Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Expresión de CD44 en tumores murinos y humanos y su relación con el proceso metastásico |
| Título alternativo: | CD44 expression in murine and human tumors, and its relationship with the metastatic process |
| Autor: | Ladeda, Virginia Edith |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto de Oncología "A.H.Roffo"
|
| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 1998 |
| Fecha en portada: | 1998 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
| Director: | Bal de Kier Joffé, Elisa |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3005_Ladeda |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3005_Ladeda.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3005_Ladeda |
| Ubicación: | Dep.BIO 003005 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Ladeda, Virginia Edith. (1998). Expresión de CD44 en tumores murinos y humanos y su relación con el proceso metastásico. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3005_Ladeda |
Resumen:
CD44, receptor del acido hialurónico, es una glicoproteína demembrana con un dominio extracelular altamente glicosilado, unaporción transmembrana y una cola citoplasmática que interactúa con elcitoesqueleto. Originalmente fue descripta como receptor “homing” encélulas linfocitarias, pero luego se vio que también se expresa en otrostipos celulares. Existen múltiples formas de esta molécula, llamadasvariantes, que se generan por splicing alternativo de 10 exones. La formamas abundante es la llamada estándar ó hemopoyética (CD44s/ H), quecarece de los diez exones alternativos y se expresa predominantemente encélulas hemopoyéticas y mesenquimaticas. Su peso molecular es de 80-90kDa. Sus principales funciones son participar en la activación de linfocitosy en la adhesión y migración celular. Las formas variantes tienen un pesomolecular de 120-150 kDa y se expresan con predominio en tejidosepiteliales. Las funciones precisas de estas isoformas aún no estan claras. En 1991, Gunthert y col., demostraron que la ísoforma v6confería capacidad metastasica al ser transfectada en células tumorales nometastásicas de rata. Como consecuencia de este hallazgo ha surgido ungran interés por el estudio de CD44 en otros modelos tumorales. En el desarrollo de este plan de Tesis, hemos estudiado la función,expresión y distribución de CD44 en una línea celular tumoral mamariamurina, F3II, altamente invasiva y metastasica. El estudio de la expresiónde CD44 en cortes histológicos de tumores F3II, mostró una alta expresiónde esta molécula asociada al crecimiento subcutaneo de los mismos,mientras que dicha expresión fue prácticamente nula en tumores F3IIcrecidos en forma peritoneal. El analisis de la expresión de CD44, por Western blot e inmunohistoquímica, en cultivos de células tumorales FSIIy normales NMuMG, mostró que las monocapas de células FSII expresanmayores niveles que las células normales. En ambas líneas se pudodetectar, por Western blot, una banda principal de 80 kDa,correspondiente a CD44s. También se observó la presencia de bandas demayor peso molecular, que podrian corresponder a la expresión devariantes de CD44, aunque dicha expresión fue menos evidente en lascélulas NMuMG. Mediante el uso de un anticuerpo monoclonal específico antíCD44 (KM201), hemos demostrado que los procesos de adhesión yspreadíng dc células FSII pueden ser inhibidos en forma significativa. Elanálisis de la expresión de CD44, por inmunocitoquímica durante elspreading, mostró que