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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Farmacología [ 11 tesis ]

Ritta, Mónica Nora. "Prostaglandinas y función pineal : Su participación en la síntesis y mecanismo de acción de la hormona pineal melatonina" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Herrero, María Belén. "Evidencias sobre la existencia de la enzima óxido nítrico sintasa en el espermatozoide murino y su participación en el proceso de fertilización" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Virtualmente todas las células de mamíferos están bajo la influencia del radical libre denominado óxido nítrico (NO). Las enzimas responsables de la síntesis del NO se conocen como óxido nítrico sintasas (NOS 6 NO-sintasas). En mamíferos, se han clonado tres isoenzimas de la NO-sintasa. Las isoformas neuronal y endotelial son dependientes de Ca++ y se expresan constitutivamente, mientras que la isoforma inducible es Ca++ independiente y se induce en presencia de lipopolisacáridos y citocinas. Todas las isoformas pertenecen a la farnilia de los citocromos P-450, utilizan L-arginina como sustrato, con oxígeno molecular y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato forma reducida (NADPH) como co-sustratos. Las funciones del NO fueron descriptas primeramente en tres sistemas fisiológicos (vascular, nervioso e inmune) y a partir de dicho estudio se fueron descubriendo funciones del NO en otros sistemas como el reproductor, respiratorio y excretor. En reproducción, se vio que el NO induce la erección peniana, estimula al factor liberador de la hormona luteinizante (LH-RH) y modula la síntesis de prostaglandinas uterinas y ováricas durante la luteólisis en la rata. Sin embargo, hasta el momento no se había descripto la participación del NO en el proceso de fertilización. En el presente trabajo se presentan evidencias de la existencia de la enzima NO-sintasa en la gameta masculina murina y su participación en la fertilización in vitro. Mediante ensayos farmacológicos determinamos que la adición de inhibidores específicos de la NO-sintasa (NG-nitro-L-arginina (NO2-arg) ó NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME)) durante el proceso de capacitación in vitro disminuye el porcentaje de ovocitos fertilizados. Esta inhibición es estereoespecífica y depende de la concentración. Dado que el proceso de fertilización se encuentra afectado en presencia de L-NAME y NO2-arg, medimos la motilidad espermática y el patrón de hiperactivación. A los 120 min de incubación, el L-NAME disminuye el porcentaje de espermatozoides mótiles e hiperactivados, mientras que un generador de NO como el nitroprusiato de sodio (NP) acelera estos parámetros de manera concentración dependiente. Considerando que el NO también podía participar en la reacción acrosomal, medimos el efecto del L-NAME sobre espermatozoides reaccionados espontáneamente ó en presencia de un inductor fisiológico como la progesterona. En estos casos, la exocitosis acrosomal también se halla inhibida; la inhibición es estereoespecífica y depende de la concentración. Contrariamente, 0.1 mM de spermine-NONOate (generador de NO) estimula la reacción acrosomal en espermatozoides previamente capacitados a niveles semejantes a los obtenidos con 15 microM de progesterona. Luego de los ensayos farmacológicos, evidenciamos la presencia de la NO-sintasa espermática mediante ensayos inmunológicos. Por inmunofluorescencia indirecta localizamos la NO-sintasa en el acrosoma y en la cola de espermatozoides no capacitados. Durante la capacitación, la fluorescencia desaparece del acrosoma y se mantiene en el flagelo, otorgando a esta enzima un potencial significado fisiológico en el proceso de capacitación y/o de reacción acrosomal. Seguidamente, realizamos ensayos de Western Blot, los cuales nos permitieron demostrar que anticuerpos anti-NOS neuronal, endotelial e inducible reconocen una única fracción proteica de 140 kD bajo condiciones desnaturalizantes y no reductoras en espermatozoides frescos de ratón. Cuando realizamos los experimentos cinéticos, detectamos la presencia de formación de NO, medida como conversión de L-arginina a L-citrulina en espermatozoides intactos y vivos (condiciones in vivo). Los espermatozoides sintetizan NO durante el proceso de capacitación alcanzando un plateau a los 120- 180 min de incubación. Además, la producción de NO depende de la concentración de L-arginina presente en el medio de incubación y es inhibida por L-NAME pero no por aminoguanidina (inhibidor específico para la NO-sintasa de caracter inducible), sugiriendo la existencia de una NO-sintasa espermática de caracter constitutivo. Considerando que en los ensayos farmacológicos evidenciamos la participación de la NO-sintasa del espermatozoide en la exocitosis acrosomal inducida por progesterona, se estudió también la modulación de este esteroide sobre la formación de NO en espermatozoides capacitados. Así, observamos que 15 microM de progesterona estimula directamente la síntesis de NO durante el período ensayado (90-120 min). Basándonos en trabajos realizados en nuestro laboratorio intentamos relacionar al NO con la síntesis de prostaglandinas e hidroxiácidos. Para ello, en primer término, demostramos que los espermatozoides de ratón son capaces de sintetizar PGE2 e hidroxiácido 5-HETE y luego observamos que el NP estimula la síntesis de estos metabolitos en la gameta masculina. Sin embargo, la síntesis basal de prostaglandinas no se ve modificada en presencia de L-NAME. Los resultados de este trabajo evidencian por primera vez la presencia de la NO-sintasa en el espermatozoide de ratón y demuestran su participación en el proceso de fertilización, modulando la motilidad espermática y la exocitosis acrosomal. Podemos afirmar entonces, que el NO sintetizado por la NO-sintasa espermática, es necesario para que el espermatozoide pueda expresar su plena capacidad fertilizante in vitro.

