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Tesis > TEMA

Biología [ 2301 tesis ]

Biotecnología [ 15 tesis ]

Malirat, Viviana. "Variabilidad genética y antigénica del virus de la fiebre aftosa, serotipo O, entre aislamientos recuperados durante la replicación del virus en animales persistentemente infectados, y entre cepas de campo" (1996) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La variación genética y antigénica en el virus de la fiebre aftosa, O1 Campos Brasil 1/58 (O1 C/58) se ha analizado en aislamientos consecutivos, recuperados durante un periodo de uno o dos años, a partir de cuatro bovinos con infección persistente, establecida en forma experimental. La comparación de los mapas bidimensionales de fragmentos resistentes a Rnasa T1, y de la secuencia de nucleótidos de la región que codifica para la proteína inmunogénica VP1, revelaron un aumento irregular de las fijaciones de mutaciones a medida que la infección avanzaba. El grado de variación con respecto a la cepa O1 C/58, usada originalmente para establecer la infección persistente, alcanzó valores máximos de 2,4 por ciento para el genoma total y de 1,4 por ciento para la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP1. La mayoría de los cambios no eran conservados entre aislamientos consecutivos. Estos resultados, junto con los valores substanciales de velocidad de variación genómica observados entre algunos pares de aislamientos recuperados con intervalos de tiempo muy cortos, indicaron la coexistencia de poblaciones heterogéneas, que predominaban unas sobre las otras en periodos irregulares, y que evolucionaban independientemente entre sí. No se observaron padrones de variación relacionados entre los cuatro animales. También fue evaluada la diversificación genética de cepas representativas de brotes de campo, serotipo O, ocurridos en regiones endémicas del sudeste de Brasil y del centro-este de Argentina entre los años 1958 y 1983. En base a los análisis de mapas bidimensionales de fragmentos resistentes a RNasa T1, los aislamientos mostraron diferencias respecto de la cepa O1 C/58, con valores que fluctuaban entre 0,7 por ciento y 4,0 por ciento de variación, y los valores registrados en base a la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP1 fluctuaron desde 1,0 por ciento hasta 17,2 por ciento. La variación genómica registrada era independiente del tiempo transcurrido entre los aislamientos, y los cambios no eran acumulativos. Estos resultados sugieren que las variantes no emergen sucesivamente en el campo, y que probablemente representan padrones independientes de evolución, donde podrían intervenir las infecciones persistentes.

Abstract:
Genetic and antigenic variation in foot-and-mouth disease virus O1 Campos Brasil 1/58 (O1 C/58) has been analyzed in consecutive isolates recovered over a one- or two-year period from four cattle with experimental persistent infections. Comparisons of RNase T1 two-dimensional maps and nucleotide sequences of the VP1-coding region revealed an oscillatory increase in the fixation of mutations as the infection progressed. The degree of variation with respect to the strain O1 C/58 used originally to establish the persistent infection, reached values of up to 2,4 per centum for the overall genome, and 1,4 per centum for the nucleotide sequence of the VP1-coding region. Most changes were not conserved in consecutive isolates. These results, together with the substantial rates of genomic variation observed between some pairs of strains recovered at close time periods, suggested the coexistence of heterogeneous populations in which variants predominate at irregular time intervals and evolve independently from each other. Furthermore, non-related patterns of variation were observed in the four animals. Genetic diversification of representative strains from major serotipe O outbreaks in endemic disease regions of southeastern Brazil and central-eastern Argentina between 1958 and 1983, was evaluated. On the basis of oligonucleotide fingerprinting, isolates showed variations, with respect to the early strain O1 C/58, ranging between 0.7 per centum and 4.0 per centum, and values between 1.0 per centum and 17.2 per centum on the basis of nucleotide sequencing of part of the VP1-coding region. The extent of differences among the genomes was independent of the time elapsed between viral isolations. Moreover, changes did not accumulate in subsequent samples. These results suggested that variants did not emerge successively in the field, and probably represent independent patterns of evolution, where persistent infections might be involved.

Quagliano, Javier Carlos. "Producción microbiológica del poliester biodegradable poli-3-hidroxibutirato (PHB) a partir de Azotobacter chroococcum 6B" (1998) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El poli-3-hidroxibutirato (PHB) es un poliéster de origen bacteriano obtenido bajo condiciones de estrés nutricional en el medio de cultivo. Se acumula en el citoplasma dentro de gránulos y representa para el microorganismo una reserva de carbono y poder reductor. El PHB es un polímero biodegradable, biocompatible, de regular cristalinidad y moderada resistencia mecánica, utilizable en varias aplicaciones una vez procesado, como por ejemplo en la fabricación de envases plásticos completamente biodegradables. Al obtenerse además a partir de fuentes de carbono naturales renovables, representa un material promisorio para reemplazar a los plásticos sintéticos en algunas áreas. En este Trabajo se optimizó en primer lugar un medio de cultivo para la obtención de PHB a partir de una cepa de Azotobacter chroococcum aislada de una muestra de suelo, para luego estudiar el efecto de distintas condiciones y sistemas de cultivo sobre el contenido de biomasa celular y PHB. Se estableció el efecto de la tasa de aireación y de la relación carbono/nitrógeno bajo cultivo en fermentador sobre el contenido de biomasa, PHB, rendimientos de biomasa y PHB a partir de la glucosa consumida, velocidad especifica de crecimiento y de formación de PHB. Un modelo para la obtención del rendimiento real de PHB que utiliza los datos experimentales del contenido de PHB, rendimiento de biomasa y el valor del rendimiento teórico fue aplicado a los resultados obtenidos. Por último, para contribuir al conocimiento de un área poco investigada en Azotobacter sp., se estudió el efecto de las condiciones fermentativas sobre las propiedades fisicoquimicas del PHB obtenido (cristalinidad, resistencia mecánica, estabilidad térmica y especialmente sobre el peso molecular relativo, factor que afecta en mayor medida al PHB en cuanto a su utilización). Tres potenciales aplicaciones del PHB fueron desarrolladas: i) como película de soporte para el cultivo de epidermis, ii) como película para el peleteado de semillas de alfalfa utilizadas como inoculante y iii) como matriz para el microencapsulamiento de enzima celulasa para su uso como aditivo en ensilado de pasturas.

Abstract:
Poly-3-hydroxybutyrate (PHB) is a bacterial polyester obtained under nutritional stress in the culutre media. It accumulates as granules inside the citoplasm and represents a carbon and reducing power source. PHB is a biodegradable and biocompatible polymer, with regular crystallinity and mechanical strength, utilizable in several applications once processed, such as for the production of completely biodegadable containers. Additionally, as it is obtained from natural and renewable carbon sources, it looks as a possible material for replacing synthetic plastics in some areas. At first, on this work, a culture media for PHB production was optimized, using a strain of Azorobacrer chroococcum isolated from a soil sample, then the effect of different conditions and culture systems was studied on biomass and PHB content. The effect of aeration rate and carbon/nitrogen ratio under fermentor cultivation was established over biomass and PHB contents, biomass and PHB yields from consumed glucose, specific growth rate and PHB formation. A model for obtaining overall PHB yields from the experimental data of PHB contents, biomass yield and theoretical yield value was applied to the obtained results. For contributing to the knowledge of a scarcely investigated area on Azorobacrer sp., the effect of fermentation conditions was studied on PHB physicochemical properties (crystallinity, mechanical strength, thermal stability and specially on the relative molecular weight, which affects PHB mostly for its utilization). Ihree potential applications were developed: i) as a film for supporting epiderrmal growth for burn cases, ii) as film for alfalfa seed pelleting used as inoculants and iii) as a matrix for the microencapsulation of the enzyme cellulase for its utilization as additive on grass silage.

