions and density-dependent effects among the species involved were analyzed with isolegs and isodars, and some parameters of their spatial ecology (home ranges and movements between habitats) were estimated. O. longicaudatus, the main reservoir of Hantavirus "Andes" in Patagonia, positively selected the sylvan habitat in summer and autumn and used both habitat types throughout the spring and winter months. This selective behavior was influenced by A. olivaceus throughout the year. Moreover, O. longicaudatus achieved the highest absolute number of captures in peridomestic habitats and showed the highest number of interhabitat movements. This alternative use of both habitats (probably) responded to its subordination within the assemblage. As a result, the competitive effects between O. longicaudatus and A. olivaceus (the intermediate competitively species) were the greatest in this assemblage. Abrothrix longipilis is the superior competitor of this assemblage and clearly the dominant species in the sylvan habitat, and consequently less affected by interspecific interactions. The model of rodent community organization varied seasonally, alternating among models of shared habitat preferences (summer and fall) and differential habitat preferences (winter and spring). O. longicaudatus may be labeled as a strategic user of peridomestic habitats (probably to minimize competitive effects) while A. olivaceus and A. longipilis as "habitat intolerants" after their marked preference for the sylvan habitat. The contributions of this thesis to human health are discussed in terms of risk of exposure and transmission of Hantavirus to humans as a result of densitydependent factors influencing habitat selective behavior of O. longicaudatus.

Delfino, Cecilia María. "Virus de hepatitis B (HBV) y virus de hepatitis D (HDV) en Argentina: epidemiología molecular y variabilidad viral" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo principal de esta tesis fue estudiar la epidemiología molecular de la infección por HBV y HDV, determinar los genotipos y analizar la variabilidad genética de los aislamientos detectados en distintas poblaciones y regiones de Argentina. Se estudiaron donantes de sangre de Buenos Aires y Misiones, y Amerindios de cuatro comunidades originarias: Mbyá-guaraníes (Misiones), Kollas (Jujuy), Sagua-Huarpes (San Juan) y Wichis (Formosa). Las cifras de prevalencia para el HBsAg variaron de 0,2 a 0,73% para donantes y de 1,4 a 1,7% para originarios. El análisis filogenético de las secuencias de HBV determinó la circulación en ambas poblaciones de los subgenotipos A2, B2, C2, D3, D3/D6, F1b y F4. En las secuencias de HBV se detectaron mutaciones en regiones regulatorias asociadas a mayor severidad de la enfermedad hepática y en las proteínas del pre-Core (productoras de fenotipo e minus), del Core (dentro de los epítopes para linfocitos T), preS1-S2 (posiblemente asociadas a infección oculta por HBV), S (mutantes de escape a la respuesta inmune humoral), P (asociadas a resistencia antiviral) y X (implicadas en el desarrollo del hepatocarcinoma celular). Se describe por primera vez la circulación del genotipo 1 de HDV en donantes de sangre de Buenos Aires y en originarios de Misiones; con el interesante hallazgo de la detección de este virus en casos de infección oculta por HBV. Además, se identificaron mutaciones en el antígeno Delta que podrían justificar la no detección de anticuerpos anti-HDV (infección “oculta”) en estos casos.

Abstract:
The main objective of this thesis was to study the molecular epidemiology of HBV and HDV infection, to determine the genotypes and to analyze the genetic variability of the isolations detected in different populations and regions of Argentina. Blood donors from Buenos Aires and Misiones, and Amerindians from four original communities were studied: Mbyá-guaraníes (Misiones), Kollas (Jujuy), Sagua-Huarpes (San Juan) and Wichis (Formosa). The prevalence of HBsAg ranged from 0.2 to 0.73% in blood donors and from 1.4 to 1.7% for aborigines. The phylogenetic analysis of the HBV sequences revealed the circulation of A2, B2, C2, D3, D3/D6, F1b and F4 genotypes in both populations. In HBV sequences, mutations in the regulatory regions associated to more severe hepatic desease and in the pre-Core proteins (e minus producers), the Core (among the epitopes for T cells), preS1-S2 (possibly associated to occult HBV infection), S (escape mutants to the humoral immune response), P (associated to antiviral resistance) and X (implicated in the development of hepatocellular carcinoma). We describe for the first time the circulation of HDV genotype 1 among blood donors of Buenos Aires and aborigines of Misiones; only among those with occult HBV infection. Moreover, we identified mutations in the Delta antigen which could explain the non-detection anti-HDV antibodies (“occult” infection) in these cases.

Artuso, María Carolina. "Rol de los polisacáridos sulfatados y variantes del virus Herpes simplex tipo 1 en la patogenia viral" (2013-05-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus Herpes simplex (HSV) es responsable de una variedad de manifestaciones clínicas desde ulceras oro-faciales y genitales hasta encefalitis y alteraciones respiratorias. Los síntomas son usualmente autolimitantes pero pueden ser extensivos y prolongados en individuos inmunocomprometidos. En estos casos, puede requerirse una larga terapia antiviral, lo que resulta en la generación de virus resistentes a las drogas como el aciclovir (ACV). El HSV ingresa a las células mediante una interacción primaria entre las glicoproteínas virales y el heparán sulfato (HS), molécula presente en la superficie celular y en la matriz celular. Los carragenanos (CGNs) son polisacáridos sulfatados derivados de algas rojas cuya estructura es similar a la del HS. Ellos actúan como inhibidores potentes y selectivos de HSV, al bloquear la interacción de virus con su receptor primario en la etapa de adsorción viral. En estudios previos realizados en nuestro laboratorio se seleccionaron y caracterizaron variantes virales de HSV-1 cepa F. Éstas fueron obtenidas bajo presión de selección con un CGN natural μ/n denominado 1C3 de estructura relacionada con los CGNs kappa (k) e iota (ɩ)-(1C3syn14-1 y 1C3syn17-2). A fin de evaluar la reproducibilidad del método utilizado para generar las variantes virales se realizaron pasajes seriados de HSV-1 cepa KOS en células Vero en presencia de concentraciones crecientes de CGN ɩ o heparina (H). Se seleccionaron 4 clones, ɩ16-6, ɩ16-11, H17-5 y H17-16, los cuales exhibieron características similares en: resistencia relativa al compuesto usado durante el tratamiento selectivo y al ACV, al igual que su curva de replicación viral. Además, fueron menos virulentos que la cepa patrón en ratones BALB/c por inoculación intravaginal pero no por vía intranasal, a excepción de la variante ɩ16-11 que fue atenuada por ambas vías. Por otro lado, se profundizó el estudio de la caracterización citopática y patogénica de las variantes virales, derivadas de HSV-1 F, en mucosa respiratoria. Se demostró la activa participación de los macrófagos como protagonistas en la patología viral y se la correlacionó con la menor activación de citoquinas inflamatorias (TNF-α, IL-6) en relación con la cepa control. Alteraciones puntuales detectadas en el gen de la glicoproteína D de las variantes virales podrían ser parte responsable de la liberación disminuida de citoquinas proinflamatorias. Mientras que las moléculas de adhesión VCAM e ICAM no se vieron afectadas. Por otro lado se mostró, que el procedimiento empleado usando CGNs permitió la selección y/o modificación de los genes de la Timidina Quinasa y la ADN polimerasa sin alterar la resistencia viral al ACV. El conjunto de estos resultados indican que la regulación de los niveles de las citoquinas TNF-α e IL-6 juega un rol importante en la patología respiratoria de HSV y además que el método utilizado de obtención de las variantes permite la selección de virus con características estables. Estos resultados contribuyen a la caracterización de las variantes virales con el objetivo de profundizar los conocimientos de la respuesta inflamatoria en el tracto respiratorio luego de una infección por HSV. Palabras Claves: virus Herpes simplex, Carragenanos, variantes virales, atenuación, inmunopatología.

Abstract:
Herpes simplex virus (HSV) is responsible for a variety of clinic manifestations, from oro-facial and genital ulcers to encephalitis and respiratory disorders. Symptoms are usually self-limiting but they can be extensive and prolonged in immunocompromised patients. In these cases, it might be required a long antiviral therapy, resulting in the generation of drugresistant viruses such as Acyclovir-resistant viruses. HSV enters the cell by a primary interaction between viral glycoproteins and the heparan sulfate (HS), molecule present in the cell surface and cellular matrix. Carrageenans (CGN) are sulfated polysaccharides derived from red algae with a chemical structure similar to HS. CGN were identified as potent and selective inhibitors of HSV by blocking the interaction between the virus and HS during the adsorption. In previous studies carried out in our laboratory, viral variants from HSV-1 strain F were selected and characterized. They were obtained under selective pressure of the μ/n -1C3 natural CGN with a chemical structure related to the kappa (k) and iota (ɩ) CGNs (1C3syn14-1 and 1C3syn17-2). In order to evaluate the reproducibility of the method used to generate viral variants, serial passages were done with HSV-1 strain KOS in Vero cells in the presence of increasing concentrations of the ɩ CGN or heparine (H). Four clones were selected: ɩ16-6, ɩ16-11, H17-5 and H17-16, which exhibited similar characteristics such as relative resistance to the compound used for the selective treatment and ACV, as well as theirs viral replication curve. Furthermore, they were less virulent than the parental strain in BALB/c by intravaginal inoculation but not intranasally, except for the variant ɩ16-11 which was attenuated by both routes. On the other hand, the cytopathic and pathogenic effect of the viral variants, derived from HSV-1 F virus, were characterized in the respiratory mucosa. It was demonstrated that the active involvement of macrophages as key players in the viral pathology correlated with the lower release of the inflammatory cytokines (TNF-a and IL-6) in relation with the parental strain. Punctual mutations detected in the gene of glycoprotein D of the viral variants could be partially responsible for the low concentration of the inflammatory cytokines. Moreover, the expression of adhesion molecules VCAM and ICAM was not altered. It was also shown that the use of the CGN allowed the selection and/or modification of the Timidine Kinase and DNA polimerase genes without modifying resistance to ACV. All these results indicate that the regulation of TNF-a and IL-6 play a key role in the respiratory pathology of HSV and that the method used to obtain the viral variants allows the selection of virus with stable and attenuated characteristics. Results obtained in the present study contribute to characterize viral variants in order to extend the knowledge about the cellular inflammatory response induced in the respiratory tract by HSV-1. Keywords: virus Herpes simplex virus, Carrageenans, viral variants, attenuation, inmunopathology

Giraldez, Adrián Nicolás. "Diseño de un sistema de genética reversa del virus de la fiebre aftosa" (2013-11-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El presente trabajo tiene como objetivo generar un sistema para ser utilizado como herramienta en técnicas de genética reversa vinculadas al estudio del virus de la Fiebre Aftosa. Se diseñó y construyó un clon basado en una copia en ADN del genoma completo de la cepa O1/Campos, que se transcribe a partir del promotor de la polimerasa del fago T7. A pesar de detectar replicación del genoma viral por identificación de ARN de cadena negativa en las células transfectadas y en pasajes sucesivos de éstas, no se observó generación de efecto citopático en células BHK-21. Se valoró la influencia de algunos cambios en nucleótidos sobre esta incapacidad, tales como mutaciones en la secuencia amino acídica, estructura secundaria del ARN, estructura secundaria y terciaria de las proteínas involucradas, y se generaron reversiones de las mutaciones que se consideraron más importantes. Se desarrolló un sistema de cuantificación de ARN viral por RT-PCR en Tiempo Real. Por otro lado, se generaron dos replicones mediante el remplazo parcial o completo de las proteínas de la cápside viral por el gen reportero Luc, incapaz de generar virus infeccioso, de modo de poder realizar estudios en laboratorios de nivel bioseguridad menos estrictos. Este sistema puede usarse para el estudio funcional de las proteínas no estructurales del virus, así como de las regiones 5’ y 3’ no codificantes. Se detectó replicación por identificación de ARN de cadena negativa en las células transfectadas así como traducción de proteínas virales por medio de técnicas de inmunofluorescencia indirecta.

Abstract:
The aim of the present work was to build a reverse genetic system for the molecular study of Foot-and-mouth Disease virus (FMDV). A full-length cDNA clone based on the genomic sequence of O1/Campos strain was cloned downstream of the T7 polymerase promoter. Genomic RNA was transcribed in vitro from this clone after linearization of the plasmid cDNA. Although replication of the viral genome was confirmed through the detection of negative strand RNA in transfected cells and subsequent passages, cytopathic effect on BHK-21 cells was not observed. The influence of nucleotide changes on this phenotype, such as aminoacid changes, RNA secondary structure, protein secondary and tertiary structure, were carefully analyzed, and several reversions of mutations were carried out. A Real Time RT qPCR assay to quantify FMDV RNA was developed. In a second step of this work, two replicons derived from the full length clone were constructed by partial or complete replacement of the sequences encoding the viral capsid proteins with those of the Luc gene. These replicons have the advantage that they are unable to generate infectious virus, and therefore require less strict biosecurity conditions. This system can be used for the study of the role of FMDV nonstructural proteins and the 5’ and 3’ UTRs during viral replication. Replication of the constructs was confirmed in transfected cells through detection of negative strand RNA by RT-PCR and detection of translation of viral proteins by indirect immunofluorescence techniques.

