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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Epigenética [ 4 tesis ]

Burgos, Valeria Laura. "Estudio de la expresión de glicanos y glicosiltransferasas en el cerebro de ratas expuestas a paradigmas de aprendizaje" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Dado el carácter dinámico de la maquinaria de glicosilación y su participación en el sistema nervioso, en la presente Tesis estudiamos la expresión de estructuras oligosacáridas y la expresión génica de glicosiltransferasas en el cerebro de ratas luego de la exposición a dos modelos inductores de plasticidad neural: el Enriquecimiento Ambiental y el aprendizaje de Evitación Inhibitoria.. La estimulación ofrecida por el Enriquecimiento Ambiental claramente modificó el perfil génico de algunos componentes de la O-glicosilación tipo mucina. Por otra parte, luego del entrenamiento en Evitación Inhibitoria la expresión génica de varias O-glicosiltransferasas pareció ser regulada de manera diferencial en respuesta al aprendizaje. Además, los perfiles génicos de algunas de estas glicosiltransferasas parecieron estar diferencialmente reguladas dependiendo de qué fase de la formación de la memoria estaba siendo estudiada. Esta tesis doctoral se ha enfocado principalmente en la O-glicosilación del cerebro de rata y se han observado resultados interesantes sobre el perfil de algunos genes de glicosiltransferasas asociados previamente a patologías en humanos, como distrofias musculares congénitas. El entendimiento de los factores que modulan a los glicanos neurales en respuesta a modelos inductores de plasticidad podría aportar una mayor comprensión sobre la fisiología de un organismo, especialmente en casos de deficiencias en la glicosilación que involucran defectos y anormalidad en el cerebro.

Abstract:
Given the highly dynamic character of the glycosylation machinery and its involvement in the nervous system, in the present dissertation we studied the expression of oligosaccharide structures and gene expression of O-glycosyltransferases in the rat brain after exposure to two neural plasticity-inducing models, the Environmental Enrichment model and the Inhibitory Avoidance Task. The stimulation offered by the Enriched Environment clearly modified the gene profile of some components of the mucin-type O-glycosylation, some of which were previously known to be involved in certain pathological conditions of neural plasticity. On the other hand, after training in the Inhibitory Avoidance task the gene expression of several O-glycosyltransferases seemed to be differentially regulated in response to learning. Furthermore, the gene profiles of some of these glycosyltransferases seemed to be differentially regulated depending on which phase of memory formation was being studied (consolidation or reconsolidation). This dissertation has focused mainly on the O-glycosylation in the rat brain and interesting results have been obtained regarding the gene profile of some glycosyltransferases known to be associated to neural pathological conditions in humans, such as congenital muscular disorders. Understanding the regulation of the brain glycosylation pathways in response to plasticity-inducing models could provide mechanistic insights into the physiology of an organism, especially in those cases where glycosylation deficits engage abnormal brain defects.

González, Rodrigo Matías. "Regulación epigenética de la familia de genes Asr en tomate (Solanum lycopersicum)" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo, se estudió la epigenética asociada al estrés por falta de agua en dos genes de tomate (Asr1 y Asr2), que pertenecen a una familia génica involucrada en la tolerancia a distintos estreses abióticos. Se analizó la región codificante del gen Asr1 en hojas y se detectó la presencia de metilación en todos los contextos: CG, CNG y CNN. Al someter las plantas a estrés hídrico, se observó un ligero aumento de la metilación en contexto CG y una marcada disminución en la metilación asimétrica (CNN). También se detectó, en histonas, una marca represiva de la expresión: H3K27me3, la cual disminuyó como consecuencia del estrés impuesto. Concomitantemente, se registró un marcado aumento en el nivel de transcripto de Asr1. También se analizaron las regiones regulatoria y codificante de Asr2 en raíces. En este sistema, se hallaron elevados niveles de metilación en citosinas en todos los contextos sobre la región regulatoria, registrándose una ligera disminución en la metilación asimétrica como consecuencia del estrés impuesto. En cambio, sobre la región codificante sólo se halló metilación CG, la cual no varió como consecuencia del estrés. Sólo se detectó la marca represiva H3K27me3 sobre una región ubicada 800 pb río arriba del gen, permaneciendo la misma invariable al aplicar el estrés. Estos hallazgos fueron concomitantes con una disminución generalizada de la transcripción, manteniéndose casi constantes los niveles de transcripto de Asr2.