Cortón, Eduardo. "Desarrollo y aplicaciones de biosensores enzimáticos y microbianos" (2000) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Se construyeron biosensores enzimáticos cableados basados en la inmovilización de una oxidasa (glucosa oxidasa, lactato oxidasa ó peroxidasa) en un hidrogel redox formado por el entrecruzamiento de la enzima, polialilamina conteniendo un cornplejo de osmio (PAAOs) y polietilediglicidiléter (PEG) como entrecruzante, sobre electrodos de carbón vítreo y de oro. Se estudió el rango de linealidad y la reproducibilidad de estos electrodos al ser utilizados como detectores en un sistema FIA. Utilizando electrodos basados en glucosa oxidasa se estudió el efecto de distintas proporciones de entrecruzante (PEG); utilizando técnicas de voltametrías cíclicas se estudió el efecto del cambio de fuerza iónica en el medio. La leche afecta de manera irreversible a estos electrodos monoezimáticos. Se diseñaron distintos tipos de biosensores bienzimáticos bicapa, en los que peroxidasa entrecruzada con PAAOs se encuentra en la capa mas cercana al electrodo, y lactato oxidasa en la capa más externa. Se estudió el efecto de la leche sobre ambas capas enzimáticas, demostrandose que esta configuración es más apropiada para la determinación de la concentración de L-lactato en muestras Iácteas. Se ha descripto un método rápido para determinar la capacidad fermentativa de distintas especies de Lactobacillus. Este método permite cuantificar esta capacidad, proporcionando una información mas completa del metabolismo de los hidratos de carbono; posibilita el estudio de cepas mutantes suministrando inforrnación más completa acerca de las posibles modificaciones en el metabolismo de los fuentes de carbono utilizadas.

Abstract:
Enzymatic "wired" biosensors based in the immobilization of one oxidase (glucose oxidase, lactate oxidase or peroxidase) within an redox hydrogel formed by crosslinking of enzyme, polyallylamine containing an osmium complex (PMOS) and poly(ethy1ene glycol) (PEG), onto glassy carbon or gold electrodes were constructed. We study the reproducibility and lineal span of these electrodes when they were used as detectors in a FIA system. To complete their characterization we study the effect of different PMOS 1 PEG ratios in the construction of enzymatic biosensores, the effect of pH, temperature and ionic strength. The effect of milk samples and their response were analyzed, these complex analytical matrix affect these electrodes catalytic current. We designs bilayer bienzyme biosensors; in these system the peroxidase layer, over the electrode ("wired"), are separated from the outer membrane containing lactate oxidase (not "wired1'). We study the effect over both layer of milk samples; from these studies a bienzyme electrode configuration was found as the most appropriate array from the determination of L-lactate in milk samples. A microbial biosensor based on calcium alginate immobilized Lactobacillus cells coupled to a pH electrode was developed for quantitative determination of carbohydrate fermentation activity. The evolution of acid production in a continuous flow-stopped biorreactor was monitored for different sugar solution. The procedure can give quantitative results compared to other reported techniques for carbohydrate fermentation pattern from which only qualitative results are obtained.

Loray, María Alicia. "Estudio y mejoramiento genético de levaduras osmotolerantes" (2002) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Entre las levaduras existen especies osmotolerantes como D. hansenii, T. delbrueckii, S. octosporus, y especies consideradas no osmotolerantes como, por ejemplo, S. cerevisiae. Algtmas levaduras osmotolerantes son utilizadas en la producción de determinados productos alimenticios mientras otras se encuentran como organismos contaminantes en varios alimentos. Sin embargo, Saccharomyces cerevisiae es la levadura empleada tradicionalmente en la industria para la producción de diversos productos. Algunos de estos bioprocesos se desarrollan en medios con alta presión osmótica y esto limita su rendimiento en los procesos mencionados. Se realizaron diversas fusiones de protoplastos entre levaduras osmotolerantes y diferentes cepas industriales de S. cerevisiae con el objeto de obtener híbridos que reúnan características de interés industrial de ambos parentales, para luego caracterizarlos principalmente en cuanto a su comportamiento en medios hiperosmóticos. Las fusiones de protoplastos realizadas entre las levaduras S. cerevisiae P-158 y Torulaspora delbrueckii CBS-813 y entre S. cerevisiae UCD-522 y Debaryomyces hansenii NRRL Y-7393, dieron como resultado productos de fusión estables que adquirieron el carácter osmotolerante. Estos productos de fusión y las cepas parentales fueron estudiados con respecto a su tolerancia osmótica y a otros aspectos fisiológicos como: morfología, asimilación y fermentación de azúcares, patrones electroforéticos de cromosomas y proteínas, cinética de crecimiento en medios de diferente osmolaridad, producción de polihidroxialcoholes y mecanismos de transporte de monosacáridos a través de la membrana plasmática. Al estudiar el efecto que tienen elevadas concentraciones de NaCl sobre el funcionamiento celular y el desarrollo del cultivo se observó: disminución de la μmax de crecimiento; disminución del rendimiento en la producción de biomasa; aumento de la síntesis y de la retención intracelular de polioles; alteración del potencial de membrana (Δψ)de las células; alteración del transporte de monosacáridos; disminución de la velocidad de consumo específico de oxígeno en presencia de glucosa; alteración de los patrones electroforéticos de proteínas totales y de membrana plasmática.

Abstract:
The most useful yeast for the industry is still being Saccharomyces cerevisiae, however this specie is not osmotolerant, and because some particular industrial processes are carried out on high osmotic environment, the yields of those processes are not as high as desired. There are some osmotolerant yeast species like Debaryomyces hansenii, Torulaspora delbrueckii, Schizosaccharomyces octosporus. Some of them are used on food manufacturing industry, but also are found as contaminant on other processes. The aim of this work was to develop yeast strains capable to being used as S. cerevisiae but also with the osmotolerant characteristic. We have carried out protoplast fusion between different industrial strains of S. cerevisiae and osmotolerant yeasts and we studied and characterized the obtained hybrids. The fusion between S. cerevisiae P-158 and T. delbruecki CBS-813, and between S. cerevisiae UCD-522 and D. hansenii NRRL Y-7393, yielded stabled hybrids which showed the desired characteristics of the parental strains. The fusion products as wells as their parental strains were studied in order to characterize their physiological behavior in high osmotic environments and also in general aspects as morphology, sugar assimilation and fermentation, proteins and chromosomal electrophoretical profiles, growth kinetics, polyhidroxyalcohols production and monosaccharides membrane transport mechanism. Studying the impact of high NaCl concentrations to the cell physiology, we observed that the maximum specific growth rate and the biomass yields decreased; the synthesis and accumulation of intracellular poliols increased; a membrane potential were modified; the monossaccharides transport were altered; the specific comsuption oxygen rate in media contained glucose decreased and that the electrophoretical profiles of total and plasmatic membranes proteins were modified.

