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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Agrobiotecnología [ 39 tesis ]

Zulpa de Caire, Gloria. "Acción de productos algales sobre plantas de importancia agrícola" (1981) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Hagelin, Karin. "Estudios estructurales y cinéticos de variantes de la fructosa-1,6- bisfosfatasa de los cloroplastos de trigo generadas en Escherichia coli" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Fructosa-1,6-bisfosfatasa de los cloroplastos (CFBPasa) de las plantas superiores es un homotetrámero de peso molecular c.a 160000 que cataliza la siguiente reacción: fructosa 1,6-bisfosfato + H2O----> fructosa 6-fosfato + Pi Mg2+ (o Mn2+) La actividad CFBPasa es modulada por la luz, tal como ocurre con otras enzimas regulatorias del cloroplasto. La actividad de la enzima aumenta luego de la transición oscuridad-luz debido a que ocurre (a) un aumento del pH y de la concentración de Mg2+ en el estroma del cloroplasto, (b) la modificación de otros metabolitos y iones del cloroplasto y (c) la reducción de grupos -S-S- de la enzima. La influencia de la luz se debe al efecto del Sistema de Transporte de Electrones mediado por el Sistema Ferredoxina-Tiorredoxina. In vitro, la actividad de la CFBPasa es modulada por componentes tanto fisiológicos (tiorredoxina) como no fisiológicos (cosolventes, aniones caotrópicos, alta presión). Los cambios conformacionales inducidos por estos moduladores son los responsables del aumento de su actividad específica. A fin de analizar las características cinéticas y estructurales de la enzima, el gen de la CFBPasa de los cloroplastos de trigo fue subclonado en el plásmido pGEX-1. La expresión del gen de la proteína de fusión conteniendo a la Glutation-S-transferasa en su extremo N-terminal y a la CFBPasa de trigo en el C-terminal produjo los cuerpos de inclusión. En consecuencia, la CFBPasa particionó en la fracción insoluble del lisado bacteriano. Con esta suspensión fue analizado el proceso de recuperación de las propiedades funcionales de la CFBPasa mediante técnicas de desnaturalización y resolubilización de proteínas. Además se estudió el efecto de moduladores -fisiológicos y no fisiológicos- y de anticuerpos sobre la reconstitución de las actividades CFBPasa como Glutation-S-transferasa en la proteína quimérica. En contraste con las CFBPasas homotetraméricas obtenidas de otras fuentes, la capacidad catalítica residía en un dímero. A fin de caracterizar a la enzima de cloroplastos y comparar su comportamiento con el de la CFBPasa contenida en la proteína de fusión, la secuencia nucleotídica que codifica para la CFBPasa de trigo fue clonada y expresada en otro vector: el plásmido pET-22. Este plásmido condujo a la obtención de la enzima libre del fragmento GST, en la fracción soluble del lidado bacteriano. A partir del mismo, la CFBPasa fue purificada a homogeneidad y caracterizada estructural y cinéticamente. Al igual que las contraparte de otros orígenes, la CFBPasa de trigo era un homotetrámero activable por reductores (ditiotreitol) y moduladores fisiológicos (tiorredoxina) y no-fisiológicos (perturbantes proteicos). De particular interés en estos estudios fue que la ausencia de 20 aminoácidos de la región N-terminal de la CFBPasa no afectara la capacidad catalítica de la enzima. De manera que una región altamente variable en las FBPasas, cloroplásticas y no cloroplásticas, no tendría participación en el mecanismo catalítico.

Abstract:
In higher plants chloroplasts, a homotetrameric enzyme (MW 160000), fructose-1,6-bisphosphatase (CFBPase) catalyzes the cleavage of fructose 1,6-bisphosphate to fructose 6-phosphate and inorganic phosphate. Like other regulatory steps in this organelle, the striking feature of CFBPase is the modulation of activity by the concerted action of stromal metabolites and the light-stimulated Ferredoxin-Tiorredoxin System. In vitro, the enzyme activity is activated by physiological (thioredoxin) and non-physiological (cosolvents, caotropic anions and high preassure) modulators. Hence the modification of intramolecular non-covalent interaction contribute to enhance the reductive activation of CFBPase. In order to determine the kinetic and structural characteristics of the enzyme, the cDNA encoding wheat CFBPase was cloned in the plasmid pGEX-1. The expressed polipeptide comprised the chloroplast enzyme bound to the C-terminus of the Glutation-S-transferase was purified by affinity chromatography. Given that most of this novel protein accumulated in the particulate fraction of the lysate in the form of Inclusion Bodies, the recovery of functionality was essayed. After the insoluble material was resuspended under different conditions, the effect of physiological and non-physiological compounds as well as antibodies were analized on the recovery of CFBPase and Glutation-S-transferase catalytic activity. At variance with homotetrameric CFBPases from other sources, the catalytic capacity of the chimeric enzyme resided in a dimer. In order to evaluate the alterations that the Glutation-S-transferase moiety introduced on the enzyme activity and the formation of Inclusion Bodies, the cDNA that encodes the CFBPase was inserted in the plasmid pET-22. The homotetrameric, soluble and active enzyme was subsequently characterized. Like counterparts from other sources, wheat CFBPase is activable by reductants (dithiothreitol) and physiological (thioredoxin) and non-physiological (protein perturbants) modulators. Interestingly, the absence of 20 aminoacid residues in the N-terminal region does not influence the catalytic activity.

Marconi, Patricia Laura. "Estudio de la fisiología y metabolismo en plantas de Solanum Tuberosum obtenidas por variación somaclonal" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La presente Tesis se basa en la caracterización fisiológica, bioquímica y genómica de plantas de papa (Solanum tuberosum spp. tuberosum). Las mismas fueron obtenidas por cultivo in vitro luego de aplicar un mecanismo de selección recurrente con ClNa. A partir de los callos tolerantes a 150 mM de cloruro de sodio agregado al medio de cultivo se regeneraron plantas por embriogénesis somática denominadas clon 150 (Ochatt et al, 1998). El crecimiento, la distribución de asimilados y de los iones sodio y potasio fueron diferentes entre ambos clones. El clon 150 fue más tolerante a elevadas concentraciones externas de ClNa que el clon T. Los medios de cultivo con elevadas concentraciones de ClNa provocaron un estrés oxidativo. Las plantas del clon 150 mostraron una rápida y eficiente respuesta antioxidante a diferencia del clon T. Los análisis comparativos entre ambos clones a nivel de callos mostraron un patrón parecido al de los de planta entera, a excepción de la respuesta antioxidante. Además, se observó una correlación positiva para la acumulación de Na+ y K+ entre ambos niveles de organización. Los patrones de isoenzimas y RAPD,sumados a las diferencias anatómicas y fisiológicas descriptas, sugieren que el clon 150 difiere genéticamente del cultivar Kennebec. Estas diferencias son particularmente importantes para el crecimiento y la respuesta fisiológica de ambos genotipos cuando son cultivados en condiciones de estrés salino.

Abstract:
This Thesis attempt to made a physiological, biochemical and genomical characterization of potatoes plants (Solanum tuberosum spp. tuberosum) that were obtained by in vitro culture through recurrent selection. Cell line originated from Kennebec cultivar showed to be able to growth on a medium with 150 mM NaCI. Plants obtained by somatic embryogenesis from this cell line were named as 150 clone (Ochatt et al, 1998). Plant growth, assimilate and sodium and potassium distributions differed between the 150 clone and the control Kennebec cultivar. The 150 clone was also salt-tolerant at relatively high NaCl concentrations. Oxidative stress was observed when plants of both clones grown on saline medium. Plants of clone 150 showed a rapid and efficient response to oxidative stress, a pattern that was not observed for the Kennebec clone. Comparative analysis between clones at the callus level shown a similar pattern than that observed for whole plants, although the oxidative defense was not detected. Likewise, a positive correlation was obtained for the accumulation of Na+ and K+ between both organization levels. The pattern here describe for isozymes and RAPD's analyses, in addition to the anatomical and physiological differences above outlined, strongly suggest that the clone 150 differs genetically from the control Kennebec cultivar. These differences are likely to be especially relevant for the growth and the whole physiological response of both genotypes under salt stress conditions.

Dus Santos, María José. "Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas: su utilización como inmunógenos experimentales" (2001) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El uso de plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenos relevantes ha sido ampliamente evaluado dada la posibilidad de utilizar plantas modificadas genéticamente para la producción de vacunas. Las vacunas a base de plantas serían más baratas y más fáciles de elaborar en grandes cantidades. Estas vacunas se podrían producir en países en desarrollo sin necesidad de instalaciones sofisticadas y costosas como las que se necesitan en la actualidad. Por otra parte, estas vacunas eliminarlanel riesgo de virus contaminantes que existe en las vacunas producidas en líneas celulares de mamíferos ya que los posibles vian de plantas contaminantes no constituyen un peligro potencial ni para el hombre ni para los animales. Adicionalmente, las plantas transgénicas que expresen antígenos en sus tejidos comestibles podrían ser usadas como sistemas de producciónde vacunas de administración oral. Hasta el momento, la mayoría de los antígenos expresados consisten en péptidos, proteínas únicas ó estructuras muy simples. Sin embargo, la producción de antígenos vacunales en sistemas heterólogos requiere, en muchos casos. ía expresión de estructuras antigénicas complejas. EIVirus de la Fiebre Aftosa (VFA)produce una de las enfermedades más temidas del ganado debido a su amplia distribucióngeográfica y por ser altamente contagiosa. La vacuna utilizada actualmente es polivalente y a virus inactivado. El progreso en la producción de vacunas antiaftosas está dirigido hacia el logro de vacunas de elaboración más fácily económica y que eviten la manipulación de grandes cantidades de virus. Una alternativa a las vacunas convencionales es la preparación de cápsides vacías expresando y procesando la poliproteína precursora en un sistema de expresión heterólogo. Se han obtenido cápsides vacías confonnacionalmente correctas de los serotipos A, 0 y C del VFA utilizando sistemas de expresion en E. CoIi, baculovirus o virus vaccinia. Los resultados obtenidos hasta ahora al expresar cápsides vacías del VFA en sistemas heterólogos, con relación a Ia conservación de epitopes protectivos, las convierten en antígenos candidatos para la formulaciónde vacunas. Sin embargo, aún no se ha logrado un método de expresión masiva de un inmunógeno eficaz como para ser utilizado a campo, ya que los sistemas desarrollados hasta ahora resultan costosos y poco aplicables a nivel industrial. Como primer objetivo de este trabajo de tesis se propuso producir plantas de alfalfa transgénicas conteniendo el gen que codifica para la poliproteína P1 precursora de las proteínas estructurales del VFA. Las construcciones utilizadas involucran únicamente a P1 ó a P1 junto con la proteasa SC. La presencia del gen foráneo se detectó, en las plantas transgénicas, por PCR y su actividad transcripcional específica por RT-PCR y Northern blot. Fue posible visualizar por microscopía electrónica estructuras que por su tamaño y morfología podrían corresponder a cápsides vacías del VFA. La inmunogenicidad de los productos expresados fue evaluada en el modelo murino. Ratones adultos inmunizados intraperitonealmente desarrollaron una respuesta de anticuerpos detectada por su reactividad. en ELISA, frente a un péptido sintetico que representa la zona más inmunogénica de VP1 y partículas virales completas; y, en Western blot, frente a las proteínas estructurales del virus nativo. Además, estos animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes y resultaron completamente protegidos frente al desafío con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la factibilidad de expresar antígenos altamente complejos en plantas transgénicas y su utilizacióncomo efectivos inmunógenos experimentales. Los resultados obtenidos por nuestro y otros grupos de investigación demuestran la factibilidad de la utilización de plantas transgénicas como fuente de producción de antígenos vacunales. Sin embargo, uno de los principales problemas que posee este sistema de expresión es que los niveles de proteína expresada en las plantas transgénicas son relativamente escasos como para extrapolar su uso a una vacuna de aplicabilidad real. De modo que, el desarrollo de estrategias que generen una mayor concentración de la proteína recombinante es sumamente importante, especialmente cuando se desea utilizar los extractos de planta sin ningún proceso de enriquecimiento y/o purificación posterior. Dado que la inserción del transgen en el genoma vegetal es al azar, es altamente probable que los niveles de su expresión varíen entre los individuos producidos. Una alternativa posible, entonces, consiste en poder identificar aquellos individuos que presentan niveles excepcionalmente altos de la proteina foránea. Sin embargo, la identificación de aquellas plantas que expresen cantidades significativas de antígeno por métodos inmunológicos es un proceso lento y labioroso. Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, y como segunda parte de este trabajo de tesis, hemos desarrollado una metodologia que nos permite evaluar un gran número de individuos y seleccionar de un modo fácil y rápido aquéllos que presentan mayores niveles de expresión de la proteina recombinante. Esta metodologia se basa en la expresión de un gen de interés fusionado a un gen reportero, codificante para la enzima B-Glucuronidasa (B-GUS), cuya presencia puede ser detectada cuantitativamente por colorimetrla. A fin de evaluar el sistema de selección propuesto, utilizamos como antígeno un péptido que comprende los residuos 135 a 160 de la proteina VP1 del VFA para generar la proteina de fusión con la enzima B-GUS.Las plantas transgénicas obtenidas fueron primeramente evaluadas por su actividad enzimática de B-GUS. Fue posible detectar por Western blot la proteina de fusión en aquellas plantas que presentaron mayores niveles de B-GUS. Las plantas seleccionadas expresaron 0.5-1 pglmg de proteina soluble total. El péptido p135-160 expresado como proteina de fusión conservó sus caracteristicas inmunogénicas ya que ratones inmunizados parenteralmente con una vacuna elaborada con extracto foliar desarrollaron una respuesta de anticuerpos especificos detectada por su reactividad en ELISAfrente a p135-160, particulas virales completas y en Western blot frente a VP1. Además, se detectaron anticuerpos neutralizantes que resultaron protectores frente al desafio con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la posibilidad de utilizaruna metodologia simple para detectar las plantas que expresan altos niveles del péptido recombinante, el cual conserva sus propiedades antigénicas e inmunogénicas al ser expresado como proteina de fusión.

Abstract:
The use of transgenic plants as a system for expressing recombinant antigens has already been widely evaluated and constitutes a feasible methodology for vaccine production. Plant based vaccines would be less expensive and easier to be produced in large scale. These vaccines could be produced in undeveloped countries without requiring sophisticated facilities, as they are currently needed. On the other hand, the use of these vaccines would eliminate the risk of contaminating viruses present in mammalian cellular lines since the plant contaminating viruses do not constitute an actual risk for animals or humans. Additionally,edible transgenic plants expressing antigens in their tissues could be used as oral vaccines. Up to now, most antigens expressed in plants are peptides, unique proteins or very simple structures. Nevertheless, production of vaccine antigens in heterologous systems often require the expression of complex antigenic structures. Foot and mouth disease virus is the causal agent of a worldwide distributed highly contagious disease of cattle. The currently used vaccine is based in the utilization of polyvalent inactivated virus. In general, progress in the process of FMDV vaccine production are pointed toward the development of simpler and cheaper protocols involving the use of lower amount of virulent viruses. An alternative to the conventional FMDV vaccines are those containing recombinant virus empty capsids after the expression of the precursor polyprotein.In the past, it has been possible to obtain empty capsids of serotypes 0, A and C using as expression systems E. coli, baculovirus and vaccinia virus. Although the products resulted immunogenically efficient, the methodologies for producing them are not suitable to be used at the industrial level. The first objective of this thesis was the production of transgenic plants of alfalfa containing the gene encoding for the polyprotein P1, which is the precursor of all structural FMDV proteins. The transgenic constructs used contained either just P1 nor P1 along with the 3C gene. The presence of the foreign gene in the recombinant plants was detected by PCR and their transcriptional activity analyzed by RT-PCR and Northen blot. Additionally. it was possible to demonstrate, by electron microscopy, the presence of structures with a size and shape resembling those of the FMDV empty capsides. The immunogenicity of the obtained products was evaluated in mice. Intraperitoneally immunized adult mice presented a FMDVantibody response detected by its activity,in ELlSA, against a synthetic peptide representing the major immunogenic area of VP1, and against complete virus particles, and in Western blot, against all the FMDV structural proteins. Additionally, these animals developed a significant neutralizing antibody response and protection when experimentally challenged with the virulent virus. These results demonstrated the feasibility of expressing highly complex structures in transgenic plants and its use as effective experimental immunogens. As stated earlier, results obtained by us and other research groups demonstrated the potential feasibility of using transgenic plants as a source of antigen for vaccine production. Nevertheless, the main problem presented by this approach resides in the relatively low concentration of the recombinant protein in the plant tissues, which hampers its possible utilization at the industrial scale. Thus, the development of strategies which allow the production of transgenic plants expressing high levels of recombinant protein would substantially modify the expectations on the utilization of this system in the future, specially in those cases where no further steps toward the enrichment or purification of the recombinant product will be needed. Due to the fact that the insertion of the transgene in the plant genome is a random process, it is expected the development of individuals presenting very different expression levels of the recombinant protein. An interesting approach could be the identification of those individuals presenting exceptionally high levels of the foreign protein. Nevertheless, the identification of those individuals,using immunological approaches, is usually a laborious and slow process. Focusing in this particular problem, the second part of this thesis deals with the development of a methodology that allows us to evaluate a significant number of individuals and select, in an easy and quick way, those presenting the highest levels of expression of the foreign protein. The methodology is based in the expression of the gene of interest as a fusion protein along with a reporter gene which encodes for the enzyme ß-Glucuronidase (ß-Gus), which could be quantitatively detect by a oolorimetric test. In order to evaluate this methodology, we selected as antigen a peptide which represent the amino acid residues at position 135 to 160 of the structural FMDV protein VP1. This peptide was expressed as a fusion protein along with ß-Gus. The obtained transgenic plants were first evaluated based in their ß-Gus activity. Among those presenting the highest enzymatic activity it was possible to detect, by Western blot, the presence of the FMDV epitope. The selected plants expressed a concentration of the recombinant protein between 0.5 to 1 mg/g of the total soluble protein extracted for the plant tissue. The peptide 135-160 appears as conserving its native immunogenic characteristic since adult mice parenterally immunized with a vaccine prepared with the foliar extracts developed a specific FMDV antibody response detected in ELISA, against the p135-160 synthetic peptide. and complete virus particles, and against native VP1 in Western blot. Additionally,the sera of these animals showed significant neutralizing antibodies titers and the mice resulted protected against the experimental challenge with infectious virus. These results demonstrate the feasibility of using this simple methodology to detect transgenic plants expressing high levels of recombinant peptide, which completely conserves its antigenic and immunogenic properties when expressed as a fusion protein.

Vicario, Ana Laura. "Estudio comparativo de la diversidad genética de germoplasma comercial de soja (Glycine max (L.) Merr.) y variedades tradicionales" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La soja (Glycine max (L) Merr.) es uno de los cultivos más importantes para los cuales la variabilidad genética es particularmente limitada debido a que es exótico en los principales países productores (USA, Brasil y Argentina). Los objetivos propuestos dentro del marco de esta tesis fueron la caracterización y cuantificación de la variabilidad genética del germoplasma de soja de uno de sus sitios de origen (China) para su comparación con el argentino y el boliviano mediante el uso de marcadores moleculares y, estudiar la posibilidad de utilizar a los SSR en el registro de variedades de soja en Argentina (y en general), específicamente mediante su adaptación al análisis DHE. Se utilizaron más de 120 genotipos que se analizaron con hasta 33 microsatélites. Como resultado se observó que la diversidad de las variedades comerciales de soja es menor que en el caso de variedades tradicionales. Las variedades chinas mostraron mayor número de alelos por locus, mayores valores de similitud e índices de diversidad genética. La mayoría de las variedades argentinas se agruparon separadas de las chinas, sin embargo algunas se relacionaron con estas últimas mostrando que hubo introgresiones de germoplasma chino en el argentino. Se analizaron 10 caracteres morfológicos para las variedades chinas a fin de compararlos con los datos de microsatélites, evidenciándose que cada tipo de marcador explica las relaciones entre las variedades de diferente manera. Ninguno de ellos mostró correlación con los requerimientos fotoperiódicos de las variedades chinas. Los análisis de homogeneidad y estabilidad muestran que es necesario establecer el número mínimo de marcadores a estudiar y cuáles serán éstos antes de aplicarlos en estudios de DHE, ya que las variaciones de los tipos alélicos de los SSR en el tiempo y el carácter selectivamente neutro de estos marcadores pueden modificar los umbrales de diferenciabilidad entre las variedades.

Abstract:
Soybean (Gycine max (L) Merr.) is one of the world most important crops for which the genetic variability is particularly limited, because it is exotic for the most important producing countries (USA, Brazil and Argentina). The principal aims of this work were to characterize and quantify the genetic variability of soybean germplasm form China (center of origin), Argentina and Bolivia using microsatellites markers and to test the possibility of using this kind of markers for DUS testing purposes. More than 120 genotypes were analyzed with up to 33 microsatellites. Commercial soybean varieties showed lower variability than traditional ones. Traditional soybean varieties showed larger allele number per locus, similarity index and diversity values. Most of Argentine varieties clustered separately form Chinese ones, but some mixes were found showing that there were Chinese introgressions into Argentine germplasm. Ten morphological traits were analyzed for Chinese germplasm to compare their genetic diversity description with that derived from micorsatellite profiles showing that different markers explain variety relationships in a different way. None of markers showed correlation with photoperiodic requirements among the Chinese varieties. The homogeneity and stability testing showed that it is needed to carefully establish a minimum number of very well characterized markers before their application to DUS testing, because variability in the allelic SSR profiles and its generally neutral selective nature could modify the distinguishing ability between varieties.

Bado, Silvina G.. "Efectos biológicos de withanólidos de solanaceae sobre plagas agrícolas" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En la búsqueda de hallar nuevas sustancias con la actividad insecticida de bajo impacto ambiental se estudiaron los efectos biológicos de un grupo de metabolitos secundarios, denominados withanólidos, extraidos de Salpichroa origanifolia, Jaborosa odonelliana y Nicandra physaloides (Solanaceae), así como de compuestos análogos obtenidos por síntesis química a partir del withanólido mayoritario de S. origanifolia (Salpicrólido A), y de los extractos crudos de Physalis peruviana (Solanaceae) sobre las siguientes plagas agrícolas: Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae); Ceratitis capitata (Wiedemann (Diptera: Tephritidae); Anticaesia gemmatalis (Hûbner) (Lepidoptera: Noctuidae) y Diabrotica speciosa (Germar) (Coleoptera: Chrysomelidae). Los estudios se llevaron a cabo a través de bioensayos que comprendieron la incorporación de los productos en alimento (dieta artificial, discos foliares y bebederos de adultos, según especie insectil) y por aplicación tópica de larvas. Se realizaron observaciones periódicas registrándose el estado morfológico de los individuos, lo que permitió detectar la aparición de demoras en el desarrollo de los individuos tratados mediante la obtención de los parámetros Tiempo de pupación 50% y Tiempo de desarrollo 50% por el método Probit. Otros datos registrados fueron la presencia de alteraciones morfológicas, mortalidad y talla de los individuos, siendo estos sometidos a análisis de varianza y test de Tukey (p ≤ 0,05). Se realizaron bioensayos de preferencia alimentaria de Lema bilineata (Germar) (Coleoptera: Chrysomelidae) con las solanáceas Salpichroa origanifolia, Physalis peruviana y Solanum gilo, analizándose los resultados teniendo en cuenta la constitución química de metabolitos de las tres especies vegetales. Los resultados obtenidos son producto de una interacción química planta-insecto de alta especificidad, considerándose de gran interés la continuación de estudios acerca de su bioactividad.