Abstract:
In this work, we studied the epigenetics associated with water stress in two tomato genes (Asr1 and Asr2), belonging to a gene family involved in tolerance to various types of abiotic stress. The Asr1 gene coding region in leaves was analyzed. The presence of methylation in all contexts (CG, CNG and CNN) was detected. When subjecting plants to water stress, a slight increase in methylation in CG context and a marked decrease in asymmetric methylation (CNN) were observed. An expressionrepressive histone mark was also detected: H3K27me3, which decreased as a result of the stress imposed. Concomitantly, a marked increase in the level of Asr1 transcript was registered. The regulatory and coding regions of Asr2 in roots were analyzed as well. In this system, high levels of cytosine methylation in all contexts were found on the regulatory region and a slight decrease in asymmetric methylation due to the stress imposed was recorded. By contrast, on the coding region, only stress-independent CG methylation was found. Only the repressive H3K27me3 mark on a region located 800 bp upstream of the gene was registered, remaining unchanged when the same stress was applied. These findings were concomitant with a general decrease in transcription, remaining the Asr2 transcript levels almost constant.

Luzzani, Carlos Daniel. "Estudio de la regulación de la expresión y de la relevancia de la metiltransferasa PRMT8 en células madre pluripotentes" (2013-03-26) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las células madre embrionarias (ESCs) son células derivadas del macizo celular interno (ICM) del blastocisto. Poseen la capacidad de auto-renovarse indefinidamente en cultivo y de dar origen a células de las tres capas germinales, propiedad conocida como pluripotencia. Existen tres factores de transcripción fundamentales para la regulación génica de las células madre pluripotentes, Oct4, SOX2 y Nanog. Estudios de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) han revelado que estos factores ocupan al mismo tiempo las regiones promotoras de diversos genes a lo largo de todo el genoma, sugiriendo que estos factores actúan como el núcleo de una red regulatoria que modula la expresión de genes involucrados en la diferenciación celular. Mientras que in vitro las ESCs pueden ser mantenidas indefinidamente en estado indiferenciado, in vivo, conforme progresa el desarrollo, las células del ICM abandonan su estado pluripotente para seguir diversos programas de diferenciación. El inicio de dichos programas depende, en gran medida, de la regulación de la expresión de genes tejidoespecíficos. Sin embargo, entender cuáles son estos genes y cómo son regulados no es suficiente para explicar el comienzo del proceso de diferenciación celular. Existen además, cambios en la organización de la cromatina a nivel global y de loci específicos, registrándose múltiples evidencias que relacionan la estructura de la cromatina de los genes marcadores de estadio indiferenciado con el mantenimiento de la pluripotencia. Nuestra hipótesis postula que existiría una relación bidireccional entre los niveles y la actividad de proteínas que remodelan la cromatina y de los factores de transcripción críticos en el mantenimiento de las propiedades de las células pluripotentes. El objetivo general de este trabajo es contribuir al esclarecimiento de la regulación epigenética que ocurre en las ESCs durante la diferenciación y el estado epigenético de éstas cuando son mantenidas en estado indiferenciado. Para ello, nos propusimos, en primer lugar analizar el patrón de expresión de proteínas modificadoras de la cromatina en ESCs indiferenciadas y en distintos estadios de diferenciación. Luego, una vez detectados genes de interés,evaluar el efecto de la modificación de sus niveles de expresión sobre el mantenimiento del estado indiferenciado y en la diferenciación de las ESCs. Por último, nos propusimos estudiar si los factores de transcripción relevantes en la preservación de la pluripotencia regulan la expresión los genes en estudio. Para nuestro primer objetivo, analizamos la expresión de enzimas relacionadas con el remodelado de la cromatina mediante RT-qPCR en ESCs indiferenciadas y las comparamos con la de células terminalmente diferenciadas. Posteriormente, diferenciamos ESCs mediante un protocolo no dirigido y analizamos la expresión de estos genes lo largo del proceso de diferenciación. Esta búsqueda arrojó una serie de genes candidato que podrían tener un rol en el mantenimiento de las propiedades básicas de las ESCs. Posteriormente, elegimos uno de estos genes, la metiltransferasa Prmt8, para continuar nuestros estudios. Los otros genes que surgieron de este análisis forman parte de otros proyectos de tesis. Utilizando tanto un protocolo de diferenciación no dirigido como uno dirigido hacia linaje neural, comprobamos que el gen de Prmt8 se regula negativamente durante el proceso de diferenciación. Por otra parte, construimos una línea estable de mESCs que contiene en su genoma un shRNA inducible contra Prmt8. Probamos que al inducir este shRNA los niveles de mensajero de esta enzima disminuyen, y que esto en un principio no afecta la capacidad de autorenovación de las células. Mediante análisis de inmunofluorescencia estudiamos la presencia y localización de marcadores del estado indiferenciado. No encontramos diferencias sustanciales en los marcadores analizados al comparar las células cultivadas en presencia del inductor del shRNA con las células control. Por otro lado, diferenciamos la línea que sub-expresa Prmt8 y encontramos que estas células parecen diferenciarse de forma diferente al control. Por último, analizamos si la expresión forzada de los factores de transcripción de pluripotencia modula la expresión de Prmt8 en un sistema heterólogo. En conjunto los datos sugieren que Prmt8 es regulado positivamente por los factores de transcripción de pluripotencia, y modulado durante la diferenciación, hecho que podría ser clave en la determinación del tipo celular de destino. En el futuro planeamos realizar estudios de inmunoprecipitación de la cromatina para estudiar la interacción de estos factores con el promotor de Prmt8. Por otra parte, nos interesa estudiar con mayor profundidad si la presencia de esta metiltransferasa es vital para la diferenciación hacia algún tipo celular en particular. Creemos que los conocimientos generados en el campo de la epigenética de células madre pueden contribuir a plantear estrategias que ayuden, en un futuro, a diseñar nuevas terapias celulares.

