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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Fisiología Vegetal [ 52 tesis ]

Mazzini, María Nélida. "Estudios sobre el sistema de polisacáridos de la semilla de la leguminosa gleditsia triacanthos" (1977) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Beconi, Martha Teresa. "Actividad de oxidasa alternativa y respiración mitocondrial en plantas superiores" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se estudió la actividad de oxidasa alternativa y la respiración mitocondrial en mitocondrias aisladas de diferentes tejidos de plantas superiores. Incubando tejido de tubérculos de papa en una cámara húmeda (envejecimiento) durante 24 y 48 horas se observó un incremento de la proteína mitocondrial con un concomitante aumento en la actividad de oxidasa alternativa. Además en dichas mitocondrias se observó un incremento en el consumo de oxígeno y una disminución en el control respiratorio con el tiempo de incubación. Al determinar la producción de anión superóxido en mitocondrias aisladas de tubérculos de papa se encontró que representa una pequeña fracción del consumo de oxígeno total y que no se incrementa con el envejecimiento. El envejecimiento del tejido produce un considerable incremento en la actividad de superóxido dismutasa citosólica (enzima Cu-Zn) lo cual es consistente con un incremento en la producción citosólica de Ō¯2̄ en condiciones fisiológicas. En la determinación de la actividad de oxidasa alternativa en mitocondrias aisladas de ejes embrionarios de semillas de soja no se observó una actividad apreciable de oxidasa alternativa durante los primeros estadíos de incubación como habían propuesto Yentur y Leopold (1976) y su nivel se mantuvo bajo entre las 2 y las 14 horas de imbibición. En embriones de soja se observó un incremento en el consumo de oxígeno que es paralelo al observado en el peso fresco entre las 2 y las 14 horas de imbibición. En mitocondrias aisladas de ejes embrionarios de soja se observó un incremento en la respiración por el agregado de citocromo c exógeno, y una disminución del efecto del citocromo c con el tiempo de imbibición. Al medir la respiración de embriones de soja se observó que el 46-50% del consumo de oxígeno total es de origen mitocondrial siendo el resto del consumo de oxígeno extramitocondrial y debido a la actividad de otras enzimas como oxidasas, oxigenasas (por ej. tirosinasa, lipoxigenasa, etc.). Esto coincide con trabajos realizados con quimioluminiscencia (Boveris y col., 1980) donde se obtiene una gran actividad de lipoxigenasa en homogenados de semillas de soja. Esta actividad de lipoxigenasa es insensible al cianuro y a la antimicina, pero es sensible al SHAM, similarmente a la oxidasa alternativa que es sensible al SHAM e insensible a los otros dos inhibidores. En mitocondrias de raíces de maiz que crecen en una solución nutritiva, se encontró una actividad de oxidasa alternativa que da cuenta del 41% del consumo de oxígeno total. En dichas mitocondrias la actividad de la oxidasa alternativa parece asociarse a la denominada "respiración salina" donde se produce exceso de ácidos orgánicos cuya función es mantener la electroneutralidad frente a la absorción de iones. Se observó con el uso de inhibidores de la respiración, que en mitocondrias de raíces de maíz, el SHAM y la antimicina actúan en sitios separados, pero que muestran una ligazón cooperativa entre ambos sitios. Los estudios realizados sobre la actividad de oxidasa alternativa y su papel fisiológico se han hecho sobre tejidos y mitocondrias aisladas de los mismos. En los trabajos realizados con tejidos enteros, no se puede afirmar que la actividad medida sea la que corresponde a la oxidasa alternativa, porque hay que considerar otros factores que pueden influir en su determinación. En el trabajo realizado para esta tesis utilizando tejidos y mitocondrias aisladas de los mismos permite concluir que para determinar la actividad de la oxidasa alternativa de un tejido hay que aislar las mitocondrias del mismo.

Zulpa de Caire, Gloria. "Acción de productos algales sobre plantas de importancia agrícola" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Saidman, Beatriz Ofelia. "Estudio de la variación alozímica en el género prosopis" (1985) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Ghini, Alberto Antonio. "Estudio sobre el catabolismo de gramina en la planta Hordeum vulgare" (1987) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo del presente trabajo fue estudiar el catabolismo del alcaloide gramina en plantas de Hordeum vulgare (cebada). Dicho estudio implicó la síntesis de gramina marcada en distintas posiciones con isótopos de carbono e hidrógeno, y de otros compuestos indólicos relacionados, los cuales fueron utilizados en experiencias "in vivo" con plantas de cebada en desarrollo. Los productos sintetizados permitieron realizar un estudio detallado de los espectros de RMN-¹H y particularmente RMN-¹³C de indoles sustituidos. En esta tesis se desarrollaron los siguientes temas: 1. Introducción: donde se resumen las características que le confieren a ciertas moléculas el carácter de alcaloide; se describen las características de las plantas de cebada utilizadas, los alcaloides presentes en las mismas y en particular, la presencia de gramina y los estudios realizados por otros autores sobre su biosíntesis y catabolismo. Se mencionan además las propiedades biológicas de la gramina y se hace referencia a su posible función en el vegetal. 2. Síntesis de indoles isotópicamente marcados: Se describe la síntesis de los distintos trazadores, radiactivos o no, y de otros compuestos indólicos empleados en la elucidación del camino catabólico de gramins y en estudios espectroscópicos . Ellos fueron: gramina-α-14C , gramina-α-¹³C, gramina-2-14C, gramina-2-¹³C, gramina-6-²H, gramina-6-³H, indol-2-¹³C, indol-6-²H, indol-3-carboxaldehido-2-14C, indol-3-carboxaldehido-2-¹³C, indol-3-carboxaldehido-6-²H, ácido indol-3-carboxílico-2-14C, 3-(hidroximetil)-indol, 3-(aminometil)-indol, 3-(metilaminometil)-indol, 6-bromoindol, 6-bromogramina y 1-trimetilsililindol . En especial, se desarrolló una síntesis novedosa para la obtención de indoles marcados con deuterio o tritio en el anillo bencénico, la cual resultó superior en especificidad y rendimiento químico e isotópico, a las anteriormente conocidas. Se aclararon además algunas contradicciones halladas en la literatura sobre la aplicabilidad de modificaciones de la reacción de Madelung para la síntesis de indol isotópicamente marcado. 3. Experiencias con plantas de cebada:En este Capítulo se describen: a) Las condiciones utilizadas para el desarrollo de las plantas y el método de inoculación de trazadores en plantas de cebada intactas en desarrollo. b) Experiencias de degradación de gramina-α-14C donde se determinó la degradación del C-α a C02. c) Experiencias de degradación de gramina-2-14C, donde se determinó la degradación del C-2 a C02. d) Experiencias de degradación de gramina-α-¹³C y su seguimiento por RMN-¹³C e) Experiencias de competencia y captura utilizando gramina-α-14C y gramina-2-14C en conjunto con posibles catabolitos como indol-3-carboxaldehido, ácido indol-3-carboxílico o 3-(hidroximetil)-indol y triptofano, ácido N- formilantranílico o formiato, respectivamente. f) Experiencias de degradación de indol-3-carboxaldehido-2-14C y ácido indol-3-carboxílico-2-14C donde se determinó la reversibilidad de la conversión gramina indol- 3-carboxaldehido. g) Experiencias realizadas con tallos aislados de cebada. h) Experiencias de degradación de gramina-6-³H y de gramina-(6-³H, 2-14C), donde se determinó la degradación total del sistema aromático. En base a estos estudios se concluyó que el C-α de la cadena lateral de la gramina es degradado cuantitativamente a C02, mientras que el C-2 sería eliminado como formiato que en gran parte se oxidaría a C02 mientras el resto pasaría al reservorio de C-1 del organismo donde sería posteriormente metabolizado a una variedad de compuestos. Los pasos en esta degradación serían la desmetilación secuencial del grupo dimetilamino y transformación a indol-3-carboxaldehido a través de una transaminasa, siendo esta parte de la secuencia reversible y probablemente común con el proceso biosintético de la gramina. Posteriormente se produciría la oxidación irreversible a ácido indol-3-carboxílico, descarboxilación con pérdida de la cadena lateral y ruptura oxidativa del anillo pirrólico para dar ácido N-formilantranílico y finalmente ácido antranílico y formiato. Las experiencias com gramina-6-³H permitieron además determinar que el ácido antranílico intermediario era también rápidamente degradado oxidativamente, con eliminación del ³H de la posición 6 de la gramina como ³H2O. La reversibilidad de la conversión gramina indol-3-carboxaldehido es analizada desde el punto de vista de su implicancia en la biosíntesis de gramina, la cual no se encontraba completamente elucidada. 4. Andlisis espectroscópico: Los distintos compuestos indólicos sintetizados, y en particular la marcación con ²H y ¹³C, permitió estudiar exhaustivamente los espectros de RMN-¹H y RMN-¹³C de estos compuestos. En especial se reasignaron las resonancias de los carbonos 5 y 6 de indol y gramina y 4 y 6 de indol-3-carboxaldehido en sus espectros de RMN-¹³C, los cuales estaban mal asignados en literatura. Además, se determinaron los espectros de RMN-²H de los compuestos deuterados, los cuales permitieron también asignar inequívocamente las resonancias del H-6 en los espectros de RMN-¹H de los compuestos sintetizados. Se asignaron completamente los espectros de RMN-¹H de indol, indol-6-²H, 6-bromoindol , gramina-6-²H, 6-bromogramina e indol-3-carboxaldeido-6-²H. 5. Parte experimental: Se describe la parte experimental de la labor realizada, donde se detallan las síntesis realizadas, las técnicas extractivas, cromatográficas y espectroscópicas empleadas, las condiciones de crecimiento de las plantas y de adrninistración de trazadores .

Fernández, Sandra Viviana. "Estudio de la estructura y regulación de la expresión de los genes Cab en plantas superiores" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se aislaron seis genes Lhc a partir de una biblioteca genómica de papa(Solanum tuberosum). Estos genes codifican polipéptidos que formarían parte de los complejos que captan la luz que luego es utilizada en la fotosíntesis. Estos genes se hallan en tandem y están separados por regiones de 1.3-1.4 kb. Todos poseen la misma orientación 5'( 3' y cada uno de ellos tiene su propio promotor localizado 5' río arriba de la región de código. Las proteínas deducidas a partir de las secuencias de bases, poseen todos los aminoácidos característicos de las proteínas CAB del PSII, Tipo I, las cuales están codificadas por los genes Lhcb1. Por lo tanto los genes aislados fueron denominados: Lhcb1*1, Lhcb1*2, Lhcb1*3, Lhcb1*4, Lhcb1*5 y Lhcb1*6. La región codificante de estos genes posee 798 pb excepto el Lhcb1*6 el cual fue aislado en forma incompleta (411 pb). Estos genes codifican proteínas de 265 aminoácidos, incluyendo el péptido señal. Los genes estudiados poseen un 94-98 por ciento de homología en sus secuencias de bases y codifican proteínas que poseen entre un 97.5 por ciento a 99.75 por ciento de identidad. Las regiones 5' flanqueantes de los seis genes poseen secuencias conservadas y que están presentes en otros genes cuya expresión es regulada por la luz (el fragmento de 62 pb localizado entre las cajas CAAT y TATA contiene tres secuencias GATA). La expresión de los genes Lhcb1 en las plantas de papa mostró ser específica de órgano. Diferentes transcriptos fueron detectados en las hojas de las plantas mientras que solo uno se detectó en los tallos y no hubo expresión en las raíces. Se determinó el sitio de iniciación de la transcripción para el gen Lhcb1*2. El mismo esta localizado a 69 nucleótidos río arriba del codón de iniciación de la traducción (codón ATG). Los resultados indicaron que la C en la secuencia CTTCAT constituye el primer nucleótido en el ARNm correspondiente al gen Lhcb1*2. La región localizada río arriba del gen Lhcb1*2 que se extiende hasta -1300pb fue secuenciada. Esta región contiene un motivo "G" (5'TGGTTGTGTC3') localizado entre las bases -162 a -171 con respecto al sitio de iniciación de la transcripción. Recientemente fue demostrado que el factor citosólico GBF, el cual se une al motivo "G", se transloca al núcleo en presencia de luz, mientras que en la oscuridad permanece en el citoplasma (Harter et al, 1994). Las funciones regularais de la región 5' flanqueaste del gen Lhcb1*2 fueron analizadas en plantas transgénicas de tabaco. En la construcción realizada, la región promotora del gen Lhcb1*2 dirige la expresión del gen reportero uidA, el cual codifica la enzima (-glucuronidasa (GUS). El análisis de las plantas transgénicas reveló que la región 5' flanqueante (-1300 a +10) del gen Lhcb1*2 es suficiente para conferir una respuesta a la luz a través del fotoreceptor fitocromo así como también una respuesta específica de órgano. Por otra parte, la expresión del gen uidA fue detectada en las plántulas transgénicas de tabaco a partir de las 72 hs luego de la germinación de las semillas. Este resultado se correlaciona con el tiempo de maduración de los cloroplastos (Oemüller et al,1986). Además, no se detectó expresión del gen uidA cuando las plántulas de tabaco transgénicas fueron cultivadas en presencia de un herbicida que impide el desarrollo de los cloroplastos. Por lo tanto, estos resultados indican que la presencia de cloroplastos maduros es necesaria para la expresión del GUS dirigida por el promotor del gen Lhcb1*2 aislado de plantas de papa. Se realizaron deleciones de la región promotora las cuales fueron fusionadas al gen uidA. De estos experimentos se pudo concluir que la región del promotor comprendida entre las bases -690 a +10 es suficiente para conferir una respuesta específica de órgano así como también una respuesta a la luz a través del fotoreceptor fitocromo.

Abstract:
A potato (Solanum tuberosum) genomic library was used to isolate five full-length genes and part of a sixth one, encoding the apoproteins of a light-harvesting complex (LHC). These genes are arrange in tandem with a spacing of 1.3-1.4 kb between neighboring genes. They present the same orientation and they have their own promoters 5'-upstream of the coding regions. All the Lhcb1 genes have 798 bp open reading frame coding for a protein of two hundred and sixty-five amino acids, including a transit peptide. The nucleotide homology among the five genes is between 94-98 per centum. The nucleotide sequences showed that they encoded very similar proteins (99.75 per centum o 97.50 per centum identities). The deduced amino acid sequences were homologous to the PSII Type I CAB proteins encoded by the Lhcb1 genes, so these genes were named Lhcb1*1, Lhcb1*2, Lhcb1*3, Lhcb1*4, Lhcb1*5 and Lhcb1*6, respectively. The 5'-flanking regions of the six potato genes shared conserved sequences already detected in other light-responsive genes (62 bp fragment located between the CAAT and TATA boxes containing three GATA motifs). The expression of Lhcb1 genes in potato was organ-specific. At least nine different transcripts can be recognized in leaves by the primer extension method. A unique transcript could be detected in stems and not in roots. The transcription start site for the Lhcb1*2 gene was determinated. It is located 69 nucleotides upstream from the ATG codon. Our results indicated that the C in the sequence CTTCAT would be the first nucleotide in the Lhcb1*2 mRNA. The 5' upstream region of Lhcb1*2 extending from -1300 bp to the cap site was sequenced. This region contained a G-box motif (TGGTTGTGTC) located between -162 and -171 from the transcription start site. It has been recently demonstrated that the translocation of the cytosolic GBFs (G-box binding factor) to the nucleus is light-regulated (Harter et al, 1994). The regulatory function of the 5'-flanking region of the potato Lhcb1*2 was analyzed in transgenic tobacco plants. The construct used contained the uidA gene which was under the control of the potato Lhcb1*2 promoter. Analysis of transgenic plants revealed that the 5'-flanking region (-1300 to +10, relative to the transcription start site) of the Lhcb1*2 gene is sufficient to confer a phytochrome response as well as organ-specific expression. In ours experiments, the expression of the uidA gene was detected in the transgenic tobacco seedlings around 72 h after germination. This result correlates well with the time of maturation of the chloroplasts (Oemüller et al, 1986). Furthermore, the expression of uidA was not detected when transgenic seedlings were grown in presence of Norflurazon. These results correlates the presence of mature chloroplasts with the GUS expression directs by the Lhcb1*2 promoter. We have obtained constructs in which the uidA gene was under the control of deletions of the 5'-flanking region of potato Lhcb1*2. The -690 to +10 flanking region of the Lhcb1*2 is enough to confer organ-specific and phytochrome-regulated expression on the uidA coding sequence.

Farber, Marisa Diana. "Transducción de señales en Phytomonas (parásitos de plantas)" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Phytomonas es un género de la familia Trypanosomatidae que parasita plantas. Si bien muchos de sus componentes no provocan daño a sus respectivos huéspedes, otros en cambio, son responsables de afecciones que acarrean pérdidas económicas. Tal es el caso de las palmas aceiteras en paises como Colombia, Venezuela y Guyana, el café en Brasil y algunos reportes de daño en algunos frutos como el tomate, tanto en Brasil como en España (Granada). La especie objeto de este estudio no es patogénica y corresponde a la aislada de Euphorbia characias (planta laticífera). Contiene una adenilil ciclasa unida a membranas y un sistema transductor de señales de proteínas G, del tipo Gs y Gi. Estas proteínas afectan la actividad de la adenilil ciclasa y posiblemente participan en un mecanismo que involucra a una señal de tipo hormonal. Si bien no existen evidencias directas de la existencia de un receptor, la proteína del tipo Gi es capaz de interaccionar con el peptido tóxico Mastoparán, que mimetiza la acción de los receptores acoplados a proteínas G. Se analizaron distintas fracciones subcelulares para caracterizar una actividad de quinasa de proteínas modulada por AMPc (PKA). Las fracciones subcelulares purificadas por cromatografía en DEAE-celulosa mostraton dos picos de actividad enzimática frente a histona IIA y a kémptido como sustratos. Usando un anticuerpo policlonal contra la subunidad catalítica de PKA de corazón bovino, se inmunoprecipitó un polipéptido con un peso molecular de 40 kDa. Estos datos en conjunto sugieren la presencia de dos tipos de actividad de quinasa de proteína de pendiente de AMPc (tipo I y 11). Experimentos in vivo con toxina del cólera, dieron como resultado un arresto del ciclo celular del parásito, poniendo en evidencia un efecto ambiguo de la vía de señalización mediada por AMPc, que requerirá de futuros estudios para su profundización. Datos preliminares, aunque incompletos nos dan un primer indicio de la conservación de este tipo de vía en una cepa patógena (responsable del Hartrot de las palmas aceiteras). La extrapolación de los resultados anteriores, nos permitirán diseñar aquellos experimentos tendientes a tratar de develar dónde reside la diferencia de patogenicidad de ambas cepas.

Abstract:
Phytomonas constitutes a genus of flagellated trypanosomatids with the capacity to infect plants. Although these trypanosomatids parasitize many plants species without apparent pathogenicity, in some cases they are responsible for economically important diseases including those affecting Solanum lycopersicum (tomato), Coffea liberica (coffee), Cocos nucifera (coconut), and Elaeis guineesis (oilpalm). Phytomonas sp membranes have an Adenylyl cyclase activity wich is greater in the presence of Mn2+ than with Mg2+. The Mg2+ and Mn2+ activity ratio varies from one preparation to another suggesting that the Adenylyl cyclase has a variable activation state. A GTP- -S binding activity with a Kd of 171 nM was detected in Phytomonas membranes. Incubation of these membranes with activated cholera or pertussis toxin and NAD+ led to incorporation of radioactivity into bands of about 40-44 kDa. Crude membranes were electrophoresed on SDS-polyacrylamide gels and analysed, by Western blotting, with the 9188 anti- s antibody and the AS/7 antibody (anti- t, anti- i1, anti- i2). These procedures resulted in the identification of polipeptides of approximately 40-44 kDa. Phytomonas Adenylyl cyclase could be activated by treatment of membrane preparation with cholera toxin in the presence of NAD+, while treatment with pertussis toxin did not affect this enzime activity. These studies indicate that in Phytomonas, Adenylyl cyclase activity is coupled to an unknown receptor entity trough G s proteins. We have identified two types of cyclic AMP-dependent protein kinase activity in Phytomonas citosol. Criteria to assert authenticity of this activity are the followings: 1- The enzime is specifically activated by cAMP; 2- Specificity for phosphate acceptors characteristic of this type of phosphotransferase activity; 3- DEAE-cellulose fractions specifically binds cAMP; 4- Polyclonal antibodies to bovine heart catalytic subunit immunoprecipitates a 40 kDa phosphorylated polypeptide; 5- As occures with mammalian type II cAMP dependent protein kinase, the activity corresponding to peak II is able to phosphorilate its own "regulatory component" an this doesn't occur with the enzime obtained in peak Y. As the present results were done in Phytomonas isolated from E.characias (a non-pathogenic specie) our next goal is to verify the regulation of this signal pathway in others strains, trying to understand the relationship with the host, and find out, why some of them are responsible of plant's deseases.

Yanovsky, Marcelo Javier. "Control del crecimiento y desarrollo de las plantas por la luz: Funciones fotoperceptivas y mecanismos de acción del fitocromo A" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La luz es un factor ambiental crítico para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Provee no solo la energía lumínica necesaria para el proceso fotosíntético, sino también señales informativas que las plantas utilizan para coordinar su crecimiento y desarrollo con el ambiente circundante. La percepción de las señales lumínicas esta mediada por fotorreceptores específicos como los fitocromos. Estos son una pequeña familia de proteínas codificada por cinco genes en Arabidopsis thaliana, FITOCROMO A-E (PHY A-E). El objetivo de esta tesis es dilucidar las funciones sensoriales y los mecanismos de acción de uno de los fitocromos más abundantes, el fitocromo A (phy A). Las funciones fotosensorias del phy A en condiciones naturales de radiación fueron investigadas comparando el comportamiento de plantas con niveles normales de phy A y de plantas mutantes y/o transgénicas con niveles incrementados o reducidos de este fotorreceptor. De los experimentos se puede concluir que el phy A actúa como un sensor de cambios en la irradiancia. En plantas etioladas el phy A es el único fotorreceptor que permite a las plantas distinguir la transición entre la oscuridad reinante bajo la superficie del suelo y la escasa luz presente bajo canopeos muy densos. Los cambios morfológicos y fisiológicos desencadenados por el phy A en respuesta a la percepción de dicho cambio en el ambiente lumínico incrementan notablemente la supervivencia de las plantas emergidas en tales condiciones. El phy A, además, está involucrado en la percepción de los cambios en el ambiente lumínico producidos por la presencia de plantas vecinas: percibe directamente la disminución de la cantidad de luz roja (R) y rojo lejana (RL) que se produce por el sombreado y modula, indirectamente, la sensibilidad a reducciones de la relación R/RL que se producen por la relexión selectiva de RL en las hojas de plantas vecinas. Estas acciones del phy A conducen finalmente a un incremento en la tasa de alargamiento del tallo que disminuyen el riesgo de sombreado. En plantas verdes el phy A también está involucrado en la percepción de las transiciones cotidianas oscuridad/luz que se producen al amanacer. En respuesta a la percepción de dicha señal el phyA sincroniza al reloj endógeno que controla el movimiento de las hojas y probablemente la actividad de numerosos procesos vitales en las plantas. El phy A actúa a través de dos modos de acción, el VLFR (por Very Low Fluence Responses) que se satura con muy bajos flujos de luz, y el HIR (por High Irradiance Responses) que se satura con altas irradiancias de RL. Aquí presento evidencias genéticas que indican que 1aacción del phy A en el VLFR y el HIR involucra dos mecanismos moleculares diferentes. Por un lado se identificaron dos loci, vlf1 (en el cromosoma 2) y vlf2 (en el cromosoma 5), polimórficos entre los ecotipos Landsberg erecta y Columbia de Arabidopsis thaliana, que afectan las respuestas VLFR pero no las HIR. También se caracterizaron las respuestas VLFR y HIR en dos mutantes de transducción de señales del phy A previamente identificados y se observó que uno de ellos, el fhy1, afectaba de manera similar las respuestas VLFR y HIR mientras que el otro, el fhy3, afectaba mucho más las respuestas HIR que las VLFR. En conjunto, estos resultados sugieren que el phy A desencadena las respuestas VLFR y HIR a través de dos vías de transducción de señales diferentes que poseen algunos elementos en común. Por otro lado, utilizando una estrategia novedosa de búsqueda, se identificaron dos mutantes débiles de phy A, denominadas phy A-301 y phy A-302, que afectaban mucho más las respuestas HIR que las VLFR. Tanto la mutante phy A-301 como la mutante phy A-302 presentaron niveles reducidos de phy A en ensayos de inmunodetección. La secuenciación del gen PH YAen el mutante phy A-301, reveló una mutación que da lugar a una proteína truncada que carece de 142 aa del extremo C-terminal. La secuenciación del gen PHYA en el mutante phyA-302 reveló una mutación puntual que convierte el glutamato 778 en lisina. Esta mutación se encuentra en una región previamente descripta como importante para la actividad regulatoria de los fitocromos. Estos resultados indican que las respuestas a muy bajos flujos, es decir las VLFR, y las respuestas a altas irradiancias, es decir las HIR, se diferenciarían en los niveles de phyA y/o en los dominios de ésta molécula necesarios para inducir cada una de las respuestas. En resúmen, hemos demostrado que el phyA está involucrado en la percepción de diferentes cambios en el ambiente lumínico durante distintas etapas del ciclo de vida de las plantas y hemos encontrado evidencias genéticas que indican que el phyA actuaría a través de dos vías de transduccíón de señales distintas, una inducida en respuesta a muy bajos flujos de luz y otra inducida en respuesta a altas irradiancias.

Abstract:
Light is a critical enviromental factor for plants. It provides not only the radiant energy for photosynthesis, but also the informational signals that plants use to adapt and optimize their growth and development in response to the ambient conditions. Perception of light signals is mediated by specific photoreceptors such as phytochromes. Phytochromes are a small family of proteins encoded by five genes in Arabidopsis thaliana (PHYA-PHYE). The aim of this thesis is to investigate the photosensory functions of phytochrome A (phyA) and to improve our understanding of the mechanisms by which this photoreceptor transduces different light signals. The photoperceptive functions of phyA were analyzed by comparing the behavior of mutant and transgenic plants with either reduced or increased phyA levels to that of wild type (WT) plants that have normal levels of this photoreceptor. It can be concluded, from the experimental results, that phyA acts as a sensor of irradiance. In etiolated plants phyA is the only photoreceptor capable of perceiving the transition from the dark envirnonment present below the earth surface to the low light levels present beneath very dense canopies. In response to the perception of that signal phyA induces several changes in the developmental pattern that are crucial for seedling survival. In light-grown plants phyA is directly involved in the perception of changes in the amount of red light (R) and far-red light (FR) produced as a consequence of vegetation shading, and modulates the sensitivity to changes in the R/FR ratio produced by the selective reflection of FR in the leaves of nearby plants. These actions of phyA lead to an increment in stem elongation that helps preventing future shading. In light-grown plants phyA is also involved in the perception of the dark/light transitions that occure daily at dawn. In response to such signal phyA sinchronizes the endogenous clock that controls the rhythm of leaf movement, and probably the activity of other vital processes. PhyA acts through two different action modes. The first, VLFR (for Very Low Fluence Responses) is saturated with very low fluences of either R or FR light. The second, HIR (for High Irradiance Reactions) is only saturated with high irradiances of FR. Here I present genetic evidence indicating that the action of phyA in the VLFR and HIR involve two different molecular mechanisms. First, I have identified two loci polyrnorphic between ecotypes Landsberg erecta and Columbia of Arabídopsis thalíana, vlf1 (on chromosome 2) and vlf2 (on chromosome 5), that affect VLFR but not HIR. Second, I have characterized two previously identified phyA signal transduction mutants, fhy1 and fhy3, and found that fhy3 is more affected in the HIR than in the VLFR, while fhy1 is similarly affected in both phyA action modes. These results suggest that phyA elicits VLFR and HIR through two different signal transduction pathways that have some common component(s). Finally, using a novel screening strategy, I have identified two mutants lacking HIR but retaining VLFR. The genetic complementation analysis indicated that they were weak alleles of phyA and therefore they were named phyA-301 and phyA-302. Western blott analysis revealed that both mutants had reduced phyA levels. The sequence analysis of the phyA-301 mutant indicated that the PHYA gene beared a mutation leading to a truncated phyA protein, lacking 142 aa from the C-terminal domain. The sequence analysis of the phyA-302 mutant revealed a mutation that converted glutamic acid 778 into lysine. These results indicate that the responses to very low fluences of light and the responses to high irradiances of FR are different either in the levels of phyA or in the domains of this molecule that are necessary to induce each type of response. In summary, we have shown that phyA is involved in the perception of different changes in the light environment during the whole life cycle of plants and we have found genetic evidence supporting the hypothesis that phyA activates two different signal transduction pathways, one in response to very low fluences of light and the other in response to high irradiances.

