Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Obtención y caracterización del anticuerpo monoclonal Fc-5.01, reactivo con cáncer de mama, melanoma y otros tumores humanos |
| Título alternativo: | Production and characterization of monoclonal antibody FC-5.01, reactive with breast cancer, melanoma and other human tumors |
| Autor: | Barrio, María Marcela |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Fundacion Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas
|
| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 1998 |
| Fecha en portada: | 1998 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
| Director: | Mordoh, José |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | ANTICUERPO MONOCLONAL FC-5.01; AG CD63; INTERNALIZACION RADIOINMUNODETECCION; RADIOINMUNOTERAPIAMAB FC-5.01; CD63 AG; RADIOINMUNODETECTION; RADIOINMUNOTHERAPY INTERNATION |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3087_Barrio |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3087_Barrio.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3087_Barrio |
| Ubicación: | Dep.BIO 003087 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Barrio, María Marcela. (1998). Obtención y caracterización del anticuerpo monoclonal Fc-5.01, reactivo con cáncer de mama, melanoma y otros tumores humanos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3087_Barrio |
Resumen:
Con el objeto de producir anticuerpos monoclonales (AMCs) dirigidos contraantígenos (Ags) expresados por células tumorales indiferenciadas, los cualespodrían ser comunes a varias neoplasias, se utilizaron las células IIB-BR-G comoinmunógeno. Esta línea celular de carcinoma mamario presenta característicassumamente indiferenciadas y fue derivada de un tumor primario de mamaaltamente indiferenciado, que no expresa receptores hormonales. Se seleccionóun AMC denominado FC-5.01 (lgG2a), el cual reconoce distintos carcinomashumanos y el 100% de los melanomas malignos. Su reactividad con la mayoría delos tejidos normales es escasa, ya que FC-5.01 reconoce algunas células delsistema neuroendócrino, macrófagos y algunos túbulos contorneados proximalesen el riñón, mayormente con un patrón intracelular. A nivel bioquímico, el Ag reconocido por FC-5.01 es una glicoproteínaheterogénea (banda ancha con un peso molecular de 30-60 kDa) en melanomas ycarcinomas humanos. El epitope reside en el núcleo protéico (25kD) y espresumiblemente conformacional, con puentes disulfuro implicados en elreconocimiento del AMC. En esta Tesis se demuestra que FC-5.01 reacciona conel Ag CD63, inicialmente descripto como un Ag asociado a melanoma, y miembrode la superfamilia Tetraspan o Tetraspaninas. La reactividad de FC-5.01 con CD63 se demostró por Western blot, con ensayos de inmunodepleción con otroanticuerpo anti-CD63 y por análisis de FACS (fluorescence activated cell sorting)de la línea celular de melanoma KM3 (CDGB-negativa) luego de la transfeccióncon la copia genómica de CD63. El epitope reconocido por el AMC FC-5.01 esdiferente del reconocido por otro AMC anti-CD63 (ME491), como se demostró porun radioimmunoensayo de inhibición cruzada. Opuestamente a lo propuesto parael AMC ME491, no se observaron diferencias significativas en Ia expresión de CD63 entre melanomas primarios y metastásicos usando AMC FC-5.01, pormedio de inmunohistoquímica. Por inmunofluorescencia indirecta realizada a 4°C con células vivas, se determinóque el Ag reconocido por FC-5.01 está presente en las membranas plasmáticasde células IIB-BR-G y otras células neoplásicas. En células permeabilizadas, FC-5.01co-localiza con el colorante naranja