Juárez, Angela Beatriz. "Estudios biológicos y enzimáticos en Chlorella kessleri (trebouxiophyceae, chlorophyta)" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este trabajo de tesis, se abordaron estudios sobre distintos aspectos de la biología de una cepa de Chlorella kessleri, aislada de la Laguna verde (Complejo Termal Copahue, Neuquén, Argentina), que no había sido estudiada previamente. Se realizó la caracterización morfológica, ultraestructural, bioquímica y fisiológica de esta cepa autóctona y se asignó su correcta identidad taxonómica. La identificación de esta especie constituyó una cita nueva para la Argentina, el segundo registro mundial de la especie en un ambiente natural, y una nueva cita de una especie del género Chlorella en un ambiente de origen volcánico. Además, se realizaron estudios enzimáticos, relacionados con los pasos regulatorios claves del camino biosintético de las clorofilas. Se determinaron, por primera vez en Chlorella kessleri, las actividades de dos enzimas involucradas en el primer paso regulatorio de este camino (síntesis del primer metabolito, ácido d -aminolevulínico), detectándose la presencia de actividad de las enzimas d -aminolevulínico sintetasa y g ,d -dioxovalerato transaminasa. Se estudió y caracterizó por primera vez en una Chlorophyta y por segunda vez en algas en general, la enzima del segundo paso regulatorio clave del camino (uroporfirinógeno decarboxilasa, UroD). Los estudios realizados sobre la actividad de esta última enzima en función de distintas condiciones (fase de crecimiento del cultivo, pH, temperatura, tiempo de incubación, tiempo de almacenamiento, concentración de proteínas, concentración de sustrato) permitieron caracterizar la UroD de C. kessleri y sentar las bases para la determinación de su actividad en las microalgas. Adicionalmente, se llevó a cabo la purificación parcial de esta enzima y se estableció que su estructura correspondería a un heterodímero de ca. 116 ± 7 kDa constituido por dos monómeros de ca. 72 ± 7 kDa y 66 ± 5 kDa de masa molecular. Al mismo tiempo, se estudiaron dos aspectos importantes relacionados con la biología aplicada de las microalgas: La potencial aplicación de esta cepa y alguna de sus propiedades como índice de contaminación ambiental con metales y xenobióticos, analizando el efecto de un metal pesado (cobre) y un hidrocarburo aromático polihalogenado (hexaclorobenceno) sobre la actividad de la enzima UroD. Se observó que, en las condiciones ensayadas, C. kessleri tolera concentraciones de cobre más elevadas que las informadas para otras especies del género (no se registró inhibición de la tasa de crecimiento) y que este metal afecta principalmente el contenido de clorofila y la actividad de la enzima UroD. Mientras que el hexaclorobenceno afecta principalmente el crecimiento de la especie y su actividad UroD a tiempos cortos de exposición, existiendo una recuperación a tiempos más largos. Los resultados obtenidos muestran que la determinación de la actividad UroD puede constituir un biomarcador de la contaminación reciente con hidrocarburos aromáticos polihalogenados y de la toxicidad de niveles de cobre que no alcanzan a producir efectos ponderables sobre el crecimiento algal. La potencialidad de esta cepa como fuente de compuestos biológicamente activos, evaluando la actividad antimicrobiana de extractos extracelulares de cultivos axénicos de C. kessleri frente a 11 cepas de microorganismos patógenos. Estos extractos mostraron actividad inhibitoria frente a todas las cepas ensayadas, tres de las cuales corresponden a bacterias altamente patógenas y resistentes a las drogas antibacilares de uso clínico actual. Los resultados obtenidos muestran la potencialidad de los cultivos de C. kessleri para la extracción, aislamiento e identificación de metabolitos farmacológicamente activos que puedan ser producidos y utilizados en la industria farmacéutica.

Abstract:
This disertation deals with the study of different biological aspects of a Chlorella kessleri strain isolated from Laguna Verde (Complejo Termal Copahue, Neuquén, Argentina). It was carried out the morphological, ultrastructural, biochemical and physiological characterization and the correct taxonomical determination of this autochtonous strain. This species is a new record for Argentina, the second record in the world and a new specific recording of the genera for volcanic environments. In addition enzymatic studies related with the regulatory steps of the chlorophyll biosynthetic pathway were made. For the first time in C. kessleri the activity of two enzymes related with the first regulatory step of this pahtway were studied. Evidences of the activity of the enzymes d -aminolevulinic synthase and g ,d -dioxovalerate transaminase were detected. For the first time in a green algae (Chlorophyta) and for second time in an algae, it was studied and characterized the enzime uroporphyrinogen decarboxylase (UroD). The studies in the activity of the UroD in different conditions (growing culture phase, pH, temperature, incubation time, storage time, protein concentration and substrate concentration), allow to characterize the enzyme. In addition partial purificated enzyme was obtained and it was established that UroD is an heterodimer of ca. 116 ± 7 kDa formed by two monomers of ca. 72 ± 7 kDa and 66 ± 5 kDa. At the same time two important aspects related with the applied biology of the microalgae were studied: 1) The potential application of this strain as an index of heavy metal and xenobiotic environmental contamination. 2) The potential usage of this strain as an source of products with biological activity. Analizing the effect of the copper and hexachlorobenzene on the C. kessleri strain it was observed that this species has a higher rank of tolerance for this heavy metal than other species of the same genera. This metal affect the chlorophyll content and the activity of the UroD. On the other hand, the hexachlorobenzene affect the growing of the species and the UroD activity in short exposure times. The results show that the activity of the UroD it would be an excellent tool to establish the levels of contamination due to HCB or copper contamination. In the other aspect C. kessleri extracellular extracts were tested against 11 pathogenic strains, testing its inhibitory properties, the results were positive in all cases. The results show C. kessleri cultures potential as a source of pharmacological substance.

Campos, Eleonora. "Obtención de mutantes de Brucella abortus genéticamente definidas: su caracteización molecular y evaluación de su uso como vacunas para la brucelosis bovina" (2003) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El desarrollo de las técnicas de ADN recombinante permitió la generación de vacunas racionalmente diseñadas. Teniendo esto en cuenta, el objetivo de este trabajo es la obtención de cepas de Brucella abortus genéticamente modificadas que puedan ser utilizadas como vacunas contra la brucelosis. La brucelosis es una zoonosis bacteriana causada por especies del género Brucella, un grupo homogéneo de patógenos intracelulares facultativos que tienen la habilidad de sobrevivir y multiplicarse en fagocitos profesionales y no profesionales. En bovinos, Brucella abortus produce una enfermedad crónica caracterizada por aborto, nacimiento de terneros enfermos y fertilidad reducida. La cepa vacunal para la brucelosis bovina en uso en la mayoría de los países es la cepa B. abortus Sl9, que confiere un 70 a 80% de protección contra el aborto pero genera dificultades en el serodiagnóstico y conserva considerable virulencia residual para el hombre. Con el fin de obtener cepas de B. abortus que sean compatibles con un ensayo diagnóstico diferencial y que tengan menor virulencia residual que Sl9, se construyó la cepa doble mutante B. abortus INTA] (II) por inactivación de los genes bp26 y bmp18. BP26 es una proteína periplásmica inmunodominante durante la infección con Brucella que no influye en la persistencia ni en la protección de la cepa en ratones BALB/c. BMP18 es una lipoproteína de membrana externa, también descripta como Ompl9, cuya anulación en Sl9 genera menor capacidad de replicar en el bazo de los ratones aunque con igual persistencia y capacidad protectiva. La cepa INTAl resultó más atenuada que S19, pero mantuvo su capacidad protectiva en el modelo ratón. Esta cepa mostró mayor sensibilidad a temperatura, a agentes hidrofóbicos y a moléculas policatiónicas que Sl9 y esta sensibilidad fue revertida por una copia funcional del gen bmp18. Para determinar la contribución de BMP18 a la virulencia de Brucella, se generó la cepa Ml8v por inactivación de bmpl8 en la cepa patógena B. abortus 2308. M18v no mostró diferencias significativas respecto de S2308 en su habilidad para sobrevivir y replicarse en macrófagos, pero fue más atenuada en ratones. Por lo tanto, la falta de expresión de BMP18 generaría desorganización de la membrana externa, haciendo a la bacteria más susceptible a mecanismos bactericidas del suero pero sin afectar significativamente su supervivencia intracelular. Para evitar el uso de genes que confieren resistencia a antibióticos en el desarrollo de cepas vacunales, se diseñó una estrategia para la generación de mutantes ísogénicas utilizando el gen sacB como marcador de contraselección. Con esta estrategia, se obtuvo la cepa B. abortus Mlluc por reemplazo de parte de la secuencia de bp26 por el gen luc en Sl9 y posteriormente la cepa doble mutante INTA2 (I2) por deleción del gen bmp18 en la cepa M1luc. Al evaluar las cepas Mlluc e I2 en bovinos, la protección obtenida contra el aborto después del desafio con una cepa patógena fue equivalente para Sl9 y Mlluc pero menor para I2. Estos resultados indican que la falta de BP26 no tiene efecto alguno sobre la capacidad de Sl9 de inducir una respuesta inmune protectiva tanto en el modelo ratón como en el hospedador natural. Sin embargo, la falta de expresión de BMP18 en Sl9 genera menor capacidad protectiva en bovinos. En las condiciones de desafio experimental de este ensayo, la respuesta humoral contra BP26 cuantificada por iELISA presentó gran heterogeneidad y bajos niveles de sensibilidad, para parámetros de especificidad óptima. La estrategia desarrollada para la obtención de mutantes ísogénicas en más de un gen sin marcadores de resistencia a antibióticos permitirá la posibilidad de generar cepas de Brucella con múltiples mutaciones definidas de manera de obtener cepas vacunales efectivas y seguras para animales y humanos que puedan ser utilizadas en el control de esta enfermedad.