Abstract:
In the search of new substances with insecticidal activity of low environmental impact, my dissertation focuses on a new group of secondary metabolites group, named withanolides. The withanolides were exracted from Salpichroa odonelliana, Jaborosa odonelliana and Nicandra physaloides (Solanaceae), and analogue compounds were synthesized from the major natural Salpichroa origanifolia withanolide (salpichrolidae A). Their biological effects of these withanolides and from Physalis peruviana (Solanaceae) crude extracts, were studied on the following agricultural pests: Tribolium castaneum (Herbst) (Coleptera: Tenebrionidae), Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae); Anticarsia gemmetalis (Hûbner) (Lepidoptera: Noctuidae) and Diabrotica speciosa (Germar) (Coleptera: Chrysomelidae). The studies involved biotests which consisted in the incorporation of the products into food (artificial diet, foliar discs, adult drinking vessels, depending on insect species) and topic application on larvae. Periodical observations of individual morphological stage registered development delays of treated individuals by fifty percent population time and fifty percent development time through Probit method. Other data obtained were morphological alterations, mortality and individual lenght, which were submitted to variance analysis and Tukey tests (p≤0,05). Preference alimentary biotests of Lema bilineata Germar(Coleoptera: Chrysomelidae), with Salpichroa origanifolia, Physalis peruviana and Solanum gilo solanaceae were caried out, whose results were analyzed taking into account the chemical constitution of these three plant species. The information here obtained indicates a high specificity in chemical plant-insect interaction, which could be considered of great interest for further bioactivity studies.

Ferrari, María Rosa. "Estudio de la composición genómica de forrajeras mediante técnicas electroforéticas y de citogenética clásica y molecular" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Tricepiro es un cereal sintético de alto valor forrajero, que fue obtenido por el Ing. Covas en 1972. Lo logró cruzando triticale Don Santiago INTA(2n=42) por trigopiro Don Noé INTA(2n=56). Luego de varios años de mejoramiento logró la linea 3-40 que fue inscripta en 1994 como cultivar con el nombre de tricepiro Don René INTA.Esta línea, que presenta resistencia a enfermedades y es tolerante al frío y a la salinidad del suelo, constituye un material apto para ser usado en programas de mejoramiento. Dentro de los objetivos de la presente tesis estuvieron. Establecer y comparar los patrones electroforéticos de gluteninas de alto peso molecular (HMW)de tricepiro Don René INTA y de sus progenitores, así como determinar la existencia de variabilidad para dichas proteínas en lineas hermanas del cultivaren estudio. Determinar la estabilidad meiótica de tricepiro Don René INTA mediante el estudio de la meiosis masculina. Establecer la relación entre la rugosidad de las semillas y el contenido de heterocromatina telomérica de los cromosomas de centeno, en lineas de tricepiro Determinar la composición genómica de tricepiro Don René INTA e individualizar sus cromosomas mediante técnicas de citogenética clásica y molecular. La electroforesis de proteinas seminales (SDS-PAGE) mostró que tricepiro Don René INTA tiene cinco bandas correspondientes a gluteninas (HMW), ninguna de las cuales le es propia. De las cinco bandas, cuatro las comparte con ambos progenitores y la quinta la comparte sólo con trigopiro Don Noé INTA. Esta banda podría provenir de Thinopyrum. Las 9 lineas hermanas de tricepiro Don René INTA que se estudiaron tienen las cinco bandas que presenta el cultivar. Dos de estas líneas, tienen una banda adicional, FA-L2 la comparte con trigopiro Don Noé INTA y FA-L66 tiene una banda propia. Los estudios meióticos de tricepiro Don René INTA mostraron la formación de 21 II en diacinesis. Sin embargo, en Metafase I se observaron asincronías en el comportamiento cromosómico tales como bivalentes que segregaban tempranamente y presencia de univalentes fuera de la placa ecuatorial. El comportamiento meiótico no reveló la presencia de heterocigosis para alteraciones numéricas ni estructurales. El número de micronúcleos presentes en las tetradas osciló entre 0 y 9 y se calculó un Índice Meiótico de 66,47. Se hizo bandeo C y DAPI en cromosomas mitóticos de tricepiro Don René INTA. Se observaron 14 cromosomas con importantes bandas teloméricas atribuibles a cromosomas de centeno y 14 cromosomas con numerosas bandas intersticiales, supuestamente pertenecientes al genoma B de trigo, de acuerdo con patrones usados internacionalmente. Tricepiro Don René INTA posee semillas rugosas, mientras que la línea FA-L2 tiene semillas lisas. Se determinó que el tamaño de las bandas teloméricas del genoma R es similar en ambas lineas. Por lo tanto, las caracteristicas rugosidad de las semillas y tamaño de las bandas teloméricas de los cromosomas de centeno no muestran asociación . Los estudios de hibridación in situ con ADN genómico total de Secale cereale y Thinopyrum bessarabicum como sondas y Triticum aestivun var Chinese Spring como bloqueante (GISH) mostraron que Tricepiro Don René INTA tiene 14 cromosomas de centeno y 28 de trigo. En un par de estos últimos se detectó introgresión de Thinopyrum. La identificación de todos los cromosomas del hibrido se logró haciendo hibridación con las sondas pSc 119.2 y pAs1 (FISH). La composición genómica y la constitución cromosómica de tricepiro Don René INTA es la siguiente: 7 pares de cromosomas de centeno (1R, 2R, 3R, 4R, 5R, 6R, 7R); 7 pares de cromosomas del genoma A de trigo (1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A); 7 pares de cromosomas del genoma B de trigo (1B, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B). Introgresión del genoma J de Thinopyrum (posiblemente Th. ponticum 2n=70) en un par cromosómico del genoma A, que por su morfología y su tamaño podría ser el 6A.

Abstract:
Tricepiro is a synthetic cereal of high forage value obtained by G. Covas in 1972 in Argentina by crossing hexaploid triticale (2n=6x=42) and octoploid trigopiro (2n=8x=56). Several years of self pollination resulted in a line, 3-40, that was registered as a cultivar under the name tricepiro Don René INTA. This line possesses high potential as a parent in breeding programmes due to its marked disease resistance and freezing and drought tolerance. Inside the objectives of the present thesis they were: to find homologies between tricepiro Don René INTA and its ancestors through high molecular weight glutenines (HMW) analysis and to compare the variability between advanced lines; to study the meiotic behavior in order to determine the meiotic stability of tricepiro Don René INTA; to correlate kernel shrivelling in tricepiro with the size of terminal heterochromatin blocks on the rye chromosomes; to characterize the genome constitution of tricepiro Don René lNTA and identify its chromosomes using clasical and molecular cytogenetical techniques. Glutenines were fractionated by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis ( SDS- PAGE) and bands of Triticum aestivum var. Chinese Spring were used for comparison. Tricepiro has five bands, four of them shared with both progenitors and one only with trigopiro Don Noé INTA. With the exception of two lines (FA L2 and FA L66) the advanced lines of tricepiro show very low variability among them. Meiotic studies showed the presence of 21 II in diacinesis but in metaphase I an asincronic chromosome behavior was observed: some bivalents segregated early and univalents were detected. Tetrades have between 0 and 9 micronuclei and the Meiotic Index was 66.47. No heterocigosis for structural rearrayement or numerical alterations were detected. C-bands and DAPI showed 14 chromosomes with large terminal heterochromatic band that are putative rye chromosomes and 14 chromosomes with intersticial bands that are putative 14 wheat chromosomes (genome B). Tricepiro Don René INTA (shrivelling kernel) and FA-L2 (smooth kernel) didn't show statistical differences between the size of their rye telomeric heterocromatin bands. So no relation were detected between shrivelling kernel and rye telomeric heterocromatin bands in these tricepiro lines. The in situ hybridization using total DNA of Seca/e, Triticumand Thinopyrum as a probe (GISH) labelled with biotin and/or digoxigenin showed that tricepiro Don René INTA consists of 14 rye chromosomes and 28 wheat chromosomes. Small introgression zones of Thinopyrum in wheat chromosomes were detected. FISH using the repetitive DNA probes pSc 119.2 and pAs1 labelled with biotin, leads us to state that the genomic composition and the chromosomes identification of tricepiro Don René INTA are the folowing: 7 rye chromosomes pairs (1R, 2R, 3R, 4R, 5R, 6R, 7R). 7 wheat chromosomes pairs belonging to the B genome (1B, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B). 7 wheat chromosomes pairs belonging to the A genome (1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A). Introgression of a region from Thinopyrum in a wheat chromosome pair belonging to the A genome (putative chromosome 6A).

Della Penna, Angela Beatriz. "Impacto del herbicida paraquat sobre invertebrados acuáticos" (2004) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El paraquat es un herbicida, ampliamente usado en ambientes terrestres y acuáticos. El objetivo del presente trabajo fue investigar algunos efectos tóxicos del paraquat en dos especies no blanco de invertebrados acuáticos. Especificamente se emplearon ejemplares adultos del oligoqueto Lumbriculus variegatus J. y moluscos gastrópodos pigmentados y no pigmentados de Biomphalaria glabrata S. En primer término se determinaron los valores de CL50, exponiendo ambos organismos en condiciones agudas. El paraquat presente en un producto formulado comercial resultó ser más tóxico para la especie L. variegatus que la solución conteniendo el compuesto puro. Para organismos de L. variegatus la toxicidad del paraquat formulado comercial aumenta con el aumento de temperatura y disminuye por el efecto de material particulado presente en el medio del bioensayo. Los valores de CL50 (96 horas y 25 +/- °C) resultaron similares para L. variegatus y ejemplares pigmentados de B. glabrata resultaron ser considerablemente más sensibles. En segundo lugar, se efectuaron bioensayos subletales a fin de investigar diversas respuestas bioquímicas. En este trabajo se reportan, por primera vez según nuestro conocimiento, valores de los niveles de las poliaminas putrescina, espermidina y espermina, en organismos controles de las dos especies de agua dulce en estudio. Por tratamiento a un nivel de 0,5 mg/L se observó que los niveles de poliaminas resultaron ser modificados por acción del paraquat producto comercial en L. variegatus. En cambio no se observaron diferencias significativas, con respecto a los controles, en organismos pigmentados y no pigmentados de B. glabrata. Los organismos de L. variegatus. al igual que ejemplares pigmentados de B. glabrata, no evidenciaron cambios en los procesos de peroxidación lipídica por acción del paraquat formulado comercial a un nivel de exposición de 0,5 mg paraquat/L. En cambio, tras 48 horas de exposición los organismos no-pigmentados de B. glabrata presentaron un aumento significativo en la peroxidación de lípidos. Los resuñtados que se obtuvieron en el presente trabajo permiten proponer tanto el análisis de niveles de poliaminas como la investigación de procesos de lipoperoxidación como posibles parámetros biomarcadores de contaminación por paraquat

Fernández, Paula del Carmen. "Análisis genómico de girasol: desarrollo de colecciones de ESTs y de una plataforma bioinformática para estudios de expresión de genes candidato en respuestas a estreses abióticos" (2006) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El girasol es uno de los principales cultivos oleaginosos del mundo por su volumen de producción y composición en ácidos grasos insaturados. En promedio, durante los últimos cinco años, la producción mundial se ha mantenido estable concentrándose el 72% de la misma entre Argentina y la Unión Europea. A pesar de esto y debido a las condiciones de los precios internacionales y la productividad comparativa con otros cultivos, el área de producción se está desplazando a regiones más áridas a nivel mundial cobrando relevancia la incidencia de estreses abióticos como sequía, salinidad y bajas temperaturas. Pese a la importancia económica del girasol a escala mundial, el grado de avance de los conocimientos públicos sobre el genoma de girasol es limitado cuando se lo compara con cultivos como el arroz, el maíz, la soja, el tomate, el trigo, la papa, la cebada. Sin embargo, en los últimos cinco años, en paralelo al avance de este trabajo, se han iniciado distintos proyectos a nivel nacional e internacional orientados al análisis genómico de girasol con lo cual ha aumentado significativamente la disponibilidad de secuencias genómicas y de ADNc, con el consecuente impacto en el avance de las investigaciones y el conocimiento sobre esta especie. El objetivo de este trabajo es contribuir al conocimiento de las regiones codificantes del genoma de girasol a partir de una estrategia de genómica funcional que sirva como base para la caracterización transcripcional simultanea de los perfiles de expresión inducidos bajo condiciones de estrés y el desarrollo de marcadores funcionales. Para lo cual se abordo el desarrollo de un banco local de secuencias que se expresan o ESTs ("expressed sequence tags") diferenciales para distintos órganos y/o estadios de desarrollo de girasol y el desarrollo de una plataforma bioinformática para la caracterización de los perfiles transcripcionales de las mismas en respuesta a estrés abióticos. En una primera etapa se evaluaron distintas estrategias de secuenciación a pequeña y mediana escala para la identificación de genes diferencialmente expresados en girasol a partir de la generación colecciones de ADNc diferencial. La técnica utilizada se basó en la hibridación substractiva como herramienta para la identificación de genes diferencialmente expresados en un tejido definido, disminuyendo significativamente la redundancia en la secuenciación de clones que representan a genes abundantes y maximizando la detección de los transcriptos “raros” o poco abundantes. Esta estrategia posibilitó un incremento de la eficiencia de secuenciación dentro del marco de un proyecto genómico de pequeña escala que apunta a la identificación de genes de utilidad para propósitos de mejoramiento y la búsqueda de marcadores funcionales. Como resultado, se obtuvieron clonotecas diferenciales a partir de hoja, tallo, raíz y flor en dos estadios de desarrollo (R1 y R4). El uso de diferentes fuentes de ARN como objeto o “tester” y referencia o “driver” fue de utilidad para la selección y detección de transcriptos poco abundantes. La especificidad órgano- específica varió dentro de un rango de 75 a 100% de las secuencias no- redundantes (unigenes) dentro de cada clonoteca de ADNc. La clonoteca correspondiente al estadio R4 de flor fue la menos redundante con un 62% de secuencias únicas y la que aportó el número más elevado de secuencias nuevas de girasol. El análisis bioinformático se llevó a cabo mediante la instalación de un servidor local (INTA 01) conteniendo las herramientas de distribución pública para la edición, análisis y ensamblado de secuencias como Phred/Phrap, CAP3 y algoritmos de comparación de secuencias como BLAST y el desarrollo de BioPipeline® una plataforma desarrollada en entorno Windows para el análisis automatizado de secuencias utilizando los mismos programas y algoritmos mencionados anteriormente. La información de secuencias generadas fue depositada en la base dbESTs de NCBI para su distribución pública. Para el manejo local de esta información se desarrolló una base relacional de tipo ACeDB para la integración de la información generada y su anotación funcional. Sobre un total de 919 secuencias que fueron editadas y anotadas, 318 representan secuencias únicas. Las comparaciones contra bases de datos públicos arrojaron un valor del 60% de secuencias no-redundantes con similitud a secuencias conocidas. El número de genes novedosos predichos varió según la clonoteca analizadas, en un rango que va de 56% en las clonotecas de flor estadio R4 al 16% en las de flor R1. Las comparaciones con los ESTs de girasol depositados y reportados en bases de datos mostraron que 197 secuencias (59,9%) del total) representaban secuencias nuevas, sin similitud significativa con secuencias conocidas. Este enfoque fue exitoso respecto del aislamiento de un número significativo de secuencias reportadas asociadas en su función inferida (probable) a caracteres de importancia agronómica, procesos regulatorios y fisiológicos clave. En una segunda etapa se abordó la evaluación de la expresión relativa simultánea de los transcriptos correspondientes a las secuencias de la base de ESTs desarrollada bajo diferentes condiciones de estrés abiótico utilizando la tecnología de micromatrices de ADN. Se imprimieron los fragmentos representativos de los 318 unigenes anotados en las clonotecas previamente descriptas en micromatrices sobre soporte de vidrio. Se evaluaron tres muestras biológicas tanto para tratamiento de frío (estrés térmico), tratamiento de salinidad (estrés salino) y controles representados por plantas crecidas en condiciones regulares. Estos estreses fueron seleccionados considerando al girasol como una planta con grado intermedio-alto de sensibilidad a bajas temperaturas en la zona radicular, así como también particularmente susceptible al desarrollo en condiciones de alta salinidad. El análisis transcripcional permitió detectar 3 grupos de genes bien diferenciados en sus patrones de expresión. Por una parte el Grupo 2, integrado por 126 genes, no mostró variación en sus niveles medios a través de los tratamientos. En cambio, el Grupo 1 (integrado por 112 genes) evidenció sobre- expresión respecto del control cuando las plantas fueron sometidas a estrés (por frío o por salinidad). De manera análoga, 49 genes conformaron el Grupo 3, pero en este caso se observó una sub-expresión respecto del control en ambos tratamientos. Dentro del grupos 1 y 3, se detectaron perfiles de expresión diferenciales para ambos tipos de estrés, siendo la sobre expresión y/o sub expresión de los genes evaluados más pronunciada en respuesta al estrés por frío respecto al estrés por salinidad. Finalmente, surgieron 80 genes candidato en la separación de tratamientos de acuerdo a su p-valor en la prueba de comparación de medias por análisis de la varianza y su ubicación en la región periférica del plano de ordenación generado por los dos primeros ejes principales de un Análisis de Componentes Principales (ACP) de la matriz de expresión génica escalada gen a gen por la desviación estándar residual del análisis de la varianza. De estos genes, 7 fueron validados por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Real Time PCR), habiéndose obtenido patrones transcripcionales similares con ambas estrategias de análisis La diferencia en expresión génica fue analizada en relación al origen de las secuencias en evaluación. Las secuencias provenientes de la colección de hoja mostraron en general patrones de subexpresión génica en respuesta a ambos estreses (la mayoría corresponden a genes asociados al proceso de fotosíntesis) mientras que las secuencias aisladas de colecciones de tallo o flor en estadio R4 mostraron patrones de inducción génica frente a los mismos estreses. Si se considera que los cambios transcripcionales en respuesta a frío y salinidad fueron evaluados en hoja, estos resultados confirman la eficiencia de la técnica de SSH utilizada para la generación de las colecciones de ADNc órgano específicas y explica la alta relación de transcriptos que muestra cambios en su perfil en respuesta a estreses en relación a los que no varían su nivel transcripcional en las condiciones evaluadas. Durante la segunda etapa de este trabajo se realizó un análisis de los 80 genes candidatos, detectándose 48 como sobre o sub expresados frente a uno u otro estrés, indicando la implicancia de mecanismos regulatorios comunes a ambos estreses. Asimismo 17 y 12 genes se detectaron inducidos o sub expresados específicamente frente a un estrés y no frente al otro. De acuerdo al análisis funcional comparativo estos genes estarían involucrados en mecanismos de regulación incluyendo procesos de transcripción, traducción, degradación/plegado o interacción de proteínas o asociados a mecanismos de generación y procesamiento de especies reactivas de oxigeno. De estas secuencias, 12 corresponden a secuencias con funcionalidad desconocida. Sólo 3 de las secuencias analizadas en este trabajo mostraron patrones transcripcionales opuestos incluyendo una con similitud a un transportador de lípidos. La información generada a partir de la caracterización del banco de ESTs constituye por una parte una fuente de información sobre genes candidatos involucrados en mecanismos de respuesta a estreses abióticos que pueden ser incluidos en ensayos de complementación en plantas transgénicas modelo y asimismo permite identificar secuencias nuevas no descriptas anteriormente para el desarrollo de marcadores funcionales a ser utilizados en programas de mejoramiento asistido de este cultivo

Abstract:
Sunflower is one of the most important oil crops worldwide regarding its production volume and composition in unsaturated fatty acids. However due to international price conditions and productivity respect to other crops, sunflower production is progressively expanding to arid regions worldwide. Consequently, abiotic stresses as drought, low temperatures and salinity arise as main constrains nowadays. Sunflower is considered a medium-high tolerant plant crop to low temperatures in the radial zone and sensitive to saline environment. Compared to other crops such as rice, maize, soybean, tomato, wheat, potato and barley genetic and genomic sunflower knowledge was limited until the onset of the present decade. However, in parallel to the advance of this thesis (last five years), different projects aimed to the genome analysis of cultivated sunflower and its related wild species, resulted in a significant increase of the number of available expressed and genome sequences in public databases. The objective of this work was to develop tools for structural and functional analysis of cultivated sunflower through the development of a model organ-specific ESTs ("expressed sequence tags") database, the creation and actualization of a bioinformatics platform to characterize transcriptional profiles of the represented genes in response to abiotic stress conditions with the aim to identify novel genes as a source of functional molecular markers associated to important traits, under the scope of an alternative, cost-effective strategy to high-throughput sequencing projects. In the first stage of this work a low scale sequencing strategy based on suppressed subtracted hybridization method was evaluated for the construction of organ- specific cDNA libraries in order to identify differentially expressed genes in sunflower Differential organ-specific ESTs were generated from leaf, stem, root and flower bud at two developmental stages (R1 and R4). Organ-specificity ranged from 75 to 100% of non-redundant sequences in the different cDNA libraries. Sequence redundancy varied according to the target and driver cDNA used for each library. The R4 flower cDNA library was the less redundant library with 62% of unique sequences. Bioinformatics analysis was achieved through the development of BioPipeline®, a bioinformatic tool for sequence quality analysis, contaminant sequence removal and sequence assembly and automatic annotation based on the utilization of free available software as Phred/Phrap, CAP3 and BLAST algorithms using a local server installed at the Institute of Biotechnology, INTA01. Processed sequences were deposited for public distribution in the dbEST database at NCBI. Biological information related to these sequences was locally stored using an ACeDB-based relational database as a laboratory information management system. Out of a total of 919 sequences that were edited and annotated, 318 were non redundant sequences. Comparison against sequences in public databases showed that 60% of non redundant sequences showed significant similarity to known sequences. The number of predicted novel genes varied among the different cDNA libraries, ranging from 56% in the R4 flower to 16 % in the R1 flower bud library. Comparison with sunflower ESTs on public databases showed that 197 of non- redundant sequences (60%) did not exhibit significant similarity to previously reported sunflower ESTs. This approach helped to successfully isolate 33 newly reported unique sequences for sunflower putatively related to responses to biotic and/or abiotic stresses. Application of suppressed subtracted hybridization technology not only enabled the cost effective isolation of differentially expressed sequences but it also allowed the identification of novel sequences in sunflower from a relative small number of analyzed sequences when compared to major sequencing projects. In a second stage, functional genomic studies were performed using microarray technology. A cDNA glass slide chip containing the 318 organ-specific unigenes was constructed in order to evaluate the expression profile under cold and salinity stress conditions. Three biological leaf samples from treated plants, exposed either to low temperatures or watered with NaCl solution, as well as control plants grew under standard condition, were evaluated by hybridization of fluorescence labeled treated and control RNA to target genes. Transcriptional analysis allowed the detection of three groups of genes well differentiated in their expression profiles during the exploratory analysis. One group composed by 126 genes did not show variation along treatments; a second group composed by 112 genes showed evidence of up-regulation under abiotic stress (cold or salinity), whereas a SUB- regulation in both treatments was observed in the 49 genes belonging to a third group. During the second phase of this analysis, 80 candidate genes were identified according to the p-value obtained by classical ANOVA and their peripheral location in the PCA analysis of the gene matrix. Seven genes were experimentally validated by quantitative real time PCR (qRT-PCR) being the transcriptional patterns derived from the two methods highly similar in all cases. Differences in genes expression were analyzed according to the differential organ-specific cDNA library from which they were isolated. While differential leaf library sequences showed the majority of genes sub-regulated (most of them corresponding to photosynthesis or general metabolism related genes), R4 flower developmental stage and stem libraries showed a larger number of up-regulated genes. Considering that transcriptional changes in response to salt and cold stresses were evaluated in leaf tissue, these results confirmed the efficiency of SSH technique in the generation of the differential organ specific libraries and explained the large transcription change / transcription unchanged ratio detected in these assays. Within the 80 candidate a large number of evaluated sequences (48) were either up-regulated or sub-regulated under both abiotic stresses, thus supporting common regulatory mechanisms and general responses to low temperature and salinity. Interestingly 17 sequences were specifically up regulated and 12 were specifically sub-regulated in one stress but not in the other. These genes are potentially involved in different regulatory mechanisms including transcription / translation / protein degradation / protein folding or correspond to genes involved in ROS production or ROS-scavenging and some of them (12) did not show similarity to reported gene products. Only three of the evaluated sequences in this work showed an inverted transcriptional pattern under cold and salinity stress, including one with similarity to a LTP transcript. The information obtained from this EST library characterization not only contributed as a major source of knowledge about candidate genes involved in the mechanisms of abiotic stress responses in sunflower that can be incorporated in future complementary gene studies in model or sunflower transgenic plants but also allows the detection of new putative functional markers as a key tool for marker assisted selection in sunflower.