de acridina en vesículas acídicas (compartimiento lisosomal/endosomal). Por análisis de Scatchard realizado concélulas IB-BR-G, se calculó una constante de afinidad de 1.4 ± 0.4 x 10^7 M^-1 y 2.1x 10^6 sitios antigénicos por célula. El AMC FC-5.01 no media reacciones citotóxicas contra células CD63+ (fijación decomplemento ni ADCC= antibody dependent cellular cytotoxicity), pero el complejo FC-5.01-CD63 es eficientemente internalizado hacia vesículasintracitoplasmáticas, como se observó en un ensayo de inmunofluorescenciaposterior a la incubación a 37°C. El catabolismo celular del AMC unido por lascélulas IIB-BR-G se estudió usando [125I]-FC-5.01. Luego de 18 hs a 37°C, >70%de la radioactividad se encontró en el sobrenadante del cultivo como fragmentosdegradados (TCA-solubles). En células IIB-BR-G se demostró rápida re-expresióndel Ag luego de la internalización. El AMC FC-5.01 disminuyó la migración decélulas CD63+ en un ensayo de cámara de Boyden. Estas propiedades permitiríanel uso del AMC FC-5.01 como un vehículo para dirigir diferentes compuestosdentro de células CD63+. Luego de haber logrado la radioinmunolocalización de xenotransplantes decarcinoma mamario humano creciendo en ratones nude (IIB-BR-GNUDE ) con [125I]-FC- 5.01, se formuló un kit de marcación en un paso, para obtener [99mTc]-FC-5.01,con posible utilidad en diagnóstico por imágenes. Este kit se preparó por reduccióndel AMC con 2-mercaptoetanol y la adición de difosfonato de metileno (MDP)como ligando transquelante. Luego de la marcación con [99mTc] eluído degenerador, las especies marcadas se analizaron por ITLC (instant thin layerchromatography) y HPLC (high performance liquid chromatography). La eficienciade marcación fue superior al 90% y la conservación de la inmunoreactividad severificó con células IIB-BR-G. En el modelo IIB-BR-GNUDE se realizaronbiodistribuciones e imágenes en cámara gamma con [99mTc]-FC-5.01. A las 24 hsla radioactividad se incrementó en los tumores (14.4 ± 5.3 % de la dosis inyectada/gr tumor) y disminuyó en la sangre y los principales órganos, y los tumores seradioinmunodetectaron perfectamente en la cámara gamma. Los controles decalidad demostraron que el kit resulta estable por un período de hasta 120 días. Alícuotas de este mismo kit se inyectaron a dos pacientes con melanoma maligno (0.5 mCi/paciente), y en uno de ellos fue posible localizar, a las 24 hs, unametástasis en un gánglio linfático axilar, que ya había sido detectada por medio detomografía computada. Este kit preparado para radioinmunodetección (RID) in vivopodría ser utilizado en el futuro con fines diagnósticos en pacientes con melanomau otros tumores CD63+. Dados estos resultados, se utilizó el mismo modelo in vivo para experimentos deradioinmunoterapia (RIT). Se investigó la capacidad de [131I]-FC-5.01 paracontrolar el crecimiento de los tumores IIB-BR-GNUDE. En un primer experimento de RIT se observó una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0.05) enanimales portadores de tumor, tratados con [131I]-FC-5.01(900 μCi) fraccionadosen tres dosis semanales, respecto de los animales control. Se observó ciertogrado de toxicidad hematológica (pérdida de peso corporal, hipoplasia de lamédula ósea, bajos recuentos de leucocitos totales). No se observaronregresiones o curas. También se observó incremento de la probabilidad desupervivencia debida al tratamiento con [131I]-FC-5.01 en uno de los experimentos. El nivel de toxicidad fue disminuído reduciendo la dosis de [131I]-FC-5.01 y poradministración de G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) comocomplemento de la RIT.