Puebla, Andrea Fabiana. "Estudios bioquímicos y moleculares del metabolismo de fructanos en respuesta a estreses ambientales en Gramíneas nativas" (1999) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se ha estudiado la respuesta a estrés por bajas temperaturas y déficit hídrico en Gramíneas nativas de regiones con climas contrastantes de la Argentina. El modelo de trabajo se basó en el análisis comparativo del metabolismo de fructanos y sacarosa en relación con estreses abióticos en especies nativas de Patagonia y otras del mismo género adaptadas a regiones con climas más benignos. Bromus pictus y Bromus auleticus, se compararon como especies patagónicas y del centro y norte de Argentina, respectivamente. Se analizaron los azúcares que contienen fructosa en plantas control y tratadas. Se estudiaron los patrones de fructanos y se determinó la composición de oligosacáridos de ambas especies. Se estudiaron las enzimas del metabolismo de sacarosa y fructanos. Se midieron la actividad de las enzimas SPS, SS, INV y SST. La actividad SST mostró aumentos constantes frente al estrés por frío en la especie patagónica. Se desarrollo un nuevo método enzimático-colorimétrico para medir la actividad SST. Se estudiaron algunas propiedades bioquímicas de esta actividad parcialmente purificada de vástagos de B. pictus tratados a 4 °C. La actividad SST de Bromus pictus mostró un pH óptimo entre 5,5 y 6, no se saturó a altas concentraciones de sacarosa y mantuvo el 55% de la actividad a 30°C en incubaciones realizadas a 0°C. Se realizaron estudios de homología y expresión a partir de ácidos nucleicos de plantas de B. pictus tratadas con bajas temperaturas utilizando sondas heterólogas de la 6-SFT de cebada. Se demostró que en la especie patagónica hay secuencias homólogas de ADN y ARN a las existentes en cebada. Por la técnica de RT-PCR se clonó un fragmento de 760 pb del ADNc de Bromus pictus usando oligonucleótidos específicos en zonas altamente conservadas en otros genes de fructosil transferasas. La comparación de secuencias mostró una alta homología con la 6-SFT de cebada, con otras enzimas del metabolismo de fructanos de mono y dicotiledóneas y con INV ácidas de plantas.

Abstract:
Low temperature and water stress treatments were assayed in plants of various species of Gramineae, belonging to different regions of Argentina. The experimental model was based in comparative studies of fructan and sucrose metabolism in relation with the abiotic stresses in native plants from Patagonia and other species of the same generous adapted to northern regions of Argentina with mild climatic conditions. Bromus pictus and Bromus auleticus were compared as patagonic and northern species respectively. Fructose-containing sugars were analysed. The fructan pool was studied and oligosaccharide composition was determined. Sucrose and fructan enzymes were studied. SPS, SS, INV and SST were assayed in control and treated plants in both Bromus species. Increasing levels of SST activity were observed in patagonic plants exposed to low temperature. A novel enzymatic-colorimetric method to assay SST activity was developed. Some biochemical properties of SST activity partially purified from shoots of Bromus pictus treated with low temperatures, were studied. SST activity of Bromus pictus has pH optimum between 5,5-6, was non-saturated at high concentrations of sucrose and maintained high activity at 0°C. Southern and northern analysis were made with tissues of low temperature treated plants of Bromus pictus, using the ADNc of barley 6-SFT as a probe. Bromus sequences of DNA and RNA hybridised with the ADNc of barley. A ADNc fragment of Bromus pictus was cloned by RT-PCR using specific primers with high homology with plant fructosyltransferases. Sequence comparison has shown a high homology of the ADNc fragment with the ADNc of barley 6-SFT, other mono and dicotyledon fructan genes and acid invertases of plants.

Bucci, Sandra Janet. "Arquitectura hidráulica y relaciones hídricas de árboles de sabanas neotropicales : efectos de la disponibilidad de agua y nutrientes" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las sabanas neotropicales se caracterizan por tener una matriz herbácea continua con árboles y arbustos aislados. El objetivo de este estudio fue evaluar el significado funcional de las respuestas morfológicas y fisiológicas de especies leñosas a variaciones espacio-temporales en la disponibilidad de recursos en una de las sabanas neotropicales más importantes (el Cerrado en el Centro de Brasil). Las variaciones en los recursos disponibles para los árboles de estas sabanas, están determinadas por factores tales como la estacionalidad en las precipitaciones, el déficit de saturación del aire (DSA) y la disponibilidad de nutrientes en el suelo, así como por variaciones espaciales en la densidad de árboles. Las densidades aumentan desde campo sujo (960 individuos por ha) hasta el cerradão (3343 individuos por ha), pasando por el cerrado en sentido estricto con densidades intermedias. Se observaron fluctuaciones estacionales promedios de un 10 % en el contenido de agua del suelo en los primeros 300 cm de profundidad y también en la demanda evaporativa del aire. Como respuesta a estos cambios, los árboles de varias especies tuvieron potenciales hídricos foliares menores en la estación seca, con disminuciones de hasta 2,6 MPa entre las estaciones húmeda y seca. En ambas estaciones, los árboles del Cerrado mostraron un fuerte control estomático de la transpiración, pero las conductancias estomáticas fueron casi el 50% menores en la estación de sequía. A pesar de este cierre estomático parcial, las tasas diarias de transpiración fueron similares entre estaciones, mientras que los flujos diarios por individuos tendieron a ser menores en la estación seca. La reducción en el área foliar total durante la estación seca provocó una disminución de la razón entre el área foliar y el área de xilema activo (AF/AX); esto condujo a una mayor eficiencia en el sistema de transporte de agua. Como consecuencia de DSA altos durante las horas de la noche, los flujos nocturnos fueron relativamente altos, en especial durante la estación seca, observándose que hasta un 24 % del consumo diario de agua ocurre durante la noche. Los árboles en el cerradão, que dispusieron de una menor cantidad de agua por debajo de los 100 cm de la superficie del suelo debido a la alta densidad de árboles, experimentaron ajustes osmóticos pasivos como consecuencia de la disminución del contenido simplástico de agua, sin que los potenciales hídricos foliares mínimos cambiaran, en comparación a los árboles en el campo sujo. Las propiedades específicas de cada individuo, relacionadas con la eficiencia en el transporte de agua y el tamaño de los reservorios internos de agua influyeron significativamente en la economía de agua de los árboles. Los árboles que tuvieron tasas diarias de transpiración altas no experimentaron déficit hídricos significativos debido a que tienen reservorios de agua relativamente grandes y una mayor eficiencia del sistema de transporte de agua. Se observaron cambios diurnos en la conductividad específica, lo que sugiere que en el sistema de conducción de agua existen procesos continuos y dinámicos de formación y reparación de vasos embolizados, que ocurren a una escala temporal menor a 24 hs. Como resultados de fertilizaciones con N y P se produjeron cambios sustanciales en la arquitectura hidráulica de las plantas debido a modificaciones en el área foliar total y en el diámetro de los troncos. Estos cambios fueron más favorables desde el punto de vista de las relaciones hídricas en los árboles de sitios con fertilizaciones con P. En este tratamiento los cambios produjeron un aumento en la capacidad de transporte de agua en relación al área foliar total (AF/AX), lo que les permitió mantener potenciales hídricos mayores (más positivos). Los árboles en sitios fertilizados con N tuvieron respuestas opuestas. Toda estas series de combinaciones de características morfológicas y funcionales, así como las respuestas fisiológicas de aclirnatación, que ocurren cuando se producen cambios en condiciones ambientales, les permiten a los árboles del Cerrado mantener flujos de agua altos durante el año, sin que experimenten déficit hídricos, lo cual posibilita que una gran cantidad de especies leñosas pueda expandir sus hojas durante la estación seca.

Abstract:
The neotropical savannas are characterized by a continuous herbaceous layer with isolated trees and shrubs. The objective of this study was to assess the functional significance of morphological and physiological traits of woody species in response to temporal and spatial variation in resource availability. This study was carried out in one of the most important neotropical savannas, the Brazilian Cerrado. The variations in resource availability in Cerrado ecosystems are determined by factors such as seasonal precipitation and changes in the air saturation deficit (ASD), soil nutrient content and tree density which affect soil water availability. Tree density increases from campo sujo (960 individuals per ha) to cerradão (3343 individuals per ha), with other physiognomies containing intermediate tree densities. Soil water content differed by about 10% between wet and dry seasons in the upper 300 cm of soil. Air saturation deficits were substantially higher during the dry season. Leaf water potentials of several tree species were more negative during the dry season compared to the wet season. In some cases 2,6 MPa water potential differences were observed between both seasons. Also in both seasons the trees exhibited a strong stomatal control of transpiration. Average stomatal conductance, however, was 50 % lower during the dry season. Despite lower stomatal conductance during this period total daily sap flow per unit leaf area tended to be similar among plants but daily water loss per individuals was significantly lower. As a consequence of a lower total leaf surface area during the dry season, the ratio between leaf area and sapwood cross sectional area (LA/XA) was also lower, resulting in an increase in the water transport efficiency from soil to leaves. Nocturnal transpiration was relatively high due to high ASD, particularly during the dry season. Nocturnal transpiration accounted up to 24% of the total daily water use per tree. Soil water availability was lower in the cerradão below the first 100 cm soil depth compared to the campo sujo sites. The cerradão trees experience passive osmotic adjustment due to the decrease in the symplastic water content. However the leaf water potentials were not different between both sites. The water transport efficiency in each individual tree, and therefore their water economy, were influenced by the size of the internal water storages. Trees with higher transpiration rates did not experienced larger water deficits due to the relatively larger water storages and more efficient water transport system. Diurnal changes in specific hydraulic conductivity observed in two tree species suggest that embolism formation and repair occurred on a daily basis. N and P fertilizations resulted in substantial changes in the hydraulic architecture of trees due to variations in total leaf surface area and stem diameter. Trees in P fertilized sites improved their water relations due to an enhancement of the water transport efficiency (lower LA/XA) which allowed them to maintain higher leaf water potentials. Trees in N fertilized sites had opposite responses in terms of water transport efficiency. The morphological and physiological acclimation responses observed in Cerrado trees have an adaptive value allowing the trees to maintain high flow rates even during the dry season without experiencing water deficits, which allow them to expand new leaves during this unfavorable period for growth.

Burgin, María José. "Estudio del fotocontrol de la germinación de semillas de Datura Ferox : Aspectos fisiológicos y moleculares" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Dependiendo del nivel de dormición la germinación de semillas de Datura ferox puede ser estimulada por la luz mediante una LFR o una VLFR. En ambos casos, esta promoción involucra el aumento de la fuerza expansiva del eje embrionario y el ablandamiento del endospenna micropilar, este último, asociado al aumento de las actividades endo-β-mananasa y β-manosidasa en ese tejido. El análisis del nivel de transcriptos relacionados con la germinación, revela la existencia de puntos en común y diferencias importantes entre la LFR y la VLFR. La LFR produce en embriones un incremento en el nivel de transcriptos para GA 3β-hidroxilasa, DfGA3β-hy, y una reducción en aquellos que codifican para GA 20 oxidasa, DfGA20-ox, indicando un probable aumento en el contenido de giberelinas. En respuesta a la LFR, y posiblemente a la acción de las giberelinas, se observa en el endosperma micropilar un aumento en el nivel de mensajeros para endo-β-mananasa y expansinas, y en embriones un aumento de la acumulación de transcriptos para expansinas. En semillas sensibles a la VLFR, el requerimiento de luz solo se mantiene para el aumento del nivel de transcriptos de DfGA3β-hy, mientras que la acumulación de los otros mensajeros analizados se produce independientemente de la luz. La germinación de D.ferox inducida por una VLFR, o una LFR, puede ser inhibida por una HIR. En ninguno de estos casos la HIR afecta el potencial de crecimiento del eje embrionario, siendo el blanco de la inhibición el ablandamiento del endosprmna micropilar. El antagonismo LFR-HIR involucra una disminución de la actividad de endo-β-mananasa, mientras que en la inhibición de la VLFR por una HIR, la promoción de las actividades endo-β-mananasa y β-manosidasa se encuentra bloqueada. A nivel de los distintos transcriptos analizados, tanto en el antagonismo LPR-HIR como en el VLFR-HIR, se observa una fuerte relación entre nivel de mensajeros de DfGA3β-hy y los valores de germinación. En el caso de inhibición de la VLFR por la HIR, la inhibición de la actividad endo-β-mananasa se encuentra asociada a una disminución en el nivel de los mensajeros para esta enzima. Los resultados obtenidos indican que los efectos de la HIR sobre la actividad de endo-β-mananasa pueden deberse, tanto a una reducción en el nivel de mensajeros para esta enzima (VLFR), como a algún proceso posterior al establecimiento de dichos niveles, que determina una disminución de esta actividad enzimática (LFR).

Abstract:
Datura ferox seed germination can be promoted by a LFR or a VLFR, according to dormancy levels. In both cases, this promotion involves an increase in embryo growth potential and endosperm softening. Endosperm weakening is related to an increase in endo-β- mannanase y β-mannosidase activities. The analysis of transcript levels related to germination, reveal some common points but also differences between germination induced by a LFR, or by a VLFR. In response to the LFR, transcript accumulation for GA 3 β-hydroxylase, DfGA3β-hy, is promoted in embryos, while a reduction in those for GA 20 oxidase, DfGA20-ox, is observed, suggesting an increase in gibberellin content. An increase in transcript levels for endo-β-mannanase and expansins, in endosperm caps, and for expansins in embryos, is promoted by the LFR and gibberellins. In seeds sensible to the VLFR, the light requirement is only maintained for the rise in DfGA3β-hy transcripts level, while the other analyzed transcripts accumulated independently of the light. Germination of D.ferox induced by a LFR, or a VLFR, can be inhibited by a HIR. It could not be detected any affect of HIR on embryo growth potential. Endosperm softening is the target of the inhibition by the HIR. Endo-β-mannanase activity promoted by LFR is deeply diminished by HIR. In the VLFR, the promotion of endo-β-mannanase y β-mannosidase activities is cancelled by the HIR. HIR inhibition of germination, promoted by VLFR or LFR, is linked to the pattern of GA 3 β-hydroxylase transcript accumulation. In the VLFR-HIR antagonism, endo-β-mannanase activity inhibition is related to a decrease in the transcripts level for this enzyme. These results indicated that endo-β-mannanase activity could be affected by HIR by a lowering on its transcripts level (VLFR), or by some other process given after the establishment of this transcripts level, determining a drop in enzyme activity.

Raíces, Marcela. "Identificación y caracterización de quinasas y fosfatasas de proteínas inducidas durante la tuberización de Solanum tuberosum" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo se estudiaron genes posiblemente involucrados en los procesos de señalización relacionados con la tuberización. Se identificaron los genes StCDPK1, StCDPK2 y StCDPK3, que son los primeros miembros de la familia CDPK de Solanum tuberosum. En particular se caracterizó el gen StCDPK1 que codifica para una quinasa activa con todas las propiedades de las CDPKs. Se demostró que StCDPK1 se miristoíla in vitro y que su localización subcelular depende de miristoilación y palmitoilación. Por otra parte se determinó que existe una fuerte correlación entre la expresión de StCDPK1 y el engrosamiento del estolón. Mediante ensayos de hibridación in situ se observó que StCDPK1 se expresa en el ápice de estolones inducidos a tuberizar. También se determinó que StCDPK3 se expresa diferencialmente en estolones tempranos. En ensayos de Western blot se identificaron dos CDPKs, de 55 y 60 kDa, cuya expresión correlaciona con la expresión de los genes StCDPK3 y StCDPK1 respectivamente. Se determinó que la actividad CDPK asociada a estolones tempranos y la actividad CDPK asociada a estolones inducidos poseen diferente especificidad de sustrato y distinta localización subcelular. Por otra parte se estudió el efecto de la sacarosa sobre la tuberización y sobre la expresión de StCDPK1. Se determinó la importancia de las actividades quinasa durante la inducción de la tuberización inducida por sacarosa y se demostró que este azúcar induce la expresión de StCDPK1 mediante un mecanismo que involucra la actividad de fosfatasas de la familia PP1/PP2A. Además, se identificó el gen StPP2A1c que codifica para la primer fosfatasa de la familia PP2A de Solanum tuberosum. Se determinó que el gen StPP2A1c se expresa diferencialmente durante la tuberización y, mediante ensayos de complementación en levaduras, se demostró que este gen codifica para una fosfatasa funcional.

Abstract:
In this work we studied genes which are possiby involved in the signalling events leading to tuber development. The first members of Solanum tuberosum CDPK family, StCDPK1, StCDPK2 y StCDPK3, were identified. The gene StCDPK1, which encodes an active kinase with all the features of CDPKs, was characterized. It was demonstrated that StCDPK1 suffers myristoylation in vitro and that its subcellular localization depends on myristoylation and palmitoylation. On the other hand, a strong correlation between StCDPK1 expression and stolon swelling was established. Using in situ hybridization we observed that StCDPK1 is expressed in the apical dome of tuberizing stolons. Moreover, StCDPK3 is differentially expressed in early stolons. By Western blot assays, two CDPKs of 55 y 60 kDa which correlated with the expression of StCDPK3 y StCDPK1 respectively, were detected. The CDPK activity associated to early and induced stolons showed different substrate specificity and subcellular localization. The effect of sucrose on tuberization and StCDPK1 expression was also analyzed. The importance of protein kinase activities during sucrose-induced tuber development was established and the induction of StCDPK1 by sucrose, through a mechanism that involves PP1/PP2A phosphatase activities,was demonstrated. Besides, we identified StPP2A1c, a gene that encodes the first phosphatase of the PP2A family in Solanum tuberosum. StPP2A1c was differentially expressed during tuberization and encoded a functional phosphatase, as was observed in yeast complementation assays.

Agüero, Marta Susana. "Fructificación partenocárpica en tomate: efecto del ácido giberélico sobre la proteólisis" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La antesis de una flor es un estadio crucial para el destino del ovario ya que estímulos endógenos -polinización O nivel hormonal elevado- o exógenos -aplicación hormonal- inducen el proceso de fructificación. En ausencia de estos estímulos el ovario deja de crecer e inicia un proceso de senescencia. Dada la importancia que posee la aplicación hormonal mejorando el establecimiento de los frutos de tomate cuando la autopolinización resulta alterada por las condiciones ambientales, el objetivo de este trabajo fue estudiar el control de actividades proteolíticas durante los procesos alternativos de senescencia o fructificación del ovario. Como sistema experimental se emplearon ovarios no polinizados y frutos en desarrollo obtenidos por polinización natural o aplicación de auxinas o giberelinas a ovarios no polinizados. La ausencia de estímulos endógenos o exógenos inició el programa de senescencia en los ovarios no polinizados, aunque éstos mantienen su sensibilidad hasta por lo menos 20 dpa. Durante este periodo se evidenciaron parámetros característicos de la senescencia como la disminución en los niveles de la subunidad mayor de la RuBisCO y el incremento en la actividad proteolítica sobre azocaseína, en los polipéptidos relacionados antigénicamente con papaina y la tiolproteasa C14, y en la expresión del gen C14-tiolproteasa. El proceso de fructificación, en cambio, fue acompañado por una disminución de estos parámetros. Los resultados obtenidos indicarían que en los ovarios no polinizados la expresión y/o actividad de proteasa/s de la familia de la papaína es regulada temporal y espacialmente durante los procesos alternativos de senescencia o fructificación.

Abstract:
Flower anthesis is a crucial stage for the ovary's fate because endogenous stimuli -pollination or high hormonal level- or exogenous ones -hormone application- induce the fruit set. In the absence of these stimuli, the ovary stops growing and starts the senescence process. Given the importance that hormone application has for the improvement of fruit set in tomato when self-pollination is altered by environmental conditions, the objective of this work was to study the control of proteolytic activities during the alternative processes of senescence or fruit set. Unpollinated ovaries and developing fruits obtained by natural pollination or by the application of auxins and gibberellins to unpollinated ovaries, were used as experimental system. The absence of endogenous or exogenous stimuli began the senescence program in the unpollinated ovaries, although these maintain their sensitivity until at least 20 dpa. During these period parameters typical of senescence, such as a decrease in the levels of the large subunit of RuBisCO and the increase in proteolytic activity on azocasein, polypeptids antigenically related to papain and recombinant tomato Cl4 thiolprotease, and in the expression of the Cl4-thiolprotease gene. None of these changes are detected if the ovary senescence is prevented and the fruit set and development was induced. The results obtained would indicate that the expression and/or activity of protease/s of the papain family in unpollinated ovaries are temporal and spatially regulated along the two alternative processes: senescence or fruit development.

Maskin, Laura. "Estudio de la familia génica Asr de tomate (Lycopersicon esculentum)" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo se estudiaron los miembros de la familia génica Asr de tomate (Asr1, Asr2 y Asr3). Por métodos computacionales se compararon las secuencias aminoacídicas de las proteinas codificadas y se realizó una búsqueda de proteinas homólogas que reveló la existencia de moléculas proteicas conservadas que se acumulan en situaciones de variados tipos de estrés y/o en fruto. La comparación de todas estas proteínas "tipo ASR", provenientes de muy distintas especies, mostró que la homología se encuentra concentrada en dos dominios particulares. Además, todas comparten caracteristicas estructurales como la alta hidrofilicidad,alta carga, sitios conservados de miristoilación y dos regiones hidrofóbicas. Por otro lado, se evaluó la expresión de cada uno de los miembros conocidos de esta familia génica en tomate (L. esculentum), determinándose que poseen un nivel de expresión variable en condiciones basales en los órganos analizados y que se inducen diferencialmente en respuesta al estrés hídrico, al daño, al frio y durante la maduración del fruto. Se observó que la expresión basal de Asr1 y Asr2 en hoja se limita especificamente a células acompañantes del floema. En condiciones de falta de agua, la expresión en hoja y en raíz se visualiza también en las células parenquimáticas adyacentes. Se muestran evidencias de que ASR forma agregados in vitro (dímeros y trímeros). Finalmente, ensayos preliminares de expresión en sistemas heterólogos demuestran que ASR1 provoca un aumento de la viabilidad de levaduras sometidas a estrés salino.

Abstract:
This work reports the study of the members of the tomato Asr gene family (Asr1, Asr2 and Asr3). Using computational methods, the amino acidic sequences were compared. A search of homologous proteins reveled the presence of conserved molecules that accumulate in responses to various types of stress and/or in fruit. Comparison of all these ASR-like proteins from different plant species showed that homology is concentrated at two particular domains. Besides, all of them share structural features like high hydrophilicity, high charge, a conserved myristoylation signal and two hydrophobic zones. In addition, the expression of each known member of the Asr family in tomato (L. esculentum) were evaluated. The results showed variable basal expression level in all the analyzed organs and differential induction in response to water stress, wounding, cold and during fruit ripening. In leaves, Asr1 and Asr2 basal expression was restricted to the companion phloem cells. Under water deficit conditions, this expression was also visualized in leaf and root parenchyma adjacent cells. Evidences that ASR form aggregates in vitro (dimers and trimers) are shown. Finally, preliminar assays in heterologous expression systems showed that ASR1 causes an increment in viability of yeast subjeted to salt stressed.

Giordano, Carla Valeria. "Efectos de la radiación ultravioleta- B solar sobre Gunnera magellanica, una planta nativa de Tierra del Fuego" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los ecosistemas de Tierra del Fuego se encuentran sometidos a aumentos estacionales de radiación ultravioleta-B (UV-B: 280-315 nm) durante la primavera, debido al pasaje del agujero de ozono sobre la región. En la presente Tesis estudiamos los efectos del UV-B y UV-A (315-400 nm) solares sobre el crecimiento, la generación de daño molecular (dímeros en el ADN y daño oxidativo componentes celulares), y la inducción de respuestas de aclimatación (reparación de dímeros del ADN y acumulación de compuestos fotoprotectores foliares), en la flora nativa de Tierra del Fuego. Para ello utilizamos la herbácea perenne Gunnera magellanica como modelo de estudio. Realizamos ensayos con dos acercamientos experimentales: exclusión de distintas porciones del UV solar en el campo mediante el uso de filtros plásticos, y utilización de dosis controladas de UV-B suministradas con lámparas en invernáculo. En los experimentos a campo encontramos un efecto inhibitorio del UV-B en la expansión foliar de G. magellanica, en forma consistente durante tres estaciones de crecimiento. En relación a las respuestas de aclimatación al UV, la fotorreparación fué el principal mecanismo de remoción de dímeros de pirimidina del tipo ciclobutano (CPDs) en esta especie. La capacidad de fotorreparación fué inducida por UV, y la velocidad varió en función de la temperatura, siendo mayor a 25 °C que 8 °C. La velocidad de reparación de CPDs en G. magellanica fué menor que la presentada por otras especies vegetales, particularmente al compararla con A. thaliana en idénticas condiciones experimentales. El UV solar no reguló los niveles de compuestos fotoprotectores foliares (flavonoides) ni la masa foliar específica en esta especie. El principal componente de la radiación solar generador de CPDs fué el UV-B. Sin embargo, el contenido de CPDs no varió durante el día acompañando las fluctuaciones naturales de UV-B, sino que fué levemente menor al mediodía que al atardecer y al amanecer. Este perfil diario de CPDs puede explicarse al considerar la fluctuación diaria de factores ambientales que favorecen la reparación de los dímeros (radiación UV-A, visible, temperatura). En los experimentos realizados en invemáculo, encontramos que todas las dosis de UV-B ensayadas (correspondientes a dosis de UV-B bajas, medias y altas registradas normalmente en Ushuaia durante la primavera) redujeron la expansión foliar de G. magellanica. Esta reducción en el crecimiento estuvo acompañada por aumentos en el contenido de CPDs (en forma dependiente de la dosis de UV-B). La mayor dosis de UV-B ensayada produjo un estado de estrés oxidativo transitorio (evaluado mediante la relación entre el contenido de radical ascorbilo y ácido ascórbico), que fué rápidamente controlado por un aumento en los niveles de ascorbato. El daño celular que mejor explicó la inhibición en la expansión foliar fue la acumulación de CPDs en el ADN, pero no el nivel de peroxidación lipídica. En conjunto, nuestros resultados indican que los niveles actuales de UV-B tienen un impacto principalmente negativo sobre G. magellanica, que se ve reflejado en la reducción del crecimiento. Las modestas velocidades de fotorreparación a temperaturas relativamente elevadas (y bajas a temperaturas menores), junto con la falta de inducción en los compuestos fotoprotectores foliares, indicarían que futuros aumentos del UV-B (debidos a la erosión de la capa de ozono) producirían mayormente efectos negativos en G. magellanica, sin la inducción concomitante de respuestas de protección eficientes. La reducción de la expansión foliar inducida por UV-B, estuvo acompañada por daño al ADN en la forma de CPDs, pero no por daño oxidativo a componentes celulares (por ejemplo, lípidos de membrana). Esto sugiere que el daño al ADN está implicado en los procesos que llevan a la reducción de la expansión foliar causada por el UV-B en esta especie.

Abstract:
The ecosystems in Tierra del Fuego are seasonally subjected to elevated ultraviolet-B radiation (UV-B: 280-315 nm) during the spring, due to the passage of the ozone hole over the region. In the present Thesis, we studied the effects of solar UV-B and UV-A (315-400 nm) on growth, production of molecular damage (dimers in DNA and oxidative damage to cellular components), and induction of acclimation responses (dimer repair in DNA and accumulation of photoprotective compounds in leaves) in native plants of Tierra del Fuego. We used the perennial herb Gunnera magellanica as a model organism. We carried out two different experimental approaches: exclusion of different portions of solar UV with plastic filters in the field, and exposure of plants to different UV-B doses using lamps inside a greenhouse. In the field experiments, we found an inhibitory effect of UV-B radiation on G. magellanica leaf expansion, which was consistently detected throughout three growing seasons. Regarding acclimation responses to UV, photorrepair was the main pathway of cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) removal in this species. Photorepair was slightly up regulated in plants exposed to solar UV. CPD photorepair was higher at 25 °C than at 8 °C. The rates of DNA repair in G. magellanica were modest compared to published values for other species, and were lower than those of Arabidopsis thaliana plants, grown under equivalent experimental conditions. The accumulation of UV-B absorbing compounds in leaves and the specific leaf mass were not affected by solar UV. UV-B was the main component of solar radiation that induced CPD formation in G. magellanica leaves. However, CPD levels did not fluctuate during the day tracking UV-B radiation, and were lower at noon than at dawn or in the morning. This daily CPD profile might be a consequence of the diurnal fluctuation of enviromental factors that promote CPD removal (UV-A, visible radiation, temperature). In the greenhouse experiments, realistic UV-B doses inhibited G. magellanica leaf expansion. This growth reduction was accompanied by high levels of CPDs. The higher UV-B dose induced oxidative stress (evaluated using the ascorbyl radical /ascorbate index), which was rapidly controlled by increments in ascorbate levels. The inhibition of leaf expansion correlated well with the CPD content, but not with levels of lipid peroxidation. Taken together, our results indicate that present-day levels of solar UV-B have mainly negative impacts on G. magellanica, with detrimental effects on growth. Modest photorepair rates at relatively high temperatures (and even lower at low temperatures), together with the lack of induction of UV-screening compounds in leaves, suggest that future increments in UV-B levels (caused by ozone reduction) would produce mainly damaging effects in G. magellanica, without sufficient enhancement of protective mechanisms. Inhibition of leaf expansion was well correlated with CPD levels, but not with oxidative damage to cellular components (such as membrane lipids), which sugests that DNA damage is involved in the inhibition of leaf expansion induced by UV-B in this species.