Abstract:
Embryonic stem cells (ESCs) are cells derived from the inner cell mass (ICM) of the blastocyst. They have the ability to self-renew indefinitely in culture and to give rise to cells of all three germ layers, property known as pluripotency. There are three basic transcription factors that regulate gene pluripotent stem cells, Oct4, Sox2 and Nanog. Studies using chromatin immunoprecipitation (ChIP) have shown that these factors are simultaneously recruited to promoter regions of various genes throughout the genome, suggesting that these factors act as a core regulatory network that modulates the expression of genes involved in cell differentiation. While ESCs can be maintained in vitro in the undifferentiated state indefinitely, in vivo, as development progresses, ICM cells leave their pluripotent state to follow various programs of differentiation. The beginning of such programs depends largely on the regulation of expression of tissue-specific genes. However, understanding who these genes are and how they are regulated is not enough to explain the beginning of the process of cell differentiation. There also changes in global chromatin organization and in specific loci, registering evidence that link the chromatin structure of marker genes of the undifferentiated stage with the maintenance of pluripotency. Our hypothesis is that there is a bidirectional connection between the levels and the activity of chromatin remodeling proteins and transcription factors that are critical for the maintenance of pluripotent cell properties. The overall objective of this work is to contribute to the elucidation of epigenetic regulation that occurs in ESCs during differentiation and the epigenetic state of these when maintained in an undifferentiated state. For this purpose, we sought, first to analyze the expression pattern of chromatin modifying proteins in undifferentiated ESCs and at different stages of differentiation. Then, once detected genes of interest, we will assess the effect of changing their expression levels on the maintenance of the undifferentiated state and in the differentiation of ESCs. Finally, we decided to study whether the relevant pluripotency core transcription factors regulate the expression of the studied genes. For our first objective, we analyzed the expression of the enzymes involved in chromatin remodeling by RT-qPCR in undifferentiated ESCs and compared it with that of terminally differentiated cells. Subsequently, using the hanging drop differentiation protocol we analyzed the expression of these genes during the differentiation process. This search yielded a number of candidate genes that may play a role in maintaining the basic properties of ESCs. Then, we chose one of these genes, the methyltransferase Prmt8 to continue our studies. The other genes that emerged from this analysis are part of other thesis projects. Utilizing both an undirected differentiation protocol as well as one directed towards neural lineage, we found that the Prmt8 gene is negatively regulated during the differentiation process. Furthermore, we constructed a mESCs stable line containing in its genome an inducible shRNA against Prmt8. We prove that this shRNA inducing messenger levels of this enzyme decreases, and this does not affect the ability of self-renewing cells. By immunofluorescence analysis we studied the presence and location of the undifferentiated state markers. No substantial differences were found when comparing the analyzed markers cells cultured in the presence of inducer of control cells shRNA. Furthermore, differentiate the sub-express line Prmt8 and found that these cells appear to differ from the control differently. Finally, we examined whether forced expression of transcription factors modulates expression of pluripotency Prmt8 in a heterologous system. Taken together these data suggest that Prmt8 is positively regulated by the transcription factors of pluripotency, and modulated during differentiation, which could play a key role in determining the target cell type. In the future we plan to study the interaction of these factors with the promoter Prmt8. Moreover, we want to explore further whether the presence of this methyltransferase is vital for differentiation into a particular cell type. We believe that the knowledge generated in the field of stem cell epigenetics can help create strategies that help in the future, to design new cell therapies.