Abstract:
Mammalian cells are all virtually exposed to the action of nitric oxide (NO). Nitric oxide synthases (NOS or NO-synthases) are the enzymes that catalyze the production of NO. Three distinct isoforms of NO-synthase have been cloned in mammals. The neuronal and the endothelial isoforms are Ca++-dependenat nd are constitutively expressed while the inducible isoform does not depend on Ca"' and is induced with bacterial products and cytokines. NO actions have been previously described in the vascular, the nervous and the immune systems. However, many other fbnctions are being shown in the reproductive, the respiratory and the urinary systems. In the reproductive field, it was found that NO induces penis erection, stimulates LH-RH factor and modulates prostaglandins synthesis in the rat uterus. Nevertheless, till now it was not described the role of NO in the fertilization process. Our results show that NO-synthase inhibitors (NO-nitro-L-arginina (NO,-arg) 6 No-nitro- L--arginina meti1 kster (L-NAME)) added at the onset of capacitation reduce the percentage of f e e d oocytes. This inhibition is stereospecific and depends on the concentration. Moreover, we demonstrate that L-NAME reduces the percentage of motile and hyperactivated spermatozoa at 120 min of incubation, while a nitric oxide donor named sodium nitroprusside (NP) accelerates hyperactivation in a concentration manner. We were then interested in searching the effect of NO-syntahse inhibitors on the spontaneous and progesterone-induced acrosome reaction. In these cases, the acrosomal exocytosis is inhibited, the inhibition is stereospecific and depends on the concentration. In contrast, 0.1 mM spermine-NONOate (NO donor) stimulates the progesterone-induced acrosome reaction. Then, we evidence the presence of sperm NO-synthase by immunological assays. Thus, we localized NO-synthase in the acrosome and tail of non capacitated mouse spermatozoa by the immunofluorescence technique. During capacitation the fluorescence disappears in the acrosome and it persists in the tail. Besides, under denaturing and non reducing conditions, Western Blot analysis of solubilized sperm proteins reveal a unique band of Mr=140 kD with the three NO-synthase antisera tested (neuronal, endothelial and inducible isoforms). By means of kinetics assays, we detect the production of NO by intact spermatozoa (in vivo conditions). During the capacitation period (120 min), lo7 spermatozoa are capable to synthesize 7*2 picomoles of NO. Besides, NO formation depends on the incubation periodand on the concentration of L-arginine present in the incubation medium. Different concentrations of L-NAME but not aminoguanidine, inhibit L-citrulline formation, suggesting that sperm NO-synthase is a constitutive isoform. In the pharmacological assays, we demonstrated that NO-synthase may be involved in the progesterone-induced acrosome reaction; so we studied the effect of this steroid on the production of NO by capacitated sperm. In this set of experiments we show that 15 pM progesterone stimulates NO formation in spermatozoa. Based on studies done in our laboratory, we finally intend to relate NO to prostaglandins and hydroxyacids synthesis. We first demonstrate that mouse spermatozoa synthesize PGE, and 5-HETE and that these synthesis are stimulated by NP. However, L-NAME does not inhibit these basal synthesis. The results presented here evidence for the first time the presence of NO-synthase in the murine male gamete and the role of this enzyme in the fertilization process: sperm NO-synthase modulates sperm motility and the acrosomal exocytosis. So, we can say that NO, synthesized by sperm NO-synthase is necessary for spermatozoa to express its full fertilizing ability.

Tejera, Agueda Mercedes. "Efectos del tratamiento prolongado con AZT sobre células tumorales : acortamiento telomérico, inducción de senescencia y apoptosis, y reducción de tumorigenicidad" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Alvarez, Lucía Paula. "Efecto del ácido salicílico sobre la virulencia de Staphylococcus aureus y su interacción con el huésped" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
S. aureus es una bacteria oportunista capaz de generar infecciones severas en humanos. Entre los factores de virulencia más importantes de S. aureus se encuentran el polisacárido capsular (PC) y la adhesina Eap, cuya expresión está controlada por los reguladores globales sae y mgrA. La expresión de eap es activada por sae, mientras que el PC es activado por mgrA e inhibido por sae. El ácido salicílico (SAL) altera la expresión de diversas moléculas en células procariotas y eucariotas. Este trabajo se propuso estudiar el efecto del SAL sobre la expresión de los factores de virulencia de S. aureus y cómo esto afecta la interacción de la bacteria con el huésped. Al respecto, el SAL provocó un aumento en la capacidad de internalización de la cepa Newman en células epiteliales. Esto correlacionó con una expresión disminuida del PC5 y un aumento de Eap, debido al efecto positivo del SAL sobre sae y negativo sobre mgrA. Por otra parte, el tratamiento de las células endoteliales con SAL, así como también sobre los ratones generó una menor adherencia de S. aureus. Además, se determinó que Eap es esencial para la internalización y colonización de S. aureus tanto in vitro como in vivo. Estos hallazgos demuestran que el SAL altera la expresión de moléculas de S. aureus directamente involucradas en la interacción con el huésped y por lo tanto la progresión de la infección podría verse afectada.