Manfreda, Vilma Teresa. "Absorción y eficiencia de uso de P en diferentes genotipos de trigo" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de la presente tesis fue el estudio de la regulación de los flujos de P y el consumo de lujo en plantas de trigo cultivadas en suministros de P no limitantes para el crecimiento. Este aspecto de la nutrición mineral ha sido objeto de poca atención por los investigadores a nivel mundial a pesar de su implicancia en los aspectos económicos relacionados con la fertilización del cultivo y la sustentabilidad de los sistemas. El acercamiento a los objetivos propuestos se realizó mediante la comparación de genotipos de trigo contrastantes en su eficiencia nutricional de P cultivados bajo condiciones controladas (cámara climática e hidroponia). Se emplearon soluciones de cultivo ya que, además del control estricto del nivel de suministro, permite la valoración de los flujos unidireccionales de P de las raíces (influjo y eflujo de P). Los pasos seguidos fueron: 1) seleccionar desde un conjunto de seis genotipos de trigo dos que fueran contrastantes en su economía del P y, 2) estudiar en ellos, con más detalle, el crecimiento, la tasa de absorción neta (SARP), flujos bidireccionales (influjo y eflujo de P) y la relación biomasa seca/contenido de P (cociente de utilización de P, CUP), como posibles indicadores de la eficiencia nutricional. Se presentan los resultados obtenidos en 0.05 y 5 mol.mˉ³ de P, suministros que mostraron no ser limitantes para el crecimiento. Los genotipos seleccionados fueron Buck candisur y Chaqueño INTA. El primero presentó un crecimiento, una SARP y un CUP mayor que Chaqueño INTA. Estos dos últimos parámetros fueron afectados por el suministro de P en forma diferente para cada genotipo. No se presentaron diferencias significativas entre genotipos ni en el influjo ni en el eflujo de P. Posteriormente se realizaron dos ensayos con estos dos genotipos de trigo, uno en cámara climática y otro en invernáculo, cultivados en un suelo deficiente de P fertilizado con altas dosis de PO4H2, con el fin de comprobar si las diferencias observadas en la SARP y CUP en hidroponia se mantienen en el cultivo con suelo. Los resultados mostraron las mismas diferencias genotípicas en la SARP y CUP que las encontradas en hidroponia. Se realizaron dos experiencias en hidroponia a fin de constatar qué flujos de P se relacionan con la concentración de P en las plantas. La obtención de plantas con distintas concentraciones internas de P se realizó mediante dos métodos: cambios de suministro de P (entre concentraciones no limitantes para el crecimiento) y privación total de P. Como resultado se observó que la SARP, la tasa de acumulación de P en las raíces (TAPr)y la tasa de transporte de P al vástago (TTPv) fueron los flujos que variaron junto con la concentración interna de P en las plantas, mientras que el eflujo e influjo de P presentaron escasas diferencias entre las plantas transferidas y las plantas control. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la absorción de P en suministros no limitantes para el crecimiento está más vinculada con los flujos internos de P (TAPr y TTPv), que con los flujos unidireccionales de entrada (influjo)y salida (eflujo) de este nutriente hacia y desde las raíces. Es de destacar las limitaciones metodológicas en la determinación de los flujos de P (en especial las relacionadas con diferentes tiempos de medición) y la alta variabilidad en los parámetros medidos (relacionados con diferencias entre unidades experimentales, ciclos de luz-oscuridad, etc.) que dificultan su utilización para comparar genotipos. Otro factor que podría haber comprometido las estimaciones de los flujos de P es su expresión por unidad de biomasa seca de raíces en vez de expresarla por unidad de área. Las posibles diferencias entre genotipos y/o entre suministros de P en la relación superficie:biomasa seca de raíces podrían enmascarar o aun arrojar diferencias espúreas en los flujos de P. Afortunadamente estas diferencias no fueron encontradas ni entre genotipos ni entre suministros, por lo que las estimaciones de los flujos realizadas con los pesos secos de raíces pueden asimilarse a las calculadas con la superficie de las mismas. Finalmente se analizó el conjunto de ensayos bajo otra perspectiva en los que se incluyó, además, datos de otro genotipo de trigo (Las Rosas INTA). Este enfoque se basa en el uso de las correlaciones entre las biomasas y el contenido de P que posibilitan identificar los cambios pasajeros en la aclimatación de las plántulas a los suministros de P, y eventualmente descartarlos en el análisis, permitiendo comparar el comportamiento general de los genotipos a más largo plazo. La pendiente de la relación entre el contenido de P y la biomasa seca por planta permitió establecer el valor de la concentración interna de P alcanzada a largo plazo (“concentración de tendencia”), como así también, la capacidad de cada genotipo de conservarla en diferentes suministros de P (0.05; 0.1 y 5 mol.mˉ³ de P). La diferencia de la concentración de P de tendencia entre los suministros indica el consumo de lujo de P entre suministros. Esta diferencia, entre 0.05 y 5 mol P.mˉ³, mostró que Chaqueño INTA presentó un menor consumo de lujo de P, Buck candisur el mayor, siendo el de Las Rosas INTA intermedio. La tasa de absorción neta (SARP) se redefinió mediante la regresión de la biomasa seca de plantas en el tiempo y con las correlaciones biomasa seca de plantas-biomasa seca de raíces y biomasa seca de planta-contenido de P de planta. El límite de la función obtenida para la SARP se interpretó como la “SARP de tendencia", quedando definida por dos componentes: 1) la concentración de P de tendencia y 2) producción-distribución de la biomasa. Ambos factores caracterizan a cada genotipo pero, mientras que el primero puede variar entre suministros de P, el último es constante para cada genotipo. Las diferencias entre genotipos muestran que Chaqueño INTA y Buck candisur difieren sólo en el primer componente, mientras que Las Rosas INTA difiere de estos dos genotipos por su menor producción-distribución de biomasa. Este análisis muestra que Las Rosas INTA posee la menor SARP, Chaqueño INTA intermedia y Buck candisur la mayor. La diferencia en el ordenamiento de genotipos según concentración interna de P o SARP pone en duda el valor de este último parámetro como estimador de la eficiencia de uso de P cuando su suministro es no limitante para el crecimiento. Otro elemento para dudar de la SARP (cuando se la estima en períodos cortos de tiempo, ej: horas) como estimador de la eficiencia nutricional es su variabilidad durante el ciclo de luz-oscuridad en estos suministros. Por último el influjode P (flujo que es sólo posible medirlo en lapsos de 20') es el parámetro de mayor variabilidad. Varía notoriamente entre unidades experimentales, durante el ciclo de luz-oscuridad, con la edad de las plantas y es además afectado por el suministro de P. En este conjunto de factores la variabilidad genotípica, aportada por los seis genotipos estudiados, fue prácticamente nula. No se encontraron correlaciones entre el influjo de P ni con la SARP ni con la concentración interna de P, sin embargo se pudo observar que disminuye en 5 y 0.1 mol P.mˉ³ y que aumenta en 0.05 mol.mˉ³ de P con el aumento de la biomasa. Los resultados muestran como poco adecuado el empleo de mediciones en tiempos cortos de los flujos de P como estimadores de su eficiencia nutricional cuando la disponibilidad de este elemento es alta.

Abstract:
The aim of the current thesis was to study P-fluxes and P-luxury consumption regulation in wheat plants grown in P-supplies which do not limit growth. This area of plant nutrition has been scarcely explored by workers in spite of its importance to the economy of crop fertilization and the sustainability of agronomical systems. The approach to the proposed objectives was to compare wheat genotypes of contrasting nutritional P efficiency, cultivated under controlled conditions (climatic chamber and hydroponics). Hydroponics was utilized because, besides the control of the supply, it allows the measurement of the unidirectional P fluxes in roots (P influx and efflux). The steps followed were: 1) to select, from a group of six wheat genotypes, two with contrasting P economy; and 2) to study in further detail their growth, specific absorption rate of P (SARP), bidirectional fluxes (P-influx and P-efflux) and the relationship dry biomass/P content (Phosphorus utilization quotient, PUQ), as possible indicators of nutritional efficiency. Results were obtained in P supplies of 0.05 and 5 mol P.mˉ³, concentrations that were shown not to be restrictive for growth. Selected genotypes were Buck Candisur and Chaqueño INTA. The first presented a higher growth, SARP and luxury consumption than Chaqueño INTA. The last two parameters were affected by P supply in a different way for each genotype. Significant differences were not observed among genotypes, neither in P influx or P efflux. Later on, experiments were carried out using both genotypes grown in a P deficient soil, one in a climatic camera and another in a glasshouse. High doses of PO4H2 were used with the purpose of checking if the differences observed in the SARP and PUQ between genotypes were maintained, a fact that was confirmed under these conditions. Two other experiments were carried out in hydroponics, with the aim of to verify which of those P-fluxes were related with plant P-concentration. Plants with different internal P concentrations were obtained by two methods: changing P supply (between non-growth limiting concentrations) and deficiency induced by total P deprivation. As a result, it was observed that SARP, P accumulation rate in roots (PARr) and P transport rate in shoots (PTRs) were the fluxes that varied with internal P concentration, while P efflux and influx showed scarce differences between transferred and control plants. These results support the hypothesis that P-uptake in high P supplies is more associated with internal P fluxes (PARr and PTRs) than with the input (influx) and output (efflux) of this nutrient towards and from roots. It should be emphasised that there are methodological limitations in the determination of P-flux (especially those related to different measurement times) and that there is high variability in the measured parameters (related to differences between experimental units, cycles of light-darkness, etc.) that hinder their use for comparing genotypes. Another factor that could have compromised the accuracy of the estimations of the P-fluxes is that they were expressed per unit of root dry matter instead of per unit of root area. Possible differences in the relationship between surface and root dry biomass among genotypes and/or among P supplies would mask or even create spurious differences in P-fluxes amongst them. Fortunately, these differences were neither found between genotypes nor between P-supplies. Therefore, the estimates of these fluxes carried out per unit root dry weight can be assimilated to those calculated using root surface. Finally, was analysed the group of experiments under another perspective, in which we included data of another wheat variety: Las Rosas INTA. The analysis was centred around the use of correlations between the biomasses and P content, which facilitate the identification of changes related to plant acclimatization to P supplies and eventually leads to their elimination from the analysis, allowing the comparison of the general behaviour of genotypes over the long term. The slope of the relationship between plant P-content and dry biomass per plant allowed the estimation of the value of internal P concentration reached over the long term (“trend P-concentration"), as well as the capacity of each genotype to conserve this concentration in different P supplies (0.05; 0.1 and 5 mol P.mˉ³). The difference of the trend P-concentration between non-limiting P-supplies indicates luxury consumption of P. This difference, calculated between 5 and 0.05 mol P.mˉ³, showed that Chaqueño INTA presented the lowest P luxury consumption, Buck Candisur the highest, and Las Rosas INTA an intermediate value. The net specific absorption rate of P (SARP) was redefined by means of the regression of plant dry biomass over time, and by two further correlations: a) plant dry biomass: root dry biomass; and b) plant dry biomass: Plant P content. The limit of SARP function (when time trends to infinite) was interpreted as a “SARP trend”. This value is defined by two components: the trend concentration of P, and the production distribution of biomass. Both factors are characteristics of each genotype, but, while the first can vary between P supplies, the second is constant for each genotype. Differences among genotypes showed that Chaqueño INTA and Buck Candisur only differ in the first component, while Las Rosas INTA differs in its smaller production-distribution of biomass. This analysis showed that Las Rosas INTA had the smallest, Chaqueño INTA intermediate and Buck Candisur the largest SARP. The different rank order obtained for the genotypes according to their internal P concentration or SARP brings into question the adequacy of this last parameter as an estimator of P use efficiency in high P supplies. Another reason for doubting the use of SARP as an estimator of the nutritional efficiency (when it is estimated during short times scale, i.e. hours) is its variability during the light-darkness cycle. Finally, P influx (flux that is only possible to measure in lapses of 20') is the more variable parameter. Besides, it is affected by P supply and shows great variation between experimental units, being affected by light-darkness cycles and plant age. In this group of factors the genotypic variability, contributed by the six genotypes studied, was practically null. They were no correlations found between P influx with the SARP or with the internal P concentration; however, it could be observed that it decreases in 5 and 0.1 and increases in 0.05 mol .mˉ³ of P with biomass increase. The results demonstrate the inadequacy of the employment of short time estimation of P fluxes as efficiency estimators in conditions of high availability of this nutrient.

Faigón Soverna, Ana. "Bases genéticas y moleculares de la interacción entre las respuestas fotomorfogénicas y las de defensa frente a patógenos" (2007) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La luz es uno de los principales factores ambientales que regulan el crecimiento y desarrollo de las plantas. A lo largo de su ciclo de vida, desde la germinación hasta la floración, las plantas monitorean la intensidad, la longitud de onda, la dirección y la duración de la luz y utilizan la información del ambiente lumínico para optimizar su desarrollo. La percepción de las señales lumínicas está mediada por fotorreceptores específicos como los fitocromos, del rojo al rojo lejano. En Arabidopsis thaliana, existen 5 fitocromos diferentes (PHYA, PHYB, PHYC, PHYD y PHYE). La percepción de los cambios en el ambiente lumínicos asociados a la presencia de plantas vecinas acelera el crecimiento de los tallos, la floración e induce la hiponastia. Conjuntamente estos cambios en el desarrollo se denominan síndrome de escape al sombreado y están mediados principalmente por el PHYB. Este trabajo aporta nuevos elementos para comprender los mecanismos implicados en la transducción de las señales lumínicas en plantas a través de la identificación de nuevos componentes involucrados en la vía de señalización del fitocromo B. En esta tesis se aisló y caracterizó al mutante csa1 (del inglés constitutive shade avoidance) por presentar el síndrome de escape al sombreado aún creciendo en condiciones no inductivas. csa1 posee una inserción de T-DNA en el segundo exón de un gen TIR-NBS-LRR (del inglés Toll/Interleukin1 receptor-nucleotide binding site-leucinerich repeat), generando así una proteína truncada que interfiere en la señalización de otras proteínas con dominios TIR. Hasta el momento las proteínas TIR-NBS-LRR habían sido implicadas únicamente en las respuestas de defensa en plantas; nuestros resultados indican que además estarían involucradas en la modulación de la vía de señalización del fitocromo B a través de la regulación de la expresión de PIF3. Además, detectamos que los niveles de expresión de los genes PIF3 y PIF4 (dos genes involucrados en las respuestas ftomorfogénicas) varían luego de la infección con Pseudomonas syringae. Finalmente, los resultados de estas tesis muestran que el mutante eds4 aislado originalmente por ser hipersensible a la infección con bacterias, está afectado en las vías de transducción de las señales lumínicas. En conjunto, los resultados de este trabajo constituyen el primer paso para comprender los mecanismos moleculares implicados en la interacción o cross-talk entre las vías de señalización que conducen a las respuestas foromorfogénicas y las que regulan las respuestas de resistencia frente al ataque de los patógenos.

Abstract:
Light is a critical factor for plant development. Plants monitor the intensity, quality, direction and duration of light and use the information to adapt and optimize their growth and development. Perception of light signal is mediated by specific photoreceptors such as phytochromes. Phytochromes are encoded by a family of five genes in Arabidopsis thaliana (PHYA, PHYB, PHYC, PHYD y PHYE). In plants, light signals generated by the presence of neighbors accelerate stem growth, flowering, and induce a more erect position of the leaves, a developmental strategy known as shade-avoidance syndrome. PHYB is the major contributor to shade avoidance responses. In this work we shed light on the mechanisms of light transduction, identifying new PHYB signaling components. We describe the constitutive shade-avoidance 1 mutant (csa1), which shows a shade- avoidance phenotype in the absence of shade. This mutant has a T-DNA inserted within the second exon of a Toll/Interleukin1 receptornucleotide binding site-leucine-rich repeat (TIR-NBS-LRR) gene, which leads to the production of a truncated protein that, in turn, interferes with TIR-proteins signaling. So far, TIR-NBS-LRR proteins had been only implicated in pathogen defense responses in plants. Our results show that they are also involved in PHYB signaling modulation, regulating PIF3 gene expression. In addition, we detected that PIF3 and PIF4 (two genes implicated in photomorphogenic responses) mRNA level changes after Pseudomonas syringae infection. Finally, we show that the eds4 mutant, which was originally isolated for displaying enhanced disease susceptibility to P. syringae, it is also defective in light signaling. Taken together, our findings constitutes a first step towards understanding the molecular mechanisms underlying the cross talk observed between photomorphogenic and defense responses.

Maroder, Horacio Luis. "Reacciones de deterioro de semillas: aspectos fisiológicos, químicos y ultraestructurales" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las semillas de las especies de sauce toleran la deshidratación a contenidos de agua similares a los de una semilla ortodoxa, pero pierden la viabilidad en unas pocas semanas a temperatura ambiente. Otra característica atípica es que los cloroplastos de los tejidos embrionarios de las semillas maduras conservan el sistema de endomembranas (tilacoides) aparentemente intacto y retienen la clorofila. En el marco de las investigaciones que se realizaron en el transcurso de esta tesis surgieron, junto a los resultados mencionados, otros que muestran los mecanismos que podrían estar involucrados en el deterioro y su reparación: 1. La luz, a través de la clorofila induce un intenso daño fotooxidativo mediados por radicales libres que se evaluó por el daño a ácidos grasos, proteínas, pigmentos lo que produjo principalmente la destrucción de las membranas tilacoides. 2. Se postula que dichas membranas que contienen clorofila, proteínas y pigmentos sería el lugar en el que se inicia el ataque fotooxidativo, el que se propagaría a otras estructuras, lo que se comprobó por evaluación de alteraciones en la permeabilidad de la membrana plasmática. 3. Si bien el ataque fotooxidativo es importante este queda mayormente restringido a los tejidos superficiales de la semilla, sin afectar sensiblemente la yema apical. 4. El daño a los tejidos superficiales determina que en las pruebas de germinación, el porcentaje de plántulas anormales sea inusitadamente elevado (disminución de la germinación normal), mientras que el porcentaje de plántulas vivas resultó sólo ligeramente menor que el que ocurre en oscuridad. 5. Las semillas que originan plantas anormales como consecuencia del ataque fotooxidativo muestran una notable recuperación de la germinación normal y de los daños metabólicos y estructurales antes mencionados, cuando se someten a humidificación. 6. Descartada la presencia de clorofila como causa importante de la mortalidad, quedan sólo dos reacciones a las que se consideran principales responsables del decaimiento de las semillas secas como son las reacciones de Maillard y de autooxidación. La primera no acompañó el descenso de la germinación total, pero si la segunda, por lo que quedaría la autooxidación como causa del rápido deterioro. 7. El ítem 6 lleva a considerar que la autooxidación en estas semillas debe ser mas activa que en otras que como estas, toleran la desecación, pero son mucho más longevas. 8. Ello podría deberse a que el estado del contenido celular presentó una mayor movilidad molecular y sea más poroso, lo que facilitaría la difusión del oxígeno, uno de los reactantes de la autooxidación. La mayor porosidad al facilitar la difusión del oxígeno y una mayor superficie lipídica atacable por ese agente debido a la desdiferenciación incompleta de las membranas, serían las causas iniciales del rápido deterioro de estas semillas.

Abstract:
Willow seeds tolerate dehydration at water contents (WC) equivalent to those of orthodox seeds, but they lose viability in few weeks at room temperature. Similarly unusual is the fact that the chloroplasts of embryonic tissues in mature seeds conserve their endomembrane system (thylakoids) apparently intact, in addition to retaining chlorophyll. During the investigations carried out in the course of this study, there emerged results, in addition to those aforementioned that reveal the mechanisms possibly involved in the deterioration process and its reparation: 1. Light produces, by means of chlorophyll, intense photooxidative damage, as mediated by free radicals (FR), which was evaluated for damage to fatty acids, proteins and pigments, and largely produced the destruction to the thylakoid membranes. 2. The photooxidative attack is believed to originate in those membranes containing chlorophyll, proteins and pigments, to later spread to other structures. This hypothesis was proven by the evaluation of alterations in plasma membrane permeability. 3. While important, the photooxidative attack is mainly confined to the superficial tissues of the seed, without sensibly affecting the shoot apical meristem. 4. The damage to superficial tissues is evident in germination tests, causing the percentage of abnormal seedlings to be unusually high (decrease in normal germination (NG)), while the percentage of live seedlings (normal + abnormal = total germination –TG-) turns out to be only slightly less than that which occurs in the darkness. 5. The seeds that originate abnormal plants, as consequence of photooxidative attack exhibit significant recovery of NG and of the metabolic and structural damages aforementioned, when submitted to humidification. 6. Once the presence of chlorophyll is discarded as a significant cause of mortality, only two reactions remain as potential causes of the decay in dry seeds, that is, the Maillard and autooxidation reactions. As the former does not occur simultaneously with the decrease in TG, autooxidation, which does coincide, is presumed to be the cause of the rapid deterioration. 7. Item 6 leads to the consideration that the autooxidation that occurs in these seeds must be more active than in others that, like these, tolerate desiccation but live much longer. 8. This could be due to the fact that the state of the cellular content presents a greater molecular mobility and/or is more porous, which would facilitate the diffusion of oxygen, one of the reactants in autooxidation. The increased porosity which facilitates diffusion of oxygen and the greater lipid surface attackable by that agent due to the incomplete dedifferentiation of the membranes, are proposed as the initial causes of rapid deterioration in these seeds.

Castellión, Martina Laura. "Procesos de deterioro y mecanismos de protección y reparación involucrados en la pérdida diferencial de la viabilidad durante el almacenamiento en semillas de Chenopodium quinoa Willd" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se estudió el deterioro producido durante el almacenamiento en semillas de seis cultivares de quínoa, originarios de dos regiones altamente contrastantes. Se evaluó la longevidad de las semillas y se aplicó la ecuación de la viabilidad de Ellis y Roberts (1980a). Aunque el cv. Chadmo mostró mayor longevidad que los demás cultivares estudiados, no se detectó una clara asociación entre la longevidad y las características de las regiones de origen de los cultivares. Se determinaron tiempos de relajación transversal por resonancia magnética nuclear de baja resolución (TDNMR) lo que permitió inferir que la cinética de las reacciones de deterioro que condujeron a la pérdida de viabilidad estaba determinada principalmente por el grado de movilidad de los protones del agua de multicapas. Al analizar la estabilidad de algunas macromoléculas luego del almacenamiento, se detectó la ocurrencia de insolubilización de proteínas por formación de agregados glicosilados de alto peso molecular, mediante cuantificación de proteínas y separación electroforética por SDS-PAGE seguido de reacción PAS. Sin embargo, este evento pudo ser revertido en todos los casos durante la imbibición pre-germinativa, aún en aquellos lotes de semillas que exhibían muy bajo poder germinativo, indicando que no se trataba de un evento determinante en la pérdida de viabilidad. El análisis por cromatografía gas-líquido, permitió confirmar la ausencia de auto-oxidación de ácidos grasos en el período de tiempo analizado, hecho atribuido al alto contenido de tocoferoles de las muestras.

Abstract:
Seed storage deterioration of six cultivars of quinoa from environmentally contrasting environments was studied. Seed longevity was evaluated and analyzed using the equation of viability (Ellis and Roberts, 1980a). Though cv.Chadmo showed the highest longevity, no correlation was detected between longevity and the origin of the cultivars. Transverse relaxation times, determined by time domain nuclear magnetic resonance (TD-NMR), demonstrated that the kinetics of deteriorative reactions leading to seed damage was mainly determined by proton mobility of multilayer water molecules. Protein insolubilization was detected due to protein glycosilation and aggregation by protein quantification and SDS-PAGE techniques. Nevertheless, this process could be overturned by pre-germinative humidification, indicating that it is not a determinant event associated to viability loss. As expected, high tocopherol contents prevented fatty-acids auto-oxidation as determined by gas-liquid chromatography.

Sellaro, Romina. "Integración dinámica de señales ambientales en Arabidopsis thaliana" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las plantas han desarrollado complejos sistemas que les permiten percibir el ambiente lumínico. Los resultados expuestos en este trabajo proponen mecanismos por los cuales la compleja red de señalización regula el crecimiento de las plántulas integrando señales lumínicas. El primero se refiere a la acción sinérgica de la luz azul y la luz roja. En plántulas de Arabidopsis cultivadas en luz roja (condición que activa a phyB), un corto suplemento de luz azul activa a cry1 generado así una respuesta sinérgica. En esta tesis encontré que el mecanismo de integración implica la activación de reguladores positivos como HY5, HYH, SPA1 y SPA4 por medio de los criptocromos al percibir una señal transitoria de luz azul. Luego de esta señal, los genes HY5, HYH, SPA1 y SPA refuerzan la señalización mediada por phyB. Como phyB se mantiene activo en oscuridad, el sinergismo permite la persistencia de los procesos que llevan a la autotrofía durante la noche. En la segunda parte, investigué la integración de señales fluctuantes de sombreado vegetal. Cuando una plántula crece en sombra, distintos genes de respuesta a hormonas y genes involucrados en la señalización de la luz como PIF4, PIF5 (que promueven el alargamiento del hipocotilo) aumentan su expresión. Cuando una plántula que estaba creciendo en sombra percibe luz no filtrada por plantas vecinas, aumentan los niveles de expresión de HY5. HY5 podría regular negativamente la señalización de auxinas e inhibir la expresión de reguladores positivos del crecimiento como son PIF4, PIF5, HAT2, PKS4, LHY y CCA1 evitando que se genere la respuesta máxima a la sombra. En ambos casos se observa como las plantas integran señales ambientales mediante la conexión de distintas vías de señalización.

Abstract:
Plants have developed complex systems that allow them to perceive the light environment. The results presented in this work proposes mechanisms by which the complex signaling network regulates the seedlings growth integrating light signals. The first relates to the synergistic action of blue light and red light. In Arabidopsis seedlings grown under red light (condition that activate phyB), a short supplement of blue light activate cry1 and generated a synergistic response. In this thesis I found that the mechanism of integration involves the activation of positive regulators such as HY5, HYH, SPA1 and SPA4 through the perception of transient signal of blue light by cryptochrome. After this signal, genes HY5, HYH, SPA1 and SPA reinforce the phyB-mediated signaling. Because phyB is active in darkness, synergism allows the persistence of the processes that lead to autotrophy during night. In the second part, I researched the integration of shade fluctuating signals. When a seedling grows in shade, several hormone-response genes and genes involved in signaling of light as PIF4, PIF5 (that promote hypocotyl elongation) increase their expression. When a seedling that was growing in shade perceived unfiltered light by neighboring plants, increase the expression levels of HY5. HY5 could negatively regulate auxin signaling and inhibit the expression of positive regulators of growth such as PIF4, PIF5, HAT2, PKS4, LHY and CCA1 preventing shade maximal response. Both cases shows how plants integrate environmental signals by connecting different signaling pathways.

Karayekov, Elizabeth Irene. "Los patrones de temperatura preparan a las plántulas para responder a la luz" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la naturaleza, las plantas están sometidas a ciclos de alternancia entre el día y la noche, que generan ciclos de luz-oscuridad y de alta-baja temperatura ambiente. De ese modo, una plántula etiolada que está en la oscuridad, bajo las primeras capas del suelo, recibe temperaturas alternadas antes de ser expuesta a la luz. En esta tesis se describe un efecto sinérgico de la exposición transitoria a temperaturas elevadas y la señal de luz sobre el proceso de desetiolación en Arabidopsis thaliana. Esta respuesta se manifiesta como un aumento en la inhibición del alargamiento del hipocotilo y el desplegado de los cotiledones. Se ha demostrado que este efecto sinérgico depende de phyB en su forma activa y de componentes río abajo en la vía de señalización iniciada por la luz. Realizando un análisis de los patrones globales de expresión de las plántulas tratadas con pulsos de calor y luz, se encontró un alto porcentaje de genes involucrados en la generación de ritmos circadianos que presentan niveles de expresión diferencial. Además, se probó que la combinación de pulsos de temperatura elevada y luz genera ritmos circadianos en el crecimiento del hipocotilo, demostrándose una relación entre el reloj biológico y el fenómeno de promoción de la des-etiolación. Se demostró que cuando las plántulas son entrenadas previamente con pulsos de temperatura elevada la sensibilidad a la luz presenta un ritmo circadiano, que se correlaciona con un ritmo de abundancia de ARNm de LHY y CCA1. Asimismo, se pudo relacionar la presencia de los genes PRR7 y PRR9 con la generación de ritmos de LHY por los pulsos de temperatura elevada en oscuridad. En conclusión, breves exposiciones a altas temperaturas causan oscilaciones rítmicas de varios genes entre los que se encuentran LHY y CCA1. La capacidad del fitocromo B de provocar la inhibición del crecimiento del tallo se manifiesta cuando los niveles de expresión de LHY y CCA1 son bajos.

Abstract:
In natural environments plants are exposed to day-night cycles that lead to light-dark and high-low ambient temperature alternations. While growing in the dark, under the soil, an etiolated seedling is exposed to temperature variations prior to reach the surface and receive light. We found that the combination of a brief exposure to high temperature before the exposure to light had a synergic effect on hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. We have demonstrated that active phyB and downstream pathway components are necessary for the synergic response to occur. Microarray data of seedlings exposed to high temperature and light stimulus have shown a large portion of genes involved in circadian rhythms with differential expression pattern compared to seedlings exposed only to light. We also found that the combination of a brief exposure to high temperature with exposure to light generates circadian rhythms on hypocotyl elongation rate. Additionally, we discovered that when seedlings are daily exposed to high temperature pulses a rhythmic sensitivity to light signals is developed. We have found a correlation between light sensitivity changes and LHY and CCA1 circadian expression levels. These mRNA oscillations caused by high temperature brief exposure in darkness are dependent on PRR7 and PRR9 genes. In this work, we described a new physiological phenomenon on early plant development caused by the interaction between light and temperature signals. We have also found a possible mechanism to explain how brief high temperature exposure could impact on light signal sensitivity.

Torres, Pablo Sebastián. "Regulación de factores de virulencia y biofilm en Xanthomonas spp" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) y Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) son los agentes causales de la pudrición negra en crucíferas y de la cancrosis de los cítricos, respectivamente. En ambas bacterias la producción de diversos factores de virulencia está regulada por un grupo de genes denominados rpf (por regulation of pathogenicity factors) a través de la síntesis y percepción de moléculas difusibles que ellas mismas producen y que se denominan DSF (diffusible signal factor). RpfF y RpfB son responsables de la biosíntesis de DSF y RpfC y RpfG están involucrados en su detección y posterior transducción de la señal al interior de la bacteria. Mutaciones en los genes rpfF y rpfC producen una reducción en la producción de enzimas y polisacáridos extracelulares, formación de biofilm y patogenicidad cuando son comparadas con las respectivas cepas silvestres, lo que involucra a estos genes en la regulación de factores involucrados en todos éstos procesos. Entre éstos, hemos detectado un nuevo factor que es secretado por Xcc, que tiene la propiedad de revertir el cierre de estomas inducido por ácido Absísico (ABA), Lipopolisacárido (LPS) o bacterias. Las mutantes rprF y rpfC no pueden revertir el cierre de estomas, demostrando que la síntesis de este factor es también regulada por el sistema rpf/DSF.