Nussenbaum, Ana Laura. "Aislamientos de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae virulentos para el control del picudo del algodonero, Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae)" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El picudo del algodonero, Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae), es considerado una de las plagas más importantes de algodón en América, presente en Argentina desde 1993. El objetivo general del trabajo fue seleccionar aislamientos nativos de los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae (Ascomycota: Hypocreales) virulentos para el picudo del algodonero. Para ello se obtuvieron aislamientos nativos provenientes de muestras de suelo e insectos, así como cepas pertenecientes a la micoteca del Laboratorio de Hongos Entomopatógenos (IMYZA, INTA). Se evaluó la patogenicidad y virulencia de 28 aislamientos de M. anisopliae y 66 aislamientos de B. bassiana sobre adultos de picudo y se estudiaron los efectos subletales sobre la alimentación y oviposición producidos por estos hongos. Por otro lado, fueron evaluadas distintas características de los aislamientos seleccionados, como la compatibilidad con los insecticidas químicos utilizados en campo, el efecto conjunto de los insecticidas químicos y los aislamientos sobre la plaga, y la tolerancia a altas temperaturas de los aislamientos. Finalmente, se evaluaron parámetros de producción masiva de conidios de los aislamientos seleccionados y se realizaron evaluaciones en campo de las formulaciones experimentales. Los aislamientos de M. anisopliae (Ma 50 y Ma 20) resultaron los más virulentos donde la concentración letal media fue 1,13 x 10*7 y 1,20 x 10*7 conidios/ml, respectivamente. Además, se encontró una disminución en la alimentación de las hembras infectadas con los aislamientos Ma20 y Bb23, y una disminución de la oviposición con Ma 20. Por otro lado, los aislamientos de M. anisopliae evaluados fueron compatibles con los insecticidas piretroides y más tolerantes a temperaturas altas. Los resultados obtenidos indican la posibilidad de utilizar M. anisopliae como agente de control microbiano incluyéndolo en un programa de Manejo Integrado del Picudo del Algodonero.

Abstract:
The boll weevil, Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae), is the main pest of cotton in the Americas, present in Argentina since 1993. The aim of this work was to select native isolates of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae (Ascomycota: Hypocreales), both virulent against A. grandis. The native isolates were obtained from soil and insects, and from the Laboratory of Entomopathogenic Fungi collection (IMYZA, INTA). Screening was performed to evaluate the pathogenicity of 28 isolates of M. anisopliae and 66 isolates of B. bassiana against boll weevil adults. To select the isolates, LC50 values of the most virulent isolates were calculated, and the effects of these isolates on the feeding and reproductive behavior of the adults were evaluated. In addition, different characteristics of the selected isolates were evaluated, which included compatibility between the isolates and insecticides, the combined effect of insecticides and isolates on boll weevil adults, and high temperatures tolerance of the isolates. Finally, massive production parameters were calculated for the selected isolates, and formulations were applied in cotton crops. Isolates Ma 50 and Ma 20 (M. anisopliae) were the most virulent against A. grandis and their LC50 values were 1.13 x 10*7 and 1.20 x 10*7 conidia/ml, respectively. Also, we found a decrease on the feeding behavior caused by infected females treated with Ma 20 and Bb 23 isolates, and the decrease of the eggs laying of females treated with Ma 20 isolate. In addition, these isolates were compatible with pyrethroid insecticides, and showed tolerance to higher temperatures. In summary, these results indicate the possibility of the use of M. anisopliae as a microbiological control agent against boll weevils, included in an Integrated Pest Management program.

Pretel, Miguel Esteban. "La proteína no-estructural NS1 exclusiva del virus respiratorio sincicial: mecanismo de plegamiento y ensamblado quasi-espontáneo de oligómeros esféricos estables" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los Paramixovirus son una familia diversa de virus ARN de cadena negativa pertenecientes al orden de los Mononegavirales. Estos virus han evolucionado diversas estrategias para bloquear los mecanismos de respuesta inmune innata del huésped en el curso de un proceso infeccioso. El virus respiratorio sincicial (RSV) es la mayor causa de enfermedad pediátrica en el mundo. Este virus, contiene a dos proteínas no estructurales (NS1/NS2) la cuáles sólo se encuentran en RSV y no muestran homología con ninguna otra proteína. NS1 y NS2 han sido postuladas como los principales factores de virulencia de RSV, interviniendo en el bloqueo de la respuesta inmune inducida por el virus. Se han identificado múltiple blancos celulares que interactúan con NS1 y NS2, principalmente relacionados a las vías de inducción y respuesta a interferón. En este trabajo de tesis, se realizó el estudio de la conformación de NS1 en solución, haciendo uso de métodos bioquímicos y biofísicos para su estudio. Como primera medida, se desarrolló un protocolo de expresión y purificación que permitió obtener un rendimiento de 10 mg/L de proteína homogénea en solución. Se determinó que NS1 es un monómero plegado globular, el cual contiene regiones flexibles que presentan intercambio conformacional. La temperatura induce cambios estructurales que llevan a la formación de oligómeros esféricos solubles (NS1SOs) los cuales presentan propiedades amiloides. Se analizó la cinética de formación de estos oligómeros, a partir de lo cual se propone un modelo de ensamblado identificando eventos clave para el proceso. Por otro lado, estudios de plegamiento al equilibrio indican que NS1 se despliega cooperativamente en un proceso reversible de dos estados (Nativo – Desplegado), mientras que NS1SOs primero se disocia a monómeros nativos y luego se despliega. Estudios de cinética de plegado de NS1, indican que mientras que el desplegado de la proteína es relativamente sencillo, su plegado es complejo y limitado cinéticamente por la presencia de múltiples intermediarios, compatible con heterogeneidad cis/trans de prolinas en el estado desplegado. En resumen, en el presente trabajo se describe la diversidad conformacional de la proteína NS1. Esta proteína se encuentra en cuasi-equilibrio con oligómeros esféricos y estables, los cuales se forman en condiciones compatibles con un entorno celular. Estos estudios constituyen los primeros en analizar los equilibrios conformacionales para esta proteína y podrían explicar sus múltiples blancos y funciones reportadas.

Abstract:
Paramixoviruses are a diverse family of negative-strand RNA viruses that belong to the order of Mononegavirales. These viruses evolved different strategies in order to block the host innate immunity during infection. Respiratory Syncytial Virus (RSV) is the major infectious agent that causes pediatric respiratory disease worldwide. RSV contains the two non structural proteins (NS1 and NS2) which are unique to RSV and show no homology to any other protein in relation to its primary structure. These two proteins were postulated as the RSV major virulence factors, and play a central role in blocking the immune response induced by the virus. Multiple cellular targets have been reported for NS1 and NS2, mainly related to the interferon pathways. In this thesis, we studied the NS1 conformation in solution, making use of different biochemical and biophysical techniques. First, we developed an expression and purification protocol which allowed us to obtain 10 mg/L of highly purified protein. We observed that NS1 is a folded and globular monomer which contains some flexible regions subject to slow conformational motions. Temperature induces a cooperative structural change leading to soluble and spherical oligomers (NS1SOs) with amyloid properties. We performed a kinetic analysis which allowed us to propose a model in relation to oligomer formation, identifying key events of the process. Equilibrium folding studies revealed that NS1 unfolds following a two-state reaction, in a fully reversible process, whereas NS1SOs first dissociates into native monomers and them unfolds. On the other hand, kinetic folding studies indicated that although unfolding is a rather simple process, refolding is complex, limited by multiple kinetic intermediates, compatible with prolyl cis/trans heterogeneity in the unfolded state. In summary, the present work describes the conformational diversity of the NS1 protein. NS1 exists in quasi-equilibrium with stable and spherical oligomers, which are formed in conditions compatible with a cellular environment. This work represents the first study in relation to conformational equilibria of the NS1 protein and may explain its multiple binding partners and functions reported.

Legisa, Danilo Mario. "Estudio de aislamientos nacionales y desarrollo de una vacuna a subunidad, direccionada a células presentadoras de antígenos, para el Virus de la Lengua Azul" (2014-04-03) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Lengua Azul es una enfermedad que afecta principalmente rumiantes salvajes y doméstico, y representa una importante barrera para el comercio internacional de animales y sus subproductos. El Virus de la Lengua Azul es el causante etiológico de la enfermedad y es transmitido por insectos hematófagos del género Culicoides. El Virus de la Lengua Azul , es el miembro prototipo del género Orbivirus dentro de la familia Reoviridae. El virión está compuesto por una doble capa proteica desnuda que envuelve un genoma de 10 segmentos lineales de ARNdc, los cuales codifican para al menos diez proteínas, 7 proteínas estructurales y al menos 4 no estructurales. La distribución del Virus de la Lengua Azul es global aunque en ciertas zonas la información es escasa. En Sudamérica, evidencia serológica de la presencia del virus fue encontrada todos los países menos Uruguay y Bolivia. Argentina y Brasil son los únicos países donde ha sido aislado el virus. En Argentina han sido obtenidos 5 aislamientos de Virus de la Lengua Azul serotipo4 en ganado bovino. Tres de estos aislamientos fueron logrados entre los años 1999-2001, mientras los dos restantes fueron obtenidos en los años 2009 y 2010 como parte del presente trabajo de tesis. La medida de control más práctica y eficaz es la inmunización profiláctica de los animales susceptibles. Desde principios del siglo XX se han desarrollado vacunas atenuadas e inactivadas eficientes para la Lengua Azul. Sin embargo, las desventajas en cuanto a bioseguridad y efectos adversos impulsan el desarrollo de vacunas a subunidad, no infecciosas como alternativa a las vacunas convencionales. En este trabajo de tesis se abordó un análisis epidemiológico molecular de los aislamientos argentinos del VLA y el desarrollo de una vacuna a subunidad direccionada a células presentadoras de antígeno. El análisis epidemiológico molecular se basó en la obtención y análisis de las secuencias de 5 de los 10 segmentos virales (Segmentos 2, 3, 6, 7 y 10). El análisis de los segmentos 2 y 6 resultó en un cluster de secuencias argentinas dentro del clado del serotipo 4 y también dentro del grupo del nucleotipo A (definido para cada segmento). El análisis de los segmentos 3, 7 y 10 mostró que los aislamientos argentinos agrupan dentro del cluster de aislamientos de topotipo occidental o western, indicando que su origen se remontaría a África/Europa. El análisis filogenético reveló que, además de este origen, las secuencias argentinas representaron un fuerte linaje Sudamericano de evolución independiente. El desarrollo de la vacuna a subunidad se basó en la expresión de la proteína VP2, mayoritaria de la cápside externa e inmunodominante, sola o fusionada a la molécula APCH (Antigen Presenting Cell Homing) capaz de dirigir moléculas a células presentadoras de antígeno, utilizando el sistema de expresión de baculovirus. Los ensayos de inmunogenicidad en cobayos y bovinos utilizando estos dos antígenos, resultaron en altos títulos de anticuerpos neutralizantes similares a los evocados por la vacuna formulada con virus inactivado. Más aún, se obtuvieron títulos comparables para VP2 y dosis 4 veces menores de APCH-VP2 demostrando la capacidad APCH de potenciar la generación de anticuerpos. Como caracterización de la respuesta inmune asociada se analizó el perfil de inmunoglobulinas G y la presencia de células T de memoria. El perfil de IgG en los bovinos inmunizados con APCH-VP2 mostró una mayor proporción de IgG1 en comparación con los grupos vacunados con VP2 sola o con el virus inactivado. Por otro lado, la inmunización con las vacunas experimentales, mostró generación de células T de memoria para VP2 sola. Además, se comprobó la capacidad de las vacunas recombinantes de diferencias animales vacunados de infectados. Esta sección constituye un aporte en el desarrollo de vacunas a subunidad, capaces de generar una respuesta inmune comparable a vacunas inactivadas pero con características emergentes.