Soto, María Silvina. "Estudios de las relaciones interespecíficas en el género Nierembergia, como herramienta del mejoramiento" (2007) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Antecedentes y objetivos: Esta tesis forma parte del programa de mejoramiento genético en el género Nierembergia, que iniciara en 2002 en el Instituto de Floricultura de INTA. Los objetivos generales que propuse al iniciarla, fueron: (i) conocer la compatibilidad interespecífica entre las especies nativas de valor ornamental y (ii) obtener híbridos interespecíficos como fuente de variación en el mejoramiento. Material y Métodos: En primer lugar se buscó establecer el grado de cercanía entre ocho especies del género Nierembergia: N. aristata, N. browalloides, N. calycina, N. ericoides, N. micrantha, N. linariaefolia var. linariaefolia, N. scoparia, N. veitichii en un análisis filogenético con los datos obtenidos usando el gen rpl14 y los espacios intergénico (IGS) trnK y trnL, como marcadores moleculares. En estas mismas especies se realizaron cruzamientos dirigidos aplicando polinización artificial seguida del estudio de la germinación de los granos de polen sobre el estigma y el crecimiento de los tubos polínicos a lo largo de los pistilos. Esto último permitió establecer la relación Estigma-Polen/Estilo- Tubo polínico (EPET) entre todas las especies consideradas. Con el fin de estudiar las barreras post fertilización tanto en los cruzamientos compatibles como en los incompatibles, se estudió del desarrollo del endosperma y del embrión. Finalmente se caracterizaron los híbridos interespecíficos. Resultados claves y Conclusiones: El análisis filogenético reveló la formación de tres subclados N. veitichii-N. aristata, N. linariaefolia-N. micrantha y N. scoparia-N. ericoides La distancia filogenética entre las especies que integran cada uno de ellos, fue corroborada por el análisis de compatibilidad interespecífica, y por los resultados de los estudios de endospermogénesis y embriogénesis. La combinación entre N. ericoides y N. scoparia resultó compatible, presentándose como óptima para la obtención de híbridos interespecíficos. En este género, el análisis filogenético utilizando los genes el gen rpl14 y los espacios intergénico (IGS) trnK y trnL constituye una herramienta del mejoramiento que permite predecir la compatibilidad interespecífica y consecuentemente obtener híbridos estables.

Abstract:
Backgrounds and aims: This study is part of the Genetic Improvement Program for the genus Nierembergia that commenced in 2002 in the Instituto de Floricultura of INTA. The general objectives that I proposed upon initiating it were: (i) determine interspecific compatibility between native species with ornamental value; and (ii) obtain interspecific hybrids as a source of variation in the improvement. Material and Methods: The first step was to establish the degree of proximity among eight species from the genus Nierembergi: N. aristata, N. browalloides, N. calycina, N. ericoides, N. micrantha, N. linariaefolia var. linariaefolia, N. scoparia, N. veitichii in a phylogenetic analysis with data obtained using the gen rpl14 and the intergenetic spacers (IGS) trnK and trnL, as molecular markers. In these species, directed crossings were carried out for both pollen germination (on the stigma) and pollen tube growth (along the pistils). The latter allowed for establishment of the relationship Stigma-Pollen/Style-Pollen tube (SPST) in all of the crossings. Endosperm and embryo development were analyzed in order to study the post-fertilization barriers in both the compatible and incompatible crossings. Finally, the characteristics of the interspecific hybrids obtained were described. Key Results and Conclusion: Phylogenetic analysis revealed the formation of three subclads: N. veitichii-N. aristata, N. linariaefolia-N. micrantha and N. scoparia-N. ericoides. The conclusions reached concerning the phylogenetic distance between the species that integrate each one of these was coincided with that from both compatibility and embryological studies. The combination between N. ericoides and N. scoparia was compatible, allowing production of interspecific hybrids. In this genus, phylogenetic analysis using the gene rpl14 and the intergenetic spacers (IGS) trnK y trnL constitutes a tool for genetic improvement that permits the prediction of interspecific compatibility and, consequently, obtainment of stable hybrids.

Wengier, Diego Leonardo. "Aislamiento y caracterización del ligando del pistilo que interactúa con el sistema de receptores quinasa LePRK1 y LePRK2 de polen de Solanum lycopersicon (tomate)" (2008) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los LePRKs son receptores quinasa que se localizan en la membrana plasmática de polen, posiblemente mediando interacciones polen-pistilo. Previamente, hemos demostrado que LePRK2 se encuentra fosforilada en polen maduro y germinado, y se desfosforila cuando microsomas de polen son incubados con extractos de estigma-estilo. Esto sugiere que por lo menos LePRK2 podría estar transduciendo una señal del pistilo a través de la actividad de LePRK2. En esta tesis, mostramos que la desfosforilación de LePRK2 está mediada por una molécula proveniente del pistilo resistente al tratamiento térmico, alcalino y proteasas. Basándonos en la desfosforilación de LePRK2, desarrollamos un protocolo de purificación con el cual obtuvimos un pico aislado de ~3550 Da (determinado por UV-MALDI-TOF MS) correspondiente a esta molécula peptídica que nombramos MrX. Con el fin de evaluar los efectos de MrX en tubos polínicos en crecimiento, realizamos ensayos de germinación in vitro en presencia de MrX parcialmente purificado y determinamos la longitud del tubo polínico como marcador del estado fisiológico. La adición de MrX al medio de germinación resultó en un aumento del largo del largo del tubo polínico en una forma dependiente de la dosis, mientras que las fracciones control no tuvieron efecto alguno. Nuestra hipótesis plantea que las interacciones polen-pistilo a través del complejo de LePRKs involucran la percepción de MrX por LePRK2, seguido de una desfosforilación de ésta y un incremento de la tasa de crecimiento del tubo polínico.

Abstract:
LePRK1 and LePRK2 are pollen specific receptor kinases that belong to a plasma membrane high molecular weight complex possibly involved in pollen-pistil interactions. Previously, we have shown that LePRK2 is phosphorylated in mature and germinated pollen grains, but is dephosphorylated when pollen microsomes are incubated with stigma-style extracts. This suggests that LePRK complex might be transducing a signal from pistils through LePRK2 activity. In this thesis, we show that LePRK2 dephosphorylation is mediated by a heat-, base- and protease-resistant molecule from pistils. Based on LePRK2 phosphorylation, we developed a purification protocol and obtained an isolated peak of ~3550 Da peptidic compound (as determined by UV-MALDI-TOF MS) that we named MrX. In order to assess the effects of MrX on growing pollen tubes, we did in vitro germination assays in the presence of partially purified fraction of MrX and determined pollen tube length as a marker of the physiological state. MrX addition to germination medium resulted in pollen tube length increase in a dose-dependent manner, but not when pollen grains were incubated with control fractions. We hypothesize that pollen-pistil interactions through LePRK complex involve MrX perception by LePRK2, followed by LePRK2 dephosphorylation and an increase in pollen tube growth rate.

Soto, Gabriela Cynthia. "Caracterización funcional de proteínas del tipo acuaporinas en polen maduro de Arabidopsis thaliana" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La reproducción sexual en plantas incluye procesos en donde el movimiento de agua y solutos se encuentra finamente regulado, lo cual sugiere la participación de acuaporinas. La existencia de acuaporinas, facilitando estos flujos, provee una base molecular sólida para la regulación del transporte de agua y solutos a través de las membranas y de esta forma establecen conexiones entre dicho transporte, el desarrollo de las plantas y sus respuestas adaptativas a las condiciones a las que se encuentran expuestas tanto a nivel organismo, como tejido e incluso a nivel intracelular. Este trabajo de tesis se centró principalmente en la identificación y caracterización de las acuaporinas potencialmente involucradas en la reproducción desde los órganos reproductivos masculinos en Arabidopsis thaliana. Primeramente identificamos las tres acuaporinas específicas de granos de polen de Arabidopsis, AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1. En base a experimentos funcionales, utilizando ovocitos de Xenopus laevis como sistema heterólogo, pudimos determinar que AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1 son transportadores de agua. AtTIP5;1 y AtTIP1;3 son también transportadores de urea y solamente AtTIP5;1 se encuentra regulado por pH externo. Estudios de localización subcelular evidenciaron que AtTIP5;1 se expresa en mitocondrias de polen. Por otro lado, AtTIP1;3 se encuentra en estructuras intracelulares no vacuolares del tipo vesículares, pero que no participan de mecanismos de endocitosis ni exocitosis. Finalmente, los experimentos fisiológicos in vitro sugirieron un papel de AtTIP5;1 en germinación del grano de polen actuando como regulador negativo. AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1 se vincularon de forma directa o indirecta con el proceso de elongación del tubo polínico, destacándose los efectos más drásticos para AtTIP1;3. En cuanto a los experimentos fisiológicos in planta, encontramos que solamente AtNIP4;1 tiene afectados los parámetros de fertilidad con una reducción significativa en el número de semillas. En el marco de esta tesis doctoral hemos realizado una revisión de la información disponible de acuaporinas de plantas, evaluando los perfiles de expresión de las mismas en los diversos tejidos. Hemos discutido la nomenclatura utilizada para clasificar esta familia proteica y analizado la posibilidad de establecer relaciones filogenéticas y funcionales entre los distintos subgrupos: PIPs, TIPs, NIPs y SIPs. El conjunto de resultados desarrollados en esta tesis, en concordancia con los trabajos publicados en estos últimos años, nos ha permitido aventurar posibles roles en relación con la actividad de transporte de agua y/o solutos de las acuaporinas de polen; que van desde la migración celular hasta el control del daño y prevención de apoptosis. También nos ha permitido generar un modelo sobre el mecanismo de acción de las acuaporinas en el polen relativo a la actividad como transportadores de urea. Este modelo vincula la actividad de AtTIP5;1 y AtTIP1;3 con el reciclado del nitrógeno descripto en polen.

Abstract:
Sexual reproduction involves processes where water and solute movement is finely regulated, suggesting the involvement of aquaporins. The existence of aquaporins facilitating these flows, provides a solid molecular basis for the regulation of water and solute transport through membranes and thus make connections between the transport, plant development and adaptive responses to conditions to which the plant is exposed at both the organism such as tissue or even intracellular level. This thesis is focused mainly on the identification and characterization of aquaporin potentially involved in reproduction from the male reproductive organs in Arabidopsis thaliana. We first identified the three Arabidopsis pollen grains specific aquaporins, AtTIP5;1 AtTIP1,3 and AtNIP4;1. Based on functional experiments using Xenopus laevis oocytes as a heterologous system, we could determine that AtTIP5;1 AtTIP1;3 and AtNIP4;1 are water carriers. AtTIP5;1 and AtTIP1;3 are also carriers of urea and only AtTIP5;1 is regulated by external pH. Subcellular localization studies showed that AtTIP5;1 is expressed in pollen ́s mitochondria. Furthermore, AtTIP1;3 is located in intracellular structures not vesicular vacuolar-type, but not participating in endocytosis and exocytosis mechanisms. Finally, in vitro physiological experiments suggested a role AtTIP5;1 in pollen grain germination by acting as negative regulator. AtTIP5;1, AtTIP1,3 and AtNIP4;1 is linked directly or indirectly with the process of pollen tube elongation, especially the more drastic effects for AtTIP1;3. For physiological experiments in planta, we found that only AtNIP4;1 has affected fertility parameters with a significant reduction in the number of seeds. As part of this thesis, we have conducted a review of available information of plant aquaporins, evaluating the expression profiles of the same in various tissues. We discussed the nomenclature used to classify this protein family and discussed the possibility of phylogenetic and functional relationships between different subgroups: PIPs, TIPs, NIPs and SIPs. Together, the results obtained in this thesis, along different reports published in recent years has allowed us to venture possible roles in relation to water and urea transport activity of pollen's aquaporins ranging from cell migration, to damage control the and prevent apoptosis. It also allowed us to generate a model on the mechanism of action of aquaporins on the activity of urea transporters in pollen. This model links specially AtTIP5;1 activity, and AtTIP1;3 with nitrogen recycling in pollen.

Salem, Tamara Marcela. "Estudio de los residuos fosforilados del receptor quinasa LePRK2 en polen de Solanum lycopersicum VF36 (tomate cultivado) y su función en las interacciones polen-pistilo" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El crecimiento apical del tubo polínico es un modelo muy utilizado para el estudio de células polarizadas en plantas. Previamente caracterizamos a LePRK2, un receptor quinasa específico de polen de tomate (Solanum lycopersicum). Cuando se expresa de manera transitoria LePRK2-eGFP en polen de tabaco, se observa una disminución significativa del largo del tubo polínico y un aumento del ancho del ápice del tubo, comparado con tubos eGFP. Tubos que expresan la mutación en una lisina esencial para la actividad quinasa de LePRK2, muestran la misma longitud del tubo polínico y del ancho del ápice que los tubos eGFP control. Hemos demostrado que LePRK2 estaría presente como múltiples isoformas fosforiladas tanto en membranas de polen maduro como germinado. Utilizando un análisis comparativo de secuencias y la predicción de sitios de fosforilación, identificamos dos motivos posibles de fosforilación en el dominio citoplasmático yuxtamembrana. Mutagénesis dirigida sobre estos motivos y su sobreexpresión en polen de tabaco, muestra que ambos motivos tienen efectos opuestos en la regulación del crecimiento del tubo polínico. Sustituciones a alanina en residuos del motivo I de LePRK2, S277/S279/S282, resultó en tubos polínicos más largos, mientras que la sustitución a alanina de residuos del motivo II, S304/S307/T308, resultó en tubos más cortos. En contraste, sustituciones fosfomiméticas con ácido aspártico en estos residuos, mostró resultados recíprocos: tubos más cortos con mutaciones en el motivo I y tubos más largos con mutaciones en el motivo II. Concluimos que la longitud del tubo polínico puede estar controlada a través de una regulación negativa y positiva debida a la fosforilación de los residuos del motivo I y II respectivamente. Estos resultados sugieren que LePRK2 podría tener un papel central en el crecimiento del tubo polínico a través de la regulación de su propio estado de fosforilación. Hemos realizado distintos abordajes con polen maduro de tomate con el fin de determinar por espectrometría de masa los sitios de fosforilación de LePRK2, pero hasta el momento no hemos logrado identificarlos. Por otro lado, STIL, un ligando de LePRK2 proveniente del pistilo, desfosforila LePRK2 en membranas de polen maduro en 32 PγATP. Nuestra hipótesis plantea que LePRK2 está involucrada en el control del crecimiento del tubo polínico de tomate y el mismo es regulado in vivo por el equilibrio de distintos residuos de fosforilación, a veces organizados en motivos en su dominio yuxtamembrana. Por otro lado, alguno de los residuos de LePRK2 son desfosforilados por STIL.

Abstract:
The tip-growing pollen tube is a useful model for studying polarized cell growth in plants. We previously characterized LePRK2, a pollen-specific receptor-like kinase from tomato (Solanum lycopersicum). When transiently overexpressed in tobacco pollen tubes, LePRK2-eGFP significantly decreased pollen tube length and increased pollen tube tip width, relative to eGFP tubes. Tubes that expressed a mutation in a lysine essential for kinase activity showed the same length and width as the eGFP control. LePRK2 might be present as multiple phosphorylated isoforms in mature and germinated pollen membranes. Using comparative sequence analysis and phosphorylation site prediction programs we identified two putative phosphorylation motifs in the cytoplasmic juxtamembrane domain. Site-directed mutagenesis in these motifs, and overexpression in tobacco pollen, showed that both motifs have opposite effects in regulating pollen tube length. Relative to LePRK2-eGFP pollen tubes, alanine substitutions in residues of motif I, S277/S279/S282, resulted in longer pollen tubes, but alanine substitutions in motif II, S304/S307/T308, resulted in shorter tubes. In contrast, phosphomimicking aspartic substitutions at these residues gave reciprocal results: shorter tubes with mutations in motif I and longer tubes with mutations in motif II. We conclude that length of pollen tubes can be negatively and positively regulated by phosphorylation of residues in motif I and II respectively. These results suggest that LePRK2 may have a central role in pollen tube growth through regulation of its own phosphorylation status. In order to discover LePRK2 phosphorylation sites in vivo, some approaches were tested with tomato mature pollen. Morover, STIL, a ligand of LePRK2 from pisitil, dephosphorylates LePRK2 in mature pollen membranes in the 32PγATP. We hypothesize that LePRK2 is involved in the control of tomato presence pollen tube growth, and this is regulated in vivo by the equilibrium of different phosphorylated residues, sometimes organized in motifs in the juxtamembrane domain. On the other hand, some residues of LePRK2 are dephosphorylated by STIL.

Cordon, Gabriela Beatriz. "Métodos ópticos no destructivos para monitoreo de salud vegetal" (2009) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El desarrollo de métodos ópticos analíticos para monitoreo de salud vegetal ha crecido notablemente debido a que estas técnicas permiten ahorrar mucho tiempo y trabajo en el laboratorio. Actualmente, es relevante la posible aplicación de estas metodologías en el monitoreo a distancia de la vegetación. Esta tesis propone un acercamiento al monitoreo de la salud vegetal desde la óptica química-física. El objetivo principal del presente trabajo es la interpretación de la interacción de la luz con el material vegetal en forma rigurosa desde el punto de vista físico y matemático para desarrollar procedimientos de diagnóstico. En particular, se exploraron en profundidad los métodos ópticos basados en determinaciones de reflectancia y en la espectroscopía de fluorescencia. Se encontraron correlaciones entre los espectros de reflectancia con el contenido de pigmentos presentes en las hojas y con el contenido de agua de las mismas. Además, se demostró la aplicabilidad de la teoría de Kubelka-Munk y del modelo de Pila de Placas en hojas. Se efectuó un estudio exhaustivo de la emisión de fluorescencia de clorofila-a presente en el tejido foliar, prestando especial atención al desarrollo y aplicación de modelos adecuados para efectuar correcciones por procesos de reabsorción de luz. Las características morfológicas y fisiológicas de las hojas se ven reflejadas en sus propiedades ópticas; por lo tanto se evaluaron los parámetros fotofísicos de hojas expuestas a diversas condiciones naturales a fin de ahondar los conocimientos existentes al respecto. Adicionalmente, se estudió la variación de los parámetros fotofísicos de las hojas frente a situaciones de tensión tales como: senescencia, carencia de nutrientes y presencia de herbicidas. Finalmente, se desarrolló un método para obtener la distribución espacial de los pigmentos foliares dentro de las hojas. Las imágenes utilizadas se obtuvieron a partir de un escáner comercial lo que facilita la implementación de esta metodología con un bajo costo de operación.

Abstract:
The development of optical-methods for monitoring plant health has grown markedly since these techniques can save time and work in the laboratory. At present, these methodologies are relevant in connection with the remote sensing of vegetation. This thesis proposes an approach to the monitoring of plant health from a physicochemical perspective. The main objective of the present work is the interpretation of the interaction of the light with plant material from a physical and mathematical point of view to build up diagnostic procedures. In particular, optical methods based on reflectance and fluorescence spectroscopy were explored in depth. Correlations between reflectance spectra and both the pigment content and the water content of leaves were found. In addition, the applicability of the Kubelka-Munk theory and of the Pile of Plate model on plant material was tested. An exhaustive study of chlorophyll-a fluorescence from plant tissues was performed by focusing on the development and application of appropriated corrections models to account for light re-absorption processes. The morphological and physiological features of leaves are revealed in their optical properties; therefore we evaluated the photophysical parameters of leaves exposed to different natural conditions in order to deepen existing knowledge about it. Additionally, we studied the variation in the photophysical parameters of the leaves under stress situations such as senescence, nutrient deficiency and the presence of herbicides. Finally, we developed a method for obtaining the spatial distribution of pigments concentration from color images of leaves. The images used were obtained from a commercial scanner which facilitates the implementation of this methodology with a low cost of operation.

Fusari, Corina Mariana. "Mapeo por asociación en girasol: diversidad nucleotídica, desequilibrio de ligamiento e identificación de genes involucrados en la resistencia a la podredumbre húmeda del capítulo" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El mapeo por asociación es una herramienta poderosa que permite la identificación de loci cuya contribución explica parte de la variación fenotípica observada. En general, los marcadores utilizados en estos estudios son los Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms) y los indels (eventos de inserción, insertion/deletion). Los objetivos de este trabajo comprendieron el estudio de la diversidad nucleotídica y el alcance del desequilibrio de ligamiento (DL) en girasol cultivado, y el diseño de una estrategia de mapeo por asociación para la resistencia a la Podredumbre Húmeda del Capítulo (PHC), causada por Sclerotinia sclerotiorum. La frecuencia de SNPs (1/61) y la diversidad nucleotídica (θ=0,0067) se determinaron sobre un panel de 31 genes y 19 líneas endocriadas de girasol. La frecuencia de SNPs en conjunto con un alcance del DL hasta 100 kb (r2~0,1) permitieron diseñar un estudio de asociación a través de la estrategia de genotipificación de genes candidatos. Un total de 30 genes candidatos fueron seleccionados a partir de: (1) el análisis de los perfiles transcripcionales de un genotipo de Brassica napus resistente a S. sclerotiorum, (2) una colección de transcriptos de expresión diferencial de una línea de girasol moderadamente resistente desafiada con S. sclerotiorum y (3) genes descriptos en literatura como partícipes en los procesos de defensa frente a PHC. La elección, caracterización y genotipificación de genes candidatos implicó la generación de herramientas para la selección de los mismos y la optimización de técnicas de genotipificación de SNPs a gran escala. La detección de moléculas heterodúplex mediante: (1) corte con la enzima endonucleasa CEL1 (CEL1CH) y (2) cromatografía líquida de alto rendimiento en condiciones de desnaturalización parcial (dHPLC), demostraron ser técnicas robustas y versátiles para aumentar el número de loci e individuos a incluir en los estudios de mapeo por asociación. Un total de 16 genes se genotipificaron exitosamente en la población de mapeo por asociación constituida por 134 accesos del Banco Activo de Girasol de la Estación Experimental Agropecuaria (EEA) INTA Manfredi. El análisis estadístico de asociación incluyó el uso de modelos lineales mixtos que corrigieron los problemas de estructuración y las relaciones de parentesco entre los individuos de la población de mapeo. Un alelo del gen RhoBP_B exhibió una asociación estadísticamente significativa con una menor incidencia de PHC (pp<0,05). Los resultados obtenidos demuestran que es posible encontrar alelos útiles implicados en caracteres complejos a través de los estudios de mapeo por asociación en girasol.

Abstract:
Association mapping is a powerful tool to identify gene loci that may contribute to phenotypic variation. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions (indels) have become the markers of choice to conduct these studies. The aims of this thesis were to study nucleotide diversity and the extent of linkage disequilibrium (LD) in cultivated sunflower to conduct association mapping for the resistance to Sclerotinia Head Rot disease. SNP frequency and nucleotide diversity were assessed using a set of 31 genes and 19 sunflower inbred lines (1SNP/61 pb, θ=0.0067). The relatively high frequency of SNPs found here, along with the predicted extent of LD over distances of 100 kb (r2~0.1) allowed the development of an association mapping strategy through candidate gene approach. A total of 30 genes were selected based on: (1) a microarray analysis from Brassica napus genotypes resistant to S. sclerotiorum, (2) differentially expressed genes from cDNA libraries from sunflower infected tissues; (3) previous literature reports. Different methods of candidate gene selection and optimization of SNP genotyping technologies for scale-up throughput were explored. CEL1 cleavage of heteroduplex (CEL1CH) and denaturing high performance liquid chromatography (dHPLC) proved to be robust and versatile techniques to increase the amount of loci and individuals to be included in the association panel. Sixteen genes were successfully genotyped in the association population composed by 134 inbred lines from INTA Manfredi Sunflower Germplasm Bank. Mixed linear models accounting for population structure and kinship relatedness were used for the statistical analysis of associations. One candidate gene, RhoBP_B, had significant results from association analysis, indicating that it might affect the quantitave variation in sunflower resistance to Sclerotinia Head Rot disease. These results demonstrate the potential of candidate gene association mapping for complex trait dissection in sunflower.