Abstract:
Recombinant DNA technology has led to the development of rationally designed vaccines. In this context, the aim of this project was to develop genetically modified strains of Brucella abortus that could be used as vaccines against brucellosis. Brucellosis is a bacterial zoonosis caused by species from the genera Brucella, an homogenous group of intracellular facultative pathogens that have the ability to survive and replicate in professional and non-professional phagocytes. In bovines, Brucella abortus produces a chronic disease characterized by abortion, birth of sick calves and reduced fertility. The vaccine strain in use for bovine brucellosis in most countries is B. abortus Sl9. This strain confers 70 to 80% protection against abortion but generates difficulties in serodiagnosis and retains considerable residual virulence for human beings. The double mutant strain B. abortus INTA1 (II) was constructed by inactivation of bp26 and bmp18 genes, with the objective of obtaining strains of B. abortus that could have an associated differential diagnostic test and that are less virulent than Sl9. BP26 is a periplasmic protein that is inmunodominant during infection with Brucella. The lack of expression of this protein in Sl9 does not affect the strain persistence or protection capacity in the mouse model. BMP18 is an outer membrane lipoprotein, also reported as Ompl9. When its expression was abrogated in Sl9, the resulting mutant strain showed less replication in mice spleen, suggesting attenuation, although it maintained its protection capacity. B. abortus I1 resulted more attenuated than Sl9 and retained its protection capacity in the mouse model. This strain showed more sensitivity than Sl9 to temperature, hydrophobic agents and policationic molecules, and this phenotype was reverted by a functional copy of bmp18. In order to establish BMP18 contribution to Brucella virulence, bmp18 gene was mutated in pathogenic strain B. abortus 2308, generating strain Ml8v. This strain did not show any significant differences respect to S2308 in its ability to survive and replicate in murine macrophages, but was more attenuated in mice. Therefore, lack of expression of BMP18 would disrupt membrane integrity, probably leading to more susceptibility to sera bactericidal mechanisms but not affecting significantly intracellular survival. In order to avoid the use of antibiotic resistance markets in the construction of vaccine strains, a mutagenesis strategy for obtaining isogenic strains using sacB as counterselection marker was developed. With this strategy strains B. abortus Mlluc (Sl9 ∆bp26::luc) and INTA2 (I2) (Sl9 ∆bp26::luc Abmpl8) were obtained, replacing most of bp26 coding region for luc gene in M1luc and then deleting also most of bmp18 in the double mutant 12, without incorporating drug resistance markers. When strains M1luc and 12 were evaluated in bovines, protection against abortion was equal for Sl9 and M1luc but considerably reduced for I2. These results indicate that lack of BP26 has no effect in Sl9 protection capacity either in mice or the natural host. However, lack of BMP18 in Sl9 generates less protection capacity in bovines. In the conditions of experimental challenge of this assay, the humoral response against BP26 recombinant protein measured by iELISA after challenge presented high heterogeneity and poor sensitivity respect to LPS response, considering parameters of optimal specificity. The strategy for generation of mutant isogenic strains in more than one gene without the incorporation of antibiotic resistance markers opens the possibility of achieving strains with multiple defined mutations. This will most certainly lead to effective and safer vaccine strains against brucelosis.

Sarnacki, Sebastián Hernán. "Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente.

Abstract:
DNA adenine methyltransferase (Dam) enzyme is a global regulator of bacterial gene expression. In previous studies, Salmonella Typhimurium dam mutants have been proposed as excellent vaccines strains because of their characteristic of attenuation and protective capabilities. By extension, dam gene mutation has been proposed as a method for attenuating a variety of bacterial species. Given our interest in the study and prevention of infections with Salmonella Enteritidis, a serotype that most commonly causes enterocolitis in humans, we generate S. Enteritidis dam mutants by transposition and site-directed mutagenesis by replacement. Interestingly, studies in Balb/c mice showed that the S. Enteritidis dam mutants, are only moderate in their attenuation. Thirty percent (30%) of animals inoculated by the intragastric route with the mutant died within 3 weeks. Moreover, the protection of immunized animals challenge with the virulent strain of Salmonella Enteritidis # 5694, did not reach acceptable levels. Given the critical role that macrophages play in innate immunity against Salmonella, we analyzed the interaction between SEΔdam mutant and macrophage cell line RAW 264.7. By Western blot, we found that the expression of inflammatory molecules in macrophages infected with SEΔdam is attenuated. As activation of the inflammatory response of macrophages is generated in part by bacterial antigens, we wondered whether the lack of Dam might be affecting the structure or function of certain effector proteins or lipopolysaccharide (LPS) of Salmonella Enteritidis. Therefore, we studied the involvement of Dam on protein synthesis and secretion of two effector proteins both dependent on type 3 secretion systems. To this purpose, we constructed and characterized Salmonella dam mutants carrying sopA and sopB genes tagged with the FLAG epitope. The results showed that the dam mutant has a reduced expression and secretion of SopA and SopB invasion proteins, which are Salmonella pathogenicity island (SPI-1)-dependent. This finding indicates that Dam methylation is involved in the regulation of the synthesis and secretion of SopA and SopB proteins in Salmonella as an upregulator of these genes. We also investigated the involvement of the Dam enzyme in S. Enteritidis LPS synthesis. We found that compared to the parental strain, a SEΔdam mutant synthesized LPS with shorter O-antigen polysaccharide chain lengths. Since Wzz is responsible for the chain length distribution of O-antigen, we investigated whether Dam methylation is involved in regulating wzz gene expression. Densitometric analysis of Western blot with samples of protein extracts showed that the relative amount of Wzz protein produced by SEΔdam is three-fold lower than that of the parental strain. Concomitantly, wzz gene promoter activity in SEΔdam was reduced, as measured by chromosomal transcriptional fusion with a reporter gene, and this result was further confirmed by the amount of mRNA as measured by RT-PCR quantitative real-time analysis. Also, the expression of pmrA and rcsB genes (two wzz gene regulators) in the dam mutant was reduced. However, the defect in the chain length distribution of O-antigen of the SEΔdam, was associated only with RcsB. Our results show that Dam methylation regulates the LPS synthesis of Salmonella. Overall, these results indicate that Dam methylation in Salmonella regulates functions related intimately to the host-bacteria interaction. Therefore, the dam gene deletion as a method of attenuation of vaccine strains must be analyzed critically.

de Almeida, Alejandra. "Análisis de cepas recombinantes de Escherichia coli productoras de poli (3-hidroxibutirato): efecto de la acumulación del polímero y de la proteína PhaP sobre el metabolismo y la expresión génica" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
El poli(3-hidroxibutirato) (PHB) en un polímero biodegradable de gran interés biotecnológico, debido a que presenta propiedades físicas similares a las de los plásticos derivados del petróleo. Con el fin de optimizar su producción, se construyó una cepa recombinante de Escherichia coli que expresa los genes responsables de la síntesis de PHB de Azotobacter sp. FA 8. Esta cepa recombinante también expresa la proteína PhaP, la cual se asocia a los gránulos de PHB y afecta positivamente la síntesis del polímero. Se estudió la acumulación de biomasa y PHB, y las propiedades físicas del polímero, en esta cepa y en la cepa sin PhaP, observándose que la cepa que expresa PhaP produce más PHB y biomasa que la cepa isogénica. En estudios realizados en biorreactor se observaron variaciones en la síntesis de PHB y de diferentes productos metabólicos, al utilizar distintas fuentes de carbono y niveles de aireación, lo que le permitiría a las bacterias adaptar los flujos de carbono y energía a las diferentes condiciones ensayadas. Con el fin de determinar las modificaciones en E. coli cuando acumula PHB, y los posibles efectos de PhaP, se estudió la expresión de diferentes genes mediante qRT-PCR y arrays de DNA en cepas productoras y no productoras de PHB. Se observaron grandes diferencias en la expresión de genes relacionados con el hambreado en nitrógeno, cuya expresión fue mayor en las cepas productoras. Esto podría deberse a la competencia por los metabolitos precursores, acetil-CoA y poder reductor. Inesperadamente, se encontró una menor expresión de genes de estrés al comparar la cepa de E. coli que acumula el polímero y expresa PhaP con la cepa control (que no acumula el polímero ni expresa PhaP). A raíz de estos resultados, se estudió el efecto de PhaP sobre la fisiología de E. coli, en ausencia de PHB. Se observó que PhaP promueve el crecimiento de E. coli, y que además la protege contra estrés térmico. Estos resultados sugieren que PhaP tendría un efecto protector en E. coli, el cuál podría ser de gran utilidad en la producción de compuestos heterólogos.