esta molécula se distribuye en forma contínua (nopunctata) sobre la membrana plasmática, particularmente en los bordesanteriores o de avance y en la zona perinuclear de la membranaplasmática. CD44 no fue detectado en estructuras como filopodios olamelipodios, pero sí entre dichas estructuras. Las células totalmenteextendidas sobre el sustrato, presentaron una significativa disminución dela tinción de CD44 sobre la membrana plasmática, comparado con losestadios iniciales del spreading. Este descenso en la expresión a lo largodel spreading fue confirmado por Western Blot. En ensayos de migración e invasión de células F3II en cámaras Transwell, demostramos que el anticuerpo anti-CD44, fue también capazde inhibir en forma significativa ambos procesos. Además, el tratamientode células FSII con anti-CD44 conjuntamente con anti-uPA, la inhibiciónde la migración se incrementó en un 90%, sugiriendo una acciónsinergíca entre CD44 y uPA en favor de la migración de estas célulastumorales. Además de la asociación funcional entre CD44 y el uPA en elen el proceso de migración, los resultados de ensayos deinmunoprecipitación con anticuerpos específicos, indicaron que elreceptor CD44 estaría físicamente asociado con el uPA, sugiriendo laparticipación conjunta de ambas moléculas en algunas etapas de lacascada metastasica de células tumorales mamarias murinas. En conjunto estos resultados demuestran que, en la línea celulartumoral F3II, CD44 cumple un rol activo en eventos críticos que tienenlugar durante la cascada metastásica, como la adhesión, spreading,migración e invasión celular. Mediante un enfoque farmacológico, se estudiaron las vías deseñalización que participarían en la regulación de la expresión de CD44en células FSII. El tratamiento de células F3II con PMA, activador de PKC,o ácido fosfatídico, producto de la degradación de fosfatídilcolinadependiente de PLD, aumentaron en forma significativa la expresión de CD44. Cuando los cultivos fueron tratados con H7, inhibidor específicode PKC,o con propranolol, inhibidor de la conversión de acido fosfatídicoa DAG,se observó una sensible disminución de la expresión de CD44. Losresultados de estos experimentos sugieren la participación de PKC y PLDen las vias de señales que regulan la expresión de este receptor. Los tumores cerebrales raramente metastatizan pero son muyinvasivos a nivel local. Dado que el AH es un componente abundante de lamatriz extracelular del sistema nervioso central y que CD44 participa ensu degradación, la sobreexpresión de este receptor podría facilitar elproceso invasivo de estos tumores. En un trabajo colaborativo con los Servicios de Oncología y Patología del Hospital Italiano, hemos analizadola expresión de CD44 en 57 tumores de cerebro (14 astrocitomas de bajogrado, 13 astrocitomas anaplásicos, 22 glioblastomas multiformes, 5ependimomas y 3 meduloblastomas). Cuando se analizaron losglioblastomas de distintos estadios, se observó que la sobreexpresión de CD44s se correlaciona en forma lineal con el grado de agresividad deestos tumores (Clasificación de Burger). En cambio, el mismo analisis enependimomas, tumores poco agresivos, mostró una alta expresión de CD44s, mientras que, en meduloblastomas, tumores altamente agresivos,la expresión de esta molécula, fue casi nula. No se detectó expresión devariantes de CD44 en ninguno de los tumores estudiados. Nuestrosresultados sugieren que la sobreexpresión de CD44s podria ser deimportancia durante el desarrollo de tumores humanos de origenneuroglial.