Peluffo, Lucila. "Caracterización de los mecanismos de defensa a sclerotinia sclerotiorum, agente causal de la podredumbre del estudio de perfiles metabólicos y transcripcionales" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En Argentina, la podredumbre húmeda del capítulo, causada por el patógeno necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum, es una enfermedad que provoca serias mermas en la producción y tiene una incidencia anual promedio sobre la producción de la pampa húmeda del 10-20%. Los síntomas de la enfermedad se manifiestan al final de la etapa de floración o durante el llenado de granos por lesiones en el receptáculo que pueden extenderse y afectar todo el capítulo, produciendo la caída del mismo. En estados avanzados de podredumbre, se forman esclerocios, estructuras de resistencia del hongo, que pueden permanecer en los tejidos o en suelo y mantenerse viables por más de 8 años constituyendo el inóculo para futuras infecciones. La resistencia a Sclerotinia sclerotiorum en girasol es compleja, habiéndose detectado varios loci de carácter cuantitativo (QTL) específicos de línea, órganos y condiciones ambientales de crecimiento. Dicha complejidad ha limitado el desarrollo de germoplasma resistente por medio del mejoramiento clásico, reforzando la necesidad de la utilización de herramientas genómicas que incluyan tanto marcadores neutros para el mapeo de QTL como el desarrollo de marcadores funcionales desarrollados sobre genes candidatos para la resistencia al patógeno. El conocimiento de los factores determinantes de la patogénesis y las respuestas de defensa del hospedante constituyen factores claves para la identificación de dichos genes candidatos. Uno de los aspectos más destacados del mecanismo de invasión de S. sclerotiorum es la degradación de la pared celular, siendo el ácido oxálico producido por el patógeno uno de los determinantes de la patogénesis, a través de la acidificación y el secuestro de Ca^2+ de la pared celular del tejido hospedante. Asimismo, el ácido oxálico ejerce una regulación dual de la producción de especies reactivas de oxigeno (ROS). Por un lado, en los primeros estadios de la infección el ácido oxálico induce la generación de ROS y la inducción de una muerte celular programada (PCD) en una marera dependiente del pH generando un ambiente favorable para el desarrollo del patógeno, la adquisición de nutrientes y el establecimiento de la relación necrotrófica. Por el otro lado a medida que la infección progresa y al ácido oxálico se acumula en los tejidos del hospedante, el pH disminuye acompañado de la inhibición del estallido oxidativo y la PDC provocando así la muerte celular pero de una manera necrotrófica. En el presente trabajo se abordó el análisis del perfil metabólico primario, el perfil transcripcional de genes candidatos y los perfiles hormonales de dos líneas de girasol con comportamiento contrastante frente a la infección producida por S. sclerotiorum (HA 89 susceptible y RHA801 moderadamente resistente). Aplicando un método de estudio de perfiles metabólicos basado en la técnica de GC/MS, fue posible detectar diferentes patrones involucrando 63 metabolitos entre ellos azucares, aminoácidos, ácidos orgánicos, ácidos grasos y algunos metabolitos secundarios en flores de girasol que constituyen el órgano principal de infección de este patógeno. Los análisis estadísticos paramétricos y multivariados mostraron diferencias metabólicas entre estos dos líneas, así como también efectos de interacción entre línea y los días post inoculación. Los análisis de correlación de redes sugieren que estos cambios metabólicos están sincronizados en una manera dependiente del tiempo en respuesta al patógeno. Se detectaron mayor cantidad de cambios metabólicos diferenciales en la línea susceptible que en la resistente, esto se evidencia en el mayor número de interconexiones que presenta la línea susceptible entre los módulos de metabolitos formados por compuestos pertenecientes a las mismas vías. Por otro lado, la línea resistente muestra mayor interconexión entre metabolitos pertenecientes a las mismas vías. La evaluación de estos datos también demuestra una regulación línea específica de las distintas vías metabólicas, sugiriendo la importancia de detección de patrones metabólicos, en lugar de cambios específicos de metabolitos individuales, cuando se buscan marcadores metabólicos que responden diferencialmente a la infección der patógenos. Por otra parte el análisis de patrones de actividad de enzimas claves del metabolismo primario del carbono (sacarosa sintasa y las invertasas de pared celular, citológica y vacuolar), foto-respiración (catalasa) y del metabolismo de los fenilpropanoides (fenilalanina-amonio-liasa-PAL), mostró también diferencias entre líneas a tiempos tempranos del proceso de infección. La actividad catalasa presentó un aumento significativo en la línea resistente, que indicaría una regulación diferencial de la fotorespiración frente a la infección del patógeno, disminuyendo el nivel de ROS. Para la identificación de nuevos genes candidatos involucrados en la resistencia a este patógeno se construyeron colecciones de ADNc basadas en la técnica SSH de flores de girasol inoculadas y no inoculadas a partir de una línea resistente a los 2 y 4 días post inoculación. Esta estrategia dio como resultado la obtención de secuencias diferencialmente expresadas entre las flores inoculadas y no inoculadas. La mayoría de estos genes están involucrados en los procesos de traducción de proteínas, en los procesos de óxido reducción entre los cuales se encuentra un gran número de genes de respuesta a estreses biótico y abiótico, numerosos genes involucrados en el metabolismo primario. Del mismo modo, también se detectó un alto porcentaje de secuencias sin similitud con secuencias disponibles en bases de datos, sugiriendo que podrían codificar para genes no descriptos previamente, involucrados en la respuesta del girasol frente a este patógeno. De las clonotecas generadas se seleccionó un conjunto de genes para validar su comportamiento por qRT-PCR. De este conjunto, los genes quitinasa, un elemento de respuesta a etileno y el factor de transcripción WRKY7 mostraron patrones de expresión diferenciales entre las muestras inoculadas y controles a los distintos días post inoculación, sugiriendo que estos genes se encuentran involucrados en la respuesta del girasol frente a S. sclerotiorum. Asimismo se identificó un número importante de genes asociados a defensa a patógenos que se expresan en altos niveles en flores de girasol de la línea resistente aún en condiciones control, sin inoculación con el patógeno. Se estudiaron los perfiles hormonales para el ácido salicílico y para el ácido jasmónico por medio de la técnica LC-ESI-MS/MS. Estos estudios corroboraron que el ácido salicílico no contribuye a la resistencia contra S. sclerotiorum y que además se acumula en los tejidos infectados por este hongo, particularmente en la línea susceptible. A su vez, estos estudios demostraron que el jasmónico estaría asociado a la resistencia frente a este patógeno en las flores de girasol de la línea resistente. La integración del análisis de perfiles metabólicos, transcripcionales y perfiles hormonales contribuyó a una mejor comprensión de los cambios en el metabolismo en los capítulos de girasol durante los primeros estadios de la infección facilitando la identificación de genes y vías metabólicas involucradas en la respuesta al patógeno necrotrófico S. sclerotiorum. Asimismo la identificación de cambios en perfiles metabólicos y transcripcionales de genes candidatos, entre líneas resistentes y susceptibles, posibilita el desarrollo de biomarcadores metabólicos y marcadores funcionales para su aplicación en el mejoramiento asistido del cultivo de girasol.

Abstract:
Sclerotinia sclerotiorum, the causal agent of sunflower head rot, represents one of the main constrains in sunflower production in Argentina, with an average annual incidence of 10-20% of total yield of the main growing area, especially when flowering takes place during periods ofexcessive rainfall. The symptoms appeared at the end of the flowering stage or during grain filling, as water-soaked lesions on the receptacles. The fungus can decay the entire receptacle leaving only a bleached, shredded skeleton with large sclerotia. These sclerotia are resistance structures that can remain viable for more than 8 years in the soil and are main sources of inoculum for future infection. S. sclerotiorum resistance in sunflower is complex; several underlying QTLs were found to be specific for genotype, organ and environmental conditions. This complexity has limited the development of resistant genotypes by classical breeding, thus strengthening the need of using genomic tools such as neutral markers for QTL mapping and the development of functional markers based on candidate genes for resistance to this pathogen, for association mapping.. Insights into pathogenesis determinant factors and host defense responses are key factors for the identification of candidate genes. Degradation of plant cell wall is of major importance in the S. sclerotiorum invasion. Oxalic acid (OA) secreted by this pathogen induced pathogenesis by lowering the pH and chelating host cell-wall-Ca^2+ In the early stages of the infection process, low levels of OA elicits reactive oxygen species production (ROS) in host plant tissues, triggering programmed cell death and thus, creating a favorable environment for its development. As OA accumulates, the pH is lowered and the interaction becomes necrotrophic in nature, with the concomitant suppression of ROS and PCD, enabling further pathogen invasion of plant tissue. In the present work primary metabolic profiling, transcriptional profiling of candidate genes and phytohormone profiling was conducted in two sunflower inbred lines with contrasting behavior to S.sclerotiorum infection (HA89 susceptible, RHA801 resistant) Applying a metabolic profiling approach based on GC/MS, different patterns were identified, involving 63 metabolites including major and minor sugars and sugar alcohols, organic acids, amino acids, fatty acids and few soluble secondary metabolites in the sunflower capitulum, the main target organ of pathogen attack. Both point-by-point and non-parametric statistical analyses showed metabolic differences between genotypes as well as interaction effects between genotype and time after inoculation. Network correlation analyses suggested that these metabolic changes were synchronized in a time-dependent manner in response to the pathogen. Differential metabolic changes were detected to a higher extent in the susceptible line rather than in the moderate resistant line, this is in the susceptible line a higher number of interconnection are observed between modules composed by intermediates of the same pathway. Instead, in the resistant one, larger connections of metabolites within modules were detected. Evaluation of these data also demonstrated a genotype specific regulation of distinct metabolic pathways, suggesting the importance of detection of metabolic patterns rather than specific metabolite changes when looking for metabolic markers differentially responding to pathogen infection. The enzymatic activity analysis of key enzymes of the primary carbon (sucrose synthase and cell wall, cytosolic and vacuolar invertases), photorespiratory (catalase) and phenylpropanoid metabolism (phenylalanine ammonia-lyase -PAL-) showed differences between genotypes at early time point of the infection progress. A significant threefold increase in the catalase activity of the resistant genotype was observed, indicating a differential regulation in photorespiration in response to pathogen infection by lowering ROS levels. Subtractive cDNA libraries of inoculated and mock inoculated flowers at 2 y 4 DPI were constructed for identification of candidate genes involved in S. sclerotiorum resistance using a PCR-based suppression subtractive hybridization (SSH) method. Differentially expressed sequences between inoculated and mock inoculated flowers were obtained, including sequences coding for genes involved in protein transduction process, oxidorreduction process, genes involved in abiotic and biotic stress responses, genes involved in primary metabolism and a high number of sequences with no homology to sequences deposited in data bases, suggesting that they could be coding for new genes involved in sunflower response to S. Sclerotiorum. A group of 16 genes was selected for validating these libraries by qRT-PCR, genes coding for chitinase (AN: ABJ74186), Ethylene responsive element (AN: XP_002275892) and the transcription factor WRKY7 showed differential expression patterns between inoculated and mock inoculated flowers, suggesting that these genes are involved in sunflower response to S. sclerotiorum. Besides, a large number of defense-related genes were identified as constitutively expressed in mock inoculated flowers of the resistant genotype. Hormonal profiling analysis of Salicylic and jasmonic acid levels were determined by LC-ESI- MS/MS at different time points after inoculation in inoculated and mock inoculated sunflower flowers. These studies support the findings that SA does not contribute to resistance against S. sclerotiorum, moreover SA accumulation was induced in diseased tissues particularly in the susceptible genotype. Furthermore this work showed that JA was associated to resistance against this pathogen in sunflower capitula. The integration of metabolic, transcription and hormone profiling analysis contributed towards a better understanding of sunflower capitulum metabolism changes during the early stages of infection, greatly facilitate the selection of candidate genes for this plant-pathogen interaction, thus allowing the development of metabolic biomarkers and functional markers based on candidate genes, for application in sunflower breeding programs.

Moreno, María Valeria. "Diversidad genética en girasol cultivado: análisis de una colección de germoplasma local para su aplicación en programas de mejoramiento" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los bancos de semillas ofrecen una valiosa fuente de diversidad para el mejoramiento genético de los cultivos. Para un aprovechamiento óptimo de los recursos genéticos, la caracterización fenotípica de los materiales conservados (resistencia a estreses bióticos y abióticos, índices de calidad química, nutricional y rendimiento, entre otros) debe ser acompañada por la caracterización genética de los mismos. De este modo, la diversidad alélica evaluada a través de marcadores moleculares es uno de los mejores indicadores del potencial genético de las entradas (accessions) de un banco. Los objetivos de este trabajo fueron: a) estudiar la diversidad genética en un conjunto de entradas de girasol cultivado preservadas en el Banco Activo de Germoplasma de INTA Manfredi (BAG-IM), b) estudiar la distribución de los polimorfismos detectados y la estructura poblacional, c) evaluar la consistencia entre metodologías de fenotipificación para el carácter de tolerancia a sequía, comparando ensayos de campo con ensayos en condiciones controladas, y d) analizar los patrones de variación nucleotídica en regiones candidatas asociadas al carácter tolerancia a déficit hídrico en líneas endocriadas pertenecientes al programa de mejoramiento de tolerancia a sequía del BAGIM. A fin de cuantificar los niveles de variabilidad se genotipificaron 337 individuos pertenecientes a 21 entradas representativas de las distintas categorías conservadas en el banco (líneas, poblaciones y compuestos) utilizando 16 marcadores microsatélites de localización genómica conocida. Esta elección fue respaldada mediante un análisis de diversidad basado en caracteres morfológicos y agronómicos en base a 309 entradas conservadas en el banco. Se obtuvo un número total de 108 alelos, mientras que el número promedio de alelos por locus (A) fue de 6,75. El locus con mayor valor de A para todas las entradas fue HA2077 (3,66), mientras que los que mostraron menor valor fueron HA3582 y HA4239 (1,57 y 1,52, respectivamente). La heterocigosis esperada promedio fue de 0,29, con valores extremos de 0,476 para la población Prao-Co y de 0,054 para la línea F-164. El número promedio de alelos por locus varió entre 3 y 16. El 100% de las poblaciones (8) y el 83,3% de los compuestos analizados (5 de 6) mostraron desvío a las proporciones de Hardy-Weinberg, con exceso de homocigotas en la mayoría de los loci. La estima global de FST permitió detectar niveles de diferenciación altos y estadísticamente significativos entre entradas (FST=0,413, p<0,05). La estructura poblacional inferida mediante métodos bayesianos mostró la existencia de 14 entidades panmícticas. Individuos de todas las entradas evidenciaron patrones de mezcla con diferentes proporciones de los acervos génicos detectados contribuyendo a sus constituciones genéticas. Los mayores niveles de mezcla se detectaron para la población Prao-co. El ensayo bajo condiciones controladas en déficit hídrico moderado resultó eficiente para la fenotipificación rápida de líneas pertenecientes al programa de mejoramiento para tolerancia a sequía. El análisis de los patrones de variación en 7 regiones candidatas para tolerancia a déficit hídrico (Hahb4- p, Hahb4, Suntip, FB, HaL1L, HaDhn1 y CK) reveló una frecuencia promedio de SNP de 1/48,3 pb y una diversidad nucleotídica promedio (Өw) de 0,00501. Se obtuvo un elevado nivel de desequilibrio de ligamiento (DL) (r2=0,88 a las 900 pb), decayendo sólo en Suntip (r2=0,325 a las 207 pb) y en HaDhn1 (r2=0,249 a las 78 pb). Las regiones Suntip y HaDhn1 serían las más apropiadas como candidatas para mapeo por asociación por la multiplicidad de variantes alélicas en frecuencias similares, mientras que las regiones Hahb4, Hahb4-p, FB y HaL1L resultan interesantes debido a la posible incidencia de procesos selectivos y podrían emplearse en un futuro, complementando el análisis con un mayor número de entradas en la población de mapeo. Este trabajo constituye el primer aporte en la evaluación de la variabilidad genética contenida en el BAG-IM mediante marcadores moleculares. Los resultados aquí presentados permitirán diseñar estrategias para la caracterización genética exhaustiva del banco y sentar las bases para el desarrollo de estudios de mapeo por asociación para el carácter de tolerancia a déficit hídrico.

Abstract:
Seed banks offer a valuable source of alelic diversity for crop genetic improvement. For genetic resources to reach their maximum utilty, the phenotypic characterization of the conserved materials (abiotic and biotic stress resistance, chemical indices, nutritional quality and yield, among others), must be accompanied by their genetic characterization. The genetic composition at the molecular level is the best indicator of the genetic potential of the bank´s accessions. The aims of this study were: a) to asses the genetic diversity of a set sunflower accessions preserved at the Active Germplasm Bank of INTA Manfredi (AGB-IM), b) to assess the polymorphisms distribution and population structure, c) to study the consistence between two methods for the evaluation of drought tolerance, and d) to study the nucleotide diversity of candidates regions for drought tolerance in a set of lines from the corresponding breeding program. For the first goal, a total of 337 individuals corresponding to 21 accessions encompassing a wide range of geographic origins and breeding programmes were selected for analysis. These accessions include inbreed lines, cultivated populations and compounds used in sunflower breeding programs of INTA and they are representative of the morphological diversity spectrum conserved at the AGB-IM, as confirmed by cluster analysis of a more comprehensive set of accessions. Molecular characterization was conducted using 16 microsatellite markers of known genomic location representing different linkage groups. The 16 loci used in the analysis were polymorphic and revealed a total of 108 alleles. The average gene diversity was 0,29 and the average number of alleles per locus was 6,75. Gene diversity indices varied from 0,476 to 0,054, with population Prao-co and line F-164 showing the highest and lowest values, respectively. The mean number of allele per locus ranged from 3 to 16. As expected for breeding materials, departures from Hardy-Weinberg proportions were observed in 100% of populations (8) and 83,3% of composites (5 of 6) studied, with most loci exhibiting an excess of 6 homozygotes. Global estimates of FST revealed very high and statistically significant levels of differentiation among accessions (FST=0,413, p< 0,05). Inference of population structure was also performed using a bayesian model based approach. The number of gene pools showing the highest likelihood was 14. Individuals from all accessions were admixed, with different proportions of the inferred gene pools contributing to their genomic constitution. Prao-co cultivated population exhibited the highest levels of admixture and showed evidence of several gene pools contributing to their genomes. The mannitol test proved to be a reliable and potentially useful method for the screening of drought tolerance in sunflower. Analysis of nucleotide diversity in seven candidate genes (Hahb4-p, Hahb4, Suntip, FB, HaL1L, HaDhn1 and CK) revealed an average SNP frequency of 1/48,3 bp and an average nucleotide diversity (Өw) of 0,00501. A high level of LD was obtained for all the regions (r2=0,88 at 900 pb) except for Suntip where LD decays to r2=0,325 at 207 pb and HaDhn1 where LD decays to r2=0,249 at 78 pb. Suntip and HaDhn1 are the most promising regions for association mapping, while Hahb4, Hahb4-p, FB y HaL1L are interesting for future studies of association mapping with a larger set of lines, because they showed possible incidence of selective process. This work allowed characterizing a set of AGB-IM accessions at the molecular level based on neutral and functional markers. This information will also be useful for genetic resources management, germplasm selection, association mapping studies and plant breeding programs.

Chaneton, Luciano. "Nuevos enfoques en el diagnóstico, prevención y tratamiento de la mastitis bovina a través del uso de moléculas con acción antimicrobiana" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo de esta tesis fue caracterizar el papel de lactoferrina (LF) y otros factores solubles endógenos, en la defensa de la glándula mamaria contra la infección. También, se buscó analizar la potencial aplicación de estos elementos para el diagnóstico y la predicción de la mastitis bovina y para la generación de ganado resistente a esta enfermedad. Para abordar estos objetivos se realizaron estudios bioquímicos, microbiológicos y epidemiológicos que se presentan en 4 apartados de resultados. En el primer apartado de resultados se propuso estudiar la relación entre el incremento de los niveles de LF asociados a la infección intramamaria y el agente causal involucrado. Los resultados obtenidos muestran que la concentración de LF aumenta con la infección clínica o subclínica y que la infección con Streptococcus uberis está asociada a mayores niveles de LF en leche. Además se demostró que Strep. uberis es capaz de inducir la síntesis de LF in vitro y que este microorganismos es resistente a LF, lo que estaría indicando una asociación entre la respuesta mediada por LF a la infección y la sensibilidad a LF de los patógenos. En el segundo apartado de resultados se profundizaron los hallazgos del primero realizando un estudio de cohorte de 80 vacas durante una lactancia completa. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la respuesta de LF es mayor en los primeros días de lactancia; que los cuartos mamarios positivos para infecciones presentan también concentraciones de LF aumentadas antes y después de la infección y que cuartos con mayores concentraciones de LF durante el periparto presentan mayor riesgo de infectarse durante la lactancia. En el tercer apartado de resultados se analizó la actividad antimicrobiana de β- lactoglobulina (β-LG) sobre bacterias causantes de mastitis. Se demostró que β-LG inhibe el crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus y Strep. uberis pero no el de Escherichia coli en forma dosis dependiente. Este espectro de inhibición parece complementario al de LF. Además, se hallaron diferencias de actividad específica entre dos variantes alélicas de β-LG: β- LG A y β-LG. Por último se demostró que LF y β-LG pueden actuar en conjunto para inhibir el crecimiento de Strep. uberis y Staph. aureus. En el cuarto apartado de resultados se realizaron digestiones enzimáticas de LF y los péptidos obtenidos fueron caracterizados bioquímica y microbiológicamente. Uno de estos péptidos, identificado como la molécula lactoferricina (LFcin), presentó mayor actividad antimicrobiana que LF y una cinética de inhibición diferente. El péptido LFcin fue expresado en forma recombinante como proteína de fusión con β-LG en células CHO. Esta proteína quimérica demostró alta actividad antimicrobiana contra Staph. aureus y Strep. uberis pero no contra E. coli. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de tesis aportan información relevante sobre el papel de LF y β-LG en la infección intramamaria y sobre la potencial aplicación diagnóstica y terapéutica de estos elementos.