Abstract:
Poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) is a biodegradable polymer of great biotechnological interest, because it has physical properties similar to fuel-derived plastics. In order to optimize the production of PHB, we constructed a recombinant Escherichia coli strain that expresses the phb genes from Azotobacter sp. FA8. This recombinant strain also produces the protein PhaP, which is found associated to PHB granules and positively affects PHB synthesis. We studied the accumulation of biomass, PHB, and physical properties of the polymer produced in this strain, and in the strain lacking PhaP. The strain that expresses PhaP produced more PHB and biomass that the isogenic strain. The production of PHB and several metabolic products varied in bioreactor cultures when using different carbon sources and aeration conditions, allowing bacteria to adjust carbon and energy flow. To study the effect of PHB and PhaP on recombinant E. coli, we studied the expression of different genes by qRT-PCR and microarray analysis. In the PHB-producing strains there was an increase in the expression of genes related with nitrogen metabolism, which could be related to the fact that acetyl-CoA and reducing power are needed for the production of PHB. We also observed that the production of the polymer generates a stress response in E. coli, similar to a heat shock response, which is diminished in the presence of PhaP. Surprisingly, the expression of stress-related genes was lower in the PHB and PhaP producing strain, that in the strain which does not express either PHB or PhaP. Based on these results, we studied the effect of PhaP on the physiology of E. coli, in the absence of PHB. PhaP-bearing strains grew more, and were more resistant to heat stress. These results suggest that PhaP has a protective effect on E. coli, which could be very useful for the production of heterologous products.

Góngora, Adrián Daniel. "Supresión de la angiogénesis tumoral a través de anticuerpos monoclonales" (2010) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La angiogénesis es el mecanismo por el cual se generan nuevos vasos sanguíneos a partir de los pre-existentes. En adultos, la angiogénesis es un evento raro excepto durante la reparación de heridas o en procesos asociados con el ciclo menstrual. Sin embargo, existen desórdenes patológicos dependientes de angiogénesis, como el desarrollo de tumores, la retinopatía diabética, la artritis reumatoidea, entre otras. Este proceso, es modulado en condiciones normales y patológicas por el balance entre factores positivos (pro-angiogénicos) y negativos (anti-angiogénicos), y ha sido propuesto como un factor limitante en el desarrollo tumoral, jugando también un papel importante en la metástasis. Los melanomas son tumores muy agresivos y resistentes a las terapias antineoplásicas que se caracterizan por expresar diversos factores de crecimiento. Estos pueden actuar en forma autocrina e intracrina sobre la proliferación y sobrevida, y en forma paracrina en la angiogénesis. Entre estos factores se destacan el VEGF y el FGF-2. Este trabajo tiene como objetivo principal el desarrollo de anticuerpos monoclonales (AMs), capaces de neutralizar los efectos biológicos del VEGF y del FGF-2 sobre las células endoteliales y evaluarlos terapéuticamente sobre el crecimiento tumoral en ratones atímicos, inducidos por distintas líneas de melanoma humanos. También, se caracterizó la expresión de estos factores en las líneas de melanoma para evaluar si existe una relación entre el efecto terapéutico de dichos AMs y el patrón de expresión de dichos factores en las líneas de melanoma. Concluimos que sólo el bloqueo del VEGF con AMs conduce a una reducción del crecimiento tumoral, mientras que el bloqueo del FGF-2 con AMs no mostró efectos terapéuticos en los modelos ensayados, incluso en las líneas que sobre-expresaban FGF-2, ni la combinación de ambos AMs sinergizó el efecto terapéutico del AM anti-VEGF. Por otro lado, si bien el efecto del bloqueo del VEGF con AMs se observó en todas las líneas neoplásicas ensayadas, evidenciaron una gran diferencia en la respuesta, dependiendo de los niveles de expresión de FGF-2. Las líneas de melanoma que sobreexpresan FGF-2 (A375 y 1205Lu) mostraron una mayor resistencia a esta terapia antiangiogénica, con una reducción del tamaño tumoral del orden del 50% respecto a los controles. Sin embargo, en la línea de melanoma que expresa bajos niveles de FGF-2 (IIB-Mel-J) esta reducción fue cercana al 90%. En conclusión, demostramos que solo el bloqueo del VEGF con AMs es efectivo en el tratamiento de melanomas experimentales y encontramos que este efecto terapéutico es en parte dependiente de los niveles de expresión de FGF-2, que actuaría en forma intracrina, generando una resistencia al tratamiento mencionado. De esta manera, contribuimos a definir al FGF-2 como un posible marcador de resistencia a esta terapia en melanoma. Finalmente, a partir del AM anti-VEGF, desarrollamos un anticuerpo recombinante de cadena simple (scFv-Fc) neutralizante de la actividad biológica del VEGF. Resultados preliminares indican que con solo un bajo porcentaje de células transfectadas con un plásmido que expresa el scFv-Fc anti-VEGF, xenotransplantadas en ratones atímicos, alcanza para disminuir significativamente la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

Abstract:
Angiogenesis is the process by which new blood vessels sprout from pre-existing vasculature. In adults, angiogenesis is a rare event except during the wound healing or menstrual cycle. However there are pathological disorders like tumors, diabetic retinopathy, and rheumatoid arthritis, among others, that depends on angiogenesis. This process is controlled in normal and pathological conditions by a balance between positive (pro-angiogenic), and negative (anti-angiogenic) factors, and it has been proposed as a limiting process in tumor development, and metastasis. Melanoma is an aggressive tumor resistant to antineoplastic therapies and are known to express several growth factors that can act as an autocrine and intracrine way in proliferation and survival and as a paracrine way in angiogenesis. Among other factors, VEGF and FGF- 2, are the more important pro-angiogenic factors. The aim of this work was to develop two monoclonal antibodies (MAs) able to block the biological effects of VEGF and FGF-2 on endothelial cells growth, and to evaluate their therapeutic effect on human melanoma cells growing in athymic mice. Moreover, we have characterized the expression of these factors in three melanoma cell lines, to evaluate the possible relationship between the therapeutic effect of these MAs and the expression of these factors in those cells. We have concluded, that only the MA anti- VEGF induces a reduction on tumor growth, while MAs against FGF-2 showed no antitumor activity on the assayed models, even in cell lines that overexpress this factor, and the combination of both MAs did not show improvements in the MA anti-VEGF therapeutic effect. On the other hand, although the therapeutic effects of VEGF inhibition was observed in all cell lines studied, we have found a great response differences depending on FGF-2 expression levels. Cells that overexpressed FGF-2 (A375 y 1205Lu), showed a greater resistance to this anti-angiogenic therapy with only a 50% on tumor size reduction as compared with the untreated mice. Nevertheless, when the xenotransplanted mice carrying melanoma cell line (IIB-Mel-J), that express lower values of FGF-2, were treated with MA anti-VEGF, the tumor mass reduction was near 90%. In conclusion, we have demonstrated that only the use of MA anti-VEGF is responsible for the decrease of experimental melanoma progression and we found that this therapeutic effect is in part dependent on FGF-2 expression levels, acting as an intracrine factor given rise to anti- VEGF therapy resistance. In this way, we have defined FGF-2 as a possible melanoma resistance molecular marker to this therapy. Finally, from the MA anti-VEGF, we have developed a recombinant single chain version (scFv) that neutralizes VEGF activity. Preliminar results indicated that only few percentage of melanoma cells transfected with a plasmid codifing scFv-Fc anti-VEGF, and xenotransplanted in athymic mice, are enough to reduce both angiogenesis and tumor progression.