Abstract:
CD44, the receptor of hyaluronan acid, is a transmembraneglycoprotein, which has an extracellular domain, a transmembraneportion, and a cytoplasmic tail which is connected to the cytoskeleton. CD44 was originally described as the lymphocyte “homing receptor” tolymph nodes endothelium. A large number of isoforms are generated byalternative splicing of up to IO variant exons. Further diversity is createdby variable side chain glycosilation. The most abundant form is the socalled standard or hematopoetic form, CD44s/H, expressedpredominantly in hematopoetic and mesenchymal cells. CD44s lacks thevariant exons and has a molecular weight of 80-90 kD. Its multiplefunctions include lymphocyte activation, cell adhesion and migration. Thevariant forms range from 120 to 250 kD and are expressedpredominantly in epithelial tissues. The precise functions of theseisoforms are not clear at present. A considerable amount of interest in this molecule was generatedby the finding reported by Gunthert et al (1991), that a particular isoform (v6), when transfected into non metastatic rat pancreatic carcinoma cells,conferred metastatic capability. This was followed by a series of papersindicating increased expression of CD44s and variants in other tumormodels. In this Thesis project, we have studied the function, expressionand distribution of CD44 in the highly invasive and metastatic murinemammary tumor cell line, F3II. We detected a high CD44 expression on F311subcutaneous tumors, while the expression was almost nule whenthe tumor grew intraperitoneally. Confluent monolayers of normalmurine mammary cells (NMuMG) and F311tumor cells were assayed fortheir capacity to express CD44 by Western blot andimmunohystochemistry. F3II cells were found to express significantlyhigher levels of CD44 than NMuMG. The Western blot analysis showed amain specific band of 80 kDa on both cell lines, corresponding to CD44s,and minor bands of higher molecular weight suggesting the expression of CD44 variants. A mAb anti-CD44 (KM201) dramatically blocked F3II celladhesion and spreading. Immunocytochemistry of spreading cellsrevealed that CD44 distributed in bands on the cell surface, particularlyin the tip of leading edges and in the perinuclear zones of the cellmembrane. CD44 antigen was never detected in filopodia or lamellipodiabut was detected as strong interlamellar bands. CD44 staining nevershowed a distribution compatible with association to focal adhesion-likestructures. Fully spread cells showed remarkably less CD44 stainingcompared to cells in early stages of spreading. This decrease observed by ICCstudies, correlated with a reduced expression of CD44, as detected by Western blot. KM201 mAb significantly inhibited F3II cell migration andinvasion in Transwell Chambers. When F3II cells migration was assayedin the presence of both anti-CD44 and anti-uPA antibodies, theinhibition on migration was dramatically enhanced (90% inhibition). Thisresult suggest a sinergistic cooperation between CD44 and uPA duringmigration of F3II cells. In addition to the functional cooperation between CD44 and uPA during cell migration, we demonstrated byimmunoprecipitation with specific antibodies, a physical link betweenboth molecules on F3II cells. These results may indicate that the closeproximity of CD44 and uPA may be important for the functional synergyduring the migration process of murine mammary tumor cells. Taken together, these results demonstrate that CD44 plays animportant role during F3II cells adhesion, spreading, migration andinvasion, all of them critical events during tumor metastasis. We used a pharmacologycal approach to study the signalpathways regulating CD44 expression in F3II cells. Treatment of F3II cellswith PMA, a PKC activator, or phosphatidic acid, the product of PLD dependentphosphatidilcholine degradation, significantly enhanced CD44 expression. When F3II cells monolayers were treated with H7, aspecific PKC inhibitor, or propranolol, which inhibits phosphatidic acidconvertion to DAG, it was observed a dramatic decrease of CD44 antigenlevels. These results suggest the involvement of PKC and PLD pathways inthe regulation of CD44 expression. Primary brain tumors are characterized by their highly invasivebehaviour, although they seldom metastasize to distant organs. HA, amain component of the extracellular matrix in the central nervoussystem, may be substrate for tumor cell invasion through CD44. In acollaborative study with the “Hospital Italiano”, we have analyzed CD44expression on 57 human brain tumor biopsies (14 low gradeastrocytomas, 13 anaplastic astrocytomas, 22 glioblastomas multiforme, 5ependymomas and 3 medulloblastomas). In the astrocytomas group wefound that overexpression of CD44s correlates with tumor aggresiveness (upon Burger grade). In contrast, in ependymomas, less aggressivetumors, CD44s expression was high, while CD44s expression was almostnegative in medulloblastomas, highly aggressive tumors. No CD44variants expression was detected in any of the samples analyzed. Ourresults suggest that overexpression of CD44s could be important duringthe development of human astrocytomas.
Citación:
---------- APA ----------
Ladeda, Virginia Edith. (1998). Expresión de CD44 en tumores murinos y humanos y su relación con el proceso metastásico. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3005_Ladeda
---------- CHICAGO ----------
Ladeda, Virginia Edith. "Expresión de CD44 en tumores murinos y humanos y su relación con el proceso metastásico". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1998.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3005_Ladeda
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