Baccarini, Leticia Cecilia. "Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae" (2014-03-20) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La regulación de la expresión génica mediada por proteínas quinasas es esencial para la correcta adaptación celular frente a un estímulo extracelular. En S. cerevisiae, la PKA está formada por tres subunidades catalíticas: Tpk1, Tpk2 y Tpk3 y una subunidad regulatoria: Bcy1. Existen antecedentes que indican la asociación de Tpk1 y Tpk2 a la cromatina durante el crecimiento en glucosa, glicerol y estrés oxidativo (Pokholok et al, 2006). El rol de la vía cAMP/PKA sobre la expresión génica en glucosa ha sido ampliamente estudiado (Livas et al, 2011). Por otro lado, se ha descripto, que la activación de la PKA limita la expresión de genes de respuesta a estrés (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). Durante el desarrollo de esta tesis analizamos la unión de Bcy1, Tpk1 y Tpk2 a diferentes regiones génicas en respuesta a estrés osmótico y oxidativo. Describimos que tanto las subunidades catalíticas como la subunidad regulatoria de la PKA se encuentran asociadas tanto a regiones transcriptas como a promotores de los genes blancos de manera estrés-dependiente. Además analizamos el requerimiento de la actividad quinasa y el papel de Bcy1 en la asociación de las Tpks a la cromatina. Versiones inactivas de Tpk1 y Tpk2 no se asociaron a la cromatina. La deleción de Bcy1 promueve una mayor asociación de Tpk1, mientras que anuló la asociación de Tpk2. Luego analizamos el posible rol de las Tpk en el remodelado de la cromatina en respuesta a estrés a través del análisis de la cinética de unión de factores remodeladores de la cromatina a las regiones donde encontramos asociadas a Tpk1 y Tpk2. Observamos unión transitoria a la cromatina de Arp8, Rsc1 y Snf2 seguido temporalmente por la asociación de las Tpk. Observamos también, la ocupación concomitante de Tpk2 y el factor de transcripción de unión al DNA Rap1. En conjunto los datos existentes y los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la PKA podría participar en la expresión génica mediante fosforilación in situ de los reguladores transcripcionales o de la cromatina. La distribución núcleo-citoplasmática permite regular la actividad diferencial de muchas proteínas quinasas. Hemos analizado la localización subcelular de las subunidades de PKA y su mecanismo de transporte durante estrés. Hemos observado que Tpk1-GFP y Tpk3-GFP acumulan en el núcleo post-estrés oxidativo y osmótico, sin embargo Tpk2- GFP y Bcy1-GFP no cambian su acumulación nuclear. El análisis cinético de la acumulación nuclear de Tpk1 mostró mayor velocidad en respuesta a estrés osmótico versus oxidativo. Hemos determinado que la acumulación nuclear de Tpk1, Tpk2, Tpk3 y Bcy1 es un mecanismo de transporte activo. Sorprendentemente, cada una de las subunidades de PKA es importada al núcleo por diferentes carioferinas. Por otra parte, las cepas defectivas en carioferinas las cuales impiden la acumulación nuclear específicamente de Tpk1 o Tpk2 no mostraron asociación a la cromatina las Tpks, lo que sugiere el requerimiento de acumulación nuclear de las subunidades catalíticas para la asociación a sus genes blancos.