Abstract:
S. aureus is an opportunistic bacterium capable of generating severe infection in humans. Among the most important virulence factors of S. aureus are the capsular polysaccharide (CP) and Eap adhesin, whose expression is modulated by sae and mgrA global regulators. Expression of eap is activated by sae, while CP is activated by mgrA and inhibited by sae. Salicylic acid (SAL) alters the expression of various molecules in prokaryotic and eukaryotic cells. This work proposed to characterize the effect of SAL on hostbacteria interaction. In this regard, SAL caused an increased internalization of strain Newman into epithelial cells. This observation correlated with a decreased expression of CP and an increased expression of Eap, which would be caused by a positive effect of SAL on sae and a negative effect on mgrA. Moreover, the action of SAL on endothelial cells and mice generated a lower adherence of S. aureus. Moreover, it was determined that Eap is essential for internalization and colonization of S. aureus both in vitro and in vivo. These findings demonstrate that SAL is able to alter the expression of molecules directly involved in of host - S. aureus interaction, and therefore the progression of infection would be affected.

Larramendy, Celia. "Efectos y adaptaciones inducidos por el tratamiento prolongado con agonistas dopaminérgicos en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Levodopa y pramipexol son drogas de uso frecuente en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Levodopa es el fármaco más efectivo para aliviar las deficiencias motoras pero en la mayoría de los casos induce disquinesias (movimientos involuntarios anormales). Pramipexol ha sido relacionado con efectos neuroprotectores y con una menor inducción de disquinesias. Sin embargo, su eficacia disminuye a medida que progresa la enfermedad. Con el objetivo de analizar si estas diferencias se reflejan a nivel de la expresión de genes, inyectamos ratas con 6-hidroxidopamina en el estriado y caracterizamos un modelo de lesión moderada de la vía nigroestriatal. Luego de la cirugía los animales fueron tratados con levodopa o pramipexol, en dosis que produjeron un beneficio terapéutico similar, determinado como la disminución de la aquinesia, inducida por la lesión, de la pata delantera contralateral al hemisferio lesionado. Un grupo control recibió vehículo. Mediante la tecnología de microarreglos de ADN analizamos 3 tandas independientes de animales a fin de comparar los cambios en la expresión de genes inducidos por los tratamientos de los grupos: normal/vehículo, lesionado/vehículo, lesionado/levodopa, y lesionado/pramipexol. Encontramos que el tratamiento crónico con levodopa y pramipexol indujo cambios en la expresión de numerosos genes, demostrando que, además de las diferencias observadas en el perfil farmacológico y en los efectos clínicos (tanto anti-parkinsonianos como adversos), estas drogas también inducen importantes diferencias a nivel de la expresión génica. La exploración de los genes expresados diferencialmente permitió elaborar nuevas hipótesis, siendo éste el valor principal del análisis masivo de genes.

Abstract:
Levodopa and pramipexole are frequently used drugs in the treatment of Parkinson's disease. Levodopa is the most effective to alleviate motor disability but induces abnormal involuntary movements (dyskinesias). Pramipexole have been proposed to have neuroprotective effects and less induction of dyskinesias. In order to evaluate possible differences at the gene expression level, rats were injected with 6- hydroxydopamine in the striatum and a partial nigrostriatal lesion model was characterized. After surgery, animals were treated with levodopa or pramipexole at doses that produced similar therapeutic benefit, evaluated by the reversal of akinesia, induced by the lesion, of the forepaw contralateral to the lesioned hemisphere. A control group received vehicle alone. We analyzed 3 independent groups of normal and lesioned rats by DNA microarray technology in order to compare the genetic profile of the groups: normal/vehicle, lesioned/vehicle, lesioned/levodopa, and lesioned/pramipexole. We have found that cronic treatment with levodopa and pramipexole induced changes in gene expression. We have demostrated that besides the differences seen in the pharmacological profile and the clinic effects (antiparkinsonian and colateral effects) of levodopa and pramipexole, these drugs also have important differences at the gene expression level. The analysis of differentially expressed genes induced by these drugs allowed us to elaborate new hypothesis, being the most valuable result of massive gene analysis.