Abstract:
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) and Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) are the causative agents of crucifer black rot and citrus canker, respectively. In both bacteria the production of virulence factors is regulated by the rpf (for regulation of pathogenicity factors) gene cluster through the synthesis and perception of diffusible molecules called DSF (diffusible signal factor). RpfB and RpfF are responsible for the biosynthesis of DSF and RpfG and RpfC are involved in detection and subsequent signal transduction inside the bacteria. Mutations in the rpfC or rpfF genes produce a reduction in enzymes and extracellular polysaccharides production, biofilm formation and pathogenicity in comparison with the respective wild type strains. Among these, we identified a new factor that is secreted by Xcc, which has the ability to reverse the stomatal closure induced by abscisic acid (ABA), lipopolysaccharide (LPS) or bacteria. rpfC and rpfF mutants cannot reverse the stomatal closure, showing that the synthesis of this factor is also regulated by the rpf / DSF system.

Montti, Lía Fernanda. "Ecología y fisiología de Chusquea ramosissima, una especie de bambú monocárpico y los efectos de su floración sobre la dinámica y funcionamiento del Bosque Atlántico semideciduo" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Chusquea ramosissima es un bambú monocárpico muy abundante en el Bosque Atlántico semideciduo. Su presencia ocasiona cambios en la estructura y funcionamiento del ecosistema, al inhibir la regeneración de los árboles del dosel y disminuir la capacidad de cicatrización de los claros. La floración de los bambúes monocárpicos puede afectar la dinámica de los ecosistemas debido a su masiva mortalidad. A partir del año 2001 C. ramosissima comenzó a florecer y morir en diversas zonas de la provincia de Misiones (Argentina). El objetivo general de este estudio fue determinar las características ecofisiológicas de C. ramosissima asociadas a su gran capacidad de colonización y analizar si su floración y muerte constituye una oportunidad para la regeneración de las especies arbóreas. Para ello se realizaron estudios que incluyeron descripciones anatómicas y experimentos ecofisiológicos donde se realizaron comparaciones con otra especie de bambú congenérico presente en el área de estudio (Chusquea tenella) y trabajo de campo en parcelas permanentes. Chusquea ramosissima presentó características anatómicas que complementan la fisiología de la especie y le otorgan ventajas a la hora de competir en ambientes dinámicos. La floración ocurrió de forma asincrónica lo cual permitió mantener cierta cobertura de bambú vivo en extensas áreas durante el período de estudio. Luego de este evento, y en las áreas donde el bambú floreció se produjo un aumento en la radiación solar, se establecieron nuevas plántulas de bambú, se incrementó la abundancia de otras especies del sotobosque y se favoreció el crecimiento de los renovales establecidos. Los cambios ocasionados por la muerte de C. ramosissima, no obstante, estuvieron restringidos a un período de pocos años luego de su muerte. En síntesis, la floración y muerte de C. ramosissima no sería un determinante por si solo de la regeneración de árboles del dosel en el Bosque Atlántico semideciduo de Argentina.

Abstract:
Chusquea ramosissima is a monocarpic woody bamboo very abundant in the semideciduous Atlantic Forest, which colonizes gaps and open areas and affects the structure and function of this ecosystem by inhibiting the regeneration of canopy trees. The flowering of monocarpic bamboos can affect the dynamics of ecosystems due to gregarious mortality. During the year 2001 C. ramosissima started flowering in different areas of Misiones province. The general objective of this study was to determine the ecophysiological traits of C. ramosissima that confer to this species a high colonization capacity, and evaluate if the bamboo died-back promotes tree species regeneration. These studies included anatomical descriptions, ecophysiological experiments and comparative analysis of C. ramosissima and C. tenella and field work in permanent plots. Chusquea ramosissima presented anatomical features that complement the physiology of the species and give advantages when competing in dynamic environments. The flowering occurred asynchronously which allowed the persistence of live bamboo coverage over wide areas during the study period. Bamboo died-back resulted in higher levels of solar radiation in the forest understory, the emergence of new bamboo seedlings, increased abundance of other understory species, and higher growth of tree saplings. The changes brought about by the death of C. ramosissima, however, were limited to a period of a few years after the death of the bamboo. Flowering of C. ramosissima, followed by died-back, does not necessarily facilitate the recovery of the structure and function of the forest ecosystem.

De Pino, Verónica. "Estudio de la función de los polipéptidos reversiblemente glicosilados (Reversibly Glycosylated Polypeptide) en plantas de interés agro-económico" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las plantas explotan una variedad de mecanismos para regular la producción y el acceso a los azúcares en respuesta al desarrollo, al ambiente, y al estado metabólico. La síntesis de polisacáridos a partir de fotosintatos, como la sacarosa, es un proceso muy regulado en el que están involucradas invertasas y glicosiltransferasas. La estructura y destino de los polisacáridos es bien conocida, pero el mecanismo de biosíntesis particularmente la síntesis de novo y las enzimas que transfieren los azúcares siguen siendo un enigma a resolver. En este trabajo de tesis nos focalizaremos en unas proteínas muy particulares que fueron descubiertas intentando identificar componentes de la pared celular. Estas proteínas se denominan RGP, por “reversibly glycosylated polypeptide”, y tienen capacidad de autoglicosilarse, a partir de UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-Xyl y UDP-Ara dando como producto la proteína glicosilada y regenerando el nucleótido azúcar. Las RGPs están presentes en plantas superiores tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas, pero están ausentes en otras especies, lo que indicaría que su función está muy conservada en las plantas, aunque se sabe poco de su rol fisiológico (Moreno & Tandecarz 1982; Moreno et al. 1986; Delgado et al. 1998; Bocca et al. 1999). Un análisis filogenético (Wald et al. 2003) muestra que hay dos clases, clase 1, la mayoría de las RGps pertenece a esta clase, que es muy activa, y la clase 2, a la cual no se le asoció actividad, pero sí capacidad de interactuar con la clase 1. Se encontró una multiplicidad de isoformas en todas las especies donde está presente, aspecto asociado con su capacidad de formar homo y heterodímeros. Anteriormente se demostró que la expresión de la RGP se produce en los tejidos donde hay activa síntesis de pared celular, durante este trabajo mostramos que la expresión esta modulada por el desarrollo, la inducción hormonal y el estrés, clarificando el rol fisiológico de la RGP en la remodelación/reconstrucción de novo de la pared celular vegetal, en donde uno de los caminos metabólicos claves en dicho proceso de la célula vegetal es la síntesis de polisacáridos.

Abstract:
Plants exploit diversity of mechanisms to regulate the production and the access to sugars in response to developmental cues, the environment and to the metabolic sate. Polysaccharide synthesis upon photosynthates as sucrose is a highly regulated process, in which invertases and glycosyltransferases are implicated. Although the structure and destination of polysaccharides is well established, mechanisms of de novo synthesis as well as the identification of glycosyltransferases are yet an enigma to be resolved. This work is focused on a group of proteins called reversibly glycosylated polypeptide, RGP which have the unique capability to perform self-glycosylation upon incubation with UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-Xyl and UDP-Ara given as product the glycosylated protein and the regeneration of the nucleotide diphosphate. RGPs are present in higher plants; in monocotyledons as well as in dicotyledons, indicating that their functions is highly conserved, although little is known about their physiological role (Moreno & Tandecarz 1982; Moreno et al. 1986; Delgado et al. 1998; Bocca et al. 1999). A phylogenetic analysis of RGP (Wald et al. 2003) showed that there are two classes, class 1, the majority of RGP belongs to this class, which is highly active, and class 2, which is inactive but it has the capability to interact with the class 1 forming heteromultimers. It was found a multiplicity of forms of RGP in all species; this fact is associated with its ability to form homo and heterodimers. Previously, it was found that the expression of the RGP is particularly relevant in tissues where an active synthesis of cell wall take place. Here we demonstrate that the expression of the RGP is modulated by development, elongating involved hormones, germination as well by stress, clarifying the physiological role of the RGP in the remodeling/de novo synthesis of the plant cell wall, where the synthesis of polysaccharide is a key metabolic pathway.

Pais, Silvia Marina. "Caracterización de fosfatasas de proteínas 2 A en Solanum tuberosum L. y su participación en vías de señalización asociadas a tuberización y estrés" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La fosforilación reversible de proteínas tiene un rol importante en la señalización asociada al desarrollo y al estrés en plantas. Algunos estudios sugieren que las fosfatasas de proteínas 2A (PP2A) están involucradas en estos procesos. El objetivo de este trabajo fue caracterizar las subunidades catalíticas de PP2A (PP2Ac) en Solanum tuberosum L. y estudiar su participación en la señalización asociada a la tuberización y el estrés. Búsquedas bioinformáticas en bases de datos de ESTs revelaron la presencia de seis isoformas de PP2Ac en S. tuberosum. Estas isoformas muestran patrones de expresión diferentes en distintos órganos de la planta y sus niveles cambian durante la formación del tubérculo. Se ha propuesto que las señales hormonales y ambientales que modulan la tuberización son integradas en las hojas. Para estudiar el rol de las PP2As en respuesta a condiciones que afectan la tuberización, se analizó la expresión en hojas de los genes “específicos de tubérculo” Patatina y Pin2, en presencia o ausencia de inhibidores de estas fosfatasas. Se encontró que una alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio (condición promotora de la tuberización) estimula la expresión de Patatina y Pin2 posiblemente mediante el aumento de la actividad de PP2A, sin afectar los niveles de ARNm y proteínas de PP2Ac. Por otro lado, el ácido giberélico (GA, regulador negativo de la tuberización), disminuye el nivel de ARNm de algunas de las subunidades catalíticas, lo que se correlaciona con una menor cantidad de proteínas PP2Ac. Esta disminución causada por el GA inhibiría las señales de tuberización río abajo de los efectos inductores de una alta relación sacarosa/nitrógeno. Por otro lado, para estudiar la participación de las PP2As en la señalización asociada al estrés, se estudió la expresión de genes de respuesta a estrés en presencia o ausencia de un inhibidor de estas fosfatasas y se determinaron los patrones de expresión de las subunidades catalíticas en dichas condiciones. Se observó que las isoformas de PP2Ac son diferencialmente reguladas en respuesta a estrés y que estas fosfatasas tendrían un rol positivo en la señalización asociada a salinidad, mientras que regularían negativamente la transducción del estrés biótico.

Abstract:
Protein phosphorylation/dephosphorylation plays critical roles in development and stress signaling in plants, and some studies have suggested that protein phosphatases 2A (PP2A) are involved in these processes. The aim of this work was to characterize PP2A catalytic subunits (PP2Ac) in Solanum tuberosum L. and to study their involvement in tuberization and stress signaling. Bioinformatic searches of EST databases revealed the presence of six PP2Ac isoforms in S. tuberosum. PP2Ac isoforms show distinct expression patterns in different organs and are developmentally regulated during tuber formation. The hormonal and environmental signals that modulate potato tuberization are thought to be integrated in the leaves. To study the roles of PP2A in the leaf responses to conditions that affect tuberization, the expression of the “tuber-specific” genes Patatin and Pin2 was analyzed in the presence or absence of PP2A inhibitors. It was found that a high sucrose/nitrogen ratio, which promotes tuber formation, increases the transcript levels of Patatin and Pin2 possibly by increasing the activity of PP2As, without affecting PP2Ac mRNA or protein levels. In addition, gibberellic acid (GA), a negative regulator of tuberization, down-regulates the transcription of some of the PP2Ac isoforms, decreasing their protein levels. PP2Ac downregulation by GA may inhibit tuberization signaling downstream of the inductive effects of a high sucrose/nitrogen ratio. These results suggest that PP2As may act as molecular switches that can be regulated by signals that affect tuberization to activate or inhibit the response. In addition, to determine if PP2As are involved in stress signaling in potato plants, the expression of stress-responsive genes was analyzed in the presence or absence of a PP2A inhibitor. PP2Ac expression profiles in response to different environmental stresses were also determined. The results obtained show that the expression of different PP2Ac isoforms is modified in response to stress, and that these phosphatases may positively regulate salt stress signaling while having a negative role in biotic stress signal transduction.

Peluffo, Lucila. "Caracterización de los mecanismos de defensa a sclerotinia sclerotiorum, agente causal de la podredumbre del estudio de perfiles metabólicos y transcripcionales" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En Argentina, la podredumbre húmeda del capítulo, causada por el patógeno necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum, es una enfermedad que provoca serias mermas en la producción y tiene una incidencia anual promedio sobre la producción de la pampa húmeda del 10-20%. Los síntomas de la enfermedad se manifiestan al final de la etapa de floración o durante el llenado de granos por lesiones en el receptáculo que pueden extenderse y afectar todo el capítulo, produciendo la caída del mismo. En estados avanzados de podredumbre, se forman esclerocios, estructuras de resistencia del hongo, que pueden permanecer en los tejidos o en suelo y mantenerse viables por más de 8 años constituyendo el inóculo para futuras infecciones. La resistencia a Sclerotinia sclerotiorum en girasol es compleja, habiéndose detectado varios loci de carácter cuantitativo (QTL) específicos de línea, órganos y condiciones ambientales de crecimiento. Dicha complejidad ha limitado el desarrollo de germoplasma resistente por medio del mejoramiento clásico, reforzando la necesidad de la utilización de herramientas genómicas que incluyan tanto marcadores neutros para el mapeo de QTL como el desarrollo de marcadores funcionales desarrollados sobre genes candidatos para la resistencia al patógeno. El conocimiento de los factores determinantes de la patogénesis y las respuestas de defensa del hospedante constituyen factores claves para la identificación de dichos genes candidatos. Uno de los aspectos más destacados del mecanismo de invasión de S. sclerotiorum es la degradación de la pared celular, siendo el ácido oxálico producido por el patógeno uno de los determinantes de la patogénesis, a través de la acidificación y el secuestro de Ca^2+ de la pared celular del tejido hospedante. Asimismo, el ácido oxálico ejerce una regulación dual de la producción de especies reactivas de oxigeno (ROS). Por un lado, en los primeros estadios de la infección el ácido oxálico induce la generación de ROS y la inducción de una muerte celular programada (PCD) en una marera dependiente del pH generando un ambiente favorable para el desarrollo del patógeno, la adquisición de nutrientes y el establecimiento de la relación necrotrófica. Por el otro lado a medida que la infección progresa y al ácido oxálico se acumula en los tejidos del hospedante, el pH disminuye acompañado de la inhibición del estallido oxidativo y la PDC provocando así la muerte celular pero de una manera necrotrófica. En el presente trabajo se abordó el análisis del perfil metabólico primario, el perfil transcripcional de genes candidatos y los perfiles hormonales de dos líneas de girasol con comportamiento contrastante frente a la infección producida por S. sclerotiorum (HA 89 susceptible y RHA801 moderadamente resistente). Aplicando un método de estudio de perfiles metabólicos basado en la técnica de GC/MS, fue posible detectar diferentes patrones involucrando 63 metabolitos entre ellos azucares, aminoácidos, ácidos orgánicos, ácidos grasos y algunos metabolitos secundarios en flores de girasol que constituyen el órgano principal de infección de este patógeno. Los análisis estadísticos paramétricos y multivariados mostraron diferencias metabólicas entre estos dos líneas, así como también efectos de interacción entre línea y los días post inoculación. Los análisis de correlación de redes sugieren que estos cambios metabólicos están sincronizados en una manera dependiente del tiempo en respuesta al patógeno. Se detectaron mayor cantidad de cambios metabólicos diferenciales en la línea susceptible que en la resistente, esto se evidencia en el mayor número de interconexiones que presenta la línea susceptible entre los módulos de metabolitos formados por compuestos pertenecientes a las mismas vías. Por otro lado, la línea resistente muestra mayor interconexión entre metabolitos pertenecientes a las mismas vías. La evaluación de estos datos también demuestra una regulación línea específica de las distintas vías metabólicas, sugiriendo la importancia de detección de patrones metabólicos, en lugar de cambios específicos de metabolitos individuales, cuando se buscan marcadores metabólicos que responden diferencialmente a la infección der patógenos. Por otra parte el análisis de patrones de actividad de enzimas claves del metabolismo primario del carbono (sacarosa sintasa y las invertasas de pared celular, citológica y vacuolar), foto-respiración (catalasa) y del metabolismo de los fenilpropanoides (fenilalanina-amonio-liasa-PAL), mostró también diferencias entre líneas a tiempos tempranos del proceso de infección. La actividad catalasa presentó un aumento significativo en la línea resistente, que indicaría una regulación diferencial de la fotorespiración frente a la infección del patógeno, disminuyendo el nivel de ROS. Para la identificación de nuevos genes candidatos involucrados en la resistencia a este patógeno se construyeron colecciones de ADNc basadas en la técnica SSH de flores de girasol inoculadas y no inoculadas a partir de una línea resistente a los 2 y 4 días post inoculación. Esta estrategia dio como resultado la obtención de secuencias diferencialmente expresadas entre las flores inoculadas y no inoculadas. La mayoría de estos genes están involucrados en los procesos de traducción de proteínas, en los procesos de óxido reducción entre los cuales se encuentra un gran número de genes de respuesta a estreses biótico y abiótico, numerosos genes involucrados en el metabolismo primario. Del mismo modo, también se detectó un alto porcentaje de secuencias sin similitud con secuencias disponibles en bases de datos, sugiriendo que podrían codificar para genes no descriptos previamente, involucrados en la respuesta del girasol frente a este patógeno. De las clonotecas generadas se seleccionó un conjunto de genes para validar su comportamiento por qRT-PCR. De este conjunto, los genes quitinasa, un elemento de respuesta a etileno y el factor de transcripción WRKY7 mostraron patrones de expresión diferenciales entre las muestras inoculadas y controles a los distintos días post inoculación, sugiriendo que estos genes se encuentran involucrados en la respuesta del girasol frente a S. sclerotiorum. Asimismo se identificó un número importante de genes asociados a defensa a patógenos que se expresan en altos niveles en flores de girasol de la línea resistente aún en condiciones control, sin inoculación con el patógeno. Se estudiaron los perfiles hormonales para el ácido salicílico y para el ácido jasmónico por medio de la técnica LC-ESI-MS/MS. Estos estudios corroboraron que el ácido salicílico no contribuye a la resistencia contra S. sclerotiorum y que además se acumula en los tejidos infectados por este hongo, particularmente en la línea susceptible. A su vez, estos estudios demostraron que el jasmónico estaría asociado a la resistencia frente a este patógeno en las flores de girasol de la línea resistente. La integración del análisis de perfiles metabólicos, transcripcionales y perfiles hormonales contribuyó a una mejor comprensión de los cambios en el metabolismo en los capítulos de girasol durante los primeros estadios de la infección facilitando la identificación de genes y vías metabólicas involucradas en la respuesta al patógeno necrotrófico S. sclerotiorum. Asimismo la identificación de cambios en perfiles metabólicos y transcripcionales de genes candidatos, entre líneas resistentes y susceptibles, posibilita el desarrollo de biomarcadores metabólicos y marcadores funcionales para su aplicación en el mejoramiento asistido del cultivo de girasol.

Abstract:
Sclerotinia sclerotiorum, the causal agent of sunflower head rot, represents one of the main constrains in sunflower production in Argentina, with an average annual incidence of 10-20% of total yield of the main growing area, especially when flowering takes place during periods ofexcessive rainfall. The symptoms appeared at the end of the flowering stage or during grain filling, as water-soaked lesions on the receptacles. The fungus can decay the entire receptacle leaving only a bleached, shredded skeleton with large sclerotia. These sclerotia are resistance structures that can remain viable for more than 8 years in the soil and are main sources of inoculum for future infection. S. sclerotiorum resistance in sunflower is complex; several underlying QTLs were found to be specific for genotype, organ and environmental conditions. This complexity has limited the development of resistant genotypes by classical breeding, thus strengthening the need of using genomic tools such as neutral markers for QTL mapping and the development of functional markers based on candidate genes for resistance to this pathogen, for association mapping.. Insights into pathogenesis determinant factors and host defense responses are key factors for the identification of candidate genes. Degradation of plant cell wall is of major importance in the S. sclerotiorum invasion. Oxalic acid (OA) secreted by this pathogen induced pathogenesis by lowering the pH and chelating host cell-wall-Ca^2+ In the early stages of the infection process, low levels of OA elicits reactive oxygen species production (ROS) in host plant tissues, triggering programmed cell death and thus, creating a favorable environment for its development. As OA accumulates, the pH is lowered and the interaction becomes necrotrophic in nature, with the concomitant suppression of ROS and PCD, enabling further pathogen invasion of plant tissue. In the present work primary metabolic profiling, transcriptional profiling of candidate genes and phytohormone profiling was conducted in two sunflower inbred lines with contrasting behavior to S.sclerotiorum infection (HA89 susceptible, RHA801 resistant) Applying a metabolic profiling approach based on GC/MS, different patterns were identified, involving 63 metabolites including major and minor sugars and sugar alcohols, organic acids, amino acids, fatty acids and few soluble secondary metabolites in the sunflower capitulum, the main target organ of pathogen attack. Both point-by-point and non-parametric statistical analyses showed metabolic differences between genotypes as well as interaction effects between genotype and time after inoculation. Network correlation analyses suggested that these metabolic changes were synchronized in a time-dependent manner in response to the pathogen. Differential metabolic changes were detected to a higher extent in the susceptible line rather than in the moderate resistant line, this is in the susceptible line a higher number of interconnection are observed between modules composed by intermediates of the same pathway. Instead, in the resistant one, larger connections of metabolites within modules were detected. Evaluation of these data also demonstrated a genotype specific regulation of distinct metabolic pathways, suggesting the importance of detection of metabolic patterns rather than specific metabolite changes when looking for metabolic markers differentially responding to pathogen infection. The enzymatic activity analysis of key enzymes of the primary carbon (sucrose synthase and cell wall, cytosolic and vacuolar invertases), photorespiratory (catalase) and phenylpropanoid metabolism (phenylalanine ammonia-lyase -PAL-) showed differences between genotypes at early time point of the infection progress. A significant threefold increase in the catalase activity of the resistant genotype was observed, indicating a differential regulation in photorespiration in response to pathogen infection by lowering ROS levels. Subtractive cDNA libraries of inoculated and mock inoculated flowers at 2 y 4 DPI were constructed for identification of candidate genes involved in S. sclerotiorum resistance using a PCR-based suppression subtractive hybridization (SSH) method. Differentially expressed sequences between inoculated and mock inoculated flowers were obtained, including sequences coding for genes involved in protein transduction process, oxidorreduction process, genes involved in abiotic and biotic stress responses, genes involved in primary metabolism and a high number of sequences with no homology to sequences deposited in data bases, suggesting that they could be coding for new genes involved in sunflower response to S. Sclerotiorum. A group of 16 genes was selected for validating these libraries by qRT-PCR, genes coding for chitinase (AN: ABJ74186), Ethylene responsive element (AN: XP_002275892) and the transcription factor WRKY7 showed differential expression patterns between inoculated and mock inoculated flowers, suggesting that these genes are involved in sunflower response to S. sclerotiorum. Besides, a large number of defense-related genes were identified as constitutively expressed in mock inoculated flowers of the resistant genotype. Hormonal profiling analysis of Salicylic and jasmonic acid levels were determined by LC-ESI- MS/MS at different time points after inoculation in inoculated and mock inoculated sunflower flowers. These studies support the findings that SA does not contribute to resistance against S. sclerotiorum, moreover SA accumulation was induced in diseased tissues particularly in the susceptible genotype. Furthermore this work showed that JA was associated to resistance against this pathogen in sunflower capitula. The integration of metabolic, transcription and hormone profiling analysis contributed towards a better understanding of sunflower capitulum metabolism changes during the early stages of infection, greatly facilitate the selection of candidate genes for this plant-pathogen interaction, thus allowing the development of metabolic biomarkers and functional markers based on candidate genes, for application in sunflower breeding programs.

Petrillo, Ezequiel. "Regulación del splicing alternativo en plantas. Efectos de la luz por señales retrógradas y de la metil-transferasa de proteínas PRMT5" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Como organismos sésiles, las plantas superiores se caracterizan por un alto grado de plasticidad en el desarrollo en respuesta a las señales ambientales, optimizando así sus funciones de una manera que maximiza sus posibilidades de supervivencia y reproducción. Son capaces de detectar la calidad, cantidad y dirección de la luz, y utilizarla como una señal externa para optimizar su crecimiento. Por otra parte, el splicing alternativo es un mecanismo esencial para aumentar la plasticidad del transcriptoma que juega importantes roles en varios aspectos del desarrollo de los metazoos. Sin embargo, poco se conoce del proceso en plantas y de las consecuencias del mismo. Aquí demostramos que el splicing alternativo de varios genes de Arabidopsis thaliana está regulado por transiciones de luz/oscuridad. Para el caso particular de RSp31 (un gen que codifica para una proteína reguladora de splicing o SR) es la intensidad de la luz incidente la que tiene un efecto directo sobre su transcripción y procesamiento. El cloroplasto percibe la luz y genera una señal (retrógrada) capaz de viajar por la planta que provoca los cambios observados en la abundancia relativa de isoformas de RSp31. Las plastoquinonas, componentes de la cadena de transporte electrónico fotosintético, serían un lugar de integración de diferentes señales y una pieza clave en la respuesta de RSp31 a la luz. Por otra parte, demostramos que la metil‐transferasa de proteínas PRMT5 es un importante regulador del proceso de splicing alternativo en Arabidopsis thaliana y está involucrada en la generación de respuestas circadianas en esta planta. Reunimos evidencia que apunta a un efecto sobre el reconocimiento de los sitios dadores (5’ss) de splicing en el mecanismo por el cual PRMT5 ejerce su modulación sobre el proceso de splicing alternativo. Tal mecanismo estaría conservado en Drosophila melanogaster. En este organismo, al igual que en Arabidopsis, PRMT5 regula la expresión y los patrones de splicing alternativo de numerosos genes. Sin embargo, si bien controla la actividad locomotora (una respuesta mediada por el reloj), su vínculo con el oscilador central es más difuso.

Abstract:
As sessile organisms, higher plants are characterized by a high degree of developmental plasticity in response to environmental signals, thereby optimizing their developmental patterns in a manner that maximizes their chances of survival and reproduction. Plants are able to detect the quality, quantity and direction of light and to use it as an external cue to optimize their growth. On the other hand, alternative splicing is an essential mechanism to increase transcriptome’s plasticity that plays important roles in various aspects of metazoan development. However, little is known of this process and its consequences in plants. Here we show that alternative splicing of several genes of Arabidopsis thaliana is regulated by light/dark transitions. For the particular case of RSp31 (a gene encoding a splicing regulator or SR protein) it is the intensity of light what leads to the effect on transcription and processing. The chloroplast senses light and creates a retrograde signal that travels through the plant that causes the observed changes in the relative abundance of RSp31’s isoforms. The plastoquinone pool, from the photosynthetic electron transport chain, would be a place for integration of different signals and a key factor responsible for RSp31 responses to light. We also identified the protein‐arginine methyltransferase PRMT5 as an important splicing regulator in Arabidopsis thaliana which is involved in circadian responses. We raised evidence pointing at an effect on the recognition of the splicing donor sites (5'ss) underlying the mechanism by which PRMT5 regulates the alternative splicing process. Such a mechanism would be conserved in Drosophila melanogaster. However, while controlling locomotor activity in this organism (a response mediated by the clock), the link to the central oscillator appears more diffuse.

Crepy, María Andrea. "Beneficio mutuo entre plantas emparentadas" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las respuestas de las plantas al ambiente luminoso, históricamente interpretadas como reacciones de competencia, pueden dar origen a reacciones más cercanas al altruismo cuando existe reconocimiento de parentesco. Al cultivar plantas de Arabidopsis thaliana en macetas individuales dispuestas en un diseño rectangular (poca distancia entre plantas dentro de la hilera, mucha distancia entre hileras), hemos observado que las plantas aumentan la proporción de hojas dispuestas perpendicularmente a las hileras. Este patrón no se da si se combinan individuos genéticamente diferentes en la misma hilera o si se combinan individuos genéticamente iguales pero con edades distintas. El ordenamiento se debe a cambios en la dirección de crecimiento de las hojas y es una respuesta mediada por el fitocromo B, criptocromos y fototropinas (principales receptores de las señales lumínicas generadas por un diseño rectangular). Esta disposición de las hojas aumenta el auto-sombreado de las hojas más viejas (con menor capacidad fotosintética), mientras que reduce el sombreado mutuo permitiendo la exposición a la luz de las hojas más jóvenes. Decimos entonces, que el reconocimiento de parientes genera un beneficio mutuo, donde el costo (incremento de auto-sombreado) es rápidamente compensado por la reducción del sombreado mutuo. Esto se ve reflejado en el fitness reproductivo cuando se compara con individuos que no acomodan sus hojas hacia los laterales.

Abstract:
Plant responses to the light environment, historically interpreted as part of the competition reactions, can lead to altruistic behavior when there is kin recognition. When plants of Arabidopsis thaliana grown in individual pots were arranged in a rectangular design (i.e. a larger distance between rows than within the same row), we observed that plants showed increased proportion of their leaves placed perpendicular to the row. This pattern of leaf orientation does not occur when the rows involved seedlings of different genotype or seedlings of the same genotype but different age. This leaf arrangement is due to the redirection of leaf growth. This response mediated by phytochrome B, cryptochromes and phototropins (the main receptors of light signals generated by a rectangular design). This arrangement of the leaves increases self-shading of leaves, while reduces mutual shading. Therefore, kin recognition generates mutual benefit, where the cost (increased self-shading) is rapidly compensated by the reduced mutual shading. This is reflected on reproductive fitness when compared with individuals who failed to reorient leaf growth to out of the row.