Abstract:
The aim of this thesis was to characterize the role of lactoferrin (LF) and other soluble factors in the defense of the mammary gland against infections. Additionally, we aimed to analyze the potential application of these elements in the diagnosis and prediction of bovine mastitis and in the generation of disease resistant cattle. To address these objectives we carried out biochemical, microbiological and epidemiological studies that are presented in 4 sections of results. In the first section we examined the relationship between the increase in LF levels associated with intramammary infection and the involved etiologic agent. Our results showed that the LF concentration increases upon clinical or subclinical infection and that infection with Streptococcus uberis is associated with the highest levels of LF in milk. We also showed that the challenge with Strep. uberis induced the synthesis of LF in vitro and that this microorganism is resistant to LF which suggests an association between infection response mediated by LF and pathogen susceptibility to this protein. In the second section, we extended the findings made in section 1. To do that, we carried out a longitudinal study over 80 cows during a complete lactation. The results indicated that: 1) LF response to infection is greater in the early days of lactation than in later stages. 2) infected quarters presented augmented levels of LF at sample times before and after the time of infection 3) quarters with higher concentrations of LF during peripartum presented increased risk of becoming infected afterwards. In the third section we analyzed the antimicrobial activity of β-lactoglobulin (β-LG) towards mastitis-causing bacteria. We demonstrated that β-LG inhibits the growth of Staphylococcus aureus and Strep. uberis but not Escherichia coli in a dose-dependent manner. This inhibition spectrum was complementary to the observed for LF. We also found differences in specific activity between two allelic variants of β-LG: β-LG A and β-LG. Finally, we showed that LF and β-LG can act together to inhibit the growth of Strep. uberis and Staph. aureus. In the fourth section, we performed enzymatic digestions of LF and the resulting peptides were characterized by means of biochemical and microbiological methods. One of the peptides obtained, identified as the molecule lactoferricin (LFcin), showed higher antimicrobial activity and different inhibition kinetics compared to LF. LFcin was expressed as a recombinant fusion protein with β-LG. When expressed in CHO cells, this chimeric protein showed high antimicrobial activity against Staph. aureus and Strep. uberis but not against E. coli. Overall, the results presented in this thesis provide relevant information on the role of LF and β-LG in intramammary infection and on the potential application of these molecules in the fight against bovine mastitis.

Petrigh, Romina Sandra. "Identificación y caracterización de antígenos de Babesia bigemina" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los protozoarios intraeritrocitarios Babesia bovis y Babesia bigemina son los agentes causales de la babesiosis bovina, una enfermedad transmitida por la garrapata Rhipicephalus microplus que provoca importantes pérdidas económicas a la ganadería en áreas enzoóticas. En tal sentido resulta de gran relevancia la identificación de genes y la caracterización de proteínas para el desarrollo de pruebas diagnósticas de elevada sensibilidad y especificidad y el diseño racional de vacunas. En este trabajo, hemos desarrollado un método de detección molecular de B. bigemina, basado en la amplificación del gen rap-1a, útil para el estudio epidemiológico de la babesiosis bovina en áreas enzoóticas. La PCR en un solo paso, resultó altamente específica detectando 0,00002% de parasitemia. Por otra parte, para la identificación de nuevos antígenos de B. bigemina, se aplicaron dos estrategias: proteómica y herramientas de genómica comparativa. A través de la aproximación proteómica logramos extraer y separar en geles de dos dimensiones las proteínas solubles del estadio de merozoíto de B. bigemina que fueron reconocidas por sueros de bovinos infectados. A partir de las secuencias disponibles del proyecto genoma de B. bigemina y en base a la información proveniente de los genomas anotados de otros apicomplejos, pudimos identificar, anotar y caracterizar una familia de ocho genes que codifican para proteínas del tipo perforina (PLP) con el dominio de ataque a membrana MACPF en B. bigemina. Además se demostró que si bien todos los genes plp se transcriben en el estadio intraeritrocitario, particularmente los genes plpb y plpe presentan una tasa transcripcional significativamente mas alta indicando su importancia en este estadio. Asimismo, el reconocimiento de la proteína PLPA por los sueros bovinos infectados puede ser considerado como un indicio de la participación de esta proteína en la salida del parásito del eritrocito. Este trabajo de tesis contribuye al estudio de la babesiosis bovina a través del desarrollo de herramientas de diagnóstico y de la identificación de genes implicados en los mecanismos moleculares que median la interacción parásito-hospedador.

Abstract:
The intraerythrocytic Protozoan, Babesia bovis and Babesia bigemina, are causal agents of bovine babesiosis, a tick-borne disease trasmitted by Rhipicephalus microplus that cause important economic losses to livestock in areas where the disease is enzootic. In this regard is important the gene identification and protein characterization in order to develop highly sensitive and specific diagnostic methods and rational vaccines. In this work, we developed a molecular test, based on rap-1a gene amplification, for B. bigemina detection, a useful tool for epidemiological studies of babesiosis in enzootic areas. The one-step PCR assay was highly especific and sensitive detecting up to 0.00002% of parasitemia. Moreover, to identify relevant B. bigemina proteins to the development of methods of diagnosis and control of babesiosis, we applied two strategies: proteomic and comparative genomic tools. In the proteomic aproach we could purify and separate B. bigemina merozoites proteins using two dimensional gels and detecting immunodominant proteis using bovine sera. The bioinformatic tools applied to the available sequences of the B. bigemina genome project based on data from the annotated genomes of other apicomplexans, allowed us to identify, annotate and characterize a perforin-like proteins family (PLP) in B. bigemina containing a membrane-attack complex domain (MACPF). Transcriptional studies showed that while all plp genes are transcribed in the intraerythrocytic stage, particularly plpe and plpb genes have a significantly higher transcriptional rate, which may suggest its possible role in intraerythrocytic stage. Furthermore, PLPA recognition of bovine sera from animals infected can also be considered as an indication of the involvement of this protein in the exit of the parasite erythrocyte. This thesis work, contributes to the study of bovine babesiosis through the development of diagnostic tools and the identification of genes involved in the molecular mechanisms that mediate the parasite-host cell interaction.

Lucca, A. María Florencia. "Búsqueda de genes candidatos que controlen QTLs involucrados en la resistencia al estrés hídrico mediante el análisis de perfiles transcripcionales en especies silvestres de Solanum" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La papa (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) es el tercer cultivo más importante y la dicotiledónea de mayor importancia en la alimentación. El estrés hídrico es la mayor limitante de la producción. En respuesta a la sequía las plantas activan estrategias que involucran adaptaciones morfológicas, fisiológicas y bioquímicas controladas por un número de genes aditivos y en muchas ocasiones sinérgicos. Esta tesis se focalizó en el análisis de los cambios transcripcionales de las especies silvestres de Solanum: S. venturii (VNT) y S. cardiophyllum (CPH) que presentan comportamientos contrastantes frente al estrés hídrico mediante hibridación con micromatrices de ADNc. Se analizaron 1.033.250 datos de expresión de 32 soportes de cristal de papa, que monitorearon 10 días de evolución del estrés. El análisis bioinformático de los datos de expresión de estas especies arrojó diferencias significativas en los perfiles transcripcionales. El análisis comparativo de estos perfiles reveló que en CPH se ven afectados por el tratamiento de sequía un total de 235 genes, mientras que en VNT la diferenciación involucra 4133 genes. Ambas especies presentan una expresión de 151 genes comunes. Los genes expresados diferencialmente no solo variaron en el número sino también en sus perfiles temporales de expresión. Los genes diferencialmente expresados como respuesta al tratamiento tendieron a agruparse mostrando comportamientos particulares en ambas especies. En CPH, los perfiles de expresión permitieron identificar al menos 5 conglomerados que resumen las principales tendencias del comportamiento de los transcriptos frente al estrés, mientras que en VNT la dinámica de expresión mostró expresiones contrastantes y agrupadas, que sugieren una regulación común sincrónica, confirmando la diversidad genética de respuestas en el germoplasma de especies silvestres de papa. Estas diferencias de expresión entre las especies silvestres de papa sugieren nuevas vías para explotar la variabilidad genética del germoplasma silvestre para el mejoramiento del cultivo. La información generada brinda interesantes genes candidatos involucrados en respuesta al estrés hídrico a la vez que permite identificar secuencias para el desarrollo de marcadores funcionales útiles en programas de mejoramiento asistido.

Abstract:
The potato is the third most important crop and the most relevance dicot in feeding. Water stress is the greatest limitation of production. In response to drought, plant triggers strategies that involve morphological, physiological and biochemical changes controlled by a number of additive genes and often synergistic. This Thesis focused on the analysis of transcriptional profiling on Solanum wild species: S. venturii (VNT) and S. cardiophyllum (CPH) that present contrasting behavior under water stress using cDNA microarray hybridizations. We analyzed 1,033,250 expression data of 32 potato chips, which monitored 10 days of stress treatment. Bioinformatic analysis of expression data of wild species showed significant differences in transcriptional profiles. The comparative analysis of these profiles revealed that CPH differentially expressed under drought 235 genes, while VNT involves 4133 differentially genes. Both species have a common expression of 151 genes. Differentially expressed genes vary not only in number but also in their temporal expression profiles. The genes differentially expressed in response to stress tended to cluster following a particular behaviors in both species. In CPH, the expression profiles helped to identify at least 5 clusters that summarize the main trends of behavior of the transcripts under stress, while the dynamics of expression in VNT showed contrasting clustered patterns, suggesting a common regulation synchronously, confirming the genetic diversity of wild potato species responses. These differences in expression between wild potato species suggest new ways to exploit the genetic variability of wild germplasm for crop breeding. The information generated provides interesting candidate genes involved in response to water stress as well as to identify sequences for the development of useful functional Marker Aided Selection (MAS) in Plant Breeding programs.

Parody, Betiana Paula. "Caracterización espacial y temporal de la estructura genética del primer insecto blanco del maíz transgénico Bt en Argentina, el barrenador Diatraea saccharalis (Fabricius)" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Durante la última década, distintos eventos de maíz transgénico resistente a insectos (maíz Bt) han sido cultivados extensamente en la Argentina. La principal plaga blanco de los primeros eventos de maíz Bt en Argentina ha sido el barrenador del tallo, Diatraea saccharalis (F.) (Crambidae). La eficacia de estos eventos puede verse limitada por la capacidad de los insectos blanco de desarrollar resistencia. La evolución de la resistencia de los insectos a los cultivos Bt depende de muchos factores biológicos, ambientales y genéticos, como la estructura genética espacial de las poblaciones de los insectos blanco, y el flujo génico entre las poblaciones. En Argentina, la CONABIA propicia un plan de manejo de la resistencia de insectos al maíz Bt, el cual es cumplimentado por las compañías semilleras por medio de programas de monitoreo. Hasta el momento, en Argentina, no se ha documentado la aparición de resistencia en poblaciones de campo de D. saccharalis. Aún no se ha investigado la genética las poblaciones del barrenador a fin de entender la estructura genética espacial de esta especie. La estructura genética del insecto blanco del cultivo Bt puede ser una información útil a la hora de determinar las unidades de monitoreo. En este contexto, el principal objeto de la investigación aquí presentada fue el estudio de la estructura genética espacial y temporal de las poblaciones de Diatraea saccharalis para aportar conocimiento sobre esta especie en un contexto de ecología molecular. Se colectaron muestras de poblaciones de D. saccharalis de varias localidades de nuestro país, incluyendo regiones con diferente perfil agroproductivo y relieve geográfico, desde el Noroeste argentino hasta el sur de la provincia de Buenos Aires, incluyendo varias localidades de la región maicera central. También se estudió la posibilidad de existencia de razas asociadas a los diferentes cultivos hospedadores en simpatría y la evolución de los parámetros genético-poblacionales durante un continuo de ocho generaciones a lo largo de dos campañas agrícolas en una misma localidad. Debido a la falta de estudios genéticos previos sobre esta especie, se utilizaron marcadores moleculares RAPD, AFLP y secuencias mitocondriales (COI) en un contexto de genética del paisaje y análisis filogeográfico. El estudio filogeográfico se realizó con el objetivo de discernir si la baja diferenciación genética detectada entre las poblaciones en un rango geográfico tan grande se podría deber a causas pasadas o presentes. Finalmente se analizó la variación en la estructura genética de las poblaciones entre el año 2005 y el 2009 en función de los cambios en la diversidad y en la diferenciación de cada localidad en dicho período de tiempo. Los resultados sugieren que el nivel de estructura genética es bajo con los marcadores nucleares utilizados y la mayor parte de la diversidad genética se encuentra al nivel individual dentro de las poblaciones. A nivel nuclear también se detectó un buen ajuste al modelo genético espacial de aislamiento por distancia en el rango geografico estudiado. No se detectó diferenciación genética entre los grupos de insectos que se desarrollaron simpátricamente sobre hospedadores diferentes. En el contexto de la evolución de la resistencia al maíz Bt, la falta de diferenciación entre hospedadores sugeriría que no habría restricciones para el apareamiento aleatorio entre individuos provenientes de diferentes cultivos hospedadores, pudiendo estar funcionando en el campo estos cultivos no Bt como refugios no estructurales. La variación temporal de la estructura genética a nivel generacional durante dos campañas agrícolas mostró un patrón relacionado a la densidad poblacional, con valores máximos en la última generación estival y mínimos luego del invierno. El análisis filogeográfico detectó una posible expansión demográfica reciente y que las poblaciones estudiadas compartirían el mismo tiempo al ancestro común más reciente, y con una alta migración desde la región núcleo hacia el sur de Buenos Aires. Por lo tanto, los altos niveles de conectividad entre las poblaciones podrían ser el resultado mayoritariamente de la expansión poblacional reciente, y en menor escala del flujo génico actual dado por la vagilidad de la especie y por posibles migraciones pasivas asociadas a la actividad agrícola. En el período comprendido entre el año 2005 y 2009, no se detectaron cambios biológicamente significativos en la estructura genética de la especie a nivel país, acorde a la evolución de los parámetros de diversidad y diferenciación genética.

Abstract:
Different events of transgenic insect resistant maize (Bt corn) have been grown extensively across Argentina during the last decade. The main lepidopteran target pest of Bt corn in this country is the sugarcane borer, Diatraea saccharalis (F.) (Crambidae). The efficacy of these transgenic events might be limited by the capacity of the target insect to develop resistance. The evolution of insect resistance to Bt crops depends on many different biological, environmental and genetic factors, such as insect population structure and gene flow among populations. In Argentina, an insect resistance management plan for Bt corn is encouraged by the Regulatory Agency (CONABIA) and complied with by the seed companies by means of a monitoring program. So far, no resistance has been documented for field populations of D. saccharalis in this country. Additionally, there has been no research into the genetics of the local sugarcane borer populations intended to understand the genetic structure of this species. The genetic structure of a Bt-crop target insect might be useful information for the determination of the monitoring units. In this context, the main object of the research presented here was to study the spatial and temporal population genetic structure of this target insect in a molecular ecology framework. Samples of Diatraea saccharalis populations were collected from several locations along the country, including regions with different agricultural practices and geography, from the northwestern province of Salta to the southern region of the province of Buenos Aires, covering several corn producing locations. Additional studies were carried out in one location to determine whether this species presents host-races and to evaluate the variation of genetic parameters along eight consecutive generations during two cropping seasons. Due to the lack of previous genetic studies on this species, RAPD, AFLP and mitochondrial sequences (COI) were used as molecular markers for landscape genetics and phylogeographic analysis. The phylogeographic analysis was performed to understand the possible historical demographical reasons that might have still an impact on the genetic structure of this species. The last study was carried out to characterize the temporal variation in the genetic structure of D. saccharalis from 2005 to 2009 in all the locations included in the spatial analysis. The results obtained using molecular markers (AFLP) suggest that the level of genetic structure is low and that most of the genetic diversity is at the individual level within populations. These markers also determined a good fit to the model of isolation by distance at the spatial range studied. No genetic differentiation was detected among groups of insects which develop on different hosts. In the context of resistance evolution, the lack of host race differentiation would suggest no mating restriction for insects developing on different crops in neighboring fields, which are considered as functional non-structural refuges. The temporal variation of genetic structure for the continuous of eight generations within one location demonstrated that the diversity levels are associated with population density levels, highest in the last summer generation and lowest after the wintering period. The phylogeogrphic analysis detected a recent demographic and range expansion event, probably a common genetic pool as ancestry for all the populations included in this study and high levels of gene flow from the corn-belt region to the southern region. Therefore, the high level of connectivity among the populations might be mainly the result of the recent expansion, and as a second and minor reason for high correlation among populations, current gene flow restricted by the vagility of this species could be also be probable at the short distance together with some low level of long distance dispersal associated with agricultural practices. No biologically significant changes were detected for the temporal genetic study from 2005 to 2009 based on diversity and differentiation parameters.

Farroni, Abel Eduardo. "Transformaciones estructurales y físico-químicas de maíces argentinos en la producción de alimentos obtenidos por procesos de gelatinización-laminación" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El objetivo del presente trabajo fue analizar y caracterizar los factores involucrados en las transformaciones estructurales y físico-químicas de maíces argentinos de tipo colorado duro que determinan la calidad de productos obtenidos por procesos de gelatinización-laminación. Se estudiaron muestras tomadas de distintas etapas del proceso de producción industrial de copos de maíz comerciales que incluyeron desde la materia prima hasta el producto final. Además se analizaron sistemas modelo producidos en el laboratorio para estudiar la influencia de la formulación en el proceso de cocción. Se generó un mapa completo de los cambios de fase y estado que se produjeron a lo largo del proceso industrial mediante diagramas de estado suplementados y el estudio de la movilidad molecular. Se observó un efecto antiplastificante del agua, detectado al estudiar las propiedades mecánicas y los atributos sensoriales de los copos de maíz en función del contenido de agua. Los cambios más importantes en la textura producidos por la absorción de agua se observaron en el estado vítreo, indicando que el agua límite de hidratación es un mejor indicador de estabilidad que la Tg para estos sistemas. La correlación entre la generación de pigmentos y la apariencia visual de las muestras fue afectada por los procesos que afectan la transparencia como los cambios de forma y la generación y destrucción de interfases. Los diagramas de estado y las técnicas de medición no destructivas relacionadas a los marcadores químicos junto al modelado del efecto del agua en las propiedades texturales pueden utilizarse como herramientas para el diseño de procesos, desarrollo de productos y el control de su estabilidad. Se establecieron parámetros que podrían emplearse en e control de proceso o en el producto final para garantizar atributos de calidad.

Abstract:
The objective of the present work was to analyze and characterize factors involved in structural and physicochemical transformations of argentine red flint corn which have impact on quality of food obtained by using gelatinization-lamination process. Samples from selected industrial process steps which included from raw materials to finished products were taken from cornflake production line. Model systems were cooked in the laboratory to study formulation effects on cooking process. Supplemented state diagrams generated and molecular mobility studies allowed to generate a complete map of phase and state changes that took place along the industrial process. Mechanical properties and sensory attributes of corn flakes were characterized as a function of water content. Antiplasticizing effect of water was detected both sensory and instrumentally. Important texture changes upon water absorption were observed when the samples were still in glassy state indicating that, for these samples, hydration limit is a better stability indicator than Tg. The correlation between pigment concentration and visual appearance was affected by shape and transparency changes, mainly due to generation or disappearance of inter-phases. Supplemented state diagrams and non destructive measurements techniques that correlate to chemical markers, along with water effect modeling on textural properties can be used as useful tools in process design, product development and stability control.

Acuña, Cintia Vanesa. "Desarrollo de marcadores funcionales y evaluación de la diversidad genética en Eucalyptus globulus con énfasis en genes potencialmente involucrados en características de calidad de la madera" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Eucalyptus globulus es la especie forestal con mejor aptitud papelera y para la obtención de bioenergía a partir de celulosa, mayormente plantada en regiones templadas del mundo. Los proyectos genómicos en Eucalyptus han incrementado el número de secuencias disponibles en los bancos de datos públicos. Los marcadores funcionales públicos, si bien son frecuentes en diferentes cultivos, son aún escasos en especies forestales. De allí la importancia de la búsqueda y validación de regiones SSRs en genes de interés, para ser utilizados en futuros proyectos de mejoramiento asistido por marcadores (marker assisted breeding). En este estudio, se identificaron secuencias no redundantes de ADN de Eucalyptus (genómicas y ESTs) depositadas en bancos de datos públicos para revelar secuencias microsatélites y predecir, in silico, su función putativa. Éstas fueron luego validadas en laboratorio para predecir su potencial uso en análisis de diversidad genética. A partir de 12.690 ESTs de Eucalyptus globulus publicados en NCBI se identificaron 4.924 secuencias no redundantes. De éstas, 952 unigenes (19,3%) contenían 1.140 regiones SSR. Luego del análisis bioinformático de estos EST-SSRs, se diseñaron 979 oligonucleótidos novedosos y se predijo su función putativa, incluyendo categorías Gene Ontology (GO) según su proceso biológico, función molecular y componente celular. Se identificaron así 29 SSRs en 24 genes candidatos (estructurales y reguladores) para calidad de madera. Los SSRs se encontraron en promotores, intrones y exones de genes candidatos (GC) de distintas rutas metabólicas (biosíntesis del fenilpropanoico, biosíntesis de celulosa, metabolismo de hemicelulosas, ruta metabólica del shikimato, metabolismo de la metionina y genes de tubulinas y el factor de transcripción LIM1). Un total de 85 SSRs (56 EST-SSRs y 29 SSRs incluídos en GC) hallados en este trabajo fueron analizados para su validación en 8 genotipos de E. globulus, resultando positivos un 65%. A partir de esta validación se obtuvieron 17 EST-SSRs y 12 GC-SSRs polimórficos. Con éstos se estimaron los valores de diversidad en una muestra de 60 individuos no emparentados de E. globulus representantes de seis razas que cubren el rango de distribución natural de la especie. Los valores de PIC, Ho y UHe variaron ampliamente entre aproximadamente 0,02 y 0,9, mientras que el número de alelos varió entre 2 y 16, con un promedio de 7,55. Al realizar el test de Equilibrio de Hardy Weinberg (EHW) para los 29 loci, se encontró que 14 de ellos mostraron un significante déficit de heterocigotas (P<0,01). Este desvío del EHW podría explicarse por la presencia de subestructura poblacional y a la presencia de alelos nulos que sesgó las estimaciones de las frecuencias alélicas. Se realizó el estudio de transferibilidad de 49 loci (37 EST-SSRs validados (polimórficos y monomórficos) y los 12 GC-SSRs polimórficos) a otras seis especies de Eucalyptus (E. camaldulensis, E. dunnii, E. grandis, E. saligna, E. tereticornis y E. viminalis). Se encontró que 33 marcadores amplificaron en las seis especies estudiadas y seis en al menos cinco, mostrando la alta transferiblidad de los mismos. Finalmente, el estudio del polimorfismo y transferibilidad de los marcadores funcionales, permitió la selección de un conjunto de 13 (7 EST-SSRs y 6 GC-SSRs) altamente informativos y transferibles a otras seis especies de Eucalyptus. El conjunto de marcadores desarrollados son altamente informativos tendrán un uso potencial en estudios de diversidad genética, taxonomía, mapeo de QTL y en facilitar, en un futuro, la selección asistida en el mejoramiento de Eucalyptus.

Abstract:
Eucalyptus globulus is the most planted hardwood species for pulpwood in temperate regions. Genomic researches in Eucalyptus have increased the information available in DNA sequence`s public databases. Functional genetic markers, while frequent in crop, are still scarce in forest species. Hence the detection and validation of SSRs in interesting genes to be used in future projects of marker-assisted breeding are needed. Here, Eucalyptus DNA sequences (genomics and ESTs) from public databases were screened to identify non redundant sequences, to discover microsatellite sequences and to in silico predict putative gene functions. These were also validated in wet lab to predict their potential for functional genetic diversity analysis. From 12,690 updated E. globulus EST database published in National Center for Biotechnology Information a total of 4,924 non-redundant sequences were identified. From these ones, 952 unigenes (19.3 %) contained 1,140 SSRs. A new set of 979 primers were designed for putative SSR-markers after bioinformatic analysis. The predicted functions of these EST-SSRs were adjudged, including biological process, molecular function and cellular component Gene Ontology (GO) categories. Twenty four structural and regulatory candidate genes for wood quality carrying 29 SSR were indentified. Microsatellite sequences were located in promoters, introns and exons from candidate genes (CG) from: phenylpropanoid biosynthesis, cellulose biosynthetic process, hemicellulose metabolism, shikimate pathway, methionine metabolism, tubulin genes and the transcriptor factor LIM1. Sixty five percent out of a total of 85 SSR (56 EST-SSRs and 29 SSR containg GC) detected in this work were validated for actual PCR amplification of tree DNA samples in eight genotypes of E. globulus. From this assessment a total of 17 polymorphic EST-SSRs and 12 polymorphic CG-SSRs markers were obtained. These ones were selected for further analyses, so as to accurately estimate genetic information content in a larger sample of 60 non related trees represented major geographical races of the species’ natural distribution. PIC, Ho and UHe values varied over a wide range from around 0.02 to 0.9, whereas the allele number ranged from 2 to 16, with and average of 7.55. Fourteen out of the 29 loci tested showed significant deviation from Hardy Weinberg Equilibrium (HWE) showing a significant deficit of heterozygotes (P <0.01). This deviation from HWE could be explained by the presence of substructure population and the presence of null alleles that biased estimates of allele frequencies. A set of 49 loci (37 validated EST-SSRs (polymorphic and monomorphic) and 12 polymorphic CG-SSRs) were also tested for cross-transferability to other six Eucalyptus species (E. grandis, E. saligna, E. dunnii, E. viminalis, E. camaldulensis, E. tereticornis). A total of 33 out of the 49 validated markers in E. globulus amplified in the six other species and six markers amplified in at least other five. Finally, the analyses of polymorphism and transferability of functional markers, enabled the selection of a set of 13 (7 EST-SSRs and 6 GC-SSRs) highly informative and transferable to other six species of Eucalyptus. The set of highly informative markers developed here will have potential use in studies of genetic diversity, taxonomy, gene mapping and will help the improvement of Eucalyptus trough the assisted selection.