Vota, Daiana Marina. "Eriptosis. Mecanismos involucrados y efecto protector de la eritropoyetina" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los procesos inflamatorios, frecuentemente asociados a anemia de enfermedades crónicas, podrían cumplir un rol en la inhibición de la eritropoyesis. La existencia de señales intracelulares comunes entre los procesos que regulan la eritropoyesis y la respuesta inflamatoria sugiere que la desregulación de un sistema podría explicar la disminución de la función del otro. Por otro lado, un daño directo sobre los eritrocitos maduros en circulación, causado por factores presentes en dichos procesos, podría contribuir también al desarrollo de anemia. Teniendo en cuenta que la identificación de factores que pueden afectar la sensibilidad de células eritroides a las diferentes señales recibidas permitiría conocer la interferencia de la inflamación en la eritropoyesis, se planteó como primer objetivo, dilucidar la interrelación entre diferenciación eritroide y apoptosis. Se observó una mayor sensibilidad de la línea eritroleucémica humana K562 a la acción proapoptótica de citoquinas proinflamatorias, como TNF-α e IL-1β, cuando las células se encontraban en etapa de diferenciación eritroide. El estudio de los mecanismos involucrados permitió sugerir, por primera vez, una posible explicación del efecto de TNF-α e IL-1β basada en la disminución de los niveles de la proteína antiapoptótica c-FLIP observada durante la diferenciación con hemina. Más aún, el tratamiento previo con el factor de crecimiento eritropoyetina (Epo) de las células inducidas a diferenciación eritroide las protegió de la acción proapoptótica a la vez que se detectó la modulación positiva de c-FLIP. La Epo contrarrestaría los cambios en las vías de señalización producidos durante el proceso de diferenciación eritroide permitiendo a las células mantener su resistencia a la apoptosis mediada por citoquinas proinflamatorias. Bajo ciertas circunstancias, eritrocitos maduros pueden sufrir autodestrucción prematura presentando alteraciones celulares similares a las de la apoptosis de una célula nucleada, razón por la que se denominó a este proceso eriptosis. Además de citoquinas, durante los procesos inflamatorios es frecuente encontrar incrementados los niveles de compuestos prooxidantes. Por ello, a continuación se enfocó el trabajo hacia la evaluación de un posible efecto directo de estos agentes sobre eritrocitos maduros. Se estudió el desarrollo de signos de eriptosis en los eritrocitos expuestos a citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β e IFN-γ) y a agentes prooxidantes (NaNO2 y H2O2). Se encontró que éstos pero no las citoquinas indujeron traslocación de fosfatidilserina (PS) en la membrana del eritrocito. Para investigar los posibles mecanismos involucrados en la autodestrucción prematura de los eritrocitos, se analizaron cambios morfológicos y bioquímicos en el glóbulo rojo expuesto a dos condiciones: aumento masivo de calcio intracelular y exposición celular a NaNO2 y H2O2. Además de la externalización de PS, los eritrocitos bajo ambos tratamientos mostraron un incremento del nivel intracelular de calcio, ambas características típicas del desarrollo de eriptosis. Sólo en el modelo de estrés oxidativo se observó, además, el incremento de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la disminución de glutation (GSH). La activación de la proteína PI3K parecería ser relevante en la eriptosis inducida por ambos modelos mientras que la activación de la fosfatasa PTP1B estaría favorecida en el modelo de sobrecarga de calcio. Las modificaciones de proteínas de membrana y los cambios en la morfología celular fueron también signos diferenciales entre ambos tratamientos. La Epo fue capaz de disminuir significativamente la inducción de la alteración en el estado redox celular por NaNO2 y H2O2. En cambio, no fue capaz de inhibir la traslocación de PS en el modelo de incremento de calcio. Las diferencias en los mecanismos involucrados en los dos modelos estudiados podrían explicar la acción diferencial de Epo sobre los eritrocitos inducidos a eriptosis por los diferentes agentes. En base a los resultados obtenidos y a otros trabajos realizados previamente en nuestro laboratorio, se decidió, en el siguiente paso, investigar si compuestos de aluminio pueden actuar como factores proeriptóticos. Experiencias in vivo e in vitro permitieron asociar la sobrecarga de aluminio con anemia. En este trabajo, se estudiaron mecanismos de acción del metal, utilizando un modelo de eritrocitos humanos sometidos a tratamiento prolongado in vitro con cloruro de aluminio. La aparición de eritrocitos con morfología anormal sugirió una interacción del metal con la superficie celular, sustentado por el hallazgo de elevada concentración de Al en la membrana celular. Se demostró que el Al induce signos de eriptosis, como externalización de PS, aumento de calcio intracelular y degradación de banda 3. El hallazgo de un incremento significativo de ROS en conjunto con una disminución de la concentración de GSH mostró un estado de estrés oxidativo. Un punto interesante es que la acción prooxidante del aluminio fue contrarrestada por la Epo. El hecho de que este resultado fuera similar a la prevención del desbalance óxido-reducción por la acción del antioxidante N-acetilcisteina (NAC), sugiere un rol antioxidante de la Epo. El efecto antieriptótico de la Epo podría contribuir a enriquecer el conocimiento acerca del rol fisiológico de esta hormona sobre células eritroides. Independientemente de cuál sea su mecanismo antioxidante, el efecto de Epo demostrado en este modelo de exposición a aluminio, así como en el modelo de estrés oxidativo, nos permite sugerir potenciales beneficios del tratamiento con la hormona en pacientes con anemia asociada a patologías con un ambiente redox alterado.