Abstract:
Bluetongue disease affects principally wild and domestic ruminants and represents a major barrier to animal trade and their sub products. The etiological agent is the Bluetongue Virus, it is transmitted by hematophagous arthropods from the genus Culicoides. Bluetongue Virus is the prototype member of genus Orbivirus and it belongs to Reoviridae family. The non enveloped virión is composed by two concentric protein layer which contents the viral genome, composed by ten dsRNA segments. This genome codifies for 7 structural proteins and at least, 4 non structural proteins. Bluetongue Virus is worldwide distributed, although there is a lack of information in certain regions. In Southamerica, serologic evidences of Bluetongue Virus were recorded in all countries except Uruguay and Bolivia. Argentina and Brazil are the only two countries where the virus was isolated. In Argentina, five Bluetongue Virus serotype 4 isolates have been obtained from asymptomatic cattle. Three isolates were obtained in years 1999-2001, and two in years 2009 and 2010 as result of this thesis work. Prophylactic immunization of susceptible animals is the most practical and effective measure to prevent Bluetongue disease. From beginning of XX century, attenuated and inactivated vaccines against Bluetongue Virus have been developed, however, biosafety issues and the well known adverse effects lead to the development of subunit vaccines as an alternative to classic ones. In this work, we performed a molecular epidemiology study of Argentinean Bluetongue Virus isolates and we also developed a subunit vaccine delivered to antigen presenting cells. The molecular epidemiology approach was based on the sequence analysis from 5 out of 10 genome segments (Segments 2, 3, 6, 7, and 10). Segments 2 and 6 analysis showed that Argentinean sequences grouped into the serotype 4 cluster and nucleotype A group, and even more, they grouped in a unique Argentinean cluster whit high bootstrap value. Segments 3, 7 and 10 analysis, showed that Argentinean isolates grouped into a western topotype cluster, along with sequences already classified as originated in Africa and/or Europe. Phylogenetic analysis revealed that all Argentinean sequences formed a well supported Southamerican lineage with independent evolutionary history. The subunit vaccine development was based on the baculoviral expression of VP2 protein, the major and immunodominant component of the outer capsid, alone or fussed to a molecule named APCH (antigen presenting cell homing), capable to deliver peptides or molecules to antigen presenting cells. Immunogenicity assays conducted in guinea pigs and cattle showed that both antigens were able to induce high neutralizing antibodies titers similar to those evoked by the inactivated vaccine. Moreover, VP2 antibody titers were comparable to APCH-VP2 titers which were generated using a 4 times lower dose of antigen, demonstrating the ability of APCH molecule to enhance the generation of antibodies. As part of the immune response characterization, immunoglobulin G profile and the presence of memory T cells were analyzed. IgG profile in animals vaccinated whit APCH-VP2 showed a higher proportion of IgG1 in comparison with VP2 and inactivated BTV groups. On the other hand, immunization with both candidate vaccines showed the generation of memory T cells specific to VP2. In addition, the capacity of the recombinant vaccine to differentiate vaccinated animal from infected ones was confirmed. This section represents a contribution in the development of Bluetongue Virus subunit vaccines capable of generating an immune response comparable to inactivated vaccines but with new and advance features.

Díaz Carrasco, Juan María. "Compartimentación de variantes virales entre plasma y células mononucleares de sangre periférica en pacientes con infección crónica por virus de hepatitis C" (2014-08-19) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de hepatitis C (VHC) afecta al 3% de la población mundial, representando una de las principales causas de hepatitis crónica y trasplante hepático. En el paciente infectado, el virus existe como un espectro de mutantes que difieren en su potencial de replicación, denominado cuasiespecie. La extensa variabilidad del VHC proporciona a la cuasiespecie una alta plasticidad fenotípica y capacidad de adaptación, que favorece el mantenimiento de la infección crónica. Si bien el principal sitio de replicación del VHC es el hígado, numerosos estudios han descripto la replicación del virus en tejidos extrahepáticos, en particular en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y esto se ha asociado con el desarrollo de distintas manifestaciones extrahepáticas. Se ha relacionado a distintos genes del VHC con la compartimentación en CMSP, pero aún no está claro cuáles son los factores celulares y virales requeridos para la infección de las células linfoides, por lo que la búsqueda de patrones moleculares asociados con el linfotropismo podría aportar datos valiosos para la comprensión de este fenómeno. Además, la gran mayoría de los estudios de compartimentación se han realizado en pacientes adultos y se basan únicamente en la región HVR1 de E2. El objetivo del trabajo fue evaluar la compartimentación del VHC en CMSP y su dinámica durante la infección crónica por VHC en pacientes pediátricos mediante el análisis de genes virales involucrados en distintas etapas del ciclo de replicación viral. Se evaluó la compartimentación y la existencia de patrones moleculares asociados con el linfotropismo mediante el análisis filogenético de las secuencias de tres regiones del genoma viral: IRES, E1E2 y NS5B, obtenidas a partir de muestras seriadas de plasma y CMSP de 6 niños. Se demostró estadísticamente que existe compartimentación viral en niños, principalmente en regiones discretas dentro de E1E2 que incluyen sitios de unión a receptores, lo que sugiere que el linfotropismo del VHC podría estar determinado por restricciones en la interacción de las glucoproteínas con factores celulares involucrados en el proceso de adsorción y entrada. Si bien no se evidenció un patrón molecular asociado con el linfotropismo común a todos los casos estudiados, se observó que las regiones identificadas están sujetas a presiones selectivas diferentes en plasma y CMSP y se describieron variaciones aminoacídicas asociadas con las variantes linfotrópicas. Además de contribuir al conocimiento general acerca de la compartimentación del VHC, nuestro trabajo pone de manifiesto el importante papel que juegan las CMSP como reservorios de variabilidad genética y como compartimentos de replicación extrahepática, favoreciendo la persistencia y contribuyendo al mantenimiento de la cronicidad durante la infección por VHC en niños.

Abstract:
Worldwide prevalence of chronic hepatitis C virus (HCV) infection is estimated at 3%, representing the major cause of chronic hepatitis and liver transplantation. Within the infected patient, the virus exists as a spectrum of mutants which differ in their replication potential, termed quasispecies. The large variability of HCV quasispecies provides high phenotypic plasticity and adaptability, which favors the maintenance of chronic infection. Although the primary site of HCV replication is the liver, numerous studies have described replication in extrahepatic tissues, particularly in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and this has been associated with the development of different extrahepatic manifestations. Several viral genes have been linked to HCV PBMCs compartmentalization, but the factors required for the infection of lymphoid cells still remain unclear, and therefore the search for molecular patterns associated with lymphotropism could provide valuable data for the understanding of this phenomenon. In addition, most studies examining compartmentalization have been conducted in adult patients and are based solely on the HVR1 region of E2. The aim of this study was to assess the compartmentalization of HCV in PBMCs and its evolution dynamics during chronic HCV infection in pediatric patients by means of the analysis of certain genes involved in different stages of the viral replication cycle. Compartmentalization and the existence of molecular patterns associated with lymphotropism were evaluated by phylogenetic analysis of the sequences of three viral genes, namely IRES, E1E2 and NS5B, which were obtained from serial samples of plasma and PBMCs of 6 children. We showed that there is statistically significant compartmentalization in children, mainly in discrete regions within E1E2 that includes receptor binding sites, suggesting that HCV lymphotropism could be influenced by restrictions in the interaction of the glycoproteins with cellular factors involved in viral attachment and entry. While a common molecular pattern associated with lymphotropism was not evident in all the studied cases, it was found that the identified regions were influenced by different selective pressures both in plasma and PBMCs. Moreover, amino acid variations associated with lymphotropic variants were described. Besides contributing to general knowledge about the compartmentalization of HCV, our work highlights the important role played by PBMCs as reservoirs of genetic variability and as compartments for extrahepatic replication, favoring persistence and contributing to the maintenance of chronicity during HCV infection in children.

Fernández Bell Fano, Pablo. "Infección persistente del virus Junín in vitro: perturbación del equilibrio virus-célula como estrategia de estudio del mecanismo involucrado en este tipo de infecciones" (2014-10-31) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, pertenece a la familia Arenaviridae. Los virus pertenecientes a esta familia son capaces de causar infecciones persistentes en roedores, los cuales actúan como reservorios naturales, asegurándose así su evolución y perpetuación en la naturaleza. Asimismo, son capaces de multiplicar en una amplia variedad de cultivos celulares pudiendo desarrollar el estadio de persistencia en la mayoría de ellos. El objetivo de este trabajo fue determinar las diferencias existentes entre infecciones agudas y persistentes en cultivos de células Vero frente a tratamientos que tienden a desestabilizar el equilibrio virus célula. A tal fin, mediante la infección experimental de células Vero con la cepa XJCl3, se obtuvo una línea celular persistentemente infectada con dicho virus, denominada V3, que se utilizó como modelo de estudio. En los ensayos realizados con el agente mutagénico 5-fluoruracilo (5-FU) se observó que la susceptibilidad a la inhibición ejercida por esta droga sobre JUNV dependió del lapso transcurrido entre el momento de la infección y el tratamiento, y de la m.o.i. utilizada sugiriendo que la proporción de células infectadas al momento de tratar definía la resistencia a la droga. En este sentido, las células V3 resultaron menos afectadas por el 5-FU en comparación con las células infectadas y tratadas durante la etapa aguda. Por otro lado, el análisis del ciclo celular de células Vero mostró que la infección con JUNV generó alteraciones en la respuesta del cultivo frente a estímulos como la confluencia de las células de la monocapa y el tratamiento con agentes inductores de arresto del ciclo. Durante ensayos de transfección con proteínas virales dicha alteración del ciclo fue asociada a la nucleoproteína viral N. Sin embargo, a pesar de la aparente manipulación del ciclo celular por parte del virus no se pudo asociar alteraciones inducidas del ciclo, a una disminución en el rendimiento viral. Teniendo en cuenta que los cultivos persistentemente infectados no presentan el efecto citopático (EC) típico de las infecciones agudas de este virus en células Vero, se evaluó en primer lugar la naturaleza de dicho fenómeno. El estudio de distintos indicadores de apoptosis mostró que dicho evento seguía una cinética similar a la desarrollada por el EC viral, observándose además un incremento en la expresión de p53 y en el clivaje de la caspasa 3. Cuando estos indicadores se analizaron en células V3, los valores encontrados presentaron valores similares a los de células Vero sin infectar. Por otro lado, al analizar la respuesta de los distintos cultivos frente a la inducción de apoptosis con staurosporina (STS) o luz ultravioleta (UV) los cultivos persistentemente infectados resultaron más resistentes que los cultivos infectados de forma aguda y las células sin infectar frente a la apoptosis inducida por luz UV y todos se comportaron de manera similar frente a la STS. Este comportamiento sugiere que JUNV podría estar modulando negativamente la apoptosis durante la persistencia de manera específica frente a ciertos estímulos aunque no frente a un inductor fuerte como la STS. La resistencia al estrés térmico también fue evaluada como un parámetro diferencial entre los distintos tipos de cultivos. En forma similar a lo que sucedió con el 5-FU el virus resultó más resistente al tratamiento con calor cuando éste se aplicó a tiempos de tratamiento p.i. tardíos y a mayores m.o.i.. La síntesis de HSP-70, principal efector de la respuesta celular al shock térmico, no se asoció temporalmente con la reducción de los títulos virales. De manera similar a lo observado con la respuesta al shock térmico, el tratamiento con arsenito de sodio (Ars), inductor de estrés oxidativo, resultó menos efectivo cuanto mayor era la proporción de células infectadas en los cultivos. El conjunto de resultados permite concluir que las características diferenciales presentadas por los cultivos infectados en forma persistente serían adquiridas durante el transcurso de la infección, al menos en el caso de la resistencia a los inductores de: extinción viral (5-FU), estrés térmico y oxidativo (HS y Ars) y alteraciones del ciclo. Esta estrategia estaría basada en la acumulación de suficiente cantidad de proteínas, en particular, la nucleoproteína N, a fin de controlar las respuestas a estrés, ya sea por intervención directa de dichas proteínas o a través de la modulación en la formación de gránulos de estrés citoplasmáticos y/o de cuerpos nucleares asociados a la proteína de leucemia promielocítica.

Abstract:
Junín virus (JUNV), the etiological agent of the Argentine Hemorrhagic Fever, belongs to the family Arenaviridae. Viruses belonging to this family are able to cause persistent infections in rodents, which act as natural reservoirs, thus ensuring their evolution and perpetuation in nature. They are also able to multiply in a wide variety of cell cultures having the capacity to develop persistence stage in most of them. The aim of this study was to determine the differences in the response of acute and persistent infection of JUNV in Vero cells to treatments that tend to disrupt the virus-cell equilibrium typical of the latter. To this end, we obtained a cell line persistently infected with the virus, called V3, through experimental infection of Vero cells with JUNV XJCl3 strain, which was used as a study model. Studies performed with the mutagenic agent 5-fluorouracil (5-FU) showed that susceptibility to inhibition exerted by this drug on JUNV depended on the time elapsed between the time of infection and treatment, and the m.o.i. used suggesting that the proportion of infected cells when treatment was applied defined the degree of drug resistance. In this sense, the V3 cells were less affected by the 5-FU compared with treated acutely infected cells. On the other hand, cell cycle profile of Vero cells infected with JUNV was different from acutely and non infected cultures when subjected to conditions of cell cycle arrest. During transfection assays with plasmids expressing viral proteins, alterations of cell cycle, similar to those observed by infection, were associated with the expression of the viral nucleocapsid N. However, despite the apparent alteration of cell cycle by the virus, no effect on viral replication could be associated with experimentally induced cell cycle alterations. Given that persistently infected cultures do not exhibit the typical cytopathic effect (CE) characteristic of acutely infected Vero cells, the nature of this phenomenon was evaluated in first place. The study of various indicators of apoptosis showed that this event followed similar kinetics as the CE that took place in infected cells, with a concomitant increase in expression of p53 and cleavage of caspase-3. By contrast, the level of these apoptotic markers was similar for V3 and non-infected Vero cells. On the other hand, the response to two apoptosis inducers, staurosporine (STS) and UV radiation revealed that persistently infected cultures showed resistance to the latter whereas acutely, persistently and non-infected cells were equally susceptible to STS. This is probably due to the fact that induction of apoptosis by UV treatment is carried out by a specific cellular pathway that might be modulated by the virus during persistence, while STS exerts its effect as a multitarget agent. The tests performed to determine the effect of HSP-70 induction on JUNV replication of the virus showed that this protein was not involved in the reduction of viral titer. Similar to the results obtained with 5-FU, the virus was more resistant at late p.i. treatment times and high m.o.i.. Both heat-shock and treatment with the oxidative stress-inducing drug sodium arsenite (Ars) were effective in reducing viral titers. Further analysis of the activity of heat shock showed that its range of action embraced 2 steps of the viral cycle: the processes leading to the budding of virions and protein translation. Heat-shock response was also evaluated as a differential parameter among the different types of infected and non-infected cell cultures. Similarly to the conclusions withdrawn with 5-FU, JUNV infections were more resistant to heat-shock when treatment was applied late during infection or when high m.o.i. were employed. Synthesis of HSP-70, main effector of heat-shock response, could not be associated to the decrease in virus titer observed in heat-shocked cultures. Also, arsenite, an oxidative stress inducer, diminished viral replication. The degree of arsenite inhibition was dependent of the proportion of infected cells in the monolayer. Altogether, the results allow to conclude that the differential characteristics between JUNV acutely and persistently infected Vero cells would be acquired during the course of infection, at least for the resistance to 5-FU, heat shock, oxidative stress and altered cell cycle. This strategy would be based on the premise of accumulation of viral proteins, particularly the nucleoprotein, in order to control cellular response to stress, either directly or by modulating stress granules formation and/or nuclear bodies associated to the promielocytic leukemia protein.