Crocco, Melisa Candela de los Angeles. "Suero en el medio de cultivo: actividad celular de embriones mantenidos in vitro en estadios iniciales de clivaje" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El cultivo de embriones en medio suplementado con suero se utiliza durante el desarrollo parcial o total de embriones producidos in vitro (PIV). Este suplemento de composición compleja y variable se ha asociado con un alto grado de alteraciones de la estructura mitocondrial que provocaría una deficiente utilización y posterior acumulación de lípidos, respecto del medio sin suero. En esta tesis, se evaluó esta asociación y se determinó el día de desarrollo en que la adición de suero al medio produce menores daños mitocondriales en embriones bovinos. El estudio de la ultraestructura mitocondrial en estadios iniciales de clivaje de embriones bovinos in vitro permitió completar la información disponible sobre la estructura de la organela, e interpretar el efecto del medio de cultivo sobre la organela. No se encontraron indicios que atribuyan al suero el daño mitocondrial morfológico in vitro, en embriones bovinos de 2 a 16 células. Se encontraron en cambio, modificaciones que podrían ser ventajosas para el desarrollo embrionario cuando la adición del suero al medio de cultivo se produce en el día 3 de desarrollo. Como alternativa procedimental al cultivo de embriones en medio con suero, en esta tesis se estudiaron el crecimiento y la adhesión de embriones y ovocitos humanos, en condiciones libres de suero y de productos animales. El cultivo de embriones en medio definido sin suero es de enorme interés en humanos, pues de él depende el desarrollo de líneas de células troncales embrionarias humanas (CTEh) con grado clínico. En este sentido, se emplearon condiciones de mínima complejidad durante el proceso de derivación de células troncales de grado clínico, utilizando una matriz de fibronectina como sustrato y medio de cultivo sin suero.

Abstract:
Serum-supplemented medium are used during the partial or complete development of in vitro produced (IVP) embryos. This supplement of complex and variable composition has been associated with a high degree of alterations of mitochondrial structure that would cause a poor use and accumulation of lipids, compared with the non-serum medium. The main objective of this thesis is to study this association and to state the day in which serum should be added in order to cause the minimum amount of mitochondrial damages in bovine embryos. The study on mitochondrial ultra-structure in early cleavage stages of in vitro bovine embryos, allowed us to complete the already available information about the organelles´ structure, understanding the effect that the culture medium has on the organelle. No evidence has been found to support the hypothesis that the serum damaged in vitro mitochondrial morphology in 2 to 16 cells stages bovine embryos. However, we have found changes that might be advantageous for the embryonic development when the addition of serum to the culture medium occurs in day 3 of this process. As an alternative to the embryo cultured in a serum-supplemented medium, in this thesis we studied human embryos and oocytes growth and adhesion free of animal products and serum. Embryos cultured in a serum free media are of great interest, because of it depends the human embryonic stem cells (hESC) development, with clinical grade. Therefore, minimum complexity conditions were used during the derivation process of clinical grade stem cells, using a fibronectin matrix as substrate and serum-free culture medium.

Módena, Natalia A.. "Estudios sobre la fosforilación de la proteína de movimiento TGBp1 del Potato Virus X" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas, miembro tipo del género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para el movimiento viral de célula a célula en la planta hospedera. Diferentes líneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puede regular la replicación y el movimiento viral. En este estudio, se demostró que la proteína TGBp1 es fosforilada por al menos una proteína quinasa, presente en extractos de plantas de Nicotiana tabacum infectadas con PVX y no infectadas, que posee características distintivas de la caseína quinasa 2 (CK2). El análisis en geles bidimensionales de extractos de plantas infectadas permitió determinar que la proteína TGBp1 producida durante la infección viral presenta múltiples isoformas de diferentes puntos isoeléctricos; el tratamiento con fosfatasas de los extractos de plantas infectadas indicó la presencia de isoformas fosforiladas. A través de la combinación de estudios de determinación de aminoácidos fosforilados por espectrometría de masa, comparación de secuencias aminoacídicas de TGBp1 de distintos virus y evaluación de la fosforilación in vitro de mutantes puntuales y de deleción de la proteína TGBp1, se identificaron tres probables sitios de fosforilación por la quinasa CK2 de N. tabacum: S-165, T-193, T-214. Se observó que la simulación de la fosforilación en los residuos T-193 y T-214 regula negativamente la dispersión viral y la capacidad de la proteína TGBp1 de hidrolizar ATP. Los resultados sugieren firmemente que una proteína quinasa de la familia de CK2 estaría involucrada en la fosforilación de TGBp1 durante el curso de la infección viral de N. tabacum. Además, se discute el modo en que la fosforilación podría regular las actividades de la proteína TGBp1 durante la infección viral.

Abstract:
Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome is based on a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movement proteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capside protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside the host plant. Recent work on other plant viruses has indicated that viral proteins phosphorylation by host kinases can regulate processes such us viral replication and mobilization. The results obtained during this Thesis work show that TGBp1 is phosphorylated by at least one kinase protein with properties characteristic of Caseinkinase 2 (CK2). This kinase activity is present in crude extracts prepared from both non-infected and PVX infected Nicotiana tabacum plants. Bi-dimensional gel experiments with crude extracts from PVX infected plants showed that TGBp1 expressed during infection presented several isoforms with different Isoelectrical points. Some of these isoforms were sensitive to phosphatase treatment, suggesting that TGBp1 is phosphorylated in multiple residues. Several experimental approaches (mass spectrometer identification of phosphorylated aminoacids, sequence comparison among TGBp1 homologues from several viruses, and in vitro phosphorylation experiments with mutated versions of TGBp1), allowed the identification of three potential phosphorylation sites by recombinant alpha subunit N. tabacum CK2: S-165, T-193 and T-214. Mimicking phosphorylation on residues T-193 and T-214 had a negative impact on viral spreading and TGBp1 ATP hydrolysis activity. The results presented in this Thesis strongly suggest that a N. tabacum kinase protein belonging to CK2 family is involved in the phosphorylation of TGBp1 during PVX infection. How the phosphorylation regulates TGBp1 activities is discussed.

Zavallo, Diego. "Aislamiento y caracterización de regiones promotoras de girasol para dirigir la expresión tejido específica de genes foráneos a semilla" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Desde el inicio de la utilización de variedades transgénicas, la superficie agrobiotecnológica ha aumentado exponencialmente, con un incremento del orden de 80 veces en solo 14 años, y su uso se ha expandido a más de veinte especies vegetales. Las ventajas obtenidas con estos cultivos transgénicos de primera generación incluyen: mejor control de insectos y malezas, mayor productividad, y una reducción del uso de agroquímicos. Los avances de la biotecnología en los últimos años permitirán, probablemente en un futuro muy cercano, el desarrollo de cultivos con características de interés para los consumidores, relacionadas con una mejora en la calidad nutritiva.. En este sentido las semillas constituyen un blanco ideal para este tipo de cultivos debido a sus propiedades de dormición, almacenamiento de nutrientes y la capacidad de germinar en condiciones limitantes de nutrientes. En este trabajo, se aislaron las regiones promotoras de tres genes específicos de semillas de girasol (Helianthus annuus L. HA89), que codifican para una proteína de transferencia de lípidos (HaAP10), una oleato desaturasa (HaFAD2-1) y una oleosina (HaOLE), las cuales fueron clonadas y caracterizadas “in silico”. Los fragmentos aislados de 964, 867 y 1838pb respectivamente, contienen en sus secuencias varios motivos específicos de semilla como elementos GCN4, motivos (AACA) y (ACTG), Prolamine-Box, E-Box, G-Box, sitos de unión SEF, Sh1 Box y elementos RY/G repetidos entre otros. A su vez, contienen motivos de respuesta a hormonas ABRE y GARE (ácido abscísico y giberélico) relacionados con desarrollo embrionario. Se realizaron análisis funcionales mediante la fusión de los promotores aislados al gen reportero GUS en plantas transgénicas de Arabidopsis y lechuga. No se observó actividad de la proteína reportera en ningún tejido vegetativo exceptuando los cotiledones de plántulas pequeñas. Al ser analizados a lo largo del desarrollo de la semilla, se observó tinción específica restringida a tejido embrionario. En los ensayos fluorométricos cuantitativos se observó actividad en estadios tardíos del desarrollo, similares a los patrones típicos de genes de reserva, siendo el HaFAD2-1 un promotor con una fuerte actividad especifica de semilla, con niveles similares a los del promotor constitutivo 35S. En este trabajo de tesis se confirmó que las regiones promotoras aisladas dirigen la expresión a semilla en forma específica y fuerte, con diferencias temporales, constituyendo, por lo tanto, importantes herramientas que podrán ser de utilidad en futuras aplicaciones biotecnológicas.

Abstract:
The successful engineering of genetically modified (GM) crops has been increasing exponentially, and its use has been widely extended in more than 20 species. The advantages obtained with this first generation of transgenics include: herbicide and pathogen tolerance, increased productivity and reduction of agrochemical use. Second generation crops will soon bring to the consumers products with better nutritious properties. In this regard, seeds are natural storage organs that accumulate high levels of lipids and proteins and constitute ideal targets for expression of recombinant proteins to increase nutritional contents and to develop molecular farming strategies. Here, we report the isolation and functional characterization of three novel sunflower seed-specific promoters which enconded for a sunflower lipid transfer protein HaAP10, an oleate desaturase HaFAD2-1 and an oleosin HaOLE. The 5’ fragments of 964 bp, 867 bp and 1838 bp respectively, were isolated, cloned and sequenced. Bioinformatic analyses of these sequences allowed the identification of several cis-elements involved in seed-specific transacting factors such as GCN4 motif, AACA motif, ACGT element E-Boxes, SEF binding sites and Sh1 Box. Among them, it is worth mentioning that ABRE and GARE elements which are related to embryo or seed development, were also identified. Putative promoter regions of these three genes were cloned into expression vector, directing the expression of the GUS gene. Arabidopsis thaliana and Letucce plants were transformed with these constructions. No GUS activity was displayed in any vegetative tissue. Although, promoter activity at different seed developmental stages showed GUS expression in embryos and mature seeds. Quantitative fluorometric assays showed activity on late seed developmental stage, similar to seed storage protein patterns, being the HaFAD2-1 a strong specific seed promoter with similar expression level to the 35S constitutive promoter. In this thesis we confirmed that the isolated regions are strong specific seed promoters, with distinct temporal expression patterns. These promoters represent potencial biotechnological tools that may be useful for future biotechnological applications.

Lentz, Ezequiel Matías. "Producción de antígenos y anticuerpos de interés veterinario en plantas transplastómicas de tabaco" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta Tesis Doctoral, se evaluó la factibilidad de utilizar plantas transplastómicas de tabaco (Nicotiana tabacum) para la producción de proteínas de interés en medicina veterinaria: dos antígenos virales y un anticuerpo de camélido de cadena simple (VHH). La primera proteína producida en este sistema consistió en una fusión entre un epítope inmunogénico de la proteina VP1 del virus de la fiebre aftosa y la enzima β-glucuronidasa (VP-βGUS). Se generaron plantas transplastómicas, las cuales fueron caracterizadas a nivel molecular. La proteína heteróloga se acumuló de un modo importante en los cloroplastos de las plantas transformadas: hasta el 51% de las proteínas solubles totales (PST) (8 mg/g de tejido fresco ), conservando su actividad enzimática e inmunogenicidad. Los niveles de expresión observados resultaron claramente mayores a los obtenidos previamente en plantas transgénicas nucleares utilizando la misma construcción. A pesar de estos altos niveles de expresión, el fenotipo de las plantas transplastómicas resultó ser indistinguible del de las plantas wild-type. Esta prueba de concepto con resultados alentadores nos permitió avanzar en la producción de otras moléculas mediante este sistema. El segundo antígeno expresado fue VP8*, una proteína no glicosilada de la cápside de rotavirus bovino (RVB). Se utilizó una versión del vector que permite la acumulación de VP8* en el estroma y se generaron dos construcciones adicionales, una para expresarla como una fusión a la β-glucuronidasa (GUS-E-VP8*), y otra para dirigirla al lúmen de los tilacoides (str- VP8*). VP8* se acumuló como agregados insolubles en el estroma de los cloroplastos y pudo ser solubilizada parcialmente por sonicación. Se obtuvieron extractos de VP8* utilizando la fracción soluble, donde VP8* representaba el 4% de las PST (250 μg/g TF). Al extraerse VP8* a partir de la fracción insoluble sin incluir el paso de sonicación, fue posible enriquecer la preparación en la proteína recombinante, eliminar la nicotina, y mejorar el rendimiento al obtenerse 500 μg/g TF. La proteína VP8* obtenida a partir de ambas fracciones resultó ser inmunogénica y protectiva contra el virus en el modelo del ratón lactante. Las estrategias alternativas para la expresión de VP8* no fueron exitosas. GUS-E-VP8* se acumuló como una proteína soluble en el estroma del cloroplasto, pero en niveles significativamente menores que VP8*. La construcción str-VP8* permitió la translocación de VP8* al lúmen de los tilacoides, pero se observó una proteólisis no esperada de la proteína, y la presencia de una forma truncada de la misma. Estos resultados sugieren que la acumulación de VP8* en el estroma del cloroplasto es favorecida por su insolubilidad, que la protegería del ataque proteolítico. La tercera molécula expresada fue el VHH clon 3B2 dirigido contra un epítope conformacional de la proteína VP6 de RVB. Para la expresión de este nanoanticuerpo también se evaluaron tres estrategias: expresión de VHH en el estroma, redirección al lúmen de los tilacoides (pep- VHH) y fusión a la enzima β-glucuronidasa (GUS-E-VHH). Todas las líneas de plantas transplastómicas expresando VHH mostraron un fenotipo heteroplástico. El análisis molecular confirmó la heteroplastía en líneas que habían sido regeneradas en medio selectivo al menos tres veces. La proteína VHH se acumuló en niveles bajos, los cuales se acercaban al límite de la detección por la técnica de western blot. La expresión se mejoró significativamente tanto en las plantas pep-VHH (2,5% de las PST; 60 μg/g TF) como en las GUS-E-VHH (3% de las PST; 70 μg/g TF), aunque en este último caso se observaron productos de degradación. Las plantas pep-VHH homoplásticas tenían un fenotipo clorótico que se intensificaba con la mayor iluminación. Los resultados obtenidos muestran la dificultad de expresar este VHH en cloroplastos y sugieren un efecto tóxico del transgén. La redirección al lúmen de los tilacoides favorecería la estabilidad de esta proteína heteróloga, lo cual es consistente con su expresión exitosa en E. coli cuando se expresa en el periplasma bacteriano. Los resultados presentados en este trabajo aportan evidencias que promueven el uso y optimización de plantas transplastómicas como biorreactores, para llegar a ser alternativas rentables y concretas de uso en la industria.

Abstract:
In this PhD Thesis, we evaluated the feasibility of using transplastomic plants (Nicotiana tabacum) for the production of proteins of interest in veterinary medicine: two viral antigens and a camelid single-chain antibody (VHH). The first protein produced in this system was a translational fusion of an immunogenic peptide from VP1 of foot-and-mouth disease virus and the enzime β-glucuronidase (VP-βGUS). Transplastomic plants engineered to express the aforementioned construction were characterized at the molecular level. The heterologous protein accumulated up to 51% of the total soluble leaf protein (TSP), or 8 mg/g of fresh tissue (FT), while retaining its enzymatic activity and immunogenicity. The observed expression levels were clearly higher than those obtained previously in nuclear transgenic plants, using the same construction. Despite these high levels of expression, the phenotype of the transplastomic plants was indistinguishable from that of wild-type plants. This proof of concept with encouraging results, allowed us to continue evaluating this system for the production of other recombinant proteins. The second antigen expressed was VP8*, a non-glycosilated capside protein from bovine rotavirus (BRV). Two additional constructions were used to express it in the chloroplast stroma as a β-glucuronidase fusion (GUS-E-VP8*), and to accumulate it in the thylakoid lumen (str- VP8*). VP8* formed insoluble aggregates in the stroma and was partially solubilized by sonication. In the soluble extracts obtained from VP8* transplastomic plants, the recombinant protein represented 4% of the TSP (250 μg/g FT). The insoluble fraction from these plants was highly enriched in VP8*, devoid of nicotine, and contained 500 μg/g FT. The protein from both fractions was immunogenic and conferred protection against the virus in the suckling mouse model. The alternative strategies for VP8* expression were unsuccessful. GUS-E-VP8* accumulated as a soluble protein at barely detectable levels. The construction str-VP8* allowed translocation of VP8* into the thylakoid lumen, but the protein was processed in an unexpected manner. These results suggest that VP8* accumulation in the chloroplast stroma is boosted by its insolubility, which would protect the recombinant protein from proteolytic attack and degradation. The third molecule expressed was the VHH clone 3B2 directed against a conformational epitope of the VP6, an inner capsid protein of BVR. This nanobody was expressed using three strategies: accumulation in the stroma by itself (VHH) or as a fusion to the β-glucuronidase (GUS-E-VHH), and translocation into the thylakoid lumen (pep-VHH). All the transplastomic lines expressing the single-chain antibody presented an heteroplastic phenotype. Southern blot analysis confirmed the heteroplasmy of these plants. In VHH transplastomic plants the protein accumulated at very low levels, almost undetectable by western blot. Expression levels were improved in both pep-VHH (2,5% of TSP; 60 μg/g TF) and GUS-E-VHH plants (3 % of TSP; 70 μg/g TF), but in the latter case degradation products were observed. Homoplastic pep-VHH plants had a chlorotic phenotype, which was more intense when the plants were grown with higher illumination. These results show the difficulty of expressing this VHH in chloroplasts and suggest a toxic effect of the transgen on the plant. The redirection to the lumen of thylakoids favors the stability of the heterologous protein, which is consistent with its successful expression in E. coli when it is directed to the bacterial periplasm. The results presented in this work support the use and optimization of transplastomic plants as biorreactors, in order to become concrete industrial alternatives.

Robredo, Claudio Gabriel. "Caracterización de un segmento del cromosoma seis de una línea de maíz portadora de un Sistema de Letales Balanceados (BLS)" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La línea BLS1A posee un sistema de letales balanceados localizado en las cercanías del centrómero del cromosoma 6 de maíz formado por un gen letal clorofílico estrechamente ligado en fase de repulsión con un gen letal gamético. Los objetivos de esta tesis fueron los de caracterizar agronómica y molecularmente el segmento cromosómico balanceado de la línea de maíz BLS1A. Los resultados de ensayos a campo mostraron diferencias estadísticamente significativas entre BLS1A y algunos de sus recombinantes. La línea BLS1A mantuvo su vigor a pesar de los años de endocría. La caracterización genética a nivel molecular se realizó a través de la búsqueda de polimorfismos con marcadores moleculares de RAPD, RFLP, STS, AFLP y Microsatélites. Se analizaron más de 13200 loci génicos en todo el genoma de las líneas. Cinco microsatélites resultaron polimórficos para en el segmento y se lograron clonar y secuenciar siete bandas de RAPD y AFLP que mapearon en la región cromosómica en estudio. Las técnicas moleculares permitieron demostrar la alta homocigosis de la línea BLS1A, por fuera del segmento balanceado, luego de más de 25 años de endocría Del resultado de algunos de los ensayos de rendimiento de híbridos se observó que las líneas Rec 9 y Rec 10 que perdieron los letales, debido a la recombinación, parecerían corresponderse a los “homocigotas” de cada uno de los brazos del segmento balanceado original. La línea BLS1A como sus Recombinantes presentan buena aptitud combinatoria con las líneas públicas Mo17 y B73 representativas de los 2 grupos heteróticos más importantes en la producción de híbridos comerciales.

Abstract:
BLS1A maize line has a Balanced Lethal System located near the centromeric region of chromosome 6, formed by a chlorophyll lethal gene closely linked in repulsion phase with a gametic lethal gene. The objective of this tesis was to characterize agronomic and at the molecular level the Balanced Lethal System of BLS1A corn line. The results of field trials showed statistically significant differentces between BLS1A and some of their Recominant lines. BLS1A remained strong vigor despite the 25 years of inbreeding. Genetic caracterización was performed at the molecular level by searching for polymorphisms with RAPD, RFLP, STS,AFLP and microsatellites molecular markers. More than 13,200 gene loci were analized across the lines genome. Five microsatellites were polymorfic for the segment and seven RAPS and AFLP bands, that mapped in the chromosomal region under study. The molecular markers allow to demostrate the high hozygosity of the BLS1A, outside the balanced system, after more than 25 years of inbreeding. At the field yield trials of hybrids was observed that the lines Rec 9 and Rec 10, that lost the lethal ones due to the recombination, would seem to correspond to the "homozigous" of each arms of the original balanced lethal system. The BLS1A as its Recombinants present good (ac) with the public lines Mo17 and B73 representative of the 2 more important heterótic groups in the production of commercial hybrids

Laserna, María Paula. "Variaciones fenotípicas y poblacionales entre híbridos convencionales y transgénicos de maíz (Zea mays L.) y sus posibles bases genéticas" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El uso de híbridos de maíz transgénicos (Bt, RR, Bt-RR) ha simplificado el manejo de los cultivos, debido a un control efectivo de plagas y malezas. Los efectos de la inserción de los transgenes sobre el comportamiento de los híbridos de maíz no están completamente documentados, especialmente sin la incidencia de adversidades bióticas. Los objetivos de esta tesis fueron (i) establecer las posibles diferencias en fenología, crecimiento y rendimiento entre un híbrido de maíz no transgénico y sus versiones transgénicas (híbridos Bt, híbridos RR e híbridos Bt-RR) y entre las versiones transgénicas de otro híbrido; (ii) analizar el impacto del aumento de la densidad poblacional sobre la variabilidad fenotípica de los diferentes rasgos en los distintos genotipos; (iii) establecer las diferencias genéticas existentes entre las distintas versiones dentro de cada grupo de híbridos; y (iv) relacionar la variabilidad genética entre las plantas de una misma versión con la variabilidad fenotípica observada en los distintos rasgos. Los experimentos se llevaron a cabo en el campo experimental de la FA-UBA, durante el período 2008-2009 (Exp 1), 2009-2010 (Exp 2) y 2010-2011 (Exp 3). Se cultivaron las distintas versiones de dos grupos de híbridos (DK747 y DK190) en dos densidades de siembra contrastantes (6 y 12 pl m-2 en Exp 1 y Exp 2) y con distinto espaciamiento entre las plantas de la hilera de siembra (Exp3). Todos los experimentos fueron regados y conducidos sin limitaciones de nutrientes, con controles químicos y mecánicos de malezas y de plagas. En las dos densidades de siembra, se registró variabilidad fenotípica de diferentes rasgos entre las versiones de un mismo grupo de híbridos (e.g. tasas de crecimiento, partición de biomasa a la espiga, TT a floración). También se describieron diferencias en la respuesta de la variabilidad fenotípica de algunos rasgos (e.g. rendimiento y tasa de crecimiento de la espiga) frente al aumento de presión de competencia, indicador de diferencias entre las versiones en la tolerancia a la alta densidad de siembra. Por último, se encontraron diferencias genéticas entre las versiones del híbrido DK747 y entre las plantas de una misma versión, siendo la versión convencional la más variable, y la versión Bt-RR la menos variable. La ubicación de los SNP variables en cada una de las versiones permitió inferir que la variabilidad podría deberse a heterocigosis residual en las líneas parentales. Algunos de los estimadores de la variabilidad fenotípica pudieron relacionarse con la variabilidad genética (e.g. el CV del NGP, la amplitud de la BT y el coeficiente de asimetría de la TCPPC), aunque resta establecer la bases ecofisiológicas determinantes de la variabilidad.