Abstract:
The first part of this study focused on the modulation of factors that would affect the sensitivity of erythroid differentiated cells to proinflammatory citokines, such as TNF-α and IL- 1β. The tumor necrosis factor alpha (TNF-α) affects a wide range of biological activities, such as cell proliferation and apoptosis. Cell life or death responses to this cytokine might depend on cell condition. Therefore, it was interesting to study whether erythroid differentiation may affect erythroid progenitors to apoptosis induced by proinflammatory cytokines. Hemin-differentiated K562 cells showed higher sensitivity to TNF-induced apoptosis than undifferentiated cells. At the same time, hemin-induced erythroid differentiation reduced c- FLIP expression. However, this negative effect was prevented by previous treatment with erythropoietin, which allowed the cell line to maintain c-FLIP levels. The results suggest that erythroid differentiation might deregulate the balance between growth promotion and death signals induced by TNF-α, depending on cell type and environmental conditions. The role of c-FLIP seemed to be critical in the protection of erythroid differentiated cells from apoptosis or in the determination of their sensitivity to TNF-mediated programmed cell death. Epo, which for the first time was found to be involved in the prevention of c-FLIP downregulation, proved to have an antiapoptotic effect against the proinflammatory factor. The identification of signals related to cell life/death switching would have significant implications in the control of proliferative diseases, and would contribute to the understanding of mechanisms underlying the anemia associated to inflammatory processes. Proinflammatory factors may not only affect the erythropoiesis process but also cause direct injury upon mature erythrocytes. Eryptosis is a process by which red blood cells can undergo self-destruction sharing several features with apoptosis. Since premature programmed erythrocyte death may be induced by different agents, in this work mechanisms involved in two eryptotic models (oxidative stress and cell calcium overload) were compared. Phosphatidylserine (PS) translocation and increased calcium content were common signs observed in erythrocytes exposed to sodium nitrite plus hydrogen peroxide or calcium ionophore A23187, while increased reactive oxygen species (ROS) and decreased reduced gluthation (GSH) levels were detected in the oxidative model. Protein kinase activation seemed to be an outstanding feature in eryptosis induced by oxidative stress whereas phosphatase activation was favored in the calcium overload model. Cell morphology and membrane protein alterations were also differential signs between both models. Erythropoietin was able to prevent cell oxidative unbalance, thus blunting PS translocation. However, the hormone favored intracellular calcium influx which could be the reason why it could not completely counteract the induction of eryptosis. Instead, erythropoietin was unable to inhibit PS externalization in the increased calcium model. The different mechanisms involved in the eryptotic models may explain the differential action of erythropoietin upon erythrocytes induced to eryptosis by different agents. Previous works developed in our laboratory suggested that aluminum compounds could be proeryptotic agents. The widespread use of aluminum provides easy exposure of humans to the metal and its accumulation remains a potential problem. In vivo and in vitro assays have associated Al overload with anemia and erythrocyte morphological and biochemical changes. To better understand the mechanisms by which aluminum affects human erythrocytes, these cells were exposed to long-term treatment with the metal using an in vitro model developed in our laboratory that mimic in vivo effects. The appearance of erythrocytes with abnormal shapes suggested metal interaction with cell surface, supported by the fact that high amounts of aluminum were found attached to cell membrane. Long-term incubation of human erythrocytes with Al induced signs of premature erythrocyte death (eryptosis), such as phosphatidylserine externalization, increased intracellular calcium, and band 3 degradation. Signs of oxidative stress, such as significant increase in ROS in parallel with decrease in the amount of GSH, were also observed. Interestingly, Epo protected erythrocytes from the prooxidative action of aluminum. Since this result was similar to that of the antioxidant N-acetylcysteine, it can be suggested an antioxidant ability of Epo. In conclusion, results provide evidence that chronic aluminum exposure may lead to biochemical and morphological alterations similar to those shown in eryptosis induced by oxidant compounds in human erythrocytes. The antieryptotic effect of Epo may contribute to enhance the knowledge of its physiological role on erythroid cells. Irrespective of the mechanism involved in its antioxidant action, this property of Epo shown in this model of aluminum exposure, let us suggest additional benefits of the Epo treatment in patients with anemia associated to altered redox environment.

Di Guilmi, Mariano Nicolás. "Alteraciones en la transmisión sináptica en ratones transgénicos modelo de migraña (S218L) y su modulación por drogas antiepilépticas" (2012-03-02) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Ratones transgénicos (knock-in, KI) con mutaciones del canal de calcio P/Q fueron utilizados como modelos murinos de Migraña Hemipléjica Familiar tipo I. Se estudiaron mediante técnicas de patch-clamp (whole cell) las corrientes de calcio presinápticas (IpCa) en los terminales nerviosos gigantes del caliz de Held y las corrientes postsinápticas en las neuronas que este inerva. En los KI S218L se observo la activación de las IpCa hacia potenciales más hiperpolarizados y una reducción de la amplitud de la corriente de calcio siendo esto ultimo dependiente de la duración de la repolarizacion del potencial de acción. A pesar de la reducción de las IpCa las corrientes postsinápticas evocadas están incrementadas así como la frecuencia pero no la amplitud de las espontaneas indicando la existencia de un ingreso continuo de calcio al terminal presinápticos, posible generador de cambios en la maquinaria de liberación responsable de la ganancia de función observada. La droga antiepiléptica pregabalina estudiada sobre ratones normales mostró ser efectiva en disminuir la liberación evocada a través de la reducción de la amplitud de las IpCa y de la remoción de su inactivación. La mayor tasa de inactivación observada en el KI R192Q fue absolutamente removida por la pregabalina.

Abstract:
Transgenic mice models (knock-in, KI), with the human mutation on the P/Q calcium channels were used as model of Familial Hemiplegic Migraine type-1. Using patchclamp (whole-cell) recordings, it was studied presynaptic calcium currents (IpCa) at the calyx of Held and postsynaptic currents onto principal cells of the MNTB. It was observe a shift of the I-V curve to more negative potentials on KI mice and a reduction of calcium currents (IpCa) depending on the shape of action potentials. Despite the reduction of IpCa, both amplitude of excitatory postsynaptic currents and frequency of miniature events were enhanced (without changes on its amplitude). These data suggest a continuous calcium influx at resting membrane potential which might be responsible to enhance transmitter release and its possible gain of function. The anticonvulsant medication pregabalin was tested on WT mice showing a reduction of postsynaptic currents by reduction of IpCa and removing its inactivation. It was observed that inactivation rate of IpCa in KI R192Q was larger in KI than WT and it was completely recovered after PGB application.