Rimondi, Agustina. "Estudio de la patogenia del Virus de Influenza Aviar de baja patogenicidad en aves de corral inmunosuprimidas por la afección con el virus de la Anemia Infecciosa Aviar" (2014-12-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Influenza Aviar es considerada una zoonosis con potencial pandémico. El agente etiológico responsable de esta enfermedad es el Virus de Influenza A, cuyo reservorio natural son las aves silvestres acuáticas. En ellas, la infección con el Virus de Influenza Aviar (AIV) generalmente es asintomática, mientras que en las aves de corral la infección con AIV puede producir una variedad de síntomas que se extienden desde presentaciones asintomáticas o suaves a una enfermedad aguda y fatal. En consecuencia, se generan grandes pérdidas económicas asociadas al control y erradicación de este agente en las aves domésticas. Por ello, en la presente tesis nos propusimos estudiar, primero, la presencia del AIV en las aves silvestres acuáticas de la Argentina y, luego, su introducción y difusión en aves de corral con diferente estado inmunológico. Los resultados obtenidos permitieron evidenciar la circulación de veinte Virus de Influenza Aviar de Baja Patogenicidad (LPAIV) de diversos subtipos en las aves silvestres que habitan en la Argentina. Estos LPAIV aislados presentaron características genéticas particulares en sus genes que los diferencian de los AIV aislados en otras regiones. En particular, se evidenció la existencia de un linaje Sudamericano con evolución independiente para los seis genes que codifican las proteínas internas del Virus de Influenza Aviar. Debido a que la mayoría de los LPAIV aislados en nuestro país fueron de subtipo H6, se estudió la patogenia de estos virus en las aves de corral. Los resultados demostraron que estos virus de subtipo H6 tienen capacidad de infectar pollos y de transmitirse por contacto, evidenciando el riesgo potencial de introducción de estos virus en las aves de corral. Por otra parte, se sabe que en la Argentina, como en cualquier país con una producción avícola intensiva, existe una alta incidencia del Virus de Anemia Infecciosa Aviar (CAV) dentro de los planteles de aves domésticas. Actualmente, se carece de conocimiento acerca de la importancia que puede tener el estado de inmunosupresión provocado por este agente en la evolución de la patogenia del AIV. Por ello, en el trabajo de tesis que se presenta a continuación se estudió de patogenia del LPAIV subtipo H6 en pollos inmunosuprimidos experimentalmente por la infección con una cepa de CAV autóctona. Los resultados obtenidos demostraron que el AIV utilizado, aislado de aves silvestres en la Argentina, tiene igual capacidad de infectar pollos y de transmitirse por contacto directo en aves inmunocompetentes e inmunosuprimidas con CAV. En conjunto, los resultados presentados en esta tesis permiten colaborar con mejores análisis de riesgo para el diseño de estrategias de control y prevención con el objetivo de proteger las aves domésticas de nuestro país. Además, haber aumentado la información acerca de la epidemiología de la Influenza Aviar en la región es de suma importancia para comprender en mayor profundidad las potenciales consecuencias de esta enfermedad, tanto en las aves silvestres como en las aves domésticas. Sumado a esto último, es importante destacar que la Influenza Aviar es una zoonosis, con lo cual el aumento de la información disponible sobre este agente infeccioso es de relevancia para el sistema de Salud Pública nacional.

Abstract:
Avian influenza is considered a zoonosis with pandemic potential. The etiologic agent responsible for this disease is influenza A virus, whose natural reservoir are aquatic wild birds. In this species, the infection with Avian Influenza Virus (AIV) is generally asymptomatic, while in poultry AIV infection can cause a variety of symptoms ranging from asymptomatic or mild presentations to an acute and fatal disease. Consequently, there are large economic losses associated with control and eradication of this agent in commercial sheds. Therefore, in this thesis we intended to study the presence of AIV in wild aquatic birds circulating in Argentina and their possible introduction and spread in poultry with different immunologic status. The results obtained showed the circulation of twenty Low Pathogenic Avian Influenza Virus (LPAIV) from wild birds in Argentina. These viruses were from different subtype and all showed particular genetic characteristics in their genes that differ from AIV isolated in other regions. Particularly, genetic and phylogenetic analyses of their internal gene segments revealed a close relationship with influenza viruses from South America, forming a unique clade and supporting the notion of independent evolution from influenza A viruses in other latitudes. Due to AIV from H6 subtype were most consistently isolated in Argentina, we investigated the replication and transmission of these Argentine H6 AIV in poultry. The results suggested that these Argentine H6 viruses could replicate and transmit in chickens, demonstrating the potential risk of introduction of these viruses in poultry. It is known that in Argentina, as in any country with intensive poultry production, there is a high incidence of Chicken Infectious Anemia Virus (CAV) in commercial flocks. Currently, there is a lack of knowledge about the importance of the immunosuppression caused by this agent in the evolution of the pathogenesis of AIV. Therefore, in this thesis we studied the pathogenesis of LPAIV H6 subtype in chickens experimentally immunosuppressed by infection with an Argentinean field CAV strain. The results obtained showed that, under our experimental conditions, Argentinean H6 AIVs have equal ability to infect chickens and be transmitted as a result of direct contact, either in immunocompetent chickens or immunosuppressed chickens with CAV. Overall, the results presented in this thesis allow cooperate with better risk analysis for the design of prevention and control strategies to protect commercial poultry farms in our country. Also, it has increased the information about the epidemiology of AIV in South America, critical to understand in greater depth the potential consequences of this disease in both wild birds and domestic poultry. In addition, it is noteworthy that avian influenza is a zoonosis, thereby our results increase the information available on this infectious agent which is relevant to the national public health system.

Carballeda, Juan Manuel. "Estudio de la relación del virus de la Bursitis Infecciosa con su hospedador. Análisis de la respuesta inmune y de la función y localización de la proteína viral VP5" (2015-03-25) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las aves representan un eslabón fundamental en la economía internacional. A nivel mundial, alrededor del 40% de la carne consumida es de origen aviar. La industria avícola ha experimentado en los últimos años un crecimiento muy importante tanto dentro del mercado local como del internacional, permitiendo ubicar a la Argentina en el octavo lugar como exportador mundial de carne de pollo junto con otros productos. El tipo de crianza intensiva utilizada dentro de la producción avícola facilita la aparición de factores que perjudican la estabilidad de los planteles, afectando si status sanitario. Por otra parte, tanto las enfermedades respiratorias como las inmunosupresoras suelen estar íntimamente asociadas con este tipo de crianza. El virus de la Bursitis Infecciosa Aviar (IBDV) es un patógeno de alta relevancia en la producción avícola debido a que causa, entre otros efectos, inmunosupresión, dejando así a los animales propensos a nuevas infecciones. El blanco principal del IBDV es la bursa de Fabricio, órgano exclusivo de las aves, donde se desarrollan y maduran los linfocitos B. En el presente trabajo de tesis doctoral se abordó el estudio de la respuesta inmune inducida por cepas de virulencia intermedia, habitualmente utilizadas como vacunas, en el hospedador natural. Se analizaron distintas facetas como la inducción de la expresión de citoquinas en distintos órganos, la capacidad de proliferación de linfocitos y las poblaciones celulares involucradas. Se estudiaron las vías de inoculación oral e intramuscular, habitualmente utilizadas en la vacunación comercial siendo la oral la vía de entrada natural del virus. Los resultados mostraron que altas dosis de virus de cepas intermedias son capaces de imitar efectos reportados con cepas de mayor virulencia como son: una fuerte infiltración de linfocitos T en la bursa de Fabricio (analizada por citpmetría de flujo), junto con una sobreexpresión de interleuquina 6 e inter ferón gama en este órgano (analizado por RT-PCR en tiempo real) e inmunosupresión (corroborada en ensayos de coinfección con otro agente viral aviar). La segunda parte del presente trabajo de tesis se abocó al estudio de la proteína no estructural VP5 de IBDV. Su función ha sido ampliamente discutida en la bibliografía respecto a su actividad apoptótica, ya que parece tener efectos opuestos en distintos estadíos del ciclo de replicación viral. Por otra parte, también existen reportes ambiguos respecto a su localización subcelular. En el presente trabajo, mediante ensayos in vitro y utilizando técnicas de Imaging, se determinó la localización de la proteína en la membrana plasmática no exponiendo ningún dominio al espacio extracelular, contradiciendo reportes que indicaban que se trataba de una proteína de transmembrana de clase dos. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis permitieron desarrollar un método de desafío sin utilizar cepas virulentas de IBDV. Asimismo se caracterizó una amplia variedad de efectos de cepas de virulencia intermedia del virus que, aunque son habitualmente utilizadas como vacuna, no habían sido descriptos hasta el presente trabajo de tesis. En la segunda parte, se determinó la localización de la proteína viral VP5. Estos resultados brindan un abanico de posibles mecanismos de acción de la misma, que luego de ser abordados posibilitarán el desarrollo de herramientas y estrategias sanitarias para combatir este importante patógeno aviar.

Abstract:
Birds play an important role in the international economy. Globally, about 40% of the meat consumed is of avian origin. In recent years, the poultry industry has exhibited a significant growth both in the local and international market, being Argentina the eighth largest exporter of chickens along with other avian products. The intensive breeding in poultry production facilitates the emergence of factors that affect the stability of the farms diminishing their health status. Moreover, both respiratory and immunosuppressive diseases are other closely associated with this type of production. Infectious bursal disease virus (IBDV) is a highly relevant avian pathogen in poultry production because it causes, among other effects, immunosuppression, leaving the animal susceptible to new infections. The main target of IBDV is the bursa of Fabricius, which is the organ where B-lymphocytes develop and mature. In the present work, we studied the immune response elicited by IBDV strains of intermediate virulence, commonly used as vaccines, in the natural host. Several parameters, such as the induction of cytokine expression in different organs, the ability of lymphocyte proliferation and the involved cell populations in inoculated chickens were analyzed. The oral and intramuscular routes, usually employed in conventional immunization procedures (the oral route being natural virus entry) were analyzed. The results showed that high doses of intermediate IBDV strains are able to mimic the effects caused by virulent strains, such as a strong infiltration of T lymphocytes in the bursa os Fabricius (assessed by flow cytometry), together with an overexpression of interleukin 6 and interferon gamma in this organ (analyzed by real time RT-PCR) and immunosuppression (demonstrated) by coinfection assays with another avian viral pathogen). The second part of this thesis focuses on the study of VP5, a non-structural protein of IBDV. Its role has been widely discussed in the literature regarding its apoptotic or anti-apoptotic function because it could have opposite effects at different stages of the viral replication cycle. Additionally, there are ambiguous reports concerning VP5 subcellular localization. By in vitro assays using Imaging techniques, we determined the localization of the protein in the plasma membrane of avian cells. Results showed that VP5 did not expose any domain to the extracellular space even though previous reports had indicated that it was a class two transmembrane protein. The results obtained in this thesis allowed the development of a method for viral challenge without using virulent strains of IBDV. Also, the characterization of a wide variety of effects induced by intermediated IBDV strains, which had not been described so far, although these strains are commonly used as a vaccine, were described. In the second part, the localization of VP5 viral protein was determined. Taken together, the results obtained in the present work provide a broad range of possible mechanisms of action for this protein that will contribute to the development of new sanitary tools and strategies to fight against this important avoan pathogen.