Abstract:
Regulation of gene expression by intracellular stimulus-activated protein kinases is essential for cell adaptation to environmental changes. There are three PKA catalytic subunits in S. cerevisiae: Tpk1, Tpk2 and Tpk3 and one regulatory subunit: Bcy1. Previous data indicates that Tpk1 and Tpk2 were found associated to the chromatin during growth on glucose, glycerol and oxidative stress (Pokholok et al, 2006). Using ChIP-real time assay we analyzed the Bcy1, Tpk1 and Tpk2 association to 5 genes regions in response to osmotic and oxidative stresses. We had demonstrated that both catalytic and regulatory subunits of PKA were associated to transcribed regions and promoters of target genes in a stress dependent manner. Furthermore we analyze the requirement of kinase activity and the role of Bcy1 protein on Tpk chromatin association. Inactive versions of Tpk1 and Tpk2 do not associate to chromatin. Deletion of BCY1 promotes higher Tpk1 association, whereas it abolished Tpk2 association. We then analyze the possible role of Tpk on chromatin remodeling in response to stress conditions. We analyze the kinetics of binding chromatin remodelers in the regions bound by Tpk1 and Tpk2 in response to stress. During stress stimulus there is a transient binding to chromatin of Arp8, Rsc1 and Snf2 - chromatin remodelers followed temporarily by Tpk association. We also observe cooccupancy of Tpk2 and DNA-binding transcription factor Rap1. The role of cAMP / PKA on gene expression in glucose has been extensively studied (Livas et al, 2011). However PKA activation limits the expression of stress responsive genes (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). These results suggest that PKA could participate in gene expression by in situ phosphorylation of transcriptional or chromatin regulators. Actually it is known that a single protein kinase distributed dynamically between cytoplasm and nucleus, can regulate target genes expression by both nuclear and cytoplasmic signaling mechanisms. Thus, the nucleus-cytoplasmic kinases transport would be important to regulate differential activity in both compartments. Here we analyze stress subcellular localization of PKA subunits and their transport mechanism, using fluorescence microscopy. We observed that Tpk1 and Tpk3 accumulate in the nucleus post-oxidative and osmotic stress however Tpk2 and Bcy1 not change their nucleus-cytoplasmic distribution, staying preferentially nuclear. Our results over Tpk1 stress re-localization kinetics suggest that under osmotic stress is necessary its faster nuclear accumulation. We determined that Tpk1, Tpk2, Tpk3 and Bcy1 nuclear accumulation is ATP dependent suggesting an active transport mechanism. Surprisingly, we found that each PKA subunits is transported into the nucleus by different karyopherins. Moreover, karyopherin mutant strains which prevent nuclear accumulation of Tpk1 or Tpk2 prevented its association with chromatin, suggesting that nuclear accumulation of catalytic subunits to association to their targets genes is required.

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