Andrioli, Nancy Beatriz. "Evaluación de agentes químicos con potencial genotóxico en células meristemáticas de Allium cepa" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La toxicidad y genotoxicidad del Metronidazol (MTZ) y Tiabendazol (TBZ) fueron estudiados en raíces de Allium cepa. Ambos compuestos, inhibieron el crecimiento de las raíces en el rango de concentraciones 10-500 μg/ml. La exposición a 250μg/ml MTZ, indujo peroxidación lipídica y aumento significativo en los niveles de glutatión reducido en la zona de elongación. En la zona meristemática no se observó peroxidación lipídica y la respuesta antioxidante enzimática como actividad catalasa y superóxido dismutasa y no enzimática como contenido de ascorbato y dehidroascorbato, se incrementaron significativamente. Las células expuestas a 10-250 μg/ml de MTZ no mostraron efectos genotóxicos sugiriendo que las defensas antioxidantes contrarrestaron los radicales libres generados por exposición a MTZ. El TBZ indujo efectos genotóxicos para rango de concentraciones 50-250 μg/ml como inhibición del índice mitótico, alteración de índices de fase e inducción de biomarcadores citogenéticos de genotoxicidad. La inmunodetección de moléculas de tubulina , demostró el TBZ induce daño en las estructuras microtubulares promoviendo anormalidades en la segregación cromosómica y en la citocinesis. Los resultados obtenidos indicaron que la acción del MTZ estaría vinculada con la generación de radicales libres, mientras que el TBZ actuaría interfiriendo con la dinámica de formación de las estructuras microtubulares.

Abstract:
The toxicity and genotoxicity of metronidazole (MTZ) and Thiabendazole (TBZ) were studied in of Allium cepa roots. Both compounds inhibited the growth of roots for the concentration range 10-500 mg / μl. 250μg/ml MTZ exposure, induced lipid peroxidation and significantly increased of reduced glutathione levels in the elongation zone. In the meristem zone was not observed lipid peroxidation and enzymatic antioxidant response as catalase and superoxide dismutase activity and not enzymatic response as content of ascorbate and dehydroascorbate, increased significantly. Cells exposed to 10-250 μg / ml of MTZ showed no genotoxic effects, suggesting that antioxidant defenses offset the free radicals generated by exposure to MTZ. The genotoxic effects induced TBZ concentration range 50-250 μg / ml and inhibition of mitotic index, phase index alteration and induction of cytogenetic biomarkers of genotoxicity. The Immunodetection of tubulin molecules, demonstrated the TBZ induces damage to the microtubule structures and promote abnormalities in chromosome segregation and cytokinesis. The results indicated that the action of MTZ would be linked to the generation of free radicals, while TBZ act by interfering with the dynamics of formation of microtubule structures.

Di Santo, Mariana Carolina. "Caracterización de genes codificantes de glicosidasas de pared celular relacionadas al crecimiento y a la maduración de prunoideas" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La arabinosa es el prinicipal azúcar neutro no celulósico de la pared celular de durazno (Prunus persica (L.) Batsch) y de ciruela japonesa (Prunus salicina Lindl), observándose una pérdida neta de arabinosa tanto durante la maduración y el ablandamiento como en etapas previas a dicho proceso. Las α-L-arabinofuranosidasas y α-L-arabinofuranosidasas/β-D-xilosidasas son enzimas responsables de estas modificaciones en la pared celular de Prunus persica (L.) Batsch y de Prunus salicina Lindl. Se obtuvieron clones completos de ADNc desconocidos de durazno (PpARF1) y de ciruela japonesa (PsARF/XYL). Además, el gen PsARF/XYL fue clonado y secuenciado. PsARF/XYL presentó dos variantes de ARNm maduro, uno completamente spliceado y otro con un intrón terminal retenido, probablemente debido a splicing alternativo. La proteína deducida a partir de este último, resulta en un péptido truncado en su porción carboxi-terminal que podría alterar su funcionalidad pero que no implica la pérdida de los aminoácidos del sitio activo. También se obtuvieron secuencias parciales de un gen de ciruelo japonés denominado PsARF1 (por su homología con PpARF1) el cual fue incluido en los análisis de expresión génica. Reacciones de RT-PCR para el gen PsARF/XYL en distintas fases de la ontogenia y maduración del fruto reveló una expresión diferencial de los dos transcriptos alternativamente spliceados. Aunque PsARF1 se expresa durante el climaterio, se inhibe fuertemente ante tratamientos con etileno. En todos los casos analizados, los transcriptos se detectaron en otros tejidos de la planta, tanto vegetativos como reproductivos. Los resultados sugieren fuertemente que la expresión de estos genes de pared celular se encuentra regulada a nivel transcripcional y post-transcripcional en distintos tejidos y estados de desarrollo y que el etileno, hormona de la maduración en frutos climatéricos, podría participar en esa regulación.

Abstract:
Arabinose es the major non-cellulosic neutral sugar in the peach (Prunus persica (L.) Batsch) and japanese plum (Prunus salicina Lindl) cell wall and a net loss of arabinose residues accurs during ripening and softening and even in stages prior to this process. The α-L-arabinofuranosidases and α-L-arabinofuranosidase/β-D-xylosidases are enzymes responsible for these changes in the cell wall. In this work we characterized genes encoding cell wall glycosidases of Prunus persica (L.) Batsch and Prunus salicina Lindl. We obtained unknown full cDNA clones of peach (PpARF1) and Japanese plum (PsARF1/XYL). In addition, the gene PsARF/XYL was cloned and sequenced. PsARF/XYL presented two variants of the mRNA, a completely spliced and another terminal intron retained probably due to alternative splicing. The protein deduced from the latter, resulting in a truncated peptide at its carboxy-terminal portion tha could affect their functionality but that does not involve the loss of active site amino acids. Partial sequences of a gene called PsARF1 of Japanese plum (given its homology with PpARF1) were also obtained, which was included in the analysis of gene expression. PpARF1 expression was detected in mesocarp throughout development and ripening stages showed a differential expression of two alternatively spliced transcripts. Although PsARF1 is expressed during the climateric stage, it is strongly inhibited when ethylene treatment is applied. In all cases analyzed , transcripts were detected in other vegetative and reproductive tissues. The expression of both PsARF/XYL transcripts was detected in flower organs, roots and leaves. Results strongly suggest that the expression of these cell wall genes is regulated at the transcriptional and postranscriptional level in different tissues and developmental stages and that ethylene, the ripening hormone in climateric fruit, could be involved in the regulation of these enzymes.

Roqueiro, Gonzalo. "La fotooxidación en la semilla de sauce y sus consecuencias en la imbibición y formación de la plántula" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
A diferencia de lo que ocurre en una semilla ortodoxa típica, los tejidos embrionarios de las semillas de sauce (Salix nigra L.) presentan cloroplastos que no desdiferencian durante la maduración del secado, por lo que conservan la clorofila y mantienen su sistema de endomembranas intacto. Debido a que las membranas tilacoides son los principales sitios para la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO), resulta inevitable que sean afectadas o dañadas cuando las semillas son expuestas a la luz (fotooxidación). Otra atipicidad que presentan estas semillas es que durante la hidratación controlada (priming) ocurre un descenso de la germinación normal (GN) que es seguido por una recuperación de la misma. El objetivo de este trabajo de tesis fue determinar la probable participación de las ERO en los procesos fotooxidativos que afectan las semillas de sauce y estudiar sus consecuencias durante la imbibición y la germinación de las mismas. Las reacciones oxidativas generadas por la clorofila excitada por la luz, inducen un fuerte deterioro principalmente en los tejidos externos más expuestos a dicho agente. En semillas de otras especies se ha reportado que, con la hidratación inicial, se genera un estallido oxidativo. En las semillas de sauce, el alto nivel basal de ERO producido por la fotooxidación potencia el estallido oxidativo provocando el atípico descenso de la GN. Cuando la hidratación es controlada el daño causado por el estallido oxidativo es revertido debido a un mayor tiempo de actuación de los mecanismos de reparación y de las defensas antioxidantes que conduce a la recuperación de la GN. Por el contrario, si los mecanismos de reparación no tienen el suficiente tiempo de actuación, como ocurre cuando la hidratación no es controlada, los daños no se revierten, lo que se ve reflejado en un aumento de la geminación anormal. En este caso, si la fotooxidación no afecta el eje embrionario, la plántula genera diversos mecanismos de recuperación entre los que se destaca un sensible aumento de las defensas antioxidantes, que le permiten superar los daños y continuar con su desarrollo.

Abstract:
Contrary to what happens in a typical orthodox seed, in willow seeds (Salix nigra L.) the chloroplasts of the embryonic tissues do not dedifferentiate during the maturation drying process, preserving chlorophyll and maintaining intact their endomembrane system. Since the thylakoid membranes are the principal sites of reactive oxygen species (ROS) generation, it is inevitable that they be affected and damaged when seeds are exposed to light (photo-oxidation). Another atypical characteristic presented by these seeds is that during controlled hydration (priming) normal germination (NG) experiences a decrease, followed by a recovery. The objective of this thesis was to confirm the likely participation of ROS in the photo-oxidative processes that affect the willow seeds and to study the consequences of these processes on seed imbibitions and germination. The oxidative reactions produced by light-excited chlorophyll induced a strong deterioration process, principally in the external tissues most exposed to the light. There have been reports of an oxidative burst accompanying initial hydration in seeds of other species. In willow seeds, the high ROS baseline produced by photo-oxidation strengthens that oxidative burst, causing an atypical decrease in NG. Subsequently, under controlled hydration conditions, the damage caused by the oxidative burst is reverted due to the increased exposure to the reparative mechanisms and antioxidant defenses that leads to the recovery of NG. On the other hand, if the reparative mechanisms are not allowed to act long enough, as occurs during non-controlled hydration, the damages are not reverted, which is reflected in an increase in abnormal germination. In this case, if photo- oxidation does not affect the embryonic axis, the seedling generates diverse mechanisms of reparation, particularly a sensitive increase in antioxidant defenses that allow it to overcome damages and continue developing.

Fox, Ana Romina. "Fototransducción de señales en Arabidopsis thaliana. Dos casos de estudio: participación de la subunidad alfa de la proteína G heterotrimérica; e identificación de proteínas diferencialmente expresadas en el cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El desarrollo de las plantas es un proceso que ocurre bajo fluctuaciones del ambiente lumínico que son percibidas por fotorreceptores específicos, principalmente los fitocromos phyA y phyB, y los criptocromos cry1 y cry2. El estudio de las respuestas de mutantes simples y múltiples de fotorreceptores en diferentes condiciones lumínicas es una herramienta muy útil para analizar las vías de señalización. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo principal estudiar los mecanismos moleculares y bioquímicos de la transducción de señales lumínicas mediadas por fitocromos y criptocromos durante el desarrollo de Arabidopsis thaliana. En el primer capítulo estudiamos la participación de la subunidad α de la proteína G heterotrimérica (GPA1) en los caminos de señalización de los fotorreceptores. Los mutantes cry1 fueron los únicos simples mutantes que mostraron una reducción en la unión de GTPγS35, a niveles similares a los observados en el mutante gpa1. Hallamos interacción génica entre cry1 y GPA1 en la apertura del gancho apical en oscuridad y en la acumulación de antocianas en luz azul. Estas respuestas fueron dependientes de la presencia de sacarosa en el medio. Análisis moleculares nos llevaron a proponer un modelo en el que la posible modificación posttraduccional de GPA1 mediada por cry1 alteraría su actividad. En el segundo capítulo realizamos un estudio comparativo de los perfiles proteicos entre plántulas cuádruples mutantes phyA phyB cry1 cry2 y plántulas salvajes utilizando la técnica de geles bidimensionales. La identificación de proteínas sub-expresadas en el cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 fue consistente con la drástica reducción en la tasa fotosintética, el contenido de clorofila y el concomitante retraso en el desarrollo del mutante. Las proteínas sobreexpresadas en el cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 estuvieron involucradas en respuesta a estrés por temperatura y por sequía. Sin embargo, sólo la expresión de éstas proteínas no permitió explicar el comportamiento del cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 en condiciones de estrés. La reducción en la cantidad relativa de ácidos grasos insaturados de las membranas del cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 fue consistente con una mayor sensibilidad a un shock de bajas temperaturas y una mayor tolerancia a un shock de altas temperaturas. Las posibles significancias fisiológicas y ecológicas de estos resultados son discutidas en esta tesis.

Abstract:
Plant development is a process that occurs under fluctuating light environment which is perceived by specific photoreceptors, mainly by phytochromes phyA and phyB, and cryptochromes cry1 and cry2. The study of the behaviour of simple and multiple photoreceptor mutants in different light conditions is a useful tool to analyze signalling pathways. The main objective of this thesis was to study the molecular and biochemical transduction of light signalling mediated by phytochromes and cryptochromes during Arabidopsis thaliana development. In the first chapter we studied the involvement of the α- subunit of the Heterotrimeric G protein (GPA1) in photoreceptors signalling pathways. cry1 mutants were the only single mutants that showed GTPγS35 binding reduction, at similar levels to that observed for the gpa1 mutant. We found genetic interaction between cry1 and GPA1 on apical hook opening in darkness and anthocyanin accumulation under blue light. These responses were dependent on the presence of sucrose. Molecular approaches conducted us to propose a model where a potential post-translational modification of GPA1 mediated by cry1 would alter its activity. In the second chapter we made a comparative study of the protein profiles between the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant and wild type seedlings using the two-dimensional gel electrophoresis technology. Under-expressed proteins in the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant were consistent with the drastic reduction in photosynthetic rates, reduced chlorophylls contents and retarded development in the mutants. Over-expressed proteins were involved in temperature and drought stresses. However, the expression of these proteins does not explain the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant behaviours under stress conditions. The reduction in the relative contents of unsaturated fatty acid of the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant membranes was consistent with its sensitivity to a low temperature shock and its tolerance to a high temperature shock. The physiological and ecological significance of these results are discussed in this thesis.

Bachmann, Sandra D.. "Caracterización bioquímica y molecular de nucleósido difosfato quinasas de Solanum tuberosum (StNDPKs): análisis de su expresión en la planta de papa en respuesta a estreses" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La capacidad de respuesta de una planta ante los cambios ambientales circundantes asegura su supervivencia. Los mecanismos de respuesta a estres biótico y abiótico están regulados por vías que dependen de la activación de genes en la cual una red de transducción de señales abarca desde la percepción de las señales hasta la expresión de genes de respuesta permitiendo la adaptación de la planta a su entorno, debiendo para ello integrar las señales externas e internas. Las nucleosido di fosfato quinasas (NDPKs) son enzimas que transfieren el fosfato γ de nucleósidos tri fosfatos (NTPs) a nucleósidos di fosfatos (NDPs) a través de un intermediario fosforilado en una histidina conservada, participando de la red de comunicación energética intracelular y pudiendo alterar el pool de NTPs. En plantas se han visto recientemente involucradas en varias cascadas de señalización. El objetivo general del trabajo es caracterizar las isoformas de NDPK en plantas de papa (S. tuberosum, var. Spunta) y estudiar su participación en la percepción de señales ambientales, analizando su expresión en respuesta a señales de estrés biótico y abiótico. La hipótesis planteada es que, dado que en toda situación de estrés subyace un compromiso energético y considerando que las NDPKs poseen actividad de fosfo-transferasa, éstas podrían estar involucradas en las respuestas a estímulos ambientales. A partir de los EST correspondientes a isoformas de NDPKs (STMED71, STMHY37) detectados en los microarreglos TIGR 10K de ARNm de brotes de papa cultivados en luz/oscuridad, se clonó de la secuencia codificante completa de StNDPK1 (GB FJ743686) a partir de brotes de papa y se sub-clonó un fragmento de la secuencia codificante de StNDPK2 (GB JF832386) a partir de una biblioteca de estolones. Se comparó la expresión de ambas en los distintos tejidos vegetativos y reproductivos de la planta y en tres estadios de tuberización por RT-PCR semi cuantitativa. StNDPK1 se expresa con distintos niveles de ARNm tanto en los tejidos como en los estadios de tuberización, mientras que StNDPK2 se expresaría en algún estadio de estolón tuberizante que no se pudo determinar. El análisis in silico de la secuencia aminoacidica de StNDPK1 muestra que tiene 238 amino ácidos de longitud, un peso molecular aproximado de 26 kDa y un punto isoeléctrico de 9.24. Codificaría para una proteína mitocondrial, el péptido señal comprendería los primeros 56 aa y el PM de la proteína madura sería de aprox. 20 kDa. La proteína recombinante StNDPK1 marcada con seis histidinas (6xHis) en su N-terminal producida se analizó por Western blot. Un anticuerpo anti-His detectó una banda de 26 kDa, mientras que un anticuerpo anti-NDPK1 dirigido contra el extremo Cterminal de la proteína reveló la banda de 26 kDa y una banda de 18kDa que podría corresponder a la proteína madura. Se detectó actividad de NDPK en extractos crudos y fracciones mitocondriales de brotación tubérculos, pero no en fracciones de cloroplastos. Además, los ensayos de Western blot realizados con el anticuerpo específico antiNDPK1 detectó la enzima en la fracción mitocondrial. El análisis filogenético de la proteína muestra que StNDPK1 está directamente emparentada con NDPK de Spinacia olaracea (que localiza en cloroplastos) y que posee un ancestro común con las otras isoformas de NDPKs de localización mitocondrial (AtNDPK3, BrNDPKIII y PsNDPK3). Además se pudo clonar la secuencia genómica completa de Stndpk1 (GB GU144806) de 3358 nts, posee 7 exones y 6 intrones. El Southern Blot usando como sonda la secuencia codificante de StNDPK1 sugiere que este gen pertenece a una familia multigénica. Por otro lado, se obtuvo el promotor de éste gen de 2385 pb cuyo análisis in silico revela la presencia de elementos regulados por luz, frío, daño mecánico, respuesta a defensa y dos sitios reguladores de los niveles transcripcionales (CAATbox y 5UTR Py-rich stretch). Dado que se disponía de mayor información respecto de la estructura del gen y de los elementos regulatorios que contiene la isoforma 1 de StNDPK y considerando que ésta tenía un perfil de expresión menos complejo que la isoforma 2, se realizaron los estudios de expresión en condiciones de estrés abiótico y biótico sólo para la isoforma 1. Los resultados de las RT-PCR semi-cuantitativas muestran que el nivel de ARNm de StNDPK1 aumenta en la exposición de plantas a oscuridad por tiempos cortos, mientras que en la exposición a bajas temperaturas se produce una disminución inicial de la expresión para luego recuperar los niveles normales. Se observó que tanto en el tratamiento con daño mecánico como el agregado de AJ (10μM) producen un aumento del mensajero de StNDPK1. Por otro lado, se midió actividad de NDPK en extractos de proteínas nativas de fracciones mitocondriales y de cloroplastos; tanto el extracto crudo, como la fracción mitocondrial presentan actividad de NDPK, sin embargo en la fracción de cloroplastos no se detectó actividad alguna. El análisis bio-informático sugiere que las dos isoformas, son de localización sub-celular. Pero en particular, StNDPK1 fue detectada por Western blot en la fracción mitocondrial donde también se midió la actividad enzimática; por lo que StNDPK1 sería una isoforma que localiza en la mitocondria. Al menos dos isoformas de NDPK en plantas de papa muestran un patrón muy diferente de expresión, StNDPK1 tiene diferentes niveles de expresión en tejidos, pero su expresión es ubicua, mientras StNDPK2 muestra un patrón más restringido y sólo se expresa en ciertas etapas de estolones, lo que sugiere que posiblemente su expresión esté asociada a ciertas etapas del desarrollo del tubérculo. Nuestros resultados sugieren fuertemente que StNDPK1 está dirigida a la mitocondria. El análisis de los datos de Stndpk1 promotor es consistente con los resultados de la expresión, lo que sugiere que StNDPK1 podrían estar involucrados en las respuestas ambientales a la disponibilidad de luz, temperaturas bajas o ataque herbívoro.

Abstract:
The responsiveness of a plant to environmental changes ensures its survival. Response mechanisms to biotic and abiotic stresses are regulated by signal transduction networks that extend from signal perception to gene activation allowing the plant´s adaptation to the environment through a process that integrates external and internal signals. Nucleoside diphosphate kinases (NDPKs) participate in the intracellular energy communication network by altering the nucleoside triphosphates (NTPs) pool; they catalyze the transfer of γ phosphates from NTPs to nucleoside diphosphate (NDPs) through a phosphorylated protein intermediary at a conserved histidine. NDPKs have been involved in several signaling cascades in plants. The overall aim of this study is to characterize NDPK isoforms in potato (S. tuberosum, var. Spunta) plants and to study their involvement in the perception of environmental signals by analyzing their expression in response to biotic and abiotic stress signals. Our hypothesis is that, as in all stress situations there is an underlying commitment to energy; NDPKs could be involved in responses to environmental stimuli. ESTs from NDPKs isoforms (STMED71, STMHY37) were detected in a TIGR 10K microarray probed with total RNA from potato sprouts grown under different conditions (light/dark). StNDPK1 complete coding sequence (GB FJ743686) was cloned using total RNA from potato sprouts while a fragment of StNDPK2 coding sequence (GB JF832386) was amplified from a cDNA library from tuberizing stolons. Bioinformatic analysis suggested that both isoforms have a sub-cellular localization because they don´t have the characteristic YE motif present in cytosolic NDPKs. Phylogenetic analysis shows that StNDPK1 protein is directly akin of Spinacia olaracea NDPK (which is located in chloroplasts) and shares a common ancestor with other NDPK isoforms with mitochondrial localization (AtNDPK3, BrNDPKIII and PsNDPK3). In silico analysis of StNDPK1 sequence shows that it encodes a protein of 238 aminoacids (aa) with a molecular weight of 26 kDa and an isoelectric point of 9.24. A mitochondrial signal peptide of 56 aa was predicted, thus the mature protein would be of approx. 20 kDa. The recombinant StNDPK1protein tagged with six histidines (6xHis) in its N-terminus was produced and analyzed by Western blot. An anti-His antibody detected a 26 kDa band while an anti-NDPK1 antibody directed against the C-terminus of the protein revealed the 26 kDa band and an 18kDa band that could correspond to the mature protein. NDPK activity was detected in crude extracts and mitochondrial fractions from sprouting tubers, but not in chloroplast fractions. In addition, Western blot assays performed with the specific antiNDPK1 antibody detected the enzyme in the mitochondrial fraction. A Southern blot probed with StNDPK1 complete coding sequence suggests that this gene belongs to a multigene family. The complete genomic sequence of Stndpk1 (GB GU144806) and its promoter region (2385 bp) were cloned. Stndpk1 is 3358 bp long and has seven exons and six introns. In silico analysis of the promoter region reveals the presence of elements regulated by light, cold, wounding, defense and two regulatory sites of transcriptional levels (CAATbox and Py-rich 5UTR stretch). We compared the expression of both isoforms in various vegetative and reproductive tissues of the plant and in three stages of tuberization by semiquantitative RT-PCR. StNDPK1 is expressed in all tissues and tuberization stages being most abundant in shoot apex, flowers and leaves, while StNDPK2 expression was undetectable in the tissues analyzed. Expression studies under abiotic and biotic stress conditions were performed only for StNDPK1. Semiquantitative RT-PCR results show that StNDPK1 transcripts increased in plants exposed to short periods of darkness, while exposure to low temperatures produced an initial decrease in the expression recovering after 6hs. Both, mechanical wounding or the addition of 10μM jasmonic acid (JA) produced an increase in StNDPK1´s mRNA. According to our results we propose that at least two NDPK isoforms are present in potato plants that show different expression patterns, StNDPK1 is ubiquitous being most abundant in aerial tissues, while StNDPK2 is restricted to tuberizing stolons. Our results strongly suggest that StNDPK1 is targeted to mitochondria. The data analysis of Stndpk1 promoter is consistent with the expression results, suggesting that StNDPK1 could be involved in environmental responses to light availability, low temperatures or herbivore attack.

Crocco, Carlos Daniel. "Rol de las proteínas B-box en las respuestas de escape al sombreado en Arabidopsis thaliana" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Cuando las plantas crecen a altas densidades perciben la presencia temprana de plantas vecinas sensando los cambios en la calidad de luz que las rodea. Esta percepción es mediada principalmente por los fitocromos, una familia de fotorreceptores que detectan una reducción en la relación rojo:rojo lejano (R:RL) causada por la proximidad de plantas vecinas induciendo un conjunto de respuestas morfo-fisiológicos tales como la elongación de hipocotilo y tallo, dominancia apical, aceleración de la floración, entre otros. Este conjunto de respuestas plásticas constituye “el síndrome de escape al sombreado”, SAS (del inglés, Shade Avoidance Syndrome). Si bien en los últimos años se ha comenzado a comprender los mecanismos moleculares involucrados en la SAS, aún nuestro conocimiento es escaso. En esta tesis estudiamos la función de las proteínas B-Box (BBX) en la señalización de la SAS en plántulas de Arabidopsis thaliana, enfocando nuestra atención en un subgrupo de esta familia que se caracteriza por presentar un doble dominio B-box en su región amino terminal. La caracterización fisiológica de algunos mutantes simples nos permitió demostrar que BBX18 y BBX24 promueven, mientras que BBX19, BBX21, BBX22 inhiben la respuesta de elongación por sombra. En particular, estudiamos el mecanismo de acción de BBX21 y BBX24 en la señalización de las SAS mediante aproximaciones genéticas-moleculares y fisiológicas. La escasa similitud que detectamos entre los transcriptomas asociados a BBX21 y BBX24 en respuesta a las señales de sombra sugiere que ambas proteínas participarían por vías distintas de señalización. En sombra prolongada, la función de BBX21 es inhibir la expresión de genes que codifican para proteínas involucradas en el crecimiento y proliferación celular, mientras que BBX24 promueve la expresión de genes del metabolismo y señalización de hormonas vinculadas a la SAS. Por medio de aproximaciones genéticas demostramos que BBX21 modula esta respuesta interaccionando genéticamente con COP1 (CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC1), un represor maestro de la fotomorfogénesis que promueve la SAS. También demostramos que BBX24 participa en la misma vía de señalización que PIF4 (PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4), un factor de transcripción que promueve la elongación, y que interviene en la síntesis de giberelinas para promover la SAS. En base a los resultados obtenidos, se propone un posible mecanismo de acción de estas proteínas BBX en la modulación de la respuesta de escape al sombreado.

Abstract:
Plants grown at high densities perceive the presence of neighboring plants by sensing changes in light quality that surrounds and adapt their growth and development (Ballaré et al., 1990). This perception is mediated primarily by phytochrome, a family of photoreceptors that detect a reduction in the red:far red (R:RL) ratio as reliable indicator of future competition. Low R:FR light is perceived by the phytochromes, triggering dramatic changes in gene expression which lead to changes at morpho-physiological levels of shaded plants, such as hypocotyl and stem elongation, apical dominance and acceleration of flowering, which are collectively known as the shade-avoidance syndrome (SAS). Using Arabidopsis thaliana as model system, we study the role of B-Box proteins (BBX) in the SAS signaling pathway. Our study focused on the characterization of a subset of these BBX proteins, which have a high homology between their sequences and two Bbox domains at the N-terminal region. The physiological characterization of some single mutants allowed us to demonstrate that while BBX18 and BBX24 promote elongation, BBX19, BBX21 and BBX22 inhibit elongation response under shade. We use physiological, genetic and molecular approach to understand the mechanism of action of BBX21 and BBX24 in the SAS signalling pathway. The low similarity between the transcriptomes of BBX24 and BBX21 suggested that both proteins participate by different signaling pathways to modulate SAS. In long term shade, BBX21 inhibits the expression levels of genes that promote cell growth and proliferation, while BBX24 is promoting genes involve in hormones biosynthesis and signaling pathway related to the shade. Applying genetic approaches, we demonstrated that BBX21 interacting genetically with COP1 (CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC1), a master repressor of photomorphogenesis, in the regulation of SAS. We also demonstrated that BBX24 and PIF4 (PHYTOCHROMEINTERACTING FACTOR 4) are part of the same signaling pathway and that BBX24 promoted gibberellin biosynthesis during the SAS. Based on these results, we propose a possible mechanism of action of these BBX proteins in shade avoidance response.

Villagra, Mariana. "Plasticidad morfológica y fisológica de especies arbóreas del Bosque Atlántico en respuesta a cambios en la disponibilidad de luz y nutrientes" (2012-03-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo se evaluaron los efectos de la disponibilidad de luz y de nutrientes sobre el crecimiento y supervivencia de renovales arbóreos del Bosque Atlántico en Misiones, Argentina. Para ello se realizó un experimento de fertilización a largo plazo en el sotobosque (baja radiación solar) y en claros naturales (alta radiación solar). Luego de cuatro años se investigaron también los efectos de la adición de N+P sobre características fisiológicas involucradas en el transporte de agua. Los resultados indican que la disponibilidad de luz sería un factor más limitante de la supervivencia, el crecimiento y la capacidad fotosintética de las especies estudiadas que la disponibilidad de nutrientes, aunque dependiendo del grado de tolerancia a la sombra de las especies, los renovales pudieron responder a la adición de nutrientes aún bajo condiciones de baja radiación. La fertilización y el grado de tolerancia a la sombra de las especies determinaron cambios en la longevidad foliar, el área foliar específica, el daño foliar por herbivoría, la densidad de la madera y la vulnerabilidad a la cavitación de las ramas terminales. Las especies estudiadas fueron capaces de ajustar la arquitectura hidráulica a la adición de N+P a nivel de las ramas terminales, y no así a nivel de hojas, incrementando por ejemplo la resistencia a la cavitación del xilema. La vulnerabilidad a la disfunción hidráulica de hojas y de ramas terminales fue independiente. Además, no se encontró un compromiso entre la eficiencia en el transporte de agua y la vulnerabilidad a la cavitación. Finalmente, tanto el N como el P limitarían el crecimiento de estas especies en los bosques del norte de Misiones.