Carro, Ana Clara. "La entrada de virus dengue a líneas celulares humanas en la infección primaria en ausencia o presencia de anticuerpos" (2015-04-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Actualmente, casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de contraer virus dengue (DENV), agente patógeno que puede causar una infección aguda febril autolimitada o progresar a formas más severas de enfermedad, con una tasa de mortalidad de 2,5 %. A pesar de representar un grave problema para la salud pública, no existen vacunas ni quimioterapias disponibles para DENV. La entrada del virus a la célula huésped es una interesante estrategia antiviral ya que permite bloquear el comienzo de la infección viral. En el caso de DENV, sólo se ha estudiado hasta el presente el modo de entrada en líneas celulares epiteliales o fibroblásticas de mamíferos y de mosquito, con resultados controversiales. El presente trabajo de tesis se enfocó en el estudio del mecanismo de entrada de este patógeno a células mieloides humanas, más representativas de la infección natural, y la implicancia que pudiese tener en la quimioterapia antiviral. Mediante la utilización de inhibidores químicos de las distintas vías endocíticas, medida de infectividad por formación de placas, determinaciones de RNA viral por RT-PCR en tiempo real y técnicas de microscopía de fluorescencia y electrónica, se demostró que los dos serotipos DENV-1 cepa Hawaii y DENV-2 cepa NGC utilizan una vía clásica de endocitosis dependiente de clatrina y dinamina para entrar en células humanas U937, de origen monocítico, y K562, de origen ertitroleucémico. En la infección de ambas células en presencia de anticuerpos no neutralizantes anti-DENV, condiciones en que hay incremento de la infección in Vitro y pueden explicarse las formas más severas de la enfermedad in vivo, se observó que DENV-2 utiliza diferentes vías de entrada, mediadas o no por clatrina, según el receptor FcR involucrado en el proceso. También se evaluó en los mismos sistemas la actividad antiviral del carragenano , polisacárido sulfatado que inhibe la adsorción e internalización de DENV-2 en células Vero, encontrándose también una relación entre la susceptibilidad antiviral y el tipo de receptor empleado para la entrada mediada por anticuerpos. Finalmente, se realizó un estudio de la dependencia de colesterol para la infección con DENV, concluyendo que el contenido adecuado de colesterol en la envoltura viral, no así en la membrana celular, sería determinante para lograr la fusión de ambas membranas y alcanzar una infección productiva. La caracterización de la vía de entrada en células mieloides y el rol del colesterol viral aporta nueva información para comprender los factores involucrados en la infección de DENV y favorecer el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales más efectivas.

Abstract:
At present, a high proportion of world population is at risk of infection with dengue virus (DENV), a pathogen causing either a mild febrile illness or more severe forms of disease, with 2.5 % mortality. Although DENV represents a serious health problem worldwide, no specific chemotherapy or vaccine is currently available. Virus entry is an attractive antiviral strategy to block initiation of infection. For DENV, the mode of entry into the host cell has been studied only in fibroblastic or epithelial cell lines, derived from mammals or mosquitoes, with controversial results. In the present study, the entry of DENV into human myeloid cell lines, a model more representative of the natural infection, was analyzed as well as the relationship between mode of entry and antiviral susceptibility to sulfated polysaccharides. By using biochemical inhibitors of endocytic routes, infectivity titrations by plaque formation, viral RNA determinations by quantitative RT-PCR, fluorescence and electron microscopy, a clathrin- and dynamin-mediated endocytosis was demonstrated for entry of both serotypes DENV-2 strain NGC and DENV-1 strain Hawaii into human myelomonocytic U937 and erithroleukaemic K562 cell lines. When both cells were infected with DENV-2 in the presence of nonneutralizing anti-DENV antibodies, conditions which allow an enhancement of infection in vitro and lead to severe forms of disease in vivo, the route of entry was clathrin-mediated or not, according to the receptor FcR involved in the infective process. Furthermore, the antiviral activity in both cell systems of carrageenan, a sulfated polysaccharide known to inhibit DENV-2 adsorption and uncoating in Vero cells, was also evaluated. A relationship between antiviral susceptibility to carrageenan and the type of receptor employed for antibody-mediated entry was observed. Finally, studies about the cholesterol-dependence for DENV infection have shown that the envelope cholesterol is a critical factor in the fusion process for DENV entry whereas cell membrane cholesterol is not involved. The characterization of the mode of entry in myeloid cells and the role of viral cholesterol contributes to the knowledge of factors involved in DENV infection and the design and usage of new and more effective antiviral therapies.

Suyay Roldán, Julieta. "Interacciones de los Arenavirus Tacaribe y Junín con sus células hospedadoras en las etapas tempranas de la infección" (2015-05-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los arenavirus son virus envueltos con genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación tiene polaridad bisentido. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de pH. Una vez que la nucleocápside se encuentra en el citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside se denomina NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP), los cuales conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos del ciclo de multiplicación de los arenavirus Tacaribe (TCRV) y Junín (JUNV). Debido a que TCRV no utiliza el receptor de transferrina humano (hTfR) para entrar en las células, se utilizo un modelo de células que expresan diferencialmente el TfR y se analizaron las vías de entrada utilizadas por el virus. Para ello, se utilizaron inhibidores farmacológicos de las diferentes vías endocíticas (dependiente de clatrina, colesterol, dinamina, acidificación endosomal y macropinocitosis) y se confirmaron los resultados obtenidos utilizando construcciones dominantes negativas unidas a GFP de proteínas involucradas en cada una de ellas. Estos experimentos permitieron caracterizar que en aquellas líneas que no expresan el hTfR, la vía endocítica principal de entrada es la dependiente de clatrina, dinamina y acidificación endosomal mientras que en las células que si expresan dicho receptor, la vía principal es la macropinocitosis. La endocitosis del virus mediada por la unión a un receptor celular puede desencadenar diferentes señales intracelulares para beneficiarse de procesos celulares. En este trabajo estudiamos la participación de la autofagia durante la infección con JUNV en un modelo de células humanas. Se analizó la distribución de la proteína LC3 sobreexpresada (marcador de la vía de la autofagia), se utilizaron inhibidores farmacológicos y células con el gen Atg 5 mutado (esencial para la activación de la vía convencional de la autofagia). Los resultados obtenidos permitieron determinar que esta vía se activa desde el inicio de la infección y permanece activa hasta 24 hs post-infección. Los hallazgos presentados en este trabajo no sólo aportan conocimientos básicos sobre los pasos iniciales del ciclo de replicación de estos arenavirus, sino que además permite desarrollar nuevos blancos antivirales contra JUNV.

Abstract:
Arenavirus are enveloped viruses with a segmented RNA genome which replication cycle has a bisense polarity. The entry into the target cell depends on a receptor mediated endocitosis and a subsequent fusion pH dependant. Once the nucleocapsid is in the cytoplasm, 5 structural proteins are expressed. The majority nucleocapsid associated protein it is called NP. From one glycoprotein precursor (GPC), two glycoproteins are obtained called GP1 and GP2 and the signal peptide (SP) which they shape the claviforme structures found in the viral envelope. In this work, interactions virus-host cells were studied, characterizing the roll of different cellular proteins in the early stage of the Tacaribe (TCRV) and Junin (JUNV) Areniavirus multiplication cycle. Since TCRV does not use the human transferrine receptor (hTfR) to enter the cells, a model with a differential expression of the TfR was used and the pathways used by the virus were analyzed. In order to do that, pharmacological inhibitors of the different endocytic pathways (dependent on clathrin, cholesterol, dinamin, endosomal acidification and macropinocytosis) were used and the results obtained were confirmed using dominant negative tagged GFP constructions involved in each one of them. These experiments allowed us to characterize that in those cells that do not express the hTfR, the main endocytic pathway used by TCRV is the one dependent on clathrin, dinamin and endosomal acidification, while in those cells expressing this receptor, the main pathway is de macropinocytosis. Receptor mediated endocytosis used by the virus can unleash different intracellular signals in order to exploit different cellular processes. In this work we studied the autophagy involvement during the infection in a human cell line model. The distribution of the protein LC3 overexpressed (an autophagic marker) was analyzed. Pharmacological inhibitors of this pathway and Atg 5 gen mutated cells (essential for the conventional autophagy activation) were also used. Results obtained allow us to determine that this pathway is activated from the early steps of infection and remains active up to 24 hs post-infection. The findings presented in this work not only provides basic knowledge about the initial steps of these arenavirus replication cycles, but also allows to develop new antiviral targets against JUNV.

Rodríguez, María Cecilia. "Estudio del rol de la proteína de cápside del virus TMV-Cg en la modulación de la expresión génica y en la alteración de factores endógenos del hospedante Arabidopsis thaliana" (2015-12-03) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las enfermedades producidas por patógenos virales generan cuantiosas pérdidas en la producción de cultivos de importancia agropecuaria. El impacto de los virus en la alteración de la expresión génica explica, en parte, las reducciones en el rendimiento de estos cultivos. Por este motivo, entender los mecanismos por los cuales los virus modulan la expresión de genes del hospedante es de vital importancia para proponer estrategias antivirales efectivas o perfeccionar las que se están utilizando en la actualidad. En este estudio, se empleó una línea transgénica de Arabidopsis thaliana que expresa la proteína de cápside del virus TMV-Cg (CgCP) con el objetivo de estudiar el efecto de esta proteína en las alteraciones de la expresión génica y su concomitante impacto sobre los mecanismos de defensa. Inicialmente, se analizó el efecto de la CgCP sobre la expresión de genes implicados en vías de defensa, observándose que la CgCP modula negativamente la expresión de genes que participan de la vía de defensa mediada por ácido salicílico (SA, por sus siglás en inglés) y que, además, tienen un rol reportado frente a defensa antiviral. A continuación, se procedió a analizar el impacto global de la CgCp sobre el transcriptoma de A. thaliana por medio de un microarreglo realizado en plantas que expresan la CgCP. Los resultados indicaron que la CPCg altera la expresión de genes que están implicados en una amplia variedad de procesos. El uso de herramientas bio-informáticas permitió determinar que la CgCP regula negativamente la expresión de una red de genes que presentan en sus regiones promotoras motivos de respuesta a los factores de transcripción W-BOX y al factor Non-Expressor of PR 1(NPR1), un factor central en la vía del SA. Paralelamente, se observó que durante la infección con el virus TMV-Cg los genes dependientes de la vía de SA son incrementados a tiempos tempranos de infección, mientras que su expresión disminuye a tiempos tardíos. Por otra parte, se observó que la expresión de la CgCP en plantas de A. thaliana produce un retraso en el crecimiento. En base a estas observaciones, se procedió a estudiar la capacidad de la CgCP de alterar la estabilidad de las proteínas DELLA, las cuales están implicadas en la regulación de vías de desarrollo, como también en la supresión de la vía de defensa mediada por SA. Se observó que la proteína CgCP altera la estabilidad de la proteína RGA, una de las cinco proteínas DELLAs codificadas por el genoma de A. thaliana. Por otra parte, ensayos realizados con el virus TMV-Cg mostraron que el virus altera la estabilidad de otra proteína DELLA, la proteína GAI. Además, plantas mutantes para cuatro de los cinco genes que codifican proteínas DELLAs acumularon menores niveles del virus TMV-Cg que las plantas salvajes. En conclusión, los resultados de esta tesis muestran que la CgCP altera la expresión de un amplio conjunto de genes de A. thaliana. En particular, esta proteína modula negativamente un grupo de genes de defensa, dependientes de la vía de SA, a través de la estabilización de las proteínas DELLA. Estos resultados sugieren que la CgCP alteraría la estabilidad de las proteínas DELLAs como un mecanismo para modular negativamente las respuestas de defensa antivirales.

Abstract:
Phytopathogenic viruses produce significant losses on economically important crops species. Those losses are mostly dependent on the alterations of gene expression during viral infections. Consequently, the study of the virus-induced alterations in the gene expression profile is important for the development of strategies to reduce the losses caused by plant virus. In this study we used transgenic Arabidopsis plants that express the capsid protein of TMV-Cg (CgCP) with the aim of studying alterations in gene expression and defense mechanisms. First, we studied a subset of genes involved in antiviral defense pathways that are regulated by salicylic acid (SA), and found that CgCP negatively modulates the SA mediated defense pathways. Then, we studied the global impact of CgCP expression in the A. thaliana’s transcriptome. The results indicate that the CgCP alters the expression of genes that are involved in a wide range of processes. By means of the use of bioinformatic tools, we found CgCP negatively regulates a gene network dependent on Non-Expressor of PR 1(NPR1), which is a central player in the SA mediated response. In parallel, we observed that the expression of this set of genes is also altered during TMV-Cg virus infection. The expression is up-regulated at early time post infection and downregulated at late time of TMV-Cg infection. Also, we observed that the CgCP expression reduces plant growth of A. thaliana. Based on these data, we proceeded to study the alterations of DELLA proteins by CgCP, which are involved in the regulation of development and defense pathways. We found that the CgCP alters the stability of RGA, which is one of the five DELLA proteins codified by A. thaliana. Furthermore, the stability of DELLAs proteins was altered during the TMV-Cg infection. Moreover, it was observed that DELLA proteins negatively modulated the defense transcript profiles during TMV-Cg infection. As a result, TMV-Cg accumulation was significantly lower in the quadruple-DELLA mutant Arabidopsis plants than in wild type plants. Taken together, in this study we demonstrated that CgCP alters the expression of genes involved in a wide range of processes, particularly, negatively regulates the salicylic acid-mediated defense pathway by stabilizing the DELLA proteins. These results suggest that CgCP alters the stability of DELLAs as a mechanism of negative modulation of antiviral defense responses.