Sabio y García, Julia Verónica. "Uso de Brucella abortus como vector para la expresión de antígenos heterólogos" (2011) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Auzmendi, Jerónimo Andrés. "Desarrollo de tecnología para el estudio de la activación rápida de canales iónicos" (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los canales iónicos son proteínas multiméricas que regulan el pasaje de iones a través de la membrana celular acoplando su funcionamiento a factores externos como el voltaje de membrana y/o presencia de ligandos específicos. Sus dinámicas de cambio de estado pueden ser descriptas cuantitativamente en términos de un proceso de Markov, aleatorio y sin memoria. Las constantes cinéticas de estos procesos pueden ser obtenidas, a partir de resultados experimentales, con la estimación de la máxima verosimilitud (EMV), empleando el algoritmo recursivo de cadenas ocultas de Markov. En el caso particular de los canales activados por ligando se han postulado estados parciales de energía intermedia (FLIP-STATE), para explicar retardos durante la activación del receptor. Para dilucidar si la existencia de estos estados es una propiedad del receptor o de cada una de las subunidades es necesario poder realizar aplicaciones de agonista aún más breves que las del estado de arte (0.2 ms). Por tal motivo en esta tesis se presenta la creación de un método que permite realizar aplicaciones discretas de agonista ultra-rápidas (20 μs), sobre una preparación de outside-out patch clamp, marcando una mejora sustancial de 10- 50 veces comparado con el estado del arte actual y a los dispositivos comerciales, respectivamente. Se analizó el rango de condiciones en el que esta técnica puede s er empleada y se realizaron modificaciones para generar aplicaciones arbitrarias del agonista maximizando la información cinética obtenida por experimento. Por último, se realizó un análisis teórico, bajo la óptica de la estadística Bayesiana, de la respuesta de canales a aplicaciones ultra-cortas de agonista. Empleando esta técnica y método de análisis puede discriminarse entre modelos que ajustan igualmente los datos experimentales.

Abstract:
Ion channels are multimeric proteins that regulate the passage of ions through cell membrane coupling their functioning to external factors like membrane voltage and/or the presence of specific ligands, etc. Their change of state dynamics can be quantitatively descripted in terms of a Markov’s process, random and without memory. The kinetic constants of these processes can be obtained, from experimental results, with the maximum likelihood estimation (MLE), using the recursive algorithm of hidden chains of Markov. In the particular case of ligandactivated channels there had been postulated states of intermediate energy (FLIPSTATE), to explain delays during the activation of the receptor. To elucidate whether the existence of these states is a property of the receptor or each one of the subunits it is necessary to make applications of agonist even shorter than art state (0.2 ms). Therefore in this thesis presents the creation of a method that allows discrete ultra-fast applications of agonist (20 μs), on an outside-out patch clamp preparation, marking a substantial 10-50 fold improvement compared with actual art state and commercial devices, respectively. We analyzed the range of conditions in which this technique can be used and we made modifications to generate random applications of agonist maximizing the kinetic information obtained by experiment. Finally, we made a theoretical analysis, under the viewpoint of Bayesian statistics, of the response of channels to ultra-fast applications of agonist. Using this technique and this method of analysis can discriminate between models that also fit the experimental data.

Quintana, Paula Gabriela. "Lipasas y células enteras de microorganismos como biocatalizadores en síntesis de derivados de esteroides y ácido 2-oxoglutárico" (2012-09-28) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En el presente trabajo se estudió la aplicación de enzimas aisladas y células enteras de microorganismos en la síntesis y transformación de compuestos orgánicos. Se estudió la actividad de lipasas comerciales y una proveniente de un agroresiduo, en la síntesis de ésteres de ácido 2-oxoglutárico. Los resultados obtenidos permitieron no sólo la preparación de seis productos novedosos sino también otorgarle un valor y utilidad a un agro-residuo ampliamente disponible. La aplicación de lipasas en la reacción de acilación de hidrocortisona y en la desacetilación de su derivado peracetilado, permitió la preparación de nueve derivados, ocho de los cuales resultaron novedosos. Además se estudió una lipasa heteróloga del hongo Rhizopus oryzae en la acetilación del esteroide cortexolona. Se evaluó el biocatalizador en su forma nativa e inmovilizado sobre diversos soportes. Se aplicó un modelo matemático con el objetivo de lograr una mejor optimización de los parámetros de reacción. Finalmente se describió la aplicación de células enteras de diferentes cepas fúngicas del Orden Mucorales en la biotransformación de la drospirenona, progestina de origen sintético usada en terapia hormonal combinada. A través de la biotransformación se obtuvieron cuatro productos, tres de ellos novedosos y uno mayoritario.

Abstract:
In this work, the application of lipases and microorganism whole cells in the synthesis and transformation of organic compounds is described. The activity of commercial lipases and a non-commercial one, obtained from agrowastes, in the synthesis of 2-oxoglutaric esters was studied. The obtained results allowed the preparation of six novel compounds and the possibility of increasing the value of a widely available agrowaste. The application of lipases in the acylation reaction of hydrocortisone and the desacetylation of its peracetylated derivative allowed us preparing nine derivatives, eight of them novel compounds. Moreover, the study of a heterologous lipase from the fungus Rhizopus oryzae in the acetylation of the steroid cortexolone was carried out. The biocatalyst was evaluated in the native form and immobilized on several supports. With the aim of achieving an optimization in the reaction parameters, a mathematical model was applied. Finally, the use of whole cells of various fungi strains belonging to the Order Mucorales in the biotransformation of drospirenone, a synthetic progestin used in combined hormone therapy, was studied. The biotransformation afforded four compounds, three of them not reported previously in literature and one as a major constituent.

Catone, Mariela Verónica. "Identificación y análisis de los genes asociados al metabolismo de polihidroxialcanoatos en Pseudomonas extremaustralis" (2013) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
Los polihidroxialcanoatos (PHA) son polímeros de reserva bacterianos que poseen propiedades termoplásticas y son biodegradables. P. extremaustralis acumula polihidroxibutirato (PHB), formado por monómeros de longitud de cadena corta. Esta es una característica poco común en bacterias del género Pseudomonas, que normalmente acumulan PHA de longitud de cadena media (PHAmcl). Trabajos previos demostraron que los genes PHB se encuentran en una isla genómica. El objetivo de este trabajo consistió en la búsqueda y análisis de genes relacionados con la producción de distintos tipos de PHA en P. extremaustralis. También se realizaron análisis bioinformáticos del genoma de esta bacteria para identificar los genes involucrados en vías metabólicas centrales y los relacionados con la producción de alginato, de interés para comprender el metabolismo de compuestos carbonados que podrían estar relacionados con la producción de PHA. Se identificaron los genes de producción de PHAmcl, phaC1ZC2D y phaFI, además de los genes, phbFPX, asociados a la síntesis de PHB. Los análisis filogenéticos realizados permitieron inferir que estos genes poseen diverso origen. En base a estudios de complementación, de expresión génica y de proteómica de los gránulos del polímero se determinó la funcionalidad de las polimerasas de PHAmcl (PhaC1 y PhaC2) y se comprobó que la diferencia en la expresión de las 3 polimerasas, encontradas en el genoma de esta bacteria, podía explicar la alta producción de PHB en comparación con otros PHA. Los resultados en conjunto ponen de manifiesto la importante capacidad de adaptación al metabolismo de esta bacteria de genes probablemente adquiridos por transferencia horizontal, como los genes PHB. La capacidad de producción de PHA con distintas propiedades en P. extremaustralis resulta de interés biotecnológico dado que a través de manipulaciones genéticas sería posible lograr la producción de diferentes bioplásticos, utilizando la misma bacteria.