Abstract:
The effects of light and nutrient availability on growth and survival of tree seedlings were evaluated in the Atlantic Forest of Misiones, Argentina. A long-term fertilization experiment was carried out in the understory (low solar radiation) and in natural gaps (high solar radiation). After four years the effects of N+P addition on physiological traits involved in the water transport system were also investigated. The results indicate that light availability would be a major factor limiting the survival, growth and photosynthetic capacity of the species studied than nutrient availability, although depending on species shade tolerance, plants were able to respond to nutrient addition even under low light availability. Fertilization and species shade tolerance determined changes in leaf lifespan, specific leaf area, leaf herbivory damage, wood density and vulnerability to cavitation of terminal branches. The species studied were able to adjust the hydraulic architecture to N+P addition in terminal branches, but not in leaves, for example, increasing the resistance to xylem cavitation. Vulnerability to hydraulic dysfunction in leaves and terminal branches was independent. In addition, a trade-off between the efficiency of the water transport system and vulnerability to cavitation was not observed. Finally, both N and P limit the growth of these species in northern forests of Misiones.

Scambato, Agustina Azul. "Influencia de la simbiosis con micorrizas arbusculares y rizobios sobre el crecimiento y la tolerancia a estrès salino en especies forestales de Prosopis" (2013-05-02) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Prosopis es un género de plantas pertenecientes a la familia Fabaceae, adaptada a ambientes de escasa fertilidad. Como otras especies de leguminosas, las especies de este género pueden establecer simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno y hongos formadores de micorrizas arbusculares. En esta tesis se estudiaron las variaciones entre diversas especies de interés forestal del género Prosopis respecto de su respuesta a condiciones salinas extremas y de los mecanismos que intervienen en dicho proceso. Por otro lado se pone a prueba la hipótesis de que las plántulas de P. alba y P. hassleri mejoran su tolerancia a la salinidad cuando se encuentran asociadas simbióticamente a un hongo MA. Más aún, que dicha respuesta difiere dependiendo de la especie de MA a la que estén asociadas. También se aislaron bacterias capaces de formar nódulos en las seis especies de Prosopis, las cuales fueron caracterizadas genéticamente y evaluadas respecto de su tolerancia a concentraciones de 200 mM de NaCl. Como un objetivo secundario de este trabajo se describieron las variaciones morfológicas entre las diferentes especies de Prosopis estudiadas, respecto del nódulo que desarrollan. Finalmente, se evaluó si la asociación simbiótica con micorrizas arbusculares incrementa la fijación de nitrógeno en especies de Prosopis bajo condiciones control y de estrés salino. Palabras claves: Prosopis spp., estrés salino, hongos micorrícicos arbusculares, bacterias fijadoras de nitrógeno.

Abstract:
Prosopis is a genus of woody legume species (family Fabaceae) adapted to soils with low fertility. Like most legumes, these species establish symbiosis with nitrogen-fixing bacteria and arbuscular mycorrhizal fungi. In this thesis, variations between different tree species of the genus Prosopis were studied regarding their response to extreme saline conditions and mechanisms involved in this process. On the other hand, the hypothesis that seedlings of P. alba and P. hassleri improve their salt tolerance when they are symbiotically associated AM fungi has been tested. Furthermore, it has been shown that such a response differs depending on the inoculated AM fungal isolate. Also, bacteria capable of forming nodules in the six species of Prosopis, were genetically characterized and evaluated for their tolerance to concentrations of 200 mM NaCl. As a secondary objective of this paper, the morphological variations of nodules between different species of Prosopis was described. Finally, we assessed whether the symbiotic association with arbuscular mycorrhizae increases nitrogen fixation in Prosopis species under control and salt stress. Key words: Prosopis spp., salt stress, tolerance, arbuscular mycorrhizal fungi, nitrogen fixing bacteria.

Ribaudo, Claudia Mónica. "Mecanismos bioquímicos y moleculares desencadenados en la interacción bacterias promotoras de crecimiento vegetal y plantas de interés agronómico" (2013-06-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta Tesis se abordó el estudio de los mecanismos bioquímicos involucrados en la interacción entre algunas bacterias promotoras del crecimiento y dos plantas de interés agronómico, arroz (Oryza sativa) y tomate (Solanum lycopersicum). La bacteria Azospirillum brasilense promovió el crecimiento de plantas de arroz, especialmente de su sistema radicular; la inoculación indujo un aumento en la producción de etileno en la planta y en la actividad y expresión de la ácido 1-amino-ciclopropano-1- carboxílico sintasa (ACS). Se observó también un aumento en la actividad de quinasa de proteínas dependiente de Ca⁺² cuyas características bioquímicas indican que se trata de una CDPK que estaría relacionada con el crecimiento de las raíces laterales. La inoculación con A. brasilense promovió el crecimiento de plantas de tomate, aumentó los niveles de ácido indol acético (AIA) y etileno y la actividad y expresión de ACS. El suplemento exógeno de etileno y el uso de un inhibidor de su percepción permiten asignar a modo de hipótesis un rol intermediario del etileno en la promoción del crecimiento del sistema radicular en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. El análisis global del perfil de expresión génica asociado a la inoculación de plantas de tomate con A. brasilense indicó que la inoculación estimuló la expresión de una variedad de genes, muchos de los cuales se inducen por etileno y que se han encontrado sobre expresados en otras especies en respuesta a la infección con patógenos o afectadas por agentes generadores de estrés. Los niveles de expresión de los genes implicados en el establecimiento de la respuesta hipersensible aparecen sub expresados lo cual podría favorecer el establecimiento de la interacción endofítica entre A. brasilense y tomate. Utilizando la técnica de 2D-DIGE se comenzó el análisis de los perfiles de proteínas expresadas en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. Con esta técnica se logró evidenciar diferencias en los patrones de expresión que dependen del tratamiento al que se sometió a las plantas.

Abstract:
This thesis is focused on the study of biochemical mechanisms involved in the interaction among some growth-promoting bacteria and two plants of interest for agronomy: rice (Oryza sativa) and tomato (Solanum Iycopersicum). The bacterium Azospirillum brasilense promoted growth in rice plants, especially in their root system; inoculation induced an increase in ethylene production in the plant and in 1- aminocyclopropane-1-carboxilic acid synthase (ACS) activity and expression. A rise was also noticed in a Ca⁺²-dependent protein kinase activity with the biochemical features of a CDPK that could be related to lateral roots’ growth. A. brasilense inoculation also promoted tomato plants growth, raised indole acetic acid (IAA) and ethylene levels and the activity and expression of ACS. Exogenous supplement of ethylene and the use of an inhibitor of their perception have allowed for the hypothesis for an intermediary role of ethylene in A. brasilense-inoculated tomato plants’ root system growth. The overall analysis of the genetic expression profile of tomato plants associated to the inoculation with A. brasilense has indicated that inoculation stimulated expression of a variety of genes which are also induced by ethylene and have been found overexpressed in other species as a result of pathogenic infection or affected by stress-generating agents. The genes involved in the hypersensitive response appeared as underexpressed; this fact could favour the stablishment of the endophitic interaction between A. brasilense and tomato. 2D-DIGE technique was used to start the analysis of protein profiles expressed in A. brasilense-inoculated tomato plants.

Moschen, Sebastián. "Identificación y caracterización funcional de genes candidatos asociados a la senescencia foliar en girasol basado en perfiles transcripcionales y metabólicos" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El proceso de senescencia en plantas es un mecanismo complejo controlado por múltiples variables genéticas y ambientales que condicionan el rendimiento de los cultivos. En el caso del girasol, el segundo cultivo oleaginoso en importancia económica para nuestro país, se trata de un proceso con impacto económico que interviene en la brecha existente entre el rendimiento potencial y el rendimiento real observado, por la mayor o menor oportunidad de las plantas para mantener el sistema fotosintético activo durante periodos prolongados. Los parámetros visuales resultan tardíos para evaluar el desencadenamiento y posterior tasa de evolución de la senescencia foliar. La clorosis, la variación en el contenido de clorofila así como también la necrosis de las hojas, son detectables mucho tiempo después que la señal iniciadora de la senescencia ha sido activada. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del proceso de senescencia en girasol a través de distintos niveles de organización: ecofisiológico, metabolómico, transcriptómico, culminando con la integración de los diversos enfoques ómicos mediante una aproximación de biología de sistemas, con el objetivo final de identificar potenciales biomarcadores asociados al proceso de senescencia en girasol. Se condujeron distintos ensayos que fueron realizados tanto a campo, en la Estación Experimental INTA-Balcarce como en invernáculo, en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar, para evaluar el progreso del proceso de senescencia tanto en condiciones naturales como controladas. Asimismo se evaluó la respuesta frente a condiciones de restricción hídrica impuesta en distintas etapas del desarrollo de las plantas. Se realizaron evaluaciones ecofisiológicas relacionadas con el avance de la senescencia, a través de la medición de variables como contenido de clorofila, azúcares solubles y nitrógeno total de hojas, mediciones a campo de área foliar verde, SPAD, intercepción de la radiación y materia seca por órganos, mediante las cuales fue posible evaluar la evolución del proceso en las diferentes hojas, en condiciones naturales de cultivo. Adicionalmente, se llevó adelante un análisis de los perfiles metabólicos utilizando técnicas de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) que permitió la optimización del protocolo de la extracción de metabolitos de hojas de girasol, y la detección de aproximadamente 60 metabolitos primarios incluyendo distintos aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y azucares alcohol. Asimismo se optimizó la tecnología de cromatografía iónica, mediante la cual se cuantificaron diferentes nutrientes iónicos relevantes durante el proceso de senescencia tales como nitratos, sulfatos, fosfatos entre otros. En forma paralela se llevó a cabo un estudio a nivel transcriptómico considerando tanto estrategias de genes candidato, mediante la búsqueda de secuencias putativamente ortólogas a girasol asociadas a senescencia en especies modelo, como el análisis concertado de expresión génica utilizando una micromatriz de oligonucleótidos desarrollada para esta especie. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos con la micromatriz, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre el total de los unigenes que mostraron un comportamiento diferencial y significativo para las distintas condiciones evaluadas, utilizando la metodología de Gene Set Analysis basado en modelos de regresión logística. De este modo se identificaron las diferentes categorías funcionales asociadas a bloques de genes con un patrón de expresión similar. La búsqueda de genes candidato se profundizó con la consulta de bases de datos de genes asociados a senescencia (SAGs del inglés: Senescence Associated Genes), así como también sobre aquellos genes con dominios de factores de transcripción como posibles desencadenantes de las cascadas de señalización de este proceso. Por último, se realizó la integración de los datos obtenidos a partir de distintas estrategias (fisiológicas, metabolómicas y transcriptómicas) utilizando una aproximación basada en biología de sistemas con el objetivo de identificar biomarcadores asociados a la senescencia en girasol. Para este fin se usaron los programas Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (García-Alcalde y col 2011) y Mapman (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm y col 2004) que fueron adaptados para su uso con datos provenientes de esta especie. Los resultados obtenidos a partir de la integración de datos mostraron una correspondencia entre los cambios detectados a través de los diferentes niveles analizados. A partir de una visión general del metabolismo celular se pudo observar una disminución de la actividad fotosintética y el crecimiento celular, y un incremento en el metabolismo de sacarosa, ácidos grasos, nucleótidos y aminoácidos así como también en aquellos procesos relacionados al reciclado de nutrientes. En particular, los factores de transcripción con dominios NAC, AP2- EREBP y MYB mostraron altos niveles de expresión y mayores niveles de correlación y co-expresión, puntualizándolos como importantes biomarcadores candidatos para la ejecución del programa de senescencia en girasol. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso de senescencia en girasol, así como a la selección robusta de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo del proceso, especialmente factores de transcripción. Estos últimos fundamentalmente, podrán ser validados a futuro sobre materiales de mejora para ser incorporados a los programas de mejoramiento asistido de este cultivo de gran importancia agronómica para nuestro país. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de la genómica y la post-genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol.

Abstract:
Leaf senescence is a complex mechanism controlled by multiple variables, either from genetical and environmental origin that has strong impact on crop yield. In sunflower, the second economically important oil crop in Argentina, the senescence process has an economic impact involved in the gap between potential and real yield observed due to the incapacity of the plants in keeping their green leaf area for longer periods. Visual parameters are belated to assess the onset and the evolution of leaf senescence. Chlorosis, variation in chlorophyll content as well as leaf necrosis is detected long after the triggering signal has been activated. The main objective of this work was the study of the senescence process in sunflower through different organization levels: ecophysiological, metabolomic, transcriptomic, and finally an integration of the different omics strategies using a systems biology approach, in order to identify potential biomarkers associated to leaf senescence in sunflower. Different experiments were conducted in both, field and greenhouse condition at INTA-Balcarce Experimental Station and at the Biotechnology Institute, INTA Castelar respectively, assessing the senescence process under natural and controlled conditions. Response to water restrictions imposed at different plant development stages was also evaluated. Ecophysiological assessments related to the senescence progress were performed through different measurements such as chlorophyll, soluble sugars and total leaf nitrogen content, field measurements of green leaf area, SPAD, interception of radiation and dry material by organ, allowing the evaluation of the senescence process progression in different leaves growing under natural field conditions. Additionally, metabolic profiles analysis was performed by using Gas Chromatography - Mass Spectrometry technique (GC-MS), allowing the metabolite extraction protocol optimization in sunflower leaves and the detection of approximately 60 primary metabolites, including different amino acids, organic acids, sugars and sugar alcohol. Likewise, it was possible to optimize the ion chromatography technology, leading to the quantification of relevant ionic nutrients content such as nitrates, sulphates, phosphates and others, along the senescence process. In parallel, transcriptomic studies were performed considering both, candidate gene strategies by searching of sunflower orthologous gene sequences reported as senescence associated in model species, as well as through a concerted expression analysis using a customized oligonucleotide microarray developed for this species. Statistical functional enrichment analysis was conducted over the complete significant unigenes set derived from the microarray assay, for each evaluated conditions, using Gene Set Analysis methodology based on logistic regression models. In this way, different functional categories were identified for gene clusters with similar expression patterns. Moreover, the exploration for candidate genes was deepened by searching into the senescence associated gene databases for model species, as well as by identification of putative triggers of the signalling pathways leading to senescence in sunflower among the transcription factor domains gene database. Finally, a systems biology approach was achieved in order to integrate the information from the different physiological, metabolomic and transcriptomic strategies with the aim to identify biomarkers associated with leaf senescence in sunflower. These analyses were performed using Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (Garcia-Mayor et al 2011) and Mapman software (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm et al 2004) that were adapted for sunflower data. These results showed a correspondence between the changes detected by the different strategies. Through a metabolism overview, a decrease of photosynthetic activity and cell growth was detected. Moreover, sucrose, fatty acids, nucleotides and amino acids metabolism as well as those pathways related to nutrient recycling processes showed an up-regulation during leaf development. In particular, NAC, AP2-EREBP and MYB transcription factors showed high expression levels and higher levels of correlation and co-expression making them important candidates biomarker in the execution of the senescence program in sunflower. The results of this work contributed to the knowledge of the molecular mechanisms involved at the onset and evolution of the senescence process in sunflower as well as to the identification of robust candidate genes involved in the different developmental stages of this process, especially transcription factors. These genes could be further validated on breeding materials to be incorporated into assisted breeding programs for this agronomic important crop for our country. Furthermore, the strategies, methodologies, tools and knowledge developed in this thesis, contribute to the crop development and promote the adoption of genomics and post-genomics in the different stages of sunflower breeding.

Kasulin, Luciana. "Variación genética natural en las respuestas de escape al sombreado en Arabidopsis thaliana" (2014-03-31) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las señales lumínicas percibidas por los fotorreceptores son importantes para una aclimatación adecuada de las plantas a su ambiente natural. Las plantas detectan la baja relación rojo:rojo-lejano (R/RL) reflejada por la proximidad de las plantas vecinas respondiendo morfológicamente antes de ser sombreadas. La disminución de luz R/RL promueve en las plantas el síndrome de escape al sombreado, SAS (del inglés, Shade Avoidance Syndrome) un conjunto de respuestas morfológicas que promueve el crecimiento de las estructuras vegetativas y mejora la competencia por luz evitando el sombreo por plantas vecinas. Es común encontrar una importante variación natural entre poblaciones de una misma especie en respuesta a la luz. El objetivo de esta tesis fue estudiar la variación natural en las respuestas asociadas al SAS en Arabidopsis thaliana, un modelo funcional muy atrayente para comprender cómo el genotipo determina la expresión de la plasticidad adaptativa de las plantas en ambientes lumínicos cambiantes. Mediante el mapeo de QTL en tres líneas recombinantes y endrocriadas, RILs (del inglés, Recombinant Inbred Lines) que comparten una misma línea parental, Landsberg erecta, se identificaron los QTL comunes y divergentes en la respuesta de crecimiento del hipocotilo entre las poblaciones. Además se determinó y caracterizó la contribución de ERECTA en distintas respuestas asociadas al SAS en las cuales los efectos pleiotrópicos de este gen fueron dependientes del fondo genético. Por otro parte, se realizaron mapeos de asociación de GWAS (del inglés, Genome Wide Association Study) para caracteres vegetativos, florales y reproductivos en plantas cultivadas en condiciones de radiación natural y sombreado en el invernáculo. Si bien la resolución de los mapeos GWAS fue baja, se identificaron dos QTNs (del inglés, Quantitative Trait Nucleotide) asociados al largo de la lámina y del vástago floral. Además, se estudió la fisiología y la diversidad genética de plantas de A.thaliana recolectadas en la Patagonia Argentina. El árbol de similitud genética sugiere que las poblaciones patagónicas son idénticas entre sí y similares a las accesiones originarias de Italia, siendo la más cercana Tívoli. Por otra parte, se determinó que la accesión Patagonia es hiposensible a la luz roja y a la SAS, y tiene requerimientos de vernalización que correlacionan con los patrones de expresión de FLC. Finalmente, esta tesis ha contribuido a la incorporación de un nuevo genotipo de A.thaliana al germoplasma de esta especie que puede ser de interés para estudios futuros.

Abstract:
Light signals perceived by photoreceptors are important for acclimation of plants to their natural environment. Plants detect low Red/Far-Red (R/FR) ratio reflected by the proximity of neighboring plants responding morphologically before being shaded. The decrease of R/FR ratio promotes the shade avoidance syndrome, SAS, a set of morphological responses that promotes the growth of vegetative structures to improve competition for photosynthesis light. It is common to find a large natural variation among populations of the same species in response to light. The aim of this thesis was to study the SAS natural variation in Arabidopsis thaliana, a small crucifera and an attractive model to understand how genotype determines the expression of plant adaptive plasticity in changing light environments. By mapping strategies, we explored the genetic bases of allelic variations associated to the phenotype. We found common and divergent QTL (Quantitative Trait Loci) for hypocotyl growth induced by simulated shade among three RIL (Recombinant Inbred Lines) populations sharing the same parental line, Landsberg erecta. Furthermore we characterized the contribution of ERECTA in the shade. We found ERECTA pleiotropic effects in the SAS being its effects dependent on the genetic background. Also we carried out genome wide mapping association study (GWAS) for vegetative, floral and reproductive traits for plants grown under natural radiation and shade light in a greenhouse. However GWAS resolution was low in our conditions, we mapped two QTNs (Quantitative Trait Nucleotide) associated with the length of leaf and flowering stem. Moreover, we studied the physiology and genetic diversity of A.thaliana plants collected in Patagonia, Argentina. The genetic similarity analysis suggests that Patagonia populations are identical between them, and similar to genotypes from Italy, being the closest Tivoli accession. In addition, we demonstrated that Patagonia accession is hyposensitive to red light and SAS, and it has vernalization requirements that correlate with the expression patterns of FLC. This thesis also contributes adding a new genotype in the A.thaliana germplasm that may be of interest for future studies.

Krzymuski, Martín Javier. "Determinantes moleculares involucrados en la relación cuantitativa entre el tiempo a floración y el fotoperíodo en Arabidopsis thaliana" (2014-06-10) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El éxito reproductivo de las angiospermas se encuentra fuertemente afectado por el momento del año en que ocurra la floración, que en numerosas especies es ajustado mediante la percepción del fotoperíodo. En la presente tesis se demuestra que en Arabidopsis thaliana el requerimiento de varios días largos para florecer se vincula a la necesidad de mantener elevados niveles de expresión de FLOWERING LOCUS T (FT) durante varios días para inducir la expresión de genes florales del meristema, siendo los tiempos a floración proporcionales a la integral de la expresión de FT. A su vez, este proceso presenta un ritmo de sensibilidad a FT, cuya fase de alta sensibilidad se encuentra entre ZT12 y ZT20. Por otro lado, CONSTANS (CO), que promueve la expresión de FT en condiciones fotoperiódicas inductoras, demora la floración en Arabidopsis bajo días cortos. Este efecto no está mediado por la represión de FT, como sucede en arroz con el homólogo de CO, sino vía el represor meristemático TERMINAL FLOWER 1 (TFL1). CO modula el momento diario expresión de TFL1, registrándose los mayores valores en la ventana del día en que plantas son más sensibles a FT. La presencia de TFL1 en este rango ayudaría a establecer un umbral mínimo de FT. En conjunto, los resultados sugieren que los mecanismos de integración de la señal fotoperiódica tenderían a reducir las probabilidades que la floración ocurra cuando las condiciones externas son adversas, debido a fluctuaciones en la expresión de FT vinculadas a otros factores del ambiente.

Abstract:
Reproductive success in angiosperms is closely related to the time of the year when flowering occurs, which in many species is adjusted via the perception of the photoperiod. This thesis shows that in Arabidopsis thaliana the requirement of several long days for flowering to occur is related to the need of maintaining high levels of FLOWERING LOCUS T (FT) expression for several days to induce the expression of floral identity genes. This process involves a rhythm of sensitivity to FT, in which the phase of high sensitivity is between ZT12 and ZT20. Additionally, CONSTANS (CO), which promotes FT expression under inductive photoperiod conditions, delays flowering in Arabidopsis under short days. This effect is not mediated by FT repression, as it occurs in rice with the CO homolog, but it involves the meristem repressor TERMINAL FLOWER 1 (TLF1). CO modulates the daily pattern of TFL1 expression, with higher values within the daily window in which plants are actually more sensitive to FT. Taken together, the results suggest that the mechanism of photoperiod signal integration could reduce the chances of flowering when the external conditions are adverse, due to fluctuations in FT expression linked with other environmental factors.

Arrieta, Alejandro Matías. "Los endofitos fúngicos como inductores de cambios en la rizósfera de gramíneas nativas" (2014-06-23) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las especies asexuales del género Epichloë Tul (Clavicipictaceae, Hypocreales, Ascomycota) establecen simbiosis mutualista con diferentes especies de gramíneas (C3) muchas de ellas de interés agronómico. El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de las simbiosis entre gramíneas nativas y endofitos asexuales Epichloë sobre la diversidad fúngica de la rizósfera. Se postuló que la simbiosis Bromus auleticus – Epichloë pampeana modificaría la estructura de la comunidad del suelo debido a que los endofitos producen metabolitos en el interior de la planta los cuales son excretados por el sistema radical. Para poner a prueba la hipótesis, se realizó un ensayo en vivero con diversos tiempos de muestreo en el cual se evaluaron diferentes parámetros. Semillas de B. auleticus asociadas (E+) o no asociadas (E-) a E. pampeana fueron sembradas en macetas con dos tipos de suelo (Agronómico y No Agronómico). Se evaluó el efecto de la interacción gramínea-endofito y del uso agronómico del suelo mediante identificación por análisis macro y micromorfológico, metagenómico y cultivo en medios selectivos. La presencia de E. pampeana en las plantas de B. auleticus se asoció con un aumento de la diversidad de hongos saprobios de la rizósfera, un aumento del porcentaje de micorrización, y sumado a esto, un incremento de la diversidad de los hongos micorrícicos en suelos No Agronómico. También se evidenció un incremento de especies micorrícicas con mayor capacidad para movilizar fósforo (P), en asociación a plantas E+ en comparación a las E-, en muestras de suelo Agronómico. No se detectó un efecto significativo del estatus endofítico ni de los suelos sobre la cantidad de hongos solubilizadores de P, pero si se observó un efecto sobre su diversidad atribuible a la introducción de B. auleticus. En cuanto a su rol defensivo frente a especies parásitas y/o potenciales patógenos, no se observaron deferencias entre los diferentes tratamientos en cuanto al porcentaje de colonización de las raíces por Chytridiomycetes, pero si se detectó un aumento en el porcentaje de mortalidad de plantas E- de B. auleticus en comparación a las E+. Los resultados obtenidos en ésta tesis ponen en evidencia el efecto de los endofitos asexuales Epichloë en el entorno en el que se desarrolla su hospedante, lo cual señala la relevancia de este modelo para el estudio no sólo de la simbiosis planta-endofito sino también de múltiples interacciones, con el valor agregado de ser B. auleticus una gramínea nativa de interés agronómico.

Abstract:
Asexual species of the genus Epichloë Tul (Clavicipitaceae, Hypocreales, Ascomycota) establish mutualistic symbiosis with different species of C3 grasses, many of them of agronomic interest. The aim of this work was to evaluate the effect of the symbiosis established between native grasses and asexual Epichloë endophytes on the fungal diversity of the rhizosphere. It was postulated that the symbiosis Bromus auleticus – Epichloë pampeana could modify the structure of the soil community as endophytes produce metabolites within the plant which are excreted by the root system. To test this hypothesis, a greenhouse assay was conducted in with different sampling times, in which different parameters were evaluated. Seeds of B. auleticus associated (E+) or not (E-) with E. pampeana were sown in pots with two different soil types (Agricultural and Non- Agricultural). The effect of the interaction grass - endophyte and the agronomical management of soil was evaluated through identification by clasical taxonomic techniques, high-throughput analysis and cultivation on selective media. The presence of E. pampeana in plants of B. auleticus was associated with an increase in the diversity of saprobe fungi in the rhizosphere, in the percentage of mycorrhizal colonization, and also, in the diversity of mycorrhizal fungi in Non Agricultural soil. In addition, an increase was evidenced on mycorrhizal species with a greater capacity to mobilize phosphorus (P) in E+ plants in comparison to E-, in Agricultural soil samples. However, it was not detected a significant effect of the association nor the soils used over the P solubilizing fungi amount. But it did was observed an increase in its diversity, attributable to the introduction of B. auleticus. Regarding the defensive role against parasitic species and/or potential pathogens, although no significant differences on the percentage of root colonization by Chytridiomycetes were found between the different treatments, it was detected a significant increase in the mortality percentage of B. auleticus E- plants of compared to E +. The results obtained in this thesis highlight the effect of Epichloë asexual endophytes in the environment where the host develops , which indicates the relevance of this model for the study not only of the symbiosis established between plant-endophytes but also for multiple interactions, combined with the agronomic interest B. auleticus a native grass.

Rodríguez Batiller, María José. "Regulación de la expresión de genes en plantas por fotorreceptores" (2014-06-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La luz es uno de los factores más importantes en el desarrollo de las plantas. Las mismas poseen sistemas que les permiten percibir la calidad, intensidad, dirección y duración de la luz. Existen fotorreceptores específicos que registran la señal lumínica, la cual es traducida produciendo cambios en la expresión de los genes. Los fitocromos pertenecen al grupo de fotorreceptores que absorben predominantemente longitudes de onda del rojo (R) y rojo lejano (RL). El promotor del gen Lhcb es regulado por la luz a través del sistema de los fitocromos, ya que responde a muy bajas fluencias (VLFR) y altas irradiancias (HIR) de luz mediante el fitocromo A, y a bajas fluencias (LFR) de luz mediante el fitocromo B. El análisis del promotor Lhcb reveló un motivo necesario para la respuesta HIR pero no para la respuesta VLFR. Este motivo es a su vez necesario para la unión de la proteína BEL-LIKE HOMEODOMAIN 1 (BLH1) al promotor, lo cual se pudo observar tanto en experimentos in vitro como en experimentos de simple híbrido en levaduras. Sustituciones de promotor que aumentaron la unión de BLH1 también aumentaron la respuesta HIR. En contraparte, plantas mutantes blh1 mostraron una disminución en la respuesta al RL continuo pero mantuvieron valores normales a los pulsos de RL. Esto indica que el factor de transcripción BLH1 regula específicamente el HIR y no la VLFR del fitocromo A. De este modo se pone de manifiesto un mecanismo central de control de la sensibilidad a la luz por las plantas. Entre las diversas proteínas de la familia BLH se encuentran las proteínas BLH6 y BLH5, las cual es se caracterizan por presentar una alta homología estructural con la proteína BLH1. Se estudió la expresión de BLH1 y BLH6 en plantas deficientes en blh1 y blh6 y dobles mutantes blh1 blh6. Por la medida de expresión del gen β-glucuronidasa se pudo determinar que existe una regulación mutua entre las proteínas BLH1 y BLH6. Estudios fisiológicos sobre múltiples mutantes blh1, blh5 y blh6, indicaron una función aditiva de miembros de la familia BLH.

Abstract:
Light is one of the most important in plant growth factors. Plants possess sensory systems that allow them to perceive quality, intensity, direction and duration of light. Specific photoreceptors perceive selected light signals, which are transmitted to produce changes in the expression of genes. Phytochromes absorb predominantly red light (R) and far-red light (FR). The promoter of the Lhcb1*2 gene is regulated by light through the system of phytochromes, as phytochrome A mediates the very-lowfluence responses (VLFR) and the high-irradiance responses (HIR), and phytochrome B mediates the low-fluence responses. Lhcb1*2 promoter analysis revealed a motif necessary for HIR but not for VLFR. This motif is necessary for binding of the protein BEL-LIKE HOMEODOMAIN 1 (BLH1) to the promoter, as revealed by both in experiments in vitro and experiments using the one hybrid system in yeast. Substitutions that increased promoter binding BLH1 also increased HIR. The blh1 mutant showed a decrease in the response to continuous FR but retained normal to pulses of RL values. This indicates that the transcription factor BLH1 specifically regulates the HIR but not the VLFR of the phytochrome A. This reveals a mechanism of control of sensitivity to light in plants. Among the various members of the BLH family, the BLH5 and BLH6 proteins are characterized by high structural similarity to BLH1. There is mutual regulation of expression between BLH1 and BLH6 proteins. Physiological studies involving double and triple mutants among blh1, blh5 and blh6 indicate an additive function of BLH family members.