Caceres, Lucila Guadalupe. "Efectos de la radiación X neonatal sobre el hipocampo de rata. Estrategias de neuroprotección" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La radioterapia es un tratamiento utilizado en humanos como herramienta para eliminar células tumorales mediante el uso de radiaciones ionizantes; sin embargo, éstas también puede dañar tejidos sanos debido a la inducción de estrés oxidativo. Dada la alta radiosensibilidad del Sistema Nervioso Central en desarrollo, el objetivo del presente trabajo fue profundizar en el estudio de sus efectos sobre el hipocampo de animales jóvenes expuestos en el período neonatal. Más aún, el esclarecimiento del mecanismo de acción de la radiación ionizante podría permitir proponer intervenciones terapéuticas que prevengan sus efectos, siendo el 17β-estradiol una herramienta ideal por poseer múltiples mecanismos de acción neuroprotectora. Los resultados encontrados sugieren que los cambios observados en la memoria asociativa a P30 se deberían a modificaciones en el hipocampo a nivel molecular e histológico, siendo el sistema GABAérgico uno de los componentes afectados. Asimismo, la expresión de estas alteraciones en el animal joven ocurriría debido a cambios en la PKCβ1 a P15. Por otro lado, el tratamiento con estradiol fue capaz de prevenir la mayoría de los cambios inducidos por la radiación, permitiendo postular que ejercería su acción neuroprotectora tanto a través de un mecanismo antioxidante como de uno mediado por receptor. Por consiguiente, la vulnerabilidad del hipocampo frente a las radiaciones ionizantes podría prevenirse mediante el uso de fármacos que actúen mediante mecanismos semejantes al estradiol.

Abstract:
Radiation therapy is a widely used tool to kill tumor cells in humans through the use of ionizing radiations. Unfortunately, they can also damage healthy tissue by the induction of oxidative stress. Due to the high radiosensitivity of developing Central Nervous System, the aim of the present work was to search more comprehensively about its effects on the hippocampus of young animals exposed to radiation in the neonatal period. Indeed, the elucidation of the action mechanism of radiation would allow proposing therapeutic interventions to prevent its effects, being 17β -estradiol an ideal tool due to its multiple mechanisms of neuroprotection. Results obtained in the present work suggest that the changes observed in the associative memory at P30 could be related to hippocampal changes at the molecular and histological level, being the GABAergic system one of the components affected by the radiation. Furthermore, the expression of these alterations in the youth would occur due to changes in the PKCβ1 at P15. On the other hand, the treatment with estradiol was able to prevent most of the radiation-induced changes, allowing us to postulate that both an antioxidant and a receptor-mediated mechanism might underlie its neuroprotective action. Accordingly, the vulnerability of the hippocampus to ionizing radiation could be prevented by the use of drugs that exert similar neuroprotection mechanisms than 17β-estradiol.

Legisa, Danilo Mario. "Estudio de aislamientos nacionales y desarrollo de una vacuna a subunidad, direccionada a células presentadoras de antígenos, para el Virus de la Lengua Azul" (2014-04-03) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Lengua Azul es una enfermedad que afecta principalmente rumiantes salvajes y doméstico, y representa una importante barrera para el comercio internacional de animales y sus subproductos. El Virus de la Lengua Azul es el causante etiológico de la enfermedad y es transmitido por insectos hematófagos del género Culicoides. El Virus de la Lengua Azul , es el miembro prototipo del género Orbivirus dentro de la familia Reoviridae. El virión está compuesto por una doble capa proteica desnuda que envuelve un genoma de 10 segmentos lineales de ARNdc, los cuales codifican para al menos diez proteínas, 7 proteínas estructurales y al menos 4 no estructurales. La distribución del Virus de la Lengua Azul es global aunque en ciertas zonas la información es escasa. En Sudamérica, evidencia serológica de la presencia del virus fue encontrada todos los países menos Uruguay y Bolivia. Argentina y Brasil son los únicos países donde ha sido aislado el virus. En Argentina han sido obtenidos 5 aislamientos de Virus de la Lengua Azul serotipo4 en ganado bovino. Tres de estos aislamientos fueron logrados entre los años 1999-2001, mientras los dos restantes fueron obtenidos en los años 2009 y 2010 como parte del presente trabajo de tesis. La medida de control más práctica y eficaz es la inmunización profiláctica de los animales susceptibles. Desde principios del siglo XX se han desarrollado vacunas atenuadas e inactivadas eficientes para la Lengua Azul. Sin embargo, las desventajas en cuanto a bioseguridad y efectos adversos impulsan el desarrollo de vacunas a subunidad, no infecciosas como alternativa a las vacunas convencionales. En este trabajo de tesis se abordó un análisis epidemiológico molecular de los aislamientos argentinos del VLA y el desarrollo de una vacuna a subunidad direccionada a células presentadoras de antígeno. El análisis epidemiológico molecular se basó en la obtención y análisis de las secuencias de 5 de los 10 segmentos virales (Segmentos 2, 3, 6, 7 y 10). El análisis de los segmentos 2 y 6 resultó en un cluster de secuencias argentinas dentro del clado del serotipo 4 y también dentro del grupo del nucleotipo A (definido para cada segmento). El análisis de los segmentos 3, 7 y 10 mostró que los aislamientos argentinos agrupan dentro del cluster de aislamientos de topotipo occidental o western, indicando que su origen se remontaría a África/Europa. El análisis filogenético reveló que, además de este origen, las secuencias argentinas representaron un fuerte linaje Sudamericano de evolución independiente. El desarrollo de la vacuna a subunidad se basó en la expresión de la proteína VP2, mayoritaria de la cápside externa e inmunodominante, sola o fusionada a la molécula APCH (Antigen Presenting Cell Homing) capaz de dirigir moléculas a células presentadoras de antígeno, utilizando el sistema de expresión de baculovirus. Los ensayos de inmunogenicidad en cobayos y bovinos utilizando estos dos antígenos, resultaron en altos títulos de anticuerpos neutralizantes similares a los evocados por la vacuna formulada con virus inactivado. Más aún, se obtuvieron títulos comparables para VP2 y dosis 4 veces menores de APCH-VP2 demostrando la capacidad APCH de potenciar la generación de anticuerpos. Como caracterización de la respuesta inmune asociada se analizó el perfil de inmunoglobulinas G y la presencia de células T de memoria. El perfil de IgG en los bovinos inmunizados con APCH-VP2 mostró una mayor proporción de IgG1 en comparación con los grupos vacunados con VP2 sola o con el virus inactivado. Por otro lado, la inmunización con las vacunas experimentales, mostró generación de células T de memoria para VP2 sola. Además, se comprobó la capacidad de las vacunas recombinantes de diferencias animales vacunados de infectados. Esta sección constituye un aporte en el desarrollo de vacunas a subunidad, capaces de generar una respuesta inmune comparable a vacunas inactivadas pero con características emergentes.