Abstract:
In a research project directed to produce monoclonal antibodies (mAbs) towardsundifferentiation antigens (Ags), which could be common to several tumors,immunization with extremely undifferentiated tumor cells was attempted. One ofsuch cells is the human breast cancer cell line, IIB-BR-G, developed in ourlaboratory and derived from a highly undifferentiated breast tumor. A mAbdesignated FC-5.01(IgG2a) was selected, that binds to several human carcinomasand malignant melanoma. It has null or very low reactivity with most human normaltissues, with the exception that FC-5.01 binds to some cells from theneuroendocrine system, macrophages and some renal proximal convolute tubules. Biochemical studies indicate that FC-5.01 recognizes an heterogeneousglycoprotein (broad band between 30-60 kDa) in melanoma tumors. The epitoperesides in the protein core and is presumably conformational, with disulphidebonds implicated in mAb recognition. In this Thesis it is demonstrated that mAb FC-5.01 reacts with CD63 Ag, which has been initially described as a melanoma-associated Ag, and is a member of the tetraspan superfamily. Reactivity of mAb FC-5.01 with CD63 was demonstrated by Western blot, immunodepletion assaysand FACS analysis of the CD63-negative melanoma cells (KM3) after transfectionwith the genomic copy of CD63. The epitope recognized by mAb FC-5.01 isdifferent from the epitope recognized by another anti-CD63 mAb, ME491, asshown by an inhibition radioimmunoassay. Opposite to what has been stated formAb ME491, no significant differences were found in CD63 expression betweenprimary and metastatic melanoma using mAb FC-5.01. The Ag recognized by mAb FC-5.01 is located in the plasma membranes of IIB-BR-Gand other neoplastic cells, as detected by indirect immunofluorescenceperformed at 4°C on live cells. When the cells are permeabilized, mAb FC-5.01recognizes acidic vesicles which colocalize with acridine orange (lysosomal/endosomal compartment). Scatchard plot analysis performed on IB-BR-G cellsdemonstrated a 1.4 ± 0.4 x 10^7 M^-1 affinity constant and 2.1 x 10^6 antigenic sitesper cell.mAb FC-5.01 is not able to mediate C (complement) fixation or antibody dependentcellular cytotoxicity (ADCC) towards CD63+ cells, but the FC-5.01-CD63 complex isefficiently internalized into cytoplasmic vesicles, as shown by an acid washimmunofluorescence assay. Cellular catabolism of the bound antibody by IIB-BR-Gcells was studied using [125I]-FC-5.01. At 18 hs, >70% of the radioactivity waspresent in the supernatant as degraded fragments (TCA-soluble). Afterinternalization, rapid Ag re-expression could be demonstrated in IIB-BR-G cells.mAb FC-5.01 diminished migration of CD63+ cells, in a Boyden chamber assay. These properties would enable to use mAb FC-5.01 as a vehicle to target differentcompounds inside CD63+ cells. After demonstrating positive radioimmunolocalization with [125I]-FC-5.01 of humanbreast growing in nude mice, a one-step labelling kit was specially formulated forthis mAb in order to obtain [99mTc]-FC-5.01. This kit was produced by mAbreduction with 2-mercaptoethanol and by adding methylene diphosphonate (MDP)as the transchelating ligand. The labeled species were analyzed by instant thinlayer chromatography (ITLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Labeling efficiency was greater than 90%. Immunoreactivity was assessed on IIB-BR-Gcells. Biodistribution of [99mTc]-labeled mAb FC-5.01 and tumor imaging wereperformed in nude mice bearing breast cancer IIB-BR-GNUDE xenografts. At 24 hsaccumulation of [99mTc] increased in tumor (14.4 ± 5.3 % injected dose/ gr tumor)and decreased in blood and most organs. Quality control tests demonstrated thatthe kit was stable for up to 120 days. Therefore, animal studies demonstrated goodand specific in vivo tumor targeting. Given these results, the ability of [131I]-FC-5.01 to influence tumor growth in vivowas further investigated. Preliminary radioimmunotherapy (RIT) experimentsshowed that there was a significative tumor growth inhibition (p<0.05) in animalstreated with 900 μCi fractionated into three doses (one week apart), respect tocontrol mice. Some degree of hematological toxicity was observed (bone marrowhipoplasia, low white blood cell counts). Increase in survival probability due to [131I]FC-5.01 treatment was also evident in one of such experiments. We did notobserve tumor regressions or cures. Hematological toxicity was decreased byreducing [131I]-FC-5.01 dose and by administration of granulocyte-colonystimulating factor (G-CSF) as a complement for RIT.
Citación:
---------- APA ----------
Barrio, María Marcela. (1998). Obtención y caracterización del anticuerpo monoclonal Fc-5.01, reactivo con cáncer de mama, melanoma y otros tumores humanos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3087_Barrio
---------- CHICAGO ----------
Barrio, María Marcela. "Obtención y caracterización del anticuerpo monoclonal Fc-5.01, reactivo con cáncer de mama, melanoma y otros tumores humanos". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1998.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3087_Barrio
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