Velásquez, Silvia Melina. "Las modificaciones post-traduccionales en extensinas son esenciales en la expansión polarizada de pelos radiculares en Arabidopsis thaliana" (2014-12-02) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los pelos radiculares son células individuales especializadas en la absorción de agua y nutrientes que crecen mediante expansión polarizada, proceso compartido con los tubos polínicos, axones, e hifas de hongos. No obstante, las paredes celulares imponen límites al crecimiento por lo cual, en plantas, se debe estar constantemente incorporando nuevas moléculas para lograr el crecimiento. Sus paredes celulares están compuestas por polisacáridos y proteínas ricas en hidroxiprolina (hydroxyproline-rich glycoproteins; HRPGs) que incluyen a las extensinas (EXTs). La hidroxilación de Prolinas (Hyp), una modificación post-traduccional (MPT) temprana de las HRGPs, catalizada por las Prolil-4-hidroxilasas (P4Hs), define los subsecuentes sitios de Oglicosilación en las EXTs, que son principalmente arabinosiladas. En este trabajo se exploró la función biológica de las P4Hs, las arabinosiltransferasas y las EXTs asociadas al desarrollo del pelo radicular. Inhibición bioquímica o disrupción genética de las P4Hs resultó en una interrupción del crecimiento polarizado en los pelos radiculares y en una reducción de la arabinosilación de las EXTs. En segundo lugar, se demostró que la prolil-4-hidroxilasa 5 (P4H5) y en menor medida P4H2 y P4H13, son centrales para el desarrollo del pelo mediado por EXTs. Mediante experimentos de intercambio de promotores y regiones catalíticas, se pudo mostrar que P4H2 y P4H13 tienen funcionalidades intercambiables pero son incapaces de reemplazar a P4H5. Estas tres P4Hs son direccionadas a la vía secretoria, más específicamente al Retículo y Aparato de Golgi, donde P4H5 forma dímeros con P4H2 y P4H13, sugiriendo la existencia de complejos de proteínas P4Hs. En tercer lugar, se exploró la localización sub-celular y la especificidad de sustrato de P4H5, como también la arquitectura de la pared celular resultante en el mutante p4h5. También se analizó la significancia fisiológica de las MPTs en las EXTs. Específicamente, mutantes deficientes en Hyp-O-arabinosilación o en Ser-O-galactosialción mostraron pelos más cortos, debido al efecto conjunto de una tasa de crecimiento más lenta y una interrupción temprana del crecimiento. A su vez, nuestros hallazgos resaltan que ambos tipos de O-glicosilación (Hyp-O-arabinosilación y Ser-O-galactosilación) son necesarios y tienen efectos aditivos en el correcto funcionamiento de las EXTs durante la expansión del pelo radicular. Finalmente, a través de simulaciones de dinámicas moleculares se pudo explorar la influencia de los O-glicanos en una putativa, auto-ensamblada, conformación de triple hélice de EXTs. Nuestros resultados demostrarían que una correcta O-glicosilación de las EXTs sería esencial para el auto-ensamblado de la pared celular y por lo tanto en la elongación del pelo radicular en Arabidopsis thaliana.

Abstract:
Root hairs are single cells that develop by tip growth and are specialized in the absorption of nutrients, a process shared with pollen tubes, axons, and fungal hyphae. However, structural cell walls imposed constraints prompt utilization of new molecules to accomplish tip growth in plants. Their cell walls are composed of polysaccharides and hydroxyproline-rich glycoproteins (HRGPs) that include extensins (EXTs). Proline hydroxylation, an early post-translational modification (MPT) of HRGPs that is catalyzed by prolyl 4-hydroxylases (P4Hs), defines the subsequent O-glycosylation sites in EXTs, which are mainly arabinosylated. Here, we explored the biological function of P4Hs, arabinosyltransferases and EXTs in root hair cell growth. Biochemical inhibition or genetic disruption of P4Hs resulted in the blockage of polarized growth in root hairs and reduced arabinosylation of EXTs. Secondly, we demonstrate that prolyl-4- hydroxylase 5 (P4H5), and to a lower extent P4H2 and P4H13, are pivotal for EXT-mediated root hair tip-growth. By P4H promoter and protein swaps approaches, it was shown that P4H2 and P4H13 have interchangeable functionalities but they cannot replace P4H5. These three P4Hs are targeted to the secretory pathway, most specifically to the ER and Golgi compartments, where P4H5 forms dimers with P4H2 and P4H13 suggesting the existence of P4Hs protein complexes. Thirdly, we explored the subcellular localization and substrate specificity of the P4H5, as well as the resulting cell wall architecture in the p4h5 mutant. We also addressed the physiological significance of the MPTs of EXTs. In particular, mutants who were deficient in Hyp-Oarabinosylation or in Ser-O-galactosylation showed shorter root hairs, due to both slower kinetics and premature growth termination. In addition, our findings highlights that both Oglycosylation types (Hyp-O-arabinosylation and serine-O galactosylation) are required and have additive effects for correct EXT function in root hair cell expansion. Finally, molecular dynamics simulations addressed the influence of O-glycans on a putative EXT self-assembled triple helix conformation. Our results demonstrate that correct O-glycosylation on EXTs is essential for cell wall self-assembly and hence root hair elongation in Arabidopsis thaliana.

Keller, Mercedes Magdalena. "Mecanismos de crecimiento y expresión de defensas dependientes del ácido jasmónico modulados por el ambiente lumínico. Respuestas afectadas en la competencia por la luz en Arabidopsis" (2015-03-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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En poblaciones vegetales de alta densidad, es de vital importancia para las plantas ajustar su crecimiento y desarrollo en respuesta a señales lumínicas percibidas por proteínas fotorreceptoras. Estos fotorreceptores actúan percibiendo cambios cualitativos y cuantitativos de la luz en los canopeos, y activan varias vías de señalización cuyas respuestas tienen consecuencias importantes para la interacción de las plantas entre sí y con otros organismos. En esta tesis se abordó el estudio de cómo las bajas relaciones Rojo/Rojo Lejano (R/RL) o la disminución de la luz azul, que representan señales de competencia (futura o presente), desencadenan respuestas adaptativas fundamentales asociadas con la habilidad competitiva y la capacidad de defensa. La inactivación del fitocromo B (phyB) por bajas relaciones R:RL, es el evento principal que activa el Síndrome de Escape al Sombreado (SAS), aún en situaciones en las que las plantas no han sido efectivamente sombreadas por plantas vecinas. Cuando la sombra es efectiva, en canopeos de mayor área foliar, también disminuye la cantidad de luz azul, aunque las consecuencias fisiológicas de este cambio en el ambiente lumínico son menos conocidas. Experimentos fisiológicos y genéticos llevados a cabo en esta tesis, empleando Arabidopsis thaliana, demuestran que la disminución de la irradiancia de luz azul es suficiente para activar el típico crecimiento elongado del SAS, y que el fotorreceptor involucrado en esta respuesta es el criptocromo 1 (cry1). A su vez, se encontró que la vía de señalización reclutada por la inactivación de cry1 en las respuestas SAS, requiere de PIF4 y PIF5, pero que a diferencia de la vía de señalización del SAS disparada por la inactivación del phyB, no requiere TAA1. Otro fenómeno común en ambientes lumínicos que conducen a la inactivación de phyB es la atenuación en la producción de defensas anti-herbívoro o contra microorganismos patógenos. Este fenómeno es en parte una consecuencia de la pérdida de sensibilidad de los tejidos a la hormona de defensa ácido jasmónico (JA). Los mecanismos moleculares involucrados podrían ser varios, y en esta tesis se estudió el rol de la proteína JAZ10, represora de la vía de JA, en el mecanismo que vincula la inactivación del phyB con la reducción en la sensibilidad a JA. Se encontró que el RL actúa estabilizando a JAZ10, lo que explica, al menos en parte, porqué las defensas están atenuadas cuando phyB es inactivado. Existe un creciente interés en comprender los mecanismos que permiten a las plantas activar respuestas adaptativas al enfrentar, en forma simultánea, un conjunto de factores de estrés, como la competencia con otras plantas y los ataques de organismos heterótrofos. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan elementos de importancia para entender las bases fisiológicas de algunas de estas respuestas. Este conocimiento, desarrollado en Arabidopsis como especie de referencia, podrá emplearse en el futuro para el desarrollo de cultivos que, por ejemplo, expresen sistemas de defensa robustos en un amplio rango de densidades de siembra.

Abstract:
In dense plant populations, it is important for plants to adjust their growth and development in response to the light signals perceived by photoreceptor proteins. These photoreceptors have a role in sensing changes in the canopy light environment, and activate several signaling pathways, whose final responses have important consequences to the interaction between plants and other organisms. This thesis focuses on the effect of low red to far red (R:FR) ratios and blue light attenuation, which are signals of competition, on adaptative responses associated with competitive ability and plant defense. Phytochrome B (phyB) inactivation by low R:FR ratios is the main event leading to the Shade Avoidance Syndrome (SAS), even before the plants are shaded by their neighbors. When shading among neighboring plants becomes intense, in canopies with elevated leaf area, blue light irradiance is also attenuated, but the physiological consequences of this change in the light environment are less well understood. Physiological and genetic experiments reported in this thesis demonstrate that blue light attenuation is enough to promote typical SAS responses in rosettes of Arabidopsis thaliana, and that the blue light photoreceptor involved in this response is cryptochrome 1 (cry1). In turn, it was found that the signaling pathway recruited by cry1 inactivation to promote SAS requires the proteins PIF4 and PIF5 but, in contrast with the SAS pathway triggered by phyB inactivation, it does not require TAA1. Another common response to canopy shade is the reduced production of plant defenses against pathogens and herbivorous insects. This phenomenon is partly a consequence of the loss of tissue sensitivity to the defense hormone jasmonic acid (JA) in plants exposed to low R:FR ratios. The experiments reported here addressed the role of the JAZ10 protein, a transcriptional repressor of the JA signaling pathway. It was found that low R:FR ratios stabilize JAZ10, which contributes to explain why JA responses are attenuated when phyB is inactivated. There is growing interest for understanding how plants activate adaptive responses to cope with multiple biotic stressors. The results obtained in this thesis provide important elements to understand the molecular mechanisms that are behind some of these responses. This knowledge, developed in Arabidopsis as a reference model, may be used in the future for the development of crop plants with improved performance in high-density agricultural systems.

Pérez, Juliana Andrea. "Caracterización genómica y funcional de los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 que codifican para proteínas de tipo acuaporinas en Arabidopsis thaliana" (2015-03-25) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En las Angiospermas, la reproducción incluye procesos en los cuales el transporte de agua está espacial y temporalmente regulado. Durante la microgametogénesis del polen, el contenido de agua del grano de polen comienza a aumentar de manera significativa desde el estadio temprano de la microespora y continúa haciéndolo hasta la deshidratación parcial. El volumen de polen, al igual que el contenido de agua, disminuye durante la deshidratación de las anteras y el polen, se adapta a las condiciones ambientales durante la dispersión y aumenta durante la rehidratación en el estigma. En plantas con estigmas secos, la regulación de la rehidratación del polen proporciona una barrera temprana y eficaz para las polinizaciones incompatibles. El agua, los nutrientes y otras moléculas pequeñas son transportados rápidamente desde las papilas estigmáticas al grano de polen para promover su germinación por mecanismos que aún no se conocen completamente. Luego durante la elongación del tubo polínico, la entrada adicional de agua a través de la membrana plasmática permite el ajuste citosólico de iones (Ca2+, K+, H+ y Cl–) y de la presión de turgencia. Se ha propuesto que las acuaporinas estarían involucradas en el transporte de agua y/o solutos durante la germinación del polen y el crecimiento del tubo polínico. En Arabidopsis thaliana sólo 4 genes (de un total de 35 loci) se expresan específicamente en los granos de polen maduros y/o tubos polínicos: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 y AtNIP4;2. En este trabajo de tesis se demuestra la participación de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 en los procesos asociados a la reproducción. Los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 presentan alta identidad de secuencia nucleotídica, estructura génica similar (5 exones, 4 intrones) y están dispuestos en tándem. A nivel de proteínas, tienen un 84% de identidad aminoacídica, y comparten los mismos dos motivos NPA y el filtro de constricción ar/R (W, V, A, R), involucrados en la selectividad del transporte. Sin embargo, AtNIP4;1 y AtNIP4;2 muestran diferentes patrones de expresión. Ensayos de PCR en tiempo real demostraron que AtNIP4;1 tiene niveles relativos de expresión bajos en polen maduro y que AtNIP4;2 presenta un pico de expresión durante la elongación del tubo polínico. Además, flores transgénicas promotorNIP4;1::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS en los granos de polen maduros y persistente en los tubos polínicos, mientras que las flores promotorNIP4;2::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS solamente en el tubo polínico. Por lo tanto, nuestra hipótesis es que AtNIP4;1 y AtNIP4;2 podrían tener redundancia funcional durante la reproducción, pero desempeñar roles diferentes y específicos en el desarrollo del polen, la polinización y/o fertilización. Con el objetivo de llevar a cabo experimentos fisiológicos in vitro e in planta, se obtuvieron plantas mutantes simples de inserción de ADN-T y se generaron líneas amiARN doble knockdown. Las plantas simple mutante y doble knockdown mostraron parámetros de fertilidad afectados: reducción del número de semillas por silicua y segregación distorsionada asociada solamente al gametofito masculino. Además, las plantas doble knockdown mostraron reducción de la viabilidad y del diámetro de los granos de polen maduros, aumento del número de granos de polen inmaduros (granos de polen uni y bi-celulares), defectos en la rehidratación de polen, reducción de la tasa de germinación y de la longitud del tubo polínico (especialmente en condiciones limitantes de ácido bórico), y aumento del porcentaje de las flores no polinizadas. También se generaron líneas de complementación que expresan las proteínas de fusión eGFPAtNIP4; 1 y eGFP-AtNIP4;2 bajo sus promotores endógenos en el background de sus respectivas líneas simple mutantes. Los análisis de segregación demostraron que estas líneas de complementación rescatan el fenotipo mutante. Además, mediante microscopía confocal se observó que la proteínas de fusión eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 están localizadas en la membrana plasmática y en vesículas intracelulares de los granos (AtNIP4;1) y tubos polínicos (AtNIP4;1 y AtNIP4;2). Ensayos de expresión heteróloga de eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 en ovocitos de Xenopus laevis confirmaron que ambas acuaporinas presentan una baja permeabilidad al agua y un significativo transporte de glicerol. Ensayos de actividad quinasa in vitro demostraron que los dominios C-terminales de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 son fosforilados específicamente en Ser267 por AtCPK34, una proteína quinasa dependiente de calcio expresada en polen, sugiriendo que la fosforilación puede regular su actividad de transporte in planta. En resumen las evidencias obtenidas en esta tesis doctoral permiten sugerir que AtNIP4;1 estaría involucrada principalmente en las etapas del desarrollo del polen, polinización y germinación, y AtNIP4;2 tendría un rol preponderante en la elongación del tubo polínico. Palabras claves: acuaporinas de polen, transporte de agua, reproducción

Abstract:
In Angiosperms, reproduction involves processes where water and solutes transport is temporally and spatially regulated. During pollen development, pollen water content starts increasing significantly at the early microspore stage and continues to increase until partial dehydration. Then, pollen volume decreases during anther and pollen dehydration and, similar to water content, adapts to environmental conditions during dispersal, increasing later during rehydration. In plants with dry stigmas, regulated pollen hydration provides an effective early barrier to incompatible pollinations. Water, nutrients, and other non-polar small molecules are transported rapidly into pollen from the stigma papillae to promote its germination by mechanisms that are still unknown. Then, additional entry of water through the plasma membrane allows cytosolic adjustment of ions (Ca2+, K+, H+, and Cl–) and maintenance of turgor pressure during tip elongation. It has been proposed that aquaporins may mediate water and solute transport during pollen germination and pollen tube growth. In Arabidopsis thaliana only 4 genes (out of 35 loci) are specifically expressed in mature pollen grains and/or pollen tubes: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 and AtNIP4;2. Here, we show the involvement of AtNIP4;1 and AtNIP4;2 in reproduction processes. Interestingly, AtNIP4;1 and AtNIP4;2 are genes with high nucleotide sequence identity, similar gene structure (5 exons, 4 introns), and disposed in tandem. At protein level, they have 84% amino acidic identity, and share the same two NPA motifs and the ar/R constriction (W,V,A,R), involved in transport selectivity. However, they displayed different expression patterns. Real time PCR assays showed that AtNIP4;1 has low relative expression levels in mature pollen while AtNIP4;2 peaks during pollen tube elongation. Additionally, NIP4;1promoter::GUS flowers showed strong GUS activity in mature pollen grains, remaining in the pollen tubes, whereas NIP4;2promoter::GUS flowers, showed strong GUS activity upon pollen tube germination. Therefore, we hypothesized that they could have a functional redundancy during reproduction, even though they may play different roles in pollen development, pollination and/or fertilization. In order to perform in vitro and in planta physiological experiments, we obtained simple mutant T-DNA insertion lines and developed double knockdown amiRNA lines. Simple mutant and double knockdown plants showed affected fertility parameters: reduced number of seeds per silique, and distorted segregation ratios. Furthermore, double knockdowns displayed reduced mature pollen grain viability and diameter, increased number of immature pollen grains (increased number of pollen grains arrested at uni- and bi-cellular stages), defects in pollen rehydration, reduced germination rate and pollen tube length (specially under low boric acid conditions), and increased percentage of non-pollinated flowers. Complementation lines expressing eGFP-tagged AtNIP4;1 and AtNIP4;2 under their own promoters, in each mutant line background, rescued the mutant phenotype in segregation analysis. Additionally, confocal microscopy showed that eGFP-AtNIP4;1 and -AtNIP4;2 are localized in the plasma membrane and intracellular vesicles of pollen grains (AtNIP4;1) and tubes (AtNIP4;1 and AtNIP4;2). Functional expression of eGFP-AtNIP4;1 and eGFP-AtNIP4;2 in Xenopus laevis oocytes confirmed that both aquaporins have relatively low water permeability and significant glycerol transport. In vitro kinase assays showed that the C-terminal domains of AtNIP4;1 and AtNIP4;2 are specifically phosphorylated at Ser267 by AtCPK34, a pollen Calcium-dependent protein kinase, suggesting that phosphorylation might regulate their transport activity in planta. In summary, the obtained results suggest that AtNIP4;1 might be involved mainly in pollen development, pollination, and germination, and AtNIP4;2 could play a major role in pollen tube elongation. Keywords: aquaporins, pollen, water transport, reproduction

Márquez, María Mercedes. "Caracterización hidráulica del fruto de Fragaria x ananassa durante el proceso de maduración" (2015-04-07) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Durante la maduración de los frutos, procesos como la división celular, la expansión celular y la pérdida de turgencia requieren un control estricto de los flujos de agua. Estos flujos tienen lugar a través del sistema vascular en coordinación con los movimientos de agua celulares, dando como resultado un fenómeno hidráulico complejo. Si bien son pocos los estudios sobre procesos hidráulicos en frutos, se pudo comprobar que en etapas tardías de la maduración se pierde relación con el estado hídrico del resto de la planta. Este fenómeno se asocia a menudo con una alteración o pérdida de la función del xilema que en consecuencia determina un descenso en la conductancia hidráulica. Y si bien es sabido que los canales de agua (acuaporinas) expresados en las membranas celulares pueden jugar un rol importante en estos procesos, su participación específica resta ser elucidada. El trabajo de tesis aquí presentado se centró fundamentalmente en llevar a cabo un estudio integral de la frutilla contemplando aspectos anatómicos, fisiológicos y moleculares, que nos permitió entender el proceso general del movimiento de agua de este fruto compuesto en diferentes estadios madurativos. En base a los datos anatómicos y fisiológicos aquí presentados pudimos determinar que no existe en frutilla interrupción de la continuidad física de los vasos del xilema o pérdida de funcionalidad de los mismos. El conjunto de resultados aquí expuestos, en consonancia con los trabajos publicados acerca de la maduración de la frutas, nos ha permitido además exponer y discutir que los cambios en las fuerzas impulsoras serían responsables de la disminución de la entrada de agua vía xilema en las frutas maduras. Nuestros resultados también indican que las acuaporinas PIP1 y PIP2 presentan un patrón de expresión asociado a diferentes etapas de la maduración y que ambos subtipos se encuentran localizados en la misma membrana plasmática. En cuanto a las posibilidades de modulación del flujo de agua a través de la membrana plasmática detectamos la capacidad de regularlo mediante la co-expresión e inhibición por pH citosólico. En resumen, estos hallazgos integran la dinámica hidráulica en el proceso de maduración como un aspecto que debería ser considerado en el análisis de este proceso, no solamente para comprender la fisiología del fruto sino también para aumentar las herramientas que permitan introducir mejoras en el manejo comercial de las frutas.

Abstract:
Fruit ripening includes processes as cell division, cell expansion and loss of turgor, that request a strict control of water flows. These flows take place not only through the fruit vascular system but also are coordinated with the transcellular water movements resulting in a complex hydraulic phenomenon. Despite studies on fruits hydraulic processes are scarce, it is generally stated that at later stages of ripening the relationship between fruit and the plant water status is lost. This phenomenon is often associated with a disruption or loss of function of the xylem which consequently determines a drop in hydraulic conductance. In this context, although evidence is fueling that water channels (aquaporins) expressed in cell membranes should play an important role in these processes, their participation and specific function still demands to be elucidated. The thesis presented here intends to perform a comprehensive study of strawberry fruits, contemplating anatomical, physiological and molecular aspects, allowing us to understand the general process of water movement in different stages of fruit ripening. Based on anatomical and physiological data we determined that there is neither interruption of the physical continuity nor loss of functionality of the xylem vessels in the strawberry fruit unto the later stages (100% Red). On the other hand, the results presented here, in line with published work on other fruits, allowed us to discuss that changes in the driving forces would be responsible for the decrease in water intake by xylem in mature fruits. At the cellular level, our results also indicate that PIP1 and PIP2 aquaporins are both located in the same plasma membrane, have an expression pattern associated with different stages of ripening and can be regulated by co-expression (increasing water permeability) and cellular acidification (decreasing water permeability). In summary, these findings are integrated at hydraulic dynamics into the ripening process, as a trait that should be considered in the analysis of the overall process not only to understand the fruit physiology but also to consider when exploring the management of fruit.

Viñas, Ezequiel Santiago. "Análisis de plantas transgénicas ATEMYB32::IPT de pasto miel (Paspalum dilatatum Poir.) una gramínea C4" (2015-04-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En plantas forrajeras como Paspalum dilatatum Poir, la senescencia foliar es un proceso que afecta su producción y especialmente su calidad. Una estrategia molecular para retrasar la senescencia mediante la ingeniería genética se basa en la expresión de la secuencia codificante de la isopentenil transferasa (IPT), enzima clave en la biosíntesis de citoquininas. Para lograrlo se utilizan promotores con expresión no constitutiva que permitan la producción autorregulada de citoquininas. Se analizó el efecto de la incorporación vía transgénesis de las construcción quimérica ATEMYB32::IPT en clones de Paspalum dilatatum cv “Relincho”. Se estudiaron 8 eventos obtenidos mediante transformación biolística con controles isogénicos, dos provenientes de cultivo de tejido que no incorporaron al transgén después de la transformación biolística y uno de campo. Los individuos fueron propagados vegetativamente para generar réplicas que permitieron estimar la respuesta de los eventos a diferentes condiciones de estrés abiótico (deficiencias hídricas y temperaturas bajas extremas). Se realizaron análisis moleculares, PCR para amplificar el transgén ipt, complementándose esta información con la medición del nivel de citocininas y auxinas por HPLC. Se caracterizaron a las líneas transgénicas desde su comportamiento germinativo, su anatomía foliar y la ultraestructura de los cloroplastos. En todas las plantas ensayadas se estimó el contenido de clorofila, azúcares, proteínas totales y actividad de la enzima SOD. Se halló un mayor nivel de citocininas y de la relación citocininas/auxinas en plantas transgénicas respecto a las controles y variabilidad entre los eventos analizados. A niveles anatómico y ultraestructural se encontraron características distintivas de las líneas transgénicas. Además algunos de los eventos obtenidos mostraron una mayor resistencia a ambas condiciones de estrés y un mejor comportamiento germinativo. Se generaron conocimientos para comprender el efecto de la incorporación del transgén ATEMYB32::IPT en especies C4.

Abstract:
Leaf senescence is a process that affects the production and quality of fodder plant such as Paspalum dilatatum Poir. In order to delay the senescence, there is a molecular strategy which consists on using genetic engineering. It uses the sequence encoding isopentenyl transferase (IPT), a key enzyme in the biosynthesis of cytokinins. Promoter with expression non constitutive are used to allow the self –regulated production of cytokinin. The effect of incorporation of transgenesis via ATMYB32::IPT chimeric construct was analyzed in clones of Paspalum dilatatum cv " Relincho ". Eight events obtained by biolistic transformation and isogenic controls were studied. Two of them came from tissue culture with transformation biolistic which they did not incorporate to the transgenic after the biolistic conversion and also a third coming form field. The individuals were spread in a vegetative way to obtain replicates for estimating the response of different events under abiotic stress conditions (water deficits and frost). In addition, molecular analyzes were performed PCR to amplify the ipt transgene. This information was complemented with measures of cytokinins and auxins by HPLC. Transgenic Lines were characterized considering the germination behaviour, leaf anatomy and chloroplast ultrastructure. Content of chlorophyll, sugars, total protein and SOD enzyme activity was estimated in all plants under analysis. Higher levels of cytokinins were found in transgenic plants compared to the controls and variation in the analyzed events. Distinctive features of the transgenic lines were found in the anatomic and ultrastructural level. Furthermore some of the obtained events showed a higher resistance to stress conditions and a better germination behavior. Knowledge was developed in order to understand the effect produced by the incorporation of the transgene ATMYB32::IPT in C4 specie.

Rodríguez, Sabrina Andrea. "Propiedades biomecánicas y ecofisiológicas de especies de árboles nativos y cultivados en la provincia de Misiones" (2015-05-29) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo general de este estudio fue el de analizar propiedades biomecánicas y ecofisiológicas de 10 especies nativas del bosque subtropical y 5 especies cultivadas en plantaciones forestales para comprender aspectos importantes de la estructura, funcionamiento y dinámica de bosques nativos subtropicales y plantaciones forestales en la Provincia de Misiones. Se hizo énfasis en mecanismos de regulación del flujo de agua a dos escalas: individuo y ecosistema así como características biomecánicas de especies del bosque nativo y su relación con modos de mortalidad. Una hipótesis general de este estudio es que las características biomecánicas y de la estructura hidráulica de los árboles, como por ejemplo la densidad de madera, esta funcionalmente relacionada con aspectos fisiológicos y ecológicos de especies de árboles: tasas de crecimiento, estabilidad mecánica, tasas y modos de mortalidad, eficiencia en el transporte de agua y la vulnerabilidad a la cavitación de los árboles tanto de especies nativas como cultivadas. Los objetivos específicos fueron: 1.Establecer la relación entre densidad de madera y tasas de crecimiento, analizar la relación entre la densidad y otras propiedades biomecánicas de la madera (resistencia a la deformación, ruptura, penetración) y; establecer la relación entre propiedades biomecánicas, tasas de crecimiento y modo de mortalidad (desarraigado, quebrado, muerto en pie, otros); 2.Determinar si la densidad de madera es un buen predictor de la eficiencia del transporte de agua y la vulnerabilidad a la cavitación; y establecer si hay compromisos entre la eficiencia de transporte del agua y vulnerabilidad a la cavitación, es decir si propiedades del sistema de transporte que confieren menor vulnerabilidad tienen un costo que resulta en xilemas con menor capacidad para transportar agua desde el suelo hasta las hojas; 3. Cuantificar el consumo de agua, su variación diaria y estacional; y analizar la relación entre el consumo de agua, la densidad de madera, tasas de crecimiento y condiciones climáticas a diferentes escalas espacio temporales desde individuo a ecosistema. Se estudió la densidad de madera en tallo principal y ramas, área de xilema activo, consumo de agua, tasas de crecimiento, características arquitecturales, modo de mortalidad de los árboles adultos, eficiencia de transporte de agua, vulnerabilidad a la cavitación y propiedades biomecánicas. La densidad de madera estuvo fuertemente relacionada con las tasas de crecimiento (una menor densidad, y por lo tanto, un menor costo de construcción por unidad de volumen del xilema estuvo asociado a una mayor tasa de crecimiento, tal como lo sugieren modelos derivados de teorías fractales), las propiedades biomecánicas y en menor medida con el modo de mortalidad de los árboles. El modo de mortalidad en los árboles estuvo relacionado con la resistencia a la rotura y la dureza y con la posición en el dosel que ocupaban los árboles. Esto último se debe a la combinación de elevadas precipitaciones y vientos fuertes en el sitio de estudio en donde el grado de protección al viento de un árbol por sus vecinos tiene gran importancia en la protección de los arboles a condiciones ambientales extremas. La densidad de madera estuvo relacionada con la eficiencia de transporte de agua en las especies nativas, pero no se relacionó con la vulnerabilidad a la cavitación. Las especies cultivadas fueron menos eficientes en el transporte de agua, pero menos vulnerables a la cavitación comparadas con las especies nativas. Esto es consistente con la baja eficiencia en el transporte de agua de las gimnospermas y sus pequeños márgenes de seguridad. El consumo de agua no estuvo relacionado con la densidad de madera a nivel individuo, pero sí con el tamaño de los árboles (DAP) cuando se incluyeron a todas las especies en los análisis de relaciones funcionales. A nivel de ecosistema, la evapotranspiración en las plantaciones forestales estudiadas fue similar a la del bosque nativo.