Abstract:
The use of transgenic maize hybrids (Bt, RR, Bt-RR) has simplified crop management because of an effective control of pests and weeds. The effects of the transgenes insertion on the performance of maize hybrids are not well documented, especially without the incidence of biotic adversities. The objectives of this thesis were (i) to establish the differences in phenology, growth and yield between non-transgenic maize hybrid versions and its transgenic versions (Bt hybrids, RR hybrids and Bt RR hybrid ) and among transgenic versions of another hybrid, (ii) to analyze the impact of increased population density on the phenotypic variability of several traits of the different genotypes, (iii) to establish the genetic differences among versions of each group of hybrids, and (iv) to relate the genetic variability among plants of a genotype with the phenotypic variability of several traits. The experiments were carried out in the experimental field of the FA-UBA, during 2008-2009 (Exp 1), 2009-2010 (Exp 2) and 2010-2011 (Exp 3). Different versions of two groups of hybrids (DK747 and DK190) were cultivated at two contrasting plant population densities (6 and 12 pl m-2 in Exp 1 and Exp 2) and with different spacing between plants along the rows (Exp3). All experiments were irrigated and conducted without nutrients limitations, with chemical and mechanical control of weeds and pests. At both plant densities, there were phenotypic variations of some traits among versions of the same group of hybrids (e.g. plant growth rate, biomass partitioning to the ear, time to flowering). Some versions also exhibited different phenotypic variability of some traits (e.g. grain yield and ear growth rate around female flowering) as competition was increased, i.e. an indicator of the tolerance to crowding degree of each genotype. Finally, genetic differences among versions of the DK747 and between plants of the same version were detected, resulting the non- transgenic DK747 the most variable, and the DK747MGRR, the less variable. The location of the variable SNP in each version let us infer that genetic variability is probably due to residual heterozygosity in the parental lines. Some of the estimators of the phenotypic variability could be related to genetic variability (e.g. the CV of the kernel number per plant, the amplitude of the total biomass and the skewness of plant growth rate around the critical period). Physiological bases of inter-plant variability were not determined.

Gómez, Maximiliano. "Desarrollo de caña de azúcar transgénica resistente al Sugarcane mosaic virus (SCMV) y al Sorghum mosaic virus (SrMV) por silenciamiento génico" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El desarrollo de plantas transgénicas que explotan el mecanismo de silenciamiento génico contra los virus causales del mosaico (SCMV y SrMV) representa una interesante estrategia alternativa a los métodos de mejoramiento genético clásico. Sin embargo hasta el momento dichas estrategias han sido implementadas en base al conocimiento de unas pocas secuencias virales, lo que incrementa la posibilidad de que la resistencia sea quebrada por variantes poco frecuentes del virus. Se desarrolló un protocolo simple, rápido y económico diseñado para obtener secuencias virales a partir de un gran número de hojas de caña sintomáticas. Utilizando dicho protocolo se analizó la estructura poblacional de los virus causales del mosaico de la caña de azúcar en la Argentina y las áreas cañeras limítrofes de Bolivia, Uruguay y Paraguay, incluyendo 103 sitios de muestreo. Se analizaron 567 muestras sintomáticas por RT-PCR (pertenecientes a 104 genotipos de caña de azúcar) amplificando un fragmento del gen de la proteína de cápside del SCMV y del SrMV con iniciadores reportados en la literatura. Los productos de amplificación fueron secuenciados directamente. El análisis de las secuencias virales determinó que el principal agente causal de mosaico en la región es el SCMV, presente en 94% de las muestras. El SrMV estaba presente en solo 2,8% de las muestras, con bajos porcentajes de coinfección de los dos virus (0,5%). Las secuencias fueron analizadas filogenéticamente y clasificadas en cuatro grupos virales utilizando un valor de corte de 0,91 de identidad de secuencia, con un nuevo grupo viral (W) propuesto dentro de la clasificación del SCMV reportada en la literatura. Se diseñó un transgén de resistencia para desencadenar el silenciamiento génico contra todas las variantes virales encontradas en el muestreo realizado. Se seleccionaron tres fragmentos del genoma viral evolutivamente conservados: parte del gen P3 (función probables de anclaje a membrana del complejo de replicación) y dos fragmentos no homólogos del gen de la proteína de cápside, para ser clonados en direcciones opuestas a ambos lados de un intrón (construcción tipo horquilla), bajo la dirección del promotor del gen de la ubiquitina de maíz. Se obtuvieron plantas transgénicas de cinco variedades de caña de azúcar de interés comercial y fueron desafiadas con el SCMV en un ensayo de inoculación artificial en invernáculo y en un ensayo a campo bajo condiciones naturales de infección en la Chacra Experimental (provincia de Salta). Resultados preliminares indican la ocurrencia de eventos resistentes a la infección con mosaico de cuatro variedades de caña. El análisis molecular de un grupo de eventos es consistente con una resistencia mediada por silenciamiento génico. Se planea la realización de ensayos a campo para confirmar el fenotipo de resistencia a mosaico e identificar eventos que conserven las características agronómicas del genotipo transformado.

Abstract:
Attractive alternatives to traditional resistance breeding in sugarcane against sugarcane and sorghum mosaic virus (SCMV and SrMV, respectively), both causal agents of mosaic disease, have derived from transgenic approaches exploiting gene silencing. Such approaches, however, have been implemented based upon relatively few available virus sequences, therefore it is possible that infrequent variants escape gene silencing and break resistance. We developed a simple, fast and economic protocol designed to obtain viral sequences from a large set of symptomatic sugarcane leaf samples. Using this protocol, we estimated the population structure of potyviruses causing sugarcane mosaic disease throughout the sugarcane growing area of Argentina and neighboring regions in Bolivia, Uruguay and Paraguay by analyzing sugarcane leaf samples showing mosaic symptoms from 103 locations, including commercial and experimental fields. A set of 567 samples from 104 sugarcane genotypes were extracted and analyzed for the presence of a genomic fragment including most of the SCMV and SrMV coat protein coding regions by RT-PCR using reported sets of primers. PCR products were directly sequenced using the same amplification primers. Sequence analysis demonstrated that SCMV is the predominant mosaic virus infecting sugarcane in the region, and is present in 94% of the samples. SrMV was present only in 2.8% of samples, with low (0.5%) coinfection rates. Sequences were subject to phylogenetic analysis and classified into four viral groups using a 0.91 nucleotide identity cutoff, and a new group (W) was proposed to be included in the SCMV classification previously reported. A resistance transgene was designed to trigger silencing mediated resistance against all virus variants found in the large scale survey. Three viral fragments: a P3 gene fragment and two nonoverlapping fragments from the coat protein gene, were cloned in opposite directions separated by an intron in a hairpin construct, and placed under the maize UBI promoter. Transgenic sugarcane plants belonging to 5 varieties were obtained and putative events were tested in the greenhouse with artificial inoculation and in a field trial at Chacra Experimental (Salta province) under natural infection conditions. Preliminary results indicate the occurrence of events from four sugarcane varieties that are resistant to mosaic infection. Preliminary molecular analysis are consistent with a resistance mechanism mediated by gene silencing. Further analysis are needed to identify resistant events that have a good agronomic performance as well.

Ricardi, Martiniano María. "La proteína ASR1 de tomate. Aspectos estructurales y funcionales. Búsqueda de sus genes blanco" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Las proteínas ASR, exclusivas del reino vegetal, se encuentran relacionadas con la respuesta al estrés por falta de agua y otros estreses. ASR1 tiene funciones de chaperona y factor de transcripción. Esta función dual de ASR1 se condice con su presencia en extractos citosólicos y nucleares. Hemos corroborado in planta esta localización dual y demostrando que la misma ocurre por difusión y no mediante transporte activo. Además demostramos que dicha proteína puede homodimerizar en el citosol y se encuentra como dímero en el núcleo. Por otra parte, hemos adaptado exitosamente una metodología de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) para tomate. Este protocolo fue utilizado para realizar un ChIP “semi-nativo” y detectar marcas de histonas relacionadas a represión y activación de genes en todo el genoma de tomate a lo largo de diferentes estadíos de maduración del fruto. Además, experimentos de ChIP sobre hojas de plantas de tomate estresadas, usando un anticuerpo anti-ASR1, mostraron que la mayoría de las regiones genómicas se ubicaron cerca de genes. Los grupos de genes hallados, y por lo tanto posiblemente regulados por ASR1, están relacionados a la síntesis y remodelación de la pared celular, y al transporte de agua y solutos. Finalmente, encontramos una robusta secuencia de ADN consenso de "binding" para ASR1.

Abstract:
ASR proteins, exclusive to the plant kingdom, are related to water stress and other abiotic stresses. ASR1 has chaperone and transcription factor functions. This dual function is correlated with a dual nuclear/cytosolic subcellular localization, demonstrated to be due to diffusion rather than active transport. Additionally, we observed homodimerization in cytosol and homodimers in the nucleus. We have also successfully adapted a chromatin immunoprecipitation protocol (ChIP) for tomato. This protocol was used to perform semi-native ChIP for detection of repressive and activating histone modifications genome wide at different fruit maturation stages. In addition, ChIP assays on leaves from stressed tomato plants, performed with an anti-ASR1 antibody, showed that most of the enriched genomic regions were located near genes. The gene groups found, and hence probably regulated by ASR1, were related to cell wall synthesis and remodeling, and water and solute transport. Finally, we were able to find a robust consensus ASR1-binding DNA sequence.

Guerrero, Leandro Demián. "Comunidades bacterianas en suelos bajo siembra directa en la región agropecuaria pampeana. Influencia del manejo y propuesta de nuevos indicadores biológicos" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los suelos son considerados uno de los ambientes más diversos y heterogéneos que se conocen. En ellos se producen innumerables procesos que permiten el reciclado y transformación de sustancias esenciales para la vida de plantas y animales. La mayoría de estos procesos son realizados por bacterias, y se ven afectados por distintos factores en el ambiente. Una de las principales causas que modifican estos ecosistemas es la producción agrícola. En los últimos tiempos el desarrollo de nuevas tecnologías, como la siembra directa podrían atenuar parcialmente el impacto de esta explotación. Sin embargo, el uso sustentable implica también la aplicación de prácticas de manejo, que incluyen rotaciones de cultivos, reposición de nutrientes y manejo integral de plagas. En este trabajo estudiamos la composición y dinámica de las comunidades de bacterias bajo prácticas contrastantes en siembra directa, con los objetivos de determinar de qué manera las prácticas agrícolas impactan sobre el suelo, y encontrar variaciones en las comunidades que puedan servir como indicadores de biológicos de calidad del suelo. Para el estudio se analizaron ambientes naturales y dos tratamientos de siembra directa que difieren principalmente en el régimen de rotación de cultivos, y otras características que los separan en Buenas y Malas prácticas agrícolas. Se tomaron datos de cuatro localidades diferentes de la región que abarca desde la provincia de Córdoba hasta Entre Ríos durante un periodo de dos años. Mediante la utilización de herramientas moleculares encontramos que las diferencias entre los distintos ambientes a nivel de las comunidades de bacterias y los taxones mayoritarios se ven influenciadas en primer lugar por las diferencias geográficas y en menor medida por los efectos del uso del suelo. A medida que aumentamos el nivel de resolución taxonómica encontramos que existen diferencias para determinados grupos que pueden separar las Buenas de las Malas prácticas. El número de bacterias pertenecientes al grupo de Acidobacteria Gp1 y al género Rubellimicrobium varían de forma dependiente de los tratamientos, por lo cual son potenciales candidatos como indicadores de calidad de suelos. Para esto proponemos la confección de un índice calculado como el cociente entre la proporción de bacterias de cada grupo encontradas en la muestra (Acidobacteria Gp1/Rubellimicrobium), respecto del número encontrado en un ambiente natural próximo.

Abstract:
The soil is considered one of the most diverse and heterogeneous environments. They produce many processes that enable the recycling and transformation of substances essential for plant life and animals. Most of these processes are performed by bacteria, and are affected by different factors in the environment. One of the main causes that modify these ecosystems is agricultural production. The recent development of new technologies, such as no-till crop could reduce the impact of this exploitation. However, the sustainable use also involves the implementation of management practices, including crop rotations, nutrient replenishment and integrated pest management. In this work we have studied the composition and dynamics of bacterial communities under contrasting no-till crop systems in order to determine how impacts on soil, and to find variations in the communities that can serve as biological indicators of soil quality. For the study, two tillage treatments that differ mainly in the rotation regime and other features that separate into good and poor agricultural practices were analyzed. Data were collected from four different locations in the region from the province of Cordoba to Entre Rios for a period of two years. Using molecular tools we found that the differences between the different environments at the level of bacterial communities and major taxa, are influenced primarily by geographic differences and in lesser extent by the effects of land use. As we increased the level of taxonomic resolution, we found that there were differences for certain groups that can separate good from poor practices. The number of bacteria belonging to the Acidobacteria Gp1 group and the genus Rubellimicrobium varied depending on the treatments, suggesting that they could be potential candidates indicators of soil quality. To this end we propose the confection of an index calculated as the ratio (Acidobacteria Gp1/Rubellimicrobium) between the proportion of each group of bacteria found in the sample and the number found in a nearby grassland soil.

Folcia, Ana María. "Evaluación de Pseudapanteles dignus (Hymenoptera-Braconidae) como posible agente de control biológico de Tuta Absoluta (Lepidoptera-Gelechidae), plaga clave del cultivo de tomate en los alrededores del Gran Buenos Aires" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La polilla del tomate (Tuta absoluta) es considerada plaga clave del cultivo de tomate producido bajo cubierta en los alrededores de Buenos Aires debido a los daños que causa, en hojas, brotes y frutos, y a requerir permanentes medidas de control. Tanto el corto ciclo de vida que ocurre en los cultivos protegidos como la elevada cantidad de medidas de control requeridas han generado problemas de resistencia a insecticidas. Una de las alternativas al control químico es el control biológico. Hacia 1995 fue detectada la presencia natural de un parasitoide de larvas de T. absoluta, Pseudapanteles dignus (Hymenoptera, Braconidae). El objetivo general de esta tesis fue determinar la eficacia de Ps. dignus como agente de control biológico aumentativo de Tuta absoluta y evaluar su compatibilidad con la estrategia de control químico de la plaga. Para ello se determinó su potencialidad mediante la evaluación de sus atributos biológicos en condiciones de laboratorio (supervivencia y fecundidad) y comparación con los de la plaga. Se estimó su tasa de ataque en relación con la densidad de la presa (respuesta funcional). Se evaluó su eficacia en el control por medio de liberaciones controladas en laboratorio e invernáculos experimentales. Además, se analizó la compatibilidad de su empleo con estrategias de control químico aceptadas en manejo convencional (insecticidas) y orgánico (extractos vegetales) de plagas. Estos estudios resultan fundamentales para la implementación de una estrategia de manejo integrado de T. absoluta en cultivos de tomate en ambientes protegidos, que incluyan el empleo de liberaciones inoculativas de Ps. dignus en un contexto productivo.

Abstract:
The tomato moth (Tuta absoluta) is considered a key pest of tomato crops produced under cover near Buenos Aires due to the damage it causes, in leaves, shoots and fruits, and require permanent control measures. Both the short life cycle that occurs in protected crops and the high number of required control measures have led to problems of insecticide resistance. One alternative to chemical control is biological control. By 1995 it was detected naturally occurring larval parasitoid T. absoluta, Pseudapanteles dignus (Hymenoptera, Braconidae). The aim of this thesis was to evaluate the effectiveness of Ps. dignus as augmentative biological control agent of Tuta absoluta and to assess their compatibility with the chemical control strategy of the pest. This was determined by evaluating potential biological attributes in laboratory conditions (survival and fecundity) and compared with those of the pest. Estimated its attack rate relative to the density of prey (functional response). Evaluated its efficacy in control through releases controlled in laboratory and experimental greenhouses. Further analyzed the compatibility of use with chemical control strategies accepted in conventional (insecticides) and organic (plant extracts) pest management. These studies are essential for the implementation of an integrated pest management strategy of T. absoluta in tomato crop under protected environment, with the use of Ps dignus inoculative releases in a productive context.

Quadrana, Leandro Daniel. "Análisis funcional de los determinantes genéticos del metabolismo de vitamina E en tomate" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El conocimiento acerca de los mecanismos fisiológicos y moleculares que determinan la calidad nutricional de los vegetales es de fundamental importancia tanto para el diseño de estrategias de mejoramiento vegetal como para ganar conocimiento en los mecanismos regulatorios del metabolismo secundario. La presente Tesis se focaliza en el estudio de los mecanismos que determinan los contenidos de Vitamina E de los frutos de tomate. Para ello caracterizamos estructuralmente y localizamos en el mapa genético todos los genes involucrados en la biosíntesis de vitamina E e identificamos QTLs para los contenidos de esta vitamina en los frutos de tomate. Así mismo identificamos los principales componentes de la red de regulación a nivel de la expresión génica que opera en la síntesis de vitamina E en tomate a partir del desarrollo de una plataforma de RT-qPCR capaz de evaluar la acumulación de RNA mensajeros para todos los genes de esta ruta biosintética. Adicionalmente y con el objetivo de estudiar funcionalmente genes involucrados en el metabolismo de vitamina E, desarrollamos un sistema de silenciamiento transiente mediado por virus basado en la expresión constitutiva de la proteína verde fluorescente para su silenciamiento como reportero. Por último, nos centramos en la identificación los determinantes genéticos del mayor QTL de vitamina E de tomate localizado durante la primera parte de esta Tesis.

Abstract:
Understanding the molecular and physiological mechanisms that determine the quality of vegetables-derived foods is of fundamental importance to design programs centered in plant breeding as well as to gain further insight on regulatory mechanisms of secondary metabolism.In this work we studied the regulatory mechanisms of Vitamin E content of the tomato fruits. We first structurally characterized and mapped all the genes involved in the vitamin E biosynthesis. Furthermore, we developed and take advantage of a RT-qPCR array which allow us to study the major players gene network determining the vitamin E synthesis. Additionally we developed a VIGS (Viral Induced Gene Silencing) system capable of silencing a target gene, coupled to a fluorescent reporter gene. Moreover we used this approach to study the function of several genes presumably involved or related to the vitamin E metabolism. Finally, we identified the molecular factors determining a major QTL of vitamin E in tomato fruit, identified during the first part of this thesis, and localized in the chromosome 9.

Furman, Nicolás. "Desarrollo de alternativas biotecnológicas para la obtención de plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck resistentes a la enfermedad de la Cancrosis de los cítricos" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Entre las enfermedades bacterianas más relevantes para la citricultura argentina se encuentra la Cancrosis de los cítricos, presente en la mayoría de las zonas productoras de todo el mundo, a excepción de Europa. Las pérdidas económicas más importantes son ocasionadas por las restricciones cuarentenarias a los frutos, impuestas por países libres de estas enfermedades, que limitan las exportaciones a tales destinos. Dado que no se ha encontrado resistencia natural a la enfermedad, ni en el germoplasma disponible para el mejoramiento, ni en las especies utilizadas como pie para propagar las variedades comerciales de citrus, actualmente se intenta controlar al patógeno causante de la Cancrosis (Xanthomonas axonopodis pv. citri) mediante la aplicación de bactericidas de contacto a base de cobre. Si bien éstos permiten controlar parcialmente el desarrollo de la enfermedad, no sólo son eliminados por las lluvias y el viento, sino que también resultan contaminantes para el ambiente y para el hombre. Por estas razones el desarrollo de estrategias biotecnológicas representa una alternativa atractiva para la búsqueda de la resistencia a la Cancrosis. En tal sentido, el objetivo principal de esta Tesis fue desarrollar plantas transgénicas de Citrus sinensis (naranjo dulce) resistentes a la enfermedad, a partir de la expresión del péptido antimicrobiano dermaseptina. En primer lugar, se demostró el efecto bactericida del péptido frente a Xanthomonas spp. en ensayos in vitro. Siguiendo estos resultados, se realizó una construcción que permite la expresión constitutiva de dermaseptina y su exportación a apoplasto, región donde se multiplica la bacteria durante la infección. Luego, se transformaron plantas de C. sinensis y se obtuvieron 7 positivas para los genes marcadores de selección utilizados (resistencia kanamicina y GFP), cuya posterior caracterización molecular confirmó la presencia de la secuencia de dermaseptina en el genoma de las plantas. Finalmente, mediante ensayos de infección en cámaras de crecimiento, se estableció que la expresión del péptido antimicrobiano en las plantas transgénicas de naranjo indujo resistencia parcial frente a la infección con X. axonopodis. Si bien aún resta desarrollar ensayos de infección en invernadero, estos resultados permitieron convalidar la estrategia biotecnológica escogida para conferir resistencia a la Cancrosis.

Abstract:
Canker disease is one of the most important bacterial diseases affecting citric production in Argentina, and it is also present in most producing areas around the world, except in Europe. Since that a substantial percentage of lemon, grapefruit and orange is intended for export, outbreaks of this disease provoke an immediate quarantine for the fruits harvested in the affected areas, with the subsequent losses of economic income. As no natural resistance has been found, neither in commercial orange varieties nor in any of the common graft stock varieties, current attempts to control the Canker causative pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri consists of preventive sprayings with copper-based bactericides. Despite this approach confers partial disease control, copper-based bactericides are not only be eliminated by rain and wind, but they also result harmful to the environment and to human beings. Due to these limitations, biotechnological strategies represent an attractive alternative for the search of Canker resistance. In that way, the main aim of this work was to obtain transgenic Citrus sinensis (sweet orange) plants expressing an antimicrobial peptide (dermaseptin) in order to confer resistance against Xanthomonas axonopodis pv. citri infections. First of all, bactericidal effect of dermaseptin against Xanthomonas spp. was demonstrated by in vitro assays. Following these results, a genetic construct allowing the constitutive expression of dermaseptin and its export to apoplast was generated. That´s where bacteria multiplies during infection. Then, C. sinensis plants where transformed with this construction, obtaining seven positive plants for the GFP and kanamycin marker genes. Later molecular characterization confirmed the presence of dermaseptin sequence in the corresponding genomes. Finally, controlled X. axonopodis infection assays showed significant reduction of disease symptoms in transgenic plants. Even though the results obtained in this work should be confirmed at the level of greenhouse and field trial assays (since controlled infection assays cannot be directly extrapolated to real agricultural conditions), they indicate that the strategy used in this work could be effective in achieving Canker resistance.