Abstract:
Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are reserve bacterial polymers that possess thermoplastic properties and are biodegradable. P. extremaustralis accumulates polyhydroxybutyrate (PHB), a PHA composed by short chain length monomers. This is an unusual feature in bacteria of the genus Pseudomonas, which normally accumulate medium chain length PHAs (PHAmcl). Previous works demostrated that PHB genes are located in a genomic island. The aim of this work was the identification and analysis of genes involved in the production of different types of PHAs in P. extremaustralis. Bioinformatic analysis of the genome of P. extremaustralis were performed in order to identify genes involved in the central metabolic pathways and other associated with alginate production, interesting to understand the metabolism of carbon compounds that could be associated with PHA production. Genes coding PHAmcl production (phaC1ZC2D and phaFI) were identified, and other group of genes (phbFPX) associated with the synthesis of PHB. Phylogenetic analysis allowed to infer that these genes have different origins. Complementation studies, gene expression analysis and proteomics assays of polymer granules showed the functionality of PHAmcl polymerases (PhaC1 and PhaC2), the key enzymes for the PHAmcl production, and allowed to determine that the difference in the expression of the 3 polymerases found in the genome of this bacterium could explain the high production of PHB in comparison with other PHAs. The overall results show the high adaptability of genes probably acquired by horizontal transfer to the metabolism of this bacterium, as PHB genes. The capability of PHA production with different properties in P. extremaustralis has biotechnological interest due to genetic manipulation could allow the production of different bioplastics such as PHB and other PHAmcl, using the same bacterium.

Tolivia, Analía Alejandra. "Prospección biotecnológica de cultivos de Euglena gracilis (Euglenozoa)" (2014) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
En este estudio, extractos libres de paramilon, de dos cepas de Euglena gracilis (Klebs), se sometieron a un cribado químico para detectar metabolitos secundarios. Ambas cepas fueron estudiadas en sus formas fotosintéticas y blanqueadas, en sus fases de crecimiento exponencial y estacionaria. Se realizaron análisis cromatográficos y se estudiaron sus capacidades bioactivas mediante ensayos primarios. Se detectó así la presencia de esteroides, cardenólidos, triterpenos, taninos y flavonoides. En correlación con la presencia de polifenoles, los extractos polares mostraron actividad antioxidante frente al radical estable DPPH• e inhibición de crecimiento in vitro, incluso en ausencia de paramilon, sustancia con propiedades antioxidantes y antitumorales. También se evaluó la producción de paramilon resultando las cepas blanqueadas cultivadas en medio mineral con exceso de acetato las más eficientes. Por derivatización de este polisacárido se obtuvo un producto con propiedades antivirales frente al Herpes virus tipo I, y su inclusión en la dieta de Cherax quadricarinatus, especie de importancia comercial, tuvo un efecto protector e inmunoestimulante de los efectores humorales sin afectar su crecimiento. Finalmente, dado que estas microalgas poseen una película formada por bandas superpuestas que se asemeja a una red de difracción, se investigó desde el punto de vista electromagnético el papel que esta estructura desempeña en la protección frente a la radiación UV. Aplicando el método de Chandezón para resolver el problema de difracción de una red iluminada por una onda plana, se calculó la reflectancia de esta estructura, mostrando que el patrón periódico exhibido por la película podría proporcionar un método de protección frente a los rayos UV.

Abstract:
In this study, Euglena gracilis (Klebs) extracts from two strains were screened for the identification of secondary metabolites. Both strains were studied in their photosynthetic and bleached forms, on their exponential and stationary growth phases. Chromatographic analyses were performed and bioactive capabilities were studied using primary assays. Steroids, cardenolids, triterpenes, tannins, and flavonoids were found. In agreement with the presence of polyphenols, the polar fractions showed antioxidant activity against DPPH• and growth inhibition activity in vitro even in the absence of paramylon, which has been previously reported to have antioxidant and antitumoral properties. The bleached strain grown in mineral medium with an excess of acetate was the most efficient at paramylon production. By derivatization of this polysaccharide, a product was obtained with antiviral properties against herpes virus type I. Its inclusion in the diet of Cherax quadricarinatus, a commercially important species, had a protective and immunostimulant effect of the humoral effectors without affecting their growth. Finally, since these microalgae are covered by a typical surface pellicle formed by overlapping bands which resemble a diffraction grating, we investigated from an electromagnetic point of view the role this pellicle might play in the protection against UV radiation. The reflectance of the structure, calculated by applying the C-method to solve the diffraction problem of a grating illuminated by a plane wave, showed that the periodic pattern exhibited by the pellicle has the potential to provide protection against UV damage.

Mon, María Laura. "Nuevas estrategias para el diagnóstico de la tuberculosis y paratuberculosis bovina" (2015-03-27) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires

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Resumen:
La Tuberculosis (TBB) y Paratuberculosis bovina (PTB) son las principales enfermedades que limitan el desarrollo de la industria lechera y de la carne en Argentina, siendo importantes en el contexto de la Sanidad animal debido a las grandes pérdidas económicas que producen en el ganado bovino. La TBB es producida por M. bovis. El hospedador primario es el bovino, pero otras especies de interés económico, así como también especies salvajes se infectan con esta micobacteria. La TBB es considerada una de las zoonosis más importantes en Argentina, siendo más expuestos los trabajadores rurales y de frigorífico, así como, los que consumen leche cruda sin pasteurizar. No existen vacunas comerciales contra la TBB, por lo tanto disponer de métodos de diagnóstico confiables para la identificación de los animales enfermos es esencial. La prueba oficial de diagnóstico más empleada, aprobada por el SENASA, es la intradermoreacción (IDR) con PPD-B, la cual consiste en la inoculación intradérmica de un derivado proteico purificado de la cepa de M. bovis AN5 (PPD-B), y la posterior medición de la reacción de hipersensibilidad retardada producida. La PPD-B es una mezcla de componentes, principalmente proteínas y lípidos de M. bovis. El principal inconveniente de la IDR radica en que algunas proteínas presentes en la PPD-B se encuentran en otras micobacterias, lo cual disminuye la especificidad, ya que animales sensibilizados por exposición previa a otras micobacterias también responden a este reactivo. En la última década se desarrollaron nuevas pruebas para el diagnóstico de tuberculosis, la más difundida consiste en la medición de IFN- luego de la estimulación de linfocitos con PPD-B o antígenos específicos de M. bovis. Otro método utilizado para el diagnóstico de TBB es la prueba de ELISA, sin embargo esta sólo permite detectar animales en estados severos de la enfermedad o en estado de anergia. Por otro lado, la PTB es una enfermedad infecciosa, producida por M. avium subsp. paratuberculosis (MAP), la cual se caracteriza por una enteritis crónica que resulta en un deterioro progresivo del animal enfermo. Afecta principalmente al ganado bovino, ovino y caprino. El diagnóstico de certeza de PTB es el aislamiento de MAP, pero este es un microorganismo de crecimiento muy lento. Por estas razones, los métodos inmunológicos para el diagnóstico de PTB resultan más efectivos para aplicar en una campaña de erradicación de la enfermedad que el cultivo. El diagnóstico inmunológico de PTB es principalmente serológico debido a que en estadios tempranos de la enfermedad se detectan anticuerpos. Contrariamente a lo que sucede con TBB, el diagnóstico serológico en PTB permite detectar con mayor especificidad los animales infectados que las pruebas que miden respuesta celular. Actualmente hay varios kits comerciales serológicos disponibles con diferentes antígenos, pero estos han demostrado discrepancia en la capacidad de ser detectados por todos los animales infectados. También hay vacunas comerciales disponibles para PTB, pero estas no son utilizadas en nuestro país debido a que interfieren con el diagnóstico de TBB. Por lo mencionado, en este trabajo se identificaron y evaluaron antígenos específicos de M. bovis y MAP para mejorar el diagnóstico de ambas enfermedades y poder contar en el futuro con herramientas que permitan la utilización de vacunas en desarrollo para la erradicación de la TBB y PTB. Para este fin, se identificaron por técnicas de proteómica, antígenos en aquellas fracciones proteicas más inmunogénicas de la PPD-B. A partir de las proteínas identificadas, se evaluaron 2 mezclas de antígenos altamente inmunogénicos identificados ya en trabajos previos en nuestro laboratorio, ESAT- 6, CFP-10, MPB-83, MPB-70, HSPX y TB10.3. Además de ser altamente inmunogénicos ESAT-6 y CFP-10 tienen la ventaja de que no se encuentran en la vacuna BCG, con lo cual son útiles para un diagnóstico DIVA (diferenciando vacunados de infectados). Estas mezclas resultaron ser más específicas que la PPD-B al no ser detectadas por animales vacunados con BCG, ni animales con PTB o sanos. Para mejorar la sensibilidad de estas mezclas se incluyeron otras proteínas identificadas en este estudio, no estudiadas hasta el momento: FixB y CFP2. Las nuevas mezclas incluyendo a estas proteínas, fueron evaluadas por las técnicas de IFN- e IDR, en animales naturalmente infectados con M. bovis, animales con PTB y animales sanos. En base a estos resultados, se observó que FixB aumentó la sensibilidad de las mezclas sin comprometer la especificidad. Luego estas mezclas fueron evaluadas en una prueba serológica, siendo detectadas también específicamente por los sueros de animales infectados con M. bovis. Nuestros resultados demuestran que una nueva mezcla compuesta por las proteínas recombinantes CFP-10, ESAT-6, MPB83 y FixB, es un promisorio nuevo reactivo para aplicar al diagnóstico específico de TBB tanto celular como serológico, sin interferencias con animales sensibilizados con otras micobacterias o vacunados con BCG. En cuanto la evaluación de antígenos de MAP para utilizar en el diagnóstico de PTB, se evaluó un panel de 51 antígenos por la técnica de MAPIA. Esto permitió seleccionar 7 antígenos específicos: Map2513, Map1693c, Map2020, Map0038, Map1272, CSP, Map0210c, los cuales fueron detectados específicamente por los sueros de animales con PTB. En base a esto, se realizó una mezcla con los 7 antígenos (M1-PTB), la cual se evaluó también por MAPIA. Por otra parte se identificaron proteínas antigénicas a partir de PPD-A (Derivado proteico purificado a partir de M. avium por técnicas de proteómica identificándose 3 proteínas las cuales también se evaluaron por la técnica de MAPIA, conformando una segunda mezcla (M2-PTB). esta mezcla resultó sensible, pero no específica. Luego M1-PTB y M2-PTB fueron evaluadas con mayor cantidad de sueros de animales con PTB y con un grupo de animales con TBB por la técnica de ELISA, comparando con el ELISA convencional PPA-3 que utiliza un antígeno protoplasmático de MAP. M1- PTB tuvo sensibilidad del 33% y no exhibió reacción cruzada con sueros de animales sanos y la reactividad con el suero de animales con TBB fue muy baja mostrando una mayor especificidad que el ELISA-PPA-3. El panel de 51 antígenos también fue evaluado por la técnica de IFN-ningún antígeno de MAP demostró capacidad de liberar esta citoquina en valores que permitan su utilización en un test que mida respuesta celular. Los resultados presentados en este trabajo sugieren que varios antígenos específicos tanto de M. bovis como de MAP pueden mejorar la detección de la infección pudiendo permitir además el uso de vacunas tanto contra PTB como TBB, sin que estas interfieran en el diagnóstico.

Abstract:
Tuberculosis (TBB) and bovine paratuberculosis (PTB) are the main diseases that limit the development of dairying and beef in Argentina, being important in the context of animal health, due to the large economic losses that occur in cattle. TBB is produced by M. bovis. The primary host is cattle but other species of economic interest as well as wild species are infected with this mycobacterium. TBB is considered one of the most important zoonoses in Argentina where rural workers and those who consume raw unpasteurized milk are primarily exposed. There are no commercial vaccines against TBB therefore having reliable diagnostic methods its essential. The official diagnostic test, approved by SENASA is the tuberculin test (IDR), which involves intradermal inoculation of a purified protein derivative of M. bovis strain AN5 (PPD-B), and subsequent measuring of the delayed hypersensitivity reaction. PPD-B is a mixture of components, proteins and lipids from M. bovis. The main disadvantage of the IDR is that some proteins present in the PPD-B are in others mycobacteria, which decreases the specificity, since animals sensitized by previous exposure to other mycobacteria also respond to this reagent. In the last decade, new tests for the diagnosis of tuberculosis were developed; the most widespread is the measurement of IFN- after lymphocyte stimulation with PPD- B or specific M. bovis antigens. Another method used for TBB- diagnosis is the ELISA, but this only allows detecting anergic animals in severe disease states. Furthermore, PTB is an infectious disease caused by M. avium subsp. paratuberculosis (MAP), which is characterized by chronic enteritis resulting in a progressive deterioration of the animal. Primarily affects cattle, sheep and goats. Definitive diagnosis of PTB is the isolation of MAP, but this is a very slow growing organism. For these reasons, immunological methods for PTB diagnosis are more effective to implement in a campaign to eradicate the disease than culture. Immunological PTB diagnosis is primarily serologic because in the early stages of the disease antibodies are detected. Contrary to what happens with TBB, serological PTB diagnosis has a greater specificity to detect infected animals than cellular response test. Currently, several serological commercial kits are available with different antigens, but these have shown discrepancy in the ability to detect all infected animals. There are also commercial PTB-vaccines available, but these are not used in our country because they interfere with TBB diagnosis. In this study M. bovis and MAP specific antigens were identified and evaluated to improve the diagnosis of both diseases and to have tools in the future that allow the use of vaccines in development for the eradication of TBB and PTB. For this purpose, antigens were identified by proteomic techniques in those immunogenic PPD-B protein fractions. From this, 2 mixtures composed by highly immunogenic antigens identified in previous studies in our laboratory, ESAT-6, CFP-10, MPB-83, MPB-70, HSPX and TB10.3, were evaluated. Besides, being highly immunogenic ESAT-6 and CFP- 10 have the advantage of not to found in BCG, thereby serve as a diagnostic DIVA (differentiating vaccinated from infected). These mixtures were more specific than PPD-B not reacting with BCG-vaccinated animals, or PTB-infected or healthy animals. To improve the sensitivity of these cocktails, two unknown proteins, CFP2 and FixB were included. These new cocktails were evaluated by IFN- release assay and IDR. Based on these results, it was observed that FixB increased the sensitivity without compromising the specificity. Our results demonstrate that a novel mixture comprising the recombinant proteins CFP-10, ESAT-6, MPB83 and FixB, is a promising new reagent for specific diagnosis applied to both cellular and serological TBB without interference with other mycobacteria sensitized animals. Thus, the mixture can be used for diagnosis of TBB, and also applied in BCG vaccinated animals without interfering. As the evaluation of MAP antigens for PTB-diagnosis, a panel of 51 antigens was evaluated by MAPIA (multi-print antigen immunoassay). This allowed selecting 7 specific antigens: Map2513, Map1693c, Map2020, Map0038, Map1272, CSP, and Map0210c. Based on this, a mixture with the seven antigens (M1-PTB) was performed, which was also evaluated by MAPIA. Moreover, PPD-A antigenic proteins were identified by proteomic techniques. Three proteins from these were also evaluated by the technique of MAPIA, forming a second mixture (M2 -PTB). After this, both cocktails were evaluated with greater amount of sera from MAP and M. bovis infected animals by ELISA, comparing with conventional ELISA-PPA-3 using a M. avium protoplasmic antigen. M1-PTB had a sensitivity of 33% and exhibited no crossreaction with healthy animals and the reactivity of TBB animals was very low, being more specific than ELISA-PPA-3. The panel of 51 antigens was also evaluated by the technique of IFN-any antigen was very inmunogenic to allow their use in a test to measure cellular response. The results presented in this thesis suggest that several specific M. bovis and MAP antigens can improve the detection of infection and also allow the use of vaccines for both PTB as TBB, without interfering with the diagnosis.

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