Abstract:
The overall objective of this study was to analyze biomechanical and ecophysiological properties of 10 native species of subtropical forests and five cultivated species in forest plantations with the aim of understanding important aspects of the structure, function and dynamics of subtropical native forests and plantations in the Province of Misiones. A general hypothesis of this study is: wood density is functionally related to physiological and ecological aspects of tree species such as growth rates, mechanical stability, mortality rates, and efficiency and safety in the water transport system of trees. The specific objectives were: 1. To establish the relationship between wood density and growth rates, analyze the relationship between density and other biomechanical properties of wood (resistance to deformation, rupture, penetration) and establish the relationship between biomechanical properties, growth rates and mode of death (uprooted, broken, dead standing, others) 2. Determine if the density of wood is a good predictor of the water transport efficiency and vulnerability to cavitation, and establish whether there is trade offs between water transport efficiency and vulnerability to cavitation, ie if transport system properties that confer reduced vulnerability to xylem results in a lower capacity to transport water from the soil to the leaves; 3. Quantify the daily water consumption and it seasonal variation, and analyze the relationship between water consumption, wood density, growth rates and climate at different spatial and temporal scales from individual to ecosystem. Wood density of the main stem and branches, area of active xylem, water consumption, growth rates, architectural characteristics, death of adult trees, water transport efficiency, vulnerability to cavitation and biomechanical properties were studied. The wood density was strongly correlated with growth rates (lower density, and therefore, lower construction cost per unit volume of xylem was associated with high growth rates), biomechanical properties and modes of tree mortality. Tree mortality was related to the breaking strength and hardness, and the position occupied by the trees in the canopy. This was the results of high rainfall and high winds and thus the degree of wind protection from a tree by its neighbors is important. The wood density was related to the water transport efficiency in the native species, but was not associated with the vulnerability to cavitation. Cultivated species were less efficient in water transport, but more resistant to water stress compared to native species. Water consumption was not related to wood density at individual level, but it was functionally related to tree size (DBH) when all species were included in the analysis. At the ecosystem level, water consumption in forest plantations was similar to that of the native forests.

Salvucci, Rubén Darío. "Loci de caracteres cuantitativos (QTLs) de la soja (Glycine max L. Merr) asociados a su capacidad de nodular y fijar nitrógeno" (2015-06-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La soja (Glycine max L. Merr) es la leguminosa más importante cultivada a nivel mundial y en Argentina que, junto con Estados Unidos y Brasil, son los paises que lideran la producción y el comercio de esta oleaginosa. Para obtener materiales con altos rendimientos en las producciones agrícolas, el N se incorpora por medio de la fertilización química y/o biológica. Esta última tiene ventajas por sobre la fertilización química ya que presenta menores riesgos para la contaminación del medio ambiente y contribuye a un manejo sustentable. Ésta consiste en adicionar bacterias del suelo Gram (-) del género Bradyrhizobium que tienen la capacidad de interaccionar con las raíces de la planta, como resultado de lo cual, desarrollan estructuras denominados nódulos, en los cuales la bacteria fija nitrógeno. La soja usa casi todo el nitrógeno fijado en la producción de granos. Las compañías de inoculantes se han focalizado en producir formulados con cepas de bacterias seleccionadas que fijen más eficientemente el N y que puedan ser utilizadas en una amplia variedad de leguminosas. Sin embargo, el foco del mejoramiento en leguminosas ha sido principalmente el rendimiento y la resistencia a factores abióticos y bióticos. Desde 1950 se han caracterizado varios genes involucrados en el reconocimiento de las señales disparadas por los rizobios y las distintas etapas de la infección y nodulación. Sin embargo, los caracteres capacidad de nodulación y de fijación biológica de nitrógeno (FBN) presentan una arquitectura genética compleja, y además depende de la interacción planta-bacteria y del ambiente. Debido al gran tamaño y complejidad del genoma de la soja, todavía resta identificar genes de la planta involucrados en la nodulación y fijación de nitrógeno. Por lo tanto, en el objetivo del presente trabajo de tesis fue identificar a los loci de caracteres cuantitativos (QTLs) asociados a la capacidad de nodulación de la soja, de manera de disponer de la información y de los marcadores moleculares que permitan mejorar al hospedante en lo que hace a la nodulación y por ende a la fijación de nitrógeno. Para ello se analizó la habilidad de 31 cultivares comerciales argentinos de soja para desarrollar nódulos cuando estos fueron inoculados con una mezcla de las cepas Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5079 (CPAC 7) y SEMIA 5080 (CPAC 15). Los experimentos se realizaron en condiciones controladas de luz y temperatura. Se utilizaron para evaluar la capacidad de nodulación tres variables cuantitativas: número de nódulos (NN), peso seco de nódulos (PSN) y peso seco de la parte aérea de la planta (PSA). Los resultados permitieron seleccionar cultivares con alta, media y baja capacidad de nodulación. En un segundo experimento se confirmó la respuesta diferencial para la capacidad de nodulación y en un tercer experimento se comprobó que la capacidad de nodulación no es dependiente de la cepa inoculada ya que los cultivares de alta y baja capacidad de nodulación mostraron el mismo fenotipo cuando fueron inoculados con la estirpe E109. Los cultivares con alta capacidad de nodular tuvieron el doble de nódulos que aquellos con menor capacidad, confirmando resultados de trabajos previos. Además, se demostró la existencia de una variabilidad fenotípica amplia para las variables estudiadas. Los resultados señalaron valores medianos a altos de heredabilidad H2, siendo la variable NN la que denotó mayor variabilidad genética. La respuesta de la planta a la inoculación con una concentración determinada de bacterias estuvo condicionada al número de bacterias inoculadas. Un aumento en la concentración de células bacterianas resultó en un incremento del número de nódulos, hasta una concentración umbral, por encima de la cual la nodulación fue inhibida, lo que probablemente esté vinculado al mecanismo de “quorum sensing”. Esto último se observó tanto en los dos cultivares de alta como en los dos de baja capacidad de nodulación. La densidad celular de los rizobios no alteró la respuesta al comparar los cultivares a la inoculación. Luego se procedió a caracterizar la diversidad genética de los cultivares argentinos de alta y baja capacidad de nodulación por medio de SSRs ligados a QTLs asociados a nodulación en cultivares brasileros. Se determinó la asociación de estos marcadores con la capacidad de nodulación y otras características agronómicas de los cultivares de soja y se identificó la generación parental con capacidad de nodulación contrastante para que a partir del cruzamiento entre ellas se obtenga poblaciones segregantes aplicables al análisis de QTLs. Se encontró polimorfismo para 10 marcadores SSR. En los cultivares argentinos e encontró asociación entre la capacidad de nodulación y los marcadores SSR definidos por los cultivares brasileros. Metodologías de análisis multivariados permitieron tomar la decisión de seleccionar un cultivar de alta nodulación (NA 5485 RG) y uno de baja nodulación (A 7053 RG). Éstos fueron los parentales que se utilizaron para generar la población segregante F2:3 como población de mapeo. En la generación F2 se realizó el genotipado de los individuos a partir de ADN foliar con un “screening” de 221 marcadores SSR a lo largo del genoma de los cuales sólo 36 fueron polimórficos. Se construyó un mapa genético parcial conteniendo 5 grupos de ligamiento. El fenotipado se realizó sobre 94 familias F3 en un ensayo de nodulación en condiciones controladas de luz y temperatura y se evaluaron los caracteres cuantitativos que definen la capacidad de nodulación: número de nódulos (NN), peso seco de nódulos (PSN) y peso seco de nódulo por nódulo (PSNN) calculado como PSN/NN. También otros caracteres relacionados con el crecimiento de la planta fueron considerados: la biomasa seca de hojas (PSH) y biomasa seca de tallo (PST) y la suma de ambas, peso seco de la parte aérea (PSA). Se realizó un análisis de correlaciones entre las variables y de coeficientes de paso. A partir de una matriz básica combinada con los datos genotípicos (SSR) y fenotípicos se realizó finalmente el análisis mapeo de QTLs para estos caracteres mediante tres metodologías: por locus simple (ANOVA y regresión), por intervalo (SIM) e intervalo compuesto (CIM). Los resultados encontrados para la mayoría de los QTLs y sus efectos génicos coincidieron en general por los dos primeros métodos. Se pudo confirmar que el QTL Satt414 se asoció a NN y PSN (locus simple). Se concluyó que las variables asociadas a capacidad de nodulación en la población F3, presentaron altos valores de varianza genética y heredabilidad. Se localizaron QTLs para las variables estudiadas que explicaron valores mayores al 15% de la varianza fenotípica total de la población segregante. Se observó una segregación transgresiva para la mayoría de las variables asociadas a capacidad de nodulación. Se probó asociación en acoplamiento entre variables relacionadas con la capacidad de nodular y el aumento de la biomasa. Para caracteres de capacidad de nodulación, se localizaron QTLs en los siguientes grupos de ligamiento: GL H para NN; PSN y PSNN; GL D1b para NN; GL A2 para NN; GL J para NN y PSN; GL B2 para PSN y PSNN; GL B1 para PSNN, GL C1 para PSNN. Estos QTLs explicaron entre 12.2-13.4% de la variación fenotípica total. Para caracteres de biomasa, relacionados con la FBN, se localizaron QTLs en los siguientes grupos de ligamiento: GL H para AP y PST; GL M para AP. GL D1b para AP, PST, PSA y PSH; GL B2 para AP; GL N para PSA. GL L para PSA; GL G para PSH. Estos QTLs explicaron entre 8.3-25.6% de la variación fenotípica total. Si bien la metodología aplicada permitió localizar algunos QTLs de nodulación en intervalos. Estas regiones deberían saturarse con otros marcadores de mayor eficiencia y variabilidad como los SNPs. Una mayor saturación conjuntamente con la información disponible sobre el genoma de la soja y los bancos de ESTs permitirán identificar genes candidatos relacionados con el carácter en estudio. Estos resultados aportan herramientas útiles como punto de partida para realizar mejoramiento asistido por marcadores para la capacidad de nodular y fijar nitrógeno en soja promoviendo rendimientos superiores bajo una agricultura sustentable. Palabras clave: Soja (Glycine max), Bradyrhizobium japonicum, marcador molecular, análisis de mapeo de QTLs, nodulación, fijación biológica de nitrógeno.

Abstract:
Soybean (Glycine max L. Merr) is the most important legume cultivated worldwide. Argentina, Brazil and USA are the most important countries in terms of production and exports of soybean products. In order to make get the most of the production potential of soybean cultivars, N is incorporated by chemical and/or biological fertilization methods. The latter is aimed at using Biological Nitrogen Fixation (BNF) that has an advantage over the chemical fertilization since it reduces the risks of environmental pollution and contributes to a sustainable agriculture. BNF is the result of the plant rizobia interaction, because of this a biotechnological process was developed and is known as inoculation. It consists in adding Gram-negative soil bacteria from the genus Bradyrhizobium that has the ability to interact with the soybean root, to the plant that as a result of this develops structures known as nodules, where bacteria fix nitrogen. In soybean almost most of the nitrogen fixed biologically is used by the plant growth therefore production is improved. Companies improved nitrogen fixation by developing formulations containing bacteria. selected based on its outstanding efficiency to fix nitrogen in an interaction with a wide array of cultivars and/or legume species. However, on the plant side breeding programs have been focused mostly in improving yield and resistance to biotic and abiotic factors. Starting in 1950, several genes that are involved in rhizobia-soybean interactions have been characterized. However, the ability of soybean cultivars to nodulate and fix nitrogen has a complex genetic architecture that depends on plant-bacterial and environment interactions. The size and complexity of the soybean genome, delayed the identification of plant genes involved in nitrogen fixation. Therefore the aim of this work was to identify quantitative trait loci (QTLs) associated to the ability of soybean to develop nodules, as well as to identify molecular markers associated to this trait. I analyzed the nodulation ability of 31 Argentinian commercial soybean cultivars which were inoculated with a mixture of Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 5079 (CPAC 7) and SEMIA 5080 (CPAC 15). The results allowed me to classify cultivars in high, medium and low nodulating cultivars. In a second experiment, a subset of the already analyzed cultivars was selected for further analysis and their response to inoculation was confirmed. In a third experiment, four cultivars two with high and two with low nodulation capacity were inoculated with another bacterial strain, B. japonicum E109 (recommended by INTA for the soybean crop in Argentina). Cultivars responded like in previous experiments suggesting that the response was governed by the plant genome. Cultivars with high nodulation ability doubled the number of nodules developed by low nodulating cultivars. Heritability was estimated (H2) for the nodule number (NN), nodule dry weight (NDW) and shoot dry weight (SDW) and the results showed that the values of heritability was either medium or high and that NN was the most variable genetic trait. Soybean cultivars, whether with low or high nodulation capacity, increased nodulation as the concentration of bacteria in the inoculum increased though this occurred till a threshold value, decreasing thereafter. Probably nodulation was inhibited by a "quorum sensing" mechanism. Then we analyzed the genetic diversity of Argentinian soybean cultivars by means of SSR markers linked to QTLs linked to nodulation capacity. In addition to this, also the association between markers with nodulation capacity and other agronomic traits was studied and cultivars with contrasting nodulation capacity were identified, to cross them and in order to get a segregating population for QTL analysis. It was found that 10 SSR loci were polymorphic among Argentinian cultivars and that NN, NDW and SDW were associated to SSR markers previously described in Brazilian cultivars. Cultivar NA 5485 RG (high nodulating) and cultivar A 7053 RG (low nodulating) were selected as parents to generate the mapping population F2:3. Genotyping was carried out in the F2 generation. Genomic DNA was screened 221 SSR loci along the whole soybean genome. Among them only 36 were polymorphic. A partial genetic map was constructed containing 5 linkage groups. Phenotyping was carried out over 94 families (F3) in a nodulation essay with light and temperature controlled conditions and quantitative traits that define the nodulation capacity: nodule number (NN), of nodule dry weight (NDW) and nodule dry weight per nodule (NDWN) calculated as NDW/NN. Other traits related to plant growth also were considered in the analysis: leaves dry biomass (LDB) and stem dry biomass (SDB) and the sum of both, shoot dry weight (SDW) and plant height (PH). A matrix with genotypic and phenotypic data was constructed and QTL mapping analysis was performed by three methods: single marker (ANOVA and regression), interval mapping (IM) and composite interval mapping (CIM). Satt414 locus was confirmed as QTL associated with NN and NDW (single marker). It was concluded that the variables associated with nodulation capacity in the F3 population presented high values of genetic variance and heritability. Identified QTLs for studied variables explained values higher than 15% of the phenotypic variance. A transgressive segregation was observed for most of the variables associated with nodulation capacity. In addition I also found that variables related to the nodulation capacity and biomass were associated. QTLs associated to nodulation capacity were located in linkage group GL H for NN; NDW and NDWN; GL D1b for NN; GL A2 for NN; GL J for NN and NDW; GL B2 for NDW and NDWN; GL B1 for NDWN, GL C1 for NDWN. These QTLs explained 12.2-13.4 % of the phenotypic variation. QTLs related to growth and biomass were located in the following linkage groups: GL H for PH and SDB; GL M for PH. GL D1b for PH, SDB, SDW and LDB; GL B2 for PH; GL N for SDW; GL L for SDW and GL G for LDB. These QTLs explained 8.3-25.6% of the phenotypic variation. The applied methodology allowed me to locate a few QTLs for nodulation in intervals. However, these regions should be saturated with more and/or other molecular markers with better efficiency and variability as e.g. SNPs. A higher level of saturation as well as the information regarding the soybean genome sequence and EST's should help in the identification of genes related to nodulation and nitrogen fixation. To my knowledge this is the first work aimed at identifying nodulation and nitrogen fixation genes in soybean cultivars from Argentina and provide the starting point for marker assisted selection for nodulation capacity and nitrogen fixation in soybean in order to promote better yields under a sustainable agriculture. Keywords: Soybean (Glycine max), Bradyrhizobium japonicum, molecular marker, QTL mapping analysis, nodulation, biological nitrogen fixation.

Bordenave, César Daniel. "Estudio de los mecanismos de respuesta a la infección causada por la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae en la leguminosa modelo Lotus japonicus" (2015-12-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Lotus japonicus es una legumbre modelo ampliamente utilizada para el estudio de procesos importantes como la nodulación y la respuesta al estrés salino. Sin embargo, existen pocos estudios sobre la respuesta defensiva de esta especie contra microorganismos patógenos. Comprender como se protege esta especie modelo contra patógenos podría ayudar a desarrollar cultivares más tolerantes en especies de Lotus de relevancia agronómica, así como también en otros géneros de legumbres. Para poder dilucidar los mecanismos de defensa más importantes en esta leguminosa, en este trabajo se exploraron las principales respuestas de dos ecotipos fenotípicamente contrastantes, Miyakojima MG-20 y Gifu B-129, a la inoculación con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Las respuestas de defensa activadas en ambos ecotipos fueron considerablemente diferentes. Así, en Miyakojima MG-20 se observó una interacción compatible caracterizada por una rápida multiplicación de la bacteria, acompañada por un descenso en la eficiencia del fotosistema II, la aparición de clorosis, desecación y defoliación, así como un moderado pero sostenido aumento en los niveles de especies reactivas del oxígeno (EROs). Estos fenómenos sólo fueron observados en los folíolos inoculados y no afectaron el desarrollo normal de la planta. Por su parte, en Gifu B-129 la interacción fue incompatible, los síntomas fueron en general imperceptibles, la bacteria fue incapaz de multiplicarse en los tejidos de la planta y existió un aumento notable de las EROs durante las primeras horas luego de la inoculación con la bacteria. A partir de estudios transcripcionales utilizando microarreglos de ADN, pudieron identificarse alrededor de 3000 genes regulados diferencialmente frente a la inoculación con la bacteria en el ecotipo Miyakojima MG-20 y alrededor de 300 genes en el ecotipo Gifu B-129. Además, se comparó la expresión génica basal de estas líneas, observándose diferencias en genes relacionados con estrés biótico y abiótico, metabolismo hormonal, estado redox y procesos fotosintéticos. Por otro lado se realizó un estudio del metaboloma, en el cual también se observó un comportamiento contrastante entre ambos ecotipos, detectándose un conjunto diferente de metabolitos que se modifican frente a la inoculación con la bacteria. Integrando los resultados del transcriptoma y del metaboloma se pudieron identificar numerosas vías metabólicas afectadas de manera diferencial en respuesta al ataque bacteriano, lo que permite explicar las diferencias de comportamiento observadas entre ambos ecotipos. Entre estas vías se destacan el sistema de antioxidantes (ascorbato y glutatión), el metabolismo del ácido γ-aminobutírico, la síntesis y degradación de componentes de la pared celular, la síntesis y degradación lípidos y el metabolismo hormonal. Posteriormente, sobre la base del análisis transcriptómico se seleccionaron distintas líneas mutantes insercionales del ecotipo Gifu B-129 para un conjunto de genes que podrían jugar un rol importante en la defensa vegetal. La mayoría de tales líneas demostró una tolerancia equivalente a la observada en la línea salvaje, sugiriendo que los genes mutados no son esenciales en la respuesta de defensa en estos ecotipos. Sin embargo, una línea incapaz de expresar el gen de la enzima Poliamina Oxidasa I demostró una mayor tolerancia durante la patogénesis, lo que indicaría que la expresión de este gen afecta negativamente la respuesta defensiva de la planta. Este trabajo permitió describir de manera global las principales vías metabólicas reguladas en dos ecotipos de L. japonicus durante la respuesta a la bacteria P. syringae pv. tomato DC3000. Las diferencias entre las respuestas inducidas en el ecotipo Gifu B-129 (interacción incompatible) con las observadas en el ecotipo Miyakojima MG-20 (interacción compatible) permitieron discernir cuales son los mecanismos de defensa más efectivos entre los presentadaos por los ecotipos evaluados. Estos resultados podrían ser extrapolados a otras especies de leguminosas de interés agronómico.

Abstract:
Lotus japonicus is a model legume widely used for the study of important processes such as nodulation and response to salt stress. However, there are few works focusing on the defensive response of this species against pathogenic microorganisms. Understanding how this model species responds against plant pathogens could help to develope more tolerant cultivars in agronomically important Lotus species as well as in other legume genera. In order to elucidate the most important defensive mechanisms in this legume, in this work it was explored the main responses of two phenotypically contrasting L. japonicus ecotypes, Miyakojima MG-20 and Gifu B-129, to the inoculation with the bacterial species Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. The defensive responses activated in both ecotypes were considerably different. Thus, in Miyakojima MG-20 was observed a compatible interaction, characterized by a rapid multiplication of the bacteria in infiltrated tissues, along with a decrease in the efficiency of the photosystem II, the appearance of chlorosis, desiccation and defoliation, as well as a moderate but steady increase in the levels of reactive oxygen species (ROS). All these symptoms were observed only in the inoculated leaflets, and never affected the normal development of the plant. In contrast, the interaction was incompatible in Gifu B-129 , where symptoms were rather imperceptible, the bacterium was unable to multiply in leaf tissues, and a critical increase in ROS accumulation was observed during the first few hours after bacterial infiltration. Based on DNA microarrays, were identified about 3,000 differentially regulated genes, upon infiltration with the bacteria in Miyakojima MG-20, and about 300 genes of this type in Gifu B-129. Moreover, it was posible to compare the basal gene expression between these lines, which showed differences in genes related to biotic and abiotic stresses, hormonal metabolism, redox state, and photosynthetic processes. A metabolomic study on these samples was also performed, revealing that a different set of metabolites in each ecotype was modified in response to the bacteria. By integrating the transcriptomic and metabolomic data, several metabolic pathways affected differentially in response to bacterial attack were identified , which helps to explain the observed differences in behavior between both ecotypes. Among these pathways stand out those of the antioxidants system (ascorbate and glutathione), the γ-aminobutyric acid metabolism, the synthesis and degradation of cell wall components, the synthesis and degradation of lipids, and hormone metabolism. Finally, several insertional mutants of the Gifu B-129 ecotype were selected for a set of genes that could play an important role in plant defense. Most of them showed a level of tolerance to the bacteria similar to that of the wild type, suggesting that this genes are not essentials in the defense response in these ecotypes. However, one line defective in the Polyamine Oxidase I gene showed higher tolerance, indicating that the expression of this gene during the plant response to the bacterial attack. negatively affects the defense of the plant. This work globally describes the main metabolic pathways regulated in response to P. syringae pv. tomato DC3000 in two ecotypes of L. japonicus. The differences between the responses triggered in the ecotype Gifu B-129 (incompatible interaction) and Miyakojima MG-20 (compatible interaction) let us to unravel the most effective defense mechanisms among those presented by the evaluated ecotypes. These results could be extrapolated to other agronomical important legumes.

Toum Terrones, Laila. "Mecanismos de Xanthomonas campestris pv. campestris en la supresión de la respuesta inmune de Arabidopsis thaliana" (2015-12-21) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta tesis, estudiamos algunos de los mecanismos a través de los cuales Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) suprime la respuesta inmune de Arabidopsis thaliana. Los microbios gatillan el cierre estomático en la planta a través de patrones moleculares asociados a microbios (MAMPs), sin embargo Xcc es capaz de colonizar A. thaliana a través de estos poros mediante un factor de virulencia (Xcc FV) capaz de inhibir su cierre. En la primera parte de esta tesis estudiamos el mecanismo de acción del Xcc FV y de una toxina de efecto similar producida por la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae pv. tomato denominada coronatina. Encontramos que ambos compuestos inhiben el cierre estomático inducido por MAMPs y por la hormona ácido abscísico a través de la inhibición de la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) mediada por NADPH oxidasas y de manera dependiente de la señalización de jasmonatos. En la segunda parte de la tesis, estudiamos el rol del glucano cíclico β-(1,2) de Xcc en el proceso infectivo. Hallamos que este compuesto inhibe la producción de ERO, disminuye la expresión de genes de defensa y suprime la deposición de calosa inducidas por flagelina. Asimismo, observamos que el efecto del glucano cíclico β-(1,2) requiere de dos receptores quinasa con dominios ricos en lisina, LYK3 y LYK4, y que se une específicamente a preparaciones de membranas de A. thaliana, lo cual sugiere que actúa a través de la unión a un receptor de membrana. En la tercera parte de la tesis, estudiamos el mecanismo a través del cual el xantano, un exopolisacárido producido por Xcc, actúa como factor de virulencia. A través del uso mutantes de Xcc afectadas en enzimas biosintéticas encargadas de modificar químicamente el xantano, descubrimos que la piruvilación sobre la manosa externa de la unidad repetitiva de este polisacárido son esenciales para su actividad de supresión de la respuesta inmune de A. thaliana. Palabras clave: estomas, ABA, coronatina, NADPH oxidasas, especies reactivas de oxígeno, glucano cíclico β-(1,2), flg22, inmunidad vegetal, xantano, Xanthomonas, Arabidopsis thaliana.

Abstract:
In this thesis, we studied some of the mechanisms by which Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) suppresses Arabidopsis thaliana immune response. Microbes trigger stomatal closure through microbe-associated molecular patterns (MAMPs). However, Xcc is able to colonize A. thaliana through stomatal pores by synthesizing a virulence factor (Xcc VF), which is capable of inhibiting stomatal closure induced by MAMPs. In the first part of this thesis we studied the mechanism of action of the Xcc VF and of coronatine, a similar toxin produced by the phytopathogen Pseudomonas syringae pv. tomato. We found that both compounds inhibit stomatal closure triggered by ABA and by MAMPs by preventing NADPH oxidasedependent reactive oxygen species (ROS) production and in a jasmonate signalling-dependent manner. In the second part of this thesis, we studied the role of a cyclic β-(1,2)-glucan produced by Xcc during the infective process. We found that this compound prevents flagellin-induced ROS production, inhibits induction of defense genes and suppresses callose deposition elicited by this MAMP. We also demonstrated that the cyclic β-(1,2)-glucan effect requires two lysin motif receptor kinases, LYK3 and LYK4. Additionally, we observed that cyclic β-(1,2)-glucan binds specifically to A. thaliana membranes, which suggests that this compound might exert its suppressive effect via membrane-bound receptors. In the third part of this thesis, we studied the mechanism by which xanthan, an exopolysaccharide produced by Xcc, acts as a virulence factor. By using mutants of Xcc affected in enzymes that modify xanthan chemically during its biosynthetic process, we found that pyruvilation and mannosylation of the polysaccharide are essential for its activity as a suppressor of A. thaliana immune response. Keywords: stomata, ABA, Xcc VF, coronatine, NADPH oxidases, ROS, cyclic β-(1,2)-glucan, flg22, plant immunity, xanthan structure, Xanthomonas, Arabidopsis thaliana.

Godoy Herz, Micaela. "Regulación del splicing alternativo y de la elongación de la transcripción en plantas por acción de la luz" (2017-03-23) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La luz es un estímulo ambiental que regula varios procesos biológicos en las plantas. A través del cloroplasto, la luz regula el splicing alternativo de un conjunto de genes. En este trabajo nos propusimos estudiar los mecanismos por los que la luz realiza esta regulación. Tomamos como modelo el gen RS31, que codifica para un factor de splicing rico en serinas y argininas. Encontramos que los cambios que se observan en las isoformas de RNA mensajero de RS31 por acción de la luz se deben al proceso de splicing alternativo y no a una degradación diferencial de sus isoformas. Por otro lado, encontramos que el tratamiento de plantas que se encuentran en oscuridad con tricostatina A, una droga que promueve la hiperacetilación de histonas, imita el efecto de la luz sobre el splicing alternativo. Además, demostramos que una mutante de Arabidopsis deficiente en la deacetilación de histonas HD1 muestra un menor efecto de luz a oscuridad que las plantas salvajes. El efecto de la luz sobre el splicing alternativo implica cambios en la elongación de la transcripción: el tratamiento de plantas con camptotecina, droga que inhibe la elongación, imita el efecto de la oscuridad sobre el splicing alternativo. Realizamos mediciones de la tasa de elongación y encontramos que en luz la elongación es más rápida que en oscuridad en el gen de RS31. Finalmente, en plantas de Arabidopsis defectuosas en el factor de elongación TFIIS el efecto de la luz sobre el splicing alternativo de los eventos estudiados se inhibe por completo. Estos resultados muestran que el efecto de la luz sobre el splicing alternativo depende de cambios en la elongación de la transcripción.

Abstract:
Light is an environmental stimulus that regulates several biological processes in plants. Through the chloroplast, light regulates alternative splicing of a subset of genes. In this work, we aim to study the mechanism of light- regulation of alternative splicing. We chose the Ser-Arg-rich splicing factor RS31 as a model and found that changes in the abundance of mRNA isoforms are due to changes in alternative splicing –and are not caused by degradation of mRNA isoforms. Treatment of plants with trichostatin A, a drug that suppresses histone deacetylase activity and therefore increases histone acetylation, mimics the effect of light on RS31 alternative splicing. Furthermore, in an Arabidopsis mutant defective in the histone deacetylase HD1 the effect of light to dark transition on alternative splicing is strongly reduced. The effect of light on alternative splicing involves changes in transcription elongation: treatment of plants with camptothecin, a drug that inhibits transcription elongation, mimics the effect of darkness on alternative splicing. We performed measurements of transcription elongation rate and found that in light-treated plants transcription elongation is faster than in dark-treated plants along the RS31 gene. Finally, in a plant defective in the elongation factor TFIIS the light/dark effect on alternative splicing is completely abolished. These results show that the effect of light on alternative splicing involves changes in transcription elongation.

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