Forlenza, María Belén. "Eventos tempranos del ciclo de replicación del virus Junín: interacción del virus con lectinas del tipo C" (2016-03-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus Junín (JUNV) es el agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina (FHA), una enfermedad zoonótica que afecta el área central de la Pampa húmeda de la República Argentina. Distintos mecanismos de endocitosis son utilizados en las infecciones virales. En la línea celular Vero, el complejo glicoproteico presente en los viriones es el responsable de las interacciones iniciales con el receptor celular de transferrina 1 (TfR1) y la entrada a la célula es por endocitosis mediada por vesículas recubiertas de clatrina. En varias familias de virus envueltos, su entrada y diseminación pueden estar mediadas por lectinas de tipo C. Las mismas son proteínas transmembrana tipo 2, constituyen una amplia familia de receptores que reconocen estructuras específicas de carbohidratos presentes en patógenos y se encuentra presente principalmente en células dendríticas inmaduras, macrófagos y células endoteliales. Una de ellas, DC-SIGN posee un rol importante en los estadios iniciales de la respuesta inmune, reconoce estructuras internas ramificadas de manosas y posee funciones de receptor para varios virus. DC-SIGN se compone por un dominio extracelular de reconocimiento a carbohidratos (DRC) que une residuos con carbohidratos de alta manosa y una cola citoplasmática con motivos conservados de dileucinas (LL) y un cluster triacídico (EEE). Debido a que JUNV presenta proteínas altamente glicosiladas, y que en los estadíos de la infección temprana interactuaría con células dendríticas y otras del sistema inmune, en este trabajo se estudió la interacción de JUNV con DC-SIGN y el mecanismo endocítico asociado a la misma. Los resultados demuestran que DC-SIGN actúa como un auténtico receptor para JUNV en las células que la expresan y que la entrada a las mismas es a través de endocitosis utilizando vesículas recubiertas de clatrina con dependencia de colesterol y filamentos de actina corticales intactos.

Abstract:
Junin Virus (JUNV) is a member of the Arenaviridae family and the etiologic agent of Argentine Hemorrhagic fever (AHF), a zoonotic illness affecting the farming land of Argentina. Several endocytic pathways are used during viral infections. In Vero cell line, the glycoprotein complex present in virions is responsible of interaction with Transferrin receptor type I (TfR1) and internalization is clathrin mediated. Entry and dissemination of several envelope viruses are mediated by C-type lectins. These are transmembrane proteins that are expressed in immature dendritic, macrophages and endothelial cells, integrating a family of receptors which recognize specific carbohydrates present in pathogens. One of them, Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Nonintegrin (DC-SIGN) has an important role during the initial stages of the immune response, recognizes high mannose residues and is considered as a receptor for several viruses. DC-SIGN is composed by an extracellular carbohydrate recognition domain (CRD) and a cytoplasmic tail containing conserved motives as dileucine (LL) and triacidic cluster (EEE). As JUNV presents highly glycosylated proteins and that during initial steps of the infection, JUNV would interact with dendritic cells and others belonging to the immune system, in this work we studied the interaction between JUNV and DC-SIGN and the entry pathway associated with this. Taken together our results demonstrate that DC-SIGN is a real receptor for JUNV and that the main entry pathway involved is clathrin mediated endocytosis and it depends on cholesterol and intact cortical actin filaments.

Peña Cárcamo, José Rafael. "Viperina, un factor de restricción en la infección con el arenavirus Junín" (2016-03-23) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Viperina (VIP) es una proteína cuya expresión es inducida por interferón (IFN) y se ha reportado como factor de restricción viral de diversos virus. En el presente trabajo se analizó por primera vez la acción antiviral de viperina en células A549 sobre la multiplicación del virus Junín (JUNV). Asimismo, se analizó la importancia de las estructuras lipídicas en el ciclo de mutiplicación de JUNV y la localización subcelular en la cual VIP ejerce su acción antiviral. Mediante distintos ensayos se pudo comprobar que la respuesta de IFN/VIP se encuentra activada en las células A549 infectadas con JUNV. Del análisis de sobreexpresión de VIP se confirmó que esta proteína tiene un efecto antiviral sobre la multiplicación de JUNV. Cabe destacar que los aumentos de los niveles relativos de mRNAs/proteínas VIP encontrados se correlacionan con la progresión de la infección con JUNV. Interesantemente, las estructuras lipídicas denominadas lipid droplets (LDs) se observaron aumentadas tanto en número como en tamaño en los cultivos infectados con JUNV. Por otro lado, la disminución de los LDs afectó negativamente la producción de viriones extracelulares, y las imágenes de microscopía revelaron que en las células infectadas las nucleoproteínas virales se encuentran cerca de los LDs, lo que sugiere que los complejos de replicación de JUNV podrían estar utilizando estas estructuras. Por último, los estudios de localización en membrana plasmática de las glicoproteínas virales sugieren que la acción de VIP no sería directamente en membrana pero sí podría ser a través de un paso previo relacionado con el transporte de glicoproteínas a microdominios rafts. En su conjunto, estos resultados no solamente incrementan el conocimiento sobre la biología del arenavirus Junín, sino que ofrece un nuevo blanco para la intervención del ciclo de replicación y la búsqueda de agentes quimioterapéuticos específicos.

Abstract:
Viperin (VIP) is a cellular protein induced by interferon (IFN) reported as restriction factor for several viruses. In the present work and for the first time it has been analyzed viperin antiviral action in A549 cells infected with Junín virus (JUNV). The importance of cellular lipidic structures in JUNV multiplication and putative subcellular localization where VIP action could take place, were also studied. Different assays showed that IFN/VIP response is activated in A549 cells upon JUNV infection. Overexpression of VIP showed to exert a strong antiviral effect on JUNV multiplication. In this line relative amounts of mRNA/protein levels correlate with the progression of JUNV infection. Interestingly, lipid droplets structures (LDs) in infected cells were augmented both in numbers and size. Accordingly diminished of LDs negatively affected extracellular virion production. Microscopy analysis revealed viral nucleoproteins close to LDs, suggesting that viral replication complexes may make use of these structures. Finally, immunofluorescense assays and localization studies showed that the viral glycoproteins is almost absent from plasma membrane suggesting that VIP action might be exerted in an indirect fashion through lipids rafts negative modulation. All together these results enlighten the knowledge about the biology of the arenaviruses and additionally reveal a very new and interesting target for the intervention design and screening of specific chemotherapeutic agents to combat JUNV.

Villordo, Sergio Manuel. "Estudios de estructuras de ARN que regulan la replicación del virus del dengue en humanos y mosquitos" (2016-04-11) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus de dengue es el principal patógeno humano transmitido por mosquitos para el cual aún no existen tratamientos antivirales efectivos. El genoma viral es una molécula de ARN compuesta por un único marco de lectura abierto flanqueado por las regiones 5' y 3' no codificantes. Mediante la manipulación genética de clones infecciosos y ensayos funcionales hemos, demostrado que la estructura del ARN en los extremos del genoma es dinámica y que la formación regulada de conformaciones alternativas es necesaria para la síntesis del ARN viral en células de mamíferos. Experimentos complementarios en células de mosquito confirmaron además la importancia de este fenómeno en ambos hospedadores y permitieron detectar una secuencia en el extremo 3' del genoma que funciona como un determinante específico para la replicación del virus en insectos. Por otro lado, la combinación de estudios de mapeo químico y análisis de conservación de la región 3' no codificante han revelado la existencia de estructuras de ARN que se mantienen conservadas entre distintos flavivirus transmitidos por insectos. El análisis de esta región mediante experimentos de adaptación en células y técnicas de secuenciación masiva ha permitido caracterizar una estructura de ARN que se adapta de manera diferencial durante la infección en mosquitos y mamíferos. Además a través de ensayos de mutagénesis dirigida y el estudio del fitness viral en células y mosquitos adultos se demostró que la duplicación de dicha estructura facilita la alternancia de hospedadores con requerimientos diferentes. En conjunto los resultados de esta tesis proveen nuevos conocimientos sobre la biología del dengue de posible utilidad para el desarrollo racional de estrategias antivirales. Asimismo, la información aquí presentada permitirá entender aspectos epidemiológicos y evolutivos de virus de ARN transmitidos por insectos con relevancia en salud pública.

Abstract:
Dengue virus is the most important mosquito-borne human pathogen for which there are no vaccines and no effective antiviral treatments available. The viral genome is an RNA molecule coding for a single open reading frame flanked by highly structured 5' and 3' non coding regions. Using infectious clones and evaluating replication of recombinant viruses, we have demonstrated that the ends of the viral genome are dynamic and that the regulation of alternative conformations of the viral RNA is crucial for infectivity. Additional experiments using mosquito cells confirmed the relevance of our findings for mosquito and human hosts, and allowed the identification of specific sequence requirements for viral replication in insects. Furthermore, by combining chemical probing and sequence conservation analysis of viral 3' non coding regions, the existence of RNA structure motifs that are conserved in mosquitoborne flaviviruses was demonstrated. In this regard, new models and patterns of 3’UTR conservation among all known flaviviruses were constructed. Employing host adaptation assays and deep sequencing analysis, different viral populations were characterized from distinct hosts. Interestingly, the sequence variations detected modified the secondary structure of a single RNA structure. Mutational analysis and virus fitness measurements in mosquito cells and infected mosquitoes showed the requirement of RNA structure duplication as a mechanism to maintain high viral fitness during host mosquito-human switch. Together, these results provide new knowledge about dengue virus biology useful for rational development of antiviral strategies. Importantly, in these studies we present new mechanisms of virus-host adaptation that will help the understanding of epidemiological and evolutionary aspects of viral pathogens transmitted by insects.

Gantuz, Magdalena. "Identificación y caracterización molecular y funcional de variantes de la Proteína Latente de Membrana 1 del virus de Epstein Barr" (2016-08-24) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Virus de Epstein Barr (EBV), agente etiológico de la mononucleosis infecciosa (MNI), se asocia también a neoplasias. Si bien las causas por las cuales contribuye a la linfomagénesis están aún en estudio, la identificación de variantes virales asociadas a tumores podrían responder en parte este interrogante. Dado que LMP1 es la principal proteína oncogénica de EBV, el objetivo fue identificar y caracterizar las variantes moleculares en sus regiones promotora y codificante, y determinar su participación en la patogenia de las enfermedades asociadas. Se incluyeron 29 pacientes pediátricos con linfomas asociados a EBV, 30 con MNI y 14 controles con hiperplasia reactiva. Se amplificaron mediante PCR las regiones promotora ED-L1 y codificante, se secuenciaron y se realizó análisis filogenético. Se analizó además in vitro la actividad del promotor. Región ED-L1: se definieron 4 clados denominados según las líneas celulares B95.8, Cao, Raji and P3HR1. B95.8 fue el más frecuente (47%), pero no se asoció a a ninguna patología en particular. Se observaron mutaciones en sitios de unión a factores de transcripción, la pérdida del C/EBP disminuye 3 veces la actividad de ED-L1. Región codificante: se identificaron 6 clados (China1, China2, Med-, Alaskan, B95.8 and Argentina ) de los cuales prevaleció la variante de circulación local, Arg, (46%) potencialmente originada por recombinación Raji/China1 y que podría tener un origen africano. No se observó una asociación entre variantes específicas y linfomagénesis, aunque algunos polimorfismos tuvieron mayor frecuencia en linfomas. Se estimó una tasa de evolución acelerada en comparación a lo esperado para un herpesvirus, quizás influenciado por la presión de selección positiva sobre codones específicos. Este análisis muestra una evolución compleja de este gen y revela la importancia de su potencial utilización como marcador de variantes virales geográficas.

Abstract:
Epstein Barr virus (EBV), the etiological agent of infectious mononucleosis, is also associated with neoplasia. Little is known about variants prevalence and their influence in EBV diseases. Our aim was to study viral LMP1 variant distribution among children with EBV+ malignant and benign conditions as well as healthy carriers. Oral secretions (OS) and blood cells (PBMC) from 30 children with IM, and biopsies from 14 EBV+ reactive hyperplasia (RH) and 29 EBV+ lymphomas (L) were included. LMP1 sequences were amplified by nested PCR. Sequencing and phylogenetic analysis was performed. Promoter activity was assayed in EDL1 variants. ED-L1: Phylogenetic reconstruction defined 4 clades termed after B95.8, Cao, Raji and P3HR1. B95.8 clade was the most frequent (47%), but it was not associated with any particular condition. Mutations were found in transcription factor binding sites; the abolition of C/EBP caused a 3-fold diminish in EDL1 activity. Coding region: 6 clades were defined (China1, China2, Med-, Alaskan, B95.8 and Argentine (Arg)). Arg clade, the most prevalent (46%), proved to be a Raji and China1 recombinant. No pathology or compartment associations were observed for LMP1 variants, however some polymorphisms presented a higher prevalence in lymphoma patients. Viral evolutionary rate estimated from LMP1 was faster than the expected for a herpesvirus, perhaps due to positive selection influence. These results contribute to the knowledge of EBV genetic diversity and evolution. LMP1 appears to have a complex evolution pattern and reveals the importance of its potential use as a marker of geographical viral variants.