Ribaudo, Claudia Mónica. "Mecanismos bioquímicos y moleculares desencadenados en la interacción bacterias promotoras de crecimiento vegetal y plantas de interés agronómico" (2013-06-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En esta Tesis se abordó el estudio de los mecanismos bioquímicos involucrados en la interacción entre algunas bacterias promotoras del crecimiento y dos plantas de interés agronómico, arroz (Oryza sativa) y tomate (Solanum lycopersicum). La bacteria Azospirillum brasilense promovió el crecimiento de plantas de arroz, especialmente de su sistema radicular; la inoculación indujo un aumento en la producción de etileno en la planta y en la actividad y expresión de la ácido 1-amino-ciclopropano-1- carboxílico sintasa (ACS). Se observó también un aumento en la actividad de quinasa de proteínas dependiente de Ca⁺² cuyas características bioquímicas indican que se trata de una CDPK que estaría relacionada con el crecimiento de las raíces laterales. La inoculación con A. brasilense promovió el crecimiento de plantas de tomate, aumentó los niveles de ácido indol acético (AIA) y etileno y la actividad y expresión de ACS. El suplemento exógeno de etileno y el uso de un inhibidor de su percepción permiten asignar a modo de hipótesis un rol intermediario del etileno en la promoción del crecimiento del sistema radicular en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. El análisis global del perfil de expresión génica asociado a la inoculación de plantas de tomate con A. brasilense indicó que la inoculación estimuló la expresión de una variedad de genes, muchos de los cuales se inducen por etileno y que se han encontrado sobre expresados en otras especies en respuesta a la infección con patógenos o afectadas por agentes generadores de estrés. Los niveles de expresión de los genes implicados en el establecimiento de la respuesta hipersensible aparecen sub expresados lo cual podría favorecer el establecimiento de la interacción endofítica entre A. brasilense y tomate. Utilizando la técnica de 2D-DIGE se comenzó el análisis de los perfiles de proteínas expresadas en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. Con esta técnica se logró evidenciar diferencias en los patrones de expresión que dependen del tratamiento al que se sometió a las plantas.

Abstract:
This thesis is focused on the study of biochemical mechanisms involved in the interaction among some growth-promoting bacteria and two plants of interest for agronomy: rice (Oryza sativa) and tomato (Solanum Iycopersicum). The bacterium Azospirillum brasilense promoted growth in rice plants, especially in their root system; inoculation induced an increase in ethylene production in the plant and in 1- aminocyclopropane-1-carboxilic acid synthase (ACS) activity and expression. A rise was also noticed in a Ca⁺²-dependent protein kinase activity with the biochemical features of a CDPK that could be related to lateral roots’ growth. A. brasilense inoculation also promoted tomato plants growth, raised indole acetic acid (IAA) and ethylene levels and the activity and expression of ACS. Exogenous supplement of ethylene and the use of an inhibitor of their perception have allowed for the hypothesis for an intermediary role of ethylene in A. brasilense-inoculated tomato plants’ root system growth. The overall analysis of the genetic expression profile of tomato plants associated to the inoculation with A. brasilense has indicated that inoculation stimulated expression of a variety of genes which are also induced by ethylene and have been found overexpressed in other species as a result of pathogenic infection or affected by stress-generating agents. The genes involved in the hypersensitive response appeared as underexpressed; this fact could favour the stablishment of the endophitic interaction between A. brasilense and tomato. 2D-DIGE technique was used to start the analysis of protein profiles expressed in A. brasilense-inoculated tomato plants.

Moschen, Sebastián. "Identificación y caracterización funcional de genes candidatos asociados a la senescencia foliar en girasol basado en perfiles transcripcionales y metabólicos" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El proceso de senescencia en plantas es un mecanismo complejo controlado por múltiples variables genéticas y ambientales que condicionan el rendimiento de los cultivos. En el caso del girasol, el segundo cultivo oleaginoso en importancia económica para nuestro país, se trata de un proceso con impacto económico que interviene en la brecha existente entre el rendimiento potencial y el rendimiento real observado, por la mayor o menor oportunidad de las plantas para mantener el sistema fotosintético activo durante periodos prolongados. Los parámetros visuales resultan tardíos para evaluar el desencadenamiento y posterior tasa de evolución de la senescencia foliar. La clorosis, la variación en el contenido de clorofila así como también la necrosis de las hojas, son detectables mucho tiempo después que la señal iniciadora de la senescencia ha sido activada. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del proceso de senescencia en girasol a través de distintos niveles de organización: ecofisiológico, metabolómico, transcriptómico, culminando con la integración de los diversos enfoques ómicos mediante una aproximación de biología de sistemas, con el objetivo final de identificar potenciales biomarcadores asociados al proceso de senescencia en girasol. Se condujeron distintos ensayos que fueron realizados tanto a campo, en la Estación Experimental INTA-Balcarce como en invernáculo, en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar, para evaluar el progreso del proceso de senescencia tanto en condiciones naturales como controladas. Asimismo se evaluó la respuesta frente a condiciones de restricción hídrica impuesta en distintas etapas del desarrollo de las plantas. Se realizaron evaluaciones ecofisiológicas relacionadas con el avance de la senescencia, a través de la medición de variables como contenido de clorofila, azúcares solubles y nitrógeno total de hojas, mediciones a campo de área foliar verde, SPAD, intercepción de la radiación y materia seca por órganos, mediante las cuales fue posible evaluar la evolución del proceso en las diferentes hojas, en condiciones naturales de cultivo. Adicionalmente, se llevó adelante un análisis de los perfiles metabólicos utilizando técnicas de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) que permitió la optimización del protocolo de la extracción de metabolitos de hojas de girasol, y la detección de aproximadamente 60 metabolitos primarios incluyendo distintos aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y azucares alcohol. Asimismo se optimizó la tecnología de cromatografía iónica, mediante la cual se cuantificaron diferentes nutrientes iónicos relevantes durante el proceso de senescencia tales como nitratos, sulfatos, fosfatos entre otros. En forma paralela se llevó a cabo un estudio a nivel transcriptómico considerando tanto estrategias de genes candidato, mediante la búsqueda de secuencias putativamente ortólogas a girasol asociadas a senescencia en especies modelo, como el análisis concertado de expresión génica utilizando una micromatriz de oligonucleótidos desarrollada para esta especie. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos con la micromatriz, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre el total de los unigenes que mostraron un comportamiento diferencial y significativo para las distintas condiciones evaluadas, utilizando la metodología de Gene Set Analysis basado en modelos de regresión logística. De este modo se identificaron las diferentes categorías funcionales asociadas a bloques de genes con un patrón de expresión similar. La búsqueda de genes candidato se profundizó con la consulta de bases de datos de genes asociados a senescencia (SAGs del inglés: Senescence Associated Genes), así como también sobre aquellos genes con dominios de factores de transcripción como posibles desencadenantes de las cascadas de señalización de este proceso. Por último, se realizó la integración de los datos obtenidos a partir de distintas estrategias (fisiológicas, metabolómicas y transcriptómicas) utilizando una aproximación basada en biología de sistemas con el objetivo de identificar biomarcadores asociados a la senescencia en girasol. Para este fin se usaron los programas Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (García-Alcalde y col 2011) y Mapman (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm y col 2004) que fueron adaptados para su uso con datos provenientes de esta especie. Los resultados obtenidos a partir de la integración de datos mostraron una correspondencia entre los cambios detectados a través de los diferentes niveles analizados. A partir de una visión general del metabolismo celular se pudo observar una disminución de la actividad fotosintética y el crecimiento celular, y un incremento en el metabolismo de sacarosa, ácidos grasos, nucleótidos y aminoácidos así como también en aquellos procesos relacionados al reciclado de nutrientes. En particular, los factores de transcripción con dominios NAC, AP2- EREBP y MYB mostraron altos niveles de expresión y mayores niveles de correlación y co-expresión, puntualizándolos como importantes biomarcadores candidatos para la ejecución del programa de senescencia en girasol. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso de senescencia en girasol, así como a la selección robusta de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo del proceso, especialmente factores de transcripción. Estos últimos fundamentalmente, podrán ser validados a futuro sobre materiales de mejora para ser incorporados a los programas de mejoramiento asistido de este cultivo de gran importancia agronómica para nuestro país. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de la genómica y la post-genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol.

Abstract:
Leaf senescence is a complex mechanism controlled by multiple variables, either from genetical and environmental origin that has strong impact on crop yield. In sunflower, the second economically important oil crop in Argentina, the senescence process has an economic impact involved in the gap between potential and real yield observed due to the incapacity of the plants in keeping their green leaf area for longer periods. Visual parameters are belated to assess the onset and the evolution of leaf senescence. Chlorosis, variation in chlorophyll content as well as leaf necrosis is detected long after the triggering signal has been activated. The main objective of this work was the study of the senescence process in sunflower through different organization levels: ecophysiological, metabolomic, transcriptomic, and finally an integration of the different omics strategies using a systems biology approach, in order to identify potential biomarkers associated to leaf senescence in sunflower. Different experiments were conducted in both, field and greenhouse condition at INTA-Balcarce Experimental Station and at the Biotechnology Institute, INTA Castelar respectively, assessing the senescence process under natural and controlled conditions. Response to water restrictions imposed at different plant development stages was also evaluated. Ecophysiological assessments related to the senescence progress were performed through different measurements such as chlorophyll, soluble sugars and total leaf nitrogen content, field measurements of green leaf area, SPAD, interception of radiation and dry material by organ, allowing the evaluation of the senescence process progression in different leaves growing under natural field conditions. Additionally, metabolic profiles analysis was performed by using Gas Chromatography - Mass Spectrometry technique (GC-MS), allowing the metabolite extraction protocol optimization in sunflower leaves and the detection of approximately 60 primary metabolites, including different amino acids, organic acids, sugars and sugar alcohol. Likewise, it was possible to optimize the ion chromatography technology, leading to the quantification of relevant ionic nutrients content such as nitrates, sulphates, phosphates and others, along the senescence process. In parallel, transcriptomic studies were performed considering both, candidate gene strategies by searching of sunflower orthologous gene sequences reported as senescence associated in model species, as well as through a concerted expression analysis using a customized oligonucleotide microarray developed for this species. Statistical functional enrichment analysis was conducted over the complete significant unigenes set derived from the microarray assay, for each evaluated conditions, using Gene Set Analysis methodology based on logistic regression models. In this way, different functional categories were identified for gene clusters with similar expression patterns. Moreover, the exploration for candidate genes was deepened by searching into the senescence associated gene databases for model species, as well as by identification of putative triggers of the signalling pathways leading to senescence in sunflower among the transcription factor domains gene database. Finally, a systems biology approach was achieved in order to integrate the information from the different physiological, metabolomic and transcriptomic strategies with the aim to identify biomarkers associated with leaf senescence in sunflower. These analyses were performed using Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (Garcia-Mayor et al 2011) and Mapman software (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm et al 2004) that were adapted for sunflower data. These results showed a correspondence between the changes detected by the different strategies. Through a metabolism overview, a decrease of photosynthetic activity and cell growth was detected. Moreover, sucrose, fatty acids, nucleotides and amino acids metabolism as well as those pathways related to nutrient recycling processes showed an up-regulation during leaf development. In particular, NAC, AP2-EREBP and MYB transcription factors showed high expression levels and higher levels of correlation and co-expression making them important candidates biomarker in the execution of the senescence program in sunflower. The results of this work contributed to the knowledge of the molecular mechanisms involved at the onset and evolution of the senescence process in sunflower as well as to the identification of robust candidate genes involved in the different developmental stages of this process, especially transcription factors. These genes could be further validated on breeding materials to be incorporated into assisted breeding programs for this agronomic important crop for our country. Furthermore, the strategies, methodologies, tools and knowledge developed in this thesis, contribute to the crop development and promote the adoption of genomics and post-genomics in the different stages of sunflower breeding.

Viñas, Ezequiel Santiago. "Análisis de plantas transgénicas ATEMYB32::IPT de pasto miel (Paspalum dilatatum Poir.) una gramínea C4" (2015-04-13) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En plantas forrajeras como Paspalum dilatatum Poir, la senescencia foliar es un proceso que afecta su producción y especialmente su calidad. Una estrategia molecular para retrasar la senescencia mediante la ingeniería genética se basa en la expresión de la secuencia codificante de la isopentenil transferasa (IPT), enzima clave en la biosíntesis de citoquininas. Para lograrlo se utilizan promotores con expresión no constitutiva que permitan la producción autorregulada de citoquininas. Se analizó el efecto de la incorporación vía transgénesis de las construcción quimérica ATEMYB32::IPT en clones de Paspalum dilatatum cv “Relincho”. Se estudiaron 8 eventos obtenidos mediante transformación biolística con controles isogénicos, dos provenientes de cultivo de tejido que no incorporaron al transgén después de la transformación biolística y uno de campo. Los individuos fueron propagados vegetativamente para generar réplicas que permitieron estimar la respuesta de los eventos a diferentes condiciones de estrés abiótico (deficiencias hídricas y temperaturas bajas extremas). Se realizaron análisis moleculares, PCR para amplificar el transgén ipt, complementándose esta información con la medición del nivel de citocininas y auxinas por HPLC. Se caracterizaron a las líneas transgénicas desde su comportamiento germinativo, su anatomía foliar y la ultraestructura de los cloroplastos. En todas las plantas ensayadas se estimó el contenido de clorofila, azúcares, proteínas totales y actividad de la enzima SOD. Se halló un mayor nivel de citocininas y de la relación citocininas/auxinas en plantas transgénicas respecto a las controles y variabilidad entre los eventos analizados. A niveles anatómico y ultraestructural se encontraron características distintivas de las líneas transgénicas. Además algunos de los eventos obtenidos mostraron una mayor resistencia a ambas condiciones de estrés y un mejor comportamiento germinativo. Se generaron conocimientos para comprender el efecto de la incorporación del transgén ATEMYB32::IPT en especies C4.

Abstract:
Leaf senescence is a process that affects the production and quality of fodder plant such as Paspalum dilatatum Poir. In order to delay the senescence, there is a molecular strategy which consists on using genetic engineering. It uses the sequence encoding isopentenyl transferase (IPT), a key enzyme in the biosynthesis of cytokinins. Promoter with expression non constitutive are used to allow the self –regulated production of cytokinin. The effect of incorporation of transgenesis via ATMYB32::IPT chimeric construct was analyzed in clones of Paspalum dilatatum cv " Relincho ". Eight events obtained by biolistic transformation and isogenic controls were studied. Two of them came from tissue culture with transformation biolistic which they did not incorporate to the transgenic after the biolistic conversion and also a third coming form field. The individuals were spread in a vegetative way to obtain replicates for estimating the response of different events under abiotic stress conditions (water deficits and frost). In addition, molecular analyzes were performed PCR to amplify the ipt transgene. This information was complemented with measures of cytokinins and auxins by HPLC. Transgenic Lines were characterized considering the germination behaviour, leaf anatomy and chloroplast ultrastructure. Content of chlorophyll, sugars, total protein and SOD enzyme activity was estimated in all plants under analysis. Higher levels of cytokinins were found in transgenic plants compared to the controls and variation in the analyzed events. Distinctive features of the transgenic lines were found in the anatomic and ultrastructural level. Furthermore some of the obtained events showed a higher resistance to stress conditions and a better germination behavior. Knowledge was developed in order to understand the effect produced by the incorporation of the transgene ATMYB32::IPT in C4 specie.

Ibarra, Jose Gervasio. "Estudios microbiológicos relacionados con el mejoramiento de cultivos vegetales en zonas desfavorables" (2017-03-22) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El desarrollo de estrategias para incrementar la producción agrícola es de relevancia debido a la importancia de los vegetales en la alimentación humana. Entre estas estrategias se incluyen la expansión de la frontera agrícola a zonas menos aptas, como los ambientes fríos o áridos, pero es necesario que las plantas puedan resistir y prosperar en esas condiciones. El uso de cultivos transgénicos resistentes a la sequía constituye una buena alternativa que puede ser mejorada con el uso de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB), que puedan desarrollarse en condiciones de estrés, manteniendo sus actividades. El objetivo de este trabajo consistió en el análisis de cepas bacterianas aisladas de suelos, con diferentes regímenes hídricos, y de Pseudomonas extremaustralis, procedente de un ambiente extremo, en cuanto a su potencialidad para ser utilizadas como promotoras de crecimiento vegetal. Además se analizó la influencia de cultivos de maíz genéticamente modificados (GM) resistentes a la sequía sobre la composición de las comunidades bacterianas del suelo por técnicas secuenciación masiva. Las características de PGP en P. extremaustralis se analizaron en comparación con P. protegens Pf-5, una conocida PGPB. P. extremaustralis presentó una buena capacidad de solubilización y mineralización de fósforo, tanto a 28°C como en frio. El perfil de ácidos orgánicos, responsables de la solubilización de fosfato inorgánico, fue diferente al de P. protegens Pf-5. Estas diferencias se correlacionaron con la ausencia del gen gad responsable de la producción de 2-ceto-gluconato, en el genoma de P. extremaustralis. Esta bacteria también fue capaz de producir ácido indol acético (AIA) y posee genes relacionados a la resistencia a ácido fusárico y otros que la capacitan para resistir la desecación. Posee también la ruta metabólica completa para la síntesis y liberación de pioverdinas y se observó un efecto del regulador global anaeróbico Anr sobre la producción de estos compuestos. Ensayos de quimiotaxis mostraron que P. extremaustralis es atraída por exudados radiculares de plantas de trigo y es capaz de colonizar raíces de trigo y maíz de forma estable e incrementar el peso seco de vástago de plantas de trigo, mostrando que además de sus características como PGPB es capaz de interactuar con vegetales. También se analizaron características de PGP en aislamientos bacterianos obtenidos a partir de suelos de la provincia de Buenos Aires con distinto régimen de lluvias. Se obtuvieron 19 cepas bacterianas capaces de solubilizar fósforo, 3 de las cuales mostraron una alta capacidad de solubilización. Se encontraron 22 aislamientos positivos para la producción de AIA. Se observó un efecto positivo sobre el crecimiento de plantas de maíz en un sistema axénico autotrófico de 2 de las cepas, IIM-Man4 e IIA-Man30, indicando que pueden ser buenas candidatas como PGPB. Para analizar si existe un impacto de plantas GM resistentes a la sequía sobre la comunidad bacteriana del suelo se realizaron experimentos en macetas con suelo de dos localidades Río Cuarto(RC) e Inés Indart (II) en cámaras de cultivo con condiciones controladas, utilizando cultivares de maíz portadores del gen Hahb4 que confiere resistencia a sequía y salinidad. Las plantas fueron sometidas a dos tratamientos hídricos: alta y baja irrigación. Se analizó la diversidad bacteriana de las muestras de suelo mediante la secuenciación de amplicones del gen que codifica el 16S rRNA. Los suelos analizados fueron diferentes en cuanto a la α diversidad. En II no hubo diferencias en β diversidad, mientras que en RC se encontraron diferencias al utilizar los índices cuantitativos (Bray Curtis y Weighted UniFrac) al comparar el tipo de planta. La composición de los grupos mayoritarios fue similar, siendo las Proteobacterias el más representado en ambos suelos con alrededor del 30%, seguido por Acidobacterias con alrededor del 17% y Planctomycetes y Verrucomicrobia representando aproximadamente un 10% del total cada uno. En todas las muestras el género predominante fue Acidobacterium con 14 a 20 % de los registros (lecturas). La mayoría de los géneros presentó una abundancia relativa de 0,01-0,1 %. Se realizó un análisis para determinar que géneros bacterianos son afectados por cada condición de riego. Se detectaron 10 géneros en II y 16 géneros en RC que estuvieron significativamente (p<0,05) más representados en la condición de sequía con respecto a buena irrigación; siendo Chromatium, perteneciente a las Gamma Proteobacterias, el que mayor proporción de cambio mostró en II y Amycolatopsis, perteneciente al grupo de las Actinobacterias, y Nevskia, dentro de las Gamma Proteobacterias, en RC. También se observaron 29 géneros que mostraron diferencias significativas en relación al tipo de planta en II y 61 géneros en suelo de RC. Los tratamientos tuvieron menos efecto en II en comparación con RC. En II no se observaron diferencias significativas ni con el régimen de irrigación ni con el tipo de planta y hubo un menor número de géneros afectados. EN RC se observó un efecto significativo del tipo de planta pero no de la irrigación.

Abstract:
Due to the continuous human population growth, food production may be insufficient in the coming years, so it is necessary to implement strategies to increase crop production. These strategies include expanding the agricultural frontier to less suitable areas, such as cold or arid environments. To reach this goal it is necessary that plants can withstand and thrive in these conditions. The use of genetically modified (GM) crops resistant to drought can be a good option, as well as the use of plant growth promoting bacteria (PGPB) that can grow under stress conditions, maintaining their plant-beneficial traits. The objective of this study was to analyze bacterial strains isolated from environments under different rainfall regimes and cold, in relation to their potential as PGPB under unfavorable conditions. We also assessed the influence of drought-tolerant GM maize on the composition of the soil bacterial communities, using high throughput sequencing techniques. Pseudomonas extremaustralis isolated from an extreme environment (Antarctica) was analyzed for PGP traits in comparison with P. protegens Pf-5, a well known PGPB. P. extremaustralis presented a good solubilization and mineralization capacity of phosphate in comparison to P. protegens Pf-5, both at 28°C and under cold conditions. The profile of organic acids, responsible for the inorganic phosphate solubilization, was different from that of P. protegens Pf-5. These differences were correlated with genetic differences between both genomes, including lack of the gad gene in P. extremaustralis genome, related to 2-ketogluconate production. P. extremaustralis was also able to produce indole acetic acid (IAA); possesses genes encoding fusaric acid resistance and genes that enable it to withstand desiccation. It is, also a good siderophore producer, posses a complete genetic pathway to produce and release pyoverdine. We observed that pyoverdine production was influenced by the global anaerobic regulator Anr. Chemotaxis and colonization assays showed that P. extremaustralis was attracted to wheat root exudates and was able to colonize wheat and maize roots forming stable colonies in root surface, improving the dry weight of the stem in wheat plants. In addition, different characteristics related to the ability to promote plant growth in bacterial isolates obtained from soils with different rainfall regimes were analyzed. We found 19 isolates able to solubilizing inorganic phosphate, three of which showed a high solubilizing capacity and 22 isolates that were positive for IAA production, some of which reached high production (up to 60 μg / ml). Two strains, IIM-Man4 and IIA-Man30, showed a positive effect on the growth of maize plants in an autotrophic axenic system. The results indicate that P. extremaustralis, as some of the isolated bacterial strains, could be good candidates for their analysis in experimental plots subjected to stress conditions. Another expanding strategy to improve crop yield involves the use of GM plants. However, the evaluation of the impact of these organisms on the soil communities has not been deeply analyzed yet. We evaluated the effect of drought tolerant GM corn plants carrying the Hahb4 gene, on soil microbial community. Experiments were carried out in pots with soil from two locations Río Cuarto (RC) and Inés Indart (II) in culture chambers under controlled conditions. The plants were subjected to two soil irrigation regimes. Bacterial diversity of the soil community was analyzed using global amplicon sequencing techniques of the gene encoding the 16S rRNA. Soils were different in terms of α diversity. In II there were not differences in β diversity, while in RC differences were found when comparing the type of plant using the quantitative index (Bray Curtis and Weighted UniFrac). The composition of the major groups was similar, with Proteobacterias being more represented in both soils with about 30%, followed by Acidobacterias with around 17% and Planctomycetes and Verrucomicrobia representing approximately 10% of the total. In all the samples the genus Acidobacterium was predominant with 14 to 19% of the records (readings). Most genera had a relative abundance of 0.01-0.1%. Analysis of bacterial genera affected by irrigation conditions was performed. Ten genera in II and 16 genera in RC were detected that were significantly (p <0.05) more represented in drought conditions in comparison with good irrigation; being Chromatium belonging to GammaProteobacteria that showed the highest proportion of change in II soil, and Amycolatopsis belonging to Actinobacterias and Nevskia within the GammaProteobacteria in RC. We also observed 29 genera that showed significant differences in relation to the type of plant in II and 61 genera in RC soil. Treatments had less effect on II as compared to RC. In II, no significant differences were observed either with the irrigation regime or the type of plant and there were fewer affected genera. The analysis of bacterial community of RC soils showed a significant effect of the type of plant but not of irrigation regimes.

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