Abstract:
Bluetongue disease affects principally wild and domestic ruminants and represents a major barrier to animal trade and their sub products. The etiological agent is the Bluetongue Virus, it is transmitted by hematophagous arthropods from the genus Culicoides. Bluetongue Virus is the prototype member of genus Orbivirus and it belongs to Reoviridae family. The non enveloped virión is composed by two concentric protein layer which contents the viral genome, composed by ten dsRNA segments. This genome codifies for 7 structural proteins and at least, 4 non structural proteins. Bluetongue Virus is worldwide distributed, although there is a lack of information in certain regions. In Southamerica, serologic evidences of Bluetongue Virus were recorded in all countries except Uruguay and Bolivia. Argentina and Brazil are the only two countries where the virus was isolated. In Argentina, five Bluetongue Virus serotype 4 isolates have been obtained from asymptomatic cattle. Three isolates were obtained in years 1999-2001, and two in years 2009 and 2010 as result of this thesis work. Prophylactic immunization of susceptible animals is the most practical and effective measure to prevent Bluetongue disease. From beginning of XX century, attenuated and inactivated vaccines against Bluetongue Virus have been developed, however, biosafety issues and the well known adverse effects lead to the development of subunit vaccines as an alternative to classic ones. In this work, we performed a molecular epidemiology study of Argentinean Bluetongue Virus isolates and we also developed a subunit vaccine delivered to antigen presenting cells. The molecular epidemiology approach was based on the sequence analysis from 5 out of 10 genome segments (Segments 2, 3, 6, 7, and 10). Segments 2 and 6 analysis showed that Argentinean sequences grouped into the serotype 4 cluster and nucleotype A group, and even more, they grouped in a unique Argentinean cluster whit high bootstrap value. Segments 3, 7 and 10 analysis, showed that Argentinean isolates grouped into a western topotype cluster, along with sequences already classified as originated in Africa and/or Europe. Phylogenetic analysis revealed that all Argentinean sequences formed a well supported Southamerican lineage with independent evolutionary history. The subunit vaccine development was based on the baculoviral expression of VP2 protein, the major and immunodominant component of the outer capsid, alone or fussed to a molecule named APCH (antigen presenting cell homing), capable to deliver peptides or molecules to antigen presenting cells. Immunogenicity assays conducted in guinea pigs and cattle showed that both antigens were able to induce high neutralizing antibodies titers similar to those evoked by the inactivated vaccine. Moreover, VP2 antibody titers were comparable to APCH-VP2 titers which were generated using a 4 times lower dose of antigen, demonstrating the ability of APCH molecule to enhance the generation of antibodies. As part of the immune response characterization, immunoglobulin G profile and the presence of memory T cells were analyzed. IgG profile in animals vaccinated whit APCH-VP2 showed a higher proportion of IgG1 in comparison with VP2 and inactivated BTV groups. On the other hand, immunization with both candidate vaccines showed the generation of memory T cells specific to VP2. In addition, the capacity of the recombinant vaccine to differentiate vaccinated animal from infected ones was confirmed. This section represents a contribution in the development of Bluetongue Virus subunit vaccines capable of generating an immune response comparable to inactivated vaccines but with new and advance features.

Saborido, Mariano Diego. "Bases farmacológicas y moleculares de las disquinesias inducidas por L-dopa en un modelo experimental de la enfermedad de Parkinson" (2014-07-15) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enfermedad de Parkinson se caracteriza por una deficiencia de dopamina estriatal debida a la pérdida progresiva de neuronas de la substantia nigra pars compacta. La L-dopa es el antiparkinsoniano más eficaz, aun cuando luego de algunos años de tratamiento la mayoría de los pacientes presentan complicaciones motoras como las disquinesias. Éstas reducen la calidad de vida del paciente e interfieren con el beneficio terapéutico de la Ldopa. Se sabe que la exposición repetida a agonistas dopaminérgicos, la estimulación pulsátil de receptores dopaminérgicos estriatales y una severa degeneración nigroestriatal favorecen la aparición de disquinesias. Existe consenso respecto a que la aparición de disquinesias involucra profundos y persistentes cambios moleculares en el estriado. El objetivo general del presente trabajo fue examinar los mecanismos farmacológicos y moleculares que dan origen a las complicaciones motoras que se presentan durante la terapéutica sustitutiva con L-dopa en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Nuestros resultados avalan la participación de los receptores dopaminérgicos D1 y sugieren la participación de la proteína Fyn en el desarrollo de disquinesias. Aunque no hemos sido capaces de reducir la severidad de las disquinesias mediante la inhibición de la vía mediada por mTOR, no podemos descartar su participación en el desarrollo y consolidación del fenómeno disquinético.