Esteva, María Jimena. "Caracterización funcional de virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV) quiméricos expresando diferentes dominios de la proteína cápside del virus de la inmunodeficiencia de felinos (FIV)" (2016-12-12) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La formación de partículas lentivirales resulta de la multimerización de la poliproteína Gag, la cual contiene toda la información necesaria para autoensamblarse y brotar al medio extracelular a través de la membrana plasmática. Durante la maduración de los viriones, la proteína cápside (CA), que corresponde al dominio central de Gag, se condensa generando el core viral que preserva la integridad del complejo ribonucleoproteico requerido para iniciar un nuevo ciclo de replicación viral. Los virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV) y de felinos (FIV) son dos lentivirus evolutivamente distantes cuyas proteínas CA no han sido aún estudiadas. Con el objeto de establecer la relación funcional entre los dominios CA de SIV y de FIV, construimos SIV quiméricos en los cuales la región codificante para la CA fue parcial o totalmente reemplazada por su equivalente de la CA de FIV. La caracterización fenotípica de las quimeras nos permitió agruparlas en tres categorías: un grupo formado por virus quiméricos capaces de ensamblarse en viriones, pero cuya maduración causa la inestabilidad de la CA de FIV; un segundo grupo representado únicamente por el SIV quimérico llevando el dominio N-terminal (NTD) de la CA de FIV y que exhibe un fenotipo de ensamblado defectivo; y un tercer grupo formado por los virus quiméricos que se ensamblan en viriones exhibiendo una CA de FIV madura estable, que incorporan la glicoproteína de envoltura, y que contienen niveles salvajes del ARN genómico viral y de la transcriptasa reversa. Sin embargo, este último grupo de SIV quiméricos resultó ser no infeccioso debido a defectos en alguna etapa posterior a la entrada viral. Por otra parte, demostramos que el dominio C-terminal (CTD) de la CA de FIV presenta la capacidad intrínseca de dimerizar in vitro y de formar oligómeros de alto peso molecular. Esto, junto con nuestros resultados que muestran que el CTD de la CA de FIV es suficiente para el ensamblado de la poliproteína quimérica Gag de SIV, provee evidencia de que el CTD de la CA exhibe mayor plasticidad funcional que el NTD. En su conjunto, nuestros resultados aportan información relevante sobre la homología funcional entre los dominios CA de las poliproteínas Gag de los lentivirus de primates y de no primates y contribuyen a nuestro conocimiento sobre cómo han evolucionado los requerimientos para el ensamblado de viriones infecciosos en los retrovirus.

Abstract:
The formation of lentiviral particles results from the multimerization of the Gag polyprotein, which contains all the information necessary for its self-assembly and budding into the extracellular medium. During virion maturation, the capsid (CA) protein, which corresponds to the central domain of Gag, generates the core structure that preserves the integrity of the ribonucleoprotein complex required to initiate a new round of viral replication. The simian and feline immunodeficiency viruses (SIV and FIV, respectively) are two evolutionarily distant lentiviruses whose CA proteins have not as yet been studied. To gain insight into the functional relationship between the SIV and FIV CA domains, we constructed chimeric SIVs in which the CA-coding region was partially or totally replaced by the equivalent region of the FIV CA. The phenotypic characterization of the chimeras allowed us to group them into three categories: the chimeric viruses that, while being assembly-competent, exhibit a virionassociated unstable FIV CA; a second group represented only by the chimeric SIV carrying the N-terminal domain (NTD) of the FIV CA which proved to be assemblydefective; and a third group constituted by the chimeric viruses that produce virions exhibiting a mature and stable FIV CA protein, and which incorporate the envelope glycoprotein and contain wild-type levels of viral genome RNA and reverse transcriptase. However, further analysis of the latter group of chimeric SIVs demonstrated that they are non-infectious due to a post-entry impairment. Furthermore, we show that the carboxyl-terminus domain (CTD) of the FIV CA has an intrinsic ability to dimerize in vitro and form high-molecular-weight oligomers, which, together with our finding that the FIV CA-CTD is sufficient to confer assembly competence to the resulting chimeric SIV Gag polyprotein, indicates that the CA-CTD exhibits more functional plasticity than the CA-NTD. Taken together, our results provide relevant information on the functional homology between the CA domains of primate and nonprimate lentiviral Gag polyproteins and contribute to our understanding of how the requirements for the assembly of infectious virions have evolved among retroviruses.

Maffey, Lucía. "Prevención y tratamiento de Rotavirus A mediante nanoanticuerpos VHH anti-VP6" (2016-12-16) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La diarrea asociada a Rotavirus A (RVA) representa una de las principales causas de mortalidad infantil a nivel mundial. Si bien la vacunación masiva contra RVA ha logrado disminuir significativamente las muertes causadas por este patógeno, la disponibilidad y la eficacia de las vacunas en zonas de bajos recursos es limitada. Por otra parte, el manejo clínico de la infección por RVA se basa en la administración de Sales de Rehidratación Oral (SRO), mientras que las opciones terapéuticas específicas resultan limitadas. El principal objetivo de este trabajo fue estudiar y optimizar la utilización de dos fragmentos correspondientes a la porción variable de anticuerpos de cadena pesada derivados de llama (VHH) dirigidos contra la proteína VP6 – 2KD1 y 3B2– para la prevención y el tratamiento de la diarrea asociada a RVA y comparar su eficacia respecto de otras opciones terapéuticas disponibles. En primer lugar, se analizó la eficacia de ambos clones de VHH anti-VP6 para la prevención y el tratamiento de la diarrea inducida por RVA en un modelo de ratón (BALB/c) lactante inoculado con una cepa virulenta de RVA murino (EcW, G16PI7). En el tratamiento profiláctico, los VHH fueron administrados oralmente dos horas antes de la inoculación viral mientras que en el tratamiento terapéutico, los VHH fueron administrados oralmente luego de la inoculación viral, tanto en forma previa a la aparición de los síntomas (pre-sintomático) como luego de la ocurrencia de diarrea (post-sintomático). En todos los casos, ratones lactantes de cuatro días de vida fueron inoculados con 1778 DD50 (Dosis Diarrea 50) de RVA murino a los 0 Días Post Inoculación (DPI) y examinados diariamente para determinar la ocurrencia de diarrea y recolectar muestras de heces. Los ratones tratados y el control no tratado fueron sacrificados en forma secuencial entre los 0 y los 6 DPI para el tratamiento profiláctico y los 0 a 7 DPI en el caso de los tratamientos terapéuticos pre y post-sintomáticos. Luego de la eutanasia, se colectaron muestras de intestinos y de suero. 1. Ensayos profilácticos. Se evaluó la eficacia de dos dosis de VHH, utilizando cuatro camadas de ratones lactantes para cada tratamiento diario: 160 μg de 2KD1+3B2 (N = 31) y 200 μg de 2KD1+3B2 (N = 30). En ambos casos, el tratamiento comenzó a los -1 DPI y continuó hasta los 6 DPI. En el DPI 0, los VHH fueron administrados dos horas antes de la inoculación viral. Los controles incluidos fueron ratones inoculados no tratados (control no tratado) y ratones no inoculados (control normal). 2. Ensayo terapéutico pre-sintomático. Se evaluaron cuatro tratamientos orales: 160 μg de 2KD1+3B2 (80 μg de cada uno) (N = 25), 200 μg de 2KD1+3B2 (100 μg de cada uno) (N = 28), 200 μg de 3B2 (N = 24), 200 μg de 2KD1 (N = 30). Para ambos ensayos, se determinó también la presencia de anticuerpos anti-RVA en muestras de sueros e intestino a los 0, 7 y 40 DPI. Asimismo, se evaluó el surgimiento de una respuesta inmune humoral contra el tratamiento de VHH por medición de anticuerpos anti-VHH intestinales y séricos a esos tiempos y el posible surgimiento de mutantes virales de escape al tratamiento mediante PCR, secuenciación completa y análisis filogenéticos del gen codificante de VP6 en muestras de intestinos y heces positivas para RVA luego de 4-6 días de tratamiento. Los resultados obtenidos mostraron que ambas dosis profilácticas de 2KD1+3B2 redujeron significativamente la duración y la severidad de la diarrea al igual que el título infeccioso en intestino y la excreción viral en heces. En relación al tratamiento terapéutico pre-sintomático, la administración conjunta de 2KD1 y 3B2 (200 μg) redujo significativamente la duración y severidad de la diarrea, la infección intestinal y la excreción fecal en relación al grupo no tratado. Mientras que la misma dosis de 2KD1 o 3B2 (200 μg) también redujo la duración de la diarrea por RVA con respecto al control, 2KD1 resultó más efectivo en la disminución de la infección intestinal y la excreción de RVA en heces. Si bien ambos clones presentaron amplia actividad neutralizante contra diferentes cepas de RVA in vitro, el clon 2KD1 requirió menores concentraciones que 3B2 para neutralizar algunas variedades, en particular la cepa de RVA murino usada en los ensayos previos. Asimismo, 2KD1 presentó valores de afinidad por las partículas de RVA tres veces mayor que 3B2 (EC50). Ni el tratamiento profiláctico ni el tratamiento terapéutico pre-sintomático con VHH anti-VP6 interfirieron con la respuesta inmune humoral del hospedador frente a RVA. Tampoco se detectaron mutantes virales de escape al tratamiento a nivel de la proteína VP6 en ningún caso. Tratamiento terapéutico post-sintomático. En este caso, los ratones fueron inoculados con 1778 DD50 de RVA murino al cuarto día de vida como ya fuera descripto y recibieron un tratamiento diario de 200 μg de 2KD1 a partir de los 2 DPI, cuando todos los ratones presentaban diarrea, hasta los 7 DPI. El tratamiento terapéutico post-sintomático con 200 μg de 2KD1 redujo la infección intestinal por RVA y la excreción viral en heces en relación al control no tratado. Aunque hubo una tendencia a reducir la duración de los síntomas, las diferencias no fueron significativas. Con el objetivo de evaluar la prevención de la diarrea por RVA en un modelo de administración continua de los VHH, se realizó un nuevo ensayo involucrando ratonas transgénicas que expresaban los VHH anti-VP6 (2KD1+3B2) en leche materna, regulados bajo el promotor del Virus de Tumor Mamario Murino. En este caso, los ratones fueron inoculados a los cuatro días de vida con una dosis menor de RVA murino (800 DD50) y se utilizaron cuatro camadas de ratones transgénicos amamantados por madres transgénicas y cuatro camadas de ratones wild type amamantados por madres wild type como control. Para descartar que la transgénesis de los ejemplares pudiera tener un efecto sobre el desarrollo de la enfermedad por RVA, se efectuó un ensayo de cross-fostering en el cual las progenies de cuatro madres transgénicas fueron amamantadas por madres wild type y viceversa. Los ratones transgénicos alimentados por madres transgénicas presentaron una menor prevalencia de diarrea a los 3, 4 y 7 DPI en relación al control. A los 8 DPI, estos ratones habían resuelto por completo el cuadro clínico. Asimismo, redujeron la infección intestinal por RVA y la excreción viral en heces en comparación con el control. Con respecto a los ensayos de cross-fostering, los resultados obtenidos fueron contradictorios. Si bien los ratones wild type amamantados por madres transgénicas redujeron la prevalencia y duración de la diarrea en relación a los ratones amamantados por madres wild type como se esperaba, presentaron mayores títulos infecciosos en el intestino y una mayor excreción viral fecal. Con el propósito de comparar la eficacia de la administración oral de VHH anti-VP6 con otras opciones terapéuticas disponibles para tratar la diarrea por RVA, se realizó un último experimento en el modelo de ratón lactante infectado con 1778 DD50 de RVA murino para comparar la eficacia de los nanoanticuerpos con dos drogas sintéticas (nitazoxanida, crema de bismuto) y dos hierbas aromáticas usadas tradicionalmente para el tratamiento de la diarrea (Aloysa citrodora, Piper aduncum): 2KD1+3B2 (50 mg/kg) + SRO, 2KD1(50 mg/kg) + SRO, nitazoxanida (15 mg/kg), crema de Bismuto (750 mg/kg), A. citrodora (infusión, 2 g/kg); P. aduncum (infusión, 2 g/kg). En este caso, los VHH fueron disueltos en SRO dado que la adición de este excipiente aumentaba significativamente la resistencia proteolítica frente a enzimas gástricas. A excepción de los ratones tratados con nitazoxanida, los restantes tratamientos redujeron significativamente la duración y la severidad de la diarrea por RVA en relación al control no tratado. En relación a los títulos infecciosos a nivel intestinal, los ratones tratados con VHH anti-VP6, crema de Bismuto y nitazoxanida disminuyeron la severidad de la infección mientras que aquellos tratados con A. citrodora y P. aduncum no mostraron mejoras. La excreción viral en heces sólo se redujo en los ratones tratados con VHH y nitazoxanida pero no se apreciaron diferencias significativas en el resto de los tratamientos. El presente trabajo de tesis muestra que la administración oral de VHH anti-VP6 constituye, no sólo un tratamiento profiláctico efectivo frente a la diarrea asociada a RVA, sino también una herramienta terapéutica eficaz y segura contra la infección por este virus, incluso luego de la aparición de los primeros síntomas. En este sentido, la terapia oral con VHH anti-VP6 representaría un mejoramiento considerable en relación a otras opciones terapéuticas disponibles actualmente. Asimismo, los VHH anti-VP6 podrían ser empleados como una estrategia complementaria a la vacunación, especialmente en poblaciones que han mostrado menor eficacia de inmunización. En términos generales, el uso de anticuerpos VHH dirigidos contra VP6 presenta un enorme potencial para su implementación en pacientes inmunocomprometidos y en países de bajos recursos, donde la mortalidad por RVA continúa siendo elevada y las actuales vacunas muestran menor eficacia.

Abstract:
Species A Rotaviruses (RVA) remain a worldwide leading cause of child mortality. Although extensive vaccination has achieved a significant reduction in RVA-associated deaths, vaccine efficacy in some impoverished areas remains low. On the other hand, mainstay clinical management of RVA-associated diarrhea consists of Oral Rehydration Solution (ORS) administration whereas specific therapeutic options are limited. The main goal of this study was to assess and optimize the use of two VP6-specific llama-derived heavy chain antibody fragments (VHH) -2KD1 and 3B2- in the prevention and treatment of RVA-associated diarrhea and to compare the obtained results with other available therapeutic options against the disease. We first assessed the efficacy of two VP6-specific llama-derived heavy chain antibody fragments (VHH) -2KD1 and 3B2- as an oral prophylactic and therapeutic treatment against RVAinduced diarrhea in a neonatal BALB/c mouse model inoculated with virulent murine RVA (ECw strain, G16PI7). Prophylactic treatment was administered two hours prior to inoculation whereas therapeutic treatment was delivered after viral inoculation, both prior to the symptoms (presymptomatic) and once diarrhea had already occurred (post-symptomatic). In all cases, four-day old pups were inoculated with 1778 DD50 murine RVA at PID 0 (Post Inoculation Day 0) and examined daily to assess occurrence of diarrhea and collect feces. Control and treated mice were euthanized sequentially from PID 0 to 6 for prophylactic groups and from PID 0 to 7 for pre-symptomatic and post-symptomatic therapeutic groups. After sacrifice, sera and intestinal samples were collected. Prophylactic assays: the efficacy of two doses of VHH was assessed, using four litters of suckling mice for each daily treatment: 160 μg of 2KD1+3B2 (N = 31) and 200 μg of 2KD1+3B2 (N = 30). In both cases the treatment started on PID -1 and was administered until PID 6. On PID 0, the VHH were administered 2 hours prior to viral challenge. Controls included: untreated ECw RVAinoculated mice (untreated control group); untreated and not RVA-inoculated mice (normal control group). Pre-symptomatic therapeutic assays: In order to study the therapeutic effect of 2KD1 and 3B2 against RVA-induced diarrhea, treatment administration started at PID 1 and four VHH daily treatments were tested from PID 1 to 7: 160 μg of 2KD1+3B2 (80 μg of each) (N = 25), 200 μg of 2KD1+3B2 (100 μg of each) (N = 28), 200 μg of 3B2 (N = 24), 200 μg of 2KD1 (N = 30). Included controls were the same as before. For both assays, anti-RVA murine antibodies (Abs) were determined in sera and intestinal samples at PID 0, 7 and 40. Occurrence of an immune response against the VHH was examined by measuring anti-VHH Abs titers at PID 0, 7 and 40 in sera and intestinal samples of treated mice and possible uprising of viral escape mutants to the treatment was assessed by PCR, complete sequencing and phylogenetic analyses of VP6. Prophylactic administration of both doses of 2KD1+3B2 successfully reduced diarrhea duration and severity as well as intestinal RVA titers and fecal shedding of viral particles. Joint presymptomatic therapeutic administration of 2KD1+3B2 (200 μg/dose) successfully reduced diarrhea duration, RVA infection severity and virus shedding in feces. While the same dose of 2KD1 or 3B2 (200 μg) significantly reduced duration of RVA-induced diarrhea, 2KD1 was more effective in diminishing the severity of intestinal infection and RVA shedding in feces. Although both clones showed extensive neutralizing properties against a wide range of RVA strains, 2KD1 required lower concentrations than 3B2 to neutralize some of them, particularly the murine RVA strain used in mice assays. Also, 2KD1 evidenced a three-fold higher affinity for RVA particles (EC50) than 3B2. Neither prophylactic nor pre-symptomatic therapeutic administration of the VHH interfered with the host’s humoral immune response against RVA. No viral escape mutants to the VHH treatment were detected. Post-symptomatic therapeutic assays: Mouse pups were also inoculated at PID 0 with 1778 DD50 of murine ECw RVA as described and received a daily dose of 200 μg of 2KD1 from PID 2, at which time all mice in the group had already developed diarrhea, to PID 7. When 2KD1 (200 μg) was administered after diarrhea development, it also significantly reduced RVA intestinal infection and fecal shedding. Although treated mice showed a trend towards reducing diarrhea duration, differences with the control group were not significant. In order to assess the prevention of RVA-induced diarrhea in a model of continuous administration of the VHH, a new assay was conducted, involving transgenic mice that expressed anti-VP6 VHH 2KD1+3B2 in maternal milk regulated under the MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) promoter. In this case, four-day old mice were inoculated with a lower dose of murine RVA (800 DD50) given that VHH levels in maternal milk were lower than in oral treatment experiments. Four litters of transgenic mice fed by transgenic dams were used and four litters of wild type mice fed by wild type dams were employed as control. In order to discard that the transgenesis per se could have an effect on the development of RVA disease, a cross- fostering assay was conducted. In this case transgenic pups were fed by wild type dams and vice versa. Neonatal transgenic mice fed by transgenic mothers showed lower severe diarrhea prevalence than the wild type control at PID 3, 4 and 7 and by PID 8 all mice in this group had resolved the symptoms completely. Pups nursed by transgenic dams also reduced intestinal infection with RVA and viral shedding in feces when compared with the control. Regarding cross-fostering experiments, the obtained results were inconsistent. Although mice nursed by transgenic dams successfully reduced diarrhea prevalence when compared with mice nursed by wild type dams, as expected, they showed higher intestinal infection and higher fecal shedding. To establish if oral administration of anti-VP6 VHH represents an improvement regarding current clinical management of RVA-associated diarrhea, a last experiment in the neonatal mouse model was conducted to compare the efficacy of the VHH against two synthetic drugs (nitazoxanide, Bismuth salicylate) and two aromatic herbal compounds used in folk medicine for the treatment of diarrhea (Aloysa citrodora, Piper aduncum): 2KD1+3B2 (50 mg/kg) + ORS; 2KD1(50 mg/kg) + ORS, nitazoxanide (15 mg/kg), Bismuth salicylate (750 mg/kg), A. citrodora (infusion, 2 g/kg); P. aduncum (infusion, 2 g/kg). In this case, anti-VP6 VHH were administered with ORS given that the addition increases proteolytic resistance to gastric enzymes. Four-day old mice were inoculated with 1778 DD50 of murine RVA and assessed daily as described before. The obtained results showed that, with the exception of mice treated with nitazoxanide, all other treatments achieved a significant reduction in diarrhea duration and severity when compared with the untreated control. Regarding intestinal RVA titers, mice administered with anti-VP6 VHH, Bismuth salicylate and nitazoxanide diminished the severity of the infection whereas mice treated with aromatic herbs showed no improvement. Similarly, fecal RVA shedding was only significantly reduced in mice receiving VHH and nitazoxanide but not those treated with other compounds. Our findings show that oral administration of anti-VP6 VHH constitute, not only an effective prophylactic treatment against RVA-associated diarrhea, but also a safe and effective therapeutic tool against RVA infection, even once diarrhea is present. These results suggest that oral administration of anti-VP6 VHH represents a significant improvement in the therapeutic treatment of RVA-associated diarrhea when compared with current available options. Anti-VP6 VHH could be used as a complement to ongoing vaccination, especially in populations that have shown lower immunization efficacy. Overall, oral therapy using anti-VP6 VHH has enormous potential to be implemented in developing countries, where RVA mortality is still high and current vaccines seem less efficacious, and also to be administered to prematurely born or immunosuppressed children worldwide.

Holgado, María Pía. "Estudio de la deleción de tres genes inmunomoduladores del genoma de MVA: efecto sobre su inmunogenicidad" (2017-02-10) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El virus Vaccinia Ankara modificado (MVA, del inglés Modified Vaccinia Ankara) es un vector viral atenuado que aún conserva numerosos genes inmunomoduladores en su genoma. Nuestro grupo reportó anteriormente la optimización de este vector luego de eliminar el gen viral C12L, el cual codifica para la proteína de unión a IL-18. En este trabajo se analizó la inmunogenicidad del vector MVA al cual se le delecionaron de manera simultánea los genes A44L, relacionado con la síntesis de esteroides, y A46R, un inhibidor de la señalización mediada por receptores Toll (MVAΔA44L-A46R); o también incluyendo la deleción del gen C12L, previamente descripto (MVAΔC12L/ΔA44L-A46R). Para ello, se evaluó la respuesta celular T contra epítopes de Vaccinia tanto en bazo como en ganglios inguinales, drenantes al sitio de inoculación, en ratones de la cepa C57BL/6. Se observó que la magnitud de la respuesta adaptativa, tanto en la etapa aguda como de memoria, fue mayor en los animales inmunizados con los vectores delecionados en relación a aquellos que recibieron el vector de la cepa salvaje (MVAwt). Asimismo, el vector MVAΔC12L/ΔA44L-A46R indujo una respuesta celular T específica de memoria de mayor calidad, caracterizada tanto por la bifuncionalidad de las células T-CD8+ (expresión simultánea de CD107a/b e IFN-γ) como por la capacidad de proliferación específica de las células T-CD4+ y CD8+. Al estudiar la respuesta innata generada por el MVAΔC12L/ΔA44L-A46R, se observó que este vector indujo una mayor producción de citoquinas relacionadas con la generación de una respuesta celular T, tales como IL-12 e IFN-γ, así como mediadores pro inflamatorios y antivirales como IL-1β e IFN-β. En conclusión, este estudio describe por primera vez que la deleción simultánea de los genes inmunomoduladores del genoma de MVA, cuyas funciones se encuentran inter-relacionadas, tales como A44L, A46R y C12L constituye una metodología adecuada para incrementar la inmunogenicidad del vector generando de esta manera una mayor respuesta inmune tanto innata como adaptativa. Esto convierte al vector MVA en una herramienta útil y versátil para ser utilizada en el campo del desarrollo de vacunas.

Abstract:
Modified Vaccinia Ankara virus (MVA) is an attenuated vector that still retains many immunomodulatory genes in its genome. Our group previously reported the optimization of this viral vector after removing the C12L gene, coding for the IL-18 binding protein. In this work, we analyzed the immunogenicity of MVA vectors harboring the simultaneous deletion of A44L gene, related to steroid synthesis, and A46R, a TLR-signaling inhibitor (MVAΔA44L-A46R); or also including a deletion of C12L (MVAΔC12L/ΔA44L-A46R), previously described. For this, T-cell responses against Vaccinia virus epitopes were evaluated in C57BL/6 mice in spleen and inguinal lymph-nodes, draining to the site of inoculation. The results showed that the magnitude of the adaptive response, in both the acute and memory phases, was higher in mice immunized with the deleted vectors in relation to those that received the MVAwt. Furthermore, MVAΔC12L/ΔA44L-A46R induced specific memory T cell responses of higher quality, characterized by the CD8 T-cell bifunctionality (simultaneous expression of CD107a/b and IFN-γ) and the specific proliferation capacity of CD4+ and CD8+ T-cells. The study of innate immune responses generated by the MVAΔC12L/ΔA44L-A46R indicated that this vector induced an increased production of cytokines associated with the generation of a specific Tcell response, such as IL-12 and IFN-γ and also, pro inflammatory and antiviral mediators like IL-1β and IFN-β. In summary, this study describes for the first time that the simultaneous deletion of immunomodulatory genes from MVA genome, whose functions are inter-related, such as A44L, A46R and C12L is an appropriate methodology to enhance the immunogenicity of the vector, enhancing both innate and adaptive immune responses. This type of strategies converts MVA vector in a useful and versatile tool to be used in the vaccine development field.

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