Abstract:
Parkinson's disease is characterized by a deficiency of striatal dopamine due to the progressive loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. L-dopa is the most effective anti-Parkinsonian drug, even though after a few years of treatment, the majority of patients present motor complications such as dyskinesias. They reduce the quality of life of the patients and interfere with the L-dopa therapeutic benefit. It is known that repeated exposure to dopamine agonists, pulsatile stimulation of striatal dopaminergic receptors and a severe striatonigral degeneration favor the emergence of dyskinesias. There is consensus that the occurrence of dyskinesias involves deep and persistent molecular changes in the striatum. The general objective of this work was to examine the pharmacological and molecular mechanisms that give rise to complications that arise during substitutive therapy with L-dopa in an animal model of Parkinson´s disease. Our results support the participation of D1 dopamine receptors and suggest the involvement of the protein Fyn in the development of dyskinesias. Although we have not been able to reduce the severity of dyskinesias by inhibiting the mTOR-mediated pathway, we cannot dismiss its participation in the development and maintenance of the dyskinetic phenomenon.

Venturutti, Leandro. "Rol de los micro-ARN 21 y 16 en la diseminación metastásica y resistencia a terapias dirigidas en el cáncer de mama ErbB-2 positivo" (2016-05-04) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La sobreexpresión/amplificación del receptor con actividad tirosina-quinasa ErbB-2 define un subtipo agresivo de cáncer de mama (CM) con incidencia elevada de metástasis, denominado ErbB-2 positivo. En esta Tesis revelamos un nuevo sentido de la interacción entre el ErbB-2 y Stat3, otro actor clave en CM, la cual subyace la diseminación metastásica. Encontramos que Stat3 no solo induce la expresión del ErbB-2, sino que también lo recluta como coactivador en el promotor del microARN-21, un microARN promotor de metástasis. El ErbB-2 induce además la expresión del microARN-21 actuando como factor de transcripción. El microARN-21, a su vez, inhibe la expresión de PDCD4, un supresor de metástasis. En la clínica, encontramos en tumores ErbB-2 positivos una correlación inversa entre la coexpresión nuclear Stat3/ErbB-2 y la expresión de PDCD4, la expresión del microARN-21 y de PDCD4, y la expresión de PDCD4 y la presencia de metástasis ganglionares. A pesar de que terapias dirigidas al ErbB-2, como el trastuzumab y el lapatinib, han probado ser beneficiosas, las respuestas tienden a ser limitadas en magnitud y duración. Aquí, describimos un mecanismo de acción novedoso para estos agentes. Encontramos que el trastuzumab y el lapatinib, a través del bloqueo de las vías de PI3K/AKT y MAPK, inhiben al oncogén c-Myc, lo cual aumenta los niveles del microARN-16, un potente supresor tumoral. La incapacidad de inducir la expresión del microARN-16 subyace fenómenos de resistencia. Identificamos a CCNJ y FUBP1 como blancos novedosos del microARN-16, responsables de sus efectos antiprolfierativos, y demostramos que los niveles del microARN-16 y FUBP1 predicen la respuesta al trastuzumab en adyuvancia, en pacientes con CM ErbB-2 positivo. Postulamos al microARN-16 como un agente terapéutico innovador para tumores resistentes al trastuzumab y/o lapatinib.

Abstract:
Overexpression/amplification of the receptor tyrosine kinase ErbB-2 accounts for an aggressive breast cancer (BC) subtype (ErbB-2 positive) with increased incidence of metastases. In the present Thesis, we revealed a novel direction of the interaction between ErbB-2 and Stat3 (another key player in BC), underlying BC metastasis. We found that Stat3 not only induces ErbB-2 expression, but it also recruits ErbB-2 as its co-activator at the promoter of microRNA-21, a metastasis-promoting microRNA. ErbB-2 also up-regulates microRNA-21 through its direct role as transcription factor. MicroRNA-21, in turn, downregulates the expression of the metastasis-suppressor protein PDCD4. In the clinic, we found an inverse correlation between ErbB-2/Stat3 nuclear coexpression and PDCD4 expression, microRNA-21 and PDCD4 expression, and PDCD4 expression and nodal metastasis in ErbB-2 positive tumors. Although the ErbB-2-targeted therapies trastuzumab and lapatinib have proven beneficial, responses are usually limited in length and magnitude. Here, we revealed a novel mechanism of action of these agents. We found that that blockade of PI3K/AKT and MAPK by trastuzumab or lapatinib inhibits the oncogene c-Myc, resulting in upregulation of microRNA-16, a potent tumor suppressor. Accordingly, we found that failure to upregulate microRNA-16 underlies resistance. We identified two novel microRNA-16 targets, CCNJ and FUBP1, which mediate microRNA-16 antiproliferative effects, and identified microRNA-16 and FUBP1 as predictive biomarkers of adjuvant trastuzumab response in patients with ErbB-2 positive BC. We propose microRNA-16 as an innovative therapeutic agent for trastuzumab- and lapatinib-resistant tumors.

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